CN104136610B - 人源化抗上皮调节蛋白抗体和含有该抗体作为有效成分的癌症治疗药 - Google Patents

人源化抗上皮调节蛋白抗体和含有该抗体作为有效成分的癌症治疗药 Download PDF

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Abstract

本发明人将通过对表达人上皮调节蛋白的癌细胞发挥细胞毒活性和中和活性而抑制癌细胞增殖的人源化EP27抗体的可变区序列中的氨基酸残基适当取代，从而成功制作了：显示出作为非人动物的食蟹猴和人动物间的种属交叉反应性的抗上皮调节蛋白抗体、化学分解得到抑制的抗上皮调节蛋白抗体、等电点降低的抗上皮调节蛋白抗体、热变性中间温度升高的抗上皮调节蛋白抗体、以及缔合体量减少的抗上皮调节蛋白抗体。

Description

人源化抗上皮调节蛋白抗体和含有该抗体作为有效成分的癌 症治疗药
技术领域
本发明涉及癌症的治疗方法、以及癌细胞增殖抑制剂和抗癌药。
背景技术
在发达国家癌症是死亡率的主要原因。为了治疗癌症，在过去的50年间开发了许多化疗药。大部分化疗药可以分为烷基化剂、代谢拮抗剂、蒽环霉素(anthracycline)、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和抗肿瘤药。这些药物均影响细胞***或DNA的合成，通过以某种形式发挥作用的机制产生疗效。
特定的化疗药的有效性在癌症之间、患者之间、或者根据各个患者中的经过时间而不同。暴露于化疗药下的癌细胞往往会对这种化疗药产生耐性，对其他几种抗癌药也同样产生交叉耐性。而且，根据上述化疗药的机理，为了控制这些化疗药对正常细胞产生的细胞毒的结果带来的副作用，化疗药的用量或用法在很多情况下都受到制约。
近年来，人们在推进以在癌细胞中特异性表达的分子为靶的分子靶向药物的开发，以代替现有的化疗药。随着这种分子靶向药物的问世，可以避免现有的化疗药所固有的副作用，实现有助于癌症患者的QOL的癌症治疗。这种分子靶向药物除了包含低分子(smallmolecule)药物以外，还包含抗体等高分子药物。治疗抗体是生物体内与生俱来的分子，除了具有对生物体的毒性低的优点以外，还具有通过由效应子功能介导的细胞毒活性等低分子药物以外的作用机制特异性地杀伤靶细胞、发挥疗效的优点，因此近年来有多种治疗抗体上市。
作为这种通过由效应子功能介导的细胞毒活性等低分子药物以外的作用机制特异性地杀伤靶细胞的抗体，公开了以在大肠癌、肺腺癌、胰癌、胃癌、肾癌中高度表达的上皮调节蛋白(Epiregulin)为靶的治疗抗体(专利文献1)。具体而言，在测定抗上皮调节蛋白抗体的补体依赖性细胞毒(complement-dependent cytotoxicity; CDC)活性、以及抗体依赖性细胞毒(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)活性时，发现抗上皮调节蛋白抗体对表达上皮调节蛋白的细胞具有CDC活性和ADCC活性。另外，明确了抗上皮调节蛋白抗体对癌细胞株具有通过中和作用产生的增殖抑制效果。而且，根据以上的认知，发现抗上皮调节蛋白抗体对原发性或转移性的各种癌症的诊断、预防和治疗有效。
包括上述抗癌药在内的任何新型候选药物为了销售也必须通过严密的试验。例如，这种试验分为临床前试验和临床试验。其中，后者通常进一步细分为I期试验、II期试验和III期试验，使用人患者来进行，而前者使用动物来进行。通常，临床前试验的目的在于：证明候选药物起作用、同时该药物是有效且安全的。具体而言，这些动物试验的目的在于：证明药物没有致癌性、致突变性或致畸性，同时理解药物的药物动力学。只有在临床前试验中确立了被测药物对动物的安全性和被测药物有效的可能性的情况下，才认可对人给予该被测药物的临床试验。
在许多情况下，低分子(small molecule)的被测药物(例如由蒽环霉素衍生的新型抗癌药)在动物体内的作用都能够作为对人给药时该药物的预测作用的指标。因此，由这种临床前试验得到的数据通常能提供对人给药时的作用的高度预测性。但是，并不是在所有种类的被测药物中都会得到这种预测性，来自临床前试验结果的预测性和关于临床试验认可候选药物的可能性都非常小。
一般说来，抗体通常可以通过极其特异性地识别蛋白性的靶分子来发挥作用。在大多数情况下，作为单克隆抗体的被测抗体药物只识别靶分子上的单一位点或单一表位。由于单克隆抗体向来就具有的高靶向识别功能，所以抗体成为用于药物开发的意义非常深远的候选，但另一方面，由于该识别功能，有时难以进行临床前试验。这是由于在这种抗体所结合的靶分子的序列中存在种依赖性的突变。在人中，例如，经由表位X特异性地识别分子Y、并且与该分子结合的单克隆抗体，在用于临床前试验的生物种中的对应靶分子(直向同源物)Y’中对应存在的表位X’还有可能与人中对应的靶分子中存在的X不同，在非人种中常常无法特异性地识别直向同源物分子Y’并与该分子结合。即使是对人和灵长类抗原具有反应性的单克隆抗体组间，只与人和黑猩猩抗原相同体反应的抗体的例子也增多。例如，关于抗CD3单克隆抗体，观察到了这样的例子。应用最广泛且性质了解最全面的、CD3复合体的特异性单克隆抗体之一是OKT-3，其与黑猩猩CD3反应，但不与其他灵长类、例如恒河猴的CD3同源体或狗CD3反应(非专利文献2)。另一方面，还存在识别恒河猴抗原、而不识别其人直向同源物的单克隆抗体的例子。该组的一个例子是针对来自恒河猴的CD3的单克隆抗体FN-18(非专利文献2)。
为了应对由上述的单克隆抗体的高特异性产生的临床前动物试验中的问题，采取了几种策略。
第一种公知的方法是：使用黑猩猩模型来实施被测抗体药物的临床前试验。黑猩猩的遗传亲缘与人最接近，其基因组的99%与人的基因组相同，所以被测抗体药物特异性结合的靶分子在黑猩猩中的突变与该分子在人中的突变相同的可能性非常大，实际上Schlereth等人发现了CD3的突变在人和黑猩猩中共通(非专利文献3)。因此，认为在黑猩猩中该分子不被被测抗体药物识别的危险性小。但是，使用黑猩猩的试验非常昂贵，而且还伴有伦理上的问题。而且，由于黑猩猩是濒临灭绝的动物，所以可用于实验的动物数量非常受限。因此，在大部分被测抗体药物的开发中，黑猩猩中的这种临床前试验被排除。
第二种方法是：使临床前试验中使用的分子适应该试验中使用的动物。在该方法中，由于是对试验动物给药，所以通过构建所谓的“代理(surrogate，替代)”抗体，在临床前试验中获得必须的安全性信息。通常，这种代理抗体是非代理抗体，即被修饰成特异性识别人中的实际的被测抗体药物所结合的靶分子的试验动物的直向同源物、而且与该直向同源物结合的抗体。因此，在使用这种“代理”抗体的方法中，分别开发两个不同的分子、即被测临床药物和该被测临床药物的靶向特异性所对应的、用于动物种的临床前试验的被测临床前药物，必须研究其安全性等。这种代理方法的最大缺点在于：用于临床前试验的代理抗体是被测临床抗体药物的修饰物。因此，通过使用了代理抗体的临床前试验得到的数据常常无法直接应用于人。因此，基于采用这些方法的临床前研究的试验结果的临床试验结果的结果预见性有可能降低。
上述方法是使被测药物适应于临床前试验中使用的动物的方法。另一方面，其他公知的方法是使临床前试验中使用的动物适应给予人的候选药物的方法。
使试验动物适应打算给予人的被测抗体药物的一个例子，是生成表达被测抗体药物特异性结合的人分子以代替表达该试验动物种的内源性非人分子的转基因动物。在该方式中，临床前试验中给予的被测抗体药物在该转基因试验动物中与人抗原结合。作为这种例子，在由Bugelski等人进行的研究中，为了预测人患者的类风湿性关节炎的长期治疗，使用人CD4转基因小鼠，进行单克隆抗体凯利昔单抗的临床前安全性评价。凯利昔单抗是对人和黑猩猩的CD4具有特异性的单克隆抗体。Bugelski等人得出以下结论：表达人蛋白的转基因小鼠的使用将提供在受限定的使用具有交叉种特异性的生物药物的黑猩猩中的研究的有效替代方法。但是，为了试验目的而制作转基因动物时，需要大量的劳力，因此耗费时间和成本。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/047723；
非专利文献
非专利文献1：J. Med. Primatol. (1986) 15, 441-451；
非专利文献2：J. Med. Primatol. (2001) 40, 141-147；
非专利文献3：Hum. Exp. Toxicol. (2000) 19, 230-243。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明涉及显示出非人动物和人动物间的种属交叉反应性(cross-speciesreactivity)的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及化学分解得到了抑制的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及等电点降低的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及缔合体量减少的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及包含上述的抗上皮调节蛋白抗体的药物组合物、或癌症治疗药。本发明还涉及上述抗上皮调节蛋白抗体的制备方法。
用于解决课题的方法
本发明人发现：通过将对表达人上皮调节蛋白的癌细胞发挥细胞毒活性和中和活性而抑制癌细胞增殖的人源化EP27抗体的可变区序列中的氨基酸残基取代成精氨酸残基，对从食蟹猴中分离的上皮调节蛋白的结合活性与对人上皮调节蛋白的结合活性之比上升。即，本发明人制作了显示出作为非人动物的食蟹猴和人动物间的种属交叉反应性(cross-species reactivity)的抗上皮调节蛋白抗体。另外，通过适当取代人源化EP27抗体的可变区序列中的氨基酸残基，制作了化学分解得到抑制的抗上皮调节蛋白抗体。而且，通过适当取代人源化EP27抗体的可变区序列中的氨基酸残基，制作了等电点降低的抗上皮调节蛋白抗体。另外，通过适当取代人源化EP27抗体的可变区序列中的氨基酸残基，制作了缔合体量减少的抗上皮调节蛋白抗体。另外，本发明人明确了：具有这些性质的抗上皮调节蛋白抗体对癌细胞株显示出源自细胞毒活性和中和活性的增殖抑制效果。而且，根据以上认知，本发明人发现抗上皮调节蛋白抗体对原发性或转移性的各种癌症的治疗有效，完成了本发明。
更具体而言，本发明涉及以下内容。
[1] 抗上皮调节蛋白抗体，其特征在于：是与包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重链可变区CDR以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的轻链可变区CDR的抗上皮调节蛋白抗体所结合的表位结合的抗体，其中，对SEQ ID NO: 170所表示的猴上皮调节蛋白的KD值(cEREG KD)与对SEQ ID NO: 34所表示的人上皮调节蛋白的KD值(hEREG KD)之比(cEREGKD/hEREG KD)小于包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重链可变区CDR以及SEQ ID NO:12、13和14所表示的轻链可变区CDR的抗上皮调节蛋白抗体的cEREG KD/hEREG KD。
[2] [1]所述的抗体，其中，cEREG KD/hEREG KD小于40。
[3] [1]所述的抗体，其中，cEREG KD/hEREG KD小于10。
[4] [1]所述的抗体，其中，cEREG KD/hEREG KD小于6。
[5] [1]所述的抗体，其中，cEREG KD/hEREG KD小于4。
[6] [1]～[5]中任一项所述的抗体，该抗体包含重链可变区以及轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 9所表示的重链CDR1、选自SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101和100的重链CDR2、以及选自SEQ ID NO:158、154、152、151、112、111、110和11的重链CDR3，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:163、68、67和12的轻链CDR1、选自SEQ ID NO: 71、69和13的轻链CDR2、以及选自SEQ ID NO:164、48、47和14的轻链CDR3。
[7] [1]～[5]中任一项所述的抗体，该抗体包含：选自SEQ ID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116和115的重链可变区、以及选自SEQ ID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57和29的轻链可变区。
[8] 选自以下任一项的抗上皮调节蛋白抗体：
(1) 抗上皮调节蛋白抗体，其包含选自SEQ ID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49和38的重链可变区；
(2) 抗上皮调节蛋白抗体，其包含选自SEQ ID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57和29的轻链可变区；或
(3) 抗上皮调节蛋白抗体，其包含选自SEQ ID NO: 150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49和38的重链可变区、以及选自SEQ ID NO: 141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57和29的轻链可变区。
[9] [6]～[8]中任一项所述的抗体，该抗体包含SEQ ID NO: 26的重链恒定区。
[10] [6]～[9]中任一项所述的抗体，该抗体包含SEQ ID NO: 27的轻链恒定区。
[11] [1]～[10]中任一项所述的抗体，该抗体具有中和活性。
[12] [1]～[11]中任一项所述的抗体，该抗体具有细胞毒活性。
[13] [12]所述的抗体，其中，细胞毒活性为CDC和/或ADCC。
[14] [1]～[12]中任一项所述的抗体，该抗体连接有增殖抑制剂或细胞毒性物质。
[15] [14]所述的抗体，该抗体为低分子抗体。
[16] [12]～[15]中任一项所述的抗体，其中，在SEQ ID NO: 26的重链恒定区中包含选自以EU编号表示的230位、240位、244位、245位、247位、262位、263位、266位、273位、275位、299位、302位、313位、323位、325位、328位和332位的氨基酸的至少一个取代。
[17] 载体，该载体包含编码重链可变区的多核苷酸，所述重链可变区包含：SEQID NO: 9的重链CDR1、选自SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101和100的重链CDR2、以及选自SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110和11的重链CDR3。
[18] [17]所述的载体，该载体包含编码SEQ ID NO: 26的重链恒定区的多核苷酸。
[19] 载体，该载体包含编码轻链可变区的多核苷酸，所述轻链可变区包含：选自SEQ ID NO: 163、68、67和12的轻链CDR1、选自SEQ ID NO: 71、69和13的轻链CDR2、以及选自SEQ ID NO: 164、48、47和14的轻链CDR3。
[20] [19]所述的载体，该载体包含编码SEQ ID NO: 27的轻链恒定区的多核苷酸。
[21] 载体，该载体包含下述的多核苷酸：
(1) 编码重链可变区的多核苷酸，所述重链可变区包含：SEQ ID NO: 9所表示的重链CDR1、选自SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101和100的重链CDR2、以及选自SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110和11的重链CDR3；以及
(2) 编码轻链可变区的多核苷酸，所述轻链可变区包含：选自SEQ ID NO: 163、68、67和12的轻链CDR1、选自SEQ ID NO: 71、69和13的轻链CDR2、以及选自SEQ ID NO:164、48、47和14的轻链CDR3。
[22] 载体，该载体包含下述的多核苷酸：
(1) 编码重链可变区的多核苷酸，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 9所表示的重链CDR1、选自SEQ ID NO: 161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101和100的重链CDR2、以及选自SEQ ID NO: 158、154、152、151、112、111、110和11的重链CDR3；以及编码SEQ ID NO: 26所表示的重链恒定区的多核苷酸；以及
(2) 编码轻链可变区的多核苷酸，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO: 163、68、67和12的轻链CDR1、选自SEQ ID NO: 71、69和13的轻链CDR2、以及选自SEQ ID NO: 164、48、47和14的轻链CDR3；以及编码SEQ ID NO: 27所表示的轻链恒定区的多核苷酸。
[23] [18]或[22]所述的包含多核苷酸的载体，其中，在编码SEQ ID NO: 26所表示的重链恒定区的多核苷酸中，包含编码选自以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位的氨基酸的至少一个取代的突变核苷酸。
[24] 宿主细胞，该宿主细胞包含[17]和[19]所述的载体、[18]和[20]所述的载体、[21]或[22]所述的载体。
[25] 宿主细胞，该宿主细胞包含[23]所述的载体。
[26] [25]所述的宿主细胞，其中，上述宿主细胞为在糖链中添加岩藻糖的能力低的宿主细胞。
[27] [26]所述的宿主细胞，其中，上述在糖链中添加岩藻糖的能力低的宿主细胞为选自岩藻糖基转移酶、岩藻糖转运蛋白、GMD(GDP-甘露糖4,6-脱水酶)、Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖3,5-差向异构酶,4-还原酶)和GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)的功能性蛋白的一种或一种以上缺损的宿主细胞。
[28] [25]所述的宿主细胞，其中，上述宿主细胞为具有在糖链中形成二等分的N-乙酰葡糖胺结构的能力的宿主细胞。
[29] [28]所述的宿主细胞，其中，上述具有在糖链中形成二等分的N-乙酰葡糖胺结构的能力的宿主细胞为具有β(1,4)-半乳糖基转移酶活性、且包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码高尔基体定居多肽的功能性的高尔基体局部化结构域的多核苷酸。
[30] [29]所述的宿主细胞，该宿主细胞为包含载体、并且包含编码含有β(1,4)-半乳糖基转移酶的催化结构域的融合多肽的多核苷酸的宿主细胞，所述载体包含编码选自甘露糖苷酶II的局部化结构域、β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶I的局部化结构域、β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶II的局部化结构域、甘露糖苷酶I的局部化结构域和α1-6核心岩藻糖基转移酶的局部化结构域的功能性的高尔基体局部化结构域的多核苷酸。
[31] [24]～[30]中任一项所述的宿主细胞，其中，宿主细胞为选自CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞或杂交瘤细胞的宿主细胞。
[32] [1]～[16]中任一项所述的抗体的制备方法，该方法包括：从[24]～[31]中任一项所述的宿主细胞的培养液中进行回收。
[33] 抗体，该抗体是通过[32]所述的方法制备的。
[34] [33]所述的抗体，该抗体连接有增殖抑制剂或细胞毒性物质。
[35] 药物组合物，该药物组合物含有[1]～[16]或[33]～[34]中任一项所述的抗体作为有效成分。
[36] 癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂，其中含有[1]～[16]或[33]～[34]中任一项所述的抗体作为有效成分。
[37] [36]所述的癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂，其中，癌症为选自大肠癌、肺腺癌、胰癌、胃癌和肾癌的任一种癌。
[38] [37]所述的癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂，其中，上述大肠癌为低分化大肠癌、中分化大肠癌、高分化大肠癌。
[39] [36]～[38]中任一项所述的癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂，其中，给予上述癌症治疗药的对象为包含在分离的组织样本中检测到的上皮调节蛋白表达的癌细胞的对象。
另外，本发明还涉及抑制细胞增殖的方法、预防或治疗癌症的方法、或抑制癌症的复发或转移的方法，上述方法包括向对象给予本发明的抗体或利用本发明的制备方法制备的抗体的步骤。本发明还涉及本发明的抗体或利用本发明的制备方法制备的抗体在细胞增殖抑制剂、癌症预防药或癌症治疗药、或癌症的复发或转移抑制剂的制备中的应用。本发明还涉及用于在细胞增殖抑制、癌症的预防或治疗、或癌症的复发或转移抑制中使用的本发明的抗体或利用本发明的制备方法制备的抗体。本发明还涉及制备细胞增殖抑制剂、癌症预防药或癌症治疗药、或癌症的复发或转移抑制剂的方法，所述方法包括：使用本发明的抗体或通过本发明的制备方法制备的抗体的步骤。
附图说明
图1是显示各抗体中的对人上皮调节蛋白的亲和比(各抗体的KD值/嵌合抗体EP27的KD值)的图。抗体名称的表征虽然只记载了可变区，但其是包含重链G1d和轻链kappa的恒定区的抗体的试验结果。
图2是显示各抗体中的亲和比(对猴上皮调节蛋白的KD值/对人上皮调节蛋白的KD值)的图。抗体名称的表征虽然只记载了可变区，但其是包含重链G1d和轻链kappa的恒定区的抗体的试验结果。
图3是显示各抗体中的对人上皮调节蛋白的亲和比(各抗体的KD值/嵌合抗体EP27的KD值)的图。
图4是显示各抗体中的亲和比(对猴上皮调节蛋白的KD值/对人上皮调节蛋白的KD值)的图。
图5是显示各抗体的ADCC活性(特异性钙黄绿素AM游离率)的图。
图6是通过人上皮调节蛋白依赖性BAF_EGFR细胞增殖抑制率来显示各抗体的中和活性的图。
图7是通过猴上皮调节蛋白依赖性BAF_EGFR细胞增殖抑制率来显示各抗体的中和活性的图。
图8是通过人癌细胞移植小鼠模型中的抗肿瘤活性来显示各抗体的体内人肿瘤增殖抑制活性的图。
图9是显示人上皮调节蛋白(hsEREG-His)和猴上皮调节蛋白(cysEREG-His)的电泳图形的泳动图像。
图10是显示表达彼此不同量的上皮调节蛋白的细胞的荧光染色和移植了该细胞的小鼠的组织免疫学染色的图。
图11是显示对于表达彼此不同量的上皮调节蛋白的细胞的ADCC活性的图。
图12是通过在移植了表达彼此不同量的上皮调节蛋白的细胞的小鼠模型中的抗肿瘤活性显示体内人肿瘤增殖抑制活性的图。
图13是显示低分化大肠癌的临床病例中的上皮调节蛋白的表达的图。
图14是显示表示对大肠癌的转移的药效的、EP27人源化Glycomab抗体对大肠癌干细胞PLR123的肿瘤发生的药效的图。
图15是显示表示对大肠癌干细胞的转移的药效的、EP27人源化Glycomab抗体对大肠癌干细胞PLR123的肺转移的药效的图。
图16是显示使用低分化大肠癌模型COL-53-JCK的EP27人源化Glycomab抗体对低分化大肠癌的药效的图。
图17是显示使用中分化大肠癌模型PLR379的EP27人源化Glycomab抗体对中分化大肠癌的药效的图。
图18是显示肺腺癌临床病例中的上皮调节蛋白的表达的图。
图19是显示EP27人源化Glycomab抗体对人肺腺癌株Calu-3的ADCC活性(特异性钙黄绿素AM游离率)的图。
图20是显示使用肺腺癌模型Calu-3的EP27人源化Glycomab抗体对肺腺癌的药效的图。
图21是显示包含EP27人源化Glycomab抗体的抗体药物复合体在表达上皮调节蛋白的DLD-1细胞株的细胞内内化，并对DLD-1细胞株产生细胞毒的图。
具体实施方式
本发明涉及显示出非人动物和人动物间的种属交叉反应性(cross-speciesreactivity)的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及化学分解得到了抑制的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及等电点降低的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及缔合体量减少的抗上皮调节蛋白抗体。本发明还涉及包含上述抗上皮调节蛋白抗体的药物组合物或癌症治疗药。本发明还涉及上述抗上皮调节蛋白抗体的制备方法。
以下的定义和详细说明是为了容易理解本说明书中说明的本发明而提供。
定义
氨基酸
本说明书中，以单字母密码或三字母密码或者该两种方式表征氨基酸，例如表示为Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V。需要说明的是，本发明记载的氨基酸序列中所含的氨基酸还存在翻译后进行修饰的情况(例如，N末端的谷氨酰胺的焦谷氨酰化所致的向焦谷氨酸的修饰是本领域技术人员所熟知的修饰)，勿庸赘言，这样氨基酸进行了翻译后修饰的情况也包括在本发明记载的氨基酸序列中。
抗原
本发明提供的抗体与作为抗原的上皮调节蛋白结合。上皮调节蛋白是膜结合型上皮细胞生长因子蛋白。其氨基酸序列公开在GenBank登录号NP_001423(SEQ ID NO: 167)中。本发明中，上皮调节蛋白的定义包括全长蛋白及其片段的双方。片段是指包含上皮调节蛋白的任意区的多肽，可以不具有天然的上皮调节蛋白的功能。作为片段的例子，可以列举包含上皮调节蛋白的胞外区的片段。上皮调节蛋白的胞外区在SEQ ID NO: 167的氨基酸序列中相当于第30-118位。另外，跨膜区在SEQ ID NO: 167的氨基酸序列中相当于第119-140位。另外，本说明书中有时还将上皮调节蛋白称作EREG，它们作为相同意义的用语使用。
表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗上皮调节蛋白抗体中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。另外，也可以通过识别该表位的抗上皮调节蛋白抗体对抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来特定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来特定表位。
线性表位例如象由在氨基酸的一级序列中连续的多个氨基酸组成的表位那样，是由氨基酸的一级序列识别的表位。就线性表位而言，在固有序列中代表性的是含有至少3个氨基酸、以及最普通的是含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个氨基酸。
与线性表位对比，立体结构表位是下述的表位，即，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别的表位的单一规定成分的表位(例如，氨基酸的一级序列未必是被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位也许包含较大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，蛋白分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链形成并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法例如包括：X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并不限于这些。例如，参照Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology(1996), 第66卷, Morris(编)。
结合活性
下述例示了通过抗体来确认对上皮调节蛋白、即上皮调节蛋白分子中存在的表位的结合的方法，但并不限于下述方法，本领域技术人员可以适当采用测定抗体对抗原的结合活性的公知方法。
例如，抗上皮调节蛋白抗体是否识别存在于上皮调节蛋白分子中的线性表位，可以通过如下所示的操作来确认。为了上述目的，合成了由构成上皮调节蛋白的细胞外结构域的氨基酸序列组成的线性肽。该肽可进行化学合成。或者，可以利用编码上皮调节蛋白的DNA(例如，cDNA序列的例子可以列举CR541887(SEQ ID NO: 169)等，而mRNA序列的例子可以列举NM_001432等)中编码相当于细胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接下来，对由构成细胞外结构域的氨基酸序列组成的线性肽与抗上皮调节蛋白抗体的结合活性进行评价。例如，通过以固定化的线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗体对该肽的结合活性。或者，基于该抗体对上皮调节蛋白表达细胞的结合中的、线性肽所产生的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗体对线性肽的结合活性。
另外，抗上皮调节蛋白抗体是否识别立体结构表位，这可以通过如下操作来确认。为了上述目的，制备了表达上皮调节蛋白的细胞。可以列举：抗上皮调节蛋白抗体与上皮调节蛋白表达细胞接触时，强烈地与该细胞结合，但该抗体与固定化的由构成上皮调节蛋白的细胞外结构域的氨基酸序列组成的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人上皮调节蛋白表达细胞的结合活性的80%以下、通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的结合活性。
作为测定抗上皮调节蛋白抗体对上皮调节蛋白表达细胞的结合活性的方法，例如可以列举Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow, David Lane, ColdSpring Harbor Laboratory(1988) 359-420)。即，可以根据以上皮调节蛋白表达细胞为抗原的ELISA或FACS(荧光活化细胞分选技术，fluorescence activated cell sorting)的原理进行评价。
在ELISA形式中，抗上皮调节蛋白抗体对上皮调节蛋白表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测抗体添加至固定有上皮调节蛋白表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗体的酶标记抗体，检测与细胞结合的被测抗体。或者在FACS中，制作被测抗体的稀释系列，确定对上皮调节蛋白表达细胞的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗体对上皮调节蛋白表达细胞的结合活性。
被测抗体与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪来检测。作为流式细胞仪，例如已知如下的装置：
FACSCantoTM II；
FACSAriaTM；
FACSArrayTM；
FACSVantageTM SE；
FACSCaliburTM (均为BD Biosciences公司的商品名)；
EPICS ALTRA HyPerSort；
Cytomics FC 500；
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC；
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)。
例如，作为抗上皮调节蛋白抗体对上皮调节蛋白的结合活性的优选测定方法之一例，可以列举以下方法。首先，使被测抗体与表达上皮调节蛋白的细胞反应，再用识别该被测抗体的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗体用适合的缓冲液适当稀释，由此将该抗上皮调节蛋白抗体制备成所期望的浓度来使用。例如，能够以10 μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接下来，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体与该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST软件(BD公司)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗体的结合量表示的被测抗体的结合活性。
抗上皮调节蛋白抗体是否与某抗体共有表位，可以通过两者对相同表位的竞争来确认。抗体间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。
具体而言，在交叉阻断试验中，包被于微量滴定板的孔上的上皮调节蛋白在候选竞争抗体的存在下或不存在下经孵育后，添加被测抗体。与孔中的上皮调节蛋白结合的被测抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗体的结合能力间接相关。即，竞争抗体对相同表位的亲和性越大，则被测抗体对包被了上皮调节蛋白的孔的结合活性越降低。
经由上皮调节蛋白而与孔结合的被测抗体的量可以通过预先标记抗体来容易地测定。例如，经生物素标记的抗体通过使用亲和素过氧化酶缀合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗体能够用可检测或可测定的其它标志物质进行标记。具体而言，公知的是放射标记或荧光标记等。
与在候选竞争抗体的不存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗体只要可以阻断至少20%、优选至少20-50%、进一步优选至少50%的抗体对上皮调节蛋白的结合，则该被测抗体是与竞争抗体实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同表位的抗体。
在鉴定抗上皮调节蛋白抗体所结合的表位的结构时，被测抗体与对照抗体是否共有表位，可以通过比较两抗体对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
作为这种测定结合活性的方法，例如，在上述ELISA形式中，可通过比较被测抗体和对照抗体对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗体和对照抗体流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗体进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式吸附于柱的方法是公知的。
另外，所鉴定的表位为立体表位时，被测抗体与对照抗体是否共有表位，例如可通过以下方法来评价。首先，制备表达上皮调节蛋白的细胞和表达在表位中导入了突变的上皮调节蛋白的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液中添加被测抗体和对照抗体。接着，用合适的缓冲液清洗，向所得细胞悬浮液中添加能够识别被测抗体和对照抗体的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)来测定。被测抗体和对照抗体的浓度通过适合的缓冲液适当稀释，由此可以制备成所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml～10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为通过使用CELL QUEST软件(BD公司)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗体和对照抗体的结合活性。
在本方法中，例如“实质上不与突变上皮调节蛋白表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变上皮调节蛋白的细胞结合的被测抗体和对照抗体。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用FACSCalibur作为流式细胞仪时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST软件进行分析。由抗体存在下和不存在下的几何平均值，根据以下算式(式1)算出该比较值(ΔGeo-Mean)，由此可以求出由于抗体的结合而导致的荧光强度的增加比例。
(式1)
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(抗体存在下)/Geo-Mean(抗体不存在下)
将通过分析得到的、反映被测抗体对突变上皮调节蛋白表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变上皮调节蛋白分子ΔGeo-Mean值)与反映被测抗体对上皮调节蛋白表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算对突变上皮调节蛋白表达细胞和上皮调节蛋白表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗体的浓度特别优选制备成彼此相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别上皮调节蛋白中的表位的抗体被用作对照抗体。
被测抗体对突变上皮调节蛋白表达细胞的ΔGeo-Mean比较值只要小于被测抗体对上皮调节蛋白表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80%、优选50%、进一步优选30%、特别优选15%，则认为“实质上不与突变上皮调节蛋白表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(几何平均)的算式记载于CELL QUEST软件用户指南(BD biosciences公司)。通过将比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价为被测抗上皮调节蛋白抗体与对照抗上皮调节蛋白抗体的表位相同。
抗体
本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制备的免疫球蛋白。抗体可从其天然存在的血浆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离，或者通过使用基因重组等方法部分或完全地合成。作为抗体的实例，优选列举免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚型。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可包含这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
制作具有所期望的结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示制作与上皮调节蛋白结合的抗体(抗上皮调节蛋白抗体)的非限定性的一种方法。
抗上皮调节蛋白抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗上皮调节蛋白抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。需要说明的是，本申请发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”或“嵌合抗体”。
产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下制作。即，使用上皮调节蛋白作为致敏抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，使所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选与上皮调节蛋白分子中的表位结合的单克隆抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗上皮调节蛋白抗体的杂交瘤。
具体而言，单克隆抗体的制作例如如下进行。首先，通过表达在SEQ ID NO: 169中其核苷酸序列被公开的人上皮调节蛋白基因，可得到SEQ ID NO: 167所表示的人上皮调节蛋白，其被用作抗体获取的致敏抗原。即，将编码人上皮调节蛋白的基因序列***公知的表达载体中，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中纯化所期望的人上皮调节蛋白。另外，为了从培养上清中获得可溶型人上皮调节蛋白，例如使SEQ ID NO: 167所表示的人上皮调节蛋白多肽序列中包含第30～118位氨基酸的多肽或第30～108位氨基酸中所含的SEQ ID NO: 34所表示的蛋白表达。另外，纯化的天然人上皮调节蛋白也同样可用作致敏抗原。
作为用于免疫哺乳动物的致敏抗原，可使用该纯化上皮调节蛋白。上皮调节蛋白的部分肽也可以用作致敏抗原。此时，该部分肽也可以根据人上皮调节蛋白的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将一部分人上皮调节蛋白基因***表达载体中使其表达来获得。进而，还可以使用蛋白分解酶分解上皮调节蛋白来获得，但用作部分肽的上皮调节蛋白肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。关于优选的区域，可以从SEQ ID NO:167所表示的氨基酸序列中相当于第30～118位或第30～108位的氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为致敏抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体而言，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作致敏抗原。
另外，也可以将上皮调节蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作致敏抗原。为了制备用作致敏抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或更多的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如上所述地***表达载体中。融合蛋白的制作方法记载于Molecular Cloning 第2版. (Sambrook, J等人, Molecular Cloning 第2版,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab. press)。用作致敏抗原的上皮调节蛋白的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于WO2008/047723等中。
作为用该致敏抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。
按照公知的方法将上述动物用致敏抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过注射将致敏抗原给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体而言，将用PBS(磷酸缓冲盐水(Phosphate-Buffered Saline))或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的致敏抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该致敏抗原对哺乳动物每4至21日给予数次。另外，致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作致敏抗原时，有时希望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白结合的该致敏抗原肽进行免疫。
另外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用DNA免疫，如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，致敏抗原在该免疫动物的生物体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下的优越性：
-能够维持象上皮调节蛋白这样的膜蛋白的结构以赋予免疫刺激；
-无需纯化免疫抗原。
为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达上皮调节蛋白的DNA。编码上皮调节蛋白的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA***适当的表达载体中，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予生物体的方法，可采用通常使用的方法。例如，将吸附了表达载体的金颗粒用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别上皮调节蛋白的抗体的制作也可以采用国际公开WO2003/104453中记载的方法来制作。
如此地将哺乳动物免疫，确认血清中与上皮调节蛋白结合的抗体效价上升后，从哺乳动物体内采集免疫细胞用于细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指能够(或者不能)在特定培养条件下存活的形态。选择标志物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会增殖。
HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞各自可通过含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5’-溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中***有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法***这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称作G418抗性的选择标志物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
作为这类骨髓瘤细胞，例如可优选使用：P3(P3×63Ag8.653) (J. Immunol.(1979)123 (4), 1548-1550)、P3×63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology (1978)81, 1-7)、NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519)、MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415)、SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270)、FO(J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J. Exp.Med. (1978) 148 (1), 313-323)、R210(Nature (1979) 277 (5692), 131-133)等。
基本上，根据公知的方法，例如Kohler和Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73, 3-46)等，进行上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体而言，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了进一步提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂后使用。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞达到1至10倍。作为用于上述细胞融合的培养液，使用例如适于上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
关于细胞融合，将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量为1000至6000左右)通常以30至60%(w/v)的浓度添加。通过缓缓地混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
如此操作得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
如此操作得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标志物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体而言，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释法实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与上皮调节蛋白结合的单克隆抗体可与在细胞表面表达的上皮调节蛋白结合。这种单克隆抗体例如可以通过FACS(荧光活化细胞分选技术，fluorescence activatedcell sorting)来筛选。FACS是指，利用激光分析与荧光抗体接触的细胞，测定各细胞所发出的荧光，从而可以测定抗体与细胞表面的结合的***。
为了通过FACS来筛选产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤，首先，制备表达上皮调节蛋白的细胞。用于筛选的优选的细胞为强制表达上皮调节蛋白的哺乳动物细胞。通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞作为对照，能够选择性地检测抗体对细胞表面的上皮调节蛋白的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与上皮调节蛋白强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，能够获得产生上皮调节蛋白单克隆抗体的杂交瘤。
或者，可以根据ELISA的原理评价抗体对固定化的上皮调节蛋白表达细胞的结合活性。例如，将上皮调节蛋白表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定化细胞接触，检测与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体来检测。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释法等进行克隆。
如此操作而制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中继代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体。
也可以优选使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因***适当的载体中，再导入宿主中，由此表达由该基因编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等人确立(Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775)。另外，如下所述重组抗体的制备方法也是公知的。
例如，由产生抗上皮调节蛋白抗体的杂交瘤细胞获得编码抗上皮调节蛋白抗体可变区(V区)的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方法，例如可使用如下所述的方法。
-胍超离心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)；
-AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)。
所提取的mRNA可使用mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bioscience制)等进行纯化。或者，还有象QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bioscience制)等用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒在出售。使用这种试剂盒，可由杂交瘤获得mRNA。使用逆转录酶，可由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生化学工业)等合成。另外，为了cDNA的合成和扩增，可以适当采用使用了SMART RACEcDNA 扩增试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)85 (23), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
由所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择集落后，可以由形成该集落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，关于该重组载体是否具有目标cDNA的核苷酸序列，可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’-RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，以从杂交瘤细胞中提取的RNA为模板合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。在5’-RACE cDNA文库的合成中可适当使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
以所得的5’-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。根据公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的核苷酸序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。
具体而言，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常3’侧的引物使用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5’侧的引物则使用5’ RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
使用如此扩增了的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将重构了的免疫球蛋白对上皮调节蛋白的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。为了获得抗上皮调节蛋白的抗体时，进一步优选抗体对上皮调节蛋白的结合是特异性的。与上皮调节蛋白结合的抗体例如可如下进行筛选：
步骤(1)，使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与上皮调节蛋白表达细胞接触；
步骤(2)，检测上皮调节蛋白表达细胞与抗体的结合；以及
步骤(3)，选择与上皮调节蛋白表达细胞结合的抗体。
检测抗体与上皮调节蛋白表达细胞的结合的方法是公知的。具体而言，通过之前所述的FACS等方法，可检测出抗体与上皮调节蛋白表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适当利用上皮调节蛋白表达细胞的固定标本。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还优选采用淘选法，其利用了噬菌体载体。由多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因***噬菌体载体中，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望的结合活性的scFv。
得到目标的编码抗上皮调节蛋白抗体V区的cDNA后，该cDNA被识别***该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的核苷酸序列中出现的频率低的核苷酸序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向***载体中，优选***能提供粘性末端的限制酶。将如上消化的编码抗上皮调节蛋白抗体V区的cDNA***适当的表达载体中，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因和编码上述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中***上述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如，可在保持有编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧适当配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，而构建嵌合抗体表达载体。
为了制备与上皮调节蛋白结合的单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因***表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子或启动子。另外，可以在氨基末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 168)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。所表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗上皮调节蛋白抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别***其他的表达载体中。通过用***有H链和L链的载体共转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，将编码H链和L链的DNA***单一表达载体中，从而可以转化宿主细胞(参照国际公开第WO1994/011523)。
用于将分离的抗体基因导入适当的宿主中来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达***均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适当使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，动物细胞可例示下述细胞。
(1) 哺乳动物细胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero、HEK(人胚肾)293等；
(2) 两栖动物细胞：非洲爪蟾***等；
(3) 昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达***。在植物细胞的转化中，可以适当使用进行了愈伤组织培养的细胞。
进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞：
-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属；
-丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属。
另外，利用原核细胞的抗体基因表达***也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适当利用大肠杆菌(E. coli )、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，能够由该转化细胞的培养物获得所期望抗体。
除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以由导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内***编码乳汁中固有产生的蛋白的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有***了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，再将该注入了的胚胎导入母山羊体内。由接受了胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白形成的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702)。
对人给予本说明书中记载的抗上皮调节蛋白抗体时，作为该抗体中的抗原结合结构域，可以适当采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，所述基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化(humanized)抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适当制备。
为了制作本说明书中记载的抗上皮调节蛋白抗体的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由被4个构架区(FR)夹持的3个互补性决定区(complementarity-determining region; CDR)构成。CDR实质上是决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便在具有不同结合特异性的抗体之间也往往显示出高度的同源性。因此，认为通常可以通过CDR的移植将某抗体的结合特异性移植到其它抗体中。
人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的核苷酸序列。针对4个FR分别准备引物。通常，关于将小鼠CDR移植至人FR，认为选择与小鼠FR的同源性高的人FR在维持CDR功能方面有利。即，通常优选使用下述人FR，其由与待移植小鼠CDR相邻的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列组成。
另外，连接的核苷酸序列被设计成彼此框内连接。通过各引物单独地合成人FR。其结果，得到在各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的核苷酸序列被设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠CDR序列来连接。
最终3个CDR和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5’末端和3’末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上得到的DNA和编码人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式***表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开第WO1996/002576)。
通过定性或者定量地测定并评价如上制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以优选选择人抗体FR，以便经由CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适的抗原结合位点的方式取代FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分核苷酸序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了核苷酸序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸取代的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望的性质的突变FR序列(Cancer Res., (1993) 53, 851-856)。
此外，将具有人抗体基因的全部的所有组成成分(repertoire)的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，通过DNA免疫可以获得所期望的人抗体。
进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，***适当的表达载体中，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适当的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，从而可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
另外，作为获得抗体基因的方法，除上述方法外，还可适当使用如Bernasconi等人(Science (2002) 298, 2199-2202)或WO2008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。
EU编号和Kabat编号
根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute ofHealth, Bethesda, Md., 1987年和1991年)。本说明书中，抗上皮调节蛋白抗体的可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。
氨基酸的修饰
为了修饰抗体的氨基酸序列中的氨基酸，可以适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。另外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸修饰方法，还可以采用多种公知的方法(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例如，还优选采用无细胞翻译***(Clover Direct (Protein Express))等，该***在作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA中包含结合有非天然氨基酸的tRNA。
本说明书中，表示氨基酸的修饰位点时使用的“和/或”一词的意义包括“和”与“或”适当组合的所有组合。具体而言，例如“33位、55位和/或96位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸修饰的变异：
(a) 33位、(b) 55位、(c) 96位、(d) 33位和55位、(e) 33位和96位、(f) 55位和96位、(g) 33位和55位和96位。
免疫原性的降低
本发明的抗体优选在人宿主中预测的免疫原性降低。
“低免疫原性”是指，在为达到治疗效果的充足时间内，由于抗体给药的持续效果降低而给予充足量抗体的个体的至少超过半数中，抗体没有引起抗体反应。
人的免疫原性水平可以利用MHC类II结合预测程序Propred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred)，使用所有的对立基因的1%阈值分析进行预测。可以使用的其他程序包括：
-Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)；
-Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com)。
与初期的供体分子相比，免疫原性降低的分子虽然不包括预测为与在靶集团中高度表达的MHC纲II对立基因结合的肽，但该肽的数量减少(Flower等人(Drug Discov.Today (2004) 9(2), 82-90))。
MHC纲II结合的功能分析可以通过生成该蛋白所对应的重复的肽、且对引起T细胞活化的这些能力进行试验(T细胞增殖分析)、或者取代作为报道肽的已知的MHC纲II结合肽来实施(Hammer等人(J. Exp. Med. (1994) 180, 2353-2358))。
为了降低本发明的抗上皮调节蛋白抗体的免疫原性，可以采用几种方法。第一种方法是进行上述抗体的人源化的方法。更具体而言，将从人以外的动物例如小鼠中分离的抗上皮调节蛋白抗体的CDR移植到人抗体中。为了维持或增强与上皮调节蛋白的结合，可以追加取代FR的氨基酸残基，使人源化抗上皮调节蛋白抗体的CDR形成适合的抗原结合位点。
作为本发明的从小鼠中分离的抗上皮调节蛋白抗体的CDR的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 9所表示的重链CDR1(HCDR1)、SEQ ID NO: 10所表示的重链CDR2(HCDR2)和SEQ ID NO: 11所表示的重链CDR3(HCDR3)。另外，作为本发明的从小鼠中分离的抗上皮调节蛋白抗体的CDR的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 12所表示的轻链CDR1(LCDR1)、SEQ ID NO: 13所表示的轻链CDR2(LCDR2)和SEQ ID NO: 14所表示的轻链CDR3(LCDR3)。
作为本发明的人抗体FR的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 1所表示的重链FR1(HFR1)、SEQ ID NO: 2所表示的重链FR2(HFR2)、SEQ ID NO: 3所表示的重链FR3(HFR3)和SEQ ID NO: 4所表示的重链FR4(HFR4)。另外，作为本发明的人抗体FR的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 5所表示的轻链FR1(LFR1)、SEQ ID NO: 6所表示的轻链FR2(LFR2)、SEQ ID NO: 7所表示的轻链FR3(LFR3)和SEQ ID NO: 8所表示的轻链FR4(LFR4)。
作为本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体可变区的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 15所表示的重链可变区。另外，作为本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体可变区的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 16所表示的轻链可变区。
另外，作为本发明的人抗体FR的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 17所表示的重链FR1(HFR1)、或SEQ ID NO: 18所表示的重链FR3(HFR3)。另外，作为本发明的人抗体FR的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 20所表示的轻链FR2(LFR2)、SEQ ID NO:21所表示的轻链FR3(LFR3)或SEQ ID NO: 23所表示的轻链FR3(LFR3)。
作为本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体可变区的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 19所表示的重链可变区。另外，作为本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体可变区的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24所表示的轻链可变区。
另外，作为本发明的人源化抗体FR的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 35所表示的重链FR3(HFR3)、或SEQ ID NO: 36所表示的重链FR3(HFR3)。作为本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的可变区的一个非限定性方案，可以列举SEQ ID NO: 37或SEQ IDNO: 38所表示的重链可变区。
第二种方法是：利用上述的MHC纲II结合预测程序分析抗上皮调节蛋白抗体的氨基酸序列中的氨基酸已修饰了的修饰序列，设计免疫原性减弱的修饰序列的方法。作为为了减弱本发明的抗上皮调节蛋白抗体的免疫原性而修饰氨基酸的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的87位和/或101位的氨基酸。另外，作为为了减弱抗上皮调节蛋白抗体的免疫原性而修饰氨基酸的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮调节蛋白抗体的轻链序列中以Kabat编号表示的24位的氨基酸。
作为上述的氨基酸取代的一个非限定性方案，优选列举SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的87位的氨基酸取代成Ser(S)、和/或101位的氨基酸取代成Tyr(Y)或Phe(F)。另外，作为上述的氨基酸取代的一个非限定性方案，优选列举SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮调节蛋白抗体的轻链序列中以Kabat编号表示的24位的氨基酸取代成Arg(R)。
第三种方法是：例如，在设计包含IgG1抗体恒定区的抗上皮调节蛋白抗体时，适当选择选自作为IgG1的同种异型的G1m3型(在SEQ ID NO: 31所表示的序列的C末端添加了GK的序列)、G1m17,1型(SEQ ID NO: 26)或G1m17型(在SEQ ID NO: 30所表示的序列的C末端添加了GK的序列)的同种异型的恒定区的方法。已知被给予抗体药物的人生物种的同种异型与该抗体药物的同种异型的适应性会影响到该生物种的免疫应答(Genes and Immunity(2011) 12, 213-221)。
作为免疫原性降低的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的重链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链。另外，作为本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的轻链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 29、57、58、80-85、99、128-130、136和141的轻链。
作为免疫原性降低的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，可以列举包含选自SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链以及选自SEQ ID NO: 29、57、58、80-85、99、128-130、136和141的轻链的人源化抗上皮调节蛋白抗体。
脱酰胺化、异构化、水解的抑制
本发明的抗上皮调节蛋白抗体，优选其脱酰胺化、异构化、水解得到抑制。
控制蛋白药物的缔合体量在质量管理上、以及在考虑对药效和免疫原性的影响时是非常重要的(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714)。通常缔合化对起因于蛋白溶液环境的胶体稳定性(colloidal stability)和起因于蛋白结构的构象稳定性(conformational stability，立体配置稳定性)两者均有影响(J. Phar.m Sci. (2010)100 (4), 1306-1315)。通过研究抗体制剂的配方，筛选抗体浓度或pH、缓冲液种类、离子强度、添加剂等，从而可以得到对胶体稳定性有效的条件。另一方面，构象稳定性还有依赖于氨基酸序列的部分，当为抗体时，重要的是维持CDR的规范结构或FR的共有序列、VH/VL界面等的特征性结构(Jung等人(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716)、Xiang等人(J.Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390)、Ewert等人(Methods. (2004) 34 (2), 184-199)、Vargas-Madrazo等人(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120)和Morea等人(J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294)。
脱酰胺化反应是指，在天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链中非酶性地发生，使得存在于天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链的酰胺转变成羧酸的反应。另外，异构化的原因在于：位于天冬酰胺和天冬氨酸的侧链的羰基被位于C末端侧的残基的氮原子电子对攻击，其结果，通过天冬酰胺的脱酰胺化或天冬氨酸的脱水形成不稳定的环状酰亚胺中间体。该中间体通过开裂，大部分变成异天冬氨酸，剩余部分变成天冬氨酸。当为谷氨酰胺时，脱酰胺化速度通常是天冬酰胺时的十分之一，但其机理在本质上是相同的，进行中只需要水分子。在这些抗体等的蛋白的保存中发生的脱酰胺化、异构化反应成为上述异质性的原因，所以希望尽可能地得到抑制。另外，据报道，脱酰胺化反应特别容易在天冬酰胺和甘氨酸邻接的位点(Asn-Gly)发生(Geiger等人(J. Biol. Chem. (1987) 262, 785-794)。而且，还有报道称：天冬氨酸通过水解反应发生肽链的断裂，特别是C末端侧存在脯氨酸的序列(Asp-Pro)容易发生酸性条件下的分解(Segalas等人(FEBS Letters (1995) 371, 171-175))。
为了抑制脱酰胺化、异构化和水解，可以适当实施除去作为接受脱酰胺化的位点的谷氨酰残基和天冬氨酰残基的氨基酸的修饰等。作为除去是特别有效的脱酰胺化位点的一个非限定性方案，优选列举脱酰胺化反应得到促进的位点、即以NG和QG序列的形式表示的模体中的甘氨酸残基、天冬酰胺残基或谷氨酰胺残基。其中任意一个氨基酸残基(N、Q或G)的取代均可显著抑制脱酰胺化反应(WO2003/057881或WO2005/067620等)。另外，通过调整产生抗体的细胞的培养方法，还可适当采用用于制备脱酰胺化反应得到了抑制的抗体的方法。作为由本发明提供的抗上皮调节蛋白抗体，还包括应用了抑制上述脱酰胺化反应的技术的抗上皮调节蛋白抗体。
作为接受脱酰胺化的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的31位、52位、54位、56位和/或101位的氨基酸。另外，作为接受脱酰胺化的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮调节蛋白抗体的轻链序列中以Kabat编号表示的28位、92位和/或93位的氨基酸。
作为上述的氨基酸取代的一个非限定性方案，优选列举：SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的31位的氨基酸取代成Ala(A)、和/或55位的氨基酸取代成Thr(T)、Lys(K)、Phe(F)、Val(V)、Arg(R)或Leu(L)。另外，作为上述的氨基酸取代的一个非限定性方案，优选列举SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮调节蛋白抗体的轻链序列中以Kabat编号表示的92位的氨基酸取代成Glu(E)、和/或93位的氨基酸取代成Arg(R)或Gln(Q)。
作为脱酰胺化、异构化、水解得到了抑制的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的重链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 49-56、98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链。另外，作为脱酰胺化、异构化、水解得到了抑制的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的轻链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 57、58、128和141的轻链。
作为脱酰胺化、异构化、水解得到了抑制的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，可以列举包含选自SEQ ID NO: 49-56、98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链和选自SEQ ID NO: 57、58、128和141的轻链的人源化抗上皮调节蛋白抗体。
等电点的改变
本发明的抗上皮调节蛋白抗体，优选其等电点被改变。作为控制抗体的血浆中半衰期的方法之一，已知有修饰暴露于抗体分子表面的氨基酸残基、并控制抗体分子表面电荷的方法(WO2007/114319和WO2009/041543)。具体而言，已知通过降低抗体所具有的等电点(pI)的值，可以延长抗体的血浆中半衰期。与此相反，已知通过升高抗体的等电点，可以缩短血浆中半衰期，抗体的组织转移性提高(Vaisitti等人(J. Biol. Regul. Homeost.Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112)、Pardridge等人(J. Pharmacol. Exp. Ther.(1998) 286 (1), 548-554))。另一方面，还已知其等电点降低的修饰抗体的抗肿瘤效果与修饰前的抗体相比增强(WO2009/041062)。
抗体等的蛋白的pI作为多肽带有实效电荷的pH来定义。在该领域中，代表性的是，当该溶液的pH与蛋白的等电点(pI)相等时，可知蛋白溶解性最低。因此，根据其pI，可以评价在所处的pH、例如在pH6下的蛋白溶解性。蛋白的pI还是液体制剂中的蛋白粘性优异的指标。高pI显示出高溶解性和低粘性(当为高浓度制剂时特别重要)。在本发明的一个非限定性方案中，选择具有高于预先确定的阈值的pI的候选结构域。抗体的pI在抗体的生物体分布或药效方面也发挥特定的作用。例如，还可知：若抗体的pI变高，则其细胞内和/或脉管外局部化增大。为了达到所期望的目的，需要确定哪种pI特性是特定抗体最期望的。在几个实施方式中，可以获得pI值为约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0以上的抗体。在另一个非限定性方案中，可以选择pI值为约9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5或不足5.0的抗体。本领域技术人员会理解单一的蛋白能够具有多种电荷形态。虽然不受特定理论的束缚，但蛋白的电荷根据各种各样的作用机制而改变，对这种机制没有限定，可以列举氨基酸取代、阳离子化、脱氨基、羧基-末端氨基酸不均质性、磷酸化和糖基化等。本说明书中使用的pI作为主要电荷形态的pI被定义。
蛋白的pI可以通过各种方法来确定，对这样的方法没有限定，作为一个非限定性方案，可以列举等电点电泳和各种计算机算法(例如参照Bjellqvist等人(Electrophoresis (1993) 14, 1023)。在一个非限定性方案中，使用具备多温度(multitemp)三冷却浴再循环单元和EPS 3501 XL电源的Pharmacia Biotech Multiphor 2电泳装置来确定。Pre-cast Ampholine Gel(Amersham Biosciences、pI范围：2.5～10)与5μg蛋白同时供给。使用广泛的pI标志物标准(Amersham、pI范围：3～10、8μL)确定抗体的相对pI。在1,500V、50mA的条件下进行105分钟的电泳。接着，使用用纯净水稀释至1×的Sigma固定溶液(5×)将凝胶固定。使用Simply Blue染料(Invitrogen)，在室温下将该凝胶染色一夜。使用由25%乙醇、8%乙酸和67%纯净水组成的溶液将该凝胶脱染。使用Bio-Rad密度计，根据标准校正曲线来确定等电点。
为了改变本发明的抗上皮调节蛋白抗体的等电点，可适当实施下述的氨基酸修饰等：除去抗上皮调节蛋白抗体的氨基酸序列中带电荷的氨基酸、或者在抗上皮调节蛋白抗体的氨基酸序列中添加或***带电荷的氨基酸。已知在氨基酸中存在带电荷的氨基酸。通常，作为带正电荷的氨基酸(正电荷氨基酸)，已知有赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。作为带负电荷的氨基酸(负电荷氨基酸)，已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。除这些以外的氨基酸则作为不带电荷的氨基酸而已知。
作为上述“修饰了的氨基酸残基”，优选从以下的(a)或(b)任一组所含的氨基酸残基的添加、***或除去中适当选择，但并不特别限于这些氨基酸。
(a) 谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(b) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
需要说明的是，在原始(修饰前的)氨基酸残基已经带有电荷的情况下，将其修饰成不带有电荷的氨基酸残基，这也是本发明的优选方案之一。即，作为本发明中的修饰，可以列举：(1)由带有电荷的氨基酸取代成不带电荷的氨基酸、(2)由带有电荷的氨基酸取代成与该氨基酸带有相反电荷的氨基酸、(3)由不带有电荷的氨基酸取代成带有电荷的氨基酸。
作为为了改变本发明的抗上皮调节蛋白抗体的等电点而修饰氨基酸的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的13位、61位、62位、64位、65位、97位和/或98位的氨基酸。另外，作为为了改变抗上皮调节蛋白抗体的等电点而修饰氨基酸的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO:29所表示的抗上皮调节蛋白抗体的轻链序列中以Kabat编号表示的24位、55位、56位和/或107位的氨基酸。
作为上述氨基酸取代的一个非限定性方案，优选列举：SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的14位的氨基酸取代成Asn(N)或Lys(K)、61位的氨基酸取代成Asp(D)或Glu(E)、62位的氨基酸取代成Ser(S)或Gln(Q)、64位的氨基酸取代成Asp(D)或Glu(E)、65位的氨基酸取代成Asp(D)或Glu(E)、97位的氨基酸取代成Arg(R)、和/或98位的氨基酸取代成Glu(E)。另外，作为上述氨基酸取代的一个非限定性方案，优选列举SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮调节蛋白抗体的轻链序列中以Kabat编号表示的24位的氨基酸取代成Gln(Q)或Ser(S)、55位的氨基酸取代成Glu(E)、56位的氨基酸取代成Glu(E)、和/或106a位的氨基酸取代成Glu(E)。
作为等电点已改变的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的重链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 72-79、98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链。另外，作为等电点已改变的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的轻链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 80-85和99的轻链。
作为等电点已改变的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，可以列举：包含选自SEQ ID NO: 72-79、98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链以及选自SEQ ID NO: 80-85和99的轻链的抗上皮调节蛋白抗体。
稳定性的改善
本发明的抗上皮调节蛋白抗体，优选其稳定性得到改善。作为表示抗体稳定性的一个以上的参数，可以列举结构域的热熔解温度(Tm)值。抗体的Tm值能作为抗体的热稳定性优异的指标，而且还能成为抗体的保管期间的指标。Tm值越低，则显示越形成缔合体/稳定性越低；相对于此，Tm值越高，则显示越不形成缔合体/稳定性越高。因此，优选提供Tm值高的抗体。在本发明的一个非限定性方案中，选择具有高于预先确定的阈值的Tm值的抗体。在几个实施方式中，选择具有至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃以上的Tm值的抗体。
抗体的热熔解温度(Tm)可以通过本领域所周知的所有标准方法来测定。例如，Vermeer等人通过差示扫描量热测定(DSC)和圆二色性(CD)光谱学研究了同种型2b的单克隆小鼠抗大鼠IgG的解叠和变性(Biophys. J. (2000) 78, 394-404、Colloids SurfacesA: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150、J. Colloid Interface Sci.(2000) 225, 394-397、2000, Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154)。其结果，认为IgG的折叠和解叠以两个主要的转变为特征，可知这些转变本身也是各种步骤重合的结果。在DSC和CD实验两者中均确认到的双峰分布不被实验中的扫描速度所左右。两个转变是独立的，而解叠是不可逆的。将由该IgG消化的Fab和Fc片段的二级结构和热力学稳定性与完整的免疫球蛋白的这些值进行了比较(Vermeer等人(Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154))。认为在完整的IgG中确认到的两个峰分别分配给了Fab和Fc片段。Vermeer等人还明确了：除了可以通过热诱发IgG的结构的扰动以外，通常还可通过pH的变更(Biophys. J. (2000) 78,394-404)或与疏水性环境的相互作用、例如在Teflon表面的吸附或与表面活性剂的相互作用(Vermeer等人, 1998, Biochim. Biophys. Acta. (1988) 1425, 1-12; ColloidsSurfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150; J.ColloidInterface Sci. 225 (2000) 394-397)诱发IgG的结构的扰动。
在本发明的一个非限定性方案中，使用包含所分离的抗体的样品来测定抗体的Tm值。在一个实施方式中，使用VP-DSC(MicroCal、LLC)，在扫描速度：1.0℃/分钟和温度范围：25～120℃的条件下测定抗体的Tm值。可以采用5分钟的扫描前调温和8秒的滤过时间。在具体例子中，使用Pierce透析杯(3.5kD)，通过用25mM的组氨酸-HCl透析来制备样品。平均抗体浓度为50μg/mL，这可以由280nm的吸光度来确定。使用与装置一起提供的Origin软件，按照制备商的规程确定熔解温度。简单地，通过使多个的基线和缓冲液一同流入样品和对照池两者中，确立热平衡。从样品热解曲线中扣除基线后，对数据进行浓度基准化，使用去褶合(deconvolution)函数使其拟合。在另一实施方式中，抗体的稳定性利用以下方法来评价。一个以上的测定基准还可以包括：表示在选自各种pH值、各种温度、各种剪切应力、和各种冻结/解冻循环的一种以上的各种条件下的抗体稳定性的测定基准。
在本发明的一个非限定性方案中，DSC可以使用Setaram Micro-DSC III(Setaram、Caluire、法国)来测定。相对于包含适当的空白溶液的1mL的对照池，用1mL的样品池在量热计中配置样品。将池在量热计内于25℃下稳定4小时后，以所选择的加热速度将该池加热至最终温度。使用Setaram软件(Setaram、1.3版)，能够确定转移温度和焓。
在本发明的一个非限定性方案中，使用圆二色性(CD)光谱学能够获得热变性/再生曲线。可以通过CD光谱学研究温度和/或例如作为pH函数的IgG的二级结构的变化(Fasman等人(Circular Dichroism and the Conformational Analysis ofBiomolecules. (1996) Plenum Press))。根据de Jongh等人，该方法的优点在于：分光信号不受周围溶液的存在的影响；以及采用明确的规程，根据各种结构元素(structureelement)的基准光谱可以阐明二级结构(Biochemistry (1994) 33, 14521-14528)。二级结构元素的组分可由CD光谱获得。
在本发明的一个非限定性方案中，可以使用JASCO分光偏光计、J-715模式(JASCOInternational Co.)进行测定。可以使用光路长为0.1cm的石英比色皿。温度调节可以使用JASCO PTC-348WI(JASCO International)热电偶来进行。使用分解能为0.2℃和时间常数为16秒的Peltier热电偶，记录温度扫描。在远紫外线区(0.2nm分解能)的波长扫描可以通过蓄积具有适合的扫描速度的多个扫描来获得。
热变性/再生曲线还可以通过分光法来测定。若溶液中的蛋白对加热产生应答而变性，则分子凝聚，溶液会散射更强光。由于通过凝聚会使样品的光学透明性发生变化，所以通过监测规定波长的可见或紫外线吸收的变化，可以测定凝聚。
在本发明的一个非限定性方案中，利用荧光分光学能够获得热变性/再生曲线。在一实施方式中，监测固有蛋白荧光、例如固有色氨酸荧光。在其他实施方式中，监测荧光探针分子。实施荧光分光学实验的方法为本领域技术人员所周知。例如，参照Bashford等人(Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach (1987) 91-114, IRL Press Ltd.)、Bell J.E. (Spectroscopy in Biochemistry (1981) Vol.I,155-194, CRC Press)或Brand等人(Ann. Rev. Biochem. (1972) 41, 843)。
其生物学活性也一样，可以利用基于抗体的物理学和化学结构的、用于评价抗体组合物的稳定性的各种方法。例如，为了研究抗体的变性，除上述分析以外，还可以利用电荷转移吸收、荧光分光法、NMR、rCGE(还原毛细管凝胶电泳)和/或HPSEC(高效尺寸排阻色谱法)等方法(例如Wang等人(J. Parenteral Science & Technology 42 (增刊), S4-S26))。
还原毛细管凝胶电泳和高速尺寸排阻色谱法是用于评价蛋白缔合体或蛋白分解物、以及蛋白片段的形成的最一般的简便方法。因此，由本发明提供的包含抗上皮调节蛋白抗体的组合物的稳定性也可以通过这些方法来评价。
为了改变本发明的抗上皮调节蛋白抗体的稳定性，可以适当实施抗上皮调节蛋白抗体的氨基酸序列中的氨基酸的修饰等。
作为用于改变本发明的抗上皮调节蛋白抗体稳定性的一个非限定性方案，当抗上皮调节蛋白抗体为IgG1抗体时，作为来自人IgG抗体的重链C末端序列(G1、SEQ ID NO: 25)的异质性而报道的、作为降低由C末端氨基酸的赖氨酸残基的缺陷和C末端的两个氨基酸即甘氨酸、赖氨酸两者的缺陷引起的C末端氨基的酰胺化(Anal. Biochem. (2007) 360 (1),75-83)的方法，优选列举缺损重链C末端的两个氨基酸、即以EU编号表示的446位的甘氨酸和447位的赖氨酸的修饰(WO2009/041613)。由于希望不存在来自本发明的抗上皮调节蛋白抗体的重链C末端序列的异质性，所以可以利用缺损了人IgG1的以EU编号表示的446位的甘氨酸和447位的赖氨酸的IgG1序列(G1d、SEQ ID NO: 26)作为恒定区序列。
作为稳定性得到了改善的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的重链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链。另外，作为稳定性得到了改善的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的轻链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 99、128-130、136和141的轻链。
作为稳定性得到了改善的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，可以列举包含选自SEQ ID NO: 37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链以及选自SEQ ID NO: 99、128-130、136和141的轻链的抗上皮调节蛋白抗体。
缔合体量的减少
本发明的抗上皮调节蛋白抗体，优选其缔合体量减少。控制蛋白药物的缔合体量在质量管理上、以及在考虑对药效和免疫原性的影响时非常重要(Curr. Opin.Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714)。通常缔合化对起因于蛋白溶液环境的胶体稳定性和起因于蛋白结构的构象稳定性两者有影响(J. Pharm. Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315)。通过研究抗体制剂的配方，筛选抗体浓度或pH、缓冲液种类、离子强度、添加剂等，从而得到对胶体稳定性有效的理想条件。另一方面，构象稳定性还有依赖于氨基酸序列的部分，当为抗体时，认为重要的是维持CDR的规范结构或FR的共有序列、VH/VL界面等的特征性结构(Jung等人(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716)、Xiang等人(J. Mol. Biol.(1995) 253 (3), 385-390)、Ewert等人(Methods. (2004) 34 (2), 184-199)、Vargas-Madrazo等人(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120)、Morea等人(J. Mol. Biol.(1998) 275, 269-294)、Vargas-Madrazo等人(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120))。
根据蛋白的物理和化学结构、以及它们的生物活性，在评价包含抗体制剂的蛋白制剂的稳定性时可以采用各种方法。例如，为了研究蛋白的变性，可以利用电荷转移吸收、热分析、荧光分光法、圆二色性(CD)、NMR、以及HPSEC、切向流过滤(TFF)、静态光散射法(SLS)、傅里叶变换红外分光法(FTIR)、尿素诱发蛋白解叠技术、固有色氨酸荧光、差示扫描量热测定法、以及1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白结合技术等方法。例如，可以从记载在Wang等人(J. of Parenteral Science & Technology (1988) 42 (Suppl), S4-S26)中的方法中选择并适当使用。
rCGE和HPSEC是评价蛋白凝聚体的形成、蛋白分解和蛋白片段化的最一般且最简单的方法。因此，本发明的液体制剂的稳定性可以通过这些方法来评价。
例如，本发明的抗上皮调节蛋白抗体的稳定性可以通过HPSEC或rCGE来评价，此时，峰区域率表示未分解抗体或未分解抗体片段。在一个非限定性方案中，将约250μg的抗体(约25μL含有10mg/mL的上述抗体的液体制剂)注入装有TSK SW ×1保护柱(6.0mm×4.0cm)的TosoH Biosep TSK G3000SWXL柱(7.8mm×30cm)中。抗体(包括其抗体片段)则使用含有0.1M硫酸钠和0.05%叠氮化钠的0.1M磷酸二钠，通过0.8-1.0mL/分钟的流量以均匀浓度洗脱。洗脱蛋白使用280nm的UV吸光度来检测。在测定中，运行参照标准作为对照，与在约12～14分钟内观察到的、除所含容量峰以外的其他所有峰进行比较，以生成单体峰的区域率的形式报告其结果。记录比单体峰早洗脱的峰作为凝聚率。
为了减少本发明的抗上皮调节蛋白抗体的缔合体量，而减弱包含抗上皮调节蛋白抗体的重链和轻链的分子间的疏水性相互作用。具体而言，适当实施将抗上皮调节蛋白抗体的重链或轻链的氨基酸序列中的疏水性残基取代成亲水性残基的氨基酸修饰等。在优选的一个非限定性方案中，适当实施将抗上皮调节蛋白抗体的CDR内所含的疏水性残基取代成亲水性残基的氨基酸修饰等。已知在氨基酸中存在亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。通常，作为亲水性氨基酸，已知有Asp(D)、Glu(E)、Arg(R)、Lys(K)、His(H)、Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Asn(N)、Gln(Q)、Tyr(Y)。作为疏水性氨基酸，已知有Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Met(M)、Trp(W)、Phe(F)、Pro(P)。作为上述氨基酸的修饰，优选从选自上述疏水性残基中的一个以上的氨基酸向从上述亲水性残基中选择的氨基酸的取代中适当选择，但并不特别限于特定的氨基酸。
作为为了减少本发明的抗上皮调节蛋白抗体的缔合体量而修饰氨基酸的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的60位和/或98位的氨基酸。
作为上述的氨基酸取代的一个非限定性方案，优选列举：SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的60位的氨基酸向His(H)、Lys(K)、Thr(T)、Ser(S)或Arg(R)的取代、和/或98位的氨基酸向Ser(S)或Glu(E)的取代。
作为缔合体量已减少的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的重链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链。
作为缔合体量已减少的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，可以列举包含选自SEQ ID NO: 92-98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链以及选自SEQ ID NO: 99、128-130、136和141的轻链的抗上皮调节蛋白抗体。
与非人动物的上皮调节蛋白和人动物的上皮调节蛋白结合的种属交叉反应性的 赋予
本发明的抗上皮调节蛋白抗体优选显示出非人动物和人动物间的种属交叉反应性(cross-species reactivity)的抗上皮调节蛋白抗体。即，本发明提供抗上皮调节蛋白抗体，其特征在于：是与包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重链可变区CDR以及SEQ IDNO: 12、13和14所表示的轻链可变区CDR的抗上皮调节蛋白抗体所结合的表位结合的抗体，其中，对SEQ ID NO: 170所表示的猴上皮调节蛋白的KD值(cEREG KD)与对SEQ ID NO: 34所表示的人上皮调节蛋白的KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREG KD)小于包含SEQ IDNO: 9、10和11所表示的重链可变区CDR以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的轻链可变区CDR的抗上皮调节蛋白抗体的cEREG KD/hEREG KD。
具体而言，本发明为了改变包含SEQ ID NO: 9、10和11所表示的重链可变区CDR以及SEQ ID NO: 12、13和14所表示的轻链可变区CDR的抗上皮调节蛋白抗体对猴上皮调节蛋白的结合活性，而修饰了上述的CDR的氨基酸序列。由于猴上皮调节蛋白与人上皮调节蛋白的结构上的差异尚未明确，所以当修饰抗上皮调节蛋白抗体的哪个氨基酸残基时能增强对猴上皮调节蛋白的结合活性的指导完全没有显示。在本发明中，设计了CDR的任意位点的氨基酸残基被取代的多个抗体序列。具体而言，制作了上述的CDR序列中的氨基酸被取代成Arg(R)残基的抗上皮调节蛋白抗体。
令人惊奇的是，CDR序列中的氨基酸被取代成Arg(R)残基的抗上皮调节蛋白抗体对猴上皮调节蛋白的结合活性增强。即，通过将抗上皮调节蛋白抗体的CDR序列中的氨基酸取代成Arg(R)残基，可以赋予与非人动物的上皮调节蛋白和人动物的上皮调节蛋白结合的种属交叉反应性。
对SEQ ID NO: 170所表示的猴上皮调节蛋白的KD值(cEREG KD)可以通过上述结合活性的项目中记载的方法算出。抗上皮调节蛋白抗体对上皮调节蛋白的结合活性可以通过本领域技术人员所公知的方法进行测定，关于其测定条件，可以由本领域技术人员适当确定。抗上皮调节蛋白抗体对上皮调节蛋白的结合活性可以以KD(Dissociationconstant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、作为解离速度的kd(Dissociation rate：解离速度常数)、或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速度常数)等形式来评价。这些常数可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、FACS等。通过用该KD值除以对SEQ ID NO: 34所表示的人上皮调节蛋白的KD值(hEREG KD)，能够确定对猴上皮调节蛋白的KD值(cEREG KD)与对人上皮调节蛋白的KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREGKD)。
本发明中，cEREG KD/hEREG KD优选小于40。另外，在一个非限定性方案中，cEREGKD/hEREG KD优选小于10。在其他的一个非限定性方案中，cEREG KD/hEREG KD优选小于6，进而在不同的一个非限定性方案中，cEREG KD/hEREG KD优选小于4。
作为由本发明提供的、为了赋予与非人动物的上皮调节蛋白和人动物的上皮调节蛋白结合的种属交叉反应性而修饰氨基酸的位点的非限定例子，优选列举SEQ ID NO: 38所表示的抗上皮调节蛋白抗体的重链序列中以Kabat编号表示的33位、51位、54位、55位、56位、57位、58位、59位、60位、62位、65位、96位、97位和/或98位的氨基酸。另外，作为由本发明提供的、为了赋予与非人动物的上皮调节蛋白和人动物的上皮调节蛋白结合的种属交叉反应性而修饰氨基酸的位点的非限定性例子，优选列举SEQ ID NO: 29所表示的抗上皮调节蛋白抗体的轻链序列中以Kabat编号表示的24位、93位和/或94位的氨基酸。作为氨基酸修饰的优选例子，可以列举上述的一个以上的氨基酸向Arg(R)的取代。
作为赋予了种属交叉性的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的重链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 115-127、131-135、137-140和142-150的重链。另外，作为赋予了种属交叉性的本发明的人源化抗上皮调节蛋白抗体的轻链的一个非限定性方案，可以列举选自SEQ ID NO: 128-130、136和141的轻链。
作为赋予了种属交叉性的本发明的抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，可以列举包含选自SEQ ID NO: 98、115-127、131-135、137-140和142-150的重链以及选自SEQID NO: 29、128-130、136和141的轻链的抗上皮调节蛋白抗体。
中和活性
本发明的抗上皮调节蛋白抗体，优选为具有中和活性的抗体。通常，中和活性是指，抑制病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的活性。即，具有中和活性的物质是指，与该配体或该配体所结合的受体结合，抑制该配体与受体的结合的物质。通过中和活性抑制了与配体的结合的受体无法发挥由该受体介导的生物学活性。具有这种中和活性的抗体通常被称作中和抗体。该中和活性可以通过在作为对象的配体的存在下、在评价其中和活性的被测物质的存在或不存在下的条件之间比较该生物学活性来测定。
在认为是本发明的上皮调节蛋白的主要受体的EGF受体的情况下，通过配体的结合形成二聚物，激活存在于细胞内的自身结构域即酪氨酸激酶。被激活的酪氨酸激酶通过自身磷酸化形成含有磷酸化酪氨酸的肽，使各种信号传递的辅助分子与之缔合。这些辅助分子主要是PLCγ(磷脂酶Cγ)、Shc、Grb2等。在这些辅助分子中，前两者进一步通过EGF受体的酪氨酸激酶而接受磷酸化。从EGF受体开始的信号传递中的主要路径是以Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的顺序传递磷酸化的路径。而且，认为存在作为副路径的从PLCγ到PKC的路径。
这种细胞内的信号级联根据各细胞种类而不同，所以可以根据作为目标的各靶细胞设定适当靶分子，并不限于上述因素。生物体内信号活化的测定试剂盒可以使用市售的试剂盒(例如，蛋白激酶C活性测定***(GE Healthcare Bioscience株式会社)等)。
另外，以对于存在于生物体内信号级联下游的靶基因的转录诱导作用为指标，也可以检测生物体内信号的活化。转录活性的变化可以根据报道基因测定的原理进行检测。具体而言，在靶基因的转录因子或启动子区的下游配置GFP(绿色荧光蛋白，GreenFluorescence Protein)或萤光素酶等报道基因，测定其报道基因活性，从而可以以报道基因活性的形式测定转录活性的变化。
而且，由于EGF受体通常在促进细胞增殖的方向发挥作用，所以通过测定靶细胞的增殖活性，可以评价生物体内信号传递的活化。本发明中，通过评价后者的细胞增殖活性来评价本发明的中和抗体的中和活性，但并不限于该方法，对于选择的各靶细胞，可以优选采用上述列举的方法进行评价。
即，例如通过测定以下的细胞增殖活性，可以评价或测定抗上皮调节蛋白抗体的中和活性。例如，采用以添加在培养基中的[3H]标记的胸苷的活细胞的摄入作为DNA复制能力的指标进行测定的方法。作为更简便的方法，采用在显微镜下计测将台盼蓝等色素排除到细胞外的能力的色素排除法或MTT法。后一种方法利用的是活细胞具有将作为四氮唑盐的MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)转换成蓝色的甲臜产物的能力。更具体而言，在被测细胞的培养液中添加被测抗体，经过一定时间后，将MTT溶液添加到培养液中静置一定时间，从而MTT被摄入到细胞内。其结果，黄色化合物MTT通过细胞内的线粒体内的琥珀酸脱氢酶转变成蓝色化合物。将该蓝色产物溶解、显色后，测定其吸光度，以此作为活细胞数的指标。
除MTT以外，MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也在出售(nacalai tesque等)，可以优选使用。而且，以细胞的ATP或细胞培养物的阻抗为指标来评价细胞增殖活性的方法也是公知的。测定活性时，将作为对照抗体的在具有与抗上皮调节蛋白抗体相同的同种型的抗体中不具有该中和活性的结合抗体与抗上皮调节蛋白抗体一样使用，由于抗上皮调节蛋白抗体显示出比对照抗体强的中和活性，从而可以判定活性。中和活性的测定方法的具体例子还公开在WO2008/047723等中，本领域技术人员还可以适当使用这些公知的测定方法。
细胞毒活性
本发明中使用的抗体优选为具有细胞毒活性的抗体。
作为本发明中的细胞毒活性，例如可以列举：抗体依赖性细胞介导的细胞毒(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性等。本发明中，CDC活性是指由补体***产生的细胞毒活性。而ADCC活性是指，特异性抗体附着在靶细胞的细胞表面抗原上时，在其Fc部分上，经由Fcγ受体结合有Fcγ受体保守细胞(免疫细胞等)，对靶细胞带来伤害的活性。本发明中使用的抗体可以是具有CDC活性或ADCC活性的抗体，或者可以是一并具有CDC活性和ADCC活性的抗体。
抗上皮调节蛋白抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，可以通过公知的方法来测定(例如Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studiesin humans, Editor, John E, Coligan等人, John Wiley & Sons, Inc., (1993)等)。
具体而言，首先，进行效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
(1) 效应细胞的制备
从CBA/N小鼠等中取出脾脏，在RPMI1640培养基(Invitrogen公司制)中分离脾细胞。用包含10%胎牛血清(FBS、HyClone公司制)的相同培养基清洗后，将细胞浓度调整至5×106/mL，从而可以制备效应细胞。
(2) 补体溶液的制备
使用含有10%FBS的培养基(Invitrogen公司制)，将幼兔补体(CEDARLANE公司制)稀释10倍，可以制得补体溶液。
(3) 靶细胞的制备
将表达上皮调节蛋白的细胞和0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GE Healthcare Bioscience公司制)一同在含有10%FBS的DMEM培养基中、在37℃下培养1小时，从而能够对该靶细胞进行放射性标记。作为表达上皮调节蛋白的细胞，可以使用经编码上皮调节蛋白的基因转化的细胞、原发性大肠癌细胞、转移性大肠癌细胞、肺腺癌细胞、胰癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞等。在放射性标记后，用含有10%FBS的RPMI1640培养基清洗细胞3次，将细胞浓度调整至2×105/mL，从而能够制备该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可以通过下述方法来测定。测定ADCC活性时，将各孔中分别加入了50μL靶细胞和50μL抗上皮调节蛋白抗体的96孔U底板(Becton Dickinson公司制)在冰上静置15分钟。之后，将各孔中加入了100μL效应细胞的板在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度可以调整至0或10μg/mL。培养后，回收的100μL上清中的放射活性使用γ计数仪(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company公司制)来测定。至于细胞毒活性(%)，可以使用所得的值根据下述算式来计算：
(式2)
(A-C)/(B-C)×100。
A表示各样品中的放射活性(cpm)，B表示加入了1%NP-40(nacalai tesque公司制)的样品中的放射活性(cpm)，C表示只含有靶细胞的样品的放射活性(cpm)。
另一方面，测定CDC活性时，将各孔中分别加入了50μL靶细胞和50μL抗上皮调节蛋白抗体的96孔平底板(Becton Dickinson公司制)在冰上静置15分钟。之后，将各孔中加入了100μL补体溶液的板在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度调整至0或3μg/mL。培养后，回收的100μL上清中的放射活性使用γ计数仪来测定。细胞毒活性与ADCC活性的测定一样来计算。
ADCC活性增强的抗上皮调节蛋白抗体
作为本发明的抗上皮调节蛋白抗体，还可优选使用ADCC活性增强的抗上皮调节蛋白抗体。如上所述，ADCC活性是指，特异性抗体附着在靶细胞的细胞表面抗原上时，在其Fc部分上经由Fcγ受体结合有Fcγ受体表达细胞(免疫细胞等)，对靶细胞带来伤害的活性，所以通过增强免疫细胞等的Fcγ受体表达细胞对Fcγ受体的结合活性，可以增强由抗上皮调节蛋白抗体介导的ADCC活性。作为增强免疫细胞等的Fcγ受体表达细胞对Fcγ受体的结合活性的方法，至少可以采用下述三种公知的方法。
(1) Fc区的氨基酸被修饰的抗上皮调节蛋白抗体
通过修饰本发明的抗上皮调节蛋白抗体中所含的Fc区的氨基酸，能够获得对Fcγ受体的结合活性增强的抗上皮调节蛋白抗体。作为用于修饰的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，例如可以列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4和它们的修饰体)的Fc区。
关于向其他氨基酸的修饰，只要对Fcγ受体的结合活性增强，则可以修饰任何位置的氨基酸。在本发明的抗上皮调节蛋白抗体包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来对Fcγ受体的结合与来自人IgG1的Fc区的结合活性相比增强的效果的修饰。作为用于增强对Fcγ受体的结合活性的氨基酸修饰，例如在WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中有报道。
作为可以进行这种修饰的氨基酸，例如可以列举：选自以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位的至少一个以上的氨基酸。通过这些氨基酸的修饰，能够增强本发明的抗上皮调节蛋白抗体的Fc区对Fcγ受体的结合。本发明的抗上皮调节蛋白抗体可以包含下述取代：在SEQ ID NO: 26的重链恒定区中，例如选自以EU编号表示的230位、240位、244位、245位、247位、262位、263位、266位、273位、275位、299位、302位、313位、323位、325位、328位和332位的氨基酸的至少一个取代。
为了在本发明中使用，作为特别优选的修饰，例如可以列举：本发明的抗上皮调节蛋白抗体的Fc区的以EU编号表示的、选自以下的至少一个以上的氨基酸的修饰：
221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；
222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
233位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
234位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
235位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
236位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
237位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
238位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
239位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；
241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；
243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；
244位的氨基酸为His；
245位的氨基酸为Ala；
246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
247位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中的任一个；
249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
251位的氨基酸为Phe；
254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；
256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；
263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；
264位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；
265位的氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；
267位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
268位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中的任一个；
269位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
270位的氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；
271位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
272位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
274位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；
276位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
278位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一个；
279位的氨基酸为Ala；
280位的氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中的任一个；
281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
283位的氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中的任一个；
284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；
285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；
286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
290位的氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；
291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；
292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；
293位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
294位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
295位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
296位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
297位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
298位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
299位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；
300位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一个；
301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
302位的氨基酸为Ile；
303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；
305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；
311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；
313位的氨基酸为Phe；
315位的氨基酸为Leu；
317位的氨基酸为Glu或Gln；
318位的氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中的任一个；
320位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
322位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
323位的氨基酸为Ile；
324位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
325位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
326位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
327位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
328位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
329位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
330位的氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
331位的氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
332位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
333位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一个；
334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；
335位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；
336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
339位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中的任一个；
376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；
377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
378位的氨基酸为Asp；
379位的氨基酸为Asn；
380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
385位的氨基酸为Glu；
392位的氨基酸为Thr；
396位的氨基酸为Leu；
421位的氨基酸为Lys；
427位的氨基酸为Asn；
428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
429位的氨基酸为Met；
434位的氨基酸为Trp；
436位的氨基酸为Ile；或
440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。另外，对所修饰的氨基酸的数量没有特别限定，可以仅修饰一处氨基酸，也可以修饰两处以上的氨基酸。作为两处以上氨基酸的修饰的组合，例如可以列举表1-1和表1-2中记载的组合。
[表1-1]
表1-2是表1-1的续表。
[表1-2]
在本说明书中，抗上皮调节蛋白抗体的Fc区对Fcγ受体的结合活性增强是指，实施了上述的氨基酸修饰的抗上皮调节蛋白抗体的Fc区对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb的任一种人Fcγ受体的结合活性均高于实施上述氨基酸修饰前的抗上皮调节蛋白抗体的Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性。例如，根据上述分析方法，与作为对照的修饰前的抗上皮调节蛋白抗体的结合活性相比，修饰后的抗上皮调节蛋白抗体的结合活性显示出105%以上、优选110%以上、115%以上、120%以上、125%以上、特别优选130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上的结合活性。
(2) 与Fc区结合的糖链中的岩藻糖含量减少的抗上皮调节蛋白抗体
作为本发明的抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，优选列举：修饰成与该抗上皮调节蛋白抗体的Fc区结合的糖链的组成结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例增高的抗上皮调节蛋白抗体。按照后述的糖链结构的分析方法，本领域技术人员可以适当选择结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例高的抗上皮调节蛋白抗体。这种结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例可以由本领域技术人员从10%～100%中适当选择。在一个非限定性方案中，该比例可以从10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%中选择。已知若从与抗体Fc区结合的N-糖苷键复合型糖链还原末端的N -乙酰葡糖胺中除去岩藻糖残基，则对FcγRIIIa的亲和性增强(J. Biol. Chem. (2003) 278,3466-3473)。已知包含这种Fc区的IgG1抗体的后述的ADCC活性增强，所以包含该Fc区的抗上皮调节蛋白抗体作为本发明的药物组合物中所含的抗上皮调节蛋白抗体也有效。作为从与抗体Fc区结合的N -糖苷键复合型糖链还原末端的N -乙酰葡糖胺中除去了岩藻糖残基的抗体的一个非限定性方案，优选列举进行了糖基化修饰的抗体(WO1999/054342)。
作为从与抗体Fc区结合的N -糖苷键复合型糖链还原末端的N -乙酰葡糖胺中除去了岩藻糖残基的抗体的一个不同的非限定性方案，还优选列举：添加在糖链中的岩藻糖缺损了的抗体(WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。接受糖链修饰的多肽的形成糖链结构的活性发生改变的结果，在糖链中添加岩藻糖的能力低的宿主细胞被用于制作添加在糖链中的岩藻糖缺损了的抗体。通过在该宿主细胞中表达所期望的抗体基因，能够从该宿主细胞的培养液中回收其糖链中的岩藻糖缺损了的该抗体。关于多肽的形成糖链结构的活性，作为其非限定性的优选例子，可以列举选自岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.152)、岩藻糖转运蛋白(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脱水酶) (EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖3,5-差向异构酶，4-还原酶) (EC 1.1.1.271)和GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶) (EC 2.7.7.30)的酶或转运蛋白的活性。这些酶或转运蛋白只要可以发挥其活性即可，未必特定其结构。在本说明书中，将可以发挥这些活性的蛋白称作功能性蛋白。作为改变这些活性的方法的一个非限定性方案，可以列举这些活性的缺失。为了制作缺失了这些活性的宿主细胞，可以适当采用不能发挥功能地破坏这些功能性蛋白的基因的方法等公知方法(WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。缺失了这种活性的宿主细胞可以通过不能发挥功能地破坏CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞或杂交瘤细胞等内源性的这些功能性蛋白的基因的方法等来制作。
通过从转化有包含抗上皮调节蛋白抗体基因的表达载体的上述宿主细胞的培养上清中进行回收，可回收从与抗体Fc区结合的N -糖苷键复合型糖链还原末端的N-乙酰葡糖胺中除去了岩藻糖残基的抗上皮调节蛋白抗体。
(3) 包含添加有二等分的N-乙酰葡糖胺的Fc区的抗上皮调节蛋白抗体
作为本发明的抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，还优选列举包含添加有二等分的N-乙酰葡糖胺的Fc区的抗上皮调节蛋白抗体。具有包含二等分的GlcNAc结构的糖链的抗体(WO2002/079255等)是公知的。具有形成包含二等分的GlcNAc结构的糖链的活性的宿主细胞被用于制作添加有包含二等分的GlcNAc结构的糖链的抗体。在一个非限定性的优选方案中，制作表达编码功能性蛋白的基因的宿主细胞，所述功能性蛋白具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶) (EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基转移酶) (EC 2.4.1.38)活性。在其他的一个非限定性优选方案中，制作了与除了编码上述功能性蛋白外还编码具有人ManII(甘露糖苷酶II) (3.2.1.114)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTI(β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶I) (EC 2.4.1.94)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTII(β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶II) (EC 2.4.1.143)活性的功能性蛋白的基因、编码具有ManI(甘露糖苷酶) (EC 3.2.1.113)活性的功能性蛋白的基因、以及α-1,6-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.68)共表达的宿主细胞(WO2004/065540)。如上所述的具有形成包含二等分的GlcNAc结构的糖链的活性的宿主细胞可以通过向CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞或杂交瘤细胞等中转化包含上述功能性蛋白的基因的表达载体来制作。
通过从转化有包含抗上皮调节蛋白抗体基因的表达载体的上述宿主细胞的培养上清中进行回收，回收了包含添加有二等分的N-乙酰葡糖胺的Fc区的抗上皮调节蛋白抗体。为了分析与抗体连接的糖链结构，可以采用公知的方法。在一个非限定性方案中，通过使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)与本发明的抗上皮调节蛋白抗体发生作用，使与抗上皮调节蛋白抗体结合的糖链从蛋白中游离出来(J. Pharm. Sci. (1994) 83 (12), 1670-1675)。在使用乙醇的除蛋白操作后(J. Clin. Invest. (2001), 108 (11), 1687-95)，将游离糖链浓缩干固，接着用2-氨基吡啶或2-氨基苯甲酰胺进行荧光标记(Anal. Biochem.(1995) 230 (2), 229-238)。得到的2-AP化糖链或2-AB化糖链通过使用纤维素滤筒的固相提取进行脱试剂后，通过离心分离进行浓缩，作为纯化2-AB化糖链用于以后的分析。接下来，使β-半乳糖苷酶(生化学工业)与纯化2-AB化糖链进行作用，从而制备非半乳糖基2-AB化糖链。以从本发明的抗上皮调节蛋白抗体中游离的糖链作为起始材料而制备的非半乳糖基2-AB化糖链通过酰胺柱TSK凝胶酰胺-80(TOSOH)的正向HPLC进行分析，比较其色谱图。
另外，有报道称：抗体的Fc区与FcgR的相互作用强度呈Zn2+离子浓度依赖性(Immunology Letters 143 (2012) 60-69)。抗体Fc区的Zn2+离子浓度越高，则Fc区与FcgR的相互作用就越增强。存在于抗体Fc区的CH3中的His310、His435通过螯合Zn2+，使得位于远位的Fc区的各CH2结构域开放。由此，CH2结构域与FcgR容易发生相互作用，Fc区与FcgR的相互作用增强。作为本发明抗体的一个非限定性方案，可以列举在以EU编号表示的310位的His、435位的His、433位的His和/或434位的Asn上螯合有Zn2+的抗体。
抗体药物复合体(Antibody-Drug Conjugate，抗体药物缀合物)
作为本发明的抗上皮调节蛋白抗体的一个非限定性方案，还优选列举在抗上皮调节蛋白抗体上连接了具有细胞毒活性的药物的抗上皮调节蛋白抗体药物复合体。以下，在本说明书中，抗体药物复合体(Antibody-Drug Conjugate)有时还被称作ADC。更具体而言，本发明中使用的抗上皮调节蛋白抗体药物复合体能够与增殖抑制剂或毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质适当连接。在本发明中，放射性化学物质是指包含放射性同位素的物质。对放射性同位素没有特别限定，可以使用任一种放射性同位素，例如可以使用32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Re等。这种抗上皮调节蛋白抗体药物复合体可以通过对所得的抗上皮调节蛋白抗体进行化学修饰而得到。即，接头分子经由化学键(上述的)将增殖抑制剂或细胞毒性物质与抗体连接，使得增殖抑制剂或细胞毒性物质与抗上皮调节蛋白抗体可以互相化学共轭(例如，可以进行共价结合)。
优选结合剂(接头)为可以切断的接头。更优选在温和条件(即，药物活性不受影响的细胞内条件)下切断接头。作为适当的可以切断的接头的例子，可以列举二硫键接头、酸不稳定性接头、光不稳定性接头、肽酶不稳定性接头、以及酯酶不稳定性接头。包含二硫键的接头是指通过在生理学条件下能够发生的二硫键交换而可以切断的接头。酸不稳定性接头是指在酸性pH下可以切断的接头。例如，核内体和溶酶体等特定的细胞内腔室具有酸性pH(pH4～5)，提供适于切断酸不稳定性接头的条件。光不稳定性接头在可暴露于光下的体表面和多个体腔中有用。而且，红外线光能够透过组织。肽酶不稳定性接头能够用于切断细胞内或细胞外的特定肽(例如参照Trouet等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982) 79,626-629和Umemoto等人Int.J.Cancer (1989) 43, 677-684)。
这种ADC除了通过上述的化学修饰而获得以外，还可以作为利用基因重组技术设计成识别增殖抑制剂、或毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质的双特异性抗体(bispecific antibody)这样的分子型而获得。本发明中的“抗上皮调节蛋白抗体”还包含这些抗体。
另外，作为本发明所提供的抗上皮调节蛋白抗体药物复合体的一个非限定性方案，还例示通过篦麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙酶(onconase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、L-天冬酰胺酶、PEG L-天冬酰胺酶等毒性肽修饰的抗上皮调节蛋白抗体。另外，在其他方案中，将一种或两种以上的增殖抑制剂与毒性肽等细胞毒性物质分别组合，可用于修饰抗上皮调节蛋白抗体。如上所述，在抗上皮调节蛋白抗体与上述的增殖抑制剂、或毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质的连接中能够利用共价结合或非共价结合。连接有这些增殖抑制剂、或毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质的ADC的制作方法是公知的。例如，关于直接结合有抗上皮调节蛋白抗体和增殖抑制剂、或毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质时的连接基团，例如在其连接时，可以列举利用SH基的二硫键。具体而言，将使用还原剂、例如二硫苏糖醇等将其Fc区的分子内二硫键还原得到的抗上皮调节蛋白抗体、以及其分子内的二硫键同样被还原得到的增殖抑制剂、或细胞毒性物质通过二硫键连接。在连接前使用活化促进剂、例如埃尔曼氏试剂(Ellman’s reagent)将抗体或增殖抑制剂、或细胞毒性物质中的任一种活化，能够促进两者间的二硫键形成。作为将抗上皮调节蛋白抗体和增殖抑制剂、或毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质直接结合的其他方法，例如作为非限定性的优选例子，可以列举使用席夫碱的方法、碳化二亚胺法、活性酯法(N-羟基琥珀酰亚胺法)、使用混合酸酐(Mixed anhydride)的方法、利用重氮反应的方法等。
作为本发明中使用的毒性肽，例如能够例示以下的毒性肽。
-白喉毒素A链(Diphtheria toxin A Chain) (Langone等人(Methods inEnzymology (1993) 93, 307-308)；
-假单胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin) (Pai等人(Nat. Med. (1996) 2(3), 350-353)；
-篦麻毒素链(Ricin A Chain) (Fulton等人(J. Biol. Chem. (1986) 261,5314-5319)、Sivam等人(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173)、Cumber等人(J. Immunol.Methods (1990) 135, 15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562)、Gheeite等人(J. Immunol. Methods (1991) 142, 223-230))；
-无糖链篦麻毒素A链(Deglicosylated Ricin A Chain) (Thorpe等人(CancerRes. (1987) 47, 5924-5931)；
-相思豆毒素A链(Abrin A Chain) (Wawrzynczak等人(Br. J. Cancer (1992)66, 361-366)、Wawrzynczak等人(Cancer Res (1990) 50, 7519-7562)、Sivam等人(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173)、Thorpe等人(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)；
-白树毒蛋白(Gelonin) (Sivam等人(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173)、Cumber等人(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990) 50, 7519-7562)、Bolognesi等人(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
-美洲商陆抗病毒蛋白(PAP-s或Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi等人(Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346))；
-Briodin (Bolognesi等人(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
-皂草毒蛋白(Saporin) (Bolognesi等人(Clin. Exp. Immunol. (1992), 89,341-346))；
-苦瓜毒蛋白(Momordin) (Cumber等人(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24)、(Wawrzynczak等人(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562)(Bolognesi等人(Clin.Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)；
-木鳖毒蛋白(Momorcochin) (Bolognesi等人(Clin. Exp. Immunol. (1992)89, 341-346)；
-石竹毒蛋白32(Dianthin 32) (Bolognesi等人(Clin. Exp. Immunol. (1992)89, 341-346)；
-石竹毒蛋白30(Dianthin 30) (Stirpe等人(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)；
-蒴莲根毒蛋白(Modeccin) (Stirpe等人(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)；
-槲寄生毒蛋白(Viscumin) (Stirpe等人(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)；
-塑莲根毒蛋白(Volkesin) (Stirpe等人(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)；
-商陆毒蛋白(Dodecandrin) (Stirpe等人(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)；
-小麦毒蛋白(Tritin) (Stirpe等人(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)；
-软瓜蛋白 (Luffin) (Stirpe等人(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)；
-括楼素(Trichokirin) (Casellas等人(Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588)、Bolognesi等人(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)。
蛋白或肽性的药物或毒素通过基因工程技术也能够与抗上皮调节蛋白抗体连接。具体而言，例如，将编码上述毒性肽的DNA和编码本发明的抗上皮调节蛋白抗体的DNA进行框内融合得到重组DNA，将该重组DNA***表达载体中，能够构建重组载体。培养通过将该载体导入适当的宿主细胞中而得到的转化细胞，重组的DNA在该细胞中表达。从上述培养液中进行分离和纯化，能够获得连接有毒性肽的抗上皮调节蛋白抗体药物复合体。得到与抗体的融合蛋白时，通常往往是以在抗体的C末端侧配置蛋白性药物或毒素的方式连接这些DNA，但并不限于这些。还可以使肽接头介于抗体与蛋白性药物或毒素之间。
增殖抑制剂
在一个非限定性方案中，作为增殖抑制剂，可以优选列举DNA损伤剂、抗有丝***剂和/或代谢拮抗剂。DNA损伤剂可以是烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂和/或DNA嵌入剂。作为非限定性的优选的增殖抑制剂，能够例示卡铂(DNA烷基化剂)、依托泊苷(拓扑异构酶II的抑制剂)、多柔比星(DNA嵌入剂)、多西他赛(抗有丝***剂)和Gemzar(吉西他宾、代谢拮抗剂)等。
烷基化剂可以从以下的至少一种中选择。即，可以使用选自苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、美法仑、尿嘧啶芥、噻替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、卡铂、顺铂、沙铂、奥沙利铂、六甲蜜胺、ET-743、XL119(becatecarin)、达卡巴嗪、氮芥、苯达莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、福莫司汀、尼莫司汀、泼尼莫司汀、雷莫司汀、司莫司汀、奈达铂、四硝酸三铂、甘露舒凡、苏消安、替莫唑胺、卡波醌、三亚胺醌、三亚胺嗪和丙卡巴肼等的至少一种烷基化剂。
拓扑异构酶抑制剂能够从以下的至少一种中选择。能够使用选自多柔比星(Doxil)、柔红比星、表柔比星、伊达比星、蒽二酮(Novantrone，诺安托)、米托蒽醌、丝裂霉素C、博来霉素、更生霉素、普卡霉素、伊立替康(Camptosar)、喜树碱、卢比替康、贝洛替康、依托泊苷、替尼泊苷和托泊替康(Hycamptin)等的至少一种拓扑异构酶抑制剂。
DNA嵌入剂能够使用选自原黄素、多柔比星(adriamycin，阿霉素)、柔红比星、更生霉素和沙利度胺等的至少一种DNA嵌入剂。
抗有丝***剂能够从以下的至少一种中选择。能够使用选自紫杉醇(Abraxane)/Taxol、多西他赛(Taxotere)、BMS-275183、Xyotax、Tocosal、长春瑞宾(vinorlebine)、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春利定、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(VM-26)、伊沙匹隆、larotaxel、Ortataxel、tesetaxel和ispinesib等的至少一种抗有丝***剂。
代谢拮抗剂能够从以下的至少一种中选择。能够使用选自氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、希罗达(Xeloda)、Arranon、亚叶酸、羟基脲、硫代鸟嘌呤(6-TG)、6-巯基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他丁、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他滨、培美曲塞、硼替佐米(bortezomib)、氨基蝶呤、雷替曲塞、氯法拉滨(clofarabine)、依诺他滨、卡培他滨和阿扎胞苷等的至少一种代谢拮抗剂。
抗上皮调节蛋白抗体药物复合体被摄入到细胞内时，通过与该复合体连接的增殖抑制剂或毒性肽等细胞毒性物质，能够在摄入了该抗体的细胞中诱导细胞死亡。因此，连接有增殖抑制剂或毒性肽等细胞毒性物质的抗体优选进一步具有内化活性。在本发明中，“具有内化活性的抗体”是指，与细胞表面上的上皮调节蛋白结合时被输送到细胞内(细胞质内、小胞内、其他小器官内等)的抗体。抗体是否具有内化活性，可以利用本领域技术人员所公知的方法来确认。例如，可以通过下述方法来确认：使结合有标记物质的抗上皮调节蛋白抗体与表达上皮调节蛋白的细胞接触，确认该标记物质是否被摄入到细胞内的方法；使结合有增殖抑制剂或毒性肽等细胞毒性物质的抗上皮调节蛋白抗体与表达上皮调节蛋白的细胞接触，结果，确认是否在该上皮调节蛋白表达细胞中诱导细胞死亡的方法等。更具体而言，利用下述实施例中记载的方法等，能够确认抗体是否具有内化活性。
具有ADCC等细胞毒活性的抗体与在细胞表面表达的靶抗原结合后，经由与该抗原的结合而滞留在细胞表面，从而NK细胞等效应细胞与该抗体的Fc区结合，结果，该效应细胞对表达靶抗原的细胞引起细胞毒。相对于此，用作ADC的抗体与抗原结合后，优选被内化到细胞内。象根据上述作用机理推定的那样，认为通常优选通过ADCC等细胞毒活性伤害靶细胞的抗体的内化活性小，优选以ADC的形式伤害靶细胞的抗体的内化活性大(AnticancerResearch (1993) 13, 2207-2212)。相对于此，令人惊奇的是，明确了：本申请的抗上皮调节蛋白抗体不仅通过其中和活性发挥表达上皮调节蛋白的细胞的增殖抑制，还通过ADCC等细胞毒活性引起对表达上皮调节蛋白的细胞的细胞毒，另一方面，本申请的包含抗上皮调节蛋白抗体的抗体药物复合体还对表达上皮调节蛋白的细胞引起细胞毒活性。
低分子抗体
在一个非限定性方案中，本发明的抗上皮调节蛋白抗体药物复合体所包含的抗上皮调节蛋白抗体可以是低分子抗体。低分子抗体包含全长抗体(全长抗体、例如全长IgG等)的一部分缺损的抗体片段。只要对上皮调节蛋白抗原具有结合活性，则容许抗体分子的一部分缺损。本发明中的抗体片段优选包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的任一方或双方。VH或VL的氨基酸序列可以包含取代、缺失、添加和/或***。而且，只要对上皮调节蛋白抗原具有结合活性，则可以缺损VH和VL中的任一方或双方的一部分。另外，可变区可以进行嵌合化或人源化。作为抗体片段的具体例子，例如可以列举Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。另外，作为低分子抗体的具体例子，例如能够例示：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体(Diabody)、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、聚合物)也包含在本发明的低分子抗体中。
低分子抗体可以通过将抗体用酶进行处理生成抗体片段而得到。作为生成抗体片段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶等是公知的。或者，将***有编码这些抗体片段的基因的表达载体导入适当的宿主细胞中，培养该宿主细胞，从其培养液中分离和纯化所表达的抗体片段，能够获得低分子抗体(例如参照Co等人(J. Immunol. (1994) 152,2968-2976、Better等人(Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496)、Plueckthun等人(Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496)、Lamoyi(Methods in Enzymology(1989) 121, 652-663)、Rousseaux等人(Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669)、Bird等人(TIBTECH (1991) 9, 132-137))。
双抗体是指通过基因融合而构建的二价(bivalent)的抗体片段(Holliger等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 6444-6448、EP404,097、WO93/11161等)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体，通常，构成二聚体的多肽链各自在同一链中VL和VH通过接头连接。双抗体中的接头通常短至VL和VH无法相互结合。具体而言，构成接头的氨基酸残基例如为5个残基左右。因此，编码在同一多肽链上的VL和VH无法形成单链可变区片段，而与其他的单链可变区片段形成二聚体，其结果，双抗体有两个抗原结合位点。scFv可以通过连接抗体的H链V区和L链V区而获得。具体而言，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头连接，能够制作scFv(Huston等人(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, (1988) 85, 5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中作为抗体而记载的抗上皮调节蛋白抗体的任一种抗体。连接V区的肽接头，对其结构或性质没有特别限定。例如可以使用由3个～25个残基左右构成的任意单链肽作为接头。
sc(Fv)2是低分子抗体，其中两个VH和两个VL通过接头等连接成单链(Hudson等人(J. Immunol. Methods (1999) 231, 177-189)。sc(Fv)2例如可以通过用接头连接scFv来制作。
药物组合物
从其他观点考虑，本发明提供药物组合物，其中含有本发明的抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分。本发明还涉及含有抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂、特别是抗癌药或癌症的复发或转移抑制剂。本发明的细胞增殖抑制剂和抗癌药或癌症的复发或转移抑制剂，优选对罹患癌症的对象、或者现在或将来有可能罹患癌症的对象进行给药。
本发明中，含有抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂还可以表述为：抑制细胞增殖的方法，该方法包括向对象给予抗上皮调节蛋白抗体的步骤；或者，抗上皮调节蛋白抗体在细胞增殖抑制剂的制备中的应用；或者，用于在细胞增殖的抑制中使用的抗上皮调节蛋白抗体。
另外，在本发明中，含有抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的抗癌药或癌症的复发或转移抑制剂还可以表述为：预防或治疗癌症的方法或抑制癌症的复发或转移的方法，该方法包括向对象给予抗上皮调节蛋白抗体的步骤；或者，抗上皮调节蛋白抗体在抗癌药或癌症的复发或转移抑制剂的制备中的应用；或者，用于在癌症的预防或治疗、或者癌症的复发或转移抑制中使用的抗上皮调节蛋白抗体。
本发明中，含有抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分是指，包含抗上皮调节蛋白抗体作为主要的活性成分，但并不限定抗上皮调节蛋白抗体的含有率。本发明的药物组合物(例如，本发明的细胞增殖抑制剂、抗癌药。下同。)中所含的抗体只要与上皮调节蛋白结合即可，没有特别限定，能够例示本说明书中记载的抗体。
本发明的药物组合物，可以通过口服、胃肠外给药中的任一种方法向对象(患者)给药。优选为胃肠外给药。作为所涉及的给药方法，具体而言，可以列举注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药的例子，例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等，将本发明的药物组合物进行全身或局部给药。另外，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。作为给药量，例如可以在每次给药每1kg体重0.0001mg~1000mg的范围内选择给药量。或者，例如可以在每位患者0.001~100000mg/人的范围内选择给药量。但本发明的药物组合物并不限于上述的给药量。
本发明的药物组合物，可以利用常规方法制成制剂(例如Remington’sPharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,U.S.A)，可以同时含有药学上可接受的载体或添加剂。例如可以列举：表面活性剂、赋形剂、着色剂、香味料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。不限于这些，还可以适当使用其他常用的载体。具体而言，作为载体，可以列举轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
抗上皮调节蛋白抗体作为与本发明的药物组合物中所含的上皮调节蛋白结合的抗体如上所述。抗上皮调节蛋白抗体所结合的细胞只要是上皮调节蛋白表达的细胞，则没有特别限定。本发明中优选的上皮调节蛋白表达细胞为癌细胞。更优选为大肠癌细胞、肺腺癌细胞、胰癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和肾癌细胞。本发明的方法对上述癌症的原发灶和转移灶均适用。进一步优选的癌细胞为原发性大肠癌细胞、转移性大肠癌细胞和胰癌细胞。
在本发明中，“接触”例如通过向在试管内培养的上皮调节蛋白表达细胞的培养液中添加抗体来进行。这种情况下，作为添加的抗体的形态，可以适当使用溶液或通过冷冻干燥等得到的固体等形态。以水溶液的形式添加时，可以是纯粹地只含有抗体的水溶液，也可以是包含例如上述记载的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香味料、保存料、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。对添加的浓度没有特别限定，作为培养液中的最终浓度，优选为1pg/mL～1g/mL的范围，更优选为1ng/mL～1mg/mL，可以进一步优选使用1μg/mL～1mg/mL。
另外，本发明中，在其他方案中，“接触”还可以通过对体内移植有上皮调节蛋白表达细胞的非人动物或内源性地具有表达上皮调节蛋白的癌细胞的动物给予抗体来进行。给药方法可以通过口服、胃肠外给药的任一种方法进行。特别优选为胃肠外给药的给药方法，作为所涉及的给药方法，具体而言，可以列举注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药的例子，例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等，将本发明的药物组合物细胞增殖抑制剂和抗癌药进行全身或局部给药。另外，可以根据被测动物的年龄、症状选自适当的给药方法。以水溶液的形式给药时，可以是纯粹地只含有抗体的水溶液，也可以是包含例如上述记载的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香味料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。作为给药量，例如可以在每次给药每1kg体重0.0001mg～1000mg的范围内选择给药量。或者，例如可以在每位患者0.001～100000mg/人的范围内选择给药量。但本发明的抗体给药量并不限于上述的给药量。
对包含上皮调节蛋白表达的癌细胞的对象给予的癌症治疗药或癌症的复发或转 移抑制剂
本发明还提供癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂，其中，给予癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂的对象为包含在分离的组织样本中检测到的上皮调节蛋白表达的癌细胞的对象。上皮调节蛋白的表达量除了可以利用本说明书中记载的方法来确定外，还可以通过本领域技术人员所公知的方法来确定。为了确定是否是本发明的癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂的给药对象，可以确定从候选对象中分离的组织样本中的上皮调节蛋白的表达量。如果在该样本中检测到上皮调节蛋白，则该样本来源的对象能够成为本发明的癌症治疗药或癌症的复发或转移抑制剂的给药对象。上皮调节蛋白的表达量并不限于特定的数值，作为非限定性方案，可以从103、104、105、106、107、108的数值位数(等级)范围内适当设定。作为一个非限定性方案，作为能够设定作为用于选择给药的对象的基准的数值(阈值)的优选例子，能够例示选自1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108的任意一个的上皮调节蛋白的表达量。上述数值可以是以一位有效数字的形式算出的数值，但这种情况下，例如通过一位有效数字算出的EREG的表达量为1×103是指，以两位有效数字的形式算出有效数字时，EREG的表达量为包含0.5×103、0.6×103、0.7×103、0.8×103、0.9×103、1.0×103、1.1×103、1.2×103、1.3×103、1.4×103中的任一个的数值。
组织样本
本发明中使用的用语“组织样本”是指，由个体、体液(例如血液、血清、血浆和脊髓液)、组织培养物或组织切片等得到的任意的生物学样本。作为用作生物学样本的物质，优选列举被测体样本。优选的被测体样本为由被测体得到的组织，进一步优选为被测体的大肠组织。作为采集大肠组织的方法，优选采用作为公知方法的活检(活组织检查)。作为活检的方法，可以适当使用公知的方法。作为这样的例子，可以通过吸引活检、钳取活检、棉试活检、细胞诊断用活检、内窥镜活检、细针吸引活检、针活检、经支气管的肺活检等活检(活组织检查)、或者在外科手术时得到。
在本发明中，为了在显微镜下通过透射光观察组织样本，将组织样本薄切至足以透过显微镜中使用的光线的程度。作为薄切的前阶段，将组织样本固定。即，使组织细胞的蛋白发生脱水或变性而使其凝固，从而导致构成组织的细胞迅速死亡，其结构被稳定化和不溶化。首先，作为固定的对象的组织样本用手术刀等刀物切成适于制作石蜡包埋切片的大小和形状的片断。接着，将该片断浸在作为用于实施固定的试剂的固定液中。作为固定液，优选使用***，更优选中性缓冲***。中性缓冲***的浓度根据组织样本的特性或理化性质来适当选择。浓度可以在1～50%、优选5～25%、更优选10～15%之间适当变更、使用。浸有组织样本的固定液使用真空泵进行适当脱气。通过将组织标本在常压和室温条件下在固定液中放置数小时来进行固定。固定所需的时间可以在1小时～7天、优选2小时～3天、还优选3小时～24小时、进一步优选4小时～16小时的范围内适当选择。固定后再于磷酸缓冲液等中适当浸渍数小时(在2小时～48小时、优选3小时～24小时、进一步优选4小时～16小时的范围内可以适当选择的时间)。
接下来，由进行了固定的组织样本，利用冷冻切片法或石蜡切片法可以适当地制作切片。作为冷冻切片法的优选例子，可以列举下述方法：将组织投入O.C.T.混合物(Miles. Inc)中使其冻结，再使用低温恒温器(冷冻切片制作装置)将已冻结的组织薄切。在石蜡切片法中，通过将进行了固定的组织样本浸在包埋剂中使其***，赋予均匀且适当的硬度。作为包埋剂，可以优选使用石蜡。进行了固定的组织样本用乙醇进行脱水。具体而言，通过将组织样本依次浸在70%乙醇、80%乙醇、100%乙醇中，使该组织样本脱水。浸渍所需的时间和次数可以在1小时～数日和1次～3次的范围内适当选择。另外，也可以在室温或4℃下浸渍，但在4℃下浸渍时，浸渍时间优选为长时间(过夜等)。接着，将该液相置换成二甲苯后，将组织样本用石蜡包埋。该液相置换成二甲苯所需的时间可以在1小时～数小时的范围内适当选择。此时，既可以在室温下进行置换，也可以在4℃下进行置换，但在4℃下进行置换时，置换的时间优选为长时间(过夜等)。石蜡包埋所需的时间和次数可以在1小时～数小时和1次～4次的范围内适当选择。此时，既可以在室温下包埋，也可以在4℃下包埋，但在4℃下包埋时，包埋的时间优选为长时间(过夜)。另外，通过使用自动处理石蜡包埋反应的石蜡包埋装置(EG1160、Leica等)，可以对组织样本适当地进行石蜡包埋。
通过将如上操作进行了石蜡包埋的组织样本粘附于基材上，以制作“块”，该块通过超薄切片机薄切成选自1～20μm的厚度的所期望的厚度。薄切的组织切片通过在作为透过性支撑体的载玻片上静置而固定。这种情况下，为了防止组织切片的剥离，还可以优选使用在载玻片上涂布了0.01%聚-L-赖氨酸(Sigma)并干燥的载玻片。固定了的组织切片被风干选自数分钟～1小时之间的适当时间。
抗原赋活化(Antigen retrieval)
在本发明的方法中，将通过***固定而减弱了与抗体的反应性的抗原的反应性赋活。在本发明中，对两个组织样本中的一个样本应用蛋白酶抗原赋活化法(PIER法)，而对另一个样本应用热诱导抗原赋活化法(HIER法)，将与抗体反应时的两者间的染色程度的不同数值化。
热诱导抗原赋活化法可适当采用微波加热法或高压釜加热法、或煮沸处理加热法等。在以780W的功率进行煮沸处理以使液温保持在约98℃的情况下，处理等赋活化所需的时间从5分钟-60分钟之间适当选择，例如10分钟。抗原的赋活化处理除了在10mM枸橼酸钠缓冲液中进行以外，还可以在市售的Target Retrieval溶液(DakoCytomation)等中进行。在下述实施例中，使用Target Retrieval溶液。赋活化处理的结果，获得了上皮调节蛋白抗体所识别的抗原中的表位与抗体的结合性，如果能够检测后述的抗原与抗体的复合体，则所有的缓冲液、水溶液均可优选使用。
蛋白酶抗原赋活化法中使用的蛋白酶，对其种类或来源没有特别限定，通常可以适当选择使用能够获取的蛋白酶。作为使用的蛋白酶的例子，优选列举0.01N盐酸中0.05%浓度的胃蛋白酶、或pH7.6的Tris缓冲液中还含有0.01%浓度的CaCl2的0.1%浓度的胰蛋白酶、含有10mM EDTA和0.5%SDS的pH7.8的10mM Tris盐酸缓冲液中1～50μg/ml浓度的蛋白酶K等。而且在使用蛋白酶K时，其反应液的pH可以在6.5～9.5之间适当选择，还可以适当利用SH试剂或胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂。作为这种优选的蛋白酶的具体例子，还可以列举本说明书实施例中记载的Histofine HER2试剂盒(MONO) (Nichirei Bioscience)所附带的蛋白酶。蛋白酶抗原赋活化通常在37℃下进行，但反应温度可以在25℃～50℃的范围内适当变更。在37℃下进行蛋白酶抗原赋活化时，反应时间例如在1分钟～5小时之间适当选择，例如15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时等。赋活化处理结束后，实施了该处理的组织样本用清洗用缓冲液清洗。清洗用缓冲液优选使用PBS(磷酸缓冲盐)，此外还可优选使用Tris盐酸缓冲液。通常，作为清洗条件，采用在室温下进行3次5分钟清洗的方法，但清洗的时间和温度可以适当变更。
作为本发明中使用的检测用物质，通常可以列举抗体、核酸等。例如，可以进行下述的(1)和(2)：(1)通过使用可以检测EREG蛋白的EREG抗体的免疫学方法检测EREG蛋白；(2)虽然使用与可以检测编码EREG的mRNA的该mRNA互补的核酸分子(例如DNA、RNA、mRNA)等，但优选为互补的核酸分子，可以利用所述核酸分子之间的杂交来检测编码EREG的mRNA(例如FISH法)。在本发明中，可以优选使用免疫学方法、特别是组织免疫学染色法。
组织样本与上皮调节蛋白抗体的反应
对于通过热诱导抗原赋活化法实施了抗原赋活化处理的组织样本和通过蛋白酶抗原赋活化法实施了抗原赋活化处理的组织样本，使上皮调节蛋白抗体作为一次抗体进行反应。该反应在适于上皮调节蛋白抗体识别抗原中的表位以形成抗原抗体复合体的条件下进行。通常，该反应在4℃下进行过夜、或者在37℃下进行1小时，但反应条件可以在适于抗体识别抗原中的表位以形成抗原抗体复合体的范围内适当变更。例如，反应温度可以在4℃～50℃的范围内变更，反应时间可以在1分钟～7天之间变更。实施低温下的反应时，优选进行长时间的反应。一次抗体反应结束后，组织样本用清洗用缓冲液清洗。清洗用缓冲液除了优选使用PBS(磷酸缓冲盐)以外，还可以优选使用Tris盐酸缓冲液。通常，作为清洗条件，采用在室温下进行3次5分钟清洗的方法，但清洗的时间和温度可以适当变更。
接着，使识别一次抗体的二次抗体与实施了一次抗体反应的组织样本反应。通常，使用通过用于将二次抗体可视化的标记物质预先标记了的二次抗体。作为标记物质，优选列举FITC(异硫氰酸荧光素)或Cy2(Amersham)、Alexa488(Molecular Probe)等荧光色素、过氧化酶或碱性磷酸酶等酶、或胶体金等。
与二次抗体的反应在适于上皮调节蛋白抗体与识别该上皮调节蛋白抗体的二次抗体形成抗原抗体复合体的条件下进行。通常，该反应在室温或37℃下进行30分钟至1小时，可以在适于上皮调节蛋白抗体与二次抗体形成抗原抗体复合体的范围内适当变更。例如，反应温度可以在4℃～50℃的范围内变更，反应时间可以在1分钟～7天之间变更。进行低温下的反应时，优选进行长时间的反应。二次抗体反应结束后，组织样本用清洗用缓冲液清洗。清洗用缓冲液除了优选使用PBS(磷酸缓冲盐)以外，还可以优选使用Tris盐酸缓冲液。通常，作为清洗条件，采用在室温下进行3次5分钟清洗的方法，但清洗的时间和温度可以适当变更。
接下来，使将标记物质可视化的物质与实施了二次抗体反应的组织样本反应。使用过氧化酶作为二次抗体的标记物质时，在反应液中培养组织样本，所述反应液是将0.02%过氧化氢和用pH7.2的0.1M Tris盐酸缓冲液调整至0.1%浓度的DAB(二氨基联苯胺)溶液在临培养前等量混合而得到的。除了DAB以外，还可以适当选择DAB-Ni或AEC+ (以上，DAKO)等显色底物。在培养过程中，在显微镜下间断地观察显色的程度，在确认到适当显色的阶段，将组织样本浸在PBS中，从而停止可视化反应。
使用碱性磷酸酶作为二次抗体的标记物质时，用BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)/NBT(硝基蓝四唑)(Zymed)底物溶液(在含有10mM浓度的MgCl2和28mM浓度的NaCl的pH9.8的50mM碳酸钠缓冲液中溶解有0.4mM浓度的NBT和0.38mM浓度的BCIP的溶液)培养组织样本。另外，除了BCIP和NBT以外，还可以适当使用Permanent Red、Fast Red或Fuchsin+(以上，DAKO)等。在培养之前，可以将组织样本和包含1mM浓度的作为内源性碱性磷酸酶抑制剂的氯化左旋咪唑(Nacalai Tesque)、0.1M氯化钠和50mM氯化镁的0.1M Tris-盐酸缓冲液(pH9.5)在室温下预培养1分钟～数小时。在培养过程中，在显微镜下间断地观察，在观察到作为反应最终产物的紫色甲臜沉淀的阶段，在水洗或通过包含2%聚乙烯醇的TBS使反应停止后，用TBST(包含0.1%Tween20的TBS)清洗组织样本。使用胶体金作为二次抗体的标记时，通过银增敏使金属银附着在金颗粒上，从而使胶体金可视化。银增敏的方法为本领域技术人员所公知。
使用FITC(异硫氰酸荧光素)或Cy2(Amersham)、Alexa488 (Molecular Probe)等荧光色素作为二次抗体的标记物质时，不需要进行可视化物质的反应步骤，照射该荧光物质的激发波长的光，通过使用荧光显微镜可以适当检测发出的光。
在本发明中，如上所述检测从被测对象中分离的组织样本中所含的上皮调节蛋白。所检测的该组织样本中所含的上皮调节蛋白是否在含有癌细胞的组织中高度表达，可以根据将通过上述组织免疫学染色法得到的染色图形数值化而得到的染色强度分数来判定。作为染色图形数值化的一个非限定性方案，例如例示如下所述的判定标准。
-染色强度分数0：在检体组织中的肿瘤细胞中没有呈上皮调节蛋白阳性的细胞。或不足10%；
-染色强度分数1：在检体组织中的肿瘤细胞中呈上皮调节蛋白阳性的细胞为10%以上，但具有局限于一部分肿瘤细胞的膜的弱染色强度；
-染色强度分数2：在检体组织中的肿瘤细胞中呈上皮调节蛋白阳性的细胞为30%以上，或者在检体组织中的肿瘤细胞中呈上皮调节蛋白阳性的细胞为10%以上，具有局限于肿瘤细胞膜的中程度的染色强度；
-染色强度分数3：在检体组织中的肿瘤细胞中呈上皮调节蛋白阳性的细胞为60%以上，或者在检体组织中的肿瘤细胞中呈上皮调节蛋白阳性的细胞为10%以上，并具有局限于肿瘤细胞膜的强度的染色强度。
另外，在本发明中，根据通过上述组织免疫学染色法得到的染色图形数值化的染色强度分数进行从被测对象中分离的组织样本中所含的上皮调节蛋白的表达量的判定时，还可以与检测校正用而制备的预先确定上皮调节蛋白的表达量的染色图形的图像进行比较。确定上皮调节蛋白的表达量时，可以适当采用使用荧光标记珠粒的公知方法，所述荧光标记珠粒在制作用于抗原定量的标准曲线中使用(例如BD Quantibrite PETM等)。
通过上述方法，能够确定从被测对象中分离的组织样本中所含的上皮调节蛋白是否高度表达。作为高度表达的例示，例如，在换算成每个细胞的上皮调节蛋白分子的表达数时，可以从1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×105、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107的范围内适当选择。
需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参照而纳入本说明书中。
实施例
以下，通过实施例来具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
[实施例1] 嵌合抗体EP27的人源化
1-1．人源化用构架序列的选定
实施由小鼠可变区和人IgG1恒定区构成的嵌合抗体EP27(WO2008/047723记载)的人源化。CDR、FR的确定遵照Kabat的定义(Kabat编号)。
最初，通过比较数据库上的人抗体可变区序列和EP27小鼠可变区序列，选择可以用作人源化模板的以下的人FR序列。数据库利用IMGT Database (http://www.imgt.org/)和NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。表2显示所选择的FR序列。
[表2]
构架 登录号 数据库名称 SEQ ID NO
H链FR1 M99642 IMGT数据库 1
H链FR2 L22582 IMGT数据库 2
H链FR3 A252274 NCBI GenBank 3
H链FR4 J00256 IMGT数据库 4
L链FR1 M64856 IMGT数据库 5
L链FR2 X01668 IMGT数据库 6
L链FR3 M64856 IMGT数据库 7
L链FR4 J00242 IMGT数据库 8
接下来，通过将EP27可变区的H链和L链的CDR序列(表3、SEQ ID NO: 9～14)与上述选择的人FR连接，设计人源化抗体可变区序列。这些序列作为人源化H链可变区序列HA(SEQ ID NO: 15)、人源化L链可变区序列LA(SEQ ID NO: 16)。
[表3]
CDR SEQ ID NO
H链CDR1 9
H链CDR2 10
H链CDR3 11
L链CDR1 12
L链CDR2 13
L链CDR3 14
1-2．EP27人源化可变区HJ的设计
据报道，在表2中选择的H链FR1的序列中，以Kabat编号表示的第2位、第4位、第24位、第27位、第29位氨基酸残基形成上部核心，有助于抗体结构的稳定化(Ewert等人(Methods. 2004 Oct; 34(2): 184-99))。另外，在Chothia的定义中，以Kabat编号表示的第26～30位的氨基酸残基包含在CDR1中(Honegger等人, J. Mol. Biol. (2001) 309,657-670)。根据这些信息，为了制作具有与嵌合抗体EP27同等的抗原结合活性的人源化抗体，将相当于上述的氨基酸残基还原成存在于EP27小鼠可变区序列中的残基。因此，重新设计了表2中选择的人H链FR1(SEQ ID NO: 1)的以Kabat编号表示的2位、24位、27位、28位、29位、30位的氨基酸残基被还原成存在于EP27小鼠可变区序列中的氨基酸残基的人源化H链FR1(表4、SEQ ID NO: 17)。
在表2中选择的H链FR3的序列中，以Kabat编号表示的93位氨基酸残基是Ala，但EP27小鼠可变区序列的氨基酸残基是Val。由小鼠和人的种系序列的数据库IMGT Database(http://www.imgt.org/)确认到：在该位点包含Val的序列少。认为EP27小鼠可变区序列中所含的以Kabat编号表示的93位的Val参与抗原结合，所以重新设计了在表2中选择的人H链FR3(SEQ ID NO: 3)的Kabat 93位的氨基酸残基被存在于EP27小鼠可变区序列中的残基取代的人源化H链FR3(表4、SEQ ID NO: 18)。
由人源化H链可变区序列HA(SEQ ID NO: 15)设计了包含重新设计的表4所示的FR1(表4、SEQ ID NO: 17)和FR3(表4、SEQ ID NO: 18)的人源化H链可变区序列HJ(SEQ IDNO: 19)。
[表4]
修饰FR SEQ ID NO
H链FR1 17
H链FR3 18
1-3．EP27人源化可变区LB、L18的设计
在表2中选择的L链FR2的序列中，以Kabat编号表示的49位是Tyr，但在EP27小鼠可变区序列中是Gln。由小鼠和人的种系序列的数据库IMGT Database(http://www.imgt.org/)确认到：在该位点包含Gln的序列少。因此，暗示EP27小鼠可变区序列中所含的49位的Gln有可能参与抗原结合。由此，重新设计了在表2中选择的人L链FR2(SEQ IDNO: 6)的以Kabat编号表示的49位的氨基酸残基被EP27小鼠可变区序列的氨基酸残基取代的人源化L链FR2(表5、SEQ ID NO: 20)。
据报道，在表2中选择的L链FR3的序列中，以Kabat编号表示的71位形成上部核心，有助于抗体结构的稳定化(Ewert等人(Methods. 2004 Oct; 34(2): 184-99))。为了制作具有与嵌合抗体EP27同等的抗原结合活性的人源化抗体，而将相当于上述的氨基酸残基取代成EP27小鼠可变区序列的氨基酸残基，所以重新设计了在表2中选择的人L链FR3(SEQ IDNO: 7)的以Kabat编号表示的71位的氨基酸残基被取代成EP27小鼠可变区序列的氨基酸残基的人源化L链FR3(表5、SEQ ID NO: 21)。
由人源化L链可变区序列LA(SEQ ID NO: 16)，设计了包含重新设计的FR2、FR3(表5、SEQ ID NO: 20、21)的人源化L链可变区序列LB(SEQ ID NO: 22)。
另外，由人源化L链可变区序列LA(SEQ ID NO: 16)，设计了包含重新设计的FR2(表5、SEQ ID NO: 20)和登录号AB064134(NCBI GenBank)中记载的人抗体L链序列的FR3(表5、SEQ ID NO: 23)的人源化L链可变区序列L18(SEQ ID NO: 24)。
[表5]
修饰FR SEQ ID NO
H链FR2 20
H链FR3 21
H链FR3 23
1-4．EP27人源化抗体序列的制作
最初，为了制作EP27人源化可变区的cDNA，分别设计了H链(HJ)、L链(LB)的合成寡DNA。接下来，混合各合成寡DNA，通过装配PCR法等本领域技术人员公知的方法扩增编码EP27人源化抗体可变区的基因片段。最后，利用适当的动物细胞表达载体克隆所得的扩增片段，将其与人IgG1恒定区基因连接。得到的表达载体的核苷酸序列通过本领域技术人员公知的方法来确定。
作为来源于人IgG抗体的H链C末端序列(G1、SEQ ID NO: 25)的异质性，有人报道了C末端氨基酸的赖氨酸残基的缺陷和由C末端的两个氨基酸甘氨酸、赖氨酸两者的缺陷导致的C末端氨基的酰胺化(Anal Biochem. 2007 Jan 1; 360(1): 75-83.)。作为降低这些异质性的方法，已知有使H链C末端的两个氨基酸、即以EU编号表示的446位的甘氨酸和447位的赖氨酸缺损的方法(WO 2009/041613)。在EP27 人源化抗体的情况下，也希望不存在来源于H链C末端序列的异质性，所以使人IgG1的以EU编号表示的446位的甘氨酸和447位的赖氨酸缺损了的IgG1序列(G1d、SEQ ID NO: 26)可以用作恒定区序列。另一方面，作为L链恒定区，天然型人κ链(k、SEQ ID NO: 27)可以用作恒定区序列。作为如上操作得到的EP27人源化抗体序列的H链，制作了HJ-G1d(SEQ ID NO: 28)，作为L链制作了LB-k(SEQ ID NO:29)。需要说明的是，在IgG1恒定区中虽然报道了同种异型(Jefferis等人, mAbs 1:4, 1-7; July/August 2009)，但除上述记载的IgG1的G1m17,1型恒定区(SEQ ID NO: 26)以外，G1m17型(SEQ ID NO: 30)或G1m3型(SEQ ID NO: 31)也可用于制作EP27人源化抗体。
1-5．EP27人源化抗体的评价
为了评价已制作的EP27人源化抗体序列，通过使H链(HJ-G1d、SEQ ID NO: 28)和L链(LB-k、SEQ ID NO: 29)共表达，得到EP27人源化抗体HJ-G1d/LB-k。具体而言，通过将上述制作的H链表达载体和L链表达载体一过性地导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen)中，使抗体表达。使用rProtein ASepharoseTM Fast Flow(GE healthcare)等，按照本领域技术人员公知的方法，从得到的培养上清中纯化抗体。用分光光度计测定(波长280nm)包含抗体的溶液，使用得到的吸光度和通过PACE法算出的吸光系数，算出抗体浓度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。另外，作为对照，使用H链(cH-G1、SEQ ID NO: 32)和L链(cL-k、SEQ ID NO: 33)，利用相同的方法还制作了作为嵌合抗体EP27的cH-G1/cL-k。
利用针对嵌合抗体EP27的上皮调节蛋白结合抑制评价***(参考例5)，评价EP27人源化抗体对人上皮调节蛋白(SEQ ID NO: 167)的结合能力。以嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)的IC50浓度为100时，EP27人源化抗体HJ-G1d/ LB-k的值为24。
1-6．与嵌合抗体具有同等活性的EP27人源化抗体的制作
设计了将EP27人源化抗体的H链序列HJ-G1d的FR序列的一部分氨基酸残基取代成EP27小鼠可变区序列的氨基酸残基的序列。最初，由以Kabat编号表示的75-76位氨基酸残基为人FR3序列的氨基酸残基的Thr-Asp设计了被取代成EP27小鼠可变区序列中所包含的氨基酸残基即Ser-Asn的序列(SEQ ID NO: 35)、以及只有76位的Asp被取代成作为EP27小鼠可变区序列的氨基酸残基的Asn的序列(SEQ ID NO: 36)(表6)。接下来，通过向包含人源化H链可变区序列HJ-G1d(SEQ ID NO: 28)的表达载体中导入突变，制作具有表6所示的FR3序列(SEQ ID NO: 35)的人源化H链可变区序列即HS-G1d(SEQ ID NO: 37)。氨基酸残基取代的导入利用PCR法等按照本领域技术人员公知的方法进行。同样，制作了包含表6所示的FR3序列(SEQ ID NO: 36)的人源化H链可变区序列即HY-G1d(SEQ ID NO: 38)。利用与实施例1-4相同的方法，得到EP27 人源化抗体HS-G1d/LB-k、HY-G1d/LB-k和HY-G1d/L18-k。所得抗体对人上皮调节蛋白的结合能力作为针对嵌合抗体EP27的上皮调节蛋白结合抑制(参考例5)来评价。其结果，以嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)的IC50浓度为100时，EP27人源化抗体HS-G1d/LB-k、HY-G1d/LB-k和HY-G1d/L18-k的IC50浓度分别为142、146、100。
由以上结果发现了：通过人源化与嵌合抗体EP27相比免疫原性风险降低，而且与嵌合抗体EP27具有同等抗原结合能力的EP27人源化抗体序列。
[表6]
修饰FR SEQ ID NO
H链FR3 35
H链FR3 36
[实施例2] 抑制脱酰胺化、异构化、水解反应的突变的导入
虽然药物中使用的抗体是由来自单一的抗体产生细胞的克隆得到的单克隆抗体，但却存在异质性。已知这种抗体的异质性通过氧化、脱酰胺化、异构化、水解等修饰而产生，以抗体为代表的蛋白在长期保存中或暴露于热应激、光应激等应激条件下而使异质性增加(Heterogeneity of Monoclonal Antibodies: Journal of pharmaceutical sciences,第97卷, No.7, 2426-2447)。但是，在开发抗体作为药物时，其蛋白的理化性质、其中均匀性和稳定性非常重要，希望降低目标物质的异质性，尽可能是单一物质。
脱酰胺化反应是指，在天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链中非酶性地发生，将天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链中存在的酰胺转变成羧酸的反应。另外，异构化起因于：位于天冬酰胺和天冬氨酸的侧链的羰基对位于C末端侧的残基的氮原子电子对发起攻击，结果，通过天冬酰胺的脱酰胺化或天冬氨酸的脱水而形成不稳定的环状酰亚胺中间体。该中间体通过开裂，大部分变成异天冬氨酸，剩余部分变成天冬氨酸。在这些抗体等的蛋白的保存中发生的脱酰胺化、异构化反应成为上述异质性的原因，所以希望尽可能得到抑制。另外，据报道，脱酰胺化反应特别是在天冬酰胺和甘氨酸相邻的位点(Asn-Gly)容易发生(Geiger等人, J.Biol. Chem. 1987; 262:785-794)。而且，有报道称：天冬氨酸通过水解反应而发生肽链的断裂，特别是C末端侧存在脯氨酸的序列(Asp-Pro)容易发生酸性条件下的分解(Segalas等人, FEBS Letters 1995; 371: 171-175 )。
在人源化H链可变区序列HY的CDR序列中，天冬酰胺和天冬氨酸残基存在于以Kabat编号表示的31位(Asp)、52位(Asp)、54位(Asn)、56位(Asn)、101位(Asp)。在人源化L链可变区序列LB的CDR序列中，天冬酰胺和天冬氨酸残基存在于以Kabat编号表示的28位(Asp)、92位(Asp)、93位(Asn)。通过这些位点的氨基酸残基的取代，研究能否获得脱酰胺化、异构化、水解反应得到抑制的修饰体。
为了抑制由氨基酸残基取代引起的上述分解反应，将该残基取代成不同的残基。具体而言，作为包含表7所示的CDR序列(SEQ ID NO: 39～46)的H链基因，制作了H71-G1d(SEQ ID NO: 49)、H57-G1d(SEQ ID NO: 50)、H61-G1d(SEQ ID NO: 51)、H65-G1d(SEQ IDNO: 52)、H66-G1d(SEQ ID NO: 53)、H67-G1d(SEQ ID NO: 54)、H23-G1d(SEQ ID NO: 55)、H40-G1d(SEQ ID NO: 56)。同样，作为包含表7所示的CDR序列(SEQ ID NO: 47、48)的L链基因，设计了L30-k(SEQ ID NO: 57)、L32-k(SEQ ID NO: 58)。利用实施例1的方法，将导入了残基取代的H链基因载体与LB-k载体共表达，得到EP27人源化抗体H71-G1d/LB-k、H57-G1d/LB-k、H61-G1d/LB-k、H65-G1d/LB-k、H66-G1d/LB-k、H67-G1d/LB-k、H23-G1d/LB-k、H40-G1d/LB-k。同样，将导入了残基取代的L链基因载体与HY-G1d载体共表达，得到了EP27人源化抗体HY-G1d /L32-k。所得抗体对人上皮调节蛋白的结合能力作为针对嵌合抗体EP27的上皮调节蛋白结合抑制(参考例5)来评价，结果见表8。由此，确认了包含表7所示的序列的抗体具有与嵌合抗体EP27同等的结合活性。由以上结果，发现了脱酰胺化、异构化反应等化学分解得到抑制的EP27人源化抗体序列。
[表7]
[表8]
(IC50浓度：以嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)的IC50浓度为100时的各抗体的IC50浓度)
[实施例3] 改变等电点的突变的导入
作为控制抗体的血浆中半衰期的方法之一，已知有修饰暴露于抗体分子表面的氨基酸残基，控制抗体分子表面电荷的方法(WO2007/114319和WO2009/041543)。具体而言，已知通过降低抗体所具有的等电点(pI)的值，可以延长抗体的血浆中半衰期。与此相反，已知通过升高抗体的等电点，血浆中半衰期缩短，抗体的组织转移性提高(Vaisitti等人(J.Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112)、Pardridge等人(J.Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554))。
由以上可知：改变了等电点的EP27人源化抗体通过延长血浆中半衰期或者提高组织转移性，期待着更强的抗肿瘤活性。于是，在不影响EP27 人源化抗体对抗原的结合活性或其立体结构的情况下，尝试着鉴定通过调节抗体分子表面的电荷可以控制抗体的药物动力学的氨基酸残基。具体而言，探索了不使EP27人源化抗体HY-G1d/LB-k (H链HY-G1d、SEQID NO: 38和L链LB-k、SEQ ID NO: 29)的抗原结合抑制活性大幅降低、而可以降低其等电点的突变位点。
使用EP27人源化抗体HY-G1d/LB-k的立体结构模型，筛选不使与上皮调节蛋白的结合大幅降低而使可变区的等电点发生变化的残基。具体而言，作为包含表9所示的CDR序列(SEQ ID NO: 59～71)的任一个或几个的H链基因，设计了H3-G1d(SEQ ID NO: 72)、H5-G1d(SEQ ID NO: 73)、H6-G1d(SEQ ID NO: 74)、H7-G1d(SEQ ID NO: 75)、H8-G1d(SEQ IDNO: 76)、H9-G1d(SEQ ID NO: 77)、H10-G1d(SEQ ID NO: 78)、H31-G1d(SEQ ID NO: 79)。同样，作为包含表9所示CDR序列的L链基因，设计了L1-k(SEQ ID NO: 80)、L2-k(SEQ IDNO: 81)、L12-k(SEQ ID NO: 82)、L20-k(SEQ ID NO: 83)、L21-k(SEQ ID NO: 84)、L23-k(SEQ ID NO: 85)。利用实施例1的方法，使导入了残基取代的H链基因载体与LB-k载体共表达，得到了EP27 人源化抗体H3-G1d/LB-k、H5-G1d/LB-k、H6-G1d/LB-k、H7-G1d/LB-k、H8-G1d/LB-k、H9-G1d/LB-k、H10-G1d/LB-k、H31-G1d/LB-k。同样，使导入了残基取代的L链基因载体与HY-G1d载体共表达，得到了EP27 人源化抗体HY-G1d /L1-k、HY-G1d /L2-k、HY-G1d/L12-k、HY-G1d /L63-k。所得抗体对人上皮调节蛋白的结合能力作为针对嵌合抗体EP27的上皮调节蛋白结合抑制(参考例5)来评价。其结果，如表10所示，各EP27人源化抗体的抗原结合能力与嵌合抗体EP27同等。通过以上研究，发现了能够改变抗体的等电点的EP27人源化抗体序列。
[表9]
[表10]
(IC50浓度：以嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)的IC50浓度为100时的各抗体的IC50浓度)
[实施例4] 减少缔合体量的突变的导入
控制蛋白药物的缔合体量在质量管理上、以及考虑对药效和免疫原性的影响时是非常重要的(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714)。通常，缔合化对起因于蛋白溶液环境的胶体稳定性和起因于蛋白结构的构象稳定性两者有影响(J. Pharm.Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315)。通过研究抗体制剂的配方，筛选抗体浓度或pH、缓冲液种类、离子强度、添加剂等，从而可以得到对胶体稳定性有效的理想条件。另一方面，构象稳定性还存在依赖于氨基酸序列的部分，当为抗体时，认为维持CDR的规范结构或FR的共有序列、VH/VL界面等的特征性结构较为重要(Jung等人(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3),701-716)、Xiang等人(J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390)、Ewert等人(Methods.(2004) 34 (2), 184-199)、Vargas-Madrazo等人(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3),113-120)、Morea等人(J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294)、Vargas-Madrazo 等人(J.Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120))。
从上述观点考虑，在本发明中进行了以制备结构更稳定的人源化抗体为目标的设计。其结果，发现了EP27人源化抗体HY-G1d/LB-k。为了进一步减少HY-G1d/LB-k所含的缔合体量，将HY-G1d/LB-k的CDR内所含的疏水性残基取代成亲水性残基，研究了基于减弱分子间的疏水性相互作用的缔合化抑制效果。
具体而言，作为在EP27人源化抗体HY-G1d/LB-k (H链HY-G1d/SEQ ID NO: 38、L链LB-k /SEQ ID NO: 29)中导入了表11所示的CDR序列(SEQ ID NO: 86～91)中的任一种的H链基因，设计了H25-G1d(SEQ ID NO: 92)、H41-G1d(SEQ ID NO: 93)、H42-G1d(SEQ ID NO:94)、H43-G1d(SEQ ID NO: 95)、H44-G1d(SEQ ID NO: 96)、H45-G1d(SEQ ID NO: 97)。利用实施例1的方法，将残基被取代的H链基因载体和LB-k载体共表达，得到EP27人源化抗体H25-G1d/LB-k、H41-G1d/LB-k、H42-G1d/LB-k、H43-G1d/LB-k、H44-G1d/LB-k、H45-G1d/LB-k。利用凝胶过滤层析法(参考例9)测定这些EP27人源化抗体中所含的缔合体量，结果见表12。由此，发现了与嵌合抗体EP27(cH-G1d/cL-k)相比缔合体量大幅减少的EP27人源化抗体序列。
[表11]
[表12]
另外，所得抗体对人上皮调节蛋白的结合能力作为针对嵌合抗体EP27的上皮调节蛋白结合抑制(参考例5)来评价。如表13所示，各EP27人源化抗体的抗原结合能力与嵌合抗体EP27同等。通过上述研究，发现了其缔合体量得到抑制、且与嵌合抗体EP27具有同等抗原结合能力的EP27人源化抗体序列。
[表13]
(IC50浓度：以嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)的IC50浓度为100时的各抗体的IC50浓度)
而且，作为包含实施例1～4中发现的氨基酸残基取代的序列任意组合得到的EP27人源化抗体而设计的以下抗体；
H87-G1d/LB-k(H链：SEQ ID NO: 98、L链：SEQ ID NO: 29)、
H87-G1d/L21-k (H链：SEQ ID NO: 98、L链：SEQ ID NO: 84)、
H87-G1d/L37-k(H链：SEQ ID NO: 98、L链：SEQ ID NO: 99)通过实施例1的方法来制作。对人上皮调节蛋白的结合能力作为针对嵌合抗体EP27的上皮调节蛋白结合抑制(参考例5)来评价。其结果，如表14所示，所有抗体均与嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)具有同等的结合能力。另外，通过凝胶过滤层析法(参考例9)测定这些EP27人源化抗体中所含的缔合体量，使用差示扫描量热分析仪(参考例10)测定Fab的热变性中间温度(Tm)，再利用等电点电泳法(参考例11)测定等电点(pI)。如表14所示，确认了：与嵌合抗体EP27(cH-G1d/cL-k)相比，其缔合体量大幅减少，且其Tm值上升。由此，发现了实施例1～4所示的实现了人源化的免疫原性风险降低、化学分解抑制、等电点降低、缔合体量减少的EP27人源化抗体序列。
[表14]
(IC50浓度：以嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)的IC50浓度为100时的各抗体的IC50浓度)
[实施例5] 猴抗原结合能力的改善和降低免疫原性的突变的导入
开发药物时，通常认为临床前试验中的毒性安全性评价是用于确定临床试验中的给药量或评价各种风险的重要研究。当为抗体药物时，有时其抗原结合特异性会限制临床前试验中使用的动物种类的选择，往往会选择与人在遗传上接近的灵长类。但是，在目标抗体不与灵长类抗原结合、或者其结合能力与对人抗原的结合能力相比明显不同时，有时无法判断使用灵长类的评价是否妥当。为了应对这种情况，通过使用与所用动物种的抗原结合的替代抗体、或者使用人抗原转基因动物，尝试着评价临床前试验中的毒性安全性(Chapman等人(Nat. Rev. Drug Discov. (2007) 6, 120-126))。
作为改变目标抗体的抗原结合能力的方法，利用噬菌体文库或核糖体展示的亲和性成熟等本领域技术人员公知的方法进行的氨基酸残基取代是有效的。另外，还可以根据抗原和抗体可变区结合位点的立体结构，利用计算科学方法改善种属交叉性(Farady等人,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 3744-3747)。但是，不依赖于大规模的筛选或计算科学的方法而改变抗人上皮调节蛋白抗体对抗原的结合能力的报道尚无。另外，猴上皮调节蛋白与人上皮调节蛋白的结构上的差异也尚未明确，所以修饰抗人上皮调节蛋白抗体的哪个氨基酸残基时可以增强对猴上皮调节蛋白的结合活性的指导完全没有显示。在本发明中，设计了CDR的任意位点的氨基酸残基被取代的多个抗体序列。利用实施例1的方法，进行这些残基已被取代的抗体基因的制作和抗体表达。具体而言，设计了表15所示的H链CDR2和CDR3、L链CDR3被取代成Arg残基的序列，制作表16所示的抗体。使用利用了表面等离子体散射的装置(BIACORE)，评价对人和猴上皮调节蛋白的亲和性(参考例6)。
其结果，发现了：与嵌合抗体EP27相比对人上皮调节蛋白的亲和性没有降低、对猴上皮调节蛋白的亲和性增强、且作为显示猴上皮调节蛋白与人上皮调节蛋白的交叉性的指标的亲和比(＝对猴上皮调节蛋白的KD值/对人上皮调节蛋白的KD值)小的EP27人源化抗体序列(图1和2)。
[表15]
[表16]
另外，在医用药物的开发中，给药后出现对抗药物的抗体是药效、安全性上的课题。因此，降低目标药物的免疫原性的操作较为重要。作为预测生物制剂的免疫原性的方法，存在体内、体外、in silico(计算机芯片上)的方法，关于与实际临床中的抗药物抗体的出现率的关系还未见报道(Baker等人(Curr. Drug Saf. (2010) 5 (4), 308-313;Bryson等人(BioDrugs. (2010) 24 (1), 1-8); Groot等人(Curr. Opin. Pharmacol.(2008) 8 (5), 620-626)。在本发明中，也利用参考例13记载的方法预测T-细胞表位，从而不会损及目标抗体的抗原结合能量，并且可以预测降低免疫原性风险的EP27人源化抗体序列。
对于包含实施例1～4中发现的修饰的序列，设计了对猴上皮调节蛋白的亲和性的改善和/或降低免疫原性的突变任意组合而得到的序列。如此设计的表17(SEQ ID NO: 115～150)所示的EP27人源化抗体通过实施例1的方法来制作。表17记载的EP27人源化抗体的突变CDR序列见表18。对人和猴上皮调节蛋白的亲和性的评价使用利用了表面等离子体散射的装置(BIACORE)(参考例6)。如图3所示，各EP27 人源化抗体对人上皮调节蛋白的亲和性与嵌合抗体EP27(cH-G1/cL-k)的亲和性同等。另外，作为显示猴抗原与人抗原的亲和性的差异的指标，比较亲和比(＝对猴上皮调节蛋白的KD值/对人上皮调节蛋白的KD值)时，确认到：与嵌合抗体相比，各EP27 人源化抗体对两种抗原的亲和性的差异大幅减少(图4)。由此，发现了对人上皮调节蛋白的亲和性没有降低而对猴上皮调节蛋白的亲和性得到改善的EP27人源化抗体序列。
[表17]
[表18]
而且，通过凝胶过滤层析法测定了这些EP27人源化抗体中所含的缔合体量(参考例9)，并利用差示扫描量热分析仪(参考例10)测定了由这些EP27人源化抗体制备的Fab的热变性中间温度(Tm)。如表19所示，与嵌合抗体EP27(cH-G1d/cL-k)相比，确认到缔合体量大幅减少、且Tm值上升。由此，发现了实施例1～5中所示的具有人源化的免疫原性风险降低、化学分解抑制、等电点降低、缔合体量减少、对猴抗原的结合能力改善的EP27人源化抗体序列。
[表19]
(KD比表示以cH-G1/cL-k为1时的相对比。)
[实施例7] 使用人外周血单核细胞作为效应细胞的各被测抗体的ADCC活性
使用人外周血单核细胞(以下，称为人PBMC。)作为效应细胞，如下测定各被测抗体的ADCC活性。来源于人的效应细胞使用从人外周血中采集的单核细胞组分。其结果，明确了：用于试验的所有EP27人源化抗体对MIA PaCa-2细胞均诱导ADCC(参考例7) (图5)。
[实施例8] 抗上皮调节蛋白单克隆抗体对由人或猴上皮调节蛋白产生的细胞增殖刺激的中和活性的测定
在实施例5中发现了与猴的亲和性增强的EP27人源化抗体序列。因此，为了评价在细胞中的活性，测定EP27人源化抗体对由猴和人上皮调节蛋白产生的细胞增殖刺激的中和活性。细胞使用BAF_EGFR，研究这次评价的所有EP27人源化抗体抑制人和猴上皮调节蛋白依赖性的EGFR_BAF细胞增殖的中和活性(参考例8)，与嵌合抗体相比，所有的EP27人源化抗体对猴上皮调节蛋白的中和活性均增强(图6、7)。
[实施例9] 使用体内模型的EP27人源化抗体的药效试验
使用移植了人肿瘤的小鼠模型，评价在实施例7和实施例8中确认了体内细胞活性的EP27人源化抗体在体内的抗肿瘤活性(参考例14)。关于所评价的MIA PaCa-2和DLD-1人癌细胞移植小鼠模型中的各被测抗体的抗肿瘤效果，通过测定从给予给药样品的最终日起7天后的肿瘤体积来进行评价。其结果，如图8所示，以0.4mg/kg和2mg/kg给予cH-G1/cL-k抗体、H206-G1d/L73-k抗体、H240-G1d/L73-k抗体的各抗体时，在动物模型中也确认到了已修饰的EP27人源化抗体产生的优异的药效。
[实施例10] 使用抗上皮调节蛋白抗体的免疫组织化学染色
使用EP27抗体，确立了反映抗原表达量的免疫组织化学染色方法。使用向scid小鼠体内移植了作为表达量不同的EREG强制表达细胞株的SKE-18(其抗原量估计为7.7×103)、SKE-23 (其抗原量估计为6.1×104)、SKE-4B2(其抗原量估计为2.9×105)和宿主细胞的SK-HEP-1 (抗原量8.4×102)的组织的石蜡包埋块，进行免疫组织化学染色。关于由这些石蜡块作成的薄切组织切片中的EREG的表达，通过在以EP27抗体作为一次抗体的培养后，再与作为二次抗体的兔抗小鼠IgG多克隆抗体(Jackson Imunoresearch Laboratories)、作为三次抗体的聚合物-HRP(Dako cytomation)结合山羊抗兔IgG抗体进行反应，以二氨基联苯胺作为底物而被可视化。如图10所示，被染色的细胞·组织根据EREG的表达量来确认染色性的等级性。另外，根据这些细胞的表达量，确认了H240-G1d/L73-k抗体在体外的ADCC活性(图11)。在上述试验中，作为H240-G1d/L73-k抗体，使用了低岩藻糖抗体。该低岩藻糖抗体通过WO2004/065540中记载的方法来制作。以下，该低岩藻糖抗体还被称为EP27人源化Glycomab抗体。除了确认对上述4个EREG强制表达细胞株的ADCC活性以外，还确认了H240-G1d/L73-k抗体(EP27人源化Glycomab抗体)对抗原量估计为2.8×104的SKE-10和SKE-15的体外ADCC活性。与图11一样，根据这些细胞的表达量确认到了H240-G1d/L73-k抗体在体外的ADCC活性(表20)。而且，根据这些细胞的表达量还确认了H240-G1d/L73-k抗体(EP27人源化Glycomab抗体)在体内的肿瘤增殖抑制活性(图12)。即，通过免疫组织化学染色法确认了EREG的表达量的评价与药效之间相关。
[表20]
[实施例11] 临床低分化大肠癌中的EREG的表达
为了研究低分化大肠癌的9例临床病例中的EREG表达，通过实施例10记载的染色法对该病例的石蜡包埋薄切标本进行染色时，在7/9病例中确认到了明确的阳性图像(图13)。
[实施例12] EP27人源化Glycomab抗体对大肠癌干细胞的肿瘤发生的药效
对于在腹股沟部移植了由人大肠癌肿瘤模型PLR123 (WO02012/046797)分离的细胞数为1×106的大肠癌干细胞的SCID小鼠，从给予该干细胞的第二天起以10mg/kg每周给予一次EP27人源化Glycomab抗体。其结果，进行Wilcoxon符号秩检验(SAS***8.02 TS水平02M0和SAS临床前包装 版5.00.010720)时，在移植后第29天，如图14所示，与对照组相比，在抗体组中肿瘤发生被显著抑制。
[实施例13] EP27人源化Glycomab抗体对大肠癌干细胞转移的药效
对于从尾静脉移植了由人大肠癌肿瘤模型PLR123分离的细胞数为2×106的大肠癌干细胞的SCID-beige小鼠，在给予该干细胞的3天后，以10mg/kg每周给予一次EP27人源化Glycomab抗体。其结果，在移植后第52天，如图15所示，与对照组相比，在抗体给药组中确认到小鼠肺中的肿瘤块数(转移病灶数)和肿瘤块大小(转移病灶直径)被显著抑制。
[实施例14] EP27人源化Glycomab抗体对低分化大肠癌的药效
对于移植了人低分化大肠癌肿瘤COL-53-JCK(实验动物中央研究所)的肿瘤组织片的SCID小鼠，从该肿瘤组织片移植后第14天起，以10mg/kg每周给予一次EP27人源化Glycomab抗体。其结果，在给予该抗体开始后第14天评价肿瘤体积时，与对照组相比，在抗体给药组中确认到肿瘤增殖被显著抑制(图16)。
[实施例15] EP27人源化Glycomab抗体对中分化大肠癌的药效
作为人中分化大肠癌肿瘤模型的PLR379(PCT/JP2012/072852)中的肿瘤具有观察到肿瘤出芽的形态上的特征，但上皮调节蛋白的表达的检测并不依赖于肿瘤出芽的部位。对于移植了该PLR379的肿瘤组织片的SCID小鼠，从该肿瘤组织片移植后第21天起以10mg/kg每周给予一次EP27人源化Glycomab抗体。在给予该抗体开始后第18天评价肿瘤体积时，与对照组相比，在抗体给药组中确认到肿瘤增殖被显著抑制(图17)。
[实施例16] 临床肺腺癌中的EREG的表达
为了研究肺腺癌的7例临床病例中的EREG表达，将该病例的石蜡包埋薄切标本通过实施例10记载的染色法进行染色。其结果，在4/7病例中确认到了明确的阳性图像(图18)。
[实施例17] 使用人外周血单核细胞作为效应细胞的EP27人源化Glycomab抗体的ADCC活性
对于人肺腺癌株Calu-3，评价使用人PBMC作为效应细胞的ADCC活性。其结果，确认到EP27人源化Glycomab抗体对于Calu-3细胞诱导ADCC。(图19)。
[实施例18] EP27人源化Glycomab抗体对肺腺癌的药效
对于移植了人肺腺癌模型Calu-3的肿瘤组织片的SCID小鼠，从该肿瘤移植片移植后第13天起，以10mg/kg每周给予一次EP27人源化Glycomab抗体。在给予该抗体开始后第28天测定肿瘤体积时，与对照组相比，在抗体给药组中确认到肿瘤增殖被显著抑制(图20)。
[实施例19] EP27人源化抗体的细胞内化
EP27人源化抗体的细胞内化通过以下的***进行评价。若一次抗体内化，则二次抗体所抱合的核糖体失活蛋白-皂草毒蛋白经由二次抗体与一次抗体的结合，被输送到细胞内。若发生内化，则皂草毒蛋白从IgG抱合体中分离，抑制蛋白合成，最终引起细胞死亡。在每个孔中以1×103细胞的细胞密度分别接种了表达EREG的细胞株DLD-1、或作为对照的细胞株SK-HEP1的96-孔微板的各孔中，在接种的第二天添加作为一次抗体的EP27人源化Glycomab抗体、作为二次抗体的识别结合有核糖体失活蛋白的人单克隆抗体的山羊IgG、Hum-ZAP(Advanced Targeting Systems)。添加的4天后，通过WST8(Dojindo)评价细胞存活率。如图21所示，EP27 人源化Glycomab抗体只对表达EREG的细胞株DLD-1引起细胞毒。另一方面，对于用作对照的细胞株SK-HEP1没有引起细胞毒。
[参考例1] 人和食蟹猴上皮调节蛋白基因的分离
利用标准方法(standard method)分离全长人EREG cDNA(CR541887、SEQ ID NO:169)，将其基因片段克隆到哺乳细胞表达用载体(pMCN)中而得到的质粒命名为hEREG/pMCN。pMCN是可以在小鼠CMV启动子(ACCESSION No. U 68299)下表达诱导外来基因、并且***有新霉素抗性基因的载体。关于全长食蟹猴EREG cDNA，根据恒河猴EREG cDNA(XM_001102069)序列信息，将利用标准方法从食蟹猴cDNA文库中分离的基因片段(编码SEQ IDNO: 165的基因片段)克隆到哺乳细胞表达用载体(pMCN)中而得到的质粒命名为cyEREG/pMCN。通过电穿孔将hEREG/pMCN和cyEREG/pMCN导入CHO细胞DG44株(Invitrogen)中，用500μg/mL的遗传霉素进行选择，建立全长人EREG恒定表达CHO细胞和全长食蟹猴EREG恒定表达CHO，分别命名为hEREG_DG和cyEREG_DG。
[参考例2] 人和食蟹猴成熟型上皮调节蛋白表达方法的建立
在人和食蟹猴上皮调节蛋白基因的成熟型人EREG胞外区(分别在SEQ ID NO: 170和SEQ ID NO: 34所表示的多肽的N末端融合了SEQ ID NO: 171的序列的多肽)的C末端，通过PCR法扩增表达6个组氨酸重复序列的cDNA。分别***了这些cDNA的哺乳动物细胞用表达载体通过制限酶形成直链状后，使用293 fectin将其导入Free style 293细胞中，使人和食蟹猴成熟型上皮调节蛋白一过性地表达。
[参考例3] 上皮调节蛋白的制备
将成熟型人上皮调节蛋白基因和成熟型食蟹猴上皮调节蛋白基因分别***哺乳动物细胞用表达载体中。从通过下述方法表达各基因的动物细胞的培养液中纯化分离的成熟型人EREG-6His和食蟹猴EREG-6His融合蛋白。
构建成熟型人EREG胞外区(在SEQ ID NO: 34的N末端融合了SEQ ID NO: 171的序列的多肽)和6个组氨酸区与哺乳动物细胞用表达载体进行框内连接的hsEREG-6His表达载体(表达的融合多肽以下称作hsEREG-His)。构建成熟型食蟹猴EREG胞外区(在SEQ ID NO:170的N末端融合了SEQ ID NO: 171的序列的多肽)和6个组氨酸区与哺乳动物细胞用表达载体进行框内连接的csEREG-6His表达载体(表达的EREG以下称作cysEREG-His)。hsEREG-6His表达载体和csEREG-6His表达载体通过293 fectin(Invitrogen)导入FreeStyle 293细胞(Invitrogen)中，通过500μg/mL的Zeocin选择转化株，在37℃的8%CO2培养箱中培养6天。
接下来，从培养上清中纯化hsEREG-His和cysEREG-His。将在培养上清中加入4M咪唑使其终浓度达到10mM咪唑而得到的混合液与HisMicroSpin纯化***(Amersham)的Niresin(Ni树脂)混合。用20mM咪唑和50mM咪唑清洗该树脂后，用200mM咪唑洗脱hsEREG-His或cysEREG-His(洗脱组分1)，接着，用400mM咪唑洗脱hsEREG-His或cysEREG-His(洗脱组分2)。接下来，使用Bio-tech透析杯MWCO8000对包含洗脱的hsEREG-His或cysEREG-His的缓冲液进行PBS透析取代。关于纯化蛋白的定量，利用PACE法由280nm的波长换算出其含有的蛋白量。
纯化蛋白的电泳图形见图9。
[参考例4] 上皮调节蛋白ELISA***确立
具有成熟型EGF结构域结构的可溶型人EREG片段(相当于63Val～108Leu的SEQ IDNO: 34记载的多肽)从R&D Systems(cat.no. 1195- EP/CF)购入。将可溶型人EREG片段包被在nunc免疫板上，用含有BSA的溶液封闭，之后分析纯化抗EREG抗体的结合反应性。添加纯化抗EREG抗体后培养1小时，之后在清洗了的板的各孔中添加经碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(Zymed)，由此实施反应。进行各孔的清洗后，通过加入检测试剂Sigma对硝基苯基磷酸盐片(Sigma p-Nitrophenyl phosphate Tablets)，来测定抗体结合量。
[参考例5] 利用竞争ELISA确立上皮调节蛋白结合抑制***
具有成熟型EGF结构域结构的可溶型人EREG片段(相当于63Val～108Leu的SEQ IDNO: 34记载的多肽)从R&D Systems(cat.no. 1195- EP/CF)购入。将可溶型人EREG片段包被在nunc免疫板上，用含有BSA的溶液封闭，之后分析纯化人源化抗EREG抗体对来自小鼠杂交瘤的EP27的竞争结合反应性。添加来自小鼠杂交瘤的EP27和纯化人源化抗EREG抗体后培养2小时，之后在清洗后的板的各孔中添加经碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(Zymed)，由此进行反应。进行各孔的清洗后，通过加入检测试剂Sigma对硝基苯基磷酸盐片，来测定抗体结合量(A405/655检测值)。
[参考例6] 抗原结合能力(亲和性测定法)的确立
通过BiacoreTM-T100(GE healthcare Japan)的表面等离子体共振测定的单循环动力学法测定抗EREG抗体对抗原的亲和性和结合速度常数。运行缓冲液使用HBS-EP+(GEhealthcare Japan)，使用胺偶联试剂盒(GE healthcare Japan)使蛋白A与CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被的芯片)共价结合。运行缓冲液使用HBS-EP+ (GE healthcare Japan)，使用胺偶联试剂盒(GE healthcare Japan)，使蛋白A与CM5芯片(羧甲基葡聚糖包覆的芯片)共价结合。制备各抗EREG抗体，使其中的约350RU捕捉到蛋白A上。用作分析物的人EREG或食蟹猴EREG用HBS-EP+调整成0、0.7、1.4、2.8、5.6、11.2nM。测定时，首先将抗体溶液捕捉到蛋白A上，再以30μL/分钟的流速连续注射0.7、1.4、2.8、5.6、11.2nM的人EREG或食蟹猴EREG溶液各3分钟使其反应，之后换成HBS-EP+，测定解离相15分钟。解离相的测定结束后，用25mM的NaOH清洗，将传感器芯片再生。在浓度0的测定中，同样将抗体溶液捕捉到蛋白A上，每次各用3分钟连续5次注射HBS-EP+使之反应，之后换成 HBS-EP+，测定解离相15分钟。解离相的测定结束后，用25mM的NaOH清洗，将传感器芯片再生。根据得到的传感图，使用作为Biacore专用数据分析软件的Biacore T100评估软件2.0.1版进行动力学分析，算出结合速度常数(ka)、解离速度常数(kd)和速度常数比。结果见表21。需要说明的是，为了补正测定值的日差，在图1～4以及表16和19中显示以同日测定的对照样品(cH-G1/cL-k)的值为1的比。
[表21]
[参考例7] ADCC活性测定法的确立
使用从人外周血中采集的单核细胞组分作为来自人的效应细胞。使用事先注入了200μL 1000单位/mL的肝素溶液(Novo-Heparin注5千单位，Novo Nordisk)的注射器，从健康人志愿者(成人男性)体内采集50mL外周血。将用PBS(-)稀释至2倍的该外周血事先注入Ficoll-Paque PLUS中，进行离心分离操作。加入Leucosep淋巴细胞分离管(Greiner bio-one)中。将其离心分离(2150rpm、10分钟、室温)后，分离并收集单核细胞组分层。用10%FBS/D-MEM清洗细胞1次后，用10%FBS/D-MEM调整细胞密度以达到5×106/mL，由此制备效应细胞悬浮液。将该细胞悬浮液作为人PBMC溶液，用于以后的实验。
试验时，在使用时制备靶细胞悬浮液。将人胰脏癌细胞株MIA PaCa-2细胞(ATCC)在含有10%FBS、2.5%马血清、4mmol/L L-谷氨酰胺(Invitrogen)、4.5g/L葡萄糖(Invitrogen)、1.5g/L碳酸氢钠(Invitrogen)的Dulbecco’s Modified Eagle Media(Invitrogen) (以下，称作继代用培养基。)中继代、维持。关于标记试剂，将228μL 10%的FBS/D-MEM添加在包含12μL制备成4mg/mL的Calcein-AM/DMSO储备溶液(nacalai)的管中，轻轻悬浮，作为Calcein-AM溶液。在进行了离心分离(1200rpm, 5分钟, 4℃)的1×106个MIA PaCa-2细胞株中，每1×106/个细胞团块添加200μL如上制备的Calcein-AM溶液，由此制备细胞悬浮液。将该悬浮液全量移入塑料采血管(日本制药)中，在37℃的CO2培养箱中培养2小时。将用10%FBS/D-MEM清洗了3次的细胞悬浮于10%FBS/D-MEM中使达到20×104/mL(1×104/50μL)，制备靶细胞悬浮液。
关于靶细胞游离液，在96孔平底板中添加100μL培养基。接下来，用培养基稀释抗上皮调节蛋白单克隆抗体(H206-G1d/L73-k(SEQ ID NO: 142/141), H240-G1d/L73-k(SEQID NO: 150/141)和嵌合EP27(SEQ ID NO: 32/33))后，向该板的各孔中分别添加50μL。抗体以0.0001～10μg/mL的终浓度进行添加。接着，在各孔中分别添加50μL PBMC溶液(1×107个/mL)，将该板在5%二氧化碳培养箱中、在37℃下静置4小时，确定特异性钙黄绿素-AM游离率。使用荧光光度计测定从离心分离(1200rpm、5分钟、室温)后的该板的各孔中回收的100μL上清的荧光强度(λex=490nm、λem=515nm)。通过下式(式3)求出特异性钙黄绿素游离率。
(式3)
特异性钙黄绿素游离率(%) = (A-C) ×100/(B-C)
A表示各孔中的荧光强度，B表示在50μL的10%FBS/D-MEM中添加了50μL靶细胞悬浮液和100μL NP-40溶液的孔中的荧光强度的平均值，C表示在50μL的10%FBS/D-MEM中添加了50μL靶细胞悬浮液和100μL 10%FBS/D-MEM的孔中的荧光强度的平均值。试验以N=3来进行，利用Microsoft Office Excel 2007确定各抗体浓度的特异性钙黄绿素游离率。
[参考例8] 中和活性测定法
(1) 表达人EGFR嵌合受体的Ba/F3细胞株(EGFR_BAF)的建立
利用常规方法，分离其序列以SEQ ID NO: 166(GeneBank Acc. No. NM_005228)表示的人EGF受体(以下，记作“hEGFR”。)，之后制作表达人EGF受体的载体(pCXZD1/EGFR#3)。
将通过用Pvu I切断而形成直链的15μg hEGFR表达载体(pCXZD1/EGFR#3)在0.33kV、950μFD的条件下通过电穿孔(Gene Pulser; BioRad)导入Ba/F3细胞中。通过含有10%FBS、300μg/mL Zeocin和200ng/mL重组体人上皮调节蛋白(R&D Systems公司、Cat:1195-EP/CF)的RPMI1640培养基选择导入有基因的细胞，进行EGFR_BAF株的分离。
(2) 抗上皮调节蛋白抗体对人上皮调节蛋白或猴上皮调节蛋白依赖性EGFR_BAF 株的细胞增殖的中和活性
使用通过(1)中记载的方法分离的EGFR_BAF株，实施测定抗上皮调节蛋白抗体对人上皮调节蛋白或猴上皮调节蛋白依赖性细胞增殖的中和活性的试验。为了除去培养时的人上皮调节蛋白，对细胞进行清洗，再次悬浮于含有hsEREG-His或cysEREG-His(终浓度2.5ng/mL)和10%FBS的RPMI1640培养基中，以2×104细胞/100μL/孔的密度接种在96孔板上。将抗上皮调节蛋白抗体用培养基稀释至各浓度(0.014～30μg/mL)后添加在细胞中，之后，细胞在37℃、5%CO2培养箱内培养3天。培养后，加入Cell Counting Kit(同仁化学研究所社)的测定试剂进行2小时的显色，使用Benchmark Plus(BIO-RAD社)测定反应液的吸光度(450/655nm)。以0μg/mL抗体浓度的数值作为对照值，算出细胞增殖抑制率(各抗体浓度中的OD值/对照的OD值×100(%))。
[参考例9] 利用凝胶过滤层析法测定缔合体量
通过使用G3000SWXL(粒径为5μm、7.8mmI.D.×30cm、TOSOH制)作为柱、使用含有300mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为流动相的凝胶过滤层析测定缔合体量。连接在Alliance system(Waters制)上的柱以0.5mL/分钟的流量平衡化后，向该柱中注入5-10μg抗体溶液。使用紫外吸光度检测器(215或280nm)检测抗体的洗脱。由得到的色谱图算出总峰面积中所含的缔合体峰面积的存在比例。
[参考例10] 利用差示扫描量热分析仪测定热变性中间温度(Tm)
通过将封入了相当于50-100μg量的抗体溶液的透析膜浸在制备成包含150mmol/L氯化钠的20mmol/L乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)的透析外液中，进行一昼夜的透析。用透析外液制备成抗体浓度为50-100μg/mL的溶液作为样品溶液，用于测定Tm值。
适当的DSC装置、例如DSC-II(Calorimetry Sciences Corporation制)、MicroCalVP-DSC(GE healthcare制)可用于该实验。通过将充分脱气的样品溶液和对照溶液(透析外液)分别封入量热计池中，使得40℃下的热平衡化充分进行。接下来，在40℃～100℃下以约1K～2.5K/分钟的扫描速度实施DSC扫描。结果，以作为温度函数的变性峰的顶点来表示。参考非专利文献(Rodolfo等人, Immunology Letters, 1999年, 第47-52页)，通过进行Fab结构域的峰归属，算出样品的热变性中间温度。
[参考例11] 通过等电点电泳进行的pI测定
使用Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience)，在以下的溶胀液中使Phast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience)凝胶溶胀30分钟。
[表22]
组成 用量
20%甘油 0.95mL
Milli-Q水 0.95mL
Bio-Lyte7/9 (BioRad) 10μL
Bio-Lyte3/10 (BioRad) 10μL
IEF用Pharmalyte 8-10.5 (AmerchamBioscience) 80μL
使用溶胀了的凝胶，利用PhastSystem(AmerchamBioscience)按照以下方法进行电泳。将样品在步骤2中添加在凝胶中。作为pI标志物，使用校正试剂盒用pI(AmerchamBioscience)。
[表23]
步骤 条件
步骤1 2000V、2.5mA、3.5W、15℃、75Vh
步骤2 200V、2.5mA、3.5W、15℃、15Vh
步骤3 2000V、2.5mA、3.5W、15℃、410Vh
使用银染色试剂盒、蛋白(AmerchamBioscience)，按照试剂盒所附带的操作规程，进行用20%TCA固定的泳动后的凝胶的银染色。染色后，由pI标志物的已知等电点算出样品的等电点。
[参考例12] 无岩藻糖基抗体表达株的构建
在相同染色体上的两个岩藻糖转运蛋白基因的表达被人为抑制的细胞中，岩藻糖转运蛋白的功能被抑制。通过使用该细胞，可以得到岩藻糖缺陷的抗体(WO2006/067913等)。另外，即使在β1,4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III和高尔基α-甘露糖苷酶II被强制表达的细胞中产生抗体，也可以得到岩藻糖缺陷的抗体(Ferrara等人, Biotechnol. Bioeng.(2006) 93 (5), 851-861)。研究中使用通过本领域技术人员公知的这些方法制备的无岩藻糖基化EREG抗体。
[参考例13] 使用in silico免疫原性预测工具Epibase进行免疫原性风险评价
临床中的抗体药物的有效性和药效受到抗药物抗体(ADAs)的限制。ADAs对抗体药物的药效和动力学有影响，有时还会带来严重的副作用。有人报道了许多影响免疫原性的因素，认为抗原中包含T细胞表位特别重要。作为预测该T细胞表位的in silico工具，可以使用Epibase(Lonza)、iTope/TCED(Antitope)和EpiMatrix(EpiVax)等。据报道，通过使用这些工具，可以预测目标蛋白中存在的包含T细胞表位的序列(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar; 7(3): 405-18.)。
Epibase Light (Lonza)是使用FASTER算法(Expert Opin Biol Ther. 2007Mar; 7(3): 405-18.)，计算9-mer肽与主要的DRB1等位基因的结合能力的in silico工具。本工具可以鉴定成为与MHC classII的强结合和中等程度结合的T细胞表位。
各修饰抗体的in silico免疫原性分数通过Epibase Light(Lonza)***内的以下算式(式4)来求得。
(式4)
免疫原性分数=总和(各DRB1同种异型群体频率×关键表位数) (Immunogenicityscore = Sum (each DRB1 allotype population frequency X number of criticalepitopes))
计算中反映DRB1同种异型的存在比，其中可以使用以下所示的Caucasian中的存在比。
DRB1*1501(24.5%)、DRB1*0301(23.7%)、DRB1*0701(23.3%)、DRB1*0101(15.0%)、DRB1*1101(11.6%)、DRB1*1302(8.2%)、DRB1*1401/1454(4.9%)、DRB1*0901(2.3%)、DRB1*1502(0.5%)、DRB1*1202(0.1%)。
通过FASTER算法求出各修饰抗体序列中所含的强结合和中等程度的结合的所有表位后，将人种系序列和可变区与恒定区的边界序列除外的表位作为关键表位用于免疫原性分数计算。分数越低，则认为是免疫原性风险越小的序列。
[参考例14] 使用体内模型的抗上皮调节蛋白抗体的药效试验
(1) 用于移植到体内模型中的细胞株的维持
使用MIA PaCa-2细胞(ATCC)和DLD-1(ATCC)作为体内模型。MIA PaCa-2细胞在包含10%FBS、2.5%马血清、4mmol/l L-谷氨酰胺(Invitrogen)、4.5g/l的葡萄糖(Invitrogen)、1.5g/l的碳酸氢钠(Invitrogen)的Dulbecco’s Modified Eagle Media(Invitrogen) (以下，称作继代用培养基。)中继代、维持。DLD-1细胞在包含10%FBS、10mmol/l HEPES(Invitrogen)、4.5g/l的葡萄糖(Invitrogen)、1mmol/l丙酮酸钠(Invitrogen)的RPMI1640培养基(SIGMA) (以下，称作继代用培养基。)中继代、维持。
(2) MIA PaCa-2和DLD-1细胞移植小鼠模型的制作
使用以1:1含有继代用培养基和MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)的溶液，制备MIA PaCa-2和DLD-1细胞的细胞悬浮液使达到5×107细胞/mL，将100μl该细胞悬浮液(5×106细胞/小鼠)移植到SCID小鼠(雌性、5周龄) (日本CLEA)的腹部皮下。利用式5算出肿瘤体积，在肿瘤体积的平均值达到130-330mm3时判断为模型成立。
(式5)
肿瘤体积＝长径×短径×短径/2
(3) 含有各被测抗体的给药样品的制备
在给药当天使用生理盐水制备包含cH-G1/cL-k抗体、H206-G1d/L7-3k抗体、H240-G1d/L73-k抗体的各抗体的给药样品，使浓度达到0.04mg/mL(0.4mg/kg给药组)或0.2mg/mL(2mg/kg给药组)。
(4) 给予含有抗体的给药样品
对于(2)中制作的小鼠模型，从移植MIA PaCa-2细胞后14天起每周1次、14天期间以及从移植上述DLD细胞后12天起每周1次、14天期间，尾静脉给予(3)中制备的给药样品。作为阴性对照，同样每周1次在各期间以10mL/kg的给药量从尾静脉给予生理盐水。所有组均以5只为1组，对各组进行含有各被测抗体的给药样品的给予。
(5) 各被测抗体的抗肿瘤效果的评价
通过测定从给予给药样品的最终日起3天或7天后的肿瘤体积，评价人癌细胞移植小鼠模型中的各被测抗体的抗肿瘤效果。

Claims (9)

1.抗上皮调节蛋白抗体，其包含重链可变区以及轻链可变区，
所述重链可变区包含序列为SEQ ID NO：9的重链CDR1，序列为SEQ ID NO：160的重链CDR2和序列为SEQ ID NO：158的重链CDR3，
所述轻链可变区包含序列为SEQ ID NO：163的轻链CDR1，序列为SEQ ID NO：13的轻链CDR2和序列为SEQ ID NO：164的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含序列为SEQ ID NO：30的重链恒定区。
3.权利要求1-2中任一项的抗体，其中所述抗体包含序列为SEQ ID NO：27的轻链恒定区。
4.抗上皮调节蛋白抗体，其包含SEQ ID NO：150中的重链可变区和SEQ ID NO：141中的轻链可变区。
5.权利要求1，2和4中任一项的抗体，其中所述抗体具有中和活性。
6.权利要求1，2和4中任一项的抗体，其中所述抗体具有细胞毒活性。
7.权利要求6的抗体，其中细胞毒活性是CDC和/或ADCC。
8.权利要求1，2和4中任一项的抗体，其中所述抗体连接有增殖抑制剂或细胞毒性物质。
9.用于癌症的治疗剂或用于抑制癌症复发或转移的药剂，其包含权利要求1，2和4中任一项的抗体作为活性成分。
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