KR20090057936A

KR20090057936A - 2가 ｅｒｂｂ 리간드 결합 분자 및 그의 제조 방법 및 사용방법

Info

Publication number: KR20090057936A
Application number: KR1020087021636A
Authority: KR
Inventors: 사라 에스. 바커스; 제이슨 이. 힐; 요세프 야르덴; 보세 에스. 코추푸라칼
Original assignee: 타게티드 몰레큘라 다이아그노스틱스, 엘엘씨; 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2009-06-08
Also published as: AU2007213709A1; EP2010665A4; CA2642516A1; EP2010665A2; WO2007092932A8; WO2007092932A3; IL193320A0; US20090318346A1; WO2007092932A2; JP2009525762A

Abstract

새로운 2가 ErbB-기초 리간드 결합 분자를 그의 제조 방법 및 사용 방법과 함께 개시한다. 결합 분자는 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질일 수 있다. 단백질은 둘 모두가 ErbB 수용체 리간드에 결합하는 ErbB 수용체의 세포외 도메인을 2개 함유할 수 있다. 이들 결합 분자는 리간드에 결합하고 이를 격리시킴으로써, 세포 ErbB 수용체에 결합할 수 없도록 하는 트랩으로서 작용한다.

2가 결합 분자, ErbB 수용체, ErbB 리간드

Description

2가 ＥＲＢＢ 리간드 결합 분자 및 그의 제조 방법 및 사용 방법{BIVALENT ＥＲＢＢ LIGAND BINDING MOLECULES AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE}

수용체 티로신 키나제는 많은 암들의 성장을 자극하는데 관여한다. 일반적으로, 수용체 티로신 키나제는 (1) 특이적인 리간드와 결합할 수 있는 세포외 도메인, (2) 막횡단 영역, (3) 예를 들면, 단백질 인산화에 의해 수용체가 조절될 수 있는 곳인 막근접 도메인, (4) 수용체의 효소 성분인 티로신 키나제 도메인, 및 (5) 카르복시말단 테일로 구성된 당단백질이다. 많은 고형 종양의 경우, 제I형 수용체 티로신 키나제의 ErbB 계열은 세포 성장, 분화 및 생존을 매개하는데 있어 중요하기 때문에 이들이 하나의 중요한 수용체 부류를 구성한다. 이들 수용체 계열의 일원으로 ErbB1 (HER1로도 공지됨), ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3), 및 ErbB4 (HER4)를 포함한다. 이들 수용체 티로신 키나제는 상피, 중간엽, 및 신경 조직을 비롯한, 각종 조직에서 광범위하게 발현된다. 몇몇 유방암과 각종 기타 악성 종양에 있어 ErbB2 또는 ErbB1의 과발현은 더욱 저조한 임상 결과와 서로 관련이 있다.

ErbB 수용체는 불활성 상태에서는 일반적으로 단량체로서 존재한다고 여겨진다. 그들 각각의 리간드와 결합할 때 수용체 내에서는 입체형태적인 변화가 발생함으로써 수용체 동종- 및 이종이량체, 즉, 활성화된 수용체 형태가 형성될 수 있다. 리간드 결합 및 뒤따른 동종- 또는 이종이량체화는 자가인산화 및 인산전이를 통해 수용체의 촉매적 활성을 자극시킬 수 있고, 즉, 개개의 단량체는 티로신 잔기 상에서 서로 인산화시킬 것이다. 이는 추가로 수용체의 촉매적 활성을 자극시킬 수 있다. 또한, 인산화된 티로신 잔기 중 일부는 하류의 신호 전달 분자에 도킹 부위를 제공한다.

ErbB 수용체의 활성화는 예로서, 증식 및 세포 생존과 같은 임의의 여러가지 별개의 효과를 가져올 수 있다. 이러한 상이한 결과들은 특정 수용체에 결합하는 특정 리간드에 따라 다른 상이한 신호 전달 경로를 통해 발생한다. 리간드 결합은 최종적으로 형성되는 동종- 또는 이종이량체 군집을 지시한다. 다수의 연구를 통해 결합된 리간드의 유형, 및 뒤따라 형성된 동종- 또는 이종이량체 유형이 활성화된 ErbB 수용체 상에서 티로신 잔기를 차별적으로 인산화시킨다고 밝혀졌다. 일례로서, 뉴레글린 ("NRG", 헤레굴린으로도 공지됨)은 ErbB 수용체에 결합할 수 있고, 증식, 분화, 생존, 및 이동을 비롯한 각종 반응을 유도할 수 있는 리간드 계열이다. NRG1β 및 NRG2β는 ErbB3에 결합하고, ErbB2/ErbB3 이종이량체를 유도할 수 있고, 오직 NRG1β만이 배양물내 유방암 세포의 분화를 자극시킨다. 이는 NRG2β가 결합하였을 때와 비교하여 NRG1β가 결합하였을 때에 상이한 하류 신호 전달 분자를 활성화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체로 동원하기 때문이다. 예를 들면, NRG1β 및 NRG2β는 전반적으로 유사한 수준으로 ErbB2 티로신을 인산화시키지만, 오직 NRG1β만이 PI3K (p85), SHP2, Grb2, 및 Shc를 그 수용체에 결합시킨다.

현 수용체 티로신 키나제 기초 치료제는 일반적으로 2개의 카테고리로 분류된다. 소분자 저해제, 예로서, 라파티닙(Lapatinib)은 세포내 티로신 키나제 영역 에 결합하고, ATP 결합 및 수용체 인산화를 방지한다. 두번째 유형의 치료제는 단일클론 항체에 기초하여, 수용체 분해를 일으키는 특정 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 인식하고 그에 결합하는 것으로, 예로서, 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙(Trastuzumab))이 있다. 이들 요법 모두 효능이 있는 것으로 나타났다. 그러나, 각종 인자가 각 요법의 상대적인 효능에 영향을 미치다는 것은 명백하다. 예를 들면, 고수준의 IGF-IR이 허셉틴™ 치료법은 방해하지만, 라파티닙 치료법은 방해하지 못한다고 알려져 있다. 허셉틴™ 및 라파티닙의 작용 기전은 상이하지만, 허셉틴™ 및 라파티닙, 둘 모두는 상기 수용체를 표적으로 하고, 그에 결합한다.

활성화 리간드의 과발현이 탈조절될 수용체의 것과 유사한, 제어되지 않는 세포 증식을 유발할 수 있다는 것 또한 명확하게 되고 있다. 그러한 경우, 활성화 리간드가 수용체에 결합하는 것을 방해하는 것이, 보다 효과적일 수 있거나 또는 단독의 기존 수용체 기초 요법 또는 기타 요법을 강화할 수 있는 새로운 치료학적 전략법을 제공할 수 있다.

ErbB3에 대한 리간드 결합을 방해하는 치료제가 특히 효과적일 수 있다. ErbB3은 그의 티로신 키나제 도메인이 기능적으로 불활성이기 때문에 EGFR 계열의 다른 수용체와 상이하지만; ErbB2/ErbB3 이종이량체는 ErbB 계열의 임의 동종- 또는 이종이량체 조합물의 가장 강력한 분열촉진 신호를 전달한다. 그러므로, ErbB3이 중요한 표적이 되지만, 키나제 영역을 표적하는 소분자를 통해 저해될 수는 없는 것이다. ErbB3은 활성화 리간드, 예로서, 헤레굴린 (NDF)을 필요로 하기 때문에 활성화된 이종이량체가 형성될 수 있기 전에 ErbB3 수용체 리간드의 결합을 방 해할 수 있는 분자를 사용하여 ErbB 이량체 및 이종이량체의 형성을 차단하거나 방해할 수 있다. 그러한 분자의 일례는 견고한 리간드 결합 친화성을 보유하고, 이로써 리간드를 "트랩"하고, 그의 농도를 효과적으로 감소시킴으로써 ErbB3 수용체를 활성화시킬 수 없도록 하는 수용체 분자의 엑토도메인의 가용성 부분일 것이다.

이러한 트랩 또는 "유인" 현상을 이용하려고 시도하는 수개의 치료제들이 존재한다. 예를 들면, 엔브렐(Enbrel)™ (에타너셉트 - 암젠(Amgen))은 전-염증성 리간드 TNFα에 결합하고, 그를 트랩하는 것으로서, 가용성인, TNFR 수용체의 변형된 버전이다. 또한, VEGF 트랩으로도 명명되는, 가용성인, VEGFR1 및 VEGFR2 수용체의 융합 단백질은 황반 변성과 여러 형태의 암, 둘 모두의 치료를 위해 현재 임상 실험 중에 있다 (리제네론 파라마큐티칼스(Regeneron Pharmaceuticals)). ErbB3 트랩 또한 NDF로 치료받는 세포에서 이중 EGFR/ErbB2 저해제 및 역 GW2974 (ErbB1 및 ErbB2의 소분자 저해제) 내성 효과를 증진시키는 시험관내 효능을 나타내었다.

현재 인가받은 모든 ErbB 저해제는 EGFR 또는 ErbB2 중 어느 하나, 또는 둘 모두를 표적으로 한다. 그러나, 현재 인가받은 요법 중 어느 것도 리간드가 다수의 ErbB 수용체에 결합하는 것을 동시에 방해하지는 못하고 있다. 수용체 리간드, 예로서, ErbB 리간드를 격리시킴으로써 리간드가 다수의 ErbB 수용체에 결합하는 것을 차단하고, 이어서 수용체가 활성화되는 것을 차단하기 위해 사용될 수 있는 새로운 결합 분자가 필요시 된다는 것은 분명하다. 공지된 모든 ErbB 리간드에 결합할 수 있는 결합 분자가 특히 유용할 것이다. 이상적으로는, 그러한 분자가 제 조될 수 있다면, 이는 유일의 단일 분자와 같은, 공유 결합된 단일 분자가 될 것이다. 그러한 분자는 제조 및 투여 프로토콜을 간소화시킬 것이며, 수용체 리간드를 격리시키기 위하여 사용될 경우, 치료학적으로 최대의 잇점을 제공할 것이다. 그러한 분자는 특히 ErbB 리간드, 예로서, TGFα 및 NDF를 과발현하는 종양에 탁월한 치료학적 효능을 제공할 것이다.

요약

새로운 2가 ErbB 수용체-기초 리간드 결합 분자를 그의 제조 방법 및 사용 방법과 함께 개시한다. 결합 분자는 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질이다. 단백질은 ErbB 활성화 리간드에 결합하는 ErbB 세포외 도메인을 2개 함유할 수 있다. 이들 결합 도메인은 리간드에 결합하고 이를 격리시킴으로써, 세포 ErbB 수용체에 결합할 수 없도록 하는 트랩으로서 작용한다. ErbB 수용체의 엑토도메인의 부분들은 양자의 결합 부분 모두가 그들 각각의 리간드에 대하여 실질적인 결합 친화성을 유지하도록 단일 폴리펩티드 내에 함께 공유 결합될 수 있고, 이로써 ELISA 분석법, 및 비아코어(Biacore) 기기 상에서 수행되는 분석법 등을 비롯한 각종 결합 분석법들 중 임의 것에서의 결합에 의해 입증된 바, ErbB 리간드에 결합시키고 그를 트랩시키기 위해 상기를 사용할 수 있다는 놀라운 사실이 밝혀지게 되었다.

개시된 단백질은 수개의 ErbB 수용체의 부분을 포함할 수 있고, 바람직하게는 매우 다양한 또는 공지된 모든 ErbB 리간드에 결합할 것이다.

개시된 분자를 사용하여 질환 또는 용태를 치료하는 방법 또한 기술한다. ErbB 리간드의 제거 또는 저해에 의해 개선, 호전, 또는 저해될 수 있는 임의의 질 환은 개시된 방법에 의해 치료될 수 있다. 본 방법은 일반적으로 개시된 결합 분자에서 ErbB 리간드를 트랩시킴으로써 ErbB 리간드가 수용체에 결합하지 못하도록 하는 것을 포함한다. 본 방법에서는 치료를 필요로 하는 대상자에게 본원에서 개시된 2가 결합분자를 투여함으로써 수행될 수 있다.

추가의 특징과 장점은 본원에 기술되어 있으며, 이는 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 자명해질 것이다.

도 1은 ErbB 단일 트랩 작용 기전과 차세대 ErbB 이중 트랩을 도시한다.

도 2는 ErbB 단일 트랩 치료제와 함께 사용하였을 때의 GW2974 세포독성 증진을 도시한다.

도 3은 하기 작제물: 1. pEF-ECD3-IRES-P (ErbB3 수용체의 엑토도메인의 부분을 함유하는 단일 트랩), 2. pEF-IRES-P (음성 대조군 벡터), 3. pEF-ECD13-IRES-P9 (아미노 말단 측 상의 ErbB1 수용체의 엑토도메인의 부분 및 폴리펩티드 카복시 말단 측 상의 ErbB3 수용체를 함유하는 이중 트랩), 4. pEF-ECD31-IRES-P (아미노 말단 측 상의 ErbB3의 엑토도메인의 부분 및 폴리펩티드 카복시 말단 측 상의 ErbB1 수용체를 함유하는 이중 트랩), 5. pEF-ECD14-IRES-P (아미노 말단 측 상의 ErbB1의 엑토도메인의 부분 및 폴리펩티드 카복시 말단 측 상의 ErbB4 수용체를 함유하는 이중 트랩), 6. pEF-ECD41-IRES-P (아미노 말단 측 상의 ErbB4의 엑토도메인의 부분 및 폴리펩티드 카복시 말단 측 상의 ErbB1 수용체를 함유하는 이중 트랩) 및 7. MDA-MB-468 세포 (양성 항체 대조군)을 발현하는 293T 세포로부터 제 조된 용해물의 웨스턴 블롯에 관한 사진을 제공한다. 작제물은 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이 제조하였다. ErbB1의 세포외 도메인에서 에피토프를 인식하는 항체로 블롯을 프로빙하였다.

도 4: 각종 트랩 작제물을 발현하는 293T 세포로부터의 배지를 3일 후에 수집하였다. 배지를 1:1000으로 희석시키고, R&D 시스템즈(R&D Systems)로부터 입수한 휴먼 EGFR 듀오세트(Human EGFR DuoSet)를 사용하여 각 샘플에 대한 ELISA를 2회 실시하였다. ELISA 분석은 바이오-테크 EL312e(Bio-Tek EL312e)를 사용하여 판독하였다. 작제물은 하기와 같다: VC - 벡터 대조군, Her3* - 단일 ErbB3 트랩, ECD1-3.p6, ECD3-1.p6, ECD1-4.p5 및 ECD4-1.p5. 작제물은 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이 제조하였다.

도 5: 트랩의 기능성을 시험하기 위하여 293T 세포로부터 조절된 배지(conditioned medium)를 수집하고, 여과하고, 새 배지를 사용하여 1:1로 희석시켰다. 이어서, 이렇게 희석시킨 조절된 배지를 사용하여 BT474 세포를 배양하였다. 48시간 후, 세포를 고정시키고, 50% 메탄올 중 1% 메틸렌 블루 용액으로 염색시켰다. BT474 세포를 하기와 같은 트랩 작제물로부터의 배지 중에서 배양하였다: 1. pEF-IRES-P (대조군), 2. PEF-ECD13-IRES-P, 3. pEF-ECD14-IRES-P, 4. pEF-ECD3-IRES-P (단일 트랩), 5. pEF-ECD31-IRES-P 및 6. pEF-ECD41-IRES-P (작제물에 대한 약어는 상기 도 3에 정의되어 있다).

도 6: 트랩에 대한 고온 EGF의 가교 결합. 2가 및 1가 트랩을 고온 EGF와 함께, 그리고 과량의 미표지 EGF 또는 NDF와 함께/없이 인큐베이션시킨 후, 분자 BS3과 가교 결합시켰다. 나타난 밴드는 고온 EGF에 가교 결합된 2가 또는 1가 트랩 중 하나이다. 예측된 바와 같이, 2가 트랩 모두는 EGF에 결합한 반면, 오직 ErbB1의 1가 트랩만이 EGF에 결합하였다. 예측된 바와 같이, 냉 EGF의 첨가로 인하여 모든 트랩에서 고온 EGF의 결합에 대하여 경합하였다. 흥미롭게도, 냉 EGF의 첨가가 ErbB3-ErbB1 또는 ErbB4-ErbB1 2가 트랩을 제외한, ErbB1-ErbB3 2가 트랩에서 EGF의 결합을 방해하는 것처럼 보였다. 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 작제물을 제조하였다.

도 7: 비아코어에 의해 측정된, 특정 리간드에 대한 트랩의 결합 친화도. 표준 방법으로 비아코어를 사용하여 수개의 상이한 리간드에 대한 2가 및 1가 트랩의 결합 친화도(Kd)를 측정하였다. 트랩을 비아코어 칩에 결합시키고, 리간드의 농도를 증가시키면서 가하여 트랩과 리간드 사이의 결합 친화도를 측정하였다. 2가 트랩 모두는 ErbB1 및 ErbB3/ErbB4 특이적인 리간드, 둘 모두에 결합할 수 있었지만, 1가 트랩은 오직 그들 각각의 리간드 부류에만 결합할 수 있었다. 전장의 엑토도메인은 TGFα에 대하여 약 412 - 961 nM의 친화도를 갖는 것으로 알려져 있다.

도 8: 트랩의 존재하에 표지된 EGF (1.6 ng/ml)의 EGFR에 대한 결합. EGFR을 비아코어 칩에 결합시킨 후, 고온 EGF를 가하였다. 트랩 부재하의 EGFR에 대한 고온 EGF의 결합을 1로 설정하였다. 이어서, 상이한 농도의 2가 및 1가 트랩, 둘 모두를 고온 EGF 풀에 가한 후, EGFR 결합 칩에 노출시켰다. 2가 트랩은 이용가능한 고온 EGF 풀을 감소시킬 수 있는 반면, 동일 농도에서 1가 ErbB1 트랩은 상기와 같이 하지 못했다.

상세한 설명

다수의 수용체, 예로서, ErbB 수용체들에 대한 리간드에 결합할 수 있는, 공유적으로 연결된 2가 결합 분자를 개시한다. 바람직한 2가 결합 분자는 2개 이상의 별개의 수용체에 대한 리간드에 결합할 수 있다. 본 명세서의 목적상 그러한 결합 분자를 "이중 트랩"으로 명명한다. 하나의 실시태양에서, 분자는 모든 ErbB 리간드에 대하여 실질적인 친화성을 갖는다. 결합 분자의 예시적인 실시태양이 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 도 1은 또한 이에 따라 이중 결합 분자가 작동하는 것으로 사료되는 기전에 대하여 도시하고 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 별개의 수용체에 결합하는 리간드에 대하여 실질적인 결합 친화성을 갖는 2가 결합 분자에 관한 것이다. 2가 결합 분자는 수용체의 엑토도메인의 부분을 포함할 수 있고, 바람직하게는 단일 폴리펩티드 서열로 공유 결합되어 있다. 2개의 수용체가 결합하는 리간드의 범위가 중복되는 경우, 그러한 수용체의 부분으로부터 제조된 2가 결합 분자의 각 결합 부분은 유사하거나 동일한 리간드에 결합할 수 있다. 2가 결합 분자는 수용액 중에서 가용성인 것이 바람직하다.

하나의 실시태양에서, 2가 결합 분자의 각 결합 부분은 수용체의 세포외 도메인을 함유하는 가용성인 부분일 수 있다. 임의의 적합한 수용체가 결합 분자에 사용될 수 있다. 적합한 수용체는 일반적으로, 리간드 결합에 필요하고 리간드 결합에 충분한 결정기 모두를 함유하는 세포외 또는 세포내 도메인을 함유할 것이다. 하나의 실시태양에서, ErbB 수용체 계열의 다양한 일원들을 사용하여 2가 결합 분자를 생성시킬 수 있다. 따라서, 2가 결합 분자는 예를 들면, ErbB1과 ErbB3, ErbB1과 ErbB4 또는 다른 조합물과 같은, ErbB 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인의 조합물일 수 있다. 결합 도메인은, 수용체 리간드에 대해 적합한 결합 친화성이 유지되는 한, 폴리펩티드 상에 임의 순서로 존재할 수 있다.

본 출원의 목적상 적합한 결합 친화도는 생리학적 매트릭스에서 ErbB 리간드를 트랩할 만큼 충분히 높은 친화도이다. 바람직하게, 해리 상수는 천연 수용체의 해리 상수보다 약 100-배 내지 약 1,000-배보다 높지는 않을 것이다. 더욱 바람직하게는, 나노몰 범위 또는 그 이하의 해리 상수가 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 개시된 조성물에서 사용하기에는 ErbB 리간드에 결합하고 그를 트랩함으로써 ErbB 리간드가 ErbB 수용체에 결합하지 못하도록 하거나 결합하는 것을 방해하기에 충분하고 개시된 방법에서 사용될 수 있는 임의의 친화도가 적합할 것이다.

ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4의 완전한 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있고, ErbB1의 경우, 진뱅크 수탁 번호: NM_005228, ErbB2의 경우, 진뱅크 수탁 번호: NM_004448, ErbB3의 경우, 진뱅크 수탁 번호: M29366 또는 NM_01982, 및 ErbB4의 경우, 진뱅크 수탁 번호: NM_005235로 찾아볼 수 있다. 본 명세서의 목적상, 전장의 EGFR 엑토도메인은 ErbB1의 아미노산 잔기 1-621, 또는 EGF 수용체 계열의 다른 일원의 등가의 잔기로 구성된 엑토도메인을 지칭한다. ErbB 수용체 계열에 대한 전장의 엑토도메인의 아미노산 서열 또한 공지되어 있고, 이들 서열의 부분은 ErbB1 아미노산 잔기 1-532에 대한 서열 번호: 2, ErbB1 아미노산 잔기 1-500에 대한 서열 번호: 22, ErbB3 아미노산 잔기 1-531에 대한 서열 번호: 6, ErbB3 아미노산 잔기 1-499에 대한 서열 번호: 24, ErbB4 아미노산 잔기 1-528에 대한 서열 번호: 8, 및 ErbB4 아미노산 1-496에 대한 서열 번호: 26으로서 하기에 포함되어 있다. 각 서열에서 "1"번 위치는 신호 펩티드 다음에 오는 첫번째 아미노산이다. 이들 아미노산을 코딩하는 상응하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 2, 6 및 8로서 발견될 수 있다. ErbB 수용체에 대한 전장의 엑토도메인은 L1, CR1, L2 및 CR2로서 지칭되는 4개의 하위-도메인을 함유하는데, 여기서, L 및 CR은 각각 큰(large) 및 시스테인-풍부(cys-rich)에 대한 두문자어이다. ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4의 엑토도메인의 아미노산 서열 정렬이 결정되어 있다. 미국 특허 공개 번호 제2006/0234343호, 도 1A 및 1B를 참조한다.

ErbB 수용체의 CR2 하위-도메인이 리간드 결합 도메인 (L1, CR1 및 L2)을 막 스패닝 영역과 연결시킨다고 여겨지며, 2 또는 3개의 아미노산 잔기의 링커에 의해 결합되고 시스테인 잔기에 의해 결합된 추가의 7개의 모듈로 구성된다. ErbB1의 경우, 이들 모듈은 모듈 1-7에 대해 각각 아미노산 위치 482-499, 502-511, 515-531, 534-555, 558-567, 571-593, 및 596-612로부터 확장된다. ErbB2의 경우, 이들 모듈은 모듈 1-7에 대해 각각 아미노산 위치 490-507, 510-519, 523-539, 542-563, 566-575, 579-602 및 605-621로부터 확장된다. ErbB3의 경우, 이들 모듈은 모듈 1-7에 대해 각각 아미노산 위치 481-498, 501-510, 514-530, 533-554, 557-566, 570-591, 및 594-610으로부터 확장된다. ErbB4의 경우, 이들 모듈은 모듈 1-7에 대해 각각 아미노산 위치 478-495, 498-507, 511-527, 530-552, 555-564, 568-589, 및 592-608로부터 확장된다.

적합한 ErbB 엑토도메인의 부분은 당업계에 공지되어 있고, 본원 실시예에 기술되어 있는 것과 같이 임의의 적합한 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 원하는 엑토도메인 또는 엑토도메인의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 현재 주문 제조될 수 있고, 함께 결찰될 수 있고, 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이어서, 발현 벡터를 사용하여 단백질을 발현하는 세포를 형질전환시킬 수 있고, 이어서, 결합 분자를 세포 또는 세포 상등액으로부터 정제할 수 있다. 엑토도메인은 각 수용체의 전장의 엑토도메인을 포함한다. 별법으로, 엑토도메인은 아미노 또는 카복시 말단 종단 중 어느 하나에서 절단될 수 있다. 예를 들면, 생성된 결합 부분의 결합 활성이 상당 감소하지 않는 한, 아미노-말단 종단에서 엑토도메인은 1번, 2번, 3번, 4번, 5번, 6번, 7번, 8번, 9번, 10번 또는 그 이상의 위치에서 시작될 수 있다. 카복시-말단 종단에서 엑토도메인은 7번째 모듈, 6번째 모듈, 5번째 모듈, 4번째 모듈, 3번째 모듈, 2번째 모듈, 1번째 모듈 다음에서 또는 그 내부에서 또는 심지어 1번째 모듈 앞에서, 예를 들면 ErbB1과 관련하여, 아미노산 번호 500번, 512번, 532번, 556번, 568번, 594번, 613번 및 ErbB3 및 ErbB4에 대하여 상응하는 위치에서 종결될 수 있다. 따라서, ErbB1의 경우, 예를 들면, ErbB1 아미노산 1-532 [서열 번호: 2] 또는 1-500 [서열 번호: 22]이 사용될 수 있다. ErbB3의 경우, 다른 서열 중에서 아미노산 1-499 [서열 번호: 24] 또는 1-531 [서열 번호: 6]이 사용될 수 있다. ErbB4의 경우, 다른 서열 중에서 아미노산 1-496 [서열 번호: 26] 또는 1-528 [서열 번호: 8]이 사용될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 결합 부분들 중 하나 또는 둘 모두의 아미노산 서열은, 단, 변형이 그의 리간드(들)에 대한 결합 부분의 결합 친화성에 불리한 영향을 미치지 않는다면, 변형될 수 있다. 예를 들면, 변형된 결합 부분은 잔기 또는 서열을 다양하게 치환시킴으로써, 또는 결합 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 작제될 수 있다. 일반적으로, 치환은 보존적으로 이루어져야 한다; 예를 들면, 가장 바람직한 치환 아미노산은 대체되어 지는 잔기의 것과 유사한 물리화학적 특징을 갖는 것이다. 유사하게, 결실 또는 삽입 전략법을 채택할 경우, 결실 또는 삽입이 생물학적 활성에 미치게 될 잠재적인 효과를 고려하여야 한다. 결합 부분의 생물학적 활성을 보존하기 위해서는 결실 및 치환이 바람직하게 상동성이거나 보존적으로 치환된 서열을 가져올 것이며, 이는 주어진 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 대체된다는 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 하나의 지방족 잔기가 또다른 것 대용으로 치환, 예로서, 서로의 대용으로 He, Val, Leu, Met 또는 Ala 치환, 또는 하나의 극성 잔기가 또다른 것 대용으로 치환, 예로서, Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln와 Asn 간의 치환를 포함한다. 기타의 상기와 같은 보존적 치환, 예를 들면, 유사한 소수성 특징을 갖는 전체 영역의 치환도 잘 알려져 있다. 게다가, 인간, 뮤린, 또는 기타 포유동물 EGFR 사이에 특정 아미노산이 차이가 난다는 것은 결합 부분의 필수적인 생물학적 특징은 변경시키지 않으면서 ErbB 결합 부분에서 이루어질 수 있는 추가적인 보존적 치환을 시사한다.

하나의 실시태양에서, 2가 결합 분자는 하기 모티프: B-L-B-F; B-L-rB-F 및 B-F-B로 배열될 수 있다. B는 수용체로부터 유래될 수 있는 결합 부분을 나타낸다. 결합 부분은 동일하거나 상이할 수 있다. rB는 아미노산 서열이 역전되어 있어 아미노-말단 아미노산이 카복시-말단 잔기가 되어 있는 결합 부분을 나타낸다. ErbB1에 대한 예시적인 서열은 서열 번호: 1의 상기와 같은 역서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 서열 번호: 3인데, 이는 서열 번호: 2의 역서열인 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 제공한다. 원한다면 ErbB3 및 ErbB4에 대하여 유사한 역위가 작제될 수 있다. 그러한 역서열은 막에서 발견되는 것과 같은 수용체 구조를 모사하기 위하여 카복시-말단 결합 부분으로서 배치될 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 2개의 결합 부분은 상이하다. 적합한 배열로는 예를 들면, B1-L-B2-F, B2-L-B1-F, B1-F-B2, B2-F-B1을 포함한다. 특정 실시태양에서, B1 및 B2는 상이하고, ErbB1, ErbB3 및 ErbB4의 엑토도메인의 부분이다. 하나의 특히 바람직한 실시태양에서, B1 및 B2는 각각 ErbB1 및 ErbB4이다. 더욱 특히, ErbB1과 관련해서 활성 결합 분자를 형성하기 위해 아미노산 1-500 및 1-532가 사용될 수 있고, ErbB4와 관련해서는 ErbB1 및 ErbB4가 단일 폴리펩티드로 결합될 경우, ErbB1이 ErbB4의 아미노 또는 카복시-말단 측 상에 배치되든 아니든 그와는 무관하게 ErbB1과 ErbB4 리간드, 둘 모두에 대하여 실질적인 친화성을 갖는 2가 결합 분자를 형성하기 위해 아미노산 1-496 및 1-528이 사용될 수 있다. 물론, B1 또는 B2는 임의의 다른 수용체 또는 리간드 결합 단백질일 수 있고, 반드시 아미노산 번호 1부터 시작되는 것은 아니다.

"L"은 결합 부분에 결합시키기 위하여 사용될 수 있는 임의의 링커 부분이다. 다수의 적합한 링커 분자가 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 바람직하게, 링커는 비-면역원성일 것이다. 링커 및 바람직할 수 있는 링커를 동정하는 방법에 관해서는 예를 들면, 문헌 [George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879] (특별히 참고로 인용됨)를 참조한다. 링커 서열은 결합 부분에 천연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 특별히 관심의 대상이 되는 원하는 부위를 제공하기 위해, 성분 도메인이 최적의 3차 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해 및/또는 성분과 그의 표적 분자와의 상호작용을 증진시키기 위해서 첨가될 수 있다. 하나의 간단한 링커는 (Gly₄Ser)_X인데, 여기서, "X"는 1 내지 약 10 이상 중 임의의 숫자일 수 있고, 특정 실시태양에서는 [서열 번호: 29]에서 사용되는 것으로 밝혀진 "X"가 3인 링커이다. 그러나, 링커는 또한 아미드 결합일 수 있다.

"F"는 임의의 융합 파트너이고, 2가 결합 분자의 기능성을 증진시키는 임의의 성분일 수 있다. 적합한 융합 파트너는 예를 들면, 융합 폴리펩티드의 혈청 반감, 조직 투과성, 면역원성의 부족, 또는 안정성을 증진시킴으로써 2가 결합 분자의 생물학적 활성을 증진시킬 수 있거나, 그의 생산 및/또는 회수에 도움을 줄 수 있거나, 융합 폴리펩티드의 약물학적 성질 또는 약동학적 프로필을 증진시킬 수 있다.

융합 파트너가 혈청 단백질 또는 그의 단편일 때, 이는 α-1-저분자글로불린, AGP-1, 오로소뮤코이드, α-1-산 당단백질, 비타민 D 결합 단백질 (DBP), 헤모펙신, 인간 혈청 알부민 (hSA), 트랜스페린, 페리틴, 아파민, 햅토글로빈, α-태아 단백질 티로글로불린, α-2-HS-당단백질, β-2-당단백질, 히알우로난-결합 단백질, 신택신, C1R, C1q a 쇄, 갈렉틴3-Mac2 결합 단백질, 섬유원, 중합체성 Ig 수용체 (PIGR), α-2-고분자글로불린, 우레아 수송 단백질, 햅토글로빈, IGFBPs, 마크로파지 스캐빈저 수용체, 섬유결합소, 지안틴, Fc (특히 IgG Fc 도메인 포함), α-1-안티키로모트립신, α-1-안티트립신, 안티트롬빈 III, 아포지방단백질 A-I, 아포지방단백질 B, β-2-저분자글로불린, 셀룰로플라스민, 보체 성분 C3 또는 C4, CI 에스테라제 저해제, C-반응성 단백질, 시스타틴 C, 및 단백질 C일 수 있다. 융합 파트너 성분을 포함하는 것은 바람직할 경우, 본 발명의 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장시킬 수 있다.

ErbB 수용체의 경우, 공지의 리간드 및 수용체 결합 특이성을 하기 표 1에 제시한다. 따라서, ErbB1 및 ErbB3 결합 부분의 조합을 사용하여 EGF, TGFα, HB-EGF, 베타셀룰린, 암피레귤린, 에피레귤린, 에피겐, 뉴레글린 1α, 뉴레글린 1β, 뉴레글린 2α 및 뉴레글린 2β에 대해 특이성을 갖는 2가 결합 분자를 형성할 수 있다. ErbB1 및 ErbB4에 대한 결합 도메인의 조합은, 공지 ErbB 리간드 모두를 포함하는 EGF, TGFα, HB-EGF, 베타셀룰린, 암피레귤린, 에피레귤린, 에피겐, 뉴레글린 1α, 뉴레글린 1β, 뉴레글린 2α, 뉴레글린 2β, 뉴레글린 3 및 뉴레글린 4에 대한 결합 친화성을 갖는다.

리간드 수용체 특이성

ErbB1 ● EGF ● TGFα ● HB-EGF ● 베타셀룰린 ● 암피레귤린 ● 에피레귤린 ● 에피겐

ErbB3 ● 뉴레글린 1α ● 뉴레글린 1β ● 뉴레글린 2α ● 뉴레글린 2β

ErbB4 ● 베타셀룰린 ● HB-EGF ● 에피레귤린 ● 뉴레글린 1α ● 뉴레글린 1β ● 뉴레글린 2α ● 뉴레글린 2β ● 뉴레글린 3 ● 뉴레글린 4

2가 결합 분자는 또한 일반적으로 그의 아미노 말단 종단에 신호 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 신호 서열 중 다수는 공지되어 있으며, 이는 사용될 수 있다. 예를 들면, 2가 결합 분자의 첫번째 위치에는 있는 ErbB 엑토도메인은 그 자신의 천연 신호 펩티드를 함유할 수 있다. 별법으로, 상기 신호 펩티드는 컨센서스 코작(Kozak) 서열 (GCCGCCACCATGG)에 따르도록 변형될 수 있는데, 여기서, ATG는 ErbB 엑토도메인의 출발 코돈이며, +4번 위치는 컨센서스 코작 서열에 따르도록 G로 변경된다. 적합한 서열은 하기 표 2에서 찾아볼 수 있다.

개시된 2가 결합 분자는 재조합 DNA 분자로부터 발현된 아미노산 서열을 포함할 것이다. 상기 나타낸 바와 같이, 재조합 DNA 분자는 제1 수용체 단백질의 부분을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열과, 제2 수용체 단백질의 부분을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 수용체 단백질은 동일하거나 상이할 수 있지만, 일반적으로는 2가 결합 분자가 보다 광범위한 범위의 결합 분자에 결합할 수 있도록 상이한 수용체 단백질을 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 경우 제1 및 제2 수용체 단백질은 일반적으로 상이한 유전자로부터 코딩된다.

2가 결합 분자가 적합한 숙주에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현될 수 있도록 2가 결합 부분, 임의의 링커 및 임의의 융합 파트너를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 전사 및 번역 서열과 함께 하나의 배열로 재조합 DNA 작제물 내로 클로닝될 수 있다. DNA 단편을 벡터 내로 삽입시키는 방법들 중 당업자에게 알려져 있는 임의의 것을 사용하여 전사/번역 제어 신호의 제어하에 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 적합한 숙주에서 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있는 전사 및 번역 서열을 선택하는 것은 충분히 당업자의 기술 영역내 포함된다. 그의 재조합 유전자로부터 개시된 분자를 생산할 수 있는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 세균, 효모, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 수많은 상황하에서, 수용체는 글리코실화되고, 글리코실화는 리간드 결합에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 숙주 선별은 숙주 세포에 의해 생성되는 글리코실화 패턴에 따라 달라질 수 있다. 적합한 결합 친화성을 갖는 리간드 결합 분자를 생산할 수 있는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. ErbB-함유 결합 분자의 경우, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포, 더욱 특히, 예를 들면, CHO 세포가 사용될 수 있다.

다수의 적합한 프로모터 및 인핸서 요소가 당업계에 공지되어 있다. 키메라 폴리펩티드 분자의 발현을 제어하는데 사용될 수 있는 프로모터로는 말단의 긴 반복서열; SV40 조기 프로모터 영역, CMV, M-MuLV, 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열; 원핵성 발현 벡터, 예로서, β-락타마제 프로모터, 또는 tac 프로모터; 효소 또는 다른 진균으로부터 유래된 프로모터 요소, 예로서, Gal 4 프로모터, ADH, PGK, 알칼리성 포스파타제, 및 유전자, 예로서, 엘라스타제 I로부터 유래된 조직-특이성 전사 제어 영역을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

개시된 2가 결합 분자는 생성된 이중 트랩 분자가 안정적으로 2가 결합을 할 수 있도록 하는 임의의 기법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, 2가 결합 분자는 가용성 단백질로서 또는 봉입체로서 세포로부터 회수될 수 있으며, 공지되어 있는 바와 같이 8M 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 투석에 의해 상기로부터 정량적으로 추출될 수 있다. 별법으로, 2가 결합 분자, 통상의 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과가 사용될 수 있다. 고정된 리간드 또는 리간드 모사체를 사용하는 친화도법 또한 사용될 수 있다.

2가 결합 분자의 결합 친화성 및 저해제 효능은 바이오센서 기술을 사용함으로써, 또는 예로서, 당업계에 잘 알려져 있는 ELISA와 같은 고전적 결합 분석법에 의해 후보 절단된 엑토도메인에 대해 측정될 수 있다.

2가 결합 분자는 단일요법으로서 또는 병용 요법에서 사용될 수 있다. 다수의 실시태양에서, 2가 결합 분자는 화학요법제, 수술, 카테터 장치, 및 방사선을 비롯한 하나 이상의 추가 화합물, 또는 요법과 함께 병용 투여될 수 있다. 병용 요법은, 2가 결합 분자 및 하나 이상의 추가 제제를 함유하는 단일의 약제학적 투여용 제형의 투여; 뿐만 아니라, 그들 각자의 개별 약제학적 투여용 제형 내에 있는 2가 결합 분자 및 하나 이상의 추가 제제(들)의 투여를 포함한다. 예를 들면, 2가 결합 분자 및 세포독성제, 화학요법제 또는 성장 저해제는 단일 투여용 조성물, 예로서, 배합된 제형으로 함께 환자에게 투여될 수 있거나, 각각의 제제는 개별 투여용 제형으로 투여될 수 있다. 더욱 특히, 2가 결합 분자는 치료제, 예로서, 라파티닙, 허셉틴™, 어비턱스(Erbitux) 등과 함께 병용 요법으로 사용될 수 있다. 개별 투여용 제형이 사용되는 경우, 본 발명의 융합 폴리펩티드와 하나 이상의 추가 제제는 동시에, 또는 개별적으로 시차를 두고, 즉, 순차적으로 투여될 수 있다.

도 2는 유방암 세포 배양물을 사용하여 시험하였을 때의, 수개의 2가 결합 분자의 시험관내 효능을 입증한다. 도 2의 상단 열에서, 유방암 세포를 대조군 배지 (상단 열) 또는 ErbB3 리간드 결합 분자 "단일 트랩" 또는 1가 결합 분자 (하단 열)로 미리 조절된 배지 중 어느 것에서 배양하였다. 이어서, 세포를 미처리하거나, 1 μM GW2974 (제너릭 GW572016) 또는 GW2974 + NDF (헤레굴린)로 처리하였다. 보여지는 바와 같이, ErbB3 단일 트랩은 이중 저해제 독성을 증진시켜고, 이중 저해제에 대한 NDF 의존적 내성을 역전시켰다.

본 발명은 또한 본 발명의 2가 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 치료학적 유효량의 2가 결합 분자, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. "약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 동물, 및 더욱 특히 인간용으로서 연방 또는 주 정부의 규제 기관으로부터 인가받았거나, 미국 약전 또는 기타 일반 공인 약전에 열거되어 있음을 의미한다. "담체"라는 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예로서, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예로서, 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 비롯한, 물 및 오일일 수 있다. 적합한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 원하는 경우 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 액제, 현탁액제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 서방성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체로는 예로서, DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC와 같이 제제에 사용하기 위한 기타 성분들을 포함한다. 천연 또는 합성 계면활성제가 사용될 수 있다. PEG가 사용될 수 있으며 (심지어는 단백질 또는 유사체를 유도체화시키는데 사용되는 것과는 별도로 사용), 덱스트란, 예로서, 사이클로덱스트란이 사용될 수 있다. 담즙산염 및 기타 관련 증진제가 사용될 수 있다. 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체가 사용될 수 있다. 아미노산은 예로서, 완충액 제제에서의 용도로 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 희석제로는 다양한 성분들 (예컨대, Tris-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 강도를 갖는 완충제; 첨가제, 예로서, 세제 및 가용화제 (예컨대, 트위드(TWEED)™80, 폴리소르베이트(Polysorbate) 80), 항산화제 (예컨대, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 방부제 (예컨대, 티메로살, 벤질 알코올) 및 벌크화 물질 (예컨대, 락토스, 만닛톨); 예로서, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제제내, 또는 리포좀내 물질의 혼입물을 포함한다. 히알루론산 또한 사용될 수 있으며, 이는 순환시 지속 기간을 촉진시키는 효과를 가질 수 있다. 그러한 조성물은 본 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712] (본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 본 조성물은 액체 형태로 제조될 수 있거나, 건조 분말, 예로서, 동결건조된 형태일 수 있다. 경피용 제제와 같은, 삽입형 서방성 제제 또한 주시된다. 리포좀, 미세캡슐, 미세구, 포접 복합체, 또는 다른 유형의 담체 또한 주시된다.

그가 의도하는 치료학적 용도로서 효과적일 수 있는 활성의 2가 결합 분자의 양은 본 설명에 기초하여 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적의 투여 범위를 확인하기 위해 시험관내 분석법을 임의로 사용할 수 있다. 일반적으로, 1일 요법은 체중 1 ㎏당 활성물 0.1-1000 ㎍ 범위, 바람직하게 1 ㎏당 0.1-150 ㎍이어야 한다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽법으로부터 추정될 수 있다. 투여량 및 투여 간격은 치료 효과를 유지시키는데 충분한 혈장 수준의 화합물을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 화합물의 국소 유효 농도는 혈장 농도와는 관련이 없을 수 있다. 치료 방법에 포함되는 투여 요법은 약물 작용을 변형시킬 수 있는 각종 인자, 예컨대, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 질환의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상적 요소를 고려하여, 주치의에 의해 결정될 것이다.

투여되는 화합물의 양도 물론 치료받는 대상자, 대상자의 체중, 질병의 중증도, 투여 방식, 및 처방하는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 증상이 발견될 수 있는 경우, 또는 심지어는 증상이 발견될 수 없는 경우에도 요법은 간헐적으로 반복될 수 있다. 요법은 단독으로 제공되거나, 다른 약물과 함께 병용하여 제공될 수 있다.

ErbB 리간드에 결합하는 결합 분자를 수득하고, 혈청으로부터 리간드의 부분을 제거하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 개시한다. 본원에 개시된 것과 같은 결합 분자를 표준 방법에 의해 고체 지지체, 예로서, 페레시스(apheresis) 또는 비아코어 지지체에 고정시킬 수 있다. 결합 분자를 고체 지지체에 고정시킬 때, 환자의 혈청 또는 혈액을 페레시스 칼럼 중에서 고체 지지체와 접촉할 수 있도록 배치하여 혈액으로부터 ErbB 리간드의 부분이 제거될 수 있도록 한다.

방법에서 개시된 2가 결합 분자는 ErbB 리간드의 과발현을 검출하는 진단 방법에서 사용될 수 있다. ErbB 수용체의 과도한 활성화를 특징으로 하는 암은 동일 조직 유형의 비-암성 세포보다 과도한 활성화를 통해 유발될 수 있다. 그러한 과도한 활성화는 ErbB 수용체의 과발현에 의해 및/또는 정상 수준을 초과하는 ErbB 리간드에 의해 유발될 수 있다.

하나의 실시태양에서, ErbB 수용체의 과도한 활성화가 ErbB 리간드의 과발현에 의해 유발되었는지 여부를 측정하기 위해 암을 진단 또는 예후 분석법으로 분석할 수 있다. 2가 결합 분자를 임의의 검출가능한 마커, 예로서, 방사성 또는 조영 마커로 표지할 수 있다. 이어서, 분자를 암 세포와 접촉시키고, 당업계에 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 시각화할 수 있다. 예를 들면, 검출하고자 하는 분자에 결합하고, 검출가능한 표지 (예컨대, 방사성 동위원소)로 태깅된 2가 결합 분자를 투여하고, 표지의 위치 측정을 위해 환자를 외부적으로 스캐닝함으로서 상기 방법을 수행할 수 있다.

실시예 1

본 실시예는 2개의 ErbB 수용체 세포외 도메인을 갖는 2가 결합 분자의 대표적인 조성물의 작제를 설명한다.

ErbB1 및 ErbB3 또는 ErbB1 및 ErbB4의 세포외 도메인을 혼입함으로써 ErbB 계열의 모든 리간드에 결합하는 ErbB 2가 결합 분자를 디자인하였다. 각 쌍에 대해 상이한 2개의 배향으로 디자인하였다. 따라서, 하기 조합물을 제조하였다: ErbB1-ErbB3, ErbB3-ErbB1, ErbB1-ErbB4 및 ErbB4-ErbB1.

pcDNA3.1(+) 벡터는 그의 신장성 다중 클로닝 부위 때문에 작제물의 작제를 촉진시키는 클로닝 비히클로서 사용되었다. 먼저, 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus: TEV) 프로테아제 인식 서열 (ETVRFQG/S) [서열 번호: 27]에 이어 6x 히스티딘 태그 및 종결 코돈에 대한 올리고뉴클레오티드를 pcDNA3.1(+)의 XbaI 및 ApaI 부위로 클로닝하여 pcDNA3.1(+)-TH를 수득하였다. 올리고뉴클레오티드는 ApaI 부위 상류에 NotI 부위를 포함함으로써 상기 작제물이 결국에는 pcDNA3.1(+)로부터 유리될 수 있도록 하였다. ApaI 부위 상류에 XbaI 부위 및 NotI 부위가 삽입되어 있는(embedded) TEV-6xHis-STOP 센스 올리고뉴클레오티드: 5' CTA GAG AAA ACC TGT ACT TCC AGT CCC ATC ATC ATC ATC ATC ATT GAG CGG CCG CGG GCC [서열 번호: 28]를, ApaI 부위 상류에 XbaI 부위 및 NotI 부위가 삽입되어 있는 TEV-6xHis-STOP 안티-센스 올리고뉴클레오티드: 5' CGC GGC CGC TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGA CTG GAA GTA CAG GTT TTC T [서열 번호: 30]와 함께 사용하였다.

ErbB1 또는 ErbB4 중 하나의 세포외 도메인의 처음 3개의 하위도메인 (LI, SI, LII로서 공지됨) 및 4번째 하위도메인 (SII로서 공지됨)의 첫번째 모듈을 링커 서열과 함께 pcDNA3.1(+)-TH의 NheI 및 KpnI 부위 내로 클로닝하였다. 특히, 링커 서열은 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [서열 번호: 29]로 구성된 15개의 아미노산 (Gly₄Ser)₃ 펩티드를 코딩한다. 신호 펩티드와, ErbB1 및 ErbB4, 둘 모두의 LI, SI, LII 및 SII 하위도메인의 첫번째 모듈을 증폭시키기 위해 순방향 PCR 프라이머를 디자인하였다. 공지된 바와 같은 컨센서스 "코작" 서열을 신호 펩티드 개시 코돈 상류에 인접하게 위치하는 프라이머 내로 클로닝하였다. ErbB1의 V500 아미노산 및 ErbB4의 L496 아미노산 이하와 (ErbB1의 신호 펩티드 다음의 류신은 L1 아미노산으로 정의되고, ErbB4의 신호 펩티드 다음의 글루타민은 Q1 아미노산으로 정의된다), 이어서, AgeI 부위, (Gly₄Ser)₃ 링커 서열 [서열 번호: 29] 및 KpnI 부위를 포함하는 역방향 PCR 프라이머를 디자인하였다. NheI 부위 및 컨센서스 "코작" 서열을 포함하는 ErbB1 순방향 프라이머 서열은 하기와 같았다: 5' AGC TGC TAG CGC CAC CAT GCG ACC CTC CGG GAC GGC CG [서열 번호: 31]. NheI 부위 및 컨센서스 "코작" 서열을 포함하는 ErbB4 순방향 프라이머 서열은 하기와 같았다: 5' AGC TGC TAG CGC CAC CAT GAA GCC GGC GAC AGG ACT TT [서열 번호: 32]. AgeI 부위, (Gly₄Ser)₃ 링커 서열 및 KpnI 부위를 포함하는 ErbB1 역방향 프라이머 서열은 5' TCT GGT ACC CGA TCC GCC ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC ACC GGT GAC GCA GTC CCT GGG CTC CGG GCC C [서열 번호: 33]였다. AgeI 부위, (Gly₄Ser)₃ [서열 번호: 29] 링커 서열 및 KpnI 부위를 포함하는 ErbB1 역방향 프라이머 서열은 5' TCT GGT ACC CGA TCC GCC ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC ACC GGT CAG ACA TTG GTC TGG CCC AGG TCC C [서열 번호: 34]였다.

ErbB1 또는 ErbB4 중 하나의 전장의 cDNA로부터 세포외 도메인을 증폭시켰다. 이를 통해 플라스미드 pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-TH 및 pcDNA3.1 (+)-ECD4-GS-TH를 수득하였다.

ErbB3 작제물을 작제하기 위하여 ErbB3의 세포외 도메인의 처음 3개의 하위도메인 (LI, SI, LII) 및 4번째 하위도메인 (SII)의 첫번째 모듈을 전장의 cDNA로 부터 PCR에 의해 증폭시키고, pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-TH의 NheI 및 AgeI 부위 내로 클로닝하였다. 상기 기술된 바와 같이, ErbB3의 신호 펩티드 개시 코돈 상류에 인접하게 NheI 부위 및 컨센서스 "코작" 서열을 혼입시켜 순향 PCR 프라이머를 디자인하였다. NheI 부위 및 컨센서스 "코작" 서열을 포함하는 ErbB3 순방향 프라이머 서열은 5' AGC GCT AGC GCC ACC ATG AGG GCG AAC GAC GCT CTG CAG G [서열 번호: 35]이고, AgeI 부위를 포함하는 ErbB3 역방향 프라이머 서열은 5' AGC ACC GGT CAA GCA CTG ACC AGG GCC TGG GCC C [서열 번호: 36]였다.

ErbB3의 전장의 cDNA로부터 세포외 도메인을 증폭시키고, 이를 사용하여 플라스미드 pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-TH를 제조하였다.

두번째 ErbB 세포외 도메인을 각 작제물 내로 클로닝하였다. 이는 ErbB1, ErbB3 또는 ErbB4의 세포외 도메인의 처음 3개의 하위도메인 (LI, SI, LII) 및 SII 하위도메인의 첫번째 모듈을 증폭시킴으로써 수행하였다. 첫번째 위치의 것과 비교할 때, 작제물의 두번째 위치에 배치된 세포외 도메인들 간의 유일한 차이는 신호 펩티드를 포함하지 않는다는 점이었다. ErbB1, ErbB3 또는 ErbB4의 처음 3개의 하위도메인 및 4번째 하위도메인의 첫번째 모듈을 증폭시키기 위해 KpnI 부위를 포함하는 순방향 PCR 프라이머를 디자인하였다. ErbB1, ErbB3 또는 ErbB4에 대한, XbaI 부위를 포함하는 역방향 PCR 프라이머를 디자인하였다. 각 세포외 도메인에 대한 마지막 아미노산은 V500 (ErbB1), L499 (ErbB3) 및 L496 (ErbB4)였다. KpnI 부위를 포함하는 ErbB1 두번째 위치의 순방향 프라이머는 5' CGG GGT ACC CTG GAG GAA AAG AAA GTT TGC C [서열 번호: 37]였고, KpnI 부위를 포함하는 ErbB3 두번째 위치의 순방향 프라이머는 5' CGG GGT ACC TCC GAG GTG GGC AAC TCT CAG GCA G [서열 번호: 38]였다. KpnI 부위를 포함하는 ErbB4 두번째 위치의 순방향 프라이머는 5' CGG GGT ACC CAG TCA GTG TGT GCA GGA ACG G [서열 번호: 39]였다. XbaI 부위를 포함하는 ErbB1 두번째 위치의 역방향 프라이머는 5' TGC TCT AGA GAC GCA GTC CCT GGG CTC CGG G [서열 번호: 40]였다. XbaI 부위를 포함하는 ErbB3 두번째 위치의 역방향 프라이머는 5' TGC TCT AGA CAA GCA CTG ACC AGG GCC TGG GCC C [서열 번호: 41]였다. XbaI 부위를 포함하는 ErbB4 두번째 위치의 역방향 프라이머는 5' TGC TCT AGA CAG ACA TTG GTC TGG CCC AGG T [서열 번호: 42]였다.

ErbB1의 세포외 도메인을 pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-TH 및pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-TH, 둘 모두의 두번째 위치 내로 클로닝하여 플라스미드 pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-ECD1-TH 및 pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-ECD1-TH를 수득하였다. ErbB3의 세포외 도메인을 pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-TH의 두번째 위치 내로 클로닝하여 플라스미드 pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-ECD3-TH를 수득하였다. ErbB4의 세포외 도메인을 pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-TH의 두번째 위치 내로 클로닝하여 플라스미드 pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-ECD4-TH를 수득하였다.

직접 서열 분석하여 모든 작제물을 확인하였다. 신장 인자 1 알파(EF 1α) 프로모터, 및 다중 클로닝 부위 다음의 IRES 서열로부터 발현되는 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 바이시스트로닉 플라스미드, pEF-IRES-P를 발현에 사용하였다. 4개의 이중 트랩 작제물 모두를 NheI 및 NotI로 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 pcDNA3.1(+)로부터 유리시키고, pEF-IRES-P 중 동일 부위로 클로닝하였다. 이를 통해 플라스미드 pEF-ECD13-IRES-P, pEF-ECD31-IRES-P, pEF-ECD14-IRES-P 및 pEF-ECD41-IRES-P를 수득하고, 이는 각각 ErbB1-ErbB3, ErbB3-ErbB1, ErbB1-ErbB4, 및 ErbB4-ErbB1 단백질을 발현시키는데 사용하였으며, 첫번재 결합 부분은 상기 단백질의 아미노 말단 방향으로 위치하였다.

실시예 2

본 실시예는 포유동물 숙주 세포에서 재조합 DNA 분자로부터 이중 트랩 분자를 발현시키는 것과 활성 형태로 그를 정제하는 것을 설명한다. 실시예 1로부터 얻은 4개의 작제물 모두를 PvuI로 분해하여 선형 재조합 DNA 분자를 생성하였는데, 이것이 세포 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합시키는데는 더 적합하다. 표준 방법에 의해 4개의 선형화된 이중 트랩 분자를 293T 세포 내로 형질감염시킨 후, 퓨로마이신의 농도를 고농도로 증가시키면서 선별하여 작제물이 안정적으로 통합된 세포 군집을 생성하였다. 작제물 발현은 세포 배양 배지내 결합 분자의 농도를 측정하는 상이한 수단, 예로서, 도 3에 나타낸 것과 같은, 분비 이전에 세포내 트랩의 수준을 검출하는 웨스턴 블롯, 또는 도 4에 나타낸 것과 같은 ELISA에 의해 평가할 수 있다. ELISA 분석법을 사용하여 다수의 개개의 세포를 스크리닝함으로써 최고 수준으로 트랩 분자를 발현시키는 것으로서, 클론에 의해 유래된 세포를 확립시켰다. 결합 분자는 상기 분자가 간단한 친화성 정제 방법에 의해 정제될 수 있도록 하는 히스티딘 태그를 함유한다.

결합 분자의 기능성을 시험하기 위하여 293T 세포로부터 조절된 배지를 수집하고, 여과하고, 이를 사용하여 BT474 세포를 배양하였다. 48시간 후에 pEF- ECD14-IRES-P 작제물을 발현하는 293T 세포로부터 유래된 배지를 사용하여 배양된 BT474 세포에서는 세포수가 현저히 감소된 것이 관찰되었다. 도 5를 참조한다.

SEQUENCE LISTING <110> TARGETED MOLECULAR DIAGNOSTICS, LLC YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD. BACUS, Sarah HILL, Jason YARDEN, Yosef KOCHUPURAKKAL, Bose S. <120> BIVALENT ERBB LIGAND BINDING MOLECULES AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE <130> 115881-18 <150> US 60/771,237 <151> 2006-02-08 <150> US 60/828,343 <151> 2006-10-05 <160> 42 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1596 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctggaggaaa agaaagtttg ccaaggcacg agtaacaagc tcacgcagtt gggcactttt 60 gaagatcatt ttctcagcct ccagaggatg ttcaataact gtgaggtggt ccttgggaat 120 ttggaaatta cctatgtgca gaggaattat gatctttcct tcttaaagac catccaggag 180 gtggctggtt atgtcctcat tgccctcaac acagtggagc gaattccttt ggaaaacctg 240 cagatcatca gaggaaatat gtactacgaa aattcctatg ccttagcagt cttatctaac 300 tatgatgcaa ataaaaccgg actgaaggag ctgcccatga gaaatttaca ggaaatcctg 360 catggcgccg tgcggttcag caacaaccct gccctgtgca acgtggagag catccagtgg 420 cgggacatag tcagcagtga ctttctcagc aacatgtcga tggacttcca gaaccacctg 480 ggcagctgcc aaaagtgtga tccaagctgt cccaatggga gctgctgggg tgcaggagag 540 gagaactgcc agaaactgac caaaatcatc tgtgcccagc agtgctccgg gcgctgccgt 600 ggcaagtccc ccagtgactg ctgccacaac cagtgtgctg caggctgcac aggcccccgg 660 gagagcgact gcctggtctg ccgcaaattc cgagacgaag ccacgtgcaa ggacacctgc 720 cccccactca tgctctacaa ccccaccacg taccagatgg atgtgaaccc cgagggcaaa 780 tacagctttg gtgccacctg cgtgaagaag tgtccccgta attatgtggt gacagatcac 840 ggctcgtgcg tccgagcctg tggggccgac agctatgaga tggaggaaga cggcgtccgc 900 aagtgtaaga agtgcgaagg gccttgccgc aaagtgtgta acggaatagg tattggtgaa 960 tttaaagact cactctccat aaatgctacg aatattaaac acttcaaaaa ctgcacctcc 1020 atcagtggcg atctccacat cctgccggtg gcatttaggg gtgactcctt cacacatact 1080 cctcctctgg atccacagga actggatatt ctgaaaaccg taaaggaaat cacagggttt 1140 ttgctgattc aggcttggcc tgaaaacagg acggacctcc atgcctttga gaacctagaa 1200 atcatacgcg gcaggaccaa gcaacatggt cagttttctc ttgcagtcgt cagcctgaac 1260 ataacatcct tgggattacg ctccctcaag gagataagtg atggagatgt gataatttca 1320 ggaaacaaaa atttgtgcta tgcaaataca ataaactgga aaaaactgtt tgggacctcc 1380 ggtcagaaaa ccaaaattat aagcaacaga ggtgaaaaca gctgcaaggc cacaggccag 1440 gtctgccatg ccttgtgctc ccccgagggc tgctggggcc cggagcccag ggactgcgtc 1500 tcttgccgga atgtcagccg aggcagggaa tgcgtggaca agtgcaacct tctggagggt 1560 gagccaaggg agtttgtgga gaactctgag tgcata 1596 <210> 2 <211> 532 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15 Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn 20 25 30 Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg 35 40 45 Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60 Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95 Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro 100 105 110 Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn 115 120 125 Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val 130 135 140 Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp 165 170 175 Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala 180 185 190 Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys 195 200 205 His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys 210 215 220 Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255 Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro 260 265 270 Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly 275 280 285 Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300 Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys 325 330 335 Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe 340 345 350 Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu 355 360 365 Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln 370 375 380 Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415 Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile 420 425 430 Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala 435 440 445 Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr 450 455 460 Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln 465 470 475 480 Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro 485 490 495 Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val 500 505 510 Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn 515 520 525 Ser Glu Cys Ile 530 <210> 3 <211> 1596 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atatgcgagt ctaacgaggt gtttgagagg ccagagggtg agctgcttaa ctgcaaggac 60 gtgtgcgaaa ggggccgaag cgtcaatcgg tgctctgtct gcgacaggcc cgagccgggc 120 tggtgcggcg agccctcctg cttggcccat tgcgtccagg gcacagccaa gtgcagcaac 180 gaaggtagaa acagcataat taaaaccaaa cagggttcca ccgggtttct gaaaaaatgg 240 aacataacaa atgcatattg cttgaataaa aacggatcaa ttatagtgga tggagatagt 300 atagagaagc tctcccgctt aggattgtcc acaataaacc tgagcgtcgt cgcactttct 360 tttcagggtc atcaaaagac caggggccgc ataatcgaac taaacgagtt tgcccatctc 420 gacacgagga acgaaccttg ggctcagatt ctgttgtttg ggacaatcga aaaggtaacc 480 aaactgattg atctggaaca gccagatctg cctcctactc atacattctc cgacggtagg 540 tttgcagtgc cgctgatcca cctcgatggc agtatctcca cctgcaacaa attccacaaa 600 attaatacgg ctaatatatc cctctcagac aaatttgaag gtattggtat aggaaactgt 660 gtgaaacgct gccctgggga atgcaagaag tgtaagcgcg tcggcgacga agagatggag 720 tatagcgacg ccgggtgtgc ccgagtctgc tcgggccacg atacagtggt gtataatcgt 780 ccctgtaaga aggtgtgcac cgccggtttt agctacaaag gcgagcccaa cgtggatatg 840 cagtacacga cccccaacta cctcatgctc ccaccctgca ccgacaagtg cacggccgaa 900 gaccgattca aacgctgcgt cctgtgcgac agcgagcggc ccggcacatg cggcgcagct 960 tgtcagaacc 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Ser Cys Leu 35 40 45 Ala His Cys Val Gln Gly Thr Ala Lys Cys Ser Asn Glu Gly Arg Asn 50 55 60 Ser Ile Ile Lys Thr Lys Gln Gly Ser Thr Gly Phe Leu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Asn Ile Thr Asn Ala Tyr Cys Leu Asn Lys Asn Gly Ser Ile Ile Val 85 90 95 Asp Gly Asp Ser Ile Glu Lys Leu Ser Arg Leu Gly Leu Ser Thr Ile 100 105 110 Asn Leu Ser Val Val Ala Leu Ser Phe Gln Gly His Gln Lys Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Ile Ile Glu Leu Asn Glu Phe Ala His Leu Asp Thr Arg Asn 130 135 140 Glu Pro Trp Ala Gln Ile Leu Leu Phe Gly Thr Ile Glu Lys Val Thr 145 150 155 160 Lys Leu Ile Asp Leu Glu Gln Pro Asp Leu Pro Pro Thr His Thr Phe 165 170 175 Ser Asp Gly Arg Phe Ala Val Pro Leu Ile His Leu Asp Gly Ser Ile 180 185 190 Ser Thr Cys Asn Lys Phe His Lys Ile Asn Thr Ala Asn Ile Ser Leu 195 200 205 Ser Asp Lys Phe Glu Gly Ile Gly Ile Gly Asn Cys Val Lys Arg Cys 210 215 220 Pro Gly Glu Cys Lys Lys Cys Lys Arg Val Gly Asp Glu Glu Met Glu 225 230 235 240 Tyr Ser Asp Ala Gly Cys Ala Arg Val Cys Ser Gly His Asp Thr Val 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gatgctgggg tcctggatca 540 gaagactgcc agacattgac caagaccatc tgtgctcctc agtgtaatgg tcactgcttt 600 gggcccaacc ccaaccagtg ctgccatgat gagtgtgccg ggggctgctc aggccctcag 660 gacacagact gctttgcctg ccggcacttc aatgacagtg gagcctgtgt acctcgctgt 720 ccacagcctc ttgtctacaa caagctaact ttccagctgg aacccaatcc ccacaccaag 780 tatcagtatg gaggagtttg tgtagccagc tgtccccata actttgtggt ggatcaaaca 840 tcctgtgtca gggcctgtcc tcctgacaag atggaagtag ataaaaatgg gctcaagatg 900 tgtgagcctt gtgggggact atgtcccaaa gcctgtgagg gaacaggctc tgggagccgc 960 ttccagactg tggactcgag caacattgat ggatttgtga actgcaccaa gatcctgggc 1020 aacctggact ttctgatcac cggcctcaat ggagacccct ggcacaagat ccctgccctg 1080 gacccagaga agctcaatgt cttccggaca gtacgggaga tcacaggtta cctgaacatc 1140 cagtcctggc cgccccacat gcacaacttc agtgtttttt ccaatttgac aaccattgga 1200 ggcagaagcc tctacaaccg gggcttctca ttgttgatca tgaagaactt gaatgtcaca 1260 tctctgggct tccgatccct gaaggaaatt agtgctgggc gtatctatat aagtgccaat 1320 aggcagctct gctaccacca ctctttgaac tggaccaagg tgcttcgggg gcctacggaa 1380 gagcgactag acatcaagca taatcggccg cgcagagact gcgtggcaga gggcaaagtg 1440 tgtgacccac tgtgctcctc tgggggatgc tggggcccag gccctggtca gtgcttgtcc 1500 tgtcgaaatt atagccgagg aggtgtctgt gtgacccact gcaactttct gaatggggag 1560 cctcgagaat ttgcccatga ggccgaatgc ttc 1593 <210> 6 <211> 531 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly 1 5 10 15 Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu 35 40 45 Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val 50 55 60 Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe 85 90 95 Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu 100 105 110 Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val 115 120 125 Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp 130 135 140 Arg 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aagtgccaat 1320 aggcagctct gctaccacca ctctttgaac tggaccaagg tgcttcgggg gcctacggaa 1380 gagcgactag acatcaagca taatcggccg cgcagagact gcgtggcaga gggcaaagtg 1440 tgtgacccac tgtgctcctc tgggggatgc tggggcccag gccctggtca gtgcttg 1497 <210> 24 <211> 499 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly 1 5 10 15 Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu 35 40 45 Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val 50 55 60 Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe 85 90 95 Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu 100 105 110 Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val 115 120 125 Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp 130 135 140 Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val 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Leu Asn Val Phe 355 360 365 Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro 370 375 380 Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly 385 390 395 400 Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn 405 410 415 Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala 420 425 430 Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser 435 440 445 Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp 450 455 460 Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val 465 470 475 480 Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly 485 490 495 Gln Cys Leu <210> 25 <211> 1488 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 cagtcagtgt gtgcaggaac ggagaataaa ctgagctctc tctctgacct ggaacagcag 60 taccgagcct tgcgcaagta ctatgaaaac tgtgaggttg tcatgggcaa cctggagata 120 accagcattg agcacaaccg ggacctctcc ttcctgcggt ctgttcgaga agtcacaggc 180 tacgtgttag tggctcttaa tcagtttcgt tacctgcctc tggagaattt acgcattatt 240 cgtgggacaa aactttatga ggatcgatat gccttggcaa tatttttaaa ctacagaaaa 300 gatggaaact ttggacttca agaacttgga ttaaagaact tgacagaaat cctaaatggt 360 ggagtctatg tagaccagaa caaattcctt tgttatgcag acaccattca ttggcaagat 420 attgttcgga acccatggcc ttccaacttg actcttgtgt caacaaatgg tagttcagga 480 tgtggacgtt gccataagtc ctgtactggc cgttgctggg gacccacaga aaatcattgc 540 cagactttga caaggacggt gtgtgcagaa caatgtgacg gcagatgcta cggaccttac 600 gtcagtgact gctgccatcg agaatgtgct ggaggctgct caggacctaa ggacacagac 660 tgctttgcct gcatgaattt caatgacagt ggagcatgtg ttactcagtg tccccaaacc 720 tttgtctaca atccaaccac ctttcaactg gagcacaatt tcaatgcaaa gtacacatat 780 ggagcattct gtgtcaagaa atgtccacat aactttgtgg tagattccag ttcttgtgtg 840 cgtgcctgcc ctagttccaa gatggaagta gaagaaaatg ggattaaaat gtgtaaacct 900 tgcactgaca tttgcccaaa agcttgtgat ggcattggca caggatcatt gatgtcagct 960 cagactgtgg attccagtaa cattgacaaa ttcataaact gtaccaagat caatgggaat 1020 ttgatctttc tagtcactgg tattcatggg gacccttaca atgcaattga agccatagac 1080 ccagagaaac tgaacgtctt tcggacagtc agagagataa caggtttcct gaacatacag 1140 tcatggccac caaacatgac tgacttcagt gttttttcta acctggtgac cattggtgga 1200 agagtactct atagtggcct gtccttgctt atcctcaagc aacagggcat cacctctcta 1260 cagttccagt ccctgaagga aatcagcgca ggaaacatct atattactga caacagcaac 1320 ctgtgttatt atcataccat taactggaca acactcttca gcacaatcaa ccagagaata 1380 gtaatccggg acaacagaaa agctgaaaat tgtactgctg aaggaatggt gtgcaaccat 1440 ctgtgttcca gtgatggctg ttggggacct gggccagacc aatgtctg 1488 <210> 26 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Ser Val Cys Ala Gly Thr Glu Asn Lys Leu Ser Ser Leu Ser Asp 1 5 10 15 Leu Glu Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Arg Lys Tyr Tyr Glu Asn Cys Glu 20 25 30 Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Thr Ser Ile Glu His Asn Arg Asp 35 40 45 Leu Ser Phe Leu Arg Ser Val Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val 50 55 60 Ala Leu Asn Gln Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Glu Asn Leu Arg Ile Ile 65 70 75 80 Arg Gly Thr Lys Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Ala Leu Ala Ile Phe Leu 85 90 95 Asn Tyr Arg Lys Asp Gly Asn Phe Gly Leu Gln Glu Leu Gly Leu Lys 100 105 110 Asn Leu Thr Glu Ile Leu Asn Gly Gly Val Tyr Val Asp Gln Asn Lys 115 120 125 Phe Leu Cys Tyr Ala Asp Thr Ile His Trp Gln Asp Ile Val Arg Asn 130 135 140 Pro Trp Pro Ser Asn Leu Thr Leu Val Ser Thr Asn Gly Ser Ser Gly 145 150 155 160 Cys Gly Arg Cys His Lys Ser Cys Thr Gly Arg Cys Trp Gly Pro Thr 165 170 175 Glu Asn His Cys Gln Thr Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Glu Gln Cys 180 185 190 Asp Gly Arg Cys Tyr Gly Pro Tyr Val Ser Asp Cys Cys His Arg Glu 195 200 205 Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Lys Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys 210 215 220 Met Asn Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Thr Gln Cys Pro Gln Thr 225 230 235 240 Phe Val Tyr Asn Pro Thr Thr Phe Gln Leu Glu His Asn Phe Asn Ala 245 250 255 Lys Tyr Thr Tyr Gly Ala Phe Cys Val Lys Lys Cys Pro His Asn Phe 260 265 270 Val Val Asp Ser Ser Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Ser Ser Lys Met 275 280 285 Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Lys Met Cys Lys Pro Cys Thr Asp Ile 290 295 300 Cys Pro Lys Ala Cys Asp Gly Ile Gly Thr Gly Ser Leu Met Ser Ala 305 310 315 320 Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Lys Phe Ile Asn Cys Thr Lys 325 330 335 Ile Asn Gly Asn Leu Ile Phe Leu Val Thr Gly Ile His Gly Asp Pro 340 345 350 Tyr Asn Ala Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe Arg 355 360 365 Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Phe Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro Pro 370 375 380 Asn Met Thr Asp Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Val Thr Ile Gly Gly 385 390 395 400 Arg Val Leu Tyr Ser Gly Leu Ser Leu Leu Ile Leu Lys Gln Gln Gly 405 410 415 Ile Thr Ser Leu Gln Phe Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala Gly Asn 420 425 430 Ile Tyr Ile Thr Asp Asn Ser Asn Leu Cys Tyr Tyr His Thr Ile Asn 435 440 445 Trp Thr Thr Leu Phe Ser Thr Ile Asn Gln Arg Ile Val Ile Arg Asp 450 455 460 Asn Arg Lys Ala Glu Asn Cys Thr Ala Glu Gly Met Val Cys Asn His 465 470 475 480 Leu Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Asp Gln Cys Leu 485 490 495 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Tobacco etch virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be Gly or Ser <400> 27 Glu Thr Val Arg Phe Gln Xaa 1 5 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Tobacco etch virus <400> 28 ctagagaaaa cctgtacttc cagtcccatc atcatcatca tcattgagcg gccgcgggcc 60 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker sequence encodes <400> 29 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 30 <211> 52 <212> DNA <213> Tobacco etch virus <400> 30 cgcggccgct caatgatgat gatgatgatg ggactggaag tacaggtttt ct 52 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 agctgctagc gccaccatgc gaccctccgg gacggccg 38 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 agctgctagc gccaccatga agccggcgac aggacttt 38 <210> 33 <211> 85 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 tctggtaccc gatccgccac cgccagagcc acctccgcct gaaccgcctc caccaccggt 60 gacgcagtcc ctgggctccg ggccc 85 <210> 34 <211> 85 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 tctggtaccc gatccgccac cgccagagcc acctccgcct gaaccgcctc caccaccggt 60 cagacattgg tctggcccag gtccc 85 <210> 35 <211> 40 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Claims

공유 결합된 단일 단백질 분자 중 별개의 결합 부위에 제1 및 제2 ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 2가 결합 분자.
제1항에 있어서, 결합 분자가 수용액 중에서 가용성인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB 수용체에 대한 리간드에 결합하는 ErbB 수용체의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하는 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하는 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB 수용체의 아미노산 1-500을 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB1 수용체의 아미노산 1-532를 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB1 수용체의 아미노산 1-621을 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3으로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하는 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3으로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB3 수용체의 아미노산 1-499를 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3으로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB3 수용체의 아미노산 1-531을 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3으로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB3 수용체의 아미노산 1-624를 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하는 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB4 수용체의 아미노산 1-496을 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB4 수용체의 아미노산 1-528을 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB4 수용체의 아미노산 1-626을 포함하는 것인 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분 및 ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3으로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하는 결합 분자.
제1항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도 메인의 부분 및 ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4로부터의 세포외 도메인의 부분을 추가로 포함하는 결합 분자.
제16항 또는 제17항에 있어서, 카복시-말단 ErbB 리간드 결합 부위가 아미노에서 카복시 말단 방향으로 역전되어 있는 아미노산 서열을 갖는 결합 분자.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 부위 사이에 링커를 추가로 포함하는 결합 분자.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너를 추가로 포함하는 결합 분자.
공유 결합된 단일 단백질 분자 중 별개의 결합 부위에 제1 및 제2 ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB에 대한 리간드에 결합하는 ErbB 수용체 단백질의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB에 대한 리간드에 결합하는 ErbB 수용체 단백질의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 ErbB에 대한 리간드에 결합하는 ErbB 수용체 단백질의 부분을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1 수용체 단백질의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB1 수용체의 아미노산 1-500을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB1 수용체의 아미노산 1-532를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 부분은 ErbB1 수용체의 아미노산 1-621을 코딩하는 것인 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3으로부터의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB3 수용체의 아미노산 1-499를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB3 수용체의 아미노산 1-531을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB3 수용체의 아미노산 1-624를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4로부터의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB4 수용체의 아미노산 1-496을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB4 수용체의 아미노산 1-528을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB4 수용체의 아미노산 1-626을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분 및 ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3으로부터의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1로부터의 세포외 도메인의 부분 및 ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4로부터의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
제32항 또는 제33항에 있어서, 카복시-말단 ErbB 리간드 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아미노에서 카복시 말단 방향으로 역전되어 있는 아미노산 서열을 코딩하는 것인 재조합 DNA 분자.
제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 결합 부위들을 결합시키는 링커를 코딩하는 것인 재조합 DNA 분자.
제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 추가로 융합 파트너를 코딩하는 것인 재조합 DNA 분자.
공유 결합된 단일 단백질 분자 중 별개의 결합 부위에 제1 및 제2 ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙 주 세포.
제41항에 있어서, 세포가 공유 결합된 단일 단백질 분자 중 별개의 결합 부위에 제1 및 제2 ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 2가 결합 분자를 생산하는 것인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 세포가 결합 분자의 부분을 세포 외부로 및 주변 배지 내로 수송하는 것인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 재조합 DNA 분자가 ErbB 수용체에 대한 리간드에 결합하는 ErbB 수용체의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 것인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 재조합 DNA 분자가 ErbB1 수용체에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1 수용체의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 것인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 재조합 DNA 분자가 ErbB3 수용체에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3 수용체의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 것인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 재조합 DNA 분자가 ErbB4 수용체에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4 수용체의 세포외 도메인의 부분을 코딩하는 것인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 숙주 세포가 진핵 세포인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 숙주 세포가 효모 세포인 숙주 세포.
제41항에 있어서, 숙주 세포가 원핵 세포인 숙주 세포.
치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 공유 결합된 단일 단백질 분자 중 별개의 결합 부위에 제1 및 제2 ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 2가 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법.
제53항에 있어서, 결합 분자가 ErbB 수용체의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 것인, 질환을 치료하는 방법.
제53항에 있어서, 결합 분자가 ErbB1에 대한 리간드에 결합하는 ErbB1의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 것인, 질환을 치료하는 방법.
제53항에 있어서, 결합 분자가 ErbB3에 대한 리간드에 결합하는 ErbB3의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 것인, 질환을 치료하는 방법.
제53항에 있어서, 결합 분자가 ErbB4에 대한 리간드에 결합하는 ErbB4의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 것인, 질환을 치료하는 방법.
종양 세포를, 공유 결합된 단일 단백질 분자 중 별개의 결합 부위에 제1 및 제2 ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 2가 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 암을 진단하는 방법.
EGF, TGFα, HB-EGF, 베타셀룰린, 암피레귤린, 에피레귤린, 에피겐, 뉴레글린 1α, 뉴레글린 1β, 뉴레글린 2α, 뉴레글린 2β, 뉴레글린 3 및 뉴레글린 4에 대한 친화성을 갖는 단일 분자를 포함하는 결합 분자.
치료를 필요로 하는 대상자에게 공유 결합된 단일 단백질 분자 중 별개의 결합 부위에 제1 및 제2 ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 2가 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, ErbB 리간드의 제거 또는 저해에 의해 개선되거나, 호전되거나, 저해되는 질환 또는 용태를 치료하는 방법.