JP6010551B2 - ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 - Google Patents
ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6010551B2 JP6010551B2 JP2013551852A JP2013551852A JP6010551B2 JP 6010551 B2 JP6010551 B2 JP 6010551B2 JP 2013551852 A JP2013551852 A JP 2013551852A JP 2013551852 A JP2013551852 A JP 2013551852A JP 6010551 B2 JP6010551 B2 JP 6010551B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- epiregulin
- seq
- amino acid
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Description
〔1〕配列番号:9、10および11で表される重鎖可変領域CDRならびに配列番号:12、13および14で表される軽鎖可変領域CDRを含む抗Epiregulin抗体が結合するエピトープに結合する抗体であって、配列番号:170で表されるサルEpiregulinに対するKD値(cEREG KD)の配列番号:34で表されるヒトEpiregulinに対するKD値(hEREG KD)の比(cEREG KD/hEREG KD)が、配列番号:9、10および11で表される重鎖可変領域CDRならびに配列番号:12、13および14で表される軽鎖可変領域CDRを含む抗Epiregulin抗体のcEREG KD/hEREG KDよりも小さいことを特徴とする抗Epiregulin抗体。
〔2〕cEREG KD/hEREG KDが、40よりも小さい〔1〕に記載の抗体。
〔3〕cEREG KD/hEREG KDが、10よりも小さい〔1〕に記載の抗体。
〔4〕cEREG KD/hEREG KDが、6よりも小さい〔1〕に記載の抗体。
〔5〕cEREG KD/hEREG KDが、4よりも小さい〔1〕に記載の抗体。
〔6〕配列番号:9で表される重鎖CDR1、配列番号:161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、および100からなる群から選択される重鎖CDR2、ならびに配列番号:158、154、152、151、112、111、110、および11からなる群から選択される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに、配列番号:163、68、67および12からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号:71、69、および13からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに配列番号:164、48、47および14からなる群から選択される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の抗体。
〔7〕配列番号:150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、および115からなる群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号:141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57、および29からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の抗体。
〔8〕以下のいずれかから選択される抗Epiregulin抗体
(1)配列番号:150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49、および38からなる群から選択される重鎖可変領域を含む抗Epiregulin抗体、
(2)配列番号:141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57、および29からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む抗Epiregulin抗体、または
(3)配列番号:150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49、および38からなる群から選択される重鎖可変領域、ならびに、配列番号:141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57、および29からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む抗Epiregulin抗体。
〔9〕配列番号:26の重鎖定常領域を含む〔6〕から〔8〕のいずれかに記載の抗体。
〔10〕配列番号:27の軽鎖定常領域を含む〔6〕から〔9〕のいずれかに記載の抗体。
〔11〕中和活性を有する〔1〕から〔10〕のいずれかに記載の抗体。
〔12〕細胞傷害活性を有する〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の抗体。
〔13〕細胞傷害活性がCDCおよび/またはADCCである〔12〕に記載の抗体。
〔14〕増殖抑制剤または細胞傷害性物質が連結された〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の抗体。
〔15〕抗体が低分子抗体である〔14〕に記載の抗体。
〔16〕配列番号:26の重鎖定常領域において、EUナンバリングで表される230位、240位、244位、245位、247位、262位、263位、266位、273位、275位、299位、302位、313位、323位、325位、328位および332位からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1つの置換を含む〔12〕から〔15〕のいずれかに記載の抗体。
〔17〕配列番号:9の重鎖CDR1、配列番号:161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、および100からなる群から選択される重鎖CDR2、ならびに配列番号:158、154、152、151、112、111、110、および11からなる群から選択される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔18〕配列番号:26の重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドを含む〔17〕に記載のベクター。
〔19〕配列番号:163、68、67および12からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号:71、69、および13からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに配列番号:164、48、47および14からなる群から選択される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔20〕配列番号:27の軽鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドを含む〔19〕に記載のベクター。
〔21〕(1)配列番号:9で表される重鎖CDR1、配列番号:161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、および100からなる群から選択される重鎖CDR2、ならびに配列番号:158、154、152、151、112、111、110、および11からなる群から選択される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および、
(2)配列番号:163、68、67および12からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号:71、69、および13からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに配列番号:164、48、47および14からなる群から選択される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔22〕(1)配列番号:9で表される重鎖CDR1、配列番号:161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、および100からなる群から選択される重鎖CDR2、ならびに配列番号:158、154、152、151、112、111、110、および11からなる群から選択される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、ならびに、配列番号:26で表される重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド、および
(2)配列番号:163、68、67および12からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号:71、69、および13からなる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに配列番号:164、48、47および14からなる群から選択される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、ならびに、配列番号:27で表される軽鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
〔23〕配列番号:26で表される重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、EUナンバリングで表される221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位および440位の群から選択されるアミノ酸の少なくとも1つの置換をコードする変異ヌクレオチドを含む〔18〕または〔22〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔24〕〔17〕および〔19〕に記載のベクター、〔18〕および〔20〕に記載のベクター、〔21〕または〔22〕に記載のベクターを含む宿主細胞。
〔25〕〔23〕に記載のベクターを含む宿主細胞。
〔26〕前記宿主細胞が、糖鎖にフコースを付加する能力が低い宿主細胞である〔25〕に記載の宿主細胞。
〔27〕前記糖鎖にフコースを付加する能力が低い宿主細胞が、フコシルトランスフェラーゼ、フコーストランスポーター、GMD(GDP−マンノース4,6−デヒドラターゼ)、Fx(GDP−ケト−6−デオキシマンノース3,5−エピメラーゼ,4−レダクターゼ)、およびGFPP(GDP−β−L−フコースピロフォスフォリラーゼ)からなる群から選択される機能性タンパク質の一つまたはそれ以上が欠損している宿主細胞である〔26〕に記載の宿主細胞。
〔28〕前記宿主細胞が、糖鎖にバイセクティングN-アセチルグルコサミン構造を形成する能力を有する宿主細胞である〔25〕に記載の宿主細胞。
〔29〕前記糖鎖にバイセクティングN-アセチルグルコサミン構造を形成する能力を有する宿主細胞が、β(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、およびゴルジ常在ポリペプチドの機能性のゴルジ局在化ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞である〔28〕に記載の宿主細胞。
〔30〕マンノシダーゼIIの局在化ドメイン、β(1,2)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの局在化ドメイン、β(1,2)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIの局在化ドメイン、マンノシダーゼIの局在化ドメイン、およびα1−6コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される機能性のゴルジ局在化ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、β(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞である〔29〕に記載の宿主細胞。
〔31〕宿主細胞が、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、またはハイブリドーマ細胞からなる群から選択される宿主細胞である〔24〕から〔30〕のいずれかに記載の宿主細胞。
〔32〕〔24〕から〔31〕のいずれかに記載の宿主細胞の培養液から回収することを含む〔1〕から〔16〕のいずれかに記載の抗体を製造する方法。
〔33〕〔32〕に記載の方法によって製造された抗体。
〔34〕増殖抑制剤または細胞傷害性物質が連結された〔33〕に記載の抗体。
〔35〕〔1〕から〔16〕または〔33〕から〔34〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
〔36〕〔1〕から〔16〕または〔33〕から〔34〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む癌治療剤または癌の再発もしくは転移抑制剤。
〔37〕癌が、大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、および腎癌からなる群から選択されるいずれかの癌である〔36〕に記載の癌治療剤または癌の再発もしくは転移抑制剤。
〔38〕前記大腸癌が、低分化大腸癌、中分化大腸癌、高分化大腸癌である〔37〕に記載の癌治療剤または癌の再発もしくは転移抑制剤。
〔39〕前記癌治療剤が投与される対象が、単離された組織標品で検出されたEpiregulinタンパク質が発現している癌細胞を含む対象である、〔36〕から〔38〕のいずれかに記載の癌治療剤または癌の再発もしくは転移抑制剤。
アミノ酸
本明細書においては、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸を1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記する。なお、本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾(例えば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である)を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。
本発明が提供する抗体は抗原としてEpiregulinに結合する。Epiregulinは、膜結合型上皮細胞成長因子蛋白質である。そのアミノ酸配列は、GenBank登録番号NP_001423(配列番号:167)に開示されている。本発明において、Epiregulinの定義には、全長タンパク質およびその断片の両方が含まれる。断片とは、Epiregulinの任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のEpiregulinの機能を有していなくてもよい。断片の例として、Epiregulinの細胞外領域を含む断片が挙げられる。Epiregulinの細胞外領域は配列番号:167のアミノ酸配列において30-118番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号:167のアミノ酸配列において119-140番目が相当する。また、本明細書においてEpiregulinをEREGと称することもあるが、これらは同義の用語として用いられる。
下記に抗体によるEpiregulin、すなわちEpiregulin分子中に存在するエピトープに対する結合の確認方法が例示されるが、下記の方法に限定されるものではなく、当業者は抗体の抗原に対する結合活性を測定する公知の方法を適宜使用することが可能である。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
(式1)
ΔGeo-Mean=Geo-Mean(抗体存在下)/Geo-Mean(抗体非存在下)
本明細書において、抗体とは、天然のものであるか、または部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス(アイソタイプ)が知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。
−Epiregulinのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
−免疫抗原を精製する必要が無い
−グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
−AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をEpiregulin発現細胞に接触させる工程、
(2)Epiregulin発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)Epiregulin発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
(1)哺乳類細胞:CHO、COS、ミエローマ、BHK (baby hamster kidney )、Hela、Vero、HEK(human embryonic kidney)293など
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
−酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
−糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)。本明細書において、抗Epiregulin抗体の可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたEUナンバリングにしたがって表される。
抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法(Kunkelら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン(アンバーコドン)の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム(Clover Direct(Protein Express))等も好適に用いられる。
(a) 33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位および55位、(e)33位および96位、(f)55位および96位、(g)33位および55位および96位。
本発明の抗体は、ヒト宿主において予測される免疫原性が低減されていることが好ましい。
−Rankpep(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)
−Epibase(Algonomics proprietary software: algonomics.com)
が含まれる。
本発明の抗Epiregulin抗体は、脱アミド化、異性化、加水分解が抑制されていることが好ましい。
本発明の抗Epiregulin抗体は、その等電点が改変されていることが好ましい。抗体の血漿中半減期を制御する方法の一つとして、抗体分子表面に露出するアミノ酸残基を改変し、抗体分子表面電荷をコントロールする方法が知られている(WO2007/114319およびWO2009/041543)。具体的には、抗体が有する等電点(pI)の値を低下させることにより、抗体の血漿中半減期を伸長させることが可能であることが知られている。それとは逆に、抗体の等電点が上昇することにより、血漿中半減期が短縮し、抗体の組織移行性が向上することが知られている(Vaisittiら(J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112)、Pardridgeら(J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554))。その一方で、その等電点を減少させた改変抗体の抗腫瘍効果が、改変前の抗体と比較して増強されていることも知られている(WO2009/041062)。
(a) グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)
(b) リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)
本発明の抗Epiregulin抗体は、その安定性が改善されていることが好ましい。抗体の安定性を表す一以上のパラメーターとして、ドメインの熱融解温度(Tm)値が挙げられる。抗体のTm値は、抗体の熱安定性の優れた指標となり、しかも、抗体の保管期間の指標にもなり得る。Tm値が低いほど、会合体の形成/低い安定性を示すのに対し、Tm値が高いほど、会合体の不形成/高い安定性を示す。従って、Tm値が高い抗体が提供されることが好ましい。本発明の非限定の一態様では、予め定めた閾値よりも高いTm値を有する抗体が選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、もしくは100℃以上のTm値を有する抗体が選択される。
本発明の抗Epiregulin抗体は、その会合体量が低減されていることが好ましい。タンパク質医薬品の会合体量をコントロールすることは、品質管理上、また、薬効および免疫原性に与える影響を考慮した場合大変重要である(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714)。一般に会合化はタンパク質溶液環境に起因するcolloidal stabilityとタンパク質構造に起因するconformational stabilityの両方に影響される(J. Pharm. Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315)。抗体製剤の処方検討により、抗体濃度やpH、緩衝液種、イオン強度、添加剤等をスクリーニングすることでcolloidal stabilityに有効な望ましい条件を得ることが可能である。一方、conformational stabilityはアミノ酸配列に依存する部分もあり、抗体の場合はCDRのカノニカル構造やFRのコンセンサス配列、VH/VL界面等の特徴的な構造を維持することが重要とされている考えられる(Jungら(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716)、Xiangら(J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390)、Ewertら(Methods. (2004) 34 (2), 184-199)、Vargas-Madrazo ら(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120)、Moreaら(J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294)、Vargas-Madrazo ら(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120))。
本発明の抗Epiregulin抗体は、非ヒト動物およびヒト動物間の種交差反応性(cross-species reactivity)を示す抗Epiregulin抗体が好ましい。すなわち、本発明は、配列番号:9、10および11で表される重鎖可変領域CDRならびに配列番号:12、13および14で表される軽鎖可変領域CDRを含む抗Epiregulin抗体が結合するエピトープに結合する抗体であって、配列番号:170で表されるサルEpiregulinに対するKD値(cEREG KD)の配列番号:34で表されるヒトEpiregulinに対するKD値(hEREG KD)の比(cEREG KD/hEREG KD)が、配列番号:9、10および11で表される重鎖可変領域CDRならびに配列番号:12、13および14で表される軽鎖可変領域CDRを含む抗Epiregulin抗体のcEREG KD/hEREG KDよりも小さいことを特徴とする抗Epiregulin抗体を提供する。
本発明の抗Epiregulin抗体は、好ましくは中和活性を有する抗体である。一般的に、中和活性とは、ウイルスや毒素など、細胞に対して生物学的活性を有するリガンドの当該生物学的活性を阻害する活性をいう。即ち、中和活性を有する物質とは、当該リガンド又は当該リガンドが結合する受容体に結合し、当該リガンドと受容体の結合を阻害する物質を指す。中和活性によりリガンドとの結合を阻止された受容体は、当該受容体を通じた生物学的活性を発揮することができなくなる。このような中和活性を有する抗体は一般に中和抗体と呼ばれる。当該中和活性は、対象とするリガンドの存在下において、当該生物学的活性をその中和活性を評価する被検物質の存在又は非存在下条件間で比較することにより測定することができる。
こうした細胞内のシグナルカスケードは細胞種毎に異なるため、目的とする標的細胞毎に適宜標的分子を設定することができ、上記の因子に限定されるものではない。生体内シグナルの活性化の測定キットは市販のものを適宜使用することができる(例えば、プロテインキナーゼC活性測定システム(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)等)。
本発明で使用される抗体は、好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mLに調製することによって、エフェクター細胞が調製され得る。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製され得る。
(3)標的細胞の調製
Epiregulinタンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより当該標的細胞が放射性標識され得る。Epiregulinタンパク質を発現する細胞としては、Epiregulinタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、原発性大腸癌細胞、転移性大腸癌細胞、肺腺癌細胞、膵癌細胞、胃癌細胞、腎癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞等が利用され得る。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mLに調製することによって、当該標的細胞が調製され得る。
(式2)
(A-C)/(B-C)x 100
の計算式に基づいて計算される。Aは各試料における放射活性(cpm)、Bは1% NP-40(nacalai tesque社製)を加えた試料における放射活性(cpm)、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性(cpm)を示す。
本発明の抗Epiregulin抗体としてはADCC活性が増強された抗Epiregulin抗体も好適に使用され得る。前記のように、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体発現細胞(免疫細胞等)がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味するため、免疫細胞等のFcγ受容体発現細胞のFcγ受容体に対する結合活性を増強することによって、抗Epiregulin抗体が介在するADCC活性を増強することが可能である。免疫細胞等のFcγ受容体発現細胞のFcγ受容体に対する結合活性を増強する方法として、少なくとも下記の三つの公知の方法が利用され得る。
本発明の抗Epiregulin抗体に含まれるFc領域のアミノ酸の改変によってFcγレセプターに対する結合活性が増強された抗Epiregulin抗体が取得され得る。改変のための好ましいIgG型免疫グロブリンのFc領域としては、例えばヒトIgG(IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4、およびそれらの改変体)のFc領域が挙げられる。
221位のアミノ酸がLysまたはTyrのいずれか、
222位のアミノ酸がPhe、Trp、GluまたはTyrのいずれか、
223位のアミノ酸がPhe、Trp、GluまたはLysのいずれか、
224位のアミノ酸がPhe、Trp、GluまたはTyrのいずれか、
225位のアミノ酸がGlu、LysまたはTrpのいずれか、
227位のアミノ酸がGlu、Gly、LysまたはTyrのいずれか、
228位のアミノ酸がGlu、Gly、LysまたはTyrのいずれか、
230位のアミノ酸がAla、Glu、GlyまたはTyrのいずれか、
231位のアミノ酸がGlu、Gly、Lys、ProまたはTyrのいずれか、
232位のアミノ酸がGlu、Gly、LysまたはTyrのいずれか、
233位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
234位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
235位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
236位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
237位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
238位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
239位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
240位のアミノ酸がAla、Ile、MetまたはThrのいずれか、
241位のアミノ酸がAsp、Glu、Leu、Arg、TrpまたはTyrのいずれか、
243位のアミノ酸がLeu、Glu、Leu、Gln、Arg、TrpまたはTyrのいずれか、
244位のアミノ酸がHis、
245位のアミノ酸がAla、
246位のアミノ酸がAsp、Glu、HisまたはTyrのいずれか、
247位のアミノ酸がAla、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
249位のアミノ酸がGlu、His、GlnまたはTyrのいずれか、
250位のアミノ酸がGluまたはGlnのいずれか、
251位のアミノ酸がPhe、
254位のアミノ酸がPhe、MetまたはTyrのいずれか、
255位のアミノ酸がGlu、LeuまたはTyrのいずれか、
256位のアミノ酸がAla、MetまたはProのいずれか、
258位のアミノ酸がAsp、Glu、His、SerまたはTyrのいずれか、
260位のアミノ酸がAsp、Glu、HisまたはTyrのいずれか、
262位のアミノ酸がAla、Glu、Phe、IleまたはThrのいずれか、
263位のアミノ酸がAla、Ile、MetまたはThrのいずれか、
264位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、TrpまたはTyrのいずれか、
265位のアミノ酸がAla、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
266位のアミノ酸がAla、Ile、MetまたはThrのいずれか、
267位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、ValまたはTrpのいずれか、
269位のアミノ酸がPhe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
270位のアミノ酸がGlu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、TrpまたはTyrのいずれか、
271位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
273位のアミノ酸がPheまたはIleのいずれか、
274位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
275位のアミノ酸がLeuまたはTrpのいずれか、
276位のアミノ酸が、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
278位のアミノ酸がAsp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、ValまたはTrpのいずれか、
279位のアミノ酸がAla、
280位のアミノ酸がAla、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、TrpまたはTyrのいずれか、
281位のアミノ酸がAsp、Lys、ProまたはTyrのいずれか、
282位のアミノ酸がGlu、Gly、Lys、ProまたはTyrのいずれか、
283位のアミノ酸がAla、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、ArgまたはTyrのいずれか、
284位のアミノ酸がAsp、Glu、Leu、Asn、ThrまたはTyrのいずれか、
285位のアミノ酸がAsp、Glu、Lys、Gln、TrpまたはTyrのいずれか、
286位のアミノ酸がGlu、Gly、ProまたはTyrのいずれか、
288位のアミノ酸がAsn、Asp、GluまたはTyrのいずれか、
290位のアミノ酸がAsp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、TrpまたはTyrのいずれか、291位のアミノ酸がAsp、Glu、Gly、His、Ile、GlnまたはThrのいずれか、
292位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、ThrまたはTyrのいずれか、
293位のアミノ酸がPhe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
294位のアミノ酸がPhe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
295位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
296位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、ThrまたはValのいずれか、
297位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
298位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
299位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
300位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、ValまたはTrpのいずれか、
301位のアミノ酸がAsp、Glu、HisまたはTyrのいずれか、
302位のアミノ酸がIle、
303位のアミノ酸がAsp、GlyまたはTyrのいずれか、
304位のアミノ酸がAsp、His、Leu、AsnまたはThrのいずれか、
305位のアミノ酸がGlu、Ile、ThrまたはTyrのいずれか、
311位のアミノ酸がAla、Asp、Asn、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
313位のアミノ酸がPhe、
315位のアミノ酸がLeu、
317位のアミノ酸がGluまたはGln、
318位のアミノ酸がHis、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
320位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
322位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
323位のアミノ酸がIle、
324位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
325位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
327位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
328位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
329位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
330位のアミノ酸がCys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
331位のアミノ酸がAsp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
332位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
333位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
334位のアミノ酸がAla、Glu、Phe、Ile、Leu、ProまたはThrのいずれか、
335位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
336位のアミノ酸がGlu、LysまたはTyrのいずれか、
337位のアミノ酸がGlu、HisまたはAsnのいずれか、
339位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、SerまたはThrのいずれか、
376位のアミノ酸がAlaまたはValのいずれか、
377位のアミノ酸がGlyまたはLysのいずれか、
378位のアミノ酸がAsp、
379位のアミノ酸がAsn、
380位のアミノ酸がAla、AsnまたはSerのいずれか、
382位のアミノ酸がAlaまたはIleのいずれか、
385位のアミノ酸がGlu、
392位のアミノ酸がThr、
396位のアミノ酸がLeu、
421位のアミノ酸がLys、
427位のアミノ酸がAsn、
428位のアミノ酸がPheまたはLeuのいずれか、
429位のアミノ酸がMet、
434位のアミノ酸がTrp、
436位のアミノ酸がIle、または
440位のアミノ酸がGly、His、Ile、LeuまたはTyrのいずれか、
の群から選択される少なくともひとつ以上のアミノ酸の改変が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、二箇所以上のアミノ酸が改変され得る。二箇所以上のアミノ酸の改変の組合せとしては、例えば表1−1および表1−2に記載されるような組合せが挙げられる。
本発明の抗Epiregulin抗体の非限定の一態様として、当該抗Epiregulin抗体のFc領域に結合した糖鎖の組成がフコース欠損糖鎖を結合したFc領域の割合が高くなるように修飾された抗Epiregulin抗体が、好適に挙げられる。後述される糖鎖構造の解析方法にしたがって、当業者はフコース欠損糖鎖を結合したFc領域の割合が高い抗Epiregulin抗体を適宜選択することが可能である。そのようなフコース欠損糖鎖を結合したFc領域の割合は、10%から100%の中から当業者によって適宜選択され得る。非限定の一態様では、当該割合は10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の中から選択され得る。抗体のFc領域に結合するN -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN -アセチルグルコサミンからフコース残基を除去すると、FcγRIIIaに対する親和性が増強されることが知られている(J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473)。こうしたFc領域を含むIgG1抗体は、後述するADCC活性が増強されていることが知られていることから、当該Fc領域を含む抗Epiregulin抗体は、本発明の医薬組成物に含まれる抗Epiregulin抗体としても有用である。抗体Fc領域に結合するN -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN -アセチルグルコサミンからフコース残基が除去された抗体の非限定の一態様として、グリコシル化が修飾された抗体(WO1999/054342)が好適に挙げられる。
本発明の抗Epiregulin抗体の非限定の一態様として、バイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加されたFc領域を含む抗Epiregulin抗体も好適に挙げられる。バイセクティングGlcNAc構造を含む糖鎖を有する抗体(WO2002/079255等)が公知である。バイセクティングGlcNAc構造を含む糖鎖を形成する活性を有する宿主細胞が、バイセクティングGlcNAc構造を含む糖鎖が付加された抗体を作製するために用いられる。非限定の好適な一態様では、GnTIII(β-1,4-マンノシル-グリコプロテイン,4-β-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)(EC 2.4.1.144)活性またはGalT(β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ)(EC 2.4.1.38)活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子を発現する宿主細胞が作製される。別の非限定の好適な一態様では、前記の機能性タンパク質に加えて、ヒトManII(マンノシダーゼII)(3.2.1.114)活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、GnTI(β-1,2-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI)(EC 2.4.1.94)活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、GnTII(β-1,2-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII)(EC 2.4.1.143)活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、ManI(マンノシダーゼ)(EC 3.2.1.113)活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、およびα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.68)と共発現する宿主細胞が作製される(WO2004/065540)。前記のようなバイセクティングGlcNAc構造を含む糖鎖を形成する活性を有する宿主細胞は、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、またはハイブリドーマ細胞等に前記の機能性タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを形質導入することによって作製され得る。
本発明の抗Epiregulin抗体の非限定の一態様として、抗Epiregulin抗体に細胞傷害活性を有する薬物が連結された抗Epiregulin抗体薬物複合体も好適に挙げられる。抗体薬物複合体(Antibody-Drug Conjugate)は、以下本明細書において、ADCと指称される場合もある。より具体的には、本発明で使用される抗Epiregulin抗体薬物複合体は、増殖抑制剤、または毒性ペプチドもしくは放射性化学物質などの細胞傷害性物質と適宜連結され得る。本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体が用いられ得るが、例えば、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reなどを用いることが可能である。このような抗Epiregulin抗体薬物複合体は、得られた抗Epiregulin抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。すなわち、増殖抑制剤または細胞傷害性物質と抗Epiregulin抗体が互いに化学的に共役可能(例、共有結合することが可能)なように、リンカー分子は、増殖抑制剤または細胞傷害性物質を抗体に化学結合(上述のような)を介し、連結される。
−ジフテリアトキシンA鎖(Diphtheria toxin A Chain)(Langoneら(Methods in Enzymology (1993) 93, 307-308)
−シュードモナスエクソトキシン(Pseudomonas Exotoxin)(Paiら(Nat. Med. (1996) 2 (3), 350-353)
−リシン鎖(Ricin A Chain) (Fultonら(J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319)、Sivamら(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173)、Cumberら(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24)、Wawrzynczakら(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562)、Gheeiteら(J. Immunol. Methods (1991) 142, 223-230))
−無糖鎖リシンA鎖(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpeら(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
−アブリンA鎖(Abrin A Chain)(Wawrzynczakら(Br. J. Cancer (1992) 66, 361-366)、;Wawrzynczakら(Cancer Res (1990) 50, 7519-7562)、Sivamら(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173)、Thorpeら(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
−ゲロニン(Gelonin)(Sivamら(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173)、Cumberら(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24)、Wawrzynczakら(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562)、Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))
−ポークウイード抗ウイルス蛋白(PAP-sまたはPokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346))
−ブリオジン(Briodin)(Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))
−サポリン(Saporin)(Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346))
−モモルジン(Momordin)(Cumberら(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24)、(Wawrzynczakら(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562)(Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
−モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
−ジアンシン32(Dianthin 32)(Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
−ジアンシン30(Dianthin 30)(Stirpeら(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
−モデッシン(Modeccin)(Stirpeら(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
−ビスカミン(Viscumin)(Stirpeら(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
−ボルケシン(Volkesin)(Stirpeら(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
−ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpeら(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
−トリチン(Tritin)(Stirpeら(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
−ルフィン(Luffin)(Stirpeら(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
−トリコキリン(Trichokirin)(Casellasら(Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588)、Bolognesiら(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
非限定の一態様では、増殖抑制剤として、DNA損傷剤、抗有糸***剤および/または代謝拮抗剤が好適に挙げられ得る。DNA損傷剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤および/またはDNAインターカレータであり得る。カルボプラチン(DNAアルキル化剤)、エトポシド(トポイソメラーゼIIの阻害剤)、ドキソルビシン(DNAインターカレータ)、ドセタキセル(抗有糸***剤)およびGemzar(ゲムシタビン、代謝拮抗剤)等が非限定の好適な増殖抑制剤として例示され得る。
非限定の一態様では本発明の抗Epiregulin抗体薬物複合体に含まれる抗Epiregulin抗体は、低分子抗体でもあり得る。低分子抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の部分が欠損している抗体断片を含む。Epiregulin抗原に対する結合活性を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加および/または挿入を含むことができる。さらにEpiregulin抗原に対する結合活性を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の部分を欠損させることも可能である。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(single chain Fv)、ダイアボディー(Diabody)、sc(Fv)2(single chain (Fv)2)などが例示され得る。これらの抗体の多量体(例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー)も、本発明の低分子抗体に含まれる。
別の観点において、本発明は、本発明の抗Epiregulin抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明は抗Epiregulin抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤に関する。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤は、癌を罹患している対象または現在または将来において罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
本発明はまた、癌治療剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤が投与される対象が、単離された組織標品で検出されたEpiregulinタンパク質が発現している癌細胞を含む対象である癌治療剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤を提供する。Epiregulinタンパク質の発現量は本明細書に記載された方法のほか、当業者に公知の方法によって決定することが可能である。本発明の癌治療剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤が投与される対象であるか否かを決定するために、対象の候補から単離された組織標品におけるEpiregulinタンパク質の発現量が決定され得る。当該標品においてEpiregulinタンパク質が検出されれば、当該標品が由来する対象が本発明の癌治療剤または癌の再発もしくは転移の抑制剤が投与される対象となり得る。Epiregulinタンパク質の発現量は特定の数値に限定されないが、非限定の態様として、103、104、105、106、107、108の数値の桁(オーダー)の範囲から適宜設定され得る。非限定の一態様として、1x103、2x103、3x103、4x103、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108のいずれかから選択されるEpiregulinタンパク質の発現量が、投与される対象を選択するための基準として設定され得る数値(閾値)の好適な例として例示され得る。上記の数値は、有効数字一桁として算出された数値であり得るが、この場合において、例えば有効数字一桁で算出されたEREGの発現量が1x103であるとは、有効数字が二桁として算出された場合にはEREGの発現量が0.5x103、0.6x103、0.7x103、0.8x103、0.9x103、1.0x103、1.1x103、1.2x103、1.3x103、1.4x103、のいずれかを含む数値であることもある。
本発明で使用される用語「組織標品」とは、個体、体液( 例えば、血液、血清、血漿、および髄液)、組織培養物もしくは組織切片等から得られる任意の生物学的標品をいう。生物学的標品として用いられるものとして被験体標品が好適に挙げられる。好ましい被験体標品は、被験体から得られた組織であり、さらに好ましくは、被験体の大腸組織である。大腸組織を採取する方法としては公知の方法である生検(バイオプシー)が好適に用いられる。生検の手段として公知の手段が適宜使用され得る。そのような例として、吸引生検、挟みとり生検、擦過生検、細胞診用生検、内視鏡生検、細針吸引生検、針生検、経気管支的肺生検等の生検(バイオプシー)により、または外科手術の際に得ることができる。
本発明の方法においては、ホルマリン固定により抗体との反応性が減弱した抗原の反応性を賦活化する。本発明においては、二つの組織標品のうち一の標品に対して、プロテアーゼ抗原賦活化法(PIER法)を適用し、他方の標品に対して、熱誘導抗原賦活化法(HIER法)を適用し、抗体と反応させたときの両者間の染色程度の相違を数値化する。
熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品およびプロテアーゼ抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品に対して、Epiregulin抗体を一次抗体として反応させる。当該反応はEpiregulin抗体が抗原中のエピトープを認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な条件下で実施される。通常、当該反応は4℃にて終夜、または37℃にて1時間実施されるが、反応条件は、抗体が抗原中のエピトープを認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な範囲で適宜変更され得る。例えば、反応温度は4℃から50℃の範囲内で変更され得るし、反応時間は1分から7日の間で変更され得る。低温での反応が実施される場合には長い時間反応させることが好ましい。一次抗体反応が終了した後、組織標品は洗浄用緩衝液によって洗浄される。洗浄用緩衝液はPBS(Phosphate buffer saline)が好適に用いられる他、Tris塩酸緩衝液も好適に使用され得る。通常、洗浄条件としては室温にて5分間の洗浄を3回実施する方法が採用されるが、洗浄の時間および温度は適宜変更され得る。
−染色強度スコア0:検体組織中の腫瘍細胞の中でEpiregulin 陽性を呈している細胞がない。または10%に満たないもの
−染色強度スコア1:検体組織中の腫瘍細胞の中でEpiregulin 陽性を呈している細胞が10%以上あるが、腫瘍細胞の一部の膜に限局した弱い染色強度を有するもの
−染色強度スコア2:検体組織中の腫瘍細胞の中でEpiregulin 陽性を呈している細胞が30%以上あるもの、または検体組織中の腫瘍細胞の中でEpiregulin 陽性を呈している細胞が10%以上あり、腫瘍細胞の膜に限局した中程度の染色強度を有するもの
−染色強度スコア3:検体組織中の腫瘍細胞の中でEpiregulin 陽性を呈している細胞が60%以上あるもの、または検体組織中の腫瘍細胞の中でEpiregulin 陽性を呈している細胞が10%以上あり、腫瘍細胞の膜に限局した強度の染色強度を有するもの
1−1.ヒト化用フレームワーク配列の選定
マウス可変領域とヒトIgG1定常領域からなるキメラ抗体EP27(WO2008/047723記載)のヒト化が実施された。CDR、FRの決定はKabatの定義(Kabatナンバリング)に従った。
表2で選択されたH鎖FR1の配列において、Kabatナンバリングで表される2番、4番、24番、27番、29番のアミノ酸残基はupper coreを形成して抗体構造の安定化に寄与することが報告されている(Ewertら(Methods. 2004 Oct;34(2):184-99))。また、Chothiaの定義ではKabatナンバリングで表される26から30番のアミノ酸残基はCDR1に含まれる(Honeggerら、J. Mol. Biol. (2001) 309, 657-670)。これらの情報から、キメラ抗体EP27と同等の抗原結合活性を持つヒト化抗体を作成するために、上記に該当するアミノ酸残基がEP27マウス可変領域配列に存在する残基に戻された。よって、表2で選択したヒトH鎖FR1(配列番号:1)のKabatナンバリングで表される2番、24番、27番、28番、29番、30番のアミノ酸残基がEP27マウス可変領域配列に存在するアミノ酸残基に戻されたヒト化H鎖FR1(表4、配列番号:17)が新たにデザインされた。
表2で選択されたL鎖FR2の配列において、Kabatナンバリングで表される49番はTyrであるが、EP27マウス可変領域配列ではGlnである。マウスおよびヒトのgermline配列のデータベースIMGT Database(http://www.imgt.org/)から、該当部位にGlnが含まれている配列は少ない事が確認された。よって、EP27マウス可変領域配列に含まれる49番のGlnは抗原結合に関与する可能性が示唆された。これより、表2で選択されたヒトL鎖FR2(配列番号:6)のKabatナンバリングで表される49番のアミノ酸残基がEP27マウス可変領域配列のアミノ酸残基で置換されたヒト化L鎖FR2(表5、配列番号:20)が新たにデザインされた。
初めに、EP27ヒト化可変領域のcDNAを作製するため、H鎖(HJ)、L鎖(LB)について合成オリゴDNAをそれぞれ設計した。次に、各合成オリゴDNAを混和し、アッセンブルPCR法等の当業者公知の方法によりEP27ヒト化抗体の可変領域をコードする遺伝子断片を増幅した。最後に、得られた増幅断片を適当な動物細胞発現ベクターによりクローニングし、ヒトIgG1定常領域遺伝子と連結した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。
作成したEP27ヒト化抗体配列を評価するため、H鎖(HJ-G1d、配列番号:28)およびL鎖(LB-k、配列番号:29)を共発現させることによって、EP27ヒト化抗体HJ-G1d/LB-kが得られた。具体的には、上記で作製したH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)、またはFreeStyle293細胞(Invitrogen)に一過性に導入することによって抗体を発現させた。得られた培養上清からrProtein A SepharoseTM Fast Flow(GEヘルスケア)等を用いた当業者公知の方法で抗体が精製された。抗体を含む溶液を分光光度計で測定(波長280 nm)し、得られた吸光度とPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度が算出された(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。また、コントロールとして、キメラ抗体EP27であるcH-G1/cL-kもH鎖(cH-G1、配列番号:32)およびL鎖(cL-k、配列番号:33)を用いて同様の手法により作製された。
EP27ヒト化抗体のH鎖配列HJ-G1dのFR配列の一部のアミノ酸残基がEP27マウス可変領域配列のアミノ酸残基に置換された配列がデザインされた。初めに、Kabatナンバリングで表される75-76番のアミノ酸残基がヒトFR3配列のアミノ酸残基であるThr-AspからEP27マウス可変領域配列に含まれているアミノ酸残基であるSer-Asnに置換された配列(配列番号:35)、また、76番のAspのみがEP27マウス可変領域配列のアミノ酸残基であるAsnに置換された配列(配列番号:36)がデザインされた(表6)。次に、ヒト化H鎖可変領域配列HJ-G1d(配列番号:28)を含む発現ベクターに変異を導入することで、表6に示したFR3配列(配列番号:35)を持つヒト化H鎖可変領域配列であるHS-G1d(配列番号:37)が作製された。アミノ酸残基置換の導入はPCR法等を用いて当業者公知の方法で行われた。同様に、表6に示されたFR3配列(配列番号:36)を含むヒト化H鎖可変領域配列であるHY-G1d(配列番号:38)が作製された。実施例1-4と同様の方法によりEP27ヒト化抗体HS-G1d/LB-k、HY-G1d/LB-kおよびHY-G1d/L18-kが得られた。得られた抗体のヒトEpiregulinに対する結合能が、キメラ抗体EP27に対するEpiregulin結合阻害(参考例5)として評価された。この結果、キメラ抗体EP27(cH-G1/cL-k)のIC50濃度を100とした場合、EP27ヒト化抗体HS-G1d/LB-k、HY-G1d/LB-kおよびHY-G1d/L18-kのIC50濃度はそれぞれ142、146、100であった。
医薬品に使用する抗体は、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られるモノクローナル抗体であるにも関わらず、ヘテロジェニティーが存在する。そのような抗体のヘテロジェニティーは酸化、脱アミド化、異性化、加水分解などの修飾により起こり、抗体をはじめとするタンパク質が長期間の保存中や熱ストレス、光ストレスといったストレス条件下にさらされることで増加することが知られている(Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences, vol.97,No.7,2426-2447)。しかしながら、抗体を医薬品として開発するにあたり、そのタンパク質の物性、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、目的物質のヘテロジェニティーを低減し、可能な限り単一物質であることが望まれる。
抗体の血漿中半減期を制御する方法の一つとして、抗体分子表面に露出するアミノ酸残基を改変し、抗体分子表面電荷をコントロールする方法が知られている(WO2007/114319およびWO2009/041543)。具体的には、抗体が有する等電点(pI)の値を低下させることにより、抗体の血漿中半減期を伸長させることが可能であることが知られている。それとは逆に、抗体の等電点が上昇することにより、血漿中半減期が短縮し、抗体の組織移行性が向上することが知られている(Vaisittiら(J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112)、Pardridgeら(J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554))。
タンパク質医薬品の会合体量をコントロールすることは、品質管理上、また、薬効および免疫原性に与える影響を考慮した場合大変重要である(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714)。一般に会合化はタンパク質溶液環境に起因するcolloidal stabilityとタンパク質構造に起因するconformational stabilityの両方に影響される(J. Pharm. Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315)。抗体製剤の処方検討により、抗体濃度やpH、緩衝液種、イオン強度、添加剤等をスクリーニングすることでcolloidal stabilityに有効な望ましい条件を得ることが可能である。一方、conformational stabilityはアミノ酸配列に依存する部分もあり、抗体の場合はCDRのカノニカル構造やFRのコンセンサス配列、VH/VL界面等の特徴的な構造を維持することが重要とされている考えられる(Jungら(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716)、Xiangら(J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390)、Ewertら(Methods. (2004) 34 (2), 184-199)、Vargas-Madrazo ら(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120)、Moreaら(J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294)、Vargas-Madrazo ら(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120))。
H87-G1d/LB-k(H鎖:配列番号:98、L鎖:配列番号:29)、
H87-G1d/L21-k (H鎖:配列番号:98、L鎖:配列番号:84)、
H87-G1d/L37-k(H鎖:配列番号:98、L鎖:配列番号:99)、
が、実施例1の方法により作製された。ヒトEpiregulinに対する結合能がキメラ抗体EP27に対するEpiregulin結合阻害(参考例5)として評価された。その結果、表14に示したとおり、いずれの抗体もキメラ抗体EP27(cH-G1/cL-k)と同等の結合能を有していた。また、これらのEP27ヒト化抗体に含まれる会合体量がゲルろ過クロマトグラフ法(参考例9)で、Fabの熱変性中間温度(Tm)が示差走査熱量分析計(参考例10)で、さらに等電点(pI)が等電点電気泳動法(参考例11)により測定された。表14に示したように、キメラ抗体EP27(cH-G1d/cL-k)と比較してその会合体量が大幅に減少し、そのTm値は上昇することが確認された。これより、実施例1から4で示された、ヒト化による免疫原性リスク低減、化学的分解の抑制、等電点の低下、会合体量の低減が達成されたEP27ヒト化抗体配列が見出された。
医薬品を開発する際、一般に前臨床試験での毒性・安全性評価は臨床試験での投与量決定や各種リスク評価のための重要な検討と考えられる。抗体医薬品の場合、その抗原結合特異性から前臨床試験に用いる動物種の選択が限定されることがあり、多くの場合、ヒトと遺伝子的に近い霊長類が選択される。しかしながら、目的とする抗体が霊長類の抗原と結合しない、あるいはその結合能がヒト抗原に対する結合能と比べ著しく異なる場合、霊長類を用いた評価が妥当とは判断されないことがある。このような事例に対応するため、使用する動物種の抗原と結合するサロゲート抗体を用いたり、ヒト抗原トランスジェニック動物を使用したりすることで前臨床試験での毒性・安全性を評価する試みがなされている(Chapmanら(Nat. Rev. Drug Discov. (2007) 6, 120-126))。
ヒト末梢血単核球(以下、ヒトPBMCと指称する。)をエフェクター細胞として用いて各被験抗体のADCC活性が以下のように測定された。ヒト由来エフェクター細胞は、ヒト末梢血より採取した単核球画分を用いた。その結果、試験に用いられた全てのEP27ヒト化抗体がMIA PaCa-2細胞に対してADCCを誘導することが明らかとなった(参考例7)(図5)。
実施例5においてサルとのAffinityが増強されたEP27ヒト化抗体配列が見出された。そこで、細胞における活性を評価するために、サルおよびヒトEpiregulinによる細胞増殖刺激に対するEP27ヒト化抗体の中和活性が測定された。細胞はBAF_EGFRを用い、今回評価した全てのEP27ヒト化抗体は、ヒトおよびサルEpiregulinに依存したEGFR_BAF細胞の増殖を阻害する中和活性が検討され(参考例8)、いずれのEP27ヒト化抗体も、キメラ抗体に比べてサルEpiregulinに対する中和活性が増強された。(図6、7)
ヒト腫瘍を移植したマウスモデルを用いて実施例7および実施例8においてin vitroの細胞で活性が確認されたEP27ヒト化抗体のin vivoでの抗腫瘍活性が評価された(参考例14)。評価されたMIA PaCa-2およびDLD-1ヒト癌細胞移植マウスモデルにおける各被験抗体の抗腫瘍効果は、投与試料の投与の最終日から7日後の腫瘍体積を測定することによって評価された。その結果、図8に示すとおり、cH-G1/cL-k抗体、H206-G1d/L73-k抗体、H240-G1d/L73-k抗体の各抗体が0.4 mg/kg及び2 mg/kgで投与された場合、動物モデルにおいても改変されたEP27ヒト化抗体による優れた薬効が確認された。
EP27抗体を用いて、抗原発現量を反映した免疫組織化学的染色方法が確立された。発現量が異なるEREG強制発現細胞株であるSKE-18 (その抗原量は7.7x103と見積もられた) 、SKE-23 (その抗原量は6.1x104と見積もられた) 、SKE-4B2 (その抗原量は2.9x105と見積もられた) と宿主細胞のSK-HEP-1 (抗原量8.4×10 2)がscidマウスに移植された組織のパラフィン包埋ブロックを用いて免疫組織化学的染色が行われた。これらのパラフィンブロックから作成された薄切組織切片におけるEREGの発現が、EP27抗体を一次抗体とするインキュベーションの後に二次抗体としてウサギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(Jackson Imunoresearch Laboratories)、三次抗体としてポリマー-HRP(Dako cytomation)と結合したヤギ抗ウサギIgG抗体と反応させることによって、ジアミノベンジジンを基質として可視化された。図10で示したように、染色された細胞・組織はEREGの発現量に応じて染色性の階調性が認められた。また、これらの細胞の発現量に応じたH240-G1d/L73-k抗体のin vitroでのADCC活性が確認された(図11)。上記の試験においては、H240-G1d/L73-k抗体として、低フコース抗体が使用された。当該低フコース抗体はWO2004/065540に記載された方法によって作製された。以下では当該低フコース抗体はEP27ヒト化Glycomab抗体とも指称される。上記の4つのEREG強制発現細胞株に加えて抗原量が2.8x104と見積もられたSKE-10およびSKE-15に対するH240-G1d/L73-k抗体(EP27ヒト化Glycomab抗体)のin vitroでのADCC活性が確認された。図11と同様にこれらの細胞の発現量に応じたH240-G1d/L73-k抗体のin vitroでのADCC活性が確認された(表20)。さらに、これらの細胞の発現量に応じたH240-G1d/L73-k抗体(EP27ヒト化Glycomab抗体)のin vivoでの腫瘍増殖抑制活性も確認された(図12)。すなわち、免疫組織化学的染色法によるEREGの発現量の評価と薬効との間に相関が確認された。
低分化大腸癌の臨床9症例でのEREG発現を検討するため、同症例のパラフィン包埋薄切標本を実施例10に記載される染色法によって染色したところ、7/9症例で明確な陽性像が確認された(図13)。
ヒト大腸癌腫瘍モデルPLR123(WO02012/046797)から単離された細胞数1x106の大腸癌幹細胞が鼠蹊部に移植されたSCIDマウスに、当該幹細胞の投与の翌日からEP27ヒト化Glycomab抗体が10 mg/kgで週一回投与された。その結果、ウィルコクソンの符号順位検定(SASシステム8.02 TSレベル02M0およびSAS前臨床パッケージVersion 5.00.010720)を行ったところ、移植後29日目で図14に示す通り抗体群ではコントロール群と比べて有意に腫瘍生着が抑制されていることが確認された。
ヒト大腸癌腫瘍モデルPLR123から単離された細胞数2x106の大腸癌幹細胞が尾静脈から移植されたSCID-beigeマウスに、当該幹細胞の投与3日後に、EP27ヒト化Glycomab抗体が10 mg/kgで週一回投与された。その結果、移植後52日目で図15に示す通り抗体投与群ではコントロール群と比べて、マウス肺における腫瘍塊数(転移病巣数)、および腫瘍塊サイズ(転移病巣直径)が有意に抑制されていることが確認された。
ヒト低分化大腸癌腫瘍COL-53-JCK(実験動物中央研究所)の腫瘍組織片が移植されたSCIDマウスに、当該腫瘍組織片の移植後14日目からEP27ヒト化Glycomab抗体が10 mg/kgで週一回投与された。その結果、当該抗体の投与開始後14日目に腫瘍体積を評価したところ、抗体投与群ではコントロール群と比べて有意に腫瘍増殖が抑制されていることが確認された(図16)。
ヒト中分化大腸癌腫瘍モデルであるPLR379(PCT/JP2012/072852)における腫瘍はTumor buddingが観察される形態上の特徴を有するが、Epiregulinの発現はTumor buddingの部位によらず検出される。当該PLR379の腫瘍組織片が移植されたSCIDマウスに、当該腫瘍組織片の移植後21日目からEP27ヒト化Glycomab抗体が10 mg/kgで週一回投与された。当該抗体の投与開始後18日目に腫瘍体積を評価したところ、抗体投与群ではコントロール群と比べて有意に腫瘍増殖が抑制されていることが確認された(図17)。
肺腺癌の臨床7症例でのEREG発現を検討するため、同症例のパラフィン包埋薄切標本が実施例10に記載される染色法によって染色された。その結果、4/7症例で明確な陽性像が確認された(図18)。
ヒト肺腺癌株Calu-3に対してヒトPBMCをエフェクター細胞として用いたADCC活性が評価された。その結果、EP27ヒト化Glycomab抗体がCalu-3細胞に対してADCCを誘導することが確認された。(図19)。
ヒト肺腺癌モデルCalu-3の腫瘍組織片が移植されたSCIDマウスに、当該腫瘍移植片の移植後13日目からEP27ヒト化Glycomab抗体が10 mg/kgで週一回投与された。当該抗体の投与開始後28日目に腫瘍体積を測定したところ、抗体投与群ではコントロール群と比べて有意に腫瘍増殖が抑制されていることが確認された(図20)。
EP27ヒト化抗体の細胞内在化は以下の系で評価された。一次抗体が内在化すると、二次抗体に抱合されたリボソーム不活性化タンパク質サポリンは二次抗体の一次抗体への結合を介して、細胞内に輸送される。内在化するとサポリンはIgG抱合体から分離し、タンパク質合成を阻害し、最終的に細胞死を引き起こすことになる。各ウェル当たりEREGを発現する細胞株DLD-1、または対照とする細胞株SK-HEP1がそれぞれ1x103細胞の細胞密度で播種された96-well マイクロプレートの各ウェルに、播種の翌日に一次抗体としてEP27ヒト化Glycomab抗体、二次抗体としてリボソーム不活性化タンパク質が結合したヒトモノクローナル抗体を認識するヤギIgG、 Hum-ZAP(Advanced Targeting Systems)が添加された。添加の4日後にWST8(Dojindo)で細胞生存率が評価された。図21に示すように、EP27ヒト化Glycomab抗体はEREGを発現する細胞株DLD-1に対してのみ細胞傷害を引き起こした。その一方で対照として用いられた細胞株SK-HEP1に対しては細胞傷害を引き起こさなかった。
全長ヒトEREG cDNA(CR541887、配列番号:169)は定法により単離され、その遺伝子断片が哺乳細胞発現用ベクター(pMCN)にクローニングされたプラスミドがhEREG/pMCNと命名された。pMCNは、mouse CMVプロモーター(ACCESSION No. U 68299)下で外来遺伝子を発現誘導させることが可能であり、かつ、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたベクターである。全長カニクイサルEREG cDNAはアカゲサル EREG cDNA(XM_001102069)配列情報をもとに、カニクイサルcDNAライブラリから定法により単離された遺伝子断片(配列番号:165をコードする遺伝子断片)が哺乳細胞発現用ベクター(pMCN)にクローニングされたプラスミドがcyEREG/pMCNと命名された。hEREG/pMCNおよびcyEREG/pMCNがCHO細胞 DG44株(Invitrogen)へエレクトロポレーションにより導入され、500μg/mL Geneticinでの選抜により、全長ヒトEREG定常発現CHO細胞および全長カニクイサルEREG定常発現CHOが樹立され、それぞれhEREG_DGおよびcyEREG_DGと命名された。
ヒトおよびカニクイサルEpiregulin遺伝子の成熟型ヒトEREG細胞外領域(それぞれ配列番号:170および配列番号:34で表されるポリペプチドのN末端に配列番号171の配列が融合されたポリペプチド)のC末端に6つのヒスチジン繰り返し配列を発現するcDNAがPCR法によって増幅された。これらがそれぞれ挿入された哺乳動物細胞用発現ベクターが制限酵素にて直鎖状にされたのち、Free style 293細胞に293フェクチンを用いて導入することによって、ヒトおよびカニクイサル成熟型Epiregulinを一過性に発現させた。
成熟型ヒトEpiregulin遺伝子および成熟型カニクイサルEpiregulin遺伝子がそれぞれ哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入された。各遺伝子を下記の方法によって発現させた動物細胞の培養液から単離された成熟型ヒト EREG-6HisおよびカニクイサルEREG-6His融合蛋白が精製された。
成熟型EGFドメイン構造をもつ可溶型ヒトEREG断片(63Valから108Leuに相当する配列番号:34に記載のポリペプチド)は R&D Systems(cat.no. 1195- EP/CF)より購入された。可溶型ヒトEREG断片をnuncイムノプレートにコートし、BSAを含む溶液でブロッキング後に、精製抗EREG抗体の結合反応性が解析された。精製抗EREG抗体を添加してから一時間のインキュベーション後、洗浄されたプレートの各ウェルに、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒトIgG抗体(Zymed)を添加することによって、反応が実施された。各ウェルの洗浄を行ったあと、検出試薬 Sigma p-Nitrophenyl phosphate Tabletsを加えることにより抗体結合量が測定された。
成熟型EGFドメイン構造をもつ可溶型ヒトEREG断片(63Valから108Leuに相当する配列番号:34に記載のポリペプチド)は R&D Systems(cat.no. 1195- EP/CF)より購入された。可溶型ヒトEREG断片をnuncイムノプレートにコートし、BSAを含む溶液でブロッキング後に、マウスハイブリドーマ由来のEP27に対する精製ヒト化抗EREG抗体の競合結合反応性が解析された。マウスハイブリドーマ由来のEP27および精製ヒト化抗EREG抗体を添加してから二時間のインキュベーション後、洗浄されたプレートの各ウェルに、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒトIgG抗体(Zymed)を添加することによって、反応が実施された。各ウェルの洗浄を行ったあと、検出試薬 Sigma p-Nitrophenyl phosphate Tabletsを加えることにより抗体結合量(A405/655検出値)が測定された。
抗EREG抗体の抗原に対する親和性と結合速度定数を、BiacoreTM-T100(GEヘルスケア・ジャパン)による表面プラズモン共鳴アッセイのsingle-cycle kinetics法によって測定した。ランニングバッファーには HBS-EP+ (GEヘルスケア・ジャパン)を用い、アミンカップリングキット(GEヘルスケア・ジャパン)を用いて、Protein AをCM5チップ(カルボキシメチルデキストラン被覆チップ)に共有結合させた。ランニングバッファーには HBS-EP+ (GEヘルスケア・ジャパン)を用い、アミンカップリングキット(GEヘルスケア・ジャパン)を用いて、Protein AをCM5チップ(カルボキシメチルデキストラン被覆チップ)に共有結合させた。各抗EREG抗体はProtein A に約 350 RU 捕捉するように調製した。アナライトとして用いたヒトEREGまたはカニクイサルEREGは HBS-EP+ を用いて0、0.7、1.4、2.8、5.6、11.2 nMに調製した。測定はまず抗体溶液をProtein A に捕捉させ、さらに流速30μL/minにて、0.7、1.4、2.8、5.6、11.2 nMのヒトEREGまたはカニクイサルEREG溶液を 各3 minずつ連続してインジェクションすることで反応させ、その後 HBS-EP+ に切り替え15 min解離相を測定した。解離相の測定終了後、25 mM NaOH で洗浄し、センサーチップを再生した。濃度0の測定は同様に抗体溶液をProtein A に捕捉させ、HBS-EP+を各3 minずつ5回連続してインジェクションすることで反応させ、その後 HBS-EP+ に切り替え15 min解離相を測定した。解離相の測定終了後、25 mM NaOH で洗浄し、センサーチップを再生した。得られたセンサーグラムから、Biacore 専用のデータ解析ソフトウェアである Biacore T100 Evaluation Software Version 2.0.1 を用いて速度論的な解析を行い、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)および速度定数比を算出した。結果を表21に示した。なお、測定値の日間差を補正するため、図1〜4ならびに表16および19では同日測定の対照試料(cH-G1/cL-k)の値を1とした比を示した。
ヒト由来エフェクター細胞として、ヒト末梢血より採取した単核球画分が用いられた。1000単位/mLのヘパリン溶液(ノボ・ヘパリン注5千単位、ノボ・ノルディスク)があらかじめ200μL注入された注射器を用い、健常人ボランティア(成人男性)より末梢血50 mLが採取された。PBS(-)で2倍に希釈された当該末梢血が、Ficoll-Paque PLUSをあらかじめ注入して遠心分離操作が行われた。Leucosepリンパ球分離管(Greiner bio-one)に加えられた。これを遠心分離(2150 rpm、10分間、室温)した後、単核球画分層が分取された。10% FBS/D-MEMで1回細胞を洗浄した後、10% FBS/D-MEMで細胞密度を5 x 106/mLに調製することによって、エフェクター細胞浮遊液が調製された。当該細胞懸濁液がヒトPBMC溶液として以後の実験に供された。
特異的カルセイン遊離率(%) = (A-C) x 100/(B-C)
(1)ヒトEGFRキメラレセプターを発現するBa/F3細胞株(EGFR_BAF)の樹立
常法により、その配列が配列番号:166(GeneBank Acc. No. NM_005228)で示されるヒトEGFレセプター(以下、「hEGFR」と記載する。)が単離された後に、ヒトEGFレセプターを発現するベクター(pCXZD1/EGFR#3)が作製された。
(1)で記載の方法により単離されたEGFR_BAF株を用いて、ヒトEpiregulinまたはサルEpiregulin依存性細胞増殖に対する抗Epiregulin抗体の中和活性を測定する試験が実施された。培養時のヒトEpiregulinを除去するため細胞が洗浄され、再びhsEREG-HisまたはcysEREG-His(終濃度2.5 ng/mL)および10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁 され、2x104細胞/100μL/wellの密度にて96穴プレートに播種された。抗Epiregulin抗体が各濃度(0.014〜30μg/mL)にて培地により希釈された後に細胞に添加され、その後、細胞は37℃、5% CO2インキュベーター内で3日培養された。培養後、Cell Counting Kit(同仁化学研究所社)の測定試薬を加えて2時間発色を行い、反応液の吸光度(450/655 nm)がBenchmark Plus(BIO-RAD社)を用いて測定された。抗体濃度0μg/mLの数値を対照値として、細胞増殖抑制率(各抗体濃度におけるOD値/コントロールのOD値x100(%))が算出された。
カラムとしてG3000SWXL(粒子径5μm、7.8 mmI.D.×30 cm、TOSOH製)を用い、移動相として300 mM NaClを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を用いた、ゲルろ過クロマトグラフィによって会合体量が測定された。Alliance system(Waters製)に接続されたカラムが流量0.5 mL/minで平衡化された後、当該カラムに5-10μgの抗体溶液が注入された。抗体の溶出が紫外吸光度検出器(215または280 nm)で検出された。得られたクロマトグラムから、総ピーク面積に含まれる会合体ピーク面積の存在比率が算出された。
150 mmol/Lの塩化ナトリウムを含む20 mmol/Lの酢酸ナトリウム緩衝溶液(pH6.0)に調製された透析外液に50-100μg相当量の抗体溶液が封入された透析膜を浸すことによって一昼夜透析された。透析外液で抗体濃度が50-100μg/mLに調製されたものが、試料溶液としてTm値の測定に用いられた。
Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience)を用いて以下の膨潤液中で30 minほどPhast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience)ゲルを膨潤させた。
相同染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞ではフコーストランスポーターの機能が阻害される。この細胞を用いることでフコースが欠損した抗体を得ることが可能である(WO2006/067913等)。また、beta 1, 4-N-acetylglucosaminyltransferase IIIとGolgi alpha-mannosidase IIが強制発現される細胞で抗体を産生させてもフコースが欠損した抗体を得ることが可能である(Ferrara ら、 Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861)。これら当業者公知の手法により調製されたアフコシル化EREG抗体が検討に用いられた。
臨床における抗体医薬品の有用性と薬効は抗医薬品抗体(ADAs)により制限される。ADAsは抗体医薬品の薬効および動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがある。免疫原性に影響する因子は多数報告されているが、特にT細胞エピトープが抗原に含まれることが重要であるとされる。このT細胞エピトープを予測するin silicoツールとしてはEpibase(Lonza)、iTope/TCED(Antitope)およびEpiMatrix(EpiVax)等が利用可能である。これらのツールを用いることで目的とするタンパク質に存在するT細胞エピトープを含む配列を予測できることが報告されている(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)。
免疫原性スコア = Sum (each DRB1 allotype population frequency X number of critical epitopes)
(1)in vivoモデルへの移植に供する細胞株の維持
in vivoモデルとしてMIA PaCa-2細胞(ATCC)およびDLD-1(ATCC)が用いられた。MIA PaCa-2細胞は10%FBS、2.5% Horse Serum、4 mmol/l L-Glutamine(Invitrogen)、4.5 g/l glucose(Invitrogen)、1.5 g/l Sodium bicarbonate(Invitrogen)を含むDulbecco's Modified Eagle Media(Invitrogen)(以下、継代用培地という。)中で継代されて維持された。DLD-1細胞は10%FBS、10 mmol/l HEPES(Invitrogen)、4.5 g/l glucose(Invitrogen)、1 mmol/l Sodium Pyruvate(Invitrogen)を含むRPMI1640培地(SIGMA)(以下、継代用培地という。)中で継代されて維持された。
MIA PaCa-2およびDLD-1細胞の細胞懸濁液が継代用培地とMATRIGEL Matrix(BD Bioscience)を1:1で含む溶液を用いて5x107細胞/mLになるように調製され、SCIDマウス(メス、5週齢)(日本クレア)の腹部皮下へ当該細胞懸濁液100μl(5x106細胞/マウス)が移植された。腫瘍体積は、式5を用いて算出され、腫瘍体積の平均が130-330 mm3になった時点でモデルが成立したものと判断された。
腫瘍体積=長径×短径×短径/2
cH-G1/cL-k抗体、H206-G1d/L7-3k抗体、H240-G1d/L73-k抗体の各抗体を含む投与試料が、その投与当日に生理食塩水を用いて、0.04 mg/mL(0.4 mg/kg投与群)または0.2 mg/mL(2 mg/kg投与群)となるように調製された。
(2)で作製されたマウスモデルに対するMIA PaCa-2細胞の移植後14日から週に1回ずつ、14日の期間で、DLD細胞上記の移植後12日から週に1回ずつ、14日の期間で、(3)で調製された投与試料が尾静脈より投与された。陰性対照として、生理食塩水を同様に週に1回ずつ、それぞれの期間で、10 mL/kgの投与量で尾静脈より投与された。いずれの群も、5匹を1群として、各群に対して各被験抗体を含む投与試料の投与が実施された。
ヒト癌細胞移植マウスモデルにおける各被験抗体の抗腫瘍効果が、投与試料の投与の最終日から3日または7日後の腫瘍体積を測定することによって評価された。
Claims (8)
- 配列番号:9の重鎖CDR1、配列番号:160の重鎖CDR2、および配列番号:158の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに、配列番号:163の軽鎖CDR1、配列番号:13の軽鎖CDR2、および配列番号:164の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗Epiregulin抗体。
- 配列番号:150における重鎖可変領域および配列番号:141における軽鎖可変領域を含む、抗Epiregulin抗体。
- 配列番号:30の重鎖定常領域を含む請求項1または2のいずれかに記載の抗体。
- 配列番号:27の軽鎖定常領域を含む請求項1から3のいずれかに記載の抗体。
- 中和活性を有する請求項1から4のいずれかに記載の抗体。
- 細胞傷害活性を有する請求項1から5のいずれかに記載の抗体。
- 細胞傷害活性がCDCおよび/またはADCCである請求項6に記載の抗体。
- 増殖抑制剤または細胞傷害性物質が連結された請求項1から7のいずれかに記載の抗体。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011287654 | 2011-12-28 | ||
JP2011287654 | 2011-12-28 | ||
JP2012133394 | 2012-06-13 | ||
JP2012133394 | 2012-06-13 | ||
PCT/JP2012/084042 WO2013100120A1 (ja) | 2011-12-28 | 2012-12-28 | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016181435A Division JP6329601B2 (ja) | 2011-12-28 | 2016-09-16 | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2013100120A1 JPWO2013100120A1 (ja) | 2015-05-11 |
JP6010551B2 true JP6010551B2 (ja) | 2016-10-19 |
Family
ID=48697597
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013551852A Expired - Fee Related JP6010551B2 (ja) | 2011-12-28 | 2012-12-28 | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 |
JP2016181435A Expired - Fee Related JP6329601B2 (ja) | 2011-12-28 | 2016-09-16 | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016181435A Expired - Fee Related JP6329601B2 (ja) | 2011-12-28 | 2016-09-16 | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9556264B2 (ja) |
EP (1) | EP2799543A4 (ja) |
JP (2) | JP6010551B2 (ja) |
KR (1) | KR20140107610A (ja) |
CN (1) | CN104136610B (ja) |
AU (1) | AU2012361510B8 (ja) |
BR (1) | BR112014015581A2 (ja) |
CA (1) | CA2862254A1 (ja) |
CL (1) | CL2014001730A1 (ja) |
CO (1) | CO7101193A2 (ja) |
CR (1) | CR20140352A (ja) |
HK (1) | HK1200187A1 (ja) |
IL (1) | IL233368A0 (ja) |
MX (1) | MX350044B (ja) |
MY (1) | MY172428A (ja) |
PE (1) | PE20141560A1 (ja) |
PH (1) | PH12014501468A1 (ja) |
RU (1) | RU2634383C2 (ja) |
SG (2) | SG11201403565XA (ja) |
TW (1) | TWI593705B (ja) |
UA (1) | UA115046C2 (ja) |
WO (1) | WO2013100120A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201405405B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2014208482A1 (ja) * | 2013-06-24 | 2017-02-23 | 中外製薬株式会社 | ヒト化抗Epiregulin抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤 |
JP7232707B2 (ja) | 2019-05-21 | 2023-03-03 | トーソー株式会社 | ブラケット構造 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ576855A (en) | 2006-10-12 | 2012-08-31 | Forerunner Pharma Res Co Ltd | Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody |
JP5808052B2 (ja) | 2009-05-29 | 2015-11-10 | 中外製薬株式会社 | Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物 |
TWI687441B (zh) | 2011-06-30 | 2020-03-11 | 中外製藥股份有限公司 | 異源二聚化多胜肽 |
US20140302511A1 (en) | 2011-10-28 | 2014-10-09 | Pharmalogicals Research Pte. Ltd. | Cancer stem cell-specific molecule |
TWI593705B (zh) | 2011-12-28 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient |
CN105102618B (zh) | 2012-12-27 | 2018-04-17 | 中外制药株式会社 | 异源二聚化多肽 |
US10654933B2 (en) * | 2013-12-27 | 2020-05-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for purifying antibody having low isoelectric point |
BR112016025312A2 (pt) * | 2014-05-01 | 2017-10-17 | Genentech Inc | variantes de anticorpo, anticorpo anti-fator d, formulação farmacêutica, dispositivo de distribuição, utilização da formulação e de uma composição, composição e método de tratamento de uma desordem |
JP6858559B2 (ja) * | 2014-08-20 | 2021-04-14 | 中外製薬株式会社 | 蛋白質溶液の粘度測定方法 |
JP2019202936A (ja) * | 2016-08-17 | 2019-11-28 | 中外製薬株式会社 | 抗Epiregulin抗体と抗EGFR抗体との併用医薬 |
JPWO2018155611A1 (ja) | 2017-02-24 | 2019-12-12 | 中外製薬株式会社 | 薬学的組成物、抗原結合分子、治療方法、およびスクリーニング方法 |
CN110753703B (zh) * | 2017-05-23 | 2024-04-09 | 德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心(有限公司) | 新的cd73抗体、其制备和用途 |
GB201803892D0 (en) * | 2018-03-12 | 2018-04-25 | Ultrahuman Six Ltd | C-met binding agents |
WO2020045545A1 (ja) | 2018-08-29 | 2020-03-05 | 中外製薬株式会社 | 抗体半分子、および抗体半分子のホモ二量体形成を抑制する方法 |
US20220089770A1 (en) * | 2019-01-24 | 2022-03-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel cancer antigens and antibodies of said antigens |
CN112574308A (zh) | 2019-09-30 | 2021-03-30 | 和铂医药(苏州)有限公司 | 靶向bcma的抗体、双特异性抗体及其用途 |
CN113150155B (zh) * | 2021-04-22 | 2022-04-08 | 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 | 一种抗pd-l1人源化单克隆抗体及其应用 |
Family Cites Families (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5190858A (en) | 1989-02-01 | 1993-03-02 | Oncogene Science, Inc. | Monoclonal antibodies directed to epitopes of human transforming growth factor--α and uses thereof |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
WO1992020791A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-11-26 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
ES2108048T3 (es) | 1990-08-29 | 1997-12-16 | Genpharm Int | Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
US6800738B1 (en) | 1991-06-14 | 2004-10-05 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
DK0605522T3 (da) | 1991-09-23 | 2000-01-17 | Medical Res Council | Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer |
ATE297465T1 (de) | 1991-11-25 | 2005-06-15 | Enzon Inc | Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen |
ES2227512T3 (es) | 1991-12-02 | 2005-04-01 | Medical Research Council | Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago. |
CA2124967C (en) | 1991-12-17 | 2008-04-08 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
JP3507073B2 (ja) | 1992-03-24 | 2004-03-15 | ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド | 特異的結合対の成員の製造方法 |
CA2140638C (en) | 1992-07-24 | 2010-05-04 | Raju Kucherlapati | Generation of xenogeneic antibodies |
US5648267A (en) | 1992-11-13 | 1997-07-15 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same |
CA2161351C (en) | 1993-04-26 | 2010-12-21 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1994029340A1 (fr) | 1993-06-04 | 1994-12-22 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Facteur d'inhibition de la proliferation de cellules tumorales d'origine humaine |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
EP0731842A1 (en) | 1993-12-03 | 1996-09-18 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
EP0770628B9 (en) | 1994-07-13 | 2007-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin-8 |
CA2219361C (en) | 1995-04-27 | 2012-02-28 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
EP0823941A4 (en) | 1995-04-28 | 2001-09-19 | Abgenix Inc | HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES |
US6172213B1 (en) | 1997-07-02 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides |
US5994511A (en) | 1997-07-02 | 1999-11-30 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides |
ES2364266T3 (es) | 1998-04-03 | 2011-08-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticuerpo humanizado hacia el factor tisular humano (tf) y procedimiento para construir el anticuerpo humanizado. |
PT1071700E (pt) | 1998-04-20 | 2010-04-23 | Glycart Biotechnology Ag | Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos |
ES2694002T3 (es) | 1999-01-15 | 2018-12-17 | Genentech, Inc. | Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante |
PT1914244E (pt) | 1999-04-09 | 2013-07-26 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico |
US6949245B1 (en) | 1999-06-25 | 2005-09-27 | Genentech, Inc. | Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies |
BR122014028365B8 (pt) | 1999-06-25 | 2021-07-06 | Genentech Inc | artigo industrializado compreendendo um primeiro recipiente que compreende uma composição de humab4d5-8 nele contida e um segundo recipiente que compreende uma composição rhumab 2c4 nele contida |
CA2785941C (en) | 2000-10-06 | 2017-01-10 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antibody composition-producing cell |
CU22979A1 (es) | 2000-12-08 | 2004-09-09 | Centro Inmunologia Molecular | Combinación inmunoterapéutica para el tratamiento de tumores que sobre-expresan receptores con actividad quinasa en residuos de tirosina |
WO2002079255A1 (en) | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Idec Pharmaceuticals Corporation | RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII |
WO2004003019A2 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Domantis Limited | Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs |
EP3960855A1 (en) | 2001-12-28 | 2022-03-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for stabilizing proteins |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
JP3991280B2 (ja) | 2002-06-05 | 2007-10-17 | 中外製薬株式会社 | 抗体作製方法 |
DK2345671T3 (en) | 2002-09-27 | 2016-02-15 | Xencor Inc | Optimized Fc variants and methods for their formation |
NZ541503A (en) * | 2003-01-22 | 2008-09-26 | Glycart Biotechnology Ag | Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function |
CN1761682A (zh) | 2003-03-14 | 2006-04-19 | 大正制药株式会社 | 单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤 |
US7195764B2 (en) | 2003-04-14 | 2007-03-27 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
PT2311873T (pt) | 2004-01-07 | 2018-11-20 | Novartis Vaccines & Diagnostics Inc | Anticorpo monoclonal específico para m-csf e respetivos usos |
DK2177537T3 (da) | 2004-01-09 | 2011-12-12 | Pfizer | Antistoffer til MAdCAM |
US20080089892A1 (en) | 2004-01-12 | 2008-04-17 | Eli Lilly And Co. | Fc Region Variants |
WO2005076979A2 (en) | 2004-02-06 | 2005-08-25 | Wyeth | Diagnosis and therapeutics for cancer |
DK1776384T3 (da) | 2004-08-04 | 2013-09-02 | Mentrik Biotech Llc | VARIANT-Fc-REGIONER |
CA2577370A1 (en) | 2004-08-16 | 2006-03-02 | Medimmune, Inc. | Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity |
KR20070057839A (ko) | 2004-08-19 | 2007-06-07 | 제넨테크, 인크. | 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체 |
AU2005335714B2 (en) | 2004-11-10 | 2012-07-26 | Macrogenics, Inc. | Engineering Fc antibody regions to confer effector function |
JPWO2006067847A1 (ja) * | 2004-12-22 | 2008-06-12 | 中外製薬株式会社 | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
EP1838730A4 (en) | 2005-01-11 | 2015-04-29 | Molecular Logix Inc | PAN-HER ANTAGONISTS AND METHODS OF USE |
AU2006230413B8 (en) | 2005-03-31 | 2011-01-20 | Xencor, Inc | Fc variants with optimized properties |
US8008443B2 (en) | 2005-04-26 | 2011-08-30 | Medimmune, Llc | Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering |
EP2281901B1 (en) | 2005-08-02 | 2013-11-27 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Anti-tumour pharmaceutical composition with angiogenesis inhibitors |
DK1919503T3 (en) | 2005-08-10 | 2014-12-15 | Macrogenics Inc | Identification and preparation of antibodies with variant fc regions and methods of use thereof |
EP1931709B1 (en) | 2005-10-03 | 2016-12-07 | Xencor, Inc. | Fc variants with optimized fc receptor binding properties |
WO2007092932A2 (en) | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Targeted Molecular Diagnostics, Llc | Bivalent erbb ligand binding molecules and methods for their preparation and use |
ES2568436T3 (es) | 2006-03-31 | 2016-04-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos |
NZ576855A (en) | 2006-10-12 | 2012-08-31 | Forerunner Pharma Res Co Ltd | Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody |
CN103408661B (zh) | 2007-01-05 | 2016-04-06 | 苏黎世大学 | 提供疾患特异性结合分子和靶的方法 |
WO2008092117A2 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Xencor, Inc. | Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region |
JP2009078946A (ja) | 2007-09-26 | 2009-04-16 | Fujifilm Corp | コア−シェル型金属酸化物粒子及びその製造方法 |
SG10201605394SA (en) | 2007-09-26 | 2016-08-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified Antibody Constant Region |
BRPI0817637A2 (pt) | 2007-09-28 | 2015-09-08 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | anticorpo anti-glipican-3 tendo cinéticas aperfeiçoadas no plasma |
JP5808052B2 (ja) | 2009-05-29 | 2015-11-10 | 中外製薬株式会社 | Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物 |
GB0909904D0 (en) | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Affitech As | Product |
GB0909906D0 (en) * | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Affitech As | Antibodies |
CN103328626B (zh) | 2010-10-06 | 2017-02-08 | 中外制药株式会社 | 癌干细胞群及其制备方法 |
TWI687441B (zh) * | 2011-06-30 | 2020-03-11 | 中外製藥股份有限公司 | 異源二聚化多胜肽 |
TWI593705B (zh) | 2011-12-28 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient |
JPWO2014208482A1 (ja) | 2013-06-24 | 2017-02-23 | 中外製薬株式会社 | ヒト化抗Epiregulin抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤 |
-
2012
- 2012-12-26 TW TW101150028A patent/TWI593705B/zh not_active IP Right Cessation
- 2012-12-28 BR BR112014015581-0A patent/BR112014015581A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-12-28 SG SG11201403565XA patent/SG11201403565XA/en unknown
- 2012-12-28 UA UAA201408353A patent/UA115046C2/uk unknown
- 2012-12-28 KR KR20147020786A patent/KR20140107610A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-28 PE PE2014001036A patent/PE20141560A1/es not_active Application Discontinuation
- 2012-12-28 EP EP12863154.6A patent/EP2799543A4/en not_active Withdrawn
- 2012-12-28 CA CA2862254A patent/CA2862254A1/en not_active Abandoned
- 2012-12-28 MX MX2014008009A patent/MX350044B/es active IP Right Grant
- 2012-12-28 US US14/369,539 patent/US9556264B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-12-28 RU RU2014130766A patent/RU2634383C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-12-28 JP JP2013551852A patent/JP6010551B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-12-28 CN CN201280070788.2A patent/CN104136610B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2012-12-28 SG SG10201508095UA patent/SG10201508095UA/en unknown
- 2012-12-28 WO PCT/JP2012/084042 patent/WO2013100120A1/ja active Application Filing
- 2012-12-28 MY MYPI2014701733A patent/MY172428A/en unknown
- 2012-12-28 AU AU2012361510A patent/AU2012361510B8/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-06-25 PH PH12014501468A patent/PH12014501468A1/en unknown
- 2014-06-25 IL IL233368A patent/IL233368A0/en unknown
- 2014-06-26 CL CL2014001730A patent/CL2014001730A1/es unknown
- 2014-07-22 CR CR20140352A patent/CR20140352A/es unknown
- 2014-07-22 ZA ZA2014/05405A patent/ZA201405405B/en unknown
- 2014-07-24 CO CO14161083A patent/CO7101193A2/es unknown
-
2015
- 2015-01-16 HK HK15100507.9A patent/HK1200187A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-09-15 US US15/266,829 patent/US20170129950A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-16 JP JP2016181435A patent/JP6329601B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2014208482A1 (ja) * | 2013-06-24 | 2017-02-23 | 中外製薬株式会社 | ヒト化抗Epiregulin抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤 |
JP7232707B2 (ja) | 2019-05-21 | 2023-03-03 | トーソー株式会社 | ブラケット構造 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6329601B2 (ja) | ヒト化抗Epiregulin抗体および当該抗体を有効成分として含む癌治療剤 | |
JP6925278B2 (ja) | 液性免疫応答の増強方法 | |
JP5998060B2 (ja) | B7−h3と反応性のある抗体、その免疫学的に活性なフラグメントおよびその使用 | |
WO2014208482A1 (ja) | ヒト化抗Epiregulin抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤 | |
CN113330036B (zh) | 结合pd-l1和ox40的双特异性抗体 | |
EP3916016A1 (en) | Novel bispecific antibody molecule and bispecific antibody simultaneously combining pd-l1 and lag-3 | |
WO2011105573A1 (ja) | 抗icam3抗体およびその用途 | |
CA3142635A1 (en) | Anti-ceacam5 monoclonal antibody and preparation method thereof and use thereof | |
CN117377694A (zh) | 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途 | |
JP2023528350A (ja) | Cd3抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用 | |
NZ627024B2 (en) | Humanized anti-epiregulin antibody, and cancer therapeutic agent comprising said antibody as active ingredient |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150318 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150715 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150715 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160104 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160608 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160802 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160824 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160916 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6010551 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |