TWI570109B - Preparation of aromatic heterocyclic compounds as selective JAK3 and / or JAK1 kinase inhibitors and their use - Google Patents

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Description

作為選擇性JAK3及/或JAK1激酶抑制劑的芳雜環化合物的製備方法及其應用
本發明屬於醫藥技術領域，關於具有Janus激酶3(JAK3)及/或Janus激酶1(JAK1)抑制活性的芳雜環化合物，本發明還關於該化合物的製備方法、包含該化合物作為活性成分的藥物組合物以及其製藥應用。本發明的化合物可作為JAK3及/或JAK1激酶的抑制劑，用於治療/預防與這些激酶活性異常相關疾病的臨床應用，包括自體免疫性疾病、炎症疾病、癌症及其它疾病。
2002年，Manning等人確定了人類激酶組中包括518種蛋白激酶基因，其中218種酶基因與人類疾病的發生發展密切相關(Manning G.,et al.2002,Science,298：1912-1934)。在目前已發現的藥物中，以酶為作用靶點的藥物占20%之多，特別是靶向蛋白激酶在臨床應用上具有特殊價值。
蛋白激酶是一類胞內信使依賴的，催化特定蛋白磷酸化並完成信號傳遞過程的酶，主要包括酪胺酸蛋白激酶(JAKs、Src、Abl、EGFR、FGFR、PDGFR等)、絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶(PKC、MAPK、Rho激酶等)、雙特異性蛋白激酶(MAPKK)以及磷脂醯肌醇激酶(PI3K)。蛋白激酶磷 酸化/去磷酸化過程能夠調節不同細胞的多種生物學過程，如代謝、細胞分化、細胞存活、細胞凋亡、器官形成、血管生成、免疫反應等(Shchemelinin I.,et al.2006,Folia Biol.,52：81-100)。
JAK激酶(Janus kinase，簡稱JAKs，包括四個已知成員JAK3、JAK1、TYK2、JAK2)是胞漿內非受體酪胺酸蛋白激酶超家族中的一個小家族。JAK3分佈於骨髓和淋巴系統中，JAK1、TYK2、JAK2則廣泛分佈於多種組織細胞中。當JAKs結合到細胞表面的細胞因數受體後，啟動受體偶聯的JAKs，進而使受體磷酸化，這為胞漿信號轉導和轉錄啟動因數STAT蛋白(Signal Transducers and Activators of Transcription，STAT1~4、STAT5a、STAT5b、STAT6)提供了募集反應位點，JAKs磷酸化STAT蛋白，後者二聚化後轉移到細胞核內調控基因表達，這條途徑即JAK/STAT信號通路(O’Shea J.J.,et al.2013,N.Engl.J.Med.,368：161-170)。
JAK/STAT信號通路是一條由多種細胞因數和生長因數受體刺激的信號轉導通路，這些因數包括白介素類(IL-2~7、IL-9、IL-10、IL-15、IL-21)、干擾素類(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、促紅細胞生成素(EPO)、粒細胞和巨細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促生長素(GH)、催乳素(PRL)、促血小板生成素(TPO)等，其在參與免疫細胞和造血幹細胞的增殖、免疫調節的生物學過程中起關鍵作用(Ghoreschi K.,et al.2009,Immunol.Rev.,228：273-287)。不同受體可 啟動不同亞型的JAK激酶，從而實現差異化的生物學功能。
JAK1可與IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、IL-28、IFN-α、IFN-γ、gp130家族中的IL-6以及含γc的其它受體等結合(Rodig S.J.,et al.1998,Cell,93：373-383)。小鼠模型上的JAK1基因敲除實驗表明該酶在調節上述多種細胞因子受體的生物學效應中起著關鍵作用(Kisseleva T.,et al.2002,Gene,285：1-24)。JAK1是免疫相關疾病、炎症和癌症等疾病領域的新型靶點。JAK1抑制劑可用於治療/預防自體免疫性疾病、炎症和腫瘤(Hornakova T.,et al.2010,Blood,115：3287-3295)，如白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、關節炎、銀屑病、克羅恩病、紅斑狼瘡、獲得性免疫缺陷綜合症、白塞病(Hou S.,et al.2013,Hum.Genet.,132：1049-1058)等，但並不限於此。
JAK2在包括EPO、GH、PRL、IL-3、IFN-γ等多種受體信號的調節過程中發揮重要作用(Kisseleva T.,et al.2002,Gene,285：1-24；Levy D.E.,et al.2002,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,3：651-662；O’Shea J.J.,et al.2002,Cell,109(suppl.)：S121-S131)。在小鼠模型中敲除JAK2可導致貧血動物死亡(Schindler C.,et al.2007,J.Biol.Chem.,282：20059-20063)；人體中的JAK2基因上的一個鹼基突變JAK2V617F，其與骨髓增生性疾病中的真性紅細胞增多症(PV)、特發性血小板增多症(ET)、特發性骨髓纖維化(IMF)、慢性粒細胞白血病(CML)等的發生密切相關(Ghoreschi K.,et al.2009,Immunol.Rev.,228：273-287)。 因此，JAK2已成為該類疾病的治療/預防的確切作用靶點。
JAK3通過與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21等細胞因子受體複合物中的γ共鏈(γc)相結合，調節細胞信號傳導。JAK3或γc突變都可導致重症聯合免疫缺陷(SCID)(Villa A.,et al.1996,Blood,88：817-823)。JAK3活性異常表現為T細胞和NK細胞大量減少、B細胞功能喪失，嚴重影響免疫系統等的正常生物學功能。基於其功能特點和特殊的組織分佈，JAK3成為針對免疫系統相關疾病極具吸引力的藥物靶點，其抑制劑在類風濕性關節炎(RA)、克羅恩病、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、I型糖尿病、銀屑病、過敏性疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病、白血病、淋巴瘤、器官移植和其它等疾病的治療/預防方面具有重要的臨床應用價值(Papageorgiou A.C.,et al.2004,Trends Pharm.Sci.,2004,25：558-562)。
TYK2是JAK家族中的第一個成員，其可被干擾素(IFNs)、IL-10、IL-6、IL-12、IL-23、IL-27等多種受體啟動。在小鼠中，TYK2功能缺失會引起多種細胞因子受體的信號通路發生缺陷，進而導致病毒感染、抗菌免疫功能下降並增加了肺部感染的可能性等(Kisseleva T.,et al.2002,Gene,285：1-24)。另外，Larner A.C.小組的研究表明TYK2可有助於抑制乳腺癌的生長和轉移(Zhang Q.,et al.2011,J.Interferon Cytokine Res.,31：671-677)；該課題組近來報導了TYK2可在小鼠和人體內通過棕色脂肪組織(BAT)的分化而協助肥胖調節的研究成果，其可保護機體 免於肥胖，甚至能夠逆轉肥胖(Derecka M.,et al.2012,Cell Metab.,16：814-824)。這或許為肥胖的癌症患者治療提供了新機會。
2012年11月，Pfizer公司的pan-JAKs抑制劑Xeljanz(Tofacitinib)獲FDA批准用於治療RA。2013年10月，該公司公開了Xeljanz用於治療銀屑病的Ⅲ臨床資料，對照Enbrel(Etanercept)的雙盲試驗，該藥物滿足了非劣效性設計研究結果。然而，Xeljanz具有包括引起紅細胞與白細胞數量下降、膽固醇水準上升等副作用，這或許與其具有高JAK2抑制活性但選擇性較低相關(Zak M.,et al.2012,J.Med.Chem.,55：6176-6193)。因此，需要研究並發現選擇性的JAK抑制劑。
現已有多種選擇性JAK抑制劑處於不同的臨床研究階段，包括選擇性JAK3抑制劑VX-509、選擇性JAK1抑制劑GLPG0634(Feist E.,et al.2013,Rheumatology,52：1352-1357)和INCB39110(http：//www.incyte.com/research/pipeline)等，用於治療RA、克羅恩病、銀屑病、骨髓纖維化等免疫系統相關疾病。除此之外，多種不同結構類型的選擇性抑制劑的相關專利被公開：1)選擇性JAK3抑制劑，如吡咯并[1,2-b]噠嗪(WO2012125887)、吡唑并[3,4-d]嘧啶(WO2011048082、WO2011134861、WO2012022681)、二胺基嘧啶類(WO2011029807、WO2012015972)、吡咯并[2,3-b]吡啶(JP2012012332)、二胺基-吡啶-3-甲醯胺 (WO2010061971、US20120108566)、吡咯并[2,3-b]吡嗪(WO2011144584、WO2011144585)等；2)選擇性JAK1抑制劑，如三環類化合物(WO2011086053)、取代的吡唑類和吡咯類(WO2010135650、WO2011112662)、苯胺基酞嗪類(WO2012037132)等。另外，具有選擇性JAK2抑制劑、選擇性TYK2抑制劑以及同時具有兩種亞型(JAK3/1，JAK1/2等)抑制劑的相關專利也已被報導，在此不再贅述。
ITK(Inducible T-cell kinase)是Tec家族中的非受體酪胺酸激酶之一，亦稱Emt或Tsk。ITK表達於T細胞、NKT細胞和肥大細胞中。該激酶在T細胞受體(TCR)、CD28、CD2、趨化因子受體CXCR4及Fc□R等的信號通路調節過程中起著關鍵作用，對T細胞的分化和增殖等有重要影響。Th2類型細胞因子(包括IL-4、IL-5、IL-13等)的分泌在調節免疫炎症過程中具有重要作用，ITK缺陷影響Th2細胞反應，從而降低慢性或晚期炎症反應(Sahu N.,et al.2009,Curr.Top.Med.Chem.,9：690-703；Lin T.A.,et al.2004,Biochemistry,43：11056-11062)。BLK(B-cell lymphocyte kinase)是Src家族中的非受體酪胺酸激酶之一，表達於B淋巴細胞中，與B淋巴細胞的生長和分化等相關。BLK激酶、磷酸酯酶及相應共同受體之間的緊密結合在B細胞受體(BCR)的信號通路調節過程中發揮重要作用，如該激酶可影響BCR的凋亡和生成阻滯(Texido G.,et al.2000,Mol.Cell Biol.,20：1227-1233)。BLK在前B細胞受體介導NF-κB的活化中也具有重要作用(Saijo K.,et al. 2003,Nat.Immunol.,4：274-279)。近來的研究表明了BLK與RA、系統性紅斑狼瘡以及其它多種自體免疫性疾病的發病機制相關(Simpfendorfer KR.,et al.2012,Hum.Mol.Genet.,21：3918-3925；Génin E.,et al.2013,PLoS One,8：e61044)。
TBK1(TANK-binding kinase1)是IKK家族中的一種Ser/Thr蛋白激酶，也被稱為NAK(NF-κB activating kinase)或T2K。TBK1在小鼠的胃部、結腸、肺部、胸腺和肝臟等中廣泛表達；同時在人的淋巴和非淋巴器官中都有表達，包括脾臟、大腦和腎臟等。該激酶對細菌和病毒的免疫反應、炎症相關因子的表達都具有調節作用，如IL-6、TNF-α及IFN-β等。在胰島素信號通路中，TBK1可調節胰島素受體上Ser994的磷酸化和脂代謝。這些結果表明，TBK1在不同的免疫生物學和免疫病理學機制中起著關鍵作用(Yu T.,et al.2012,Mediators Inflamm.,2012：979105-979112；Hammaker D.,et al.2012,Rheumatology,51：610-618)。
VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)家族中包括VEGFR-1(Flt1)、VEGFR-2(KDR/Flk1)及VEGFR-3(Flt4)3個成員，由含7個免疫球蛋白樣結構的細胞外區、膜區和酪胺酸激酶區組成，其中的酪胺酸激酶活性通過受體和配體結合而啟動，配體如VEGFs A-F和胎盤生長因子，進一步引起細胞的多種生物學效應，如在細胞的生長和分化中的重要作用(shibuya M.,et al.2010,Genes Cancer,1：1119-1123)。此外的研究表明，VEGFR1在RA患者的內皮細胞、單核細胞及巨噬細胞等中有表達。VEGFA可啟動VEGFR1，導致內皮細胞增殖和血管形成等。VEGFA蛋白在RA病人中的滑液、淋巴液、血清及滑膜組織中高表達，VEGFA水準與RA疾病呈正相關。VEGFR2在RA患者的滑膜組織中有表達。VEGF A、C、D可啟動VEGFR2信號，增加血管滲透性和血管形成。VEGFC在RA增厚滑膜內層的多種細胞中被檢測到，特別是在血管周細胞和平滑肌細胞中。VEGFR3可表達於單核細胞、巨噬細胞、一些樹突狀細胞、正常乳腺組織中的毛細血管及神經內分泌器官等。研究發現，VEGFR3在RA、炎症性腸病、潰瘍性疾病及克羅恩病等自體免疫性疾病和***形成相關腫瘤的發病中都具有一定作用，相關的作用機制尚未完全清楚(D'Aura Swanson C,et al.2009,Nat.Rev.Rheumatol.,5：317-324；Aoki Y.,et al.2005,J.Natl.Cancer Inst.,97：2-3)。
本文所公開的蛋白激酶抑制劑可用於治療及/或預防RA、銀屑病、克羅恩病、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、I型糖尿病、過敏性疾病、慢性阻塞性肺病、哮喘、白血病、淋巴瘤等免疫系統相關疾病，但並不限於此。同時，這些化合物或者包含其作為活性成分的藥物組合物等可在安全治療視窗內能將這些疾病的臨床療效達到最大化。
本發明的一個方面，關於一種具有JAK3及/或JAK1 抑制活性的芳雜環化合物，包括其藥學上可接受的鹽、水合物、立體異構物、前藥等衍生物。
本發明另一方面關於一種本文所述化合物的製備方法。
本發明的又一方面關於一種包括其本發明化合物作為活性成分的藥物組合物、以及一種本發明化合物或藥物組合物用於治療/預防與JAKs等激酶活性異常相關的疾病的臨床應用、以及一種本發明化合物或藥物組合物在製備用於治療及/或預防與JAKs等激酶活性異常相關的疾病的藥物中的應用。
本發明關於一種通式(I)所示的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物，
式中，R1為鹵素或C1-C6烷基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷基羰基和C1-C6烷基胺基；R3為氫或鹵素；R4為氫或C1-C4烷基； X為NH、O或S；Y為CO或S(O)2；Z為共價鍵、CH2或(CH2)2；n為1到4的整數；環A為苯環、吡啶環或哌啶環。
在一個較佳的方面，本發明關於一種通式(I)所示的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物，式中，R1為鹵素或C1-C6烷基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或鹵素；R4為氫或甲基；X為NH或O；Y為CO或S(O)2；Z為共價鍵、CH2或(CH2)2；n為1到4的整數；環A為苯環、吡啶環或哌啶環。
在一個更佳的方面，本發明關於一種通式(I)所示的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物，式中，R1為鹵素或C1-C6烷基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、 甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n為1到4的整數；環A為苯環、吡啶環。
在一個更佳的方面，本發明關於一種通式(I)所示的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物，式中，R1為氯、氟或甲基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n為1到4的整數；環A為苯環。
在一個還更佳的方面，本發明關於一種通式(I)所示 的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物，式中，R1為氯；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n為1到4的整數；環A為苯環。
在一個特別較佳的方面，本發明關於一種通式(I)所示的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物，式中，R1為氯；R2為一個或複數個取代基，選自氰基、氟和三氟甲基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n等於1； 環A為苯環。
在一個尤其較佳的方面，本發明關於一種通式(I)所示的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物，其中，R1為氯；R2為一個或複數個取代基，選自氰基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n等於1；環A為苯環。
圖1是顯示Z’-LYTE激酶活性檢測原理的示意圖，其反映了檢測過程中所關於的激酶與底物反應、發生顯色反應以及進行檢測等步驟。
本發明所述的“鹵素”為氟、氯、溴、碘，尤其是氟、氯或溴。
本發明所述的“烷基”，包括直鏈、支鏈或環狀的烷基。較佳地，該烷基為C1-C8烷基、C1-C6烷基；特別較佳的，該烷基為C1-C4烷基；更特別較佳的，該烷基為甲基、乙基、丙基或異丙基、正丁基、異丁基或特丁基(叔丁 基)。本發明化合物中的烷基可以是任選取代或未取代的，取代基可以包括烷基、鹵素、烷氧基、烴基、羥基等。本發明烷基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、特丁基、正戊基、異戊基、正己基、異己基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。
本發明所述的“烷氧基”，是指上述烷基與氧原子相連所形成的基團，其中，氧原子具有自由成鍵能力，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、異丙氧基、特丁氧基、環丙氧基、環己基氧基等。
本發明所述的“烷基羰基”，是指上述烷基與羰基相連所形成的基團，如乙醯基、丙醯基、異丙醯基、丁醯基、特丁醯基、環丙醯基、環己基醯基等。
本發明所述的“烷基胺基”，是指上述烷基與胺基相連所形成的基團，如甲胺基、乙胺基、4-二甲胺基等。
本發明所述的“可藥用的”或“藥學上可接受的”被理解為在合理的醫學範圍內適於人和動物使用，可耐受且並無不可接受的副作用包括毒性、過敏反應、刺激及併發症和其它。
本發明關於一種藥物組合物，該藥物組合物含有上述通式(I)的化合物，包括其前藥、立體異構物、藥學上可接受的鹽或水合物作為活性成分，以及可藥用載體、輔料或賦形劑等。該可藥用載體、輔料或賦形劑是指任何可用於藥物領域的稀釋劑、輔助劑和載體，如藥用輔料手冊(Handbook of Pharmaceutical Excipients 8th ed，2013)中所 列的材料，但並不限於此。
本發明所述的化合物任選地可與其他一種或多種活性成分聯合使用，其各自用量和比例可由本領域技術人員根據具體病症和患者具體等情況以及臨床需要而進行調整。
本發明所述的化合物、藥物組合物可配製成各種劑型，其中含有藥物領域中常用賦形劑，如口服製劑(片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、滴丸劑等)、注射製劑、局部製劑等，但並不限於此。本發明的製劑形式中通常含有按重量計0.5~70%的活性成分，較佳地，含有按重量計1~20%的活性成分。
本發明所述通式I的化合物，在臨床上可以通過口服或注射方式對哺乳動物(包括人)進行用藥，其中尤以口服方式為佳。用藥劑量為每日0.0001~200mg/kg體重，較佳用藥劑量為每日0.01~100mg/kg體重，最佳用藥劑量為每日0.1~50mg/kg體重。同時，最佳劑量視個體而定，通常開始時劑量較小，然後逐漸增加用量。
本發明中所提供的實施例和製備例進一步闡明並舉例說明了本發明所述化合物及其製備方法。應當理解，下述製備例和實施例的範圍不以任何方式限制本發明的範圍。
下面的合成路線描述了本發明的通式(I)衍生物的製備方法，如下合成示意圖中所用原料、試劑、催化劑、溶劑等均可通過有機化學領域普通技術人員熟知的方法製備或者可商購得到。本發明的全部最終衍生物都可都過示意圖中所描述的方法或其類似方法制得，這些方法都是有機 化學領域普通技術人員熟知的。這些示意圖中應用的全部可變因素如下文定義或如申請專利範圍中的定義。
製備方法：
(a)中間體III(a)可由市場直接購得或由如下的示例性合成方法製備：
使單邊保護的二胺VI與化合物VII縮合獲得化合物VIII。該縮合反應以肽縮合劑為催化劑，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺(EDC)，N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)，N,N'-羰基二咪唑(CDI)等。反應溫度為0~60℃，反應時間為2~72小時。反應所用溶劑為常用溶劑，如苯、甲苯、四氫呋喃、二氧六環、二氯甲烷、氯仿、N,N'-二甲基甲醯胺等。必要時，也可以加入鹼，如氫氧化鈉、三乙胺或吡啶等。
所得化合物VIII在酸(較佳三氟乙酸)作用下脫Boc得化合物III(a)，反應溫度為0~60℃，反應時間為0.5~2小時。反應所用溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、N,N'-二甲基甲醯胺等。
(b)中間體III(b)可直接購得或由如下的示例性合成方法製備：
使單邊保護的二胺VI與化合物IX縮合獲得化合物X，反應溫度為0~60℃，反應時間為0.5~2小時。反應所用溶劑為常用溶劑，如苯、甲苯、四氫呋喃、二氧六環、二氯甲烷、氯仿、N,N'-二甲基甲醯胺等。縛酸劑常用三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶等；任選地，可加入無機鹼如NaOH、Na2CO3、NaOAc等。
所得化合物X在酸(較佳三氟乙酸)作用下脫Boc得化合物III(b)。反應溫度為0~60℃，反應時間為0.5~2小時。反應所用常用溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、N,N'-二甲基甲醯胺、水等。所用的酸可以為三氟乙酸、鹽酸等。
(c)中間體V可由如下的示例性合成方法製備：
使化合物XI(可市場購得或合成得到)與丙烯醯氯在鹼(較佳二異丙基乙基胺)存在下縮合得到化合物XII，所得化 合物XII經鐵粉還原硝基獲得目標中間體V。所用的鹼可以為二異丙基乙基胺、三乙胺等。
(d)本發明所述通式(I)可由如下的示例性合成方法製備：
使化合物II與化合物III在三乙胺存在下發生取代反應得到化合物IV，其中化合物II和III均可由市售購買得到反應溫度為回流，反應時間為8-16小時。反應所用溶劑為乙醇、甲醇、正丁醇等。鹼為三乙胺、二異丙基乙基胺等。
使化合物IV與合成的化合物V在酸(較佳三氟乙酸)催化下發生取代反應得到化合物I。反應溫度為回流，反應時間為8-16小時。反應所用溶劑為異丙醇、正丁醇等；反應所用的酸為三氟乙酸、鹽酸等。
通式I所述的化合物可以採用常見的分離方法進行純化，如萃取、重結晶、柱層析等。
本發明所述的代表性化合物如表1所示。化合物編號與實施例部分中的“實施例編號”相一致，即表1中化合 物1的合成在“實施例1”中得到描述，表1中化合物30的合成在“實施例30”中得到描述。
下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的保護範圍並不僅僅局限於這些實例。本發明所述的百分比除特別注明外，均為重量百分比。說明書中所描述的數值範圍，如計量單位、反應條件、化合物物理狀態或百分比，均是為了提供明白無誤的書面參考。本領域技術人員在實施本發明時，使用在此範圍之外或有別於單個數值的溫度、濃度、數量、碳原子數等，仍然有可能得到預期的結果。
實施例1 2-氟-N-甲基-5-硝基苯胺的製備
黃色固體2-氟-N-甲基-5-硝基苯胺(19.0g,87.0%產率)由如下方法製備。2-氟-5-硝基苯胺(20.0g,128.2mmol) 和多聚甲醛(16.0g,533.3mmol)溶於500mL甲醇中於室溫下攪拌。然後滴加甲醇鈉(3.4g,63mmol)的甲醇溶液100mL。該反應液在室溫下攪拌16小時後分兩等分加入NaBH4(9.7g,255.2mmol)。攪拌15分鐘。LC-MS跟蹤反應。反應結束後倒入1M KOH的水溶液中，攪拌析出固體。過濾獲得目標中間體。LC-MS(m/z)171(M+1)。
實施例2 N-(2-氟-5-硝基苯基)-N-甲基丙烯醯胺的製備
黃色油狀物N-(2-氟-5-硝基苯基)-N-甲基丙烯醯胺(12.0g,83.0%產率)由如下方法製備。2-氟-N-甲基-5-硝基苯胺(11.0g,64.7mmol)和DIPEA(23mL,129.4mmol)溶於100mL THF中，將其在室溫下攪拌。然後滴加丙烯醯氯(11mL,129.4mmol)。該反應液在室溫下攪拌1小時後蒸掉大部分溶劑，加入100mL乙酸乙酯稀釋，飽和食鹽水洗滌，乾燥，過濾，減壓濃縮獲得目標中間體。LC-MS(m/z)225(M+1)。
實施例3 N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺的製備
棕色油狀物N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(5.6g,54.0%產率)由如下方法製備。鐵粉(20.0g,357mmol) 和NH4Cl(20.0g,374mmol)溶於200mL水中加熱至80℃攪拌半小時。然後加入N-(2-氟-5-硝基苯基)-N-甲基丙烯醯胺(12.0g,53.6mmol)的乙酸乙酯溶液20mL。該反應液在80℃下攪拌1小時後加入NaHCO3水溶液調鹼，過濾鐵泥，濾液用乙酸乙酯萃取，合併有機相減壓濃縮獲得目標中間體。LC-MS(m/z)195(M+1)。
實施例4 3-(4-氰基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-氰基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(850mg,98.0%產率)由如下方法製備。將3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(500mg,2.87mmol)溶於20mL THF中，然後加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1.0g,5.24mmol)、1-羥基苯并***(580mg,4.30mmol)、DIPEA(1mL,5.63mmol)和4-氰基苯甲酸(425mg,2.89mmol)。混合物在室溫下攪拌20小時。然後用NaHCO3水溶液調pH至8-10。乙酸乙酯萃取，合併有機相乾燥，過濾，減壓濃縮獲得目標中間體。LC-MS(m/z)304(M+1)。
實施例5 N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯甲醯胺(350mg, 62.0%產率)由如下方法製備。3-(4-氰基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(850mg,2.8mmol)溶於10mL二氯甲烷，然後加入三氟乙酸(500μL,6.7mmol)。該反應液在室溫下攪拌16小時後加入NaHCO3水溶液調鹼，蒸乾後加入二氯甲烷/甲醇(10：1)的混合溶液超聲。過濾固體後將濾液蒸乾獲得目標中間體。LC-MS(m/z)204(M+1)。
實施例6 4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯甲醯胺(3.5g,78.0%產率)由如下方法製備。2,4,5-三氯嘧啶(2.6g,14.2mmol)、N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯甲醯胺(2.6g,12.8mmol)和三乙胺(2mL,14mmol)溶於50mL乙醇。該反應液加熱至70℃攪拌4小時後反應結束。蒸乾溶劑後用***洗滌。過濾獲得目標中間體。LC-MS(m/z)351(M+1)。
實施例7 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺(3.1g,60.0%產率)由如下方法製備。N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯甲醯胺(4.0g,11.4mmol)、N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(2.7g,13.9mmol)和三氟乙酸(1mL,7mmol)溶於60mL異丙醇。該反應液加熱至90℃攪拌24小時後反應結束。反應液倒入NaHCO3水溶液中，析出固體。靜置，過濾。粗產物溶於乙酸乙酯中超聲，過濾得目標化合物。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.80-1.83(m,2H,CH2),3.10-3.12(m,2H,CH2),3.32(s,3H,CH3),3.44-3.46(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.4Hz,1H,CH),6.02-6.08(m,1H,CH),6.18(d,J=16.0Hz,1H,CH),7.21-7.23(m,1H,Ar-H),7.26-7.27(m,1H,Ar-H),7.64(s,1H，嘧啶-NH),7.91(s,1H,Ar-H),7.93(s,1H，嘧啶-H),7.95-7.96(m,2H,Ar-H),7.97-7.98(m,2H,Ar-H),8.72(s,1H,NH),9.43(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)508(M+1)。
實施例8 N-(2-氟-5-硝基苯基)丙烯醯胺的製備
黃色固體N-(2-氟-5-硝基苯基)丙烯醯胺(0.3g,71.4%產率)是由2-氟-5-硝基苯胺(0.3g,2.0mmol)和丙烯醯氯(0.27g,3mmol)按照實施例2中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)211(M+1)。
實施例9 N-(5-胺基-2-氟苯基)丙烯醯胺的製備
棕色固體N-(5-胺基-2-氟苯基)丙烯醯胺(0.1g,46.7%產率)是由N-(2-氟-5-硝基苯基)丙烯醯胺(0.25g,4.7mmol)按照實施例3中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)181(M+1)。
實施例10 3-(4-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(0.22g,90%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(0.4g,2.4mmol)和4-三氟甲基苯甲酸(0.38g,2mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)347(M+1)。
實施例11 N-(3-胺基丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
黃色液體N-(3-胺基丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(1.1g,53%產率)是由3-(4-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(2.8g,8mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)247(M+1)。
實施例12 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(1.9g,57%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(1.46g,8mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(1.9g,8mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)393(M+1)。
實施例13 N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟-苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
灰色固體N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟-苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(18mg,33%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(39mg,0.1mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)丙烯醯胺(20mg,0.11mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.85-1.88(m,2H,CH2),3.32-3.37(m,2H,CH2),3.55-3.58(m,2H,CH2),5.76-5.79(m,1H, CH),6.27-6.32(m,1H,CH),6.61-6.68(m,1H,CH),7.21(t,J=10.04Hz,1H，嘧啶-NH),7.36-7.40(m,1H,Ar-H),7.82(d,J=8.16Hz,2H,Ar-H),8.02(d,J=8.1Hz,2H,Ar-H),8.16(s,1H，嘧啶-H),8.28(s,1H,Ar-H),8.37-8.38(m,1H,NH),8.73-8.76(m,1H,NH),9.99(s,1H，苯環-NH),10.28(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)537(M+1)。
實施例14 3-(4-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(800mg,94.1%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(500mg,2.87mmol)和4-氟苯甲酸(400mg,2.86mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)297(M+1)。
實施例15 N-(3-胺基丙基)-4-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-氟苯甲醯胺(400mg,75.2%產率)是由3-(4-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(800mg,2.70mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)197(M+1)。
實施例16 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺(440mg,63.2%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(400mg,2.19mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-氟苯甲醯胺(400mg,2.03mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)343(M+1)。
實施例17 N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟-苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟-苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺(8mg,9.41%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺(60mg,0.17mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)丙烯醯胺(40mg,0.22mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.79-1.83(m,2H,CH2),3.31-3.33(m,2H,CH2),3.49-3.51(m,2H,CH2),5.75(d,J=11.2Hz,1H,CH),6.26(d,J=16.99Hz,1H,CH),6.55-6.62(m,1H,CH),7.11(t,J=9.92Hz,1H,Ar-H),7.22(t,J=5.66Hz,1H，嘧啶-NH),7.28(t,J=8.73Hz,2H,Ar-H),7.47(t,J=4.93Hz,1H, Ar-H),7.88-7.93(m,3H,Ar-H，嘧啶-H),8.31(d,J=5.12Hz,1H,Ar-H),8.50-8.52(m,1H,NH),9.26(s,1H，苯環-NH),9.85(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)487(M+1)。
實施例18 N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺(40mg,52.3%產率)是由2,4-二氯-5-甲基嘧啶(40mg,0.25mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-氟苯甲醯胺(40mg,0.20mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)323(M+1)。
實施例19 4-氟-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體4-氟-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(5mg,8.68%產率)是由N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺(40mg,0.12mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N- 甲基丙烯醯胺(40mg,0.21mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.80-1.83(m,2H,CH2),1.92(s,3H,CH3),3.19(s,3H,CH3),3.30-3.32(m,2H,CH2),3.42-3.44(m,2H,CH2),5.58-5.61(m,1H,CH),6.04-6.11(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),6.72(t,J=5.17Hz,1H,Ar-H),7.21(t,J=9.44Hz,1H，嘧啶-NH),7.28(t,J=8.8Hz,2H,Ar-H),7.66-7.68(m,2H,Ar-H，嘧啶-H),7.88-7.92(m,2H,Ar-H),7.98-7.99(m,1H,Ar-H),8.51(t,J=5.26Hz,1H,NH),9.09(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)481(M+1)。
實施例20 N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(0.26g,72%產率)是由2,4-二氯-5-甲基嘧啶(0.16g,1mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(0.24g,1mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)373(M+1)。
實施例21 N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(0.26g,72%產率)是由N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(75mg,0.2mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(70mg,0.3mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.81-1.87(m,2H,CH2),1.93(s,3H,CH3),3.19(s,3H,CH3),3.36-3.38(m,2H,CH2),3.44-3.46(m,2H,CH2),5.58-5.61(m,1H,CH),6.04-6.11(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),6.73(t,J=5.64Hz,1H,Ar-H),7.21(t,J=9.4Hz,1H，嘧啶-NH),7.66-7.68(m,2H,Ar-H，嘧啶-H),7.84(d,J=8.3Hz,2H,Ar-H),7.98-8.00(m,1H,Ar-H),8.03(d,J=8.1Hz,2H,Ar-H),8.71-9.74(m,1H,NH),9.10(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)531(M+1)。
實施例22 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
灰色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(0.23g,42%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺(0.39g,1mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(0.28g,1.5mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.81-1.84(m,2H,CH2),3.31-3.33(m,2H,CH2),3.45-3.47(m,2H,CH2),5.60(d,J=9.6Hz,1H,CH),6.02-6.08(m,1H,CH),6.18(d,J=15.1Hz,1H,CH),7.25-7.29(m,1H,Ar-H),7.61-7.67(m,3H,Ar-H，嘧啶-NH),7.82-7.84(m,3H,Ar-H，嘧啶-H),8.00-8.03(m,3H,Ar-H,NH),8.71(s,1H，苯環-NH),9.71(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)551(M+1)。
實施例23 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺(117mg,40.3%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺(200mg,0.58mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(150mg,0.77mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.78-1.81(m,2H, CH2),3.28-3.29(m,2H,CH2),3.32(s,3H,CH3),3.43-3.45(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.8Hz,1H,CH),6.05-6.09(m,1H,CH),6.15-6.20(m,1H,CH),7.22-7.30(m,4H,Ar-H),7.64-7.66(m,1H，嘧啶-NH),7.87-7.91(m,3H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.50(t,J=5.2Hz,1H,NH),9.43(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)501(M+1)。
實施例24 3-(1-甲基哌啶基-4-甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(1-甲基哌啶基-4-甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(220mg,25.6%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(500mg,2.87mmol)和1-甲基哌啶-4-羧酸(410mg,2.87mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)300(M+1)。
實施例25 N-(3-胺基丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲醯胺(130mg,80.1%產率)是由3-(1-甲基哌啶基-4-甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(220mg,0.74mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)200(M+1)。
實施例26 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-1-甲基哌啶-4-甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-1-甲基哌啶-4-甲醯胺(200mg,79.6%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(130mg,0.71mmol)和N-(3-胺基丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲醯胺(130mg,0.65mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)346(M+1)。
實施例27 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲醯胺(12mg,11.6%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-1-甲基哌啶-4-甲醯胺(80mg,0.23mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(40mg,0.20mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-da)δ 1.52-1.58(m,4H,2×CH2),1.74-1.79(m,2H,CH2),1.96-1.99(m,1H,CH),2.11(s,3H,CH3),3.05-3.12(m,4H,2×CH2),3.13-3.16(m,4H,2×CH2),3.18(s,3H,CH3),5.60(d,J=9.7Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.15-6.21(m,1H,CH),7.25-7.30(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.64-7.69(m,1H,Ar-H),7.76(t,J=5.45Hz,1H,NH),7.84-7.88(m,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),9.43(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)504(M+1)。
實施例28 N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺的製備
黑色固體N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺(20mg,40%產率)是由4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(35mg,0.1mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)丙烯醯胺(22mg,0.12mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.81-1.87(m,2H,CH2),3.30-3.34(m,2H,CH2),3.52-3.57(m,2H,CH2),5.75-5.78(m,1H,CH),6.25-6.30(m,1H,CH),6.59-6.66(m,1H,CH),7.19(t,J=10.48Hz,1H，嘧啶-NH),7.36-7.40(m,1H,Ar-H),7.92-7.97(m,4H,Ar-H),8.11(s,1H，嘧啶-H),8.34(d, J=4.6Hz,1H,Ar-H),8.73(t,J=5.44Hz,1H,NH),9.95(s,1H，苯環-NH),10.05(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)494(M+1)。
實施例29 3-(4-二甲胺基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-二甲胺基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(840mg,91.1%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(500mg,2.87mmol)和4-二甲胺基苯甲酸(475mg,2.87mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)322(M+1)。
實施例30 N-(3-胺基丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺(500mg,86.5%產率)是由3-(4-二甲胺基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(840mg,2.62mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)222(M+1)。
實施例31 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺(700mg,84.3%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(550mg,3.00mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺(500mg,2.26mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)368(M+1)。
實施例32 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺(49mg,58.3%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺(50mg,0,14mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(30mg,0.15mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.74-1.78(m,2H,CH2),2.95(s,6H,2×CH3),3.25-3.60(m,2H,CH2),3.32(s,3H,CH3),3.41-3.43(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.8Hz,1H,CH),6.02-6.09(m,1H,CH),6.16-6.20(m,1H,CH),6.68(d,J=9.8Hz,2H,Ar-H),7.22-7.27(m,1H,Ar-H), 7.31-7.34(m,1H,Ar-H),7.64-7.67(m,1H，嘧啶-NH),7.70(d,J=8.7Hz,2H,Ar-H),7.89-7.90(m,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.14(t,J=5.6Hz,1H,NH),9.43(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)526(M+1)。
實施例33 3-(2,4,6-三氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(2,4,6-三氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(200mg,60.1%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(174mg,1.0mmol)和2,4,6-三氟苯甲酸(176mg,1.0mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)333(M+1)。
實施例34 N-(3-胺基丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺(100mg,43.1%產率)是由3-(2,4,6-三氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(200mg,0.6mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)233(M+1)。
實施例35 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺的製備
黃色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺(120mg,73.6%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(100mg,0.55mmol)和N-(3-胺基丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺(100mg,0.43mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)379(M+1)。
實施例36 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺的製備
黃色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺(80mg,58.3%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺(120mg,0.32mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(110mg,0.56mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.75-1.82(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.25-3.31(m,2H,CH2),3.44-3.45(m,2H,CH2),5.61(d,J=9.5Hz,1H,CH),6.04-6.11(m,1H,CH),6.16-6.22(m,1H,CH),7.22-7.28(m, 4H,Ar-H，嘧啶-NH),7.67-7.69(m,1H,Ar-H),7.87(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.71(t,J=5.4Hz,1H,NH)，9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)537(M+1)。
實施例37 3-(4-甲氧基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-甲氧基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(800mg,90.4%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(500mg,2.87mmol)和4-甲氧基苯甲酸(437mg,2.87mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)309(M+1)。
實施例38 N-(3-胺基丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺(500mg,92.6%產率)是由3-(4-甲氧基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(800mg,2.60mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)209(M+1)。
實施例39 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺(600mg,70.3%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(690mg,3.74mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺(500mg,2.40mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)355(M+1)。
實施例40 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺(10mg,13.9%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺(50mg,0.14mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(30mg,0.15mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.77-1.80(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.28-3.31(m,2H,CH2),3.43-3.45(m,2H,CH2),3.80(s,3H,CH3),5.59(d,J=9.5Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),6.97(d, J=8.7Hz,2H,Ar-H),7.21-7.27(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.65-7.67(m,1H,Ar-H),7.81(d,J=8.7Hz,2H,Ar-H),7.89(d,J=6.4Hz,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.31(t,J=5.2Hz,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)513(M+1)。
實施例41 3-(2-氰基煙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(2-氰基煙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(400mg,91.3%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(250mg,1.44mmol)和6-氰基煙酸(212mg,1.44mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)305(M+1)。
實施例42 N-(3-胺基丙基)-6-氰基煙醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-6-氰基煙醯胺(240mg,89.6%產率)是由3-(2-氰基煙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(400mg,1.32mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)205(M+1)。
實施例43 6-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)煙醯胺的製備
白色固體6-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)煙醯胺(80mg,19.3%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(280mg,1.53mmol)和N-(3-胺基丙基)-6-氰基煙醯胺(240mg,1.18mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)351(M+1)。
實施例44 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-6-氰基煙醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-6-氰基煙醯胺(15mg,17.4%產率)是由6-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)煙醯胺(60mg,0.17mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(46mg,0.24mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.81-1.88(m,2H,CH2),3.21(s,3H,CH3),3.32-3.36(m,2H,CH2),3.46-3.51(m,2H,CH2),5.61(d,J=9.8Hz,1H,CH),6.04-6.1(m,1H,CH),6.17-6.22(m,1H,CH),7.29(t,J=9.3Hz,1H，嘧啶-NH), 7.61-7.62(m,1H,Ar-H),7.78(s,1H,Ar-H),7.83(d,J=5.3Hz,1H,Ar-H),8.06(s,1H，嘧啶-H),8.17(d,J=7.4Hz,1H,Ar-H),8.36-8.41(m,1H,Ar-H),8.89(t,J=5.4Hz,1H,NH),9.09(s,1H,Ar-H),9.85(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)509(M+1)。
實施例45 3-(4-羥基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-羥基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(600mg,71.1%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(500mg,2.87mmol)和4-羥基苯甲酸(440mg,2.87mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)295(M+1)。
實施例46 N-(3-胺基丙基)-4-羥基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-羥基苯甲醯胺(300mg,75.8%產率)是由3-(4-羥基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(600mg,2.04mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)195(M+1)。
實施例47 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-羥基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-羥基苯甲醯胺(200mg,84.3%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(300mg,1.64mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-羥基苯甲醯胺(300mg,1.54mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)341(M+1)。
實施例48 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-羥基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-羥基苯甲醯胺(3mg,1.3%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-羥基苯甲醯胺(200mg,0.47mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(100mg,0.52mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.75-1.81(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.27-3.29(m,2H,CH2),3.42-3.44(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.4Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.20(m,1H,CH),6.78(d,J=7.9Hz,2H,Ar-H), 7.24-7.27(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.67-7.69(m,1H,Ar-H),7.70(d,J=8.1Hz,2H,Ar-H),7.88-7.90(m,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.20(s,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH),9.89(s,1H,OH).LC-MS(m/z)499(M+1)。
實施例49 3-(4-氰基-2-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-氰基-2-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(450mg,70.1%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(348mg,2.0mmol)和4-氰基-2-氟苯甲酸(330mg,2.0mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)322(M+1)。
實施例50 N-(3-胺基丙基)-4-氰基-2-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-氰基-2-氟苯甲醯胺(278mg,90.0%產率)是由3-(4-氰基-2-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(450mg,1.4mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)222(M+1)。
實施例51 4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2-氟苯甲 醯胺的製備
白色固體4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2-氟苯甲醯胺(312mg,67.4%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(238mg,1.3mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-氰基-2-氟苯甲醯胺(278mg,1.26mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)368(M+1)。
實施例52 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基-2-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基-2-氟苯甲醯胺(106mg,49.3%產率)是由4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2-氟苯甲醯胺(150mg,0.41mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(87mg,0.45mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.80-1.83(m,2H,CH2),3.20(s,3H,CH3),3.30-3.31(m,2H,CH2),3.45-3.47(m,2H,CH2),5.61(d,J=9.7Hz,1H,CH), 6.04-6.10(m,1H,CH),6.15-6.21(m,1H,CH),7.20-7.25(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.62-7.65(m,1H,Ar-H),7.75-7.76(m,2H,Ar-H),7.88-7.94(m,2H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.57(s,1H,NH),9.41(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)526(M+1)。
實施例53 3-(4-氰基-3-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-氰基-3-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(462mg,71.9%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(348mg,2.0mmol)和4-氰基-3-氟苯甲酸(330mg,2.0mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)322(M+1)。
實施例54 N-(3-胺基丙基)-4-氰基-3-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-氰基-3-氟苯甲醯胺(275mg,86.5%產率)是由3-(4-氰基-3-氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(462mg,1.44mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)222(M+1)。
實施例55 4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟苯甲醯胺的製備
白色固體4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟苯甲醯胺(340mg,74.6%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(229mg,1.25mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-氰基-3-氟苯甲醯胺(275mg,1.24mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)368(M+1)。
實施例56 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基-3-氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基-3-氟苯甲醯胺(98mg,45.6%產率)是由4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟苯甲醯胺(150mg,0.41mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(87mg,0.45mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.81-1.84(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.33-3.35(m,2H,CH2), 3.45-3.46(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.7Hz,1H,CH),6.02-6.09(m,1H,CH),6.21-6.20(m,1H,CH),7.21-7.25(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.63-7.65(m,1H,Ar-H),7.81-7.89(m,2H,Ar-H),7.95(s,1H，嘧啶-H),8.04-8.12(m,2H,Ar-H),8.76(t,J=5.6Hz,1H,NH),9.45(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)526(M+1)。
實施例57 N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺的製備
黃色固體N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺(100mg,60.6%產率)是由2,4-二氯-5-甲基嘧啶(82mg,0.5mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯甲醯胺(100mg,0.5mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)330(M+1)。
實施例58 4-氰基-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-苯甲醯胺的製備
黑色固體4-氰基-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-苯甲醯胺(10mg,3.3%產率)是由N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺(100mg,0.61mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(128mg,0.66mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.82-1.85(m,2H,CH2),1.92(s,3H,CH3),3.19(s,3H,CH3),3.35-3.37(m,2H,CH2),3.43-3.46(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.8Hz,1H,CH),6.04-6.1(m,1H,CH),6.15-6.20(m,1H,CH),6.68(t,J=5.5Hz,1H,Ar-H),7.19(t,J=9.5Hz,1H，嘧啶-NH),7.65-7.67(m,2H,Ar-H),7.93-7.99(m,5H,Ar-H，嘧啶-H),8.69(t,J=5.5Hz,1H,NH),9.04(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)488(M+1)。
實施例59 N-(3-(2-氯-5-氟嘧啶基-4-胺基)丙基)4-氰基苯甲醯胺的製備
黃色固體N-(3-(2-氯-5-氟嘧啶基-4-胺基)丙基)4-氰基苯甲醯胺(100mg,60.0%產率)是由2,4-二氯-5-氟嘧啶(83mg,0.5mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯甲醯胺(100mg,0.5mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)334(M+1)。
實施例60 4-氰基-N-(3-(5-氟-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺的製備
灰色固體4-氰基-N-(3-(5-氟-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(49mg,58.3%產率)是由N-(3-(2-氯-5-氟嘧啶基-4-胺基)丙基)4-氰基苯甲醯胺(100mg,0.30mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(110mg,0.56mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.84-1.85(m,2H,CH2),3.18(s,3H,CH3),3.33-3.35(m,2H,CH2),3.42-3.43(m,2H,CH2),5.59(d,J=8.6Hz,1H,CH),6.02-6.09(m,1H,CH),6.15-6.20(m,1H,CH),7.20(t,J=9.1Hz,1H，嘧啶-NH),7.47-7.49(m,1H,Ar-H),7.63-7.64(m,1H,Ar-H),7.88-7.89(m,2H,Ar-H),7.92-7.96(m,4H，嘧啶-H,Ar-H),8.68(s,1H,NH)，9.23(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)492(M+1)。
實施例61 3-(2-(4-氰基苯基)乙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(2-(4-氰基苯基)乙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(511mg,80.6%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(348mg,2.0mmol)和2-(4-氰基苯基)乙酸(322mg,2.0mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)318(M+1)。
實施例62 N-(3-胺基丙基)-2-(4-氰基苯基)乙醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-2-(4-氰基苯基)乙醯胺(312mg,89.4%產率)是由3-(2-(4-氰基苯基)乙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(511mg,1.61mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)218(M+1)。
實施例63 2-(4-氰基苯基)-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)乙醯胺的製備
白色固體2-(4-氰基苯基)-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)乙醯胺(360mg,68.9%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(265mg,1.45mmol)和N-(3-胺基丙基)-2-(4-氰基苯基)乙醯胺(312mg,1.44mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)364(M+1)。
實施例64 N-(5-(5-氯-4-(3-(2-(4-氰基苯基)乙醯胺基)丙基胺基)嘧啶基-2-胺基)-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺的製備
白色固體N-(5-(5-氯-4-(3-(2-(4-氰基苯基)乙醯胺基)丙基胺基)嘧啶基-2-胺基)-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(113mg,53.1%產率)是由2-(4-氰基苯基)-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)乙醯胺(150mg,0.41mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(87mg,0.45mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.67-1.72(m,2H,CH2),3.08-3.11(m,2H,CH2),3.18(s,3H,CH3),3.37-3.38(m,2H,CH2),3.52(s,2H,CH2),5.60(d,J=10..2Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.19-7.22(m,1H,Ar-H),7.26(t,J=9.3Hz,1H，嘧啶-NH),7.44(d,J=8.1Hz,2H,Ar-H),7.64-7.66(m,1H,Ar-H),7.74(d,J=8.2Hz,2H,Ar-H),7.88-7.89(m,1H,Ar-H),7.95(s,1H，嘧啶-H),8.13(t,J=5.6Hz,1H,NH),9.39(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)522(M+1)。
實施例65 3-(4-氰基苯磺醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-氰基苯基磺醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(0.25g,73.7%產率)由如下方法製備。4-氰基苯磺醯氯(0.2g,1.0mmol)和N-Boc-1,3-丙二胺(0.18g,1.03mmol)溶於5mL THF中於室溫下攪拌。然後加入DIPEA(0.26g，2.0mmol)室溫反應4小時。LC-MS跟蹤反應。反應結束後倒入飽和的NaHCO3的水溶液中，攪拌析出固體。過濾獲得目標中間體。LC-MS(m/z)340(M+1)。
實施例66 N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯磺醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯磺醯胺(150mg,85.2%產率)是由3-(4-氰基苯磺醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(250mg,0.74mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)240(M+1)。
實施例67 4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯磺醯胺的製備
白色固體4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基) 苯磺醯胺(150mg,61.9%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(128mg,0.7mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-氰基苯磺醯胺(150mg,0.63mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)386(M+1)。
實施例68 N-(5-(5-氯-4-(3-(4-氰基苯磺醯胺基)丙基胺基)嘧啶基-2-胺基)-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺的製備
白色固體N-(5-(5-氯-4-(3-(4-氰基苯磺醯胺基)丙基胺基)嘧啶基-2-胺基)-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺的製備(35mg,30.7%產率)是由4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯磺醯胺(80mg,0.21mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(43mg,0.22mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.63-1.70(m,2H,CH2),2.80-2.85(m,2H,CH2),3.17(s,3H,CH3),3.34-3.35(m,2H,CH2),5.60(d,J=10.3Hz,1H,CH),6.02-6.09(m,1H,CH),6.15-6.20(m,1H,CH),7.13-7.16(m,1H,Ar-H),7.25(t,J=9.4Hz,1H，嘧啶-NH),7.65-7.67(m,1H,Ar-H),7.81-7.82(m,1H,Ar-H),7.88(t,J=5.9Hz,1H,NH),7.91(d,J=8.4Hz,2H,Ar-H),7.94(s,1H，嘧啶-H),8.03(d,J=8.4Hz,2H,Ar-H),9.38(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)544(M+1)。
實施例69 4-氰基-N-(3-羥基丙基)苯甲醯胺的製備
黃色液體4-氰基-N-(3-羥基丙基)苯甲醯胺(400mg,99%產率)是由3-胺基-1-丙醇(150mg,2mmol)和4-氰基苯甲酸(294mg,2mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)205(M+1)。
實施例70 4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-氧基)丙基)苯甲醯胺的製備
黃色固體4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-氧基)丙基)苯甲醯胺(120mg,17%產率)由如下方法製備。4-氰基-N-(3-羥基丙基)苯甲醯胺(408mg,2mmol)溶於3mL DMF中置於冰浴下攪拌，10分鐘後加入NaH(48mg,2mmol)，繼續攪拌，10分鐘後加入2,4,5-三氯嘧啶(366mg,2mmol)撤掉冰浴，室溫反應。LC-MS跟蹤反應。反應結束後倒入200mL鹽水，析出黃色黏稠物，倒掉水層，加入200mL PE超聲，過濾獲得目標中間體。LC-MS(m/z)351(M+1)。
實施例71 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基) 嘧啶基-4-氧基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺的製備
褐色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-氧基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺(20mg,20.0%產率)是由4-氰基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-氧基)丙基)苯甲醯胺(70mg,0.2mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(50mg,0.24mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.98-2.06(m,2H,CH2),3.18(s,3H,CH3),3.40-3.47(m,2H,CH2),4.45-4.51(m,2H,CH2),5.60(d,J=9.5Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.28(t,J=9.4Hz,1H，嘧啶-NH),7.64-7.67(m,1H,Ar-H),7.78-7.80(m,1H,Ar-H),7.93(d,J=8.3Hz,2H,Ar-H),7.98(d,J=8.3Hz,2H,Ar-H),8.32(s,1H，嘧啶-H),8.77(t,J=5.3Hz,1H,NH),9.85(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)509(M+1)。
實施例72 3-(異煙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(異煙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(1.0g,78.0%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(800mg,4.60 mmol)和異煙醯氯(900mg,6.38mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)280(M+1)。
實施例73 N-(3-胺基丙基)-異煙醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-異煙醯胺(180mg,28.1%產率)是由3-(異煙醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(1.0g,3.58mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)180(M+1)。
實施例74 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)異煙醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)異煙醯胺(120mg,32.8%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(276mg,1.51mmol)和N-(3-胺基丙基)-異煙醯胺(180mg,1.00mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)326(M+1)。
實施例75 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)異煙醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)異煙醯胺(4.2mg,2.3%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)異煙醯胺(120mg,0.36mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(70mg,0.36mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.80-1.84(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.26-3.33(m,2H,CH2),3.45-3.47(m,2H,CH2),5.59(d,J=10.1Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.15-6.20(m,1H,CH),7.23-7.27(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.64-7.66(m,1H,Ar-H),7.72(d,J=5.6Hz,2H,Ar-H),7.89(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),7.70(d,J=5.5Hz,2H,Ar-H),8.73(s,1H,NH)，9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)484(M+1)。
實施例76 3-(4-乙基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-乙基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(800mg,91.1%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(500mg,2.87mmol)和4-乙基苯甲醯氯(530mg,3.15mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)307(M+1)。
實施例77 N-(3-胺基丙基)-4-乙基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-乙基苯甲醯胺(300mg,55.7%產率)是由3-(4-乙基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(800mg,2.61mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)207(M+1)。
實施例78 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-乙基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-乙基苯甲醯胺(500mg,97.5%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(300mg,1.64mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-乙基苯甲醯胺(300mg,1.46mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)353(M+1)。
實施例79 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-乙基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-乙基苯甲醯胺(86mg,59.4%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-羥基苯甲醯胺(100mg,0.28mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(71mg,0.37mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.19(t,J=7.6Hz,3H,CH3),1.78-1.81(m,2H,CH2),2.62-2.67(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.30-3.33(m,2H,CH2),3.44-3.45(m,2H,CH2),5.59(d,J=10.1Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.22-7.29(m,4H,Ar-H，嘧啶-NH),7.65-7.67(m,1H,Ar-H),7.76(m,J=8.0Hz,2H,Ar-H),7.89(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.37(t,J=5.5Hz,1H,NH),9.39(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)511(M+1)。
實施例80 3-(4-甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(0.45g,79%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(0.3g,1.95mmol)和4-甲基苯甲醯氯(0.34g,1.95mmol)按照實 施例76中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)293(M+1)。
實施例81 N-(3-胺基丙基)-4-甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-甲基苯甲醯胺(290mg,99%產率)是由3-(4-甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(450mg,1.54mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)193(M+1)。
實施例82 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲基苯甲醯胺(400mg,78.1%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(300mg,1.64mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-甲基苯甲醯胺(290mg,1.51mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)339(M+1)。
實施例83 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲基苯甲醯胺(200mg,34.2%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲基苯甲醯胺(400mg,1.18mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(400mg,2.06mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.76-1.83(m,2H,CH2),2.34(s,3H,CH3),3.19(s,3H,CH3),3.29-3.33(m,2H,CH2),3.44-3.45(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.7Hz,1H,CH),6.03-6.10(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.22-7.26(m,4H,Ar-H，嘧啶-NH),7.65-7.67(m,1H,Ar-H),7.74(d,J=8.0Hz,2H,Ar-H),7.89(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.38(t,J=5.4Hz,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)497(M+1)。
實施例84 3-苯甲醯胺基丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-苯甲醯胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(700mg,88.3%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(400mg,2.85mmol)和苯甲醯氯(500mg,3.57mmol)按照實施例76中的 類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)279(M+1)。
實施例85 N-(3-胺基丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)苯甲醯胺(375mg,80.4%產率)是由3-苯甲醯胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(700mg,2.62mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)179(M+1)。
實施例86 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(556mg,81.7%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(550mg,3.00mmol)和N-(3-胺基丙基)苯甲醯胺(375mg,2.1mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)325(M+1)。
實施例87 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(245mg,42.8%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(400mg,1.23mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(280mg,1.44mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.79-1.83(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.31-3.34(m,2H,CH2),3.44-3.46(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.8Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.22-7.27(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.45(d,J=7.5Hz,2H,Ar-H),7.52(t,J=7.1Hz,1H,Ar-H),7.65-7.67(m,1H,Ar-H),7.83(d,J=5.2Hz,2H,Ar-H),7.89(d,J=7.4Hz,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.46(t,J=5.2Hz,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)483(M+1)。
實施例88 3-(3-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(3-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(640mg,79.7%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(400mg,2.32mmol)和3-三氟甲基苯甲醯氯(596mg,2.87mmol)按照實施例76中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)347(M+1)。
實施例89 N-(3-胺基丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺(300mg,66.0%產率)是由3-(3-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(640mg,1.84mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)247(M+1)。
實施例90 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺(480mg,93.2%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(360mg,2.21mmol)和N-(3-胺基丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺(300mg,1.47mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)393(M+1)。
實施例91 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺(240mg,35.7%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺(480mg,1.22mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(260mg,1.34mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.80-1.87(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.32-3.37(m,2H,CH2),3.44-3.48(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.6Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.21-7.25(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.65-7.67(m,1H,Ar-H),7.71(t,J=7.8Hz,1H,Ar-H),7.88-7.90(m,2H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.14(d,J=7.9Hz,1H,Ar-H),8.16(s,1H,Ar-H),8.72(t,J=5.4Hz,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)551(M+1)。
實施例92 3-(3-氰基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(3-氰基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(740mg,80.6%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(600mg,3.44mmol)和3-氰基苯甲醯氯(500mg,3.02mmol)按照 實施例76中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)304(M+1)。
實施例93 N-(3-胺基丙基)-3-氰基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-3-氰基苯甲醯胺(300mg,86.5%產率)是由3-(3-氰基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(740mg,2.62mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)204(M+1)。
實施例94 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氰基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氰基苯甲醯胺(460mg,89.4%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(360mg,2.21mmol)和N-(3-胺基丙基)-3-氰基苯甲醯胺(300mg,1.47mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)350(M+1)。
實施例95 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氰基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氰基苯甲醯胺(210mg,31.8%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氰基苯甲醯胺(460mg,1.31mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(280mg,1.44mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.80-1.86(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.31-3.35(m,2H,CH2),3.44-3.48(m,2H,CH2),5.59(d,J=10.2Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.21-7.26(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.64-7.66(m,1H,Ar-H),7.68-7.70(m,1H,Ar-H),7.89-7.90(m,1H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),7.98(d,J=7.7Hz,1H,Ar-H),8.13(d,J=7.9Hz,1H,Ar-H),8.24(s,1H,Ar-H),8.66(t,J=5.7Hz,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)508(M+1)。
實施例100 3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
黃色固體3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(728mg,100%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸 叔丁酯(348mg,2mmol)和3-氟-4-三氟甲基苯甲酸(416mg,2mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)365(M+1)。
實施例101 N-(3-胺基丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺(264mg,50%產率)是由3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(728mg,2mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)265(M+1)。
實施例102 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
黃色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺(200mg,49%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(183mg,1.00mmol)和N-(3-胺基丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺(264mg,1.00mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)411(M+1)。
實施例103 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基) 嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺(50mg,20%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺(205mg,0.5mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(110mg,0.6mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.81-1.86(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.32-3.36(m,2H,CH2),3.45-3.47(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.4Hz,1H,CH),6.02-6.09(m,1H,CH),6.15-6.20(m,1H,CH),7.20-7.24(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.64-7.66(m,1H,Ar-H),7.83-7.92(m,4H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.75(t,J=5.2Hz,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)569(M+1)。
實施例104 3-(2,3,4,5-四氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(2,3,4,5-四氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸 叔丁酯(400mg,57.1%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(348mg,2.00mmol)和2,3,4,5-四氟苯甲醯氯(848mg,4.00mmol)按照實施例76中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)351(M+1)。
實施例105 N-(3-胺基丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺(250mg,100%產率)是由3-(2,3,4,5-四氟苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(350mg,1.00mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)251(M+1)。
實施例106 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺(200mg,50%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(183mg,1.00mmol)和N-(3-胺基丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺(250mg,1.00mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)397(M+1)。
實施例107 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺(50mg,18%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺(200mg,0.5mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(110mg,0.6mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.79-1.82(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.28-3.30(m,2H,CH2),3.44-3.46(m,2H,CH2),5.60(d,J=9.8Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.21(m,1H,CH),7.23-7.27(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.56-7.61(m,1H,Ar-H),7.65-7.67(m,1H,Ar-H),7.88(d,J=5.4Hz,1H,Ar-H),7.95(s,1H，嘧啶-H),8.52(s,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)555(M+1)。
實施例108 3-(4-乙醯基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-乙醯基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁 酯(385mg,60.2%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(350mg,2.01mmol)和4-乙醯基苯甲酸(328mg,2.00mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)321(M+1)。
實施例109 4-乙醯基-N-(3-胺基丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體4-乙醯基-N-(3-胺基丙基)苯甲醯胺(200mg,75.8%產率)是由3-(4-乙醯基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(385mg,1.20mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)221(M+1)。
實施例110 4-乙醯基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體4-乙醯基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(120mg,36.1%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(180mg,0.98mmol)和4-乙醯基-N-(3-胺基丙基)苯甲醯胺(200mg,0.91mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)367(M+1)。
實施例111 4-乙醯基-N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺的製備
白色固體4-乙醯基-N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(83mg,47.9%產率)是由4-乙醯基-N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺(120mg,0.33mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(70mg,0.36mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.79-1.85(m,2H,CH2),2.61(s,3H,CH3),3.19(s,3H,CH3),3.32-3.36(m,2H,CH2),3.45-3.48(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.9Hz,1H,CH),6.02-6.09(m,1H,CH),6,15-6.20(m,1H,CH),7.21-7.28(m,2H，嘧啶-NH,Ar-H),7.64-7.69(m,1H,Ar-H),7.88-7.89(m,1H,Ar-H),7.94(d,J=8.3Hz,2H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.01(d,J=8.4Hz,2H,Ar-H),8.65(t,J=5.3Hz,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)525(M+1)。
實施例112 3-(4-二氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體3-(4-二氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(780mg,84.3%產率)是由3-胺基丙基胺基甲酸叔丁酯(490mg,2.82mmol)和4-二氟甲基苯甲酸(485mg,2.82mmol)按照實施例4中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)329(M+1)。
實施例113 N-(3-胺基丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-胺基丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺(180mg,33.2%產率)是由3-(4-二氟甲基苯甲醯胺基)丙基胺基甲酸叔丁酯(780mg,2.38mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)229(M+1)。
實施例114 N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺(250mg,84.5%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(180mg,0.98mmol)和N-(3-胺基丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺(180mg,0.79mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)375(M+1)。
實施例115 N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺(26mg,23.2%產率)是由N-(3-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺(80mg,0.21mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(50mg,0.26mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.81-1.84(m,2H,CH2),3.19(s,3H,CH3),3.32-3.40(m,2H,CH2),3.45-3.47(m,2H,CH2),5.59(d,J=9.4Hz,1H,CH),6.03-6.09(m,1H,CH),6.16-6.20(m,1H,CH),6.94(s,0.4H,CHF2),7.08(s,0.6H,CHF2),7.22-7.26(m,2H,Ar-H，嘧啶-NH),7.64-7.66(m,3H,Ar-H),7.89-7.90(m,1H,Ar-H),7.95(d,J=7.3Hz,2H,Ar-H),7.96(s,1H，嘧啶-H),8.59(s,1H,NH),9.40(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)533(M+1)。
實施例120 6-(4-氰基苯甲醯胺基)己基胺基甲酸叔丁酯的製備
白色固體6-(4-氰基苯甲醯胺基)己基胺基甲酸叔丁酯 (1300mg,73.4%產率)是由6-己基胺基甲酸叔丁酯(1100mg,5.09mmol)和4-氰基苯甲醯氯(900mg,5.45mmol)按照實施例76中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)346(M+1)。
實施例121 N-(6-胺基己基)-4-氰基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(6-胺基己基)-4-氰基苯甲醯胺(700mg,75.6%產率)是由6-(4-氰基苯甲醯胺基)己基胺基甲酸叔丁酯(1300mg,3.76mmol)按照實施例5中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)246(M+1)。
實施例122 4-氰基-N-(6-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)己基)苯甲醯胺的製備
白色固體4-氰基-N-(6-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)己基)苯甲醯胺(80mg,49.7%產率)是由2,4,5-三氯嘧啶(120mg,0.66mmol)和N-(6-胺基己基)-4-氰基苯甲醯胺(100mg,0.41mmol)按照實施例6中的類似步驟製備而成。LC-MS(m/z)392(M+1)。
實施例123 N-(6-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基) 嘧啶基-4-胺基)己基)-4-氰基苯甲醯胺的製備
白色固體N-(6-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)己基)-4-氰基苯甲醯胺(47mg,50.3%產率)是由4-氰基-N-(6-(2,5-二氯嘧啶基-4-胺基)己基)苯甲醯胺(68mg,0.17mmol)和N-(5-胺基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯胺(46mg,0.24mmol)按照實施例7中的類似步驟製備而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ 1.30-1.32(m,4H,2×CH2),1.52-1.56(m,4H,2×CH2),3.19(s,3H,CH3),3.26-3.29(m,2H,CH2),3.36-3.37(m,2H,CH2),5.60(d,J=9.9Hz,1H,CH),6.03-6.10(m,1H,CH),6.17-6.21(m,1H,CH),7.22-7.27(m,2H，嘧啶-NH,Ar-H),7.59-7.61(m,1H,Ar-H),7.93-7.98(m,6H，嘧啶-NH,Ar-H),8.64(s,1H,NH)，9.38(s,1H，苯環-NH).LC-MS(m/z)550(M+1)。
體外生物學評價
本檢測方法用於本發明所述化合物的體外活性評價，包括體外酶學活性評價方法、細胞生長活性評價方法以及細胞內活性評價方法。
本檢測的目的在於綜合評價不同化合物對JAK、ITK、BLK、TBK1及VEGFR等激酶的體外酶學抑制活性特點、亞型選擇性特徵以及對細胞模型的生物學活性影響，包括細胞生長活性以及信號通路調節活性。
實施例A 酶學活性檢測 實驗主要原理
體外酶學活性檢測的基本原理是利用螢光標記的特異性底物，在激酶作用下進行磷酸化，磷酸化底物和非磷酸化底物在不同波長會產生強弱不同的螢光信號(445nm與520nm)。當加入不同測試化合物時，其對激酶活性的抑制體現為底物磷酸化的程度，從而表現出不同的螢光信號，並以此計算化合物對激酶的抑制活性。基本的檢測原理如附圖1所示。
酶學抑制活性檢測利用GST標記的人重組JAKs激酶JAK1/PV4774、JAK2/PV4210、JAK3/PV3855、TYK2/PV4790及其相應的特異性底物Tyr6(Z'-LYTE® Kinase Assay Kit-Tyrosine 6 Peptide，JAK1/PV4122)、Tyr4(Z'-LYTE® Kinase Assay Kit-Tyrosine 4 Peptide，JAK2/PV3193)、Tyr4(Z'-LYTE® Kinase Assay Kit-Tyrosine 4 Peptide，JAK3/PV3193)、Tyr3(Z'-LYTE® Kinase Assay Kit-Tyrosine 4 Peptide，TYK2/PV3192)。檢測試劑均為顯色劑A(Development reagent A，PV3297)。上述所有材料均從Invitrogen公司購買。
實驗主要過程
實驗過程按照檢測試劑使用說明書要求的流程進行(Invitrogen)。流程如下：
(1)實驗準備：按照要求配製激酶反應緩衝液(工作 液)，用激酶反應緩衝液將測試化合物稀釋成不同濃度梯度(對JAK1、JAK2、TYK2檢測，化合物最高濃度均為10μM；對JAK3檢測，化合物最高濃度為1μM)。
(2)酶學反應體系10μL，包含2.5μL測試化合物、5μL激酶反應緩衝液和2.5μL ATP溶液(試劑盒提供)，混勻後，室溫反應1小時。
(3)檢測反應同時設置有對照反應，包括未添加測試化合物的溶劑對照、未添加ATP的陰性對照以及添加磷酸化底物的陽性對照。所有檢測重複3次。
(4)酶學反應結束後，加入5μL預先配製的顯色反應緩衝液，室溫反應1小時。隨後加入5μL終止緩衝液終止反應。
(5)使用螢光檢測儀(Ascent Fluoroskan FL reader，Thermo Labsystems)檢測每孔的螢光信號，激發波長為400nm，檢測的發射波長分別為445nm和520nm。底物磷酸化的比例參照螢光信號強度C445/F520。
(6)測試化合物的酶學抑制率計算公式：抑制率(%)=1-檢測孔底物磷酸化/溶劑對照孔磷酸化率。對不同濃度梯度的測試化合物分別計算出磷酸化抑制率後利用IC50計算器計算酶學半抑制濃度(IC50)。
根據上述實驗方法，以Xeljanz(枸櫞酸托法替尼)為陽性對照化合物，將本發明該化合物進行體外JAKs酶學評價(對JAK3和JAK2檢測，測試化合物濃度為30nM；對JAK1檢測，測試化合物濃度為300nM)。數據小結見下 表(表2)。
aRV=測試化合物/Xeljanz的抑制率比值；ND(沒有資料)
上表資料表明：與陽性對照藥相比，本發明化合物具有選擇性JAK3和/或JAK1激酶抑制活性。
選擇本發明該部分化合物委託Eurofins公司(http：//www.eurofins.com)進行激酶譜篩選(KinaseProfilerTM)和酶學抑制活性(IC50ProfilerTM)測定。完成活性篩選的激酶中除了JAK家族激酶外，還包括多數Group 3F和Group 4激酶(ITK、BLK、TBK1、VEGFRs、ERBBs等)以及血液系統相關激酶(Zhang J.,et al.2009,Nat.Rev.Cancer.,9：28-39)。測試化合物進行激酶譜篩選的濃度為1μM，IC50測定採用9個半對數濃度梯度。實驗檢測按照Eurofins公司的標準實驗流程開展。實驗方法如下：根據不同激酶的反應要求，0.2μL測試化合物(50μM溶於二甲基亞碸DMSO)加入含有特定激酶的反應緩衝液(根據激酶類型不同，緩衝體系分別包含：20mM MOPS,1mM EDTA,0.01% Brij-35,5% Glycerol,0.1% β-mercaptoethanol,1mg/mL BSA或50mM TRIS,0.1mM EGTA,0.1mM Na3VO4,0.1% β-巰基乙醇，1mg/mL BSA)，隨後依次加入終濃度為50μM的激酶特異性底物(不同激酶採用不同底物)、10mM MgAcetate和同位素標記的γ-33P ATP(放射活性約500cpm/pmol)，反應體系總體積為 10μL。室溫孵育40分鐘，以3%磷酸終止反應，隨後轉入濾網式低溫噴霧乾燥設備(P30 filtermat)，以75mM磷酸清洗三次和甲醇清洗一次，乾燥後進行放射活性檢測。具體操作流程參見Eurofins公司提供的標準操作流程：http：//www.eurofins.com/media/9724077/kinaseprofiler_assay_protocol_guide_eurofins_v64.pdf)。數據小結見下表(表3)。
ND(沒有資料)
上表資料表明：(1)本發明部分化合物具有選擇性JAK3及/或JAK1激酶抑制活性。(2)本發明部分化合物對ITK、BLK、TBK1及VEGFR家族中的部分激酶具有抑制活性。
實施例B 細胞生長活性檢測
如前該，JAKs激酶表達分佈具有分佈特異性，除了免疫系統細胞外，在其它細胞類型也有表達。JAK3主要表達於T淋巴細胞，其它亞型的分佈較為廣泛。JAK激酶通過介導不同細胞因子信號，對靶細胞的生長活性具有潛在的影響。JAKs激酶抑制劑通過抑制不同亞型的JAKs，從而對模型細胞的生長可能產生不同的作用效果。
MTS檢測為常規細胞毒檢測方法，其基本原理是活細胞線粒體中的脫氫酶能夠代謝還原黃色的新型甲臢化合物MTS為甲臢，在490nm吸收值(OD)測量的甲臢產物的量直接與培養物中活細胞的數量成正比，因此可根據OD值推測出活細胞的數目，瞭解測試化合物抑制細胞生長或殺傷細胞的能力。
本實驗依據MTS檢測方法利用不同類型的細胞模型評價本發明所述化合物對細胞生長活性的影響，進而瞭解其細胞內的活性特點。
(1)CTLL-2細胞模型 實驗主要原理
JAKs活性對免疫細胞的生長有明顯影響。對於活化增殖的T淋巴細胞，其生長依賴於細胞生長因子受體IL-2以及其下游的JAK1/3激酶活性。
本實驗採用小鼠T淋巴細胞系CTLL-2，該細胞系的增殖生長嚴重依賴於IL-2，通常用於評價外源IL-2的活性效價。通過抑制JAK1/3激酶活性，在體外培養條件下能夠抑制CTLL-2細胞增殖。T淋巴細胞活化增殖也是各種免疫性疾病的重要病理特徵。因此，本模型同時具有病理相關性。
採用MTS檢測方法，通過比較經測試化合物處理後細胞產生吸光度值的變化，來瞭解測試化合物對模型細胞的生長抑制活性，進而評價化合物對JAK1/3通路的潛在抑制活性。
實驗主要過程
MTS按常規實驗操作流程，實驗在96孔板中進行。
模型細胞按照適當的濃度(約20,000個/每孔)接種到96孔培養板中，24小時後加入不同濃度梯度的測試化合物(最高終濃度10μM)，同時設置溶劑對照(DMSO)和陰性對照孔，按照3次重複孔設置。細胞繼續培養24小時後進行檢測。
CTLL-2為懸浮細胞，培養結束後，直接向培養孔中加入20μL預先配製的MTS和PMS混合液(按照20：1的比例混合)，37℃溫箱培養2小時後用酶標儀進行檢測(490nm)。
扣除陰性對照的背景值後，測試化合物對細胞生長的影響，其通過比較測試孔和溶劑對照孔的OD值差異進行計算。對不同濃度梯度的測試化合物分別計算對模型細胞的生長率，並計算其生長半抑制濃度(GI50)。
(2)HeLa和HUVEC細胞模型 實驗主要原理
HeLa細胞為人宮頸癌細胞系，屬於上皮類型腫瘤細胞系；HUVEC為人臍靜脈血管內皮細胞，屬於內皮型原代細胞；這兩種細胞均表達除JAK3以外的其他亞型。
JAK激酶活性變化對除免疫細胞外的其他細胞類型的生長沒有明顯影響，利用上述兩種細胞模型主要評價測試化合物是否存在JAK激酶以外影響細胞生長的其他激酶靶點或者非選擇性的細胞毒作用。
實驗採用培養的細胞模型，與不同濃度的測試化合物 共孵育指定時間後，利用MTS方法檢測測試化合物處理對細胞生長的影響。
實驗主要過程
MTS按常規實驗操作流程，實驗在96孔板中進行。
模型細胞按照適當的濃度(約5000個/每孔)接種到96孔培養板中，24小時後加入不同濃度梯度的測試化合物(最高終濃度40μM，同時設置溶劑對照(DMSO)和陰性對照孔，按照3次重複孔設置。細胞繼續培養72小時後進行檢測。
吸出培養孔中的所有培養液，每孔加入100μL新鮮培養基和20μL預先配製的MTS和PMS混合液(按照20：1的比例混合)，37℃溫箱培養2小時後用酶標儀進行檢測(490nm)。
測試化合物的細胞生長率和GI50的計算方法同上。
根據上述實驗方法，將本發明所述化合物進行細胞學評價(對CTLL-2細胞檢測，測試化合物濃度為300nM；對HeLa和HUVEC細胞檢測，測試化合物濃度為10μM)。數據小結見下表(表4)。
ND(沒有資料)
上表資料表明：本發明部分化合物具有特異性的CTLL-2細胞抑制活性。
根據細胞學實驗方法，以Xeljanz為陽性對照化合物，選擇本發明化合物進行體外JAKs酶學的IC50和對不同細胞株的GI50測定。結果見下表(表5)。
ND(沒有資料)
上表資料表明：與陽性對照藥相比，本發明化合物具有高選擇性的JAK3激酶抑制活性，同時這些化合物還具有很好的特異性CTLL-2的細胞抑制活性。
實施例C 細胞內活性評價
細胞因子、JAK激酶和STAT蛋白信號通路是一個複雜的網路系統，不同的細胞因子通過啟動特定的JAK亞型同源二聚體或不同亞型組成的異源二聚體，進而促進不同STAT蛋白成員的磷酸化。在不同的細胞模型上，利用特定的細胞因子刺激，可以檢測到與相關JAK亞型特定相關的下游STAT磷酸化信號，而JAK抑制劑通過抑制相關激酶的活性而抑制這一通路活性，由此可以評價測試化合物對不同JAK亞型的細胞內抑制活性。
本實驗採用蛋白免疫印跡(WB)方法和流式細胞術，利用U937、THP-1、CTLL-2、UT-7/EPO及活化的人外周血細胞(hPBC)共5種細胞模型，通過比較STATs磷酸化和非磷酸化檢測信號的相對水準評價待測化合物的細胞內活性。本實驗中WB雜交使用的一抗和二抗均從Cell Signaling公司(http：//www.cellsignal.com)購買，流式細胞術使用的螢光標記抗體均從eBiosciences公司(http：//www.ebioscience.com)購買。
實驗主要原理
U937為單核細胞系，細胞因子IFNγ通過啟動JAK1/2異源二聚體而引起下游STAT5a磷酸化，通過抑制JAK1/2活性進而抑制STAT5a磷酸化。基於此，通過檢測STAT5磷酸化水準變化可以評價測試化合物對JAK1/2的細胞內抑制活性。
THP-1為單核細胞系，細胞因子IL-4通過啟動JAK1/3異源二聚體，引起下游STAT6磷酸化，JAK抑制劑化合物通過抑制JAK1/3活性進而抑制STAT6磷酸化。通過檢測STAT6磷酸化水準變化可以評價化合物對JAK1/3的細胞內抑制活性。
CTLL-2為T淋巴細胞系，其增殖生長依賴於細胞因子IL-2，細胞因子IL-2通過啟動JAK1/3異源二聚體，引起下游STAT5磷酸化，JAK抑制劑化合物通過抑制JAK1/3活性進而抑制STAT5磷酸化。通過檢測STAT5磷酸化水準變化可以評價化合物對JAK1/3的細胞內抑制活性。
UT-7/EPO為來自巨細胞白血病患者骨髓經EPO誘導培養後形成的細胞系，其對細胞因子EPO具有明顯反應，EPO信號經由JAK2同源二聚體傳遞，引起下游STAT5磷酸化，JAK抑制劑化合物通過抑制JAK2活性進而抑制STAT5磷酸化。通過檢測STAT5磷酸化水準變化可以評 價化合物對JAK2的細胞內抑制活性。
人外周血細胞(hPBC)經過CD3抗體共刺激活化後形成細胞因子IL-2依賴的增殖，該生長信號通路由JAK1/3異源二聚體介導，并引起下游STAT5磷酸化。通過檢測STAT5磷酸化水準變化可以評價化合物對JAK1/3的細胞內抑制活性。
實驗主要過程 蛋白免疫印跡(WB)
(1)化合物處理：實驗採用6孔板，U937、THP-1細胞分別培養至適當密度，加入不同濃度的測試化合物，過夜培養(16小時)，加入相應的IFNγ、IL-4(10ng/mL)，30分鐘後離心收集相應細胞。
(2)蛋白提取和WB檢測：蛋白提取後定量，蛋白經PAGE電泳後轉膜，WB檢測按照標準實驗流程進行。雜交使用的二抗分別包括STAT5(#9363)、STAT6(#9362)和相應的磷酸化STAT5(#9351)、STAT6(#9361)，按照抗體說明書推薦的方法進行檢測。
(3)信號檢測：雜交信號檢測採用X光片成像，掃描後的灰度信號轉化為數位信號，分別計算磷酸化STATs和STATs的相對信號強度，進而評價化合物對STATs的磷酸化抑制活性。
流式細胞術(FCS)
(1)化合物處理：實驗採用6孔板，THP-1、CTLL-2、UT7/EPO、以及體外活化的志願者外周血細胞(hPBC)分別 培養至適當密度，加入不同濃度的測試化合物，過夜培養(16小時)，加入相應的IFNγ、IL-4、IL-2、EPO(10ng/mL)，30分鐘後離心收集相應細胞。
(2)細胞固定和螢光標記：細胞採用多聚甲醛固定(30分鐘)，隨後以冷凍甲醇進行透膜處理(15分鐘)。細胞以PBS緩衝液清洗後製成懸液，按照100：1的比例加入抗磷酸化STAT5、STAT6抗體(Mouse anti-Human p-STAT5(pY694)-Fluor®488；Mouse anti-Rabbit p-STAT6(pY641)-Fluor®488)，避光孵育30分鐘，以PBS清洗後製成上樣懸液。
(3)流式細胞檢測：檢測採用Guava® easyCyte流式細胞儀，按照儀器說明書進行檢測操作，選定合適的細胞群測量樣品的中位元螢光信號(MFI)，以此為依據，參照實驗中的陰性(未加因子刺激)和陽性對照(加因子刺激和溶劑對照)樣品的信號，分別計算不同化合物處理濃度下磷酸化STATs的相對信號強度，進而計算出評價化合物對STATs磷酸化抑制活性的IC50值。
根據上述實驗方法，選擇本發明化合物進行WB和流式細胞檢測，其中部分化合物對特定細胞模型中的STATs磷酸化抑制IC50值。數據小結見下表(表6)。
ND(沒有資料)
上表資料表明：本發明部分化合物具有細胞內選擇性的JAK3及/或JAK1抑制活性，其與體外酶學評價結果一致。
實施例D 試驗化合物在大鼠膠原蛋白誘發的關節炎(CIA)模型中的影響
目的：本試驗用雞型膠原誘發Wistar大鼠關節炎，體內給予實施例7和實施例22的化合物，通過觀察大鼠關節炎發病指數的變化來評價試驗化合物對大鼠關節炎的治療作用。
實驗動物：36隻雌性Wistar大鼠，開始研究時，重180-200g，購於廣州中山大學動物實驗中心。四組(每組8隻)用於關節炎模型，另有一組(4隻)用作正常對照。
實驗材料：雞II型膠原蛋白，弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)，均購於北京博蕾德科技發展有限公司。陽性對照物：甲胺蝶呤(methotrexat，MTX)隻。
受試藥物：測試化合物實施例7和實施例22。
配製方法：臨用時先配製0.2% CMC-Na+0.1% Tween-80無菌水作為溶劑，加入受試化合物配成所需濃度，超聲混勻即可。
試驗方法：CIA模型：將雞膠原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，在0天於大鼠尾根部皮下注射進行致敏(250μL/隻)，第7天再於尾根部注射(100μL/隻)進行加強免疫。在關節 炎發病(約第13天)後，將大鼠隨機分成4組，每組8隻。於首次免疫後第14天開始給藥，連續給藥14天。肉眼觀察大鼠四肢，對關節炎的嚴重程度進行0-4級評分：0=正常；1=輕微症狀，但踝關節或腕出現紅腫等現象；2=踝關節或腕中度紅腫現象；3=整個爪包括趾(指)在內都嚴重紅腫；4=關節嚴重腫脹並伴有功能障礙；每隻鼠最高評分為16分。同時測量動物後肢足趾部厚度及足容積。
藥物治療：灌服化合物實施例7，40mg/kg，2次/天；灌服化合物實施例22，40mg/kg，2次/天。陽性對照，使用MTX 5mg/kg腹腔注射，每週2次。用灌服溶劑作為陰性對照。給藥後14天與給藥前資料相比，實驗結果見下表(表7)。
實驗結果顯示：
1、與溶劑組比較，灌服化合物實施例7(40mg/kg)時能顯著地抑制大鼠關節炎腫脹程度，各項指標的抑制率均優於陽性對照藥物甲胺蝶呤；灌服化合物實施例22(40mg/kg)對大鼠關節炎發病也有一定抑制作用。
2、甲胺蝶呤給藥組與溶劑組比較，動物體重有所減 輕，反映了甲胺蝶呤對試驗大鼠有一定的毒性。而測試化合物實施例7和22組大鼠體重增加均優於溶劑組，提示化合物實施例7和22不具有明顯毒性，化合物實施例7的綜合藥效/安全性指標優於陽性對照藥物MTX。

Claims (21)

  1. 一種通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽， 式中，R1為鹵素或C1-C6烷基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷基羰基和C1-C6烷基胺基；R3為氫或鹵素；R4為氫或C1-C4烷基；X為NH、O或S；Y為CO或S(O)2；Z為共價鍵、CH2或(CH2)2；n為1到4的整數；環A為苯環、吡啶環或哌啶環。
  2. 如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，其中R1為鹵素或C1-C6烷基； R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或鹵素；R4為氫或甲基；X為NH或O；Y為CO或S(O)2；Z為共價鍵、CH2或(CH2)2；n為1到4的整數；環A為苯環、吡啶環或哌啶環。
  3. 如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，其中R1為鹵素或C1-C6烷基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n為1到4的整數；環A為苯環或吡啶環。
  4. 如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，其中R1為氯、氟或甲基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n為1到4的整數；環A為苯環。
  5. 如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，其中R1為氯；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、二氟甲基、三氟甲基、乙醯基和二甲胺基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n為1到4的整數；環A為苯環。
  6. 如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，其中R1為氯；R2為一個或複數個取代基，選自氰基、氟和三氟甲基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n等於1；環A為苯環。
  7. 如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，其中R1為氯；R2為一個或複數個取代基，選自氰基；R3為氫或氟；R4為甲基；X為NH；Y為CO；Z為共價鍵；n等於1；環A為苯環。
  8. 如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽，其中該通式(I)的化合物選自： N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺；N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟-苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯醯胺；N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟-苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺；4-氟-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺；N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-三氟甲基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氟苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-1-甲基脈啶基-4-甲醯胺；N-(3-(2-(3-丙烯醯胺基-4-氟苯基胺基)-5-氯嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二甲胺基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,4,6-三氟苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲氧基苯甲醯胺； N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-6-氰基煙醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-羥基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-氰基-3-氟苯甲醯胺；4-氰基-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)-5-甲基嘧啶基-4-胺基)丙基)-苯甲醯胺；4-氰基-N-(3-(5-氟-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺；N-(5-(5-氯-4-(3-(2-(4-氰基苯基)乙醯胺基)丙基胺基)嘧啶基-2-胺基)-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯基；N-(5-(5-氯-4-(3-(4-氰基苯基磺醯胺基)丙基胺基)嘧啶基-2-胺基)-2-氟苯基)-N-甲基丙烯醯基；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-氧基)丙基)-4-氰基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-異煙醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-乙基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-甲基苯甲醯胺； N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-三氟甲基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氰基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-2,3,4,5-四氟苯甲醯胺；4-乙醯基-N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)苯甲醯胺；N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)丙基)-4-二氟甲基苯甲醯胺；和N-(6-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯醯胺基)苯基胺基)嘧啶基-4-胺基)己基)-4-氰基苯甲醯胺。
  9. 一種製備如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽的方法，包括使通式(IV)化合物 與通式(V)化合物 在有機溶劑和催化劑作用下反應形成通式(I)化合物，式中R1為鹵素或C1-C6烷基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷基羰基和C1-C6烷基胺基；R3為氫或鹵素；R4為氫或C1-C4烷基；X為NH、O或S；Y為CO或S(O)2；Z為共價鍵、CH2或(CH2)2；n為1到4的整數；環A為苯環、吡啶環或哌啶環。
  10. 如請求項9所記載之製備如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽的方法，其中該催化劑選自三氟乙酸、鹽酸和甲磺酸。
  11. 如請求項9所記載之製備如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽的方法，其中該有機溶劑選自異丙醇和正丁醇。
  12. 一種製備通式(IV)化合物的方法， 包括使通式(III)化合物 與通式(II)化合物 在有機溶劑和鹼的作用下反應形成通式(IV)化合物，式中R1為鹵素或C1-C6烷基；R2為一個或複數個取代基，選自氫、羥基、氰基、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷基羰基和C1-C6烷基胺基；X為NH或O；X1為NH2或OH；Y為CO或S(O)2；Z為共價鍵、CH2或(CH2)2；n為1到4的整數；環A為苯環、吡啶環或哌啶環。
  13. 如請求項12所記載之製備通式(IV)化合物的方法，其中該鹼選自三乙胺和二異丙基乙基胺。
  14. 如請求項12所記載之製備通式(IV)化合物的方法，其中該有機溶劑選自乙醇、甲醇和正丁醇。
  15. 一種用於治療與JAK3及/或JAK1激酶活性異常相關的疾病的藥物組合物，其包含如請求項1所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽作為活性成分以及可藥用載體、輔料或稀釋劑。
  16. 如請求項15所記載之用於治療與JAK3及/或JAK1激酶活性異常相關的疾病的藥物組合物，其為片劑、膠囊、粉劑、糖漿、液劑、懸浮劑、針劑或膏劑的製劑形式。
  17. 一種如請求項1至8中任一項所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽在製備用於藥物之用途，該藥物用於治療自體免疫性疾病、炎症性疾病、癌症、骨髓增生性疾病、骨再吸收疾病或器官移植排斥疾病。
  18. 一種如請求項1至8中任一項所記載之通式(I)的化合物或其立體異構物或藥學上可接受的鹽在製備用於藥物之用途，該藥物用於治療類風濕性關節炎、銀屑病、克羅恩病、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、I型糖尿病、過敏性疾病、慢性阻塞性肺病、哮喘、白血病或淋巴瘤疾病。
  19. 一種如請求項15或16所記載之用於治療與JAK3及/或JAK1激酶活性異常相關的疾病的藥物組合物在製備用於藥物之用途，該藥物用於治療自體免疫性疾病、炎症性疾病、癌症、骨髓增生性疾病、骨再吸收疾病或器官移植排斥疾病。
  20. 一種如請求項15或16所記載之用於治療與JAK3及/或JAK1激酶活性異常相關的疾病的藥物組合物在製備用於藥物之用途，該藥物用於治療類風濕性關節炎、銀屑病、克羅恩病、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、I型糖尿病、過敏性疾病、慢性阻塞性肺病、哮喘、白血病或淋巴瘤疾病。
  21. 如請求項16所記載之用於治療與JAK3及/或JAK1激酶活性異常相關的疾病的藥物組合物，其中該製劑形式的單位劑量為0.0001~200mg。
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