TWI488970B

TWI488970B - 葡萄糖二酸的製造方法

Info

Publication number: TWI488970B
Application number: TW102106172A
Authority: TW
Inventors: Kazunobu Konishi; Shinichi Imazu
Original assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2015-06-21
Also published as: JP6144804B2; US20150010969A1; US9506091B2; TW201339306A; CN104080918A; EP2818552A1; JP2016163587A; JP6012703B2; EP2818552A4; WO2013125509A1; EP2818552B1; JPWO2013125509A1; CN104080918B

Description

葡萄糖二酸的製造方法

本發明係有關在製造葡萄糖二酸中基因重組技術之應用。

葡萄糖二酸(四羥基己二酸)為自古以來在植物或哺乳動物中發現之化合物。

近年來美國國立再生能研究所在對於從生物質(biomass)可製作高附加價值化學產品之報告(非專利文獻1)中列舉將葡萄糖二酸作為前12名以內之化合物。另，該報告對於將葡萄糖二酸作為原料而可調製之葡萄糖二酸衍生物例示有葡萄酸-γ-內酯、葡萄酸-δ-內酯或葡萄酸二內酯等內酯類(可期待作為溶劑之用途)、多羥基聚醯胺類(可期待作為新穎尼龍之用途)等。又，於該報告，對於已知之葡萄糖二酸製造方法，可利用澱粉之硝酸氧化反應、在鹼性漂白劑存在下之觸媒氧化反應。

另，最近根據專利文獻1，揭示可生合成葡萄糖二酸之轉形體。亦即，於該專利文獻中，將各別編碼肌肉肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)、肌肉肌醇加氧酶(MIOX)及糖醛酸脫氫酶(udh)之3個基因轉染(transfect)至大腸桿菌宿主。接著，經此獲得之轉形體在培養基內以0.72至1.13g/L之濃度生產葡萄糖二酸。惟，專利文獻1之發明人等對該專利文獻之轉形體不需導入肌醇單磷酸酯酶(suhB)。

亦即，在將葡萄糖作為基質生合成葡萄糖二酸之途徑，理論上下列5種活性是必要的：活性1：從適當之碳源生成葡萄糖-6-磷酸之活性；活性2：將葡萄糖-6-磷酸轉換為肌肉肌醇-1-磷酸之活性，亦即，肌醇-1-磷酸合成酶活性；活性3：將肌肉肌醇-1-磷酸轉換為肌肉肌醇之活性，亦即，將肌肉肌醇-1-磷酸作為基質之磷酸酯酶活性；活性4：將肌肉肌醇轉換為葡萄糖醛酸之活性，亦即，肌肉肌醇加氧酶活性；及活性5：將葡萄糖醛酸轉換為葡萄糖二酸之活性，亦即，糖醛酸脫氫酶活性。惟，實際上，由於活性1生成物之葡萄糖-6-磷酸為原核微生物普遍生成之代謝中間體，不需在原核微生物賦予該活性。

又，對於活性3，已知不少微生物株表現內生性肌醇單磷酸酯酶，或具有可將肌肉肌醇-1-磷酸作為基質而廣泛使用之單磷酸酯酶活性。因此，亦同意專利文獻1之轉形體不需導入肌醇單磷酸酯酶基因。

惟，專利文獻1之結論為，在以所製造之轉形體之代謝分析為基礎，用於生成葡萄糖二酸之轉形體不需導入肌醇單磷酸酯酶基因。亦即，專利文獻1記載「亦應注意，我們不使suhB基因或相同之磷酸酯酶表現過度。惟，在培養產物中未偵測出肌肉肌醇-1-磷酸，另一方面，肌肉肌醇累積。因此，我們的結論是，磷酸酯酶活性並未限制通過途徑之代謝流量(flux)。」(第33頁，第2行至第5行)。

因此，在用於生合成葡萄糖二酸之轉形體中導入肌醇單磷酸酯酶基因之明確動機不存在。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2009/145838號說明書

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Top Value Added Chemicals from Biomass Volume I-Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas””、http：//www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf、T.Werpy及G.Peterson編，2004年8月發行

本發明要解決的課題為製造具有經有意義改善之葡萄糖二酸生產能之轉形體及其利用。

如上所述，連在已揭示可生合成葡萄糖二酸之轉形體之專利文獻1中，都未在該轉形體中導入肌醇單磷酸酯酶基因，對於該活性亦未特別注意。

惟，與專利文獻1預想的相反，本發明人等發現在用於生合成葡萄糖二酸之轉形體，肌醇單磷酸酯酶活性占有重大的角色。尤其是經由強化肌醇單磷酸酯酶活性，該等轉形體之葡萄糖二酸生產能提昇令人驚愕的數十至數百倍。

因此，本發明之第1方面為：(1)一種葡萄糖二酸之製造方法，上述製造方法包含以下步驟：1)準備帶有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因及糖醛酸脫氫酶基因之轉形體的步驟，該轉形體具有用以誘導在該轉形體內之功能性肌醇單磷酸酯酶生產過剩或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或突變；2)在適合上述轉形體繁殖及/或維持之條件下，將該轉形體與可經由該轉形體轉換為葡萄糖二酸之碳源接觸之步驟；及3)將葡萄糖二酸或葡萄糖二酸鹽從上述2)獲得之培養物中分離之步驟。

更特定的為，在使用帶有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因及糖醛酸脫氫酶基因之轉形體之葡萄糖二酸製造方法中，上述轉形體之特徵為具有誘導功能性肌醇單磷酸酯酶生產過剩或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或突變之轉形體。

於本發明葡萄糖二酸之發酵生產中，較佳為使用包含適合生成肌醇-1-磷酸合成酶(上述之活性2)基質之葡萄糖-6-磷酸之化合物之碳源作為培養基材。因此，本發明之較佳形式為：(2)如上述(1)所述之製造方法，其中，上述碳源包含在上述轉形體內可轉換為葡萄糖-6-磷酸之化合物；及(3)如上述(2)所述之製造方法，其中，上述碳源為1個以上選自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、澱粉、纖維素、米糠、廢糖蜜(molasses)及含有D-葡萄糖之生物質所成群組者。

以大腸桿菌為代表之原核微生物，因其迅速之繁殖能力、發酵管理之容易度，從工業性發酵生產之觀點而言，具有極大的魅力，同時，從基因重組技術適用之實績、經確立之安全性之觀點而言，亦具有優點。又，不具有從葡萄糖經過肌肉肌醇生合成葡萄糖二酸之途徑之多數原核微生物係使用與基因重組技術聯合之合成生物學方法，具有容易控制葡萄糖二酸生產性之優點。尤其是大腸桿菌等原核微生物宿主，由於不具有將作為葡萄糖二酸生合成途徑之中間體之肌肉肌醇合成代謝(anabolism)之能力(分解能)，合成生物學方法之適用更容易。因此，本發明之較佳形式為：(4)如上述(1)至(3)中任何一項所述之製造方法，其中，上述轉形體之特徵為源自不具有肌肉肌醇合成代謝能之微生物；及(5)如上述(1)至(4)中任何一項所述之製造方法，其中，上述轉形體為源自選自由大腸桿菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬細菌所成群組之細菌。

不論宿主微生物是否具有內生性肌醇單磷酸酯酶活性，藉由於該細胞內生產過剩肌醇單磷酸酯酶，可強化該細胞之肌醇單磷酸酯酶活性。適用各種公知之技術，可在細胞中生產過剩肌醇單磷酸酯酶。因此，本發明為以下之形式：(6)如上述(1)至(5)中任何一項所述之製造方法，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩為對上述轉形體經由下列方式誘導者： a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內生性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、c)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區導入突變、d)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區以高表現誘導性外來調控區置換、或e)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區缺失；及(7)如上述(6)所述之製造方法，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩經由對上述轉形體導入外來肌醇單磷酸酯酶基因而誘導者。

又，宿主細胞具有內生性肌醇單磷酸酯酶基因時，根據以下之形式，亦可強化該細胞之肌醇單磷酸酯酶活性。

(8)如上述(1)至(5)中任何一項所述之製造方法，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之活化為對上述轉形體經由下列方式誘導者：f)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因中導入突變、g)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部予以置換、h)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶降低活性之其他蛋白質；j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。

又，本發明亦意圖用於上述葡萄糖二酸之製造方法之轉形體。因此，本發明之第2方面為：(9)一種帶有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因及糖醛酸脫氫酶基因之轉形體，該轉形體具有用以誘導在該轉形體內功能性肌醇單磷酸酯酶生產過剩或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或突變。

更特定的為，在帶有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因及糖醛酸脫氫酶基因之轉形體中，其特徵為具有誘導功能性肌醇單磷酸酯酶生產過剩或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或突變。

又，對於本發明第1方面記載之形式亦適用於本發明之第2方面。該等形式為：(10)如上述(9)所述之轉形體，其中，上述轉形體之特徵為源自不具有肌肉肌醇合成代謝能之微生物；(11)如上述(9)或(10)所述之轉形體，其中，上述轉形體為源自選自由大腸桿菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬細菌所成群組之細菌；(12)如上述(9)至(11)中任何一項所述之轉形體，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩為對上述轉形體經由下列方式誘導者：a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內生性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、c)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區導入突變、d)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區以高表現誘導性外來調控區置換、或e)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區缺失；(13)如上述(12)所述之轉形體，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩為經由對上述轉形體導入外來肌醇單磷酸酯酶基因而誘導者；及 (14)如上述(9)至(11)中任何一項所述之轉形體，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之活化為對上述轉形體經由下列方式誘導者：f)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因中導入突變、g)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部予以置換、h)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質、j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。

根據本發明，可達成經由微生物培養技術，效率化的工業性生產葡萄糖二酸。

第1圖係表示INO1基因之編碼區(序列編號1)。

第2圖係表示suhB基因之編碼區(序列編號3)。

第3圖係表示miox基因之編碼區(序列編號5)。

第4圖係表示udh基因之編碼區(序列編號7)。

本發明之課題經由在帶有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因及糖醛酸脫氫酶基因之轉形體中，強化肌醇單磷酸酯酶活性而解決。

本發明之轉形體可使用各種宿主微生物細胞製造。尤其是將原核微生物作為宿主，由於在該宿主細胞內可建構新的葡萄糖二酸生合成途徑(亦即，不影響既存之內生性途徑)，在合成生物學方法之適用上有極大的魅力。例示之原核微生物為：埃希氏菌(Escherichia )、綠膿桿菌(Pseudomonas )、桿菌(Bacillus )、芽孢桿菌(Geobacillius )、甲烷單胞菌(Methanomonas )、甲基菌(Methylobacillus )、嗜甲基菌(Methylophilus )、精蛋白桿菌(Protaminobacter )、嗜甲烷菌(Methylococcus )、棒狀桿菌(Corynebacterium )、短桿菌(Brevibacterium )、發酵單胞菌(Zymomonas )及李斯特菌(Listeria )屬之細菌。於工業性發酵生產中較佳之原核微生物之非限定例示包含大腸桿菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬細菌。大腸桿菌由於其迅速之繁殖能力或發酵管理容易，為本發明宿主微生物之特佳例。

又，作為本發明宿主細胞而可利用之細胞株，可為通常意思之野生型，或者亦可為營養需求性突變株、抗生素耐性突變株。另，作為本發明宿主細胞而可利用之細胞株，亦可為具有關於如上述之突變之各種標識基因的經轉形者。該等突變或基因在本發明轉形體之製造、維持、管理中可提供有益之性質。較好為經由使用對氯徽素(chloramphenicol)、安比西林(ampicillin)、卡那黴素(kanamycin)、四環素(tetracycline)等抗生素顯示耐性之細胞株，可使本發明之葡萄糖二酸之生產簡便地進行。

於指向合成生物學之本發明中，為了在宿主細胞中建構新的葡萄糖二酸生合成途徑，在宿主細胞未表現內生性肌醇-1-磷酸合成酶之情況中，導入外來肌醇-1-磷酸合成酶基因。又，於本明細書中，所謂的「外來」或「外來性」之用語係用於，在轉形前之宿主微生物不具有經由本發明應導入之基因的情形經由該基因編碼之酶實質上未表現的情形、及根據不同基因將該酶之胺基酸序列編碼，惟，轉形後未表現比得上內生性酶活性的情形，將以本發明為基礎之基因或核酸序列導入宿主之意思。

肌醇-1-磷酸合成酶基因為公知(例如，GenBank Accession Nos.AB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、AF284065、BC111160、L23520、U32511)，該任何一種基因均可在本發明之目的使用。尤其是具有序列編號1表示之編碼化區核苷酸序列之肌醇-1-磷酸合成酶基因可適用於本發明。惟，本發明中可利用之肌醇-1-磷酸合成酶基因不只限於上述者，亦可為源自其他生物者或可為人工合成者，只要是在上述宿主微生物細胞內可表現實質之肌醇-1-磷酸合成酶活性者即可。

因此，可利用於本發明之目的之肌醇-1-磷酸合成酶基因只要是在上述宿主微生物細胞內可表現實質之肌醇-1-磷酸合成酶活性者即可，亦可具有在自然界會發生之所有突變或經人工導入之突變及修飾。例如，編碼特定之胺基酸之各種密碼子(coden)已知有多餘之密碼子(冗餘碼，redundancy)存在。因此，於本發明中，可利用最終轉譯成為同一胺基酸之代替密碼子。亦即，由於基因編碼簡化，為了要將某一特定胺基酸編碼而可使用複數之密碼子，因此，胺基酸序列可以任意1組合之類似DNA寡核苷酸編碼。雖然只有該組合之唯一成員與天然型酶之基因序列相同，但即使是不匹配(mismatch)之DNA寡核苷酸，在適當之緊縮條件下(例如，3xSSC、於68℃雜交、2xSSC、以0.1%SDS及於68℃洗浄)，可在天然型序列中雜交，可將天然型序列編碼之DNA鑑定、分離，另，該等基因亦可利用於本發明。尤其是，已知大部分之生物優先使用特定密碼子(最適合之密碼子)之子集(subset)(Gene、Vol.105、第61-72頁、1991等)、依據宿主微生物所進行之「編碼最適化」於本發明亦有用。

惟，業者應了解於本發明中，經由將肌醇-1-磷酸合成酶基因作為「表現匣」(expression cassatte)而導入宿主微生物細胞內，可獲得更安定、高水平之肌醇-1-磷酸合成酶活性。於本說明書中，「表現匣」意指包含將表現對象之核酸或在表現對象之基因中功能性結合之轉錄及翻譯而調控之核酸序列之核苷酸。典型上，本發明之表現匣包含從編碼序列於5’上流為啟動子序列、於3’下流為終止序列，且根據情況復將通常之調控元件(element)功能性結合之狀態，於該等情況，表現對象之核酸或表現對象之基因在宿主微生物中「可表現導入」。

啟動子(promoter)之定義為不論是構造性啟動子或是調控性啟動子，將RNA聚合酶結合於DNA而開始RNA合成之DNA序列。強啟動子為使mRNA合成以高頻率開始之啟動子，亦適用於本發明中。對於lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌體之主要操作子(operator)及啟動子區、fd編碼蛋白質之調控區、糖解系酶(例如，3-磷酸甘油激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、麩胺酸脫羧酶A、絲胺酸羥甲基轉移酶之啟動子等，可依據其宿主細胞之性質等利用。除了啟動子及終結子(terminator)序列之外，可作為其他調控元件之例列舉有選擇標識、增幅信號、複製起點等。較佳之調控序列記載於例如“Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185”、Academic Press(1990)。

將上述說明之表現匣組合至由例如質體、噬菌體、轉位子(transposon)、IS元件(insertion sequence element)、尾感器(phasmid)、黏質體(cosmid)或由線狀或環狀DNA等形成之載體，並***宿主微生物中。較佳為質體及噬菌體。該等載體可為在宿主微生物中自行複製者，亦可經由染色體複製。較佳之質體為例如大腸桿菌之pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λ g t11或pBdCI；桿菌之pUB110、pC194或pBD214；棒狀桿菌屬之pSA77或pAJ667等。其他亦可使用之質體等記載於“Cloning Vectors”、Elsevier、1985。載體中導入表現匣可經由包含經適當之限制酶切出、選殖及黏合(ligation)之慣用方法。

經由上述操作建構具有本發明表現匣之載體後，將該載體導入宿主微生物中時適用之方法係使用，例如共沈澱、原生質體融合、電穿孔法、反轉錄病毒轉染等慣用之選殖法及轉染法。該等例記載於「分子生物學之最新實驗步驟(Current Protocols in Molecular Biology)」、F.Ausubel人等、Publ.Wiley Interscience、New York、1997或Sambrook人等「分子選殖：實驗室手冊」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989。

令人驚訝的是本發明人等發現，在不具有內生性葡萄糖二酸生合成途徑之宿主微生物內導入葡萄糖二酸生合成途徑獲得之轉形體中，肌醇單磷酸酯酶活性扮演重大的角色。如上所述，至今之任何研究對於肌醇單磷酸酯酶活性沒有特別的注意。惟，未預期的，經由強化肌醇單磷酸酯酶活性，大幅度提昇該等轉形體之葡萄糖二酸生產能。

因此，本發明之一形式包含在帶有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因及糖醛酸脫氫酶基因之轉形體中生產過剩肌醇單磷酸酯酶。

本發明意圖之肌醇單磷酸酯酶，除了對於肌醇-1-磷酸顯示高基質專一性之外，亦包含經由顯示對於廣泛之基質可作用之磷酸單酯水解酶活性，可將肌醇-1-磷酸實質水解化之蛋白質。典型之肌醇單磷酸酯酶已知例如肌醇-1-單磷酸酯酶，多數源自生物之該基因(suhB基因)發表於GenBank Accession Nos.ZP_04619988、YP_001451848等。尤其是使用源自大腸桿菌之suhB基因(序列編號3：AAC75586(MG1655))在將大腸桿菌作為宿主細胞時為便利。

本發明之轉形微生物應具有之下一個活性為肌肉肌醇加氧酶活性。該酶典型的經由以下之反應，將肌肉肌醇轉換為葡萄糖二酸。

已知各種肌肉肌醇加氧酶基因且可利用。例如，於 WO2002/074926號說明書揭示源自隱球菌(Cryptococcus )及人類之肌肉肌醇加氧酶基因及其異種之表現。其他亦有於專利文獻1揭示之肌肉肌醇加氧酶基因可使用於本發明。另，已知例如以下之賦予GenBank Accession編號之源自多數生物之肌肉肌醇加氧酶基因可用於本發明。

Accession No.AY738258(人類肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

Accession No.NM101319(***芥(Arabidopsis thaliana )肌醇加氧酶1(MIOX1))

Accession No.NM001101065(歐洲牛(Bos taurus )肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

Accession No.NM001030266(斑馬魚(Danio rerio )肌肉肌醇加氧酶(miox))

Accession No.NM214102(山豬(Sus scrofa )肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

Accession No.AY064416(人類肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

Accession No.NM001247664(蕃茄(Solanum lycopersicum )肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

Accession No.XM630762(黏菌(Dictyostelium discoideum )AX4肌醇加氧酶(miox))

Accession No.NM145771(褐鼠(Rattus norvegicus) 肌肉肌醇加氧酶(Miox))

Accession No.NM017584(人類肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

Accession No.NM001131282(蘇門答臘猩猩(Pongo abelii )肌肉肌醇加氧酶(MIOX))

尤其是序列編號5表示之具有編碼化區核苷酸序列之miox基因之使用為便利。

本發明之轉形微生物應具有之最後之生物活性為糖醛酸脫氫酶活性。該酶典型的經由以下之反應，在NAD⁺ 存在下將葡萄糖醛酸轉換為葡萄糖二酸。

已知各種糖醛酸脫氫酶基因且可利用。例如於專利文獻1記載之綠膿桿菌或農桿菌(Agrobacterium )屬細菌之糖醛酸脫氫酶亦可使用於本發明。另，已知例如以下之賦予GenBank Accession編號之udh基因可用於本發明。

Accession No.BK006462(根瘤土壤桿菌種(Agrobacterium tumefaciens str. C58)糖醛酸脫氫酶(udh)基因)

Accession No.EU377538(假單孢菌蕃茄葉致病種(Pseudomonas syringae pv.tomato str. DC3000)糖醛酸脫氫酶(udh)基因)

尤其是序列編號7表示之具有編碼化區核苷酸序列之udh基因之使用為便利。

於肌醇-1-磷酸合成酶基因記載之突變或修飾及密碼子最適化及表現匣、啟動子等之調控序列及質體等與經由此轉形之說明，係適用於所有本發明之肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因及糖醛酸脫氫酶基因，該業者應該可容易理解。因此，本發明之轉形體可帶有4個表現匣：包含將肌醇-1-磷酸合成酶編碼之核酸之表現匣、包含將肌醇單磷酸酯酶編碼之核酸之表現匣、包含將肌肉肌醇加氧酶編碼之核酸之表現匣及包含將糖醛酸脫氫酶編碼之核酸之表現匣。較佳之本發明之轉形體帶有包含具有序列編號1表示之核苷酸序列之核酸之表現匣、包含具有序列編號3表示之核苷酸序列之核酸之表現匣、包含具有序列編號5表示之核苷酸序列之核酸之表現匣及包含具有序列編號7表示之核苷酸序列之核酸之表現匣。

上述4個表現匣可配置於1個載體上而轉染至宿主微生物。或是將配置其中之任意2個以上之表現匣之載體與配置剩餘表現匣之載體共同轉染至宿主微生物中，亦可將配置各個表現匣之4個載體共同轉染至宿主微生物中。另，亦可將上述4個表現匣中之任意1個以上組合至宿主微生物之基因組中，且剩餘之表現匣作為質體存在於該轉形體內。例如，對大腸桿菌AKC-018株(作為FERM P-22181，於2011年10月25日寄託於獨立行政法人產業技術總合研究所特許生物寄託中心。)，其染色體上具有包含肌醇-1-磷酸合成酶編碼化核酸(INO1)之表現匣及包含將肌醇單磷酸酯酶編碼之核酸(suhB)之表現匣兩者，亦可轉染配置包含將肌肉肌醇加氧酶編碼之核酸之表現匣及包含將葡萄糖二酸脫氫酶編碼之核酸之表現匣之質體。

另，多數微生物細胞被認為表現著本發明意圖之肌醇單磷酸酯酶活性(亦即，具有將肌醇單磷酸酯酶編碼之內生性基因)。因此，本發明中肌醇單磷酸酯酶之生產過剩亦可經由誘導增加內生性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數；在內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區導入突變；將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區以高表現誘導性外來調控區置換；及使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區缺失。具體而言，為了達成肌醇單磷酸酯酶之過剩表現，可以下列方式達成：經由包含內生性肌醇單磷酸酯酶基因、或經由包含在該內生性基因編碼化區中附加適當調控區之表現匣之建構物，將上述宿主微生物轉形，使在該轉形體內之該肌醇單磷酸酯酶基因複製數與原本之宿主細胞相比實質性增加、或關於具有內生性肌醇單磷酸酯酶基因之原本宿主細胞，將染色體之突變、附加及缺失經由公知之基因重組技術實施、或使用突變劑等在染色體任意地進行突變導入。肌醇單磷酸酯酶生產過剩之確認可使用公知之SDS-PAGE分析法等。

另，為了將肌醇單磷酸酯酶活性強化之本發明之另一形式包含在宿主微生物細胞中誘導肌醇單磷酸酯酶活化。為了其目的，可例示1)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因導入突變、2)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部置換、3)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、4)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質及/或5)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物生成之方法。

關於上述為了將肌醇單磷酸酯酶活性強化之1)至5)之方法，具體而言，在肌醇單磷酸酯酶之基因實施突變、附加或缺失後評估將該基因編碼之肌醇單磷酸酯酶之活性，可獲得肌醇單磷酸酯酶活性經強化之肌醇單磷酸酯酶。

如上操作獲得之轉形體為了生產本發明之葡萄糖二酸，在適合繁殖及/或維持上述轉形體之條件下培養及維持。用於源自各種宿主微生物細胞之轉形體之適當培養基組成、培養條件、培養時間於業者為公知。

培養基可為1個以上之碳源、氮源、無機鹽、維生素及根據情況含有微量元素或維生素等微量成分之天然、半合成、合成培養基。惟，使用之培養基並非一定要適當滿足培養轉形體之營養需求。另，為了將上述轉形體與經由該轉形體可變換為葡萄糖二酸之碳源接觸，本發明之培養基應含有最終可作為葡萄糖二酸生產之基質利用之碳源，亦即轉形體內可轉換為葡萄糖 -6-磷酸之化合物。碳源可為D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、澱粉、纖維素、米糠、廢糖蜜，另，可為含有D-葡萄糖之生物質。較佳之生物質可例示玉蜀黍分解液或纖維素分解液。又，培養基在轉形體表現有用之附加性質時，例如具有對於抗生素耐性之標識時，可包含對應之抗生素。經由此可降低因發酵中之雜菌污染之風險。

上述宿主微生物不能將纖維素或多糖類等碳源合成代謝時，藉由在該宿主微生物實施導入外來基因等公知之基因工學方法，可適用於使用該等碳源之葡萄糖二酸生產。外來基因可列舉例如纖維素酶基因或澱粉酶基因等。

培養可為分批式，亦可為連續式。又，於任何一種情況，亦可為在培養之適當時間點補給追加之上述碳源等之形式。另，培養應邊維持適合之溫度、氧濃度、pH等邊繼續培養。源自通常之微生物宿主細胞之轉形體之適當培養溫度通常在15℃至45℃、較好25℃至37℃之範圍。宿主微生物為好氧性時，為了確保發酵中適當之氧濃度，必須進行振盪(燒瓶培養等)、攪拌/通氣(小型發酵罐(jar fermentor)培養等)。該等培養條件係業者可容易地設定。

經由將業者公知之方法組合，可將葡萄糖二酸從上述之培養物中精製。例如，為了該目的，有用之葡萄糖二酸之偵測或定量方法具體記載於專利文獻1。

將以上之說明提供給業者，可充分實施本發明。以下，以進一步說明為目的提供實施例，因此，本發明並非受限於於該等實施例。又，於本說明書若無特別說明，核苷酸序列係從 5’向3’之方向記載。

[實施例] 實施例1：質體之建構

1-a)肌醇單磷酸酯酶表現匣

於37℃，將大腸桿菌株W3110(NBRC 12713)在LB培養基中(2ml)振盪培養。培養完成後，將菌體從培養液回收，使用Nucleo Spin Tissue(商品名，MACHEREY-NAGEL公司製造)將基因組(genome)DNA萃取。萃取之基因組DNA用為模板，經由以下之引子進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(商品名，Takara Bio公司製造)，反應條件：98℃歷時10秒，55℃歷時5秒，72℃歷時20秒，28個循環)而將suhB基因之編碼區(序列編號3)選殖。

所獲得之suhB編碼區可轉錄***下述序列之啟動子下游。

亦即，在質體pNFP-A51(作為FERM AP-22182於2011年10月25日寄託於獨立行政法人產業技術總合研究所特許生物寄託中心)之多重選殖位中***終結子序列及上述啟動子序列。在導入之啟動子序列之下游黏合以上述方式選殖之suhB編碼區，建構pNFP-A54。將建構之pNFP-A54經由氯化鈣法(參照羊土社基因工學實驗摘記上田村隆明著)轉染至大腸桿菌AKC-016株(作為FERM P-22104，於2011年4月20日寄託於獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄託中心。)。經由SDS-PAGE確認在該大腸桿菌可溶性區分中之肌醇單磷酸酯酶高表現。

1-b)肌醇-1-磷酸合成酶表現匣

將菌體從酒精酵母之培養液中回收，使用Nucleo Spin Tissue(商品名，MACHEREY-NAGEL公司製造)將基因組DNA萃取。萃取之基因組DNA用於模板，經由以下之引子進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(商品名，Takara Bio公司製造)，反應條件：98℃歷時10秒，55℃歷時5秒，72℃歷時20秒，28個循環)，而將INO1基因之編碼區(序列編號1)選殖。

所獲得之INO1編碼領域可轉錄***下述序列之啟動子之下游。

亦即，在質體pNFP-A51之多重選殖位中***終結子序列及上述啟動子序列。在導入之啟動子序列之下游黏合以上述方式選殖之INO1編碼區，建構pNFP-D78。將建構之pNFP-D78經由氯化鈣法(參照羊土社基因工學實驗摘記上田村隆明著)轉染至大腸桿菌AKC-016株(作為FERM P-22104，於2011年4月20日寄託於獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄託中心。)。經由SDS-PAGE確認在該大腸桿菌可溶性區分中之肌醇-1磷酸合成酶之高表現。

1-c)肌肉肌醇加氧酶表現匣

肌肉肌醇加氧酶(miox)基因可由將具有序列編號5之核苷酸序列之DNA經由人工合成製造，將該DNA用作模板，經由以下之引子進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(商品名，Takara Bio公司製造)，反應條件：98℃歷時10秒，55℃歷時5秒，72℃歷時20秒，28個循環)而獲得。

所獲得之miox編碼區可轉錄***序列編號11之啟動子之下游。亦即，在上述pNFP-A51之多重選殖位中***終結子序列及上述啟動子序列。在導入之啟動子序列之下游黏合以上述方式選殖之miox編碼區，建構pNFP-H26。將建構之pNFP-H26經由氯化鈣法(參照羊土社基因工學實驗摘記上田村隆明著)轉染至大腸桿菌株FERM P-22104。經由SDS-PAGE確認在該大腸桿菌可溶性區分中之肌肉肌醇加氧酶之高表現。

1-d)糖醛酸脫氫酶表現匣

糖醛酸脫氫酶(udh)基因可由將具有序列編號7之核苷酸序列之DNA經由人工合成製造，將該DNA用作模板，經由以下之引子進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(商品名，Takara Bio公司製造)，反應條件：98℃歷時10秒，55℃歷時5秒，72℃歷時20秒，28個循環)而獲得。

所獲得之udh編碼區可轉錄***序列編號11之啟動子之下游。亦即，在上述pNFP-A51之多重選殖位中***終結子序列及上述啟動子序列。在導入之啟動子序列之下游黏合以上述方式選殖之udh編碼區，建構pNFP-H45。將建構之pNFP-H45經由氯化鈣法(參照羊土社基因工學實驗摘記上田村隆明著)轉染至大腸桿菌株FERM P-22104。經由SDS-PAGE確認在該大腸桿菌可溶性區分中之糖醛酸脫氫酶之高表現。

1-e)用於轉形之質體之建構

將以上述方式製造之pNFP-D78以Sal I切割(digest)，使其成為平滑末端(bluent end)及將5’末端去磷酸化。將pNFP-A54中之suhB表現匣選殖，黏合於pNFP-D78。獲得與pNFP-D78中之INO1表現匣同方向之黏合suhB表現匣之pNFP-G22。接著，將pNFP-G22以Sal I切割，使其成為平滑末端及將5’末端去磷酸化。將實施例1中製造之pNFP-H26中之miox表現匣及pNFP-H45中之udh表現匣選殖，將兩個表現匣黏合於pNFP-G22。獲得與pNFP-G22中之INO1表現匣及suhB表現匣同方向之黏合miox表現匣及udh表現匣之本發明之質體。

實施例2：

2-a)經由含有表現匣之質體轉染之轉形體，使用Jar培養槽生產葡萄糖二酸

將根據上述之步驟建構之本發明之質體在大腸桿菌AKC-016株(作為FERM P-22104，於2011年4月20日寄託於獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄託中心。)使用氯化鈣法(參照羊土社基因工學實驗摘記上田村隆明著)進行轉染。

將獲得之轉形體在含有安比西林(100mg/L)之LB盤上，於37℃培養1日，使其形成群體(colony)。將含有安比西林(100mg/L)之LB培養基30mL放入150mL容量之燒瓶中，從上述盤將群體用接種環(inculating loop)植菌，以180rpm於37℃，3至5小時進行培養至OD(600nm)成為約0.5左右，將此作為用於本培養之前培養液。

在1000mL容量之Jar培養裝置(丸菱生物工程(Bioengineering)公司製造)中放入包含10g/L之葡萄糖及100mg/L之安比西林之合成培養基(表1)300mL，添加6mL之前培養液，進行本培養(使用Jar裝置之葡萄糖二酸生產試驗)。培養條件如下所述；培養溫度32℃；培養pH 6.0[下限]；鹼添加為28%(重量/容量)氨水；攪拌850rpm；通氣1vvm。適當添加成為原料之葡萄糖給料溶液(表2)，使培養液中之葡萄糖濃度成為0至5g/L。

將上述之培養液於4℃以10,000g×10分鐘離心分離，將上清液回收，測定培養上清液之葡萄糖二酸濃度。具體而言，將Shim-Pak SCR-H(保護管柱)及Shim-Pak SCR-101H(均為商品名，島津GLC公司製造)連結，進行HPLC分析(偵測器：RI，管柱溫度：40℃，流速：1mL/分鐘，移動相：0.1%甲酸)，定量培養上清液中葡萄糖二酸之濃度。

其結果，根據本發明之帶有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酯酶基因、肌肉肌醇加氧酶酶基因及糖醛酸脫氫酶基因之轉形體中，經由強化肌醇單磷酸酯酶活性，在該轉形體之培養上清中生產約73g/L(培養時間68小時)之葡萄糖二酸。

參考例：

製造肌醇單磷酸酯酶未生產過剩之轉形體，除了使用該肌醇單磷酸酯酶非強化株之外，根據上述實施例進行葡萄糖二酸生產試驗時，在培養時間68小時中，只生產0.26g/L之葡萄糖二酸。

(產業上之利用可能性)

本發明可利用於葡萄糖二酸之工業發酵生產。

【生物材料寄存】國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

日本國、獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄託中心

1.2011年4月20日、FERM ABP-11512

2.2011年10月25日、FERM ABP-11514

3.2011年10月25日、FERM ABP-11515

<110> 旭化成化學股份有限公司(ASAHI KASEI CHEMICALS)

<120> 葡萄糖二酸的製造方法(METHOD OF PRODUCTION OF GLUCARIC ACID)

<130> F112222-WO

<150> 日本專利申請案第2012-39129號

<151> 2012-02-24

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1602)

<400> 1

<210> 2

<211> 533

<212> PRT

<213> 啤酒酵母菌

<400> 2

<210> 3

<211> 804

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(804)

<400> 3

<210> 4

<211> 267

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 858

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌肉肌醇加氧酶基因編碼區

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(858)

<400> 5

<210> 6

<211> 285

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的建構體

<400> 6

<210> 7

<211> 807

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 糖醛酸脫氫酶基因編碼區

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 7

<210> 8

<211> 268

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的建構體

<400> 8

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌醇單磷酸酯酶編碼區之正向PCR引子

<400> 9

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌醇單磷酸酯酶編碼區之反向PCR引子

<400> 10

<210> 11

<211> 109

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌醇單磷酸酯酶編碼區之促進子

<400> 11

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌肉肌醇-1-磷酸合成酶編碼區之正向PCR引子

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌肉肌醇-1-磷酸合成酶編碼區之反向PCR引子

<400> 13

<210> 14

<211> 155

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌肉肌醇-1-磷酸合成酶編碼區之促進子

<400> 14

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 肌肉肌醇加氧酶編碼區之正向PCR引子

<400> 15

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人造區域

<220>

<223> 肌肉肌醇加氧酶編碼區之反向PCR引子

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 糖醛酸脫氫酶編碼區之正向PCR引子

<400> 17

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 糖醛酸脫氫酶編碼區之反向PCR引子

<400> 18

本案圖式均為DNA及蛋白質序列，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims

一種葡萄糖二酸之製造方法，其中，上述製造方法包含下列步驟：1)準備帶有肌醇-1-磷酸合成酶表現匣、肌醇單磷酸酯酶表現匣、肌肉肌醇加氧酶表現匣及糖醛酸脫氫酶表現匣之轉形體之步驟，該轉形體具有用以誘導在該轉形體內之功能性肌醇單磷酸酯酶生產過剩或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或突變；2)在適合繁殖及/或維持上述轉形體之條件下，將該轉形體與可經由該轉形體轉換為葡萄糖二酸之碳源接觸之步驟；及3)將葡萄糖二酸或葡萄糖二酸鹽從上述2)獲得之培養物中分離之步驟。
如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，上述碳源包含在上述轉形體內可轉換為葡萄糖-6-磷酸之化合物。
如申請專利範圍第2項所述之製造方法，其中，上述碳源為1個以上選自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、澱粉、纖維素、米糠、廢糖蜜及含有D-葡萄糖之生物質所成群組。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，上述轉形體之特徵為源自不具有肌肉肌醇合成代謝能之微生物。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，上述轉形體為源自選自由大腸桿菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬細菌所成群組之細菌。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩為對上述轉形體經由下列方式誘導者：a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內生性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、c)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區導入突變、d)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區以高表現誘導性外來調控區置換、或e)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區缺失。
如申請專利範圍第6項所述之製造方法，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩為經由對上述轉形體導入外來肌醇單磷酸酯酶基因而誘導。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之活化為對上述轉形體經由下列方式誘導者：f)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因中導入突變、g)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部予以置換、h)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質、j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。
一種轉形體，為帶有肌醇-1-磷酸合成酶表現匣、肌醇單磷酸酯酶表現匣、肌肉肌醇加氧酶表現匣及糖醛酸脫氫酶表現匣之轉形體，該轉形體具有用以誘導該轉形體內之功能性肌醇單磷酸酯酶生產過剩或肌醇單磷酸酯酶活化之基因重組或突變。
如申請專利範圍第9項所述之轉形體，其中，上述轉形體為源自不具有肌肉肌醇合成代謝能之微生物。
如申請專利範圍第9項或第10項所述之轉形體，其中，上述轉形體為源自選自由大腸桿菌、桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬細菌所成群組之細菌。
如申請專利範圍第9項或第10項所述之轉形體，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩為對上述轉形體經由下列方式誘導者：a)導入外來肌醇單磷酸酯酶基因、b)增加內生性肌醇單磷酸酯酶基因之複製數、c)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區導入突變、d)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區以高表現誘導性外來調控區置換、或e)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之調控區缺失。
如申請專利範圍第12項所述之轉形體，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之生產過剩為經由對上述轉形體導入外來肌醇單磷酸酯酶基因而誘導者。
如申請專利範圍第9項或第10項所述之轉形體，其中，上述肌醇單磷酸酯酶之活化為對上述轉形體經由下列方式誘導者：f)在內生性肌醇單磷酸酯酶基因中導入突變、g)將內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分或全部予以置換、h)使內生性肌醇單磷酸酯酶基因之一部分缺失、i)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之其他蛋白質、j)減少使肌醇單磷酸酯酶活性降低之化合物之生成。