JP6012703B2 - グルカル酸の製造方法 - Google Patents
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Description
活性1: 適当な炭素源からグルコース‐6‐リン酸を生成させる活性;
活性2: グルコース‐6‐リン酸をミオイノシトール‐1‐リン酸へ変換する活性、つまり、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素活性;
活性3: ミオイノシトール‐1‐リン酸をミオイノシトールへ変換する活性、つまり、ミオイノシトール‐1‐リン酸を基質としたフォスファターゼ活性;
活性4: ミオイノシトールをグルクロン酸へ変換する活性、つまり、ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性;及び
活性5: グルクロン酸をグルカル酸へ変換する活性、つまり、ウロン酸デヒドロゲナーゼ活性、
の5つ活性が必要である。しかし、実際には、活性1の生成物であるグルコース‐6‐リン酸は、原核微生物が普遍的に生成する代謝中間体であるので、当該活性を原核微生物に付与することは必須ではない。
従って、本発明の第1の局面は:
(1)グルカル酸の製造方法であって、以下の工程:
1) イノシトール−1−リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子及びウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換体であって、該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する形質転換体を用意する工程;
2) 前記形質転換体の生育及び/又は維持に適した条件下で、該形質転換体と該形質転換体によりグルカル酸に変換され得る炭素源を接触させる工程;及び
3) 前記2)で得られた培養物からグルカル酸あるいはグルカル酸塩を分離する工程、
を含む、前記製造方法である。
より特定的には、イノシトール−1−リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子及びウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換体を用いたグルカル酸の製造方法において、前記形質転換体が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する形質転換体であることを特徴とする、前記製造方法である。
(2) 前記炭素源が、前記形質転換体内でグルコース‐6‐リン酸へと変換され得る化合物を含む、上記(1)に記載の製造方法;及び
(3) 前記炭素源が、D‐グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、及びD‐グルコースを含有するバイオマスからなる群から選択される1つ以上である、上記(2)に記載の製造方法である。
(4) 前記形質転換体が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記(1)から(3)のいずれかに記載の製造方法;及び
(5) 前記形質転換体が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記(1)から(4)のいずれかに記載の製造方法を含む。
(6) 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換体に対して、
a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導される、上記(1)から(5)のいずれかに記載の製造方法;及び
(7) 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換体に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記(6)に記載の製造方法を含む。
(8) 前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換体に対して、
f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導される、上記(1)から(5)のいずれかに記載の製造方法。
(9) イノシトール−1−リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子及びウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換体であって、該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する形質転換体である。
より特定的には、イノシトール−1−リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子及びウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換体において、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有することを特徴とする、前記形質転換体である。
(10) 前記形質転換体が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記(9)に記載の形質転換体;
(11) 前記形質転換体が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記(9)又は(10)に記載の形質転換体;
(12) 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換体に対して、
a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導される、上記(9)から(11)のいずれかに記載の形質転換体;
(13) 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換体に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記(12)に記載の形質転換体;及び
(14) 前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換体に対して、
f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導される、上記(9)から(11)のいずれかに記載の形質転換体である。
ACCESSION No.AY738258(Homo sapiens myo−inositol oxygenase (MIOX))
ACCESSION No.NM101319(Arabidopsis thaliana inositol oxygenase 1 (MIOX1))
ACCESSION No.NM001101065(Bos taurus myo−inositol oxygenase (MIOX))
ACCESSION No.NM001030266(Danio rerio myo−inositol oxygenase (miox))
ACCESSION No.NM214102(Sus scrofa myo−inositol oxygenase (MIOX))
ACCESSION No.AY064416(Homo sapiens myo−inositol oxygenase (MIOX))
ACCESSION No.NM001247664(Solanum lycopersicum myo−inositol oxygenase (MIOX))
ACCESSION No.XM630762(Dictyostelium discoideum AX4 inositol oxygenase (miox))
ACCESSION No.NM145771(Rattus norvegicus myo−inositol oxygenase (Miox))
ACCESSION No.NM017584(Homo sapiens myo−inositol oxygenase (MIOX))
ACCESSION No.NM001131282(Pongo abelii myo−inositol oxygenase (MIOX))
特に、配列番号5で示されるコード化領域ヌクレオチド配列を有するmiox遺伝子の使用は便利である。
ACCESSION No.BK006462(Agrobacterium tumefaciens str. C58 uronate dehydrogenase (udh) gene)
ACCESSION No.EU377538(Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 uronate dehydrogenase (udh) gene)
特に、配列番号7で示されるコード化領域ヌクレオチド配列を有するudh遺伝子の使用は便利である。
上記、セルロースや多糖類などの炭素源を宿主微生物が資化できない場合は、当該宿主微生物に外来遺伝子を導入するなどの公知の遺伝子工学的手法を施すことで、これら炭素源を使用したグルカル酸生産に適応させることができる。外来遺伝子としては、例えば、セルラーゼ遺伝子やアミラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
1−a)イノシトールモノフォスファターゼ発現カセット
大腸菌株W3110(NBRC 12713)をLB培地中(2ml)で37℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY−NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、suhB遺伝子のコード領域(配列番号3)をクローニングした。
得られたsuhBコード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
すなわち、プラスミドpNFP−A51(FERM P−22182として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに2011年10月25日に寄託した。国際寄託番号:FERM BP−11515)のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたsuhBコード領域をライゲーションして、pNFP−A54を構築した。構築したpNFP−A54を、塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)により大腸菌AKC−016株(FERM P−22104として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。国際寄託番号:FERM BP−11512)にトランスフェクトした。SDS−PAGEにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトールモノフォスファターゼの高発現を確認した。
酒精酵母の培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY−NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、INO1遺伝子のコード領域(配列番号1)をクローニングした。
得られたino1コード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
すなわち、上記プラスミドpNFP−A51のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたino1コード領域をライゲーションして、pNFP−D78を構築した。構築したpNFP−D78を、塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)により大腸菌AKC−016株(FERM P−22104として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。国際寄託番号:FERM BP−11512)にトランスフェクトした。SDS−PAGEにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトール‐1‐リン酸合成酵素の高発現を確認した。
ミオイノシトールオキシゲナーゼ(miox)遺伝子は、配列番号5のヌクレオチド配列を有するDNAを人工合成により作製し、当該DNAを鋳型にして以下のプライマーによりPCR(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)を行うことで得た。
得られたmioxコード領域は配列番号11のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。すなわち、前記pNFP−A51のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたmioxコード領域をライゲーションして、pNFP−H26を構築した。構築したpNFP−H26を、塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)により大腸菌株FERM P−22104にトランスフェクトした。SDS−PAGEにより当該大腸菌の可溶性画分でのミオイノシトールオキシゲナーゼの高発現を確認した。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ(udh)遺伝子は、配列番号7のヌクレオチド配列を有するDNAを人工合成により作製し、当該DNAを鋳型にして以下のプライマーによりPCR(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)を行うことで得た。
得られたudhコード領域は配列番号11のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。すなわち、前記pNFP−A51のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたudhコード領域をライゲーションして、pNFP−H45を構築した。構築したpNFP−H45を、塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)により大腸菌株FERM P−22104にトランスフェクトした。SDS−PAGEにより当該大腸菌の可溶性画分でのウロン酸デヒドロゲナーゼの高発現を確認した。
上記で作製したpNFP−D78をSalIで消化し、平滑末端化及び5’末端脱リン酸化した。pNFP−A54中のsuhB発現カセットをクローニングして、pNFP−D78にライゲーションした。pNFP−D78中のINO1発現カセットと順方向にsuhB発現カセットがライゲーションしていたpNFP−G22を取得した。次いで、pNFP−G22をSalIで消化し、平滑末端化及び5’末端脱リン酸化した。実施例1で作製したpNFP−H26中のmiox発現カセット及びpNFP−H45中のudh発現カセットをクローニングして、両発現カセットをpNFP−G22にライゲーションした。pNFP−G22中のINO1発現カセット及びsuhB発現カセットと順方向にmiox発現カセット及びudh発現カセットがライゲーションしていた本発明のプラスミドを取得した。
2−a) 発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるJar培養槽を用いたグルカル酸の生産
上記の手順に従って構築した本発明のプラスミドを、大腸菌AKC−016株(FERM P−22104として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。国際寄託番号:FERM BP−11512)に塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)を用いてトランスフェクトした。
得られた形質転換体を、アンピシリン(100mg/L)含有LBプレート上で、37℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン(100mg/L)を含むLB培地30mLを150mL容のフラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、37℃で、3〜5時間、OD(600nm)が0.5程度になるまで180rpmで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。
1000mL容のJar培養装置(丸菱バイオエンジ社製)に、10g/Lのグルコースと、100mg/Lのアンピシリンを含む合成培地(表1)を300mL入れ、6mLの前培養液を添加し本培養(Jar培養装置を用いたグルカル酸生産試験)を行った。培養条件は次のとおり培養温度 32℃;培養pH 6.0〔下限〕;アルカリ添加 28%(重量/容量)アンモニア水;攪拌 850rpm;通気 1vvm。原料となるグルコースフィード溶液(表2)は、培養液中のグルコース濃度が0〜5g/Lとなるように適宜添加した。
上記の培養液を、4℃で、10,000g×10分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のグルカル酸濃度を測定した。具体的には、Shim−Pak SCR−H(ガードカラム)及びShim−Pak SCR−101H(いずれも商品名、島津ジーエルシー社製)を連結して、HPLC分析(検出器:RI、カラム温度:40℃、流速:1mL/min、移動層:0.1% ギ酸)を行うことで、培養上清中のグルカル酸濃度を定量した。
イノシトールモノフォスファターゼを過剰生産しない形質転換体を作製し、当該イノシトールモノフォスファターゼ非強化株を用いた以外は、上記実施例2に従ってグルカル酸生産試験を行ったところ、培養時間68時間で0.26g/Lしかグルカル酸を生産しなかった。
Claims (4)
- グルカル酸の製造方法であって、以下の工程:
1) イノシトール−1−リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子及びウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する、大腸菌に由来する形質転換体であって、該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産を誘導する遺伝子組換を有する形質転換体であり、該形質転換体は、イノシトール−1−リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットの4つの発現カセットを保有することを特徴とし、但し、イノシトール−1−リン酸合成酵素、ミオイノシトールオキシゲナーゼ及びウロン酸デヒドロゲナーゼのための足場ペプチドを発現する形質転換体を除く形質転換体を用意する工程;
2) 前記形質転換体の生育及び/又は維持に適した条件下で、該形質転換体と該形質転換体によりグルカル酸に変換され得る炭素源を接触させる工程;及び
3) 前記2)で得られた培養物からグルカル酸あるいはグルカル酸塩を分離する工程、
を含む、前記製造方法。 - 前記炭素源が、前記形質転換体内でグルコース−6−リン酸へと変換され得る化合物を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記炭素源が、D−グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、及びD−グルコースを含有するバイオマスからなる群から選択される1つ以上である、請求項2に記載の製造方法。
- イノシトール−1−リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子及びウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する、大腸菌に由来する形質転換体であって、該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産を誘導する遺伝子組換を有する形質転換体であり、該形質転換体は、イノシトール−1−リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットの4つの発現カセットを保有することを特徴とし、但し、イノシトール−1−リン酸合成酵素、ミオイノシトールオキシゲナーゼ及びウロン酸デヒドロゲナーゼのための足場ペプチドを発現する形質転換体を除く、形質転換体。
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