TWI390037B - 用於植物之昆蟲感染的基因控制方法及其組合物 - Google Patents

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Description

用於植物之昆蟲感染的基因控制方法及其組合物
本發明大體上係關於害蟲感染之基因控制。更特定言之，本發明係關於供轉錄後壓製或抑制害蟲細胞中目標編碼序列之表現以提供害蟲－保護效應之重組DNA技術。
人類生活之環境充滿害蟲感染。包括昆蟲、蜘蛛類動物、甲殼綱動物、真菌、細菌、病毒、線蟲綱動物、扁形動物、蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲、絛蟲、錐體蟲、血吸蟲、馬蠅、跳蚤、扁虱、蟎及虱及其類似物之害蟲遍佈於人類環境中。已利用大量方法以試圖控制此等害蟲之感染。已以抗生素組合物、抗病毒組合物及抗真菌組合物之形式提供用於控制藉由諸如細菌、真菌及病毒之微觀害蟲之感染的組合物。用於控制藉由較大害蟲(諸如線蟲綱動物、扁形動物、蛔蟲、蟯蟲、犬惡絲蟲、絛蟲、錐體蟲、血吸蟲及其類似物)之感染的組合物通常為可施用至害蟲存在於其上之表面或可以丸粒、散劑、錠劑、糊狀物或膠囊及其類似物之形式投予受感染動物之化學組合物形式。此項技術中極需要改良此等方法且尤其需要相對於先前技術之有利於環境之方法。
商業作物常為昆蟲攻擊之目標。最近數十年中在開發用於控制植物中昆蟲感染之更有效方法及組合物方面已有實質進展。化學殺蟲劑在根除害蟲感染方面已非常有效。然而，使用化學殺蟲劑存在若干不足。化學殺蟲劑並非選擇性。施用化學殺蟲劑意欲控制無脊椎害蟲(諸如包括對多種作物及其他植物有害之玉米根蟲種之鞘翅目昆蟲)，亦發揮其對非目標動物群之效應，常有效地將已施用殺蟲劑之區域消毒一段時間。若施用的話，化學殺蟲劑持續存在於環境中且通常代謝緩慢。其累積於食物鏈中，且尤其於更高捕食者物種中。此等化學殺蟲劑之累積導致對藥劑抗性之發展且導致進化階梯向上之更高物種可充當引起不可逆及不利基因修飾之誘變劑及/或致癌劑。因此尤其長期迫切需要環境友好的用於控制或根除昆蟲於植物上或植物中之感染的方法，意即為選擇性、環境惰性、非持久性及生物可降解且為十分適合於害蟲抗性管理方案之方法。
包括蘇力菌(Bacillus thuringiensis )(Bt)細菌之組合物已為市售的且用作環境安全及可接受殺昆蟲劑已超過三十年。Bt細菌之殺昆蟲效應並不繼續存在於環境中，其對受影響之目標物種為高度選擇性的、僅對由目標害蟲之攝取發揮其效應，且已表現為對植物及其他包括人類之非目標有機物無害。含有一或多種基因編碼殺昆蟲Bt蛋白之轉殖基因植物在此技術中亦可用且在控制害蟲感染中相當有效。使用表現Bt殺昆蟲蛋白之重組植物的大體結果為顯著減少施用至環境中以控制作物區中使用此等轉殖基因作物之區域中害蟲感染之化學殺蟲劑之量。減少化學殺蟲劑施用量已導致土壤更潔淨且更潔淨的水自土壤中流入周圍溪流、河流、池塘及湖泊中。除此等環境優勢外，由於化學殺昆蟲劑之使用減少，生長轉殖基因抗昆蟲作物之作物區中有益昆蟲之量顯著增加。
此項技術中已報導反義方法及組合物且咸信其可經由合成單股RNA分子(其理論上在活體內雜交為大體上互補之有義股RNA分子)發揮其效應。反義技術由於三個主要原因難於在許多系統中採用。首先，經轉形細胞中所表現之反義序列不穩定。其次，經轉形細胞中表現之反義序列的不穩定伴隨產生將序列傳遞至遠離轉殖基因細胞之宿主、細胞類型或生物學系統的困難。第三，所遇到的反義序列不穩定及傳遞之困難產生試圖在表現反義序列之重組細胞(其可有效地調節目標有義核苷酸序列之表現量)內提供一劑量的困難。
在用於調節細胞、組織或有機體內之基因表現量之技術方面已有少量改良，且尤其缺少用於使用重組DNA技術延緩、壓製或另外減少特異性基因表現之發達技術。此外，由於此等途徑不可預計之結果，因此不可利用任何商業上可行的用於調節真核或原核有機體中特異性基因之表現量的方法。
在不同害蟲中雙股RNA調節抑制特異性基因先前已得到證明。已在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )中測試dsRNA調節基因控制之方法(Kennerdell及Carthew,1998；Kennerdell及Carthew,2000)。Kennerdell及Carthew(1998)描述一用於傳遞dsRNA之方法，該方法涉及產生表現雙股RNA分子之轉殖基因昆蟲或在胚胎發育之前或期間將dsRNA溶液注入昆蟲體內或卵囊內。
研究調查員先前已證明可藉由使線蟲綱動物取食或藉由將線蟲綱動物浸泡在含有雙股或小干擾RNA分子之溶液中及藉由注射dsRNA分子達到雙股RNA調節基因抑制之目的。Rajagopal等人(2002)描述失敗於嘗試藉由使新生幼蟲取食或藉由將新生幼蟲浸泡在含有對於目標基因特異性之dsRNA之溶液中抑制害蟲斜紋夜蛾(Spodoptera litura )幼蟲中之內因性基因，但成功地使用微供液器在將dsRNA注入幼蟲之第5齡期幼蟲的血淋巴之後抑制該內因性基因。最近Yadav等人(2006)報導了植物中產生的宿主產生之dsRNA可保護此等植物免受線蟲綱動物感染。類似地，美國專利申請公開案第2003/0150017號預言地描述了一供使用藉由攝取經轉形以產生dsRNA之植物傳遞至幼蟲之dsRNA以抑制鱗翅目幼蟲棉鈴蟲(Helicoverpa armigera )之較佳位點。WO 2005/110068教示在玉米根蟲(CRW)植物中提供針對必需CRW基因之CRW－特異性dsRNA。在試管內或植物體內之CRW食物中提供dsRNA，結果為在取食食物後，CRW幼蟲發育受阻或被殺死，且此結果經若干不同基因證明。
因此，存在對識別有效核苷酸序列以用於在特定鞘翅目害蟲內藉由壓製、延緩或另外減少基因表現調節基因表現之用於控制害蟲感染或產生新穎表型性狀之改良方法之需要。
在一態樣中，本發明提供一種抑制鞘翅目害蟲中目標基因表現之方法。在某些實施例中，該方法包含調節或抑制鞘翅目害蟲中一或多種目標基因之表現，其將引起取食、生長、發育及/或感染性停止且最終導致昆蟲死亡。該方法包含將部分或全部穩定雙股RNA(dsRNA)(包括其諸如小干擾RNA(siRNA)序列之修飾形式)引入細胞中或引入鞘翅目害蟲體內之細胞外環境(諸如中腸)中，在鞘翅目害蟲體內dsRNA進入細胞且抑制至少一或多種目標基因表現且在鞘翅目害蟲體內抑制發揮其對鞘翅目害蟲之不利效應。該方法及相關組合物可用於藉由在害蟲食物中提供一或多種包含本文所述dsRNA分子之組合物限制或消除任何害蟲宿主、害蟲共生體或存在害蟲之環境中或其上的鞘翅目害蟲感染。該方法對保護植物免受昆蟲攻擊有特別好處。在一實施例中，害蟲定義為包含pH在自約4.5至約9.5、約5至約9、約6至約8及自約pH 7.0範圍內之消化系統。
在另一態樣中，本發明提供例示性核酸組合物，其與目標害蟲中之一或多種原生核酸序列之至少一部分同源。在某些實施例中，害蟲係選自包括西方玉米根蟲(Western Corn Rootworm)(WCR,Diabrotica virgifera 或Diabrotica virgifera virgifera )、南方玉米根蟲(Southern Corn Rootworm)(SCR,Diabrotica undecimpunctata howardi )、墨西哥玉米根蟲(Mexican Corn Rootworm)(MCR,Diabrotica virgifera zea )、巴西玉米根蟲(Brazilian Corn Rootworm)(BZR,Diabrotica balteata,Diabrotica viridula,Diabrotica speciosa )、北方玉米根蟲(Northern Corn rootworm)(NCR,Diabrotica barberi )、黃瓜十二點葉甲(Diabrotica undecimpunctata )；及科羅拉多馬鈴薯葉甲(Colorado Potato Beetle)(CPB,Leptinotarsa decemlineata )、赤擬穀盜(Red Flour Beetle)(RFB,Tribolium castaneum )及瓢蟲(Mexican Bean Beetle)(Epilachna varivestis )之葉甲種(Diabrotica sp.)中者。在其他實施例中，害蟲係選自包括歐洲玉米螟(European Corn Borer)(ECB,Ostrinia nubilalis )、切根蟲(Black Cutworm)(BCW,Agrotis ipsilon )、玉米穗蟲(Corn Earworm)(CEW,Helicoverpa zea )、秋天行軍蟲(Fall Armyworm)(FAW,Spodoptera frugiperda )、墨西哥棉鈴象(Cotton Ball Weevil)(BWV,Anthonomus grandis )、蠶(silkworm)(Bombyx mori )及煙草天蛾(Manduca sexta)之鱗翅目昆蟲中者，且係選自包括黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae )及埃及伊蚊(Aedes aegypti )之雙翅類昆蟲。本發明提供之此等核酸之特定實例在列為SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之所附序列中給出。
在另一態樣中，本發明提供一種用於抑制諸如玉米根蟲或相關物種之鞘翅目害蟲中基因表現的方法，其包含在害蟲食物中提供基因抑制性量之至少一種自本文所述之核苷酸序列轉錄之dsRNA分子、至少一種與害蟲細胞內mRNA序列互補之區段的步驟。該方法可進一步包含觀察害蟲之死亡、抑制、發育受阻或取食停止。根據本發明餵飼給害蟲之dsRNA分子(包括其諸如siRNA分子之修飾形式)可為至少來自約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或約100%與自選自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906組成之群之核苷酸序列轉錄之RNA分子一致者。在特定實施例中，核苷酸序列可選自由SEQ ID NO：697、SEQ ID NOs：806－819、SEQ ID NO：820－821、SEQ ID NO：841及SEQ ID NO：874組成之群。
因此，本發明之另一態樣中，提供一組經分離及純化的如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中所述之核苷酸序列。本發明提供穩定dsRNA分子或由此等序列及其片段表現之一或多種用於抑制鞘翅目害蟲中目標基因之表現的miRNA之表現。包括miRNA或siRNA分子之穩定dsRNA可包含至少兩種經配置為相對於至少一個啟動子有義及反義取向之編碼序列，其中該包含有義股及反義股之核苷酸序列經由至少來自約五種至約一千種核苷酸之間隔區序列連接，其中該有義股及反義股可為不同長度，且其中該兩個編碼序列之每一者與任一或多個於陳述為SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中所述之核苷酸序列共有至少80%序列同一性、至少90%、至少95%、至少98%或100%序列同一性。
本發明進一步提供選自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906組成之群之核苷酸序列片段或串聯體。在特定實施例中，該核苷酸序列可包含選自由SEQ ID NO：697、SEQ ID NOs：806－819、SEQ ID NO：820－821、SEQ ID NO：841及SEQ ID NO：874組成之群的序列之片段或串聯體。
在片段表現為dsRNA且受提供至害蟲時，可將其定義為引起害蟲死亡、抑制、發育受阻或取食停止者。舉例而言，該片段包含任一或多個SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中的序列或其互補序列之至少約19、21、23、25、40、60、80、100、125或更多鄰近核苷酸。用於本發明之一種有益DNA區段之長度為至少約19至約23或至少23至約100個核苷酸直至約2000個核苷酸或更多。尤其有用者可為包括約23至約300個與害蟲目標序列同源之核苷酸之dsRNA序列。本發明亦提供自任何此等包括dsRNA之序列表現之核糖核酸。經選擇以用於表現基因抑制劑之序列可建構自來自一或多種目標害蟲所衍生之單一序列且意欲用於表現在抑制一或多種目標害蟲中的單一基因或基因家族起作用之RNA時，或者DNA序列可建構為來自複數個DNA序列之嵌合體。
在另一態樣中，本發明提供包含編碼如本文所述之dsRNA分子之核酸分子的重組DNA建構體。可藉由轉錄來自核苷酸序列之dsRNA分子之一股形成dsRNA，該核苷酸序列至少來自約80%至約100%與選自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906組成之群的核苷酸序列一致者。此等重組DNA建構體可定義為可在攝取時抑制害蟲細胞中內因性目標基因表現之dsRNA分子之產生。該建構體可包含可操作地連接至在宿主細胞中起作用之啟動子序列之本發明之核苷酸序列。此啟動子可為組織特異性的，且可(例如)對害蟲攻擊對象之組織類型為特異性的。舉例而言，在根蟲情況下，可需要使用可提供根部較佳表現之啟動子。
根據本發明核酸建構體可包含至少一種非天然產生之核苷酸序列，其可轉錄為可經由雜交在活體內形成dsRNA分子之單股RNA。此等dsRNA序列自身組合且可將其提供至鞘翅目害蟲之食物中以達到所要之抑制。
重組DNA建構體可包含兩種不同非天然產生序列，當該序列在活體內表現為dsRNA序列且提供至鞘翅目害蟲食物中時，將抑制鞘翅目害蟲細胞中之至少兩種不同目標基因的表現。在某些實施例中，至少3、4、5、6、8或10或更多不同dsRNA產生於具有害蟲抑制效應之細胞或包含該細胞之植物中。dsRNA可自於不同轉形情況中導入之多建構體表現或可導入於單一核酸分子之上。可使用單一啟動子或多啟動子表現dsRNA。在本發明之一實施例中，可產生包含與害蟲中多位點同源之核酸之單一dsRNA。
在另一態樣中，本發明提供其基因組中具有至少一個重組DNA序列之重組宿主細胞，該重組DNA序列經轉錄以產生至少一個在由鞘翅目害蟲攝取時作用於抑制害蟲中目標基因表現的dsRNA分子。可藉由任何如本文所述及如序列列表中所陳述之核酸編碼dsRNA分子。本發明亦提供其基因組中具有至少一個本文所述之重組DNA序列之經轉形植物細胞。亦提供包含此經轉形植物細胞之轉殖基因植物，該轉殖基因植物包括各包含重組DNA之任何世代之後裔植物、種子及植物產品。
本發明之方法及組合物可視所要之鞘翅目害蟲控制而定施用至任何單子葉植物及雙子葉植物。特定言之，該等植物意欲包括(但不限於)紫苜蓿、茴香、蘋果、杏、朝鮮薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑莓、越桔、椰菜、抱子甘藍、甘藍菜、菜籽油、哈密瓜、胡蘿蔔、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、芫荽葉、橘、克萊門小柑橘、咖啡樹、玉米、棉、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、苦苣、桉樹、小茴香、無花果、葫蘆、葡萄、葡萄柚、蜜汁、豆薯、奇異果、萵苣、韭菜、檸檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、堅果、燕麥、秋葵、洋蔥、桔子、觀賞植物、番木瓜、香芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松樹、鳳梨、車前草、李、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、榅桲、放射松、菊苣、蘿蔔、覆盆子、稻、黑麥、高粱、美國長葉松、大豆、菠菜、西葫蘆、草莓、密西西比樸、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香屬、紅桔、茶、煙草、番茄、草皮、葡萄樹、西瓜、小麥、山藥及筍瓜植物。因此，本發明亦提供經以如前所陳述之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中之重組DNA序列或其串聯體、片段或互補序列轉形之植物，該序列經轉錄以產生至少一種dsRNA分子，其在由鞘翅目害蟲攝取時作用以抑制害蟲中目標基因之表現。在特定實施例中，重組DNA序列係選自由SEQ ID NO：697、SEQ ID NOs：806－819、SEQ ID NO：820－821、SEQ ID NO：841及SEQ ID NO：874或其片段、互補序列或其串聯體組成之群。
本發明亦提供用於控制鞘翅目害蟲感染之方法及組合物之組合。一種方法提供如本文所述之dsRNA方法，其連同一或多種殺昆蟲劑用於保護植物免受昆蟲感染，該等殺昆蟲劑展示與彼等由dsRNA方法及組合物所展示者不同之特徵。舉例而言，可在害蟲食物中提供一或多種與一或多種如本文所述之dsRNA組合之Bt蛋白。經調配以用於局部施用或使用轉殖基因途徑(將dsRNA方法及組合物與Bt組合)衍生之組合物可用於提供用於控制昆蟲感染之此項技術中先前未知之協合作用。一種協合作用為減少dsRNA或Bt蛋白所需之表現量。當組合在一起時，可使用較低有效劑量之各害蟲控制劑。咸信Bt殺昆蟲蛋白產生入口孔隙，dsRNA分子可經由該等入口孔隙更有效地穿透進入遠離害蟲之消化道的空間，或更有效地進入接近Bt蛋白產生之損害之細胞，因此需要較少Bt或dsRNA以達到所要殺昆蟲結果或所要對目標害蟲中目標生物功能之抑制或抑制。
因此本發明提供含有兩種或兩種以上不同殺蟲劑(每一者對相同害蟲或昆蟲物種有毒)之組合物，至少一種殺蟲劑包含本文所述之dsRNA。在某些實施例中，第二藥劑可為選自由儲藏蛋白(patatin)、蘇力菌殺昆蟲蛋白、嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus )殺昆蟲蛋白、發光桿菌(Photorhabdus )殺昆蟲蛋白、側胞芽胞桿菌(Bacillus laterosporus )殺昆蟲蛋白、球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus )殺昆蟲蛋白及木質素組成之群之藥劑。蘇力菌殺昆蟲蛋白可為許多殺昆蟲蛋白(包括但不限於Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、二元殺昆蟲蛋白CryET33與CryET34、二元殺昆蟲蛋白CryET80與CryET76、二元殺昆蟲蛋白TIC100與TIC101、二元殺昆蟲蛋白PS149B1、VIP殺昆蟲蛋白、TIC900或相關蛋白，或殺昆蟲蛋白ET29或ET37與殺昆蟲蛋白TIC810或TIC812之組合，及任何前述殺昆蟲蛋白之殺昆蟲嵌合體)之任一者。
在食物中提供之核糖核酸可在人工食物提供，該人工食物經調配以滿足用於在此食物上維持害蟲之特定營養需求。可以害蟲控制量之RNA補充該食物，RNA已自獨立表現系統中純化以測定RNA組合物之害蟲控制量或測定對害蟲攝取所補充食物之抑制性活性的程度。該食物亦可為經以DNA序列(其經建構用於表現藥劑、RNA或基因抑制劑)轉形之重組細胞。一旦害蟲攝取一或多種此等經轉形細胞，即可觀察到所要表型結果，表明該藥劑已作用於抑制害蟲細胞內目標核苷酸序列之表現。
目標為抑制之基因可編碼必要蛋白，該必要蛋白之受預測功能係選自由肌肉形成、幼體激素形成、幼體激素調節、離子調節及轉運、蛋白合成及轉運、消化酶合成、維持細胞膜電位、胺基酸生物合成、胺基酸降解、***形成、信息素合成、信息素感應、觸角形成、翼形成、腿形成、發育及分化、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經傳遞、細胞***、能量代謝、呼吸、一未知功能及細胞凋亡組成之群。
本發明之另一態樣亦提供用於改良由經受害蟲感染之作物植株生產之作物產量之方法，該方法包含步驟a)將包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之序列之聚核苷酸或其互補序列或串聯體或片段導入該作物植株；及b)培育該作物植株以使該聚核苷酸表現，其中該聚核苷酸之表現抑制害蟲之取食及由於害蟲感染引起之產量減少。
在某些實施例中，聚核苷酸之表現產生抑制至少害蟲中之一第一目標基因之RNA分子，該害蟲攝取一部分該作物植株，其中該目標基因執行至少一種選自由下列功能組成之群之必要功能：害蟲之取食、害蟲生存力、害蟲細胞凋亡、害蟲或任何害蟲細胞之分化及發育、害蟲之有性繁殖、肌肉形成、肌肉抽搐、肌肉收縮、幼體激素形成及/或減少、幼體激素調節、離子調節及轉運、維持細胞膜電位、胺基酸生物合成、胺基酸降解、***形成、信息素合成、信息素感應、觸角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經傳遞、幼蟲期轉變、化蛹、自蛹羽化、細胞***、能量代謝、呼吸、細胞骨架結構合成及維持、核苷酸代謝、氮代謝、水分利用、水分保持及感官知覺。
在其他實施例中，害蟲為選自由下列害蟲組成之群之玉米根蟲害蟲：南方玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata howardi )(Southern Corn Rootworm(SCR))、西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera )(Western Corn Rootworm(WCR))、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi )(Northern Corn Rootworm(NCR))、墨西哥玉米根蟲(Diabrotica virgifera zea )(Mexican Corn Rootworm(MCR))、巴西玉米根蟲(Diabrotica balteata )(Brazilian Corn Rootworm(BZR))、巴西玉米根蟲(Diabrotica viridula )(Brazilian Corn Rootworm(BZR))及巴西玉米根蟲(Diabrotica speciosa )(Brazilian Corn Rootworm(BZR))。
本發明亦提供用於改良由經受害蟲感染之作物植株產生之作物之耐旱性的方法，該方法包含步驟：a)將選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之聚核苷酸序列或其片段導入該作物植株；及b)培育該作物植株以允許該聚核苷酸表現，其中該聚核苷酸之表現抑制害蟲之取食及由於害蟲感染引起之耐旱性降低。
本發明之另一態樣進一步提供農藝學及商業上重要之產品及/或包括(但不限於)動物飼料、商品、產品及副產品之物質的組合物，該等組合物意欲用作人類消耗之食物或用於意欲用於人類消耗之組合物及商品包括但不限於玉米粉、玉米粗粉、玉米糖漿、玉米油、玉米澱粉、爆玉米花、玉米餅、穀類及其類似物。此等組合物可定義為含有可檢測量之本文所述之核苷酸序列，且因此亦可用於診斷任何含有此等核苷酸序列之轉殖基因事件。此等產品為有用的，至少由於其可能衍生於繁殖時帶有較少殺蟲劑及有機磷酸酯之作物，作為本發明之核苷酸與其合併以控制植物中鞘翅目害蟲感染之結果。此等商品及商品產品可產生於由轉殖基因植物產生之種子，其中該轉殖基因植物自一或多個本發明之鄰近核苷酸或一或多種鞘翅目害蟲之核苷酸及其互補序列表現RNA。此等商品及商品產品亦可用於控制此商品及此等產品之鞘翅目害蟲，諸如控制黃粉蟲，此係由於商品或商品產品中存在由本發明前述之基因序列表現之害蟲基因抑制性RNA。
本發明亦提供一種用於產生此商品產品之方法，其包含獲得經包含選自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906組成之群之序列或其串聯體或片段或互補序列之聚核苷酸轉形之植物，及自植物或其部分製備商品產品。此外，一種產生食物或飼料之方法，其包含獲得經以選自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906組成之群之聚核苷酸或其片段或互補序列轉形之植物，及自該植物或其部分製備食物或飼料，該方法為本發明之另一態樣。
本發明亦提供一種具有一或多種如所述之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之核苷酸序列或其互補序列記錄於其上之電腦可讀取媒體，其用於許多基於計算機之應用，該等應用包括但不限於DNA同一性及相似性搜尋、蛋白同一性及相似性搜尋、轉錄圖譜特徵、基因組之間的比較及人工雜交分析。
下述為供幫助一般熟習此項技術者操作本發明之本發明之實施方式。一般熟習此項技術者可對本文描述之實施例作出修飾及變化而不偏離本發明之精神或範疇。
本發明提供用於基因控制害蟲感染之方法及組合物。舉例而言，本發明提供重組DNA技術以在轉錄後壓製或抑制害蟲細胞中目標編碼序列之表現，從而藉由以一或多個自所有或一部分目標編碼序列轉錄之雙股或小干擾核糖核酸(RNA)分子餵飼害蟲提供害蟲保護效應，由此控制感染。因此，本發明係關於使用雙股RNA(dsRNA)(包括小干擾RNA(siRNA))序列－特異性抑制編碼序列之表現，從而達到預期之害蟲控制程度。
提供包括(但不限於)非天然產生之核苷酸序列及重組DNA建構體之經分離及大體上純化的用於轉錄本發明之dsRNA分子的核酸分子，其在導入害蟲時抑制或抑制害蟲中內因性編碼序列或目標編碼序列之表現。亦提供(a)含有核苷酸序列編碼經分離及大體上純化核酸分子及非天然產生之重組DNA建構體用於轉錄dsRNA分子以控制植物害蟲感染；及(b)展示對昆蟲感染抗性及/或經增強之耐性之轉殖基因植物。亦描述含有本發明之dsRNA核苷酸序列之組合物，該組合物用於局部施用於植物上或動物上或動物環境中以達到消除或減少害蟲感染之目的。
與先前技術之教示相比，本發明者本文已發現以含有由發現於鞘翅目物種之一或多種經表現之核苷酸序列中的序列組成之雙股RNA分子的組合物餵飼自其獲得核苷酸序列之物種導致鞘翅目物種中的一或多種生物功能受抑制。特定言之，發明者已發現以本文所述之雙股RNA分子餵飼諸如玉米根蟲之作物害蟲物種導致攝取此等組合物之害蟲死亡或發育及分化受抑制。
發明者已將本文所述之核苷酸序列識別為提供抗鞘翅目害蟲物種之植物保護效應。已推斷出由cDNA序列編碼之胺基酸序列並將其與已知胺基酸序列比較。已預測許多序列以編碼具有一些與其相關之註釋資訊之蛋白。與特定核苷酸序列及由其編碼之蛋白序列相關之註釋資訊係基於經由轉譯如所陳述的本文所述之編碼序列所推斷出的胺基酸序列與公開可用庫中的此項技術中已知的胺基酸序列之間的同源性或相似性。
涉及不同新陳代謝或分解代謝生物化學路徑、細胞***、繁殖、能量代謝、消化、神經功能及其類似功能的編碼存活必需之蛋白或部分蛋白的cDNA序列(諸如胺基酸序列)經選擇以用於製備在鞘翅目害蟲的食物中提供之雙股RNA分子。如本文所述，由目標害蟲攝取含有一或多個dsRNA(該等dsRNA之至少一個區段與目標害蟲之細胞中產生的RNA之至少一大體上相同區段對應)導致目標害蟲死亡、發育受阻或其他抑制。此等結果表明自鞘翅目害蟲衍生之或為DNA或為RNA之核苷酸序列可用於建構抗害蟲感染之植物細胞。舉例而言，害蟲宿主可經轉形以含有一或多個自鞘翅目害蟲衍生之核苷酸序列。經轉形為害蟲宿主或共生體之核苷酸序列可編碼一或多種RNA(該或該等RNA組成經轉形宿主或共生體內之細胞或生物流體中的dsRNA序列)，因此使得若/當以該轉殖基因宿主或共生體餵飼害蟲時dsRNA在害蟲食物中可用，導致害蟲細胞中一或多個基因之表現抑制且最終導致害蟲死亡、發育受阻或其他抑制。
本發明一般係關於宿主有機體中鞘翅目害蟲之基因控制。更特定言之，本發明包括用於將害蟲控制劑傳遞至鞘翅目害蟲之方法。此等害蟲控制劑引起直接或間接損害害蟲維持自身、生長或另外感染目標宿主或共生體之能力。本發明提供用於在害蟲食物中採用穩定dsRNA分子作為抑制害蟲中的目標基因之方法，由此達到所要對由害蟲作為目標之宿主或共生體中或附近之害蟲感染之控制的方法。
在完成前述內容過程中，本發明提供一種抑制鞘翅目害蟲(例如包括玉米根蟲或其他鞘翅目昆蟲物種)中目標基因表現之方法，其導致害蟲之取食、生長、發育、繁殖、感染停止，且最終可導致害蟲死亡。該方法在一實施例中包含將部分或全部穩定雙股RNA(dsRNA)核苷酸分子導入害蟲依賴其作為食物源之營養組合物中，且使得害蟲可取食該營養組合物。攝取含有雙股或siRNA分子之營養組合物導致害蟲細胞吸收該等分子，從而導致抑制害蟲細胞中至少一個目標基因的表現。對目標基因之抑制發揮其對害蟲之不利效應。
在某些實施例中，本發明提供之dsRNA分子包含與如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之任一者所述序列互補之核苷酸序列，對害蟲有機體中之dsRNA的抑制導致害蟲生長及發育或其他生物功能必需之蛋白或核苷酸序列藥劑減少或移除。經選擇之核苷酸序列可展示與如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中所述、如序列列表所述之核苷酸序列(包括其互補序列)之一的約80%至至少約100%之序列相似性。此抑制可描述為特異性的，因為來自一部分目標基因之核苷酸序列係選自抑制dsRNA或siRNA自其轉錄者。該方法可有效抑制至少一個目標基因之表現且可用於抑制害蟲中許多不同類型之目標基因。在特定實施例中，核苷酸序列係選自由SEQ ID NO：697、SEQ ID NOs：806－819、SEQ ID NO：820－821、SEQ ID NO：841及SEQ ID NO：874組成之群。
識別為具有害蟲保護效應之序列不難經由產生適當表現建構體表現為dsRNA分子。舉例而言，此等序列可藉由獲取與選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之序列或其片段對應之第一區段、將此序列連接至並非與第一區段同源或互補之第二區段間隔區區域，並將此受連接之兩者連接至轉錄RNA之第三區段(其中第三區段之至少一部分大體上與第一區段互補)表現為U形及桿狀及環狀結構。此建構體藉由將第一區段與第三區段雜交形成桿狀及環狀結構且環狀結構形式包含第二區段(WO94/01550、WO98/05770、US 2002/0048814A1及US 2003/0018993A1)。
A.核酸組合物及建構體
本發明提供用於達到特定宿主或共生體害蟲目標之穩定轉形之重組DNA建構體。經轉形宿主或共生體害蟲目標可表現殺蟲有效含量之來自重組DNA建構體之較佳dsRNA或siRNA分子，且在害蟲食物中提供該等分子。可自cDNA庫及/或基因體組庫資訊提供經分離及純化核苷酸序列對。該等核苷酸序列對可衍生自任何較佳鞘翅目害蟲用作熱擴增引子以產生用於製備本發明之dsRNA及siRNA分子的DNA模板。
如本文所用之術語"核酸"係指自5'至3'端讀取之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基之單股或雙股聚合物。"核酸"亦可視情況含有非天然產生或經改變之核苷酸鹼基(其准許藉由聚合酶正確通讀且不減少由彼核酸編碼之多肽的表現)。術語"核苷酸序列"或"核酸序列"係指作為個別單股或雙鏈體中之核酸之有義及反義股。術語"核糖核酸"(RNA)包括RNAi(抑制RNA)、dsRNA(雙股RNA)、siRNA(小干擾RNA)、mRNA(信息RNA)、miRNA(微－RNA)、tRNA(轉移RNA，無論裝載或未裝載相應醯化胺基酸)，及cRNA(互補RNA)且術語"去氧核酸"(DNA)包括cDNA及基因體組DNA及DNA－RNA雜種。一般技術者應將詞"核酸區段"、"核苷酸序列區段"或更通常之"區段"理解為包括基因體組序列、核糖體RNA序列、轉移RNA序列、信息RNA序列、操縱子序列及更小可表現或適合表現之經改造核苷酸序列、蛋白、多肽或肽之功能性術語。
本發明提供核苷酸序列，其表現產生大體上與昆蟲體內目標基因之RNA分子同源之RNA序列，該RNA分子包含由昆蟲之基因組內的核苷酸序列編碼之RNA序列。因此，在攝取穩定RNA序列後，可獲得昆蟲細胞中目標基因之核苷酸序列的降－調節，其導致對昆蟲維持、生存力、增殖、繁殖及感染有不利效應。
如本文所用之關於核酸序列之術語"大體上同源"或"大體同源性"包括在嚴格條件下與編碼如序列列表中所述之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之任一者中所述之序列或其互補序列雜交之核苷酸序列。在嚴格條件下與如序列列表中所述之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之任一者或其互補序列雜交之序列為彼等可允許反平行對準發生於兩個序列之間，且接著該兩個序列可在嚴格條件下與反向股上的相應鹼基形成氫鍵以形成雙鏈體分子者，該雙鏈體分子在嚴格條件下足夠穩定以使用此項技術中熟知之方法檢測。大體上同源序列具有與如序列列表中所述之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906之任一者所述之參考核苷酸序列或其互補序列之間的較佳約70%至約80%之序列同一性，或更佳約80%至約85%之序列同一性，或最佳約90至約95%之序列同一性，至約99%之序列同一性。
如本文所用之術語"序列同一性"、"序列相似性"或"同源性"係用於描述兩個或更多核苷酸序列之間的序列關係。藉由經由一比較窗比較兩個最佳對準序列測定兩個序列之間的"序列同一性"之百分比，其中兩個序列最佳對準情況下，與參考序列相比(其不包含加成或缺失)，比較窗中序列之部分可包含加成或缺失(意即缺口)。藉由測定在其中相同核酸鹼基或胺基酸殘基發生於兩個序列中以產生匹配位置數之位置數、用比較窗中位置之總數除匹配位置數，並用100乘計算結果以產生序列同一性之百分比來計算百分比。與參考序列相比每一位置皆相同之序列稱作與參考序列相同且反之亦然。若第一核苷酸序列展示與第二或參考序列完全互補，則將在5'至3'方向觀察之第一核苷酸序列稱作在3'至5'方向觀察之第二或參考核苷酸序列之"互補序列"或與其互補。當自5'至3'讀取之序列之一之每一核苷酸與其他自3'至5'讀取之序列之每一核苷酸互補時，如本文所用之核酸序列分子稱為展示"完全互補"。與參考核苷酸序列互補之核苷酸序列將展示與參考核苷酸序列之反向互補序列相同之序列。此項技術中已充分定義此等術語及描述，且熟習此項技術者將易於瞭解此等術語及描述。
如本文所用之"比較窗"係指至少6個、通常為約50至約100個、更通常為約100個至約150個鄰近位置之概念區段，在該區段中兩個序列最佳對準之後將序列與相同數之鄰近位置的參考序列比較。兩個序列最佳對準情況下，與參考序列相比(其不含加成或缺失)，該比較窗可包含約20%左右之加成或缺失(意即缺口)。熟習此項技術者應參考Wisconsin遺傳學軟體套件版本7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)(Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison,Wis.,USA)中之用於序列對準之詳述方法，或參考Ausubel等人(1998)之序列分析的詳細討論。
本發明提供可在細胞或微生物中表現為RNA以抑制昆蟲細胞、組織或器官之目標基因表現的DNA序列。該等序列包含一或多種不同核苷酸序列之DNA分子編碼，其中不同核苷酸序列之每一者包含藉由本發明之dsRNA分子之間隔區序列編碼連接之有義核苷酸序列及反義核苷酸序列。間隔區序列組成有義核苷酸序列或反義核苷酸序列的一部分且形成於介於有義及反義序列之間的dsRNA分子內。有義核苷酸序列或反義核苷酸序列大體上與目標基因的核苷酸序列或其衍生物或其互補序列相同。可在啟動子序列的控制下可操作地放置dsDNA分子，該啟動子序列在宿主細胞、組織或器官中作用於使dsDNA表現以產生dsRNA分子。在一實施例中，DNA序列可衍生於序列列表中之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中如所述之核苷酸序列。
本發明亦提供用於在細胞或植物中表現之DNA序列，其在DNA表現為RNA並藉由目標害蟲攝取時完成對害蟲細胞、組織或器官中之目標基因的抑制。dsRNA至少包含一或多個結構基因序列，其中該等結構基因序列之每一者包含藉由在互補及反義序列內形成環狀之間隔區序列連接之一有義核苷酸序列及一反義核苷酸序列。有義核苷酸序列或反義核苷酸序列大體上與目標基因之核苷酸序列、其衍生物或與其互補之序列相同。在一或多個啟動子序列控制下可操作地放置該一或多個結構基因序列，該一或多個啟動子序列之至少一者可操作地在原核或真核有機體、尤其為植物之細胞、組織或器官中。
根據本發明控制害蟲之基因序列或片段可在兩個組織特異性啟動子(諸如兩個根特異性啟動子)之間選殖，該等啟動子可操作地在轉殖基因植物細胞中且在其中表現以在轉殖基因植物細胞中產生由其形成dsRNA分子之mRNA。植物組織中所含有的dsRNA分子由昆蟲攝取，因此可達到所打算的對目標基因表現之抑制。
本發明提供之核苷酸序列可包含藉由"間隔區序列"分離之反向重複序列。間隔區序列可為包含任何可促進第二結構在所需的各重複序列之間形成之核苷酸序列之區域。在本發明之一實施例中，間隔區序列為mRNA之有義或反義編碼序列的一部分。間隔區序列可或者包含可共價連接至核酸分子之核苷酸或其同系物之任何組合。間隔區序列可包含長度至少為10至100個核苷酸、或可選擇地長度至少為約100至200個核苷酸、長度至少為約200至400個核苷酸、或長度至少為約400至500個核苷酸之核苷酸序列。
核酸分子或該等核酸分子之片段或序列列表中之其他核酸分子在某些情況下可特異性地與其他核酸分子雜交。若如本文所用之兩個核酸分子可形成反平行、雙股核酸結構，則將該兩個分子稱作可特異性地互相雜交。若兩個核酸分子展示完全互補，則將一核酸分子稱作另一核酸分子之互補序列。若兩個分子可互相雜交同時足夠穩定以准許其在至少習知"低嚴格度"條件下仍可保持彼此黏接，則可將該兩個分子稱作"最低互補"。類似地，若分子可互相雜交同時足夠穩定以准許其在習知"高嚴格度"條件下仍可保持彼此黏接，則可將該等分子稱作互補。習知嚴格度條件由Sambrook等人(1989)且由Haymes等人(1985)描述。
因此允許偏離完全互補，只要此等偏離並未完全阻礙分子形成雙股結構之能力。因此，為了使核酸分子或核酸分子之片段可用作引子或探針，其僅需在序列上足夠互補以便可在所採用之特定溶劑及鹽濃度下形成穩定雙股結構。
促進DNA雜交之適當嚴格度條件(例如在約45℃下6.0 x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在50℃下以2.0×SSC洗滌)為熟習此項技術者已知的或可發現於分子生物學現行規範(Current Protocols in Molecular Biology)(1989)中。舉例而言，洗滌步驟中鹽濃度可選自在50℃下約2.0×SSC之低嚴格度至在50℃下約0.2×SSC之高嚴格度。此外，洗滌步驟之溫度可自低嚴格度條件下之室溫(約22℃)增加至高嚴格度條件下之約65℃。溫度及鹽皆可變化，或者溫度或鹽濃度保持不變而其他變數變化。本發明中所用之核酸可在此等條件下特異性地與一或多種來自WCR之核酸分子或其互補序列雜交。本發明中所用之核酸較佳展示與一或多種如序列列表中所述之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中所述之核酸分子間之至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約98%或甚至約100%之序列同一性。
本發明之核酸亦可藉由此項技術中已知之方法完全或部分(尤其需提供植物較佳序列)合成。因此，可使用經選擇宿主之較佳密碼子合成所有或一部分本發明之核酸。例如可自特定宿主物種中表現之蛋白中最常用的密碼子測定物種較佳密碼子。核苷酸序列之其他修飾可產生具有輕微改變活性之突變體。
dsRNA或siRNA核苷酸序列包含雙股聚合核糖核苷酸且可包括對磷酸－糖主鏈或核苷之修飾。可剪裁RNA結構中的修飾以允許特異性基因抑制。在一實施例中，可經由酶促過程修飾dsRNA分子以產生siRNA分子。siRNA可有效地調節一些昆蟲中一些目標基因之降－調節效應。可藉由利用在真核RNAi路徑中存在於昆蟲、有脊椎動物、真菌或植物細胞中之RNAse III酶或DICER酶完成此酶促過程(Elbashir等人2002；Hamilton及Baulcombe，1999)。此過程亦可利用經由熟習此項技術者不難已知之重組DNA技術導入目標昆蟲細胞中之重組DICER或RNAse III。天然產生於昆蟲中或經由重組DNA技術製成之DICER酶及RNAse III將較大dsRNA股分解為較小寡核苷酸。DICER酶特異性地將dsRNA分子切割為長度各為19至25個核苷酸之siRNA碎片，而RNAse III酶通常將dsRNA分子分解為12至15個鹼基對siRNA。藉由具有2至3個核苷酸3'懸垂物及5'磷酸酯及3'羥基末端之酶之任一者產生siRNA分子。藉由RNAse III酶產生之siRNA分子與彼等藉由切斷酶在真核RNAi路徑中產生者相同，且因此接著由固有細胞RNA－降解機制定為目標並降解，在其隨後解開後分成單股RNA並與藉由目標基因轉錄之RNA序列雜交。此過程導致有效降解或移除藉由昆蟲中目標基因之核苷酸序列編碼之RNA序列。結果為昆蟲內的特定目標核苷酸序列沉默。酶促過程之詳細描述可發現於Hannon(2002)中。
本發明之核苷酸序列可記錄於電腦可讀取媒體上。如本文所用之"電腦可讀取媒體"係指任何可經由電腦讀取及直接存取之可觸知表現媒體。此等媒體包括(但不限於)磁性儲存媒體(諸如軟性磁碟、硬碟、儲存媒體及磁帶)；光儲存媒體(諸如CD－ROM)；電儲存媒體(諸如RAM及ROM)；光學字元辨識格式化電腦檔案及此等分類之混合(諸如磁性/光儲存媒體)。熟練技術人員不難瞭解任何現今已知電腦可讀取媒體可用於產生包含可將本發明之核苷酸序列記錄於其上之電腦可讀取媒體的產品。
如本文所用之"記錄"係指用於在電腦可讀取媒體上儲存資訊之過程。熟練技術人員不難接受任何現今已知的用於在電腦可讀取媒體上記錄資訊以產生包含本發明之核苷酸序列資訊之媒體的方法。熟練技術人員可利用大量資料儲存結構以產生可將本發明之核苷酸序列記錄於其上之電腦可讀取媒體。對資料儲存結構之選擇通常基於經選擇用於存取經儲存資訊之方法。此外，大量資料處理器程式及格式可用於將本發明之核苷酸序列資訊儲存於電腦可讀取媒體上。序列資訊可以文字處理文本檔案表示、格式化於市售軟體(諸如WordPerfect及Microsoft Word)中，或以ASCII文本檔案形式表示、儲存於庫應用(諸如DB2、Sybase、Oracle或其類似物)中。熟練技術人員不難接受任何數目之資料處理器結構格式(例如本文檔案或庫)以獲得可將本發明之核苷酸序列資訊記錄於其上之電腦可讀取媒體。
電腦軟體為公開可用的，其允許熟練技術人員存取電腦可讀取媒體中提供之序列資訊。實施BLAST(Altschul等人，1990)及BLAZE(Brutlag等人，1993)於Sybase系統上之搜尋算法之軟體可用於在序列(諸如本文提供的且含有與ORF或來自其他有機體之蛋白的同源性之單一基因(Unigene)及EST)內識別開放閱讀框架(ORF)。此等ORF為本發明之序列內的蛋白編碼片段且可用於產生商業上重要的蛋白，諸如用於胺基酸生物合成、代謝、轉錄、轉譯、RNA加工、核酸及蛋白降解、蛋白修飾及DNA複製、限制、修飾、重組及修復之酶。
本發明進一步提供含有本文所述之序列資訊之系統，尤其為基於電腦的系統。此等系統經設計以識別本發明之核酸分子之商業上重要的片段。如本文所用之"基於電腦的系統"係指用於分析本發明之核苷酸序列資訊之硬體構件、軟體構件及資料儲存構件。本發明之基於電腦的系統之最少硬體構件包含一中央處理單元(CPU)、輸入構件、輸出構件及資料儲存構件。熟練技術人員不難瞭解現今可用之基於電腦的系統之任一者適用於本發明。
如本文所用之"目標結構基元"或"目標基元"係指任何經合理選擇之序列或序列組合(其中基於形成於目標基元之折疊上之三維組態選擇該等序列或該序列)。此項技術中已知大量目標基元。蛋白目標基元包括(但不限於)酶促活性部位及訊號序列。核酸目標基元包括(但不限於)啟動子序列、順式元件、U形結構及誘導性表現元件(蛋白結合序列)。
B.重組載體及宿主細胞轉形作用
舉例而言，重組DNA載體可為線性或封閉圓環質體。載體系統可為單一載體或質體或兩個或兩個以上同時含有全部待引入細菌宿主基因組之DNA的載體或質體。此外，細菌載體可為表現載體。如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中所述之核酸分子或其片段或互補序列可(例如)在適合啟動子控制下適合地***載體中，該啟動子在一或多種微生物宿主中作用於驅動受連接之編碼序列或其他DNA序列之表現。許多載體可用於此目的，且對適當載體之選擇主要取決於待***載體的核酸之尺寸及待以該載體轉形之特定宿主細胞。各載體含有不同的視其功能(DNA之擴增或DNA之表現)及其與之相容之特定宿主細胞而定之組份。用於細菌轉形之載體組份通常包括(但不限於)一或多種下述者：一訊號序列、一複製起始點、一或多種可選擇標記基因及一使外源DNA表現之誘導性啟動子。
表現及選殖載體通常含有一選擇基因，亦係指一可選擇標記。此基因編碼生長於選擇性培養基中之經轉形宿主細胞存活或生長必需之蛋白。典型選擇基因編碼蛋白其(a)具有抗抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline))性，(b)補充營養缺陷缺失或(c)供應不可自複雜培養基中得到之關鍵營養，例如供給桿菌之基因編碼D－丙胺酸消旋酶。彼等經異源蛋白或其片段成功轉形之細胞產生具有藥物抗性且因此倖免於選擇療法之蛋白。
用於產生mRNA之表現載體亦可含有誘導性啟動子，該啟動子由宿主細菌有機體識別並可操作地連接至核酸編碼(例如編碼所關心的西方玉米根蟲(D.v.virgifera )mRNA或其片段之核酸分子)。適於在細菌宿主中使用之誘導性啟動子包括β－內醯胺酶啟動子、大腸桿菌(E.coli )λ噬菌體PL及PR啟動子，及大腸桿菌半乳糖啟動子、***膠糖啟動子、鹼性磷酸酶啟動子、色胺酸(trp)啟動子，及乳糖操縱子啟動子及其變化及雜交啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其他已知細菌誘導性啟動子為適合的。
如所用之關於調節序列及結構核苷酸序列之術語"可操作地連接"意謂調節序列引起經連接結構核苷酸序列之受調節表現。"調節序列"或"控制元件"係指位於結構核苷酸序列之上游(5'非編碼序列)、內、下游(3'非轉譯序列)之核苷酸序列，且其影響轉錄時機及程度或量、RNA加工或穩定性、或相關結構核苷酸序列轉譯。調節序列可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、強化子、桿狀－環狀結構、壓製劑結合序列及多聚腺嘌呤識別序列及其類似物。
或者表現建構體可併入具有合併載體之細菌基因組中。合併載體通常含有至少一個與允許載體合併之細菌基因體同源之序列。合併似乎產生於載體與細菌基因體中之同源DNA之間的重組。舉例而言，與來自不同桿菌菌株之DNA一起建構之合併載體併入桿菌基因體(EP 0 127,328)。合併載體亦可包含噬菌體或轉座子序列。自殺載體亦為此項技術中已知的。
含有一或多種上文列出組份之適合載體之建構體採用標準重組DNA技術。經分離質體或DNA片段經分解、剪裁並再接合為所要形式以產生所需質體。可用的細菌表現載體之實例包括(但不限於)多功能大腸桿菌選殖及諸如BluescriptT M (Stratagene,La Jolla,CA)之表現載體(其中(例如)西方玉米根蟲蛋白或其片段可接合至正確***胺基－末端Met及β－半乳糖苷酶之連續7個殘基之序列之載體以便產生雜交蛋白)；pIN載體(Van Heeke及Schuster，1989)；及其類似物。
酵母重組建構體通常可包括一或多種下述者：一啟動子序列、融合搭配物序列、前導序列、轉錄終止序列、可選擇標記。此等元件可組成表現序列盒，其可維持於諸如基因體外元件(例如質體)之複製子中，該元件可穩定維持於諸如酵母或細菌之宿主內。該複製子可具有兩個複製系統，因此允許其維持於(例如)用於表現之酵母中及用於選殖及擴增之原核宿主中。此等酵母－細菌穿梭載體包括YEp24(Botstein等人，1979)、pCl/1(Brake等人，1984)及YRp17(Stinchcomb等人，1982)。此外，複製子可為高或低複製數質體。高複製數質體通常具有約5至約200、且通常約10至約150範圍內之複製數。含有高複製數質體之宿主較佳具有至少約10、且更佳至少約20之複製數。
有用酵母啟動子序列可衍生於在新陳代謝路徑中編碼酶之基因。此等基因之實例包括包括醇脫氫酶(ADH)(EP 0 284044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖－6－磷酸異構酶、甘油醛－3－磷酸－脫氫酶(GAP或GAPDH)、已糖激酶、磷酸果糖激酶、3－磷酸甘油酸變位酶及丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 3215447)。編碼酸性磷酸酶之酵母PHO5基因亦提供有用啟動子序列(Myanohara等人，1983)。此外，不天然產生之合成啟動子亦起酵母啟動子的作用。此等雜交啟動子之實例包括連接至GAP轉錄活性區域之ADH調節序列(美國專利第4,876,197及4,880,734號)。轉錄終止子序列及其他酵母識別終止序列(諸如彼等醣解酶之編碼)之實例為熟習此項技術者已知的。
或者表現建構體可併入具有合併載體之酵母基因組。合併載體通常含有至少一個與允許載體合併之酵母基因體同源之序列，且較佳含有兩個側接表現建構體之同源序列。合併似乎產生於載體與酵母基因體內同源DNA之間的重組(Orr－Weaver等人，1983)。合併載體可藉由為載體中的包涵物選擇適當同源序列指向酵母中的特異性位點。見Orr－Weaver等人(見上述)。一或多種表現建構體可合併，可能影響產生的重組蛋白之量(Rine等人，1983)。
本發明亦預期將本發明之核苷酸序列轉形至植物中以達到對一或多個dsRNA分子之表現的害蟲抑制程度。可使用此項技術中可用之方法容易地製備轉形載體。轉形載體包含一或多個核苷酸序列，該核苷酸序列可經轉錄為RNA分子且其大體上與一或多個由昆蟲基因組編碼之核苷酸序列同源及/或互補，因此一旦吸收RNA，即存在昆蟲基因組之至少一個個別核苷酸序列之表現降調節。
可將轉形載體稱作dsDNA建構體且亦可將其定義為重組分子、昆蟲控制劑、基因分子或嵌合基因建構體。本發明之嵌合基因建構體可包含(例如)編碼一或多個反義轉錄物、一或多個有義轉錄物、一或多個上述之各者之核苷酸序列，其中自其形成之轉錄物之全部或部分與包含由昆蟲基因組內的核苷酸序列編碼之RNA序列之RNA分子之全部或部分同源。
在一實施例中，植物轉形載體包含一經分離及純化DNA分子，該分子包含可操作地連接至一或多個本發明之核苷酸序列的啟動子。核苷酸序列係選自由序列列表中所述之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906組成之群。核苷酸序列包括編碼存在於目標害蟲RNA轉錄物中之RNA的全部或部分之區段且可包含目標害蟲RNA之全部或部分之反向重複。包含表現載體之DNA分子亦可含有位於編碼序列上游或甚至編碼序列內之功能性內含子序列，且亦可含有一位於啟動子與轉譯起始點之間的(5')不可轉譯前導序列(意即UTR或5'－UTR).
植物轉形載體可含有來自超過一個基因之序列，因此可允許產生超過一個用於抑制目標害蟲細胞中兩個或兩個以上基因表現之dsRNA。熟習此項技術者不難瞭解其序列與存在於不同基因中者一致之DNA區段可組合為用於在轉殖基因植物中表現之單一複合DNA區段。或者可藉由在強化子與啟動子與終止子序列之間連續***之額外DNA區段修飾已含有至少一個區段之本發明之質體。在經設計用於抑制多基因之本發明之昆蟲控制劑中，可自相同昆蟲物種獲得待抑制基因以便增強昆蟲控制劑之有效性。在某些實施例中，基因可衍生於不同昆蟲以加寬藥劑對其有效之昆蟲範圍。當為抑制或表現與抑制之組合將多基因定為目標時，可如Fillatti之美國申請公開案第2004－0029283號所說明及揭示的製造多順反子DNA元件。
在不同植物物種中起作用之啟動子亦為此項技術中熟知的。對植物中多肽表現有用之啟動子包括彼等如Odell等人(1985)所述為誘導性、病毒性、合成或組成性者，及/或在時間上受調節、空間上受調節及時空上受調節之啟動子。較佳啟動子包括經增強之CaMV35S啟動子及FMV35S啟動子。為了本發明之目的，例如為了最佳控制以根為食之物種，較佳可達到植物根內此等基因表現之最高程度。已識別大量根－經提昇啟動子且其為此項技術中已知的(Lu等人，2000；美國專利案第5,837,848及6,489,542號)。
本發明之重組DNA載體或建構體通常包含具有在植物細胞上的可選擇表型之可選擇標記。可選擇標記亦可用於選擇含有編碼本發明之多肽或蛋白之外源核酸的植物或植物細胞。標記可編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如康黴素(kanamycin)、G418博萊黴素(bleomycin)、潮黴素(hygromycin)等)或除草劑抗性(例如草甘膦(glyphosate)等)。可選擇標記之實例包括(但不限於)編碼康黴素抗性及經選擇以使用康黴素、G418等之neo基因、編碼雙丙胺膦抗性之bar基因；編碼草甘膦抗性之突變體EPSP合成酶基因；具有抗溴苯腈(bromoxynil)性之腈水解酶基因；具有咪唑啉酮(imidazolinone)或磺醯脲(sulfonylurea)抗性之突變體乙醯乳酸合成酶基因(ALS)及甲胺喋呤抗性DHFR基因。在美國專利5,550,318；5,633,435；5,780,708及6,118,047中說明此等可選擇標記之實例。
本發明之重組載體或建構體亦可包括可篩檢標記。可篩檢標記可用於監控表現。例示性可篩檢標記包括β－葡糖苷酸酶或編碼不同產色底物為已知之酶之uid A基因(GUS)(Jefferson，1987；Jefferson等人，1987)；R－位點基因，其編碼調節植物組織中花青素色素(紅色)產生之產物(Dellaporta等人，1988)；β－內醯胺酶基因(Sutcliffe等人，1978)，編碼不同產色底物為已知(例如PADAC，產色頭孢菌素)之酶之基因；螢光素酶基因(Ow等人，1986)，編碼可轉換產色兒茶酚之兒茶酚加雙氧酶之xylE 基因(Zukowsky等人，1983)；α－澱粉酶基因(Ikatu等人，1990)；乾酪胺酸酶基因(Katz等人，1983)，其編碼可將酪胺酸氧化為DOPA及多巴醌，DOPA及多巴醌又濃縮為黑色素之酶；α－半乳糖苷酶，其催化產色α－半乳糖底物。
較佳植物轉形載體包括彼等衍生於根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之Ti質體者(例如美國專利案第4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501,967及EP 0 122 791號)。發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes )質體(或"Ti")亦有用且為此項技術中已知的。其他較佳植物轉形載體包括彼等(例如)由Herrera－Estrella(1983)；Bevan(1983)、Klee(1985)及EP 0 120 516揭示者。
通常較佳將功能性重組DNA導入植物基因組中非特異性位置。在特別情況下，藉由位點特異性合併***重組DNA建構體為有用的。存在的若干已知為對植入物起作用之位點特異性重組系統包括揭示於美國專利4,959,317中之cre－lox及揭示於美國專利5,527,695中之FLP－FRT。
咸信用於在本發明中使用之用於宿主細胞轉形之適合方法包括實際上任何可藉由其將DNA導入細胞(諸如藉由直接傳遞DNA、諸如藉由原生質體之PEG調節轉形(Omirulleh等人，1993)、藉由乾燥/抑制調節DNA吸收(Potrykus等人，1985)、藉由電穿孔(美國專利案第5,384,253號)、藉由以碳化矽纖維攪動(Kaeppler等人，1990；美國專利案第5,302,523號；及美國專利案第5,464,765號)、藉由土壤桿菌－調節轉形(美國專利案第5,591,616號及美國專利案第5,563,055號)及藉由DNA塗佈粒子加速(美國專利案第5,550,318；美國專利案第5,538,877號；及美國專利案第5,538,880號)等)之方法。經由諸如此等技術應用，可將實際上任何物種之細胞穩定轉形。在多細胞物種情況下，轉殖基因細胞可再生為轉殖基因有機體。
用於產生轉殖基因植物及在植物中表現異源核酸特別為已知的且可與本文提供之核酸一起使用以製備展示受目標害蟲有機體(諸如玉米根蟲)取食之易感性減少之轉殖基因植物。舉例而言，可藉由將本文揭示之dsRNA產生的核酸導入植物轉形載體並將此等載體導入植物製備植物轉形載體。藉由修飾根瘤土壤桿菌之天然基因轉移系統衍生一種已知載體系統。天然系統包含含有大區段之大Ti(瘤誘導)質體，其已知為T－DNA，經轉移至經轉形植物。Ti質體之另一區段vir區域負責T－DNA轉移。T－DNA區域由末端重複序列連接。在經修飾二元載體中，已刪除瘤誘導基因並利用vir區域之功能轉移由T－DNA邊緣序列接壤之外來DNA。T區域亦可含有供轉殖基因植物及細胞充分恢復之可選擇標記，及供用於轉移之諸如dsRNA編碼核酸之序列***之多選殖位點。
使用土壤桿菌轉形方法形成之轉殖基因植物通常含有***一個基因體之單一簡單重組DNA序列且稱作轉殖基因事件。可將此等轉殖基因植物稱為受***的外緣序列雜合。可藉由使獨立隔離轉殖基因植物自體受精產生F1種子獲得關於轉殖基因之轉殖基因植物雜合。所產生F1種子的四分之一可關於轉殖基因雜合。使F1種子發芽產生可通常使用考慮雜合體與純合體之間的相異性的SNP檢定或熱擴增檢定(意即接合性檢定)測試其雜合性或純合性之植物。
C.核酸表現及目標基因抑制
本發明提供作為實例之一經轉形宿主或共生體害蟲目標有機體、經轉形植物細胞及經轉形植物及其後裔。經轉形植物細胞及經轉形植物可經改造以表現一或多個本文所述之dsRNA或siRNA序列從而提供害蟲保護效應。此等序列可用於害蟲有機體中之基因抑制，由此減少害蟲對受保護經轉形宿主或共生體有機體之捕食。如本文所用之字"基因抑制"意欲指稱任何熟知用於減少基因轉錄為mRNA及/或mRNA之隨後轉譯之程度之方法。
基因抑制亦意欲意謂減少自基因或編碼序列之蛋白表現，包括轉錄後基因抑制及轉錄抑制。轉錄後基因抑制受自目標為抑制之基因或編碼序列轉錄之mRNA之全部或部分與相應用於抑制的雙股RNA之間的同源性調節，且係指大體上及可量測之在供核糖體結合之細胞中可用之可用mRNA之量的減少。經轉錄RNA可為有義取向以產生所謂共抑制，可為反義取向以產生所謂反義抑制，或為兩個取向產生dsRNA以產生所謂RNA干擾(RNAi)。
轉錄抑制受細胞中存在之dsRNA基因抑制劑調節，該抑制劑展示與啟動子DNA序列或其互補序列之大體上序列同一性從而實現所稱的啟動子trans 抑制。基因抑制可對與形狀相關之原生植物基因有效，例如給植物提供經減少量之由原生基因編碼之蛋白或經增強或減少量之受感染代謝物。基因抑制亦可對可攝取或接觸含有基因抑制劑之植物材料之植物害蟲中的目標基因有效，該基因抑制劑特異性地經設計以抑制或抑制害蟲細胞中一或多個同源或互補序列之表現。反義或有義定向RNA轉錄後抑制基因以調節植物細胞中基因表現揭示於美國專利案第5,107,065、5,759,829、5,283,184及5,231,020中。dsRNA抑制植物中基因之用途揭示於WO 99/53050、WO 99/49029、美國專利申請公開案第2003/0175965及2003/0061626號、美國專利申請案第10/465,800號及美國專利案第6,506,559及6,326,193號中。
一種用於植物中轉錄後基因抑制之有益方法採用有義定向及反義定向之經轉錄RNA，其為穩定的，例如為U形及桿狀及環狀結構。較佳用於產生轉錄後基因抑制之DNA建構體為其中第一區段編碼展示反義取向(該取向展示與目標為抑制之基因區段的大體上同一性)之RNA，該RNA連接至為有義取向之編碼展示與第一區段大體上互補之RNA之第二區段者。此建構體藉由第一區段與第二區段雜交且來自核苷酸序列之環狀結構連接該兩個區段形成桿狀及環狀結構(見WO 94/01550、WO 98/05770、US 2002/0048814及US 2003/0018993)。
根據本發明之一實施例，提供一試管內表現導致穩定的RNA序列轉錄之核苷酸序列，該穩定RNA序列與包含由昆蟲基因組內核苷酸序列編碼之RNA序列的昆蟲內的目標RNA分子大體上同源。因此，在昆蟲攝取併入食物中或噴霧於植物表面上之穩定RNA序列之後，與目標昆蟲細胞中的目標基因一致之核苷酸序列之降調節受影響。
使用本發明之穩定dsRNA技術抑制目標基因在與目標為基因抑制之RNA之雙鏈體區域相應之核苷酸序列中為序列特異性的。含有與一部分目標基因相同之核苷酸序列之RNA對抑制為較佳。亦已發現相對於目標序列，有***、缺失及單點突變之RNA序列對抑制為有效的。在執行本發明時，抑制性dsRNA及部分目標基因較佳共享至少約80%之序列同一性，或約90%之序列同一性，或約95%之序列同一性，或約99%之序列同一性，或甚至約100%之序列同一性。或者RNA雙鏈體區域可就其功能定義為可與一部分目標基因轉錄物雜交之核苷酸序列。展示更大同源性之小於全長的序列可補償更長之同源性較小之序列。相同核苷酸序列之長度可為至少約25、50、100、200、300、400、500或至少約1000個鹼基。視目標基因尺寸而定，儘管大於約200至300個核苷酸之序列為較佳且大於約500至1000個核苷酸之序列為尤其較佳，但是一般可使用大於20至100個核苷酸之序列。本發明具有可容忍由於基因突變、株系多態現象或進化趨異可預期之序列變化之益處。導入之核酸分子相對於目標基因之最初轉錄產物或經完全加工之mRNA而言，無需完全同源，無需為全長。因此，熟習此項技術者應認識到如本文所揭示之RNA與目標基因之間的100%之序列同一性並非為實施本發明所需要的。
可藉由量測內因性目標RNA或由目標RNA轉譯產生之蛋白量化目標基因表現之抑制且可藉由檢查細胞或有機體之外在性質證實抑制結果。用於量化RNA及蛋白之技術為一般技術者之一所熟知的。多個可選擇標記為可用的，其具有對安比西林、博萊黴素、氯黴素(chloramphenicol)、健他黴素(gentamycin)、潮黴素、康黴素、林可黴素(lincomycin)、甲胺喋呤、草丁膦(phosphinothricin)、嘌黴素(puromycin)、觀黴素(spectinomycin)、利福平(rifampicin)及四環素及其類似物之抗性。
在某些實施例中，基因表現至少10%、較佳至少33%、更佳至少50%且更佳至少80%受抑制。在本發明之尤其較佳實施例中，昆蟲細胞內基因表現至少80%、更佳至少90%、更佳至少95%或至少99%受抑制，因此發生顯著抑制。顯著抑制意欲指稱充分抑制，其可產生RNA及/或與受抑制目標基因一致之蛋白中的可檢測表型(例如幼蟲生長停止、麻痹或死亡等)或可檢測減少。儘管在本發明之一些實施例中，抑制發生於昆蟲大體上所有細胞內，在其他較佳實施例中，抑制僅發生於表現基因之細胞的子集中。舉例而言，若待抑制基因在昆蟲消化道細胞中起基本作用，則此等細胞內之基因抑制足夠發揮其對昆蟲之不利效應。
可在活體內或試管內合成dsRNA分子。可藉由單一自我互補RNA股或自兩個互補RNA股形成dsRNA。細胞之內因性RNA聚合酶可調節活體內轉錄或經選殖RNA聚合酶可用於在活體內或試管內轉錄。可由器官、組織或細胞類型中的特異性轉錄；環境條件之刺激(例如感染、應力、溫度、化學誘導物)；及/或在發育階段或年齡之工程轉錄將抑制定為目標。RNA股可或不可經聚腺苷酸化；RNA股可或不可經細胞轉譯裝置轉譯為多肽。
可藉由熟習此項技術者手工或自動反應或在另一有機體活體內化學地或酶促地產生本發明之RNA、dsRNA、siRNA或miRNA。亦可藉由部分或全部有機合成產生RNA；可藉由試管內酶促或有機合成產生經修飾核糖核苷酸。可藉由細胞RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(例如T3、T7、SP6)合成RNA。表現建構體制用途及產生為此項技術中已知的(見(例如)WO 97/32016；美國專利案第5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214及5,804,693號)。若由化學合成或藉由試管內酶促合成，則可在導入細胞之前將RNA純化。舉例而言，可藉由以溶劑或樹脂、萃取、沉澱、電泳法、層析法或其組合自混合物中萃取純化RNA。或者可使用未經純化或經最小純化之RNA以避免由於樣品加工造成的損失。RNA可經乾燥以用於儲存或溶解於水溶液中。該溶液可含有緩衝液或鹽以促進黏接及/或穩定雙鏈體股。
對自活體內轉殖基因或表現建構體轉錄而言，調節區域(例如啟動子、強化子、靜止子及多聚腺嘌呤)可用於轉錄RNA股。因此，在一實施例中，用於產生RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至一或多個在微生物、真菌或植物宿主細胞中起作用之啟動子序列。理想地在內因性啟動子控制下放置核苷酸序列，通常其常駐於宿主基因組內。本發明之核苷酸序列在經可操作連接之啟動子序列的控制下可進一步由可有利地影響其轉錄及/或所得轉錄物穩定性之額外序列側接。此等序列通常位於經可操作連接之啟動子之上游及/或表現建構體之3'端之下游且可存在於啟動子之上游及表現建構體之3'端之下游，儘管僅此上游序列亦為所期望的。
如本文所用之術語"昆蟲控制劑"或"基因抑制劑"係指包含一第一RNA區段及一第二RNA區段之特定RNA分子，其中該第一與該第二RNA區段之間的互補形成該兩個區段在活體內及試管內雜交形成雙股分子之能力。其通常較佳包括一第三RNA區段，該第三RNA區段連接及穩定該第一及第二序列，因此完整結構形成桿狀及環狀結構或甚至更堅固地雜交結構形成桿狀－環狀有節結構。或者可在無第三區段存在下形成其中不存在任何經設計之環狀之對稱U形，但由於空間原因，當桿狀足夠長以穩定其自身時，U形可產生其自身環狀。該第一及第二RNA區段通常位於RNA分子長度內且大體上為彼此之***重複序列並藉由第三RNA區段連接在一起。第一及第二區段總是對應且不分別為關於自目標害蟲中的受dsRNA分子之攝取抑制之目標基因轉錄之目標RNA之有義及反義序列。昆蟲控制劑亦可為大體上純化(或經分離)之核酸分子且更特定言之為來自基因體DNA(gDNA)或cDNA庫之核酸分子或其核酸片段分子。或者該等片段可包含具有約15至約250個核苷酸殘基且更佳為約15至約30個核苷酸殘基之較小寡核苷酸。
如本文所用之如其施用於昆蟲或宿主細胞之術語"基因組"不僅涵蓋發現於核內之基因體DNA，而且涵蓋發現於細胞之亞細胞組份內之細胞器DNA。因此導入植物細胞之本發明之DNA可為經基因體合併或定位於細胞器。如其施用於細菌之術語"基因組"涵蓋細菌宿主細胞內之基因體及質體。因此導入細菌宿主細胞之本發明之DNA可為經基因體合併或定位於質體。
如本文所用之術語"害蟲"係指昆蟲、蜘蛛類動物、甲殼綱動物、真菌、細菌、病毒、線蟲綱動物、扁形動物、蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲、絛蟲、錐體蟲、血吸蟲、馬蠅、跳蚤、扁虱、蟎及虱及其類似物，該等害蟲遍佈於人類環境中且其可攝取或接觸由經轉形以表現或塗佈雙股基因抑制劑之害蟲宿主或共生體產生之一或多種細胞、組織或液體或其可攝取含有基因抑制劑之植物材料。如本文所用之"害蟲抗性"性狀為轉殖基因植物、轉殖基因動物、轉殖基因宿主或轉殖基因共生體之特徵，該特徵使得植物、動物、宿主或共生體對來自通常可使植物、動物、宿主或共生體經受損害或損失之害蟲之攻擊有抗性。此等害蟲抗性可產生於天然突變或更通常為產生於具有害蟲抗性之重組DNA之合併。為了將昆蟲抗性給予轉殖基因植物，可(例如)將重組DNA轉錄為在重組植物組織或液體內形成dsRNA分子之RNA分子。dsRNA分子包含於部分RNA區段中，該RNA區段與相應自較佳以重組植物為食之害蟲內的DNA序列編碼之RNA區段相同。目標害蟲內基因表現受dsRNA抑制，且目標害蟲內基因表現抑制導致植物可抗昆蟲。Fire等人(美國專利案第6,506,599號)一般描述害蟲感染之抑制，提供僅關於若干有效於抑制線蟲物種秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans )基因功能之核苷酸序列之細節。類似地，Plaetinck等人(US 2003/0061626)描述dsRNA用於抑制大量線蟲害蟲中基因功能之用途。Mesa等人(US 2003/0150017)描述使用dsDNA序列轉形宿主細胞以表現相應與特異性病原體中目標序列大體上相同之dsRNA序列，且尤其描述建構表現此等dsRNA序列之重組植物供不同植物害蟲攝取，推動害蟲基因組中的基因降調節並改良植物對害蟲感染之抗性。
本發明提供使用穩定的dsRNA方法抑制目標害蟲中一或多個目標基因之基因表現。本發明尤其有用於調節真核基因表現，尤其為調節存在於害蟲中的基因之表現，該等害蟲展示約4.5至約9.5、更佳約5.0至約8.0，且甚至更佳約6.5至約7.5之消化系統pH值。對於具有展示在此等範圍之外的pH值之消化系統之植物害蟲，需要使用無需攝取dsRNA分子之傳遞方法。
dsRNA調節效應適用於大量在害蟲中表現之基因，該等基因包括(例如)負責細胞代謝或細胞轉形之內因性基因、包括管家基因、轉錄因子及其他編碼有關細胞代謝之多肽的基因。
如本文所用之片語"抑制基因表現"或"抑制昆蟲細胞中目標基因表現"係指來自目標基因之蛋白及/或mRNA產物之量的缺失(或可觀察到的減少)。特異性係指抑制目標基因而不表現對細胞其他基因之效應且無任何對產生dsRNA分子之細胞內任何基因之效應的能力。抑制害蟲中目標基因之基因表現可導致害蟲中產生新穎表型性狀。
本發明部分地提供一種用於經由使昆蟲暴露於含有本發明之昆蟲控制劑之食物將昆蟲控制劑傳遞至昆蟲的傳遞系統。根據實施例之一者，可將穩定的dsRNA或siRNA分子併入昆蟲食物中或者可將其覆蓋於供昆蟲消耗之食物頂部。本發明亦部分地提供一種用於使昆蟲暴露於含有本發明之昆蟲控制劑之微生物或諸如植物之宿主，藉由攝取微生物或宿主細胞或細胞內含物將昆蟲控制劑傳遞至昆蟲的傳遞系統。根據另一實施例，本發明涉及產生含有轉錄本發明之穩定的dsRNA分子之重組DNA建構體之轉殖基因植物細胞或植物。如本文所用之片語"產生轉殖基因植物細胞或植物"係指採用此項技術中容易得到之重組DNA技術(例如Sambrook等人，1989的)建構轉錄本發明之穩定dsRNA分子之植物轉形載體、轉形植物細胞或植物並產生含有經轉錄的、穩定的dsRNA分子之轉殖基因植物細胞或轉殖基因植物的方法。
在另一實施例中，微生物之非病原性、減毒株可用作昆蟲控制劑之載體，且從此觀點看，載運此等藥劑之微生物亦可稱作昆蟲控制劑。微生物可經改造以表現目標基因之核苷酸序列以產生包含與通常發現於昆蟲細胞內的RNA序列同源或互補之RNA序列之RNA分子。昆蟲暴露於微生物導致微生物之攝取及目標基因表現之降調節直接或間接地受RNA分子或片段或其衍生物調節。
或者本發明提供使昆蟲暴露於併入螺旋混合器中並施用至諸如宿主植物之宿主的表面之本發明之昆蟲控制劑。在一例示性實施例中，藉由昆蟲攝取昆蟲控制劑將昆蟲控制劑傳遞至昆蟲消化道且隨後至昆蟲體內細胞。在另一實施例中，昆蟲控制劑經由其他方法(諸如注射或其他物理方法)感染昆蟲亦准許傳遞昆蟲控制劑。在另一實施例中，RNA分子自身包裹於諸如聚合物之合成基質中並施用至諸如植物之宿主表面。昆蟲對宿主細胞之攝取准許將昆蟲控制劑傳遞至昆蟲且導致宿主中目標基因降調節。
已預見可將本發明之組合物併入植物物種之種子或者作為自重組基因表現之產物併入植物細胞基因組中，或者併入在種植前施用至種子之塗層或種子處理中。本文認為含有重組基因之植物細胞為轉殖基因事件。
咸信在與可提供在對目標害蟲較佳有效範圍內之免受鞘翅目害蟲感染之保護的轉殖基因事件組合時，殺蟲劑處理可提供顯著優勢。此外，咸信存在熟習此項技術者已知之情況，在此情況下使此等轉殖基因事件在較佳有效範圍內為有益的。
本發明部分地提供一種用於將昆蟲控制劑傳遞至昆蟲之傳遞系統。可直接經由口頭攝取或其他熟習此項技術者可採用之方法將本發明之穩定dsRNA或siRNA分子導入昆蟲細胞中，或導入細胞外腔、胞間隙、淋巴系統、消化系統、導入昆蟲循環。口腔導入之方法可包括將RNA與昆蟲食物直接混合，且改造途徑中用作食物之物種經改造以表現dsRNA或siRNA，接著將其餵食待感染之昆蟲。舉例而言，在一實施例中，可將dsRNA或siRNA分子併入或覆蓋於昆蟲食物之頂部。在另一實施例中，可將RNA噴霧於植物表面之上。在另一實施例中，可由微生物表現dsRNA或siRNA且可將微生物施用於植物表面之上或藉由諸如注射之物理方法導入根、莖。在另一實施例中，植物可經基因改造以表現足夠殺死已知為感染植物之昆蟲之量之dsRNA或siRNA。
特定言之，在WCR中實踐本發明時，可將穩定dsRNA或siRNA導入昆蟲內中腸中並達到所要的對目標基因的抑制。如上所述，可將dsRNA或siRNA分子併入食物中或覆蓋在食物上且可由昆蟲攝取。在任何事件中，可在目標害蟲食物中提供本發明之dsRNA。本發明之目標害蟲將展示消化道pH值為約4.5至約9.5、或約5至約8.5、或約6至約8、或約6.5至約7.7、或約7.0。本文將目標害蟲之消化道定義為由目標害蟲攝取之食物在該處暴露於有助於吸收本發明之dsRNA分子的環境中之害蟲內的位置，該環境未經受如此極端以致引起dsRNA之雙股之間的氫鍵拆開並形成單股分子之pH值。
亦預期可以與一般農業操作一致之方式調配由化學或酶促合成產生之dsRNA且可將其用作噴霧產品以控制昆蟲感染。調配物可包括高效葉片覆蓋及保護dsRNA免受紫外(UV)損害之紫外防護劑所需的適當黏著劑及濕潤劑。此等添加劑一般用於生物殺昆蟲劑產業且為熟習此項技術者熟知的。此等應用可基於生物學或不基於生物學地與其他噴霧殺昆蟲劑應用組合以增強對使植物免受昆蟲取食損害之保護。
本發明者預期產生殺昆蟲蛋白之細菌菌株可用於為控制昆蟲之目的產生dsRNA。此等菌株可展示經改良之昆蟲控制特性。大量不同細菌宿主可用於產生昆蟲控制dsRNA。例示性細菌可包括大腸桿菌、蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis )、假單胞桿菌屬(Pseudomonas sp. )、發光桿菌屬、致病桿菌屬(Xenorhabdus sp. )、嗜蟲沙雷氏菌(Serratia entomophila )及相關菌沙雷氏菌屬(Serratia sp. )、球形芽孢桿菌(B.sphaericus )、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus )、側孢芽孢桿菌(B.laterosporus )、日本甲蟲芽孢桿菌(B.popilliae )、雙酶梭菌(Clostridium bifermentans )及其他梭菌(Clostridium )物種，或其他孢子形成革蘭氏陽性細菌。在某些實施例中，細菌可經改造以控制諸如蚊之害蟲。
本發明亦係關於用於在微生物中表現之重組DNA建構體。可使用此項技術中已知之方法將所關心的RNA自其轉錄之外源核酸導入諸如細菌細胞或真菌細胞之微生物宿主細胞中。
本發明之核苷酸序列可導入大量原核及真核微生物宿主以產生穩定的dsRNA或siRNA分子。術語"微生物"包括原核及真核微生物物種，諸如細菌、真菌及藻類。其中真菌尤其包括酵母及絲狀真菌。革蘭氏陰性及革蘭氏陽性之說明性原核生物包括腸內菌科(Enterobacteriaceae )，諸如埃希氏菌(Escherichia )、伊文氏桿菌(Erwinia )、志賀桿菌(Shigella )、沙門氏菌(Salmonella )及變形桿菌(Proteus )；芽孢桿菌科(Bacillaceae )；根瘤菌科(Rhizobiceae )，諸如根瘤菌(Rhizobium )；螺旋狀細菌科(Spirillaceae )，諸如發光菌(photobacterium )、醱酵單孢菌(Zymomonas )、沙雷氏菌(Serratia )、氣單胞菌(Aeromonas )、弧菌(Vibrio )、脫硫弧菌(Desulfovibrio )、螺旋菌(Spirillum )；乳酸桿菌(Lactobacillaceae )；假單胞菌科(Pseudomonadaceae )，諸如假單胞菌(Pseudomonas )及醋酸菌(Acetobacter )；固氮菌科(Azotobacteraceae )、放線菌科(Actinomycetales )及硝化桿菌科(Nitrobacteraceae )。真核細胞之一為真菌，諸如藻菌綱(Phycomycetes )及子囊菌(Ascomycetes )，其包括酵母，諸如植酵母(Saccharomyces )及裂殖酵母(Schizosaccharomyces )；及擔子菌(Basidiomycetes )，諸如紅酵母(Rhodotorula )、短梗黴(Aureobasidium )、擲孢酵母(Sporobolomyces )及其類似物。
為植物防昆蟲之目的，大量已知為存在於大量重要作物葉面(植物葉片表面)及/或根圈(植物根周圍的土壤)之微生物亦為操縱、傳播、儲存、傳遞及/或誘變所揭示之重組建構體所需之宿主細胞。此等微生物包括細菌、藻類及真菌。特別關心的為微生物，諸如細菌(例如)芽孢桿菌屬(generaBacillus )(包括種及亞種蘇雲金芽孢桿菌kurstaki變種HD－1(B.thuringiensis kurstaki HD－1 )、蘇雲金芽孢桿菌kurstaki變種HD－73(B.thuringiensis kurstaki HD－73 )、蘇雲金芽孢桿菌sotto變種(B.thuringiensis sotto )、蘇雲金芽孢桿菌berliner變種(B.thuringiensis berliner )、蘇雲金芽孢桿菌thuringiensis變種(B.thuringiensis thuringiensis )、蘇雲金芽孢桿菌tolworthi變種(B.thuringiensis tolworthi )、蘇雲金芽孢桿菌dendrolimus變種(B.thuringiensis dendrolimus )、蘇雲金芽孢桿菌alesti變種(B.thuringiensis alesti )、蘇雲金芽孢桿菌galleriae變種(B.thuringiensis galleriae )、蘇雲金芽孢桿菌aizawai變種(B.thuringiensis aizawai )、蘇雲金芽孢桿菌subtoxicus變種(B.thuringiensis subtoxicus )、蘇雲金芽孢桿菌entomocidu變種(B.thuringiensis entomocidus )、蘇雲金芽孢桿菌tenebrionis變種(B.thuringiensis tenebrionis )及蘇雲金芽孢桿菌san diego變種(B.thuringiensis san diego )；假單胞菌(Pseudomonas )、伊文氏桿菌(Erwinia )、沙雷氏菌、克雷伯氏菌(Klebsiella )、黃單胞菌屬(Zanthomonas )、鏈黴菌(Streptomyces )、根瘤、紅色無硫黃細菌(Rhodopseudomonas )、嗜甲基菌(Methylophilus )、土壤桿菌、醋酸桿菌(Acetobacter )、乳酸桿菌(Lactobacillus )、節桿菌(Arthrobacter )、固氮菌(Azotobacter )、白念珠球菌(Leuconostoc )及產鹼桿菌(Alcaligenes )；真菌，尤其為酵母，例如植酵母屬(generaSaccharomyces )、隱球菌(Cryptococcus )、刻魯維拉菌(Kluyveromyces )、擲孢酵母、紅酵母及短梗黴(Aureobasidium )。特別關心的為此等植物圈細菌物種，諸如假單胞菌(Pseudomonas syringae )、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens )、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens )、木醋桿菌(Acetobacter xylinum )、根瘤土壤桿菌、球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides )、油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris )、Rhizobium melioti 、真養產鹼桿菌(Alcaligenes eutrophus )及棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii )；及植物圈酵母物種，諸如深紅酵母菌(Rhodotorula rubra )、酵母拮抗菌(R.glutinis )、R.marina 、橙黃紅酵母(R.aurantiaca )、淺白隱球菌(Cryptococcus albidus )、C.diffluens 、酵母拮抗菌(C.laurentii )、Saccharomyces rosei 、S.pretoriensis 、釀酒酵母(S.cerevisiae )、擲孢酵母(Sporobolomyces roseus )、香味酵母菌(S.odorus )、Kluyveromyces veronae 及Aureobasidium pollulans 。
D.轉殖基因植物
本發明提供具有一或多種轉殖基因事件之種子及植物。將事件組合稱作"堆疊"轉殖基因事件。此等堆疊轉殖基因事件可為指向相同目標害蟲之事件，或者其可指向不同目標害蟲。在一實施例中，具有表現本文提供之核酸能力之種子亦具有表現至少一種其他殺昆蟲劑之能力，其包括(但不限於)其序列衍生於在目標害蟲中表現之RNA之序列之RNA分子及一旦在種子或自種子長成之植物細胞中表現即形成雙股RNA結構者，其中目標害蟲攝取一或多個植物細胞導致抑制目標害蟲細胞中的RNA表現。
在某些實施例中，具有表現dsRNA(其序列衍生於目標害蟲)能力之種子亦具有提供除草劑耐性之轉殖基因事件。除草劑耐性基因之一有益實例提供對草甘膦、N－(膦醯基甲基)甘胺酸，包括此除草劑之異丙胺鹽形式的抗性。
在本方法中，轉殖基因種子或自該種子長成之植物之細胞內的殺昆蟲量之dsRNA表現聯同以一些化學或蛋白殺蟲劑處理種子或植物之組合可用於提供意外的協同優勢(包括較好的防目標害蟲對所得轉殖基因植物損害之功效)。在特定實施例中，以每100 kg種子約100 gm至約400 gm殺蟲劑處理可表現某些形成dsRNA分子(其序列衍生於一或多個在玉米根蟲中表現之序列)之建構體的轉殖基因種子可提供意外較好的防玉米根蟲之保護。此外，咸信此等組合亦有效於保護水生植物免受其他害蟲之捕食。本發明之種子亦可用於較少殺蟲劑使用之費用，此係由於與未使用此等方法之情況相比，可用較少殺蟲劑獲得所需量之保護。此外，由於使用較少殺蟲劑且由於其在種植之前施用且無單獨土地施用，因此咸信該標的方法對操作者及環境更安全且可能沒有習知方法昂貴。
藉由"協同"其意謂包括組合對轉殖基因事件與殺蟲劑之組合的殺蟲劑活性之協同效應(或功效)。然而，其不欲將此等協同效應限制為殺蟲劑活性，但其應亦包括此等如活性範疇增加、與損害減少之類型及量有關之有利活性分佈、殺蟲劑及施用的費用減少、殺蟲劑在環境中分佈減少、生產、處理及種植玉米種子人員暴露於殺蟲劑的減少及其他熟習此項技術者已知之優勢之意外優勢。
與本發明之方法及組合物組合(包括如種子處理及塗佈及用於使用此等組合物之方法)之在組合物中有用之殺蟲劑及殺昆蟲劑可發現於(例如)美國專利案第6,551,962號中，其全文以引用的方式併入本文中。
儘管咸信種子處理可施用於任何生理狀態之轉殖基因種子，但較佳為種子處於具有足夠堅固性之狀態以便在處理過程期間不受到任何損害。通常種子可為已自田間收穫；自轉殖基因植物移除；並自任何其他非種子植物物質分離之種子。種子較佳亦具有使處理不能對種子造成生物損害之程度的生物穩定性。例如，在一實施例中，處理可施用於已收穫、清潔且乾燥至水分含量低於約15重量%之種子玉米。在一替代實施例中，種子可為已經乾燥且接著以水及/或另一種物質滲調且接著在以殺蟲劑處理之前或期間重新乾燥之種子。在所述限制內，咸信處理可在介於種子收穫之種子播種之間的任何時間施用至種子。如本文所用之術語"未播種之種子"意謂包括在種子收穫至將種子播種至地裏以使植物發芽及生長期間之任何時期的種子。當表述以殺蟲劑"處理"未播種之種子時，此處理不意謂包括將殺蟲劑施用於土壤之彼等實踐，而是將處理直接施用於種子。舉例而言，不認為此等如在條帶內、"T"帶或在溝中施用殺蟲劑且同時播種種子之處理包括在本發明內。
可施用"純"殺蟲劑或殺蟲劑組合，意即不存在任何稀釋或額外組份。然而，通常以殺蟲劑調配物之形式將殺蟲劑施用於種子。此調配物可含有一或多種其他所要組份，該等組份包括(但不限於)液體稀釋劑、用作殺蟲劑基質之黏合劑、用於在應力狀態期間保護種子之填充劑及改良塗層可撓性、黏著及/或延展性之增塑劑。
標的殺蟲劑可施用至種子作為種子塗層之組份。此項技術中已知之種子塗佈方法及組合物在藉由添加本發明之殺蟲劑組合之實施例之一者將其改質時有用。此等塗佈方法及用於施用之裝置揭示於(例如)美國專利案第5,918,413、5,891,246、5,554,445、5,389,399、5,107,787、5,080,925、4,759,945及4,465,017號中。種子塗佈組合物分別揭示於(例如)美國專利案第5,939,356、5,882,713、5,876,739、5,849,320、5,834,447、5,791,084、5,661,103、5,622,003、5,580,544、5,328,942、5,300,127、4,735,015、4,634,587、4,383,391、4,372,080、4,339,456、4,272,417及4,245,432號中。
在塗佈中有用之殺蟲劑為彼等本文描述之殺蟲劑。用於處理種子之殺蟲劑之量視種子類型及活性組份類型而變化，但處理包含以殺蟲有效量之殺蟲劑組合接觸種子。當昆蟲為目標害蟲時，該量為殺昆蟲有效量之殺昆蟲劑。如本文所用之殺昆蟲有效量意謂該殺昆蟲劑之量可殺死幼蟲或生長之蛹狀態中之害蟲，或一貫地減少或阻礙由害蟲產生之損害量。
通常處理中施用至種子之殺蟲劑之量在每100 kg種子重量約10 gm至約2000 gm殺蟲劑活性組份範圍內。殺蟲劑之量較佳在每100 kg種子約50 gm至約1000 gm活性範圍內，更佳在每100 kg種子約100 gm至約600 gm活性範圍內，且甚至更佳在每100 kg種子重量約200 gm至約500 gm活性範圍內。或者已發現殺蟲劑之量較佳為每100 kg種子超過約60 gm殺蟲劑活性組份，且更佳為每100 kg種子超過約80 gm。
在處理中使用之殺蟲劑不可抑制種子發芽且在給種子或植物造成損害之目標昆蟲生命週期的該段時間期間應有效保護種子及/或植物。大體上，塗佈應在播種後約0至120天內有效。標的發明之殺蟲劑可以塗層之形式施用於種子。
本發明提供之好處可包括(但不限於)將dsRNA導入昆蟲細胞之容易程度、可使用之dsRNA之低濃度、dsRNA之穩定性及抑制的有效性。使用低濃度穩定dsRNA之能力避免了反義干擾之若干不利條件。與一些此項技術中已知之可用技術(諸如反義及共抑制)相比，本發明並非限於試管內使用或限於特異性序列組合物、限於特定組織目標基因、目標基因核苷酸序列之特定部分或特定轉殖基因或限於特定傳遞方法。此外，基因操縱在並非為常規基因模型之有機體中成為可能。
在操作本發明時，可進行選擇以確保自重組建構體轉錄之核苷酸序列之存在對非害蟲細胞無害。此可藉由將展示與植物或有脊椎動物中相應基因序列同一性程度較低之基因定為目標達到。序列同一性程度較佳少於大約80%。序列同一性程度更佳少於大約70%。序列同一性程度最佳少於大約60%。
除以重組DNA建構體直接轉形植物之外，可藉由將具有重組DNA建構體之第一植株與缺少該建構體之第二植株雜交製備轉殖基因植物。舉例而言，可將用於基因抑制之重組DNA導入順從轉形之第一植株系以產生可與第二植株系雜交使得用於基因抑制之重組DNA基因滲入第二植株系之轉殖基因植物。
本發明實際上可與植物中其他昆蟲控制性狀組合以達到所要的經增強的對昆蟲感染控制之性狀。將採用相異作用模式之昆蟲控制性狀組合可提供昆蟲保護轉殖基因植物，該等轉殖基因植物由於抗性在田間發展之可能性減少，因此與有單一昆蟲控制性狀之植物相比具有較高的堅固性。
在過去數年中已廣泛研究蘇雲金芽孢桿菌結晶蛋白殺昆蟲活性之機制。已表明結晶蛋白僅在攝取蛋白後對昆蟲的幼蟲形式有毒。在鱗翅目幼蟲中，昆蟲中腸中的鹼性pH及蛋白水解酶使蛋白溶解，由此使對昆蟲有毒之組份釋放。此等有毒組份破壞中腸細胞，導致昆蟲停止取食且最終使得昆蟲死亡。為此，蘇雲金芽孢桿菌已證明其自身對處理不同害蟲有效且為環境安全殺昆蟲劑。鞘翅目及半翅目昆蟲及可能的雙翅目、草盲蝽(Lygus)及其他刺式及吸式昆蟲展示消化道pH為弱酸性，且因此對鱗翅目幼蟲有效之Bt毒素對此等害蟲無效。亦咸信此等昆蟲消化道之弱酸性pH更適宜於本發明之組合物，且不欲限制為特定理論，鱗翅目幼蟲消化道之鹼性pH可能為先前對展示dsRNA功效之嘗試失敗的一個起作用的原因(Fire等人，美國專利案第6,506,559號；Mesa等人，美國專利公開案第US2003/0150017號；Rajagopal等人，2002；Tabara等人，1998)。因此咸信本文揭示之dsRNA方法應優先用於控制鞘翅目、雙翅目、半翅目、草盲蝽及刺式及吸式昆蟲之組合物及植物中。本文所述之方法及組合物尤其對於將昆蟲中用於抑制之基因定為目標時有用，該等昆蟲展示消化道pH為約4.5至約9.5、或約5.0至約9.0、或約5.5至約8.5、或約6.0至約8.0、或約6.5至約7.7、或約6.8至約7.6、或約7.0。然而，展示消化道pH為約7.5至約11.5、或約8.0至約11.0、或約9.0至約10.0之昆蟲及其他害蟲物種(諸如鱗翅目昆蟲幼蟲)亦意欲在本發明之範疇內。此在當在幼蟲食物中與一或多種Bt蛋白一起提供特異性抑制鱗翅目幼蟲中基因之dsRNA時尤其正確(其考慮當提供為臨限值水平或高於臨限值水平之Bt蛋白時，其通常對鱗翅目幼蟲有毒)。一或多種對相同昆蟲物種有毒之Bt毒素之存在可有效地降低消化道pH、為雙股RNA分子提供穩定環境以發揮其抑制害蟲中的目標基因之效應。
已預期一些穩定dsRNA建構體與一或多種昆蟲控制蛋白基因之組合可產生可增強轉殖基因植物昆蟲控制表型之協合作用。採用人工食物或整個植物組織之昆蟲生物檢定可用於使用dsRNA及昆蟲控制蛋白定義幼蟲死亡率或生長抑制之劑量響應。熟習此項技術者可在生物檢定中測試dsRNA分子與昆蟲控制蛋白之混合物以識別為協同的且為推廣使用昆蟲保護植物所要的活性組合(Tabashnik,1992)。已報導不同昆蟲控制蛋白之間殺死害蟲的協合作用(欲回顧，可見Schnepf等人，1998)。預期協合作用將存在於某些dsRNA之間及某些dsRNA與某些昆蟲控制蛋白之間。
本發明亦係關於含有一或多個本發明之序列的商品產品，且特定言之將自含有一或多個本發明之核苷酸序列的重組植物或種子產生預期為本發明之實施例。含有一或多個本發明之序列的商品產品意欲包括(但不限於)粗粉、油、植物之碾碎或完整穀粒或種子，或任何包含任何粗粉、油或含有本發明之一或多個序列之重組植物或種子的碾碎或完整穀粒之食物產品。對在一或多個本文預期之商品或商品產品中之一或多個本發明之序列的檢測為該商品或商品產品由經設計以表現一或多個本發明之核苷酸序列從而使用dsRNA調節基因抑制方法控制昆蟲感染之轉殖基因植物構成之事實證據。
E.獲得核酸
本發明提供一種用於獲得包含用於產生dsRNA或siRNA之核苷酸序列之核酸的方法。在一實施例中，此方法包含：(a)以包含來自目標昆蟲之全部或部分核苷酸序列或其同源物之雜交探針探測cDNA或gDNA庫；(b)識別與雜交探針雜交之DNA純系；(c)分離步驟(b)中識別之DNA純系；(d)定序包含步驟(c)中分離之純系之cDNA或gDNA片段，其中經定序核酸分子轉錄所有或一大體部分RNA核苷酸序列或其同源物。
在另一實施例中，一種本發明之用於獲得包含用於產生一大體部分dsRNA或siRNA之核苷酸序列之核酸片段的方法包含：(a)合成與來自目標昆蟲之核苷酸序列之一之一部分一致的第一及第二寡核苷酸引子；及(b)使用步驟(a)之該第一及第二寡核苷酸引子擴增選殖載體中的cDNA或gDNA模板，其中經擴增核酸分子轉錄本發明之dsRNA或siRNA之一大體部分。
在實踐本發明時，目標基因可衍生於玉米根蟲(CRW)，諸如WCR或SCR或任何導致作物植株受損害且隨後產量損失之昆蟲物種。預期在選擇較佳目標基因時可採用若干標準。基因為其蛋白產生具有快速轉換速率，因此dsRNA抑制導致蛋白之量快速減少之基因。在某些實施例中，選擇其表現程度微弱下降可導致對昆蟲之不利效應之基因為有利的。若需要以寬範圍之昆蟲物種為目標，則選擇對此等物種高度保守之基因。相反，為具有特異性之目的，在本發明之一些實施例中，選擇含有在個別昆蟲物種之間或在昆蟲與其他有機體之間低度保守之區域的基因。在某些實施例中，選擇具有在其他有機體中無已知同系物之基因為所要的。
如本文所用之術語"衍生於"係指可自特別特定源或物種(雖然並非必需直接自彼特定源或物種)獲得之特定核苷酸序列。
在一實施例中，選擇在昆蟲消化道中表現之基因。在消化道中表現之目標基因避免了對dsRNA在昆蟲內展布之需要。供本發明使用之目標基因可包括(但不限於)彼等共有與已知消化道表現基因之核苷酸序列的大體同源性，該基因編碼液胞及質膜質子V－ATP酶之蛋白組份(Dow等人，1997；Dow，1999)。此蛋白錯合物為上皮離子轉運之唯一激發器且負責中腸內腔之鹼性化。V－ATP酶亦在馬氏(Malpighian)小管中表現，昆蟲後腸之生長物以類似於哺乳動物之腎臟之方式作用於液體均衡及外來化合物解毒。在另一實施例中，V－ATP酶可為Vha68－2或其同源物或其直系同源(例如，如發現於SEQ ID NO：821)。
在另一實施例中，選擇本質上關於昆蟲生長、發育及繁殖之基因。例示性基因包括(但不限於)CHD3基因、β－微管蛋白基因及編碼經預測關於轉運之蛋白的基因。黑腹果蠅中的CHD3基因編碼具有與核中染色質組成/分解有關之ATP依賴DNA解螺旋酶活性之蛋白。已在諸如擬南芥(Arabidopsis thaliana )、秀麗隱桿線蟲及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )之不同有機體中發現類似序列。β－微管蛋白基因家族編碼為細胞骨架組份之微管相關蛋白。在此等諸如秀麗隱桿線蟲(C.elegans )及煙草天蛾之不同有機體中發現相關序列。經預測為轉運所需的胞內分選錯合物(ESCRT)－III之次單位的蛋白(Babst等人，2002)，如Dv49，發現於包括哺乳動物、酵母及諸如西方玉米根蟲(D.virgifera )之昆蟲之不同有機體中。另一轉運相關單位為β'－外被體蛋白，縮寫為β'Cop，其編碼有關降級(高基(Golgi)至ER)轉運之產物。已在秀麗隱桿線蟲及西方玉米根蟲 (例如Dv248(SEQ ID NO：.))中確認類似或經預測序列。
其他供本發明中使用之目標基因可包括(例如)彼等在生存力、生長、發育、繁殖及感染性方面起重要作用者。此等目標基因可為果蠅中管家基因、轉錄因子及昆蟲特異性基因或致死因子剔除突變之一者。供本發明中使用之目標基因亦可為彼等來自其他有機體(例如來自線蟲(例如秀麗隱桿線蟲))者。此外，用於本發明之核苷酸序列亦可衍生於植物、病毒、細菌或真菌基因，該等基因之功能已自文獻建立且其核苷酸序列與昆蟲基因組中的目標基因共有大體相似性。根據本發明之一態樣，對於WCR控制，目標序列可基本上衍生於目標WCR昆蟲。一些來自WCR之cDNA庫之編碼為已知蛋白同系物之西方玉米根蟲蛋白或其片段之例示性目標序列可發現於序列列表中。來自西方玉米根蟲之編碼已知蛋白同系物之核酸分子為已知的(Andersen等人，美國專利申請案第10/205,189號)。
為本發明之目的，可藉由聚合酶鏈(PCRT M )擴增衍生於玉米根蟲gDNA或cDNA庫之目標CRW基因序列或其部分自CRW獲得dsRNA或siRNA分子。可使用熟習此項技術者已知之方法製備WCR幼蟲且可萃取DNA/RNA。具有不同尺寸之在自第一齡期至完全成熟範圍內之CRW的幼蟲可用於本發明之目的萃取DNA/RNA。產生於WCR之基因體組DNA或cDNA庫可用於PCRT M 擴增以產生dsRNA或siRNA。
接著可使用此項技術中不難利用之方法將目標基因PCRT M 擴增並定序。熟習此項技術者可改質PCRT M 條件以確保最佳PCRT M 產物形成。經證實PCRT M 產物可用作試管內轉錄模板(其含有所包括的最小啟動子)以產生有義及反義RNA。
本發明人預期在昆蟲王國中自任何昆蟲物種識別及分離之核酸序列可在本發明中用於控制WCR及另一目標昆蟲。在本發明之一態樣中，核酸可衍生於鞘翅目物種。特定言之，核酸可衍生於葉甲屬之葉甲(鞘翅目，葉甲屬)且更特定言之，本發明之核酸分子可衍生於virgifera群中之物種。最特定言之，本發明之核酸分子可衍生於通常稱作WCR之玉米根葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte )。例如，經分離核酸可用於識別目標基因及建構產生本發明之穩定dsRNA或siRNA以保護植物免受WCR昆蟲感染之重組載體。
因此，在一實施例中，本發明包含自WCR或草盲蝽分離及純化之核苷酸序列(其可用作昆蟲控制劑)。經分離及純化核苷酸序列可包含彼等如序列列表中所述者。
可在本發明中使用之來自WCR或其他昆蟲之核酸亦可包含經分離及大體上純化之單一基因及EST核酸分子或其核酸片段分子。EST核酸分子可編碼該等多肽之顯著部分或實際上大部分。或者該等片段可包含具有約15至約250個核苷酸殘基，且更佳約15至約30個核苷酸殘基之較小寡核苷酸。或者用於本發明之核酸分子可得自來自WCR或來自任何其他鞘翅目害蟲物種之cDNA庫。
可採用來自WCR或其他鞘翅目害蟲物種之核酸分子及其片段以獲得來自其他物種之其他核酸分子以用於本發明中產生所要的dsRNA及siRNA分子。此等核酸分子包括編碼蛋白之全編碼序列之核酸分子及及此等分子之啟動子及側翼序列。此外，此等核酸分子包括為基因家族成員編碼之核酸分子。藉由使用上述核酸分子或其片段篩檢(例如)自西方玉米根蟲或其他鞘翅目或自盲椿獲得之cDNA或gDNA庫不難獲得此等分子。形成此等庫之方法為此項技術中熟知的。
如本文所用之片語"編碼序列"、"結構核苷酸序列"或"結構核酸分子"係指當放置於在適當調節序列控制下時，通常經由mRNA轉譯為多肽之核苷酸序列。藉由在5'末端轉譯起始密碼子並在3'末端轉譯終止密碼子測定編碼序列之邊界。編碼序列可包括(但不限於)基因體組DNA、cDNA、EST及重組核苷酸序列。
術語"重組DNA"或"重組核苷酸序列"係指含有經由借助於突變、限制酶及其類似物操縱的基因工程修飾之DNA。
對於許多可為本發明控制之潛在目標的昆蟲，存在關於大多數基因之序列或由特定基因突變產生的表型之有限資訊。因此，本發明人預期自害蟲中選擇適當基因以用於本發明可藉由使用在其中基因得以表徵之模型有機體(諸如果蠅中、一些其他昆蟲物種中、或甚至線蟲物種中、真菌物種中、植物物種中，)中相應基因之研究中可用之資訊完成。在一些情況下，藉由使用來自(例如)基因自其選殖之果蠅、另一昆蟲、線蟲、真菌之基因或序列之名稱搜尋諸如GenBank之庫獲得來自目標昆蟲之相應基因之序列為可能的。一旦獲得序列，即可使用PCRT M 擴增本發明中所使用之昆蟲基因之適當選擇區段。
為了獲得來自昆蟲物種中相應基因之DNA區段，基於如發現於基因自其選殖之WCR或其他昆蟲之序列設計PCRT M 引子。引子經設計以擴增足夠長之DNA區段以在本發明中使用。自昆蟲物種製備DNA(或基因體組DNA或cDNA)，且用PCRT M 擴增DNA區段。選擇擴增條件以便即使引子與目標序列不完全匹配，擴增可發生。或者可自使用WCR基因或另一已知昆蟲基因作為探針自害蟲物種中製備之gDNA或cDNA庫中選殖基因(或其部分)。執行PCRT M 及自庫選殖之技術為已知的。實例中提供可藉由其基於先前自WCR或其他昆蟲物種中選殖之基因的序列分離來自目標害蟲物種之DNA區段之過程之其他細節。一般技術者應認識到可使用大量技術分離與先前自其他物種中分離之基因一致之來自害蟲物種之基因區段。
當一昆蟲為本發明之目標害蟲時，此等害蟲包括(但不限於)：來自鱗翅目者，例如，長翅卷蛾屬(Acleris spp. )、茶姬卷葉蛾屬(Adoxophyes spp. )、透翅蛾屬(Aegeria spp. )、地夜蛾屬(Agrotis spp. )、Alabama argillaceae 、Amylois spp. 、象鼻蟲(Anticarsia gemmatalis )、葉卷蛾科(Archips spp )、桔帶卷蛾屬(Argyrotaenia spp. )、Autographa spp. 、Busseola fusca 、粉斑螟(Cadra cautella )、桃小食心蟲(Carposina nipponensis )、禾草螟屬(Chilo spp. )、色卷蛾屬(Choristoneura spp. )、葡萄螟蛾(Clysia ambiguella )、Cnaphalocrocis spp. 、卷蛾屬(Cnephasia spp. )、Cochylis spp. 、鞘蛾屬(Coleophora spp. )、大菜螟(Crocidolomia binotalis )、蘋果異形小卷蛾(Cryptophlebia leucotreta )、小卷蛾屬(Cydia spp. )、桿草螟屬(Diatraea spp. )、Diparopsis castanea 、Earias spp. 、粉斑螟屬(Ephestia spp. )、卷葉蛾屬(Eucosma spp. )、卷葉蛾屬(Eupoecilia ambiguella )、黃毒蛾屬(Euproctis spp. )、切根屬(Euxoa spp. )、小食心蟲屬(Grapholita spp. )、Hedya nubiferana 、實夜蛾屬(Heliothis spp. )、菜螟屬(Hellula undalis )、美國白蛾屬(Hyphantria cunea )、Keiferia lycopersicella 、潛蛾屬(Leucoptera scitella )、Lithocollethis spp. 、小卷蛾屬(Lobesia botrana )、毒峨屬(Lymantria spp. )、潛蛾屬(Lyonetia spp. )、天幕毛蟲屬(Malacosoma spp. )、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae )、煙草天蛾、秋尺蛾屬(Operophtera spp. )、玉米螟屬(Ostrinia Nubilalis )、超小卷葉娥屬(Pammene spp. )、褐卷蛾屬(Pandemis spp. )、小眼夜蛾(Panolis flammea )、棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella )、馬鈴薯蠹蛾(Phthorimaea operculella )、菜青蟲(Pieris rapae )、粉蝶屬(Pieris spp. )、小菜蛾(Plutella xylostella )、小白巢蛾屬(Prays spp. )、Scirpophaga spp. 、蛀莖夜蛾屬(Sesamia spp. )、卷蛾科(Sparganothis spp. )、灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp. )、透翅蛾屬(Synanthedon spp. )、Thaumetopoea spp. 、卷蛾屬(Tortrix spp. )、夜蛾屬(Trichoplusia ni )及巢蛾屬(Yponomeuta spp. )；來自鞘翅目者，例如，叩頭蟲屬(Agriotes spp. )、象甲屬(Anthonomus spp. )、甜菜隱食甲(Atomaria linearis )、蚤凹脛跳甲(Chaetocnema tibialis )、象鼻蟲屬(Cosmopolites spp. )、象蟲屬(Curculio spp. )、皮蠹屬(Dermestes spp. )、葉甲屬(Diabrotica spp. )、食植瓢蟲屬(Epilachna spp. )、Eremnus spp. 、馬鈴薯甲蟲、稻水象屬(Lissorhoptrus spp. )、鰓金龜屬(Melolontha spp. )、Orycaephilus spp. 、象鼻蟲屬(Otiorhynchus spp. )、Phlyctinus spp. )、弧麗金龜屬(Popillia spp. )、蚤跳甲屬(Psylliodes spp. )、穀蠹(Rhizopertha spp. )、金龜子科(Scarabeidae )、象鼻蟲科(Sitophilus spp. )、麥蛾屬(Sitotroga spp. )、粉蟲屬(Tenebrio spp. )、擬穀盜屬(Tribolium spp. )及斑皮蠹屬(Trogoderma spp. )；來自直翅目者，例如，蜚蠊屬(Blatta spp. )、小蠊屬(Blattella spp. )、螻蛄屬(Gryllotalpa spp. )、佛羅里達蟑螂(Leucophaea maderae )、飛蝗屬(Locusta spp. )、大蠊屬(Periplaneta ssp. )及Schistocerca spp. ；來自等翅目者，例如，Reticulitemes ssp. ；來自囓蟲目者，例如，書虱屬(Liposcelis spp. )；來自蝨目者，例如，吸血虱屬(Haematopinus spp. )、顎虱屬(Linognathus spp. )、虱屬(Pediculus spp. )、癭綿蚜屬(Pemphigus spp. )及根瘤蚜屬(Phylloxera spp. )；來自食毛目者，例如，Damalinea spp. 及毛虱屬(Trichodectes spp. )；來自纓翅目者，例如，薊馬屬(Franklinella spp.)、Hercinothrips spp.、帶薊馬屬(Taeniothrips spp.)、南黃薊馬(Thrips palmi)、蔥薊馬(Thrips tabaci)及桔硬薊馬(Scirtothrips aurantii)；來自異翅目者，例如，臭蟲屬(Cimex spp.)、可可瘤盲蝽(Distantiella theobroma)、棉紅蝽屬(Dysdercus spp.)、Euchistus spp.、盾蝽屬(Eurygaster spp.)、稻緣蝽屬(Leptocorisa spp.)、綠蝽屬(Nezara spp.)、皮蝽屬(Piesma spp.)、獵蝽屬(Rhodnius spp.)、可可斑褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、稻黑蝽屬(Scotinophara spp.)、錐蝽屬(Triatoma spp.)、盲蝽科家族(Miridae family spp.，諸如盲椿(Lygus hesperus))及Lygus lineoloris、長椿科家族(Lygaeidae family spp.，諸如臭蟲(Blissus leucopterus))、椿象科家族(Pentatomidae family spp.)；來自同翅目者，例如，絲絨粉虱(Aleurothrixus floccosus)、菜粉虱(Aleyrodes brassicae)、片圓蚧屬(Aonidiella spp.)、中國蚜科(Aphididae)、蚜屬(Aphis spp.)、圃盾蚧屬(Aspidiotus spp.)、煙粉虱(Bemisia tabaci)、同翅目屬(Ceroplaster spp.)、Chrysomphalus aonidium、褐圓盾蚧(Chrysomphalus dictyospermi)、褐軟蚧(Coccus hesperidum)、小綠葉蟬屬(Empoasca spp.)、Eriosoma larigerum、斑葉蟬屬(Erythroneura spp.)、白蠟蚧屬(Gascardia spp.)、灰飛虱屬(Laodelphax spp.)、Lacanium corni、牡蠣屬(Lepidosaphes spp.)、Macrosiphus spp.、瘤蚜屬(Myzus spp.)、Nehotettix spp.、褐飛虱屬(Nilaparvata spp.)、Paratoria spp.、癭綿蚜屬(Pemphigus spp.)、動性球菌屬(Planococcus spp.)、桑質蚧屬(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧屬(Pseudococcus spp.)、木虱屬(Psylla ssp.)、Pulvinaria aethiopica、廣盾蚧屬(Quadraspidiotus spp.)、縊管蚜屬(Rhopalosiphum spp.)、黑盔蚧屬(Saissetia spp.)、帶葉蟬屬(Scaphoideus spp.)、二叉蚜屬(Schizaphis spp.)、穀網管蚜屬(Sitobion spp.)、溫室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、非洲木虱(Trioza erytreae)及柑矢尖介殼蟲(Unaspis citri)；來自膜翅目者，例如，Acromyrmex、美切葉蟻屬(Atta spp.)、莖蜂屬(Cephus spp.)、松葉蜂屬(Diprion spp.)、松葉蜂科(Diprionidae)、Gilpinia polytoma、實葉蜂屬(Hoplocampa spp.)、毛蟻屬(Lasius spp.)、小黃家蟻(Monomorium pharaonis)、新松葉蜂屬(Neodiprion spp)、火蟻屬(Solenopsis spp.)及胡蜂屬(Vespa ssp.)；來自雙翅目者，例如，伊蚊屬(Aedes spp.)、Antherigona soccata、Bibio hortulanus、紅頭麗蠅(Calliphora erythrocephala)、實蠅屬(Ceratitis spp.)、金蠅屬(Chrysomyia spp.)、庫蚊屬(Culex spp.)、黃狂蠅屬(Cuterebra spp.)、寡鬃實蠅屬(Dacus spp.)、黑腹果蠅、廁蠅屬(Fannia spp.)、胃蠅屬(Gastrophilus spp.)、舌蠅屬(Glossina spp.)、牛瘤蠅屬(Hypoderma spp.)、Hyppobosca spp.、Liriomysa spp.、綠蠅屬(Lucilia spp.)、黑潛蠅屬(Melanagromyza spp.)、家蠅屬(Musca ssp.)、狂蠅屬(Oestrus spp.)、稻癭蚊屬(Orseolia spp.)、黑麥稈蠅(Oscinella frit)、甜菜潛葉蠅(Pegomyia hyoscyami)、草種蠅屬(Phorbia spp.)、蘋繞實蠅(Rhagoletis pomonella)、眼蕈蚊屬(Sciara spp.)、螫蠅屬(Stomoxys spp.)、虻屬(Tabanus spp.)、Tannia spp.及大蚊屬(Tipula spp.)；來自蚤目者，例如，角葉蚤屬(Ceratophyllus spp.)及印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)及來自纓尾目者，例如，衣魚(Lepisma saccharina)。
已發現本發明在害蟲為葉甲屬時，且尤其在害蟲為Diabrotica virgifera virgifera(西方玉米根蟲，WCR)、Diabrotica barberi(北方玉米根蟲，NCR)、Diabrotica virgifera zea(墨西哥玉米根蟲，MCR)、Diabrotica balteata(巴西玉米根蟲，BzR)或由Diabrotica viridula與Diabrotica speciosa組成之巴西玉米根蟲錯合物(BCR)或Diabrotica undecimpunctata howardi(南方玉米根蟲，SCR)時尤其有效。
實例
發明者已在本文識別用於藉由在害蟲食物中提供雙股核糖核酸分子控制鞘翅目害蟲感染的方法。令人驚訝地是，發明者已發現對藉由害蟲攝取抑制害蟲生物功能起作用的雙股核糖核酸分子導致一或多種下述屬性：減少害蟲之取食、害蟲生存力減少、害蟲死亡、抑制害蟲分化及發育、害蟲無有性繁殖能力或有性繁殖能力降低、肌肉形成、幼體激素形成、幼體激素調節、離子調節及轉運、維持細胞膜電位、胺基酸生物合成、胺基酸降解、***形成、信息素合成、信息素感應、觸角形成、翼形成、腿形成、發育及分化、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經傳遞、細胞***、能量代謝、呼吸、細胞凋亡及真核細胞之細胞骨架結構的任何組份(諸如肌動蛋白及微管蛋白)。此等屬性之任一者或任何組合可導致有效控制害蟲感染，且在植物害蟲情況下，抑制植物感染。舉例而言，當用作局部提供給植物之含有害蟲抑制的足量之一或多種雙股核糖核酸分子之食物組合物、用作種子處理、用作植物周圍土壤施用、或當植物從存在於植物細胞中的重組DNA分子產生時，植物害蟲感染出乎意料地顯著減少。本文下述實例為在施用於單一害蟲時說明本發明。然而，熟練技術人員將認識到實例中存在的該等方法、配方及觀念不欲為限制性，且可施用於所有可消耗可調配為含有足量害蟲抑制劑之食物源的鞘翅目害蟲物種，該害蟲抑制劑由至少一或多種本文例證的意欲抑制一些關於害蟲或在害蟲內起作用的基本特徵之雙股RNA分子組成。
實例1
製備可用於控制玉米根蟲之dsRNA的目標核苷酸序列之識別 自整個幼蟲、蛹及自經解剖中腸部分建構玉米根蟲cDNA庫(LIB149、LIB150、LIB3027、LIB3373)，並獲得核苷酸序列資訊(見Andersen等人，存檔於2002年7月24日之美國專利申請案第10/205,189號，其全文特定地以引用的方式併入本文中)。此外，自在不同發育階段及在各發育階段內之不同時間之整個幼蟲建構cDNA庫以使來自葉甲(Diabrotica )物種的不同EST序列之數量最大化。分別自第一(1公克)及第三(2.9公克)齡期西方玉米根蟲幼蟲獲得之mRNA庫建構庫LIB5444及LIB5462。藉由***液氮迅速將收穫的昆蟲冷凍。藉由在乾冰上冷卻及/或在研缽中添加液氮維持在或低於－20℃下在研缽及研杵中將昆蟲研磨並搗碎直至將組織研磨為精細散劑。根據製造商的使用說明使用TRIzol試劑(Invitrogen)萃取RNA。根據製造商之使用說明使用DYNABEADS Oligo dT(Invitrogen)自總RNA prep中分離出Poly A＋RNA。使用SuperScriptT M Plasmid系統(Invitrogen)自Poly A＋RNA建構cDNA庫。使用層析法將cDNA尺寸分級。收集第四及第五部分並接合至介於Sal 1與Not 1限制性核酸內切酶識別位點之間的pSPORT1載體中(Life Technologies Inc.,Gaithersburg MD)，並藉由電穿孔將第四及第五部分轉形為大腸桿菌DH10B電感受態細胞。第一齡期幼蟲庫產生約420,000個群落形成單位。第三齡期幼蟲庫產生約2.78×106 個群落形成單位。將來自LIB149、LIB150之群落自盤上洗滌，藉由簡短地渦旋將其混合為均質，並集中至Tris－EDTA緩衝液中。將一半洗液放入10%甘油中，等分放入冷凍管中，並於－70℃下儲存。使用Quiagen midi－prep純化柱或其等效物將另一半用於產生質體DNA。將純化質體DNA等分入微量離心管中並在－20℃下儲存。
在高黏度培養基中將來自西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera )幼蟲cDNA庫LIB5444及LIB5462之群落個別擴增。將大約200,000個來自LIB5444之群落形成單位及600,000個來自LIB5462之群落形成單位分別在500 ml含有0.3% SeaPrep agarose及50 mg/l卡本西林(carbenecillin)之LB培養基中在37℃下於一攪拌盤上混合且接著迅速在水/冰浴中冷卻1小時以使細菌群落均一懸浮。接著使經接種庫在30℃下生長42小時。接種後，將細胞於一攪拌盤上混合5分鐘。接著將培養基轉移至兩個250 ml離心瓶中。將細菌細胞在10,000×g下製粒10分鐘。將培養基自瓶中移除且將細胞重新懸浮於一總計為20 ml之具有50 mg/l卡本西林的LB培養基中。添加二甲亞碸至10%以保持細胞凍結。將兩個庫擴增至最終滴定量為每毫升108 個群落形成單位。西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera )cDNAz庫LIB5444及LIB5462之樣品經組合，且在無菌蒸餾及去離子水中調節至DNA濃度為每微升約1.25微克，並等分至25個冷凍管中，各冷凍管含有約8.75微克DNA。申請人/發明人於2004年6月10日將此等樣品存放於位於10801 University Boulevard,Manassas,Virginia,USA ZIP 20110－2209之American Type Culture Collection(ATCC)中且記為LIB5444/62。ATCC為申請人提供存放收據，指定為ATCC存放入藏登記號第PTA－6072號。
大體上如上所述製備玉米根蟲高分子量cDNA庫(意即LIB5496及LIB5498)以用於產生玉米根蟲cDNA庫。庫LIB5496及LIB5498分別建構於自第一(1公克)及第三(1公克)齡期西方玉米根蟲幼蟲獲得之mRNA庫。簡而言之，使昆蟲在液氮中迅速冷卻。藉由在研缽及研杵中研磨將已冷卻的昆蟲弄碎成精細散劑。根據製造商的使用說明使用TRIzol試劑(Invitrogen)萃取RNA。使用DYNABEADS Oligo dT(Invitrogen)自總RNA prep中分離出Poly A＋RNA。使用SuperScriptT M 質體系統(Invitrogen)自20微克Poly A＋RNA製成高分子量cDNA庫。在TAE之1%瓊脂糖凝膠上將cDNA尺寸分級，且收集介於1 Kb至10Kb範圍內的cDNA並將其接合至介於Sal 1與Not 1限制位點之間的pSPORT1載體中並藉由電穿孔轉形為大腸桿菌DH10B電感受態細胞。LIB5496產生約為3.5×106 個群落形成單位之總滴定量。LIB5498產生約為1.0×106 個群落形成單位之總滴定量。在高黏度培養基中將來自玉米根蟲高分子量cDNA庫LIB5496及LIB5498之群落個別擴增。將大約600,000個來自LIB5496及LIB5498之群落形成單位分別在500 ml含有0.3% SeaPrep agarose及50 mg/l卡本西林之LB培養基中在37℃下於一攪拌盤上混合且接著迅速在水/冰浴中冷卻1小時以使細菌群落均一懸浮。接著使庫在30℃下生長42小時。接種後，將細胞於一攪拌盤上混合5分鐘。接著將培養基轉移至兩個250 ml離心瓶中。將細菌細胞在10,000 xg下製粒10分鐘。將培養基自瓶中移除且將細胞重新懸浮於一總計為20 ml之具有50 mg/l卡本西林的LB培養基中。添加二甲亞碸至10%以保持細胞凍結。將兩個庫擴增至最終滴定量為每毫升108 個群落形成單位。自玉米根蟲物種特異性質體庫獲得***cDNA序列資訊。
Andersen等人之根蟲庫加上來自庫LIB5444及LIB5462之額外序列最初產生由大約1.0×107 個核苷酸殘基組成之約18,415條個別EST序列。EST序列之平均長度為約586個核苷酸殘基。此等EST序列經受生物資訊學演算法導致連續體序列總成本文係指UNIGENE序列，且不可藉由與其他EST序列間的重疊同一性編碼之個別EST序列本文係指單條序列。接著將LIB5444及LIB5462庫排序成更加緊密，產生額外個別EST序列。自庫(例如LIB149、LIB150、LIB3027、LIB3373、LIB5444、LIB5462、LIB5496及LIB5503)獲得之EST序列經選擇以用於如下所述之取食生物檢定的進一步調查且相應序列在序列列表中給出。
將自CRW cDNA庫分離之EST序列組合(若可能)為UNIGENE組且此等經組合Unigene序列包括在序列列表中。UNIGENE為形成於個別EST序列在序列同一性區域內重疊以形成更大序列的基因定向簇。Pontius等人(2003)。對入序列列表中所述之核苷酸序列進行分析以識別開放讀碼區之存在。將自開放讀碼區推斷出的胺基酸序列資訊與可在公開庫中得到的已知胺基酸序列資訊比較以推斷出與彼等已知胺基酸序列的胺基酸序列同一性或相似性程度。用與公開庫中已知胺基酸序列相關之生物功能(若存在)註釋自cDNA庫核苷酸序列資訊推斷出的胺基酸序列。註釋提供暗示可自產生特別cDNA序列之特別基因表現之蛋白功能之資訊，但並不產生決定性。基於暗示註釋資訊，可將一些cDNA序列表徵為彼等編碼蛋白者，該蛋白可能與一些在玉米根蟲細胞內的生物功能有關，其或為生命必需的，或為確保細胞健康及生活力所必要的，或可能與細胞完整性、細胞維持、繁殖能力及其類似物有關。
經選擇以用於進一步調查之序列用於建構用於併入CRW食物之雙股RNA分子。基於cDNA及EST起始序列設計熱擴增引子對以獲得用於取食檢定之序列。將引子對建構成或為有義或為反義序列。一些引子對序列經建構以使該對之各成員展示在其5'端含有T7噬菌體RNA聚合酶啟動子之序列。較佳使用缺少T7啟動子之第一引子對進行更高逼真的第一擴增反應以使用CRW基因體組DNA作為模板產生第一擴增子。由於此項技術中認為真核基因組序列含有不存在於成熟RNA分子中的序列，因此cDNA或mRNA序列較佳作為模板用於合成本發明中所用之dsRNA分子。接著將自較高逼真第一擴增反應產生的第一擴增子之樣品用作第二熱擴增反應的模板，將其與含有T7啟動子序列之第二引子對一起產生位於第二擴增子之各股之5'端或嵌入其中的含有T7啟動子之第二擴增子。在各方向獲得第二擴增子的完整核苷酸序列，並將其與如為cDNA報導的核苷酸序列比較，並標記兩個序列之間的差異(若存在)。通常，由於基因組序列中的變異不存在於mRNA或cDNA序列中，因此使用基因組DNA作為模板製備的序列與進一步用作用於達到顯著抑制水平的dsRNA分子者不一致。
試管內轉錄反應通常含有約1至約2微克線性化DNA模板、來自10X濃縮物之T7聚合酶反應緩衝液、最終濃度各為介於50與100 mM之間的核糖核苷酸ATP、CTP、GTP及UTP，及1單位T7 RNA聚合酶。視根據製造商的使用說明所用的RNA聚合酶的最適溫度而定，將RNA聚合酶反應置於約37℃下若干分鐘至若干小時範圍內的時間。通常，反應進行約2小時至約6小時以使模板序列轉錄長度高達約400個核苷酸，且進行高達20小時以使模板序列轉錄長度大於約400個核苷酸。將反應加熱至65℃ 15分鐘使RNA轉錄終止。將RNA轉錄產物於乙醇中沉澱、洗滌、空氣乾燥並在無RNAse的水中重新懸浮至濃度為每微升約1微克。大多數利用上述反向T7啟動子策略的轉錄物在試管內轉錄反應中產生雙股RNA，然而，藉由將純化RNA加熱至65℃且接著緩慢冷卻至室溫以確保有義及反義RNA區段適度黏接可獲得更高產量之雙股RNA。接著將雙股RNA產物與DNAse I及RNAse置於37℃下1小時以移除任何存在於混合物中的DNA或單股RNA。根據製造商的使用說明(AMBION MEGAscriptRNAi KIT)將雙股RNA產物經柱純化並在10 mM Tris－HCl緩衝液(pH 7.5)或無RNAse的水中重新懸浮至濃度為介於每微升0.1與1.0微克之間。
下列核苷酸序列首先衍生為在玉米根蟲mid－gut cDNA庫(Andersen等人，ibid)中識別的cDNA序列，且適用於建構用於藉由在害蟲食物中餵飼雙股RNA分子測試抑制害蟲中的生物功能之功效的雙股RNA分子。
A. Chd3同源序列 已在大量真核細胞中識別CHD基因，且建議相應蛋白作用為染色質－重塑因子。術語CHD衍生於發現與CHD蛋白之序列同源的三個域：顏色(染色質組織修飾劑)域、SNF2相關解螺旋酶/ATP酶域及DNA結合域，咸信各者具有相異的染色質相關活性。基於另一序列同源性域(PHD鋅指域，通常與染色質相關活性相關聯)的存在或缺少，將CHD蛋白分為兩類。CHD3相關蛋白具有PHD鋅指域，而CHD1相關蛋白不具有。實驗觀察認為CHD3蛋白作用於壓製轉錄，且在一些物種中表明其為含有作為次單位之組蛋白脫乙醯基酶錯合物之組份。組蛋白之脫乙醯作用與轉錄失活有關，且因此CHD3蛋白暗示由於其為組蛋白脫乙醯基酶錯合物之組份，因此可作用於作為轉錄的壓製劑(Ogas等人，1999)。因此，抑制CHD3蛋白合成可成為雙股RNA調解抑制鞘翅目害蟲之有用目標。
B. β－微管蛋白同源序列 微管蛋白為所有真核細胞中許多細胞結構的重要結構組份且主要形成微管。抑制細胞中微管形成導致災難性效應，包括干擾有絲***紡錘體形成、阻塞細胞***及其類似物。因此，抑制微管蛋白形成可為雙股RNA調節抑制作用的有用目標。
C. 40 kDa V－ATP酶同源序列 真核系統中亞細胞細胞器內的能量代謝為必需功能。液胞ATP合成酶涉及在液胞內維持足夠ATP含量。因此，液胞ATP合成酶可為雙股RNA調節抑制作用的有用目標。
D. EF1α同源序列 轉錄伸長及轉錄終止因子為代謝必需的且可為雙股RNA調節抑制作用的有利目標。
E. 26S蛋白酶體次單位p28同源序列 26S蛋白酶體為大的、ATP依賴的、多次單位的蛋白酶，其在所有真核細胞中高度保守。其具有在選擇性移除不同短命蛋白之一般功能，短命蛋白首先共價連接至泛素，且接著隨後藉由26S蛋白酶體錯合物降解。泛素路徑在藉由特定降解大量調節蛋白(包括有絲***細胞週期蛋白及諸如哺乳動物細胞的細胞週期蛋白依賴激酶之抑制劑)控制細胞週期中起重要作用。因此，抑制26S蛋白酶體合成及抑制其組份次單位合成可為雙股RNA調節抑制的較佳目標。(Smith等人，1997)。
F.幼體激素環氧化物水解酶同源序列 昆蟲幼體激素在昆蟲生命週期(包括但不需限於變態、繁殖及滯育)中控制及調節大量必需生物學過程。需幼體激素(JH)濃度在害蟲(尤其為鱗翅目及鞘翅目幼蟲)幼蟲形式之血淋巴內的適當時間達峰值，且接著濃度必須降低以終止激素響應效應。涉及降低幼體激素濃度的酶經由兩條主要新陳代謝降解路徑有效。一條路徑涉及幼體激素酯酶(JHE)，其將甲酯水解提供相應酸。第二條路徑利用幼體激素環氧化物水解酶(JHEH)已達到水解環氧化物的目的，結果形成二醇。JHE在降解JH中的貢獻易於理解且已發現其在鱗翅目及鞘翅目物種之間不變化。JH酯酶之抑制與嚴重形態學變化相關聯，該等變化包括但不限於幼蟲遊走、延緩化蛹及畸形中間體發育。相反，JHEH對JH代謝的貢獻不易瞭解且表現出在物種間變化，但近期研究指出暗示JHEH可為JH代謝主要路徑的跡象(Brandon J.Fetterolf,Doctoral Dissertation,North Carolina State University(2002年2月10日)Synthesis and Analysis of Mechanism Based Inhibitors of Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase from InsectTrichoplusia ni )。在任何情況下，使用基因抑制技術破壞任一種JH降解路徑可為雙股RNA調節害蟲抑制的有效目標。
G.膨脹依賴性氯化物通道蛋白同源序列 已假定膨脹依賴性氯化物通道蛋白在真核動物細胞系統之滲透調節中起重要作用。因此，展示有表現展示與先前識別的膨脹依賴性氯化物通道蛋白同源之胺基酸序列能力的核苷酸序列可為害蟲中RNA抑制的有用目標。
H.葡萄糖－6－磷酸1－脫氫酶蛋白同源序列 葡萄糖－6－磷酸1－脫氫酶蛋白(G6PD)催化葡萄糖－6－磷酸氧化為6－磷酸葡糖酸鹽同時伴隨著將氧化形式之煙鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP＋)還原為NADPH。NADPH在此項技術中已知為許多真核生物合成反應所需輔因子，且已知為將麩胱甘肽維持為還原態。還原麩胱甘肽在真核細胞中充當有害氧化代謝物的淨化劑，且在酶麩胱甘肽過氧化物酶的幫助下將有害過氧化氫轉化為水(Beutler等人，1991)。因此，G6PD可為鞘翅目害蟲中雙股RNA調節抑制作用的較佳目標。
I. Act42A蛋白同源序列 肌動蛋白為普遍存在且高度保守的細胞活動力及運轉力所需的真核蛋白(Lovato等人，2001)。已識別大量經預測可編碼肌動蛋白或展示與肌動蛋白相關的胺基酸序列結構之蛋白的CRW cDNA序列。因此，害蟲細胞中編碼肌動蛋白同系物之基因可為雙股RNA調節抑制作用的有用目標。
J. ADP－核糖基化作用因子1同源序列 已證明ADP核糖基化作用因子在細胞功能中為必需的，由於其在DNA損害修復、癌形成、細胞死亡及基因體組穩定性的過程中起整體作用。因此，其可有用於能夠使用雙股RNA調節抑制作用選擇性地破壞鞘翅目害蟲物種中ADP－核糖基化作用因子之轉錄。
K.轉錄因子IIB蛋白同源序列 如上所述之轉錄伸長及轉錄終止因子為代謝必需的且可為雙股RNA調節抑制作用以控制或消除鞘翅目害蟲感染的有利目標。
L.甲殼素酶同源序列 甲殼素為N－乙醯葡糖胺之β(1→4)均聚物且發現於昆蟲外骨骼中。甲殼素係在藉由甲殼素合成酶催化的反應中自UDP－N－乙醯葡糖胺形成。甲殼素為結構均聚物多醣，且在建構此高度分枝及交叉連接結構中存在許多酶促步驟。甲殼素賦予昆蟲形狀、剛性及支撐且提供諸如肌肉之內部器官附著於其上之骨架。甲殼素亦可受降解至某種程度以調節包含在昆蟲蛻皮過程中的步驟。因此，咸信此等路徑中雙股RNA調節抑制蛋白可用作控制鞘翅目害蟲感染的方法。
M.泛素結合酶同源序列 泛素路徑在藉由特異性降解大量調節蛋白(包括有絲***細胞週期蛋白及諸如哺乳動物細胞之p27之細胞週期蛋白依賴激酶抑制劑)控制細胞週期中起重要作用。因此，編碼泛素及相關組份之基因可為雙股RNA調節抑制作用的較佳目標。(Smith等人，1997)。泛素依賴蛋白水解路徑為真核細胞中胞內蛋白藉以受到選擇性破壞的主要路徑之一。藉由顯著不同陣列之酶調節泛素與底物蛋白之結合。蛋白水解目標亦可在介於底物泛素化與其降解為肽之間的步驟受多次單位26S蛋白酶調節。泛素系統的複雜性暗示蛋白轉化在真核細胞調節中的中心作用，且暗示在路徑中的其他蛋白(包括泛素活化酶、泛素結合酶、泛素蛋白連接酶及26S蛋白酶體次單位組份)。因此，咸信雙股RNA調節於此路徑中之蛋白抑制作用可用作控制鞘翅目害蟲感染之方法。
N.甘油醛－3－磷酸脫氫酶同源序列 醣解路徑為大多數有機體中的基本路徑且包含在自葡萄糖降解產生新陳代謝能量的過程中。醣解路徑第二階段中的一種重要酶為甘油醛－3－磷酸脫氫酶(G3PDH)，其在NAD＋及無機磷酸鹽存在下催化3－磷酸基－甘油醛氧化為3－磷酸甘油醯基－磷酸同時形成NADH。此反應的重要組份為經由NADH之形成儲存能量。編碼與醣解路徑相關的酶之基因及特定言之編碼包含在形成能量儲備中有用之步驟中的酶之基因可為鞘翅目害蟲物種中雙股RNA調節抑制作用的特別有用目標。
O.泛素B同源序列 如上所述，泛素蛋白降解路徑在藉由特異性降解大量調節蛋白(包括有絲***細胞週期蛋白及諸如哺乳動物細胞之p27之細胞週期蛋白依賴激酶抑制劑)控制細胞週期中起重要作用。因此，編碼泛素及相關組份之基因可為雙股RNA調節抑制作用的較佳目標。(Smith等人，1997)。
P.幼體激素酯酶同系物 如上所述，昆蟲幼體激素控制及調節大量在昆蟲生命週期中必需的生物學過程，該等過程包括但非必需限於變態、繁殖及滯育。使用基因抑制技術破壞JH合成或降解路徑可為雙股RNA調節害蟲抑制作用的有效目標。
Q. α微管蛋白同源序列 真核細胞通常利用細胞骨架結構元件，該等結構元件不僅作為機械骨架，而且在維持細胞形狀方面亦為重要的。半彎曲性微絲使得細胞可移動、幫助其在有絲***(胞質***)中分開且在有脊椎及無脊椎動物中負責肌肉收縮。由α及β微管蛋白構成之相對硬的微管在充當一種用於轉運泡囊及細胞器之干道及在有絲***(細胞核***)期間分離基因體中起重要作用。可彎曲中間體絲將至少額外強度提供給全部細胞結構。細胞骨架亦已知為涉及穿過細胞的細胞質發訊號。考慮此等功能，咸信任何對細胞骨架的破壞或甚至其完整性的微妙變化可引起細胞病變結果。
R.與轉運相關的序列 如上所述，在細胞內分選及轉運不同分子(包括至適當的細胞器)以及其之分泌為重要的生理功能。此等分選路徑可包括彼等在其他路徑中的依靠轉運所需的胞內分選錯合物(ESCRT)、錯合物I－III者。因此，與多肽及其他分子之轉運相關之功能亦可為dsRNA調節抑制作用的較佳目標。
實例2
昆蟲取食生物檢定 使雙股RNA(dsRNA)之樣品經受以選擇之大量目標害蟲進行的生物檢定。自根據實例1使用在SEQ ID Nos：1至6情況下的完整連續體序列或者使用如序列列表中所述的引子對自組合連續體擴增之序列所識別的序列製備dsRNA。根據下述程式將dsRNA的變化作為覆蓋施用於玉米根蟲人工食物。自Crop Characteristics,Inc.,Farmington,Minnesota獲得西方玉米根蟲(WCR)卵。將非滯育WCR卵於土壤中在24℃、60%相對濕度、完全黑暗下孵化約13天。在第13天，將含有WCR卵之土壤放置於介於#30與#60網篩之間且使用高壓園藝軟管將卵自土壤中洗出。藉由將卵浸泡在LYSOL中3分鐘、以無菌水沖洗3次、以10%福馬林(formalin)溶液洗滌1次且接著在無菌水中另外沖洗3次將其表面殺蟲。將以此方法處理之卵分配至無菌咖啡過濾器上且在27℃、60%相對濕度、完全黑暗下孵育整夜。
為製備dsRNA，將所選序列之擴增子選殖至可在大腸桿菌中複製之質體載體中且回收足夠量之質體DNA以允許試管內T7 RNA聚合酶在經選殖片段的任一端自嵌入彙集T7啟動子轉錄。產生雙股RNA且使其經受生物檢定；一個RNA區段包含如序列列表中所述之序列，另一RNA區段大體上為核苷酸序列之反向互補序列，尿苷經適當地安置以代替胸苷。將雙股RNA(dsRNA)之樣品以DICER或RNAse III處理以產生足量之小干擾RNA(siRNA)。將含有siRNA或dsRNA之樣品覆蓋於如上所述之CRW食物生物檢定之上且允許如下文所述餵飼幼蟲。
將雙股RNA樣品直接添加至含有如上所述之昆蟲食物之各孔，或使其在添加至昆蟲食物之前受修飾。製造商提供遵循RNAse III使用說明(AMBION CORPORATION,Austin,Texas)或DICER使用說明(sTRATAGENE,La Jolla,California)之雙股RNA之修飾。RNAse III消化雙股RNA產生21及22個含有5'磷酸化端及具有2至3個鹼基懸垂物之3'羥基端之核苷酸雙鏈體，其與藉由切斷酶在由Hamilton等人(1999)及Elbashir等人(2001)識別之真核路徑中產生的~21－26鹼基對成對短干擾RNA(siRNA)片段類似。此短干擾RNA雙鏈體之收集經進一步純化且樣品由聚丙烯醯胺凝膠電泳表徵以測定雙鏈體形成之完整性及功效。接著藉由分光光度法在250奈米波長下測定樣品之純度及數量，且藉由在－20℃下儲存保存未用樣品以用於其他用途。
主要根據Pleau等人(2002)及下述修飾製備昆蟲食物。將9.4公克SERVA瓊脂分配至540毫升純化水中且攪動直至瓊脂充分分佈。將水/瓊脂混合物加熱至沸騰以使瓊脂完全溶解，且接著將其傾入韋林氏(WARING)摻合器中。使摻合器維持在低速下將62.7公克BIO－SERV DIET混合料(F9757)、3.75公克凍乾玉米根、1.25毫升綠色食物色素及0.6毫升福馬林添加至熱瓊脂混合物中。接著添加10%氫氧化鉀儲備溶液將混合物調節至pH 9.0。當在200微升等分試樣中經分配至FALCON 96孔圓底微量滴定盤之各孔中時，使用經消毒的塗有NALGENE的磁性攪拌棒在磁性攪拌熱盤上將大約600毫升體積之液體食物高速地不斷混合且維持在約48℃至約60℃。允許盤中的食物在無菌生物通風櫥中固化且風乾約10分鐘。
使用微移液重發器將三十(30)微升體積的含有不同量之對照試劑或雙股RNA之測試樣品覆蓋於各孔中之昆蟲食物表面。在施用測試樣品以使試劑擴散進入食物中且使食物表面乾燥後，允許昆蟲食物位於無菌生物通風櫥中達一個半小時。用一精細漆刷將一個WCR新生幼蟲存放在各孔中，接著用MYLAR密封盤且使用昆蟲針進行通風。視檢定的設計而定測試12至72個昆蟲幼蟲。接著將生物檢定盤在27℃、60%相對濕度、完全黑暗下孵化12至14天。在12至14天時點記錄每劑量之存活幼蟲數目。使用合適之微量天平測定各存活幼蟲之幼蟲質量。使用JMP4統計軟體(SAS Institute,1995)分析資料且以Dunnet測試進行全因子ANOVA以檢查與未處理對照相比之處理效應(P<0.05)。此後進行Tukey－Kramer測試以比較所有對之處理(P<0.05)。CRW幼蟲取食檢定之結果展示與下文解釋之對照相比的顯著生長抑制及死亡率。
實例3
昆蟲取食生物檢定結果 藉由使用如實例2所述執行之生物檢定應用如實例1中所述識別之雙股RNA序列樣品製備足夠飼養玉米根蟲幼蟲之人工食物。與允許僅以陰性及陽性對照食物為食之根蟲相比，通常允許玉米根蟲幼蟲以該食物為食12天且監控其死亡率及發育受阻。研究結果證明使用含有部分與大量不同基因種類同源之序列的dsRNA之幼蟲發育受阻及/或死亡率之顯著水平(p<0.05)。下表1至5中給出產生顯著發育受阻及/或死亡率之序列及載體及表現為dsRNA之序列的相應SEQ ID NO。
實例4
轉殖基因植物轉形及生物檢定 簡而言之，使編碼如上所述之dsRNA建構體的序列在5'端連接至由可操作地連接至玉米hsp70內含子之35S啟動子組成之序列且在3'端連接至Nos3'轉錄終止及多聚腺嘌呤序列。將此表現序列盒放置於草甘膦選擇標記盒之下游。接著將此經連接序列盒放入根瘤土壤桿菌植物轉形功能性載體中，用於將玉米組織轉形為耐草甘膦且經選擇結果並轉入土壤中。將R0 植物根餵飼給西方玉米根蟲幼蟲(WCR,Diabrotica virgifera )。轉殖基因玉米根在具有含抗生素及草甘膦之MS0D培養基的皮氏(Petri)培養皿中手動切斷以供試管內選擇。在各培養皿中用一精細尖漆刷使每根感染兩個WCR幼蟲。將培養皿以Parafilm封口膜密封以阻止幼蟲逃跑。檢定在完全黑暗下放置於27。C、60% RH的Percival恆溫箱中。監控污染及幼蟲品質。在以根組織餵飼6天後，將幼蟲轉至一96孔盤中的WCR食物中。允許幼蟲已該食物為食8天使得整個檢定為14天長。記錄幼蟲群體及存活者以用於分析。對幼蟲群體資料進行單因子變異數分析(one－way ANOVA analysis)及Dunnett測試以尋找與非經轉形陰性對照相比之統計顯著性。在餵飼兩個事件後量測WCR幼蟲發育受阻且與以陰性對照植物為食的幼蟲生長相比較。
在達到適當尺寸後，將產生的轉殖基因玉米植物(R0 )植入含有Metromix土壤的10吋罐中。當植物達到V4生長階段時，以大約1000個西方玉米根蟲(WCR,Diabrotica virgifera )卵感染根區。在相似生長階段感染相同基因型的非轉殖基因玉米以作為陰性對照組。將卵提前孵化以使在感染後24小時內孵出。允許幼蟲以根系統為食3週。將植物自土壤中移除並洗滌以便可評估供幼蟲取食之根。使用節損害量表(Node Injury Scale)(NIS)以對損害程度評分從而將根損害定級，其中0表示無損害，1表示一節根受修剪至1.5吋內，2表示2節受修剪，而3表示3節受修剪。由於用於評估的植物直接來自轉形後的組織培養且由於轉形作用為唯一的，因此此時每事件僅評估一單一植物。檢定中植物呈現幼蟲取食跡象或症狀表明已獲得成功感染。使陰性對照植物根適度至嚴重損害平均值，而轉殖基因植物根提供對幼蟲取食的大體上的控制，其中節損害量表上值為約0.2或更少。
實例5
使用ta－siRNA調節沉默方法實施害蟲基因抑制 一種使植物害蟲中的基因沉默之替代方法使用最近發現的此類反式作用小干擾RNA(ta－siRNA)(Dalmay等人，2000；Mourrain等人，2000；Peragine等人，2004；Vazquez等人，2004)。ta－siRNA衍生於由細胞內天然產生之miRNA作為目標之單股RNA轉錄物。美國臨時專利申請案第60/643,136號(Carrington等人，2004)描述用microRNA觸發ta－siRNA以使植物中基因沉默之方法，其全文以引用的方式併入本文中。識別至少一種表現於玉米根蟲消化道上皮細胞中之害蟲特異性miRNA。接著用此害蟲特異性miRNA識別至少一種與在細胞中表現之miRNA互補之目標RNA轉錄序列。相應目標序列為不超過21個鄰近核苷酸之短序列，該短序列在當部分RNA轉錄物藉由其在一細胞類型中相應miRNA與功能性RNAi路徑接觸時導致該轉錄物經切片機調節***。一旦識別miRNA目標序列，則將至少一種miRNA目標序列與一第二序列融合，該第二序列與待使用本方法沉默之害蟲基因之一部分一致。舉例而言，miRNA目標序列經融合至SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：906中之任一者或其片段(諸如玉米根蟲液胞ATP酶(V－ATP酶)基因之序列)。miRNA目標序列可放置於5'端、3'端或嵌入目標序列中間。較佳在miRNA目標序列與目標基因序列之嵌合體中使用與多miRNA基因相當之多miRNA目標序列，或使用相同miRNA目標序列多次。目標基因序列可為任何長度，最小長度為21 bp。
只要轉錄發生於經受在害蟲食物(例如玉米根)中提供以用於控制玉米根蟲之細胞類型中，即使用大量適當啟動子及其他轉錄調節元件之任一者使miRNA目標序列與目標基因序列之嵌合體在植物細胞中表現。
此方法可具有可將更長RNA分子傳遞至目標害蟲之額外優勢。通常，在植物中產生的dsRNA由Dicer迅速加工為短RNA，該短RNA在經外因地餵飼給一些害蟲時並非有效。在此方法中，單股轉錄物產生於植物細胞中、由害蟲吸收並在害蟲細胞中轉化為dsRNA，接著在害蟲細胞中受加工為能在轉錄後使一或多個目標害蟲中的一或多個基因沉默的ta－siRNA。
實例6
用於為dsRNA調節基因沉默提供DNA序列之方法 本實例說明一種用於為dsRNA調節基因沉默提供DNA序列之方法。更特定言之，本實例描述藉由(a)自目標基因選擇包括超過21個鄰近核苷酸之初始DNA序列；(b)識別至少一種衍生於初始DNA序列區域(該等區域由經預測不產生不良多肽之區域組成)之較短DNA序列；及(c)為dsRNA調節基因沉默選擇DNA序列(該序列包括至少一種較短DNA序列)選擇可用於dsRNA調節基因沉默之經改良DNA。不良多肽包括(但不限於)與可誘致過敏症多肽同源之多肽及與已知多肽毒素同源之多肽。
已證明WCR V－ATP酶在測試dsRNA調節沉默作為控制幼蟲生長之方法的玉米根蟲取食檢定中起作用。來自諸如西方玉米根蟲(WCR)(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)之液胞ATP酶基因(V－ATP酶)之目標基因的cDNA序列經選擇用作初始DNA序列。此初始DNA序列可經篩檢以識別其中每一包括至少21個核苷酸之鄰近片段與已知脊椎動物序列之21個鄰近核苷酸中的少於21個鄰近核苷酸匹配之區域。識別大於約100個在此21/21命中之外的鄰近核苷酸之序列區段。此等序列區段之不同組合經組合以建構嵌合DNA序列用於表現為dsRNA且用於如上所述之昆蟲取食生物檢定。
實例7
以選自EST庫之序列進行的昆蟲取食生物檢定之額外結果 此實例說明發現額外序列在作為雙股RNA序列藉由根蟲幼蟲攝取時引起幼蟲發育受阻及/或死亡率方面有效。實例1至3描述用於飼養玉米根蟲幼蟲、應用dsRNA及昆蟲生物檢定之方法。研究結果證明使用含有部分與大量不同基因種類同源之序列的dsRNA之幼蟲發育受阻及/或死亡率之顯著水平(p<0.05)。下表6中給出產生顯著發育受阻及/或死亡率之序列及載體及表現為dsRNA之序列的相應SEQ ID NO。用於玉米轉形之例示性二元載體pMON98503含有下列用於轉入植物細胞之介於左與右T－DNA邊緣之間的元件：e35S－HSP70－DV49(反義取向)－通用間隔－DV49(有義取向)－hsp17；ACT(啟動子及內含子)－CTP2轉變訊號－CP4－NOS。：用於玉米轉形之另一例示性二元載體pMON98504含有下列介於左與右邊緣之間的元件：e35S－HSP70－C1(反義取向)－通用間隔－C1(有義取向)－hsp17；ACT(啟動子及內含子)－CTP2轉變訊號－CP4－NOS。
如下所述進行功效測試，利用經所選昆蟲控制建構體轉形之玉米植株的後裔：1.種植後7天：在25℃、60% RH、完全黑暗條件下每事件孵化10,000個WCR卵(每事件10個植株)7天。
2.感染後14天：將植株自4"泥炭缽移植至8"缽中；取v4根尖樣品用於基因表現研究。
3.種植後14天：將WCR卵自土壤中洗出。將卵及土壤放入一60目篩且在該60目篩上放置一30目篩以保護卵不受水流影響。使用噴嘴以熱水徹底沖洗直至移除土壤。
4.將卵懸浮於2%(w/v)Difc0瓊脂溶液中，每1 mL卵25 mL溶液。使用(例如)Eppendorf重發移液器將卵以每植株約1000個卵以約3或4等分試樣感染土壤。在感染之前使用刮勺在土壤中挖洞且在感染後覆蓋該等洞。
5.種植28天後，可取v8根尖樣品用於基因表現研究。
6.種植35天後，對檢定進行評估。使用修枝剪割掉植物，留下約6"之莖。將含有事件資訊之植株樁打孔且迅速系至莖上。自根系統中移除盡可能多的土壤。使用噴霧膠管沖洗土壤剩餘物。
7.檢查根且藉由使用用於WCR幼蟲損害之Olsen(0－3)NIS量表對根損害定級。
圖1及圖2說明由下列以WCR激發F1玉米植株(衍生自經pMON98503或pMON98504轉形之植物)所得的昆蟲控制結果。在基本上如上述執行之生長箱功效測試中，在由以pMON98503或pMON98504轉形衍生之事件的後裔中觀察到為經濟損害臨限值或低於經濟損害臨限值之NIS得分。
對於實例3及7中所述之顯示對西方玉米根蟲有顯著活性的經選擇基因將全長EST DNA序列組合。表7中列出此等EST序列。
實例8
Dv49及Dv248序列之產生及功效結果 將基於經由RNAi Ffrag預測之活性及個別Dv49及Dv248序列之CG含量分析選擇、基於其經預測的各自對WCR的活性於試管內合成一部分經組合之EST及Dv49(SEQ ID NO：818)與Dv248(SEQ ID NO：819)之鄰近序列，以及如圖3至4及表8中所示所聚集者施加至WCR幼蟲。
片段F1至F3與全長Dv49轉錄物之一部分相當。片段F4至F6與Dv248轉錄物或側接區之一部分相當。如圖4所示，片段F7至F13為兩個或兩個以上片段F1至F6之串聯體。片段13(SEQ ID NO：834)代表C38(Dv49至Dv248)串聯體。
圖5至7中展示F1至F13之劑量響應資料。如圖5中所示，片段F4至F6(包含Dv248所衍生序列)(圖4)在將其在0.1 ppm下餵飼給WCR幼蟲時活性(幼蟲死亡率%)顯著好於對照。當將片段F6在0.02 ppm下餵飼時，其亦顯示出顯著活性。由於存活幼蟲顯示發育未受阻，因此片段F5在最低劑量下之活性可能為假像。
如圖6中所示，在0.1 ppm下將片段F7至F10中每一者餵飼給WCR幼蟲時，其顯示出統計上的顯著活性。在0.02 ppm下將片段F9及F10餵飼給WCR幼蟲時，其亦顯示出統計上的顯著活性，且在0.01 ppm下將片段F10餵飼給WCR幼蟲時，其亦顯示出統計上的顯著活性。F8在0.01 ppm下的活性可為假像。
如圖7中所示，在0.02 ppm或更高濃度下將片段F11至F13餵飼給WCR幼蟲時，其顯示出統計上的顯著活性。此外，最大片段(F12及F13)在0.005 ppm及更高濃度下表現出活性。
實例9
衍生自串聯體C6之額外活性串聯體序列 如表9中所示，衍生自pMON98368之活性串聯體C6(SEQ ID NO：806)之部分在食物覆蓋生物檢定(如(例如)實例2中所述執行)中識別為抑制玉米根蟲(WCR)之生長及/或存活。如表6及表9中所示，C6全長串聯體含有各為70 bp之7個目標亞片段。
如表6所示，全長串聯體C7含有8個各為70 bp之目標亞片段。類似地，如表6及表10中所示，全長串聯體C12含有7個來自Dv23－Dv13－Dv26－Dv18－Dv49－Dv22－Dv20之、長度介於53至80 bp之間的目標亞片段。
表11列出用於以其他鞘翅目害蟲(包括葉甲種及其他瓢蟲屬(Coccinellidae )及葉甲屬)為目標之額外序列。
根據本揭示，可在無不適當實驗情況下製成及執行本文揭示及主張之所有組合物及方法。由於已根據前述說明性實施例描述本發明之組合物及方法，因此對熟習此項技術者而言顯而易見的是可將變更、改變、修飾及更改應用於本文所述之組合物、方法及該等方法之步驟或步驟之順序，而不偏離本發明之真正概念、精神及範疇。更特定言之，顯而易見的是某些化學及生理學相關之藥劑可為本文所述藥劑之替代品，同時可獲得相同或相似結果。咸信對熟習此項技術者而言顯而易見的是所有該等類似替代品及修飾在如所附專利申請範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。
參考文獻
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圖1：經pMON98503(SEQ ID NO：820)轉形且以西方玉米根蟲(WCR)激發之F1玉米植物事件之生物檢定。
圖2：經包含串聯體C1(SEQ ID NO：821)之pMON98504轉形且以西方玉米根蟲(WCR)激發之F1玉米植物事件之生物檢定。
圖3：Dv49及Dv248片段之選擇及Dv49－Dv248串聯體C38之示意圖。
圖4：基於串聯體C38合成之dsRNAs F1－F13。
圖5：DV49－DV248串聯體38之劑量響應(片段F1－F6)。
圖6：DV49－DV248串聯體38之劑量響應(片段F7－F10)。
圖7：DV49－DV248串聯體38之劑量響應(片段F11－F13)。
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西方玉米根蟲<400> 38<210> 39 <211> 1222 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 39 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 40<210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 41<210> 42 <211> 684 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 42<210> 43 <211> 864 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 43 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 44<210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 45<210> 46 <211> 790 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 46 <210> 47 <211> 1491 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 47 <210> 48 <211> 34 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 48<210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 49<210> 50 <211> 675 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 50 <210> 51 <211> 942 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 51<210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 52<210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 53<210> 54 <211> 605 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 54<210> 55 <211> 763 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 55 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 56<210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 57<210> 58 <211> 564 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 58 <210> 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西方玉米根蟲<400> 178<210> 179 <211> 870 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 179 <210> 180 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 180<210> 181 <211> 29 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 181<210> 182 <211> 601 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 182<210> 183 <211> 860 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 183<210> 184 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 184<210> 185 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 185<210> 186 <211> 399 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 186<210> 187 <211> 816 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 187 <210> 188 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 188<210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 189<210> 190 <211> 717 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 190<210> 191 <211> 826 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 191<210> 192 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 192<210> 193 <211> 30 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 193<210> 194 <211> 679 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 194<210> 195 <211> 873 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 195<210> 196 <211> 25 <210> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 196<210> 197 <211> 24 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 197<210> 198 <211> 677 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西方玉米根蟲<400> 237<210> 238 <211> 862 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 238<210> 239 <211> 1188 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 239 <210> 240 <211> 25 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 240<210> 241 <211> 25 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 241<210> 242 <211> 884 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 242<210> 243 <211> 1188 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 243 <210> 244 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 244<210> 245 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 245<210> 246 <211> 820 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 246 <210> 247 <211> 815 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 247<210> 248 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 248<210> 249 <211> 25 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 249<210> 250 <211> 722 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 250<210> 251 <211> 1324 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 251<210> 252 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 252<210> 253 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 253<210> 254 <211> 757 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 254<210> 255 <211> 794 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 255 <210> 256 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 256<210> 257 <211> 25 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西方玉米根蟲<400> 296<210> 297 <211> 34 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 297<210> 298 <211> 895 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 298<210> 299 <211> 822 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 299 <210> 300 <211> 23 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 300<210> 301 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 301<210> 302 <211> 573 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 302 <210> 303 <211> 755 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 303<210> 304 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 304<210> 305 <211> 29 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 305<210> 306 <211> 656 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 306<210> 307 <211> 428 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 307<210> 308 <211> 36 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 308<210> 309 <211> 34 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 309<210> 310 <211> 265 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 310<210> 311 <211> 657 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 311<210> 312 <211> 29 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 312<210> 313 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 313<210> 314 <211> 401 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 314<210> 315 <211> 822 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 315<210> 316 <211> 32 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西方玉米根蟲<400> 355 <210> 356 <211> 27 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 356<210> 357 <211> 27 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 357<210> 358 <211> 1043 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 358<210> 359 <211> 649 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 359<210> 360 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 360<210> 361 <211> 30 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 361<210> 362 <211> 547 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 362<210> 363 <211> 677 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 363<210> 364 <211> 27 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 364<210> 365 <211> 24 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 365<210> 366 <211> 587 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 366<210> 367 <211> 882 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 367 <210> 368 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 368<210> 369 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 369<210> 370 <211> 711 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 370 <210> 371 <211> 2918 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 371 <210> 372 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 372<210> 373 <211> 30 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 373<210> 374 <211> 1036 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 374<210> 375 <211> 620 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西方玉米根蟲<400> 453<210> 454 <211> 482 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 454<210> 455 <211> 759 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 455<210> 456 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 456<210> 457 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 457<210> 458 <211> 710 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 458<210> 459 <211> 837 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 459<210> 460 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 460<210> 461 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 461<210> 462 <211> 673 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 462<210> 463 <211> 660 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 463 <210> 464 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 464<210> 465 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 465<210> 466 <211> 543 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 466 <210> 467 <211> 894 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 467<210> 468 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 468<210> 469 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 469<210> 470 <211> 544 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 470<210> 471 <211> 210 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 471<210> 472 <211> 25 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 472<210> 473 <211> 33 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西方玉米根蟲<400> 610<210> 611 <211> 973 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 611<210> 612 <211> 27 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 612<210> 613 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 613<210> 614 <211> 867 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 614 <210> 615 <211> 967 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 615<210> 616 <211> 25 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 616<210> 617 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 617<210> 618 <211> 846 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 618<210> 619 <211> 967 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 619<210> 620 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 620<210> 621 <211> 32 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 621<210> 622 <211> 458 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 622<210> 623 <211> 1376 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 623 <210> 624 <211> 26 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 624<210> 625 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 625<210> 626 <211> 1148 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 626 <210> 627 <211> 1142 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 627 <210> 628 <211> 28 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 628<210> 629 <211> 31 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 629<210> 630 <211> 593 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西方玉米根蟲<400> 708<210> 709 <211> 250 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 709<210> 710 <211> 273 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 710<210> 711 <211> 278 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 711<210> 712 <211> 287 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 712<210> 713 <211> 250 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 713<210> 714 <211> 250 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 714<210> 715 <211> 250 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 715<210> 716 <211> 372 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 716<210> 717 <211> 372 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 717<210> 718 <211> 490 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 718 <210> 719 <211> 560 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 719<210> 720 <211> 372 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 720 <210> 721 <211> 372 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 721<210> 722 <211> 1000 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 722 <210> 723 <211> 478 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 723<210> 724 <211> 584 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 724<210> 725 <211> 869 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 725<210> 726 <211> 737 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 726 <210> 727 <211> 867 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 727<210> 728 <211> 802 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 728 <210> 729 <211> 862 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 729<210> 730 <211> 603 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 730<210> 731 <211> 545 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 731<210> 732 <211> 496 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 732<210> 733 <211> 512 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 733<210> 734 <211> 669 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 734<210> 735 <211> 802 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 735<210> 736 <211> 579 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 736<210> 737 <211> 640 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 737<210> 738 <211> 669 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 738<210> 739 <211> 302 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 739<210> 740 <211> 838 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 740<210> 741 <211> 1301 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 741 <210> 742 <211> 824 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 742<210> 743 <211> 704 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 743 <210> 744 <211> 971 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 744<210> 745 <211> 1049 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 745<210> 746 <211> 547 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 746 <210> 747 <211> 508 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 747<210> 748 <211> 788 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 748 <210> 749 <211> 752 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 749<210> 750 <211> 436 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 750 <210> 751 <211> 1072 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 751<210> 752 <211> 864 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 752 <210> 753 <211> 383 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 753<210> 754 <211> 923 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 754 <210> 755 <211> 1312 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 755 <210> 756 <211> 442 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 756<210> 757 <211> 404 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 757<210> 758 <211> 747 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 758<210> 759 <211> 1285 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 759 <210> 760 <211> 442 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 760<210> 761 <211> 959 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 761 <210> 762 <211> 429 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 762<210> 763 <211> 828 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 763<210> 764 <211> 664 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 764<210> 765 <211> 434 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 765<210> 766 <211> 1283 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 766 <210> 767 <211> 685 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 767<210> 768 <211> 859 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 768 <210> 769 <211> 586 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 769<210> 770 <211> 563 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 770 <210> 771 <211> 1216 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 771<210> 772 <211> 617 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 772<210> 773 <211> 736 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 773 <210> 774 <211> 718 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 774<210> 775 <211> 598 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 775 <210> 776 <211> 683 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 776<210> 777 <211> 321 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 777<210> 778 <211> 311 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 778<210> 779 <211> 501 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 779<210> 780 <211> 370 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 780 <210> 781 <211> 673 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 781<210> 782 <211> 411 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 782 <210> 783 <211> 553 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 783<210> 784 <211> 902 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 784 <210> 785 <211> 1026 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 785<210> 786 <211> 469 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 786<210> 787 <211> 1159 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 787<210> 788 <211> 1261 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 788<210> 789 <211> 905 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 789<210> 790 <211> 873 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 790 <210> 791 <211> 877 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 791<210> 792 <211> 375 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 792 <210> 793 <211> 547 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 793<210> 794 <211> 334 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 794<210> 795 <211> 630 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 795<210> 796 <211> 1152 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 796 <210> 797 <211> 988 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 797<210> 798 <211> 208 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 798 <210> 799 <211> 1326 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 799<210> 800 <211> 1034 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 800<210> 801 <211> 721 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 801 <210> 802 <211> 361 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 802<210> 803 <211> 183 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 803<210> 804 <211> 372 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：C4_Dv49_CG8055串聯體；公認結合、載體活性；CG8055直系同源<400> 804<210> 805 <211> 372 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 805<210> 806 <211> 490 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26、Dv49、Dv23、Dv20、Dv13、Dv22、Dv18之區段組成<220> <221> misc特徵<222> (1)..(70) <223> 串聯體C6 Dv26區段<220> <221> misc特徵<222> (71)..(140) <223> 串聯體C6 Dv49區段<220> <221> misc特徵<222> (141)..(210) <223>串聯體C6 Dv423區段<220> <221> misc特徵<222> (211)..(280) <223> 串聯體C6 Dv20區段<220> <221> misc特徵<222> (281)..(350) <223> 串聯體C6 Dv13區段<220> <221> misc特徵<222> (351)..(420) <223> 串聯體C6 Dv22區段<220> <221> misc特徵<222> (421)..(490) <223> 串聯體C6 Dv18區段<400> 806<210> 807 <211> 560 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 由按照順序5’－3’始於Dv6,Dv1、Dv88、Dv93、Dv4、Dv113、Dv127及Dv99之區段組成的串聯體<220> <221> misc特徵<222> (1)..(70) <223> 串聯體C7 Dv6區段<220> <221> misc特徵<222> (71)..(140) <223> 串聯體C7 Dv1區段<220> <221> misc特徵<222> (141)..(210) <223> 串聯體C7 Dv88區段<220> <221> misc特徵<222> (211)..(280) <223> 串聯體C7 Dv93區段<220> <221> misc特徵<222> (281)..(350) <223> 串聯體C7 Dv4區段<220> <221> misc特徵<222> (351)..(420) <223> 串聯體C7 Dv113區段<220> <221> misc特徵<222> (421)..(490) <223> 串聯體C7 Dv127區段<220> <221> misc特徵<222> (491)..(550) <223> 串聯體C7 Dv99區段<400> 807 <210> 808 <211> 372 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：C8串聯體；公認鈉/鉀交換ATP酶：CG9261直系同源<400> 808<210> 809 <211> 372 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：C9串聯體；公認鈉/鉀交換ATP酶：CG9261直系同源<400> 809 <210> 810 <211> 1000 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：有公認相同/不同作用模式基因之C10串聯體、~ 50% GC標準<400> 810<210> 811 <211> 478 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv13－Dv26－Dv18－Dv49－Dv22－Dv20之區段組成。 <220> <221> misc特徵<222> (1)..(70) <223> 串聯體C12 Dv24區段<220> <221> misc特徵<222> (71)..(145) <223> 串聯體C12 Dv13區段<220> <221> misc特徵<222> (146)..(222) <223> 串聯體C12 Dv26區段<220> <221> misc特徵<222> (223)..(275) <223> 串聯體C12 Dv18區段<220> <221> misc特徵<222> (276)..(338) <223> 串聯體C12 Dv49區段<220> <221> misc特徵<222> (339)..(418) <223> 串聯體C12 Dv22區段<220> <221> misc特徵<222> (419)..(478) <223> 串聯體C12 Dv20區段<400> 811<210> 812 <211> 869 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：活躍於若干不同有機體中之基因目標之C14串聯體、~ 50% GC標準<400> 812 <210> 813 <211> 2694 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 813 <210> 814 <211> 622 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 814 <210> 815 <211> 670 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 815<210> 816 <211> 871 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 816 <210> 817 <211> 2410 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 817 <210> 818 <211> 988 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 818 <210> 819 <211> 3001 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 819 <210> 820 <211> 2719 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 820 <210> 821 <211> 2367 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：pMON98504 Dv49串聯體Cl dsRNA表現序列盒<400> 821 <210> 822 <211> 45 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 822<210> 823 <211> 50 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 823<210> 824 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 824<210> 825 <211> 113 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 825<210> 826 <211> 153 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 826<210> 827 <211> 183 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 827<210> 828 <211> 95 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 828 <210> 829 <211> 96 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 829<210> 830 <211> 266 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 830<210> 831 <211> 336 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 831<210> 832 <211> 141 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 832<210> 833 <211> 449 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 833<210> 834 <211> 590 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：合成引子<400> 834<210> 835 <211> 657 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 835<210> 836 <211> 1251 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 836 <210> 837 <211> 669 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 837<210> 838 <211> 793 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 838 <210> 839 <211> 767 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 839<210> 840 <211> 588 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 840 <210> 841 <211> 1098 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 841<210> 842 <211> 718 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 842<210> 843 <211> 842 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 843 <210> 844 <211> 679 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 844<210> 845 <211> 725 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 845 <210> 846 <211> 864 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 846<210> 847 <211> 140 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.1串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv49之區段組成<400> 847<210> 848 <211> 210 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.2串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv49－Dv23之區段組成<400> 848<210> 849 <211> 280 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.3串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv49－Dv23－Dv20之區段組成<400> 849 <210> 850 <211> 350 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.4串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv49－Dv23－Dv20－Dv13之區段組成<400> 850<210> 851 <211> 420 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.5串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv49－Dv23－Dv20－Dv13－Dv22之區段組成<400> 851 <210> 852 <211> 140 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.6串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv49－Dv23之區段組成<400> 852<210> 853 <211> 210 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.7串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv49－Dv23－Dv20之區段組成<400> 853<210> 854 <211> 280 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.8串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv49－Dv23－Dv20－Dv13之區段組成<400> 854<210> 855 <211> 350 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.9串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv49－Dv23－Dv20－Dv13－Dv22之區段組成<400> 855<210> 856 <211> 420 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.10串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv49－Dv23－Dv20－Dv13－Dv22－Dv18之區段組成<400> 856<210> 857 <211> 140 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.11串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv20之區段組成<400> 857<210> 858 <211> 210 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.12串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv20－Dv13之區段組成<400> 858<210> 859 <211> 280 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.13串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv20－Dv13－Dv22之區段組成<400> 859<210> 860 <211> 350 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.14串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv20－Dv13－Dv22－Dv18之區段組成<400> 860<210> 861 <211> 140 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.15串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv20－Dv13之區段組成<400> 861<210> 862 <211> 210 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.16串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv20－Dv13－Dv22之區段組成<400> 862<210> 863 <211> 280 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.17串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv20－Dv13－Dv22－Dv18之區段組成<400> 863<210> 864 <211> 140 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.18串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv13－Dv22之區段組成<400> 864<210> 865 <211> 210 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.19串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv13－Dv22－Dv18之區段組成<400> 865<210> 866 <211> 140 <212> DNA <213> 人工<220> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C6.20串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv22－Dv18之區段組成<400> 866 <210> 867 <211> 70 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 867<210> 868 <211> 70 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 868<210> 869 <211> 70 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 869<210> 870 <211> 70 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 870<210> 871 <211> 70 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 871<210> 872 <211> 70 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 872<210> 873 <211> 70 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 873<210> 874 <211> 1358 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 874<210> 875 <211> 2714 <212> DNA <213> 北方玉米根蟲<400> 875 <210> 876 <211> 2669 <212> DNA <213> 巴西玉米根蟲<400> 876 <210> 877 <211> 2701 <212> DNA <213> 南方玉米根蟲<400> 877 <210> 878 <211> 2714 <212> DNA <213> 墨西哥玉米根蟲<400> 878 <210> 879 <211> 2714 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 879 <210> 880 <211> 669 <212> DNA <213> 墨西哥豆瓢蟲<400> 880 <210> 881 <211> 1033 <212> DNA <213> 馬鈴薯甲蟲<400> 881<210> 882 <211> 601 <212> DNA <213> 巴西玉米根蟲<400> 882<210> 883 <211> 601 <212> DNA <213> 北方玉米根蟲<400> 883<210> 884 <211> 601 <212> DNA <213> 南方玉米根蟲<400> 884<210> 885 <211> 601 <212> DNA <213> 墨西哥玉米根蟲<400> 885<210> 886 <211> 601 <212> DNA <213> 西方玉米根蟲<400> 886<210> 887 <211> 145 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.1串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv13之區段組成<400> 887<210> 888 <211> 222 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.2串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於23－Dv13－Dv26之區段組成<400> 888<210> 889 <211> 275 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.3串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv13－Dv26－Dv18之區段組成<400> 889<210> 890 <211> 338 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.4串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv13－Dv26－Dv18－Dv49之區段組成<400> 890<210> 891 <211> 418 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.5串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv23－Dv13－Dv26－Dv18－Dv49－Dv22之區段組成<400> 891<210> 892 <211> 152 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.6串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv13－Dv26之區段組成<400> 892<210> 893 <211> 205 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.7串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv13－Dv26－Dv18之區段組成<400> 893<210> 894 <211> 268 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.8串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv13－Dv26－Dv18－Dv49之區段組成<400> 894<210> 895 <211> 348 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效wCR目標之C12.9串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv13－Dv26－Dv18－Dv49－Dv22之區段組成<400> 895<210> 896 <211> 408 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.10串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv13－Dv26－Dv18－Dv49－Dv22－Dv20之區段組成<400> 896<210> 897 <211> 130 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.11串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv18之區段組成<400> 897<210> 898 <211> 193 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.12串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv18－Dv49之區段組成<400> 898<210> 899 <211> 273 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.13串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv18－Dv49－Dv22之區段組成<400> 899<210> 900 <211> 333 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.14串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv26－Dv18－Dv49－Dv22－Dv20之區段組成<400> 900<210> 901 <211> 116 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.15串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv18－Dv49之區段組成<400> 901<210> 902 <211> 196 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.16串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv18－Dv49－Dv22之區段組成<400> 902<210> 903 <211> 256 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.17串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv18－Dv49－Dv22－Dv20之區段組成<400> 903<210> 904 <211> 143 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.18串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv49－Dv22之區段組成<400> 904<210> 905 <211> 203 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.19串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv49－Dv22－Dv20之區段組成<400> 905<210> 906 <211> 140 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之描述：高度有效WCR目標之C12.20串聯體、~ 50% GC標準、由按照順序5’－3’始於Dv22－Dv20之區段組成<400> 906

Claims (32)

  1. 一種經分離聚核苷酸，其係選自由下列物質組成之群：(a)聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：179、818及822至824之核酸序列；(b)聚核苷酸，其在5X SSC、50%甲醯胺及42℃ 10分鐘之洗滌條件下與SEQ ID NO：179、818及822至824之核酸序列雜交；(c)聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO：179、818及822至824之核酸序列有至少70%之序列同一性；(d)SEQ ID NO：179、818及822至824之核酸序列之至少21個鄰近核苷酸之片段，其中由鞘翅目植物害蟲攝取包含至少一個與該片段互補之股的雙股核糖核苷酸序列抑制該害蟲之生長；及(e)序列(a)、(b)、(c)或(d)之互補序列。
  2. 如請求項1之經分離聚核苷酸，其經定義為經操作連接至異源啟動子。
  3. 如請求項1之經分離聚核苷酸，其經定義為包含於植物轉形載體上。
  4. 一種由如請求項1之聚核苷酸之表現產生之雙股核糖核苷酸序列，其中藉由鞘翅目植物害蟲攝取該核糖核苷酸序列抑制該害蟲之生長。
  5. 如請求項4之雙股核糖核苷酸序列，其經定義為藉由製備包含第一、第二及第三聚核苷酸序列之重組聚核苷酸序列產生，其中該第一聚核苷酸序列包含如請求項1之 經分離聚核苷酸，其中該第三聚核苷酸序列由該第二聚核苷酸序列連接至該第一聚核苷酸序列，且其中該第三聚核苷酸序列實質上為該第一聚核苷酸序列之反向互補序列，因此當經轉錄為核糖核酸時該第一及該第三聚核苷酸序列雜交以形成由該第二核糖核苷酸序列所連接之穩定之該雙股核糖核苷酸分子。
  6. 如請求項4之雙股核糖核苷酸序列，其中藉由該害蟲攝取該聚核苷酸序列抑制實質上與該聚核苷酸序列互補之核苷酸序列之表現。
  7. 一種細胞，其經如請求項1之聚核苷酸轉形。
  8. 如請求項7之細胞，其經定義為原核細胞。
  9. 如請求項7之細胞，其經定義為真核細胞。
  10. 如請求項7之細胞，其經定義為植物細胞或細菌細胞。
  11. 一種種子細胞，其包含如請求項1之聚核苷酸。
  12. 一種植物細胞，其經如請求項2之聚核苷酸轉形。
  13. 如請求項10之細胞，其中該聚核苷酸在該細胞中表現為雙股核糖核苷酸序列，且害蟲在食物中攝取抑制量之該雙股核糖核苷酸序列抑制該害蟲進一步以該食物為食。
  14. 如請求項13之細胞，其中該害蟲係選自由西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera )、西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera )、墨西哥玉米根蟲(Diabrotica virgifera zea )、巴西玉米根蟲(Diabrotica balteata )、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi )、巴西玉米根蟲(Diabrotica viridula )、巴西玉米根蟲(Diabrotica speciosa )及黃瓜十二點葉甲(Diabrotica undecimpunctata )組成之群。
  15. 如請求項13之細胞，其中該害蟲攝取抑制量之該雙股核糖核苷酸序列使該害蟲之生長受阻。
  16. 一種由如請求項10之植物細胞所繁衍出的植物生產之商品產品，其中該商品產品包含可檢測量之如請求項1之聚核苷酸或自其表現之核糖核苷酸。
  17. 一種用於控制鞘翅目害蟲感染之方法，其包含在鞘翅目害蟲之食物中提供包含第一聚核苷酸序列之藥劑，該第一聚核苷酸序列在由該害蟲攝取時起作用以抑制該害蟲體內的生物功能，其中該聚核苷酸序列展示沿至少約19至約25個鄰近核苷酸與衍生自該害蟲之編碼序列之約95至約100%之核苷酸序列同一性，且與一與該第一聚核苷酸序列互補之第二聚核苷酸序列雜交，且其中該衍生於該害蟲之編碼序列係選自由SEQ ID NO：179、818及822至824及其互補序列組成之群。
  18. 如請求項17之方法，其中該鞘翅目害蟲為葉甲屬(Diabrotica spp. )，其係選自由西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera) 、西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera) 、墨西哥玉米根蟲(Diabrotica virgifera zea) 、巴西玉米根蟲(Diabrotica balteata) 、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi) 、巴西玉米根蟲(Diabrotica viridula) 、巴西玉米根蟲(Diabrotica speciosa) 及黃瓜十二點葉甲(Diabrotica undecimpunctata )組成之群。
  19. 一種用於控制鞘翅目害蟲感染之方法，其包含在鞘翅目害蟲之食物中提供表現如請求項1之聚核苷酸序列之植物細胞，其中該聚核苷酸經表現以產生雙股核糖核酸，該雙股核糖核酸在由該害蟲攝取時起作用以抑制該害蟲體內目標序列之表現，且相對於缺乏該植物細胞之食物，導致減少對該食物之取食。
  20. 如請求項19之方法，其中該害蟲展示攝取該細胞後生長減少。
  21. 如請求項19之方法，其中該植物細胞進一步包含編碼一殺蟲劑之聚核苷酸序列，該殺蟲劑係選自由儲藏蛋白(patatin)、蘇力菌(Bacillus thuringiensis )殺昆蟲蛋白、嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus )殺昆蟲蛋白、發光桿菌(Photorhabdus )殺昆蟲蛋白、側胞芽胞桿菌(Bacillus laterosporus )殺昆蟲蛋白及球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus )殺昆蟲蛋白組成之群。
  22. 如請求項21之方法，其中該蘇力菌殺昆蟲蛋白係選自由Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元殺昆蟲蛋白CryET33 CryET34、二元殺昆蟲蛋白CryET80及CryET76、二元殺昆蟲蛋白TIC100及TIC101、殺昆蟲蛋白ET29或ET37與殺昆蟲蛋白TIC810或TIC812之組合及二元殺昆蟲蛋白PS149B1組成之群。
  23. 如請求項19之方法，其中該目標序列編碼一蛋白，該蛋白之預測功能係選自由下列功能組成之群：肌肉形成、 幼體激素形成、幼體激素調節、離子調節及轉運、消化酶合成、維持細胞膜電位、胺基酸生物合成、胺基酸降解、***形成、信息素合成、信息素感應、觸角形成、翼形成、腿形成、發育及分化、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經傳遞、細胞***、能量代謝、呼吸及細胞凋亡。
  24. 如請求項19之方法，其中該鞘翅目害蟲為葉甲屬，其係選自由西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera) 、西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera) 、墨西哥玉米根蟲(Diabrotica virgifera zea) 、巴西玉米根蟲(Diabrotica balteata) 、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi) 、巴西玉米根蟲(Diabrotica viridula) 、巴西玉米根蟲(Diabrotica speciosa) 及黃瓜十二點葉甲(Diabrotica undecimpunctata )組成之群。
  25. 如請求項19之方法，其中該聚核苷酸藉由該害蟲之攝取起作用以抑制執行昆蟲存活必需之功能的基因，該功能係選自由下列功能組成之群：害蟲之取食、害蟲細胞凋亡、細胞分化及發育、有性繁殖能力或需要、肌肉形成、肌肉抽搐、肌肉收縮、幼體激素形成、幼體激素調節、離子調節及轉運、維持細胞膜電位、胺基酸生物合成、胺基酸降解、***形成、信息素合成、信息素感應、觸角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經傳遞、幼蟲期轉變、化蛹、自蛹羽化、細胞***、能量代謝、呼 吸及細胞骨架結構之形成。
  26. 一種用於改進經受害蟲感染之作物植株產生之作物的產量之方法，該方法包含以下步驟，a)將如請求項1之聚核苷酸導入該作物植株，b)培育該作物植株以使該聚核苷酸表現，其中該聚核苷酸之表現抑制害蟲之取食及害蟲感染引起之產量減少。
  27. 一種用於改進經受害蟲感染之作物植株產生之作物耐旱性的方法，該方法包含以下步驟，a)將如請求項1之聚核苷酸導入該作物植株，b)培育該作物植株以使該聚核苷酸表現，其中該聚核苷酸之表現抑制害蟲之取食及害蟲感染引起之耐旱性降低。
  28. 如請求項26之方法，其中該聚核苷酸之表現產生RNA分子，該RNA分子抑制已攝取一部分該作物植株之害蟲中之至少第一目標基因，其中該目標基因執行至少一種選自由下列功能組成之群之必需功能：害蟲之取食、害蟲之生存力、害蟲細胞凋亡、害蟲或任何害蟲細胞之分化及發育、害蟲之有性繁殖、肌肉形成、肌肉抽搐、肌肉收縮、幼體激素形成及/或減少、幼體激素調節、離子調節及轉運、維持細胞膜電位、胺基酸生物合成、胺基酸降解、***形成、信息素合成、信息素感應、觸角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經傳遞、幼蟲期轉 變、化蛹、自蛹羽化、細胞***、能量代謝、呼吸、細胞骨架結構合成及維持、核苷酸代謝、氮代謝、水分利用、水分保持及感官知覺。
  29. 如請求項26之方法，其中該害蟲為玉米根蟲害蟲，其係選自由南方玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata howardi )(Southern Corn Rootworm(SCR))、西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera )(Western Corn Rootworm(WCR))、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi )(Northern Corn Rootworm(NCR))、墨西哥玉米根蟲(Diabrotica virgifera zea )(Mexican Corn Rootworm(MCR))、巴西玉米根蟲(Diabrotica balteata )(Brazilian Corn Rootworm(BZR))、巴西玉米根蟲(Diabrotica viridula )(Brazilian Corn Rootworm(BZR))及巴西玉米根蟲(Diabrotica speciosa )(Brazilian Corn Rootworm(BZR))組成之群。
  30. 一種生產商品產品之方法，其包含獲得如請求項10之植物細胞所繁衍出的植物或其一部分，且自該植物或其部分製備商品產品。
  31. 一種生產食物或飼料之方法，其包含獲得如請求項10之植物細胞所繁衍出的植物或其一部分，且自該植物或其部分製備食物或飼料。
  32. 如請求項31之方法，其中該食物或飼料係定義為油、粗粉、蛋白質、澱粉、麵粉或青貯料。
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