BR102016005432A2 - moléculas de ácido nucléico de rna polimerase ii33 para controlar as pragas de inseto - Google Patents

Abstract

esta divulgação diz respeito às moléculas de ácido nucléico e aos métodos de seu uso, para o controle de pragas de inseto através da inibição mediada pela interferência de rna das sequências de codificação alvo e de não codificação transcrita nas pragas de inseto, incluindo as pragas coleópteras e/ou hemípteras. a divulgação também diz respeito aos métodos para a produção de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucléico úteis para o controle de pragas de inseto e às células vegetais e plantas assim obtidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE RNA POLIMERASE 11215 PARA CONTROLAR AS PRAGAS DE INSETO".

[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. de Série 62/133.202, depositado em 13 de março de 2015, que é incorporado neste documento em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se, de um modo geral, ao controle genético do dano à planta, causado por pragas de insetos (por exemplo, pragas coleópteras e pragas hemípteras). Nas modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de polinu-cleotídeos-alvo de codificação e de não codificação, e ao uso de tecnologias de DNA recombinante para reprimir ou inibir pós-transcri-cionalmente a expressão dos polinucleotídeos-alvo de codificação e de não codificação nas células de uma praga de inseto, para proporcionar um efeito protetor sobre a planta.

ANTECEDENTES

[003] A lagarta da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgi-fera virgifera LeConte, é uma das espécies de lagarta da raiz do milho mais devastadoras na América do Norte e é uma preocupação particular em áreas de desenvolvimento do milho dos Estados Unidos do Meio-Oeste. A lagarta da raiz do milho do norte (NCR), Diabrotica bar-beri Smith e Lawrence, é uma espécie muito relacionada que coabita muito da mesma variedade que a WCR. Existem diversas outras su-bespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: a lagarta da raiz do milho mexicana (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; a lagarta da raiz do milho do sul (SCR), D. unde-cimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella-, D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O

Departamento de Agricultura dos Estados Unidos estimou que as lagartas da raiz do milho causam 1 bilhão de dólares em receita perdida a cada ano, incluindo 800 milhões de dólares em perda de rendimento e 200 milhões de dólares em custos de tratamento.

[004] Os ovos tanto de WCR quanto de NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo por todo o inverno. Os ovos são oblongos, brancos, e menos do que 1 milímetro (0,004 polegada) de comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou início de junho, com o momento exato da eclosão do ovo variando de ano para ano devido às diferenças de temperaturas e localização. As larvas recentemente eclodidas são larvas brancas que são menos do que 3 milímetros (0,125 polegada) de comprimento. Uma vez eclodidas, as larvas começam a se alimentar das raízes do milho. As lagartas da raiz do milho passam por três instars larvais. Após alimentarem-se por diversas semanas, as larvas mudam para o estágio de pupa. Elas entram no estado de pupa no solo, e então emergem do solo como adultas em julho e agosto. As lagartas da raiz adultas são cerca de 1 centímetro (0,25 polegada) de comprimento.

[005] As larvas da lagarta da raiz do milho completam o desenvolvimento sobre o milho e diversas outras espécies de capins. As larvas produzidas sobre o capim rabo-de-raposa amarela emergem mais tarde e têm um tamanho de cápsula da cabeça menor como adultos do que as larvas produzidas sobre o milho. Ellsbury e col. (2005) Envi-ron. Entomol. 34:627-34. Os adultos de WCR se alimentam da barba do milho, do pólen, e de grãos sobre as pontas das espigas. Se os adultos de WCR emergirem antes que os tecidos reprodutivos do milho estejam presentes, eles podem se alimentar do tecido da folha, com isso retardando o crescimento da planta e, ocasionalmente, matando a planta hospedeira. Entretanto, os adultos rapidamente se mudarão para as barbas e o pólen preferidos, quando eles se tornarem disponíveis. Os adultos de NCR também se alimentam dos tecidos reprodutivos da planta de milho, porém, em contraste, raramente se alimentam das folhas do milho.

[006] A maior parte do dano no milho pela lagarta da raiz é causada por alimentação larval. As lagartas das raízes recentemente eclodidas inicialmente se alimentam dos pelos radiculares dos milhos finos e escondem-se nas pontas das raízes. À medida que as larvas crescem, elas se alimentam e se escondem nas raízes primárias. Quando as lagartas das raízes do milho forem abundantes, a alimentação larval frequentemente resulta no desbaste das raízes inteiramente até a base da haste do milho. A lesão grave das raízes interfere com a capacidade das raízes de transportarem água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta, e resulta na produção reduzida de grãos, com isso, frequentemente reduzindo drasticamente o rendimento global. A lesão grave das raízes também frequentemente resulta no aprisionamento das plantas de milho, o que torna mais difícil a coleta e adicionalmente diminui o rendimento. Ademais, a alimentação pelos adultos dos tecidos reprodutivos do milho pode resultar no desbaste das barbas na ponta da espiga. Se este "corte das barbas" for grave o suficiente durante a dispersão do pólen, a polinização pode ser interrompida.

[007] Pode-se tentar o controle das lagartas da raiz do milho por rotação da colheita, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva formadora de esporos, Bacillus thuringiensis), plantas transgênicas que expressam as toxinas de Bt, ou uma combinação destes. A rotação da colheita sofre da desvantagem da colocação de restrições indesejadas sobre o uso da terra cultivada. Além disso, a oviposição de algumas espécies de lagarta da raiz pode ocorrer nos campos de soja, com isso diminuindo a eficácia da rotação da colheita praticada com o milho e a soja.

[008] Os inseticidas químicos são a estratégia mais expressivamente recorrida para obter o controle da lagarta da raiz do milho. O uso de inseticida químico, entretanto, é uma estratégia de controle da lagarta da raiz do milho imperfeita; mais de 1 bilhão de dólares pode ser perdido nos Estados Unidos, a cada ano, devido à lagarta da raiz do milho, quando os custos dos inseticidas químicos forem adicionados aos custos do dano pela lagarta da raiz que pode ocorrer, apesar do uso dos inseticidas. As altas populações de larvas, as chuvas intensas e a aplicação inadequada do(s) inseticida(s) podem, todos, resultar no controle inadequado da lagarta da raiz do milho. Ademais, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar as linhagens de lagarta da raiz resistentes aos inseticidas, assim como elevar considerações ambientais significativas devido à toxicidade nas espécies que não forem alvo.

[009] Os besouros do pólen europeus (PB) são pragas sérias na coiza, tanto as larvas quanto os adultos se alimentam de flores e pólen. O dano do besouro do pólen na colheita pode causar 20-40% de perda de rendimento. A espécie de praga principal é Meligethes aeneus Fabricius. Atualmente, o controle do besouro do pólen na coiza apoia-se principalmente nos piretroides, que se espera sejam desativados logo por causa do seu perfil ambiental e regulador. Além disso, foi descrita a resistência do besouro do pólen aos inseticidas químicos existentes. Portanto, são urgentemente necessárias soluções de controle do besouro do pólen não prejudiciais ao meio ambiente, com novos modos de ação.

[0010] Na natureza, os besouros do pólen dormem todo o inverno como adultos no solo ou sob a camada humífera. Na primavera, os adultos emergem da hibernação, começam a se alimentar de flores de ervas-daninhas, e migram para as plantas de coiza floridas, colocando ovos nos botões das flores da coiza. As larvas se alimentam e se de- senvolvem nos botões e nas flores. As larvas de estágio final encontram um local de transformação em pupa no solo. Os adultos da segunda geração emergem em julho e agosto e se alimentam de diversas plantas que dão flores, antes de encontrarem locais para a hibernação.

[0011] Os stink bugs e os outros insetos hemípteros (heterópteros) são outro complexo importante de pragas agrícolas. No mundo todo, sabe-se que mais de 50 espécies bastante relacionadas de stink bugs causam dano à colheita. McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of México, CRC Press. Os insetos hemípteros estão presentes em um grande número de colheitas importantes, incluindo o milho, a soja, a fruta, os vegetais, e os cereais.

[0012] Os stink bugs passam por múltiplos estágios de ninfa antes de atingirem o estágio adulto. Estes insetos desenvolvem-se a partir de ovos até adultos em cerca de 30-40 dias. Tanto as ninfas quanto os adultos se alimentam da seiva dos tecidos moles, nos quais eles também injetam enzimas digestivas, causando digestão do tecido extraor-al e necrose. O material de planta digerido e os nutrientes são então ingeridos. O esgotamento de água e nutrientes do sistema vascular da planta resulta no dano ao tecido da planta. O dano no grão e nas sementes que se desenvolvem é o mais significativo, visto que o rendimento e a germinação são significativamente reduzidos. As gerações múltiplas ocorrem em clima quente, resultando em pressão significativa do inseto. O controle atual dos stink bugs baseia-se no tratamento com inseticida sobre uma base de campo individual. Portanto, são urgentemente necessárias estratégias de controle alternativas, para minimizar as perdas contínuas na colheita.

[0013] O RNA de interferência (RNAi) é um processo que utiliza vias celulares endógenas, pelo que uma molécula de RNA interferente (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA), que é específica para todo o, ou qualquer parte de tamanho adequado de um, gene-alvo, resulta na degradação do mRNA codificado pela mesma. Nos anos recentes, o RNAi tem sido usado para efetuar um "nocaute" do gene em diversas espécies e sistemas experimentais; por exemplo, plantas, embriões de insetos, e células na cultura de tcido. Ver, por exemplo, Fire e col. (1998) Nature 391:806-11; Martinez e col. (2002) Cell 110:563-74; McManus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

[0014] O RNAi efetua a degradação do mRNA através de uma via endógena, incluindo o complexo de proteína DICER. A DICER cliva as moléculas de dsRNA longas até fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, chamados RNA interferente pequeno (siRNA). O siRNA é desdobrado em dois RNAs de fita simples: a fita de passageiro e a fita guia. A fita de passageiro é degradada, e a fita guia é incorporada no complexo silenciador induzido por RNA (RISC). Os micro ácidos ribonucleicos (miRNAS) são moléculas estruturalmente muito similares que são clivadas das moléculas precursoras contendo um "loop" de polinucleotídeos unindo as fitas de passageiro e guias hibri-dizadas, e eles podem ser similarmente incorporados no RISC. O si-lenciamento do gene pós-transcricional ocorre quando a fita guia se liga especificamente a uma molécula de mRNA complementar e induz a divagem pelo Argonauta, o componente catalítico do complexo RISC. Sabe-se que este processo se espalha sistemicamente por todo o organismo, apesar das concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucariotos, tais como as plantas, os nema-tóides, e alguns insetos.

[0015] Somente os transcritos complementares ao siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados e, desse modo, o nocaute da expressão de mRNA é específico para a sequência. Nas plantas, existem diversos grupos funcionais dos genes de DICER. O efeito do silencia- mento do gene do RNAi persiste por dias e, sob condições experimentais, pode resultar em um declínio na abundância do transcrito alvejado de 90% ou mais, com redução consequente nos níveis da proteína correspondente. Nos insetos, há pelo menos dois genes de DICER, onde o DICER1 facilita a degradação orientada pelo miRNA pelo Ar-gonautal. Lee e col. (2004) Cell 117 (1):69-81. O DICER2 facilita a degradação orientada pelo siRNA pelo Argonauta2.

[0016] A Patente U.S. 7.612.194 e as Publicações de Patentes U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, e 2011/0154545 divulgam uma biblioteca de 9112 sequências de marca de sequência expressa (EST), isoladas de pupas de D. v. virgifera LeConte. É sugerido na Patente U.S. 7.612.194 e na Publicação de Patente U.S. No. 2007/ 0050860 ligar operavelmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma de diversas sequências parciais particulares de H+-ATPase do tipo vacuolar (V-ATPase), descritas nelas para a expressão de RNA sem sentido em células de plantas. A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0192265 sugere operavelmente ligar um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não descrita (a sequência parcial é estabelecida ser 58% idêntica ao produto de gene C56C10.3 em C. ele-gans) para a expressão de RNA sem sentido em células de plantas. A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0154545 sugere operavelmente ligar um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares de genes de subunida-des beta do coatômero de D. v. virgifera para a expressão do RNA sem sentido em células de plantas. Ademais, a Patente U.S. 7.943.819 divulga uma biblioteca de 906 sequências da marca de sequência expressa (EST), isoladas de larvas de D. v. virgifera LeConte, pupas, e intestinos intermediários dissecados, e sugere operavelmente ligar um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de proteína do corpo multivesicular carregado 4b de D. v. virgifera para a expressão do RNA de fita dupla nas células das plantas.

[0017] Não se proporciona nenhuma sugestão na Patente U.S. 7.612.194, e nas Publicações de Patentes Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, e 2011/0154545 de usar qualquer sequência particular, das mais que nove mil sequências listadas nelas, para o RNA de interferência, que não as diversas sequências parciais particulares de V-ATPase e as sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma da Patente U.S. 7.612.194 e das Publicações de Patentes U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, e 2011/0154545 proporciona qualquer orientação quanto a quais outras das mais de nove mil sequências proporcionadas seriam letais, ou mesmo, de outro modo, úteis, em espécies de lagarta da raiz do milho, quando usadas como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. 7.943.819 não proporciona nenhuma sugestão de usar qualquer sequência particular, das mais que novecentas sequências listadas nela, para o RNA de interferência, que não a sequência parcial particular de um gene de proteína do corpo multivesicular carregado 4b. Ademais, a Patente U.S. 7.943.819 não proporciona nenhuma orientação quanto a qual outra das mais de novecentas sequências proporcionada seria letal, ou mesmo, de outro modo, útil, em espécies de lagarta da raiz do milho, quando usada como dsRNA ou siRNA. A Publicação de Pedido de Patente U.S. No. U.S. 2013/040173 e a Publicação de Pedido PCT No. WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada de um gene Snf7 de Diabrotica virgifera para o RNA de interferência no milho. (Também descrito em Bolognesi e col. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534).

[0018] A maioria esmagadora das sequências complementares aos DNAs da lagarta da raiz do milho (tais como as precedentes) não proporciona um efeito protetor na planta das espécies de lagarta da raiz do milho, quando usada como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum e col. (2007), Nature Biotechnology 25:1322-1326, descrevem os efeitos de inibir diversos alvos de genes de WCR pelo RNAi. Estes autores descreveram que 8 dos 26 genes-alvo que eles testaram não foram capazes de proporcionar uma mortalidade da praga coleóptera experimentalmente significativa em uma concentração muito alta de iRNA (por exemplo, dsRNA) de mais do que 520 ng/cm2.

[0019] Os autores da Patente U.S. 7.612.194 e da Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 fizeram o primeiro relatório de RNAi in planta, nas plantas de milho, alvejando a lagarta da raiz do milho ocidental. Baum e col. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. Estes autores descrevem um sistema de RNAi dietético in vivo de alta produção, para examinar os genes-alvo potenciais para o desenvolvimento de milho de RNAi transgênico. De uma concentração inicial de genes de 290 alvos, somente 14 exibiram potencial de controle larval. Um dos RNAs de fita dupla (dsRNA) mais efetivos alvejou um gene codificando a subunidade A de ATPase vacuolar (V-ATPase), resultando em uma rápida supressão de mRNA endógeno correspondente e acionando uma resposta de RNAi específica com baixas concentrações de dsRNA. Desse modo, estes autores documentaram pela primeira vez o potencial para o RNAi in planta como uma ferramenta de controle de praga possível, enquanto demonstravam simultaneamente que alvos efetivos poderíam não ser acuradamente identificados a priori, mesmo a partir de um grupo relativamente pequeno de genes candidatos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0020] São descritas neste documento moléculas de ácidos nu-cleicos (por exemplo, genes-alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs, e hpRNAs), e métodos de uso delas, para o controle de pra- gas de insetos, incluindo, por exemplo, pragas coleópteras, tais como D. v. virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho ocidental, "WCR"); D. barberi Smith e Lawrence (lagarta da raiz do milho do norte, "NCR"); D. u. howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sul, "SCR"); D. v. zeae Krysan e Smith (lagarta da raiz do milho mexicana, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; e Meligethes aeneus Fabricius (besouro do pólen, "PB"); e pragas hemípteras, tais como Euschistus heros (Fabr.) (Pen-tatomídeo Marrom Neotropical, “BSB”); E. servus (Say) (Pentatomídeo Marrom); Nezara viridula (L.) (Pentatomídeo Verde do Sul); Piezodorus guildinii (Westwood) (Pentatomídeo de Listras Vermelhas); Halyomor-pha halys (Stâl) (Pentatomídeo Marmorizado Marrom); Chinavia hilare (Say) (Pentatomídeo Verde); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Di-chelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.) (Pentatomídeo das Costas Vermelhas Neotropical); Horcias nobilellus (Berg) (Besouro do Algodão); Taedia stig-mosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Ménevilie); Neomegalo-tomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (Besouro da Planta Manchado Ocidental); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois). Nos exemplos particulares, são descritas moléculas de ácidos nucleicos ilustrativas que podem ser homólogas a pelo menos uma parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga de inseto.

[0021] Nestes exemplos e nos exemplos adicionais, a sequência de ácidos nucleicos nativa pode ser um gene-alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação, envolvido em um processo meta-bólico ou envolvido no desenvolvimento larval ou de ninfas. Em alguns exemplos, a inibição pós-transcricional da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotí-deo homólogo a ele pode ser letal para uma praga de inseto ou resul- tar no crescimento e/ou na viabilidade reduzidos de uma praga de inseto. Nos exemplos específicos, a RNA polimerase 11215 (referida neste documento como, por exemplo, rpll215) ou um homólogo de rpll215 pode ser selecionado como um gene-alvo para o silenciamento pós-transcricional. Nos exemplos particulares, um gene-alvo útil para a inibição pós-transcricional é um gene de RNA polimerase 11215, o gene referido neste documento como Diabrotica virgifera rpll215-1 (por exemplo, SEQ ID NO:1), D. virgifera rpll215-2 (por exemplo, SEQ ID NO:3), D. virgifera rpll215-3 (por exemplo, SEQ ID NO:5), Euschistus heros rpll215-1 (por exemplo, SEQ ID NO:77), E. heros rpll215-2 (por exemplo, SEQ ID NO:79), o gene referido neste documento como E. heros rpll215-3 (por exemplo, SEQ ID NO:81), ou o gene referido neste documento como Meligethes aeneus rpll215 (por exemplo, SEQ ID NO:107). Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo o polinucleotídeo de SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:77; o complemento de SEQ ID NO:77; SEQ ID NO:79; o complemento de SEQ ID NO:79; SEQ ID NO:81; o complemento de SEQ ID NO:81; SEQ ID NO:107; o complemento de SEQ ID NO: 107; e/ou fragmentos de quaisquer dos precedentes (por exemplo, SEQ ID NOs:7-9, SEQ ID NOs:83-85, SEQ ID NOs:108-111, e SEQ ID NO:109) é, portanto, descrita neste documento.

[0022] São também descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de gene-alvo (por exemplo, o produto de um gene de rpll215). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico à SEQ ID NO:2 (D. virgifera RPII215-1), SEQ ID NO:4 (D. virgifera RPII215-2), SEQ ID NO:6 (D. virgifera RPII215-3), SEQ ID NO:78 (E. heros RPII215-1), SEQ ID NO:80 (E. heros RPII215-2), SEQ ID NO:82 (E. heros RPII215-3), ou SEQ ID NO:112 (M. aeneus RPII215); e/ou uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de D. virgifera rpíl215-1, D. virgifera rpll215-2, D. virgifera rpII215-3, E. heros rpll215-1, E. heros rpl/215-2, E. heros rpII215-3, ou M. aeneus rpll215. São adicionalmente descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que é o complemento invertido de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de gene-alvo.

[0023] São também descritos os polinucleotídeos de cDNA que podem ser usados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que são complementares a todo o, ou parte de um, gene-alvo de praga de inseto, por exemplo, um gene de rpll215. Nas modalidades particulares, os dsRNAs, os siRNAs, os shRNAs, os miRNAs, e/ou os hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Nos exemplos particulares, são descritas moléculas de cDNA que podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo o, ou parte de um, gene de rpll215 (por exemplo, SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:77; SEQ ID NO:79; SEQ ID NO:81; e SEQ ID NO:107), por exemplo, um gene de rpll215 de WCR (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:5), um gene de rpll215 de BSB (por exemplo, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, e SEQ ID NO:81), ou um gene de rpll215 de PB (por exemplo, SEQ ID NO:107).

[0024] São adicionalmente descritos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera, e meios para proporcionar proteção contra a praga coleóptera em uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleópte-ra é uma molécula de RNA de fita dupla consistindo em um polinucleo-tídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:98-100 e 123; e os seus complementos. Os equivalentes funcionais do meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga co-leóptera incluem as moléculas de RNA de fita simples ou dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene de rpll215 coleóptero compreendendo a SEQ ID NO:7, a SEQ ID NO:8, e/ou a SEQ ID NO:9, e as moléculas de RNA de fita simples ou dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene de rpll215 coleóptero compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e/ou a SEQ ID NO:117 [0025] Um meio para proporcionar proteção contra a praga coleóp-tera em uma planta é uma molécula de DNA compreendendo um poli-nucleotídeo que codifica um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera, operavelmente ligado a um promotor, onde a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.

[0026] São também descritos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera, e meios para proporcionar proteção contra a praga hemíptera em uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera é uma molécula de RNA de fita simples ou dupla consistindo em um polinu-cleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 104-106 e os seus complementos. Os equivalentes funcionais do meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera incluem as moléculas de RNA de fita simples ou dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene de rpll215 hemíptero compreendendo a SEQ ID NO:83, a SEQ ID NO:84, e/ou a SEQ ID NO:85. Um meio para proporcionar proteção contra a praga hemíptera em uma planta é uma molécula de DNA compreendendo um polinucleotídeo codificando um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera, operavelmente ligado a um promotor, onde a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.

[0027] São descritos adicionalmente métodos para controlar uma população de uma praga de inseto (por exemplo, uma praga coleópte-ra ou hemíptera), compreendendo proporcionar a uma praga de inseto (por exemplo, uma praga coleóptera ou hemíptera) uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que atue ao ser absorvida pela praga para inibir uma função biológica dentro da praga.

[0028] Em algumas modalidades, os métodos para controlar uma população de uma praga coleóptera compreendem proporcionar à praga coleóptera uma molécula de iRNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:95; o complemento de SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; o complemento de SEQ ID NO:96; SEQ ID NO:97; o complemento de SEQ ID NO:97; SEQ ID NO:98; o complemento de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; o complemento de SEQ ID NO:99; SEQ ID NO:100; o complemento de SEQ ID NO:100; SEQ ID NO:118; o complemento de SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; o complemento de SEQ ID NO:119; SEQ ID NO:120; o complemento de SEQ ID NO:120; SEQ ID NO:121; o complemento de SEQ ID NO:121; SEQ ID NO:122; o complemento de SEQ ID NO:122; SEQ ID NO:123; o complemento de SEQ ID NO:123; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de rpll215 nativo de uma praga coleóptera (por exemplo, WCR ou PB); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de rpll215 nativo de uma praga coleóptera; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um or- ganismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e 7-9; o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e 7-9; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:107-111 e 117; e o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:107-111 e 117.

[0029] Em outras modalidades, os métodos para controlar uma população de uma praga hemíptera compreendem proporcionar à praga hemíptera uma molécula de iRNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:101; o complemento de SEQ ID NO:101; SEQ ID NO:102; o complemento de SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:103; o complemento de SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:104; o complemento de SEQ ID NO:104; SEQ ID NO:105; o complemento de SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; o complemento de SEQ ID NO: 106; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de rp/1215 nativo de uma praga hemíptera (por exemplo, BSB); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de rpll215 nativo de uma praga hemíptera; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, 81, e 83-85; e o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, 81, e 83-85.

[0030] Nas modalidades particulares, um iRNA que atua ao ser absorvido por uma praga de inseto para inibir uma função biológica dentro da praga é transcrito de um DNA compreendendo todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:77; o complemento de SEQ ID NO:77; SEQ ID NO:79; o complemento de SEQ ID NO:79; SEQ ID NO:81; o complemento de SEQ ID NO:81; SEQ ID NO:107; o complemento de SEQ ID NO:107; SEQ ID NO:108; o complemento de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; o complemento de SEQ ID NO:109; SEQ ID NO:110; o complemento de SEQ ID NO:110; SEQ ID NO:111; o complemento de SEQ ID NO:111; SEQ ID NO:117; o complemento de SEQ ID NO:117; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e 7-9; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e 7-9; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, 81, e 83-85; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, 81, e 83-85; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:107-111 e 117; e o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:107-111 e 117.

[0031] Também são descritos métodos onde os dsRNAs, os siR-NAs, os shRNAs, os miRNAs, e/ou os hpRNAs podem ser proporcio- nados a uma praga de inseto, em um ensaio baseado em dieta, ou em células de plantas geneticamente modificadas expressando os dsR-NAs, os siRNAs, os shRNAs, os miRNAs, e/ou os hpRNAs. Nestes e nos exemplos adicionados, os dsRNAs, os siRNAs, os shRNAs, os miRNAs, e/ou os hpRNAs podem ser ingeridos pela praga. A ingestão dos dsRNAs, siRNA, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar no RNAi na praga, o que, por sua vez, pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade da praga e levando, no final de tudo, à mortalidade. Desse modo, são descritos métodos onde as moléculas de ácidos nucleicos compreendendo poli-nucleotídeo(s) ilustrativo(s) útil(eis) para o controle de pragas de insetos são proporcionadas para uma praga de inseto. Nos exemplos particulares, uma praga coleóptera e/ou hemíptera controlada pelo uso das moléculas de ácidos nucleicos da invenção pode ser WCR, NCR, SCR, D. undecimpunctata howardi, D. balteata, D. undecimpunctata tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, Meligethes aeneus, BSB, E. servus; Nezara viridula; Piezodorus guildinir, Halyomorpha halys; Chinavia hilare; C. marginatum\ Dichelops melacanthus; D. furcatus; Edessa meditabunda] Thyanta perditor, Horcias nobilellus; Taedia stigmosa; Dysdercus peruvianus; Neomegalotomus parvus; Leptoglos-sus zonatus; Niesthrea sidae-, Lygus hesperus; ou L. lineolaris.

[0032] O precedente e as outras características tornar-se-ão mais aparentes a partir da Descrição Detalhada a seguir ds diversas modalidades, que ocorre com referência às FIGS. 1-2 que acompanham. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0033] A FIG. 1 inclui uma representação de uma estratégia usada para proporcionar dsRNA a partir de um único molde de transcrição, com um único par de iniciadores.

[0034] A FIG. 2 inclui uma representação de uma estratégia usada para proporcionar dsRNA a partir de dois moldes de transcrição.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

[0035] As sequências de ácidos nucleicos listadas na listagem de sequências que acompanha são mostradas usando abreviações padrões de letras para as bases de nucleotídeos, como definido na 37 C.F.R. § 1.822. As sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos listadas definem moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) tendo os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos arranjados no modo descrito. As sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos listadas também definem, cada uma, um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos arranjados no modo descrito. Em vista da redundância do código genético, será entendido que uma sequência de nucleotídeos incluindo uma sequência de codificação também descreve o gênero dos polinucleotídeos codificando o mesmo polipeptídeo como um polinucleotídeo consistindo na sequência de referência. Será adicionalmente entendido que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero dos ORFs de polinucleotídeos codificando aquele polipeptídeo.

[0036] Somente uma fita de cada sequência de ácidos nucleicos é mostrada, porém a fita complementar é entendida como incluída por qualquer referência à fita mostrada. Como o complemento e o complemento invertido de uma sequência de ácidos nucleicos primária são necessariamente descritos pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar invertida de uma sequência de ácidos nucleicos são incluídas por qualquer referência à sequência de ácidos nucleicos, a não ser que seja explicitamente estabelecido ser de outro modo (ou esteja claro ser de outro modo a partir do contexto no qual a sequência aparece). Ademais, conforme é entendido na técnica que a sequência de nucleotídeos de uma fita de RNA é determinada pela sequência do DNA a partir do qual ela foi transcrita (porém para a substituição de timina (T) por nucleobases de uracil (U)), uma sequência de RNA é incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na listagem de sequências que acompanha: [0037] A SEQ ID NO:1 mostra um contig contendo um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo, referido neste documento, em alguns locais, como WCR rpll215 ou WCR rpll215-1: G AT GACACT GAAC ACTTT CCATTT CGCCGGT GT GT CTT C G AAG AAC GTAAC ACTTG GTGTG CCTC G ATTG AAG G AAATC ATC A ACATATCCAAGAAGCCCAAGGCTCCATCTCTAACCGTATTTTTGA CTG G AG GTG CTG CTCGTG ATG C AG AAAAAG CG AAAAATGTACTCT GTCGCCTG G AAC AC AC AAC ACTG C G AAAG GTC AC AG CTAAC AC A G C AAT CT ATT AC G AT C C AG AT C C AC AAC GAAC G G TT AT C G C AG AG G AT CAAG AATTTGTCAACGT CT ACT AT G AAAT G CCT G ATTTCG AT C CGACTCGAATCTCACCGTGGTTGTTGCGTATCGAATTGGATCGTA AACGAAT GACGGAAAAGAAATT GACC AT GGAACAGATT GCCGAGA AAAT CAACGCCGGTTTCGGT GACGACTT GAATTGCATCTTT AACG AT G AC AAT GCT GACAAATT GGTTCTGCGCATTCGT ATAAT GAAT GG CGAGGACAACAAATTCCAAGACAATGAGGAGGACACGGTCGATAA AATGGAGGACGACAT GTTTTTGCGATGCATT GAAGCGAATAT GTT GTCGGACATGACGTTGCAAGGTATCGAGGCAATTGGAAAGGTGTA C AT GC ACTTG CC AC AG AC CG AT AGCAAG AAACG AATT GTT AT CAC GGAAACTGGTGAATTTAAGGCCATCGGCGAATGGTTACTCGAAAC T GACGGTACAT CG AT GAT GAAAGTT CT AAGT G AAAG AG AT GTAGA TC CG GTT CG AAC ATT CAGCAACGAT AT CTGCGAAATTTTCCAGGT GTTGGGAATCGAAGCAGTACGAAAATCAGTCGAGAAAGAAATGAA CGCTGTGCTGCAGTTCTACGGATTGTACGTGAATTATCGTCACTT GGCCTT GTT GT GT GACGT CATGACAGCCAAAGGTCATTT G ATGG CCATCACACGTCACGGCATTAACAGACAGGACACTGGTGCGTTG AT GAGAT GCTCGTTCGAAGAAACT GTT GAT GTGCTTATGG ACGC TGCATCGCATGCCGAAAACGATCCTATGCGTGGTGTGTCGGAAA

AT ATT ATT AT G G G AC AGTT AC CC AAG AT G G GT AC AG GTTG TTTT G ATCTCTTACTG G ATG CC G AAAAATG CAAGTATG G CATC GAAATAC AGAGCACTCTAGGACCGGACTT AAT GAGTGGAACAGGAAT GTT CT TTGGTGCTGG AT C AACACCATCGACGCTTAGTT CATCGAG ACCT C CATTGTTAA

[0038] A SEQ ID NO:2 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de RPII215 codificado por um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo, referido neste documento, em alguns locais, como WCR RPII215 ou WCR RPII215-1: MTLNTFHFAGVSSKNVTLGVPRLKEIINISKKPKAPSLTVFL

TGGAARDAEKAKNVLCRLEHTTLRKVTANTAIYYDPDPQRTVIAEDQ

EFVNVYYEMPDFDPTRISPWLLRIELDRKRMTEKKLTMEQIAEKINAG

FGDDLNCIFNDDNADKLVLRIRIMNGEDNKFQDNEEDTVDKMEDDM

FLRCIEANMLSDMTLQGIEAIGKVYMHLPQTDSKKRIVITETGEFKAIG

EWLLETDGTSMMKVLSERDVDPVRTFSNDICEIFQVLGIEAVRKSVE

KEMNAVLQFYGLYVNYRHLALLCDVMTAKGHLMAITRHGINRQDTG

ALMRCSFEETVDVLMDAASHAENDPMRGVSENIIMGQLPKMGTGC

FDLLLDAEKCKYGIEIQSTLGPDLMSGTGMFFGAGSTPSTLSSSRPP

LL

[0039] A SEQ ID NO:3 mostra um contig compreendendo um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo adicional, referido neste documento, em alguns locais, como WCR rpll215-2: TGCTCGACCTGTAGATTCTTGTAACGGATTTCGGAGAG TTCG ATT CGTT GTCG AGCCTT CAAAAT GGCT ACCAACG AT AGTAA AGCTCCGTTGAGGACAGTTAAAAGAGTGCAATTTGGAATACTTAG T C C AG AT G AAATT AG AC G AAT G T C AGT C AC AG AAG G G G G C AT C C GCTTCCCAGAAACCATGGAAGCAGGCCGCCCCAAACTATGCGGT CTT AT GG ACCCC AG ACAAGGT GT CAT AGACAG AAGCT CAAG AT G CCAGACAT GT GCCGGAAAT AT GACAGAAT GT CCTGGACATTT CG G AC AT AT C G AG CT G G C AAAAC C AGTTTT C C AC GT AG G ATT C G TA

AC AAAAACAAT AAAG AT CTT G AG ATGC GTTT GCTT CTTTT GC AGT A AATTATTAGTCAGT CCAAATAAT CCGAAAATTAAAGAAGTT GTAAT G AAAT C AAAG G G AC AG C C AC G T AAAAG ATT AG CTTT C G TTT AT G A TCTGTGTAAAGGTAAAAATATTTGTGAAGGTGGAGATGAAATGGA TGTGGGTAAAGAAAGCGAAGATCCCAATAAAAAAGCAGGCCATG GTGGTTGTGGTCGATATCAACCAAATATCAGACGTGCCGGTTTA GATTTAACAGCAGAAT GGAAACACGT CAAT GAAGACACACAAGA AAAGAAAATCGCACTATCTGCCGAACGTGTCTGGGAAATCCTAA AACAT AT CACAG AT G AAG AAT GTTT CATT CTT G GTAT GG AT C CC A AATTT G CT AG ACC AG ATT G G AT G AT AG T AAC G GT ACTT C CT GTT CCT CCCCTAGCAGTACGACCT G CT GTAGTTAT GCACGGAT CT G C AAG G AAT C AG G AT G AT AT C ACT C AC AAATT G G CC G AC ATT AT C AAG G CG AAT AAC G AATT AC AG AAG AAC G AGT CT G C AG GT G C AG CCGCTCATATAAT CACAGAAAATATTAAGAT GTT GCAATTTCACG TC G C C ACTTT AGTT G AC AAC G AT ATG C C G G G AAT G C C G AG AG CA ATGCAAAAATCTGGAAAACCCCTAAAAGCTATCAAAGCTCGGCT G AAAG GTAAAG AAG G AAG G ATT C G AG GT AAC CTT AT G G G AAAG CGTGTGGACTTTTCTGCACGTACTGTCATCACACCAGATCCCAA TTTACGTATCGACCAAGTAGGAGTGCCTAGAAGTATTGCTCAAAA CAT GACGTTT CCAGAAATCGT C ACACCTTT CAATTTT GACAAAAT GTTGGAATTGGTACAGAGAGGTAATTCTCAGTATCCAGGAGCTA AGT AT AT CAT CAG AG ACAATGG AGAGAGG ATT GATTT ACGTTT C C AC CC AAAACC GT C AG ATTT AC ATTT G C AGT GTG GTT AT AAG GT AG AAAG AC ACAT C AG AG ACG GCG AT CT AGTAAT CTT CAAC CGT C AACCAACCCTCCACAAGAT GAGTAT GATGGGCCACAGAGT CAA AGTCTTACCCTGGTCGACGTTCCGTATGAATCTCTCGTGCACCT CTCCCTACAACGCCGATTTT GACGGCG ACGAAAT GAACCT CCA T GT GCCCCAAAGT AT GGAAACT CGAGCT GAAGTCGAAAACCT C CACATCACTCCCAGGCAAATCATTACTCCGCAAGCTAACCAAC C CGT CAT G GGT ATT GT AC AAG AT AC GTT G AC AG CTGTT AG G AAG

AT G ACAAAAAGG G AT GTATT CATCG AG AAGG AACAAATG AT G AAT AT ATT G AT GTT CTT G CC AATTT G G G AT G GT AAAAT G C CC C GT CC A GCCATCCTCAAACCCAAACCGTTGTGGACAGGAAAACAGATATTT TC C CT G AT C ATT C CTG G C AAT G T AAAT AT G AT AC GTAC C C ATT CTA CGCATCCAGACGACGAGGACGACGGTCCCTATAAATGGATATCG C C AG G AG ATAC G AAAGTTATG GTAG AAC ATG G AG AATTG G TC AT GGGTATATT GT GTAAGAAAAGT CTT GGAACAT CAGCAGGTT CCC TG CTG C ATATTTGTATGTTG GAATTAG G AC AC GAAGTGTGTG GT AG ATTTT AT G GT AAC ATT C AAACT GT AAT C AAC AACT G GTTGTTGT TAGAAGGTCACAGCATCGGTATTGGAGACACCATTGCCGATCCT C AG ACTTAC AC AG AAATTC AG AG AG C C ATC AG G AAAG CC AAAG A AG AT GTAAT AG AAGTCATCCAG AAAG CTCACAAC AT GG AACT G G AACCGACTCCCGGTAATACGTTGCGTCAGACTTTCGAAAATCAA GTAAAC AG AATT CTAAACG AC G CT CGT G ACAAAACT G GT G GTT C C G CT AAG AAAT CTTT G ACT G AAT AC AAT AAC CT AAAG G CTATG GT CGT AT C G G G AT C C AAG G G AT C C AAC ATT AAT ATTT C C C AG G TT AT TGCTTGCGTGGGTCAACAGAACGTAGAAGGTAAACGTATTCCAT TTGGCTTCAGAAAACGCACGTTGCCGCACTTCATCAAGGACGAT TACGGTCCTGAATCCAGAGGTTTCGTAGAAAATTCGTATCTTGC CGGTCTCACTCCTTCGGAGTTCTATTTCCACGCTATGGGAGGTC GTGAAGGTCTTATCGATACTGCTGTAAAAACTGCCGAAACTGGT TAC ATCC AACGTC GTCTG ATAAAG G CTATG G AG AGTGTAATG G TACACTACGACGGTACCGTAAG AAATT CT GTAGGACAACTTAT CC AGCT G AG AT ACG GT G AAG ACG G ACT CT GT G G AG AG AT G GTAG A G TTT C AAT ATTT AG C AAC AGT C AAATT AAGT AAC AAG G C G TTT G A GAGAAAATTC AG ATTT GATCCAAGTAATGAAAGGTATTTG AGAA G AGTTTTC AATG AAG AAGTTATC AAG C AACTG ATG G GTTC AG G G GAAGT CATTT CCG AACTT GAGAGAGAATGGG AAC AACT CCAGA AAG AC AG AG AAG CCTT AAGAC AAAT CTTCCCT AGCG G AG AAT C T AAAGT AGT ACT C CC CT GT AACTT AC AACGTAT G AT CT G G AAT GT

ACAAAAAATTTTCCACATAAACAAACGAGCCCCGACAGACCTGTC CCCGTTAAGAGTTATCCAAGGCGTTCGAGAATTACTCAGGAAAT GCGTCATCGTAGCTGGCGAGGATCGTCTGTCCAAACAAGCCAA CGAAAACGCAACGTTACTCTTCCAGTGTCTAGTCAGATCGACCC TCTG CACCAAATG CGTTTCTG AAG AATTCAG G CTCAG CACCG AAG CCTTCGAGTGGTTGATAGGAGAAATCGAGACGAGGTTCCAACAAG CCCAAGCCAATCCTGGAGAAATGGTGGGCGCTCTGGCCGCGCAG TC ACTG G G AG AAC CC G CTACTC AG ATG AC ACTG AAC ACTTTC C AT TTTGCTGGTGTATCCTCCAAGAACGTAACCCTGGGTGTACCTAGA TTAAAG G AAATT ATT AAT ATTT C C AAG AAAC CC AAG G CTCCATCTC TAACCGTGTTTTTAACTGGTGCGGCTGCTAGAGATGCGGAAAAAG CG AAG AAT GT GTT AT G CAG ACTT G AAC ACACCACT CTT CGTAAAG T AAC C G C C AAC AC C G C C AT CT ATT AC G AT C CT G AC C C AC AAAAT A CCGTCATTCCTGAGGATCAGGAGTTCGTTAACGTCTACTATGAAA T GCCCGATTT CGAT CCTACCCGT AT AT CGCCGT GGTTGCTT CGT AT CG AACT G G AC AG AAAG AG AAT G AC AG AT AAG AAACT AACT AT G GAACAAATTGCT GAAAAGATCAACGCT GGGTT CGGGGACGATTT G AATT GTATTTT CAACGACGACAATGCT G AAAAGTT GGT GCTGCGT ATCAGAATCATGAACAGCGACGATGGAAAATTCGGAGAAGGTGC T G AT G AG G ACGTAG ACAAAAT G G AT G ACG ACATGTTTTT G AG AT G C ATC G AAG CG AAC ATG CTG AG C G ATATG AC CTTG C AAG GT ATAG A AGCG ATTT CC AAG GTAT ACAT G CACTT G CCAC AG ACT G ACTCG AA AAAAAGGATCGTCATCACTGAAACAGGCGAATTTAAGGCCATCGC AG AAT GGCTATTGG AAACT GACGGTACCAGCAT GAT GAAAGTACT GT C AG AAAGAGACGT CGAT CCGGT CAGGACGTTTT CTAACGACA-TTTGTG AAATATTTTCG GTACTTG GTATC G AG G CTGTG CGTAAGT CT GT AGAGAAAG AAAT G AACG CT GTCCTTT CATT CT ACG GT CT GT ACGT AAACT AT CG CCAT CTTGCCTT GCTTT GT G ACGT AAT G ACAG CCAAAGGT CACTT AAT GGCCAT CACCCGT CACGGTAT CAACAG AC AAGACACT GGAGCTCT GAT GAGGT GTT CCTTCGAGGAAACT GTA

GATGTATTGATGGACGCTGCCAGTCATGCGGAGGTCGACCCAA T G AG AG G AGTAT CT G AAAACATT AT CCTCG GT CAACT ACC AAG AA TG G G CACAG G CTG CTTCG ATCTTTTG CTG G ACG CCG AAAAATG TAAAATG G G AATTG CC ATACCTC AAG C G C AC AG C AG C G ATCTAA TG G CTTCAG G AATGTTCTTTG G ATT AG C C G CT AC AC C C AG CAG T AT G AGTC C AG GTG GTG CT AT G ACC CC AT G G AAT C AAG C AG CT A C AC CATACGTTG G CAGTATCTG GTCTC C AC AG AATTTAATG G G CAGTGGAATGACACCAGGTGGTGCCGCTTT CTCCCCAT CAGCT G CGTCAGATGCATCAGGAATGTCACCAGCTTATGGCGGTTGGTCA C C AAC AC C AC AAT CTC CTG C AAT GTC G C C AT AT AT G G CTTCTC CA C AT G G AC AAT C G C CTTC CT AC AGT C C AT C AAGT CC AG C GTTC C AA CCTACTT CACCATCCAT GACGCCG ACCT CTCCTGGATATT CT CC C AGTT CTC CT G GTT ATT C AC CT AC CAG T CT C AATT AC AGT C C AA CGAGTCCCAGTTATTCACCCACTTCTCAGAGTTACTCCCCAACCT C AC CT AGTT ACT C AC C G ACTT CT C C AAATT ATT C AC CT ACTT C C C C AAG CT AC AG T C CA AC AT C C C CT AACT ATT C AC C AAC AT CTC C CA ACT ATT CACCC ACTT C ACCT AGTT ATCCTT C AACTT CGCCAG GTT AC AGCCCCACTT C ACG CAG CT ACT C AC CC ACAT CT CCT AGTT AC-T C AG G AACTT CGCCCTCTT ATT C AC C AACTT C G C C AAG TT ACT C C CCTACTTCTCCTAGTTATTCGCCGTCGTCTCCTAATTACTCTCCC ACTT CTCCAAATT ACAGTCCCACTT CTCCT AATT ACTCACCGT CC TCTCCTAGGTACACGCCCGGTTCTCCTAGTTTTTCCCCAAGTTCG AACAGTT ACT CTCCCACAT CTCCT CAATATT CT CCAACAT CT CCA AGTTATTCGCCTTCTTCGCCCAAATATTCACCAACTTCCCCCAAT T ATT CGCC AACAT CT CCAT C ATTTT CT G G AG G AAGTCC AC AAT AT TCACCCACATCACCGAAATACTCTCCAACCTCGCCCAATTACAC-TCTGTCGAGTCCGCAGCACACTCCAACAGGTAGCAGTCGATATT-CACCGT CAACTTCGAGTT ATT CT CCT AATTCGCCCAATTATT CACC GACGTCTCCACAATACTCCATCCACAGTACAAAATATTCCCCTGCA AGT CCT ACATT CACACCCACCAGTCCT AGTTT CT CT CCCGCTT C

ACCCGC AT ATTCGCCT C AACCT AT GT ATT C ACCTT CTT CT CCTAA-TT ATT CT CCCACT AGT CCC AGT C AAG AC ACT G ACT AAAT AT AAT C AT AAG ATT GTAGT GGTT AGTT GT ATTTT AT ACAT AG ATTTT AATT C AG AATTT AAT ATT ATTTTTT ACT ATTT AC C AG G G AC ATTTTT AAAG TTGTAAAAAC ACTTAC ATTTGTTC C AAC G G ATTTTT G C AC AAACG T AAC G AAG TT AAAT C AAAAC ATT AC AAC T G AAAC AT ACGTCGGTA TGTACTGTCAATGTGATCATTAGGAAATGGCTATTATCCCGGAG G ACGTATTTT AT AAAGTT ATTTT ATT G AAGT GTTT G AT CTTTTTT C ACT ATT G AG G AG ATTT AT G G ACT C AAC ATT AAAC AG CTT G AAC AT -C AT ACC G ACT ACT ACT AAT AT AAAG AT AAAT AT AG AAC G GT AAG A AAT AG ATT AAAAAAAAAT AC AAT AAGTT AAAC AGT AAT C AT AAAAA T AAAT ACGTTT CC G TT C G AC AG AACT AT AG CC AG ATT CTT G T AGT AT AAT G AAAATTT GT AG GTT AAAAAT ATT ACTT GT C AC ATT AG CTT AAAAAT AAAAAATT AC CG G AAGTAAT C AAAT AAG AG AG C AAC AGTT AGT CGTT CT AAC AATT AT GTTT G AAAAT AAAAATT AC AAT G AGTT A T AC AAAC G AAG ACT AC AAGTTT AAAT AGTAT G AAAAACT ATTT G T AAAC AC AAC AAAT G CGC ATT G AAATTT ATTT ATCGTACTT AACT T ATTT G CCTT AC AAAAAT AAT ACTCC G C G AGT ATTTTTT AT G AAC-T GTAAAACT AAAAAGTT GT AC AGTT C AC AC AAAAAC AT C G AAAAA TTTT GTTTTT GTAT GTTT CT ATT ATT AAAAAAAT ACTTTTT AT CTTT C ACCTT AT AGGT ACT ATTT G ACT CT AT G AC ATTTT CT CT ACATTT CTTT AAAT CTGTTCT ATTT ATT AT G T ACAT G AAT CT AT AAG C AC AAA T AAT AT ACAT AAT C ATTTT G AT AAAAAAT C AT AG TTTT AAAT AAAAC AG ATTT C AAC AC AAT ATT C AT AAGT CT ACTTTTTT AAAAATTT AT A GAGACAAAGGCCATTTTTCAGAAACAGATTAAACAAAAATCACTA TAAATTATTTT GAGTAT GTT G AAT AAGTTTAT ATT GCTTCTACAAT TTTT AAAT AT AAAATT AT AAC ATT AG C AG AG G AAC AAC G AG AATT AA GGTCGGGAAGATCATGCACCGA

[0040] A SEQ ID NO:4 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de RPII215 de WCR codificado por um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo adicional (isto é, rpll215-2): MATNDSKAPLRTVKRVQFGILSPDEIRRMSVTEGGIRFPE

TMEAGRPKLCGLMDPRQGVIDRSSRCQTCAGNMTECPGHFGHIELA

KPVFHVGFVTKTIKILRCVCFFCSKLLVSPNNPKIKEVVMKSKGQPRK

RLAFVYDLCKGKNICEGGDEMDVGKESEDPNKKAGHGGCGRYQP

NIRRAGLDLTAEWKHVNEDTQEKKIALSAERVWEILKHITDEECFILG

MDPKFARPDWMIVTVLPVPPLAVRPAVVMHGSARNQDDITHKLAD

IIKANNELQKNESAGAAAHMTENIKMLQFHVATLVDNDMPGMPRAMQ

KSGKPLKAIKARLKGKEGRIRGNLMGKRVDFSARTVITPDPNLRIDQ

VGVPRSIAQNMTFPEIVTPFNFDKMLELVQRGNSQYPGAKYIIRDNG

ERIDLRFHPKPSDLHLQCGYKVERHIRDGDLVIFNRQPTLHKMSMM

GHRVKVLPWSTFRMNLSCTSPYNADFDGDEMNLHVPQSMETRAE

VENLHITPRQIITPQANQPVMGIVQDTLTAVRKMTKRDVFIEKEQMM

NILMFLPIWDGKMPRPAILKPKPLWTGKQIFSLIIPGNVNMIRTHSTH

PDDEDDGPYKWISPGDTKVMVEHGELVMGILCKKSLGTSAGSLLHI

CMLELGHEVCGRFYGNIQTVINNWLLLEGHSIGIGDTIADPQTYTEIQ

RAIRKAKEDVIEVIQKAHNMELEPTPGNTLRQTFENQVNRILNDARD

KTGGSAKKSLTEYNNLKAMVVSGSKGSNINISQVIACVGQQNVEGK RIPFGFRKRTLPHFIKDDYGPESRGFVENSYLAGLTPSEFYFHAM- GGREGLIDTAVKTAETGYIQRRLIKAMESVMVHYDGTVRNSVGQLI- QLRYGEDGLCGEMVEFQYLATVKLSNKAFERKFRFDPSNERYLRR

VFNEEVIKQLMGSGEVISELEREWEQLQKDREALRQIFPSGESKVVL

PCNLQRMIWNVQKIFHINKRAPTDLSPLRVIQGVRELLRKCVIVAGE

DRLSKQANENATLLFQCLVRSTLCTKCVSEEFRLSTEAFEWLIGEIE

TRFQQAQANPGEMVGALAAQSLGEPATQMTLNTFHFAGVSSKN

VTLGVPRLKEIINISKKPKAPSLTVFLTGAAARDAEKAKNVLCRLEHT

TLRKVTANTAIYYDPDPQNTVIPEDQEFVNVYYEMPDFDPTRISPWL

LRIELDRKRMTDKKLTMEQIAEKINAGFGDDLNCIFNDDNAEKLVLRI

RIMNSDDGKFGEGADEDVDKMDDDMFLRCIEANMLSDMTLQGIE

AISKVYMHLPQTDSKKRIVITETGEFKAIAEWLLETDGTSMMKVLSE

RDVDPVRTFSNDICEIFSVLGIEAVRKSVEKEMNAVLSFYGLYVNYRH

LALLCDVMTAKGHLMAITRHGINRQDTGALMRCSFEETVDVLMDAA

SHAEVDPMRGVSENIILGQLPRMGTGCFDLLLDAEKCKMGIAIPQAH

SSDLMASGMFFGLAATPSSMSPGGAMTPWNQAATPYVGSIWSPQN

LMGSGMTPGGAAFSPSAASDASGMSPAYGGWSPTPQSPAMSPYM

ASPHGQSPSYSPSSPAFQPTSPSMTPTSPGYSPSSPGYSPTSLNYS

PTSPSYSPTSQSYSPTSPSYSPTSPNYSPTSPSYSPTSPNYSPTSPN

YSPTSPSYPSTSPGYSPTSRSYSPTSPSYSGTSPSYSPTSPSYSPTS

PSYSPSSPNYSPTSPNYSPTSPNYSPSSPRYTPGSPSFSPSSNSYS

PTSPQYSPTSPSYSPSSPKYSPTSPNYSPTSPSFSGGSPQYSPTSP

KYSPTSPNYTLSSPQHTPTGSSRYSPSTSSYSPNSPNYSPTSPQYSI

HSTKYSPASPTFTPTSPSFSPASPAYSPQPMYSPSSPNYSPTSPSQ

DTD

[0041] A SEQ ID NO:5 mostra um contig contendo um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo adicional, referido neste documento, em alguns locais, como WCR rpll215-3: AT CACGCGT CACG GT AT C AACAG AG AT GACT CT GGTCC TCTTGTGCGATGCTCGTTCGAAGAAACCGTTGAAATTCTCATGGA CGCTGCCATGTTCTCTGAAGGAGACCCATTGACTGGTGTGTCTG AAAACGTGATGCTTGGTCAATTGGCTCCGCTCGGTACTGGTTTGA TGGACCTTGTGTTGGATGCGAAGAAATTGGCAAACGCCATCGAG TACGAAGCATCTGAAATCCAGCAAGTGATGCGAGGTCTGGACAA CGAGT GGAGAAGTCCAGACCATGGACCTGGAACT CCAAT CT CG ACTCC ATTCG CAT C GACT CC AG GTTT C ACGGCTT CTT CTCCTTT CAGCCCTGGTGGTGGTGCGTTCTCGCCTGCAGCTGGTGCGTT TTCGCCAATGGCGAGCCCAGCCTCGCCTGGCTTCATGTCGTC T C C AG GTTT C AGT G CTG CTT CT C C AG C G C AC AG C CC AG C GTC T CCGTT G AGCCC AACGT CGCCT GCATACAGTCCAAT GT CACCAG CGTACAGCCCCACGTCGCCGGCTTACAGCCCGACGTCACCGGC TTACAGTCCAACGTCGCCTGCATACTCG

[0042] A SEQ ID NO:6 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de RPII215 codificado por um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo adicional, referido neste documento, em alguns locais, como WCR RPII215-3: ITRHGINRDDSGPLVRCSFEETVEILMDAAMFSEGDPLTG

VSENVMLGQLAPLGTGLMDLVLDAKKLANAIEYEASEIQQVMRGLDN

EWRSPDHGPGTPISTPFASTPGFTASSPFSPGGGAFSPAAGAFSPM

ASPASPGFMSSPGFSAASPAHSPASPLSPTSPAYSPMSPAYSPTSP

AYSPTSPAYSPTSPAYS

[0043] A SEQ ID NO:7 mostra um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo, referido neste documento, em alguns locais, como WCR rpll215-1 regí (região 1), que é usado, em alguns exemplos, para a produção de um dsRNA: GTGCTTATGGACGCTGCATCGCATGCCGAAAACGATC CTATGCGTGGTGTGTCGGAAAATATTATTATGGGACAGTTACCCA AG AT G G GTAC AG GTT GTTTT G AT CTCTT ACT G G AT G C C G AAAAAT G C AAGT AT G G C AT C G AAAT AC AG AG C AC

[0044] A SEQ ID NO:8 mostra um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo adicional, referido neste documento, em alguns locais, como WCR rpU215-2 regí (região 1), que é usado, em alguns exemplos, para a produção de um dsRNA: GACCCAATGAGAGGAGTATCTGAAAACATTATCCTCGG TC AACTACC AAG AATG G G C AC AG G CT GCTTCGAT CTTTT G CTG G A C G CC G AAAAATGTAAAATG G G AATTG C C ATACCTC

[0045] A SEQ ID NO:9 mostra um DNA de rpll215 de WCR ilustrativo adicional, referido neste documento, em alguns locais, como WCR rpll215-3 regí (região 1), que é usado, em alguns exemplos, para a produção de um dsRNA: G ACCCATT GACTGGT GT GT CT G AAAACGT GATGCTT G GTCAATTGGCTCCGCTCGGTACTGGTTTGATGGACCTTGTGTTGG

ATGCGAAGAAATTGGCAAACGCCATCGAG

[0046] A SEQ ID NO: 10 mostra a sequência de nucleotídeos do promotor de fago 17.

[0047] A SEQ ID NO:11 mostra um fragmento de uma sequência de codificação de YFP ilustrativa.

[0048] As SEQ ID NOs:12-19 mostram os iniciadores usados para amplificar partes das sequências de rpll215 de WCR ilustrativas compreendendo rpll215-1 regí, rpll215-2 regí, rp//275-1 v1, rpll215-2 v1, rpll215-2 v2, e rpll215-3, usados, em alguns exemplos, para a produção de dsRNA.

[0049] A SEQ ID NO:20 mostra um gene de YFP ilustrativo.

[0050] A SEQ ID NO:21 mostra uma sequência de DNA da região 1 de anexina.

[0051] A SEQ ID NO:22 mostra uma sequência de DNA da região 2 de anexina.

[0052] A SEQ ID NO:23 mostra uma sequência de DNA da região 1 de beta espectrina 2.

[0053] A SEQ ID NO:24 mostra uma sequência de DNA da região 2 de beta espectrina 2.

[0054] A SEQ ID NO:25 mostra uma sequência de DNA da região 1 de mtRP-L4.

[0055] A SEQ ID NO:26 mostra uma sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4.

[0056] As SEQ ID NOs:27-54 mostram os iniciadores usados para amplificar regiões de genes de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4, e YFP para a síntese de dsRNA.

[0057] A SEQ ID NO:55 mostra uma sequência de DNA de milho codificando uma proteína TIP41-like.

[0058] A SEQ ID NO:56 mostra a sequência de nucleotídeos de um oligonucleotídeo de iniciador de T20VN.

[0059] As SEQ ID NOs:57-61 mostram os iniciadores e as sondas usados para as análises da expressão do transcrito de dsRNA no milho.

[0060] A SEQ ID NO:62 mostra uma sequência de nucleotídeos de uma parte de uma região de codificação de SpecR usada para a detecção de base do vetor binário.

[0061] A SEQ ID NO:63 mostra uma sequência de nucleotídeos de uma região de codificação de AAD1 usada para a análise do número de cópias genômicas.

[0062] A SEQ ID NO:64 mostra uma sequência de DNA de um gene de invertase do milho.

[0063] As SEQ ID NOs:65-73 mostram as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos de DNA usados para as determinações do número de cópias de genes e a detecção de base de vetor binário.

[0064] As SEQ ID NOs:74-76 mostram os iniciadores e as sondas usados para as análises da expressão no milho do transcrito de dsRNA.

[0065] A SEQ ID NO:77 mostra um DNA de rpíl215 de BSB ilustrativo, referido neste documento, em alguns locais, como BSB rpíl215-1: TTT GACCAT GGTTAAGGCAGGTTAGCCTT CTT GAATT GT GTT GG CTT CTTT CT G GT GT CCAAT CT AATTT AAAATTT AAAAT GGT C AAGGAATTGTACCGTGAGACGGCTATGGCCCGTAAAATATCCCAT GTTAGTTTTG G GTTAG ACGGGC CTCAAC AAATG CAG CAG C AG G CT C ATTT G C AT GTCGTTGCT AAAAACTT AT ATT CT C AG G ACT CT CAGA G AACT CCT GTTCCTT AT GG AGTTTT AG AT AG AAAAAT G G G CACAA ATCAAAAAGATG CAAATTGTG GTACTTGTG GTAAAG G ATTAAATG A CT GTATT GGACACTATGGGTACATAGAT CTT CAGCTGCCAGT GTT T C AT ATT G GTT ATTTT AGGGCAGT C AT AAAT ATTTT ACAG AC AAT A T GT AAG AAT CCT CT AT GT GCAAG AGTTTT G ATTCCT G AG AAAG AAA G AC AAGTTT ATT AT AAT AAGTT G AG G AAT AAAAATTT GT CTT ACTT A

GTT AG G AAAGCTTT G AG AAAAC AAAT AC AAACT AG AGC G AAAAAG TTT AAT GTTT G C C C AC ATT G TG G T G ATTT AAAT GGCTCCGTT AAG AAAT GTG G ACTT CT G AAG ATT AT AC AT G AAAAAC AT AAC AGT AAAA AG CCT G AT GT AGT AAT G C AG AAT GT ATT AG CT G AATT AAG T AAAG A TACAGAGTATGGCAAAGAATTAGCTGGTGTAAGTCCGACTGGGCA C AT CCT AAAT CCT C AAG AG G TC CT AC G ACT ATT G G AAG CT AT C C CAT CT C AAG AT ATT CC ATT ACTT GTT AT G AATT AT AAT CTTT CAAAA CCT GCT GAT CT GAT ACT G ACCAGG ATT CCAGTT CCTCCATT AT CT AT CCG ACCCT CAGTTAT AT CT GATTT G AAAT CTGG AACAAAT GAA GAT GAT CTT AC CAT G AAACT AT C AG AAAT AGT CTTT ATT AAT GAT G T CAT CAT G AAAC AT AAACTTT CT G G AG CT AAG G C AC AAAT G ATT G C AG AAG ATT G G G AGTT CTT AC AGTT AC ATT GTG CT CTTT AC AT AA ATAGTG AG AC ATCTG G AATACC AATTAAC ATG C AG C C AAAAAAA T C C AGTAG AG G ATT AGTT C AAAG ACT AAAAG GTAAAC AT G GT AG GTTC C GTG G AAAT CTATCTG G AAAAC G AGTT GATTT CTCTG C AC G T ACT GT C ATTT CACCT GAT CCT AAT CTT AGG ATT G AAG AG GTT G G TGTTC CT ATT CAT GTTG CT AAAAT CTT AAC ATTT C CT G AAAG AGTT CAACCTGCCAATAAAGAACTTTTGAGGCGATTGGTTTGTAATGGA C CT GAT GTAC AT C CTG GTG CT AATTTT GTT C AAC AG AAG G G AC AA T C ATTT AAAAAATTT CTT AG AT AT G GT AAT C G AG C AAAAAT AG CA C AAG AATTAAAG G AAG GTG ATATTGTAG AAAG G C AC CTAAG G G A T G G AG AT AT AGTT CT ATT C AAT CGT C AG CCT AGTTT AC AC AAG CT G AGT AT AAT GT C AC AT CGT GTAC G AGT ACT AG AG AAT AG AAC ATT T AG GTT C AAT G AAT GTG C CT GT ACT CC AT AC AAT G CT G ATTTT G ATGGCGATGAAATGAATCTTCATGTACCACAGTCGATGGAAACT CGAGCAGAAGTT G AAAAT CTT C ACGTT ACT CCACG ACAAAT CATT ACCCCACAGTCAAATAAACCCGTTATGGGTATTGTACAGGACACT CT CACTGCT GT CAGAAAAAT GACAAAAAGGGAT GTTTT CTT AGAA AAG G AAC AAATG ATG AAC ATTCTC ATG C ATTT G C C AG G CTG GAA T G G AAG AAT G C C G ATT C C AG C G ATT CT G AAAC C AAAAC CTTT G T

GGACAGGTAAACAAGTATTCTCGTTGATTATCCCCGGTGAAGTT AACAT G ATT CG AACT CACT CT AC AC AT CCC G AT G AT G AAG AT AA C G G CC CTTAC AAATG G ATCTCTC CTG GTG AC AC C AAG GTAATG G TGGAAGCTGGAAAATTGGTCATGGGAATTCTCTGTAAAAAGACT

CTCGGT CAT GAAC AGT GT GGCT ATTTTTATGGTAACATT CAAACT GTCGTTAACAACTGGCTATTGTTGGAGGGTCACTCCATCGGTAT TG GT G AC ACT ATT G CT G AT C CT C AG AC AT AT CTT G AAATT CAGA AAG C AATTAAAAAAG CC AAAC AG G ATG TC ATAG AG GTTATTC AAA AAGCTCACAACATGGACCTGGAACCTACGCCTGGTAATACTTT GAGGCAGACTTTCGAAAATCAGGTAAACAGAATTCTAAACGAC G CT CG AG ACAAAACT G G AGGTT CT GCT AAG AAAT CT CTT ACT G A ATACAATAACCTAAAGGCTATGGTGGTGTCTGGTTCAAAAGGG T C C AAC ATT AAT ATTT CT C AG GTT ATT G CTT GTGTGGGT C AG C AAAACGTAGAAGGTAAGCGAATCCCATTCGGCTTCAGGAAGAGG AC ATT AC C C C ATTT CAT C AAG G AT G ATT ACGGTCCT G AG TCT AG AGGATTCGTAGAAAACTCGTACCTTGCCGGTCTGACTCCTTCC G AGTT CTT CTT C C AC G CT AT G G G AG GT AG AG AAG GT CTT ATT G A TACTGCTGTCAAAACTGCTGAAACAGGTTATATCCAGCGTCGTCT TATAAAGGCTATGGAGAGCGTTATGGTCCATTACGATGGTACCG T C AG AAATT CT GTTG G AC AG CT C ATT C AGTT G AG GT AT G G AG AG GACGGCCTTTGTGGTGAAGCAGTCGAGTTTCAGAAGATACAGAG TGTTC CT CTTT CT AAC AG G AAG TT C G AAAG C AC ATT C AAATTT G A T C CAT C G AAT G AAAG GT AC CTC C G T AA AAT CTTC G CT G AAG AT G TTCTTCGTGAGTTACTCGGCTCTGGTGAAGTTATATCTGCTCTCG AACAGGAATGGGAACAATTGAACAGGGATAGGGATGCCCTGAG GCAGATTTTCCCTTCAGGAGAGAACAAAGTTGTACTCCCTTGTA ACTT GAAG AGGAT GATAT GGAACGCT CAGAAGACTTTCAAGAT CAAT CT C AGGGCT CCGACCGAT CT CAGTCCGCT CAAAGT CATT CAGGGT GT GAAAGAGCTATT AG AGAAGT GT GT GATT GTCG CCGG

T GACGAT CATTT AAGCAAACAG GCT AAT GAAAACGCT ACCCT CC TTTT CCAAT GTTT G GTT AGGAGT ACCCT CT GTACAAAGCT AGTTT CAGAGAAGTTCAGGCTTTCATCGGCAGCTTTTGAGTGGCTTATA GGAGAAATCGAAACAAGATTTAAACAAGCCCAGGCTGCTCCAGG T GAAAT GGTT GGAGCTTTGGCAGCCCAGAGTTTGGGAGAACCG G C C ACTC AG ATG AC ACTC AAC ACTTTC C ATTTTG CTGGTGTGT CATCGAAAAACGTAACCCTTGGTGTGCCCAGGCTAAAGGAAAT C AT C AAT AT AAG T AAG AAAC C AAAG G CTC C AT CTCTT AC C G TCTT CCTTACCGGAGCAGCTGCCAGAGATGCTGAAAAGGCTAAAAATG TTCTGTGCCGTCTTGAACACACAACGCTAAGGAAGGTAACGGC T AAT ACT G C AATTT ACT AT G AT C CT G AT C C AC AAAAC AC G GT AA TC C C AG AG G AT C AAG AGTTT GTT AAT GTAT ACT AT GAAAT G CCT GACTTT GAT CCTACC AG AATTT CACCCTGGCT GTT GAGAATT GA ATTGGACAGAAAAAGAAT GACAGATAAGAAACT GACGATGGAAC AGAT AT CT GAAAAAAT CAATGCTGGTTT CGGT GAT GATTTAAATT GTATTTT C AAT G AC G AC AAT GCT G AAAAG CTT GT ATT ACGTATT A GGATCATGAACAGCGATGACGGGAAATCGGGAGAAGAGGAAGA AT CAGTT GACAAG ATGG AAG ACG AT AT GTTCCTT AGGT GTATT G AAG CTAAC ATG CTTTC AG AC ATG ACTTTAC AG G GTATTG AAG CTA TC AGC AAG GTATATATG CACTTG C CTC AAACTG ACTC AAAG AAA AG AAT C AT AAT G ACT G AAACAG G AG AGTT C AAAGCCATT G CT G ATT G GTTG CTT G AAACT G ACG GT AC AT CT CTT AT G AAAGT ACTT AGT GAAAGAG AT GT CG AT CCT GTGCGT ACATT CT CT AACG ACAT TTGTGAAATTTTCTCTGTGCTGGGTATCGAGGCTGTCCGTAAAT CGGTAGAGAAAGAAATGAACAATGTATTGCAGTTCTATGGATTG T ACGT AAACT ACC G AC ATTT G G CTTT G CTTT GT G AC GT AAT G AC TGCCAAGGGTCATCTTATGGCCATCACTAGGCACGGTATCAACA GGCAGG AC ACCG GAGCT CT CAT GAGAT GCT CTTTT GAAG AAAC T GTT GAT GT G CTC ATG G ATG C AG C ATCTC AC G CTG AG GTAG AT CCCAT GAGAGGAGT GT CAGAG AACAT CAT CAT GGGT CAATTGC

CGAGG ATGGGAACTGGCTGCTTT GACTT ATT GTT GGATGCT GAG AAAT GTAAAGAGGGCATAGAAAT CTCCAT GACT GGAGGTGCT GA G G TG CTT ACTT CGGTGGTGGTTC C AC AC C AC AG AC AT C G C CTT CTCGTACTCCTTGGTCTTCAGGTGCTACTCCCGCATCAGCTTCA T CAT GGT CACCT G GTGGAGGTT CTT CAGCTTGG AGCCACG AT C AGCCT AT GTT CT CACCTT CTACT G GTAGCG AACCCAGTTTTT CT CCCTCATGGAGCCCTGCACACAGTGGATCTTCTCCGTCATCATA TATGTCTTCTCCCGCTGGAGGAATGTCTCCAATTTACTCACCGA CTCCCATATTCGGACCAAGCTCGCCATCGGCTACCCCAACTTC TCCTGTCTATGGTCCAGCCTCCCCTCCGTCTTACTCCCCTACT ACTCCT CAATACCTTCCAACGTCTCCTT CCT ATT CTCCAACTT C ACCTTCTTATTCTCCTACATCTCCTTCCTACTCTCCTACTTCCC CTT CTT ATT C ACC AACTT CT C CTT C CT ATT C AC C AAC AT CTC CTT CCT ACT C C C C AAC AT C AC CCT CAT ATT C AC CT AC AT C C C C TT CA T ATT CT C C AAC AT CTCCATCCT ATT CCCCTACTTCTC CAT CAT ATT C G CCT AC AT CT C C CT CTT ACT CT C C AACTT C ACC AT C CT ATT CTC CT ACCT CCCCTT CTTACT CACC AACAT C ACCGT CTTACTCG CCA AGTT CTCCAAGCAATGCTGCTTCCCCAAC AT ACT CTCCTACTT C AC CTT CAT ATT CCCCGACTT C AC C AC ATT ATT CGCCTACTT CACC TT CTT ATT CACCT ACTTCTC C C C AAT ATT CTC C AAC AAG C C C C AG CTACAGCAGCTCGCCGCATTATCATCCCTCATCCCCTCATTACA CACCTACTTCTCCCAACTATTCCCCCACTTCTCCGTCTTATTCT C CAT CAT C AC CTT CAT ACT C CC C AT C CTCC C C AAAAC ACT ACT C ACCCACCTCTCCTACATATTCACCAACCTCCCCTGCTTATTCAC C AC AAT CGGCT ACCAGCCCT CAGTATT CT CCATCCAGCTCAAGA TATTCCCCAAGCAGCCCAATTTATACCCCAACCCAATCCCATTA TT CACCT GCTT CAACAAATT ATT CT CC AGG CT CT G GTT CC AATT A TTCCCCGACATCTCCCACCTATTCACCTACATTTGGTGATACCAA T G AT C AAC AG C AG C AG C G AT AAGT GTT G AATTT GT AT AT ATTTT ACTT AT G ATTTT C ATTTT AT G AAT GT AT ATTT CTT AT ATTT G AATT

G AC AAT G ACT CAATT AT AAAC ATT AT C ATCCT AAT GT CT GTT AA AGTTTATT GTT GAT AGTTTT CTT CCTTTTTTTTTTTTTTACAGGACT GTTCCTTTTTT AACAAATTT ACCTT CTG AGCT G AAG CAT CT CCTT T ATT ATT GAT AG AG G G AAT AC C AG AATT G C CTGT C ATTT C C ATT A CTTC CT CTTT AG CAT AACG AT G G ACT G TT AT AT CTTT C AAC C AC C AT G GAT CT CATTCCTT GT CAAAAGTT AAATCCT CTTT CAAG G AAAC

[0066] A SEQ ID NO:78 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de RPII215 de BSB codificado por um DNA de rpll215 de BSB ilustrativo (isto é, BSB rpll215-1): MVKELYRETAMARKISHVSFGLDGPQQMQQQAHLHVVA

KNLYSQDSQRTPVPYGVLDRKMGTNQKDANCGTCGKGLNDCIGHY

GYIDLQLPVFHIGYFRAVINILQTICKNPLCARVLIPEKERQVYYNKLRN

KNLSYLVRKALRKQIQTRAKKFNVCPHCGDLNGSVKKCGLLKIIHEKH

NSKKPDVVMQNVLAELSKDTEYGKELAGVSPTGHILNPQEVLRLLEA

IPSQDIPLLVMNYNLSKPADLILTRIPVPPLSIRPSVISDLKSGTNEDDL

TMKLSEIVFINDVIMKHKLSGAKAQMIAEDWEFLQLHCALYINSETSG

IPINMQPKKSSRGLVQRLKGKHGRFRGNLSGKRVDFSARTVISPDP

NLRIEEVGVPIHVAKILTFPERVQPANKELLRRLVCNGPDVHPGAN

FVQQKGQSFKKFLRYGNRAKIAQELKEGDIVERHLRDGDIVLFNRQ

PSLHKLSIMSHRVRVLENRTFRFNECACTPYNADFDGDEMNLHVP

QSMETRAEVENLHVTPRQIITPQSNKPVMGIVQDTLTAVRKMTKRD

VFLEKEQMMNILMHLPGWNGRMPIPAILKPKPLWTGKQVFSLIIPGE

VNMIRTHSTHPDDEDNGPYKWISPGDTKVMVEAGKLVMGILCKKTL

GTSAGSLLHICFLELGHEQCGYFYGNIQTVVNNWLLLEGHSIGIGDT

IADPQTYLEIQKAIKKAKQDVIEVIQKAHNMDLEPTPGNTLRQTFENQ

VNRILNDARDKTGGSAKKSLTEYNNLKAMVVSGSKGSNINISQVIACV

GQQNVEGKRIPFGFRKRTLPHFIKDDYGPESRGFVENSYLAGLTPS

EFFFHAMGGREGLIDTAVKTAETGYIQRRLIKAMESVMVHYDGTVR

NSVGQLIQLRYGEDGLCGEAVEFQKIQSVPLSNRKFESTFKFDPSN

ERYLRKIFAEDVLRELLGSGEVISALEQEWEQLNRDRDALRQIFPSG

ENKVVLPCNLKRMIWNAQKTFKINLRAPTDLSPLKVIQGVKELLEKC

VIVAGDDHLSKQANENATLLFQCLVRSTLCTKLVSEKFRLSSAAFEW

LIGEIETRFKQAQAAPGEMVGALAAQSLGEPATQMTLNTFHFAGVS

SKNVTLGVPRLKEIINISKKPKAPSLTVFLTGAAARDAEKAKNVLCRL

EHTTLRKVTANTAIYYDPDPQNTVIPEDQEFVNVYYEMPDFDPTRIS

PWLLRIELDRKRMTDKKLTMEQISEKINAGFGDDLNCIFNDDNAEK

LVLRIRIMNSDDGKSGEEEESVDKMEDDMFLRCIEANMLSDMTLQG

IEAISKVYMHLPQTDSKKRIIMTETGEFKAIADWLLETDGTSLMKVLSE

RDVDPVRTFSNDICEIFSVLGIEAVRKSVEKEMNNVLQFYGLYVNYRH

LALLCDVMTAKGHLMAITRHGINRQDTGALMRCSFEETVDVLMDAA

SHAEVDPMRGVSENIIMGQLPRMGTGCFDLLLDAEKCKEGIEISMTG

GADGAYFGGGSTPQTSPSRTPWSSGATPASASSWSPGGGSSAWS

HDQPMFSPSTGSEPSFSPSWSPAHSGSSPSSYMSSPAGGMSPIYS

PTPIFGPSSPSATPTSPVYGPASPPSYSPTTPQYLPTSPSYSPTSPS

YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTS

PSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPSSPSNAA

SPTYSPTSPSYSPTSPHYSPTSPSYSPTSPQYSPTSPSYSSSPHYHP

SSPHYTPTSPNYSPTSPSYSPSSPSYSPSSPKHYSPTSPTYSPTSPA

YSPQSATSPQYSPSSSRYSPSSPIYTPTQSHYSPASTNYSPGSGSN

YSPTSPTYSPTFGDTNDQQQQR

[0067] A SEQ ID NO:79 mostra um DNA de rpíl215 de BSB ilustrativo, referido neste documento, em alguns locais, como BSB rpíl215-2: G TG C CTTCTT C AGT C G C C AG CTT G CTTT C AT C AG TTT AA GCAAGCCAGTAAAATGGCGACTAACGATTCGAAGGCACCTATTCG T CAAGT GAAGAG AGTACAGTTTGG AAT CCTTT CTCCAGAT G AAATT C G AC G G AT GT C AG TT AC AG AAG G G G G AATT C GTTT C C CC G AG AC A ATGGAAGGAGGACGTCCAAAACTCGGGGGTCTCATGGATCCCCG ACAAGGCGT CATCG AT AG AAT GT CTCGCT GCCAAACTT GCGCAG G AAAT AT GT C AG AAT GT CCTG G G C ATTTT G G AC AC AT AG ATTT AG

CAAAACCAGT ATTT CAT ATT GGTTT CATT ACAAAGACT ATT AAAAT ACTCCGATGCGTGTGCTTTTATTGCTCAAAACTGTTGGTTAGCCC T AGT C ATCCT AAAATT AAG G AAAT C GTT CT G AAAT C AAAAG GTC A G C CTAG AAAAAG ACTTACTTTTGTCTATG ATTTATG CAAAG GTAAA AAT ATTT GT G AAG G C G GT G AC G AAAT G G AT AT AC AG AAAG AT AAT ATGGAT G AGAAT G CTT CAAATCGAAAACCT GGT CACGGT G GTT G TGGTCGTTACCAACCAAATCTACGTCGTGCAGGTTTGGACGTAA C AG CTG AATG G AAG C AC GTC AATG AAG ATG GTC AAG AAAAG AA AAT AG C CTT G ACT G CT G AAC G T GTTT G G G AAAT ATT AAAAC AC AT AACAGAT G AAG AGT GTTTTAT CTT GGGTATGGACCCAAAGTTCG CTCGACCCGATTGGAT GATT GT CACT GTACTT CCT GTTCCACCC CTTTGCGTAAGGCCTGCAGTCGTTATGTATGGCTCTGCAAGAA AT C AG G AC G ATTT G AC AC AT AAG CT AG CC G AT ATT AT AAAGT GTA AC AAT G AG CT C C AG CGT AAT G AAC AAT C AG G AG C G G CC AC AC A TGTT ATT G C AG AAAAT ATT AAAAT G CTT C AGTT C C AC GT C G CT AC CTTG GTT G AT AAT G AT AT G C C AG G C CTT CC AAG AG C AAT G C AAA AATCTG G AAAAC C ACTG AAAG CTATC AAAG CTAG ATTAAAAG G C AAGGAAGGTCGTATTAGAGGTAATCTTATGGGTAAGCGTGTTGA CTTCTCCGCTCGTACTGTTATTACGCCAGATCCTAATTTACGTA TT G AT C AG GTCGGTGT AC CT C G AT CT ATT G C ACTT AAC AT G ACT TTCCCCG AAATCGTCACT CCATT CAAT ATT G AC AAAAT GTT AG AG TT GGTAAGG AGAGGAAATGCT CAGTACCCTGGTGCT AAGT ACA TT GTC CGT G AC AAT GGT GAACGTATT G ACCTTAGATTT CAT CCC AAAC CAT C AG AT CTC C ATTT AC AGT G G G GTT AT AAAGTT G AACG ACACATTCGTGATGGAGATCTTGTTATTTTCAATCGACAGCCCA CT CT AC AC AAAAT G AGT AT G AT G G GTC AC AG G GTC AAAGTTCTT CCGT GGT CAACTTT CAGG AT GAAT CT C AGTT GTACGT CACCTT A CAAT GCT G ATTTT G AT GGCGAT GAAAT G AAT CTT CAT CTT CCGCA G AC AG AAG AGGCTAG GGCT GAAGCATT AATTTT G AT G G G C AAC AAAGCAAACTT AGT GACTCCT AGAAATGGAGAACT GTT GATT G C

TG C G ACT C AAG ACTT C AT C ACT G GTG C CT AC CTT CT C ACG C AA AG G AGTGTTTTCTTTACC AAG AG G G AG G CTTGTC AATTG GCTGC T ACT CTT CTGTGTG G AG AT G AT ATT AAT AT G ACC ATT AAT CT ACC AAAACCAGCCAT AAT GAAGCCAGCAAAGTT GT GGACCGGAAAA CAGATCTTCAGCTTGCTTATTAAACCAAACAAATGGTGTCCTATC AATG C CAATCTAAG G AC G AAAG G G AG AG CTTAC AC AAGTG GTG AAG AAAT GTG CATT AAT G ATT CTTT CAT CAAC ATT CGC AATTCG C AACTACTAGCTGGTGTGAT GGATAAAT CAACCCT CGGAT CT GGC GGTAAAG C G AAT AT ATTTT AT GTG CT C CTATG C G ACTG G G GTG A AGAGGCT GCCACAACT GCGAT GTGGAGGCT CAGCCGTAT GACT T CAGCTTACCTTAT GAATCGTGGTTTTT CTATTGGAATTGGAGAT GTTAC ACC AAGTC CTC G ACTTCTG C AC CTTAAAC AG GAATTGTTA AATG CTGG CT AT AC AAAAT GT AAT G AG TTTATAC AG AAG C AG G CC GACGGTAAACTTCAATGCCAGCCAGGTTGTTCTGCAGATGAAAC T CTT G AAGCT GT AATT CT C AAAG AACTTT CAGTT AT CCG AG ACAG GGCAGGGAAAGCCTGTCTCAACGAGTTGGGAAGCCAAAATAGTC C G CTT AT CAT GGCTCTCG C AG G GT C C AAAG G AT C ATTT ATT AAC AT AT C G C AG AT G ATT GCCTGTGT AG G C CAAC AAG C CAT AAGT G G AAAGCGT GTGCCT AATGGTTTT G AAGACAGAGCT CT CCCT CATT ACG AACGT C ACT C AAAAATT C C AG C AG CT AAAG G ATTT GT AG AAA AT AGTTT CTTTT CTG G C CT C ACC C CT AC AG AG TT CTTCTTC CACA CAATGGGTGGTAGAGAAGGTCTTGTAGATACCGCAGTTAAAACT G C AG AAAC G G GTT AT AT G C AG AG G C G ATT G GT G AAG T CATT AG AAG ACCT CT GCCT CCATTAT GATAT GACT GTTAGAAATTCT AC CG GAGATGTTATTCAGTTTGTGTATGGTGGTGATGGCCTGGACCCT ACCT AT AT G G AAG G AAAT G GTTGTC CT GTT G AACT G AAG AG G G TATGGGATGGTGTACGAGCTAACTACCCTTTCCAGCAGGAAAAG CCATT AAGTT AT G AT GAT GT CAT CGAAGGTT CAG AT GTTTT ATTAG ATT CAT CT G AGTTC AGTT GTT GCAGCC AT GAATT CAAAG AACAAT T GAGGT CATTT GT CAAAGAT CAGGCG AAGAAAT GTTT AGAAATT C

AG ACAG GATG G G AAAAG AAATCTCC ACTTATCAG CG AG CTGGA AAG G GT CACCTT GT CCCAG CT G AT ACACTT CTTCCAG ACTT GT C G G G AAAAAT AT CTT AAT G C G AAAATCG AAC C AG GTACTG CTGTT G G AG C CTT AG CTG C AC AAAGT ATTG GT G AG CC AG GTACTC AAAT G ACCCT CAAG ACTTTT CACTTTGCT GG AGTTGCTT CG AT G AATAT T ACT C AG G GTGT ACC AAG AAT AAAG G AAATT AT C AAC G CT AGTA AAAAC AT C AGTAC C CC AATT ATT ACT G CTT ATTT AG AG AAT G AT A C CG ACC CTG AATTTG CTCGG C AG GTAAAAG G G AG G ATAG AG AAA ACTACT CTT GGAGAAGTAACT G AATACATT GAAGAGGTTTAT GTT C CT ACT G ACT GTTT C CT AATT ATT AAGTT G G AT GTT G AAAG G ATT C G CCTTTT AAAGTT G G AAGT AAAT G C AG AC AGTATT AAGT ACAG T ATTT G T AC AT C AAAATT AAAAAT AAAG AAC CTG C AAGT AC TC GT CCAAACTTCATCCGTTCTAACCGTGAATACTCAAGCGGGAAAG G AT AC ATT AG AT G G AT CTCTT AG GT AC CT G AAAG AAAAT CTT CT C AAAGTT GTT ATT AAG GG AGT AC C AAAC GTT AAT AG AGC AGT CA TACACGAAGAAGAAGATGCTGGT GTTAAGAGGTATAAACT CCTT GTTGAAGGTGATAACTTGAGAGATGTGATGGCCACCAGAGGTAT AAAG G G TACT AAGT G C ACTT CA AAT AAT AC AT AT C AG G T CTTTT C T ACT CTTG G AATT G AAG CT G C AAG GTCTAC AAT AAT GT C AG AAA TAAAACTTGTTATGGAAAACCACGGTATGTCTATAG ACC ATAG G C AT C C AAT GTTG GT AG CT G AT CTT AT G AC AT G C AG AG G AG AG G TCCTCGGAATCACTAGGCAGGGTCTTGCGAAAATGAAGGAATC T GT C CTT AACTT AG CTT CGTTT G AAAAAACT G CT G AT C AT CT ATT T G ACG C AG C AT ATT AT G GT C AAACT G AT G CT ATT ACT G GTG T AT C G G AGTC AATAATAATG G G GAT AC C AAT GC AG ATT G G AAC AG G C C TTTTT AAACTT CTT C AC AG AT AT C CTTTTTTT AT ACT GTTTTT AATT TTT AG AT ATTTT AGT GTTGT AG G AG G GTT AAT AAT G AAG AG G C AAT GT GT AGT AGTTTCG AT GAAT ATT GCT ACT AT C AG AAG CT GTT ACT C T G AAGT AT CGT CC ACTT ACT AT ATCCTCCCT ATTTTTT AAAAACAA ATTT GT CTT G AC C ATTT AT ACT GTTTT C AT G G C AT AAATTT AAG G G

T AT G ΑΑΤΤΤΤΤ AAT CC AC GT GT GTTTTTT AAT AAG GTTCTT G AG G TACAAACGATAAATAAT GAT GATT GATAATCAT GCCCAAAAGT GA AAAAACAG GAT AC AAT AAAATT AT AG AAGTT AT AC AG GTT ATTT AA AAAC AT AAAGTT AG CT AC AAT ATT AAT AC AT AACT AC AT GTGTT AG AAT AATT AAAT AC GT AT AATT AC AAAAT AT G G AG G AGT AAAAT ACT ACTTAG AATGTTACTG GTG GATATG CTATTAG ATCTTCTG ATCTA CT C AAT AAC CT C AAG AACCTT ATT AAAG AT CT AAT AGT AAC AGT C T AG AAATT AT C C AT AT AT AT AT G T AAACTTTT AAT CTTCTT AG G CG AAAG G G CAAATG TG ATATC ATAAAACTTG AAATG GTCTG G G GTG ACCTT AACC AAG AT CTTGTGTGTGT C AT AT AT AT AT AT AT AT G AAC TGGTTCTGGT C AG TTT AAAATT C AT G CT AATT AT AAC AAAATTT AA T GAT ACTTT AAT AAG ATTTT AC AAT AAT AT CTT AAAAACC CT G GAT TTT C AAAACACCCTT ACT AC AG AAAAG G GTT ATT G CACAAC AC AT AAAAAAT ATTTTT AGT G CC AACT AG AAAG AG AT CT AAAAG AG G G A TT C ACT G GT AAAT GT AT C AT AAAT CCTTG C C AG AAAC ATTT C AC C AG GT G AC AT C AC AAAT AAATT G G ACG G C ATTT AG C AG AAG G G AA

[0068] A SEQ ID NO:80 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de RPII215 de BSB adicional, codificado por um DNA de rpll215 de BSB ilustrativo (isto é, BSB rpll215-2): MATNDSKAPIRQVKRVQFGILSPDEIRRMSVTEGGIRFPE

TMEGGRPKLGGLMDPRQGVIDRMSRCQTCAGNMSECPGHFGHIDL

AKPVFHIGFITKTIKILRCVCFYCSKLLVSPSHPKIKEIVLKSKGQPRKR

LTFVYDLCKGKNICEGGDEMDIQKDNMDENASNRKPGHGGCGRYQ

PNLRRAGLDVTAEWKHVNEDGQEKKIALTAERVWEILKHITDEECFIL

GMDPKFARPDWMIVTVLPVPPLCVRPAVVMYGSARNQDDLTHKLAD

IIKCNNELQRNEQSGAATHVIAENIKMLQFHVATLVDNDMPGLPRAM

QKSGKPLKAIKARLKGKEGRIRGNLMGKRVDFSARTVITPDPNLRIDQ

VGVPRSIALNMTFPEIVTPFNIDKMLELVRRGNAQYPGAKYIVRDNGE

RIDLRFHPKPSDLHLQWGYKVERHIRDGDLVIFNRQPTLHKMSMMG

HRVKVLPWSTFRMNLSCTSPYNADFDGDEMNLHLPQTEEARAEALIL

MGNKANLVTPRNGELLIAATQDFITGAYLLTQRSVFFTKREACQLAAT

LLCGDDINMTINLPKPAIMKPAKLWTGKQIFSLLIKPNKWCPINANLRT

KGRAYTSGEEMCINDSFINIRNSQLLAGVMDKSTLGSGGKANIFWLL

CDWGEEAATTAMWRLSRMTSAYLMNRGFSIGIGDVTPSPRLLHLKQ

ELLNAGYTKCNEFIQKQADGKLQCQPGCSADETLEAVILKELSVIRDR

AGKACLNELGSQNSPLIMALAGSKGSFINISQMIACVGQQAISGKRVP

NGFEDRALPHYERHSKIPAAKGFVENSFFSGLTPTEFFFHTMGGREG

LVDTAVKTAETGYMQRRLVKSLEDLCLHYDMTVRNSTGDVIQFVYG

GDGLDPTYMEGNGCPVELKRVWDGVRANYPFQQEKPLSYDDVIEG

SDVLLDSSEFSCCSHEFKEQLRSFVKDQAKKCLEIQTGWEKKSPLIS

ELERVTLSQLIHFFQTCREKYLNAKIEPGTAVGALAAQSIGEPGTQMT

LKTFHFAGVASMNITQGVPRIKEIINASKNISTPIITAYLENDTDPEFAR

QVKGRIEKTTLGEVTEYIEEVYVPTDCFLIIKLDVERIRLLKLEVNADSI

KYSICTSKLKIKNLQVLVQTSSVLTVNTQAGKDTLDGSLRYLKENLLK

VVIKGVPNVNRAVIHEEEDAGVKRYKLLVEGDNLRDVMATRGIKGT

KCTSNNTYQVFSTLGIEAARSTIMSEIKLVMENHGMSIDHRHPMLVA

DLMTCRGEVLGITRQGLAKMKESVLNLASFEKTADHLFDAAYYGQTD

AITGVSESIIMGIPMQIGTGLFKLLHRYPFFILFLIFRYFSVVGGLIMKR

QCV VVSMNIATIRSCYSEVSSTYYILPIF

[0069] A SEQ ID NO:81 mostra um DNA de rpíl215 de BSB ilustrativo, referido neste documento, em alguns locais, como BSB rpíl215-3: CGGACAT CAT CAAGT CCAACACTT ACCTT AAG AAGT AC GAGCT GGAAG G G G CACCAGGG C AC ATCATCCGTG ACTACG AACA ACTCCT CC AGTT CC ACATT GCG ACTTT AAT CG ACAAT G AC AT CAG TGG ACAGCCACAGGCCCTCCAAAAGAGTGGCAGGCCTTT GAAGT CGATCTCTGCCCGTCTCAAGGGGAAGGAAGGGCGAGTCAGGGG G AAT CT CAT G G G G AAG AG AG T AG ACTT CAG TG C CAG GGCGGTGA TAACAGCAG ACGCCAACAT CTCCCTT GAGGAAGT GGGAGT CCC AGT GGAAGTCGCCAAGATACACACCTT CCCCGAGAAGAT CACGC CTTTCAACGCCGAGAAATTAGAGAGGCTCGTGGCCAATGGCCCT

AAC G AAT ACC C AG G AG C AAATT ATGT G AT C AG AAC AG AT G G AC AG C G AATAG ATCTC AACTTC AAC AG G G G G G ATATC AAACTAG AAG A AG G GT ACGTCGTAG AG AG AC AC AT G C AG G AT G G AG AC ATT GT AC TGTTCAACAGACAGCCCTCTCTCCACAAAATGTCGATGATGGGA C AC AAAGT G C GTGT G AT GTC G G G G AAG AC CTTT AG ATT AAATTT G AGT GT GACCTCCCCGTACAAT G CGGATTTT GATGGAGACG AGAT GAATCTCCACATGCCCCAGAGTTACAACTCCATAGCCGAACTGG AGGAGATCTGCATGGTCCCTAAGCAAATCCTTGGACCCCAGAGC AACAAGCCCGT C AT GGGGATT GTCCAAGACACACT CACT G GCTT AAG ATT CTTCACAAT GAGAGACGCCTT CTTT GACAGGGGCGAGA TGATG CAG ATT CT GTACT C CATC GACTTG G AC AAGTAC AATG AC A TC G G ACTAG AC AC AGTC AC AAAAG AAG G AAAG AAGTTG GATGTT AAGTCCAAG G AGTACAG CCTT AT G CG ACT CCT AG AG ACAC CAG CCATAGAAAAGCCCAAACAGCT CT GGACAGGGAAACAGAT CTT AAG CTT C AT CTTC C C C AAT GTTTT CT AC CAG G C CTCTT C C AAC G AGAGT CTGGAAAAT G ACAGGG AG AAT CT GT CGG ACACTT GT GT TGT G ATTT GTGGGGGG G AG AT AAT GTCGG G AAT AAT CG ACAAG AGGG

[0070] A SEQ ID NO:82 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de RPII215 de BSB adicional, codificado por um DNA de rpll215 de BSB ilustrativo (isto é, BSB rpll215-3)\ DIIKSNTYLKKYELEGAPGHIIRDYEQLLQFHIATLIDNDISG

QPQALQKSGRPLKSISARLKGKEGRVRGNLMGKRVDFSARAVITADA

NISLEEVGVPVEVAKIHTFPEKITPFNAEKLERLVANGPNEYPGANYVI

RTDGQRIDLNFNRGDIKLEEGYVVERHMQDGDIVLFNRQPSLHKMS

MMGHKVRVMSGKTFRLNLSVTSPYNADFDGDEMNLHMPQSYNSIA

ELEEICMVPKQILGPQSNKPVMGIVQDTLTGLRFFTMRDAFFDRGEM

MQILYSIDLDKYNDIGLDTVTKEGKKLDVKSKEYSLMRLLETPAIEKPK

QLWTGKQILSFIFPNVFYQASSNESLENDRENLSDTCVVICGGEIMS

GIIDKR

[0071] A SEQ ID NO:83 mostra um DNA de rpll215 de BSB ilustrativo, referido neste documento, em alguns locais, como BSB_rpll215-1 regí (região 1), que é usado, em alguns exemplos, para a produção de um dsRNA: GCCCAGGCTGCTCCAGGTGAAATGGTTGGAGCTTTG G C AG C CC AG AGTTTG G G AG AAC CG G C C ACTC AG ATG AC ACTC A ACACTTT CCATTTTGCT GGT GT GT CAT CGAAAAACGTAACCCTT G GTGTGCCCAGGCTAAAGGAAATCATCAATATAAGTAAGAAACCA AAGGCTCCATCTCTTACCGTCTTCCTTACCGGAGCAGCTGCCAG AGATGCTGAAAAGGCTAAAAATGTTCTGTGCCGTCTTGAACACAC AACGCTAAG GAAG GTAACG G CTAATACTG CAATTTACTATG ATCC TGATCCACAAAACACGGTAATCCCAGAGGATCAAGAGTTTGTTAA T GTATACTAT GAAATGCCT GACTTT GAT CCTACCAGAATTT CACC CTGG CTGTTG AG AATTG AATTG G AC AG AAAAAG AATG AC AG ATAA GAAACT G AC GAT GG AAC AG AT AT CT G AAAAAAT CAAT GCT GGTTT CGGTGATG

[0072] A SEQ ID NO:84 mostra um DNA de rpíl215 de BSB ilustrativo adicional, referido neste documento, em alguns locais, como BSB_rpll215-2 regí (região 1), que é usado, em alguns exemplos, para a produção de um dsRNA: G TG C CTTCTT C AGT C G C C AG CTT G CTTT CAT C AG TTT A AG C AAG CC AGT AAAAT G G C G ACT AAC G ATT C GAAG G C AC CT ATT C GT C AAGT GAAG AG AGTACAGTTT G G AAT CCTTT CTCCAG AT G AAAT TCGACGGATGTCAGTTACAGAAGGGGGAATTCGTTTCCCCGAGAC AATGGAAGGAGGACGTCCAAAACTCGGGGGTCTCATGGATCCCC GACAAGGCGTCATCGATAGAATGTCTCGCTGCCAAACTTGCGCAG G AAAT AT GT C AG AAT GTCCTGGG C ATTTT G G AC AC AT AG ATTT AG C AAAACC AGT ATTT CAT ATT GGTTT C ATT AC AAAG ACT ATT AAAAT AC TCCGATGCGTGTG

[0073] A SEQ ID NO:85 mostra um DNA de rpíl215 de BSB ilustra- tivo adicional, referido neste documento, em alguns locais, como BSB_rpll215-3 regí (região 1), que é usado, em alguns exemplos, para a produção de um dsRNA: C C AG G AG CAAATT AT GT G AT CAG AACAG AT G G AC AG CG AATAGATCTCAACTTCAACAGGGGGGATATCAAACTAGAAGAAGG GTACGTCGTAGAGAGACACATGCAGGATGGAGACATTGTACTGTT CAACAGACAGCCCT CT CT CCAC AAAAT GT CGAT GAT GGG ACACAA AGT GCGT GT GAT GT CGGGGAAGACCTTTAGATTAAATTT GAGT GT G ACCT CCCCGTACAAT GCGG ATTTT GAT GGAGACGAG AT GAAT C T C C AC AT G C CC C AG AGTT AC AACT C C AT AG C C G AACT G G AG GAGA TCTG C ATG GTC CCTAAG CAAATCCTTG G ACC C CAG AG CAACAAG C CCGT CATGGGGATT GTCCAAG ACACACT CACT GGCTT AAG ATT CT T CACAAT GAG AG ACGCCTT CTTT G ACAGGGGCG AG AT GATGCAG A TT CT GTACTCCAT C G ACTT G G AC AAGT AC AAT G ACATCG G ACT AG ACAC

[0074] As SEQ ID NOs:86-91 mostram iniciadores usados para amplificar partes de sequências de rpll215 de BSB ilustrativas compreendendo rpll215-1, rpll215-2, e rpll215-3, usados, em alguns exemplos, para a produção de dsRNA.

[0075] A SEQ ID NO:92 mostra um DNA de YFP v2 ilustrativo, que é usado em alguns exemplos para a produção da fita com sentido de um dsRNA.

[0076] As SEQ ID NOs:93 e 94 mostram os iniciadores usados para a amplificação por PCR da sequência de YFP YFP v2, usada, em alguns exemplos, para a produção de dsRNA.

[0077] As SEQ ID NOs:95-106 mostram RNAs ilustrativos transcritos de ácidos nucleicos compreendendo polinucleotídeos de rpll215 ilustrativos e seus fragmentos.

[0078] A SEQ ID NO: 107 mostra uma sequência de contig de DNA de 4965 nucleotídeos de comprimento compreendendo RPII215 a par- tir de Meligethes aeneus.

[0079] A SEQ ID NO: 108 mostra uma primeira sequência de nu-cleotídeos parcial representativa a partir de um contig de RPII215 de M. aeneus: ATGGCCGCCAGTGACAGCAAAGCTCCGCTTAGAACCG TTAAAAGAGTGCAGTTTGGTATACTCAGTCCGGATGAAATCCGGC GTATGTC AGTC AC AG AG G G C G G CATCCGCTTTC C AG AG AC AATG GAGGCGGGCCGCCCCAAATTGGGGGGCCTCATGGACCCGAGAC AAG G G GT C AT C G AC AG AC ATT C C C GTT G CC AG ACGT GCGCGGGT AAC AT G AC AG AAT GTCCGGGT C ATTTT G G C C AC AT C G AGTT G G C C AAG C C C G T ATTTC AC GTTG GTTTT G TC AC G AAAAC G ATC AAAATTT TAAGATGCGTCTGCTTTTTCTGCAGTAAAATGTTAGTTAGTCCAAA TAATCCAAAAATAAAAGAGGTGGTCATGAAATCCAAAGGTCAGCC G AGG AAAAG GTT G G CTTTTGTTT ACG AT CT CT GC AAAG GT AAAAA T ATTT GCGAGGGTGGGGAT G AA AT G G ATG T AG G AAA

[0080] A SEQ ID NO: 109 mostra uma segunda sequência de nu-cleotídeos parcial representativa a partir de um contig de RPII215 de M. aeneus: TCGGCGAGAAATCAGGACGATTTGACTCACAAACTGGC CGACATCATCAAAGCGAACAACGAGTTGCAAAGGAACGAGGCGG CCGGTACGGCTGCGCACATCATCCTGGAAAACATAAAGATGCTG CAGTTTCACGTGGCAACCCTGGTCGACAACGACATGCCGGGCA T GCCAAGAGCCAT GCAGAAGT CGGGG AAGCCCCTAAAAGCGAT AAAGGCTCGGTTAAAAGGTAAGGAGGGCAGGATTCGTGGTAACC TTATGGGTAAGCGTGTGGATTTTTCCGCGCGTACCGTAATCACG CCCGATCCCAATCTGCGTATCGATCAGGTCGGGGTTCCGAGG TCCATCGCGCAGAACAT G ACGTT CCCT GA

[0081] A SEQ ID NO:110 mostra uma terceira sequência de nucle-otídeos parcial representativa a partir de um contig de RPII215 de M. aeneus: AATGGTGACAGAATAGATTTGAGGTTCCATCCCAAACC GT CAGATTTGCATTTACAGT GTGGATACAAAGTAGAAAG ACACATT CGTGATGGCGATTTGGTTATTTTCAATCGTCAACCGACCCTCCAC AAGATGAGTATGATGGGGCACAGGGTCAAAGTGCTGCCCTGGTC CACTTTCAGGATGAATTTGTCCTGTACTTCCCCCTACAACGCCGA TTTCGACGGCGACGAAATGAACTTGCACGTTCCGCAAAGTATGGA AAC AAG AG CC G AAGTG G AAAAC CTG C AC ATAACC C CG AG G C AAA TTATCACGCCGCAAGCCAATCAACCCGTCATGGGTATCGTGCAA GATACTCTTACCGCGGTGAGAAAGATGACGAAAAGGGACGTTTT CATCGAGAAGGAACAGAT GAT GAACATACT CAT GTTCTTGCCGA TTTGGGACGGTAAAATGCCCAGACCGGCCATCCTGAAACCCAA ACCCCTCTGGACGGGAAAGCAAATATTCTCGCTGATTATCCCGG GAAATGTAAATATGATCCGTACGCACTCGACGCATCCCGACGA CGAGGACGACGGTCCGTACCGGTGGATCTCCCCCGGCGACACC AAGGTCATGGTGGAGCACGGCGAGTTGATCATGGGGATCCTCTG CAAAAAATCCCTCGGTACTTCCCCCGGTT CT CTCCT CCACAT CT G CATGTTGGAGCTGGGGCACGAGGTGTGCGGCAGGTTCTACGGT AACATCCAGACCGT GAT CAAC AATTGG CTGCT CCTCGAAG GT CAC AG CAT CGGTAT CGGAGACACG ATCGCCGAT CCT CAG ACCTACTT G G AGAT CCAAAAG G CC ATC C AC AAAG C C AAAG AG GATG TC ATAG AG GT CAT CC AG AAG G CT CAC AAC AT G G AG CT G G AAC CCAC

[0082] A SEQ ID NO:111 mostra uma quarta sequência de nucleo-tídeos parcial representativa a partir de um contig de RPÍI215 de M. aeneus: GGGGTTAGAGACCTCCTTAAAAAGTGCATCATCGTGGC G G G G G AAG AC AG ACT CTC C AAAC AAG C CAAC G AAAAC G C CAC C C TACT CTTCCAAT GCTT GGT GAGATCCACCCT AT GCACAAAGT GCG TTTC G G AG G AGTTCAG G CTGAG CAC C GAAG C CTTCG AATG GTTG AT CGGAGAAATCG AG ACGAGATT CCAGCAGGCT CAGGCGAAT CC CGGCGAGATGGTGGGCGCGTTGGCCGCGCAGTCCCTTGGAGAA

CCCGCCACT CAGAT G ACACT CAACACTTT CCATTTTGCTGG AGT G

TCCTCCAAAAACGTAACCCTCGGTGTGCCGCGTCTAAAGGAAATC

ATCAACATCTCCAAGAAGCCTAAAGCGCCTTCCCTTACCGTCTTC

TTAACCGGGGCTGCAGCCAGGGATGCGGAAAAGGCCAAAAACGT

GCTCTGTCGCTTGGAACATACCACGTTGAGAAAAGTAACGGCAAA

C AC C G C C ATTT ACT AC G AT C C C G AC C C AC AG AAT AC C GTT ATT C C

G G AG G AT C AG G AATT CGTT AAT GTTT ACT AT G AAAT G CC C G ATTT C

GATCCGACCAGGATCTCGCCATGGCTACTTCGTATTGAATTGGAT

AG AAAAC G T ATG AC G G AC AAA AAATT G AC T ATG G AAC AG AT C G C G

G AAAAAAT CAAC G CC G G CTTCG GTG ACG ATTTG AATTGTATATTTA

AT GACGACAACGCCGAGAAACTGGTGCT GCGGATTCGTAT CATGG

ACAGCGACGACGGTAAATTCGGCGAAGGGGCCGACGAAGACGTG

GATAAAATGGACGACGACATGTTTTTACGGTGTATCGAGGCCAAC

ATGCT GAGCGACAT GACTTTACAGGGT ATCGAAGCCATTT CCAA

AGT GT AC AT G C ATTT GC C G C AG AC AG ACT C C AAG AAAAG G AT C G

TTATAACTGACGCGGGCGAGTTTAAAGCCATTGCGGAATGGCTA

CTGGAAACT GACGGTACCAGT AT GATG AAGGTT CTATCT GAAAGA

GACGTGGATCCCGTAAGAACGTTCTCCAACGATATCTGCGAGAT

TTTCTCCGTACTCGGCATCGAGGCCGTACGTAAATCGGTGGAGA

AAGAAATGAACGCCGTGTTGTCGTTCTACGGTCTCTACGTAAACT

ACCGTCACTTGGCTTTGCTTTGCGACGTGATGACGGCCAAAGGT

CATCTCATG G CC ATCACG CGTC ACG GTATC AAC AG AC AG G AC AC

CGGT GCT CT CAT G AGATGCTCGTT CGAAG AAACGGTGG ACGT G

CTGCTCGACGCCGCCTCGCACGCCGAAGTCGACCCCATGAGAG

GCGTGTCCGAGAACATCATCATGGGTCAGTTACCTCGTATGGGT

ACCGGGTGCTTCGACTTGCTCCTGGACGCAGAAAAGTGTAAGAT

G G GT AT AG C CAT C C C C C AAG CT CAT G G AG C C G AC AT AAT GT CAT C

GGGCATGTTCTTCGGCTCGGCGGCCACTCCGAGCAGCATGAGC

CCCGGAGGAGCCATGACTCCGTGGAACCAAGCCGCCACTCCGTA

CATGGGAAACGCCTGGTCTCCGCACAATCTCATGGGAAGCGGTAT

GACCCCCGGAGGACCCGCCTTTTCACCATCCGCAGCCTCCGATG

CTTCTGGAATGTCGCCTGGCTATGGAGCGTGGTCTCCTACGCCA

AACTCGCCCGCAATGTCTCCTTACATGAGTTCTCCTCGCGGGCAA

AGTCCATCATACAGTCCCTCGAGCCCCTCATTCCAACCAACCTCC

CCCTCTATCACTCCCACTTCCCCTGGATACTCGCCCAGCTCCCC

AGGTTACTCACCAACGAGCCCCAATTACAGCCCAACCTCACCAA

GCTATTCTCCAACAAGTCCGAGTTATTCGCCTACGTCGCCA

[0083] A SEQ ID NO:112 mostra uma sequência de 1643 aminoá-cidos de comprimento de uma proteína RPII215 de Meligethes aeneus.

[0084] A SEQ ID NO:113 mostra uma primeira sequência de ami-noácidos parcial representativa a partir de uma proteína RPII215 de M. aeneus: MAASDSKAPLRTVKRVQFGILSPDEIRRMSVTEGGIRFPE

TMEAGRPKLGGLMDPRQGVIDRHSRCQTCAGNMTECPGHFGHIELA

KPVFHVGFVTKTIKILRCVCFFCSKMLVSPNNPKIKEVVMKSKGQPR

KRLAFVYDLCKGKNICEGGDEMDVG

[0085] A SEQ ID NO:114 mostra uma segunda sequência de ami-noácidos parcial representativa a partir de uma proteína RPII215 de M. aeneus: SARNQDDLTHKLADIIKANNELQRNEAAGTAAHIILENIKM

LQFHVATLVDNDMPGMPRAMQKSGKPLKAIKARLKGKEGRIRGNLM

GKRVDFSARTVITPDPNLRIDQVGVPRSIAQNMTFP

[0086] A SEQ ID NO:115 mostra uma terceira sequência de ami-noácidos parcial representativa a partir de uma proteína RPII215 de M. aeneus: NGDRIDLRFHPKPSDLHLQCGYKVERHIRDGDLVIFNRQP

TLHKMSMMGHRVKVLPWSTFRMNLSCTSPYNADFDGDEMNLHVPQ

SMETRAEVENLHITPRQIITPQANQPVMGIVQDTLTAVRKMTKRDVFI

EKEQMMNILMFLPIWDGKMPRPAILKPKPLWTGKQIFSLIIPGNVNMI

RTHSTHPDDEDDGPYRWISPGDTKVMVEHGELIMGILCKKSLGTSP

GSLLHICMLELGHEVCGRFYGNIQTVINNWLLLEGHSIGIGDTIADPQ

TYLEIQKAIHKAKEDVIEVIQKAHNMELEP

[0087] A SEQ ID NO:116 mostra uma quarta sequência de amino-ácidos parcial representativa a partir de uma proteína RPII215 de M. aeneus: GVRDLLKKCIIVAGEDRLSKQANENATLLFQCLVRSTLCTK

CVSEEFRLSTEAFEWLIGEIETRFQQAQANPGEMVGALAAQSLGEPA

TQMTLNTFHFAGVSSKNVTLGVPRLKEIINISKKPKAPSLTVFLTGAAA

RDAEKAKNVLCRLEHTTLRKVTANTAIYYDPDPQNTVIPEDQEFVNVY

YEMPDFDPTRISPWLLRIELDRKRMTDKKLTMEQIAEKINAGFGDDL

NCIFNDDNAEKLVLRIRIMDSDDGKFGEGADEDVDKMDDDMFLRCI

EANMLSDMTLQGIEAISKVYMHLPQTDSKKRIVITDAGEFKAIAEWLL

ETDGTSMMKVLSERDVDPVRTFSNDICEIFSVLGIEAVRKSVEKEM

NAVLSFYGLYVNYRHLALLCDVMTAKGHLMAITRHGINRQDTGALM

RCSFEETVDVLLDAASHAEVDPMRGVSENIIMGQLPRMGTGCFDLL

LDAEKCKMGIAIPQAHGADIMSSGMFFGSAATPSSMSPGGAMTPWN

QAATPYMGNAWSPHNLMGSGMTPGGPAFSPSAASDASGMSPGYG

AWSPTPNSPAMSPYMSSPRGQSPSYSPSSPSFQPTSPSITPTSPGY

SPSSPGYSPTSPNYSPTSPSYSPTSPSYSPTSP

[0088] A SEQ ID NO:117 mostra M. aeneus RPII215 regí usado para a produção de dsRNA.

ATGACGACAACGCCGAGAAACTGGTGCTGCGGATTCG TATCATGGACAGCGACGACGGTAAATTCGGCGAAGGGGCCGACG AAGACGTGGATAAAATGGACGACGACATGTTTTTACGGTGTATCG AG G CC AAC AT G CT G AG CG AC AT G ACTTT AC AG G GT AT C G AAG CC ATTT CC AAAGT GT AC AT G C ATTT G C C G C AG AC AG ACT C C AAG AAA AGGATCGTTATAACTGACGCGGGCGAGTTTAAAGCCATTGCGGA AT GGCTACT GGAAACT GACGGT ACCAGTAT GAT GAAGGTT CTAT CT GAAAG AGACGT GGAT CCCGTAAGAACGTT CTCCAACGATAT C TG C G AG ATTTT CTC C G T ACT C G G C AT C G A

[0089] As SEQ ID NOs:118-123 mostram RNAs ilustrativos, transcritos de ácidos nucleicos compreendendo polinucleotídeos de rpll215 ilustrativos e seus fragmentos [0090] A SEQ ID NO: 124 mostra um DNA ilustrativo codificando um RNA de rpll215 v1 de Diabrotica; contendo um polinucleotídeo com sentido, um sequência de loop (itálico), e um polinucleotídeo sem sentido (fonte sublinhada): GACCCAATGAGAGGAGTATCTGAAAACATTATCCTCGG TC AACTACC AAG AATG G G C AC AG G CTG CTTC G ATCTTTTG CTG G A C G CC G AAAAATGTAAAATG G G AATTG C C ATACCTC GAA G C TA G TA CCAGTCATCACGCTGGAGCGCACATATAGGCCCTCCATCAGAAA GTCATTGTGTATATCTCTCATAGGGAACGAGCTGCTTGCGTATTT CCCTTCCGTAGTCAGAGTCATCAATCAGCTGCACCGTGTCGTAA AGCGGGACGTTCGCAAGCTCGTCCGCGGTAGAGGJAJGGCAAJ TC C C ATTTT AC ATTTTT C G G C GTC C AG C AAAAG AT C G AAG C AG C CTGTGCCCATTCTTGGTAGTTGACCGAGGATAATGTTTTCAGA TACTCCTCTCATTGGGTC

[0091] A SEQ ID NO: 125 mostra uma sonda usada para a análise da expressão de dsRNA.

[0092] A SEQ ID NO: 126 mostra uma sequência de nucleotídeos de DNA ilustrativa codificando um loop intermediário em um dsRNA.

[0093] A SEQ ID NO: 127 mostra um dsRNA ilustrativo transcrito de um ácido nucleico compreendendo fragmentos de polinucleotídeos de rpll215 v1 ilustrativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão geral das diversas modalidades [0094] Foi desenvolvido o RNA de interferência (RNAi) como uma ferramenta para o controle de pragas de insetos, usando uma das espécies de pragas-alvo mais prováveis para as plantas transgênicas que expressam o dsRNA; a lagarta da raiz do milho ocidental. Até ago- ra, a maioria dos genes propostos como alvos para o RNAi nas larvas da lagarta da raiz de fato não atinge este propósito. Neste documento, nós descrevemos o nocaute mediado pelo RNAi da subunidade de RNA polimerase II de 215 kD (rpll215) nas pragas de insetos ilustrativas, lagarta da raiz do milho ocidental, besouro do pólen, e Pentatomí-deo Marrom Neotropical, que se sabe tem um fenótipo letal quando, por exemplo, as moléculas de iRNA forem liberadas por meio de dsR-NA de rpll215 ingerido ou injetado. Nas modalidades aqui contidas, a capacidade de liberar o dsRNA de rpll215 por alimentação aos insetos confere um efeito do RNAi que é muito útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e hemípteras). Por combinação do RNAI mediado pela rpll215 com outros alvos de RNAi úteis (por exemplo, alvos de RNAi de RNA polimerase 11, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/133214; alvos de RNAi de RNA polimerase 1133, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/133210; alvos de RNAi de nem, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/095487; alvos de RNAi de ROP, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 14/577.811; alvos de RNAi de RNAPII140, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 14/577.854; alvos de RNAi de Dre4, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807; alvos de RNAi de COPI alpha, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199; alvos de RNAi de COPI beta, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203; alvos de RNAi de COPI gamma, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192; e alvos de RNAi de COPI delta, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216), o potencial para afetar as múltiplas sequências de alvos, por exemplo, em lagartas das raízes larvais, pode aumentar as oportunidades de desenvolver abordagens sustentáveis para o controle de pragas de insetos envolvendo tecnologias de RNAi.

[0095] São descritos neste documento métodos e composições para o controle genético de infestações de pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). São também proporcionados métodos para identificar um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga de inseto, para uso como um gene-alvo para o controle mediado pelo RNAi de uma população de pragas de insetos. Os vetores de plasmídios de DNA codificando uma molécula de RNA podem ser projetados para suprimir um ou mais genes-alvo essenciais para o crescimento, a sobrevivência e/ou o desenvolvimento. Em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser capaz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para a repressão pós-transcricional da expressão ou inibição de um gene-alvo, por meio de moléculas de ácidos nucleicos que são complementares a uma sequência de codificação ou de não codificação do gene-alvo, em uma praga de inseto. Nestas e nas modalidades adicionais, uma praga pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e/ou hpRNA, transcritas a partir de toda ou uma parte de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de codificação ou de não codificação de um gene-alvo, com isso proporcionando um efeito protetor na planta.

[0096] Desse modo, algumas modalidades envolvem a inibição específica para a sequência da expressão de produtos de genes-alvo, usando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar às sequências de codificação e/ou de não codificação do(s) gene(s)-alvo, para obter o controle pelo menos parcial de um praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). É descrito um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos isoladas e purificadas compreendendo um polinucleotídeo, por exemplo, conforme apresentado em uma das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e 107, e seus fragmentos. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir destes polinucleotídeos, de seus fragmentos, ou de um gene compreendendo um destes polinucleotídeos (por exemplo, SEQ ID NO: 124), para o silenciamento ou a inibição pós-transcricional de um gene-alvo. Em certas modalidades, as moléculas de ácidos nu-cleicos isoladas e purificadas compreendem toda ou parte de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 107-111, e 117.

[0097] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira re-combinante (por exemplo, uma célula de planta) tendo em seu geno-ma pelo menos um DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Nas modalidades particulares, uma/as molécula(s) de dsRNA codificada(s) pode(m) ser proporci-onada(s) quando ingerida(s) por uma praga de inseto (por exemplo, coieóptera e/ou hemíptera), para silenciar ou inibir pós-transcricio-nalmente a expressão de um gene-alvo na praga. O DNA recombinante pode compreender, por exemplo, quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 107-111, e 117; os fragmentos de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 107-111, e 117; e um polinucleotídeo consistindo em uma sequência parcial de um gene compreendendo uma de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81,83-85, 107-111, e 117; e/ou seus complementos.

[0098] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante tendo em seu genoma um DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo toda ou parte de qualquer de SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, e SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123 (por exemplo, pelo menos um polinucleotídeo selecionado a partir de um grupo compreendendo as SEQ ID N0s:98-100, 104-106, e 119-123), ou o seu complemento. Quando ingerida por uma praga de inseto (por exemplo, coieóptera e/ou he- míptera), a(s) moléculas de iRNA pode(m) silenciar ou inibir a expressão de um DNA-alvo de rpll215 (por exemplo, um DNA compreendendo todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 107-111, e 117) na praga ou na progênie da praga e, com isso, resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, viabilidade e/ou alimentação na praga.

[0099] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombi-nante, tendo em seu genoma pelo menos um DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA, pode ser uma célula de planta transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas compreendendo tal célula de planta transgênica. Além de tais plantas transgênica, as plantas de progênie de qualquer geração da planta transgênica, as sementes das plantas, e os produtos de plantas transgênicas são todos proporcionados, cada um dos quais compreende DNA(s) recombinante(s). Nas modalidades particulares, uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser expressa em uma célula de planta transgênica. Portanto, nestas e em outras modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser isolada de uma célula de planta transgênica. Nas modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada a partir do grupo compreendendo o milho (Zea mays), a soja (Glycine max), o algodão (Gossypium sp.), a (Brassica sp.) e as plantas da família Poaceae.

[00100] Algumas modalidades envolvem um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Nestas e em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser proporcionada, onde a molécula de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA.

Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser operativamente ligado a um promotor, e pode também ser operativamente ligado a uma sequência de terminação da transcrição. Nas modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto pode compreender: (a) transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA; (b) cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células de plantas compreendendo uma pluralidade de células de plantas transformadas; (c) selecionar uma célula de planta transformada que tenha integrado o vetor em seu genoma; e (d) determinar que a célula de planta transformada selecionada compreende a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada de uma célula de planta que tenha o vetor integrado em seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor.

[00101] Desse modo, também é descrita uma planta transgênica compreendendo um vetor tendo um polinucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, onde a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Nas modalidades particulares, a expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera) que contata a planta transformada ou a célula de planta (por exemplo, por alimentação da planta transformada, de uma parte da planta (por exemplo, a raiz) ou da célula da planta), de modo tal que o crescimento e/ou a sobrevivência da praga sejam inibi- dos. As plantas transgênicas descritas neste documento podem mostrar proteção e/ou proteção aumentada em infestações de pragas de insetos. As plantas transgênicas particulares podem mostrar proteção e/ou proteção aumentada em uma ou mais pragas coleópteras e/ou hemípteras selecionadas a partir do grupo que consiste em: WCR; BSB; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. unde-cimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; Meligethes aeneus Fabricius; Euschistus heros (Fabr.); E. servus (Say); Nezara viridula (L.); Piezodorus guildinii (Westwood); Halyomorpha halys (Stâl); Chi-navia hilare (Say); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Dichelops me-lacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.); Horcias nobilellus (Berg); Taedia stigmosa (Berg); Dys-dercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois).

[00102] São também descritos neste documento métodos para a liberação de agentes de controle, tais como uma molécula de iRNA, em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Tais agentes de controle podem causar, direta ou indiretamente, um dano na capacidade de uma população de pragas de insetos de se alimentar, crescer, ou de outro modo causar dano em um hospedeiro. Em algumas modalidades, proporciona-se um método compreendendo a liberação de uma molécula de dsRNA estabilizada em uma praga de inseto, para suprimir pelo menos um gene-alvo na praga, com isso causado RNAi e reduzindo ou eliminando o dano à planta em um hospedeiro de praga. Em algumas modalidades, um método de inibir a expressão de um gene-alvo na praga de inseto pode resultar na cessação do crescimento, da sobrevivência, e/ou do desenvolvimento na praga.

[00103] Em algumas modalidades, são proporcionadas composi- ções (por exemplo, uma composição tópica) que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) para uso em plantas, animais, e/ou no ambiente de uma planta ou animal, para obter a eliminação ou a redução de uma infestação por pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Nas modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser alimentada à praga de inseto, ou uma isca de RNAi. Algumas modalidades compreendem tornar a composição nutricional ou a fonte de alimento disponível para a praga. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da praga, o que pode, por sua vez, resultar na inibição da expressão de pelo menos um gene-alvo na(s) céiula(s) da praga. A ingestão de, ou o dano a, uma planta ou célula de planta por uma infestação de pragas de insetos pode ser limitado ou eliminado em ou sobre qualquer tecido hospedeiro ou ambiente no qual a praga esteja presente, proporcionando-se uma ou mais composições que compreendam uma molécula de iRNA no hospedeiro da praga.

[00104] As composições e os métodos descritos neste documento podem ser usados juntos, em combinação com outros métodos e composições, para controlar o dano pelas pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Por exemplo, uma molécula de iRNA como descrita neste documento, para a proteção das plantas das pragas de insetos, pode ser usada em um método que compreende o uso adicional de um ou mais agentes químicos efetivos contra uma praga de inseto, biopesticidas efetivos contra tal praga, rotação de colheita, técnicas genéticas recombinantes que exibam características diferentes das características dos métodos mediados por RNAi e composições de RNAi (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que sejam nocivas para uma praga de inseto (por exemplo, toxinas de Bt e polipeptídeos de PIP-1 (Ver a Publicação de Patente U.S. No. US 2014/0007292 A1)), e/ou expressão recombinan-te de outras moléculas de iRNA. II. Abreviações BSB Pentatomídeo marrom neotropical (Euschistus heros) dsRNA ácido ribonucleico de fita dupla Gl inibição do crescimento NCBI National Centerfor Biotechnology Information gDNA ácido desoxirribonucleico genômico iRNA ácido ribonucleico inibitório ORF quadro de leitura aberto RNAi ácido ribonucleico de interferência miRNA micro ácido ribonucleico shRNA ácido ribonucleico pequeno hairpin siRNA ácido ribonucleico pequeno inibitório hpRNA ácido ribonucleico hairpin UTR região não traduzida WCR Lagarta da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgi-fera LeConte) NCR Lagarta da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi Smith e Lawrence) MCR Lagarta da raiz do milho mexicana (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith) PB Besouro do pólen (Meligethes aeneus Fabricius) PCR Reação em cadeia por polimerase qPCR reação em cadeia por polimerase quantitativa RISC Complexo Silenciador Induzido por RNA SCR Lagarta da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber) SEM erro padrão da média III. Termos [00105] Na descrição e nas tabelas que se seguem, são usados diversos termos. Para proporcionar um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as definições a seguir são proporcionadas: [00106] Praga coleóptera: Conforme usado neste documento, o termo "praga coleóptera" refere-se aos insetos pragas da ordem Coleóptera, incluindo os insetos pragas do gênero Diabrotica, que se alimentam de culturas agrícolas e produtos da cultura, incluindo o milho e outros capins verdadeiros. Nos exemplos particulares, uma praga coleóptera é selecionada a partir de uma lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; e Meligethes aeneus Fabricius.

[00107] Contato (com um organismo): Conforme usado neste documento, o termo "contato com" ou "absorção por" um organismo (por exemplo, uma praga coleóptera ou hemíptera), com relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo, e sem limitação: a ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, por alimentação); o contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e o embebimento dos organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.

[00108] Contig: Conforme usado neste documento, o termo "contig" refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de segmentos de DNA que se sobrepõem, derivados de uma única fonte genética.

[00109] Planta de milho: Conforme usado neste documento, o termo "planta de milho" refere-se a uma planta da espécie Zea mays (mi- Iho).

[00110] Expressão: Conforme usada neste documento, a "expressão" de um polinucleotídeo de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, o gDNA ou o cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional, ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão do gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, a exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão do gene. A expressão de um gene pode também ser regulada alhures no caminho de DNA até RNA até proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam sobre a transcrição, a tradução, o transporte e o processamento do RNA, a degradação das moléculas intermediárias, tais como o mRNA, ou através da ativação, inativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteínas específicas, após elas terem sido preparadas, ou por suas combinações. A expressão do gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, northern blot, RT-PCR, western blot, ou ensaio(s) da atividade da proteína in vitro, in situ, ou in vivo.

[00111] Material genético: Conforme usado neste documento, o termo "material genético" inclui todos os genes, e moléculas de ácidos nucleicos, tais como o DNA e o RNA.

[00112] Praga hemíptera: Conforme usado neste documento, o termo "praga hemíptera" refere-se aos insetos pragas da ordem Hemíptera, incluindo, por exemplo, e sem limitação, os insetos nas famílias Pentatomidae, Miridae, Pyrrhocoridae, Coreidae, Alydidae, e Rho-palidae, que se alimentam de uma ampla variedade de plantas hospedeiras e têm partes na boca cortantes e que chupam. Nos exemplos particulares, uma praga hemíptera é selecionada a partir da lista que compreende Euschistus heros (Fabr.) (Pentatomídeo Marrom Neotro-pical), Nezara viridula (L.) (Pentatomídeo Verde do Sul), Piezodorus guildinii (Westwood) (Pentatomídeo de Listras Vermelhas), Haiyomor-pha halys (Stâl) (Pentatomídeo Marmorizado Marrom), Chinavia hilare (Say) (Pentatomídeo Verde), Euschistus servus (Say) (Pentatomídeo Marrom), Dichelops melacanthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Pentatomídeo das Costas Vermelhas Neotropical), Chinavia marginatum (Palisot de Be-auvois), Horcias nobilellus (Berg) (Besouro do Algodão), Taedia stig-mosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Ménevilie), Neomegaio-tomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Besouro da Planta Manchado Ocidental), e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).

[00113] Inibição: Conforme usado neste documento, o termo "inibição", quando usado para descrever um efeito sobre um polinucleotí-deo de codificação (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito do polinucleotídeo de codificação e/ou do peptídeo, polipeptídeo, ou produto de proteína do polinucleotídeo de codificação. Em alguns exemplos, a expressão de um polinucleotídeo de codificação pode ser inibida de modo tal que a expressão seja aproximadamente eliminada. A "inibição específica" refere-se à inibição de um polinucleotídeo de codificação alvo, sem consequentemente afetar a expressão dos outros polinucleotídeos de codificação (por exemplo, genes) na célula onde a inibição específica estiver sendo efetuada.

[00114] Inseto: Conforme usado neste documento com relação às pragas, o termo "praga de inseto" especificamente inclui as pragas de insetos coleópteras. Em alguns exemplos, o termo "praga de inseto" especificamente refere-se a uma praga coleóptera no gênero Diabroti- ca selecionada a partir de uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. un-decimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar. Em algumas modalidades, o termo também inclui algumas outras pragas de insetos; por exemplo, as pragas de insetos hemípteras.

[00115] Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou uma proteína) tenha sido substancialmente separado, produzido separado de, ou purificado, de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente (isto é, outros DNA e RNA cromossômicos e extracromossômi-cos, e proteínas), ao mesmo tempo efetuando uma modificação química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo por ruptura das ligações químicas que unem o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). As moléculas de ácidos nucleicos e as proteínas que tenham sido "isoladas" incluem as moléculas de ácidos nucleicos e as proteínas purificadas por métodos padrões de purificação. O termo também inclui os ácidos nucleicos e as proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como as moléculas de ácidos nucleicos, as proteínas e os peptídeos quimicamente sintetizados.

[00116] Molécula de ácido nucleico: Conforme usado neste documento, o termo "molécula de ácido nucleico" pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, que podem incluir ambas as fitas com sentido e sem sentido de RNA, cDNA, gDNA, e as formas sintéticas e os polímeros mistos das acima mencionadas. Um nucleotídeo ou nucleobase pode referir-se a um ribonucleotídeo, um desoxirribonucle-otídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico", como usada neste documento, é sinônimo com "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico é normalmente pelo menos 10 bases de comprimento, salvo especificação em contrário. Por convenção, a sequência de nucleotí-deos de uma molécula de ácido nucleico é lida a partir da extremidade de 5' até a de 3' da molécula. O "complemento" de uma molécula de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases que podem formar pares de bases com as nucleobases da molécula de ácido nucleico (isto é, A-T/U, e G-C).

[00117] Algumas modalidades incluem os ácidos nucleicos compreendendo um DNA de molde, que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nestas modalidades, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação 5' para 3', de modo tal que a RNA polimerase (que transcreve o DNA na direção 5' para 3') transcreverá um ácido nucleico a partir do complemento que pode hibridizar com a molécula de mRNA. A não ser que explicitamente estabelecido de outro modo, ou esteja claro ser de outro modo a partir do contexto, o termo "complemento", portanto, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases, de 5’ até 3’, que podem formar pares de bases com as nucleobases de um ácido nucleico de referência. Similarmente, a não ser que explicitamente estabelecido ser de outro modo (ou esteja claro ser de outro modo a partir do contexto), o "complemento invertido" de um ácido nucleico refere-se ao complemento na orientação invertida. O precedente é demonstrado na ilustração a seguir: ATGATGATG polinucleotídeo TACTACTAC "complemento" do polinucleotídeo CATCATCAT "complemento invertido" do polinucleotídeo [00118] Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas de RNAi formadoras de RNA. Nestas moléculas de RNAi, tanto o complemento de um ácido nucleico a ser alvejado pelo RNA de interferência, quanto o complemento invertido podem ser encontrados na mesma molécula, de modo tal que a molécula de RNA de fita simples possa "duplicar-se sobre" e hibridizar com ela própria sobre a região compreendendo os polinucleotídeos complementares e complementares invertidos.

[00119] As "moléculas de ácidos nucleicos" incluem todos os polinucleotídeos, por exemplo: as formas de DNA de fitas simples e duplas; as formas de RNA de fita simples; e as formas de RNA de fita dupla (dsRNA). O termo "sequência de nucleotídeos" ou "sequência de ácidos nucleicos" refere-se a ambas as fitas com sentido e sem sentido de um ácido nucleico como quaisquer fitas simples individuais ou no dúplex. O termo "ácido ribonucleico" (RNA) é inclusivo de iRNA (RNA inibitório), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (RNA pequeno in-terferente), shRNA (RNA pequeno hairpin), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA hairpin), tRNA (RNAs de transferência, quer sejam carregados, quer sejam descarregados com um aminoácido acilado correspondente), e cRNA (RNA complementar). O termo "ácido desoxirribonucleico" (DNA) é inclusivo de cDNA, gDNA, e híbridos de DNA-RNA. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" e seus "fragmentos" serão entendidos por aqueles na técnica como um termo que inclui ambos os gDNAs, os RNAs ribossômicos, os RNAs de transferência, os RNAs mensageiros, os operons e os polinucleotídeos menores criados por engenharia que codificam, ou podem ser adaptados para codificar, peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas.

[00120] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados por divagem de segmentos de ácidos nucleicos mais longos, ou por poli-merização de precursores de nucleotídeos individuais. Os sintetizado-res automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até diversas centenas de bases de comprimento. Porque os oligonucleotídeos podem se ligar a um ácido nucleico complementar, eles podem ser usados como sondas para detectar o DNA ou o RNA. Os oligonucleo-tídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados na PCR, uma técnica para a amplificação de DNAs. Na PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador", que permite uma DNA polimerase ampliar o oligonucleotídeo e replicar a fita complementar.

[00121] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um ou ambos de nucleotídeos que ocorrem naturalmente e os modificados, ligados conjuntamente por ligações de nucleotídeos que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente. As moléculas de ácidos nucleicos podem ser modificadas de modo químico ou bioquímico, ou podem conter bases de nucleotídeos não naturais ou derivadas, conforme será prontamente apreciado por aqueles de habilidade na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, as marcas, a me-tilação, a substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, as modificações entre os nucleotídeos (por exemplo, a ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; as ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; as porções pendentes: por exemplo, peptídeos; os intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; os quelantes; os alquilantes; e a ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo as conformações de fita simples, de fita dupla, parcialmente dúplexadas, triplexadas, em hairpin, circulares, e em cadeado.

[00122] Conforme usado neste documento em relação ao DNA, o termo "polinucleotídeo de codificação", "polinucleotídeo estrutural" ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refere-se a um polinucleotídeo que é, no final, traduzido em um polipeptídeo, por meio de transcrição e mRNA, quando colocado sob o controle de elementos reguladores apropriados. Com relação ao RNA, o termo "polinucleotídeo de codificação" refere-se a um polinucleotídeo que é traduzido em um peptí-deo, polipeptídeo, ou proteína. Os limites de um polinucleotídeo de codificação são determinados por um códon de iniciação da tradução na extremidade de 5' e um códon de interrupção da tradução na extremidade de 3'. Os polinucleotídeos de codificação incluem, porém não estão limitados ao: gDNA; cDNA; EST; e polinucleotídeos recombinan-tes.

[00123] Conforme usado neste documento, o "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se aos segmentos de moléculas de mRNA, tais como 5'UTR, 3'UTR, e aos segmentos de introns que não são traduzidos em um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína. Ademais, o "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que atua na célula, por exemplo, os RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA), conforme exemplificado por 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, e 28S rRNA, e similares); o RNA de transferência (tRNA); e os snRNAs, tais como U4, U5, U6, e similares. Os polinucleotídeos de não codificação transcritos também incluem, por exemplo, e sem limitação, os RNAs pequenos (sRNA), cujo termo é frequentemente usado para descrever os RNAs de não codificação bacterianos pequenos; os RNAs pequenos nucleolares (snoRNA); os micro RNAs (miRNA); os RNAs interferentes pequenos (siRNA); os RNAs que interagem com Piwi (piRNA); e os RNAs de não codificação longos. Ainda adicionalmente, o "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se a um polinucleotídeo que pode nativamente existir como um "espaçador" intragênico em um ácido nucleico e que é transcrito em uma molécula de RNA.

[00124] RNA de interferência letal: Conforme usado neste documento, o termo "RNA de interferência letal" refere-se a um RNA de interferência que resulta na morte ou em uma redução na viabilidade do indivíduo exposto para o qual, por exemplo, um dsRNA, miRNA, siR-NA, shRNA, e/ou hpRNA é liberado.

[00125] Genoma: Conforme usado neste documento, o termo "ge-noma" refere-se ao DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula, e também se refere ao DNA da organela encontrado dentro dos componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula de planta, de modo tal que a molécula de DNA seja integrada no genoma da célula da planta. Nestas e nas modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser integrada no DNA nuclear da célula da planta, ou integrada no DNA do cloroplasto ou da mitocôndria da célula da planta. O termo "genoma", conforme é aplicado a bactérias, refere-se tanto ao cromossomo quanto aos plasmídios dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria, de modo tal que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nestas e nas modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser integrada de modo cromossômico ou estar localizada como, ou em, um plasmídio estável.

[00126] Identidade da sequência: O termo "identidade da sequência" ou "identidade", conforme usado neste documento no contexto de dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, refere-se aos resíduos nas sequências das duas moléculas que são iguais quando alinhados para a correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[00127] Conforme usado neste documento, o termo "porcentagem de identidade da sequência" pode referir-se ao valor determinado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos ou as sequências de polipeptídeos) de uma molécula, sobre uma janela de comparação, onde a parte da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou remoções (isto é, espaços) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou remoções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais ocorre o resíduo idêntico de nucleotídeo ou de aminoácido em ambas as sequências, para produzir o número de posições correlacionadas, dividindo-se o número de posições crrelacionadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando-se o resultado por 100, para produzir a porcentagem de identidade da sequência. A sequência que é idêntica em cada posição na comparação com uma sequência de referência é dita ser 100% idêntica à sequência de referência, e vice-versa.

[00128] Os métodos para o alinhamento das sequências para comparação são bastante conhecidos na técnica. Diversos programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo, em: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet e col. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang e col. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson e col. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana e col. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento das sequências e dos cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul e col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[00129] O Basic Local Alignment Search Tool (BLAST®; Altschul e col. (1990)) do National Center for Biotechnology Information (NCBI) está disponível a partir de diversas fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com diversos programas de análise das sequências. Uma descrição de como determinar a identidade da sequência usando este programa está disponível na internet sob a seção "help" para o BLAST®. Para as comparações das sequências de ácidos nucleicos, a função "Blast 2 sequences" do programa BLAST® (Blastn) pode ser empregada usando o conjunto de matriz BLOSUM62 predeterminado para os parâmetros predeterminados. Os ácidos nucleicos com similaridade de sequência ainda maior com as sequências dos polinucleotí-deos de referência mostrarão porcentagem de identidade crescente quando avaliados por este método.

[00130] Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Conforme usados neste documento, os termos "Especificamente hibridizável" e "Especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade, de modo tal que ocorra uma ligação estável e específica entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula-alvo de ácido nucleico. A hibridização entre duas moléculas de ácidos nucleicos envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as nucleobases das duas moléculas de ácidos nucleicos. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondentes sobre a fita oposta, para formar uma molécula dúplex que, se for suficientemente estável, é detec-tável usando métodos bastante conhecidos na técnica. Um polinucleo-tídeo não necessita ser 100% complementar ao seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Entretanto, a quantidade de complementaridade que deve existir para a hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.

[00131] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de severidade variarão dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e da duração da hibridização dos ácidos nucieicos. Em geral, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização determinarão a severidade da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem a severidade. Os cálculos com relação às condições de hibridização requeridas para obter graus particulares de severidade são conhecidos para aqueles de habilidade comum na técnica, e são discutidos, por exemplo, em Sambrook e col. (ed.) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hvbridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução e orientação detalhadas com relação à hibridização de ácidos nucieicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," em Laboratorv Techniques in Biochemistry and Molecular Bioloqy- Hvbridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel e col., Eds., Current Proto-cols in Molecular Bioloqy, Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.

[00132] Conforme usadas neste documento, as "condições severas" incluem as condições sob as quais a hibridização somente ocorrerá se houver menos do que 20% de mau emparelhamento entre a sequência da molécula de hibridização e um polinucleotídeo homólogo dentro da molécula-alvo de ácido nucleico. As "condições severas" incluem níveis particulares adicionais de severidade. Desse modo, conforme usadas neste documento, as condições de "severidade moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 20% de mau emparelhamento da sequência não hibridizarão; as condições de "severidade alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 10% de mau emparelhamento não hibridizarão; e as condições de "severidade muito alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 5% de mau emparelhamento não hibridizarão.

[00133] Condição de Severidade Alta (detecta polinucleotídeos que compartilham pelo menos 90% de identidade da sequência): Hibridiza-ção em 5x tampão de SSC a 65 Ό por 16 horas; lavag em duas vezes em 2x tampão de SSC na temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavagem duas vezes em 0,5x tampão de SSC a 65 O por 20 minutos cada.

[00134] Condição de Severidade Moderada (detecta polinucleotídeos que compartilham pelo menos 80% de identidade da sequência): Hibridização em 5x-6x tampão de SSC a 65-70 °C por 16-20 horas; lavagem duas vezes em 2x tampão de SSC na temperatura ambiente por 5-20 minutos cada; e lavagem duas vezes em 1x tampão de SSC a 55-70Ό por 30 minutos cada.

[00135] Condição de controle não severa (os polinucleotídeos que compartilham pelo menos 50% de identidade da sequência hibridizarão): Hibridização em 6x tampão de SSC na temperatura ambiente até 55Ό por 16-20 horas; lavagem pelo menos duas vezes em 2x-3x tampão de SSC na temperatura ambiente até 55Ό por 20- 30 minutos cada.

[00136] Conforme usado neste documento, o termo "substancialmente homólogos" ou "homologia substancial", com relação a um ácido nucleico, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases contíguas, que hibridizam sob condições severas com o ácido nucleico de referência. Por exemplo, os ácidos nucleicos que são substancialmente homólogos com um ácido nucleico de referência de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 107-111, e 117 são os ácidos nucleicos que hibridizam sob condições severas (por exemplo, as Condições de Severidade Moderada apresentadas supra) com o ácido nucleico de referência. Os polinucleotídeos substancialmente homólo- gos podem ter pelo menos 80% de identidade da sequência. Por exemplo, os polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter de cerca de 80% a 100% de identidade da sequência, tal como 79%; 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com a hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando houver um grau suficiente de complementaridade, para evitar a ligação não específica do ácido nucleico aos polinucleotídeos que não forem alvos, sob condições onde a ligação específica for desejada, por exemplo, sob condições de hibridização severas.

[00137] Conforme usado neste documento, o termo "ortólogo" refe-re-se a um gene em duas ou mais espécies que tenha se desenvolvido a partir de um ácido nucleico ancestral comum, e pode conservar a mesma função nas duas ou mais espécies.

[00138] Conforme usado neste documento, duas moléculas de ácidos nucleicos são ditas exibirem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de um polinucleotídeo lido na direção 5' para 3' for complementar a cada nucleotídeo do outro polinucleotídeo quando lido na direção 3' para 5'. Um polinucleotídeo que é complementar a um polinucleotídeo de referência exibirá uma sequência idêntica ao complemento invertido do polinucleotídeo de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente entendidos por aqueles de habilidade comum na técnica.

[00139] Operavelmente ligado: Um primeiro polinucleotídeo está operavelmente ligado com um segundo polinucleotídeo quando o pri- meiro polinucleotídeo estiver em uma relação funcional com o segundo polinucleotídeo. Quando produzidos de modo recombinante, os polinu-cleotídeos operavelmente ligados são, em geral, contíguos, e, onde necessários para unir duas regiões de codificação da proteína, no mesmo quadro de leitura (por exemplo, em um ORF traducionalmente fundido). Entretanto, os ácidos nucleicos não necessitam ser contíguos para serem operavelmente ligados.

[00140] O termo "operavelmente ligado", quando usado em referência a um elemento genético regulador e um polinucleotídeo de codificação, significa que o elemento regulador afeta a expressão do polinucleotídeo de codificação ligado. Os "elementos reguladores" ou os "elementos de controle" referem-se aos polinucleotídeos que influenciam o momento certo e o nível/quantidade de transcrição, o processamento ou a estabilidade do RNA, ou a tradução do polinucleotídeo de codificação associado. Os elementos reguladores podem incluir os promotores; os líderes de tradução; os introns; os reforçadores; as estruturas de tronco-loop; os polinucleotídeos de ligação repressores; os polinucleotídeos com uma sequência de terminação; os polinucleotídeos com uma sequência de reconhecimento de poliadenilação; etc. Os elementos reguladores particulares podem estar localizados a montante e/ou a jusante de um polinucleotídeo de codificação operavelmente ligado a eles. Também, os elementos reguladores particulares operavelmente ligados a um polinucleotídeo de codificação podem estar localizado sobre a fita complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla.

[00141] Promotor: Conforme usado neste documento, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição, e que pode estar envolvida no reconhecimento e na ligação da RNA polimerase e de outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser operavelmente ligado a um polinu- cleotídeo de codificação para a expressão em uma célula, ou um promotor pode ser operavelmente ligado a um polinucleotídeo codificando um peptídeo de sinal que pode estar operavelmente ligado a um polinucleotídeo de codificação para a expressão em uma célula. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de plantas. Os exemplos de promotores sob o controle do desenvolvimento incluem os promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como as folhas, as raízes, as sementes, as fibras, os vasos de xilema, os traqueoides ou o escle-rênquima. Tais promotores são referidos como "preferidos para tecidos". Os promotores que iniciam a transcrição somente em certos tecidos são referidos como "específicos para tecidos". Um promotor "específico para um tipo de célula" principalmente orienta a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, as células vasculares nas raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode estar sob o controle ambiental. Os exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem as condições anaeróbicas e a presença de luz. Os promotores específicos para tecidos, preferidos para tecidos, específicos para um tipo de célula, e induzíeis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativo sob a maior parte das condições ambientais ou na maior parte dos tipos de tecidos ou células.

[00142] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Ver Ward e col. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Os promotores induzíveis ilustrativos incluem, porém não estão limitados aos: Promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 do milho que responde aos safeners do herbicida de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e ο promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcricionai pode ser induzida por um hormônio de glico-corticosteroide (Schena e col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:0421).

[00143] Os promotores constitutivos ilustrativos incluem, porém não estão limitados aos: Promotores de vírus de plantas, tais como o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV); promotores de genes de actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 do milho; e o promotor de ALS, fragmento de Xba1/Ncol, 5' ao gene estrutural de ALS3 de Brassica napus (ou um polinucleotídeo similar ao dito fragmento de Xba1/Ncol) (Publicação PCT Internacional No. W096/30530).

[00144] Adicionalmente, qualquer promotor específico para tecidos ou preferido para tecidos pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. As plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo de codificação operavel-mente ligado a um promotor específico para tecidos podem produzir o produto do polinucleotídeo de codificação exclusivamente, ou de preferência, em um tecido específico. Os promotores ilustrativos específicos para tecidos ou preferidos para tecidos incluem, porém não estão limitados a: Um promotor preferido para sementes, tal como aquele do gene de faseolina; um promotor específico para folhas e induzido por luz, tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico para antera, tal como aquele de LAT52; um promotor específico para pólen, tal como aquele de Zm13\ e um promotor preferido para microesporo, tal como aquele de apg.

[00145] A colza, a semente de colza ou a canola refere-se a uma planta do gênero Brassica; por exemplo, B. napus.

[00146] Planta de soja: Conforme usado neste documento, o termo "planta de soja" refere-se a uma planta da espécie G/yc/ne; por exem- pio, G. max.

[00147] Transformação: Conforme usado neste documento, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos para uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico tornar-se estavelmente replicada pela célula, ou por incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou por replicação epissômica. Conforme usado neste documento, o termo "transformação" inclui todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Os exemplos incluem, porém não estão limitados à: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídios; eletro-poração (Fromm e col. (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner e col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7); microinjeção (Muel-ler e col. (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacte-rium (Fraley e col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7); absorção direta de DNA; e bombardeio de microprojéteis (Klein e col. (1987) Nature 327:70).

[00148] Transgene: Um ácido nucleico exógeno. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um DNA que codifica uma ou ambas as fitas de um RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA que compreende um polinucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Nos exemplos adicionais, um transgene pode ser um polinucleotídeo sem sentido, onde a expressão do polinucleotídeo sem sentido inibe a expressão de um ácido nucleico alvo, com isso produzindo um fenóti-po de RNAi. Nos exemplos ainda adicionais, um transgene pode ser um gene (por exemplo, um gene de tolerância a herbicida, um gene codificando um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene codificando um traço agrícola desejável). Nestes e em outros exemplos, um transgene pode conter elementos reguladores opera-velmente ligados a um polinucleotídeo de codificação do transgene (por exemplo, um promotor).

[00149] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico como introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir elementos genéticos que permitam que ele replique na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Os exemplos de vetores incluem, porém não estão limitados a: um plas-mídio; cosmídio; bacteriófago; ou vírus que carrega DNA exógeno em uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, incluindo os que produzem moléculas sem sentido, e/ou genes marcadores selecionáveis, e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, com isso fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácidos nuclei-cos e/ou as proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcionalmente inclui materiais para auxiliar a atingir a entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de proteína, etc.).

[00150] Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou maior em relação ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de crescimento, crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Nas modalidades particulares, "rendimento aperfeiçoado" ou "aperfeiçoamento do rendimento" significa um cultivar tendo um rendimento estabilizado de 105% ou maior em relação ao rendimento de variedades de verificação no mesmo local de crescimento, contendo densidades significativas das pragas coleópteras e/ou hemípteras que são prejudiciais para aquela cultura desenvol-vendo-se ao mesmo tempo e sob as mesmas condições, que são alvejadas pelas composições e os métodos aqui contidos.

[00151] A não ser que especificamente indicado ou implicado, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um", conforme usado neste documento.

[00152] A não ser que de outro modo especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles de habilidade comum na técnica à qual pertence esta divulgação. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin’s Genes X. Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs e col. (eds.), The Encvclopedia of Molecular Bioloqy, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy: A Com-prehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de misturas de solventes são em volume, salvo observação em contrário. Todas as temperaturas são em graus Celsius. IV. Moléculas de Ácidos Nucleicos Compreendendo uma Sequência de Praga de Inseto A. Visão Geral [00153] São descritas neste documento moléculas de ácidos nucleicos úteis para o controle de pragas de insetos. Em alguns exemplos, a praga de inseto é uma praga de inseto coleóptera (por exemplo, as espécies do gênero Diabrotica) ou hemíptera (por exemplo, as espécies do gênero Euschistus). As moléculas de ácidos nucleicos descritas incluem os polinucleotídeos-alvo (por exemplo, genes nativos, e polinucleotídeos de não codificação), os dsRNAs, os siRNAs, os shRNAs, os hpRNAs, e os miRNAs. Por exemplo, moléculas de dsR-NA, siRNA, miRNA, shRNA, e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a todo ou parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Nestas e nas modalidades adicionais, o(s) ácido(s) nucleico(s) nativo(s) pode(m) ser um ou mais de genes-alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento larval/da ninfa. As moléculas de ácidos nucleicos descritas neste documento, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos um ácido nucleico nativo ao qual as moléculas de ácidos nucleicos são especificamente complementares, podem iniciar o RNAi na célula, e consequentemente reduzir ou eliminar a expressão do(s) ácido(s) nu-cleico(s) nativo(s). Em alguns exemplos, a redução ou a eliminação da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico especificamente complementar a ele pode resultar na redução ou cessação do crescimento, do desenvolvimento, e/ou da alimentação na praga.

[00154] Em algumas modalidades, pelo menos um gene-alvo em uma praga de inseto pode ser selecionado, onde o gene-alvo compreende um polinucleotídeo de rpll215. Em alguns exemplos, um gene-alvo em uma praga coleóptera é selecionado, onde o gene-alvo compreende um polinucleotídeo selecionado dentre as SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, e um polinucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117 (por exemplo, SEQ ID NO:107). Em alguns exemplos, um gene-alvo em uma praga hemíptera é selecionado, onde o gene-alvo compreende um polinucleotídeo selecionado dentre as SEQ ID NOs:77, 79, 81, e 83-85.

[00155] Em algumas modalidades, um gene-alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser traduzido invertido in silico em um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos contígua, que é pelo menos cerca de 85% idêntica (por exemplo, pelo menos 84%, 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica) à sequência de aminoácidos de um produto de proteína de um polinucleotídeo de rpll215. Um gene- alvo pode ser qualquer polinucleotídeo de rpll215 em uma praga de inseto, cuja inibição pós-transcricional tem um efeito deletério sobre o crescimento, a sobrevivência, e/ou a viabilidade da praga, por exemplo, para proporcionar um benefício protetor contra a praga em uma planta. Nos exemplos particulares, um gene-alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser traduzido invertido in silico em um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos contígua, que é pelo menos cerca de 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:80; SEQ ID NO:82, ou um polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs:113-116 (por exemplo, SEQ ID NO:112).

[00156] Os DNAs são proporcionados de acordo com a invenção, cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa, que é codificada por um polinucleotídeo de codificação em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Em algumas modalidades, após a ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga de inseto, pode ser obtida a in-frarregulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga. Nas modalidades particulares, pode ser obtida a infrarregulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga. Nas modalidades particulares, a infrarregulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga de inseto resulta em um efeito deletério sobre o crescimento e/ou o desenvolvimento da praga.

[00157] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos-alvo incluem os RNAs de não codificação transcritos, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; os líderes removidos; os introns; os outrons (por exemplo, RNA 5'UTR subsequentemente modificado na remoção trans); os donatrons (por exemplo, RNA de não codificação requerido para proporcionar sequências doadoras para a remoção trans)·, e outro RNA de não codificação transcrito de genes-alvo de pragas de insetos. Tais polinucieotí-deos podem ser derivados tanto de genes monocistrônicos quanto po-licistrônicos.

[00158] Desse modo, também são descritas neste documento, em conexão com algumas modalidades, as moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs, e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Em algumas modalidades, uma molécula de iRNA pode compreender polinucleotí-deo(s) que é/são complementar(es) a toda ou parte de uma pluralidade de ácidos nucleicos alvos; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ácidos nucleicos alvos. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou uma bactéria. São também descritos os cDNAs que podem ser usados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA, e/ou moléculas de hpRNA, que são especificamente complementares a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto. São adicionalmente descritos constructos de DNA recombinante para uso na obtenção da transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Os alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis efetivos de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e/ou hpRNA a partir dos constructos de DNA recombinante. Portanto, também é descrito um vetor de transformação de planta compreendendo pelo menos um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, onde a expressão do(s) polinucleotídeo(s) resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma cadeia de nucleobases contíguas que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto.

[00159] Nos exemplos particulares, as moléculas de ácidos nuclei-cos úteis para o controle de uma praga coleóptera ou hemíptera podem incluir: todo ou parte de um ácido nucleico nativo isolado de um organismo Diabrotica compreendendo um polinucleotídeo de rpll215 (por exemplo, quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e 7-9); todo ou parte de um ácido nucleico nativo isolado de um organismo hemíptero compreendendo um polinucleotídeo de rpll215 (por exemplo, quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, 81, e 83-85); todo ou parte de um ácido nucleico nativo isolado de um organismo Meligethes compreendendo um polinucleotídeo de rpll215 (por exemplo, quaisquer das SEQ ID NOs:107-111 e 117); DNAs que, quando expressos, resultam em uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada pela rpll215; moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs, e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de rpll215; cDNAs que podem ser usados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miR-NA, moléculas de shRNA, e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de rpll215; e constructos de DNA recombinante para uso na obtenção da transformação estável de alvos hospedeiros particulares, onde o alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos precedentes. B. Moléculas de Ácidos Nucleicos [00160] A presente invenção proporciona, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) que inibem a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido, ou órgão de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera); e moléculas de DNA capazes de serem expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou micro-organismo, para inibir a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido, ou órgão de uma praga de inseto.

[00161] Algumas modalidades da invenção proporcionam uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, 3, 5, ou um polinucleotídeo de 4965 nucleotídeos de comprimento compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; o complemento de SEQ ID NO:1, 3, 5, ou um polinucleotídeo de 4965 nucleotídeos de comprimento compreendendo as SEQ ID NOs: 108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1, 3, 5, ou um polinucleotídeo de 4965 nucleotídeos de comprimento compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117 (por exemplo, quaisquer das SEQ ID NOs:7-9, SEQ ID NOs: 108-111, e 117); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1, 3, 5, ou um polinucleotídeo de 4965 nucleotídeos de comprimento compreendendo as SEQ ID NOs: 108-111 e 117; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 108-111 e 117; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 108-111 e 117.

[00162] Algumas modalidades da invenção proporcionam uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:77, 79, ou 81; o complemento de SEQ ID NO:77, 79, ou 81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:77, 79, ou 81 (por exemplo, quaisquer das SEQ ID NOs:83, 84, ou 85); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:77, 79, ou 81; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85.

[00163] Nas modalidades particulares, o contato com, ou a absorção por, uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemípte-ra) de um iRNA transcrido do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, o desenvolvimento, e/ou a alimentação da praga. Em algumas modalidades, o contato com o, ou a absorção pelo inseto, ocorre por meio da alimentação do material de planta compreendendo o iRNA. Em algumas modalidades, o contato com o, ou a absorção pelo inseto, ocorre por meio de pulverização de uma planta compreendendo o inseto com uma composição compreendendo o iRNA.

[00164] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:95; o complemento de SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; o complemento de SEQ ID NO:96; SEQ ID NO:97; o complemento de SEQ ID NO:97; SEQ ID NO:98; o complemento de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; o complemento de SEQ ID NO:99; SEQ ID NO:100; o complemento de SEQ ID NO:100; SEQ ID NO:118; o complemento de SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; o complemento de SEQ ID NO:119; SEQ ID NO:120; o complemento de SEQ ID NO:120; SEQ ID NO:121; o complemento de SEQ ID NO:121; SEQ ID NO:122; o complemento de SEQ ID NO:122; SEQ ID NO:123; o complemento de SEQ ID NO: 123; um fragmento de pelo menos 15 nucleo-tídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:95-97; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:95-97; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID N0s:95-100; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID N0s:95-100; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID N0s:95-100; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID N0s:95-100; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs: 119-123; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:119-123; um polinucleotídeo de codificação nativo de 4965 nucleotídeos de comprimento de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:119-123; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de 4965 nucleotídeos de comprimento de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:119-123; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de 4965 nucleotídeos de comprimento de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:119-123; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de 4965 nucleotídeos de comprimento de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:119-123.

[00165] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:101; o complemento de SEQ ID NO:101; SEQ ID NO:102; o complemento de SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:103; o complemento de SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:104; o complemento de SEQ ID NO:104; SEQ ID NO:105; o complemento de SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; o complemento de SEQ ID NO:106; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:101-103; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NQs:101- 103; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo he-míptero (por exemplo, BSB) compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 104-106; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 104-106; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 104-106; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID N0s:104-106.

[00166] Nas modalidades particulares, o contato com, ou a absorção por, uma praga coleóptera e/ou hemíptera do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, o desenvolvimento, e/ou a alimentação da praga. Em algumas modalidades, o contato com o, ou a absorção pelo inseto, ocorre por meio de alimentação de material de planta ou isca compreendendo o iRNA. Em algumas modalidades, o contato com o, ou a absorção pelo inseto, ocorre por pulverização de uma planta compreendendo o inseto com uma composição compreendendo o iRNA.

[00167] Em certas modalidades, as moléculas de dsRNA proporcionadas pela invenção compreendem polinucleotídeos complementares a um transcrito de um gene-alvo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117, e seus fragmentos, a inibição do gene-alvo em uma praga de inseto resultando na redução ou na remoção de um agente de polipeptídeo ou polinucleotídeo que é essencial para o crescimento, o desenvolvimento, ou outra função biológica da praga. Um polinucleotídeo selecionado pode exibir de cerca de 80% a cerca de 100% de identidade da sequência com quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117; um fragmento contíguo de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7- 9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117; e o complemento de quaisquer dos precedentes. Por exemplo, um polinucleotídeo selecionado pode exibir 79%; 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; ou cerca de 100% de identidade da sequência com quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117; um fragmento contíguo de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117; e o complemento de quaisquer dos precedentes. Em alguns exemplos, uma molécula de dsRNA é transcrita da SEQ ID NO:114.

[00168] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo, para inibir a expressão do gene-alvo, pode compreender um único polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um polinucleotídeo nativo encontrado em uma ou mais es-pécies-alvo de pragas de insetos (por exemplo, uma espécie de praga coleóptera ou hemíptera), ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade de tais polinucleotídeos especificamente complementares.

[00169] Em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um primeiro e um segundo polinucleotídeo separado por um "espaçador". Um espaçador pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilite a formação de estrutura secundária entre o primeiro e o segundo polinucleotídeos, onde isto for desejado. Em uma modalidade, o espaçador é parte de um polinucleotídeo de codificação com sentido ou sem sentido para o mRNA. O espaçador pode alternativamente compreender qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que sejam capazes de serem ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico.

[00170] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender um polinucleotídeo codificando uma ou mais moléculas de iRNA diferentes, onde cada uma das diferentes moléculas de iRNA compreende um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo, onde o primeiro e o segundo polinucleotídeos são complementares um ao outro. O primeiro e o segundo polinucleotídeos podem ser unidos dentro de uma molécula de RNA por um espaçador. O espaçador pode constituir parte do primeiro polinucleotídeo ou do segundo polinucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA compreendendo o primeiro e o segundo polinucleotídeos de nucleotídeos pode levar à formação de uma molécula de dsRNA, por emparelha-mento das bases intramolecular específico do primeiro e do segundo polinucleotídeos de nucleotídeos. O primeiro polinucleotídeo ou o segundo polinucleotídeo podem ser substancialmente idênticos a um polinucleotídeo (por exemplo, um gene-alvo, ou polinucleotídeo de não codificação transcrito) nativo para uma praga de inseto (por exemplo, uma praga coleóptera ou hemíptera), um seu derivado, ou um polinucleotídeo complementar a ele.

[00171] As moléculas de ácidos nucleicos de dsRNA compreendem fitas duplas dos ribonucleotídeos polimerizados, e podem incluir modificações na cadeia principal de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. As modificações na estrutura de RNA podem ser ajustadas para permitir uma inibição específica. Em uma modalidade, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático generalizado, de modo que as moléculas de siRNA possam ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar a enzima RNase III, tal como a Dl-CER, em eucariotos, in vitro ou in vivo. Ver Elbashir e col. (2001) Natu-re 411:494-8; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286(5441):950- 2. A DICER ou as enzimas RNase III funcionalmente equivalentes cli- vam as fitas maiores de dsRNA e/ou as moléculas de hpRNA em oli-gonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais é cerca de 19-25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas têm saliências em 3' de 2 a 3 nucleotídeos, e extremidades de fosfato em 5' e hidroxila em 3'. As moléculas de siRNA geradas pelas enzimas RNase III estão estendidas e separadas em RNA de fita simples na célula. As moléculas de siRNA então especificamente hibridizam com os RNAs transcritos de um gene-alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo de degradação de RNA celular inerente. Este processo pode resultar na degradação ou na remoção efetiva do RNA codificado pelo gene-alvo no organismo alvo. O resultado é o silencia-mento pós-transcricional do gene alvejado. Em algumas modalidades, as moléculas de siRNA, produzidas pelas enzimas RNase III endóge-nas a partir de moléculas de ácidos nucleicos heterólogas, podem eficientemente mediar a infrarregulação dos genes-alvo nas pragas de insetos.

[00172] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que não ocorre naturalmente, que pode ser transcrito em uma molécula de RNA de fita simples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através de hibri-dização intermolecular. Tais dsRNAs tipicamente se autoagrupam, e podem ser fornecidos na fonte de nutrição de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera) para obter a inibição pós-transcricional de um gene-alvo. Nestas e nas modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode compreender dois polinucleotí-deos diferentes que não ocorrem naturalmente, cada um dos quais é especificamente complementar a um gene-alvo diferente em uma praga de inseto. Quando tal molécula de ácido nucleico for proporcionada como uma molécula de dsRNA para, por exemplo, uma praga coleóp- tera e/ou hemíptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes-alvo diferentes na praga. C. Obtenção das Moléculas de Ácidos Nucleicos [00173] Uma variedade de polinucleotídeos em pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e hemípteras) pode ser usada como alvos para o projeto de moléculas de ácidos nucleicos, tais como as moléculas de iRNAs e DNA codificando os iRNAs. A seleção dos polinucleotídeos nativos não é, entretanto, um processo fácil. Por exemplo, somente um pequeno número de polinucleotídeos nativos em uma praga coleóptera ou hemíptera será um alvo efetivo. Não pode ser predito com certeza se um polinucleotídeo nativo particular pode ser efetivamente infrarregulado pelas moléculas de ácidos nucleicos da invenção, ou se a infrarregulação de um polinucleotídeo nativo particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, a viabilidade, a alimentação, e/ou a sobrevivência de uma praga de inseto. A grande maioria dos polinucleotídeos nativos de pragas coleópteras e hemípteras, tais como as ESTs isoladas deles (por exemplo, os polinucleotídeos da praga coleóptera listados na Patente U.S. 7.612.194), não tem um efeito prejudicial sobre o crescimento e/ou a viabilidade da praga. Nem se é previsível quais dos polinucleotídeos nativos, que podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga de inseto, são capazes de serem usados em técnicas recombinantes para expressar as moléculas de ácidos nucleicos complementares a tais polinucleotídeos nativos, em uma planta hospedeira, e proporcionar o efeito prejudicial sobre a praga com a alimentação, sem causar dano à planta hospedeira.

[00174] Em algumas modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos (por exemplo, as moléculas de dsRNA a serem proporcionadas na planta hospedeira de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera)) são selecionadas para alvejar os cDNAs que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais para o desenvolvimento da praga, tais como os polipeptídeos envolvidos nas vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, metabolismo de energia, digestão, reconhecimento da planta hospedeira, e similares. Conforme descrito neste documento, a ingestão das composições por um organismo de praga-alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um seu segmento sendo especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico do RNA produzido nas células do organismo de praga-alvo, pode resultar na morte ou em outra inibição do alvo. Um polinucleotídeo, DNA ou RNA, derivado de uma praga de inseto pode ser usado para construir células de plantas protegidas contra a infestação pelas pragas. A planta hospedeira da praga co-leóptera e/ou hemíptera (por exemplo, Z. mays, B. napus, ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter um ou mais polinu-cleotídeos derivados da praga coleóptera e/ou hemíptera, conforme proporcionado neste documento. O polinucleotídeo transformado no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se convertem em uma estrutura de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, desse modo tornando o dsRNA disponível se/quando a praga formar uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga e, no final, na morte ou na inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

[00175] Nas modalidades particulares, um gene é alvejado que esteja essencialmente envolvido no crescimento e no desenvolvimento de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera). Os outros genes-alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham funções importantes na viabilidade, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, capacidade de infectar, e estabelecimento de locais de alimentação da praga. Um gene-alvo pode, portanto, ser um gene housekeeping ou um fator de transcrição. Adicionalmente, um polinucleotídeo nativo de praga de inseto para uso na presente invenção pode também ser derivado de um homólogo (por exemplo, um ortólogo) de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função seja conhecida para aqueles de habilidade na técnica, e cujo polinucleotídeo seja especificamente hi-bridizável com um gene-alvo no genoma da praga-alvo. Os métodos de identificar um homólogo de um gene com uma sequência de nucle-otídeos conhecida por hibridização são conhecidos para aqueles de habilidade na técnica.

[00176] Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para obter uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsR-NA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA). Tal modalidade compreende: (a) analisar um ou mais genes-alvo quanto à sua expressão, função, e fenótipo com a supressão do gene mediada por dsRNA em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera; (b) sondar uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo todo ou uma parte de um polinucleotídeo ou um seu homólogo a partir de uma praga alvejada que mostra um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise da supressão mediada por dsRNA; (c) identificar um clone de DNA que especificamente hibridiza com a sonda; (d) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciar o fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), onde a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende todo ou uma parte substancial do RNA ou um seu homólogo; e (f) sintetizar quimicamente todo ou uma parte substancial de um gene, ou um siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, ou dsRNA.

[00177] Nas modalidades adicionais, um método para obter um fragmento de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo, para produzir uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA), inclui: (a) sintetizar o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeos especificamente complementares a uma parte de um polinucleotídeo nativo a partir de uma praga de inseto alvejada (por exemplo, coleóptera ou hemíptera); e (b) amplificar um inserto de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeos da etapa (a), onde a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de uma molécula de siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, ou dsRNA.

[00178] Os ácidos nucleicos podem ser isolados, amplificados, ou produzidos por diversas abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) pode ser obtida através de amplificação por PCR de um polinucleotídeo-alvo (por exemplo, um gene-alvo ou um polinucleotídeo de não codificação transcrito alvo) derivado de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou suas porções. O DNA ou o RNA pode ser extraído de um organismo-alvo, e as bibliotecas de ácidos nucleicos podem ser preparadas a partir dele usando métodos conhecidos para aqueles comumente habilitados na técnica. As bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um or-ganismo-alvo podem ser usadas para a amplificação por PCR e o se-quenciamento dos genes-alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser usado como um molde para a transcrição in vitro, para gerar RNA com sentido e sem sentido com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácidos nucleicos podem ser sintetizadas por quaisquer de diversas técnicas (Ver, por exemplo, Ozaki e col. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal e col. (1990) Nu-cleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo o uso de um sintetiza-dor de DNA automatizado (por exemplo, um Sintetizador de DNA/RNA modelo 392 ou 394 da P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.)), usando químicas padrões, tais como a química da fosforamidita. Ver, por exemplo, Beaucage e col. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; as Patentes U.S. 4.980.460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066, e 4.973.679. Podem também ser empregadas químicas alternativas que resultam em grupos da cadeia principal não naturais, tais como fosfo-rotioato, fosforamidato, e similares.

[00179] Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida química ou enzimati-camente por alguém versado na técnica, através de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA. O RNA pode também ser produzido por síntese orgânica parcial ou total-qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase de bacteriófago (por exemplo, RNA polimerase de T3, RNA polimerase de T7, e RNA polimerase de SP6). Os constructos de expressão úteis para a clonagem e a expressão dos polinucleotídeos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Publicação PCT Internacional No. WO97/32016; e as Patentes U.S. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214, e 5.804.693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia, ou uma combinação delas. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser usadas sem nenhuma, ou com um mínimo de, purificação, por exemplo, para evitar perdas devidas ao processamento da amostra.

As moléculas de RNA podem ser secadas para a armazenagem ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o anelamento, e/ou a estabilização das fitas dúplex da molécula de dsRNA.

[00180] Nas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por uma fita de RNA autocomplementar simples ou a partir de duas fitas de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição das uma ou duas fitas de RNA in vivo, ou a RNA polimerase clonada pode ser usada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene-alvo em uma praga de inseto pode ser alvejada para o hospedeiro por transcrição específica em um órgão, tecido, ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico para tecidos); estímulo de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor induzível que seja sensível à infecção, estresse, temperatura, e/ou indutores químicos); e/ou criação por engenharia da transcrição em um estágio ou idade de desenvolvimento do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico para o estágio de desenvolvimento). As fitas de RNA que formam uma molécula de dsRNA, quer sejam transcritas in vitro, quer sejam in vivo, podem ou não ser capazes de serem traduzidas em um polipeptídeo por um aparelho de tradução de uma célula. D. Vetores Recombinantes e Transformação da Célula Hospedeira [00181] Em algumas modalidades, a invenção também proporciona uma molécula de DNA para a introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, ou uma célula de planta), onde a molécula de DNA compreende um polinucleotídeo que, com a expressão no RNA e a ingestão por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), obtém a supressão de um gene- alvo em uma célula, tecido, ou órgão da praga. Desse modo, algumas modalidades proporcionam uma molécula de ácido nucleico recombi-nante compreendendo um polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) em uma célula de planta, para inibir a expressão do gene-alvo em uma praga de inseto. Para iniciar ou aumentar a expressão, tais moléculas de ácidos nucleicos recombinantes podem compreender um ou mais elementos reguladores, elementos reguladores estes que podem ser operavelmente ligados ao polinucleotídeo capaz de ser expresso como um iRNA. Os métodos para expressar uma molécula de supressão de gene em plantas são conhecidos, e podem ser usados para expressar um polinucleotídeo da presente invenção. Ver, por exemplo, a Publicação PCT Internacional No. WO06/073727; e a Publicação de Patente U.S. No. 2006/0200878 Al.

[00182] Nas modalidades específicas, uma molécula de DNA re-combinante da invenção pode compreender um polinucleotídeo codificando um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinante podem codificar RNAs que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão de gene(s)-alvo endógeno(s) em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóp-tera e/ou hemíptera) com a ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser proporcionada em uma forma estabilizada; por exemplo, como um hairpin e estrutura de tronco e loop.

[00183] Nas modalidades alternativas, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada por transcrição a partir de um polinucleotídeo que seja substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um polinucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; os complementos das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um poli- nucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um polinucleotídeo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117 (por exemplo, SEQ ID NOs:7-9, 83-85, 108-111, e 117); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um polinucleotídeo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes (por exemplo, PB) compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 108-111 e 117; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85; o complemento de um polinucleotídeo de co- difícação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85; um fragmento de pelo menos 15 nucleo-tídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85.

[00184] Em algumas modalidades, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada por transcrição a partir de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:7-9, 83-85, 108-111, e 117; o complemento de quaisquer das SEQ ID NOs:7-9, 83-85, 108-111, e 117; fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:7-9, 83-85, 108-111, e 117; e os complementos de fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:7-9, 83-85, 108-111, e 117. Em alguns exemplos, o dsRNA é formado por transcrição a partir da SEQ ID NO:124.

[00185] Nas modalidades particulares, uma molécula de DNA re-combinante codificando um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA pode compreender uma região de codificação onde pelo menos dois polinucleotídeos estão dispostos, de modo tal que um polinucleotídeo esteja em uma orientação com sentido, e o outro polinucleotídeo esteja em uma orientação sem sentido, em relação a pelo menos um promotor, onde o polinucleotídeo com sentido e o polinucleotídeo sem sentido estão ligados ou unidos por um espaçador de, por exemplo, cerca de cinco (-5) a cerca de mil (-1000) nucleotídeos. O espaçador pode formar um loop entre os polinucleotídeos com sentido e sem sentido. O polinucleotídeo com sentido ou o polinucleotídeo sem sentido pode ser substancialmente homólogo a um gene-alvo (por exemplo, um gene de rpll215 compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117) ou seu fragmento. Em algumas modalidades, entretanto, uma molécula de DNA recombi-nante pode codificar um RNA que pode formar uma molécula de dsR-NA sem um espaçador. Nas modalidades, um polinucleotídeo de codificação com sentido e um polinucleotídeo de codificação sem sentido podem ser comprimentos diferentes.

[00186] Os polinucleotídeos identificados como tendo um efeito deletério sobre uma praga de inseto ou um efeito protetor da planta com relação à praga podem ser prontamente incorporados nas moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais polinucleotídeos podem ser expressos como um hairpin com estrutura de tronco e loop obtendo-se um primeiro segmento correspondendo a um polinucleotídeo de gene-alvo (por exemplo, um gene de rpll215 compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117, e fragmentos de quaisquer das precedentes); ligando-se este polinucleotídeo a uma região de espaçador de segundo segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando-se esta a um terceiro segmento, onde pelo menos uma parte do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Tal constructo forma uma estrutura de tronco e loop por empareihamento intramolecular de bases do primeiro segmento com o terceiro segmento, onde a estrutura de loop se forma compreendendo o segundo segmento. Ver, por exemplo, as Publicações de Patentes U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e as Publicações PCT Internacionais Nos. W094/01550 e W098/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de fita dupla, tal como uma estrutura de tronco-loop (por exemplo, hairpin), pelo que a produção do siRNA al- vejado para um polinucleotídeo nativo de praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) é aumentada por coexpressão de um fragmento do gene alvejado, por exemplo sobre um cassete capaz de ser expresso de planta adicional, que resulta na produção aumentada de siRNA, ou reduz a metilação para impedir o silenciamento do gene transcricional do promotor de dsRNA hairpin.

[00187] Certas modalidades da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação), para obter níveis de expressão de uma ou mais moléculas de iRNA inibitórios da praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídio linear ou um circular fechado. O sistema de vetor pode ser um vetor ou plasmídio individual, ou dois ou mais vetores ou plasmídios que, juntos, contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. Os ácidos nucleicos da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado, que atua em um ou mais hospedeiros para orientar a expressão de um polinucleotídeo de codificação ligado ou outro elemento de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém diversos componentes dependendo de sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira particular com a qual ele é compatível.

[00188] Para conferir proteção de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou dos fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender um polinucleotídeo que seja substancialmente homólogo e especificamente hibridizável com um polinucleotídeo transcrito correspondente dentro de uma praga de inseto que possa causar dano à espécie de planta hospedeira. A praga pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita nas células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, por ingestão de células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Desse modo, nos exemplos particulares, a expressão de um gene-alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro das pragas coleópteras e/ou hemípteras que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, a supressão da expressão do gene-alvo em uma praga-alvo coleóptera e/ou hemíptera pode resultar na planta sendo protegida contra o ataque pela praga.

[00189] Para capacitar a distribuição das moléculas de iRNA em uma praga de inseto, em uma relação nutricional com uma célula da planta que tenha sido transformada com uma molécula de ácido nu-cleico recombinante da invenção, a expressão (isto é, transcrição) das moléculas de iRNA na célula da planta é requerida. Desse modo, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender um polinucleotídeo da invenção operavelmente ligado a um ou mais elementos reguladores, tais como um elemento promotor heterólogo que atua em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana onde a molécula de ácido nucleico é para ser amplificada, e uma célula da planta onde a molécula de ácido nucleico é para ser expressa.

[00190] Os promotores adequados para uso nas moléculas de ácidos nucleicos da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos, ou constitutivos, todos os quais são bastante conhecidos na técnica. Os exemplos não limitativos que descrevem tais promotores incluem as Patentes U.S. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor de actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores constitutivos do milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196 (promotor 35S do CaMV); 6.433.252 (promotor de oleosina L3 do milho); 6.429.357 (promotor de actina 2 do arroz, e intron de actina 2 do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis pela luz); 6.140.078 (promotores in-duzíveis por sais); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor de gama-coixina); e a Publicação de Patente U.S. No. 2009/757.089 (promotor de aldolase do cloroplasto do milho). Os promotores adicionais incluem o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert e col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(16):5745-9) e os promotores de octopina sintase (OCS) (que são carregados sobre os plasmídios indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); os promotores de caulimovírus, tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e col. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S do CaMV (Odell e col. (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico da betônica-de-água (Walker e col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(19):6624-8); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-8); o promotor do complexo de gene R (Chandler e col. (1989) Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína de ligação a/b da clorofila; CaMV 35S (Patentes U.S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV 35S (Patentes U.S. 6.051.753, e 5.378.619); um promotor de PC1SV (Patente U.S. 5.850.019); o promotor de SCP1 (Patente U.S. 6.677.503); e os promotores de AGRtu.nos (No. de Acesso do Gen-Bank® V00087; Depicker e col. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan e col. (1983) Nature 304:184-7).

[00191] Nas modalidades particulares, as moléculas de ácidos nu-cleicos da invenção compreendem um promotor específico para tecidos, tal como um promotor específico para a raiz. Os promotores específicos para a raiz orientam a expressão de polinucleotídeos de codificação operavelmente ligados exclusiva ou preferencialmente no tecido da raiz. Os exemplos de promotores específicos para a raiz são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman e col. (1994) Science 263:221-3; e Hirel e col. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo ou fragmento para o controle de praga coleóp-tera de acordo com a invenção pode ser clonado entre dois promotores específicos para a raiz orientados em direções transcricionais opostas em relação ao polinucleotídeo ou fragmento, e que são operá-veis em uma célula de planta transgênica e expressos nela para produzir moléculas de RNA na célula de planta transgênica que subsequentemente podem formar moléculas de dsRNA, conforme descrito supra. As moléculas de iRNA expressas nos tecidos das plantas podem ser ingeridas por uma praga de inseto de modo que a supressão da expressão do gene-alvo seja obtida.

[00192] Os elementos reguladores adicionais que podem opcionalmente ser operavelmente ligados a um ácido nucleico incluem as 5'UTRs localizadas entre um elemento promotor e um polinucleotídeo de codificação que funciona como um elemento líder de tradução. O elemento líder de tradução está presente no mRNA totalmente processado, e ele pode afetar o processamento do transcrito primário, e/ou a estabilidade do RNA. Os exemplos de elementos líderes de tradução incluem os líderes da proteína do choque do milho e da petúnia (Patente U.S. 5.362.865), os líderes da proteína do revestimento do vírus da planta, os líderes de rubisco da planta, e outros. Ver, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Os exemplos não limitativos de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. 5.659.122); PhDnaK (U.S. Patent 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (No. de Acesso do GenBank® V00087; e Bevan e col. (1983) Nature 304:184-7).

[00193] Os elementos reguladores adicionais que podem opcionalmente ser operavelmente ligados a um ácido nucleico também incluem os elementos não traduzidos em 3', as regiões de terminação da transcrição em 3', ou as regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de um polinucleotídeo, e incluem os polinucleotídeos que proporcionam sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou o processamento do mRNA. O sinal de poliadenilação atua nas plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade de 3' do precursor de mRNA. O elemento de poliadenilação pode ser derivado de uma variedade de genes das plantas, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitativo de uma região de terminação da transcrição em 3' é a região em 3' de nopalina sintase (nos 3'; Fraley e col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de diferentes regiões não traduzidas em 3' é proporcionado em Ingelbrecht e col., (1989) Plant Cell 1:671-80. Os exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação incluem um de um gene de RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi e col. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (No. de Acesso do GenBank® E01312).

[00194] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos um dos elementos reguladores acima descritos, operavelmente ligados a um ou mais polinucleotídeos da presente invenção. Quando expressos, os um ou mais polinucleotídeos resultam em uma ou mais moléculas de iRNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Desse modo, o(s) polinucleotí-deo(s) pode(m) compreender um segmento codificando todo ou parte de um polirribonucleotídeo presente dentro do transcrito de RNA da praga coleóptera e/ou hemíptera, e pode(m) compreender repetições invertidas de todo ou uma parte de um transcrito da praga alvejada. Um vetor de transformação de planta pode conter polinucleotídeos especificamente complementares a mais do que um polinucleotídeo-alvo, desse modo permitindo a produção de mais do que um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes nas células de uma ou mais populações ou espécies das pragas-alvo de insetos. Os segmentos de polinucleotídeos especificamente complementares aos polinucleotídeos presentes em diferentes genes podem ser combinados em uma única molécula de ácido nucleico compósita, para a expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por um espaçador.

[00195] Em outras modalidades, um plasmídio da presente invenção, já contendo pelo menos um polinucleotídeo da invenção, pode ser modificado por inserção sequencial de polinucleotídeo(s) adicional(is) no mesmo plasmídio, onde o(s) polinucleotídeo(s) adicional(is) é/são operavelmente ligado(s) aos mesmos elementos reguladores que o pelo menos um polinucleotídeo original. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser projetada para a inibição de múltiplos genes-alvo. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera), o que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pragas de insetos, o que pode ampliar a variedade de pragas contra as quais o(s) agente(s) é/são efetivo(s). Quando os múltiplos genes forem alvejados para a supres- são ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser criado por engenharia.

[00196] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável sobre uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Os marcadores selecionáveis podem também ser usados para selecionar as plantas ou as células de plantas que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar a resistência ao biocida, a resistência ao antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc.), ou a tolerância ao herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem, porém não estão limitados a: um gene neo que codifica a resistência à canamicina e pode ser selecionado para usar a canamicina, a G418, etc.; um gene bar que codifica a resistência ao bialaphos; um gene de EPSP sintase mutante que codifica a tolerância ao glifosato; um gene nitrilase que confere resistência ao bromoxinil; um gene de acetoiactato sintase (ALS) mutante que confere tolerância à imidazoli-nona ou à sulfonilureia; e um gene DHFR resistente ao metotrexato. Múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis que conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromici-na, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina, e similares. Os exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

[00197] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode também incluir um marcador examinável. Os marcadores examináveis podem ser usados para monitorar a expressão. Os marcadores examináveis ilustrativos incluem um gene de β- glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual diversos substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson e col. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene do loco R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) nos tecidos das plantas (Dellaporta e col. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." Em 18th Stadler Genetics Svmposium. P. Gustafson e R. Appels, eds. (Nova York: Plenum), págs. 263-82); um gene de β-lactamase (Sutclif-fe e col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual diversos substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogêni-ca); um gene de luciferase (Ow e col. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski e col. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu e col. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene de tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina para DOPA e dopaquinona, que, por sua vez, condensa para melanina (Katz e col. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma a-galactosidase.

[00198] Em algumas modalidades, as moléculas de ácidos nuclei-cos recombinantes, conforme descritas supra, podem ser usadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e a expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar as plantas transgênicas que exibem suscetibilidade reduzida para as pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Os vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, inserindo moléculas de ácidos nucleicos codificando moléculas de iRNA nos vetores de transformação de plantas e introduzindo estes nas plantas.

[00199] Os métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA possa ser in- troduzido em uma célula, tal como por transformação de protoplastos (Ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.508.184), por absorção de DNA mediada por dessecação/inibição (Ver, por exemplo, Potrykus e col. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), por eletroporação (Ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.384.253), por agitação com fibras de carbo-neto de silício (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765), por transformação mediada por Agrobacterium (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; e 6.384.301) e por aceleração das partículas revestidas com DNA (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865), etc. As técnicas que são particularmente úteis para transformar o milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.060.876 e 5.591.616; e na Publicação PCT Internacional WO95/06722. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de virtualmente quaisquer espécies podem ser estavelmente transformadas. Em algumas modalidades, o DNA de transformação é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Quaisquer destas técnicas podem ser usadas para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo um ou mais ácidos nucleicos codificando uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00200] O método mais amplamente utilizado para introduzir um vetor de expressão nas plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. O A. tumefaciens e o A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas das plantas que transformam geneticamente as células das plantas. Os plasmídios de Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídios de Ti (indutores de tumor) contêm um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para as plantas transformadas. Outro segmento do plas-mídio de Ti, a região Vir, é responsável pela transferência do T-DNA. A região de T-DNA é cercada por repetições terminais. Nos vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram removidos, e as funções da região Vir são utilizadas para transferir o DNA exógeno cercado pelos elementos de borda de T-DNA. A região T pode também conter um marcador selecionável para a recuperação eficiente de células de plantas transgênicas, e um sítio de clonagem múltipla para inserir os polinucleotídeos para a transferência, tais como um ácido nucleico de codificação de dsRNA.

[00201] Nas modalidades particulares, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídio de Ti de A. tumefaciens (Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, e 5.501.967; e a Patente Européia No. EP 0 122 791) ou um plasmídio de Ri de A. rhizogenes. Os vetores de transformação de plantas adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, os descritos por Herrera-Estrella e col. (1983) Nature 303:209-13; Bevan e col. (1983) Nature 304:184-7; Klee e col. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia No. EP 0 120 516, e os derivados de quaisquer dos precedentes. Outras bactérias, tais como Sinorhizobium, Rhizobium, e Mesorhi-zobium, que interagem com as plantas naturalmente, podem ser modificadas para mediar a transferência do gene para diversas plantas diferentes. Estas bactérias simbióticas associadas às plantas podem ser tornadas competentes para a transferência do gene por aquisição tanto de um plasmídio de Ti desativado, quanto de um vetor binário adequado.

[00202] Após proporcionar o DNA exógeno nas células receptoras, as células transformadas são, em geral, identificadas para o cultivo adicional e a regeneração da planta. Para melhorar a capacidade de identificar as células transformadas, pode-se desejar empregar um ge- ne marcador selecionável ou examinável, conforme anteriormente apresentado, com o vetor de transformação usado para gerar o trans-formante. No caso onde for usado um marcador selecionável, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas por exposição das células a um agente, ou agentes, seletivo. No caso onde for usado um marcador examinável, as células podem ser examinadas quanto à característica desejada do gene marcador.

[00203] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou as células que tiverem sido classificadas positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas no meio que suporta a regeneração das plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido da planta adequado (por exemplo, meio MS e N6) pode ser modificado por inclusão de mais substâncias, tais como os reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido sobre um meio básico com os reguladores do crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar os esforços de regeneração da planta, ou após rodadas repetidas de seleção manual, até a morfologia do tecido ser adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então transferido para o meio propício para a formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que tenha ocorrido uma formação de brotos suficiente. Assim que os brotos forem formados, eles são transferidos para o meio propício para a formação de raízes. Assim que forem formadas raízes suficientes, as plantas podem ser transferidas para o solo para mais crescimento e maturação.

[00204] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nu-cleico de interesse (por exemplo, um DNA codificando uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão do gene-alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera) nas plantas de regeneração, pode ser efetuada uma variedade de ensaios. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e nor-thern blotting, PCR, e sequenciamento de ácidos nucleicos; ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou western blots) ou por função enzimática; ensaios de partes das plantas, tais como os ensaios das folhas ou das raízes; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.

[00205] Os eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, através de amplificação por PCR usando, por exemplo, inici-adores de oligonucleotídeos específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem por PCR é entendida incluir, porém não está limitada à, amplificação por reação em cadeia por poli-merase (PCR) do gDNA derivado de tecido de calo de planta hospedeira isolado, predito conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguida por clonagem padrão e análise da sequência dos produtos de amplificação por PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. e col. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao gDNA derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays, B. napus, ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo as culturas de células.

[00206] Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém um único DNA recombinante inserido em um cromossomo. O polinucleotídeo do único DNA recombinante é referido como um "evento transgênico" ou "evento de integração". Tais plantas transgênicas são heterozigóti-cas para o polinucleotídeo exógeno inserido. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigótica em relação a um transgene pode ser obtida sexualmente acasalando-se (cruzando-se) uma planta transgênica segregante independente que contenha um único gene exógeno com ela mesma, por exemplo, uma planta T0, para produzir a semente TV Um quarto da semente T-, produzida será homozigótico em relação ao transgene. A germinação da semente T-ι resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permita a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).

[00207] Nas modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula de planta que tenha um efeito inibidor da praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). As moléculas de iRNA (por exemplo, as moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de múltiplos ácidos nucleicos introduzidos em diferentes eventos de transformação, ou a partir de um único ácido nucleico introduzido em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de múltiplos promotores. Moléculas de iRNA individuais podem ser expressas que compreendam múltiplos polinucleotídeos que sejam, cada um, homólogos aos diferentes locais dentro de uma ou mais pragas de insetos (por exemplo, os locais definidos pelas SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um polinucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117 (por exemplo, a SEQ ID NO:107)), ambos em diferentes populações da mesma espécie de praga de inseto, ou em diferentes espécies de pragas de insetos.

[00208] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando-se uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta não tendo tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante, compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA, pode ser introduzida em uma primeira linhagem de planta que seja sensível à transformação, para produzir uma planta transgênica, planta trans-gênica esta que pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para a introgressão do polinucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem de planta.

[00209] Em alguns aspectos, estão incluídos as sementes e os produtos primários produzidos por plantas transgênicas derivadas de células de plantas transformadas, onde as sementes ou os produtos primários compreendem uma quantidade detectável de um ácido nuclei-co da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos primários podem ser produzidos, por exemplo, obtendo-se plantas transgênicas e preparando-se o alimento ou os alimentos a partir delas. Os produtos primários compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação: as farinhas, os óleos, os grãos moídos ou inteiros ou as sementes de uma planta, e qualquer produto alimentício compreendendo qualquer farinha, óleo, ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente recombinante compreendendo um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção. A detecção de um ou mais dos polinucleotídeos da invenção em um ou mais produtos ou produtos primários é de facto evidência que o produto ou o produto primário é produzido a partir de uma planta transgênica, projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para o propósito de controlar pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras).

[00210] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos outro evento transgênico em seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA alvejando um lócus em uma praga coleóptera ou hemíptera que não o definido por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, e um polinucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs: 108-111 e 117, tal como, por exemplo, um ou mais lócus selecionados a partir do grupo que consiste em Caf1-180 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258); VatpaseC (v 2012/0174259); Rho1 (U.S. Patent Application Publication No. 2012/0174260); Va-tpaseH (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586); PPI-87B (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600); RPA70 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601); RPS6 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730); RNA polimerase 11 (Pedido de Patente U.S. No. 62/133214); RNA po-limerase 1133 (Pedido de Patente U.S. No. 62/133210); ROP (Pedido de Patente U.S. No. 14/577.811); RNAPII140 (Pedido de Patente U.S. No. 14/577.854); Dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807); nem (Pedido de Patente U.S. No. 62/095487); COPÍ alfa (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199); COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203); COPI gama (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192); e COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216); um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA alvejando um gene em um organismo que não uma praga coleóptera e/ou hemíptera (por exemplo, um nematóide parasítico na planta); um gene codificando uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, e um polipeptídeo de PIP-1); um gene de tolerância ao herbicida (por exemplo, um gene proporcionando tolerância ao glifosato); e um gene contribuindo para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como rendimento aumentado, metabolismo de ácido graxo alterado, ou restauração da esterilidade masculina citoplásmica. Nas modalidades particulares, os polinucleotídeos codificando as moléculas de iRNA da invenção podem ser combinados com outras características de controle do inseto e de doença em uma planta, para obter as características desejadas para o controle aumentado da doença na planta e do dano pelo inseto. A combinação de características de controle do inseto que empregam modos de ação distintos pode proporcionar plantas transgênicas protegidas, com durabilidade superior sobre as plantas que contêm uma única característica de controle, por exemplo, por causa da probabilidade reduzida que a resistência à(s) característica(s) se desenvolverá no campo. V. Supressão do Gene-Alvo em uma Praga de Inseto A. Visão Global [00211] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico, útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras), pode ser proporcionada em uma praga de inseto, onde a molécula de ácido nucleico resulta no silenciamento do gene mediado pelo RNAi na praga. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) pode ser proporcionada em uma praga co-leóptera e/ou hemíptera. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico, útil para o controle de pragas de insetos, pode ser proporcionada em uma praga por contato da molécula de ácido nucleico com a praga. Nestas e nas modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos pode ser proporcionada em um substrato de alimentação da praga, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas e nas modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de uma praga de inseto pode ser proporcionada através da ingestão do material de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente no material de planta através da expressão de um ácido nucleico recombinante introduzido no material de planta, por exemplo, por transformação de uma célula de planta com um vetor compreen- dendo o ácido nucleico recombinante e regeneração de um material de planta ou planta inteira a partir da célula de planta transformada.

[00212] Em algumas modalidades, uma praga é contatada com a molécula de ácido nucleico, que resulta no silenciamento do gene mediado pelo RNAi na praga através do contato com uma composição tópica (por exemplo, uma composição aplicada por pulverização) ou uma isca de RNAi. As iscas de RNAi são formadas quando o dsRNA for misturado com o alimento ou um atrativo ou ambos. Quando as pragas comem a isca, elas também consomem o dsRNA. As iscas podem tomar a forma de grânulos, géis, pós escoáveis, líquidos, ou sólidos. Nas modalidades particulares, a rpll215 pode ser incorporada em uma formulação de isca, tal como aquela descrita na Patente U.S. No. 8.530.440, que é, pelo presente, incorporada por referência. Em geral, com as iscas, as iscas são colocadas no, ou em torno do, ambiente da praga de inseto, por exemplo, a WCR pode entrar em contato com, e/ou ser atraída para, a isca. B. Supressão do Gene-Alvo Mediada pelo RNAi [00213] Em certas modalidades, a invenção proporciona moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) que podem ser projetadas para alvejar polinucleotídeos nativos essenciais (por exemplo, genes essenciais) no transcritoma de uma praga de inseto (por exemplo, uma praga coleóptera (por exemplo, WCR, NCR, SCR, e PB) ou hemíptera (por exemplo, BSB)), por exemplo, projetan-do-se uma molécula de iRNA que compreenda pelo menos uma fita compreendendo um polinucleotídeo que seja especificamente complementar ao polinucleotídeo-alvo. A sequência de uma molécula de iRNA assim projetada pode ser idêntica àquela do polinucleotídeo-alvo, ou pode incorporar emparelhamentos ruins que não impedem a hibridização específica entre a molécula de iRNA e o seu polinucleotídeo-alvo.

[00214] As moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em métodos para a supressão do gene em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), com isso reduzindo o nível ou a incidência do dano causado pela praga sobre uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Conforme usado neste documento, o termo "supressão do gene" refere-se a quaisquer dos métodos bastante conhecidos para a redução dos níveis de proteína produzida como um resultado da transcrição do gene no mRNA e a subsequente tradução do mRNA, incluindo a redução da expressão da proteína a partir de um gene ou um po-linucieotídeo de codificação que inclui a inibição pós-transcricional da expressão e a supressão transcricional. A inibição pós-transcricional é mediada por homologia específica entre todo ou uma parte de um mRNA transcrito a partir de um gene alvejado para a supressão e a molécula de iRNA correspondente usada para a supressão. Adicionalmente, a inibição pós-transcricional refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para a ligação pelos ribossomos.

[00215] Em algumas modalidades onde uma molécula de iRNA for uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de fita dupla gerada pela atividade da DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de fitas duplas; a "fita de passageiro" e a "fita guia". A fita de passageiro pode ser degradada, e a fita guia pode ser incorporada no RISC. A inibição pós-transcricional ocorre por hibri-dização específica da fita guia com um polinucleotídeo especificamente complementar de uma molécula de mRNA, e divagem subsequente pela enzima, Argonauta (componente catalítico do complexo RISC).

[00216] Em outras modalidades da invenção, qualquer forma da molécula de iRNA pode ser usada. Aqueles de habilidade na técnica entenderão que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis durante a preparação e durante a etapa de proporcionar a molécula de iRNA em uma célula, do que são as moléculas de RNA de fita simples, e são tipicamente também mais estáveis em uma célula. Desse modo, embora as moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, possam ser igualmente efetivas em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida devido à sua estabilidade.

[00217] Nas modalidades particulares, uma molécula de ácido nu-cleico é proporcionada que compreende um polinucleotídeo, polinucle-otídeo este que pode ser expresso in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por um polinucleotídeo dentro do genoma de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de tron-co-loop. Após uma praga de inseto contatar a molécula ade iRNA transcrita in vitro, pode ocorrer a inibição pós-transcricional de um ge-ne-alvo na praga (por exemplo, um gene essencial).

[00218] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nu-cleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos) de um polinucleotídeo é usada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene-alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), onde o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; o complemento de SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; o complemento de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; o complemento de SEQ ID NO:9; um polinucleo- tídeo compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117 (por exemplo, SEQ ID NO:107); o complemento de um polinucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; SEQ ID NO:108; o complemento de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; o complemento de SEQ ID NO:109; SEQ ID NO:110; o complemento de SEQ ID NO:110; SEQ ID NO:111; o complemento de SEQ ID NO:111; SEQ ID NO:117; o complemento de SEQ ID NO:117; um fragmento de pelo menos 15 nucleo-tídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, e 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, e 5; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs: 108-111 e 117; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleo-tídeo de codificação nativo de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; SEQ ID NO:77; o complemento de SEQ ID NO:77; SEQ ID NO:79; o complemento de SEQ ID NO:79; SEQ ID NO:81; o complemento de SEQ ID NO:81; SEQ ID NO:83; o complemento de SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:84; o complemento de SEQ ID NO:84; SEQ ID NO:85; o complemento de SEQ ID NO:85; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:83-85. Em certas modalidades, pode ser usada a expressão de uma molécula de ácido nuclei-co que é pelo menos cerca de 80% idêntica (por exemplo, 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com quaisquer dos precedentes. Nestas e nas modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera).

[00219] É uma característica importante de algumas modalidades aqui contidas que o sistema de inibição pós-transcricional do RNAi seja capaz de tolerar variações de sequências entre os genes-alvo, que poderíam ser esperadas devidas à mutação genética, ao polimorfismo da linhagem ou à divergência evolucionária. A molécula de ácido nu-cleico introduzida pode não necessitar ser absolutamente homóloga com um produto de transcrição primário ou um mRNA totalmente processado de um gene-alvo, desde que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável com um produto de transcrição primário ou um mRNA totalmente processado do gene-alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar ser de tamanho natural, em relação a um produto de transcrição primário ou um mRNA totalmente processado do gene-alvo.

[00220] A inibição de um gene-alvo usando a tecnologia de iRNA da presente invenção é específica para a sequência; isto é, polinucleotí-deos substancialmente homólogos à(s) molécula(s) de iRNA são alvejados para a inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é idêntica àquela de uma parte de um gene-alvo pode ser usada para a inibição. Nestas e nas modalidades adicionais, pode ser usada uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo com uma ou mais mutações por inserção, remoção, e/ou pontuais em relação a um polinucleotídeo-alvo. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma parte de um gene-alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos de cerca de 80%, pelo menos de cerca de 81%, pelo menos de cerca de 82%, pelo menos de cerca de 83%, pelo menos de cerca de 84%, pelo menos de cerca de 85%, pelo menos de cerca de 86%, pelo menos de cerca de 87%, pelo menos de cerca de 88%, pelo menos de cerca de 89%, pelo menos de cerca de 90%, pelo menos de cerca de 91%, pelo menos de cerca de 92%, pelo menos de cerca de 93%, pelo menos de cerca de 94%, pelo menos de cerca de 95%, pelo menos de cerca de 96%, pelo menos de cerca de 97%, pelo menos de cerca de 98%, pelo menos de cerca de 99%, pelo menos de cerca de 100%, e 100% de identidade da sequência. Alternativamente, a região dúplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma parte de um transcrito de gene-alvo. Nas moléculas especificamente hibridizáveis, um polinucleotídeo de tamanho menor do que o normal exibindo uma homologia maior compensa um polinucleotídeo menos homólogo, maior. O comprimento do polinucleotídeo de uma região dúplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma parte de um transcrito de gene-alvo pode ser pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo de mais do que 20-100 nucleotídeos pode ser usado. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo de mais do que cerca de 200-300 nucleotídeos pode ser usado. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo de mais do que cerca de 500-1000 nucleotídeos pode ser usado, dependendo do tamanho do gene-alvo.

[00221] Em certas modalidades, a expressão de um gene-alvo em uma praga (por exemplo, coleóptera ou hemíptera) pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da praga, de modo tal que ocorra uma inibição significativa. A inibição significativa refere-se à inibição sobre um limite que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, cessação do crescimento, cessação da alimentação, cessação do desenvolvimento, mortalidade induzida, etc.), ou uma diminuição detectável no RNA e/ou produto de gene correspondendo ao gene-alvo que está sendo inibido. Embora, em certas modalidades da invenção, a inibição ocorra em substancialmente todas as células da praga, em outras mo- dalidades a inibição ocorre somente em um subgrupo de células expressando o gene-alvo.

[00222] Em algumas modalidades, a supressão transcricional é mediada pela presença, em uma célula, de uma molécula de dsRNA exibindo identidade da sequência substancial com um DNA promotor ou o seu complemento, para efetuar o que é referido como "supressão trans de promotor". A supressão do gene pode ser efetiva contra os genes-alvo em uma praga de inseto que pode ingerir ou contatar tais moléculas de dsRNA, por exemplo, por ingestão ou contato do material de planta contendo as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para uso na supressão trans de promotor podem ser especificamente projetadas para inibir ou suprimir a expressão de um ou mais polinucleotídeos homólogos ou complementares nas células da praga de inseto. A supressão do gene pós-transcricional por RNA orientado sem sentido ou com sentido para regular a expressão do gene nas células das plantas é descrita nas Patentes U.S. 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184; e 5.231.020. C. Expressão das Moléculas de iRNA Proporcionadas em uma Praga de Inseto [00223] A expressão das moléculas de iRNA para a inibição do gene mediada pelo RNAi em uma praga de inseto (por exemplo, coleóp-tera e/ou hemíptera) pode ser realizada em qualquer um de muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser proporcionadas em uma praga de inseto, por exemplo, contatando as moléculas de iRNA com a praga, ou fazendo com que a praga ingira ou de outro modo internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades incluem as plantas hospedeiras transformadas de uma praga coleóptera e/ou hemíptera, as células de plantas transformadas, e a progênie das plantas transformadas. As células das plantas transformadas e as plantas transformadas podem ser engenheiradas para ex- pressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para proporcionar um efeito protetor contra a praga. Desse modo, quando uma planta ou célula de planta transgênica for consumida por uma praga de inseto durante a alimentação, a praga pode ingerir as moléculas de iRNA expressas nas plantas ou nas células transgênicas. Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros de micro-organismos procarióticos e eucarióticos, para produzir as moléculas de iRNA. O termo "micro-organismo" inclui as espécies procarióticas e eucarióticas, tais como as bactérias e os fungos.

[00224] A modulação da expressão do gene pode incluir a supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para a supressão da expressão do gene em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) compreende proporcionar, no tecido do hospedeiro da praga, uma quantidade supressora de gene de pelo menos uma molécula de dsRNA, formada após a transcrição de um polinucleotídeo como descrito neste documento, pelo menos um segmento dela sendo complementar a um mRNA dentro das células da praga de inseto. Uma molécula de dsRNA, incluindo a sua forma modificada, tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA, ingerida por uma praga de inseto pode ser pelo menos de cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de DNA de rpll215, por exemplo, compreendendo um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 108-111, e 117. As moléculas de ácidos nu-cleicos isoladas e substancialmente purificadas, incluindo, porém não limitadas aos, polinucleotídeos que não ocorrem naturalmente e cons- tructos de DNA recombinante para proporcionar moléculas de dsRNA, são, portanto, proporcionadas, que suprimem ou inibem a expressão de um polinucleotídeo de codificação endógeno ou um polinucleotídeo-alvo de codificação em uma praga de inseto, quando introduzidas nela.

[00225] As modalidades particulares proporcionam um sistema de distribuição para a distribuição das moléculas de iRNA, para a inibição pós-transcricional de um ou mais genes-alvo em uma praga de planta de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) e o controle de uma população da praga da planta. Em algumas modalidades, o sistema de distribuição compreende a ingestão de uma célula de planta transgênica hospedeira ou os conteúdos da célula hospedeira compreendendo as moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas e nas modalidades adicionais, uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênica é criada, que contém um constructo de DNA recombinante proporcionando uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. As células de plantas transgênicas e as plantas transgênicas compreendendo os ácidos nucleicos codificando uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando as tecnologias de DNA recombinante (tecnologias básicas estas que são bastante conhecidas na técnica), para construir um vetor de transformação de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula de planta ou a planta; e para gerar a célula de planta transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00226] Para conferir proteção a uma planta transgênica contra uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA, uma molécula de shRNA, ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou dos fluidos da planta recombinante. Tal molécula de dsRNA pode ser compreendida, em parte, de um polinucleotídeo que é idêntico a um polinucleotídeo correspondente transcrito de um DNA dentro de uma praga de inseto de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene-alvo dentro da praga é suprimida pela molécula de dsRNA, e a supressão da expressão do gene-alvo na praga resulta na planta trans-gênica sendo protegida contra a praga. Os efeitos moduladores das moléculas de dsRNA foram mostrados ser aplicáveis a uma variedade de genes expressos em pragas, incluindo, por exemplo, os genes en-dógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou pela transformação celular, incluindo os genes house-keeping; os fatores de transcrição; os genes relacionados à muda; e outros genes que codificam polipep-tídeos envolvidos no metabolismo celular ou no crescimento e desenvolvimento normais.

[00227] Para a transcrição de um transgene in vivo ou um construc-to de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotores, reforçador, silenciador, e sinal de poliadenilação) pode ser usada em algumas modalidades para transcrever a fita (ou as fitas) de RNA. Portanto, em algumas modalidades, conforme apresentado supra, um polinucleotídeo para uso na produção de moléculas de iRNA pode ser operavelmente ligado a um ou mais elementos promotores, funcionais em uma célula hospedeira de planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. O polinucleotídeo da presente invenção, sob o controle de um elemento promotor operavelmente ligado, pode adicionalmente ser flanqueado por elementos adicionais, que vantajosamente afetam a sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Tais elementos podem estar localizados a montante do promotor operavelmente ligado, a jusante da extremidade de 3' do constructo de expressão, e podem ocorrer tanto a montante do promotor quanto a jusante da extremidade de 3' do constructo de expressão.

[00228] Algumas modalidades proporcionam métodos para reduzir o dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho, canola, e soja), causado por uma praga de inseto (por exemplo, co-leóptera e/ou hemíptera) que se alimenta da planta, onde o método compreende proporcionar na planta hospedeira uma célula de planta transformada expressando pelo menos uma molécula de ácido nuclei-co da invenção, onde a(s) molécula(s) de ácido nucleico atua(m) ao ser(em) absorvida(s) peia(s) praga(s), para inibir a expressão de um polinucleotídeo-alvo dentro da(s) praga(s), inibição da expressão esta que resulta na mortalidade e/ou no crescimento reduzido da(s) pra-ga(s), com isso reduzindo o dano à planta hospedeira causado pela(s) praga(s). Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA. Nestas e nas modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que, cada uma, compreendem mais do que um polinucleo-tídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consis-te(m) em um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto.

[00229] Em outras modalidades, é proporcionado um método para aumentar o rendimento de uma cultura (por exemplo, uma cultura de milho), onde o método compreende introduzir em uma planta pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivar a planta para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo o ácido nucleico, onde a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo o ácido nucleico inibe o dano e/ou o crescimento da praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), com isso reduzindo ou eliminando uma perda de rendimento devida à infestação pela praga. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e nas modalidades adicionais, a(s) moiécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que, cada uma, compreendem mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera.

[00230] Nas modalidades alternativas, é proporcionado um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), o método compreendendo: transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando pelo menos uma molécula de iRNA da invenção, onde o polinucleotídeo é operantemente ligado a um promotor e um elemento de terminação da transcrição; cultivar a célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células de planta que inclui uma pluralidade de células de plantas transformadas; selecionar as células de plantas transformadas que tenham integrado o polinucleotídeo em seus ge-nomas; examinar as células de plantas transformadas quanto à expressão de uma molécula de iRNA codificada pelo polinucleotídeo integrado; selecionar uma célula de planta transgênica que expresse a molécula de iRNA; e alimentar a célula de planta transgênica selecionada para uma praga de inseto. As plantas podem também ser regeneradas a partir de células de plantas transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e nas modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que, cada uma, compreendem mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, a(s) molécu-la(s) de ácido nucleico compreende(m) um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera.

[00231] As moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementas de uma espécie de planta (por exemplo, milho, canola, e soja), como um produto de expressão a partir de um gene recombinante incorporado em um genoma das células das plantas, ou como incorporadas em um tratamento de revestimento ou da semente que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula da planta compreendendo um gene recombinante é considerada ser um evento transgênico. Também estão incluídos nas modalidades da invenção os sistemas de distribuição para a distribuição das moléculas de iRNA para as pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de (uma) praga(s). Os métodos para a introdução podem incluir a mistura direta do iRNA com o tecido da planta de um hospedeiro para a(s) praga(s) de inseto, bem como a aplicação das composições compreendendo as moléculas de iRNA da invenção ao tecido da planta hospedeira. Por exemplo, as moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre uma superfície da planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um mi-cro-organismo, e o micro-organismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou caule por um meio físi- co, tal como uma injeção. Conforme discutido supra, uma planta trans-gênica pode também ser geneticamente engenheirada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas de insetos que se sabe infestam a planta. As moléculas de iRNA produzidas por síntese química ou enzimática podem também ser formuladas em um modo consistente com as práticas agrícolas comuns, e usadas como produtos de pulverização ou isca para controlar o dano à planta por uma praga de inseto. As formulações podem incluir os adesivos e os agentes molhantes apropriados, requeridos para a cobertura foliar eficiente, bem como os protetores de UV para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, as moléculas de dsRNA) do dano UV. Tais aditivos são comumente usados na indústria de bioinseticidas, e são bastante conhecidos para aqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticidas de pulverização (de base biológica ou de outro modo), para aumentar a proteção da planta das pragas.

[00232] Todas as referências, incluindo as publicações, as patentes, e os pedidos de patentes, citadas neste documento são, pelo presente, incorporadas por referência até o ponto que elas não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos desta divulgação, e são, assim, incorporadas na mesma proporção como se cada referência fosse individual e especificamente indicada ser incorporada por referência e fosse apresentada em sua totalidade neste documento. As referências discutidas aqui são proporcionadas somente por sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento é para ser interpretado como uma admissão que os inventores não são merecedores de anteceder tal divulgação em virtude de invenção anterior.

[00233] Os EXEMPLOS a seguir são proporcionados para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Estes EXEMPLOS não devem ser interpretados para limitar a divulgação às características ou aos aspectos particulares descritos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Materiais e Métodos Preparação da amostra e bioensaios [00234] Diversas moléculas de dsRNA (incluindo aquelas correspondendo à rpll215-1 regí (SEQ ID NO:7), rpll215-2 regí (SEQ ID NO:8), e rpll215-3 regí (SEQ ID NO:9)) foram sintetizadas e purificadas usando um kit de RNAi de T7 MEGASCRIPT® (LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA) ou um Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento Rápido de T7 (NEW ENGLAND BIOLABS, Whitby, Ontario). As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão de TE, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle consistindo neste tampão, que serviu como uma checagem secundária quanto à mortalidade ou inibição do crescimento da WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As concentrações das moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro 8000 NANODRO® (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00235] As amostras foram testadas quanto à atividade do inseto nos bioensaios conduzidos com larvas de insetos de neonatos sobre dieta artificial para insetos. Os ovos da WCR foram obtidos da CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

[00236] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas plásticas de 128 poços, especificamente projetadas para os bioensaios com insetos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada poço continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta artificial, projetada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pL de amostra de dsRNA foi distribuída, por pipeta, para a superfície da dieta de cada poço (40 pL/cm2). As concentrações das amostras de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área de superfície (1,5 cm2) no poço. As bandejas tratadas foram mantidas em uma capela de exaustão até que o líquido sobre a superfície da dieta evaporasse ou fosse absorvido na dieta.

[00237] Dentro de algumas horas da eclosão, as larvas individuais foram apanhadas com uma escova de pelo de camelo e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por poço). Os poços infestados das bandejas plásticas de 128 poços foram então vedados com folhas adesivas de plástico transparente, e ventilados para permitir a troca de gases. As bandejas do bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28 Ό, -40% de Umidade Relativa, 16:8 (Luz:Escuridão) por 9 dias, após cujo tempo o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos, e o peso dos insetos sobreviventes foram registrados. A porcentagem média de mortalidade e a inibição do crescimento média foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (Gl) foi calculada como se segue: Gl = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)], onde TWIT é o Peso Total dos Insetos vivos no Tratamento; TNIT é o Número Total de Insetos no Tratamento; TWIBC é o Peso total de Insetos vivos na Checagem Secundária (Controle de tampão); e TNIBC é o Número Total de Insetos na Checagem Secundária (Controle de tampão).

[00238] A análise estatística foi feita usando o software JMP® (SAS, Cary, NC).

[00239] A LC50 (Concentração Letal) é definida como a dosagem na qual 50% dos insetos de teste são mortos. A Gl50 (Inibição do Crescimento) é definida como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, o peso vivo) dos insetos de teste é 50% do valor médio visto nas amostras de Checagem Secundária.

[00240] Os bioensaios duplicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma mortalidade e uma inibição do crescimento surpreendentes e inesperadas das larvas da lagarta da raiz do milho. EXEMPLO 2: Identificação dos Genes-Alvo Candidatos [00241] Os insetos de múltiplos estágios de desenvolvimento da WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para a análise do transcritoma concentrado, para proporcionar sequências de genes-alvo candidatas para o controle pela tecnologia de proteção contra insetos de planta transgênica por RNAi.

[00242] Em uma exemplificação, o RNA total foi isolado de cerca de 0,9 g de larvas da WCR de primeiro instar inteiras; (4 a 5 dias após a eclosão; mantidas a 16 Ό), e purificado usando o seguinte método à base de fenol/TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, Cincinnati, OH): [00243] As larvas foram homogeneizadas na temperatura ambiente, em um homogeneizador de 15 mL, com 10 mL de TRI REAGENT® até que uma suspensão homogênea fosse obtida. Após 5 min. de incubação na temperatura ambiente, o homogeneizado foi distribuído em tubos de microfuga de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados, e a mistura foi vigorosamente agitada por 15 segundos. Após permitir a extração para acomodar na temperatura ambiente por 10 min, as fases foram separadas por centrifugação a 12.000 x g a 4 Ό. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo de 1,5 mL estéril, e um volume igual de isopropanol na temperatura ambiente foi adicionado. Após incubação na temperatura ambiente por 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min a 12.000 x g (4 O ou 25 Ο).

[00244] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado, e a pelota de RNA foi lavada duas vezes por redemoinho com 75% de etanoi, com recuperação por centrifugação por 5 min a 7.500 x g (4Ό ou 25Ό) após cada lavagem. O etanoi foi cuida dosamente removido, a pelota foi deixada secar ao ar por 3 a 5 min, e então foi dissolvida em água estéril sem nuclease. A concentração de RNA foi determinada por medição da absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 g de larvas rendeu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão de A26o/A28o de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80Ό até ser processado adicionalmente.

[00245] A qualidade do RNA foi determinada correndo-se uma alíquota através de um gel de agarose a 1%. A solução de gel de agaro-se foi preparada usando tampão de 10x TAE esterilizado em autoclave (acetato de Tris EDTA; a concentração de 1x é 0,04 M de acetato de Tris, 1 mM de EDTA (sal sódico de ácido etilenodiaminotetracético), pH 8,0), diluído com água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila) em um recipiente esterilizado por autoclave. O 1x TAE foi usado como 0 tampão de corrida. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente formador de poços foram limpos com RNaseAway® (INVITROGEN INC., Carlsbad, CA). Dois pl_ de amostra de RNA foram misturados com 8 pl_ de tampão de TE (10 mM de Tris HCI pH 7,0; 1 mM de EDTA) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® Catálogo No 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A mostra foi aquecida a 70Ό por 3 min, esfriada até a temperatura ambiente , e 5 μΙ_ (contendo 1 pg a 2 pg de RNA) foram carregados por poço. Os marcadores de pesos moleculares de RNA comercialmente disponíveis foram simultaneamente corridos em poços separados, para a comparação do tamanho molecular. O gel foi corrido a 60 volts por 2 h.

[00246] Uma biblioteca de cDNA normalizado foi preparada a partir do RNA total larval por um provedor de serviço comercial (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), usando iniciação aleatória. A biblioteca de cDNA larval normalizado foi sequenciada em escala de placa 1/2 pela química da série GS FLX 454 Titanium® no EUROFINS MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras, com um comprimento de leitura médio de 348 bp. 350.000 leituras foram agrupadas sobre 50.000 contigs. Tanto as leituras não agrupadas quanto os con-tigs foram convertidos nos bancos de dados BLASTable usando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível do NCBI).

[00247] As bibliotecas de RN A total e cDNA normalizado foram similarmente preparadas a partir de materiais coletados em outros estágios de desenvolvimento da WCR. Uma biblioteca de transcritoma concentrado para o exame do gene-alvo foi construída combinando-se os membros da biblioteca de cDNA representando os diversos estágios de desenvolvimento.

[00248] Os genes candidatos para o alvejamento do RNAi foram supostos serem essenciais para a sobrevivência e o crescimento nos insetos pragas. Os homólogos de genes-alvo selecionados foram identificados no banco de dados de sequência de transcritoma, conforme detalhado abaixo. As sequências de tamanho natural ou parciais dos genes-alvo foram amplificadas por PCR, para preparar os moldes para a produção de RNA de fita dupla (dsRNA).

[00249] As buscas por TBLASTN usando sequências de codificação de proteínas candidatas foram corridas contra os bancos de dados BLASTable contendo as leituras das sequências de Diabrotica não agrupadas ou os contigs agrupados. Os resultados significativos para uma sequência de Diabrotica (definidos como melhores do que e'20 para as homologias dos contigs e melhores do que e'10 para as homo-logias das leituras das sequências não agrupadas) foram confirmados usando BLASTX contra o banco de dados não redundante do NCBI. Os resultados desta busca por BLASTX confirmaram que as sequências dos genes candidatos homólogos de Diabrotica, identificadas na busca por TBLASTN, de fato compreendiam genes de Diabrotica, ou eram o melhor resultado para a sequência de genes candidatos que não de Diabrotica, presente nas sequências de Diabrotica. Em alguns casos, estava claro que alguns dos contigs de Diabrotica ou as leituras das sequências não agrupadas, selecionadas por homologia com um gene candidato que não de Diabrotica, se sobrepuseram, e que o agrupamento dos contigs não conseguiu unir estas sobreposições. Nestes casos, o Sequencher® v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, Ml) foi usado para agrupar as sequências em contigs mais longos.

[00250] Diversos genes-alvo candidatos codificando rpll215 de Diabrotica (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:5) foram identificados como genes que podem levar à mortalidade da praga coleóptera, à inibição do crescimento, à inibição do desenvolvimento, e/ou à inibição da alimentação na WCR.

[00251] O gene de RNA polimerase 11-215 de Drosophila (rpll215) codifica a subunidade principal da RNA polimerase II dependente de DNA (Jokerst e col. (1989) Mol. Gen. Genet. 215(2):266-75), que catalisa a transcrição de DNA em RNA. Nos eucariotos, existem três classes de RNA polimerases (RNAP): RNAP I, que transcreve o RNA ri-bossômico; RNAPII, que transcreve todos os genes de codificação das proteínas; e RNAPIII, que transcreve os genes de 5S rRNA e tRNA. Esta estrutura complexa consiste em 9 a 14 subunidades. Algumas das subunidades são comuns entre todas as três formas de polimerases em todas as espécies, enquanto outras são específicas para a classe e a espécie. A RNAPII mostrou ser altamente conservada entre os procariotos e os eucariotos. Allison e col. (1985) Cell 42(2):599-610. Na Drosophila melanogaster, a RNAPII consiste em pelo menos 12 subunidades eletroforeticamente separáveis. A maior subunidade (Rpl 1215) codifica uma subunidade de 215 kDa.

[00252] As sequências SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:5 são novas. As sequências não são fornecidas em bancos de dados públicos, e não estão descritas na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO/2011/025860; no Pedido de Patente U.S. No. 20070124836; no Pedido de Patente U.S. No. 20090306189; no Pedido de Patente U.S. No. US20070050860; no Pedido de Patente U.S. No. 20100192265; na Patente U.S. 7.612.194; ou no Pedido de Patente U.S. No. 2013192256. O WCR rpll215-1 (SEQ ID NO:1) está algo relacionado com um fragmento de uma sequência de Ceratitis capitata (No. de Acesso do GENBANK XM_004519999.1). O WCR rpll215-2 (SEQ ID NO:3) está algo relacionado com um fragmento de uma sequência de Tribolium castaneum (No. de Acesso do GENBANK XM_008196951.1). O WCR rpll215-3 (SEQ ID NO:5) está algo relacionado com um fragmento de uma sequência de Albugo laibachii (No. de Acesso do GENBANK FR824092.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de WCR RPII215-1 (SEQ ID NO:2) é uma proteína de Drosophila simulans tendo o No. de Acesso do GENBANK ABB29549.1 (95% similar; 92% idêntica sobre a região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de WCR RPII215-2 (SEQ ID NO:4) é uma proteína de Tribolium casetanum tendo o No. de Acesso do GENBANK XP_008195173.1 (97% similar; 96% idêntica sobre a região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos de WCR RPII215-3 (SEQ ID NO:6) é uma proteína de Phytophthora sojae tendo o No. de Acesso do GENBANK EGZ16741.1 (96% similar; 93% idêntica sobre a região de homologia).

[00253] Os transgenes de dsRNA de Rpll215 podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA para proporcionar alvejamento de RNAi redundante e efeitos de RNAi sinérgicos. Os eventos de milho transgênicos expressando o dsRNA que alveja rpll215 são úteis para impedir o dano de alimentação da raiz pela lagarta da raiz do milho.

Os transgenes de dsRNA de Rpll215 representam novos modos de ação para a combinação com a tecnologia da proteína inseticida de Bacillus thuringiensis nas pirâmides de genes de Controle da Resistência dos Insetos, para atenuar contra o desenvolvimento de populações de lagartas das raízes resistentes a quaisquer destas tecnologias de controle de lagartas das raízes.

EXEMPLO 3: Amplificação dos Genes-Alvo para produzir dsRNA

[00254] Os clones de tamanho natural ou parciais das sequências de um gene candidato de Diabrotica, aqui referido como rpll215, foram usados para gerar amplicons de PCR para a síntese do dsRNA. Os iniciadores foram projetados para amplificar as partes das regiões de codificação de cada gene-alvo por PCR. Ver a Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência de promotor de fago T7 (TTAATACGACTCAC-TATAGGGAGA; SEQ ID NO: 10) foi incorporada nas extremidades de 5' das fitas com sentido ou sem sentido amplificadas. Ver a Tabela 1. O RNA total foi extraído da WCR usando TRIzol® (Life Technologies, Grand Island, NY), e foi então usado para preparar o cDNA de primeira fita com o Sistema de Síntese de Primeira Fita SuperScriptlll® e as instruções do Oligo dT iniciado do fabricante (Life Technologies, Grand Island, NY). O cDNA de primeira fita foi usado como um molde para as reações PCR usando iniciadores de oposição posicionados para amplificar toda ou parte da sequência de gene-alvo nativo. O dsRNA foi também amplificado a partir de um clone de DNA compreendendo a região de codificação para uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO:11; Shagin e col. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50).

Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar partes das regiões de codificação do gene-alvo de rpll215 ilustrativo e do gene de controle negativo de YPF. EXEMPLO 4: Constructos de RNAi Preparação do molde por PCR e síntese de dsRNA

[00255] Uma estratégia usada para proporcionar moldes específicos para a produção de dsRNA de rpll215 e YFP é mostrada na FIG. 1. Os DNAs de moldes pretendidos para uso na síntese de dsRNA de rpU215 foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores na Tabela 1 e (como o molde de PCR) o cDNA de primeira fita preparado a partir do RNA total isolado de ovos de WCR, larvas de primeiro instar, ou adultos. Para cada região de gene-alvo de rpll215 e YFP selecionada, as amplificações por PCR introduziram uma sequência promotora de T7 nas extremidades de 5' das fitas com sentido e sem sentido amplificadas (o segmento de YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região de codificação de YFP). Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes-alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como molde de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIG. 1. As sequências dos moldes de dsRNA amplificados com os pares de iniciadores particulares eram: SEQ ID NO:7 (rpll215-1 regí), SEQ ID NO:8 (rpll215-2 regí), SEQ ID NO:9 (rpll215-3 regí), e SEQ ID NO:11 (YFP). O RNA de fita dupla para o bioensaio com inseto foi sintetizado e purificado usando um kit de RNAi AMBION® MEGAS-CRIPT® seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN) ou o Kit de Transcrição In Vitro de T7 HiScribe® seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA). As concentrações dos dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

Constructo dos vetores de transformação de planta [00256] Os vetores de entrada que abrigam um constructo de gene-alvo para a formação de hairpin compreendendo segmentos de rpll215 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, e SEQ ID NO:81) são agrupados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrões. A formação de hairpin in-tramolecular por transcritos primários de RNA é facilitada por arranjo (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias do segmento de gene alvo de rpll215 em orientação oposta uma à outra, os dois segmentos sendo separados por um polinucleotídeo ligador (por exemplo, SEQ ID NO:126, e um intron de ST-LS1 (Vancanneyt e col. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)). Desse modo, o transcrito de mRNA primário contém as duas sequências dos segmentos de genes de rpll215 como repetições invertidas grandes uma da outra, separadas pela sequência de intron. Uma cópia de um promotor (por exemplo, ubiquitina 1 do milho, Patente U.S. No. 5.510.474; 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV); promotor de badnavírus baciliforme da cana-de-açúcar (ScBV); promotores dos genes de actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de historia H3 do milho; promotor de ALS; promotor do gene de faseolina; cab; rubisco; LAT52; Zm13; e/ou apg) é usada para orientar a produção do transcrito de mRNA hairpin primário, e um fragmento compreendendo uma região não traduzida em 3' (por exemplo, um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3'UTR v2; Patente U.S. No. 6.699.984), AtUbilO, AtEfl, e StPinll) é usado para terminar a transcrição do gene que expressa o RNA hairpin.

[00257] O vetor de entrada pDAB126157 compreende um construc-to de RNA de rpll215 v1 (SEQ ID NO: 124) que compreende um segmento de rpll215 (SEQ ID NO:8).

[00258] Os vetores de entrada descritos acima são usados nas reações padrões de recombinação GATEWAY® com um vetor de destina-ção binário típico, para produzir os vetores de transformação da expressão do RNA hairpin de rpll215, para as transformações dos embriões do milho mediadas por Agrobacterium.

[00259] O vetor de destinação binário compreende um gene de tolerância ao herbicida (ariloxialcnoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Patente U.S. 7.838.733(B2), e Wright e col. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-5), sob a regulação de um promotor operável de planta (por exemplo, promotor de badnavírus baciliforme da cana-de-açúcar (ScBV) (Schenk e col. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) e ZmUbil (Patente U.S. 5.510.474)). Uma 5'UTR e o intron estão posicionados entre a extremidade de 3' do segmento de promotor e o códon de iniciação da região de codificação de AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região não traduzida em 3' de um gene de lipase do milho (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. 7.179.902) é usado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.

[00260] Um vetor binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construído por meio das rea- ções padrões de recombinação GATEWAY® com um vetor de destina-ção binário típico e um vetor de entrada. O vetor de destinação binário compreende um gene de tolerância ao herbicida (ariloxialcnoato dioxi-genase; AAD-1 v3) (conforme acima descrito), sob a regulação da expressão de um promotor de ubiquitina 1 do milho (conforme acima mencionado) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida em 3' de um gene de lipase do milho (ZmLip 3'UTR; conforme acima descrito). O vetor de entrada compreende uma região de codificação de YFP (SEQ ID NO:20) sob o controle da expressão de um promotor de ubiquitina 1 do milho (conforme mencionado acima) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida em 3' de um gene de peroxidase 5 do milho (conforme acima descrito). EXEMPLO 5: Exame dos Genes-Alvo Candidatos [00261] O dsRNA sintético, projetado para inibir as sequências de genes-alvos identificadas no EXEMPLO 2, causou a mortalidade e a inibição do crescimento quando administrado à WCR nos ensaios baseados em dietas.

[00262] Os bioensaios duplicados demonstraram que a ingestão das preparações de dsRNA derivadas de rpll215-2 regí resultou em mortalidade e inibição do crescimento das larvas da lagarta da raiz do milho ocidental. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados dos bioensaios de alimentação baseados em dieta das larvas da WCR após exposição por 9 dias ao dsRNA de rpll215-2 regí, bem como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativa de dsRNA, preparada a partir da região de codificação da proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO:11).

Tabela 2. Resultados dos ensaios de alimentação por dieta de dsRNA de rpll215, obtidos com as larvas de lagartas das raízes dos milhos ocidentais após 9 dias de alimentação. A análise por ANOVA encontrou diferenças significativas na Média da % de Mortalidade e na Média da % de Inibição do Crescimento (Gl). As médias foram separadas usando o teste de Tukey-Kramer. *SEM =Erro Padrão da Média. As letras entre parênteses designam níveis estatísticos. Os níveis não associados pela mesma letra são significativamente diferentes (P<0,05). **TE = Tampão de Tris HCI (1 mM) mais EDTA (0,1 mM), pH 7,2. ***YFP = Proteína Fluorescente Amarela Tabela 3. Resumo da potência oral do dsRNA de rpll215 sobre as larvas de WCR (ng/cm2).

[00263] Sugeriu-se anteriormente que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para o controle de insetos mediado por RNAi. Ver a Publicação de Patente U.S. No. 2007/0124836, que divulga 906 sequências, e a Patente U.S. No. 7.612.194, que divulga 9.112 sequências. Entretanto, determinou-se que muitos genes sugeridos terem utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Determinou-se também que a sequência rpll215-2 regí proporciona controle superior surpreendente e inesperado da Diabrotica, em comparação com os outros genes sugeridos terem utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi.

[00264] Por exemplo, a anexina, a beta espectrina 2, e a mtRP-L4 foram, cada uma, sugeridas na Patente U.S. 7.612.194 serem eficazes no controle de insetos mediado por RNAi. A SEQ ID NO:21 é a sequência de DNA da região 1 de anexina (Reg 1) e a SEQ ID NO:22 é a sequência de DNA da região 2 de anexina (Reg 2). A SEQ ID NO:23 é a sequência de DNA da região 1 de beta espectrina 2 (Reg 1) e a SEQ ID NO:24 é a sequência de DNA da região 2 de beta espectrina 2 (Reg2). a SEQ ID NO:25 é a sequência de DNA da região 1 de mtRP-L4 (Reg 1) e a SEQ ID NO:26 é a sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4 (Reg 2). Uma sequência de YFP (SEQ ID NO:11) foi também usada para produzir dsRNA como um controle negativo.

[00265] Cada uma das sequências antes mencionadas foi usada para produzir o dsRNA pelos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia usada para proporcionar moldes específicos para a produção de dsRNA é mostrada na FIG. 2. Os DNAs de moldes pretendidos para uso na síntese de dsRNA foram preparados por PCR usando os pares de iniciadores na Tabela 4 e (como molde da PCR) o cDNA de primeira fita preparado a partir do RNA total isolado das larvas de WCR de primeiro instar. (A YFP foi amplificada a partir de um clone de DNA.) Para cada região de gene-alvo selecionada, duas amplificações por PCR separadas foram efetuadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência de promotor de T7 na extremidade de 5' das fitas com sentido amplificadas. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes-alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como molde de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIG. 2. O RNA de fita dupla foi sintetizado e purificado usando um kit de RNAi AMBION® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotôme-tro NANODROP® 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) e os dsRNAs foram, cada um, testados pelos mesmos métodos de bioen-saios à base de dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores usados para produzir as moléculas de dsRNA de ane-xina Regí, anexina Reg2, beta espectrina 2 Regí, beta espectrina 2 Reg2, mtRP-L4 Regí, mtRP-L4 Reg2, e YFP. A Tabela 5 apresenta os resultados dos bioensaios de alimentação baseados em dieta das larvas de WCR após exposição por 9 dias a estas moléculas dsRNA.

Os bioensaios duplicados demonstraram que a ingestão destes dsR-NAS não resultou em nenhuma mortalidade ou inibição do crescimento das larvas da lagarta da raiz do milho ocidental acima daquela visto com as amostras de controle de tampão de TE, água, ou proteína YFP.

Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar as partes das regiões de codificação dos genes.

Tabela 5. Resultados dos ensaios de alimentação por dieta obtidos com as larvas da lagarta da raiz do milho ocidental, após 9 dias. *TE = Tampão de Tris HCI (10 mM) mais EDTA (1 mM), pH 8. **YFP = Proteína Fluorescente Amarela EXEMPLO 6: Produção de Tecidos de Milho Transgênicos Compreendendo dsRNAs Inseticidas [00266] Transformação mediada por Actrobacterium. As células, os tecidos e as plantas dos milhos transgênicos, que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo rpll215 (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:5)), através da expressão de um gene quimérico estavelmente integrado no genoma da planta, são produzidos após a transformação mediada por Agrobacterium. Os métodos de transformação do milho que empregam vetores de transformação superbiná-rios ou binários são conhecidos na técnica, como descritos, por exemplo, na Patente U.S. 8.304.604, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Os tecidos transformados são selecionados por sua capacidade de crescer sobre meio contendo Haloxifop e são examinados quanto à produção de dsRNA, conforme apropriado. Porções de tais culturas de tecidos transformados podem ser apresentadas às larvas da lagarta da raiz do milho neonatas para o bioensaio, essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 1.

[00267] Inibição da Cultura de Agrobacterium. Os estoques em gli-cerol das células da cepa de Agrobacterium DAt13192 (Publicação Internacional PCT No. WO 2012/016222A2), contendo um vetor de transformação binário descrito acima (EXEMPLO 4), são riscados sobre placas de meio mínimo AB (Watson, e col. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) contendo antibióticos apropriados, e são desenvolvidos a 20 °C por 3 dias. As culturas são então riscadas sobre placas de YEP (g/L: extrato de levedura, 10; Peptona, 10; NaCI, 5) contendo os mesmos antibióticos e são incubadas a 20 °C por 1 dia.

[00268] Cultura de Agrobacterium. No dia de um experimento, uma solução de estoque de Meio de Inoculação e acetossiringona é preparada em um volume apropriado até o número de constructos no experimento e pipetada para um frasco de 250 mL, descartável, estéril. O Meio de Inoculação (Frame e col. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. EM Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe e E. C. Yeung, (Eds), Springer Science e Business Media, LLC. págs. 327-341) contém: 2,2 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas de MS Modificadas (Frame e col., ibid.) 68,4 g/L de sacarose; 36 g/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio-inositol; em pH 5,4.) A ace-tossiringona é adicionada ao frasco contendo o Meio de Inoculação até uma concentração final de 200 μΜ a partir de uma solução de estoque a 1 M em 100% de sulfóxido de dimetila, e a solução é completamente misturada.

[00269] Para cada constructo, 1 ou 2 loops totais de inoculação de Agrobacterium da placa de YEP são suspensos em 15 mL de solução de estoque de Meio de Inoculação/acetossiringona em um tubo de centrífuga de 50 mL, descartável, estéril, e a densidade óptica da solução a 550 nm (OD550) é medida em um espectrofotômetro. A suspensão é então diluída até OD550 de 0,3 a 0,4 usando misturas adicionais de Meio de Inoculação/acetossiringona. O tubo da suspensão de Agrobacterium é então colocado horizontalmente sobre um conjunto de agitador de plataforma em torno de 75 rpm, na temperatura ambiente, e agitado por 1 a 4 horas enquanto a dissecação do embrião é efetuada.

[00270] Esterilização das espigas e isolamento dos embriões. Os embriões imaturos do milho são obtidos de plantas da linhagem endó-gama de Zea mays B104 (Hallauer e col. (1997) Crop Science 37:1405-1406), desenvolvidos na estufa e auto- ou sibpolinizados para produzir as espigas. As espigas são colhidas aproximadamente 10 a 12 dias após a polinização. No dia experimental, as espigas descascadas são esterilizadas na superfície por imersão em uma solução a 20% de alvejante comercial (ULTRA CLOROX® Germicidal Bleach, 6,15% de hipoclorito de sódio; com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas por 20 a 30 min, seguido por três lavagens em água desionizada estéril em uma capela de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) são assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos para tubos de microcentrífu-gas contendo 2,0 mL de uma suspensão de células de Agrobacterium apropriadas em Meio de Inoculação líquido com 200 μΜ de acetossi-ringona, no qual 2 μί_ do tensoativo a 10% BREAK-THRU® S233 (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Germany) são adicionados. Para um dado grupo de experimentos, os embriões das espigas agrupadas são usados para cada transformação.

[00271] Cocultivo de Agrobacterium. Após o isolamento, os embriões são colocados sobre uma plataforma oscilatória por 5 minutos. Os conteúdos do tubo são então vertidos para uma placa de Meio de Cocultivo, que contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas de MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico); 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgN03; 200 μΜ de acetossiringo-na em DMSO; e 3 g/L de GELZAN®, em pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium é removida com uma pipeta de transferência, descartável, estéril. Os embriões são então orientados com o escutelo fa-ceando para cima, usando fórceps estéreis, com o auxílio de um microscópio. A placa é fechada, vedada com fita cirúrgica 3M® MICRO-PORE®, e colocada em uma incubadora a 25 °C, com luz contínua a aproximadamente 60 μιτιοΙ rrf2s'1 de Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR).

[00272] Seleção do Calo e Regeneração dos Eventos Transqêni-cos. Após o período de Cocultivo, os embriões são transferidos para o Meio de Repouso, que é composto de 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas de MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgN03; 0,5 g/L de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico monoidrato; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de Carbenici-lina; e 2,3 g/L de GELZAN®; em pH 5,8. Não mais do que 36 embriões são movidos para cada placa. As placas são colocadas em uma caixa plástica limpa e incubadas a 27 Ό, com luz contínu a a aproximadamente 50 pmol m'2s'1 de PAR por 7 a 10 dias. Os embriões com calos são então transferidos (<18/placa) para o Meio de Seleção I, que é compreendido de Meio de Repouso (acima descrito) com 100 nM de Ácido R-Haloxifop (0,0362 mg/L; para a seleção dos calos que contêm 0 gene de AAD-1). As placas são retornadas para as caixas limpas e incubadas a 27 Ό com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m'2s' 1 de PAR por 7 dias. Os embriões com calos são então transferidos (<12/placa) para o Meio de Seleção II, que é compreendido de Meio de Repouso (acima descrito) com 500 nM de Ácido R-Haloxifop (0,181 mg/L). As placas são retornadas para as caixas limpas e incubadas a 27 Ό com luz contínua a aproximadamente 50 pmol rrf2s'1 de PAR por 14 dias. Esta etapa de seleção permite que o calo transgênico prolifere-se adicionalmente e se diferencie.

[00273] Os calos embriogênicos, que se proliferam, são transferidos (<9/placa) para o Meio de Pré-Regeneração. O Meio de Pré-Rege-neração contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas de MS Modificadas; 45 g/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgN03; 0,25 g/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6-benzi-laminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 2,5 g/L de GELZAN®; e 0,181 mg/L de Ácido haloxifop; em pH 5,8. As placas são armazenadas em caixas limpas e incubadas a 27 D com luz contínua a aproximadamente 50 pmol rrf2s'1 de PAR por 7 dias. Os calos de regeneração são então transferidos (<6/placa) para o Meio de Regeneração em PHYTATRAYS® (SIGMA-ALDRICH) e incubados a 28 Ό com 16 horas de luz/8 horas de escuridão por dia (a aproximadamente 160 pmol m'2s'1 de PAR) por 14 dias ou até que os brotos e as raízes se desenvolvessem. O Meio de Regeneração contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISÜ de Vitaminas de MS Modificadas; 60 g/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3 g/L de goma GEL-LAN®; e 0,181 mg/L de Ácido R-haloxifop; em pH 5,8. Os pequenos brotos com raízes primárias são então isolados e transferidos para o Meio de Alongamento, sem seleção. O Meio de Alongamento contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU de Vitaminas de MS Modificadas; 30 g/L de sacarose; e 3,5 g/L de GELRITE®, em pH 5,8.

[00274] Os brotos das plantas transformados, selecionados por sua capacidade de crescer sobre meio contendo Haloxifop, são transplantados do PHYTATRAYS® para pequenos potes enchidos com meio de crescimento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), cobertos com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS), e então fortalecidos em uma câmara de crescimento CONVIRON (27 Ό ao dia/24 Ό à noite, fotoperíodo de 16 horas, 50-70% de UR, 200 pmol m'2s'1 de PAR). Em algumas situações, as plantinhas transgênicas putativas são analisadas quanto ao número de cópias relativa de transgene por ensaios de PCR em tempo real, quantitativos, usando iniciadores projetados para detectar o gene de tolerância ao herbicida de AAD1, integrado no genoma do milho. Ademais, os ensaios de RT-qPCR são usados para detectar a presença da sequência ligadora e/ou da se-quência-alvo nos transformantes putativos. As plantinhas transformadas selecionadas são então movidas para uma estufa, para o crescimento adicional e o teste.

[00275] Transferência e estabelecimento das plantas Tn na estufa para o bioensaio e a produção de sementes. Quando as plantas atin- gem o estágio V3-V4, elas são transplantadas em mistura para solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e desenvolvidas até a floração, na estufa (Tipo de Exposição de Luz: Foto ou Assimilação; Limite de Luz Alto: 1200 de PAR; duração de 16 horas por dia; 27 Ό ao dia/24 Ό à noite).

[00276] As plantas a serem usadas para os bioensaios com insetos são transplantadas dos pequenos potes para os TINUS® 350-4 ROO-TRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canadá;) (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias após a transplantação para os ROOTRAINERS®, as plantas são infestadas para o bioensaio.

[00277] As plantas da geração T-ι são obtidas por polinização dos fios de seda das plantas transgênicas T0 com o pólen coletado das plantas da linhagem endógama não transgênica B104 ou outros doadores de pólen apropriados, e plantio das sementes resultantes. Os cruzamentos recíprocos são efetuados quando possíveis. EXEMPLO 7: Análises Moleculares dos Tecidos de Milho Trans-gênicos [00278] As análises moleculares (por exemplo, RT-qPCR) dos tecidos do milho são efetuadas sobre amostras das folhas que foram coletadas das plantas desenvolvidas em estufas no dia antes ou no mesmo dia que o dano da alimentação da raiz é avaliado.

[00279] Os resultados dos ensaios por RT-qPCR para o gene-alvo são usados para validar a expressão do transgene. Os resultados dos ensaios por RT-qPCR para a sequência interveniente entre as sequências de repetição (que é integral à formação das moléculas de dsRNA hairpin) nos RNAs expressos são alternativamente usados para validar a presença de transcritos hairpin. Os níveis da expressão do RNA do transgene são medidos em relação aos níveis de RNA de um gene de milho endógeno.

[00280] As análises do DNA por qPCR para detectar uma parte da região de codificação de AAD1 no gDNA são usadas para estimar o número de cópias de inserção do transgene. As amostras para estas análises são coletadas das plantas desenvolvidas em câmaras ambientais. Os resultados são comparados com os resultados da qPCR do DNA dos ensaios projetados para detectar uma parte de um gene nativo de uma única cópia, e os eventos simples (tendo uma ou duas cópias de transgenes de rpll215) são promovidos para mais estudos na estufa.

[00281] Adicionalmente, os ensaios por qPCR projetados para detectar uma parte do gene de resistência à espectinomicina (SpecR; contido sobre os plasmídios de vetores binários fora do T-DNA) são usados para determinar se as plantas transgênicas contêm sequências de suporte de plasmídio integradas irrelevantes.

[00282] Nível de expressão do transcrito de RNA: qPCR do alvo. As plantas transgênicas são analisadas por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) da sequência-alvo, para determinar o nível de expressão relativo do transgene, em comparação com o nível de transcrito de um gene do milho interno (por exemplo, No. de Acesso do GENBANK BT069734), que codifica uma proteína ΤΙP41 -like (isto é, um homólogo do milho de No. de Acesso do GENBANK AT4G34270; tendo uma pontuação no tBLASTX de 74% de identidade). O RNA é isolado usando o Kit de Isolamento de RNA Total Norgen BioTek® (Norgen, Thorold, ΟΝ). O RNA total é submetido a um tratamento com DNasel On-Column® de acordo com o protocolo sugerido do kit. O RNA é então quantificado sobre um espectrofotômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e a concentração é normalizada para 50 ng/pL. O cDNA de primeira fita é preparado usando um kit de síntese de cDNA de Alta Capacidade (INVITROGEN), em um volume de reação de 10 pL, com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado do fabricante. O protocolo é modificado ligeiramente para incluir a adição de 10 pL de 100 μΜ de oligonucleotídeo T20VN (IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C, ou G, e N é A, C, G, ou T; SEQ ID NO:56) no tubo de 1 mL da mistura de estoque de iniciadores aleatórios, para preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios e oligo dT combinados.

[00283] Após a síntese do cDNA, as amostras são diluídas 1:3 com água sem nuclease, e armazenadas a -20°C até serem testadas.

[00284] Os ensaios de PCR em tempo real separados, para o gene-alvo e o transcrito de TIP41 -like, são efetuados sobre um LIGHTCYCLER® 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianápolis, IN) em volumes de reação de 10 pL. Para o ensaio do gene-alvo, as reações são corridas com os Iniciadores rpl 1215 FWD Set 1 (SEQ ID NO:57) e rpl 1215 REV Set1 (SEQ ID NO:58), e uma sonda da IDT Custom Oligo rpl 1215 PRB Set1, marcada com FAM e duplamente inibida com os inibidores Zen e lowa Black. Para o ensaio do gene de referência de TIP41 -like, são usados os iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO:59) e Tl-PmxR (SEQ ID NO:60), e a Sonda HXTIP (SEQ ID NO:61) marcada com HEX (hexaclorofluoresceína).

[00285] Todos os ensaios incluem controles negativos de nenhum molde (mistura somente). Para as curvas padrões, um branco (água em fonte nascente) é também incluído na placa fonte, para checar quanto à contaminação cruzada da amostra. As sequências dos iniciadores e da sonda são apresentadas na Tabela 6. As fórmulas dos componentes da reação para a detecção dos diversos transcritos são descritas na Tabela 7, e as condições da reação PCR são resumidas na Tabela 8. A porção fluorescente da FAM (6-Carbóxi Fluoresceína Amidita) é excitada a 465 nm e a fluorescência é medida a 510 nm; os valores correspondentes para a porção fluorescente da HEX (hexaclorofluoresceína) são 533 nm e 580 nm.

Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeos usadas para as análises moleculares dos níveis de transcrito no milho transgênico. *Proteína TIP41-like.

Tabela 7. Fórmulas da reação PCR para a detecção do transcrito.

Tabela 8. Condições do termociclador para a qPCR do RNA.

[00286] Os dados são analisados usando o Software LIGHTCY-CLER® v1.5, por quantificação relativa, usando um segundo algoritmo max derivativo para o cálculo dos valores de Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para as análises da expressão, os valores da expressão são calculados usando o método de AACt (isto é, 2-(Cq ALVO - Cq REF)), que se vale da comparação das diferenças dos valores de Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 sendo selecionado sob a suposição que, para as reações PCR otimizadas, o produto duplica-se a cada ciclo.

[00287] Tamanho e integridade do transcrito: Ensaio de Northern Blot. Em algumas situações, a caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida pelo uso da análise por Northern Blot (blot de RNA), para determinar o tamanho molecular do dsRNA hairpin de rpíl215 em plantas transgênicas expressando um dsRNA hairpin de rpll215.

[00288] Todos os materiais e equipamento são tratados com RNaseZAP (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. As amostras de tecidos (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos de 2 mL SAFE-LOCK EPPENDORF, rompidas com um pulverizador de tecido KLECKO® (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) com três glóbulos de tungstênio em 1 mL de TRIZOL (INVITROGEN), por 5 min, então incubadas na temperatura ambiente (TA) por 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas por 10 min, a 4 Om a 11.000 rpm, e o sobrenadante é transferido para um tubo de 2 mL novo SA-FELOCK EPPENDORF. Após 200 pL de clorofórmio serem adicionados ao homogeneizado, o tubo é misturado por inversão, por 2 a 5 min, incubado na TA por 10 minutos, e centrifugado a 12.000 x g por 15 min, a 4 Ό. A fase de topo é transferida para um tubo de 1,5 mL estéril EPPENDORF, 600 pL de isopropanol a 100% são adicionados, seguidos por incubação na TA por 10 min até 2 h, então centrifugou-se a 12.000 x g por 10 min, a 4 Ό até 25 Ο. O sobren adante é descartado e a pelota de RNA é lavada duas vezes com 1 ml_ de etanol a 70%, com centrifugação a 7.500 x g por 10 min, a 4 Ό até 25 O, entre as lavagens. O etanol é descartado e a pelota é, por curto tempo, secada ao ar por 3 a 5 min, antes da suspensão novamente em 50 pL de água sem nuclease.

[00289] O RNA total é quantificado usando o NANODROP 8000® (THERMO-FISHER) e as amostras são normalizadas para 5 pg/10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) são então adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura de marcadores padrões de RNA DIG (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianápolis, IN) são distribuídos e adicionados a um volume igual de glioxal. As amostras e os RNAs marcadores são desnaturados a 50 Ό por 45 min e armazenados sobre gelo até o carregamento sobre um gel de agarose a 1,25% SEAKEM GOLD (LONZA, Allendale, NJ) em tampão de corrida de glioxal NORTHERNMAX 10 X (AMBION/INVITROGEN). Os RNAs são separados por eletroforese a 65 volts/30 mA por 2 horas e 15 minutos.

[00290] Após a eletroforese, o gel é enxaguado em 2X SSC por 5 min e tem sua imagem formada sobre uma estação GEL DOC (BIO-RAD, Hercules, CA), então o RNA é passivamente transferido para uma membrana de náilon (MILLIPORE) durante a noite, na TA, usando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste em 3 M de cloreto de sódio e 300 M de citrato de trissódio, pH 7,0). Após a transferência, a membrana é enxaguada em 2X SSC por 5 minutos, o RNA é reticulado por UV à membrana (AGILENT/STRATAGENE), e a membrana é deixada secar na temperatura ambiente por até 2 dias.

[00291] A membrana é pré-hibridizada em tampão ULTRAHY® (AMBION/INVITROGEN) por 1 a 2 h. A sonda consiste em um produto amplificado por PCR contendo a sequência de interesse (por exemplo, a parte da sequência sem sentido de SEQ ID NOs:7-9 ou 117, confor- me apropriado), marcado com digoxigenina por meio de um procedimento DIG da ROCHE APPLIED SCIENCE. A hibridização no tampão recomendado é durante a noite, em uma temperatura de 60 Q, em tubos de hibridização. Após a hibridização, o blot é submetido às lavagens com DIG, coberto, exposto ao filme por 1 a 30 minutos, então o filme é revelado, tudo por métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.

[00292] Determinação do número de cópias de transqene. Pedaços das folhas do milho aproximadamente equivalentes a 2 perfurações das folhas são coletados em placas de coleta de 96 poços (QIAGEN). O rompimento do tecido é efetuado com um pulverizador de tecido KLECK® (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (fornecido com um KIT DE PLANTA BIOS-PRINT96 IT; QIAGEN), com um glóbulo de aço inoxidável. Após a ma-ceração do tecido, o gDNA é isolado no formato de alto rendimento usando um KIT DE PLANTA BIOSPRINT96 e um robô de extração BIOSPRINT96. O gDNA é diluído 1:3 DNA:água antes de configurar a reação qPCR.

[00293] Análise por qPCR. A detecção do transgene por ensaio de sonda de hidrólise é efetuada por PCR em tempo real usando um sistema LIGHTCYCLER®480. Os oligonucleotídeos a serem usados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar o gene-alvo (por exemplo, rp215), a sequência ligadora, e/ou para detectar uma parte do gene de SpecR (isto é, o gene de resistência à espectinomicina transportado sobre os plasmídios de vetores binários; SEQ ID NO:62; oligonucleotídeos de SPC1 na Tabela 9), são projetados usando o LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Ademais, os oligonucleotídeos a serem usados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância ao herbicida de AAD-1 (SEQ ID NO:63; oligonucleotídeos de GAAD1 na Tabela 9) são proje- tados usando o software INICIADOR EXPRESS (APPLIED BIOSYS-TEMS). A Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e das sondas. Os ensaios são diversificados com reagentes para um gene cro-mossômico do milho endógeno (Invertase (SEQ ID NO:64; No. de Acesso do GENBANK: U16123; referido neste documento como IVR1), que serve como uma sequência de referência interna para garantir que o gDNA está presente em cada ensaio. Para a amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (ROCHE APPLIED SCIENCE) é preparada em concentração final de 1x em uma reação multiplex de 10 pL de volume contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação de duas etapas é efetuada conforme resumido na Tabela 11. A ativação do flu-oróforo e a emissão para as sondas marcadas com FAM e HEX são como descritas acima; os conjugados de CY5 são excitados de modo máximo a 650 nm e apresentam fluorescência de modo máximo a 670 nm.

[00294] As pontuações de Cp (o ponto no qual o sinal de fluorescência cruza o limite básico) são determinadas a partir de dados da PCR em tempo real, usando o algoritmo de pontos de adaptação (LIGHTCYCLER® SOFTWARE release 1.5) e o módulo Relative Quant (baseado no método de AACt). Os dados são gerenciados conforme descrito anteriormente (acima; qPRC de RNA).

Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) usadas para as determinações do número de cópias de genes e a detecção de suporte de plasmídio de vetor binário. CY5 = Cianina-5 Tabela 10. Componentes da reação para as análises dos números de cópias de genes e a detecção de suporte de plasmídio. *NA = Não Aplicável **ND = Não Determinado(a) Tabela 11. Condições do termociclador para a qPCR do DNA. EXEMPLO 8: Bioensaio do Milho Transgênico [00295] Bioensaios com Insetos. A bioatividade do dsRNA da presente invenção, produzida nas células das plantas, é demonstrada por métodos de bioensaios. Ver, por exemplo, Baum e col. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. Pode-se ser capaz de demonstrar a eficácia, por exemplo, alimentando-se diversos tecidos de plantas, ou pedaços de tecidos derivados de uma planta que produz um dsRNA inseticida, aos insetos-alvo, em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados a partir de diversos tecidos de plantas derivados de uma planta que produz o dsRNA inseticida, e os ácidos nucleicos extraídos são distribuídos sobre o topo das dietas artificiais para os bioensaios, conforme anteriormente descrito neste documento. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com bioensaios similarmente conduzidos, que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida, ou com outras amostras de controle. O crescimento e a sobrevivência dos insetos-alvo na dieta de teste são reduzidos em comparação com aqueles do grupo de controle.

[00296] Bioensaios com Insetos com Eventos de Milho Transqêni-cos. Duas larvas da lagarta da raiz do milho ocidental (1 a 3 dias de idade), eclodidas de ovos lavados, são selecionadas e colocadas em cada poço da bandeja de bioensaio. Os poços são então cobertos com uma cobertura de tiras "PULL Ν' PEEL" (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocados em uma incubadora a 28°C, com um ciclo de luz/escuridão de 18 h/6 h. Nove dias após a infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto à mortalidade, que é calculada como a porcentagem de insetos mortos do número total de insetos em cada tratamento. As amostras de insetos são congeladas a -20 °C por dois dias, então as larvas dos insetos de cada tratamento são reunidas e pesadas. A porcentagem de inibição do crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais, dividido pela média do peso médio de dois tratamentos do poço de controle. Os dados são expressos como uma Porcentagem da Inibição do Crescimento (dos controles negativos). Os pesos médios que excederem o peso médio de controle são normalizados para zero.

[00297] Bioensaios com Insetos na estufa. Os ovos da lagarta da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) são recebidos no solo da CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Os ovos da WCR são incubados a 280 por 10 a 1 1 dias. Os ovos são lavados do solo, colocados em uma solução de ágar a 0,15%, e a concentração é ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 ml_. Uma placa de eclosão é estabelecida em uma placa de Petri com uma alíquota da suspensão de ovos, para monitorar as taxas de eclosão.

[00298] O solo em torno das plantas de milho que crescem nos ROOTRANERS® é infestado com 150 a 200 ovos da WCR. Os insetos são deixados alimentarem-se por 2 semanas, após cujo tempo uma "Classificação da Raiz" é dada a cada planta. Uma Escala de Lesão ao Nó é utilizada para a classificação, essencialmente de acordo com Oleson e col. (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8. As plantas que são aprovadas neste bioensaio, mostrando lesão reduzida, são transplantadas para potes de 19 litros (5 galões) para a produção das sementes. Os transplantes são tratados com inseticida para impedir o dano adicional pela lagarta da raiz e a liberação dos insetos nas estufas. As plantas são polinizadas com as mãos para a produção das sementes. As sementes produzidas por estas plantas são guardadas para a avaliação na geração T-ι e nas gerações subsequentes das plantas.

[00299] As plantas de controle negativas transgênicas são geradas por transformação com vetores contendo genes projetados para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP). As plantas de controle negativas não transformadas são desenvolvidas a partir de sementes de variedades do milho parentais, a partir das quais as plantas transgênicas foram produzidas. Os bioensaios são conduzidos com os controles negativos incluídos em cada grupo de materiais de plantas. EXEMPLO 9: Zea mays Transgênica Compreendendo Sequências de Pragas Coleópteras [00300] 10-20 plantas Zea mays T0 transgênicas são geradas conforme descrito no EXEMPLO 6. 10-20 linhagens adicionais independentes de Zea mays T1f que expressam o dsRNA hairpin para um constructo de RN Ai, são obtidas para a provocação da lagarta da raiz do milho. O dsRNA hairpin compreende uma parte da SEQ ID NO:95, da SEQ ID NO:96, da SEQ ID NO:97, e/ou da SEQ ID NO:118 (por exemplo, o dsRNA hairpin transcrito da SEQ ID NO: 124). Os dsRNAs hairpin adicionais são derivados, por exemplo, de sequências das pragas coleópteras, tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730), ROP (Pedido de Patente U.S. No. 14/577.811), RNAPII140 (Pedido de Patente U.S. No. 14/577.854), Dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), nem (Pedido de Patente U.S. No. 62/095487), COPI alpha (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gama (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), ou COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216). Estas são confirmadas através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular.

[00301] As preparações de RNA total a partir de linhagens Ti independentes selecionadas são opcionalmente usadas para a RT-PCR com iniciadores projetados para ligar no ligador do cassete de expressão hairpin em cada um dos constructos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado, requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene-aivo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA hairpin dos genes-alvo no siRNA é subsequentemente confirmado, de modo opcional, em linhagens transgêni-cas independentes usando hibridizações de blots de RNA.

[00302] Além disso, as moléculas de RNAi tendo sequências de emparelhamento ruim com mais do que 80% de identidade da sequência com genes-alvo afetam as lagartas das raízes do milho em um modo similar àquele visto com as moléculas de RNAi tendo 100% de identidade da sequência com os genes-alvo. O emparelhamento da sequência de emparelhamento ruim com as sequências nativas para formar um dsRNA hairpin no mesmo constructo de RNAI libera siRNAs processados nas plantas capazes de afetar o crescimento, o desenvolvimento, e a viabilidade das pragas coleópteras que se alimentam.

[00303] A distribuição in planta de dsRNA, siRNA, ou mi RNA correspondendo aos genes-alvo e a absorção subsequente por pragas coleópteras através da alimentação resultam na infrarregulação dos genes-alvo na praga coleóptera através do silenciamento do gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene-alvo for importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento e/ou o desenvolvimento da praga coleóptera são afetados, e no caso de pelo menos uma de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. spe-ciosa Germar, D. u. tenella, e D. u. undecimpunctata Mannerheim, resultam no fracasso de infestar, alimentar, e/ou se desenvolver com êxito, ou resultam na morte da praga coleóptera. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem sucedida do RNAi são então usadas para controlar as pragas coleópteras.

[00304] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transqêni-cas e a Zea mays não transformada. Os genes ou as sequências das pragas-alvo coleópteras, selecionadas para criar dsRNA hairpin, não têm nenhuma similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Consequentemente, não se espera que a produção ou a ativação do RNAi (sistêmico) por constructos que alvejam estes genes ou sequências de pragas coleópteras tenha qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. Entretanto, as características de desenvolvimento e morfológicas das linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformadas, assim como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene expressando hairpin. As características de raiz, broto, folhagem e reprodução das plantas são comparadas. As características de broto da planta, tais como a altura, o número e o tamanho das folhas, o tempo de floração, o tamanho e o aspecto da flor, são registradas. Em geral, não há nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão das molécu-las-alvo de iRNA, quando cultivadas in vitro e no solo na estufa. EXEMPLO 10: Zea mays Transgênica Compreendendo uma Sequência da Praga Coleóptera e Constructos de RNAi Adicionais [00305] Uma planta Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma, que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo que não uma praga coleóptera, é transformada secundariamente por meio das metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS® (ver Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67), para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo a SEQ ID NO:1, a SEQ ID NO:3, e/ou a SEQ ID NO:5). Os vetores de plasmídios de transformação de plantas, preparados essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 4, são distribuídos por meio de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS® nas células em suspensão do milho ou nos embriões do milho imaturos, obtidos de uma planta transgênica Zea mays Hi II ou B104 compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma, que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo que não uma praga coleóptera. EXEMPLO 11: Zea mays Transgênica Compreendendo um Cons-tructo de RNAi e Sequências de Controle de Pragas Coleópteras Adicionais [00306] Uma planta transgênica Zea mays compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma, que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo de praga coleóptera (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo a SEQ ID NO:1, a SEQ ID NO:3, e/ou a SEQ ID NO:5), é secundariamente transformada por meio das metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS® (ver Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67), para produzir uma ou mais moléculas de proteínas inseticidas, por exemplo, as proteínas inseticidas Cry3, Cry34 e Cry35. Os vetores de plasmídios de transformação de plantas, preparados essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 4, são distribuídos por meio dos métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS® nas células em suspensão de milho ou em embriões do milho imaturos, obtidos de uma planta transgênica Zea mays B104 compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma, que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo de praga coleóptera. São obtidas plantas duplamente transformadas, que produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle de pragas coleópteras. EXEMPLO 12: Triagem dos Genes-Alvo Candidatos no Pentato-mídeo Marrom Neotropical (Euschistus heros) [00307] Colônia de Pentatomídeo Marrom Neotropical (BSB; Eus- chistus heros). Os BSB foram criados em uma incubadora a 27 O, em 65% de umidade relativa, com um ciclo de luz: escuridão de 16: 8 horas. Um grama dos ovos coletados durante 2-3 dias foi semeado em recipientes de 5 L, com discos de papéis de filtro no fundo, e os recipientes foram cobertos com malha no. 18 para a ventilação. Cada recipiente de criação produziu aproximadamente 300-400 BSB adultos. Em todos os estágios, os insetos forma alimentados com vagens frescas, três vezes por semana, um sachê de misturas de sementes que continha sementes de girassol, sojas, e amendoins (razão em peso de 3:1:1) foi substituído uma vez por semana. A água foi adicionada em frascos pequenos com chumaços de algodão como pavios. Após as duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos para um novo recipiente uma vez por semana.

[00308] Dieta artificial dos BSB. Uma dieta artificial dos BSB foi preparada como se segue. As vagens verdes liofilizadas foram misturadas até um pó fino em um misturador MAGIC BULLET®, enquanto os amendoins crus (orgânicos) eram misturados em um misturador MA-GIC BULLET® separado. Os ingredientes secos misturados foram combinados (porcentagens em peso: vagens, 35%; amendoins, 35%; sacarose, 5%; Complexo de vitaminas (por exemplo, Mistura de Vitaminas Vanderzant para insetos, SIGMA-ALDRICH, Catálogo No. V1007), 0,9%), em um grande misturador MAGIC BULLET®, que foi tampado e agitado bem para misturar os ingredientes. Os ingredientes secos misturados foram então adicionados a um recipiente de mistura. Em um recipiente separado, a água e o agente antifúngico benomil (50 ppm; 25 pL de uma solução a 20.000 ppm/50 mL de solução de dieta) foram misturados bem, e então adicionados à mistura de ingredientes secos. Todos os ingredientes foram misturados manualmente até que a solução estivesse totalmente misturada. A dieta foi moldada nos tamanhos desejados, embrulhada frouxamente em folha de alumínio, aquecida por 4 horas a 60Q, e então esfriada e arm azenada a 4Q. A dieta artificial foi usada dentro de duas semanas da preparação.

[00309] Agrupamento do transcritoma dos BSB. Seis estágios de desenvolvimento dos BSB foram selecionados para as preparações das bibliotecas de mRNA. O RNA total foi extraído de insetos congelados a -70Ό, e homogeneizado em 10 volumes de Tampão de Li-se/Ligação em tubos de 2 mL de Lise MATRIX A (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA) sobre um Instrumento FastPrep®-24 (MP BIOMEDI-CALS). O mRNA total foi extraído usando um Kit de Isolamento de miRNA mirVana® (AMBION; INVITROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O sequenciamento do RNA usando um sistema illumina® HiSeq® (San Diego, CA) proporcionou as sequências de genes-alvo candidatas para uso na tecnologia de controle de insetos de RN Ai. O HiSeq® gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram agrupadas individualmente para cada amostra usando o software de uso geral TRINITY® (Grabherr e col. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). Os transcritos agrupados foram combinados para gerar um transcritoma agrupado. Este transcritoma agrupado dos BSB continha 378.457 sequências.

[00310] Identificação do ortóloqo de mll215 de BSB. Uma busca por tBLASTn do transcritoma agrupado dos BSB foi efetuada usando, como consulta, Drosophila rpll215 (No. de Acesso do GENBANK da sequência de proteínas ABI30983). O BSB rpll215-1 (SEQ ID NO:77), o BSB rpII215-2 (SEQ ID NO:79), o BSB rpll215-3 (SEQ ID NO:81) foram identificados como genes-alvos de rpll215 candidatos de Euschis-tus heros, cujos produtos têm as sequências de peptídeos preditas; SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, e SEQ ID NO:82, respectivamente.

[00311] Preparação do molde e síntese do dsRNA. O cDNA foi preparado a partir do RNA total de BSB extraído de um único inseto adulto jovem (cerca de 90 mg), usando o Reagente TRIzol® (LIFE TECH- NOLOGIES). O inseto foi homogeneizado na temperatura ambiente, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml_, com 200 μΙ_ de TRIzol®, usando um pilão de pelotas (FISHERBRAND, Catálogo No. 12-141-363) e um Misturador de Motor de Pilão (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Após a homogeneização, uns 800 pL adicionais de TRIzol® foram adicionados, o homogeneizado foi redemoinhado, e então incubado na temperatura ambiente por cinco minutos. Os fragmentos de células foram removidos por centrifugação, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Após o protocolo de extração com TRIzol® recomendado pelo fabricante, para 1 ml_ de TRIzol®, a pelota de RNA foi secada na temperatura ambiente e suspensa novamente em 200 pL de Tampão de Tris a partir de um kit de DNA de PCR e de Extração em Gel GFX (ilustra®; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES), usando o Tampão de Eluição Tipo 4 (isto é, 10 mM de Tris-HCI; pH 8,0). A concentração de RNA foi determinada usando um espectrofotômetro Na-noDrop® 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

[00312] Amplificação do cDNA. O cDNA foi transcrito invertido a partir de 5 pg de molde de RNA total de BSB e iniciador de oligo dT, usando um SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SÍNTESE SYSTEM® para a RT-PCR (INVITROGEN), seguindo o protocolo recomendado do fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi levado para 100 pL com água sem nuclease.

[00313] Os iniciadores como mostrados na Tabela 12 foram usados para amplificar BSB _rpll215-1 regí, BSB _rpll215-2 regí, e BSB_rpll215-3 regí. O molde de DNA foi amplificado por PCR touch-down (temperatura de anelamento diminuída de 60 Ό para 50 Ό, em uma diminuição de 1 Ό/ciclo), com 1 pL de cDNA (acima descrito) como o molde. Os fragmentos compreendendo um segmento de 490 bp de BSB_rp//275-1 regí (SEQ ID NO:83), um segmento de 369 bp de BSB_rpll215-2 regí (SEQ ID NO:84), e um segmento de 491 bp de BSB_rpll215-3 regí (SEQ ID NO:85) foram gerados durante 35 ciclos de PCR. O procedimento acima mencionado foi também usado para amplificar um molde de controle negativo de 301 bp de YFPv2 (SEQ ID NO:92), usando os iniciadores YFPv2-F (SEQ ID NO:93) e YFPv2-R (SEQ ID NO:94). Os iniciadores BSB_ rpll215-1 regí, BSB_ rpll215-2 regí, BSB_ rpll215-3 regí, e YFPv2 continham uma sequência promotora de fago T7 (SEQ ID NO: 10) em suas extremidades de 5' e, desse modo, capacitou o uso de fragmentos de DNA de YFPv2 e BSB_rpll215 para a transcrição de dsRNA.

Tabela 12. Iniciadores e Pares de Iniciadores usados para amplificar partes das regiões de codificação dos genes-alvo de rpll215 ilustrativos e um gene de controle negativo de YFP.

[00314] Síntese do dsRNA. O dsRNA foi sintetizado usando 2 pL de produto da PCR (acima mencionado) como o molde ,com um kit de RNAi de T7 MEGAscript® (AMBION) usado de acordo com as instruções do fabricante. Ver a FIG. 1. O dsRNA foi quantificado em um es- pectrofotômetro NANODROP® 8000, e diluído para 500 ng/pL em 0,1X tampão de TE sem nuclease (1 mM de Tris HCL, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4).

[00315] Iniecão de dsRNA no hemocele dos BSB. Os BSB foram criados sobre uma dieta de vagem e semente, como a colônia, em uma incubadora a 27 Ό, a 65% de umidade relativa e fotoperíodo de luz: escuridão de 16:8 horas. As ninfas do segundo instar (cada uma pesando 1 a 1,5 mg) foram suavemente manuseadas com uma pequena escova, para impedir a lesão, e foram colocadas em uma placa de Petri sobre gelo, para esfriar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL de solução de dsRNA a 500 ng/pL (isto é, 27,6 ng de dsRNA; dosagem de 18,4 a 27,6 pg/g de peso do corpo). As injeções foram efetuadas usando um injetor NANOJECT® II (DRUM-MOND SCIENTIFIC, Broomhall, PA), equipado com uma agulha de injeção puxada de um capilar de vidro Drummond, 9 cm (3,5 polegadas), #3-000-203-G/X OK. A ponta da agulha foi quebrada, e o capilar foi reabastecido com óleo mineral leve e então enchido com 2 a 3 pL de dsRNA. O dsRNA foi injetado no abdômen das ninfas (10 insetos injetados por dsRNA por ensaio), e os ensaios foram repetidos em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por poço) foram transferidos para bandejas de 32 poços (Bio-RT-32 Rearing Tray; BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo uma pelota de dieta artificial de BSB, e cobertos com tiras Pull-N- Peel® (BIO-CV-4; BIO-SERV). A umidade foi fornecida por meio de 1,25 ml_ de água em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml_, com um pavio de algodão. As bandejas foram incubadas a 26,5Ό, 60% de umidade, e fotoperíodo de luz: escuridão de 16: 8 horas. As contagens de viabilidade e os pesos foram obtidos no dia 7 após as injeções.

[00316] O BSB rpll215 é um alvo de dsRNA letal. Conforme resumido na Tabela 13, em cada réplica, pelo menos dez ninfas de BSB do 2o instar (1-1,5 mg cada) foram injetadas no hemoceie com 55,2 nL de dsRNA de BSB_rpll215-1 regí, BSB_ rpll215-2 regí, ou BSB_ rpll215-3 regí (500 ng/pL), para uma concentração final aproximada de 18,4 - 27,6 pg de dsRNA/g de inseto. A mortalidade determinada para o dsRNA de BSB_rpll215-1 regí e BSB_ rpll215-2 regí foi maior do que aquela observada com a mesma quantidade de dsRNA de YFPv2 injetado (controle negativo). A mortalidade determinada para BSB_rpll215-1 regí e BSB_ rpll215-2 regí foi significativamente diferente, com p <0,05 (teste t de Student).

Tabela 13. Resultados da injeção de dsRNA de BSB rpll215 no hemoceie de ninfas de Pentatomídeos Marrons Neotropi-cais, sete dias após a injeção. *Dez insetos injetados por ensaio para cada dsRNA. **Erro padrão da média ***Significativamente diferente do controle de dsRNA de YFPv2 usando um teste t de Student. (p<0,05).

Exemplo 13: Zea mays Transgênicas Compreendendo Sequências das Pragas Hemípteras [00317] Dez a 20 plantas Zea mays T0 transgênicas, contendo vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo qualquer parte das SEQ ID NOs:77, 79, e/ou 81 (por exemplo, SEQ ID NOs:83-85), são geradas conforme descrito no EXEMPLO 4. Umas 10-20 linhagens independentes de Zea mays Tadicionais, expressando o dsRNA hairpin para um constructo de RNAi, são obtidas para a provocação dos BSB. Os dsRNAs hairpin são derivados, compreendendo uma parte das SEQ ID NOs:77, 79, e/ou 81 ou os seus fragmentos (por exem- pio, SEQ ID NOs:83-85). Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA total a partir das linhagens T·, independentes selecionadas são opcionalmente usadas para a RT-PCR, com iniciadores projetados para ligar no intron ligador do cassete de expressão de hairpin em cada um dos constructos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado, requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene-alvo confirma a expressão do RNA hairpin em cada planta Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA hairpin dos genes-alvo no siRNA é subsequentemente confirmado, de modo opcional, nas linhagens transgênicas independentes, usando hibridizações de blots de RNA.

[00318] Além disso, as moléculas de RNAi tendo sequências de emparelhamento ruim com mais do que 80% de identidade da sequência com genes-alvo afetam os hemípteros em um modo similar àquele visto com as moléculas de RNAi tendo 100% de identidade da sequência com os genes-alvo. O emparelhamento da sequência de emparelhamento ruim com as sequências nativas para formar um dsRNA hairpin no mesmo constructo de RNAI libera siRNAs processados nas plantas capazes de afetar o crescimento, o desenvolvimento, e a viabilidade das pragas hemípteras que se alimentam.

[00319] A distribuição in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA, ou miRNA correspondendo aos genes-alvo e a absorção subsequente por pragas hemípteras através da alimentação resultam na infrarregu-lação dos genes-alvo na praga hemíptera através do silenciamento do gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene-alvo for importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento e/ou a sobrevivência da praga hemíptera são afeta- dos, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, E. servus, Ne-zara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chinavia hilare, C. marginatum, Dichelops melacandesse modo, D. furcatus; Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegaíotomus parvus, Leptoglossus zona-tus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e L. lineolaris, resultam no fracasso de infestar, alimentar, e/ou se desenvolver com êxito, e/ou resultam na morte da praga hemíptera. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem sucedida do RNAi são então usadas para controlar as pragas hemípteras.

[00320] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transqêni-cas e a Zea mavs não transformada. Os genes ou as sequências das pragas-alvo hemípteras, selecionadas para criar dsRNA hairpin, não têm nenhuma similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Consequentemente, não se espera que a produção ou a ativação do RNAi (sistêmico) por constructos que alvejam estes genes ou sequências de pragas hemípteras tenha qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. Entretanto, as características de desenvolvimento e morfológicas das linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformadas, assim como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene expressando hairpin. As características de raiz, broto, folhagem e reprodução das plantas são comparadas. Não há nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento e crescimento das raízes das plantas transgênicas e não transformadas. As características de broto da planta, tais como a altura, os números e os tamanhos das folhas, o tempo de floração, o tamanho e o aspecto da flor, são similares. Em geral, não há nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão das molécu-las-alvo de iRNA, quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

Exemplo 14: Glycine max Transgênica Compreendendo Sequências de Pragas Hemípteras [00321] Dez a 20 plantas Glycine max T0 transgênicas, contendo vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo uma parte das SEQ ID NOs:77, 79, 81, ou os seus segmentos (por exemplo, SEQ ID NOs:83-85), são geradas como se conhece na técnica, incluindo, por exemplo, através de transformação mediada por Agrobacte-rium, como se segue. As sementes de soja maduras (Glycine max) são esterilizadas durante a noite, com gás cloro, por dezesseis horas. Após a esterilização com o gás cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto, em uma capela de fluxo Laminar®, para dispersar o gás cloro. A seguir, as sementes esterilizadas são absorvidas com H20 estéril por dezesseis horas, no escuro, usando uma caixa preta, a 24 *C.

[00322] Preparação das soias com sementes divididas. A semente da soja dividida compreendendo uma porção de um protocolo de eixo embrionário requer a preparação do material de semente de soja, o qual é cortado longitudinalmente, usando uma lâmina no. 10 afixada a um escalpelo, ao longo do hilo da semente, para separar e remover a cobertura da semente, e para dividir a semente em duas seções de cotilédone. Faz-se atenção cuidadosa para remover parcialmente o eixo embrionário, onde cerca de 1/2 - 1/3 do eixo embrionário permanece unido à extremidade nodal do cotilédone.

[00323] Inoculação. As sementes de soja divididas, compreendendo uma porção parcial do eixo embrionário, são então imersas, por cerca de 30 minutos, em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo um plasmídio binário compreendendo as SEQ ID NOs:77, 79, 81, e/ou os seus segmentos (por exemplo, as SEQ ID NOs:83-85). A solução de A. tumefaciens é diluída até uma concentração final de λ=0,6 OD65o, antes de imergir os cotilédones compreendendo o eixo embrionário.

[00324] Cocultivo. Após a inoculação, a semente de soja dividida é deixada cocultivar com a cepa de Agrobacterium tumefaciens por 5 dias, sobre meio de cocultivo (Agrobacterium Protocols, vol. 2, 2a Ed., Wang, K. (Ed.) Humana Press, New Jersey, 2006), em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro.

[00325] Indução do broto. Após 5 dias de cocultivo, as sementes de soja divididas são lavadas em meio de Indução do Broto (SI) líquido, consistindo em sais B5, vitaminas B5, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100 mg/L de Timentin®, 200 mg/L de cefotaxima, e 50 mg/L de vanco-micina (pH 5,7). As sementes de soja divididas são então cultivadas sobre Meio de Indução do Broto I (SI I), consistindo em sais B5, vitaminas B5, 7 g/L de Ágar nobre, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 50 mg/L de Timentin®, 200 mg/L de cefotaxima, e 50 mg/L de vancomici-na (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone faceando para cima e a extremidade nodal do cotilédone incorporada no meio. Após 2 semanas de cultura, os explantes da semente de soja dividida transformada são transferidos para o meio de Indução do Broto II (SI II), contendo o meio de SI I suplementado com 6 mg/L de glufosinato (Liberty®).

[00326] Alongamento do broto. Após 2 semanas de cultura sobre o meio de SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e uma camada do broto de crescimento contendo o eixo embriônico é excisada fazendo um corte na base do cotilédone. A camada do broto isolada do cotilédone é transferida para o meio de Alongamento do Broto (SE). O meio de SE consiste em sais de MS, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose e 0,6 g/L de MES, 50 mg/L de aspa-ragina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 0,1 mg/L de IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de ribosídeo de zeatina, 50 mg/L de Timentin®, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glufosinato, e 7 g/L de Ágar nobre, (pH 5,7). As culturas são transferidas para o meio de SE novo a cada 2 semanas. As culturas são desenvolvidas em uma câmara de crescimento Conviron®, a 24 Ό, com um fotoperíodo de 18 h, em uma intensidade de luz de 80-90 pmoi/m2s.

[00327] Enraizamento. Os brotos alongados, que se desenvolveram da camada de bromo do cotilédone, são isolados por corte do broto alongado na base da camada de broto do cotilédone, e imersão do broto alongado em 1 mg/L de IBA (Ácido indol 3-butírico), por 1-3 minutos, para promover o enraizamento. A seguir, os brotos alongados são transferidos para o meio de enraizamento (sais de MS, vitaminas B5, 28 mg/L de Ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 7 g/L de Ágar nobre, pH 5,6), em bandejas phyta.

[00328] Cultivo. Após a cultura em uma câmara de crescimento CONVIRON®, a 24 Ό, fotoperíodo de 18 h, por 1-2 semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo, em uma taça de sundae coberta, e colocados em uma câmara de crescimento CONVIRON® (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá), sob condições de dias longos (16 horas de luz/8 horas de escuridão), em uma intensidade de luz de 120-150 pmol/m2s, sob temperatura (22 Ό) e umidade (40-50%) constantes, para a aclimatização das plantinhas. As plan-tinhas enraizadas são aclimatadas nas taças de sundae por diversas semanas, antes de elas serem transferidas para a estufa, para mais aclimatização e estabelecimento de plantas de soja transgênicas saudáveis.

[00329] 10-20 linhagens adicionais de Glycine max T-ι, expressando o dsRNA hairpin para um constructo de RNAi, são obtidas para a provocação dos BSB. O dsRNA hairpin pode ser derivado compreenden- do a SEQ ID NO:101, a SEQ ID NO:102, a SEQ ID NO:103, ou os seus segmentos (por exemplo, as SEQ ID N0s:104-106). 10-20 linhagens adicionais de Glycine maxl^, expressando o dsRNA hairpin para um constructo de RNAi, são obtidas para a provocação dos BSB. O dsRNA hairpin pode ser derivado compreendendo a SEQ ID NO: 101, a SEQ ID NO:102, a SEQ ID NO:103, ou os seus segmentos (por exemplo, as SEQ ID NOs: 104-106). Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular, conforme se sabe na técnica. As preparações de RNA total a partir das linhagens T-ι independentes selecionadas são opcionalmente usadas para a RT-PCR com iniciadores projetados para ligar no intron ligador do cassete de expressão de hairpin em cada um dos constructos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado, requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene-alvo confirma e expressão do RNA hairpin em cada planta Glycine max transgênica. O processamento do dsRNA hairpin dos genes-alvo no siRNA é subsequentemente confirmado, de modo opcional, nas linhagens transgênicas independentes, usando hibridizações de blots de RNA.

[00330] As moléculas de RNAi tendo sequências de emparelha-mento ruim com mais do que 80% de identidade da sequência com genes-alvo afetam os BSB em um modo similar àquele visto com as moléculas de RNAi tendo 100% de identidade da sequência com os genes-alvo. O emparelhamento da sequência de emparelhamento ruim com as sequências nativas para formar um dsRNA hairpin no mesmo constructo de RNAI libera siRNAs processados nas plantas capazes de afetar o crescimento, o desenvolvimento, e a viabilidade das pragas hemípteras que se alimentam.

[00331] A distribuição in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, ou miR-NA correspondendo aos genes-alvo e a absorção subsequente por pragas hemípteras através da alimentação resultam na infrarregulação dos genes-alvo na praga hemíptera através do silenciamento do gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene-alvo for importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento e a viabilidade de alimentação da praga hemíptera são afetados, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, Euschistus servus, Dichelops melacandesse modo, Dichelops furcatus, Edes-sa meditabunda, Thyanta perditor, Chinavia marginatum, Horcias nobi-lellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus par-vus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, e Lygus lineolaris, resultam no fracasso de infestar, alimentar, se desenvolver com êxito, e/ou resultam na morte da praga hemíptera. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem sucedida do RNAi são então usadas para controlar as pragas hemípteras.

[00332] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transqêni-cas e a Glvcine max não transformada. Os genes ou as sequências das pragas-alvo hemípteras, selecionadas para criar dsRNA hairpin, não têm nenhuma similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Consequentemente, não se espera que a produção ou a ativação do RNAi (sistêmico) por constructos que alvejam estes genes ou sequências de pragas hemípteras tenha qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. Entretanto, as características de desenvolvimento e morfológicas das linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformadas, assim como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene expressando hairpin. As características de raiz, broto, folhagem e reprodução das plantas são comparadas. Não há nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento e crescimento das raízes das plantas transgênicas e não transformadas. As características de broto da planta, tais como a altura, os números e os tamanhos das folhas, o tempo de floração, o tamanho e o aspecto da flor, são similares. Em geral, não há nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão das molécu-las-alvo de iRNA, quando cultivadas in vitro e no solo na estufa. EXEMPLO 15: Bioensaios com E. heros em Dieta Artificial.

[00333] Nos ensaios de alimentação de dsRNA em dieta artificial, as bandejas de 32 poços são estabelecidas com uma pelota de ~18 mg de dieta artificial e água, como para os experimentos de injeção (Ver o EXEMPLO 12). O dsRNA em uma concentração de 200 ng/pL é adicionado à amostra de alimento de pelota e água; 100 pL para cada um de dois poços. Cinco ninfas de E. heros do 2o instar são introduzidas em cada poço. As amostras de água e o dsRNA que alveja um transcrito de YFP são usados como controles negativos. Os experimentos são repetidos em três dias diferentes. Os insetos sobreviventes são pesados, e as taxas de mortalidade são determinadas após 8 dias de tratamento. A mortalidade e/ou a inibição do crescimento são observadas nos poços proporcionados com o dsRNA de rpll215 de BSB, em comparação com os poços de controle.

Exemplo 16: Arabidopsis thaliana Transgênica Compreendendo Sequências de Pragas Hemípteras [00334] Os vetores de transformação de Arabidopsis, contendo um constructo de gene-alvo para a formação de hairpin compreendendo segmentos de rpll215 (SEQ ID NOs:77, 79, e/ou 81), são gerados usando métodos moleculares padrões, similares ao EXEMPLO 4. A transformação da Arabidopsis é efetuada usando procedimento padrão baseado em Agrobacterium. As sementes T-ι são selecionadas com o marcador selecionável de tolerância ao glufosinato. As plantas T-i transgênicas de Arabidopsis são geradas e as plantas transgênicas T2 de cópia simples homozigóticas são geradas para os estudos com os insetos. Os bioensaios são efetuados em plantas Arabidopsis que se desenvolvem, com inflorescências. Cinco a dez insetos são colocados sobre cada planta e monitorados quanto à sobrevivência dentro de 14 dias.

[00335] Constructo do vetor de transformação de Arabidopsis. Os clones de entrada, baseados em um vetor de entrada contendo um constructo de gene-alvo para a formação de hairpin compreendendo um segmento de rpl/215 (SEQ ID NO:77, 79, e/ou 81), são agrupados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos padrões de clonagem molecular. A formação de hairpin intramolecular por transcritos primários de RNA é facilitada por arranjo (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias de um segmento de gene alvo em orientações opostas, os dois segmentos sendo separados por uma sequência de liga-dor (por exemplo, intron de ST-LS1) (Vancanneyt e col. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Desse modo, o transcrito de mRNA primário contém as duas sequências dos segmentos de genes de rpll215 como repetições invertidas grandes uma da outra, separadas pela sequência de ligador. Uma cópia de um promotor (por exemplo, promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (Callis e col. (1990) J. Biologi-cal Chem. 265:12486-12493)) é usada para orientar a produção do transcrito de mRNA hairpin primário, e um fragmento compreendendo uma região não traduzida em 3' a partir do Quadro de Leitura Aberto 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; Patente US 5.428.147) é usado para terminar a transcrição do gene que expressa o RNA hairpin.

[00336] Os clones hairpin dentro dos vetores de entrada são usados nas reações padrões de recombinação GATEWAY® com um vetor de destinação binário típico, para produzir vetores de transformação de expressão de RNA hairpin para a transformação da Arabidopsis mediada por Agrobacterium.

[00337] Um vetor de destinação binário compreende um gene de tolerância ao herbicida, DSM-2v2 (Publicação de Patente U.S. No. 2011/0107455), sob a regulação de um Promotor do vírus do mosaico da nervura da mandioca (Promotor de CsVMV v2, Patente U.S. 7.601.885; Verdaguer e col. (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39). Um fragmento compreendendo uma região não traduzida em 3' a partir do Quadro de Leitura Aberto 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORFI 3' UTR v6; Huang e col. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22) é usado para terminar a transcrição do mRNA de DSM2v2.

[00338] Um constructo binário de controle negativa, que compreende um gene que expressa um RNA hairpin de YFP, é construído por meio das reações padrões de recombinação GATEWAY® com um vetor de destinação binário e um vetor de entrada típicos. O constructo de entrada compreende uma sequência hairpin de YFP sob o controle de expressão de um promotor de Ubiquitina 10 de Arabidopsis (conforme acima mencionado) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida em 3' a partir do ORF23 de Agrobacterium tumefaciens (conforme acima mencionado).

[00339] Produção de Arabidopsis transqênica compreendendo RNAs inseticidas: transformação mediada por Agrobacterium. Os plasmídios binários contendo sequências de dsRNA hairpin são ele-troporados na cepa de Agrobacterium GV3101 (pMP90RK). Os clones recombinantes de Agrobacterium são confirmados por análise de restrição das preparações de plasmídios das colônias recombinantes de Agrobacterium. Um Kit Plasmid Max da Qiagen (Qiagen, Cat. no. 12162) é usado para extrair plasmídios das culturas de Agrobacterium após o protocolo de manufatura recomendado.

[00340] Transformação da Arabidopsis e Seleção de Ti. Doze a quinze plantas Arabidopsis (c.v. Columbia) são desenvolvidas em potes de 10 cm (4"), na estufa, com intensidade de luz de 250 pmol/m2, 250, e 18:6 horas de condições de luz:escuridão. Os caules das flores primários são aparados uma vez por semana, antes da transformação. Os inóculos de Agrobacterium são preparados por incubação de 10 pL de estoque em glicerol de Agrobacterium recombinante em 100 mL de caldo LB (Sigma L3022) +100 mg/L de Espectinomicina + 50 mg/L de Canamicina, a 28 O, e agitação a 225 rp m por 72 horas. As células de Agrobacterium são coletadas e suspensas em 5% de sacarose + 0,04% de Silwet-L77 (Lehle Seeds Cat no. VIS-02) +10 pg/L de solução de benzamino purina (BA) até uma OD600 0,8-1,0, antes da imersão das flores. As partes moídas acima da planta são imersas na solução de Agrobacterium por 5-10 minutos, com agitação suave. As plantas são então transferidas para a estufa para o crescimento normal, com irrigação e fertilização reguladores até a fixação da semente.

Exemplo 17: Crescimento e Bioensaios de Arabidopsis Transgê-nica [00341] Seleção da Arabidopsis Ti transformada com constructos de dsRNA. Até 200 mg de sementes T-ι de cada transformação são estratificados em solução a 0,1% de agarose. As sementes são plantadas em bandejas de germinação [27 cm x 53 cm x 3 cm (10.5" x 21" x 1"); T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN.] com meio Sunshine no. 5. Os transformantes são selecionados quanto à tolerância ao Ignite® (glufo-sinato) a 280 g/ha em 6 e 9 dias após o plantio. Os eventos selecionados são transplantados em potes de 10 cm (4") de diâmetro. A análise da cópia de inserção é efetuada dentro de uma semana do transplante, por meio de PCR em Tempo Real quantitativa de hidrólise (qPCR) usando LightCycler480® da Roche Os iniciadores da PCR e as sondas da hidrólise são projetados contra um marcador selecionável de DSM2v2 usando o Software LightCycler® Probe Design 2.0 (Roche). As plantas são mantidas a 24 Ό, com um fotoperíodo de luz: escuridão de 16:8 horas, sob luzes fluorescentes e incandescentes em intensidade de 100-150 mE/m2s.

[00342] Bioensaio de alimentação com planta de E. heros. Pelo menos quatro eventos de baixa cópia (1-2 inserções), quatro de cópia média (2-3 inserções), e quatro de cópia alta (>4 inserções) são selecionados para cada constructo. As plantas são desenvolvidas até um estágio reprodutivo (plantas contendo flores e síliquas). A superfície do solo é coberta com um volume de ~ 50 ml_ de areia branca, para a fácil identificação do inseto. Cinco a dez ninfas de E. heros do 2oinstar são introduzidas sobre cada planta. As plantas são cobertas com tubos plásticos que são 8 cm (3") de diâmetro, 41 cm (16") de altura, e com espessura da parede de 8 x 10'2 cm (0,03") (Item No. 484485, Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com malha de náilon para isolar os insetos. As plantas são mantidas sob condições normais de temperatura, luz e irrigação em uma conviron. Em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; a porcentagem de mortalidade, assim como a inibição do crescimento (1 - peso do tratamento/peso de controle) são calculadas. As plantas que expressam a YFP hairpin são usadas como controles.

[00343] Geração da semente de Arabidopsis T? e bioensaios de T?. A semente T2 é produzida a partir dos eventos de baixa cópia (1-2 inserções) selecionados, para cada constructo. As plantas (homozigóti-cas e/ou heterozigóticas) são submetidas ao bioensaio de alimentação de E. heros, conforme descrito acima. A semente T3 é colhida dos ho-mozigotos e armazenada para análise futura.

Exemplo 18: Transformação de Espécies de Culturas Adicionais [00344] O algodão é transformado com um transgene de dsRNA de rpll215, para proporcionar o controle dos insetos hemípteros, por utilização de um método conhecido para aqueles de habilidade na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas práticas anteriormente descritas no EXEMPLO 14 da Patente U.S. 7.838.733, ou no Exemplo 12 da Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482. Exemplo 19: dsRNA de rpll215 no Controle de Insetos [00345] Os transgenes de dsRNA de rpll215 são combinados com outras moléculas de dsRNA em plantas transgênicas, para proporcionar alvejamento de RNAi redundante e efeitos sinérgicos de RNAi. As plantas transgênicas incluindo, por exemplo, e sem limitação, o milho, a soja, e o algodão, expressando o dsRNA que alveja rpll215, são úteis para prevenir o dano de alimentação por insetos coleópteros e hemípteros. Os transgenes de dsRNA de rpll215 são também combinados nas plantas com a tecnologia da proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, e ou os polipeptídeos inseticidas de PIP-1, para representar novos modos de ação nas pirâmides de genes de Controle da Resistência dos Insetos. Quando combinados com outras moléculas de dsRNA que alvejam pragas de insetos e/ou com proteínas inseticidas em plantas transgênicas, é observado um efeito inseticida sinérgi-co que também diminui o desenvolvimento de populações de insetos resistentes.

Exemplo 20: Transcritoma do Besouro do Pólen [00346] As larvas e os besouros adultos do pólen foram coletados de campos com plantas de colza florescendo (Giessen, Alemanha). Os besouros adultos jovens (cada um por grupo de tratamento: n = 20; 3 réplicas) foram provocados por injeção de uma mistura de duas bactérias diferentes (Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa), uma levedura (Saccharomyces cerevisiae) e LPS bacteriana. As culturas bacterianas foram desenvolvidas a 37 Ό, com ag itação, e a densidade óptica foi monitorada a 600 nm (OD600). As células foram cole- tadas em OD600 ~1 por centrifugação e suspensas novamente em solução salina tamponada com fosfato. A mistura foi introduzida de modo ventrolateral furando o abdômen das imagos do besouro do pólen, usando uma agulha de dissecação imersa em uma solução aquo-sa de 10 mg/ml de LPS (endotoxina de E. coli purificada; Sigma, Tauf-kirchen, Alemanha) e as culturas bacterianas e de leveduras. Juntamente com os besouros imuno provocados, os besouros nunca antes tratados e as larvas foram coletados (n = 20 por e 3 réplicas cada) no mesmo ponto de tempo.

[00347] O RNA total foi extraído 8 h após a imunização dos besouros e larvas congelados, usando o TriReagent (Molecular Research Centre, Cincinnati, OH, EUA), e purificado usando o Kit RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Alemanha), em cada caso seguindo as orientações dos fabricantes. A integridade do RNA foi verificada usando um Bioa-nalisador Agiient 2100 e um Kit RNA 6000 Nano (Agilent Technologies, Paio Alto, CA, EUA). A quantidade de RNA foi determinada usando um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000. O RNA foi extraído de cada um dos grupos de tratamento imunoinduzidos de adultos, grupos de controle de adultos, e grupos larvais individualmente e quantidades iguais de RNA total foram subsequentemente combinadas em um agrupamento por amostra (adultos imunoprovocados, adultos de controle e larvas) para o sequenciamento.

[00348] A geração de dados de RNA-Seq e o agrupamento de RNA-Seq de 100 bp de uma única leitura foram realizados separadamente sobre 5 pg de RNA total isolado de besouros adultos imunoprovocados, besouros adultos nunca antes tratados (controle) e larvas não tratadas. O sequenciamento foi realizado pelo Operon Eurofins MWG usando a plataforma lllumina HiSeq-2000. Isto produziu 20,8 milhões de leituras para a amostra de besouro de controle adulto, 21,5 milhões de leituras para a amostra de besouro adulto provocado com LPS e 25,1 milhões de leituras para a amostra larval. As leituras agrupadas (67,5 milhões) foram reunidas usando o software de uso geral Velvet/Oases (Schulz e col. (2012) Bioinformatics 28:1086-92; Zerbino & Birney (2008) Genoma Research 18:821-9). O transcritoma continha 55648 sequências.

[00349] Uma busca por tblastn do transcritoma foi usada para identificar os contigs correspondentes (isto é, a SEQ ID NO: 107). Como uma consulta, foi usada a sequência de peptídeos de rpll215 de Tribo-lium castaneum (Genbank XP_969020.2).

Exemplo 21: Mortalidade de Meligethes aeneus Após Tratamento com RNAi de rpll215 [00350] Os iniciadores específicos para genes, incluindo a sequência do promotor de polimerase de T7 na extremidade de 5', foram usados para criar os produtos da PCR de aproximadamente 500 bp por PCR (SEQ ID NO:117). Os fragmentos da PCR foram clonados no vetor pGEM T easy, de acordo com o protocolo do fabricante e enviados para uma empresa de sequenciamento para verificar a sequência. O dsRNA foi então produzido pela RNA polimerase de T7 (Kit de RNAi MEGAscript®, Applied Biosystems) a partir de um constructo de PCR gerado do plasmídio sequenciado, de acordo com o protocolo do fabricante.

[00351] A injeção de -100 nL de dsRNA (1 pg/pL) nos besouros adultos foi efetuada com um macromanipulador, sob um estereomi-croscópio de dissecação (n=10, 3 réplicas biológicas). Os animais foram anestesiados sobre gelo, antes de eles serem afixados a uma fita de dupla adesão. Os controles receberam o mesmo volume de água. Um dsRNA de controle negativo de IMPI (gene inibidor da metalopro-teinase de inseto do lepidóptero Galleria mellonella) foi conduzido.

[00352] Os besouros do pólen foram mantidos em placas Petri com pólen secado e um tecido úmido.

Tabela 14. Resultados do M. aeneus adultos com injeção de dsRNA de rpll215 (Porcentagem da média de sobrevivência ± std, n = 3 grupos de 10). * Desvio padrão Tabela 17. Resultados do M. aeneus adultos com injeção de dsRNA de rpll215 (Porcentagem da média de sobrevivência ± std, n = 3 grupos de 10). * Desvio padrão [00353] Os controles foram efetuados em uma data diferente devido à disponibilidade limitada dos insetos.

[00354] Bioensaio de Alimentação: Os besouros foram mantidos sem acesso à água, nos tubos falcon vazios, 24 h antes do tratamento. Uma gotícula de dsRNA (~5 μΙ_) foi colocada em uma pequena placa de Petri e 5 a 8 besouros foram adicionados à placa Petri. Os animais foram observados sob um estereomicroscópio e os que ingeriram dsRNA contendo solução de dieta foram selecionados para o bioensaio. Os besouros foram transferidos para placas petri com pólen secado e um tecido úmido. Os controles receberam o mesmo volume de água. Um dsRNA de controle negativo de IMPI (gene inibidor da meta- loproteinase de inseto do lepidóptero Galleria mellonella) foi conduzido. Todos os controles em todos os estágios não puderam ser testados devido a uma falta de animais.

Tabela 18. Resultados do M. aeneus adultos com alimentação de dsRNA de rpll215 (Porcentagem da média de sobrevivência ± std, n = 3 grupos de 10).

Tabela 19. Resultados do M. aeneus adultos com alimentação de dsRNA de rpll215 (Porcentagem da média de sobrevivência ± std, n = 3 grupos de 10). * Desvio padrão [00355] Os controles foram efetuados em uma data diferente devido à disponibilidade limitada dos insetos.

Exemplo 21: Transformação mediada por Agrobacterium dos hi-pocótilos de Canola (Brassica napus) Preparação do Agrobacterium [00356] A cepa de Agrobacterium contendo o plasmídio binário é riscada sobre placas de meio de YEP (Bacto Peptone® 20,0 g/L e Extrato de Levedura 10,0 g/L) contendo estreptomicina (100 mg/ml) e es-pectinomicina (50 mg/mL) e incubada por 2 dias a 28Ό. A cepa de Agrobacterium propagada contendo o plasmídio binário é raspada da placa com risco de 2 dias usando um laço de inoculação estéril. A ce- pa de Agrobacterium raspada contendo o plasmídio binário é então inoculada em 150 mL de líquido de YEP modificado com estreptomici-na (100 mg/ml) e espectinomicina (50 mg/ml) em frasco(s) com septo de 500 mL estéril(eis) e agitada a 200 rpm, a 28Ό. As culturas são centrifugadas e suspensas novamente em meio M (sais de LS, 3% de glicose, vitaminas B5 modificadas, 1 μΜ de cinetina, 1 μΜ de 2,4-D, pH 5,8) e diluídas até a densidade apropriada (50 Unidades Klett, como medidas usando um espectrofotômetro) antes da transformação dos hipocótilos de canola.

Transformação da Canola [00357] Germinação das sementes: As sementes de canola (var. NEXERA 710®) são esterilizadas na superfície em 10% de Clorox®, por 10 minutos, e enxaguadas três vezes com água destilada estéril (as sementes estão contidas em escorredores de sementes durante este processo). As sementes são plantadas para a germinação sobre meio de Canola 1/2 MS (1/2 MS, 2% de sacarose, 0,8% de ágar) contido em Phytatrays® (25 sementes por Phytatray®) e colocadas em uma câmara de crescimento Percival®, com um ajuste de regime de crescimento a 25°C, fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão, por 5 dias de germinação.

[00358] Pré-tratamento: No dia 5, os segmentos de hipocótilos de cerca de 3 mm de comprimento são excisados assepticamente, as seções da raiz e do broto restantes são descartadas (a secagem dos segmentos de hipocótilos é impedida por imersão dos segmentos de hipocótilos em 10 mL de água estéril milliQ® durante o processo de excisão). Os segmentos de hipocótilos são colocados horizontalmente sobre papéis de filtro estéreis, sobre o meio de indução de calo, MSK1D1 (MS, 1 mg/L de cinetina, 1 mg/L de 2,4-D, 3,0% de sacarose, 0,7% de phytagar) para o tratamento por 3 dias em uma câmara de crescimento Percival®, com ajuste do regime de crescimento a 22- 23Ό, e um fotoperíodo de 16 horas de luz, 8 horas de escuridão.

[00359] Cocultivo com Agrobacterium: No dia antes do cultivo com Agrobacterium, os frascos de meio de YEP contendo os antibióticos apropriados são inoculados com a cepa de Agrobacterium contendo o plasmídio binário. Os segmentos de hipocótilos são transferidos do meio de indução de calo sobre papéis de filtro, MSK1D1, para placas de Petri® de 100 x 25 mm, vazias, contendo 10 mL de meio M líquido para impedir que os segmentos de hipocótilos sequem. Uma espátula é usada neste estágio para remover os segmentos e transferir os segmentos para um novo meio. O meio M líquido é removido com uma pipeta e 40 mL de suspensão de Agrobacterium são adicionados à placa de Petri® (500 segmentos com 40 mL de solução de Agrobacterium). Os segmentos de hipocótilos são tratados por 30 minutos, com agitação periódica da placa de Petri®, de modo que os segmentos de hipocótilos permaneçam imersos na solução de Agrobacterium. No final do período de tratamento, a solução de Agrobacterium é pipetada para um béquer de resíduos, esterilizada em autoclave e descartada (a solução de Agrobacterium é completamente removida para impedir o crescimento excessivo de Agrobacterium). Os hipocótilos tratados são transferidos com fórceps de volta para as placas originais contendo o meio de MSK1D1 recoberto com o papel de filtro (toma-se cuidado para garantir que os segmentos não sequem). Os segmentos de hipocótilos transformados e os segmentos de hipocótilos de controle não transformados são retornados para a câmara de crescimento Per-cival®, sob intensidade de luz reduzida (cobrindo-se as placas com folha de alumínio), e os segmentos de hipocótilos tratados são coculti-vados com Agrobacterium por 3 dias.

[00360] Indução do calo sobre meio de seleção: Após 3 dias de cocultivo, os segmentos de hipocótilos são individualmente transferidos, com fórceps, para o meio de indução do calo, MSK1D1H1 (MS, 1 mg/L de cinetina, 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 g/L de MES, 5 mg/L de AgN03, 300 mg/L de Timentin®, 200 mg/L de carbenicilina, 1 mg/L de Herbiace®, 3% de sacarose, 0,7% de phytagar), com ajuste do regime de crescimento a 22-26°C. Os segmentos de hipocótilos são fixados sobre o meio, porém não são profundamente incrustados no meio.

[00361] Seleção e regeneração do broto: Após 7 dias sobre o meio de indução do caio, os segmentos de hipocótilos que formam calos são transferidos para o Meio de Regeneração de Broto 1 com seleção, MSB3Z1H1 (MS, 3 mg/L de BAP, 1 mg/L de zeatina, 0,5 g/L de MES, 5 mg/L de AgN03, 300 mg/L de Timentin®, 200 mg/L de carbenicilina, 1 mg/L de Herbiace®, 3% de sacarose, 0,7% de phytagar). Após 14 dias, os segmentos de hipocótilos que desenvolverem brotos são transferidos para o Meio de Regeneração 2 com seleção aumentada, MSB3Z1H3 (MS, 3 mg/L de BAP, 1 mg/L de Zeatina, 0,5 g/L de MES, 5 mg/L de AgN03, 300 mg/l de Timentin®, 200 mg/L de carbenicilina, 3 mg/L de Herbiace®, 3% de sacarose, 0,7% de phytagar), com ajuste do regime de crescimento a 22-26°C.

[00362] Alongamento do broto: Após 14 dias, os segmentos de hipocótilos que desenvolvem brotos são transferidos do Meio de Regeneração 2 para o meio de alongamento do broto, MSMESH5 (MS, 300 mg/L de Timentin®, 5 mg/l de Herbiace®, 2% de sacarose, 0,7% Ágar TC), com ajuste de regime de crescimento a 22-26°C. Os brotos que já estão alongados são isolados dos segmentos de hipocótilos e transferidos para o MSMESH5. Após 14 dias, os brotos restantes que não alongaram na primeira rodada de cultivo sobre o meio de alongamento do broto são transferidos para um meio de alongamento do bromo novo, MSMESH5. Neste estágio, todos os segmentos de hipocótilos restantes que não produzem brotos são descartados.

[00363] Indução da raiz: Após 14 dias de cultivo sobre o meio de alongamento do broto, os brotos isolados são transferidos para o meio MSMEST (MS, 0,5 g/L de MES, 300 mg/L de Timentin®, 2% de saca-rose, 0,7% de Ágar TC) para a indução da raiz a 22-26Ό. Quaisquer brotos que não produzam raízes após a incubação na primeira transferência para o meio MSMEST são transferidos para uma segunda ou terceira rodada de incubação sobre o meio MSMEST, até que os brotos desenvolvam raízes.

[00364] Embora a presente divulgação possa ser suscetível a diversas modificações e formas alternativas, foram descritas modalidades específicas a título de exemplo em detalhe neste documento. Entretanto, deve ser entendido que não se pretende que a presente divulgação esteja limitada às formas particulares descritas. Mais exatamente, a presente divulgação é para cobrir todas as modificações, equivalentes, e alternativas que incidam no escopo da presente divulgação, como definida pelas reivindicações anexas que se seguem e seus equivalentes legais.

REIVINDICAÇÕES

Claims (62)

1. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor heterólogo, onde o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:7; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:7; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:8; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:8; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; um frag- mento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:9; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:9; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:77; o complemento de SEQ ID NO:77; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:77; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:77; uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:83; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:83; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:83; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:79; o complemento de SEQ ID NO:79; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:79; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:79; uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:84; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:84; um fragmento de pelo me- nos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:84; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:84; SEQ ID NO:81; o complemento de SEQ ID NO:81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:81; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:81; uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:85; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:85; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:85; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO:85; uma sequência de codificação nativa de um organismo Me-ligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 108-111 e 117; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117.

2. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:107; o complemento de SEQ ID NO: 107; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo as SEQ ID NOs:108-111 e 117.

3. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:117, e os complementos de quaisquer das precedentes.

4. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, onde o organismo é selecionado a partir do grupo que consiste em D. v. virgi-fera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardr, D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella-, D. speciosa; D. u. undecimpunctata Mannerheim; Meligethes aeneus Fabricius (Besouro do Pólen); Eus-chistus heros (Fabr.) (Pentatomídeo Marrom Neotropical); Nezara viri-dula (L.) (Pentatomídeo Verde do Sul); Piezodorus guildinii (Westwo-od) (Pentatomídeo de Listras Vermelhas); Halyomorpha halys (Stâl) (Pentatomídeo Marmorizado Marrom); Chinavia hilare (Say) (Pentatomídeo Verde); Euschistus servus (Say) (Pentatomídeo Marrom); Di-chelops melacanthus (Dallas); Dichelops furcatus (F.); Edessa medita-bunda (F.); Thyanta perditor (F.) (Pentatomídeo das Costas Vermelhas Neotropical); Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois); Horcias nobi-lellus (Berg) (Besouro do Algodão); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (Besouro da Planta Manchado Ocidental); e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).

5. Vetor de transformação das plantas, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

6. Molécula de ácido ribonucleico (RNA), caracterizada pelo fato de que é transcrita a partir do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

7. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir da expressão do polinucleotí- deo como definido na reivindicação 1.

8. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência de polinucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero inibe a expressão de uma sequência de nu-cleotídeo endógena especificamente complementar ao polinucleotídeo.

9. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o contato de dita molécula de ribonucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero extermina ou inibe o crescimento, viabilidade e/ou alimentação do inseto.

10. RNA de filamento duplo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA pela segunda sequência de polinucleotídeo, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, de tal modo que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de filamento duplo.

11. RNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo e uma molécula de ácido ribonucleico de filamento único entre cerca de 15 e cerca de 30 nucle-otídeos de comprimento.

12. Vetor de transformação das plantas que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula vegetal.

13. Célula caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

14. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula procariótica.

15. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.

16. Célula de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula vegetal.

17. Planta caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

18. Semente da planta como definida na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o polinucleotídeo.

19. Produto de consumo produzido a partir da planta como definida na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto de consumo compreende uma quantidade detectável de polinucleotídeo.

20. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

21. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é uma Zea mays, Glycine max, Gossypium sp,, Brassica sp., ou Poaceae.

22. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta é Zea mays, Glycine max, Gossypium sp., Brassica sp., ou uma planta da família Poaceae .

23. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico, e a molécula de ácido ribonucleico inibe a expressão de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar a pelo menos um polinucleotídeo, quando um inseto coleóptero ou hemíptero ingere uma parte da planta.

24. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um polinucleotídeo adicional que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene de inseto endógeno.

25. Vetor de transformação das plantas caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 24, em que os polinucleotídeos adicionais são cada um ligado de maneira operável a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal.

26. Método para controlar uma população de pragas co-leópteras ou hemípteras, o método caracterizado pelo fato de que compreendendo proporcionar um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que atua com o contato com a praga para inibir uma função biológica dentro da praga, onde o RNA é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em quaisquer das SEQ ID NOs:95-106 e 119-123; o complemento de quaisquer das SEQ ID NOs:95-106 e 119-123; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:95-106 e 119-123; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:95-106 e 119-123; um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 117, e um gene de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:109-111 e 117; o complemento de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7-9, 77, 79, 81, 83-85, 117, e um gene de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:109-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, 117, e um gene de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:109-111 e 117; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs: 1,3,5, 77, 79, 81, 117, e um gene de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:109-111 e 117.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o RNA do agente é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em quaisquer das SEQ ID NOs:95-97, 101-103, e um RNA de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:119-123; o complemento de quaisquer das SEQ ID NOs:95-97, 101-103, e um RNA de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs: 119-123; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:95-97, 101-103, e um RNA de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:119-123; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:95-97, 101-103, e um RNA de Meligethes nativo compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:119-123; um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:109-111 e 117; o complemento de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs: 109-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:109-111 e 117; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 77, 79, 81, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs: 109-111 e 117.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula de RNA de filamento duplo.

29. Método para o controle de uma população de pragas coleópteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona após o contato com a praga coleóptera para inibir uma função biológica na praga co-leóptera, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que apresenta cerca de 90 % a cerca de 100 % de identidade de sequência para cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 95 a 97, e um RNA Meli-gethes nativo que compreende qualquer SEQ ID Nos: 119-123 e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridi-zada com a segunda sequência de polinucleotídeo.

30. Método para o controle de uma população de pragas hemípteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona após o contato com a praga hemíptera para inibir uma função biológica dentro da praga hemíptera, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que apresenta cerca de 90 % a cerca de 100 % de identidade de sequência para cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 101 a 103, e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridi-zada com a segunda sequência de polinucleotídeo.

31. Método para o controle de uma população de pragas coleópteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma planta hospedeira de uma praga coleóptera uma célula vegetal transformada que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona após o contato com a praga coleóptera, que pertence à população para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga coleóptera, e resulta na diminuição do crescimento e/ou sobrevivência da praga ou população de pragas coleópteras, em relação à reprodução das mesmas espécies de praga em uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o polinucleotídeo.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 103 ou a SEQ ID NO: 104.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a população de pragas coleópteras é reduzida em relação a uma população de pragas coleópteras que infestam uma planta hospedeira da mesma espécie que carece da célula vegetal transformada.

35. Método de controlar a infestação por pragas coleópteras em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar na dieta de uma praga coleóptera um ácido ribonucleico (RNA) que seja especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N0s:95-100, um RNA de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:119-123, e SEQ ID NOs:119-123; o complemento de quaisquer das SEQ ID N0s:95-100, um RNA de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs: 119-123, e SEQ ID NOs:119-123; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID N0s:95-100, um RNA de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:119-123, e as SEQ ID NOs:119-123; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 núcleo- tídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID N0s:95-100, um RNA de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:119-123, e as SEQ ID NOs:119-123; um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:109-111 e 117; o complemento de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:109-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:109-111 e 117; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, e um gene de Meligethes nativo compreendendo as SEQ ID NOs:109-111 e 117.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula vegetal transformada para expressar o polinucleotídeo.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA hibridizável especificamente é compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

39. Método de controlar a infestação por pragas hemípteras em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma praga hemíptera com um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N0s:101-106; o complemento de quaisquer das SEQ ID N0s:101-106; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:101-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:101-106; um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81; o complemento de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um transcrito de quaisquer das SEQ ID NOs:77, 79, e 81.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o contato da praga hemíptera com o RNA compreende a pulverização da planta com uma composição que compreende o RNA.

41. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

42. Método para melhorar o rendimento de uma cultura de milho, o método caracterizado pelo fato de que compreende: Introduzir o ácido nucleico como definido na reivindicação 1, em uma planta de cultura para a produção de uma planta de cultura transgênica; e cultivar a planta de cultura para permitir a expressão de pelo menos um polinucleotídeo; em que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo inibe a reprodução ou o crescimento da praga de insetos e a perda de rendimento devido à infecção por pragas de inseto, em que a planta de cultura é milho, soja ou algodão.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga de insetos que tenha entrado em contato com uma parte da planta de cultura.

44. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 117 e os complementos de qualquer um dos precedentes.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga de insetos coleópteros que tenha entrado em contato com uma parte da planta de milho.

46. Método para a produção de uma célula vegetal trans-gênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 1; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais que compreende uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram pelo menos um polinucleotídeo nos seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas com relação à expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada por pelo menos um polinucleotídeo; e selecionar uma célula vegetal que expressa o RNA.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:108, o complemento de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109, o complemento de SEQ ID NO:109; SEQ ID NO:110, o complemento de SEQ ID NO:110; SEQ ID NO:111, o complemento de SEQ ID NO:111; SEQ ID NO:117; o complemento de SEQ ID NO:117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 108-111, e 117; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de quaisquer das SEQ ID NOs:1, 3, 5, 108-111, e 117; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:7-9; uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Meligethes compreendendo quaisquer das SEQ ID NOs:108-111 e 117.

48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de filamento duplo.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende a SEQ ID NO: 124.

50. Método para a produção de planta transgênica protegida contra uma praga coleóptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 47; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada por pelo menos um polinucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera que entra em contato com a planta transformada.

51. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que: transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio para fornecer proteção contra as pragas coleópteras de uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram com os meios para fornecer proteção contra as pragas coleópteras a uma planta nos seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas com relação à expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera; e selecionar uma célula vegetal que expressa os meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera.

52. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga coleóptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 51; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera que entra em contato com a planta transformada.

53. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio para fornecer proteção contra as pragas hemípteras a uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram com os meios para fornecer proteção contra as pragas hemípteras a uma planta nos seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas com relação à expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera; e selecionar uma célula vegetal que expressa os meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera.

54. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga hemíptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 53; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga hemíptera que entra em contato com a planta transformada.

55. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp, e/ou um polipeptídeo PIP-1.

56. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A e/ou Cyt2C.

57. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp, e/ou um polipeptídeo PIP-1.

58. Célula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e/ou Cyt2C.

59. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta compreende um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., e/ou um polipeptídeo PIP-1.

60. Planta de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e/ou Cyt2C.

61. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal transformada compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp, e/ou um polipeptídeo PIP-1.

62. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e/ou Cyt2C.