CN112391390A

CN112391390A - 飞蝗网格蛋白重链基因及其靶向dsRNA的合成与应用

Info

Publication number: CN112391390A
Application number: CN202011303949.0A
Authority: CN
Inventors: 张建珍; 史学凯; 王艳丽; 李涛
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-02-23

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种飞蝗网格蛋白重链基因及其靶向dsRNA的合成与应用。本发明提供飞蝗网格蛋白重链基因及其靶向dsRNA的合成方法与其在害虫防治中的应用。具体通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取网格蛋白重链基因片段，进一步调取获得序列为SEQ ID NO：1基因全长。然后依据SEQ ID NO：1序列，设计引物并合成该基因的dsRNA，该dsRNA片段其中一条的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示序列，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，使飞蝗在蜕皮时死亡，多次实验表明其致死率达到94％以上。本发明dsRNA的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可为害虫防治提供新的途径。

Description

飞蝗网格蛋白重链基因及其靶向dsRNA的合成与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种飞蝗网格蛋白重链基因及其靶向dsRNA的合成方法与其在害虫防治中的应用。

背景技术

飞蝗是我国重要农业害虫，主要取食禾本科植物，对农业生产造成严重危害。目前对其防治主要依靠化学防治。长期施用化学杀虫剂导致一系列问题，如环境污染、农药残留、生态破坏、作物抗药性产生和食品安全隐患。因此亟待开发新型、可替代化学防治的方法治理蝗灾。

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，RNAi技术已成为生命科学的研究热点，该技术为基因功能研究、临床疾病治疗和作物害虫防治提供了新方向。由于该技术对靶基因的高效性、特异性及易操作性等特点，目前在害虫防治等领域具有潜在的应用价值。通过RNA干扰进行害虫防治具有如下优点：1)杀虫专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2)绿色环保性，对环境无害，RNA在自然界极易降解，无残留；3)经济节约性，生产成本低，相对安全。因此，学者将其称为***新型杀虫剂。基于RNA干扰进行害虫防治的前提是筛选靶标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。

昆虫发育需要不断从外界摄取营养物质，内吞作用是其主要吸收方式，网格蛋白依赖的内吞作用对于昆虫摄取营养物质，调节生长发育必不可少。网格蛋白(Chc)分布在细胞膜和细胞质内，负责将细胞外环境中的大分子物质经细胞膜内陷入胞，当外源物质与细胞膜受体结合后，上百个网格蛋白组装形成笼形结构将外源物质包裹进入细胞，随后在细胞内转运，最终营养物质被细胞利用。沉默该靶标基因后昆虫不能正常摄取外界物质，导致其不能正常发育最终死亡。

发明内容

针对上述问题本发明首先提供了一种飞蝗网格蛋白重链基因；其次提供了飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA及其合成方法；最后本发明还提供了飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA在飞蝗防治中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明提供的飞蝗网格蛋白重链基因的核苷酸长度为5296bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。

进一步，所述飞蝗网格蛋白重链基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。该氨基酸序列是对序列SEQ ID NO：1进行生物信息学分析后预测得到的。生物信息学分析表明飞蝗网格蛋白重链基因(LmChc)编码1677个氨基酸，分子量为192KD，理论等电点为5.46。

进一步，所述飞蝗网格蛋白重链基因，通过以下步骤获得：

步骤1，基于飞蝗转录组数据库，搜索其Unigene，经NCBI Blastx分析后，获得飞蝗网格蛋白重链基因的片段；

步骤2，对步骤1搜索获得的片段通过GeneDoc软件进行拼接；

步骤3，根据步骤2的拼接结果，采用primer premier 5.0软件设计并合成对应的上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4；

SEQ ID NO：3：CAGTTTCAGTCGTGAGTGCGATTAGT

SEQ ID NO：4：GGCTCATCACTGAAATAACAAACAACA

步骤4，提取飞蝗的RNA并反转录成cDNA，得到PCR扩增所需模板；

步骤5，采用步骤3合成的引物和步骤4的模板经PCR扩增反应获得飞蝗网格蛋白重链基因。

进一步，所述步骤4中模板制备的过程如下：选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞蝗若虫直接冷冻于液氮中，随后置于研钵中进行研磨，依照试剂盒提取RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，从而获得PCR反应所需模板。

进一步，述步骤5中PCR扩增反应的体系为：PrimeSTAR Max Premix(2X)10μL，上下游引物各0.2μL，模板1μL，双蒸水8.6μL，总体积20μL；反应程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸150s，循环35次。

本发明提供飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA其中一条的核苷酸序列为SEQ IDNO：5所示序列。

进一步，所述飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA的合成方法，包括如下步骤：

步骤1，按照飞蝗网格蛋白重链基因的核苷酸序列，通过primer premier5.0软件设计并合成含有T7启动子(斜体部分)的上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7；

SEQ ID NO：6：

SEQ ID NO.：7：

步骤2，通过PCR扩增获得一段长度为538bp的两端均为T7启动子的模板，经试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX^TMExpress RNAi System(Promega)试剂盒的说明体外转录合成得到飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA。

进一步，所述步骤2中PCR扩增反应的体系为：2*taq PCR Master Mix II 25μL,上下游引物各1μL，双蒸水21μL，cDNA模板2μL，总体积为50μL；反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃终延伸7min。

本发明飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA可应用于飞蝗防治。

进一步，所述靶向dsRNA用于飞蝗防治是通过微量进样器将合成的dsRNA注射进飞蝗体腔内敲低飞蝗网格蛋白重链基因的表达，从而影响飞蝗的生长发育来实现的。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明基于飞蝗网格蛋白重链基因合成的dsRNA对飞蝗具有高的特异性和致死率，飞蝗五龄若虫第一天注射网格蛋白重链基因的靶向dsRNA后，若虫在蜕皮时受阻导致死亡，死亡率达到94％以上。因此，本发明不仅可用于飞蝗的防治，对于害虫防治也具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。

附图说明

图1为PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为DL5000 DNA Marker，条带从下到上依次为100、250、500、750、1000、1500，2000、3000、5000bp，1代表飞蝗网格蛋白重链基因。

图2为dsRNA注射24h后飞蝗网格蛋白重链基因的转录情况，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图3为dsRNA对5龄飞蝗若虫生长发育的影响。

具体实施方式

下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1

飞蝗网格蛋白重链基因cDNA全长序列获得及其氨基酸序列分析：

1、飞蝗网格蛋白重链基因cDNA片段获得：

基于飞蝗的转录组数据库，对其Unigene进行搜索，经NCBI Blastx分析后，确定获得1个飞蝗网格蛋白重链基因的片段。

2、PCR扩增获得飞蝗网格蛋白重链基因cDNA全长序列：

1)PCR扩增所需引物设计：

将上述基因片段通过GeneDoc软件进行拼接，以拼接好的序列为基础，采用primerpremier5.0软件设计对应的上游引物SEQ ID NO：3：CAGTTTCAGTCGTGAGTGCGATTAGT和下游引物SEQ ID NO：4：GGCTCATCACTGAAATAACAAACAACA，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2)PCR扩增所需模板制备：

选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞蝗若虫直接冷冻于液氮中。4头一个生物学重复，随后置于研钵中进行研磨，依照TaKaRa Trizol试剂盒提取RNA。采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得PCR反应所需模板。

3)PCR扩增反应：

采用步骤2)获得的模板和步骤1)合成的引物，通过PCR扩增获得网格蛋白重链基因的全长片段。

PCR扩增体系为：PrimeSTAR Max Premix(2X)10μL，上下游引物各0.2μL，模板1μL，双蒸水8.6μL，总体积20μL。

扩增反应程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸150s，循环35次。

通过Gel Extraction Kit(Omega)将PCR产物进行纯化，随后使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带(图1)，检测后，将纯化的PCR产物送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序得到飞蝗网格蛋白重链基因的核苷酸长度为5296bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。

3、飞蝗网格蛋白重链基因氨基酸序列分析

通过ExPaSy在线软件对测序所得网格蛋白重链基因进行翻译，预测网格蛋白重链基因的开放阅读框编码1677个氨基酸，分子量为192KD，等电点为5.46。功能域预测发现网格蛋白重链基因具有7个网格蛋白重链重复同源域(CLH)。得到其编码的氨基酸序列为SEQID NO：2所示序列。

实施例2

飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA的合成：

1、飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA引物的设计

基于测序所得飞蝗网格蛋白重链基因序列，采用primer premier5.0软件设计其靶向dsRNA的引物。得到引物的序列如下(斜体部分为T7启动子)：

上游引物SEQ ID NO：6：

下游引物SEQ ID NO：7：

引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2、飞蝗网格蛋白重链基因特异性dsRNA的合成

以从上述质粒提取的网格蛋白重链基因为模板，用上述合成的含有T7启动子序列的上下游引物进行PCR扩增，得到一段长度为538bp基因片段(SEQ ID NO：7)。

PCR扩增的体系为：2*taq PCR Master Mix II 25μL,上下游引物各1μL，双蒸水21μL，cDNA模板2μL，总体积为50μL。

PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃终延伸7min。

采用Gel Extraction Kit(Omega)试剂盒将PCR产物纯化后按照T7RiboMAX^TMExpress RNAi System(Promega)试剂盒的说明体外转录合成dsRNA(dsLmChc)。使用NaNoDrop 2000(Thermo scientific)对其进行定量，使其终浓度达到2.5μg/μL。保存于-80℃超级低温冰箱备用。

实施例3

飞蝗网格蛋白重链基因的的靶向dsRNA致死飞蝗实验

1、靶向dsRNA的注射

选取33头生长健康、大小一致的5龄第1天飞蝗若虫进行实验。处理组使用25μL规格微量注射器将4μL(10μg)合成的dsRNA轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间，设置3个生物学重复，每个生物学重复11头虫；同时选取33头若虫设立为对照组，注射与处理组dsRNA相同体积和浓度的dsGFP，同样设置3个生物学重复，每个生物学重复11头虫。将注射后的飞蝗若虫置于30℃恒温培养室中饲养，(光照：黑暗时间＝14h：10h，温度30±2℃，湿度60％)。对照组和处理组每天均饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。

2、飞蝗网格蛋白重链基因沉默检测

各收集9头注射dsGFP和dsRNA(dsLmChc)24h后的若虫整虫，依照TaKaRa Trizol试剂盒提取总RNA，并采用M-MLV反转录酶将其反转录成第一链cDNA，采用Real-time PCR方法分别检测目的基因(LmChc)和管家基因(EF1a)的相对表达量，从而采用2^-ΔCt法对基因LmChc沉默效率进行计算。每组设置3个生物学重复，每个生物学重复3头若虫。

Real-time PCR方法的反应体系为：SYBR Green mixture 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板4μL，去离子水4.4μL，共20μL。

反应程序为：95℃预变性1min，95℃解链15s；60℃退火及延伸31s，循环40次，60℃进行荧光检测，DNA熔解分析60-95℃，每步上升1℃。

图2结果表明，与对照组比较，注射dsRNA(dsLmChc)后，处理组飞蝗网格蛋白重链基因(LmChc)表达显著降低。结果表明该dsRNA片段可显著沉默靶基因表达水平，dsRNA片段有效，可用于后续研究。

3.dsRNA对5龄飞蝗若虫生长发育的影响

注射dsRNA后对处理组和对照组的五龄若虫进行表型观察。从图3可以看出五龄若虫注射dsRNA后，对照组虫体在5龄第7天全部成功蜕皮至成虫，且蜕皮后成虫发育状态良好。处理组注射dsLmChc后，若虫不能正常蜕皮，出现死亡表型，致死率达到94％以上。结果表明该网格蛋白重链基因在维持飞蝗正常生长发育过程中起重要作用，沉默网格蛋白重链基因导致飞蝗不能正常发育。因此，网格蛋白重链基因的靶向dsRNA可应用于飞蝗防治工作。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

SEQ ID NO：1

cagtttcagtcgtgagtgcgattagttataaggtggacatccagaaaggatctgttattaacagaataatatccctgtggactctatgcagctgtaaccaccatgacgcagatgttaccgatacggtttcaagagcacctacagctcacaagtgtaggaatcaaccaggccagcgtgagcttcaacacgctcacaatggaatcggacaaattcatatgtgtgagggagaaagttggtgacacagcacaggtagtgataatagacatggcagacccatcaaatcctatcagacgacccatatctgcagactcagctataatgaacccagcaagcaaagtaatagctcttaaaggaaaggctggtgttgaagcccagaaaacccttcagattttcaacattgagatgaagagcaaaatgaaagcacatacaatgacggaagacgttatattttggaaatggatttcacttaacaccttagctcttgtcacagagacatctgtgtatcactggagtatggagggtgactccgttccacaaaagatgttcgataggcactcaagcttaaacggttgtcagattattaattatcgaactgatccaaagcagtcatggctgctacttattggaatatctgctcaacaaagcagagtagttggagccatgcagctgtactcagttgaacgcaagtgttcgcaaccaattgaagggcatgctgcatcttttgcacagtttaagatggaaggcaatgctgagccatcgactcttttctgttttgcagtaagaacactacagggtggaaagctgcacataatagaagttggtcaccctccagcggggaatcaaccatttccaaagaaagctgtagacgttttcttcccaccagaagcacagaatgactttcctgtagccatgcaggtcagtgcaaagtatgatgttatctacctgataacaaaatatgggtacatccacttgtatgacatcgaaactgcagtatgcatatacatgaacagaataagtggtgatacaatattcgtaactgcaccacatgaatcatcgggtggaataatcggagttaaccgtaaaggacaggtgctgtctgtcagtgttgaagaagacaacataataccttacataaatagtgtacttcagaatccagatttggctttacgtatggctgtacgtaacaaccttgctggtgcagaagacttgtttgttaggaagtttaatctgctgttccaaaatgggcaatatgcagaggctgcaaaggttgctgccaatgcgccaaaaggaattctgcgaactccacaaactattcagcgattccagcaagtacctacaccacagggtcagacttcacctctgttgcaatattttggcattctattggatcagggacaattaaacaaatacgaaagtctggaactttgtcggcccgtcctgcagcaaggccgtaagcagttactggaaaaatggctaaaagaagacaagttagagtgctcggaagaacttggagatctagtcaagcaagcagaccccacattagcattgtcagtttatctgagagctaatgttcctaacaaggttattcagtgtttcgccgagactggtcagttccagaagatagtattatatgccaaaaaagttggctatacccctgactacatctttctgctgcgaaatgttatgcgaataaatcctgaccagggtgtaacttttgcccaaatgttagtccaagatgatgaacctcttgcagatataaatcagatagtggatatcttcatggaacaaaacatggtaccacagtgcacagctttcttactagatgccttgaaaaataataggcctgctgaaggaccattgcagacaagattattggaaatgaatttgatgtcggctccacaggttgctgatgcgatactaagcaatcagatgttcacccattatgatagagcccacatagcccagctctgtgagaaagctggccttctacaacgagcattggagcattatacagatctgtacgatataaaacgagctgttgttcatacacatctgctcaacccagaatggttagtgggatactttggtactctttctgtggaagattcactggaatgcttaaaggcaatgctgactgctaacattaggcagaatttgcagatctgtgtccagattgccacaaaataccatgagcagttaacaacaaaagctcttatagacttgtttgaatcattcaagagctatgaaggtcttttctacttcctgggttcaatagtaaatttcagccaggatcaagaagtgcacttcaaatacatacaggcggcatgcaagactggtcagataaaagaagtggagcgcatctgcagagaatctaattgttacaacgcagaacgtgtaaagaacttcttgaaagaagcaaagcttacagatcagctaccattaatcattgtttgtgatagatttgattttgtccacgatttggtgctatacctgtatcgcaacaacttacagaagtacattgaaatttatgtccaaaaggtgaatccatcaaggttaccagttgttgttggagggcttttagatgtggactgctcagaagatattataaagaacttaatattagttgtgcgtgggcagttttccacagatgagctggtggaagaagttgaaaaacggaacagactgaaattgcttctgccgtggctcgagtctcgtgtacatgagggctgtgtagaaccagctacacacaatgctctggcaaagatctacatagacagcaacaataatccagaaagattcttaaaggagaatcagttctatgatagccgtgttgtaggaaaatactgcgagaagagagatcctcatctagcttgtgttgcatatgaacggggccagtgtgacagagagcttattaatgtttgtaatgagaattcactgttcaaatcggaagccaggtatctagttcgaagaagggatcctgaactttgggctgaagtcctaaatgaaaacaatccctataagaggcctctcatagaccaagtggtgcaaactgcattgtcggaaacccaggatccagaagatatatcagtaactgtaaaagccttcatgactgctgatctccctaatgaacttatagaactgctagaaaaaatagtattggataattctgtatttagtgatcatagaaaccttcaaaatttgttgatcctgacggcaataaaagctgatcgcagccgtgtgatggaatacattaaccgcctagataactatgatgcaccagatattgctaatattgccattaataatcagttgtatgaagaagccttcgcaattttcaaaaaatttgatgtgaacacatcagcaatccaggtgctaattgacaatgttcaaaatcttgaccgagcatatgaatttgctgaaagatgtaatgagcctgctgtttggagccagcttgcaaaagctcagttgcagcagggaatggttaaagaggcaatagactcattcataaaagctgatgatccatcagcatatatcgatgttgtagaaacggctcacaaaacaggaagctgggaagatcttgtaagatatctgcagatggctcgtaagaaggcgagggaatcgtatatagaatctgaattaatctatgcatatgcacgcacaaatagactagctgacttggaagaattcatttctggaccaaaccatgctgacattcagaagattggtgatcgctgcttcgatgatgggatgtatgaggctgcaaaactgttgtacaataatgtttcaaattttgctcggctggcaattactttagtacacctgaaagaattccaaggagctgtggatggtgcaagaaaagcaaatagcacaagaacatggaaagaagtgtgtttcgcctgtgtcgacagtgaagagttcagattagcacagatgtgtggccttcacattgttgttcatgccgatgaactggaagatctgataaactattaccaggacagaggctattttgaagaactgatcaacttgttagaagctgctcttggcttagaaagagcacacatggggatgtttacagaactggcaattttgtattcaaagtacaagcctgccaaaatgcgtgagcacttagaattattctggtctcgtgtaaacataccaaaggtattgcgggcagcagaacaagctcacctttgggcagaactagtattcctgtatgataagtatgaagaatatgataatgctgtaatagccatgatgaatcatccaacagaagcctggcgtgaagggcactttaaagacattattaccaaggttgctaacattgaactgtactacaaagctatccagttttatctagattacaaaccacttctgctgaatgatgtgttgctggtgctggcaccacgtatggatcacacgcgatcagttaacttcttcactaaggttaatcatttacaattagtgaagccataccttcgttctgttcagagcctgaataataaagctatcaatgaagcactaaataatcttttaatagaagaagaagattaccagggtttgcggacatcgatagatgcattcgacaacttcgataatattgcgcttgcgcaaaagttggagaagcatgagctaattgaattcaggcgcatagcagcatacttgtacaagggcaacaaccgttggaaacaatctgtggagctttgcaaaaaggatagactcttcaaggacgcaatggagtatgcagcagaatcgaagaatgccgaggtagcagaagagttacttgcatggtttctggagaaaggaaatcatgattgctttgcagcttgcttattccagtgttatgacctgcttcatccagatgtcatcctggaattagcttggaggcacaacattttagattttgctatgccttacctgatacaagttgtgcgtgaatacataacaaaggttgataaactggaagaggcagagtcacagcggttggaagagacggcgcagca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SEQ ID NO：2

MetThrMetIleArgHisThrSerValGlyIleAsnAlaSerValSerAsnThrThrMetSerAspLysIleCysValArgLysValGlyAspThrAlaValValIleIleAspMetAlaAspSerAsnIleArgArgIleSerAlaAspSerAlaIleMetAsnAlaSerLysValIleAlaLysGlyLysAlaGlyValAlaLysThrIleAsnIleMetLysSerLysMetLysAlaHisThrMetThrAspValIleTrpLysTrpIleSerAsnThrAlaValThrThrSerValTyrHisTrpSerMetGlyAspSerValLysMetAspArgHisSerSerAsnGlyCysIleIleAsnTyrArgThrAspLysSerTrpIleGlyIleSerAlaSerArgValValGlyAlaMetTyrSerValArgLysCysSerIleGlyHisAlaAlaSerAlaLysMetGlyAsnAlaSerThrCysAlaValArgThrGlyGlyLysHisIleIleValGlyHisAlaGlyAsnLysLysAlaValAspValAlaAsnAspValAlaMetValSerAlaLysTyrAspValIleTyrIleThrLysTyrGlyTyrIleHisTyrAspIleThrAlaValCysIleTyrMetAsnArgIleSerGlyAspThrIleValThrAlaHisSerSerGlyGlyIleIleGlyValAsnArgLysGlyValSerValSerValAspAsnIleIleTyrIleAsnSerValAsnAspAlaArgMetAlaValArgAsnAsnAlaGlyAlaAspValArgLysAsnAsnGlyTyrAlaAlaAlaLysValAlaAlaAsnAlaLysGlyIleArgThrThrIleArgValThrGlyThrSerTyrGlyIleAspGlyAsnLysTyrSerCysArgValGlyArgLysLysTrpLysAspLysCysSerGlyAspValLysAlaAspThrAlaSerValTyrArgAlaAsnValAsnLysValIleCysAlaThrGlyLysIleValTyrAlaLysLysValGlyTyrThrAspTyrIleArgAsnValMetArgIleAsnAspGlyValThrAlaMetValAspAspAlaAspIleAsnIleValAspIleMetAsnMetValCysThrAlaAspAlaLysAsnAsnArgAlaGlyThrArgMetAsnMetSerAlaValAlaAspAlaIleSerAsnMetThrHisTyrAspArgAlaHisIleAlaCysLysAlaGlyArgAlaHisTyrThrAspTyrAspIleLysArgAlaValValHisThrHisAsnTrpValGlyTyrGlyThrSerValAspSerCysLysAlaMetThrAlaAsnIleArgAsnIleCysValIleAlaThrLysTyrHisThrThrLysAlaIleAspSerLysSerTyrGlyTyrGlySerIleValAsnSerAspValHisLysTyrIleAlaAlaCysLysThrGlyIleLysValArgIleCysArgSerAsnCysTyrAsnAlaArgValLysAsnLysAlaLysThrAspIleIleValCysAspArgAspValHisAspValTyrTyrArgAsnAsnLysTyrIleIleTyrValLysValAsnSerArgValValValGlyGlyAspValAspCysSerAspIleIleLysAsnIleValValArgGlySerThrAspValValLysArgAsnArgLysTrpSerArgValHisGlyCysValAlaThrHisAsnAlaAlaLysIleTyrIleAspSerAsnAsnAsnArgLysAsnTyrAspSerArgValValGlyLysTyrCysLysArgAspHisAlaCysValAlaTyrArgGlyCysAspArgIleAsnValCysAsnAsnSerLysSerAlaArgTyrValArgArgArgAspTrpAlaValAsnAsnAsnTyrLysArgIleAspValValThrAlaSerThrAspAspIleSerValThrValLysAlaMetThrAlaAspAsnIleLysIleValAspAsnSerValSerAspHisArgAsnAsnIleThrAlaIleLysAlaAspArgSerArgValMetTyrIleAsnArgAspAsnTyrAspAlaAspIleAlaAsnIleAlaIleAsnAsnTyrAlaAlaIleLysLysAspValAsnThrSerAlaIleValIleAspAsnValAsnAspArgAlaTyrAlaArgCysAsnAlaValTrpSerAlaLysAlaGlyMetValLysAlaIleAspSerIleLysAlaAspAspSerAlaTyrIleAspValValThrAlaHisLysThrGlySerTrpAspValArgTyrMetAlaArgLysLysAlaArgSerTyrIleSerIleTyrAlaTyrAlaArgThrAsnArgAlaAspIleSerGlyAsnHisAlaAspIleLysIleGlyAspArgCysAspAspGlyMetTyrAlaAlaLysTyrAsnAsnValSerAsnAlaArgAlaIleThrValHisLysGlyAlaValAspGlyAlaArgLysAlaAsnSerThrArgThrTrpLysValCysAlaCysValAspSerArgAlaMetCysGlyHisIleValValHisAlaAspAspIleAsnTyrTyrAspArgGlyTyrIleAsnAlaAlaGlyArgAlaHisMetGlyMetThrAlaIleTyrSerLysTyrLysAlaLysMetArgHisTrpSerArgValAsnIleLysValArgAlaAlaAlaHisTrpAlaValTyrAspLysTyrTyrAspAsnAlaValIleAlaMetMetAsnHisThrAlaTrpArgGlyHisLysAspIleIleThrLysValAlaAsnIleTyrTyrLysAlaIleTyrAspTyrLysAsnAspValValAlaArgMetAspHisThrArgSerValAsnThrLysValAsnHisValLysTyrArgSerValSerAsnAsnLysAlaIleAsnAlaAsnAsnIleAspTyrGlyArgThrSerIleAspAlaAspAsnAspAsnIleAlaAlaLysLysHisIleArgArgIleAlaAlaTyrTyrLysGlyAsnAsnArgTrpLysSerValCysLysLysAspArgLysAspAlaMetTyrAlaAlaSerLysAsnAlaValAlaAlaTrpLysGlyAsnHisAspCysAlaAlaCysCysTyrAspHisAspValIleAlaTrpArgHisAsnIleAspAlaMetTyrIleValValArgTyrIleThrLysValAspLysAlaSerArgThrAlaAspHisLysMetIleMetMetThrAlaGlyGlyMetValGlyGlyTyrValGlyTyrThrAsnAlaTyrAlaGlyValTyrGlyTyrGlyMet

SEQ ID NO：3

cagtttcagtcgtgagtgcgattagt

SEQ ID NO：4

ggctcatcactgaaataacaaacaaca

SEQ ID NO：5

taatacgactcactatagggttgctggtgcagaagacttgtttgttaggaagtttaatctgctgttccaaaatgggcaatatgcagaggctgcaaaggttgctgccaatgcgccaaaaggaattctgcgaactccacaaactattcagcgattccagcaagtacctacaccacagggtcagacttcacctctgttgcaatattttggcattctattggatcagggacaattaaacaaatacgaaagtctggaactttgtcggcccgtcctgcagcaaggccgtaagcagttactggaaaaatggctaaaagaagacaagttagagtgctcggaagaacttggagatctagtcaagcaagcagaccccacattagcattgtcagtttatctgagagctaatgttcctaacaaggttattcagtgtttcgccgagactggtcagttccagaagatagtattatatgccaaaaaagttggctatacccctgactacatctttctgctgcgaaatgttatgctaatacgactcactataggg

SEQ ID NO：6

taatacgactcactatagggttgctggtgcagaagacttg

SEQ ID NO：7

taatacgactcactataggggcataacatttcgcagcaga

序列表

<110> 山西大学

<120> 飞蝗网格蛋白重链基因及其靶向 dsRNA 的合成与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5296

<212> DNA

<213> 飞蝗(Locusta migratoria)

<400> 1

cagtttcagt cgtgagtgcg attagttata aggtggacat ccagaaagga tctgttatta 60

acagaataat atccctgtgg actctatgca gctgtaacca ccatgacgca gatgttaccg 120

atacggtttc aagagcacct acagctcaca agtgtaggaa tcaaccaggc cagcgtgagc 180

ttcaacacgc tcacaatgga atcggacaaa ttcatatgtg tgagggagaa agttggtgac 240

acagcacagg tagtgataat agacatggca gacccatcaa atcctatcag acgacccata 300

tctgcagact cagctataat gaacccagca agcaaagtaa tagctcttaa aggaaaggct 360

ggtgttgaag cccagaaaac ccttcagatt ttcaacattg agatgaagag caaaatgaaa 420

gcacatacaa tgacggaaga cgttatattt tggaaatgga tttcacttaa caccttagct 480

cttgtcacag agacatctgt gtatcactgg agtatggagg gtgactccgt tccacaaaag 540

atgttcgata ggcactcaag cttaaacggt tgtcagatta ttaattatcg aactgatcca 600

aagcagtcat ggctgctact tattggaata tctgctcaac aaagcagagt agttggagcc 660

atgcagctgt actcagttga acgcaagtgt tcgcaaccaa ttgaagggca tgctgcatct 720

tttgcacagt ttaagatgga aggcaatgct gagccatcga ctcttttctg ttttgcagta 780

agaacactac agggtggaaa gctgcacata atagaagttg gtcaccctcc agcggggaat 840

caaccatttc caaagaaagc tgtagacgtt ttcttcccac cagaagcaca gaatgacttt 900

cctgtagcca tgcaggtcag tgcaaagtat gatgttatct acctgataac aaaatatggg 960

tacatccact tgtatgacat cgaaactgca gtatgcatat acatgaacag aataagtggt 1020

gatacaatat tcgtaactgc accacatgaa tcatcgggtg gaataatcgg agttaaccgt 1080

aaaggacagg tgctgtctgt cagtgttgaa gaagacaaca taatacctta cataaatagt 1140

gtacttcaga atccagattt ggctttacgt atggctgtac gtaacaacct tgctggtgca 1200

gaagacttgt ttgttaggaa gtttaatctg ctgttccaaa atgggcaata tgcagaggct 1260

gcaaaggttg ctgccaatgc gccaaaagga attctgcgaa ctccacaaac tattcagcga 1320

ttccagcaag tacctacacc acagggtcag acttcacctc tgttgcaata ttttggcatt 1380

ctattggatc agggacaatt aaacaaatac gaaagtctgg aactttgtcg gcccgtcctg 1440

cagcaaggcc gtaagcagtt actggaaaaa tggctaaaag aagacaagtt agagtgctcg 1500

gaagaacttg gagatctagt caagcaagca gaccccacat tagcattgtc agtttatctg 1560

agagctaatg ttcctaacaa ggttattcag tgtttcgccg agactggtca gttccagaag 1620

atagtattat atgccaaaaa agttggctat acccctgact acatctttct gctgcgaaat 1680

gttatgcgaa taaatcctga ccagggtgta acttttgccc aaatgttagt ccaagatgat 1740

gaacctcttg cagatataaa tcagatagtg gatatcttca tggaacaaaa catggtacca 1800

cagtgcacag ctttcttact agatgccttg aaaaataata ggcctgctga aggaccattg 1860

cagacaagat tattggaaat gaatttgatg tcggctccac aggttgctga tgcgatacta 1920

agcaatcaga tgttcaccca ttatgataga gcccacatag cccagctctg tgagaaagct 1980

ggccttctac aacgagcatt ggagcattat acagatctgt acgatataaa acgagctgtt 2040

gttcatacac atctgctcaa cccagaatgg ttagtgggat actttggtac tctttctgtg 2100

gaagattcac tggaatgctt aaaggcaatg ctgactgcta acattaggca gaatttgcag 2160

atctgtgtcc agattgccac aaaataccat gagcagttaa caacaaaagc tcttatagac 2220

ttgtttgaat cattcaagag ctatgaaggt cttttctact tcctgggttc aatagtaaat 2280

ttcagccagg atcaagaagt gcacttcaaa tacatacagg cggcatgcaa gactggtcag 2340

ataaaagaag tggagcgcat ctgcagagaa tctaattgtt acaacgcaga acgtgtaaag 2400

aacttcttga aagaagcaaa gcttacagat cagctaccat taatcattgt ttgtgataga 2460

tttgattttg tccacgattt ggtgctatac ctgtatcgca acaacttaca gaagtacatt 2520

gaaatttatg tccaaaaggt gaatccatca aggttaccag ttgttgttgg agggctttta 2580

gatgtggact gctcagaaga tattataaag aacttaatat tagttgtgcg tgggcagttt 2640

tccacagatg agctggtgga agaagttgaa aaacggaaca gactgaaatt gcttctgccg 2700

tggctcgagt ctcgtgtaca tgagggctgt gtagaaccag ctacacacaa tgctctggca 2760

aagatctaca tagacagcaa caataatcca gaaagattct taaaggagaa tcagttctat 2820

gatagccgtg ttgtaggaaa atactgcgag aagagagatc ctcatctagc ttgtgttgca 2880

tatgaacggg gccagtgtga cagagagctt attaatgttt gtaatgagaa ttcactgttc 2940

aaatcggaag ccaggtatct agttcgaaga agggatcctg aactttgggc tgaagtccta 3000

aatgaaaaca atccctataa gaggcctctc atagaccaag tggtgcaaac tgcattgtcg 3060

gaaacccagg atccagaaga tatatcagta actgtaaaag ccttcatgac tgctgatctc 3120

cctaatgaac ttatagaact gctagaaaaa atagtattgg ataattctgt atttagtgat 3180

catagaaacc ttcaaaattt gttgatcctg acggcaataa aagctgatcg cagccgtgtg 3240

atggaataca ttaaccgcct agataactat gatgcaccag atattgctaa tattgccatt 3300

aataatcagt tgtatgaaga agccttcgca attttcaaaa aatttgatgt gaacacatca 3360

gcaatccagg tgctaattga caatgttcaa aatcttgacc gagcatatga atttgctgaa 3420

agatgtaatg agcctgctgt ttggagccag cttgcaaaag ctcagttgca gcagggaatg 3480

gttaaagagg caatagactc attcataaaa gctgatgatc catcagcata tatcgatgtt 3540

gtagaaacgg ctcacaaaac aggaagctgg gaagatcttg taagatatct gcagatggct 3600

cgtaagaagg cgagggaatc gtatatagaa tctgaattaa tctatgcata tgcacgcaca 3660

aatagactag ctgacttgga agaattcatt tctggaccaa accatgctga cattcagaag 3720

attggtgatc gctgcttcga tgatgggatg tatgaggctg caaaactgtt gtacaataat 3780

gtttcaaatt ttgctcggct ggcaattact ttagtacacc tgaaagaatt ccaaggagct 3840

gtggatggtg caagaaaagc aaatagcaca agaacatgga aagaagtgtg tttcgcctgt 3900

gtcgacagtg aagagttcag attagcacag atgtgtggcc ttcacattgt tgttcatgcc 3960

gatgaactgg aagatctgat aaactattac caggacagag gctattttga agaactgatc 4020

aacttgttag aagctgctct tggcttagaa agagcacaca tggggatgtt tacagaactg 4080

gcaattttgt attcaaagta caagcctgcc aaaatgcgtg agcacttaga attattctgg 4140

tctcgtgtaa acataccaaa ggtattgcgg gcagcagaac aagctcacct ttgggcagaa 4200

ctagtattcc tgtatgataa gtatgaagaa tatgataatg ctgtaatagc catgatgaat 4260

catccaacag aagcctggcg tgaagggcac tttaaagaca ttattaccaa ggttgctaac 4320

attgaactgt actacaaagc tatccagttt tatctagatt acaaaccact tctgctgaat 4380

gatgtgttgc tggtgctggc accacgtatg gatcacacgc gatcagttaa cttcttcact 4440

aaggttaatc atttacaatt agtgaagcca taccttcgtt ctgttcagag cctgaataat 4500

aaagctatca atgaagcact aaataatctt ttaatagaag aagaagatta ccagggtttg 4560

cggacatcga tagatgcatt cgacaacttc gataatattg cgcttgcgca aaagttggag 4620

aagcatgagc taattgaatt caggcgcata gcagcatact tgtacaaggg caacaaccgt 4680

tggaaacaat ctgtggagct ttgcaaaaag gatagactct tcaaggacgc aatggagtat 4740

gcagcagaat cgaagaatgc cgaggtagca gaagagttac ttgcatggtt tctggagaaa 4800

ggaaatcatg attgctttgc agcttgctta ttccagtgtt atgacctgct tcatccagat 4860

gtcatcctgg aattagcttg gaggcacaac attttagatt ttgctatgcc ttacctgata 4920

caagttgtgc gtgaatacat aacaaaggtt gataaactgg aagaggcaga gtcacagcgg 4980

ttggaagaga cggcgcagca agatcataaa cctatgataa tgccggaacc ccaactaatg 5040

ctgacggctg gtcctggaat ggttggcccc ggatatgttc ctgggtacac aaatgcctac 5100

gcacctggag tgccctatca aggatatgga atgtaaatgg ctgctatgaa gttttcgtga 5160

aagggatcaa aagaaatggt tttaattgtg gtgtctataa catccatgtc tgattagtta 5220

ctgttaaatg ttgacgcatt tagagaggat tatggtaaag agattaatct gttgtttgtt 5280

atttcagtga tgagcc 5296

<210> 2

<211> 1136

<212> PRT

<213> 飞蝗(Locusta migratoria)

<400> 2

Met Thr Met Ile Ala His Thr Ser Val Gly Ile Ala Ala Ser Val Ser

1 5 10 15

Ala Thr Thr Met Ser Ala Leu Ile Cys Val Ala Leu Val Gly Ala Thr

20 25 30

Ala Val Val Ile Ile Ala Met Ala Ala Ser Ala Ile Ala Ala Ile Ser

35 40 45

Ala Ala Ser Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Val Ile Ala Leu Gly Leu

50 55 60

Ala Gly Val Ala Leu Thr Ile Ala Ile Met Leu Ser Leu Met Leu Ala

65 70 75 80

His Thr Met Thr Ala Val Ile Thr Leu Thr Ile Ser Ala Thr Ala Val

85 90 95

Thr Thr Ser Val Thr His Thr Ser Met Gly Ala Ser Val Leu Met Ala

100 105 110

Ala His Ser Ser Ala Gly Cys Ile Ile Ala Thr Ala Thr Ala Leu Ser

115 120 125

Thr Ile Gly Ile Ser Ala Ser Ala Val Val Gly Ala Met Thr Ser Val

130 135 140

Ala Leu Cys Ser Ile Gly His Ala Ala Ser Ala Leu Met Gly Ala Ala

145 150 155 160

Ser Thr Cys Ala Val Ala Thr Gly Gly Leu His Ile Ile Val Gly His

165 170 175

Ala Gly Ala Leu Leu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Val Ala Met Val

180 185 190

Ser Ala Leu Thr Ala Val Ile Thr Ile Thr Leu Thr Gly Thr Ile His

195 200 205

Thr Ala Ile Thr Ala Val Cys Ile Thr Met Ala Ala Ile Ser Gly Ala

210 215 220

Thr Ile Val Thr Ala His Ser Ser Gly Gly Ile Ile Gly Val Ala Ala

225 230 235 240

Leu Gly Val Ser Val Ser Val Ala Ala Ile Ile Thr Ile Ala Ser Val

245 250 255

Ala Ala Ala Ala Met Ala Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Val Ala

260 265 270

Leu Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala Leu Gly

275 280 285

Ile Ala Thr Thr Ile Ala Val Thr Gly Thr Ser Thr Gly Ile Ala Gly

290 295 300

Ala Leu Thr Ser Cys Ala Val Gly Ala Leu Leu Thr Leu Ala Leu Cys

305 310 315 320

Ser Gly Ala Val Leu Ala Ala Thr Ala Ser Val Thr Ala Ala Ala Val

325 330 335

Ala Leu Val Ile Cys Ala Thr Gly Leu Ile Val Thr Ala Leu Leu Val

340 345 350

Gly Thr Thr Ala Thr Ile Ala Ala Val Met Ala Ile Ala Ala Gly Val

355 360 365

Thr Ala Met Val Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ile Val Ala Ile Met Ala

370 375 380

Met Val Cys Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Met

385 390 395 400

Ala Met Ser Ala Val Ala Ala Ala Ile Ser Ala Met Thr His Thr Ala

405 410 415

Ala Ala His Ile Ala Cys Leu Ala Gly Ala Ala His Thr Thr Ala Thr

420 425 430

Ala Ile Leu Ala Ala Val Val His Thr His Ala Thr Val Gly Thr Gly

435 440 445

Thr Ser Val Ala Ser Cys Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Ala Ala Ile

450 455 460

Cys Val Ile Ala Thr Leu Thr His Thr Thr Leu Ala Ile Ala Ser Leu

465 470 475 480

Ser Thr Gly Thr Gly Ser Ile Val Ala Ser Ala Val His Leu Thr Ile

485 490 495

Ala Ala Cys Leu Thr Gly Ile Leu Val Ala Ile Cys Ala Ser Ala Cys

500 505 510

Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ile Ile Val Cys

515 520 525

Ala Ala Ala Val His Ala Val Thr Thr Ala Ala Ala Leu Thr Ile Ile

530 535 540

Thr Val Leu Val Ala Ser Ala Val Val Val Gly Gly Ala Val Ala Cys

545 550 555 560

Ser Ala Ile Ile Leu Ala Ile Val Val Ala Gly Ser Thr Ala Val Val

565 570 575

Leu Ala Ala Ala Leu Thr Ser Ala Val His Gly Cys Val Ala Thr His

580 585 590

Ala Ala Ala Leu Ile Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Thr

595 600 605

Ala Ser Ala Val Val Gly Leu Thr Cys Leu Ala Ala His Ala Cys Val

610 615 620

Ala Thr Ala Gly Cys Ala Ala Ile Ala Val Cys Ala Ala Ser Leu Ser

625 630 635 640

Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Val Ala Ala Ala Thr Leu

645 650 655

Ala Ile Ala Val Val Thr Ala Ser Thr Ala Ala Ile Ser Val Thr Val

660 665 670

Leu Ala Met Thr Ala Ala Ala Ile Leu Ile Val Ala Ala Ser Val Ser

675 680 685

Ala His Ala Ala Ala Ile Thr Ala Ile Leu Ala Ala Ala Ser Ala Val

690 695 700

Met Thr Ile Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ile Ala

705 710 715 720

Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Leu Leu Ala Val Ala Thr Ser Ala Ile

725 730 735

Val Ile Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Val

740 745 750

Thr Ser Ala Leu Ala Gly Met Val Leu Ala Ile Ala Ser Ile Leu Ala

755 760 765

Ala Ala Ser Ala Thr Ile Ala Val Val Thr Ala His Leu Thr Gly Ser

770 775 780

Thr Ala Val Ala Thr Met Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ser

785 790 795 800

Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ile Ser Gly Ala His

805 810 815

Ala Ala Ile Leu Ile Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Met Thr Ala Ala

820 825 830

Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Ala Ala Ala Ile Thr Val His Leu Gly

835 840 845

Ala Val Ala Gly Ala Ala Leu Ala Ala Ser Thr Ala Thr Thr Leu Val

850 855 860

Cys Ala Cys Val Ala Ser Ala Ala Met Cys Gly His Ile Val Val His

865 870 875 880

Ala Ala Ala Ile Ala Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ala Ala Ala Gly

885 890 895

Ala Ala His Met Gly Met Thr Ala Ile Thr Ser Leu Thr Leu Ala Leu

900 905 910

Met Ala His Thr Ser Ala Val Ala Ile Leu Val Ala Ala Ala Ala His

915 920 925

Thr Ala Val Thr Ala Leu Thr Thr Ala Ala Ala Val Ile Ala Met Met

930 935 940

Ala His Thr Ala Thr Ala Gly His Leu Ala Ile Ile Thr Leu Val Ala

945 950 955 960

Ala Ile Thr Thr Leu Ala Ile Thr Ala Thr Leu Ala Ala Val Val Ala

965 970 975

Ala Met Ala His Thr Ala Ser Val Ala Thr Leu Val Ala His Val Leu

980 985 990

Thr Ala Ser Val Ser Ala Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Ile Ala

995 1000 1005

Thr Gly Ala Thr Ser Ile Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Leu

1010 1015 1020

Leu His Ile Ala Ala Ile Ala Ala Thr Thr Leu Gly Ala Ala Ala Thr

1025 1030 1035 1040

Leu Ser Val Cys Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ala Met Thr Ala Ala Ser

1045 1050 1055

Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Leu Gly Ala His Ala Cys Ala Ala Cys

1060 1065 1070

Cys Thr Ala His Ala Val Ile Ala Thr Ala His Ala Ile Ala Ala Met

1075 1080 1085

Thr Ile Val Val Ala Thr Ile Thr Leu Val Ala Leu Ala Ser Ala Thr

1090 1095 1100

Ala Ala His Leu Met Ile Met Met Thr Ala Gly Gly Met Val Gly Gly

1105 1110 1115 1120

Thr Val Gly Thr Thr Ala Ala Thr Ala Gly Val Thr Gly Thr Gly Met

1125 1130 1135

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtttcagt cgtgagtgcg attagt 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctcatcac tgaaataaca aacaaca 27

<210> 7

<211> 538

<212> DNA

<213> 飞蝗(Locusta migratoria)

<400> 7

taatacgact cactataggg ttgctggtgc agaagacttg tttgttagga agtttaatct 60

gctgttccaa aatgggcaat atgcagaggc tgcaaaggtt gctgccaatg cgccaaaagg 120

aattctgcga actccacaaa ctattcagcg attccagcaa gtacctacac cacagggtca 180

gacttcacct ctgttgcaat attttggcat tctattggat cagggacaat taaacaaata 240

cgaaagtctg gaactttgtc ggcccgtcct gcagcaaggc cgtaagcagt tactggaaaa 300

atggctaaaa gaagacaagt tagagtgctc ggaagaactt ggagatctag tcaagcaagc 360

agaccccaca ttagcattgt cagtttatct gagagctaat gttcctaaca aggttattca 420

gtgtttcgcc gagactggtc agttccagaa gatagtatta tatgccaaaa aagttggcta 480

tacccctgac tacatctttc tgctgcgaaa tgttatgcta atacgactca ctataggg 538

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg ttgctggtgc agaagacttg 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg gcataacatt tcgcagcaga 40

Claims

1.飞蝗网格蛋白重链基因，其特征在于：该基因全长的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。

2.权利要求1所述的飞蝗网格蛋白重链基因的获得方法，其特征在于，通过以下步骤获得：

步骤2，对步骤1搜索获得的片段通过GeneDoc软件进行拼接；

3.权利要求1～2任一项所述的飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA，其特征在于：所述靶向dsRNA其中一条的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示序列。

4.权利要求3所述的飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，按照飞蝗网格蛋白重链基因的核苷酸序列，通过primer premier5.0软件设计含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7；

步骤2，通过PCR扩增获得两端均为T7启动子的模板DNA片段，经试剂盒纯化后体外转录合成得到飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA。

5.权利要求3～4任一项所述的飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA的应用，其特征在于：用于飞蝗防治。

6.根据权利要求5所述的飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA的应用，其特征在于：所述靶向dsRNA用于飞蝗防治是通过微量进样器将合成的dsRNA注射进飞蝗体腔内敲低飞蝗网格蛋白重链基因的表达，从而影响飞蝗的生长发育来实现的。

7.根据权利要求2所述的飞蝗网格蛋白重链基因的获得方法，其特征在于，所述步骤4中模板制备的过程如下：选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞蝗若虫直接冷冻于液氮中，随后置于研钵中进行研磨，依照试剂盒提取RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，从而获得PCR反应所需模板。

8.根据权利要求2所述的飞蝗网格蛋白重链基因的获得方法，其特征在于，所述步骤5中PCR扩增反应的体系为：PrimeSTAR Max Premix(2X)10μL，上下游引物各0.2μL，模板1μL，双蒸水8.6μL，总体积20μL；反应程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸150s，循环35次。

9.根据权利要求4所述的飞蝗网格蛋白重链基因的靶向dsRNA的合成方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增反应的体系为：2*taq PCR Master Mix II 25μL,上下游引物各1μL，双蒸水21μL，cDNA模板2μL，总体积为50μL；反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃终延伸7min。