BR102016005404A2 - moléculas de ácido nucléico de rna polimerase ii33 para controlar as pragas de inseto - Google Patents

Abstract

this disclosure concerns nucleic acid molecules and methods of use thereof for control of insect pests through rna interference-mediated inhibition of target coding and transcribed non-coding sequences in insect pests, including coleopteran and/or hemipteran pests. the disclosure also concerns methods for making transgenic plants that express nucleic acid molecules useful for the control of insect pests, and the plant cells and plants obtained thereby.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE RNA POLIMERASE 1133 PARA CONTROLAR AS PRAGAS DE INSETO".

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Pedido No. de Série 62/133.210, depositado em 13 de Março de 2015 que é aqui incorporado na sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO DA DESCRIÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se de uma forma geral ao controle genético de danos nas plantas provocados pelas pragas de insetos (por exemplo, pragas de coleópteros e pragas de hemípteros). Nas modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação dos polinucleotídeos de codificação e não codificação do alvo, e o uso de tecnologias de DNA recombinante para pós-transcri-cionalmente reprimir ou inibir a expressão dos polinucleotídeos de codificação e não codificação dos alvos nas células de uma praga de inseto para fornecer um efeito protetor da planta.

ANTECEDENTES

[0003] O verme da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgi-fera virgifera LeConte, é uma das espécies de verme da raiz do milho mais devastadora na América do Norte e é uma preocupação especial em áreas de cultivo de milho do Meio-Oeste dos Estados Unidos. O verme da raiz do milho do norte (NCR), Diabrotica Barberi Smith and Lawrence, é uma espécie estritamente relacionada que co-habita em grande quantidade na mesma extensão como o WCR. Existem várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: o verme da raiz do milho mexicano (MCR), D. virgifera zeae Krysan and Smith; o verme da raiz do milho do sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpuncta-ta Mannerheim. O United States Department of Agriculture estimou que os vermes da raiz do milho causam $ 1 bilhão em receitas perdidas a cada ano, incluindo $ 800 milhões em perda de produtividade e $ 200 milhões em custos de tratamento.

[0004] Os ovos tanto do WCR quanto do NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo em todo o Inverno. Os ovos são oblongos, brancos, e menores do que 0,010 cm (0,004 polegada) de comprimento. As larvas eclodem no final de Maio ou início de junho, com o tempo preciso de incubação do ovo que varia de ano para ano devido às diferenças de temperatura e localização. As larvas recém chocadas são vermes brancos que são menores do que 0,3175 cm (0,125 polegada) de comprimento. Assim que chocadas, as larvas começam a se alimentar das raízes de milho. Os vermes da raiz do milho passar por três estágios larvais. Após alimentação durante várias semanas, as larvas mudam para a fase de pupa. Elas entram em estado de pupa no solo, e depois emergem do solo como adultos em julho e agosto. Os vermes da raiz adultos são ao redor de 0,635 cm (0,25 polegada) de comprimento.

[0005] As larvas do verme da raiz do milho completam o desenvolvimento no milho e várias outras espécies de gramíneas. As larvas criadas no capim rabo de raposa amarelo surgem mais tarde e possuem um tamanho da cápsula de cabeça menor como adultos do que as larvas criadas no milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. Os adultos do WCR se alimentam da seda do milho, pólen e grãos nas pontas da espiga expostas. Se os adultos do WCR surgirem antes que os tecidos reprodutivos do milho estejam presentes, eles podem alimentar-se do tecido da folha, atrasando assim o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hospedeira. No entanto, os adultos rapidamente irão mudar para as sedas e pólen preferidos quando eles se tornam disponíveis. Os adultos do NCR também se alimentam de tecidos reprodutivos da planta de milho, mas ao contrário raramente se alimentam das folhas de milho.

[0006] A maior parte dos danos do verme da raiz do milho é provocada pela alimentação das larvas. Os vermes da raiz recém chocados inicialmente se alimentam dos pêlos finos radiculares do milho e se escondem nas pontas da raiz. Quando as larvas se desenvolvem mais, elas se alimentam das raízes primárias e se escondem nalas. Quando os vermes da raiz do milho são abundantes, a alimentação das larvas muitas vezes resulta na poda das raízes em todo o caminho até a base do caule do milho. A lesão grave da raiz interfere com a capacidade da raiz de transportar água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento das plantas, e resulta na produção reduzida de grãos, desse modo, muitas vezes reduzindo drasticamente o rendimento global. A lesão grave da raiz também muitas vezes resulta na acomodação das plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e diminui ainda mais o rendimento. Além disso, a alimentação pelos adultos nos tecidos reprodutivos do milho pode resultar na poda das sedas na ponta da espiga. Se este "corte de seda" for grave o suficiente durante a polinização, a polinização pode ser interrompida.

[0007] O controle dos vermes da raiz do milho pode ser tentado pela rotação das culturas, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva formadora de esporos, Bacillus thu-ringiensis (Bt)), plantas transgênicas que expressam toxinas Bt, ou uma combinação destas. A rotação de cultura sofre da desvantagem de colocar restrições indesejáveis sobre o uso de terras agrícolas. Além do mais, a oviposição de algumas espécies de verme da raiz pode ocorrer em campos de soja, diminuindo assim a eficácia da rotação de culturas praticada com o milho e a soja.

[0008] Os inseticidas químicos são a estratégia mais pesadamente recorrida para obter o controle do verme da raiz do milho. O uso de inseticidas químicos, porém, é uma estratégia de controle de verme da raiz do milho imperfeita; $ 1 bilhão pode ser perdido nos Estados Unidos a cada ano devido ao verme da raiz do milho, quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano do verme da raiz que pode ocorrer não obstante o uso de inseticidas. Populações elevadas de larvas, as fortes chuvas e aplicação indevida dos inseticidas podem resultar no controle inadequado do verme da raiz do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar cepas do verme da raiz resistentes a inseticida, assim como suscitar preocupações ambientais significativos devido à toxicidade das espécies não alvos.

[0009] Pentatomídeos e outros insetos hemípteros (heteroptera) são outro complexo de praga agrícola importante. Em todo o mundo, mais de 50 espécies estritamente relacionadas de pentatomídeos são conhecidas de provocar danos às culturas. McPherson & McPherson (2000) Stink buqs of economic importance in America north of México, CRC Press. Os insetos hemípteros estão presentes em um grande número de culturas importantes incluindo milho, soja, frutas, legumes e cereais.

[0010] Os pentatomídeos passam por vários estágios de ninfa antes de atingir a fase adulta. Esses insetos se desenvolvem a partir de ovos até adultos em cerca de 30 a 40 dias. Tanto as ninfas quanto os adultos se alimentam da seiva de tecidos macios na qual eles também injetam enzimas digestivas que provocam a digestão do tecido extra-oral e necrose. A matéria vegetal digerida e os nutrientes são então ingeridos. A depleção de água e nutrientes do sistema vascular da planta resulta em danos nos tecidos vegetais. O dano ao desenvolvimento de grãos e sementes é o mais significativo, já que a produção e a germinação e são significativamente reduzidas. Várias gerações ocorrem em climas quentes resultando na pressão significativa de insetos. O atual controle dos pentatomídeos conta com o tratamento de inseticida em uma base de campo individual. Portanto, estratégias de controle alternativas são urgentemente necessárias para minimizar as perdas das culturas em curso.

[0011] A interferência do RNA (RNAi) é um processo que utiliza vias celulares endógenas, por meio do qual uma molécula de RNA in-terferente (RNAi) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para todas, ou qualquer parte de tamanho adequado, de um gene alvo resulta na degradação do mRNA assim codificado. Nos últimos anos, o RNAi foi utilizado para executar o gene "neutralizado" em várias espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabditis elegans, plantas, embriões de inseto e células na cultura de tecidos. Ver, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Ge-netics 3:737-47.

[0012] O RNAi executa a degradação do mRNA através de uma via endógena incluindo o complexo de proteína DICER. O DICER cliva as moléculas longas de dsRNA em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominados RNA de interferência pequeno (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de filamento único: o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro é degradado, e o filamento guia é incorporado no complexo de silencia-mento induzido por RNA (RISC). Os ácidos micro ribonucleicos (miR-NAs) são moléculas estrutural mente muito semelhantes que são cliva-das a partir das moléculas precursoras contendo um polinucleotídeo "loop" que conecta os filamentos passageiros e guias hibridizados, e eles podem ser similarmente incorporados no RISC. O silenciamento do gene pós-transcricional ocorre quando o filamento guia se liga especificamente a uma molécula de mRNA complementar e induz a cli- vagem por Argonaute, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é conhecido por dispersar sistemicamente em todo o organismo, não obstante inicialmente as concentrações limitadas de siRNA e/ou Mirna em alguns eucariotas tais como plantas, nematói-des, e alguns insetos.

[0013] Apenas os transcritos complementares ao siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados, e, assim a redução da expressão de mRNA é específica da sequência. Nos vegetais, os vários grupos funcionais de genes DICER existem. O efeito de silenciamento do gene de RNAi persiste durante dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio na abundância do transcrito direcionado de 90 % ou mais, com a consequente redução dos níveis da proteína correspondente. Em insetos, existem pelo menos dois genes DICER, onde o DICER1 facilita a degradação direcionada por miRNA através do Ar-gonautel. Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81. DICER2 facilitates siRNA-directed degradation by Argonaute2.

[0014] A Patente U.S. 7.612.194 e a Publicação de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 divulgam uma biblioteca de 9112 sequências de alvos de sequências expressas (EST) isoladas de pupas de D. v. virgifera LeConte. Sugere-se na Patente U.S. Ng 7612194 e na Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 operativamente se ligar a um promotor de uma molécula de ácido nu-cleico que é complementar àquela de várias sequências parciais particulares de H+ -ATPase do tipo vacuolar (V-ATPase) de D. v. virgifera aqui divulgadas para a expressão de RNA anti-sentido nas células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0192265 sugere a ligação operável de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. Virgifera de função desconhecida e não divulgada (a sequência parcial é mencionada de ser 58 % idêntica ao produto genético C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA anti-sentido nas células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0154545 sugere a ligação operável de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares de genes da subunidade beta coatomer de D. v. Virgifera para a expressão de RNA anti-sentido nas células vegetais. Além disso, a Patente U.S. N-7.943.819 divulga uma biblioteca de 906 sequências de alvo de sequência expressa (EST) isoladas de larvas, pupas e intestino médio dissecado de D. v. Virgifera LeConte, e sugere operacionalmente ligar um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de proteína 4b do corpo multivesicular carregado de D. v. virgifera para a expressão de RNA de filamento duplo nas células vegetais.

[0015] Nenhuma outra sugestão é fornecida na Patente U.S. N-7.612.194, e Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 para utilizar qualquer sequência particular das mais do que nove mil sequências nelas listadas com relação à interferência de RNA, diferentes das várias sequências parciais particulares de V-ATPase e as sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma das Patente U.S. N-7.612.194 e Publicação de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 fornece qualquer orientação quanto às outras das mais de nove mil sequências fornecidas que seriam letais, ou ainda de outra forma úteis, nas espécies do verme da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. N2 7.943.819 não fornece nenhuma sugestão de uso de qualquer sequência particular das mais de novecentas sequências nela listadas com relação à interferência do RNA, diferente da sequência parcial particular de um gene da proteína 4b do corpo multivesicular carregado. Além disso, a Patente U.S. N2 7.943.819 não fornece nenhuma orientação quanto a que outra das mais de novecentas sequências fornecidas seria letal, ou mesmo de outra forma útil, nas espécies de verme da raiz do milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. A Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/040173 e a Publicação do Pedido PCT No. WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada de um gene de Diabrotica virgifera Snf7 com relação à interferência de RNA no milho. (Também divulgado em Bolognesi et al. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534).

[0016] A esmagadora maioria das sequências complementares para os DNAs do verme da raiz do milho (tal como o precedente) não fornece um efeito protetor da planta a partir das espécies de verme da raiz do milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326, descrevem os efeitos de inibição dos vários alvos genéticos do WCR através do RNAi. stes autores relataram que 8 dos 26 genes alvos que eles testaram não foram capazes de fornecer experimentalmente mortalidade significativa da praga de coleópteros em uma concentração de iRNA muito elevada (por exemplo, dsRNA) de mais do que 520 ng/cm2.

[0017] Os autores da Patente U.S. N2 7.612.194 e da Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 criaram o primeiro relatório de RNAi in planta nas plantas de milho que direcionam o verme da raiz do milho ocidental. Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. Estes autores descrevem um sistema de RNAi dietético de produção elevada in vivo para rastrear genes alvos potenciais para o desenvolvimento de milho com RNAi transgênico. De uma concentração de genes inicial de 290 alvos, apenas 14 apresentaram potencial de controle larval. Um dos RNAs de filamento duplo mais eficazes (dsRNA) direcionado a um gene que codifica a subunidade A de ATPase vacuolar (V-ATPase), que resulta em uma rápida supressão do mRNA endógeno correspondente e ativação de uma resposta específica de RNAi com baixas concentrações de dsRNA. Assim, estes autores documentaram pela primeira vez o potencial de RNAi in planta como uma possível ferramenta de controle de pragas, enquanto simultaneamente demonstra que os alvos eficazes não podem ser identificados de forma precisa a priori, mesmo a partir de um conjunto relativamente pequeno de genes candidatos.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[0018] São aqui divulgadas moléculas de ácido nucleico (por exemplo, os genes alvo, DNA, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs), e métodos de seu uso, para o controle de pragas de insetos, incluindo, por exemplo, pragas de coleópteros, tais como D. v virgifera LeConte (verme da raiz do milho ocidental, "WCR."); D. Barberi Smith and Lawrence (verme da raiz do milho do norte, "NCR"); D. u. howardi Barber (verme da raiz do milho do sul, "SCR"); . D. v zeae Krysan and Smith (verme da raiz do milho mexicano, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Ger-mar, e pragas hemípteros, tais como Euschistus heros (Fabr.) (penta-tomídeos marrom da região neotropical, "BSB"); E. servus (Say) (pen-tatomídeo marrom); Nezara viridula (L.) (pentatomídeo verde do sul); Piezodorus guildinii (Westwood) (pentatomídeo de tiras vermelhas); Halyomorpha hális (Stal) (pentatomídeo marmorated marrom); China-via hilare (Say) (pentatomídeos); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Dichelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.) (pentatomídeo ombreado vermelho da região tropical); Horcias nobilellus (Berg) (besouro do algodão); Taedia stig-mosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalo-tomus parvus (Westwood); Leptoglossus zanatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (besouro da planta manchada ocidental); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois). Nos exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico exemplares são divulgadas que podem ser homólogas a pelo menos uma parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga de insetos.

[0019] Nestes e outros exemplos, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene alvo, o produto do qual pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento das larvas ou ninfas. Em alguns exemplos, a inibição pós-transcricional da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo um homólogo de po-linucleotídeo, pode ser letal para uma praga de insetos ou resultar na redução do crescimento e/ou a viabilidade de uma praga de insetos. Nos exemplos específicos, a subunidade do RNA polimerase II 33Kd (aqui referido como, por exemplo, rplI33) ou um homólogo de rplI33 pode ser selecionado como um gene alvo para o silenciamento pós-transcricional. Nos exemplos particulares, um gene alvo útil para a inibição pós-transcricional é um gene da RNA polimerase II33 e o gene é aqui referido como Diabrotica virgifera rpll33-1 (por exemplo, SEQ ID NO: 1), D. virgifera rpll33-2 (por exemplo, SEQ ID NO: 3), o gene aqui referidos como Euschistus heros rpll33-1 (por exemplo, SEQ ID nO: 76), ou E. heros rpll33-2 (por exemplo, SEQ ID NO: 78). Uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 76; o complemento da SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; e/ou fragmentos de qualquer um dos anteriores (por exemplo, SEQ ID NOs: 5 a 8 e SEQ ID NOs: 80 a 82) é, portanto, aqui divulgado.

[0020] Também são divulgadas as moléculas de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 85 % idêntica a uma sequência de amino-ácido dentro de um produto genético alvo (por exemplo, o produto de um gene rpll33). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85 % idêntico à SEQ ID NO: 2 (D. virgifera RPII33-1), SEQ ID NO: 4 (D. virgifera RPII33-2), SEQ ID NO: 77 (E. heros RPII33-1), ou SEQ ID NO: 79 (E. heros RPII33-2); e/ou uma sequência de ami-noácido dentro de um produto de D. virgifera rpl 133-1, D. virgifera rplI33-2, E. heros rpl 133-1, ou E. heros rplI33-2. São ainda divulgadas as moléculas de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que é o complemento reverso de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85 % idêntico a uma sequência de aminoáci-dos dentro de um produto genético alvo.

[0021] Também são divulgados os polinucleotídeos de cDNA que podem ser utilizados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares em todo ou parte de um gene alvo de pragas de insetos, por exemplo, um gene rplI33. Nas modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo, por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Nos exemplos particulares, as moléculas de cDNA são divulgadas que podem ser utilizadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo ou parte de um gene rplI33 (por exemplo, SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 76; e/ou SEQ ID NO: 78), por exemplo, um gene rplI33 de WCR (por exemplo, SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 3) ou o gene rpll33 de BSB (por exemplo, SEQ ID NO: 76 e/ou SEQ ID NO: 78).

[0022] São ainda divulgados meios para a inibição da expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera, e meios para fornecer proteção contra pragas coleópteras a uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera é uma molécula de RNA de filamento único ou duplo consistindo de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 94-97; e os seus complementos. Os equivalentes funcionais de meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleópte-ra incluem moléculas de RNA de filamento único ou duplo que são substancialmente homólogos a todo ou parte de um gene rpll33 de coleópteros que compreende a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, e/ou SEQ ID NO: 8. Um meio para fornecer proteção de pragas coleópteras a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo um polinucleotídeo que codifica um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera operativamente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no ge-noma de uma planta.

[0023] São ainda divulgados meios para a inibição da expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera, e meios para fornecer proteção contra as pragas hemípteras a uma planta. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera é uma molécula de RNA de filamento único ou duplo consistindo de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 100 a 102 e os seus complementos. Os equivalentes funcionais de meios para a inibição da expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera incluem as moléculas de RNA de filamento único ou duplo que são substancialmente homólogos a todo ou parte de um gene rplI33 de hemíptera que compreende a SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 e/ou SEQ ID NO: 82. Um meio para fornecer proteção de pragas hemípteras a uma planta é uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera operativamente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.

[0024] São divulgados métodos para o controle de uma população de uma praga de insetos (por exemplo, uma praga coleóptera ou he- míptera), compreendendo fornecer a uma praga de insetos (por exemplo, uma praga coleóptera ou hemíptera) uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que funciona após ser absorvida pela praga para inibir uma função biológica dentro da praga.

[0025] Em algumas modalidades, os métodos para controlar uma população de uma praga coleóptera compreende fornecer à praga coleóptera uma molécula de iRNA que compreende a totalidade ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 92; o complemento da SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; o complemento da SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; o complemento da SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 95; o complemento da SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; o complemento da SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 97; o complemento da SEQ ID NO: 97; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo rpl 133 nativo de uma praga coleóptera (por exemplo, WCR); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo rpl 133 nativo de uma praga de coleóptera; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3e5a8;eo complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 a 8.

[0026] Em algumas modalidades, um método para o controle de uma população de uma praga hemíptera compreende fornecer à praga hemíptero uma molécula de iRNA que compreende a totalidade ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 98; o complemento da SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; o complemento da SEQ ID NO: 99; SEQ ID NO: 100; o complemento da SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 101; o complemento da SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 102; o complemento da SEQ ID NO: 102; um polinu-cleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo rplI33 nativo de uma praga hemíptera (por exemplo, BSB); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo rplI33 nativo de uma praga hemíptera; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78 e 80 a 82; e o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78, e 80 a 82.

[0027] Nas modalidades particulares, um iRNA que funciona após ser absorvido por uma praga de insetos para inibir uma função biológica dentro da praga é transcrito a partir de um DNA compreendendo a totalidade ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 76; o complemento da SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 a 8; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 a 8; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78 e 80 a 82; e o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78, e 80 a 82.

[0028] Também são aqui divulgados métodos em que os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser fornecidos a uma praga de insetos em um ensaio à base de dieta, ou em células vegetais geneticamente modificadas que expressam os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs. Nestes e em outros exemplos, os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser ingerido pela praga. A ingestão de dsRNAs, siRNA, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar em RNAi na praga, que por sua vez pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade da praga e em última análise levar à mortalidade. Assim, os métodos são divulgados em que as moléculas de ácido nucleico compreendendo polinucleotídeos exemplares úteis para o controle parental de pragas de insetos são fornecidos para uma praga de insetos. Nos exemplos particulares, uma praga coleóptera e/ou hemíptera controlada através do uso de moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser WCR, NCR, SCR, D. undecimpunctata howardi, D. balteata, D. un-decimpunctata tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, BSB, E. servus, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chi-navia hilare, C. marginatum, Dichelops melacanthus, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglos-sus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, ou L. lineolaris.

[0029] O precedente e outros aspectos se tornarão mais evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada das diversas modalidades, que prossegue com referência às Figuras 1 a 2 anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0030] A FIGURA 1 inclui uma representação de uma estratégia utilizada para fornecer dsRNA a partir de um modelo único de transcrição com um único par de iniciadores.

[0031] A FIGURA 2 inclui uma representação de uma estratégia utilizada para fornecer dsRNA a partir de dois modelos de transcrição.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0032] As sequências de ácido nucleico identificadas na listagem de sequências anexa são mostradas utilizando abreviações com letras padrão para bases de nucleotídeo, como definido no 37 C.F.R. § 1.822. As sequências de ácido nucleico e aminoácido listadas definem as moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) tendo os monômeros de nucleotídeo e aminoácido dispostos da maneira descrita. As sequências de ácido nucleico e aminoácido listadas também definem cada uma um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem os monômeros de nucleotídeos e aminoácido dispostos da maneira descrita. Em vista da redundância do código genético, ficará entendido que uma sequência de nucleotídeo incluindo uma sequência de codificação também descreve o gênero de polinucleotídeos que codificam o mesmo polipeptídeo como um poli-nucleotídeo que consiste na sequência de referência. Ficará ainda entendido que uma sequência de aminoácido descreve o gênero do poli-nucleotídeo ORFs que codifica esse polipeptídeo.

[0033] Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido como incluído por qualquer referência ao filamento apersentado. Visto que o complemento e o complemento inverso de uma sequência de ácido nucleico primária são necessariamente divulgados pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência inversa de uma sequência de ácido nucleico são incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a não ser que explicitamente mencionado de ser de outra maneira (ou fica claro de ser de outro modo a partir do contexto em que a sequência aparece). Além disso, como fica entendido na técnica que a sequência de nucleotídeo de um filamento de RNA é determinada pela sequência do DNA do qual foi transcrito (mas para a substituição de nucleobases de uracila (U) para timina (T)), uma sequência de RNA é incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na listagem de sequências em anexo.

[0034] A SEQ ID NO: 1 mostra um DNA rplI33 de WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpl 133-1 de WCR: G C CG AT G CC AT AC AT AC G CTT AAAAC AT CGT AT CT G CT C AGTT CTT T AATT AAC ACT G AAG AAAAT C G AATT AT AAAAT G C C CT AC G CT AAC ACACCGT CAGTAC AAATTT CT G AACT AACCG AT GAAAAT GTTAAGT TCGT CGTT GAGG ACACAGACCTTAGCTT GGCAAACAGT CT ACGT C GT GTTTT CAT CGCT G AAACT CCAACCCTAGCAATCGATT G GGTT CA ATTCGAAGCCAACTCCACTGTACTGGCAGATGAATTCCTTGCCCA TC GAATTG G CTTGATTC C ATTG ATTTCC G ATG AG GTAGTG G AC AG AATCCAAAACACT CGT GAAT GTT CAT G CTT GGACTTTTGCACCG AG T G C AGT GTG G AATTT AC ATT G G AT GT C AAAT G C AG C G AC G AAC AT ACGCGCCACGTTACCACGGCC G ATTT AAAG TCCAGTGACGCACG AGT GCT ACC AGTT ACGT CC AG ACAT CG CG AT G ACG AG G AC AACG A AT AT G G AG AG AC G AAC G AT G AAATT CT G AT CAT C AAACT G CG C AA AGGTCAAGAGCTGAAGTTGCGAGCATACGCGAAAAAGGGTTTCG GCAAGGAACATGCCAAATGGAATCCAACGGCTGGCGTTAGCTTTG AAT ACG ATCCAGT CAATT CGAT G AGACAT ACCCT GTACCCGAAGC CGGACGAAT GGCCGAAAAGT G AGCACACCG AACTT GACGAT GAT CAATACGAAGCTGAATATAACTGGGAGGCTAAGCCGAACAAGTTT TT CTT CAACGTT GAGT CGAGTGGTGCACTT CGACCGG AAAACATT GT GCT GATGGGAGT CAAAGTTTT GAAAAACAAATT GT CCAAT CTAC AGACGCAGTTAAGTCACGAATTGACTACAAACGATGCGCTCGTGA TT C AGT AAAAG CAG CGATCCC ATT G AATTT CTT CAAAAT CTT GTTTT TTTCCTCTAAG

[0035] A SEG ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácido de um polipeptídeo RPII33 codificado por um DNA rplI33 de WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como RPII33-1 de WCR: MPYANTPSVQISELTDENVKFVVEDTDLSLANSLRRVFIAETPTLAIDW

VQFEANSTVLADEFLAHRIGLIPLISDEVVDRIQNTRECSCLDFCTECS VEFTLDVKCSDEHTRHVTTADLKSSDARVLPVTSRHRDDEDNEYGET NDEILIIKLRKGQELKLRAYAKKGFGKEHAKWNPTAGVSFEYDPVNS MRHTLYPKPDEWPKSEHTELDDDQYEAEYNWEAKPNKFFFNVESS GALRPENIVLMGVKVLKNKLSNLQTQLSHELTTNDALVIQ

[0036] A SEQ ID NO: 3 mostra um outro DNA rpll33 de WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpl 133-2 de WCR: CGTT GACACT GTT G ACAGT GACAGTT GAAATT GAAAACCGGATTA G AG AAGTTTT CTTG G AAAGTT GTTTTTTT AAAT AACT AAC ATT AAAT AG AAGTTATTTGTTTAAG G GTTTAATATG CC ATATG CAAATCAG CC AT C AGTT C AT AT AAC AG ATTT AAC AG AT G AT AATT G C AAATTTT AT A TAGAAGACACTGATTTAAGTGTTGCGAATAGCATTCGCCGCGTCC TT ATT G C AG AAACTCCT ACT CT AG CT AT AG ACT G G GTAAAATT AG A AG CT AACT C AACT G TTCT C AG T G AT G A ATTTTT AG C AC AC C G AATT G G ATT G AT AC C ATT AGTTT C CG AT G AAGTT GT AC AAAG ATT AC AAT ATCCTAGGGACTGCGTATGTCTCGATTTTTGTCAAGAATGCAGTGT T G AATTT ACTTT AG AT GT AAAAT GTAC AG AT G AT C AAACT C G AC AT GT AACAACT G CCG ATTTT AAATCTAGT G ATCCACG AGT CAT ACCAG CTACTTCCAAACAT CGT GAT GAT GAAT CCT CAGAGTAT GGT GAAAC AG AT GAAATT CTT ATT ATT AAAC TG C G AAAG G G T C AAG AG CTT AAA GTTAAAGCGTATG CCAAAAAAG G CTTTG G AAAAG AG CATG CCAAA TGGAATCCTACATGTGGTGTTGCCTTTGAATATGATCCTGATAACG CT AT G AG AC AT AC ATT ATTT CCT AAAC C AG AC GAAT G G CCT AAAAG TGAATACAGCGAATTAGAAGATGATCAGTATGAAGCTCCATATAAC TG G G AATT AAAAC CT AAT AAATT CTT CT AC AAT GTG G AG GCTGCTG GATT GTT GAAAC C AG AAAAT ATT GT CAT CATG GGT GTAGCT AT GTT AAAAGAAAAACT GT C AAATTT G CAAAC ACAACT CAGCCAC G AACT A ACACCT GAT GTTTT GGCCATT CC AATTT AAG AAGTTAATTAC AAT CA T AGGT AG AGTT C ATT C AAC C AC AGTT AT AC ATTTTTTTT AT AAT AG A T AAGT AAGTTTT AC ACT AT AG G AAC AATTTTT G AC AT GTT G ACT AAA

G AT CTT GTT CAAAT AGACT AGAAAT AAAATTTT GAAT CCAAAAAAAA AAA

[0037] A SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácido de um polipeptídeo RPII33 do WCR codificado por um outro DNA rpl 133 de WCR exemplar (isto é, rpl 133-2): MPYANQPSVHITDLTDDNCKFYIEDTDLSVANSIRRVLIAETPTLAIDW

VKLEANSTVLSDEFLAHRIGLIPLVSDEVVQRLQYPRDCVCLDFCQEC

SVEFTLDVKCTDDQTRHVTTADFKSSDPRVIPATSKHRDDESSEYGE

TDEILIIKLRKGQELKVKAYAKKGFGKEHAKWNPTCGVAFEYDPDNA

MRHTLFPKPDEWPKSEYSELEDDQYEAPYNWELKPNKFFYNVEAAG

LLKPENIVIMGVAMLKEKLSNLQTQLSHELTPDVLAIPI

[0038] A SEQ ID NO: 5 mostra um DNA rpll33 de WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpll33-1 do WCR regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: G AATT CCTTGCCCATC G AATT G G CTT G ATT C C ATT G ATTT C C G ATG AGGT AGT G G ACAG AATCCAAAACACT C GT GAAT GTT CAT G CTTGG ACTTTT GCACCGAGTGCAGT GT GG AATTT ACATTGG AT GT CAAAT G CAGCGACGAACATACGCGCCACGTTACCACGGCCGATTTAAAGTC CAGT GACGCACGAGTGCTACCAGTTACGTCCAGACAT CGCGAT GA CGAGGACAACGAATATGGAGAGACGAACGATGAAATTCTGATCAT C AAACTG CG C AAAG GTC AAG AG CTGAAGTTG C G AG CATAC G CG A AAAAGGGTTTCG G C AAG G AAC ATG CC AAATG G AATC C AAC G G CTG GCGTTAGCTTTGAATACGATCCAGTCAATTCGATGAGACATACCCT GTACCCGAAGCCGGACGAATGGCCGAAAAGTGAGCACACCGAAC TT G ACG AT GATCAATACGAAGCT GAAT ATAAC

[0039] A SEQ ID NO: 6 mostra um DNA rpll33 de WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpll33-2 do WCR regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: GTTCT CAGT G AT G AATTTTT AG C AC AC C G AATT G G ATT G AT ACC AT TAGTTT CCGAT GAAGTT GTACAAAGATTACAATAT CCTAGGGACT G

CGTAT GT CTCGATTTTT GT CAAG AAT G CAGT GTT G AATTTACTTTA GAT GTAAAAT GTACAGAT GAT CAAACT CGACAT GTAACAACT GCCG ATTTT AAAT CT AGT G AT CC AC G AGT C AT AC C AG CT ACTT CC AAAC A TC GT GAT GAT G AAT CCT C AG AGTAT G G T G AAAC AG AT G AAATT CTT ATT ATT AAACT G C G AAAG G GTC AAG AG CTT AAAGTT AAAG CGTATG CCAAAAAAGGCTTTGGAAAAGAGCATGCCAAATGGAATCCTACAT GTGGTGTTGCCTTTGAATATGATCCTGATAACGCTATGAGACATAC ATT ATTT CCT AAAC C AG AC G AAT G G C C T AAAAGT G AAT AC AG C G AA TTAG AAG ATG ATC AGTATG AAG CTC CATATAACTG G G

[0040] A SEQ ID NO: 7 mostra um DNA rpl 133 de WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpl 133-2 do WCR v1 (versão 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: CTTT AG AT GTAAAAT GT AC AG AT GAT CAAACT CGACAT GT AAC AAC TGCCGATTTTAAATCTAGTGATCCACGAGTCATACCAGCTACTTCC AAACATCGT GAT GAT G AAT CCT CAGAGTATGGT G AAACAG

[0041] A| SEQ ID NO: 8 mostra um DNA rplI33 de WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como rplI33-2 do WCR v2 (versão 2), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: G CGTATG CCAAAAAAG G CTTTG G AAAAG AGCATG CC AAATG G AAT CCTACATGTGGTGTTGCCTTTGAATATGATCCTGATAACGCTATGA GACATACATTATTTCCTAAACCAGACGAATGGCC

[0042] A SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de nucleotídeo do promotor de fago T7.

[0043] A SEQ ID NO: 10 mostra um fragmento de uma sequência de codificação YFP exemplar.

[0044] As SEQ ID NOS: 11 a 18 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as partes das sequências de rpll-33 do WCR exemplares compreendendo rpll33-1 regí, rpll33-2 regí, rpll33-2 v1, e rpll33-2 v2, utilizado em alguns exemplos para produção de dsRNA.

[0045] A SEQ ID NO: 19 mostra um gene de YFP exemplar.

[0046] A SEQ ID NO: 20 mostra uma sequência de DNA da região de annexin 1.

[0047] A SEQ ID NO: 21 mostra uma sequência de DNA da região de annexin 2.

[0048] A SEQ ID NO: 22 mostra uma sequência de DNA da região 1 de beta espectrin 2.

[0049] A SEQ ID NO: 23 mostra uma sequência de DNA da região 2 de beta espectrin 2.

[0050] A SEQ ID NO: 24 mostra uma sequência de DNA da região de mtRP-L4 1.

[0051] A SEQ ID NO: 25 mostra uma sequência de DNA da região de mtRP-L4 2.

[0052] As SEQ ID NOS: 26 a 53 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as regiões do gene de annexin, beta spectrin 2, mtRP-L4, e YFP para a síntese de dsRNA.

[0053] A SEQ ID NO: 54 mostra uma sequência de DNA do milho que codifica uma proteína semelhante a TIP41.

[0054] A SEQ ID NO: 55 mostra a sequência nucleotídeo de um oligonucleotídeo iniciador T20VN.

[0055] A SEQ ID NOS: 56 a 60 mostram os iniciadores e as sondas utilizados para as análises de expressão de transcrição de dsRNA no milho.

[0056] A SEQ ID NO: 61 mostra uma sequência de nucleotídeo de uma parte de uma região de codificação SpecR utilizada para a detecção da cadeia principal do vetor binário.

[0057] A SEQ ID NO: 62 mostra uma sequência de nucleotídeo de uma região de codificação AAD1 utilizada para análise do número de cópias genômicas.

[0058] A SEQ ID NO: 63 mostra uma sequência de DNA de um gene da invertase do milho.

[0059] As SEQ ID NOS: 64 a 72 mostram as sequências de nucle-otídeo de oligonucleotídeos de DNA utilizados para as determinações do número de cópias do gene e detecção da cadeia principal do vetor binário.

[0060] As SEQ ID NOS: 73 a 75 mostram os iniciadores e as sondas utilizados para a análise da expressão do milho transcrito por dsRNA.

[0061] A SEQ ID NO: 76 mostra um DNA rpll33 de BSB exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpl 133-1 do BSB: GTTC G G CTCG G GTG AGTGTTTAAAC CAACTAC G C ATCTTGTTCTC GAACCTTT GCGAACAGT GTTCACAAAT AATGCT CGGTT GGT GTAAA GGTACCTTTAGAGCGTGACCCCAACTTCTTTTGACTCACCTTGCA G AAACT C G AT C ACTAAC AATT ACGTGT ATAT AAT C G ATT C ACT AC A C G AAC G AT AC AT G G TTG TTT AG G TT AC ATT C AT G TT AT C TTT AG T AA T GAAGTTATT GAGTTGGCCTAATT GTT GAAT GTAGTTAACAGAAT G CCTTATGCCAATCAACCTTCTGTTCATGTTTCAGATTTAACCGACG AC AATGTTAAATTC CAAATAG AAG ATAC AG AATTAAGTGTC G CTAA C AG C CT C AG AAG AGT CTT C AT AG CT G AAAC CC C AACTTT AG CT ATT GATT GGGT GCAATT GTCTGCAAATTCTACTGTTTTAAGT GAT GAAT TT ATT G CTT CT AG AAT CGG ACTT ATTCCTTT AACTT CT G AT G CT GC A GTC G AAAAATT AAT CT ATT CT AG G G ACT GT AATT GT ACT G ATTT CT GCCCAT CCT GTAGT GTT GAGTTT ACTTTAG AT GT CAAAT GT GTAG A T GAT C AAACT AG AC ATGTG AC AACT G C AG ATTT AAAG ACT G CT GAT CCAT GTGT AGTTCCTGCTACAT CTAAAAAT AGAGATGCT GAT GCCA AT GAAT AT GGT GAAT C AG AT GAT ATTTT GATT GTT AAATT AAG AAAA GGACAAGAGCTTAAATTGAGGGCCTTTGCTAAGAAAGGTTTTGGT AAGGAACAT GCTAAGTGGAAT CCTACTGCT GGGGTTT GTTTT GAG TAT GACCCT G ACAACT CAAT GAGGCATACACT GTTTCCAAAACCAG AT GAGT GGCCAAAAAGT GAAT ATACT GAATTAGAT GAG GAT CAGTA T G AAG CT CC ATTT AATT G G G AAG C C AAACCT AAC AAATTTTT CTTC

AATGTTGAAAGTTGTGGATCTTTGCGCCCCGAAAACATAGTATTAA AAG G AGT AG AAGTT CT AAAAT AT AAACTTT CT G ATTT ATT AATT C AA TT G AGT C AT G AAT C AG CT G G C C AAGTT G AT C AT AT G CCT GTTT AAC CAGTTTTT GT G AT AAATT ATT AT CT G AAAT AATT CAATT ATT AT ATTT AT ATT AAT GT AAAAT AAAAAG AAATTT G AT AACT G AAAAAAAAAAAA AAAAAT CT ATT G AAAG AAT AC ATT C ATT AAT ACCTTT CT AAAG AAAA ATT ATT C AATTT AAAATT GTT G CC AAAAAGTATT CAG C ATTTTTTT AA AATT C AAT CT AG G C AT AT ACT ACT GT AAAT AAAT AC AAAC AAT ACTT TCATTTTTGTACTGTTCTAAAAATTGT

[0062] A SEQ ID NO: 77 mostra a sequência de aminoácido de um polipeptídeo RPII33 do BSB codificado por um DNA rpl 133 do BSB exemplar (isto é, rpl 133-1 do BSB): MPYANQPSVHVSDLTDDNVKFQIEDTELSVANSLRRVFIAETPTLAID

WVQLSANSTVLSDEFIASRIGLIPLTSDAAVEKLIYSRDCNCTDFCPSC

SVEFTLDVKCVDDQTRHVTTADLKTADPCVVPATSKNRDADANEYG

ESDDILIVKLRKGQELKLRAFAKKGFGKEHAKWNPTAGVCFEYDPDN

SMRHTLFPKPDEWPKSEYTELDEDQYEAPFNWEAKPNKFFFNVESC

GSLRPENIVLKGVEVLKYKLSDLLIQLSHESAGQVDHMPV

[0063] A SEQ ID NO: 78 mostra um DNA rplI33 do BSB exemplares, referido aqui em alguns lugares como rplI33-2 do BSB: T GTAAAACTT GTT CTTT AAG AT CT CAAG ACCTTTT ATT AG AACAT CT ACAGGCTTAAGAGAGCCCTCTACAACTTCTACGTCCATGTGCACC GT GT CT ATTT CACAAAGGAGAT CTGGTT CTTCCT CCT CAACCAT CG GCCAGTCCTTCTTAAGCGTATCTTCTGTCCAGTAGTTTGTGGACCT AGT CTT ATT G GTTCT AT C AT ACT C G AAC CC G AC AAC AG AG AC AG G AGACCACTT GGCAT GCAT CCTCCCTAT CCCCTT CCT AGCAAT ACA C CT AATTTT C AG GCTTT G ATT CTT C CC AAGTTTT G CAATT AC C G GT GT GCTTTTT AT AAAAGT CTCGT C ACT GT CAAATTTT AT GT CTTT ACA AGT C ACGTT AAG G G G G GT CT CT G AG G TGTTG CT AACAT C AAGTT C C AT CT CT AC G G AAC AACG AG AG C AAAG CT C AT C AC AGTC AC ACT C

TT CTTTATACACAAGCT CTTT CTTT GAGTACATT GGGATAAGCCCA AG G G ACT GTG C C AAT ACTT C AT C G G G G AG G AC C GTGTTG TTTTT G ATGATTTC G AC G AG AT CT ATT G C G ATAGTAG GTACTTC AG ATAAG A G G ATT CT C CTT AG AG C ATT AG C AT AG G AG ACT GTAAT C CC AGT G A G AGT G AATTT G AT GT GTTCGT CGTTTT GTTCGT G AATT GT AATTTT C ATGAGAAAG CTG G AG G G C AAAAG AAATG AAGTAAATTTAG AAG G G AACACCT GT GAAGTAT GATCGACTACG

[0064] A SEQ ID NO: 79 mostra a sequência de aminoácido de um outro polipeptídeo RPII33 do BSB codificado por um DNA rpl 133 do BSB exemplar (isto é, rpl 133-2 do BSB): MKITIHEQNDEHIKFTLTGITVSYANALRRILLSEVPTIAIDLVEIIKNNTV

LPDEVLAQSLGLIPMYSKKELVYKEECDCDELCSRCSVEMELDVSNT

SETPLNVTCKDIKFDSDETFIKSTPVIAKLGKNQSLKIRCIARKGIGRMH

AKWSPVSVVGFEYDRTNKTRSTNYWTEDTLKKDWPMVEEEEPDLLC

EIDTVHMDVEVVEGSLKPVDVLIKGLEILKNKFY

[0065] A SEQ ID NO: 80 mostra um DNA rpll33 do BSB exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpl 133-1 do BSB regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: G GTG AATCAGATGATATTTTGATTGTTAAATTAAG AAAAG G AC AAG AG CTTAAATTG AG G G CCTTTG CTAAG AAAG GTTTTG GTAAG GAAC ATGCTAAGTGGAATCCTACTGCTGGGGTTTGTTTTGAGTATGACC CT GACAACT CAAT GAGGCATACACT GTTT CCAAAACCAGAT GAGT GGCCAAAAAGTGAATATACTGAATTAGATGAGGATCAGTATGAAG CT C C ATTT AATT G G G AAG C C AAAC CT A AC

[0066] A SEQ ID NO: 81 mostra um outro DNA rpll33 do BSB exemplar, referido aqui em alguns lugares como rpl 133-1 do BSB v1 (vêrsão 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: TT GTTTT GAGT AT GACCCT GACAACT CAAT GAGGCATACACT GTTT CCAAAACCAGAT GAGT GGCCAAAAAGT GAATATACT GAATTAGAT

GAGGATCAGTATGAAGCTCC

[0067] A SEQ ID NO: 82 mostra um DNA rpl 133 de BSB exemplares, referido aqui em alguns lugares como rpl 133-2 do BSB regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA: CGTCGAAATCATCAAAAACAACACGGTCCTCCCCGATGAAGTATT G G CACAGTCCCTTGG G CTTATC C C AATGTACTC AAAG AAAG AG CT T GT GTATAAAGAAGAGT GT GACT GT GAT GAGCTTTGCT CTCGTT GT TCCGTAGAGATGGAACTTGATGTTAGCAACACCTCAGAGACCCCC CTT AACGT G ACTT GTAAAG ACAT AAAATTT G ACAGT G ACG AG ACTT TTATAAAAAG C AC ACC G GTAATTG CAAAACTT G G G AAG AATC AAAG CCTGAAAATTAGGTGTATTGCTAGGAAGGGGATAGGGAGGATGCA TGCCAAGTGGTCTCCTGTCTCTGTTGTCGGGTTCGAGTATGATAG AACC AAT AAG ACT AG GTC C AC AAACT ACT G G AC AG

[0068] As SEQ ID NOS: 83 a 88 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as partes das sequências de rpll-33 do BSB exemplares compreendendo rpll33-1 regí, rpll33-2 regí, e rplí33-1 v1, utilizados em alguns exemplos para a produção de dsRNA.

[0069] A SEQ ID NO: 89 mostra um DNA do YFP v2 exemplar, que é utilizado em alguns exemplos para a produção do filamento sentido de um dsRNA.

[0070] As SEQ ID NOs: 90 e 91 mostram os iniciadores utilizados para a amplificação por PCR da sequência de YFP YFP v2, utilizado em alguns exemplos para a produção de dsRNA.

[0071] As SEQ ID NOs: 92 a 102 mostram RNAs exemplares transcritos a partir de ácidos nucleicos compreendendo polinucleotí-deos rplI33 exemplares e seus fragmentos.

[0072] A SEQ ID NO: 103 mostra um DNA exemplar que codifica um dsRNA rplI33-2 v1 de Diabrotica\ contendo um polinucleotídeo de sentido, uma sequência do circuito (itálicos), e um polinucleotídeo anti- sentido (tipo de letra sublinhado): CTTT AGAT GT AAAAT GT ACAG AT GAT CAAACT CGACAT GT AACAAC T G C CG ATTTT AAAT CT AGT G AT C C AC G AGTC AT ACC AG CT ACTT C C AAACATCGT GAT GAT G AAT CCT CAGAGTATGGT G AAACAG GAAGC TAGT ACC AG TCA TCACGCTGGAGCGCA CA TA TAGGCCCTCCA TC A GAAAGTCA TTGTGTA TA TCTCTCA TAGGGAACGAGCTGCTTGCGT A TTTCCC TTCCG TA G TCA GA G TCA TCAA TCAGCTGCACCG TG TCG TAAAGCGGGACGTTCGCAAGCTCGTCCGCGGTACTGTTTCACCAT ACTCTGAGGATTCATCATCACGATGTTTGGAAGTAGCTGGTATGA CTC GTG GAT C ACT AG ATTT AAAAT C G G C AG TT G TT AC AT G TC G AG T TT GAT C AT CT GT AC ATTTT AC ATCTAAAG

[0073] A SEQ ID NO: 104 mostra um DNA exemplar que codifica um dsRNA rplI33-2 v2 de Diabrotica; contendo um polinucleotídeo de sentido, uma sequência de circuito (itálicos), e um polinucleotídeo anti-sentido (tipo de letra sublinhado): G C GT AT G C C AAAAAAG G CTTT G G AAAAG AG C AT G C C AAAT G G AAT CCTACATGTGGTGTTGCCTTTGAATATGATCCTGATAACGCTATGA G AC ATACATTATTTCCTAAACCAG ACG AATG G C CGAAGCTA GTAC CAGTCA TCACGCTGGAGCGCA CA TA TA GGCCCTCCA TCA GAAA G T CA TTGTGTA TA TCTCTCA TAGGGAACGAGCTGCTTGCGTA TTTCCC TTCCGTA G TCA GA G TCA TCAA TCAGCTGCACCGTG TCG TAAAGCG GGACGTTCGCAAGCTCGTCCGCGGTAGGCCATTCGTCTGGTJTA GGAAATAATGTATGTCTCATAGCGTTATCAGGATCATATTCAAAGG CAACACCACATGTAGGATTCCATTTGGCATGCTCTTTTCCAAAGCC TTTTTT G G C AT AC G C

[0074] As SEQ ID NOs: 105 a 106 mostram as sondas utilizadas para a análise de expressão de dsRNA.

[0075] A SEQ ID NO: 107 mostra uma sequência de nucleotídeo de DNA exemplar que codifica um circuito de intervenção em um dsRNA.

[0076] As SEQ ID NOs: 108 a 109 mostram dsRNA exemplares transcritos a partir de um ácido nucleico compreendendo fragmentos de polinucleotídeo rplI33-2 exemplares.

[0077] As SEQ ID NOs: 110 a 111 mostram os iniciadores utilizados para as análises de expressão de transcrição de dsRNA no milho. DESCRIÇÃO DETALHADA I. Resumo de várias modalidades [0078] Foi desenvolvida uma interferência de RNA (RNAi) como uma ferramenta para o controle de pragas de insetos, utilizando uma das espécies de praga alvo mais prováveis para as plantas transgêni-cas que expressam dsRNA; o verme da raiz do milho ocidental. Até aqui, a maioria dos genes propostos como alvos para o RNAi em larvas de verme da raiz do atualmente não alcançam os seus propósitos. Aqui, foi descrita a redução mediada por RNAi da RNA polimerase 33 (rplI33) nas pragas de insetos exemplares, o verme da raiz do milho ocidental e o pentatomídeo marrom da região neotropical, a qual mostrou-se de ter um fenótipo letal quando, por exemplo, as moléculas de iRNA são liberadas por meio da do dsRNA rplI33 ingerido ou injetado. Nas modalidades aqui, a capacidade de liberar o dsRNA de rpl133 através da alimentação aos insetos confere um efeito de RNAi que é muito útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópte-ro e hemíptero). Através da combinação de RNAi mediado porrpll33 com outros alvos de RNAi úteis (por exemplo, ROP (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577811), RNAPII (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577854), alvos de RNA polimerase 11 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/133214, alvos de RNA polimerase 11215 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. No. 62/133202, nem (Pedido de Patente U.S. No. 62/095487), Dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), COPI alfa (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gama (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), e COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216)), o potencial de afetar as várias sequências alvos, por exemplo, nos verme da raiz lar-vais, pode aumentar as oportunidades para desenvolver abordagens sustentáveis para o controle de pragas de insetos envolvendo as tecnologias de RNAi.

[0079] São aqui divulgados métodos e composições para o controle genético de infestações por pragas de insetos (por exemplo, coieóp-teros e/ou hemípteros). Os métodos para identificar um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga de insetos para uso como um gene alvo para o controle mediado por RNAi de uma população de pragas de insetos também são fornecidos. Os vetores de plasmí-deo de DNA que codificam uma molécula de RNA podem ser designados para suprimir um ou mais genes alvo essenciais para o crescimento, sobrevivência e/ou desenvolvimento. Em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser capaz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas modalidades, métodos são fornecidos para a repressão pós-transcricional da expressão ou a inibição de um gene alvo por meio de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma sequência de codificação ou não codificação do gene alvo em uma praga de insetos. Nestas e outras modalidades, uma praga pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA transcritas de toda ou uma parte de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de codificação ou não codificação de um gene alvo, fornecendo assim um efeito protetor para as plantas.

[0080] Assim, algumas modalidades envolvem a inibição específica da sequência da expressão de produtos genéticos alvos, utilizando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar às sequências de codificação ou não codificação dos genes alvos para alcançar pelo menos o controle parcial de uma praga de insetos (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). É divulgado um conjunto de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo um polinucleotídeo, por exemplo, como apresentado em uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 76, e 78, e seus fragmentos. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir destes polinucleotídeos, seus fragmentos, ou um gene que compreende um desses polinucleotídeos, para o silenciamento ou inibição pós-transcricional de um gene alvo. Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreender a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3, 5-8, 76, 78, e 80 a 82.

[0081] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira re-combinante (por exemplo, uma célula vegetal) tendo no seu genoma pelo menos um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Nas modalidades particulares, uma molécula de dsRNA codificada pode ser fornecida quando ingerida por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) para pós-transcricionalmente silenciar ou inibir a expressão de um gene alvo na praga. O DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78, e 80 a 82, fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82, e um polinucleotídeo que consiste em uma sequência parcial de um gene compreendendo uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82, e/ou os seus complementos.

[0082] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante tendo no seu genoma um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) que compreende a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, ou SEQ ID NO: 99 (por exemplo, pelo menos um polinucleotídeo selecionado de um grupo compreendendo as SEQ ID NOs: 94 a 97 e 100 a 102), ou o seu complemento. Quando ingeridas por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), as moléculas de RNAi podem silenciar ou inibir a expressão de um DNA rpl 133 alvo (por exemplo, um DNA compreendendo a totalidade ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78, e 80 a 82) na praga ou na progênie da praga, e desse modo resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, viabilidade e/ou alimentação da praga.

[0083] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombi-nante que possui no seu genoma pelo menos um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA, pode ser uma célula vegetal transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgénicas compreendendo uma tal célula vegetal transformada. Além de tais plantas transgénicas, as plantas progênies de qualquer geração de planta transgênica, sementes transgénicas e produtos vegetais transgênicos são totalmente fornecidos, cada um dos quais compreende DNA recombinante. Nas modalidades particulares, uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser expressa em uma célula vegetal transgênica. Portanto, nestas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser isolada de uma célula vegetal transgênica. Nas modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo que compreende milho (Zea mays), soja (Glycine max), algodão (Gossypium sp.), e plantas da família Poaceae.

[0084] Outras modalidades envolvem um método para a modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser fornecida, em que a molécula de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser operativamente ligada a um promotor, e pode também ser operativamente ligado a uma sequência terminal da transcrição. Nas modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de praga de inseto pode compreender: (a) a transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo um po-linucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA; (b) o cultivo da célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) a seleção de uma célula vegetal transformada que integra o vetor no seu genoma; e (d) a determinação de que a célula vegetal transformada selecionada compreende a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA codificada pelo polinu-cleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula vegetal que possui o vetor integrado no seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor.

[0085] Também é divulgada uma planta transgênica que compreende um vetor tendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrada no seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Nas modalidades particulares, a expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera) que entra em contacto com a planta transformada ou célula vegetal (por exemplo, através da alimentação na planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula vegetal), de tal modo que o crescimento e/ou a sobrevivência da praga é inibida. As plantas transgênicas aqui divulgadas podem apresenta- ram proteção e/ou proteção reforçada para infestações de pragas de insetos. As plantas transgênicas particulares podem apresentaram proteção e/ou de proteção reforçada a uma ou mais pragas coleópte-ras e/ou hemípteras selecionadas a partir do grupo consistindo de: WCR; BSB; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; Euschistus heros (Fabr.); E. servus (Say); Nezara viridula (L.); Piezodorus guildinii (Wes-twood); Halyomorpha halys (Stâl); Chinavia hilare (Say); C. margina-tum (Palisot de Beauvois); Dichelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.); Horcias nobilellus (Berg); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zona-tus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight); e L. lineola-ris (Palisot de Beauvois).

[0086] Ainda são aqui divulgados métodos para a liberação de agentes de controle, tais como uma molécula de RNAi, a uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Tais agentes de controle podem provocar, direta ou indiretamente, uma deficiência na capacidade de uma população de pragas de insetos de se alimentar, crescer, ou de outra forma provocar danos em um hospedeiro. Em algumas modalidades, um método é fornecido compreendendo a liberação de uma molécula de dsRNA estabilizada a uma praga de insetos para suprimir pelo menos um gene alvo na praga, desse modo fazendo com que o RNAi reduza ou elimine o dano vegetal em um hospedeiro da praga. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene alvo na praga de inseto pode resultar na cessação do crescimento, sobrevivência e/ou desenvolvimento da praga.

[0087] Em algumas modalidades, as composições (por exemplo, uma composição tópica) são fornecidas as quais compreendem uma molécula iRNA (por exemplo, dsRNA) para uso nas plantas, animais, e/ou o meio ambiente de uma planta ou animal para conseguir a eliminação ou redução de uma infestação de pragas de inseto (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Nas modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser alimentada à praga de inseto, ou uma isca de RNAi. Algumas modalidades compreendem tornar a composição nutricional ou fonte alimentar disponível para a praga. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de RNAi pode resultar na absorção das moléculas de uma ou mais células da praga, o que pode por sua vez resultar na inibição da expressão de pelo menos um gene alvo nas células da praga. A ingestão ou dano a uma planta ou célula vegetal por uma infestação de praga de inseto pode ser limitado ou eliminado em ou sobre qualquer tecido hospedeiro ou ambiente no qual a praga está presente mediante o fornecimento de uma ou mais composições compreendendo uma molécula de RNAi no hospedeiro da praga.

[0088] As composições e métodos aqui divulgados podem ser utilizados em conjunto em combinações com outros métodos e composições para o controle de danos por pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Por exemplo, uma molécula de iRNA como aqui descrita para a proteção de plantas contra as pragas de insetos pode ser utilizada em um método que compreende o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga de insetos, biopesticidas eficazes contra essa praga, rotação de culturas, técnicas genéticas recombinantes que apresentam características diferentes das características dos métodos de mediados pelo RNAi e composições de RNAi (por exemplo, a produção recombinante de proteínas nas plantas que são prejudiciais para uma praga de insetos (por exemplo, toxinas Bt e polipeptídeos PIP-1 (Ver a Publicação de Patente U.S. No. US 2014/0007292 A1)), e/ou a expressão recombinante de outras moléculas de iRNA. II. Abreviações BSB pentatomídeo marrom da região neotropical (Euschistus heros) dsRNA ácido ribonucleico de filamento duplo EST marca da sequência expressa Gl inibição do crescimento NCBI National Centerfor Biotechnology Information gDNA ácido desoxirribonucleico genômico iRNA ácido ribonucleico inibidor ORF estrutura de leitura aberta RNAi interferência de ácido ribonucleico miRNA ácido micro ribonucleico shRNA ácido ribonucleico grampo de cabelo pequeno siRNA ácido ribonucleico inibidor pequeno hpRNA ácido ribonucleico grampo de cabelo UTR região não transladada WCR verme da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgife-ra LeConte) NCR verme da raiz do milho do norte (Diabrotica Barberi Smith and Lawrence) MCR verme da raiz do milho mexicano (Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith) PCR reação da cadeia polimerase qPCR reação da cadeia polimerase quantitativa RISC Complexo de Silenciamento induzido por RNA SCR verme da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber) SEM erro padrão da média YFP proteína fluorescente amarela III. Termos [0089] Na descrição e tabelas que se seguem, vários termos são utilizados. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a ser fornecido a tais termos, as seguintes definições são fornecidas.

[0090] Pragas coleópteras: Como aqui utilizado, o termo "praga coleóptera" refere-se às pragas de insetos da ordem Coleoptera, incluindo as pragas de insetos do gênero Diabrotica, que se alimentam de culturas agrícolas e produtos agrícolas, incluindo milho e outras gra-míneas verdadeiros. Nos exemplos particulares, uma praga coleóptera é selecionada de uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunc-tata Mannerheim; e D. speciosa Germar.

[0091] Contato (com um organismo): Como aqui utilizado, o termo "contato com" ou "absorvido por" um organismo (por exemplo, uma praga coleóptera ou hemíptera), no que diz respeito a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nucleico dentro do organismo, por exemplo, e sem limitação: a ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, através da alimentação); o contato do organismo com uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico; e a imersão de organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.

[0092] Contig: Como aqui utilizado o termo "contig" refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruído a partir de uma série de segmentos de DNA sobrepostos derivados de uma única fonte genética.

[0093] Planta de milho: Como aqui utilizado, o termo "planta de milho" refere-se a uma planta da espécie Zea mays (milho).

[0094] Expressão: Como aqui utilizado, "expressão" de um polinu-cleotídeo de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) re- fere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, gDNA ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, muitas vezes incluindo a síntese de uma proteína. A expressão gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, a exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão do gene. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte do percurso do DNA para RNA para a proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através do controle que atua sobre a transcrição, transla-ção, transporte de RNA e processamento, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou através da ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas após elas terem sido produzidas, ou através das suas combinações. A expressão do gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, northern blot, RT-PCR, western blot, ou in vitro, in situ, ou ensaios de atividade da proteína in vivo.

[0095] Material genético: Como aqui utilizado, o termo "material genético" inclui todos os genes e moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.

[0096] Pragas hemípteras: Como aqui utilizado, o termo "pragas hemípteras" refere-se às pragas de insetos da ordem Hemiptera, incluindo, por exemplo, e sem limitação, os insetos das famílias Pentatomi-dae, Miridae, Pyrrhocoridae, Coreidae, Alydidae e Rhopalidae, que se alimentam de uma grande variedade de plantas hospedeiras e possuem partes da boca perfurantes e sugadoras. Nos exemplos particulares, uma praga hemiptera é selecionada da lista compreendendo Eus-chistus heros (Fabr.) (Neotropical Brown Stink Bug), Nezara viridula (L.) (Southern Green Stink Bug), Piezodorus guildinii (Westwood) (Red-banded Stink Bug), Halyomorpha halys (Stâl) (Brown Marmora-ted Stink Bug), Chinavia hilare (Say) (Green Stink Bug), Euschistus servus (Say) (Brown Stink Bug), Dichelops melacanthus (Dallas), Di-chelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Neotropical Red Shouldered Stink Bug), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Cotton Bug), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneviile), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Western Tarnished Plant Bug), and Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).

[0097] Inibição: Como aqui utilizado, o termo "inibição", quando utilizado para descrever um efeito sobre um polinucleotídeo de codificação (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável do nível celular de mRNA transcrito a partir do polinucleotídeo e/ou peptídeo de codificação, polipeptídeo, ou produto proteico do polinucleotídeo de codificação. Em alguns exemplos, a expressão de um polinucleotídeo de codificação pode ser inibida de tal modo a que a expressão é aproximadamente eliminada. "Inibição específica" refere-se à inibição de um polinucleotídeo de codificação do alvo sem consequentemente afetar a expressão de outros polinucleotídeos de codificação (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo executada.

[0098] Inseto: Como aqui utilizado em relação às pragas, o termo "praga de inseto" especificamente inclui as pragas de insetos coleópte-ras. Em alguns exemplos, o termo "praga de inseto" refere-se especificamente a uma praga coleóptera no gênero Diabrotica selecionada de uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar. Em algumas modalidades, o termo também inclui algumas outras pragas de insetos; por exemplo, pragas de insetos hemípteras.

[0099] Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido sem considerar, ou purificado fora de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA e RNA cromossômico e extra-cromossômico, e proteínas), enquanto que efetua uma alteração química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado a partir de um cromossoma através da quebra das ligações químicas que conectam o ácido nucleico com o DNA remanescente no cromossoma). As moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "isoladas" incluem as moléculas de ácido nucleico e as proteínas purificadas por métodos de purificação padrão. O termo também abrange ácidos nuclei-cos e proteínas preparadas pela expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como as moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.

[00100] Molécula de ácido nucleico: Como aqui utilizado, o termo "molécula de ácido nucleico" pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, a qual pode incluir filamentos tanto sentido quanto anti-sentido de RNA, cDNA, gDNA, e sintéticas formas e polímeros misturados do acima. Um nucleotídeo ou nucleobase pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" como aqui utilizada é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico é geralmente de pelo menos 10 bases de comprimento, a não ser que de outra maneira especificada. Por convenção, a sequência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5' para a 3' da molécula. O "complemento" de uma molécula de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases que podem formar pares de base com as nucleobases da molécula de ácido nucleico (isto é, A-T/U e G-C).

[00101] Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos que compreendem um DNA modelo que é transcrito dentro de uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nestas modalidades, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação 5' para 3', de tal modo que a RNA polimerase (que transcreve o DNA na direção de 5 'para 3') irá transcrever um ácido nucleico a partir do complemento que pode hibri-dizar com a molécula de mRNA. A não ser que expressamente mencionado de outra maneira, ou que seja óbvio para ser de outro modo pelo contexto, o termo "complemento", portanto, refere-se a um polinu-cleotídeo tendo nucleobases, de 5' para 3', que pode formar pares de bases com as nucleobases de um ácido nucleico de referência. De modo semelhante, a não ser que seja explicitamente mencionado de outra maneira (ou fique claro de ser de outro modo a partir do contexto), o "complemento inverso" de um ácido nucleico refere-se ao complemento na orientação inversa. O precedente é demonstrado na seguinte ilustração: ATGATGATG polinucleotídeo TACTACTAC "complemento" do polinucleotídeo CATCATCAT "complemento inverso" do polinucleotídeo [00102] Outras modalidades da invenção podem incluir moléculas de RNAi formadoras de RNA grampo de cabelo. Nestas moléculas de RNAi, tanto o complemento de um ácido nucleico para ser direcionado pela interferência de RNA quanto o complemento inverso podem ser observados na mesma molécula, de tal modo que a molécula de RNA de filamento único pode "dobrar-se" e hibridizar-se ao longo da região compreendendo os polinucleotídeos complementares e complementares reversos.

[00103] As "moléculas de ácido nucleico" incluem todos os polinu-cleotídeos, por exemplo: as formas de filamento único e duplo de DNA; formas de filamento único de RNA; e formas de filamento duplo de RNA (dsRNA). O termo "sequência de nucleotídeo" ou "sequência de ácido nucleico" refere-se a ambos os filamentos sentido e anti-sentido de um ácido nucleico como filamentos únicos individuais ou na duple-xação. O termo "ácido ribonucleico" (RNA) é inclusivo de RNA (RNA inibidor), dsRNA (RNA de filamento duplo), siRNA (RNA interferente pequeno), shRNA (RNA grampo de cabelo pequeno), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA ), hpRNA (RNA grampo de cabelo), RNA de tRNA (RNAs de transferência, quer carregados quer descarregados com um aminoácido acilado correspondente), e cRNA (RNA complementar). O termo "ácido desoxirribonucleico" (DNA) é inclusivo de cDNA, gDNA, e híbridos de DNA-RNA. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" e seus "fragmentos" serão compreendidos por aqueles da técnica como um termo que inclui tanto gDNAs, RNAs ribosso-mais, RNAs de transferência, RNAs mensageiros, operões, e polinu-cleotídeos planejados menores que codificam ou podem ser adaptados para codificar peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

[00104] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados pela divagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou através da polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Sintetizado-res automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de bases de comprimento. Visto que os oligonucleotídeos podem ligar-se a um ácido nucleico complementar, eles podem ser utilizadas como sondas para a detecção de DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser utilizados na PCR, uma técnica para a amplificação de DNA. Na PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador", que permite que uma DNA polimerase prolonge o oligonucleotídeo e replicar o filamento complementar.

[00105] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir cada um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si pelas ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas química ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivadas, como será facilmente observado por aqueles de habilidade na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações in-ternucleotídicas (por exemplo, ligações sem carga: por exemplo, fos-fonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioato, fosforoditioato, etc.; componentes pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo configurações de filamento único, filamento duplo, parcialmente duplo, triplo, grampo de cabelo, circular e trancado.

[00106] Como aqui utilizado no que diz respeito ao DNA, o termo "poiinucleotídeo de codificação", "polinucleotídeo estrutural" ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refere-se a um polinucleotídeo que é em última análise transladado em um polipeptídeo, através de transcrição e mRNA, quando colocada sob o controle de elementos reguladores apropriados. No que diz respeito ao RNA, o termo "polinucleotídeo de codificação" refere-se a um polinucleotídeo que é transladado em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de um polinucleotídeo de codificação são determinados por um códon de partida da translação no terminal 5' e um códon de interrupção da translação no terminal 3'. Os polinucleotídeos de codificação incluem, mas não são limitados a estes: gDNA; cDNA; EST; e polinucleotídeos recombinan-tes.

[00107] Conforme aqui utilizado, "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se aos segmentos de moléculas de mRNA tais como 5'UTR, 3'UTR, e segmentos de íntron que não são transladados em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Além disso, o "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA) como exemplificado por 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, e 28S rRNA, e outros mais); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tais como U4, U5, U6, e outros mais. Os polinucleotídeos de não codificação transcritos também incluem, por exemplo, e sem limitação, pequenos RNAs (sRNA), cujo termo é frequentemente utilizado para descrever pequenos RNAs de não codificação bacterianos; pequenos RNAs nucleolares (snoRNA); micro RNAs (miRNA); pequenos RNAs interfe-rentes (siRNA); RNAs de interação com Piwi (piRNA); e RNAs de não codificação longos. Mais ainda, o "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se a um polinucleotídeo que pode existir como uma forma nativa como um "espaçador" intragênico em um ácido nucleico e que é transcrito em uma molécula de RNA.

[00108] Interferência de RNA letal: Como aqui utilizado, o termo "interferência de RNA letal" refere-se à interferência de RNA que resulta na morte ou uma redução na viabilidade do indivíduo voluntário ao qual, por exemplo, um dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA e/ou hpRNA é liberado.

[00109] Genoma: Como aqui utilizado, o termo "genoma" refere-se ao DNA cromossômico encontrada dentro do núcleo de uma célula, e também se refere ao DNA de organelas encontrado dentro de componentes subceiulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal de tal modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da célula vegetal. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser integrada no DNA nuclear da célula vegetal, ou integrada no DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula vegetal. O termo "genoma", quando se aplica a bactérias, refere-se tanto ao cromossoma quanto aos plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria de tal modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser cromossomicamente integrada ou localizada como ou em um plasmí-deo estável.

[00110] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", como aqui utilizado no contexto de dois polinucle-otídeos ou polipeptídeos, refere-se aos resíduos nas sequências das duas moléculas que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima ao longo uma janela de comparação especificada.

[00111] Como aqui utilizado, o termo "porcentagem de identidade de sequência" pode referir-se ao valor determinado através da comparação de duas sequências idealmente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de polipeptídeo) de uma molécula sobre uma janela de comparação, em que a parte da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou dele-ções (isto é, lacunas) em relação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições nas quais o resíduo de nucleotídeo ou de amino-ácido idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições comparadas, dividindo o número das posições comparadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicação do resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em cada posição em comparação com uma sequência de referência é dita de ser 100 % idêntica à sequência de referência, e vice-versa.

[00112] Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith and Wa-terman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequência e os cálculos de homo-logia podem ser encontrados em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.

[00113] The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com os vários programas de análise de sequências. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência utilizando este programa está disponível na internet sob a seção "help" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função "Blast 2 sequences" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada utilizando a matriz BLOSUM62 padrão definido para os parâmetros padrão. Os ácidos nucleicos com similaridade de sequência ainda maior com as sequências dos polinucleotídeo de referência irão apresentar identidade percentual crescente quando avaliados por este método.

[00114] Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Como aqui utilizado, os termos "Especificamente hibridizávei" e "Especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade de tal modo que a ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento anti-paralelo entre as nucleobases das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondente no filamento oposto para formar uma molécula dupla que, se for suficientemente estável, é detectável utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Um polinucleotídeo não precisa de ser 100 % complementar ao seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizávei. No entanto, a quantidade de complementaridade que deve existir para a hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização utilizadas.

[00115] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de rigor irão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e comprimento dos ácidos nu-cleicos de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização irá determinar o rigor da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciam a severidade. Os cálculos relativos às condições de hibridização requeridas para alcançar graus particulares de rigor são conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica, e são examinados, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hvbridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução e orientação mais detalhadas no que diz respeito à hibridização de ácidos nucleicos podem ser observadas, por exemplo, em Tijssen, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistrv and Molecular Bioloqy- Hvbridization with Nucleic Acid Probes. Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; and Ausubel et ai, Eds., Current Protocols in Molecular Bioloqy, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, NY, 1995.

[00116] Conforme aqui utilizado, as "condições rigorosas" abrangem as condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos do que 20 % de incompatibilidade entre a sequência da molécula de hibridização e um polinucleotídeo homólogo dentro da molécula de ácido nucleico alvo. "Condições rigorosas" incluem outros níveis particulares de rigor. Assim, como aqui utilizado, as condições de "rigor moderado" são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 20 % incompatibilidade de sequência não irá hibridizar; condições de "severidade elevada" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 10 % de incompatibilidade não irão hibridizar; e as condições de "rigor muito elevado" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 5 % de incompatibilidade não irão hibridizar.

[00117] O que se segue são as condições de hibridização representativas não limitativas.

Condição de elevado rigor (detecta polinucleotídeos que compartilham pelo menos 90 % de identidade de sequência): Hibridização em tampão 5x SSC a 65 Ό durante 16 horas; lavar duas vezes em tampão 2x SSC na temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão 0,5x SSC a 65 O durante 20 minutos cada.

As condições de rigor moderado (detecta polinucleotídeos que com- partilham pelo menos 80 % de identidade de sequência): Hibridização em tampão 5x-6x SSC em 65 a 70 Ό durante 16 a 20 h oras; lavar duas vezes em tampão 2x SSC na temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão 1x SSC em 55 a 70 Ό durante 30 minutos cada.

Condição de controle sem rigor (polinucleotídeos que compartilham pelo menos 50 % de identidade de sequência irão hibridizar): Hibridização em tampão 6x SSC na temperatura ambiente a 55 O durante 16 a 20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão 2x-3x SSC na temperatura ambiente até 55 Ό durante 20 a 30 minu tos cada.

[00118] Conforme aqui utilizado, o termo "substancialmente homólogo" ou "homologia substancial", no que diz respeito a um ácido nu-cleico, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases contíguas que hibridizam sob condições rigorosas com o ácido nucleico de referência. Por exemplo, ácidos nucleicos que são substancialmente homólogos a um ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3, 5 a 8, 76, 78, e 80 a 82 são aqueles ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas (por exemplo, as condições de rigor moderado apresentadas, supra) com o ácido nucleico de referência. Os polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter pelo menos 80 % de identidade de sequência. Por exemplo, polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter de cerca de 80 % a 100 % de identidade de sequência, tal como 79 %; 80 %, ao redor de 81 %; ao redor de 82 %, ao redor de 83 %; ao redor de 84 %, ao redor de 85 %; ao redor de 86 %, ao redor de 87 %, ao redor de 88 %, ao redor de 89 %; ao redor de 90 %, ao redor de 91 %; ao redor de 92 %, ao redor de 93 %, ao redor de 94 %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ao redor de 98,5 %, ao redor de 99 %, ao redor de 99,5 % e ao redor de 100 %. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com a hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico aos po-linucleotídeos não alvos sob condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização rigorosas.

[00119] Como aqui utilizado, o termo "ortólogo" refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluiu a partir de um ácido nucleico ancestral comum, e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.

[00120] Como aqui utilizado, duas moléculas de ácido nucleico são ditas de apresentar "complementaridade completa" quando cada nu-cleotídeo de um polinucleotídeo lido na direção de 5' para 3' for complementar de cada nucleotídeo do outro polinucleotídeo quando lido na direção 3' para 5'. Um polinucleotídeo que é complementar a um polinucleotídeo de referência irá apresentar uma sequência idêntica ao complemento reverso do polinucleotídeo de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente compreendido por aqueles de habilidade prática na técnica.

[00121] Operativamente ligado: um primeiro polinucleotídeo é operativamente ligado com um segundo polinucleotídeo quando o primeiro polinucleotídeo estiver em uma relação funcional com o segundo polinucleotídeo. Quando produzidos de forma recombinante, os polinucle-otídeos operativamente ligados são geralmente contíguos, e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, na mesma estrutura de leitura (por exemplo, em uma ORF translacionalmente fundida). No entanto, os ácidos nucleicos não necessitam ser contíguos para serem operacionalmente ligados.

[00122] O termo "operacionalmente ligado", quando utilizado em referência a um elemento genética regulador e um polinucleotídeo de codificação, significa que o elemento regulador afeta a expressão do polinucleotídeo de codificação ligado. "Elementos reguladores", ou "elementos de controle" referem-se aos polinucleotídeos que influenciam o momento e o nível/quantidade de transcrição, processamento de RNA ou estabilidade, ou translação do polinucleotídeo de codificação associado. Os elementos reguladores podem incluir promotores; líderes de translação; íntrons; intensificadores; estruturas da alça pendu-cular; polinucleotídeos de ligação do repressor; polinucleotídeos com uma sequência de terminação; polinucleotídeos com uma sequência de reconhecimento de poliadenilação, etc. Os elementos reguladores particulares podem estar localizados a montante e/ou a jusante de um polinucleotídeo de codificação operativamente ligados a ele. Da mesma forma, os elementos reguladores particulares operacionalmente ligados a um polinucleotídeo de codificação podem ser localizados no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.

[00123] Promotor: Como aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição, e que pode estar envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser operativamente ligado a um polinucleotídeo de codificação para a expressão em uma célula, ou um promotor pode ser operativamente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal, o qual pode ser operacionalmente ligado a um polinucleotídeo de codificação para a expressão em uma célula. Um "promotor vegetal" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição nas células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferivelmente iniciam a transcrição em certos tecidos tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, tra-queídeos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferíveis do tecido". Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como "específicos do tecido". Um promotor "do tipo específico da célula" principalmente impulsiona a expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição através de promotores induzíveis incluem as condições anaeróbicas e a presença de luz. Os promotores específicos do tecido, preferíveis do tecido, do tipo específico para a célula e induzíveis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativo na maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecido ou célula.

[00124] Qualquer promotor induzível pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Ver Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Os promotores induzíveis exemplares incluem, mas não são limitados a estes: promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 do milho que responde aos protetores herbicidas de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene do hormônio esterói-de, a atividade de transcrição do qual pode ser induzida por uma hormônio glucocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:0421).

[00125] Os promotores constitutivos exemplares incluem, mas não são limitados a estes: promotores de vírus vegetais tais como o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotores dos genes da actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 do milho; e o promotor de ALS, fragmento Xba1/Ncol 5' para o gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou um polinucleotídeo semelhante ao dito fragmento Xba1/Ncol) (Publicação PCT Internacional No. WO 96/30530).

[00126] Adicionalmente, qualquer promotor específico do tecido ou preferível do tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. As plantas transformadas com uma molécula de ácido nuclei-co compreendendo um polinucleotídeo de codificação operativamente ligado a um promotor específico do tecido podem produzir o produto do polinucleotídeo de codificação exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido específico. Os promotores específicos do tecido exemplares ou preferíveis do tecido incluem, mas não são limitados a estes: um promotor preferível da semente, tal como aquele do gene de faseolina; um promotor e específico da folha e induzido pela luz tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico das anteras tal como que aquele de LAT52; um promotor específico do pólen tal como aquele de Zm13; e um promotor preferível do micrósporo tal como aquele de apg.

[00127] Planta de soja: Como aqui utilizado, o termo "planta de soja" refere-se a uma planta de uma espécie do gênero Glycine; por exemplo, G. max.

[00128] Transformação: Como aqui utilizado, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico para dentro de uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida dentro da célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicada pela célula, através da incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou pela replicação epissomal. Como aqui utilizado, o termo "transformação" abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida dentro de uma tal célula. Exemplos incluem, mas não são limitados a estes: a transfecção com vetores virais; a transformação com vetores plasmídi-cos; a eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7); micro-injeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7); absorção direta de DNA; e bombardeio com micro-projéteis (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[00129] Transgene: Um ácido nucleico exógeno. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um DNA que codifica um ou ambos os filamentos de um RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA que compreende um polinucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga coleóptera e/ou hemípte-ra. Em outros exemplos, um transgene pode ser um polinucleotídeo anti-sentido, em que a expressão do polinucleotídeo anti-sentido inibe a expressão de um ácido nucleico alvo, produzindo assim um fenótipo de RNAi. Em mais outros exemplos, um transgene pode ser um gene (por exemplo, um gene de tolerância a herbicida, um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um atributo agrícola desejável). Nestes e outros exemplos, um transgene pode conter elementos reguladores operacionalmente ligados a um polinucleotídeo de codificação do transgene (por exemplo, um promotor).

[00130] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico como introduzida dentro de uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir elementos genéticos que permitem a sua replicação na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a estes: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que transporta o DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, incluindo aqueles que produzem moléculas anti-sentido, e/ou genes de marcas selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, desse modo fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcionalmente inclui materiais para auxiliar no avanço da entrada da molécula de ácido nucleico dentro da célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de proteína, etc.).

[00131] Rendimento: Um rendimento estabilizado ao redor de 100 % ou maior em relação ao rendimento das variedades de controle no mesmo local de crescimento, ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Nas modalidades particulares, "rendimento melhorado" ou "melhorar o rendimento" significa um cultivar tendo um rendimento estabilizado de 105 % ou maior em relação ao rendimento das variedades de controle no mesmo local de crescimento contendo densidades significativas das pragas coleópteras e/ou hemípteras que são prejudiciais para este desenvolvimento da cultura que, ao mesmo tempo e nas mesmas condições, são direcionadas pelas composições e métodos contidos neste documento.

[00132] A não ser que especificamente indicados ou implícitos, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um", como aqui utilizado.

[00133] A não ser que de outra maneira especificamente explicada, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como normalmente entendido por aqueles de habilidade prática na técnica à qual esta descrição pertence. As definições dos termos comuns na biologia molecular podem ser observadas em, por exemplo, Lewin’s Genes X, Jones & Bartiett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encvclopedia of Molecular Biol-oqy, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de mistura de solventes são em volume a não ser que de outra maneira mencionada. Todas as temperaturas estão em graus Celsius. IV. Moléculas de Ácido Nucleico Compreendendo uma Sequência de Praga de Insetos A. Visão Geral [00134] Aqui descritos estão as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de inseto. Em alguns exemplos, a praga de insetos é uma praga de inseto coleóptera (por exemplo, espécies do gênero Diabrotica) ou hemíptera (por exemplo, espécies do gênero Euschistus). As moléculas de ácido nucleico descritas incluem os poli-nucleotídeos alvos (por exemplo, genes nativos, e polinucleotídeos de não codificação), dsRNAs, siRNAs, shRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, as moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares à totalidade ou parte de um ou mais ácidos nuclei-cos nativos em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Nestas e outras modalidades, os ácidos nucleicos nativos podem ser um ou mais genes alvos, o produto dos quais pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento larval/ninfa. As moléculas de ácido nucleico aqui descritas, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos um ácido nucleico nativo em que as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar o RNAi na célula, e consequentemente reduzir ou eliminar a expressão dos ácidos nucleicos nativos. Em alguns exemplos, a redução ou eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico especificamente complementar a ele, pode resultar na redução ou cessação do crescimento, desenvolvimento e/ou alimentação da praga.

[00135] Em algumas modalidades, pelo menos um gene alvo em uma praga de inseto pode ser selecionado, em que o gene alvo com- preende um polinucleotídeo rpll33. Em alguns exemplos, um gene alvo em uma praga coleóptera é selecionado, em que o gene alvo compreende um polinucleotídeo selecionado dentre as SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 a 8. Em alguns exemplos, um gene alvo em uma praga hemíptera é selecionado, em que o gene alvo compreende um polinucleotídeo selecionado dentre as SEQ ID NOs: 76, 78, e 80 a 82.

[00136] Em outras modalidades, um gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser inversa transladado in silico a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos cerca de 85 % idêntica (por exemplo, pelo menos 84 %, 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 %, cerca de 100 % ou 100 % idêntica) à sequência de aminoácido de um produto de proteína de um polinucleotídeo rplI33. Um gene alvo pode ser qualquer polinucleotídeo rplI33 em uma praga de inseto, a inibição pós-transcricional da qual possui um efeito prejudicial sobre o crescimento, a sobrevivência e/ou a viabilidade da praga, por exemplo, para fornecer um benefício protetor contra a praga a uma planta. Nos exemplos particulares, um gene alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser inverso transladado in silico para um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos cerca de 85 % idêntica, cerca de 90 % idêntica, cerca de 95 % idêntica, cerca de 96 % idêntica, cerca de 97 % idêntica, cerca de 98 % idêntica, cerca de 99 % idêntica, cerca de 100 % idêntica, ou 100 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 77; ou SEQ ID NO: 79.

[00137] Fornecidos de acordo com a invenção são os DNAs, a expressão dos quais resulta em uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por um polinu- cleotídeo de codificação em uma praga de inseto (por exemplo, co-leóptera e/ou hemíptera). Em algumas modalidades, após a ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga de insetos, a infra-regulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga pode ser obtida. Nas modalidades particulares, a infra-regulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga pode ser obtida. Nas modalidades particulares, a infra-regulação do polinucleotídeo de codificação nas células da praga de insetos resulta em um efeito prejudi-cial sobre o crescimento, desenvolvimento e/ou sobrevivência da praga.

[00138] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos alvos incluem RNAs de não codificação transcritos, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; líderes unidos; íntrons; outrons (por exemplo, RNA 5'UTR subsequentemente modificado na trans-recomposição); donatrons (por exemplo, RNA de não codificação requerido para fornecer sequências doadoras de trans-recomposição); e outro RNA transcrito de não codificação de genes de pragas de insetos alvos. Tais polinucleotídeos podem ser derivados de genes tanto mono-cistrônicos quanto poli-cistrônicos.

[00139] Também aqui descritas em conexão com algumas modalidades estão as moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóp-tera e/ou hemíptera). Em algumas modalidades, uma molécula de iRNA pode compreender polinucleotídeos que são complementares à totalidade ou parte de uma pluralidade de ácidos nucleicos alvos; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ácidos nucleicos alvos. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Também são divulgados os cDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsRNA, molé- cuias de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de insetos. Ainda descritos estão os constructos de DNA recombinante para uso na execução da transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Os alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e/ou hpRNA a partir dos constructos de DNA recombinante. Portanto, também descrito está um vetor de transformação de plantas compreendendo pelo menos um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que a expressão dos polinucleo-tídeos resulta em uma molécula de RNA que compreende uma série de nucleobases contíguas que é especificamente complementar à totalidade ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de insetos.

[00140] Nos exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de uma praga coleóptera ou hemíptera podem incluir: a totalidade ou parte de um ácido nucleico nativo isolado de um organismo Diabrotica compreendendo um polinucleotídeo rplI33 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 , 3 e 5 a 8); a totalidade ou parte de um ácido nucleico nativo isolado de um organismo hemíptero que compreende um polinucleotídeo rplI33 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78, e 80 a 82); DNAs que quando expressos resultam em uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por rplI33; moléculas de iR-NA (por exemplo, dsRNA, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de rplI33; cDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todo ou parte de rpll33; e constructos de DNA recombinante para uso na execução da transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico precedentes. B. Moléculas de Ácido Nucleico [00141] A presente invenção fornece, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que inibem a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera); e moléculas de DNA capazes de ser expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de insetos.

[00142] Algumas modalidades da invenção fornecem uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1 ou 3; o complemento da SEQ ID NO: 1 ou 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou 3 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou 3; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8.

[00143] Outras modalidades da invenção fornecem uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 76 ou 78; o complemento da SEQ ID NO: 76 ou 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 76 ou 78 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 76 ou 78; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB), que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 80 a 82; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82.

[00144] Nas modalidades particulares, o contato ou absorção por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) de um iRNA transcrito a partir do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, desenvolvimento e/ou alimentação da praga. Em algumas modalidades, o contato ou a absorção pelo inseto ocorre por meio da alimentação da matéria vegetal ou isca compreendendo o iRNA. Em algumas modalidades, o contato ou a absorção pelo inseto ocorre através da pulverização de uma planta compreendendo o inseto com uma composição que compreende o iRNA.

[00145] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 92; o complemento da SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; o complemento da SEQ ID NO: 93; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 93 (por exemplo, SEQ ID NOs: 94 a 97); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 93; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 94 a 97; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 94 a 97; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 94 a 97; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 94 a 97.

[00146] Em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 98; o complemento da SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; o complemento da SEQ ID NO: 99; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 98 ou SEQ ID NO: 99 (por exemplo, as SEQ ID NOs: 100 a 102); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 98 ou SEQ ID NO: 99; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOS: 100 a 102; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 100 a 102; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codifica- ção nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 100 a 102; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 100 a 102.

[00147] Nas modalidades particulares, o contato ou absorção por uma praga coleóptera e/ou hemíptera do polinucleotídeo isolado inibe a sobrevivência, crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga.

[00148] Em certas modalidades, as moléculas de dsRNA fornecidas pela invenção compreendem polinucleotídeos complementares a um transcrito de um gene alvo compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78, e 80 a 82, e seus fragmentos, a inibição dos quais direcionam o gene em uma praga de insetos resulta na redução ou remoção de um agente de polipeptídeo ou polinucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento, ou outra função biológica da praga. Um polinucleotídeo selecionado pode apresentar de cerca de 80 % a cerca de 100 % de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82; um fragmento contíguos das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82; e o complemento de qualquer um dos precedentes. Por exemplo, um polinucleotídeo selecionado pode apresentar 79 %; 80 %; cerca de 81 %; cerca de 82 %; cerca de 83 %; cerca de 84 %; cerca de 85 %; cerca de 86 %; cerca de 87 %; cerca de 88 %; cerca de 89 %; cerca de 90 %; cerca de 91 %; cerca de 92 %; cerca de 93 %; cerca de 94 %, cerca de 95 %; cerca de 96 %; cerca de 97 %; cerca de 98 %; cerca de 98,5 %; cerca de 99 %; cerca de 99,5 %; ou cerca de 100 % de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82; um fragmento contíguo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82; e o complemento de qualquer um dos precedentes.

[00149] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão do gene alvo pode compreender um polinucleotídeo isolado que é especificamente complementar a todo ou parte de um polinucleotídeo nativo encontrado em uma ou mais espécies de praga de insetos alvo (por exemplo, uma espécie de praga co-leóptera ou hemíptera), ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera de uma pluralidade de tais polinucleotídeos especificamente complementares.

[00150] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um primeiro e um segundo polinucleotídeo separados por um "espaçador". Um espaçador pode ser uma região que compreende qualquer sequência de nucleotídeos que facilita a formação da estrutura secundária entre o primeiro e segundo polinucleotídeos, onde este for desejado. Em uma modalidade, o espaçador é parte de um polinucleotídeo de codificação sentido ou anti-sentido com relação ao mRNA. O espaçador pode alternativamente compreender qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de serem ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico.

[00151] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender um polinucleotídeo que codifica uma ou mais moléculas de iRNA diferentes, em que cada uma das moléculas de iRNA diferentes compreende um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo, em que o primeiro e segundo polinucleotídeos são complementares entre si. Os primeiro e segundo polinucleotídeos podem ser conectados dentro de uma molécula de RNA por um espaçador. O espaçador pode constituir parte do primeiro polinucleotídeo ou do segundo polinucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA que compreende o primeiro e segundo polinucleotídeos de nucleotídeo pode levar à formação de uma molécula de dsRNA, através do empa-relhamento de base intramolecular específico do primeiro e do segundo polinucleotídeos de nucleotídeo. O primeiro polinucleotídeo ou o segundo polinucleotídeo pode ser substancialmente idêntico a um polinucleotídeo (por exemplo, um gene alvo, ou polinucleotídeo de não codificação transcrito) nativo para uma praga de inseto (por exemplo, uma praga coleóptera ou hemíptera), um derivado deste, ou um polinucleotídeo complementar.

[00152] As moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem filamentos duplos de ribonucleotídeos polimerizados, e podem incluir modificações à cadeia principal de fosfato-açúcar ou o nucleosídeo. As modificações na estrutura do RNA podem ser adaptadas para permitir a inibição específica. Em uma modalidade, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo de modo que as moléculas de siRNA possam ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar um enzima RNAase III, tal como DICER em eucariotas, in vitro ou in vivo. Ver Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8; e Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950- 2. DICER ou enzimas RNase III funcionalmente equivalentes clivam os maiores filamentos de dsRNA e/ou as moléculas de hpRNA nos oligo-nucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais é de cerca de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas possuem de 2 a 3 projeções de nucleotídeo 3', e terminais de fosfato 5' e hidroxila 3'. As moléculas de siRNA geradas pelas enzimas de RNAase III são desenroladas e separadas em RNA de filamento único na célula. As moléculas de siRNA depois especificamente hibridizam com RNAs transcritos a partir de um gene alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo de degradação de RNA celular ineren- te. Este processo pode resultar na degradação ou remoção eficaz do RNA codificado pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é o si-lenciamento pós-transcricional do gene alvo. Em algumas modalidades, as moléculas de siRNA produzidas pelas enzimas RNAase III en-dógenas a partir das moléculas de ácido nucleico heterólogas podem mediar eficientemente a infra-regulação dos genes alvo nas pragas de insetos.

[00153] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode incluir pelo menos um polinucleotídeo de ocorrência não natural que pode ser transcrito em uma molécula de RNA de filamento único capaz de formar uma molécula de dsRNA 0 através da hibridização intermolecular. Tais dsRNA tipicamente se auto-agrupam, e podem ser fornecidos na fonte de alimentação de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera) para alcançar a inibição pós-transcricional de um gene alvo. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender dois polinucleotídeos de ocorrência não natural diferentes, cada um dos quais é especificamente complementar a um gene alvo diferente em uma praga de inseto. Quando uma tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA, por exemplo, a uma praga coleóptera e/ou hemíptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes alvo diferentes na praga. C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico [00154] Uma variedade de polinucleotídeos nas pragas de inseto (por exemplo, coleóptera e hemíptera) pode ser utilizada como alvos para a concepção de moléculas de ácido nucleico, tal como iRNAs e moléculas de DNA que codificam iRNAs. A seleção de polinucleotídeos nativos não é, contudo, um processo fácil. Por exemplo, apenas um pequeno número de polinucleotídeos nativos em uma praga coleóptera ou hemíptera será o alvo eficaz. Não se pode prever com cer- teza se um polinucleotídeo nativo particular pode ser eficazmente in-fra-regulado por moléculas de ácido nucleico da invenção, ou se a in-fra-regulação de um polinucleotídeo nativo particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, alimentação e/ou sobrevivência de uma praga de insetos. A grande maioria dos polinucleotí-deos nativos de pragas coleópteras e hemípteras, tais como os ESTs isolados a partir destes (por exemplo, os polinucleotídeos de praga de coleóptera listados na Patente U.S. N- 7.612.194), não possui um efeito prejudicial sobre o crescimento e/ou a viabilidade da praga. Tampouco é previsível que os polinucleotídeos nativos que podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga de insetos, são capazes de serem utilizados nas técnicas recombinantes para a expressão das moléculas de ácido nucleico complementares a tais polinucleotídeos nativos em uma planta hospedeira, e fornecer um efeito prejudicial sobre a praga após a alimentação sem provocar danos à planta hospedeira.

[00155] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem fornecidas na planta hospedeira de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemípte-ra)) são selecionadas para direcionar os cDNAs que codificam as proteínas ou partes das proteínas essenciais para o desenvolvimento e/ou sobrevivência da praga, tais como os polipeptídeos envolvidos nas vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, metabolismo de energia, digestão, reconhecimento da planta hospedeira, e outros mais. Como aqui descrito, a ingestão de composições por um organismo e praga alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos, um segmento do qual é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo de praga alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Um polinucleotídeo, DNA ou RNA, derivado de uma praga de inseto pode ser utilizado para construir as células vegetais protegidas contra a infestação pelas pragas. A planta hospedeira da praga co-leóptera e/ou hemíptera (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter um ou mais polinucleotídeos derivados da praga coleóptera e/ou hemíptera como aqui fornecido. O polinucleotídeo transformado no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se formam em uma estrutura de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, tornando assim o dsRNA disponível se/quando a praga forma uma conexão nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga, e finalmente a morte ou inibição do seu crescimento ou desenvolvimento.

[00156] Em algumas modalidades, um gene é direcionado o qual está essencialmente envolvido no crescimento e desenvolvimento de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera). Outros genes alvos para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes na viabilidade da praga, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, possibilidade de infecção, e estabelecimento de locais de alimentação. Um gene alvo pode, portanto, ser um gene de manutenção ou um fator de transcrição. Adicionalmente, um polinucleotídeo de pragas de inseto nativo para uso na presente invenção também pode ser derivado de um homólogo (por exemplo, um ortólogo), de um gene de planta, viral, bacteriano ou de insetos, cuja função é conhecida daqueles de habilidade na técnica, e o polinucleotídeo do qual é especificamente hibridi-zável com um gene alvo no genoma da praga alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotí-deos conhecida através da hibridização são conhecidos daqueles de habilidade na técnica.

[00157] Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para a obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA). Uma tal modalidade compreende: (a) analisar um ou mais genes alvos para a sua expressão, função e fenótipo após a supressão do gene mediada por dsRNA em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera); (b) investigar uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo a totalidade ou uma parte de um polinucleotídeo ou um homólogo deste de uma praga alvo que apresenta um fenótipo alterado (por exemplo, reduzido) de crescimento ou desenvolvimento em uma análise de supressão mediada pelo dsRNA; (c) identificar um clone de DNA que especificamente hibridiza com a sonda; (d) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequênciar o fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequênciado compreende toda ou uma parte substancial do RNA ou um homólogo deste; e (f) sintetizar quimica-mente a totalidade ou uma parte substancial de um gene, ou um siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA ou dsRNA.

[00158] Em outras modalidades, um método para a obtenção de um fragmento de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma parte substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) inclui: (a) sintetizar o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeo especificamente complementares a uma parte de um polinucleotídeo nativo de uma praga de inseto alvo (por exemplo, coleóptera ou hemíptera); e (b) amplificar uma inserção de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem utilizando os primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma parte substancial de um molécula de siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA ou dsRNA.

[00159] Os ácidos nucleicos podem ser isolados, amplificados ou produzidos por várias abordagens. Por exemplo, uma molécula de iR-NA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) pode ser obtida através da amplificação de PCR de um polinucleotídeo alvo (por exemplo, um gene alvo ou um polinucleotídeo de não codificação transcrito alvo) derivado de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou suas partes. O DNA ou o RNA pode ser extraído de um organismo alvo, e as bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir deste utilizando métodos conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica. As bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo alvo podem ser utilizadas para amplificação de PCR e sequên-ciamento dos genes alvos. Um produto de PCR confirmado pode ser utilizado como um modelo para a transcrição in vitro para gerar o RNA sentido e anti-sentido com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer uma de várias técnicas (Ver, por exemplo, Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo o uso de um sintetizador automático de DNA (por exemplo, um P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) model 392 or 394 DNA/RNA Synthesizer), utilizando a química convencional, tal como a química de fosforamidito. Ver, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetra hedron, 48: 2223-2311; Patentes U.S. 4.980.460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066 e 4.973.679. Químicas alternativas que resultam em grupos da cadeia principal não naturais, tais como fosforotioato, fosforamidato, e outros mais, também podem ser empregadas.

[00160] Um molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida química ou enzimati-camente por uma pessoa versada na técnica através de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA. O RNA também pode ser produzido pela síntese orgânica parcial ou total de qualquer ribonucleotídeo modificado, pode ser introduzido pela síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase bacteriófaga (por exemplo, RNA polimerase T3, RNA polimerase T7, e RNA polimerase SP6). Os constructos de expressão úteis para a clonagem e expressão de polinucleotídeos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Publicação PCT Internacional No. WO 97/32016; e as Patentes U.S. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou pela síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia, ou uma combinação destas. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou pela síntese enzimática in vitro podem ser utilizadas sem ou com um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar as perdas devidas ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secadas para armazenagem ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o recozimento, e/ou a estabilização dos filamentos duplos da molécula de dsRNA.

[00161] Nas modalidades particulares, uma molécula de dsRNA pode ser formada por um único filamento de RNA auto-complementar ou dois filamentos de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endó-gena da célula pode mediar a transcrição de um ou dois filamentos de RNA in vivo, ou a RNA polimerase clonada pode ser utilizada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de insetos pode ser direcionada pelo hospedeiro através da transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, através do uso de um promotor específico do tecido); a estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, através do uso de um promotor induzível que é sensível à infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou a transcrição de planejamento em um estádio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, através do uso de um promotor específico do estágio de desenvolvimento). Os filamentos de RNA que formam uma molécula de dsRNA, transcritos in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadenilados, e podem ou não ser capaz de ser transladados em um polipeptídeo por um mecanismo de translação da célula. D. Vetores Recombinantes e Transformação da Célula Hospedeira [00162] Em algumas modalidades, a invenção também fornece uma molécula de DNA para a introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende um polinucleotídeo que, após a expressão do RNA e ingestão por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), alcança a supressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga. Assim, algumas modalidades fornecem uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) em uma célula vegetal para inibir a expressão do gene alvo em uma praga de insetos. De modo a iniciar ou aumentar a expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender um ou mais elementos reguladores, em que os elementos reguladores podem estar ligados operacionalmente ao polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma iRNA. Os métodos para expressar uma molécula de su- pressão do gene nas plantas são conhecidos, e podem ser utilizados para expressar um polinucleotídeo da presente invenção. Ver, por exemplo, a Publicação PCT Internacional No. WO 06/073727; e Publicação de Patente U.S. No. 2006/0200878 Al) [00163] Nas modalidades específicas, uma molécula de DNA re-combinante da invenção pode compreender um polinucleotídeo que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinantes podem codificar os RNAs que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão dos genes alvos endógenos em uma célula de praga de inseto (por exemplo, co-leóptera e/ou hemíptera) após a ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser fornecida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura de grampo de cabelo, haste e circuito.

[00164] Em algumas modalidades, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado através da transcrição de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 76, e 78; os complementos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 76, e 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 76, e 78 (por exemplo, SEQ ID NOs: 5 a 8 e 80 a 82); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 76 e 78; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82.

[00165] Em outras modalidades, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado pela transcrição de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 5 a 8 e 80 a 82; o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8 e 80 a 82; fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8 e 80 a 82; e os complementos dos fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8 e 80 a 82.

[00166] Nas modalidades particulares, uma molécula de DNA re-combinante que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA pode compreender uma região de codificação em que pelo menos dois polinucleotídeos são dispostos de tal modo que um polinucleotídeo está em uma orientação de sentido, e o outro polinucleotídeo está em um orientação de anti-sentido, em relação a pelo menos um promotor, em que o polinucleotídeo sentido e o polinucleotídeo anti-sentido estão ligados ou conectados por um espaçador, por exemplo, de cerca de cinco (~5) a cerca de mil (-1000) nucleotídeos. O espaça-dor pode formar um circuito entre os polinucleotídeos de sentido e anti-sentido. O polinucleotídeo de sentido ou o polinucleotídeo anti-sentido pode ser substancialmente homólogo a um gene alvo (por exemplo, um gene rplI33 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82) ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA sem um espaça-dor. Nas modalidades, um polinucleotídeo de codificação sentido e um polinucleotídeo de codificação anti-sentido podem ser de comprimentos diferentes.

[00167] Os polinucleotídeos identificados como tendo um efeito deletério sobre uma praga de insetos ou a um efeito protetor para a planta no que diz respeito à praga, podem ser facilmente incorporados nas moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais polinucleotídeos podem ser expressos como um grampo de cabelo com a estrutura de haste e circuito por tomar um primeiro segmento que corresponde a um polinucleotídeo do gene alvo (por exemplo, um gene rplI33 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78, e 80 a 82, e fragmentos de qualquer um dos anteriores); ligar este polinucleotídeo a uma segunda região espaçadora do segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligar este polinucleotídeo a um terceiro segmento, em que pelo menos uma parte do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Um tal cons-tructo forma uma estrutura de haste e circuito através do emparelha-mento de base intramolecular do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de circuito forma o segundo segmento. Ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993.; e Publicação PCT Internacional Nos. WO 94/01550 e WO 98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de filamento duplo tal como uma estrutura de haste-circuito (por exemplo, grampo de cabelo), por meio da qual a produção de siRNA direcionada a um polinucleotídeo de praga de inseto nativo (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) é aumentada pela co-expressão de um fragmento do gene alvo, por exemplo, em um cassete exprimível da planta adicional, que leva à produção intensificada de siRNA, ou reduz a metilação para impedir o silenciamento de gene transcricional do promotor grampo de cabelo de dsRNA.

[00168] Certas modalidades da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para alcançar níveis de inibição de praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) da expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema de vetores pode ser um vetor ou plasmídeo isolado, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. Os ácidos nucleicos da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado, que funciona em um ou mais hospedeiros para acionar a expressão de um polinucleotídeo de codificação ligado ou de outro elemento de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e na célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira particular com a qual é compatível.

[00169] Para transmitir proteção a partir de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo e especificamente hibridizável com um polinucleotídeo transcrito correspondente dentro de uma praga de inseto que pode provocar danos às espécies vegetais hospedeiras. A praga pode entrar em contato com a molécula de iRNA que é transcrita nas células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, através da ingestão de células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compõem a molécula de iRNA. Assim, nos exemplos particulares, a expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro das pragas coieópteras e/ou hemípteras que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, a supressão da expressão do gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera alvo pode resultar na planta sendo protegida do ataque pela praga.

[00170] A fim de permitir a liberação de moléculas de iRNA a uma praga de insetos em uma conexão nutricional com uma célula vegetal que foi transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, a expressão (isto é, transcrição) das moléculas de iRNA na célula vegetal é requerida. Assim, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender um polinucleotídeo da invenção operacionalmente ligada a um ou mais elementos reguladores, tais como um elemento promotor heterólogo que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula vegetal em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.

[00171] Os promotores adequados para uso nas moléculas de áci- do nucleico da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Os exemplos não limitativos que descrevem tais promotores incluem as Patentes U.S. 6437217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor da actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores constitutivos do milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S de CaMV); 6.433.252 (promotor de L3 oleosina do milho); 6.429.357 (promotor da actina 2 do arroz, e íntron da actina 2 do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis de luz); 6.140.078 (promotores induzíveis de sal); 6;252; 138 (promotores induzíveis de patógeno); 6.175.060 (promotores induzíveis da deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e Publicação de Patente U.S. No. 2009/757089 (promotor da cloroplasto aldolase do milho). Promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(16):5745-9) e os promotores da sintase de octopina (OCS) (os quais são transportados em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S do CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Wal-ker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(19):6624-8); o promotor da sintase de sacarose (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-8); o promotor do complexo de genes R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína de ligação de clorofila a/b; CaMV 35S (Patentes US 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196); FMV 35S (Patentes U.S. 6.051.753 e 5.378.619), um promotor PC1SV (Patente U.S. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (GenBank™ Accession No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00172] Nas modalidades particulares, as moléculas de ácido nu-cleico da invenção compreendem um promotor específico do tecido, tal como um promotor específico da raiz. Os promotores específicos da raiz acionam a expressão de polinucleotídeos de codificação operativamente ligados exclusiva ou preferencialmente nos tecidos da raiz. Exemplos de promotores específicos da raiz são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; e Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, um poli-nucleotídeo ou fragmento para o controle de praga coleóptera de acordo com a invenção pode ser clonado entre dois promotores específicos da raiz orientados em direções de transcrição opostas em relação ao polinucleotídeo ou fragmento, e que são operáveis em uma célula vegetal transgênica e aqui expressos para produzir moléculas de RNA na célula vegetal transgênica que subsequentemente podem formar moléculas de dsRNA, como descrito, supra. As moléculas de iRNA expressas nos tecidos vegetais podem ser ingerida por uma praga de inseto de modo que a supressão da expressão do gene alvo seja alcançada.

[00173] Os elementos reguladores adicionais que opcionalmente podem ser operacionalmente ligados a um ácido nucleico incluem 5'UTRs localizados entre um elemento promotor e um polinucleotídeo de codificação que funcionam como um elemento líder da translação. O elemento líder de translação está presente no mRNA totalmente processado, e pode afetar o processamento do transcrito primário, e/ou a estabilidade do RNA. Exemplos de elementos líder de translação incluem líderes de proteína de choque térmico do milho e petúnia (Patente U.S. 5.362.865), líderes de proteína de revestimento do vírus da planta, líderes de rubisco da planta, e outros. Ver, por exemplo, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitativos de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank™ Accession No. V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[00174] Os elementos reguladores adicionais que opcionalmente podem ser operacionalmente ligados a um ácido nucleico que incluem elementos não transladados 3', regiões de terminação da transcrição 3', ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de um polinucleotídeo, e incluem polinucleotídeos que fornecem o sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou o processamento de mRNA. O sinal de poliadenilação funciona nas plantas para provocar a adição de nu-cleotídeos poliadenilados na extremidade 3' do precursor de mRNA. O elemento de poliadenilação pode ser derivado de uma variedade de genes vegetais, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitativo de uma região de terminação da transcrição 3' é a região de nopalina sin-tase 3' (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de diferentes regiões não transladadas 3' é fornecido em Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação incluem aquele de um gene de RbcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank™ Accession No. E01312).

[00175] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de plantas que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos um dos elementos reguladores acima descritos operativamente ligados a um ou mais polinucleotídeos da presente invenção. Quando expresso, os um ou mais polinucleotí- deos resultam em uma ou mais moléculas de iRNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Assim, os polinucleotídeos podem compreender um segmento que codifica a totalidade ou parte de um polirribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA de praga coleóptera e/ou hemíptera alvo, e podem compreender repetições invertidas de todo ou uma parte de um transcrito de praga alvo. Um vetor de transformação da planta pode conter polinucleotídeos especificamente complementares para mais do que um polinucleotídeo alvo, permitindo assim a produção de mais do que um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes nas células de uma ou mais populações ou espécies de pragas de inseto alvo. Os segmentos de polinucleotídeos especificamente complementares aos polinucleotídeos presentes em diferentes genes podem ser combinados em uma molécula de ácido nucleico compósito isolada para a expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por um espaçador.

[00176] Em outras modalidades, um plasmídeo da presente invenção já contendo pelo menos um polinucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de polinucleotídeos adicionais no mesmo plasmídeo, em que os polinucleotídeos adicionais são operacionalmente ligados aos mesmos elementos reguladores como o pelo menos um polinucleotídeo original. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser designada para a inibição de múltiplos genes alvos. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de praga de inseto (por exemplo, coleóptera ou hemíptera), o que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pragas de inseto, que podem alar- gar os limites das pragas contra as quais os agentes são eficazes. Quando vários genes são direcionados para a supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policis-trônico pode ser planejado.

[00177] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula vegetal. Os marcadores selecionáveis também podem ser utilizados para selecionar as plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência aos antibióticos (por exemplo, canamicina, geneticina (G418), bleomicina, hi-gromicina, etc), ou tolerância a herbicidas (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a estes: um neo gene que codifica a resistência de canamicina e pode ser selecionado para utilizar canamicina, G418, etc.; Um bar gene que codifica para a resistência de bialafos; um gene da EPSP sintase mutante que codifica a tolerância ao glifosato; um gene de nitri-lase que confere resistência à bromoxinila; um gene de acetolactato sintase mutante (ALS) que confere tolerância a imidazolinona ou sul-foniluréia; e um gene DHFR resistente ao metotrexato. Vários marcadores selecionáveis são disponíveis que conferem resistência à ampi-cilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina, e outros mais. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

[00178] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção também podem incluir um marcador rastreável. Os marcadores rastreáveis podem ser utilizados para monitorar a expres- são. Os marcadores rastreáveis exemplares incluem um gene de β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual diversos substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene R-lócus, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) nos tecidos vegetais (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Svmposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9);; um gene de xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene de tiro-sinase que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa em melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma a-galactosidase.

[00179] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes, como descrito, supra, podem ser utilizadas nos métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nu-cleicos heterólogos nas plantas para preparar as plantas transgênicas que apresentam uma sensibilidade reduzida às pragas de inseto (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Os vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, através da inserção de moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de iRNA em vetores de transformação de plantas e sua introdução nas plantas.

[00180] Os métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser intro- duzido em uma célula, tal como pela transformação de protoplastos (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.508.184), mediante a absorção de DNA mediada pela dessecação/inibição (Ver, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), através da eletroporação (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.384.253), pela agitação com fibras de carboneto de silício (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765), através da transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840 e 6.384.301) e pela aceleração de partículas revestidas com DNA (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 e 6.403.865), etc. As técnicas que são particularmente úteis para a transformação de milho estão descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.060.876 e 5.591.616; e Publicação PCT Internacional WO 95/06722. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de praticamente qualquer espécie podem ser transformadas de forma estável. Em algumas modalidades, o DNA transformante é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma destas técnicas pode ser utilizada para produzir uma planta transgêni-ca, por exemplo, compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00181] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão nas plantas baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes que são bactérias do solo patogênicas de plantas que geneticamente transformam as células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam os genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (induto- res de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é delimitada por repetições terminais. Nos vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram anulados e as funções da região Vir são utilizadas para transferir o DNA estranho delimitado pelos elementos da fronteira do T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para a recuperação eficiente de células e plantas transgênicas, e um sítio de clonagem múltipla para a inserção de polinucleotídeos para a transferência tais como um ácido nucleico que codifica o dsRNA.

[00182] Assim, em algumas modalidades, um vetor de transformação de plantas é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e Patente Européia No. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Os vetores de transformação de plantas adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella et ai (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et ai (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia No. EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer um dos anteriores. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizobium, e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência de genes para várias plantas multiformes. Estas bactérias simbióticas associadas com as plantas podem tornar-se competentes para a transferência de genes mediante a aquisição tanto um plasmídeo Ti desarmado quanto um vetor binário adequado.

[00183] Após fornecer DNA exógeno às células receptoras, as células transformadas são geralmente identificadas para outro cultivo e regeneração vegetal. A fim de melhorar a capacidade de identificar as células transformadas, pode ser desejável empregar um gene marcador selecionável ou rastreável, como anteriormente apresentado, com o vetor de transformação utilizado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável for utilizado, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas através da exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde um marcador rastreável for utilizado, as células podem ser submetidas à triagem com relação aos atributos do gene marcador desejado.

[00184] As células que sobreviveram à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meio que sustenta a regeneração das plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado (por exemplo, meio MS e N6) pode ser modificado pela inclusão de outras substâncias, tais como reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com os reguladores de crescimento até que o tecido suficiente esteja disponível para iniciar os esforços de regeneração de plantas, ou seguir ciclos repetidos de seleção manual, até que a morfologia do tecido esteja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), depois transferido para o meio conducente para a formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que a formação de brotos suficiente tenha ocorrido. Assim que brotos suficientes sejam formados, eles são transferidos para meio conducente para a formação de raízes. Logo que raízes suficientes sejam formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para posterior crescimento e maturação.

[00185] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nu-cleico de interesse (por exemplo, um DNA que codifica uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão do gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera) nas plantas de regeneração, uma varie- dade de ensaios pode ser executada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting, PCR, e seqüenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA e/ou western blots) ou por meio da função enzimática; ensaios de partes da planta, tais como os ensaios com folhas ou raízes; e análise do fenótipo da planta regenerada completa.

[00186] Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, através da amplificação por PCR utilizando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem de PCR é entendida de incluir, mas não ser limitada a isso, amplificação da reação da cadeia polimerase (PCR) de gDNA derivado do tecido do calo vegetal hospedeiro isolado predito de conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguido de clonagem padrão e análise de sequência dos produtos de amplificação da PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao gDNA derivado de qualquer espécie vegetal (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo as culturas de células.

[00187] Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação dependente de Agrobacterium tipicamente contém um único DNA recombinante inserido dentro de um cromossoma. O poli-nucleotídeo do DNA recombinante único é referido como um "evento transgênico" ou "evento de integração". Tais plantas transgênicas são heterozigóticas para o polinucleotídeo exógeno inserido. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigótica no que diz respeito a um transgene pode ser obtida por sexualmente acasalar (fertilização cruzada contínua) uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene exógeno para si mesmo, por exemplo, uma planta T0, para produzir sementes T-ι. Um quarto da semente T-ι produzido será homozigótico no que diz respeito ao transgene. A germinação de sementes T1 resulta em plantas que podem ser testadas quanto a heterozigocidade, tipicamente utilizando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que leva em conta a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).

[00188] Nas modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula vegetal que possui um efeito inibidor de praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de vários ácidos nucleicos introduzidos em diferentes eventos de transformação, ou a partir de um único ácido nucleico introduzido em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de vários promotores. As moléculas de iRNA individuais podem ser expressas que compreendem múltiplos polinucleotí-deos que são cada um homólogo a diferentes locais dentro de uma ou mais pragas de inseto (por exemplo, os locais definidos pelas SEQ ID NOs: 1, 3, 76 e 78), ambas em diferentes populações da mesma espécie de praga de insetos, ou em diferentes espécies de pragas de insetos.

[00189] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparada pelo cruzamento de uma primeira planta que possui pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta que carece de um tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica uma mo- lécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem vegetal que é receptiva à transformação para produzir uma planta transgênica, em que a planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem vegetal para incorpora o polinucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem vegetal.

[00190] Em alguns aspectos, as sementes e produtos de consumo produzidos pelas plantas transgênicas derivadas de células vegetais transformadas são incluídos, em que as sementes ou produtos de consumo compreendem uma quantidade detectável de um ácido nu-cleico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos de consumo podem ser produzidos, por exemplo, mediante a obtenção de plantas transgênicas e preparação do alimento ou ração para animais a partir delas. Os produtos de consumo compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação: farinha, óleos, grãos triturados ou inteiros ou sementes de uma planta, e qualquer produto alimentar que compreende qualquer farinha, óleo, ou grãos triturados ou inteiros de uma planta recombinante ou semente compreendendo um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção. A detecção de um ou mais dos polinucleotídeos da invenção em uma ou mais mercadorias ou produtos de consumo está de facto em evidência de que a mercadoria ou o produto de base é produzido a partir de uma planta transgênica designada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para o propósito de controlar as pragas de inseto (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras).

[00191] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos um outro evento transgênico no seu genoma, incluindo sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA que direciona um lócus em uma praga coleóptera ou hemíptera diferente daquela definida pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 76, e SEQ ID NO: 78, tal como, por exemplo, um ou mais locais selecionados do grupo que consiste em Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730), ROP (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577811), RNAPII (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577854), Dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), nem (Pedido de Patente U.S. No. 62/095487), COPI alfa (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gama (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216), RNA polimerase 11 (Pedido de Patente U.S. No. 62/133214), e RNA polimerase 11215 (Pedido de Patente U.S. No. 62/133202); um evento genético a partir do qual é transcrito uma molécula de iRNA que direciona um gene em um organismo diferente de uma praga coleóptera e/ou hemíptera (por exemplo, um nematóide parasítico de plantas); um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Baci-llus thurlngiensis, e um polipeptídeo PIP-1); um gene de tolerância a herbicidas (por exemplo, um gene que concede tolerância ao glifosa-to); e um gene que contribui com um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como o rendimento aumentado, o metabolismo de ácido graxo alterado, ou a restauração da esterilidade masculina cito-plasmática. Nas modalidades particulares, os polinucleotídeos que codificam as moléculas de iRNA da invenção pode ser combinados com outras características de controle e doença de insetos em uma planta para alcançar as características desejadas para um melhor controle de doenças vegetais e danos provocados por insetos. Combinar os atributos de controle de inseto que empregam modos de ação distintos, pode fornecer plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior sobre plantas que alojam uma única característica de controle, por exemplo, por causa da reduzida probabilidade de que a resistência à característica irá desenvolver no campo. V. Supressão do Gene Alvo em uma Praga de Inseto A. Visão Geral [00192] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras) pode ser fornecida a uma praga de insetos, em que a molécula de ácido nucleico leva ao sílenci-amento de genes mediado pelo RNAi na praga. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miR-NA, shRNA e hpRNA) pode ser fornecida a uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de inseto pode ser fornecida a uma praga através do contato da molécula de ácido nucleico com a praga. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de inseto pode ser fornecida em um substrato de alimentação da praga, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de uma praga de insetos pode ser fornecida através da ingestão da matéria vegetal que compreende a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente na matéria vegetal através da expressão de um ácido nucleico recombinante introduzido na matéria vegetal, por exemplo, mediante a transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico recombinante e a regeneração de uma matéria vegetal ou planta completa a partir da célula vegetal transformada.

[00193] Em algumas modalidades, uma praga é colocada em contato com a molécula de ácido nucleico que leva ao silenciamento de genes mediado por RNAi na praga através do contato com uma composição tópica (por exemplo, uma composição aplicada por pulverização) ou uma isca de RNAi. As iscas de RNAi são formadas quando o dsR-NA é misturado com o alimento ou um atrativo ou ambos. Quando as pragas comem a isca, elas também consomem o dsRNA. As iscas podem assumir a forma de grânulos, géis, pós fluidos, líquidos ou sólidos. Nas modalidades particulares, o rplI33 pode ser incorporado em uma formulação de isca, tal como aquela descrita na Patente U.S. N-8.530.440 que é aqui incorporada por referência. Geralmente, com iscas, as iscas são colocadas no ou ao redor do meio ambiente da praga de inseto, por exemplo, o WCR pode entrar em contacto com a isca, e/ou ser atraído por ela. B. Supressão do Gene Alvo mediada pelo RNAi [00194] Em certas modalidades, a invenção fornece moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que podem ser designadas para direcionar os polinucleotídeos nativos essenciais (por exemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma praga de insetos (por exemplo, uma praga coleóptera (por exemplo, WCR, SCR e NCR) ou hemíptera (por exemplo, BSB)), por exemplo, através da concepção de uma molécula de iRNA que compreende pelo menos um filamento compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar ao polinucleotídeo alvo. A sequência de uma molécula de iRNA assim concebida pode ser idêntica àquela do polinucleotídeo alvo, ou pode incorporar desequilíbrios que não impedem a hibridização específica entre a molécula de iRNA e seu polinucleotídeo alvo.

[00195] As moléculas iRNA da invenção podem ser utilizadas nos métodos para a supressão do gene em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), reduzindo assim o nível ou a incidência de danos provocados pela praga de uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Como aqui utilizado, o termo "supressão do gene" refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para a redução dos níveis de proteína produzida como um resultado da transcrição de genes no mRNA e a subsequente translação do mRNA, incluindo a redução da expressão da proteína a partir de um gene ou um polinucleotídeo de codificação, incluindo a inibição pós-transcricional da expressão e supressão da transcrição. A inibição pós-transcrição é mediada pela ho-mologia específica entre a totalidade ou uma parte de um mRNA transcrito a partir de um gene direcionado para a supressão e para a molécula de iRNA correspondente utilizada para a supressão. Adicionalmente, a inibição pós-transcrição refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para a ligação através de ribossomas.

[00196] Nas modalidades particulares em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, nas moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de filamento duplo gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de filamento único; o "filamento passageiro" e o "filamento guia." O filamento passageiro pode ser degradado, e o filamento guia pode ser incorporado em RISC. A inibição pós-transcricional ocorre através da hibridização específica do filamento guia com um polinucleotídeo especificamente complementar de uma molécula de mRNA, e subsequente divagem pela enzima, Ar-gonaute (componente catalítico do complexo RISC).

[00197] Em algumas modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser utilizada. Aqueles de habilidade na técnica irão entender que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis durante a preparação e durante a etapa de fornecer a molécula de iRNA a uma célula do que são moléculas de RNA de filamento único, e também são tipicamente mais estáveis em uma célula. Assim, enquanto que as moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, possam ser igualmente eficazes em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser selecionada devido à sua estabilidade.

[00198] Em certas modalidades, uma molécula de ácido nucleico é fornecida que compreende um polinucleotídeo, em que o polinucleotí-deo pode ser expresso in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por um polinucleotídeo dentro do genoma de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera). Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de haste-circuito. Depois que uma praga de insto entra em contato com a molécula de iRNA transcrita in vitro, a inibição pós-transcricional de um gene alvo na praga (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.

[00199] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nu-cleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos) de um polinucleotídeo que é utilizada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera), em que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; o complemento da SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; o complemento da SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; o complemento da SEQ ID NO: 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; um polinucleotí-deo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; o complemento de um polinu-cleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; SEQ ID NO: 76; o complemento da SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 80 a 82. Em certas modalidades, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80 % idêntica (por exemplo, 79 %, cerca de 80 %, cerca de 81 %, cerca de 82 %, cerca de 83 %, cerca de 84 %, cerca de 85 %, cerca de 86 %, cerca de 87 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 %, cerca de 100 %, e 100 %) com qualquer um dos anteriores.

Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera).

[00200] É uma característica importante de algumas modalidades contidas neste documento de que o sistema de inibição pós-transcricional de RNAi é capaz de tolerar variações de sequência entre os genes alvos que podem ser esperados devido à mutação genética, polimorfísmo da cepa, ou divergência evolutiva. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar ser absolutamente homóloga a um produto de transcrição primário ou um mRNA totalmente processado de um gene alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida é especificamente hibridizável em um produto de transcrição primário ou um mRNA totalmente processado do gene alvo. Além do mais, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser de comprimento total, em relação a um produto de transcrição primário ou um mRNA totalmente processado do gene alvo.

[00201] A inibição de um gene alvo utilizando a tecnologia de iRNA da presente invenção é específica da sequência; isto é, os polinucleo-tídeos substancialmente homólogos às moléculas de iRNA são direcionadas para a inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeo que é idêntica àquela de um componente de um gene alvo pode ser utilizada para a inibição. Nestas e outras modalidades, uma molécula de RNA que compreende um polinucleotídeo com uma ou mais inserção, deleção e/ou mutações pontuais em relação a um polinucleotídeo alvo pode ser utilizada. Nas modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma parte de um gene alvo pode compartilhar, por exemplo, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo menos cerca de 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, pelo menos cerca de 100 %, e 100 % de identidade de sequência. Alternativamente, a região dupla de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma parte de um transcrito do gene alvo. Nas moléculas especificamente hibridi-záveis, um polinucleotídeo menor do que o comprimento completo que apresenta uma maior homologia compensa um polinucleotídeo mais longo e menos homólogo. O comprimento do polinucleotídeo de uma região dupla de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma parte de um transcrito do gene alvo pode ser pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo maior do que 20 a 100 nucle-otídeos pode ser utilizado. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo maior do que cerca de 200 a 300 nucleotídeos pode ser utilizado. Nas modalidades particulares, um polinucleotídeo maior do que cerca de 500 a 1000 nucleotídeos pode ser utilizado, dependendo do tamanho do gene alvo.

[00202] Em certas modalidades, a expressão de um gene alvo em uma praga (por exemplo, coleóptera ou hemíptera) pode ser inibida em pelo menos 10 %; pelo menos 33 %; pelo menos 50 %; ou pelo menos 80 % dentro de uma célula da praga, de tal modo que uma inibição significativa ocorra. Inibição significativa refere-se à inibição sobre um limite que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, a interrupção do crescimento, a pausa de alimentação, a interrupção do desenvolvimento, a mortalidade induzida, etc.), ou uma redução detectável no RNA e/ou produto do gene que corresponde ao gene alvo sendo inibido. Embora, em certas modalidades da invenção, a inibição ocorra substancialmente em todas as células da praga, em outras modalidades a inibição ocorre apenas em um subconjunto das células que expressam o gene alvo.

[00203] Em algumas modalidades, a supressão da transcrição é mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA que apresenta identidade de sequência substancial com um DNA promotor ou o seu complemento para efetuar o que é referido como "trans supressão do promotor". A supressão do gene pode ser eficaz contra os genes alvos em uma praga de inseto que pode ingerir ou entrar em contato com tais moléculas de dsRNA, por exemplo, através da ingestão ou contato da matéria vegetal contendo as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para uso na trans supressão de promotor podem ser especificamente concebidas para inibir ou suprimir a expressão de um ou mais polinucleotídeos homólogos ou complementares nas células da praga de inseto. A supressão do gene pós-transcricional através do RNA orientado anti-sentido ou sentido para regular a expressão do gene nas células vegetais é divulgada nas Patentes U.S. 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184 e 5.231.020. C. Expressão das Moléculas de iRNA Fornecida a uma Praga de Insetos [00204] A expressão das moléculas de iRNA para a inibição do Gene mediada por RNAi em uma praga de inseto (por exemplo, coleópte-ra e/ou hemíptera) pode ser realizada em qualquer um dos muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser fornecidas a uma praga de insetos, por exemplo, através do contato das moléculas iRNA com a praga, ou por fazer com que a praga ingira ou de outra forma internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades incluem plantas hospedeiras transformadas de uma praga co-leóptera e/ou hemíptera, células vegetais transformadas, e a progênie das plantas transformadas. As células vegetais transformadas e as plantas transformadas podem ser planejadas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para fornecer um efeito protetor de pragas. Assim, quando uma planta ou célula vegetal transgênica é consumida por uma praga de insetos durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas transgênicas ou células. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros de microrganismo pro-cariótico e eucariótico para a produção de moléculas de iRNA. O termo "microrganismo" inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos.

[00205] A modulação da expressão do gene pode incluir a supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para a supressão da expressão de genes em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) compreende fornecer no tecido do hospedeiro da praga uma quantidade supressora de gene de pelo menos uma molécula de dsRNA formada após a transcrição de um polinucleotídeo como aqui descrito, pelo menos um segmento do qual é complementar a um mRNA dentro das células da praga de insetos. Uma molécula de dsRNA que inclui a sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA, ingerida por uma praga de insetos pode ser pelo menos de cerca de 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou cerca de 100 % idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA rpll33, por exemplo, compreendendo um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78, e 80 a 82. As moléculas de ácido nucleico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitado a estes, polinucleotídeos de ocorrência não natural e constructos de DNA recombinantes para fornecer moléculas de dsRNA são, portanto, fornecidas, as quais suprimem ou inibem a expressão de um polinucleotídeo de codificação en-dógena ou um polinucleotídeo de codificação alvo em uma praga de inseto quando introduzidas nela.

[00206] As modalidades particulares fornecem um sistema de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcricional de um ou mais genes alvos em uma praga de inseto das plantas (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) e controle de uma população da praga das plantas. Em algumas modalidades, o sistema de liberação compreende a ingestão de uma célula vegetal transgêni-ca hospedeira ou conteúdos da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas e outras modalidades, uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica é criada que contém um constructo de DNA recombinante que fornece uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. As células vegetais transgênicas e as plantas transgênicas que compreendem ácidos nu-cleicos que codificam uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas através do emprego de tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de plantas que compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula vegetal ou planta; e para gerar a célula vegetal transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00207] Para transmitir proteção contra pragas de inseto (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras) a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, um molécula de miRNA, uma molécula de shRNA, ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma tal molécula de dsRNA pode ser constituída em parte por um polinucleotídeo que é idêntico a um polinucleotídeo correspondente transcrito a partir de um DNA dentro de uma praga de inseto de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene alvo dentro da praga é suprimida pela molécula de dsRNA, e a supressão da expressão do gene alvo na praga resulta na planta transgênica protegida contra a praga. Os efeitos moduladores das moléculas de dsRNA foram mostrados de serem aplicáveis a uma variedade de genes expressos nas pragas, incluindo, por exemplo, os genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo os genes de manutenção de casas; fatores de transcrição; genes relacionados com a muda; e outros genes que codificam os polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou no crescimento e desenvolvimento normais.

[00208] Para a transcrição a partir de um transgene in vivo ou um constructo de expressão, uma região de regulação (por exemplo, promotor, estimulador, silenciador, e sinal de poliadenilação) pode ser utilizada em algumas modalidades para transcrever o filamento de RNA (ou filamentos). Portanto, em algumas modalidades, como apresentado supra, um polinucleotídeo para uso na produção de moléculas de iRNA pode ser operacionalmente ligado a um ou mais elementos fun- cionais do promotor em uma célula hospedeira vegetal. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. O polinucleotídeo da presente invenção, sob o controle de um elemento promotor operativamente ligado, pode ainda ser flan-queado por elementos adicionais que vantajosamente afetam a sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Tais elementos podem estar localizados a montante do promotor operativamente ligado, a jusante da extremidade 3' do constructo da expressão, e podem ocorrer tanto a montante do promotor quanto a jusante da extremidade 3' do constructo de expressão.

[00209] Algumas modalidades fornecem métodos para a redução dos danos a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) provocada por uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) que se alimenta da planta, em que o método compreende o fornecimento na planta hospedeira de uma célula vegetal transformada que expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que as moléculas de ácido nucleico funcionam após serem absorvidas pelas pragas para inibir a expressão de um polinucleotídeo alvo dentro das pragas, em que a inibição da expressão resulta na mortalidade e/ou redução do crescimento das pragas, reduzindo assim o dano na planta hospedeira provocada pelas pragas. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem as moléculas de dsRNA. Nestas e outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem as moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico consistem de um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto.

[00210] Em outras modalidades, um método para o aumento do rendimento de uma cultura de milho é fornecido, em que o método compreende a introdução em uma planta de milho de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; o cultivo da planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo o ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA que compreende o ácido nucleico inibe os danos pela praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) e/ou o crescimento, reduzindo ou eliminando assim uma perda de rendimento devido à infestação de pragas. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibri-dizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, as moléculas de ácido nucleico compreendem um polinucleotídeo que é especificamente hibri-dizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera.

[00211] Em certas modalidades, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptera e/ou hemíptera) é fornecido, o método compreendendo: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de iRNA da invenção, em que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor e um elemento de terminação da transcrição; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais que inclui uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integram o polinucleotídeo nos seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas para a expres- são de uma molécula de iRNA codificada pelo polinucleotídeo integrado; selecionar uma célula vegetal transgênica que expressa a molécula de iRNA; e introduzir a célula vegetal transgênica selecionada na praga de inseto. As plantas também podem ser regeneradas a partir das células vegetais transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais do que um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, as moléculas de ácido nucleico compreendem um polinucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga co-leóptera e/ou hemíptera.

[00212] As moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie vegetal (por exemplo, de milho ou de soja), como um produto de expressão de um gene recombinante incorporado dentro de um genoma das células vegetais, ou incorporadas em uma revestimento ou tratamento de semente que é aplicado na semente antes da plantação. Uma célula vegetal compreendendo um gene recombinante é considerada de ser um evento genético. Também incluídos nas modalidades da invenção estão os sistemas de liberação para a liberação de moléculas de iRNA nas pragas de inseto (por exemplo, coleópteras e/ou hemípteras). Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de uma praga. Os métodos para a introdução podem incluir a mistura direta de iRNA com o tecido vegetal a partir de um hospedeiro pelas pragas de inseto, assim como a aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção no tecido vegetal do hos- pedeiro. Por exemplo, as moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre uma superfície da planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microrganismo, e o microrganismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou caule por meios físicos tais como uma injeção. Como examinado, supra, uma planta transgênica também pode ser geneticamente planejada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas de insetos conhecidas de infestar a planta. As moléculas de iRNA produzidas pela síntese química ou enzimática também podem ser formuladas de uma forma consistente com as práticas agrícolas comuns, e utilizadas como produtos de pulverização para o controle de danos nas plantas por uma praga de inseto. As formulações podem incluir os adjuvantes apropriados (por exemplo, rótulos e umectantes) requeridos para a cobertura foliar eficiente, assim como protetores de UV para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) dos danos por UV. Tais aditivos são comumente utilizados na indústria de bioinseticida, e são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticida de pulverização (biologicamente baseados ou não) para melhorar a proteção vegetal das pragas.

[00213] Todas as referências, incluindo as publicações, patentes e pedidos de patente, aqui citadas são pela presente incorporadas por referência na medida em que não sejam incompatíveis com os detalhes explícitos desta descrição, e são desse modo incorporadas na mesma medida como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e foram aqui apresentadas na sua totalidade. As referências aqui examinadas são fornecidas unicamente para a sua descrição antes da data de arquivo do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não estão autorizados a antecipar tal descrição em virtude de invenção anterior.

[00214] Os seguintes EXEMPLOS são fornecidos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Estes EXEMPLOS não devem ser interpretados de limitar a descrição nas características particulares ou aspectos descritos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Materiais e Métodos Preparação de amostra e bioensaios [00215] Várias moléculas de dsRNA (incluindo aquelas que correspondem à rpl 133-1 regí (SEQ ID NO:5), rpll33-2 regí (SEQ ID NO:6), Φ//33-2 v1 (SEQ ID NO:7), e rpH33-2 v2 (SEQ ID NO:8) foram sintetizadas e purificadas utilizando um kit de RNAi MEGASCRIPT® T7 (LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA) ou T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEW ENGLAND BIOLABS, Whitby, Ontario). As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão TE, e todas os bioensaios continham um tratamento de controle que consiste ems-te tampão, que serviu como um controle de fundo com relação à mortalidade ou inibição do crescimento de WCR (Diabrotica virgifera virgi-fera LeConte). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00216] As amostras foram testadas com relação à atividade dos insetos em bioensaios conduzidos com larvas de insetos recém-nascidas na dieta artificial de inseto. Ovos de WCR foram obtidos da CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

[00217] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico com 128 reservatórios especificamente designadas para bioensaios de inseto (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada reservatório continha aproximadamente 1,0 ml de uma dieta artificial designada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 μΙ da amostra de dsRNA foi liberada por pipeta sobre a superfície da dieta de cada reservatório (40 μΙ/cm2). As concentrações de amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área de superfície (1,5 cm2) no reservatório. As bandejas tratadas foram mantidas em uma coifa de defumação até que o líquido na superfície do alimento se evapore ou seja absorvido no alimento.

[00218] Dentro de algumas horas de eclosão, as larvas individuais foram recuperadas com uma escova de pêlo de camelo umedecida e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por reservatório). Os reservatórios infestados das bandejas de plástico de 128 reservatórios foram então lacrados com folhas adesivas de plástico transparente, e ventilados para permitir a troca de gás. As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28Ό, ~40 % de Umidade Relativa, 16:8 (luz:escuro)) durante 9 dias, após cujo tempo o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos, e o peso de insetos sobreviventes foram registrados. A mortalidade percentual média e a inibição de crescimento média foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (Gl) foi calculada como se segue: Gl = [1 — (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)], onde TWIT é o peso total de insetos vivos no tratamento; TNIT é o número total de insetos no tratamento; TWIBC é o peso total dos insetos vivos na verificação secundária (controle de tampão); e TNIBC é o total número de insetos na verificação secundária (controle de tampão).

[00219] A análise estatística foi realizada utilizando o software JMP™ (SAS, Cary, NC).

[00220] A LC50 (concentração letal) é definida como a dose na qual 50 % dos insetos de teste são mortos. A Gl50 (inibição do crescimento) é definida como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é de 50 % do valor médio visto nas amostras de verificação secundária.

[00221] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma mortalidade surpreendente e inesperada e inibição do crescimento das larvas de verme da raiz do milho. EXEMPLO 2: Identificação dos Genes Alvos Candidatos [00222] Insetos de vários estágios de desenvolvimento do WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para análise de transcriptoma por agrupamento para fornecer sequências de gene alvo candidato para o controle através da tecnologia de proteção contra insetos da planta transgênica de RNAi.

[00223] Em uma exemplificação, o RNA total foi isolado em cerca de 0,9 g da totalidade das larvas de WCR de primeiro instar ; (4 a 5 dias após a eclosão, mantido a 16 Ό), e purificado utilizando o seguinte método baseado em fenol/TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, Cincinnati, OH).

[00224] As larvas foram homogeneizadas na temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 ml com 10 ml de TRI REAGENT® até que uma suspensão homogênea fosse obtida. Após 5 min. de incubação na temperatura ambiente, o homogeneizado foi distribuído em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1 ml por tubo), 200 pl de clorofórmio foram adicionados, e a mistura foi vigorosamente agitada durante 15 segundos. Após deixar a extração repousar na temperatura ambiente durante 10 min, as fases foram separadas por centrifugação em 12.000 x g a 4 Ό. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 ml) foi cuidadosamente transferida para outro tubo estéril de 1,5 ml, e um volume igual de isopropanol na temperatura ambiente foi adicionado.

Após a incubação na temperatura ambiente durante 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min a 12.000 x g (4 Ό ou 2 5 Ό).

[00225] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado e o grânulo de RNA foi lavado duas vezes com vórtice com 75 % de etanol, com a recuperação por centrifugação durante 5 min a 7500 x g (4 Ό ou 25 Ό) após cada lavagem. O etanol foi cui dadosamente removido, o grânulo foi deixado secar ao ar livre durante 3 a 5 minutos, e depois foi dissolvido em água estéril livre de nuclease. A concentração de RNA foi determinada através da medição da absorvência (A) em 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 g de larvas rendeu mais de 1 mg de RNA total, com uma relação de A26o/A28o de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80 Ό até que processado mais adiante.

[00226] A qualidade do RNA foi determinada mediante a ativação de uma alíquota através de um gel de agarose a 1 %. A solução de gel de agarose foi preparada utilizando tampão TAE 10x submetido a au-toclave (EDTA Tris-acetato; a concentração 1x é 0,04 M de Tris-acetato, 1 mM de EDTA (sal de sódio de ácido etilenodiamina tetra-acético), pH 8,0), diluída com água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila) em um recipiente submetido a autoclave. 1x TAE foi utilizado como tampão de ativação. Antes do uso, o tanque de eletroforese e a crista de formação de reservatório foram limpos com RNaseAway™ (Invitrogen INC., Carlsbad, CA). Dois pl de amostra de RNA foram misturados com 8 pl de tampão TE (10 mM Tris HCI pH 7,0; EDTA 1 mM) e 10 μΙ de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® Catalog No 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70 Ό durante 3 min, esfriada para a temperatura am biente, e 5 μΙ (contendo 1 μg a 2 μg de RNA) foram carregados por reservatório. Os marcadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram simultaneamente operados em reservatórios separados para comparação de tamanho molecular. O gel foi operado em 60 volts durante 2 horas.

[00227] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparado a partir do RNA total de larvas por um prestador de serviços comercial (EUROFINS MWG Operon, Huntsvilie, AL), utilizando a pré-ativação Aleatória. A biblioteca de cDNA de larvas normalizada foi sequênciada em escala de placa 1/2 por GS FLX 454 Titanium™ série química na EUROFINS MWG Operon, o que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento médio de leitura de 348 pb. 350.000 leituras foram coletadas em mais de 50.000 contigs. Tanto as leituras não coletadas quanto os contigs foram convertidos em bases de dados BLAS-Table utilizando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível a partir de NCBI).

[00228] As bibliotecas de RNA total e cDNA normalizado foram preparadas de modo semelhante a partir de materiais colhidos em outros estágios de desenvolvimento do WCR. Uma biblioteca transcriptoma reunida para a triagem do gene alvo foi construída através da combinação de membros da biblioteca de cDNA que representam os vários estágios de desenvolvimento.

[00229] Os genes candidatos para o direcionamento de RNAi foram hipotetizados de serem essenciais para a sobrevivência e crescimento de insetos de pestilência. Os homólogos do gene alvo selecionados foram identificados na base de dados da sequência de transcriptoma, como descrito abaixo. As sequências de comprimento total ou parciais dos genes alvo foram amplificadas por PCR para preparar modelos para a produção de RNA de filamento duplo (dsRNA).

[00230] As pesquisas TBLASTN utilizando as sequências de codificação de proteína candidata foram operadas em comparação com os bancos de dados compatível BLASTable contendo as leituras de sequência Diabrotica desagrupadas ou os contigs agrupados. Resulta- dos significativos para uma sequência de Diabrotica (definida como melhor do que e~20 para homologias contigs e melhor do que e~10 para as homologias de leituras de sequência não agrupadas) foram confirmados utilizando BLASTX em comparação com o banco de dados NCBI não redundante. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências de gene candidato homólogo de Diabrotica identificadas na pesquisa de TBLASTN de fato compreendiam os genes de Diabrotica, ou foram o melhor resultado para a sequência do gene candidato não Diabrotica presente nas sequências de Diabrotica. Em alguns casos, ficou claro que algumas das leituras de contigs de Diabrotica ou sequência não agrupada selecionadas por homologia a um gene candidato não Diabrotica sobrepostas, e que a montagem dos contigs falhou em juntar a estas sobreposições. Nesses casos, Sequencher™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, Ml) foi utilizado para agrupar as sequências nos revestimentos contigs mais longos.

[00231] Vários genes alvos candidatos que codificam rplI33 de Diabrotica (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3) foram identificados como genes que podem levar à mortalidade da praga coleóptera, à inibição do crescimento, inibição do desenvolvimento e/ou inibição da alimentação no WCR.

[00232] Os polinucleotídeos da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3 são novos. As sequências não são fornecidas nas bases de dados públicas, e não são divulgadas na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO/2011/025860; Pedido de Patente U.S. No. 20070124836; Pedido de Patente U.S. No. 20090306189; Pedido de Patente U.S. US20070050860; Pedido de Patente U.S. No. 20100192265; Patente U.S. 7.612.194; ou Pedido de Patente U.S. 2013192256. O rpll33-1 de Diabrotica (SEQ ID NO: 1) é um tanto relacionado com um fragmento de uma sequência de Drosophila willistoni (GENBANK Accession No. XM_002064757.1). Não houve nenhuma sequência nucleotídeo homóloga significativa para o rplI33-2 de Diabrotica (SEQ ID NO: 3) encontrada no GenBank. O homólogo mais próximo da sequência de amino-ácido de RPI133-1 de Diabrotica (SEQ ID NO: 2) é uma proteína de Aedes aegypti tendo o GENBANK Accession No. XP_001659470.1 (94 % semelhante, 87 % idêntica sobre a região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácido de RPII33-2 de Diabrotica (SEQ ID NO: 4) é uma proteína de Dendroctonus ponderosae tendo o GENBANK Accession No. AAE63493.1 (96 % semelhante, 91 % idêntica sobre a região de homologia).

[00233] Os transgenes de dsRNA de Rpll33 podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA para fornecer RNAi alvo e efeitos si-nérgicos de RNAi. Os eventos de milho transgênicos que expressam o dsRNA que direciona o rplI33 são úteis para a prevenção de danos de alimentação da raiz pelo verme da raiz. Os transgenes de dsRNA de RplI33 representam novos modos de ação para combinar com a tecnologia proteína inseticida de Bacillus thuringiensis nas pirâmides de genes de Controle de Resistência do Inseto para mitigar contra o desenvolvimento das populações de verme da raiz resistentes a qualquer uma destas tecnologias de controle de verme da raiz.

EXEMPLO 3: Amplificação dos Genes Alvos para produzir o dsRNA

[00234] Os clones de comprimento completo ou parciais de sequências de genes candidatos rplI33 foram utilizados para gerar am-plicons de PCR para a síntese de dsRNA. Os iniciadores foram designados para amplificar as partes das regiões de codificação de cada gene alvo por PCR. Ver a Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência de promotor de fago T7 (TT AAT AC G ACT C ACT AT AG G GAGA; SEQ ID NO: 9) foi incorporada nas extremidades 5' dos filamentos de sentido ou antisentido amplificados. Ver a Tabela 1. O RN A total foi extraído do WCR utilizando TRIzol® (Life Technologies, Grand Island, NY), e foi depois utilizado para produzir o cDNA de primeiro filamento com SuperScriptlll® First-Strand Synthesis System e instruções preparadas de Oligo dT do fabricante (Life Technologies, Grand Island, NY). O cDNA de primeiro filamento foi utilizado como modelo para as reações de PCR utilizando os iniciadores opostos posicionadas para amplificar a totalidade ou parte da sequência do gene alvo nativo. O dsRNA também foi amplificado a partir de um clone de DNA que compreende a região de codificação para uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 10; Shagin et ai (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50). Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar as partes das regiões de codificação do gene alvo rpll-33 exemplar e do gene de controle negativo YFP. EXEMPLO 4: Constructos de RNAi Preparação de Modelo através da síntese de PCR e dsRNA.

[00235] Uma estratégia utilizadas para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA rplI33 e YFP é mostrada na FIGURA 1. Os modelos de DNAs destinados para uso na síntese de dsRNA rplI33 foram preparados pela PCR utilizando os pares de iniciadores na Tabela 1 e (como modelo de PCR) cDNA de primeiro filamento preparado a partir do RNA total isolado de ovos de WCR, larvas de primeiro instar, ou adultas. Para cada região do gene alvo rplI33 e YFP selecionada, as amplificações de PCR introduziram uma sequência de promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos sentido e anti-sentido amplificados (o segmento YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região de codificação de YFP). Os dois fragmentos amplificados de PCR para cada região dos genes alvo foram depois misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi utilizada como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIGURA 1. As sequências dos modelos de dsRNA amplificados com os pares de iniciadores particulares foram: SEQ ID NO:5 (rpll33-1 regí), SEQ ID NO:6 (rpll33-2 regí), SEQ ID NO:7 (rpll33-2 ver1), SEQ ID NO:8 (rpll33-2 v2), e YFP (SEQ ID NO: 10). O RNA de filamento duplo para o bioensaio de inseto foi sintetizado e purificado utilizando um kit AMBION® MEGASCRIPT® RNAi seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN) or HiScribe® T7 In Vitro Transcription Kit seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA). As concentrações de dsRNA foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE). Construção de vetores de transformação de plantas.

[00236] Os vetores de entrada que abrigam um constructo do gene alvo para a formação grampo de cabelo compreendendo o segmento de rpll33 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:76, or SEQ ID NO:78) são agrupados utilizando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos padrão de clonagem molecular. A formação grampo de cabelo intramole-cular através de transcritos primários de RNA é facilitada pela disposição (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias do segmento do gene alvo rplI33 em orientação oposta entre si, os dois segmentos sendo separados por um polinucleotídeo ligante (por exemplo, SEQ ID NO: 107 , e por um íntron de ST-LS1 (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)). Deste modo, a transcrição de mRNA primário contém as duas sequências de segmento do gene rplI33 como grandes repetições invertidas entre si, separadas pela sequência de íntron. Uma cópia de um promotor (por exemplo, ubiquitina de milho 1, Patente U.S. N- 5.510.474; 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotor de bacilliform badnavirus da cana de açúcar (ScBV); promotores dos genes de actina de arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 do milho; promotor d e ALS; promotor do gene da faseolina; cab; rubisco; LAT52; Zm13; e/ou apg) é utilizada para acionar a produção do transcrito grampo de cabelo de mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região 3' não transladada (por exemplo, um gene de peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3’UTR v2; Patente U.S. N- 6.699.984), AtUbilO, AtEfl ou StPinll) é utilizado para terminar a transcrição do gene de expressão do RNA grampo de cabelo.

[00237] Os vetores de entrada pDAB126158 e pDAB126159 compreendem um constructo de RNA de rplI33 (SEQ ID NOs: 103 e 104, respectivamente) que compreende um segmento de rplI33 (SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente).

[00238] Os vetores de entrada descritos acima são utilizados nas reações de recombinação Gateway® padrão com um vetor de destino binário típico para produzir vetores de transformação da expressão de RNA grampo de cabelo rplI33 para as transformações do embrião de milho mediadas por Agrobacterium.

[00239] O vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Patente U.S. 7.838.733 (B2), e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-5) sob a regulação de uma promotor operável de plantas (por exemplo, promotor de bacilliform badnavirus da cana de açúcar (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) e ZmUbil (Patente U.S. 5.510.474)). A 5'UTR e o íntron são posicionados entre a extremidade 3' do segmento promotor e o códon de partida da região de codificação de AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região 3' não transladada de um gene lípase do milho (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. 7.179.902) é utilizado para a transcrição terminal do mRNA de AAD-1.

[00240] Um vetor binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construído por meio das reações padrão de recombinação GATEWAY® com um vetor de destino binário típico e vetor de entrada. O vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (como acima) sob a regulação de expressão de um promotor 1 de ubiquitina do milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região 3' não transladada de um gene lípase do milho (ZmLip 3'UTR, como acima). EXEMPLO 5: Triagem dos Genes Alvos Candidatos [00241] O dsRNA sintético designado para inibir as sequências do genes alvo identificadas no EXEMPLO 2 provocou a mortalidade e inibição do crescimento quando administrado ao WCR em ensaios com base na dieta.

[00242] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão das preparações de dsRNA derivadas de rplI33-2 regí, rplI33-2 v1 e rplI33-2 v2, cada uma resultou na mortalidade e inibição do crescimento das larvas do verme da raiz do milho ocidental. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados dos bioensaios de alimentação com base na dieta de larvas de WCR após a exposição de 9 dias nestes dsRNA, assim como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo de dsRNA preparada a partir de uma região de codifica- ção da proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 10).

Tabela 2. Resultados dos ensaios de alimentação com base na dieta de dsRNA rplI33 obtidos com as larvas de verme da raiz do milho ocidental após 9 dias de alimentação. A análise ANOVA encontrou diferenças na % média de mortalidade e % média de inibição do crescimento (Gl). As médias foram separadas utilizando o teste de Tukey-Kramer. *SEM = erro padrão da média. As letras entre parênteses designam níveis estatísticos. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (P < 0,05). **TE = Tris HCI (1 mM) acrescido de EDTA (0,1 mM), pH 7,2. ***YFP = Proteína Fluorescente Amarela Tabela 3. Resumo da potência oral do dsRNA rplI33 sobre as larvas de WCR (ng/cm2).

[00243] Foi anteriormente sugerido que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para o controle de insetos mediado por RNAi. Ver a Publicação de Patente U.S. No. 2007/0124836, que divulga 906 sequências, e a Patente U.S. N- 7.612.194, que divulga 9112 sequências. No entanto, determinou-se que muitos genes sugeridos como tendo utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Determinou-se também que as sequências rplI33-2 v1, rplI33-2 v2, e rplI33-2 regí cada uma fornece um controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, em comparação com outros genes sugeridos de ter utilidade para o con- trole de inseto mediado por RNAi.

[00244] Por exemplo, a anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4 foram cada uma sugerida na Patente U.S. 7.612.194 de ser eficaz no controle de inseto mediado por RNAi. A SEQ ID NO: 20 é a sequência de DNA da região de anexina 1 (Reg 1) e SEQ ID NO: 21 é a sequência de DNA da região de anexina 2 (Reg 2). A SEQ ID NO: 22 é a sequência de DNA de região 1 de beta espectrina 2 (Reg 1) e SEQ ID NO: 23 é a sequência de DNA da Região 2 d e beta espectrina 2 (Reg 2). A SEQ ID NO: 24 é a sequência de DNA da região de mtRP-L4 (Reg 1) e a SEQ ID NO: 25 é a sequência de DNA da região mtRP-L4 2 (Reg 2). Uma sequência de YFP (SEQ ID NO: 10) também foi utilizada para produzir dsRNA como um controle negativo.

[00245] Cada uma das sequências anteriormente mencionadas foi utilizadas para produzir dsRNA pelos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia utilizada para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA está mostrada na FIGURA 2. Os DNAs modelos destinados para uso na síntese de dsRNA foram preparados pela PCR utilizando os pares de iniciadores na Tabela 4 e o cDNA de primeiro filamento (como modelo de PCR) preparado a partir do RNA total isolado das larvas de primeiro instar de WCR. (A YFP foi amplificada a partir de um clone de DNA.) Para cada região do gene alvo selecionada, duas amplificações de PCR separadas foram realizadas. A primeira amplificação de PCR introduziu uma sequência promotora de T7 na extremidade 5' dos filamentos de sentido amplificados. A segunda reação incorporou a sequência do promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos anti-sentido. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes alvo foram depois misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi utilizada como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a FIGURA 2. O RNA de filamento duplo foi sintetizado e purificado utilizando um kit de RNAi AMBION® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN). As concentrações de dsRNA foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) e os dsRNAs foram cada um testado pelos mesmos métodos de bioensaio com base na dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores utilizados para produzir as moléculas de anexina Regí, anexina Reg2, beta espectri-na 2 Regí, beta espectrina 2 Reg2, mtRP-L4 Regí, mtRP-L4 Reg2 e dsRNA da YFP. A Tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação com base na dieta de larvas de WCR após a exposição de 9 dias para estas moléculas de dsRNA. Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão destes dsRNA não resultou em nenhuma mortalidade ou inibição do crescimento das larvas de verme da raiz do milho ocidental acima que tenha sido observada com as amostras de controle de tampão TE, água ou proteína YFP.

Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar as partes das regiões de codificação dos genes.

Tabela 5. Resultados de ensaios de alimentação com base na dieta obtidos com larvas de verme da raiz do milho ocidental após 9 dias. *ΤΕ = Tris HCI (10 mM) acrescido de EDTA (1 mM), pH 8. **YFP = Proteína Fluorescente Amarela EXEMPLO 6: Produção de Tecidos de Milho Transgênico compreendendo dsRNAs Inseticidas [00246] Transformação mediada por Agrobacterium. As células, tecidos e plantas transgênicas de milho que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA insecticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene compreendendo rplI33 (por exemplo, SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3)) através da expressão de um gene quimérico integrado de forma estável no genoma da planta são produzidas seguindo a transformação mediada por Agrobacterium. Os métodos de transformação do milho que empregam vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 8.304.604, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os tecidos transformados são selecionados pela sua capacidade de crescer em meio contendo Haloxyfope e são submetidos a triagem quanto à produção de dsRNA, como apropriado. Partes de tais culturas de tecido transformadas são apresentadas nas larvas do verme da raiz do milho recém-nascidas para o bioensaio, essencialmente como descrito no EXEMPLO 1.

[00247] Início da Cultura de Agrobacterium. Cargas de glicerol de células DAt13192 da cepa de Agrobacterium (Publicação Internacional PCT No. WO 2012/016222A2) que abrigam um vetor de transformação binário descrito acima (EXEMPLO 4) são estriadas em placas de meio mínimo AB (Watson, et al. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) contendo os antibióticos apropriados, e são cultivadas a 20 Ό durante 3 dias. As culturas são então estriadas em placas de YEP (g/L: extrato de levedura, 10; peptona, 10; NaCI, 5) contendo os mesmos antibióticos e são incubadas a 20 °C durante 1 dia.

[00248] Cultura de Agrobacterium. No dia de uma experiência, uma solução de matéria-prima de Meio de Inoculação e acetossiringona é preparada em um volume apropriado para o número de constructos na experiência e medida com pipeta em um frasco de 250 ml descartável estéril. O Meio de Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transfor-mation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Cul-ture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341) contém: 2,2 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins (Frame et al., ibid.). 68,4 g/l de sacarose; 36 g/l de glicose; 115 mg/l de L-prolina; e 100 mg/l de mio-inositol; em pH 5,4.) acetossiringona é adicionada ao frasco contendo Meio de Inoculação em uma concentração final de 200 μΜ a partir de uma solução de matéria-prima 1 M em 100 % de dimetilsulfóxido, e a solução é completamente misturada.

[00249] Para cada constructo, 1 ou 2 circuitos de inoculação completos de Agrobacterium da placa de YEP são colocados em suspensão em 15 ml de meio de solução de matéria-prima de inocula-ção/acetossiringona em um tubo de centrífuga de 50 ml estéril descartável, e a densidade óptica da solução em 550 nm (OD550) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão é então diluída para DO550 de 0,3 a 0,4 utilizando misturas adicionais de meio de inocula-ção/acetossiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium é então colocado horizontalmente sobre um agitador de plataforma fixado ao redor de 75 rpm na temperatura ambiente e agitado durante 1 a 4 horas, enquanto a dissecação de embriões é executada.

[00250] Esterilização da Espiga e isolamento de embriões. Em- briões imaturos de milho são obtidos a partir de plantas de linhagem congênita de Zea mays B104 (Hallauer et ai (1997) Crop Science 37:1405-1406), cultivadas na estufa e auto- ou sib-polinizadas para produzir espigas. As espigas são colhidas aproximadamente 10 a 12 dias após a polinização. No dia da experiência, as espigas descascadas são esterilizadas na superfície por imersão em uma solução a 20 % de lixívia comercial (ULTRA CLOROX® Germicidal Bleach, 6,15 % de hipoclorito de sódio, com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas durante 20 a 30 min, seguido por três enxágues com água deionizada estéril em uma coifa de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) são dissecados assepticamente de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo 2,0 ml de uma suspensão de células de Agrobacterium apropriadas no Meio de Inoculação líquido com acetossiringona de 200 μΜ, em que 2 pl de tensoativo BREAK-THRU® S233 a 10 % (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Germany) são adicionados. Para um dado conjunto de experiências, os embriões de espigas agrupadas são utilizadas para cada transformação.

[00251] Co-cultivo de Agrobacterium. Após isolamento, os embriões são colocados sobre uma plataforma oscilante durante 5 minutos. Os conteúdos do tubo são depois despejados em uma placa de meio de co-cultura, que contém 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamin; 30 g/l de sacarose; 700 mg/l de L-prolina; 3,3 mg/l de Dicam-ba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico); 100 mg/l de mio-inositol; 100 mg/l de Hidrolisado En-zimático de Caseína; 15 mg/l de AgN03; 200 μΜ de acetossiringona em DMSO; e 3 g/l de GELZAN™, em pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium é removida com uma pipeta de transferência estéril descartável. Os embriões são então orientados com o escutelo virado para cima utilizando fórceps estéreis com o auxílio de um microscópio. A placa é fechada, selada com fita adesiva 3M™ MICROPORE™, e colocada em uma incubadora a 25 Ό com luz contínua em aproximadamente 60 pmol de m'2s'1 de Photosynthetically Active Radiation (PAR).

[00252] Seleção de Calo e Regeneração dos Eventos Transgêni-cos. Após o período de co-cultura, os embriões são transferidos para o Meio de Descanso, que é composta de 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 30 g/l de sacarose; 700 mg/l de L-prolina; 3,3 mg/l de Dicamba em KOH; 100 mg/l de mio-inositol; 100 mg/l de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/l de AgN03; 0,5 g/l de MES (monoidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de Carbenicilina; e 2,3 g/L GELZAN™; em pH 5,8. Não mais do que 36 embriões são deslocados para cada placa. As placas são colocadas em uma caixa de plástico transparente e incubadas a 27 Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol de m'2s'1 PAR durante 7 a 10 dias. Os embriões calejados são então transferidos (<18/placa) para meio de seleção I, o qual é composto de meio de descanso (acima) com 100 nM de ácido R-Haloxyfop (0,0362 mg/L; para a seleção de calos que abrigam o gene AAD-1). As placas são devolvidas para as caixas transparentes e incubadas a 27 O com luz contínua em aproximadamente 50 pmol de m'2s'1 PAR durante 7 dias. Os embriões calejados são então transferidos (<12/placa) para o meio de seleção II, que é composto de meio de descanso (acima) com 500 nM de ácido R-Haloxyfop (0,181 mg/l). As placas são devolvidas para as caixas transparentes e incubadas a 27Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol de m'2s'1 PAR durante 14 dias. Esta etapa de seleção permite que o calo transgênico prolifere e diferencie ainda mais.

[00253] Proliferação, calos embrionários são transferidos (<9/placa) para o meio de pré-Regeneração. O Meio de Pré-Regeneração contém 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 45 g/l de sacarose; 350 mg/l de L-prolina; 100 mg/l de mio-inositol; 50 mg/l de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/l de AgN03; 0,25 g/l de MES; 0,5 mg/l de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/l de ácido abscísico em etanol; 1 mg/l de 6-benzilaminopurina; 250 mg/l de car-benicilina; 2,5 g/l de GELZAN™; e 0,181 mg/l de ácido Haloxifope; em pH 5,8. As placas são armazenadas em caixas transparentes e incubadas a 27 Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol de nrí2s~1 PAR durante 7 dias. Os calos em regeneração são então transferidos (<6/placa) para Meio de regeneração em PHYTATRAYS™ (Sigma-Aldrich) e incubados a 28 O com 16 horas de luz/8 horas de escuridão por dia (em aproximadamente 160 pmol de m'2s'1 PAR) durante 14 dias ou até que os brotos e raízes se desenvolvam. O meio de regeneração contém 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 60 g/l de sacarose; 100 mg/l de mio-inositol; 125 mg/l de carbenicilina; 3 g/l de goma GELLAN™; e 0,181 mg/l de ácido R-Haloxyfop; em pH 5,8. Pequenos brotos com raízes primárias são então isolados e transferidos para o meio de prolongamento sem seleção. O Meio de Alongamento contém 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Modified MS Vitamins; 30 g/l de sacarose; e 3,5 g/l GELRITE™: em pH 5,8.

[00254] Os brotos de plantas transformadas selecionados pela sua capacidade de crescer em meio contendo Haloxyfop são transplantados de PHYTATRAYS™ para pequenos vasos carregados com meio de crescimento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), coberto com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS), e depois endurecidos em uma câmara de crescimento CONVIRON (27 Ό dia/24 *C à noite, fotoperíodo de 16 horas, 50 a 70 % RH, 200 mmol m'2s'1 PAR). Em alguns casos, as plântulas transgênicas putativas são analisadas com relação ao número de cópias relativas do transgene por ensaios de PCR quantitativa em tempo real utilizando iniciadores designados para detectar o gene de tolerância a herbicida AAD1 integrado no genoma do milho.

Além disso, os ensaios de RT-qPCR são utilizados para detectar a presença da sequência ligante e/ou da sequência alvo em transformantes putativos. As plântulas transformadas selecionadas são então transferidas para uma estufa para crescimento adicional e testes.

[00255] Transferência e estabelecimento de plantas T0 na estufa para bioensaios e produção de sementes. Quando as plantas alcançam o estágio V3-V4, elas são transplantadas para a mistura de solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e cultivadas para a floração na estufa (Light Exposure Type: Photo or Assimilation; High Light Limit: 1200 PAR; duração do dia 16 horas; 27 Ό dia/24 Q à noite).

[00256] As plantas a serem utilizadas para bioensaios de insetos são transplantadas de pequenos vasos para TINUS™ 350-4 ROOTRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Al-berta, Canada); (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias após o transplante para ROOTRAINERS®, as plantas são infestadas para o bioensaio.

[00257] As plantas da geração T-ι são obtidas através da polinização das sedas de plantas transgênicas T0 com pólen coletado de plantas da linhagem congênita não transgênica B104 ou outros doadores de pólen apropriados e plantação das sementes resultantes. Cruzamentos recíprocos são executados quando possível. EXEMPLO 7: Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transgê-nico [00258] Análises moleculares (por exemplo, RT-qPCR) dos tecidos de milho são executadas nas amostras de folhas que foram coletadas de plantas cultivadas em estufa no dia antes ou no mesmo dia que o dano de alimentação da raiz é avaliado.

[00259] Os resultados dos ensaios de RT-qPCR para o gene alvo são utilizados para validar a expressão do transgene. Os resultados dos ensaios de RT-qPCR para a sequência de intervenção entre as sequências de repetição (que é essencial para a formação de moléculas grampo de cabelo de dsRNA) nos RNAs expressos, são alternativamente utilizados para validar a presença de transcritos de grampo de cabelo. Os níveis de expressão de RNA transgene são medidos em relação aos níveis de RNA de um gene do milho endógeno.

[00260] As análises da qPCR do DNA para detectar uma parte da região de codificação AAD1 no gDNA são utilizadas para estimar o número de cópias de inserção do transgene. As amostras para as análises são coletadas a partir de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Os resultados são comparados com os resultados da qPCR do DNA de ensaios concebidos para detectar uma parte de um gene nativo de cópia única, e eventos simples (tendo uma ou duas cópias de transgenes rplI33) são avançados para outros estudos na estufa.

[00261] Adicionalmente, os ensaios de qPCR designados para detectar uma parte do gene de resistência a espectinomicina (SpecR; abrigado nos plasmídeos de vetores binários fora do T-DNA), são utilizados para determinar se as plantas transgênicas contêm sequências da cadeia principal de plasmídeo integrado externo. Nível de expressão do transcrito de RNA: qPCR alvo. Eventos celulares de calos ou plantas transgênicas são analisados por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) da sequência alvo para determinar o nível de expressão relativa do transgene, em comparação com o nível de transcrito de um gene de milho interno (SEQ ID NO: 54; GENBANK Accession No. BT069734), que codifica uma proteína semelhante a TIP41 (isto é, um homólogo de milho de GENBANK Accession No. AT4G34270; tendo uma pontuação tBLASTX de identidade de 74 %). O RNA é isolado utilizando o Norgen BioTek™ Total RNA Isolation Kit (Norgen, Thorold, ΟΝ). O RNA total é submetido a um tratamento DNasel em coluna de acordo com o protocolo sugerido do kit. O RNA é então quantificado em um espectrofotômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e a concentração é normalizada em 50 ng/μΙ. O primeira cDNA filamentoso é preparado utilizando um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pl com 5 μΙ de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo é levemente modificado para incluir a adição de 10 μΙ de 100 μΜ T20VN oligonucleotídeo (IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C ou G, e N é A, C, G, ou T; SEQ ID NO: 55 ) dentro do tubo de 1 ml de mistura de matéria-prima de iniciador aleatório, a fim de preparar uma matéria-prima de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.

[00262] Após a síntese de cDNA, as amostras são diluídas 1:3 com água isenta de nuclease, e armazenadas a -20 Ό até que analisadas.

[00263] Os ensaios de PCR em tempo real separados pelo gene alvo e transcrição semelhante a TIP41 são executados em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em volumes de reação de 10 μΙ. Para os ensaios de gene alvo, as reações são operadas com Primers rplI33 v1 FWD Set 2 (SEQ ID NO: 56) e rplI33 v1 REV Set 2 (SEQ ID NO: 57), e uma sonda IDT Custom Oligo rplI33 v1 PRB Set 2, marcados com FAM e duplamente extintos com repressores Zen and lowa Black (SEQ ID NO: 105); ou Primers rplI33 v2 FWD Set 2 (SEQ ID NO:111) e rpll33 v2 REV Set 2 (SEQ ID NO:112), e uma sonda IDT Custom Oligo rplI33 v2 PRB Set 2, marcados com FAM e duplamente extintos repressores Zen and lowa Black (SEQ ID NO: 106). Para o ensaio de gene de referência semelhante a TIP41, iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO: 58) e TIPmxR (SEQ ID NO: 59), e Probe HXTIP (SEQ ID NO: 60) marcado com HEX (hexacloro-fluoresceína), são utilizados.

[00264] Todos os ensaios incluem controles negativos sem padrão (somente misturas). Para as curvas padrão, um espaço em branco (em água no reservatório fonte) também está incluído na placa de origem para verificar a existência de contaminação cruzada da amostra. As sequências de iniciadores e sondas estão apresentadas na Tabela 6. Os componentes da reação de receitas para a detecção dos vários transcritos são divulgados na Tabela 7, e as condições de reações PCR estão resumidas na Tabela 8. O componente fluorescente FAM (6-carbóxi fluoresceína amidita) é ativado em 465 nm e a fluorescência é medida em 510 nm; os valores correspondentes para o componente fluorescente HEX (hexaclorofluoresceína) são 533 nm e 580 nm. Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeo utilizadas para as análises moleculares de níveis de transcrito no milho transgênico. *Proteína semelhante a TIP41 Tabela 7. Receitas de reação PCR para a detecção de transcrito. Tabela 8. Condições do termociclador para a qPCR de RNA.

[00265] Os dados são analisados utilizando o software LIGHTCYCLER™ v1.5 através da quantificação relativa utilizando um segundo algoritmo max derivado para o cálculo de valores Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para as análises de expressão, os valores de expressão são calculados utilizando o método AACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que recorre à comparação de diferenças de valores Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 sendo selecionado sob o suposição de que, para reações PCR otimizadas, o produto duplica a cada ciclo.

[00266] Tamanho e integridade do transcrito: Ensaio Northern Blot. Em alguns casos, a caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida através do uso da análise de Northern Blot (mancha de RNA) para determinar o tamanho molecular do dsRNA grampo de cabelo rplI33 nas plantas transgênicas que expressam um dsRNA grampo de cabelo rplI33.

[00267] Todos os materiais e equipamentos são tratados com RNaseZAP (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos de ml SAFELOCK EPPENDORF, submetidas a disrupção com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA), com três esferas de tungstênio em 1 ml de TRIZOL (INVITROGEN) durante 5 min, em seguida incubadas na temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas durante 10 min a 4 Ό em 11000 rpm e o sobrenadante é transferido para dentro de um novo tubo de 2 ml SAFELOCK EPPENDORF. Depois 200 pl de clorofórmio são adicionados ao homogeneizado, o tubo é misturado por inversão durante 2 a 5 min, incubado na temperatura ambiente durante 10 minutos, e centrifugado em 12.000 x g durante 15 min a 4 Ό. A fase superior é transferida para um tubo EPPENDORF de 1,5 ml estéril, 600pl de isopropanol a 100 % são adicionados, seguido pela incubação na RT durante 10 min em 2 h, e depois centrifugados em 12.000 x g durante 10 min em 4 Ό a 25 Ό. O sobrenadante é desc artado e o grânulo de RNA é lavada duas vezes com 1 ml de etanol a 70 %, com centrifugação em 7500 x g durante 10 min em 4 Ό a 25 Ό entre as lavagens. O etanol é eliminado e o grânulo é secado ao ar livre com brevidade durante 3 a 5 minutos antes de colocar novamente em suspensão em 50 pl de água livre de nuclease.

[00268] O RNA total foi quantificado utilizando o NANODROP 8000® (THERMO-FISHER) e as amostras são normalizadas em 5pg/10 μΙ. 10 μΙ de glioxal (AMBION/INVITROGEN) são então adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura de marcador padrão de RNA DIG (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) são dispensados e adicionados a um volume igual de glioxal. As amostras e os RNAs marcadores são desnaturados a 50 Ό durante 45 min e armazenados em gelo até o carregamento de um gel de agarose SEAKEM GOLD 1,25 % (LONZA, Allendale, NJ) em tampão de operação de glioxal NORTHERNMAX 10 X (AMBION/INVITROGEN). Os RNAs são separados por eletroforese em 65 volts/30 mA durante 2 horas e 15 minutos.

[00269] Seguinte à eletroforese, o gel é enxaguado com 2X SSC durante 5 min e representado em uma estação GEL DOC (BIORAD, Hercules, CA), depois o RNA é passivamente transferido para uma membrana de náilon (MILLIPORE) durante a noite na RT, utilizando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste em cloreto de sódio 3 M e citrato trissódico 300 mM, pH 7,0). Após a transferência, a membrana é enxaguada com 2X SSC durante 5 minutos, o RNA é reticulado por UV na membrana (AGILENT/STRATAGENE), e a membrana é deixada secar na temperatura ambiente durante até 2 dias.

[00270] A membrana é pré-hibridizada em tampão ULTRAHYB™ (AMBION/INVITROGEN) durante 1 a 2 horas. A sonda consiste em um produto amplificado por PCR contendo a sequência de interesse, (por exemplo, a parte da sequência anti-sentido das SEQ ID NOs: 5 a 8, 103 a 104 ou, conforme apropriado) marcado com digoxigenina por meio de um procedimento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridi-zação recomendada com tampão é durante a noite em uma temperatura de 60 Ό em tubos de hibridização. Após a hibr idização, a mancha é submetida a lavagens DIG, coberta, exposto a película durante 1 a 30 minutos, em seguida a película é desenvolvida, tudo por métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.

[00271] Determinação do número de cópias de transgenes. Pedaços de folhas de milho, aproximadamente equivalente a 2 punções de folha, são coletados em placas de coleta de 96 reservatórios (QIAGEN™). As rupturas do tecido são executadas com um pulverizador de tecido KtECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (fornecido com um BIOSPRINT96 PLANT KIT; QIAGEN) com um glóbulo de aço inoxidável. Após a maceração do tecido, o gDNA é isolado em formato de alto rendimento utilizando um BIOSPRINT96 PLANT KIT e um robô de extração BIOSPRINT96. O gDNA é diluído 1:3 DNA:água antes da determinação da reação qPCR.

[00272] Análise da qPCR. A detecção de transgene através do ensaio de sonda de hidrólise é executada por PCR em tempo real utilizando um sistema LIGHTCYCLER048O. Os oligonucleotídeos a serem utilizados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar o gene alvo (por exemplo, rplI33), a sequência de ligante, e/ou para detectar uma parte do gene SpecR (isto é, o gene de resistência à espectinomicina gerado nos plasmídeos do vetor binário; SEQ ID NO : 61; SPC1 oligo-nucleotídeos na Tabela 9), são projetados utilizando LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Além disso, os oligonucleotídeos a serEM utilizados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância a herbicida AAD-1 (SEQ ID NO: 62; oligonucleotídeos GAAD1 na Tabela 9) são projetados utilizando software PRIMER EXPRESS (APPLIED BIOSYSTEMS). A Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e sondas. Os ensaios são diversificados com reagentes para um gene cromossômico do milho endógeno (Invertase (SEQ ID NO: 63; GenBank Accession No: U16123; aqui referido como IVR1), que serve como uma sequência de referência interno para garantir que o gDNA esteja presente em cada ensaio. Para amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (ROCHE APPLIED SCIENCE) é preparada em uma concentração final de 1x em um volume de reação multiplicadora de 10 pl contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação de duas etapas é executada como delineada na Tabela 11. A ativação e a emissão de fluoróforo para as sondas marcadas com FAM e HEX são como descritas acima; conjugados Cy5 são ativados no máximo em 650 nm e a fluorescência no máximo em 670 nm.

[00273] As marcações Cp (o ponto em que o sinal de fluorescência atravessa o limiar de formação) são determinadas a partir dos dados da PCR em tempo real utilizando o algoritmo de pontos fixos (LIGHTCYCLER® SOFTWARE versão 1.5) e o módulo Relative Quant (com base no método AACt). Os dados são manipulados como descrito anteriormente (acima; qPCR de RNA).

Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) utilizadas para as determinações do número de cópias do gene e detecção da cadeia principal do plasmídeo de vetor binário. CY5 = Cianina-5 Tabela 10. Componentes de reação para as análises do número de cópias do gene e detecção da cadeia principal do plasmídeo. *NA = Não Aplicável **ND = Não Determinado Tabela 11. Condições do termociclador para a qPCR de DNA. EXEMPLO 8: Bioensaio de Milho Transgênico [00274] Bioensaios com Insetos. A bioatividade do dsRNA da presente invenção produzida nas células vegetais é demonstrada através de métodos de bioensaio. Ver, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. Um destes é capaz de demonstrar a eficácia, por exemplo, pela alimentação de vários tecidos vegetais ou pedaços de tecido derivados de uma planta que produz um dsRNA inseticida para os insetos alvos em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados de vários tecidos vegetais derivados de uma planta que produz o dsRNA inseticida, e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados além das dietas artificiais para bioensaios como aqui anteriormente descrito. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com os bioensaios conduzidos de forma semelhante que empregam tecidos de controle apropriados a partir das plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida, ou em outras amostras de controle. O crescimento e a sobrevivência dos insetos alvos sobre a dieta de teste são reduzidos em comparação com aqueles do grupo de controle.

[00275] Bioensaios de Insetos com Eventos de Milho Transgênico. Duas larvas do verme da raiz do milho ocidental (1 a 3 dias de idade) criadas a partir de ovos lavados são selecionadas e colocadas em cada reservatório da bandeja de bioensaio. Os reservatórios são depois cobertos com uma cobertura separadora "PULL Ν' PEEL" (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocados em uma incubadora a 28 Ό com um ciclo de 18 h/6 hr luz/escuro. Nove dias após a infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto à mortalidade, a qual é calculada como a porcentagem de insetos mortos em relação ao número total de insetos em cada tratamento. As amostras de inseto são congeladas a -20 Ό durante dois dias, em seguida a larvas de inseto de cada tratamento são reunidas e pesadas. A porcentagem de inibição de crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais dividido pela média do peso médio dos dois tratamentos com reservatório de controle. Os dados são expressos como uma porcentagem de inibição do crescimento (dos controles negativos). Os pesos médios que excedem o peso médio de controle são normalizados para zero.

[00276] Bioensaios de inseto na estufa. Ovos do verme da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) são recebidos no solo da CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Os ovos de WCR são incubados a 28 Ό durante 10 a 11 d ias. Os ovos são lavados a partir do solo, colocadas em uma solução de ágar a 0,15 %, e a concentração é ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 ml. Uma placa de incubação é montada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovos para monitorar as taxas de ovos chocados.

[00277] O solo ao redor das plantas de milho que crescem em ROOTRANERS® é infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos são deixados alimentar durante 2 semanas, após cujo tempo uma "Root Rating" é fornecida a cada planta. Uma Node-lnjury Scale é utilizada para a classificação, essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8. A plantas que passam deste bioensaio, demonstrando lesão reduzida, são transplantadas para vasos de 5 galões para a produção de sementes. Os transplantes são tratados com inseticida para evitar mais danos com o verme da raiz e liberação de insetos nas estufas. As plantas são polinizadas manualmente para a produção de sementes. As sementes produzidas por essas plantas são guardadas para avaliação no T-ι e nas gerações subsequentes das plantas.

[00278] As plantas de controle negativo transgênicas são geradas pela transformação com vetores que abrigam os genes designados para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP). As plantas de controle negativo não transformadas são cultivadas a partir de sementes de variedades de milho de origem das quais as plantas transgênicas foram produzidas. Os bioensaios são conduzidos com controles negativos incluídos em cada conjunto de matérias vegetais. EXEMPLO 9: Zea mays Transgênicas Compreendendo as Sequências de Praga Coleóptera [00279] De 10 a 20 plantas transgênicas T0 são geradas como des- crito no EXEMPLO 6. Uma outra linhagem independente de 10 a 20 Zea mays T1 que expressa dsRNA grampo de cabelo para um cons-tructo de RNAi é obtida para a provocação com o verme da raiz do milho. O dsRNA grampo de cabelo compreende uma parte da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 (por exemplo, os dsRNAs grampo de cabelo transcritos da SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 104). Os dsRNA grampo de cabelo adicionais são derivados, por exemplo, de sequências de pragas coleópteras tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601) , RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730), ROP (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577811), RNAPII (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577854), Dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), nem (Pedido de Patente U.S. No. 62/095.487), COPI alfa (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gama (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), ou COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216). Estes são confirmadas através da RT-PCR ou outros métodos de análise molecular.

[00280] Preparações de RNA total a partir das linhagens Ti independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para a RT-PCR com iniciadores designados para se ligarem no ligante do cassete de expressão de grampo de cabelo em cada um dos constructos de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção dos mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada planta Zea mays transgênica. Processamento do dsRNA grampo de cabelo dos genes alvos em siRNA é subsequentemente de mo-doopcional confirmado nas linhagens transgênicas independentes utilizando hibridizações de mancha de RNA.

[00281] Além do mais, as moléculas de RNAi tendo sequências de incompatibilidade com mais do que 80 % de identidade de sequência com os genes alvo afetam os vermes da raiz do milho de uma forma semelhante àquela observada com as moléculas de RNAi tendo 100 % de identidade de sequência com os genes alvos. O emparelhamento da sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo no mesmo constructo RNAi libera siRNAs processados de plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação das pragas de coleópte-ras.

[00282] A liberação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA que corresponde aos genes alvos e a subsequente absorção pelas pragas coleópteras através da alimentação, resulta na infra-regulação dos genes alvos na praga coleóptera através de silenciamento do gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento e/ou desenvolvimento da praga coleóptera é afetado, e no caso de pelo menos uma de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella, D. speciosa Germar, e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva à falha na infestação bem-sucedida, alimentação, desenvolvimento, e/ou leva à morte da praga coleóptera. A escolha dos genes alvos e a aplicação bem sucedida de RNAi são então utilizadas para controlar as pragas coleópteras.

[00283] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transgêni- cas e Zea mays não transformada. Os genes alvos de pragas de co-leópteras ou as sequências selecionadas para a criação de dsRNA grampo de cabelo não possuem nenhuma semelhança com qualquer sequência de genes de plantas conhecidas. Assim, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmica) através dos constructos que direcionam estes genes ou sequências de pragas coleópteras tenha qualquer efeito prejudicial sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformadas, assim como aquelas das linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene de expressão grampo de cabelo. As característica da raiz, broto, folhagem e reprodução da planta são comparáveis. As características do broto da planta tais como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são registradas. Em geral, não existe nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão das moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

Exemplo 10: Zea mays Transgênica compreende uma Sequência de Praga Coleóptera e Constructos Adicionais de RNAi [00284] Uma planta Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que direciona um organismo diferente de uma praga coleóptera é secundariamente transformada por meio das metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (ver Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene compreendendo a SEQ ID NO: 1 e/ou a SEQ ID NO: 3). Os vetores plasmídeos de transformação de plantas preparados essenci- almente como descritos no EXEMPLO 4 são liberados por meio dos métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ nas células em suspensão de milho ou os embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta transgênica Hi II ou B104 compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu ge-noma, que é transcrita em uma molécula de iRNA que direciona a um organismo diferente de uma praga coleóptera. EXEMPLO 11: Zea mays Transgênica compreendendo um cons-tructo de RNAi e Sequências Adicionais de Controle da Praga Coleóptera [00285] Uma planta Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que direciona um organismo de praga coleóptera (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3) é transformada de forma secundária através de metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (ver Pe-tolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de proteína inseticidas, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3, Cry6, Cry34 e Cry35. Os vetores de plasmídeo de transformação de plantas preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 4 são liberados por meio de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ nas células em suspensão de milho ou nos embriões de milho imaturos obtidos de uma planta Zea mays transgênica B104 compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que direciona um organismo de praga coleóptera. As plantas duplamente transformadas são obtidas, as quais produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle de pragas coleópteras.

Exemplo 12: Triagem de Genes Alvos Candidatos em Pentatomí-deos Marrons de Regiões Neotropicais (Euschistus heros) [00286] Colônia de Pentatomídeos Marrons de Regiões Neotropicais (BSB; Euschistus heros). BSB foram criados em uma incubadora 27 Ό, em umidade relativa de 65 %, com ciclo de luz:escuro 16:8 horas. Um grama de ovos coletados ao longo de 2 a 3 dias foi semeada em recipientes de 5 L com discos de papel de filtro na parte inferior, e os recipientes foram cobertos com malha #18 para ventilação. Cada recipiente de criação produziu cerca de 300 a 400 BSB adultos. Em todos os estágios, os insetos foram alimentados com feijão verde fresco três vezes por semana, um sache de mistura de sementes que continha as sementes de girassol, soja e amendoim (3:1:1 em relação de peso) foi substituído uma vez por semana. A água foi suplementada em frascos com tampões de algodão como pavios. Após as duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos para um novo recipiente uma vez por semana.

[00287] Dieta artificial de BSB. Uma dieta artificial de BSB foi preparada como se segue. Feijões verdes liofilizados foram misturados a um pó fino em um misturador MAGIC BULLET®, enquanto amendoins em estado natural (orgânicos) foram misturados em um misturador MAGIC BULLET® separado. Os ingredientes secos misturados foram combinados (porcentagens em peso: feijão verde, 35 %; amendoins, 35 %; sacarose, 5 %; complexo de vitaminas (por exemplo, Vanderzant Vi-tamin Mixture para insetos, SIGMA-ALDRICH, Catalog No. V1007), 0,9 %); em um grande misturador MAGIC BULLET®, o qual foi tapado e bem agitado para misturar os ingredientes. Os ingredientes secos misturados foram então adicionados a uma tigela de mistura. Em um recipiente separado, a água e agente anti-fúngico de benomila (50 ppm; 25 pl de uma solução de 20000 ppm/50 ml de solução de dieta) foram bem misturados, e depois adicionados à mistura de ingredientes se- cos. Todos os ingredientes foram misturados manualmente até que a solução foi totalmente misturada. A dieta foi moldada em tamanhos desejados, embrulhados frouxamente em folha de alumínio, aquecida durante 4 horas a 60 Ό, e então esfriada e armazen ada a 4 Ό. A dieta artificial foi utilizada dentro de duas semanas de preparação.

[00288] Montagem de transcriptoma para BSB. Seis estágios de desenvolvimento de BSB Foram selecionados para a preparação da biblioteca de mRNA. O RNA total foi extraído a partir de insetos congelados a -70 Ό e homogeneizado em 10 volumes de tampão de Li-se/ligação em tubos de Lysing MATRIX A de 2 ml (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA) em um FastPrep®-24 Instrument (MP BIOMEDICALS). O mRNA total foi extraído usando um mirVana™ miRNA Isolation Kit (AMBION; INVITROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O sequênciamento de RNA utilizando um sistema de illumina® HiSeq™ (San Diego, CA) forneceu sequências do gene alvo candidato para uso na tecnologia de controle de insetos com de RNAi. HiSeq™ gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram montadas individualmente para cada amostra usando o software assembler TRINITY™ (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). Os transcritos montados foram combinados para gerar uma transcriptoma agrupada. Esta transcriptoma agrupada de BSB continha 378.457 sequências.

[00289] Identificação ortóloqa de rpll33 de BSB. Uma busca tBLASTn da transcriptoma agrupada de BSB foi executada utilizando como pergunta rpll-33 de Drosophila (sequência de proteína GENBANK Accession No. ABI30983). rpU33-1 de BSB (SEQ ID NO:76) e rpll33-2 de BSB (SEQ ID NO:78) foram identificadas como genes alvos candidatos de Euschistus heros, os produtos das quais possuem as sequências de peptídeo previstas, SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 79, respectivamente.

[00290] Preparação modelo e síntese de dsRNA. cDNA foi preparado a partir do RNA total de BSB extraído de um único inseto adulto jovem (cerca de 90 mg) utilizando TRIzol® Reagente (LIFE TECHNOLOGIES). O inseto foi homogeneizado na temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 200 pl de TRIzol®, utilizando um pilão de grânulos (FISHERBRAND Catalog No. 12-141-363) e Misturador Motorizado do Pilão (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Após a homogeneização, um adicional de 800 pl de TRIzol® foi adicionado, o homogeneizado foi submetido a vórtice, e depois incubado na temperatura ambiente durante cinco minutos. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Seguinte ao protocolo de extração de TRIzol® recomendado pelo fabricante para 1 ml de TRIzol®, o grânulo de RNA foi secado na temperatura ambiente e colocado novamente em suspensão em 200 μΙ de Tris Buffer de um kit GFX PCR DNA and Gel Extraction (lllustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES) utilizando Elution Buffer Type 4 (isto é, 10 mM Tris-HCI; pH 8,0). A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00291] Amplificação de cDNA. O cDNA foi submetido à transcrição reversa a partir de 5 pg de modelo de RNA total de BSB e iniciador oligo dT, utilizando um SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ for RT-PCR (INVITROGEN), seguindo o protocolo recomendado pelo fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi levado a 100 μΙ com água livre de nuclease.

[00292] Os iniciadores como mostrado na Tabela 12 foram utilizados para amplificar BSB_rpll33-1, BSB_rpll33-2, BSB_rpll33-3. O modelo de DNA foi amplificado pela PCR de aterragem (temperatura de recozimento reduzida de 60 Ό para 50 Ό, em uma di minuição de ΙΌ/ciclo) com 1 μΙ de cDNA (acima) como o modelo. Os fragmentos que compreendem um segmento de 255 pb de BSB_rpll33-1 (SEQ ID NO: 80), um segmento de 111 pb de BSB_rpll33-1 v1 (SEQ ID NO: 81), e um segmento de 398 pb de BSB_rpll33-2 (SEQ ID NO: 82 ) foram gerados durante 35 ciclos de PCR. O procedimento acima também foi utilizado para amplificar um modelo de controle negativo de 301 pb YFPv2 (SEQ ID NO: 89), utilizando iniciadores de YFPv2-F (SEQ ID NO: 90) e YFPv2-R (SEQ ID NO: 91). Os iniciadores de BSB_ rpl 133-1, BSB_ rpl 133-1 v1, BSB_ rplI33-2 e YFPv2 continham uma sequência de promotor do fago T7 (SEQ ID NO: 9) em suas extremidades 5', e assim permitiu o uso de fragmentos de DNA de YFPv2 e BSB_rpll33 para a transcrição de dsRNA.

Tabela 12. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar as partes das regiões de codificação dos genes alvos rplI33 exemplares e um gene de controle negativo YFP.

[00293] Síntese de dsRNA. O dsRNA foi sintetizado utilizando 2 pl do produto de PCR (acima) como o modelo com um kit MEGAscript™ T7 RNAi (AMBION) utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Ver a FIGURA 1. O dsRNA foi quantificado em um espectrofotôme-tro NANODROP™ 8000, e diluído em 500 ng/μΙ em tampão 0,1 x TE livre de nuclease (1 mM Tris HCI, 0,1 mM EDTA, pH 7,4).

[00294] Injeção de dsRNA em BSB hemocel. BSB foram criados em uma dieta de feijão verde e sementes, como a colônia, em uma incubadora a 27 Ό em umidade relativa de 65 % e fotoperíodo de luz:escuro 16:8 horas. As ninfas de segundo instar (cada uma pesando de 1 a 1,5 mg) foram suavemente manipuladas com uma escova pequena para evitar lesões, e foram colocadas em uma placa de Petri sobre gelo para esfriar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL 500 ng/μΙ de solução de dsRNA (isto é, 27,6 ng de dsRNA; dose de 18,4 a 27,6 pg/g de peso corporal). As injeções foram executadas utilizando um injetor NANOJECT™ II (DRUMMOND CIENTÍFICA, Broomhall, PA), equipado com uma agulha de injeção puxado de um capilar de vidro Drummond de 8,89 cm (3,5 polegadas) #3-000-203-G/X. A ponta da agulha foi quebrada, e o tubo capilar foi preenchido com óleo mineral leve e depois carregado com 2 a 3 pl de dsRNA. O dsRNA foi injetado no abdômen das ninfas (10 insetos injetados por dsRNA por experiência), e as experiências foram repetidas em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por reservatório) foram transferidos para bandejas de 32 reservatórios (Bio-RT-32 Rearing Tray; BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo um grânulo de dieta artificial de BSB, e cobertos com etiquetas Pull-N- Peel (BIO-CV-4; BIO-SERV). A umidade foi fornecida por meio de 1,25 ml de água em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com um pavio de algodão. As bandejas foram incubadas a 26,5 °C, 60 % de umidade e fotoperíodo de claro:escuro 16:8 horas. As contagens de viabilidade e pesos foram tomados no dia 7 após as injeções.

[00295] rplI33 de BSB é um alvo de dsRNA letal. Como resumido na Tabela 13 e Tabela 14, em cada repetição, pelo menos, dez ninfas de 2- instar de BSB (1 a 1,5 mg cada) foram injetadas no hemocelo com 55,2 nL de BSB_rpll33-1, BSB_ rpll33-2 e BSB_ rpll33-1 v1 dsRNA (500 ng/μΙ), para uma concentração final aproximada de 18,4 a 27,6 pg de dsRNA/g de inseto. A mortalidade determinada para estes dsRNAs foi significativamente diferente daquela observada com a mesma quantidade de dsRNA de YFP v2 injetada (controle negativo), com p < 0,05 (teste t de Student).

Tabela 13. Resultados da injecção BSB_rpll33 dsRNA no hemocelo de ninfas de pentatomídeos marrons da região neotropical de 2- instar sete dias após a injeção. *Dez insetos injetados per experiência para cada dsRNA. **Erro padrão da média. ***Significativamente diferente doe controle de YFP v2 dsRNA utilizando um teste t de Student. (p < 0,05).

Tabela 4. Resultados da injeção de dsRNA BSB_rpll33-1 v1 no hemocelo de Ninfas de pentatomídeos marrons da região neotropical de 2-instar sete dias após a injeção. *Dez insetos injetados per experiência para cada dsRNA. **Erro padrão da média.

Exemplo 13: Zea mays Transgênica compreendendo Sequências de Pragas Hemípteras [00296] Dez a 20 plantas Zea mays transgênicas T0 que abrigam vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo qualquer parte da SEQ ID NO: 76 e/ou SEQ ID NO: 78 (por exemplo, ID SEQ NOs: 80 a 82) são geradas como descrito no EXEMPLO 4. Mais 10 a 20 linhagens Zea mays T-ι independentes que expressam dsRNA grampo de cabelo para um constructo de RNAi são obtidas para o de- safio com BSB. Os dsRNAs grampo de cabelo são derivados compreendendo uma parte de SEQ ID NO: 76 e/ou SEQ ID NO: 78, ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID NOs: 80 a 82). Estes são confirmados através da RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA totais a partir das linhagens independentes T1 selecionadas são opcionalmente utilizadas para a RT-PCR com inicia-dores designados para ligar no íntron ligante do cassete de expressão grampo de cabelo em cada um dos constructos de RN Ai. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processados requerido para a produção de siR-NA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada planta Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA grampo de cabelo dos genes alvos em siRNA é subsequentemente de modo opcional confirmado nas linhagens transgênicas independentes utilizando as hibridi-zações da mancha de RNA.

[00297] Além do mais, as moléculas de RNAi tendo sequências de ligação imperfeita com mais do que 80 % de identidade de sequência com os genes alvos afetam os hemípteros de um modo semelhante ao observado com as moléculas de RNAi tendo 100 % de identidade de sequência com os genes alvos. O emparelhamento da sequência de ligação imperfeita com as sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo no mesmo constructo de RNAi libera os siRNAs processados de plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação das pragas hemípteras.

[00298] A liberação in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA ou miRNA que corresponde aos genes alvos e a subsequente absorção por pragas hemípteras através da alimentação resulta em infra-regulação dos genes alvos na praga hemíptera através do silencia- mento de genes mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento e/ou sobrevivência da praga hemíptera é afetada, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, E. servus, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chinavia hila-re, C. marginatum, Dichelops melacanthus, D. furcatus; Edessa medi-tabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dys-dercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e L. lineolaris leva à falha para infestar, alimentar, desenvolver com sucesso e/ou leva à morte das pragas hemípteras. A escolha de genes alvos e a aplicação bem sucedida de RNAi são então utilizadas para controlar as pragas hemípteras.

[00299] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transgêni-cas e Zea mays não transformada. Os genes ou sequências de praga hemíptera alvos selecionados para a criação de dsRNA grampo de cabelo não têm nenhuma semelhança com qualquer sequência de genes de plantas conhecidas. Por isso, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmica) por constructos que direcionam esses genes ou sequências de pragas hemípteras terá qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com as plantas não transformadas, assim como aquelas das linhagens transgênicas transformadas com um vetor de "vazio" não tendo nenhum gene de expressão grampo de cabelo. A raiz, broto, folhagem e características de reprodução da planta são comparáveis. As características do broto da planta tais como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são registrados. Em geral, não existem diferenças morfológicas observáveis entre as linhagens transgênicas e sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

Exemplo 14: Glycine Max Transgênica Compreendendo Sequências de Pragas Hemípteras [00300] Dez a 20 plantas Glycine max transgênicas T0 que abrigam vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo uma parte da SEQ ID NO: 76 e/ou SEQ ID NO: 78, ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID NOs: 80 a 82) são geradas como é conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, através da transformação mediada por Agrobacterium, como se segue. Sementes de soja maduras (Glycine max) são esterilizadas durante a noite com gás de cloro durante dezesseis horas. Após a esterilização com gás de cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma coifa de fluxo LAMINAR™ para dissipar o gás de cloro. Em seguida, as sementes esterilizadas são embebidas com H20 estéril durante dezesseis horas no escuro utilizando uma caixa negra a 24 Ό.

[00301] Preparação da semente de soja dividida. A semente de soja dividida que compreende uma parte de um protocolo de eixo embrionário requer a preparação de material de semente de soja, que é cortado longitudinalmente, utilizando uma lâmina #10 afixada a um bisturi, ao longo do hilo das sementes para separar e remover o revestimento da semente, e para dividir a semente em duas seções de cotilédones. Atenção cuidadosa é feita para remover parcialmente o eixo embrionário, em que cerca de 1/2 a 1/3 do eixo do embrião permanece ligado à extremidade nodal do cotilédone.

[00302] Inoculação. As sementes de soja divididas compreendendo uma porção parcial dos eixos embrionários são então imersas durante cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo um plasmídeo binário compreendendo a SEQ ID NO: 76 e/ou a SEQ ID NO: 78, e/ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID NOs: 80 a 82). A solução de A. tumefaciens é diluída para uma concentração final de λ = 0,6 OD6so antes da imersão dos cotilédones que compreendem o eixo do embrião.

[00303] Co-cultivo. Após a inoculação, a semente de soja dividida é deixada co-cultivar com a cepa de Agrobacterium tumefaciens durante 5 dias em meio de co-cultura (Agrobacterium Protocols, vol. 2. 2nd Ed., Wang, K. (Ed.) Humana Press, New Jersey, 2006) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro.

[00304] Indução do broto. Após 5 dias de co-cultivo, as sementes de soja divididas são lavados em meio líquido de indução de brotos (SI) consistindo de sais B5, vitaminas B5, 28 mg/l de ferrosos, 38 mg/l de Na2EDTA, 30 g/l de sacarose, 0,6 g/l de MES, 1,11 mg/l de BAP, 100 mg/l de TIMENTIN™, 200 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de van-comicina (pH 5,7). As sementes de soja divididas são então cultivadas no meio de indução de brotos I (SI I) que consiste em sais B5, vitaminas B5, 7 g/l de ágar Noble, 28 mg/l de ferrosos, 38 mg/l de Na2EDTA, 30 g/l de sacarose, 0,6 g/l de MES, 1,11 mg/l de BAP, 50 mg/l de TIMENTIN™, 200 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de vancomicina (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone voltado para cima e a extremidade nodal do cotilédone inserido no meio. Após 2 semanas de cultivo, os explantes da semente de soja dividida transformada são transferidos para o meio de indução de brotos II (SI II) contendo meio SI I suplementado com 6 mg/l de glufosinato (LIBERTY®).

[00305] Prolongamento do broto. Após 2 semanas de cultivo em meio de SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e uma esponja para brotos de fluxo corrente contendo os eixos embrionários é cortada por fazer um corte na base do cotilédone. A esponja para brotos isolada do cotilédone é transferida para o meio de Alongamento de Broto (SE). O meio SE consiste em sais de MS, 28 mg/l de ferrosos, 38 mg/l de Na2EDTA, 30 g/l de sacarose e 0,6 g/l de MES, 50 mg/l de asparagina, 100 mg/l de L-piroglutâmico, ácido 0,1 mg/l de IAA, 0,5mg/i de GA3, 1 mg/l de ribosídeo de zeatina, 50 mg/l de TIMENTIN™, 200 mg/l de cefotaxima, 50 mg/l de vancomicina, 6 mg/l de glufosinato, e 7 g/l de ágar Noble, (pH 5,7). As culturas foram transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas. As culturas são desenvolvidas em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24 Ό com um fotoperíodo de 18 h em uma intensidade luminosa de 80 a 90pmol/m2seg.

[00306] Enraizamento. Brotos prolongados que se desenvolveram a partir da esponja de brotos cotilédones são isolados através do corte do broto prolongado na base da esponja do broto cotilédone, e imersão do broto prolongado em 1 mg/l de IBA (ácido índole 3-butírico) durante 1 a 3 minutos para promover o enraizamento. Depois disso, os brotos prolongados são transferidos para o meio de enraizamento (sais de MS, vitaminas B5, 28 mg/l de ferrosos, 38 mg/l de Na2EDTA, 20 g/l de sacarose e 0,59 g/l de MES, 50 mg/l de asparagina, 100 mg/l de ácido L-piroglutâmico, 7 g/l de ágar Noble, pH 5,6) em bandejas Phyta.

[00307] Cultivo. Após o cultivo em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24 Ό, fotoperíodo de 18 h, durante 1 a 2 semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo em um copo de Sundae coberto e colocados em uma câmara de crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 and CMP3244, Controlied Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) sob condições de dias longos (16 horas de luz/8 horas de escuridão) em uma intensidade de luz de 120 a 150 pmol/m2seg sob temperatura (22 Ό) e umidade (40 a 50 %) constantes para aclimatação das planti-nhas. As plantinhas enraizadas são aclimatadas em copos de sundae durante várias semanas antes de serem transferidas para a estufa para posterior aclimatização e estabelecimento das plantas de soja transgênicas robustas.

[00308] Mais 10 a 20 linhagens independentes de Glycine max T que expressam dsRNA grampo de cabelo para um constructo de RNAi são obtidas para o desafio de BSB. O dsRNA grampo de cabelo pode ser derivado compreendendo a SEQ ID NO: 76 e/ou a SEQ ID NO: 78, ou seus segmentos (por exemplo, ID SEQ NOs: 80 a 82). Estas são confirmadas por meio da RT-PCR ou outros métodos de análise molecular como conhecidos na técnica. As preparações de RNA totais das linhagens T·, independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para a RT-PCR com iniciadores designados para se ligarem no íntron ligante do cassete de expressão grampo de cabelo em cada um dos constructos de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada planta Glycine max transgênica. O processamento do dsRNA grampo de cabelo dos genes alvos em siRNA é subsequentemente de modo opcional confirmado em linhagens transgênicas independentes utilizando hibridizações da mancha de RNA.

[00309] As moléculas de RNAi tendo sequências de ligação imperfeita com mais do que 80 % de identidade de sequência com genes alvos afetam o BSB de um modo semelhante ao observado com as moléculas de RNAi tendo 100 % de identidade de sequência com os genes alvos. O emparelhamento da sequência de ligação imperfeita com as sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo no mesmo constructo de RNAi libera siRNAs processados pela plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação das pragas hemípteras.

[00310] A liberação in planta de dsRNA, siRNA, shRNA ou miRNA correspondente para direcionar os genes e a absorção subsequente pelas pragas hemípteras através da alimentação resulta em infra-regulação dos genes alvos na praga hemíptera através do silencia-mento de genes mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação da praga hemíptera é afetada, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, Pie-zodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, Euschistus servus, Dichelops melacanthus, Dichelops furcatus, Edes-sa meditabunda, Thyanta perditor, Chinavia marginatum, Horcias nobi-lellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus par-vus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, e Lygus lineolaris leva ao fracasso de infestar, alimentar, desenvolver de forma bem sucedida e/ou leva à morte da praga hemíptera. A escolha dos genes alvos e a aplicação bem sucedida de RNAi é então utilizada para controlar as pragas hemípteras.

[00311] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transqêni-cas e Glvcine max não transformada. Os genes ou sequências de praga hemíptera alvos selecionados para a criação de dsRNA grampo de cabelo não têm nenhuma semelhança com qualquer sequência de genes de plantas conhecidas. Por isso, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmica) por constructos que direcionam esses genes ou sequências de pragas hemípteras terá qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com as plantas não transformadas, assim como aquelas das linhagens transgênicas transformadas com um vetor de "vazio" não tendo nenhum gene de expressão grampo de cabelo. A raiz, broto, folhagem e características de reprodução da planta são comparáveis. As características do broto da planta tais como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são registra- dos. Em geral, não existem diferenças morfológicas observáveis entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

Exemplo 15: Bioensaios de E. heros sobre a Dieta Artificial.

[00312] Nos ensaios de alimentação de dsRNA sobre a dieta artificial, bandejas de 32 reservatórios são configuradas com um grânulo de -18 mg de dieta artificial e água, como para as experiências de injeção (ver o EXEMPLO 12). O dsRNA em uma concentração de 200 ng/μΙ é adicionado à amostra de grânulo de alimento e água; 100 pl em cada um dos dois reservatórios. Cinco ninfas de E. heros de 2- instar são introduzidos em cada reservatório. As amostras de água e o dsRNA que direciona um transcrito de YFP são utilizados como controles negativos. As experiências são repetidas em três dias diferentes. Os insetos sobreviventes são pesados, e as taxas de mortalidade são determinadas após 8 dias de tratamento. Mortalidade significativa e/ou inibição do crescimento é observada nos reservatórios abastecidos com dsRNA rplI33, em comparação com os reservatórios de controle. Exemplo 16: Arabidopsis thaliana transgênica compreendendo Sequências de Praga Hemíptera [00313] Vetores de transformação de Arabidopsis contendo um constructo de genes alvos para a formação de grampo de cabelo que compreende segmentos de rplI33 (SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78) são gerados utilizando métodos moleculares padrão semelhantes ao EXEMPLO 4. A transformação de Arabidopsis é executada utilizando o procedimento baseado em Agrobacterium padrão. Sementes T-ι são selecionadas com marcador selecionável de tolerância a glufosinato. As plantas de Arabidopsis T-ι transgênicas são geradas e as plantas transgênicas T2 de cópia simples homozigotas são geradas para estudos de insetos. Os bioensaios são executados no crescimento de plantas de Arabidopsis com inflorescências. Cinco a dez insetos são colo- cados em cada planta e monitorados com relação à sobrevivência dentro de 14 dias.

[00314] Construção de vetores de transformação de Arabidoosis. Clones de entrada baseados em um vetor de entrada que abriga um constructo de genes alvos para a formação de grampo de cabelo compreendendo um segmento de rpll33 (SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78) são montados utilizando uma combinação de fragmentos quimi-camente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação de grampo de cabelo intramolecu-lar através de transcritos primários de RNA é facilitada pela disposição (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias de um segmento de gene alvo em orientações opostas, os dois segmentos sendo separados por uma sequência de ligante (SEQ ID NO: 107). Assim, a transcrição de mRNA primária contém as duas sequências de segmento rpll33gene como grandes repetições invertidas entre si, separadas pela sequência de ligante. Uma cópia de um promotor (por exemplo, promotor de ubiquitina de Arabidopsis thaliana 10 (Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493)) é utilizada para acionar a produção do transcrito de grampo de cabelo de mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3’ da Estrutura de Leitura Aberta 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; Patente US 5.428.147) é utilizado para terminar a transcrição do gene de expressão do RNA grampo de cabelo.

[00315] Os clones grampo de cabelo dentro dos vetores de entrada são utilizados nas reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico para produzir os vetores de transformação de expressão do RNA grampo de cabelo para a transformação de Arabidopsis mediada por Agrobacterium.

[00316] Um vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicida, DSM-2v2 (Publicação de Patente U.S. No. 2011/0107455), sob a regulação de um promotor do vírus do mosaico da veia da Mandioca (CsVMV Promoter v2, Patente U.S. 7.601.885; Verdaguer et al. (1996) Plant Mol Biol. 31:1129-1139). Um fragmento compreendendo uma região não transladada 3’ da estrutura de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORFI 3' UTR v6; Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22) é utilizado para terminar a transcrição do mRNA DSM2v2.

[00317] Um constructo binário de controle negativo que compreende um gene que expressa um RNA grampo de cabelo de YFP, é construída por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico e vetor de entrada. O constructo de entrada compreende uma sequência de grampo de cabelo da YFP sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina de Arabidopsis 10 (como acima) e um fragmento que compreende uma região não transladada 3’ de ORF23 de Agrobacterium tumefaciens (como acima).

[00318] Produção de Arabidopsis transqênica compreendendo RNAs inseticidas: transformação mediada por Agrobacterium. Os plasmídeos binários contendo sequências de dsRNA grampo de cabelo são eletroporadas na cepa de Agrobacterium GV3101 (pMP90RK). Os clones de Agrobacterium recombinantes são confirmados pela análise de restrição das preparações de plasmídeo das colônias de Agrobacterium recombinantes. Um Qiagen Plasmid Max Kit (Qiagen, Cat# 12162) é utilizado para extrair os plasmídeos das culturas de Agrobacterium seguindo o protocolo recomendado de fabricação.

[00319] Transformação de Arabidopsis e Seleção de Ti. Doze a quinze plantas de Arabidopsis (c.v. Columbia) são cultivadas em vasos de 4" na estufa com intensidade de luz de 250 pmol/m2, 25 Ό, e 18:6 horas de condições de claridade:escuridão. As hastes da flor primária são podadas uma semana antes da transformação. Os inóculos de Agrobacterium são preparados pela incubação de 10 pi de matéria-prima de glicerol de Agrobacterium recombinante em 100 ml de caldo LB (Sigma L3022) + 100 mg/l de espectinomicina + 50 mg/l de cana-micina a 28 Ό e agitação em 225 rpm durante 72 horas. As células de Agrobacterium são colhidas e colocadas em suspensão em 5 % de sacarose + 0,04 % Silwet-L77 (Lehle Seeds Cat # VIS-02) + 10 pg/l de solução de benzamino purina (BA) em OD600 0,8-1,0 antes da imersão floral. As partes acima do solo da planta são imersas na solução de Agrobacterium durante 5 a 10 minutos, com agitação suave. As plantas são então transferidas para a estufa para o crescimento normal com rega e fertilização regulares até que a semente se estabeleça. Exemplo 17: Crescimento e Bioensaios de Arabidopsis Transgê-nica [00320] Seleção de Arabidopsis T1 transformada com constructos de dsRNA. Até 200 mg de sementes Τί de cada transformação são estratificados em solução de agarose a 0,1 %. As sementes são plantadas em bandejas de germinação (10,5" x 21" x 1";. T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) com média de sol #5. Os transformantes são selecionados com relação à tolerância a Ignite® (glufosinato) em 280 g/ha nos 6 e 9 dias após o plantio. Os eventos selecionados são transplantados em vasos de 4" de diâmetro. A análise da cópia de inserção é executada dentro de uma semana do transplante através da PCR em tempo real quantitativa (qPCR) em hidrólise utilizando Roche LightCycler480™. Os iniciadores da PCR e as sondas de hidrólise são projetados contra o marcador selecionável DSM2v2 utilizando o LightCycler™ Probe Design Software 2.0 (Roche). As plantas são mantidas a 24 Ό, com um fotoperíodo de luminosidad e:escuridão 16:8 horas sob luzes fluorescentes e incandescentes na intensidade de 100 a 150 mE/m2s.

[00321] Bioensaio de alimentação de planta E. heros. Pelo menos os eventos de quatro cópias inferiores (1 a 2 inserções), quatro cópias médias (2 a 3 inserções) e quatro cópias superiores (> 4 inserções) são selecionados para cada constructo. As plantas são cultivadas em um estágio reprodutivo (plantas contendo flores e síliquas). A superfície do solo é coberta com ~50 ml de volume de areia branca para facilitar a identificação de insetos. Cinco a dez ninfas de E. heros de 2-instar são introduzidas em cada planta. As plantas são cobertas com tubos de plástico que são 3" de diâmetro, 16" de estatura, e com espessura de parede de 0,03" (Item No. 484485, Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com malha de náilon para isolar os insetos. As plantas são mantidas sob condições normais de temperatura, luminosidade e rega em um conviron. Em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; a mortalidade percentual assim como a inibição de crescimento (1 - tratamento de peso/controle de peso) são calculados. As plantas que expressam YFP grampo de cabelo são utilizadas como controles. Mortalidade significativa e/ou inibição do crescimento é observada nas ninfas que se alimentam de plantas transgênicas com dsRNA BSB_rpll33, em comparação com aquela de ninfas nas plantas de controle.

[00322] Geração de sementes de Arabidoosis T? e bioensaios T?. A semente T2 é produzida a partir de eventos de cópia inferior selecionados (1 a 2 inserções) para cada constructo. As plantas (homozigotas e/ou heterozigotas) são submetidas ao bioensaio de alimentação de E. heros, como descrito acima. A semente T3 é colhida de homozigotas e armazenada para análise futura.

Exemplo 18: Transformação de Espécies de Cultura Adicionais [00323] O algodão é transformado com um transgene de dsRNA rplI33 para fornecer controle de insetos hemípteros, utilizando um método conhecido daqueles de habilidade na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas descritas anteriormente no EXEMPLO 14 Patente U.S. 7.838.733, ou no Exemplo 12 da Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.

Exemplo 19: dsRNA rpll33 no Controle de Insetos [00324] Os transgenes de dsRNA rplI33 são combinados com outras moléculas de dsRNA nas plantas transgênicas para fornecer RNAi alvo redundante e efeitos sinérgicos de RNAi. As plantas transgênicas, incluindo, por exemplo, e sem limitação, milho, soja e algodão que expressam dsRNA que direciona rpll33 são úteis para a prevenção do dano de alimentação por insetos coleópteros e hemípteros. Os transgenes de dsRNA rplI33 também são combinados nas plantas com tecnologia de proteína inseticida do Bacillus thuringiensis e ou polipeptí-deos inseticidas PIP-1, para representar novos modos de ação nas pirâmides do gene de controle da resistência a insetos. Quando combinado com outras moléculas de dsRNA que direcionam as pragas de insetos e/ou com as proteínas inseticidas nas plantas transgênicas, um efeito inseticida sinérgico é observado que também atenua o desenvolvimento de populações de insetos resistentes.

REIVINDICAÇÕES

Claims (61)

1. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo ligado de maneira operá-vel a um promotor heterólogo, em que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende a SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 8; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 8; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 8; SEQ ID NO: 76; o complemento da SEQ ID NO: 76; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 76; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 76; uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO: 80 ou a SEQ ID NO: 81; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO: 80 ou a SEQ ID NO: 81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO: 80 ou a SEQ ID NO: 81; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus que compreende a SEQ ID NO: 80 ou a SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 78; uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus que compreende a SEQ ID NO: 82; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus que compreende a SEQ ID NO: 82; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO: 82; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo a SEQ ID NO: 82.

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8.

3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, e os complementos de qualquer um dos precedentes.

4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o organismo é selecionado do grupo que consiste em D. v. virgifera LeConte; D. Barberi Smith and Lawrence; D. u. howardr, D. v. zeae\ D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. specio-sa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

5. Vetor de transformação das plantas, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

6. Molécula de ácido ribonucleico (RNA), caracterizada pelo fato de que é transcrita a partir do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

7. Molécula de RNA de filamento duplo, caracterizada pe- Io fato de que é produzida a partir da expressão do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

8. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência de polinucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíp-tero inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeo endógena especificamente complementar ao polinucleotídeo.

9. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o contato de dita molécula de ribonucleotídeo com um inseto coleóptero ou he-míptero extermina ou inibe o crescimento, reprodução e/ou alimentação do inseto.

10. RNA de filamento duplo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA pela segunda sequência de polinucleotídeo, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, de tal modo que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibri-dam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de filamento duplo.

11. RNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo e uma molécula de ácido ribonucleico de filamento único entre cerca de 15 e cerca de 30 nucle-otídeos de comprimento.

12. Vetor de transformação das plantas que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula vegetal.

13. Célula caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

14. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula procariótica.

15. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.

16. Célula de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula vegetal.

17. Planta caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

18. Semente da planta como definida na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o polinucleotídeo.

19. Produto de consumo produzido a partir da planta como definida na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto de consumo compreende uma quantidade detectável de polinucleotídeo.

20. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

21. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de milho, soja ou algodão.

22. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta é milho, soja, ou algodão.

23. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico, e a molécula de ácido ribonucleico inibe a expressão de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar a pelo menos um polinucleotídeo, quando um inseto coleóptero ou hemíptero ingere uma parte da planta.

24. Polinucieotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um polinu-cleotídeo adicional que codifica um molécula de RNA que inibe a expressão de um gene de inseto endógeno.

25. Vetor de transformação das plantas caracterizado pelo fato de que compreende o polinucieotídeo como definido na reivindicação 24, em que os polinucleotídeos adicionais são cada um ligado de maneira operável a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal.

26. Método para controlar uma população de pragas co-leópteras ou hemípteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que funciona após o contato com a praga para inibir uma função biológica na praga, em que o RNA é especificamente hibridizáve! com um polinucieotídeo selecionado do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; a transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82; o complemento de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78 e 80 a 82; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 8, 76, 78, e 80 a 82.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o RNA do agente é especificamente hibridizável com um polinucieotídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 92 e 93; o complemento da SEQ ID NO: 92 ou 93; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 92 ou 93; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 92 ou 93; a transcrição da SEQ ID NO: 1 ou 3; o complemento de uma transcrição da SEQ ID NO: 1 ou 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 1 ou 3; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 1 ou 3.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula de RNA de filamento duplo.

29. Método para o controle de uma população de pragas coleópteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona após o contato com a praga coleóptera para inibir uma função biológica na praga co-leóptera, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que apresenta cerca de 90 % a cerca de 100 % de identidade de sequência para cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97, e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizada com a segunda sequência de polinucleotídeo.

30. Método para o controle de uma população de pragas hemípteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona após o contato com a praga hemíptera para inibir uma função biológica dentro da praga hemíptera, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que apresenta cerca de 90 % a cerca de 100 % de identidade de sequência para cerca de 15 a cerca de 30 nucleotí-deos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102, e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizada com a segunda sequência de polinucleotídeo.

31. Método para o controle de uma população de pragas coleópteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma planta hospedeira de uma praga coleóptera uma célula vegetal transformada compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona após o contato com a praga coleóptera, que pertence à população para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga coleóptera, e resulta na diminuição do crescimento e/ou sobrevivência da praga ou população de pragas coleópteras, em relação à reprodução das mesmas espécies de praga em uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o polinucleotídeo.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 103 ou a SEQ ID NO: 104.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a população de pragas coleópteras é reduzida em relação a uma população de pragas coleópteras que infestam uma planta hospedeira da mesma espécie que carece da célula vegetal transformada.

35. Método de controle de infestação de pragas coleópteras em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer na dieta de uma praga coleóptera um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 92 a 97; o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97; a transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3 e 5 a 8; o complemento de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3 e 5 a 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 3; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 3.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula vegetal transformada para expressar o polinucleotídeo.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

38. Método de controle de infestação de pragas hemípte-ras em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma praga hemíptera com um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 98 a 102; o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nu-cleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102; a transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78 e 80 a 82; o complemento de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78 e 80 a 82; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 76 ou da SEQ ID NO: 78; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição da SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o contato da praga hemíptera com o RNA compreende a pulverização da planta com uma composição que compreende o RNA.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

41. Método para melhorar o rendimento de uma cultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende: Introduzir o ácido nucleico como definido na reivindicação 1, em uma planta de cultura para a produção de uma planta de cultura transgênica; e cultivar a planta de cultura para permitir a expressão de pelo menos um polinucleotídeo; em que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo inibe a reprodução ou o crescimento da praga de insetos e a perda de rendimento devido à infecção por pragas de inseto, em que a planta de cultura é milho, soja ou algodão.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga de insetos que tenha entrado em contato com uma parte da planta de cultura.

43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, e os complementos de qualquer um dos precedentes.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga de insetos coleópteros que tenha entrado em contato com uma parte da planta de milho.

45. Método para a produção de uma célula vegetal trans-gênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 1; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais que compreende uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram o pelo menos um polinucleotídeo nos seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas com relação à expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada por pelo menos um polinucleotídeo; e selecionar uma célula vegetal que expressa o RNA.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracteri- zado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 5 a 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 8.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de filamento duplo.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende a SEQ ID NO: 103 ou a SEQ ID NO: 104.

49. Método para a produção de planta transgênica protegida contra uma praga coleóptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 46; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada por pelo menos um polinucleotídeo é suficiente para modu- lar a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera que entra em contato com a planta transformada.

50. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que: transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio para fornecer proteção contra as pragas coleópteras de uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram com os meios para fornecer proteção contra as pragas coleópteras a uma planta nos seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas com relação à expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera; e selecionar uma célula vegetal que expressa os meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera.

51. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga coleóptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 50; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera que entra em contato com a planta transformada.

52. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio para fornecer proteção contra as pragas hemípteras a uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar me conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram com os meios para fornecer proteção contra as pragas hemípteras a uma planta nos seus genomas; submeter a triagem as células vegetais transformadas com relação à expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera; e selecionar uma célula vegetal que expressa os meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera.

53. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga hemíptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 52; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão dos meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga hemíptera que entra em contato com a planta transformada.

54. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp, e/ou um polipeptídeo PIP-1.

55. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A e/ou Cyt2C.

56. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseu-domonas spp, e/ou um polipeptídeo PIP-1.

57. Célula de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e/ou Cyt2C.

58. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta compreende um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., e/ou um polipeptídeo PIP-1.

59. Planta de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e/ou Cyt2C.

60. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal transformada compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp, e/ou um polipeptídeo PIP-1.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Crylb, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e/ou Cyt2C.