TW503112B - Skin care compositions containing combinations of compounds for mimicking the effect on skin of retinoic acid - Google Patents

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503112 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1 ) - 發明領域 本發明係關於包+特定化合物及摻合視網醇及/或視網 醋類之護膚组合物，並關於涉及將此等組合物應用於皮膚 上之化狀方法。 發明背景 視網醇（維生素A )係一種人體中會自然產生之内源性化 合物’其對於正常的上皮細胞之分化作用而言係屬必須成 分。天然的以及合成性維生素A衍生物已經廣泛地使用於 許多皮膚病症之治療中，以破f皮展修復劑或者皮膚再生 劑，視網酸則經使用於許多皮膚症狀之調理中，例如：面 皰，皺紋，牛皮癬，老人斑以及脱色，可參見於，例如：

Vahlquist，A·等人發表於/nve以· Dermaio/·期刊，第94本 中，由 Holland D.B·及 Cunliffe W.J.(1990)所出版，刊登於 第496頁至第498頁之文獻；Ellis，C.N·等人發表之”視網 醇於皮膚上之藥理作用（Pharmacology of Retinols in Skin)"，Vasel，Karger，第 3 本，（1989)，第 249 頁至第 252頁；Lowe，N.J·等人發表之"視網醇於皮膚上之藥理作 甩（Pharmacology of Retinols in Skin)”，第 3 本，（1989)， 第240頁至第248寊；PCT專利申請案號第w〇 93Π 9743 號。 一般相信使用視網醇或視網醇之酯類將具有優於視網酸 之效杲，人體中自然產生之視網醇咸信較視網酸安全，一 般相信視網酯類及視網醇係依下列機制於皮膚上代謝性地 轉化爲視網酸： -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公麓） 秦-- (讀先閱瓦)

503112 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) - 視網酯 視網醇 視網酸 然而，大部分内源性經使用之視網醇會快速地轉化爲非 活化脂肪酯類，以儲存於表皮細胞（角蛋白細胞）中，視網 醇轉化爲非活化視網醋類之酯化作用，係於酵素乙醯輔媒 A視網醇轉化媒（ARAT)之催化下，於細胞中由乙醯輔媒a 所衍生之脂肪乙醯基轉化而成，或於酵素卵磷脂視網醇轉 ,___ 化媒（LRAT)之催化下，於細施寺由如磷醯膽鹼輔媒a所衍 生之乙酿基轉化而成。此等醋化反應於角蛋白細胞中相當 有效一大部分（95%)之細胞視網酯類係視網醇脂肪酯類之 形式。然不幸地，雖然視網醇及視網酯於使用上較視網酸 安全，此兩者於提供皮膚改良功效方面比視網酸無效。 本發明部分而言基於以下之發現：特定化合物可以抑制 此等酯化反應，因此藉由增加可轉化爲視網酸的視網醇之 量，便而激發視網醇之潛能。故此等化合物與視網醇或視 網酯之模擬視網酸混合物，與使用視網酸比較起來較爲安 〇 發明概述 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明部分而言包含一種皮膚調理組合物，其包括·· (a) 佔组合物重自約0.001%至約10%之視網酯； (b) 佔组合物重自約0.0001%至約50%之一種化合物，其 經由活體外微粒體測定顯示於1〇〇μΜ之濃度下、可抑 制至少20%的由LRAT或ARAT催化之視網酯化反應； -5· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 503112 A 7 -_ B7 五、發明説明（3 ) ' 其中該化合物並非脂肪酸醯胺或二甲咪唑啉酮；以及 (C) 一種化缺品可接受媒液。 較佳適用於本發明中之化合物係環系脂族不飽和烴類， 二萜燒，黃酮，黃酮醇，脂族遵乙基咪也琳界面活性劑， 及彼等之混合物。本發明中所涵蓋的與視網醇及/或視網 酯捧合之化合物，係依其模擬皮膚上的視網酸功效之能力 而選擇，若該化合物通過上述之活體外微粒體測定，即使 本說明書中並未詳加描述，其亦包含於本發明中；另言 之’倘一化合物經活體外微&體測定係可充分抑制由 LRAT或ARAT催化之視網酯化反應者，其便可與視網醇或 祝網酯摻合，以模擬視網酸於角蛋白細胞（皮膚細胞）上之 功效。 本發明進一步提供一種調理皮膚之化妝方法，包含局部 施用本發明之组合物於皮膚上。本發明亦提供一種模擬視 網酸於皮膚上之功效的化妝方法，包含局部施用本發明之 組合物於皮膚上。 本發明中之用語"調理”，意指避免及處理一或多種下列 情形：乾燥型皮膚，光易傷害型皮膚，具皺紋之外表，老 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 人斑，老化肌膚。本發明之组合物亦肴用於增加角質層之 撓性，美白皮膚，控制皮脂分泌，以及_般性地增加皮膚 質感。該组合物亦可用以改善皮膚解片化以及表皮分生情 形。 本發明组合物中所選用化合物之存在，實質地改善了視 網醇或視網酯於皮膚上的效果。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 經濟部中央標牟局員工消費合作社印製 A7 --------B7五、發明説明（4 ) 〜 根據本發明，藉由併入一有效量之化合物、其經由活體 外微粒體測定顯示於1〇〇μΜ之濃度下可抑制至少2〇%的由 LRAT或ARAT催化之視網酯化反應、至含有視網醇或視網 酯之组合物中，可實質改善該組合物之功效。 技隹具體實施例之插述 、本發明组合物中包含一種選自由視網醇及視網酯所組成 之群的化合物，以作爲第一必要成分。該用語η視網醇”除 其餘已知種類之外尚包括下列視網醇異構物：全_反_視網 醇，13-順-視網醇，丨^順·視•網^醇順·視網醇，3,4•二 去氳視網酵，較佳之異構物係全_反_視網醇，1弘順-視網 醇，9-順-視網醇，3,4·二去氫_視網醇；最佳者係全_反_ 視網醇，因其係商業上可廣泛獲得者。 視網酯係視網醇之酯類，該用語，，視網醇係如上所定 義。適用於本發明中之視網酯係視網醇之酯類，較 佳係其even酯類，最佳係其Ca、&、及酯類，因彼 等係商業上可最廣泛獲得者。視網醋之實例包括 '但不限 於··棕櫚酸視網黯，甲醯視網酯，乙醯視網屬，丙睡視網 黯，丁酿視網酿，戊醯視_黯，異戊醯視網療，己嗣酸視 網醋，，庚酮酸視辛酮酸視網醋，壬㈣視網黯，癸 酮酸視網酯，十一酮酸視網酯，月桂酸視網酯，三癸鲷酸 視網醋，十二_酸視_，十五嗣酸視網醋，十七嗣酸視 網酯，硬脂酸視網帛，異㈣酸视_，十九網酸視網 醋，花生酸視網醋，山荼酸視網酯，羊毛酸視網酿，法酸 視網酯。 (讀先閱讀背面之注意事項再本頁) *|裝. 本 訂·· 零 11-----1 1- · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x1^^7 503112 A7 B7 五、發明説明（S ) ~ ---------装— (請先閱尊面之注意事項再本貢 本發明中所適用之較佳醇類，係選自棕櫚酸視網酯，甲 醯视網酯以及乙醯視網酯，其係商業上最可廣泛獲得且最 便宜者。羊毛酸視網醋亦可使用，因其具備良妤之功效。 視網酯及/或視網酯於本發明组合物中之用量，係自約 0.001%至約10%，較佳係自约0.01%至约1%，最佳係自 约 0.01% 至约 0.5%。 本發明組合物中所含之第二必要成分，係通過活體外微 粒體測定之化合物，適用於本發明中之化合物，係經由活 體外微粒體测定顯示於100μΜ·£"濃度下、可抑制至少20% 的由LRAT或ARAT催化之視網酯化反應者。此等活體外微 粒體測定係用以測定該化合物於本發明組合物中於下列條 件下之適用性·· 於本發明之較佳具體實施例中，係選擇於ΙΟΟμΜ之濃度 下可抑制至少40%的、最佳係50%的、由LRAT或ARAT催 化之視網酯化反應之化合物。 活體外微粒體測定 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 微粒體係獲自如下列文獻中所描述之方法：C. Saari 及D.L. Bredberg所著之”含視網醇片段之上皮細胞中之輔 媒A及非輔媒A依存性之視網酯化反應（CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Figment Epithelium)”，發表於生物化學期刊，第263頁，8084-90(1988)。 將含有Ο.ί Μ磷酸納pH缓衝液、5 mM二硫藏糖醇、2 mg/ml牛血清蛋白、40微莫耳棕櫚醯基輔媒A、40微莫耳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 Α7 Β7 五、發明説明（6 ) - 二月桂醯基磷酸牛贍瞼' 10微莫耳視網醇、及一待測試化 合物或翌白試驗溶劑之溶液，於37〇c下、與單離自牛的含 視網醇片段上皮細胞之微粒體殘段保溫1小時；保溫之 後，添加等體積之乙醇使反應驟冷，然後以己烷萃取所形 成之視網酯（獲自LRAT催化反應之月桂基視網酯，或獲自 ARAT催化反應之棕櫚基視網酯）；移出己烷層，於氮氣中 汽化，殘餘物則經HPLC進行視網酯之定量分析，HPLC. 件爲· 3·9 X 30G mmtCi8逆相管柱，使用8〇〇/0之甲醇於動 相管柱中，並使用勞光偵測％^325 nm激發，48〇 1^放 射）。於空白試驗溶劑存在下所形成的視網酯之量係作爲 100%標準點，其係用以計算測試化合物對視網酯形成之 抑制作用。爲作爲控制組之用，將整份之微粒體煮沸5分 鐘，其產生至少95%之視網酯形成抑制性。 環系脂族不飽和烴類，二萜烷，黃酮，黃酮醇，及特定 的脂族羥乙基咪唑啉界面活性劑係可滿足上述活體外微粒 體測定之化合物，當然，其他本發明中未明白描述之化合 物，亦可包含於本發明组合物中，只要其係可通過上逑活 體外微粒體測定即可。 環系脂族不飽和化合物 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 適當之環系脂族不飽和化合物係選自根據上述活體外微 粒體測定之篩選者。 較佳t環系脂族不飽和化合物係選自環系脂族不飽和醛 類，酮類，醇類及酯類。 較佳之環系脂族不飽和醛類，酮類，醇類及酯類係：α -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 503112 Α7 : Β7 五、發明説明（7 ) ' 大馬士革酮（alpha damascone)，β大馬士革酮，δ大馬士 革酮，異大馬士革酮，大馬寧酮（damascenone)，α龙香 酮，β芷香酮，烯两基α芷香嗣，異丁基α芷香酮，cc甲基 龙香酮，γ甲基龙香酮，伯漢醇（brahmanol)，山達醇 (sandaol)，益品油，菜亞醛（lyral)，乙基藏花油醋，及彼 等之混合物。彼等化合物之結構如下： r CH3s/CH3i a \^^ch3 α大馬士輩.酮 gh39

(請先閱讀背面之注意事項再本頁) CH3 β大馬士革酮 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

δ大馬士革酮 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 A7 B7 五、發明説明 CH3、

異大馬士革酮 CH3n/CH3

CH3 CH3 (讀先閲讀背面之注意事項再本頁 大馬寧酮 訂/ CHx CH3

α芷香酮 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CH3x/ch3

β芷香酮 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I 03 5 ΑΊ B7 五、發明説明 9

CpX^J^CH3 ^^ch3 0C甲基芷香嗣 ch3 ο ch3 晞丙基a ：£香酮

OH (讀先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 〇

莱亞酸 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 A7 B7

丨1111 —一 * - .................... .................................................—....................................................................................111111...................... I 五、發明説明（1〇 ) ‘ c\7^ χ 广丫〜^ch3 γ甲基芷香酮 〇

乙基藏花油酉旨 較佳地，爲於最低價格下表現最大功效，環系脂族不飽 和化合物係選自由大馬士革酮及具備上述結構之芷香酮所 組成之群。 最佳地，該環系脂族不飽和化合物係α大馬士革酮及/或 CX香。 環系腊族不飽和化合物於本發明組合物中之用量，係自 約0.0001%至約50%，較佳係自約〇.〇丨％至約1〇% !最佳 係自約0.1%至約5%。 r二萜烷 適用於本發明組合物中之二萜烷係彼等通過上述活體外 微粒體測定者。較佳之二萜烷化合物係香葉草基香葉草 醇，其具下列結構： _13讎 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐ〇χ297公釐） .............................〜~ '~ - (讀先閱讀背面之注意事項再

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 503112 A7 B7 五、發明説明（11

y帖烷於本發明组合物中之用量係自約0.0001%至約 50%，較佳係约Q ϋ1%至约iQ%，最佳係约至約w。 黃酮及黃酮醇 本發明組合物中所包含之黃酮及黃酮醇係彼等通過上述 活體外微粒體測定者。較佳之黃酮及黃酮醇係選自由柚配 質（4’，5,7·三羥黃酮），3,3，，4\_5^-五羥黃酮及彼等之混合 物所组成之群。 4’，5,7·三羥黃酮及3,3，，4’，5,7-五羥黃酮之結構如下： 4f，5,7-三羥黃酮 Η

OH (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂

經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 OH 〇 3,3<，4、5,7-五羥黃_

OH

OH 〇

OH 14 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 503112 A7 B7 12 五、發明説明 黃嗣及黃_醇於本發明組合物中之用量，係自約 0.0001%至約50%，較佳係自约〇 01%至約1〇%，最佳係 自約0.1%至約5%。 3,3’，4’，5,7,五羥黃酮及4·，5,7-三羥黃酮可購自sigma& 司’含有3,3’，4’，5,7-五禮黃酮及4，，5,7-三羥黃酮之植物萃 取液亦可用於本發明組合物中，例如，蘭香松，夜來香， 洋蔥，檸檬酸。 脂族羥乙基咪唑啉界面活性劑 本發明組合物中所包含之脂_^>呈乙基咪嗖啪界面活性劑 係彼等通過上述活體外微粒體測定者。較佳之脂族藉乙基 咪唑啉界面活性劑具下列結構： (請先閱讀背面之注意事項再本頁

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

R

Y 其中R係具8至20個碳原子的腊族飽和或不飽和、直鏈 或具支鍵氮·碳鍵^ 適合的脂族幾乙基咪唑淋之實例包括，但不限於，挪子 基羥乙基咪唑啉（R係衍生自揶子油脂肪酸，大部分爲 Cu，部分爲較長鏈），月桂基羥乙基咪唑嚇 (R = CH3(CH2)i〇)，十二娱：基藉乙基咪唾淋 (R = CH3(CH2)12)，硬脂酸基幾乙基咪峻淋 15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 503112 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____;_ B7 五、發明説明（13 ) - (R CH3(CH2)16)，以及油酸基幾乙基咪峻淋 (R = CH3(CH2)7CH=CH3(CH2)7) 〇 較佳地，該脂族羥乙基咪唑啉中之R包含8至18個碳原 子，更佳係包含11至18個碳原子，最佳地，該脂族羥乙基 咪唑啉係油酸基羥乙基咪唑啉，因其商業上可獲得性及功 效較佳。 脂族禮乙基咪唑啉於本發明組合物中之用量，係自约 0.0001%至約50%，較佳係自約0·01%至約1〇%，最佳係 自約0.1%至約5%。 L了.… 本發明之組合物亦包含一化妝品可接受媒液，以作爲组 合物中活性成分之稀釋劑、分散劑或载劑，是以，當其施 用於皮膚上時，可便利組合物之塗怖。 ·· 不同於水或者除了水以外之媒液，可包括液體或固體乳 化劑，；表劑，保濕劑，增稠劑及粉末。尤隹之非水性載劑 係聚二甲矽氧烷及/或聚二甲苯基矽氧烷。本發明中適用 之矽酮係彼等於25°C下具有自10至l〇5〇00 mm2/s(分托）黏 度者’特別需要者係低黏度及高黏度硬嗣之混合物，此等 矽酮係購自通甩電子公司、商品名爲Vicasii SE及SF者， 以及購自遒康寧公司之2〇〇及500系列。矽酮於本發明組合 物中之用量，係佔組合物重之自約5%至約95%，較佳係 自约25%至約90%。 化妝品可接受媒液通常係佔組合物重之自約5%至約 99.9%，較佳係自約25%至約80%，且於無其他調整劍存 在下’可供補足組合物量之用。較佳地，媒液係爲佔組合 -16 - 本紙張尺度適用不國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇、〆297公釐Ί ~ ~ -- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂· #f 503112 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（14 ) - —~ 物之至少50重量％ '最佳係至少8〇重量％之水，較佳地， 本發明組合物中係含至少約5〇重量％、最佳係自6〇至8〇重 量％之水。 視需要添加之皮膚增益材料及化妝品調整劑 可存在油或者油性物質，以與乳化劑共同構成油包水乳 液或水包油乳液，此大部分取決於所使用乳化劑之平均親 水性，親脂性平衡値（HLB)。 本發明组合物中較佳包含防曬劑，防曬劑包括彼等一般 用以阻斷紫外線者。例示性走蚤合—物如PABA、肉桂酸酯 及水楊酸醋之衍生物，例如，可使用辛基甲氧基肉桂酸酯 及2-羥-4-甲氧基苯基酚酮（即已知之氧基苯酮），辛基甲氧 基肉桂酸酯及2-羥-4-甲氧基苯基酚酮係商業上可獲得者，· 商口口名分別爲Parsol MCX及Benzophenone-3。乳液中所使 用的防曬劑之確實用量可依所欲的於太陽光UV輻射下之 保護程度而改變。 另一種較佳之視需要成分係選自必須脂肪酸（EFAs)， 即’彼等對所有細胞之血漿膜形成係屬必須之脂肪酸。當 角蛋白細胞EFA不足，會使細胞呈高預活化狀態，供應 t EFA則可解決此節，EFA亦可提昇上皮細胞之磷脂生化合 成，並提供脂類於上皮細胞之障蔽形成。此必須脂肪酸較 佳係選自羊毛酸，γ_羊毛酸，同相_γ_羊毛酸，就酸，二十 碳-(n-6,9，13)-三晞酸，花生油晞酸，α·羊毛酸，二十碳五 晞酸，己烯酸及彼等之混合物。 乳化劑係通常併入本發明化妝品組合物中者，此等乳化 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29?公釐） ------赛-- (請先閱讀背面之注事項再本百〇

、y一口 A7 B7 五、發明説明（15 劑可爲總組合物自〇 < n ^ 目05重量％至50重量％、較佳係介於5重 I %至30重量％之顯 .. ^ ή。於一般化學分類中，乳化劑係歸類 馬酯類，脂肪酸及醇，多元醇及烴。 酉曰類可馬早-或二-酯類，可接受之脂防酸二-酯類包括己 二酸二丁酯，癸-紿_ 一 、一鉍一乙酯，二異丙基二聚物，及琥珀酸 二辛醋；可接受之具支鏈脂肪酸醋包括2_乙基·己基十二燒 酯’硬脂酸異丙酯’及棕櫚酸異硬脂酸酯；可接受之三鹼 酸酯包括三異丙某二至$ # 一 '一平毛鉍酯及三月桂基擰檬酸酯；可接 =之直鏈脂肪酸醋包括月桂_櫚酸酯，己内酷基十二 酉曰/由ak基幼克酉曰及硬脂酸油《醋。較4圭之醋類包括挪子 基辛酿醋/辛基醋（椰+基辛酿醋及挪子基辛基醋之混合 物)，丙二醇酸乙_田 . -日一兴丙基己醯酯及十六燒基辛酮 酯。 適當之脂肪酸及醇包括彼等具有服2_魏子之化合 物，此等化合物中特佳者俏+二 ,_ 有保十/、烷基、十二烷基、棕櫚基 及硬脂酸基醇及酸。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 可作爲乳化劑之多元醇係線性及具支鏈烷基多羥基化合 物’例如’丙二醇’甘露醇及甘油係較佳者，亦可使用聚 合性多元醇’例如聚丙二醇及聚乙二醇。丁二醇及丙二醇 係特佳可作爲滲透加速劑者。 可作爲乳化劑之烴類之例子，係彼等烴鏈上具有12至3〇 個碳原子者，特定之例子包括礦物油，石油膠，蜂膠及異 化白蠟油。 ' 、 本發明足化妝品組合物中所含的其他類功能性成分係爲 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公4 ) 503112 A7 B7 五、發明説明 16 經濟部中央標隼局員工消費合作社印袋 增稠劑，增稠劑通常存在佔組合物重之自〇」重量％至2〇重 量。/。，較佳係自0.5重量％至1{)重量％。增稠劑之例子爲經 又聯之聚丙缔酸醋物質，可獲自B.F. G〇〇drich公司，商品 名爲Carbopol。可使用之膠係例如黃原膠，加連膠，凝 膠，刺梧桐膠，蛋白及大豆膠等。在特定之情況下，增稠 功能可藉由矽酮或乳化劑之添加來達成，例如，黏度超過 10分托之矽酮膠，以及具有雙重功能的如硬脂酸甘2酯等 酉旨類。 粉末亦可併入本發明之化妝4組—合物中，此等粉末包 括；白咢粉，滑石粉，高嶺土，澱粉，齊黏土，經過化學 改質之鍰銘矽酸鹽，經過有機性改質之蒙托土，水合♦酸 銘’發煙碎石，銘殿粉辛醯基玻轴酸I旨，以及彼等之混合 物。 其他調整劑次要成分亦可併入本發明之化妝品組合物 中’此等成分包括著色劑，珠光劑及香水，此等其餘調整 劑次要成分之用量可佔组合物重之自0 001重量％至高達 20重量％。 組合物之#用 本發明之化妝品組合物主要係欲作爲局部施用於人類皮 膚上之製品，尤其欲作爲條理皮膚及使皮膚光滑、避免或 降低敲紋或老化皮膚之外表之製劑。 使用時，係將小量之組合物（例如1至100毫升）自適當之 容益或使用器取出並施用於皮膚外露之區域，及，若需 要，以手或手指或適當之裝置均勻塗佈及/或塗抹於皮膚 19 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項.再本頁 7装· 大 i - 五 發明説明 17 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 上。 形式及 或ί發:二:皮膚處理組合物可適當地調配成乳液、霜 當容器中、’：可依消費者之需求及配合其黏度包裝於適 中，或喑如’乳液或霜可包裝於瓶子或滾球使用器 浦之ίΠ ί噴霧裝置中’或者接有適於手指操作的寶 早 、，，*組合物爲霜時，僅可以儲存於不變形之瓶 ，η出瓶中，例如試管或加蓋噴霧器。 此組合物亦可包裝於彼^彳如描述於美國專利第 5,〇63,〇57號之膠囊中。 因片’本發明亦提供—種如本文中所定義的含有化妝上 可接雙組合物之密閉容器。 ·、 下列特定實例進一步例示本發明。 材料及方法 細胞培i 將人類角蛋白細胞（經胰蛋白酶處理並單離自新生兒前 額肌膚）於Dulbecoo改質液（DM£) Hams F12 (1 : υ介質 /10 /。胎牛血漿中、及於經照射之小鼠氣纖維細胞之夸在下 進行培養’以建立各別的負蛋白細胞複製體，將細胞於上 述條件下培養，直至第二傳代產生爲止，然後將之冷凍備 用。在替換至購自Clonetics公司（San Diego, CA)的含0.15 之無血漿MCDB 153基底介質角蛋白細胞增生介質 (KGM)、或者購自GIBCO公司的含〇·〇9 mM勞之無角蛋白 細胞介質（KSFM)之前，先將冷凍之第二傳代角蛋白細胞 -20- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) I裝_ 娜木 訂， #f 503112 A7 B7 18 五、發明説明（ 溶化並植入上述介質中，並繼績培養5天。第了天時卷 胞已有動嶋合後’將之予以胰蛋白化並植入益血

質中進行許多不同試驗。 & A 獲鹿嘧啶脱氣舷棼測定 喊啶脱氧核苷之併 培養角蛋白細胞以將3h-胸腺嘧啶脱氧核苷併入係角蛋 白細胞預活化之測定，胸腺嘧啶脱氧核甞係四種去氧核糖 核苷之一，其係DNA之單體單元動物王國基因資料庫之 總圖書館。在例如角蛋白細胞|體&胞之細胞分部之前， 組成細胞分部之細胞完全基因組係經複製，此影響到經由 細胞進行之大規模DNA合成，且同時使得子細胞自原:物 質中獲得相同之複製版本。當3H-胸腺嘧啶脱氧核甞包含 於角蛋白細胞之培養皿中時，於細胞分部之製備過程中可 合成出DN A，於是經標記之核糖核甞便可併入新合成出的 DNA中。將胸腺嘧啶脫氧核甞併入大量細胞中之成 果，係取決於該大量細胞DNA之合成速率，因此而可作爲 細胞預活化之指標。 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ 將角蛋白細胞（經上述方法培養）置入24個井狀盤中，其 密度須爲每1毫升介質每井中有2000個細胞。待培養4天 後或者當細胞已達60-70%匯合後，換掉介質，待更換介質 24小時後，添加測試物質（三次）至井中，於4小時後，於 每井中添加ΙμΟΜ 3Η-胸腺嘧啶脱氧核甞於50 μΐ介質中之添 加液。將細胞繼續培養24小時，然後將介質自細胞中移 出，添加10%冰冷的三氣乙醯酸（TCA)，然後將平盤於冰 21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2l〇X 297公釐） 03 5 A7 B7 五、發明説明（19 ) ' 中培養30分鐘。以5%TCA將細胞清洗5次，並使之於500 μΐ 0.1 Μ氫氧化鈉中溶解至少1小時（通常需隔夜）。製品接 著以0·1 Μ氫氯酸中和；500 μΐ之細胞製品係用以測定總蛋 白質含量。每分鐘之3Η·標記DNA分解作用係利用液態閃 爍計數器計算900 μΐ之細胞製品而得。胸腺嘧啶税氧核甞 併入之結杲係表爲DPM^ig蛋白質。 轉谷胺醛胺醃測定 轉谷胺醯胺酶測定與角蛋白細胞之分化 在上皮細胞之最終分化過程Ί5 nm厚之蛋白質層（已知 之角化套（CE))係形成於細胞外型之内面，CE係由許多不 同之蛋白質所構成，由於經至少一種上皮細胞中之轉谷胺 醯胺酶（TGases)之催化作用形成Νε-(γ-谷胺醯胺基）賴胺酸 異二胜肽鍵而交聯键結在一起。轉谷胺醯胺酶I(TGases I) 係豐藏於上皮細胞之分化層中，尤其係柱狀層，然不存在 於未分化之基礎上皮細胞層中，因此，轉谷胺醯胺酶I係 上皮角蛋白細胞分化作用最有用之產生源，高TGases I含 量代表更多的分化狀態。以ELIS A爲主之TGases測定（使 用TGases I抗體）係用以分析下列實例中經培養之角蛋白細 胞之分化狀態。 ‘ 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 就實例1而言，保利用以下操作程序： 將角蛋白細胞（經上述方法培養）植入96個井狀盤中，其 密度須爲每200 μΐ介質每井中有3,〇〇〇個細胞。待培養4天 後更換介質爲含有測試物質（每次測試用6個複製品）之介 質，於另外的72小時後，介質係經發氣，並將平盤儲存於 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 503112 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（20 ) ' -70°C下。自冷凍器中移出平盤，並以PB5清洗細胞，添加 10 Ο μΐ之消毒水，將細胞於-7 0 °C下冷;東以進行冷;東再造然 後溶化。細胞係於室溫（R/T)下以PBS/3% BSA(清洗緩衝 液’牛血液樣本）培養1小時，然後以新的清洗緩衝液洗 滌。以購If Biomedical公司、經以1 : 2,000清洗缓衝液稀 釋之第一抗體單複製體抗人體谷胺醯胺酶小鼠抗體 於-37°C下培養1小時，然後以清洗緩衝液清洗2次。接著 以50 μΐ的經以1 : 4,000清洗缓衝液稀釋之第二抗體（Fab殘 段，過乳化酶共耗抗小白鼠Igd ’講自Amersham公司）於 3 7°C下培養1小時，然後以清洗緩衝液清洗2次。以基底溶 液（4毫克鄰-苯烯二胺及3·3 μΐ的30% H202於10亳升〇.1 M 檸檬酸酯中缓衝至pH 5.0)於室溫（R/丁）下及黑暗中（以鋁泊· 包住）培養細胞5分鐘，添加50 μΐ的4N H2S04後反應停 止。於492 nm處自平盤讀出計上讀出樣本之吸收度，在6 個複製樣本中，將4個以兩種抗體處理，另2個僅以第二抗 體處理（即，測定鍵結酵素共軛Ab之背景）。TGases係利用 每次處理扣除背景校正所得之讀數定之，並記錄曝置於兩 種抗禮中的平均値土 s. d.。 於其他實例中，係測量TGase I之量，利用以下操作程 序： 將角蛋白細胞（經上述方法培養）植入96個井狀盤中，其 密度須爲每200 μΐ介質每井中有3, 〇〇〇個細胞。待培養4天 後更換介質爲含有測試物質（每次測試用6個複製品）之介 質，於另外的72小時後，介質係經發氣，並將平盤儲存於 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 503112 Α7 Β7 21 五、發明説明（ -7G°C下。自冷凍器中移出平盤，並以PBS清洗細胞3次， 添加100 μΐ之消毒水，將細胞於-70°C下冷凍以進行冷;東再 造然後溶化。細胞係於室溫（R/T)下以PBS/3% BSA(清洗 缓衝液，牛血液樣本）培養1小時，然後以新的清洗緩衝液 洗滌。以購自Biomedical公司、經以1 : 2,000清洗缓衝液 稀釋之弟一抗體單複製體抗人體谷胺酿胺酶小鼠抗體（igG) 於-3 7°C下培養1小時，然後以清洗緩衝液清洗2次。接著 以50以1的經以1:4,000清洗缓衝液稀釋之第二抗體（|^5殘 段’過氧化酶共輛抗+白鼠Ig(5，暴自Amersham公司）於 37°C下培養1小時，然後以清洗緩衝液清洗2次。以基底溶 液（4毫克鄰-苯烯二胺及3·3 μΐ的30% H202於1〇毫升〇.1 M 檸檬酸酯中缓衝至pH 5.0)於室溫（R/τ)下及黑暗中（以鋁泊· 包住）培養細胞5分鐘，添加50 μΐ的4N H2S〇4後反應停 止。於个92 nm處自平盤讀出計上讀出樣本之吸收度，在$ 個複製樣本中，將4個以兩種抗體處理，另2個僅以第二抗 體處理（即’測定鍵結酵素共軛Ab之背景）。轉谷胺醯胺酶 之測疋係利用每次處理扣除背景校正所得之讀數定之，並 記錄曝置於兩種抗體中的平均値土sd 。 DNA測定 * 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經細胞處理後之TGase I測定會受到細胞數目之影響，亦 即，細胞數目越多，測得之TGase-1量便越多。利用將相 同井中TGase I之量正常化至與細胞之dna含量相同，便 可消除因爲細胞數目不同造成之變異。DNA量係細胞數目 特別有用之指標，包括對角蛋白細胞而言亦然，因爲各個 -24- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS ) 格（2丨〇χ 297公釐） 503112 A7 B7 五、發明説明（22 ) ' 細胞皆有其本身之功能及相同之基因組，因此可定出DNA 之量。細胞壁之DN A總量，係直接正比於細胞壁中之細胞 數，DNA之定量係用以正常化TGase之數値至細胞數目。 將角蛋白細胞植入96個井狀盤中，其密度需爲每200 μΐ 介質每井中含有3,000個細胞。待培養4天後更換介質爲含 有測試物質（每次測試用6個複製品）之介質，於另外的72 小時後，介質係經發氣，並將平盤儲存於-70°C下至少1.5 小時。將平盤自冷凍器中移出並溶化30分鐘。添加100 μΐ 的Hoechst染料（1 μΐ/ml最終襄度），然後培養細胞1 5分 鐘，蓋上並自螢光計中讀出吸收度（3 60 nm及460 nm)。移 出染料溶液，並以測定TGase中製備之PBS清洗培養井。 實例1 ’ 於改變角蛋白細胞之分生作用狀態，視網酸比視網醇更 有效 添加視網酸（RA)及視網醇（ROH)後、對轉谷胺醯胺酶量 正常化至細胞DNA含量之影響係經測試，列於表1中。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112

A

7 B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23) - II CO CO NJ to CO LP X Μ 〇 U1 X μα 〇 LTI X o Ul X H1 〇 cn X 〇 ί-Π X o 逢 ό 2： 4 2： 3： 2： 3： — 〇 re 72 〇 D： 彦 73 〇 尝 CO M CD [_! CO M Ui (__Λ H1 o f-1 CO q + 〇 \o -ΟΛ 1+ a? i+ i-l· i+ hf 1+’ 14- 1+ 00 H O Ο 〇 o o o o ο LH VO VO UJ 办 to CsJ to g 二l;. ^ 1 V h-1 <1 -J U1 LH <1 <^P l·-3· o 〇 o <SP C9 一 o 〇ψ > '. X 一一 〇 o o 〇 o o t Ό 〇 o o h-1 o o H1 o o H1 o o μα o o <* CO 童 〇 o 〇 o o —"Ο ο o o o o 〇 〇 〇 to 1 o o o o H1 . H1 H1 H1 ρο ^ Ο to 1 S Lh 1 X 〇 o 〇 〇 o o o —* Ό o 〇 〇 CD I o o 〇 〇 o o 7〇 ^ ' M 〇ίο · η: b X1 o .一 Ό o y^v o o 〇 o o o t__k ^ [sv 2： <! 1 vJ 〇 o o 〇 V—/ o j_a h-1 Ο ro :π υ,、 τ νκ * 26 • (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )’Α4規格（210X297公釐） 503112 A7 B7 五、發明説明（24) ' 所有經測試之視網酸濃度，即，2.5 X 1 〇·7 Μ，2.5 X 1 (Γ8 Μ，2·5Χ1(Γ9 Μ，相對於乙醇控制组而言，降低了角蛋白 細胞之分生作用，而就每一個相關濃度：2.5 X 1(Γ7 Μ , 2.5 X 1(Γ8 Μ，2.5 X 1(Γ9 Μ氣網醇處理而言，其改良度亦增 加。轉谷胺醯胺酶含量之減少係取決於梘網酸及視網醇之 劑量，此與於改變角蛋白細胞分生狀態下、視網酸比視網 酵更有效之論點一致。 實例2 視網醇之活體外微粒子酯化作f方g 微粒體係獲自如下列文獻中所描述之方法：j. C. Saari 及D.L· Bredberg所著之”含視網醇片段之上皮細胞中之輔 媒A及非輔媒A依存性之視網酯化反應（c〇A and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Figment Epithelium)"，發表於生物化學期刊，第263頁，8084-90(1988)。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 將含有0·1 Μ磷酸鈉pH缓衝液、5 mM二硫蔗糖醇、2 mg/ml牛血清蛋白、40微莫耳棕櫚醯基輔媒a、40微莫耳 二月桂醯基磷酸牛贍鹼、10微莫耳視網醇、及一待測試化 合物或空白試驗溶劑之溶液，於37°C下、與單離自牛的含 視網醇片段上皮細胞之微粒體殘段保溫1小時；保溫之 後，添加等體積之乙醇使反應驟冷，然後以己烷萃取所形 成之視網黯（獲自LRAT催化反應之月桂基視網黯，或獲自 ARAT催化反應之综搁基視網醋）；移出己燒層，於氮氣中 汽化，殘餘物則經HPLC進行視網酯之定量分析，HPLC條 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 五、發明説明（25 ) ~ 件爲：3.9 X 300 mmiCi8逆相管柱，使用8〇〇/❾之甲醇於動 相管柱中，並使用螢光偵測計（325 nm激發，480 nm放 射）°於空白試驗溶劑存在下所形成的视網酯之量係作爲 1 〇〇%標準點，其係用以計算測試化合物對視網酯形成之 抑制作用。爲作爲控制組之用，將整份之微粒體煮沸5分 鐘’其產生至少95%之視網酯形成抑制性。 所得結果摘迷於表2中。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 - 8 2 ί 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0>< 297公釐） 2 1X 1X 03 5 ^命# ^itJL^6^丧备杀 &款^^^1^#^# oiit^^iD^^^^ l·^奏备玲 一 β漭冰 昏4ΙΕ 择邊4ΑΒ'Ι^^#^^^^捧 ^蠢* ^ ^ β S (,^ ^ ^ ^ β 0-^-5一^尊44-蔡^^^## ^ β 0 β l· D β β l· ^ >117|1/班^^^^漆 6)iti ib^· 2>nMi^4^*^ /l\ 明説 明發五 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) loo 10 loo loo loo loo 100 100 100 loo loo loo loo 100 100 loo >2 ,ιτ 0 0 0 0 0 0 〇 〇 0 0 0 20 90 ;u 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ARAT# #j % 9.5 28 CD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 r^>H# M 0\0 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 A7 _____B7_____ 五、發明説明（27 ) - 由表2中可知，羥乙基咪唑啉界面活性劑係具潛力之酯 化反應抑制劑，而其他界面活性劑與其他異環化合物係主 要爲非活化者。己醯基羥乙基咪唑啉（r==CH3(CH2)6)並無 法有效抑制L R A T。 · 實例3 重覆實例2，然以不同之羥乙基咪唑啉界面活性劑，其 中R係如表3所示，所得結果摘述於表3中。

基係較佳者，因其並非純粹匕2,亦具有某些長鏈烷基。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表2中己醯基羥乙基咪唑啉之數據顯示於1〇〇微莫耳下僅 八8 /〇之抑制力’將此數據一併列入比較，顯示相對活性 油醯基>椰子基> 月桂基醯基。 實例4 使用治磁基幾乙基味嗅淋卿），視網酸（ra)，視網醇 (R 〇 Η)及標櫚酸視網醋（R p)進行轉谷胺酿胺酶測定。 所得結杲摘述於表4中。 ___轉30· 本紙張尺^^關家辟公釐） 503112 A7 B7 ) 表4 化合物 濃度（微莫耳） 控制％ RA 0.25 35.1 ROH 0.25 76.2 OHI 1 80.7 ROH + OHI 0.25 + 1 45.1 RA 0.25 43.4 ROH 0,*25 91.6 OHI 1 78.2 ROH + OHI 0.25+ 1 57.9 RA 0.25 45.9 ROH 0.25 91.6 OHI 1 91.1 ROH + OHI 0.25+1 71.6 五、發明説明（28 ) 复 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表4中之結果顯示視網酸可實質降低角蛋白細胞之分 化’然而視網醇、油醯基輕乙基咪嗅琳、及棕櫚酸視網酯 單獨使用時並不具備有效之角蛋白細胞分化影響力，或僅 具備較視網酸小得多之影響程度。 於實驗1及2中，當視網醇與油醯基羥乙基咪唑啉併用 時，結果顯示其對角蛋白細胞分化之影響力具有加成性作 用，或接近視網酸之功效。 於實驗3中，當油醯基羥乙基咪唑啉與棕櫚酸視網酯傅 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 期112 A7 B7 29 i、發明説明（ 用時，結果並不似實驗1及2般戲劇化，然而亦具有加成性 作用。 此等結果證實通過本發明中所述之活體外微粒體試驗之 化合物，當與視網醇以類似於視網酸作用量併用時，確實 對角蛋白細胞分化具有相當效果。 實例^ 對表5 A及5 B所列化合物進行活體外微粒體試驗。 表5A之化合物係於100μM濃f下進行測試，表5B之化 合物係於1 〇 μΜ濃度下進行測試5 … (請先閱讀背面之注意事項再本頁} —裝 修本 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 j' !' .... 化合物 ....... LRAT抑制％ α大馬士革酮 一ι._ιιιι"_丨丨 11=*:~ i-**"****^ 83 β大馬士革酮 84 δ大馬士革酉同 87 異大馬士革嗣 80 大馬寿《 70 α芷香酮 45 β芷香酮 22 晞丙基〇c龙香酮 22 異丁基α龙香酮 8 α甲基龙香gpj 67 丫甲基：?£香酮 21 伯漢醇 70 山達醇 —*--―"丨 15 32

Μ氏張尺度適用中國國家榡準（CNS )A4規格（21 OX 297公釐） 503112 7 五、發明説明（30 ) ........... 丨 II" ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- - _ — α萜品油 '' ) -'»-·.……~ ' 丨…丨( ----. -- 26 1.........................旧· ~ ........... 25 丁柏醇 34 33 莱亞醛 76 71 酮納酯 50 3 3 乙基藏花j由黯 51 49 茶所醛 41 21 山達啉酮 .............1 ’ ·一 23 12 表50 『--— 丨丨丨丨丨 ........ .... 化合物 LRAT抑制％ I ARAT抑制❶/〇 α大馬士革嗣 67 87 β大馬士革酮 45 52 δ大馬士革酮 58 64 大馬寧酮 23 29 烯丙基α芷香酮 1~·丨丨丨冒丨II" 1 ……… 丨丨丨丨丨一丨丨 16 17 由表5A及5B之結果可知，特定環狀脂族不飽和化合 物，係爲具有潛力之LRAT及ARAT催化酯化反應抑制 劑0 * (請先閱讀背面之注意事項再

?1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 比較f例6 以另外的環狀脂族不飽和化合物進行活體外微粒體試 驗-，所得結果摘述於表6中。 表6中之化合物係於100 μΜ濃度下進行測試。 -33- 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS)Α4規格（210x297公釐〉 503112 A7 --—________B7 五、發明説明（31 ) 表6 111 —一一11 似 _ 化合物 ' 1 _ :ίΐΐΐίί!: τ1 …圓一二幽aaaaacasasaaaagaaass ι „ LRAT抑制❶/〇 ................——’' ARAT抑制％ 二遵α!香酮 13 J-1~*=~丨丨 11111111111111^~~麵·丨丨…1888181111111,11Βί""丨丨丨1~~L~1J!S*s=aaa： 18 1芷香醇 0 0 β芷香醇 0 0 肉桂醛 0 . 〇 香草醛 --------------------------------------- 0 0 桉樹趁 0 0 f醇 0 0 尹里酚 0 0 香芹酮 0 0 樟腦 0 0 堇酮 0 0 葑醇 12 4 異環香葉醇 18 16 二甲芷香酮 Q 9 δ甲基芷香酮 '' L--....... 0 10 ..........."—一 .一 (讀先閲讀背面之注意事項再頁}

JT .^^1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由表6之結果可知，並非所有環狀脂族不飽和化合物皆 可抑制或有效抑制LRAT及ARAT催化之酯化反應。 實例7 檢測表7所列化合物及其摻合物對角蛋白細胞分化作用 之影響’結果以控制％表之，轉谷胺醯胺酶含量係經正常 化至DN A，記綠其中視網醇濃度經改變之兩實驗的數據， 所得結杲摘述於表7中。-34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — ^--- 503112 A7 B7 五、發明説明（ 32 w _ ...........-........... _ 實驗 一1111111 -—- __ β合物 1 一― ' _ | — 濃度（微莫耳） ------ 控制％ 1 视網酸 0.00025 _議 ----- - | 24 1_ 视網醇 0.001 67 1 士革酮 1 92 1 視網醇+ ϋΑ士革酮 0.001 + 1 1- s==s:ss:s=ssssgsasss^' ' 1 34 2 1 1 - II 一j 视網酸 」 0.00025 _丨麵丨1·11111 11 Jl-- 丨 8 2 --—--—__ 0.00025 63.5 2 —~----- 士革國 1 86 2 ------J 視網醇+ 馬士革嗣 0.00025 + 1 '_··丨丨丨丨丨丨.........................丨丨丨丨_丨丨 —— 30 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) ir 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 巧4 田u尺馬dtr平’干例1丈用吁，對角蛋 胞之刀化作用並非非常有效，然兩者之摻合物併用時，w 角蛋白細胞分化作用之影響力卻產生加成性作用。此等實 驗亦建互起活體外微粒體試驗及細胞培養數據間之良好關 聯性。實例8 I 、萜化合物、香葉草基香葉草醇或法呢醇進行活體外 微粒體試驗。 岬得結果摘逑於表8中。 對 夢丨 ....... I —I- - HB · » ml —I-:·-· · 35- 、纸張尺度適财陶家縣（CNS ) A4規格 (210X297公釐） 五、發明説明（ 33 A7 B7 表S '"^·" ... II I --...........-丨旧-

獲自TCI美國公司（波蘭，奥勒崗）。亦可獲自Sigma及 2 ctc有機公司（亞特蘭大，喬|台亞）δ 獲自Givaudan公司，公司或公司。 由表8之：果可看出’香葉草基香葉草醇及法呢醇皆可 P制視網醇化作用，相較於法呢醇而言，香葉草基香 下：

(請先閲讀背面之注意事項再本頁)

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 依上述㈣質及方法章節中所述之操作程序進行3h胸

:她氧核菩之併入量，所得結果摘述於表9AMB 中。 36 本紙張尺度ιϋ?ϊ^家標隼（CNS) ) 503112

B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五 、發明説明（34 ) ~ 表9 A 實驗# 1 處理 DPM/蛋白質亳克 控制％ 平均値 (標準値） 控制組 (278) 100 250 nM視網醇 2082 (146) 108 250 ηΜ視網酸 3013 (226) 156 250ηΜ視網醇+10 nM 香葉草基香葉草醇 2970 . .1308) 154 表9B 實驗#2 處理 DPM/蛋白質毫克 控制％ 平均値 (標準値） 控制組 (322) 100 250 nM視網醇 974 048) 107 250 nM視網酸 1494 (45) 163 250 nM 視網醇+10nM 香葉草基香葉草醇 1450 <318) 159 由上述之結杲可看出，對相當於視網酸用量的視網醇而 言·，香葉草基香葉草醇可明顯增加其對細$增殖作用之影 響。此等實驗又再度建立起活體外微粒體試驗及細胞培養 間之良好關聯。 -37- (讀先閱讀背面之注意事項再本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 A7 B7 五、發明説明（35 實例10 以表10中之化合物進行活體外微粒體試驗，所得結果揭 述於表1 〇中，表〗0中之化合物係於100 μΜ濃度下進行測 1 1 --------- , 111丨丨_ _ 化合物 LRAT# Μ % ...... ARAl^ 制 ％ 控制組 0 0 4*，5,7-三襄黃酮 33 14 3,3、4、5,7-五蕤普酮 1 - —- 25 14 丨_丨丨丨_丨丨丨丨丨丨_丨丨丨丨ir〒丨丨丨丨丨丨丨 - 實例11 三羥音酮輿視網醇加成性地抑制角蛋白細胞之分 化作用 對TGase I量正常化至細胞DNA含量之影響係以相關於經 以測試化合物進行72小時處理後始測定之，結果列於表} ! 中。4·，5,7-三羥黃酮係獲自Sigma公司0 f請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 A7 B7

五、發明説明（36 ) II 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2.5 X ΙΟ'7 M ROM + ΜΟ^ΐνΜ·，，？-三羥黃削 10·7Μ 4丨，5,7-三羥1酮 2.5Χ 10'7从视網醇 丨 2.5Χ10-7ΜΚΛ : 控制組 處理 ， 27.61 士 10.79 (53%) 1 49.84 士 2.76 (94%) 48.31 ± 5.31 (92%) CO Η- to u> Η1 to、 U1 CO <1 α> Η* Ul σ\ *〇 平均 TGase/DNA‘ X lCT4土s.d.(控制％)丨 0.002 1 0.329 0.235 0.001 1 p値vs控組 0.005 1 0.585 | 1 0.001 0.235 p iA vs 2.5 x ΙΟ'9 Μ ROI I 、 0.328 丨 0.001 0.001 I 0.001 ρ 値 vs 2.5 X 10_7MRA 0.002 J I 0.585 0.001 0.329 ρ 値 vs 2.5 x ΚΤ7Μ 4f，5,7-三羥黃酮 莾 1mA 4/5,7- W 為蛛 i 準瀹碡^flcvTGasc/DNA" 韁 —^--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T -IIP- 9 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 37503112 A7 B7 五、發明説明（ 由表II中之數據可知，25χ丨〇·7μ之視網酸對壓抑角質 化TGase I含昼相：有效（相對於控制％而言），25xi〇-9 Μ之視網醇係無作用者（91%)，ι〇·7Μ4ί，5,7三羥黃酮當單 獨使用時，對肖質化TGase [含量不具抑制力。炊^ $ [三 藉黃酮與視_醇併料，對錢白細胞分㈣用卻產錢 似於視網酸功效之加成性效果。 實例12 胞之分化：^ 對TGase I量正常化至細胞〇]^八含量之 、、，、、 &备係以相關於經 以測試化合物進行7 2小時處理後始測定々 、 中。 ’結果Η於表1 2

II 1 I

(請先閲讀背面之注意事項再本頁W

j - - HI HI t-*-I I.....I . 7-裝▲ JI本 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -40. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 503112 A7 B7 五、發明説明（38 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 η = 3 2.5Χ]()·8Μ棕櫚酸視網醇酯 + ^^/^^//-三羥黃酮 UTKM 4f，5,7-三羥黃酮 2.5 X Ι0·κΐνΜ$櫚酸视 網醇酯(RP) 2 . 5x10'7M RA 控制组 處理 43·12 土 13.01 (85%) 45.01 土 1.90 (89%) 47.32 士 4:22 (93%) ! 16·31 土 2、：58 (32%) 50.64 ± 1^74 (100%) 平均 TGasp/DNA X 0.005 0.001 0.143 ! 0.001 I GO *1Λ- • hr/ 寺 0.036 0. .296 I 0.001 0.143 p 値 vm 2.5 x ΙΟ'8 Μ RP 0.001 0.001 1 0.001 1 (0.001 ρ ίΑ vs 2.5 X l(r7M R八 0.065 1 0.296 0.001 0.001 1)值 vs 2.5 x ΐσ7Μ 三羥i酮 捧 12 · { I. 訂 |丨舞 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） i 503112 A7 B7 39 五、發明説明（ 由表12中之數據可知，2.5X 1(Γ7Μ之視網酸對壓抑角質 化TGase I含量相當有效（相對於32控制％而言），2·5 X 1(Γ8 Μ之棕櫚酸視網酯係無作用者（93%)，1〇-8Μ 4，，5,7-三羥黃 酮當單獨使用時，對角質化TGase I含量不具抑制力。然 4f，5,7-三羥黃酮與棕櫚酸視網酯併用時，對角蛋白細胞分 化作用卻產生類似於視網酸功效之加成性效杲。 實例13 五羥黃闕輿控櫚酸視網酯加成性地抑制角蛋白 細胞之分化作用 ',- 對TGase I量正常化至細胞DNA含量之影響係以相關於經 以測試化合物進行72小時處理後始測定之，結果列於表1 3 中。3,3’，4、5,7-五羥黃酮係購自3丨§1^公司。 ^ (請先閱讀背面之注意事項再

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1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐〉 503112

A

7 B 五、發明説明（如） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 〇 ?〇 Η» ro tsJ 鈐. 之、LT1 2： X U1 X is U) P U 〇. ο f—1 ο Κ v sf 卜 ^ 〇 23^ Vi 、4; 1¾ -¾ 务* 2¾ (X) U1 ΚΩ σ\ Η1 LO (J1 cr\ κο q -1^ 办 〇 V£5 νο Η ~ W- 1+仏 U1 l-f 1+ L*J 1+ Μ 1+ cn 1+ α. ^ ^ 〇 r^r ^ CD UJ u> Η1 OJ ο CsJ 拎* g Ό 〇 0D CO μα σ\ • <μ"" _ f··»"· - > 〇 d9 0D tn dP Ο dP αι CO 并 Η» Ο Ο ο'Ρ X， 〇 Ο Ο Ο Ό < 〇 〇 ο ο ο 办 ο ο ⑺ Μ UJ CsJ Μ - .· 告 —~3 ο ο ο Ο ο UJ 1 ο ο :，· Η1 Ο NJ CD ο CO Q ro 二 X —~ . 二·詨 Ο Ο ο Ο 2 < ο Ο ο 1 Ο f· Η U1 Ο Η1 ο Η1 ο > to r /s W 1 X UJ ¥裔 ν^-> ο OJ I U) CO Vw? ο ο Ο Ο :^ < CD Η» UJ P;i 一^. 2 f ~ 43* 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） im (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂，------ 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 --——-^ _ B7 五、發明説明（41 ) - 一"： ~ 由表13中之屢果可知，2.5 X 1(Γ7Μ之乱網酸對壓抑角質 化TGase I含量相當有效（相對於52控制％而言），2 $ X ι〇 7 視網醇係無作用者（93%)，1(Γ6Μ3,广4，，5,7-五韙黃酮 田單獨使用時，對角質化TGase I含量不具抑制方。然 而’ 2.:>χι〇-7μ之視網醇與1〇-6]^3,3,，41，5,7_五羥黃酮併用 時，對壓抑角質化TGase I含量表現70%之控制量。因此， 3,3，4’，5,7-五羥黃酮與視網醇對角蛋白細胞分化作用可產 生類似於視網酸功效之加成性效杲。 基於此等研究，視網酸係用f作成-正控制組以及與其餘 化合物分析比較之參考组9視網酸，於一定劑量下係可降 低皮膚角蛋白細胞中之TGase I含量，換言之，視網酸可 降低角蛋白細胞之分化作用。於抑制角蛋白細胞之分化作 用方面，視網醇及棕櫚酸視網酯很明顯地較視網酸無效。 無論如何，上述實例所表現之非可預期功效在於：視網 醇或視網酯對培養角蛋白細胞之影響力可大爲提昇至接近 視網酸之功效，其係藉由將視網醇或酯與佔組合物重自約 0·0001%至約50%之一種化合物併用而達成，其中該化合 物t由活體外微粒體測定顯示於1 之濃度下、可抑制 至少20%的由LRAT或ARAT催化之視網酯化反應。此等功 效並非僅大於單獨使用視網醇或其酯類時者，且大於併用 此兩種成分、以對角蛋白細胞產生類似於視網酸功效的加 成桂功效者。 $ 上述實驗結果顯示，通過活體外微粒體測定之化合物與 視網醇或視網酯，可加成性地降低角蛋白細胞之分化作用 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2丨0X297公釐) ~ (請先閲讀背面之注意事項再^^本頁)

#f 503112 A7 --—----- B7 五、發明説明（42 ) ' : ^-- 及/或增加角蛋白細胞之增殖，及模擬視網酸對 胞之功效。 角蛋白細 實例14-19係例示本發明之組合物，此等組合物可 知方法製備，其係適合於化妝品用途，尤其，此等组合物 係適合於皺紋、粗糙、乾燥、裂開、老化及/或經傷害 之皮膚您用途中，以改善皮膚外觀及觸感，本發明之組合 物適合於使用於健康之皮膚上，以避免或者延遲衰老現 象。 實例14 ' , 一 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 本 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此實例係例示併入本發明組合物之^内相油包水乳液。 「丨丨 1 | -- ......... —-^«==8»=^ 圖丨 OyiiW/W „ , 丨丨1 '. ........ 丨丨丨η ............................................................................................."" 丨.丨丨·..... - ； A .· ^ | || ^^ ' ， . . I : ::.:觀 C — '1 _ι “丨 視網醇 0.5 .„； - 祕着- Ml_____ 栋搁酸視網酉旨 0.15 __ 0.15 - 全氫化揶子油 3.9 3.9 __ 3.9 3.9 4f，5,7 -三護黃酮 5 一 0.1 5 3,3·，4’，5,7-五幾黃酮 1 1 一 •雜一 ~ g ~ Brij 92* 5 5 一 5 5 * Bentone 38 0.5 0.5 0.5 0.5 MgS047H70 0.3 . 0.3 一 0.3 0.3 丁基化羥甲酮 0.01 0.01 —__ 0.01 0.01 香水 適量 適量 適* 適量 至100 至100 Vr I I _ μ — 至100 ------- |·Η 至100 *Brij 92係聚環氧乙埽⑵油醯醚。 、τ Γ -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ 297公釐） 503112

A 五、發明説明（43 ) 實例15 此實例係例示本發明之水包油面霜。 %w/w A ：w C D 棕櫊酸視網酯 讎齡觸 0.15 0.15 讎泰讎 視網醇 0.5 讎相· ,麵麵· 0.01 礦物油 4 4 4 4 α-芷香酮 1 . 缝聽M 1 甲基芷香酮 霉轉讎 0.5 … … 菜亞醛 麵轉爾 峰齡 … 0.2 異大馬士革酮 —辑_ 驗麵 0.3 麵· Brij 56* 4 4 4 4 Alfol 16RO* 4 4 4 4 三乙醇胺 0.75 0.75 0.75 0.75 1，3-丁二醇 3 3 3 3 黃原膠 0.3 0.3 0.3 0.3 香水 適量 適量 適量 適量 丁基化羥甲酮 0.01 0.01 0.01 0.01 水 至100 至100 至100 至100 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) *Brij 56係十六醇POE (10) 〇 Alfol 16RO係十六醇。 實例16 此實例係例示本發明之含醇乳液。 -46 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112

A B7 五、發明説明（44 ) %w/w 1 A B C D 視網醇 碰鷄輔 0.15 0.15 _ _ _ 棕櫚酸視網酯 0.15 嫌·鎌 晒讎腾 0.15 α-芷香酮 0.1 ▲ _ _ 0.1 籌_爹 香頁草基香頁草醇 嫌嫌賴 1 咖霉赛 0.2 乙醇 40 40 40 40 香水 適量 , 1量—… 適量 適量 丁基化羥甲酮 0.01 0.01 0.01 0.01 水 至100 至100 至100 至100 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 實例17 此實例係例示包含本發明組合物之另一種含醇乳液。 %w/w 視網醇 0.15 油醯基輕乙基咪嗤琳 0.1 乙醇 40 抗氧化劑 0.1 香水 適量 水 至100 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 實例18 此實例係例示併入本發明組合物之防曬f。 %w/w 1棕搁酸視網酯 0.01 -47- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112

7 B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五 、發明説明（45 ) 椰子基羥乙基咪唑啉 0.1 梦酮油200 cts 7.5 甘油單硬脂酸酯 3 十六烷基硬脂酸醇 1.6 聚環氧乙缔-(20)-十六烷醇 1.4 黃原膠 0.5 Parsol 1789 1.5 戊基甲氧基琥珀酸酯(Parsol MCX) 7 香水 xr- ---^ 適量 色素 適量 水 至100 實例19 此實例係例示併入本發明组合物之非水性護膚组合物。 %w/w ， 棕櫚酸視網酯 G.15 月桂基羥乙基咪唑啉 1 矽酮膠SE-301 10 矽酮流體3452 20 1 矽酮流體3443 55.79 角黨烯 10 羊毛脂 0.01 膽固醇 < 0.03 2-羥基-η-辛酮酸 0.7 維他命Ε羊毛醯脂 0.5 -48- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) τ：：!衣. 訂、· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 503112 A7 五、發明説明（） ~一~·~~.~~*- 草油 0.5 乙醇 _ 2 -----.11 | Ί - 1------------ 二甲矽酮聚合物，其具有至少50,000之分子量，及於 25°〇下至少1〇,000分托之黏度，購自〇£(：公司。 二甲矽酮環狀五聚物，購自DowCorning公司。 3二甲矽酮環狀四聚物，購自Dow Corning公司。 若未描述於實例中，則本發明中所使用之材料係購自下 列來源： 棕櫚醯基輔媒A，BSA，二另桂— 基硫肽牛贍鹼，視網 醇，視網酸二硫色瑞特醇-購自Sigma公司。 環狀脂族不飽和化合物： 大馬士革酮講自Firmenich公司， 芷香酮購自IFF公司， 其他則購自”香味及香精材料”中之供應商，1991，由 Allured Pub.公司發行， 咪唆琳界面活性劑： 油酿基味嗤淋係講自Scher化學公司之Schercozoline Ο ; 其餘者係購自McIntyre公司’ Mackazoline系列，商品名分

I 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 別爲己醯基，椰予基，月桂醯基：Mackazoline CY，C及 -49« 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐）

Claims (1)

1. 503112 屮年t月冰日

   第086118986號專利申請案 A8 中文申請專利範圍修正本(91年4月） S D8 六、申請專利範圍 1. 一種護膚組合物，其包含： (a) 自0.001%至10%的選自由視網醇及視網酯所組成之 群之化合物； (b) 自0.0001%至50%之一種化合物，其經由活體外微 粒體測定顯示於100μΜ之濃度下、可抑制至少20% 的由卵磷脂視網醇醯基轉移酶（LRAT)或醯基C ο A 視網醇轉移酶（ARAT)催化之視網酯化反應；其中 該化合物並非脂肪酸醯胺或二甲咪唑啉酮且係選自 由環系脂族不飽和烴類，二萜烷及脂族羥乙基咪唑 啉界面活性劑所組成之群 ；以及 (C) 一種化妝品可接受媒液； 其中該環系脂族不飽和烴類係選自由α大馬士革酮 (alpha damascone)，β大馬士革酮，δ大馬士革酮，異 大馬士革酮，大馬寧酮（damascenone)，α：ί£香酮，β龙 香酮，婦丙基α芷香酮，異丁基芷香酮，α甲基芷香 酮，γ甲基龙香酮，伯漢醇（brahmanol)，山達醇 (sandaol)，品油，萊亞酸（lyral)，乙基藏花油酯， 以及彼等之混合物所組成之群； 該二萜烷係香葉草基香葉草醇；及 該脂族羥乙基咪唑啉界面活性劑具有下列結構： R H—CH^CH^OH I)' ' 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4说格(210 X297公釐) A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 其中R係具8至2〇個碳原子的脂族飽和或不飽和、直鏈 或具支鏈氫-礙鏈。 2.根據申請專利範圍第丨項之组合物，其中該視網酯係選 自由棕櫚酸視網酷、乙醯酸視網酷、丙醯酸視網酉旨、羊 毛酸視網酯及彼等之混合物所組成之群。 3·根據申請專利範圍第1項之組合 _眾只 〇物，其係用於調理皮 層0 4·根據中請專利範圍第i項之組合物，其係、用於模擬視網 酸對皮膚之效應。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)