CZ399A3 - Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů - Google Patents

Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů Download PDF

Info

Publication number
CZ399A3
CZ399A3 CZ993A CZ399A CZ399A3 CZ 399 A3 CZ399 A3 CZ 399A3 CZ 993 A CZ993 A CZ 993A CZ 399 A CZ399 A CZ 399A CZ 399 A3 CZ399 A3 CZ 399A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
analog
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
CZ993A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Charles Boone
Elen Ngoi Yin Cheung
Susan Irene Hershenson
John David Young
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ399A3 publication Critical patent/CZ399A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů z
Oblast techniky
Vynález se obecně týká polypeptidových analog terapeuticky aktivních kationaktivních proteinů, včetně (ale nejenom) analog neurotrofických faktorů známých jako neurotro-fi-n-33—(-N-T--3-)—a—neurotrofickýfaktor pocházející z-mozku(BDNF-faktor; brain derived neurotrophic factor). Přesněji řečeno, tento vynález popisuje kationaktivní polypeptidy, jejichž nativní sekvence byla pozměněna tak, že vzniklá analoga mají nižší izoelektrické body a/nebo vykazují po parenterální aplikaci zvýšenou absorpci in vivo. Vynález rovněž popisuje materiály a způsoby pro produkci zmíněných polypeptidových analog, protilátek namířených proti těmto analogům a farmaceutické přípravky obsahující tato analoga, kde zmíněné farmaceutické přípravky mohou být použity k léčbě nej různějších onemocnění a patologických stavů.
Dosavadní stav techniky
Po parenterální aplikaci (jako například subkutánní, intravenózní nebo intramuskulární injekcí) nějakého terapeutického proteinu se ú jednotlivých takto aplikovaných proteinů mohou podstatně lišit jejich farmakokínetické vlastnosti jako například biologická dostupnost, doba setrvání v cirkulaci nebo rychlost clearence (vymizení z organizmu). Ačkoliv jsou ve mnoha laboratořích uskutečňovány pokusy o vyvinutí alternativních způsobů aplikace proteinových produktů, v současnosti je velmi málo známo o faktorech, které řídí farmakokinetiku terapeutických proteinů po parenterální • « ··· · ·« ··· ·· ·· « « · • t · · · « · · · · v · * · · · · » ·«··· ·· ♦ · · · · » * «»·* V» ·· · ·· aplikaci. Bylo prokázáno, že zvýšení molekulové hmotnosti proteinu má za následek přednostní příjem takového proteinu lymfatickým systémem (raději něž krevními kapilárami); viz. Supersaxo a další, Pharmaceutical Res., svazek 7, strana 167 a následující, 1990. Velikost molekuly terapeutického proteinu hraje rovněž klíčovou úlohu u příjmu insulinu, kde bylo prokázáno, že limitujícím krokem při příjmu insulinu je disociace hexamerů insulinu spojených prostřednictvím iontů zinku na monomerní formu; viz. Kang a další,—Diabetes Gare^— svazek 14, strany 942 až 948, 1991. Klinické testy analog monomerního insulinu, u kterých bylo odstraněno místo odpovědné za asociaci molekul, prováděné na pacientech postižených diabetem prokázaly u těchto pacientů rychlejší příjem zmíněných analog vedoucí k podstatnému zlepšení v řízení hladiny glukózy; viz,. Brange a další, Nátuře, svazek 33, strana 679 a následující, 1988.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci lidského NT-3 divokého typu (tj. nativní sekvenci). Tento polypeptid byl produkován rekombinantně v bakteriální buňkách E. coli a exprimován s methioninem na N-konci, tj. jde o r-metHuNT-3 (SEK. ID. Č: 1). Číslování aminokyselinových zbytků začíná na obrázku 1 u prvního aminokyselinového zbytku následujícího po startovním methioninu (Met-1) a to proto, že přirozeně se vyskytující protein je v savčích buňkách normálně exprimován bez tohoto methioninu. (Povšimněte si, že v Seznamu sekvencí je Met počítán jako +1).
Na obrázku 2 je znázorněna nukleotidová sekvence (SEK. ID. Č: 2 a obrázek 2A) a aminokyselinová sekvence .(SEK. ID..
9999
ΦΦ 9999
99
9 9 9 9 · Φ Φ Φ Φ • Φ Φ ·9 9 9 Φ φφφφ φ φ Φφφφ Φ Φ ΦφΦ ΦΦΦ *Φ ΦΦΦΦΦ Φ Φ φφ ΦΦΦ ΦΦ * ·* ·♦
Č: 3 a obrázek 2Β) polypeptidového analoga r-metHuNT-3 podle vynálezu, jmenovitě NT-3a-n9)R61A, K64D (s číslováním aminokyselin začínajícím u prvního aminokyselinového zbytku následujícího po startovním methioninu).
Na obrázku 3 je znázorněna nukleotidová sekvence (SEK.
ID. Č: 4 a obrázek 3A) a aminokyselinová sekvence (SEK. ID. Č: 5a obrázek 3B) jiného polypeptidového analoga r-metHuNT3 podle vynálezu, jmenovitě NT-3 (i.n7)R61A, K64D (s číslováním aminokyselin začínajícím u prvního aminokyselinového zbytku následujícího po startovním methioninu).
Na obrázku 4 jsou znázorněny kalibrační (standardní) křivky u stanovení ELISA pro NT-3 divokého typu (tj. o sekvenci SEK. ID. Č: 1; kroužky) a pro analoga NT-3 o sekvencích SEK. ID. Č: 3 (NT-3(1.119)R61A,K64D; trojúhelníky) a SEK. ID. Č: 5 (N.T-3(1-H7JR61A,K64D; čtverečky). V grafu je vynesena optická hustota v závislosti na koncentraci vzorku vyjádřené v nanogramech na mililitr (ng/ml). Při stanoveních ELISA je křížová reaktivita k analogům NT-3 přibližně deset procent. Vzorky sér z farmakokinetických studií byly analyzovány metodou ELISA a koncentrace NT-3 divokého typu a analog NT-3 byly stanovovaný na zaklade srovnáni s odpovídajícími kalibračními křivkami.
Obrázek 5 znázorňuje chromatogram z vysokoúčinné kapalinové chromatografie na nosiči pro gelovou chromatografii (SEC-HPLC; size exclusion high performance liquid chromatogram) , kde je NT-3 divokého typu srovnáván s analogy NT-3 o sekvencích znázorněných na obrázcích 2 a 3. Na ose y jsou vyneseny jednotky absorbance (AU) a na ose x je znázorněn eluční čas (v minutách). Z obrázku je vidět, že zmíněná analoga jsou eluována ve stejném čase jako molekula divokého typu což ukazuje, že nekovalentní dimerní struktura NT-3 divokého typu nebyla rozrušena ani u jednoho z analog.
V žádném z těchto preparátů hebyly detekovány agregované_ *4 44«4 4» »4«· 4« 44 ββ» 44 · · · · * • 4 4 4 4 *4 4 444 4 « 4 444 4 4« *44444 *4 44444 4 4
44444 44 44 44 4 · molekuly proteinů. Legenda: ( _ ) NT-3 divokého typu; ( --- ) NT-3 (i-117)R61A, K64D; a ( ) NT-3 (1-119)R61A, K64D.
Obrázek 6 znázorňuje chromatogram z vysokoúčinné kapalinové chromatografie na katexu (CEX-HPLC; cation exchance high performance liquid chromatogram), kde je NT-3 divokého typu srovnáván s analogy NT-3 o sekvencích znázorněných na obrázcích 2 a 3. Na svislé ose jsou vyneseny jednotky absorbance (AU). Na vodorovné ose je znázorněn eluční čas (v minutách). Na tomto obrázku je vidět,—že—zm-íněná-analogajsou eluována dříve než NT-3 divokého typu, což je v souladu s nižší hodnotou izoelektrických bodů těchto analog. Legenda: ( _ ) NT-3 divokého typu; (----) NT-3 d-117)R61A, K64D;
a ( ) NT-3I1-i19,R61A,K64D.
Na obrázku 7 je znázorněn elektroforetický chromatogram SDS polyakrylamidového gelu barveného stříbrem. Zde je NT-3 divokého typu (viz. obrázek 1) srovnáván s analogy NT-3 o sekvencích znázorněných na obrázcích 2 a 3. Všechny tři vzorky putovaly při elektrofořeze jako jeden proužek o přibližně stejných molekulových hmotnostech odpovídajících monomerním formám. V žádném ze vzorků není pozorována pří- « « a n » η μ λ w Vh X -! λ ť λ wt v* λ íí w » ď λ Ί ! Λ ΊΊ-ι λ ν»β» Λ TVÍ r-1 *t nVn Ί .
UULLlllkJD U V _ý ώ J Ο J-HO |Ι U ΑΟ Ο L· V J. S-/ X X LLIC X ΙΛ η ι vi-l vých hmotnostech nebo fragmentů o nižších molekulových hmotnostech. Dráha 1: NT-3 (1.117)R61A, K64D, 2,5 μg; dráha 2: NT3 (1-119)R61A,K64D, 2,5 μg; dráha 3: NT-3 divokého typu, 2,5 μg; dráha 4: NT-3 divokého typu, 12,5 μg; dráha 5: standardy o známých molekulových hmotnostech.
Na obrázku 8 jsou znázorněny profily sérových koncentrací (v nanogramech na mililitr) proteinů o sekvencích SEK.
ID. Č: 1 (plná kolečka), SEK. ID. Č: 3 (prázdné kroužky) a SEK. ID. Č: 5 (plné obdélníčky) v závislosti na čase (v hodinách) po intravenózní aplikaci (IV) do organizmu pokusných potkanů. Podávaná dávka obsahovala 1 miligram proteinu na kilogram,(mg/kg) tělesné,hmotnosti. Profily koncentrací
4444
4444
4 444 *4 4 444« · 444 4 44 4 4 4 4 4 4
44444 4 4 «4 444 «4 44 44 4« jsou dvoufázové. Počáteční distribuční fáze byla následována pomalejší eliminační fází. Každý bod grafu reprezentuje průměrnou hodnotu ze tří pokusných zvířat.
Na obrázku 9 jsou znázorněny křivky sérových koncentrací (v nanogramech na mililitr) proteinů o sekvencích SEK. ID.
Č: 1 (plná kolečka), SEK. ID. Č: 3 (prázdné kroužky) a SEK, ID. Č: 5 (plné obdélníčky) v závislosti na čase (v hodinách) po subkutánním podání (SC) proteinu v množství 1 mg/kg do organizmu pokusných potkanů. Každý bod grafu reprezentujeprůměrnou hodnotu ze tří pokusných zvířat. Absorpční fáze je charakterizována zvyšováním sérové koncentrace proteinu. NT3 divokého typu (SEK. ID. Č: l) vykazuje, po dosažení maximální koncentrace, nej rychlejší snížení sérové koncentrace.
Podstata vynálezu
2a účelem stanovení vlivu hodnoty izoelektrického bodu (pí) na farmakokinetické vlastnosti proteinů, byla vytvořena analoga NT-3 a BDNF-faktoru s relativně nižšími hodnotami pi, priceruz u uccnto analog byla zachovana struktura a biologická aktivita proteinů v „nativním stavu (tj. proteinů s přirozeně se vyskytující aminokyselinovou sekvencí, jakož i jejich verzí Met'1 (s methioninem na první pozici); obě tyto verze jsou v přihlášce označovány jako proteiny divokého typu)). Na základě těchto studií bylo zjištěno, žé vytvořená proteinová analoga s nižší hodnotou pí a/nebo nižším nábojem za fyziologických podmínek (vzhledem k molekule divokého typu) setrvávají po injekční aplikaci in vivo v krevním oběhu déle (tj. jejich poločas života je delší) a vykazují zvýšenou absorpci. Ačkoliv je tento vynález ilustrován na příkladech lidského NT-3 a BDNF-faktoru, je jeho použitelnost samozřejmě širší a tento vynález může být vyu5 ·»··
I * · ··«· «4 44 » 4 » « žit u jakéhokoliv kationaktivního proteinu, a zvláště pak u bazických proteinů s hodnotou pí vyšší než 7,0.
Melo by být zřejmé, že termíny „protein a „polypeptid používané v této přihlášce jsou navzájem zaměnitelné a označují jednu a tutéž věc.
Stručně řečeno, tento vynález popisuje substituční, inzerční a deleční analoga kationaktivních terapeutických proteinů a/nebo chemicky modifikované verze zmíněných terapeutických proteinů. 'Tafeo-anaioga—nebo-chemicky-modifiko_vané_ verze zmíněných terapeutických proteinů jsou charakterizovány nižší hodnotou pí a rovněž vykazují, vzhledem k nemodifikovaným proteinům (tj. proteinům s nativní sekvencí) , zvýšenou absorpci a/nebo delší setrvání v krevním oběhu. Proteinová analoga podle vynálezu jsou obvykle lidské terapeutické proteiny, které jsou obyčejně,, ale ne nezbytně, bazické proteiny. Ve výhodném provedení mají tyto proteiny, ve srovnání s nemodifikovanými bazickými proteiny, za fyziologických podmínek nižší náboj.
Vynález popisuje materiály a způsoby pro produkci zmíněných analog rekombinantními technikami (výhodné způsoby pro vtip? nnr!Ί 3 <=> nrnh ί 1 átlí-v nrnti ť ť *· “ J — —-------J C---prdKuicke využiti)· Vynalez ro7 těmto analogům a farmaceutické, přípravky pro použití při léčbě onemocnění nebo patologických stavů, obsahující zmíněná analoga jako biologicky aktivní látky.
Principy popsané ve vynálezu mohou být aplikovány na jakýkoliv kationaktivní protein, u kterého bude mít snížení hodnoty pí (a v některých případech náboje proteinu) za následek posílení biologických vlastností důležitých pro terapeutickou funkci. Takovými vlastnostmi jsou například doba setrvání v krevním oběhu a/nebo absorpce po parenterální aplikaci. Příkladem takových proteinů jsou (výčet není limitující) bazické proteiny jako.například NT-3, BDNF6
9« 99
I «9 «
I 9 999 9 *9 * · 99»» 9 9 999 999 & · 999·· 9 9 >99 99 99 99 99 faktor, růstový a diferenciační faktor makrofágů, jehož nejrůznější známé izoformy vykazují v podstatě stejnou schopnost stimulovat in vivo a ex vivo produkci krevních destiček (v této přihlášce jsou izoformy zmíněného faktoru společně označovány jako „MGDF,) a růstový faktor keratinocytů (KGF). Detailní popisy těchto- faktorů, jejich biologických vlastností a způsobů jejich přípravy a testování jsou popsány v patentových přihláškách: NT-3 je popsán v—přihlášce—PG-T-W0Ri/-0J56-9-;—BDNF^faktor_v_pahentových_přiz:_ hláškách US 5180820, 5229500, 5438121 a 5453361 a v publikované přihlášce PCT WO95/26745; MGDF v publikovaných přihláškách PCT WO95/26745, WO95/21919 a WO95/21920; a KGF v publikované přihlášce PCT W090/08771.
Cílem vynálezu je v podstatě vytvořit jednu nebo více modifikací primární struktury proteinu divokého typu tak, aby byla zachována struktura a biologická aktivita, zmíněného proteinu, ale aby současně došlo ke snížení hodnoty izoelektrického bodu a snížení náboje při fyziologickém pH. Přesný způsob, jehož prostřednictvím jsou tyto modifikace prováděny není podstatný, a k dosažení popisovaných vylepšených vlasti ·* & v 1 I y, Γ1, o Ί rnrr 1
111M. ÍJ 'v žit 1 akvkolΊ'J' vpdnnní k vvše uvedeU _k. v w — —£- — J.
ným změnám. Toliko jako ilustrace je zmíněn postup, který k dosažení požadovaných modifikací využívá cílené mutageneze zahrnující přidání kyselých aminokyselinových zbytků do dané sekvence, a to vložením kyselých aminokyselinových zbytků a/nebo substitucí jiných aminokyselin kyselými aminokyselinovými zbytky a/nebo odstraněním bazických aminokyselin delecí a/nebo jejich nahrazením. Jinou možností, vedoucí k dosažení stejného cíle (tj. snížení hodnoty pí a náboje při zachování struktury a biologické aktivity), je přidání chemických skupin nebo částí molekul na vybraná místa (tj. na aminokyselinové zbytky) v peptidovém řetězci molekuly divokého typu. Specifickým případem je připojení kyseliny φφ φφφφ • v ··· Φ φφ φφ • φ · · · φφφφ • · ··« · · · φ φ · φ • · φ φ φ φ φφφφφ φφφ φφ ΦΦΦ·· φ φ φφφφφ φφ φφ ·· ·· jantarové na vybrané aminokyselinové zbytky v řetězci proteinu.
Nukleové kyseliny kódující analoga proteinů podle vynálezu (tj. polypeptidy lišící se od polypeptidu divokého typu v jednom nebo více aminokyselinových zbytcích) mohou být vytvořeny s využitím cílené mutageneze nebo amplifikací metodou PCR, při níž obsahuje primer (primery) požadovanou bodovou mutaci. Detailní popisy vhodných postupů mutageneze _j.s ou u ve de nyi_vi_publ ikacíchS ambro o k a da1 š í, Mo1 ecu 1 ar— Cl o -ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989; nebo Ausubel a další,
Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, NY, 1994. K přípravě zmíněných nukleových kyselin mohou být rovněž využity postupy chemické syntézy popsané v publikaci Engels a další, Angew. Chem.
Intl. Ed., svazek 28, strany -716 až-734, 1989.
Zmíněné molekuly DNA mohou být použity k expresi analog polypeptidu podle vynálezu v rekombinantních systémech odborníkům dobře známých. Mezi takové způsoby produkce patří (nejenom) způsoby popsané ve výše zmíněných patentových přihláškách pro NT-3,- BDNF-faktor, KGF a MGDF, Jako ilustrace může být zmíněn postup, kdy je nukleotidová sekvence kódující nějaký analog polypeptidu podle vynálezu vložena do * vhodného biologicky funkčního vektoru (například do cirkulárního plazmidu nebo virové DNA) pro expresi ve vhodné hostitelské buňce. Zmíněný-vektor zahrnuje regulační sekvence pro expresi vložené nukleotidové sekvence a je zvolen tak, aby byl funkční v použité hostitelské buňce (tj. tento vektor je kompatibilní s mašinérií hostitelské buňky tak, že může dojít k amplifikaci a/nebo expresi daného genu). Zmíněný polypeptid může být amplifikován/exprimován v kvasinkách, prokaryotické, hmyzí (bakulovirový systém) a/nebo eukaryotické hostitelské buňce. Výběr hostitelské buňky bude, ales8
4944 · · 0 9 · 44 · 4 4 • ♦ »99« ·· 4 4« ·44 *9 «4*Α
44
4 4 4
4 4 4 4
449 494 * 4 9
99 44 poň z části, záviset na tom, má-li být exprimovaný polypeptidový produkt glykosylován. Je-li glykosylace žádoucí, jsou ve výhodném provedení použity kvasinky, hmyzí nebo savčí hostitelské buňky.
Obvykle budou dané vektory, obsahovat sekvenci (tato sekvence je rovněž označována jako „promotor) přiléhající k 5' konci vložené sekvence a další regulační elementy, a rovněž posilovač(-e) transkripce (enhancery), počátek replikace, _terminátor_transkripce_,_kompletní_intronovoLLsekvenci obsahující donorové a akceptorové místo sestřihu, sekvenci signálního peptidu, místo odpovědné za vazbu na ribozomy (RBS), polyadenylační signál, selekční markér a oblast polylinkeru sloužící ke vložení nukleotidové sekvence kódující polypeptid, který má být exprimován.
Sekvence přiléhající k 5' konci vloženého genu může být přirozená sekvence vyskytující se na 5' konci tohoto genu divokého typu nebo:to může být sekvence homologní (tj. ze stejného druhu a/nebo kmene jako hostitelská buňka), heterologní (tj. z druhu a/nebo kmene odlišného od hostitelské buňky), hybridní (tj. kombinace sekvencí z více než jednoho zdroje) nebo synteticky připravená.Z-drojem sekvence přiléhající k 5' konci vloženého genu může být jednobuněčný prokaryotický nebo eukaryotický organizmus, jakýkoliv obratlovec nebo bezobratlý nebo jakákoliv rostlina a to za předpokladu, že tato 5' sekvence je funkční v hostitelské buňce a může být v této hostitelské buňce aktivována.
Počátek replikace je obvykle součástí prokaryotických expresívních vektorů zakoupených komerčně a je nezbytný pro amplifikaci daného vektoru v hostitelské buňce. Amplifikace vektoru na určitý počet kopií může být v některých případech důležitá pro optimální expresi daného polypeptidu. Jestliže zvolený vektor neobsahuje místo počátku replikace, může být ·» 444»·.
• 4 * ·4 • a «a • 4 4 4 • 4 4 4
4*4 444
4 • 4 44 tento element syntetizován chemicky na základě známé sekvence a následně zaligován do daného vektoru.
Terminátor transkripce je obvykle umístěn v oblasti přilehlé ke 3' konci sekvence kódující požadovaný polypeptid a slouží k. ukončení (terminaci) transkripce tohoto polypeptidu. V prokaryotických buňkách je terminátor transkripce obvykle fragment s vysokým obsahem párů C-G následovaný sekvencí poly-T. I když tento element může být snadno nakloňován— z—něgaké kn i hovny ne bo-komerč ně_zakoupen jako součást vektoru, může být rovněž snadno syntetizován s využitím postupů pro syntézu nukleových kyselin popsaných výše.
Selekční markér kóduje protein nezbytný k přežití a růstu hostitelských buněk kultivovaných v selekčním kultivačním médiu. Obvykle využívané geny selekčních markérů kódují proteiny, které (a) propůjčují nositeli rezistenci vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, například vůči ampicilinu, tetracyklinu nebo kanamycinu u prokaryotických hostitelských buněk; (b) komplementují auxotrofní deficience buněk; nebo (c) dodávají životně důležité látky, které nejsou dostupné z komplexních médií. Ve výhodných provedeních jsou jako selekční markéry používány gen pro rezistenci vůči kanamycinu, gen pro rezistenci vůči ampicilinu a gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.
Místo odpovědné za vazbu na ribozomy, obvykle nazývané Shine-Dalgarnova sekvence (pro prokaryonty) nebo Kozákova sekvence (pro eukaryonty), je nezbytné pro iniciaci translace mRNA. Tento element je obvykle umístěn v oblasti přiléhající ke 3' konci promotoru a 5' konci kódující sekvence polypeptidu, který má být exprimován, Shine-Dalgarnova sekvence je různorodá, ale obvykle má velké zastoupení purinových bází (tj. má vysoký obsah A-G). Dosud bylo identifikováno množství Shine-Dalgarnových sekvencí a každá z těchto *♦ ·»4* »» »»44 • 4 4 • · 444 · 4
4 4
44«
I 4 . ·· ·· ’ · · *44· ί J * * 4 4 4 [ · * * ·44 44« ř · · * 4 4 ·· 4» «I sekvencí může být snadno syntetizována s využitím postupů popsaných výše a následně použita v prokaryotickém vektoru.
V případech kdy je žádoucí, aby byl daný polypeptid sekretován z hostitelské buňky, může být ke směrování tohoto polypeptidu ven z hostitelské buňky v níž je syntetizován využita signální sekvence. Obvykle je signální sekvence umístěna v kódující oblasti nukleotidové sekvence nebo přímo na 5' konci kódující oblasti. Dosud bylo identifikováno Tnnořství—si-gná-l-ních—sekvencí—a-jj-akákol-iv— z—těch to-sek věnci_ může být využita (v této přihlášce) v hostitelských buňkách za předpokladu, že je v těchto hostitelských buňkách funkční. Vzhledem k danému polypeptidu může být signální sekvence homologní nebo heterologní. Signální sekvence může být navíc syntetizována chemickou cestou s využitím postupů uvedených v předchozím textu.
Hostitelskými buňkami mohou být prokaryotické hostitelské buňky (jako'například E. coli) nebo eukaryotické'hostitelské buňky (jako například kvasinky, hmyzí buňky nebo buňky obratlovců). Jsou-li hostitelské buňky kultivovány za vhodných nutričních podmínek, mohou tyto buňky syntetizovat požadovaný polypeptid, který může být následně shromažďován z kultivačního média (jestliže je tento protein sekretován do média) nebo přímo z produkujících hostitelských buněk (není-li sekretován). Následně může být tento polypeptid purifikován s využitím metod zahrnujících například gelovou chromatografii, afinitní chromatografii a podobně. Obecně lze říci, že jestliže je daný polypeptid exprimován v E. coli., bude tento protein po izolaci obsahovat na Nkonci methioninový zbytek (tj. Met’1). Výjimkou je situace, kde je polypeptid exprimován v takovém kmenu E. coli, ve kterém je N-koncový methionin hostitelskou buňkou enzymaticky odštěpen.
•4 «444
Vhodnými hostitelskými buňkami nebo buněčnými liniemi jsou rovněžsavčí buňky, jako například buňky křečcích ovarií (CHO) nebo buňky 3T3. V současnosti jsou dobře známe způsoby transformace, kultivace, amplifikace, screeningu (testování) a produkce a purifikace požadovaného produktu, jakož i výběr vhodných savčích hostitelských buněk. Jinými vhodnými savčími buněčnými liniemi jsou opičí buněčné linie COS-1 a COS-7 a buněčná linie CV-1. Dalšími příklady savčích hostitelských buněk jsou buněčné linie odvozené z primátů a buněčné linie z hlodavců, včetně transformovaných buněčných linií. Rovněž jsou vhodné normální diploidní buňky, buňky odvozené z primárních tkání kultivovaných in vitro a rovněž primární explantáty. Vhodné buňky mohou být genotypově deficientní a tato deficience může být využita jako selekční markér. Jako selekční markér může být rovněž- využit dominantní gen. Mezi další vhodné hostitelské savčí buňky patří (výčet není limitující) 'buňky HéLa, myší buňky L-929, linie 3T3 odvozené z myší Swiss, Balb-c nebo ΝΊΗ a křeččí buněčné linie BHK nebo HaK.
Inzerce (rovněž označována termínem „transformace nebo „transfekce) příslušného vektoru do zvolené hostitelské buňky může být provedena s využitím chloridu vápenatého, elektroporací, mikróinjekcí, lipofekcí nebo metodou využívající DEAE-dextran. Zvolený Způsob inzerce vektoru bude z části záviset na typu použité hostitelské buňky. Zmíněné metody a rovněž jiné vhodné metody transformace jsou odborníkům dobře známé a jsou popsány například v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989.
Hostitelské buňky nesoucí příslušný vektor můžou být kultivovány ve standardních médiích odborníkům dobře známých. Tato média budou obvykle obsahovat všechny nutriční složky nezbytné k růstu a přežívání buněk. Vhodnými médii ··» pro kultivaci buněk E. coli jsou například Luria Broth (LB) a/nebo Terrific Broth (TB). Vhodnými médii pro kultivaci eukaryotických buněk jsou RPMI 1640, MEM a DMEM; v závislosti na druhu kultivované buněčné linie mohou být všechna tato média doplněna sérem a/nebo růstovými faktory.. Vhodným médiem pro kultivaci hmyzích buněk je Graceho médium doplněné (je-li to nezbytné) Yeastolatem, hydrolyzátem laktalbuminu a/nebo fetálním telecím sérem.
-Gbvyklej-e—;j ako—š up le ment—při- dáváno-do-mé di a—rovn ěŽ-nĚU— jaké antibiotikum nebo jiná sloučenina použitelná pro selektivní růst transformovaných buněk. Použití zmíněné sloučeniny bude záviset na povaze selekčního markéru přítomného na plazmidu, kterým byla příslušná hostitelská buňka transformována, Je-li například jako selekční markér použit gen kódující rezistenci vůči kanamycinu, bude takovou sloučeninou přidanou do média právě kanamycin.
Množství pólypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou může být stanoveno pomocí standardních metod v současnosti známých. Takovými metodami jsou například (výčet není limitující) analýza metodou Western blot, elektroforéza na SDSpclyakrylamidovém gelu, dělení s využitím HPLC, imunoprecipitace a/nebo stanovení aktivity jako například „DNA-binding gel shíft assay (pozn. jedná se o stanovení založené na rozdílných pohyblivostech samotných molekul DNA a molekul DNA s navázanými proteiny, kde je toto stanovení prováděno elektroforézou v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu).
Je-li polypeptid navržen tak, aby byl sekretován ven z hostitelské buňky, bude se většina tohoto pólypeptidu pravděpodobně nacházet v kultivačním médiu. Nicméně, není-li daný polypeptid sekretován, bude tento přítomen v cytoplazmě (u eukaryotických hostitelských buněk, Gram-pozitivních baktérií a hmyzích hostitelských buněk) nebo v periplazme (u Gram-negativních.bakteriálních hostitelských buněk).
·* ···· *· «·*· ·· ···· ·* · , s s . · · · ’ · ·
I ···· · · · · · · · · a » » · ·· ······ * *»·· · · · ··· ·· «· ·· ··
Při produkci intracelulárních peptidů jsou hostitelské buňky obvykle nejprve rozrušeny mechanicky nebo osmotickým šokem, čímž je obsah cytoplazmy uvolněn do pufrovaného roztoku. Následně je polypeptid z tohoto roztoku izolován. Následná, purifikace polypeptidu z roztoku může být provedena různými způsoby. Jestliže byl polypeptid syntetizován tak, že má na svém C-konci nebo N-konci umístěnu nějakou kotvu, jako například hexahistidin nebo jiný malý polypeptid, může být^tento purifikován v jednom-kroku Tato jednokroková_ purifikace je provedena tak, že je roztok obsahující zmíněný polypeptid nanesen na afinitní kolonu naplněnou nosičem, který má vysokou afinitu vůči použité kotvě nebo přímo vůči polypeptidu (tj. monoklonální protilátka). Polyhistidin se například se specificky s velkou afinitou váže na nikl a pro purifikaci může být tedy využita afinitní kolona s ionty niklu (jako například afinitní kolony s navázanými ionty niklu od firmy Qiagen); viz.: například Ausubel. a další, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, NY, 1994.
Na druhé straně, jestliže k danému polypeptidu není připojena Žádná kotva a rovněž nejsou dostupné žádné protilátky, mohou být pří purifikaci využity jiné dobře známé postupy. Mezí takové postupy patří (výčet není limitující) chromatografie na iontoměničích, gelová chromatografie, HPLC, gelová elektroforéza proteinů v nativním, stavu v kombinaci s následnou elucí z gelu a preparativní izoelektrická fokusace (přístroj/metoda Isoprime, Hoefer Scientific).
V některých případech mohou být za účelem dosažení vyšší čistoty použity dvě nebo více z výše uvedených purifikačních technik.
Předpokládá-li se, že daný polypeptid se bude primárně nalézat v periplazmatickém prostoru baktérií nebo cytoplazme eukaryotických buněk, múze být obsah periplazmy nebo cyto14
»»« • « ·· · · plazmy, včetně inkluzních tělísek (například u Gramnegativních baktérii, vytváří-li zmíněný polypeptid takové komplexy) hostitelských buněk extrahován s využitím jakéhokoliv standardního postupu odborníkům známého. Hostitelské buňky mohou být například lyžovány (aby došlo k uvolnění obsahu periplazmy) s využitím French pressu, homogenizací a/nebo sonikací. Získaný homogenát je následně centrifugován.
-Mimo—přípravy—polypeptidových analog podlevynálezure-^kombinantními technikami mohou být tyto polypeptidy připraveny s využitím metod chemické syntézy v současnosti známých (jako například syntéza peptidů na pevné fázi), včetně postupů popsaných v publikacích Merrifield a další, J. Am.
Chem. Soc., svazek 85, strana 2149, 1964; Houghten a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, svazek 82, strana 5132, 1985; a Stewart a Young v Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984. Aby došlo k vytvoření disulfidických můstků, mohou být polypeptidy připravené chemickou syntézou oxidovány s využitím postupů popsaných ve výše uvedených publikacích.
Hodnoty pí a náboj proteinových analog připravených jakoukoliv z výše uvedených metod mohou být měřeny pomocí standardních technik jako například pomocí technik popsaných v dalším textu ve spojení s příklady provedení vynálezu.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají polypeptidy chemicky modifikované (tj . deriváty) tak, že zmíněný polypeptid je· připojen k nějakému polymeru, čímž dojde k ovlivnění vlastností tohoto polypeptidu. Použitý polymer je obvykle rozpustný ve vodě, aby protein, ke kterému je tento polymer připojen, neprecipitoval ve vodném prostředí, jako například ve fyziologickém prostředí. Aby mohl být řízen stupeň polymerizace, může mít zmíněný polymer jednu reaktivní skupinu, jako například aktivní_es,ter (pro acylační reakci) nebo • · « · · « ♦ · · • » · > fl · · · · · · · * aldehyd {pro alkylaci). Výhodně používaným reaktivním aldehydem je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je stabilní ve vodném prostředí, nebo jeho mono Cl až CIO alkyloxy- nebo aryloxy-deriváty (viz. patentová přihláška US 5252714). Zmíněný polymer může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Ve výhodném provedení bude, kvůli terapeutickému využití připraveného koncového produktu, zmíněný polymer farmaceuticky přijatelný. Polymer rozpustný ve vodě nebo, je-li to Žádou-eír-smě s—t akovýc h po1ymerů, mů ž e bý t vyb r án z e—s kup i ny_z shrnující například polyethylenglykol (PEG), monomethoxypolyethylenglykol, dextran, celulózu nebo jiné polymery na bázi cukrů, póly(N-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, homopolymery propylenglykolu, kopolymer polypropylenoxid/ethylénoxid, polyoxyethylované polyoly (například glycerol) a polyvinylalkohol.
Obecně lze říci, že polypeptidová analoga podle vynálezu budou použitelná pro stejné účely jako proteiny divokého' typu, ze kterých jsou tato analoga odvozena. U NT-3 například probíhá klinická studie mapující jeho využitelnost při léčbě neuropatií periferních nervů (včetně diabetické neuropatis) a u 2DNF-faktoru je prováděna klinická studie posuzující možnosti léčby amyotrofické laterální sklerózy (ALS). 0 KGF-faktoru je známo, že je aktivní při růstu tkání a obnově poškozených tkání, a v současné době probíhá v klinické praxi snaha vyvinout způsob využití zmíněného faktoru při léčbě zánětů sliznice navozených chemoterapií nebo působením ionizujícího záření. U MGDF (ve formě s navázaným polyethylenglykolem) probíhají klinické studie týkající se stimulace tvorby krevních destiček při trombocytopenii (nedostatku krevních destiček) vyvolané působením chemoterapeutických látek. Předpokládá se nicméně, že analoga podle vynálezu budou, vzhledem k nemodifikovaným formám, výhodnější, a to • 44 · · 4 4 * * · ·«·«« · · · 4 · · · »4 444» ·· ··· ··· • 4 ««444 4 4
444 4 4 *4 4 · * · v důsledku jejich delšího terapeutického poločasu života a vyšší absorpce.
Pro terapeutické účely budou analoga podle vynálezu formulována do formy vhodných farmaceutických přípravků upravených pro terapeutickou aplikaci. Tato skutečnost rovněž spadá do rozsahu vynálezu. Zmíněné farmaceutické přípravky budou obvykle obsahovat terapeuticky účinné množství polypeptidového analoga a to buď samostatně nebo spolu s jednou-nebo—více pornocnými_látkami, nosiči nebo jinými_ přídavky používanými standardně při formulaci farmaceutických přípravků. Jako vehikulum (nosič) může být použita voda pro injekce, která je ve výhodném provedení doplněna jinými látkami obvykle používanými při aplikaci do organizmu savců. Analog polypeptidu bude obvykle podáván ve formě přípravku obsahujícího purifikovanou formu zmíněného polypeptidu (která může být chemicky modifikována) spolu s jedním nebo více fyziologicky přijatelnými vehikuly, pomocnými látkami nebo rozpouštědly. Příkladem vhodných vehikul jsou fyziologický roztok o neutrálním pH nebo fyziologický roztok se sérovým albuminem. Je-li to žádoucí, mohou být použita jiná standardní vehikula, pomocné látky nebo rozpouštěd.la,
Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být připraveny pro uskladnění smícháním vybrané látky (směsi látek) o požadovaném stupni čistoty s fyziologicky přijatelnými vehikuly, pomocnými, látkami nebo stabilizátory (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Company, editor A. R. Gennaro, 1990) ve formě lyofilizátu nebo vodného roztoku. Vhodná vehikula, pomocné látky a stabilizátory jsou pro organizmus příjemce netoxické a ve výhodném provedení jsou v použitých dávkách a koncentracích inertní a zahrnují: tlumivé roztoky jako například soli fosforečnanu, citrátu, acetátu, sukcinátu a jiných organických kyselin; antioxidanty jako například kyselinu askorbovou; polypeptidy • 4 «4 4 4 · 4 4
4 4 4 4 4 · » 4 · · 4
4 444 · ·· 444444
44444 · 4
444 44 «4 44 44 o nízké molekulové hmotnosti; proteiny jako například sérový albumin, želatinu nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery jako například polyvinylpyrrolídon; aminokyseliny jako například glycin, glutamin, asparagin, arginin a lysin,· monosacharidy, disacharidy a jiné karbohydráty včetně glukózy, manózy nebo dextrinů; alkoholické cukry jako například manitol nebo sorbitol; opačně nabité ionty tvořící soli jako například ionty sodné; a/nebo neionogenní povrchově aktivní Játkyij.akO-napříkladurween.f—Bluroiiie.-nebo—polyethyJLenglykoL(PEG).
Jakýkoliv přípravek podle vynálezu pro aplikaci in vivo musí být sterilní. Sterilizace je snadno prováděna filtrací přes sterilní filtrační membrány. Jestliže je přípravek lyofilizován, je sterilizace prováděná výše zmíněnými postupy uskutečňována před nebo až po lyofilizaci a rekonstituci. Přípravek pro parenterální aplikaci bude obvykle uskladněn v lyofilizované formě nebo ve formě roztoku.
Množství polypeptidu, které bude účinné při léčbě daného onemocnění nebo patologického stavu, bude záviset na chemické podstatě tohoto polypeptidu a rovněž na věku a celkovém zdravotním stavu příjemce. Toto množství může být stanoveno standardními klinickými metodami. Je-li to možné, bude, před vlastním testováním na lidech, žádoucí stanovit křivku odpovědi na podanou dávku farmaceutického přípravku nejprve in vitro a následně na vhodném živočišném modelu in vivo. Obecně lze říci, že vhodná množství používaná in vivo mohou být odvozena ze známých terapeuticky účinných dávek proteinů divokého typu, ze kterých jsou příslušná analoga odvozena. Zkušený lékař bude schopen, vezme-li do úvahy kontext léčby, druh léčeného onemocnění atp., stanovit vhodné dávkování bez vynaložení nepřiměřeného úsilí.
Způsoby aplikace přípravku zahrnuji aplikaci intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní a • ♦ * ·' · « · · · « • * * • · « *« • « · «· ·» • · ♦ · * · * · « v · · · · • · • · · · subkutánní. Do rozsahu vynálezu navíc spadají polypeptidová analoga aplikovaná prostřednictvím lipozomů, mikročástic nebo mikrotobolek; tento druh aplikace je zvláště výhodný pro dosažení prodlouženého uvolňování.
V případech použití některých polypeptidových analog jako například analog NT-3, BDNF-faktoru a jiných neurotrofických faktorů určených k léčbě neurologických stavů spojených s mozkem nebo jinými oblastmi centrálního nervového systému, může—být—nezbybné-použ-i-fe-í— speciálních aplikačních 2ařízer.í— Mezi taková zařízení například patří implantáty a osmotické pumpy pro intrathekální a intrakraniální podávání:
Analoga podle vynálezu mohou být využita při standardních postupech sloužících k produkci protilátek použitelných pro lékařské účely jako například sledování hladiny odpovídajícího analoga v krvi pacienta podstupujícího léčbu.
K produkci polyklonálních protilátek rozpoznávajících epitopy daných polypeptidů mohou být využity nejrůznější postupy v současnosti známé. Za účelem produkce protilátky mohou být imunizováni (injekcí polypeptidového analoga nebo jeho fragmentu nebo derivátu) různí živočišní hostitelé včetně (nejenom) králíků, myší, potkanů atd. V závislosti na druhu hostitele mohou být, za účelem zvýšení imunologické reakce hostitele, použita nej různější adjuvans včetně (nejenom) Freundova adjuvans, minerálních gelů jako například hydroxidu hlinitého (alum), povrchově aktivních látek jako například lysolecithinu, polyolů Pluronic, polyaniontů, peptidů, emulzí olejů, hemocyaninů z druhu Megathura crenulata, dinitrofenolu a adjuvans používaných v humánní medicíně jako například Calmetteho-Guerinova bacilu a Corynebacterium parvum.
K přípravě monoklonálních protilátek namířených proti polypeptidovým analogům mohou být použity jakékoliv postupy vedoucí k molekulám protilátek produkovaných kontinuálními
» · · • · ·
buněčnými liniemi v buněčných kulturách. Vhodnými postupy pro produkci monoklonálních protilátek jsou například příprava hybridomú původně vyvinutá Kohlerem a Milsteinem a popsaná v článku Nátuře, svazek 256, strany 495 až 497,
1975; příprava triomů, příprava hybridomú lidských B-buněk popsaná v publikaci Kozbor a další, Immunology Today, svazek 4, strana 72, 1983; příprava EBV-hybridomů produkujících monoklonální protilátky popsaná v publikaci Cole a další,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,.Alan R.—L-iss-,lne., strany 77 až 96, 1985.
Klon protilátky namířené proti epitopu nebo epitopům daného polypeptidu může být připraven s využitím známých postupů. K vytvoření nukleotidových sekvencí kódujících molekulu monoklonální protilátky nebo její oblasti vážící antigen je zvláště výhodné využití rekombinantní ch technik; viz;, například Maniatis a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982.
Protilátky jsou užitečné pro diagnózu prováděnou jak in vivo tak in vitro, zvláště pak jsou-li tyto protilátky znaJí A Λ w Λ R I X í* -r -r—t ^-1 Á 1* J Λ ! & 4 ΛΙΎ1Υ1 O +
L.C11C CL pUUó X V CU.J.C n. «uXCÍ J. i o ti <7Vn νχι'Άΐ irr^dZiTťl- π ζ*1ιοι άγο vzorcích tekutin a tkání.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je dále detailně popsán s odkazem na následující materiál, metody, postupy a výsledky experimentů. Aminokyselinové zbytky proteinů jsou v textu označovány obvyklým způsobem za použití třípísmenných zkratek (například „met zastupuje methionin, „val valin atp.) nebo v některých případech za použití zavedených jednopísmenných zkratek (například „M zastupuje methionin, „R arginin atp.)._____ «»» 4 · * 4 · · ·
4 ·«· 4 4 4 · 4 4 4 •4 4444 4» 444 ·44
44444 · 4
4 44 4 4· ·4 · · 44
Materiál a metody:
Příprava analog NT-3
Substituované aminokyselinové zbytky z nativní sekvence lidského NT-3 byly vybrány s cílem zachovat základní strukturu, a biologickou/terapeutickou aktivitu (viz. Holland a další, J. Mol. Biol., svazek 239, strany 385 až 400, 1994; Ibanez a další, Cell, svazek 69, strany 329 až 341, 1992; -Tbane-2^a-da-l-š-ÍT—EMBO-Journa-l-^svazok—T2-,—strany—2281_až2293, 1993). Skutečně provedené substituce v nativní sekvenci lidského NT-3 jsou znázorněny na obrázcích 2 a 3.
U. analoga znázorněného na obrázku 2 byly provedeny následující dvě substituce: arginin v poloze 61 (arg61) byl nahrazen alaninem (ala) a lysin v pozici 64 (lyse4) byl nahrazen kyselinou asparágovou. Tento analog byl označen „NT-3(ih9)R61A,K64D. U druhého analoga znázorněného na obrázku 3 byly provedeny stejné substituce aminokyselin jako u analoga prvního a navíc byl polypeptidový řetězec ukončen za aminokyselinovým zbytkem 117 (tudíž došlo k odstranění aminokyselin argn8 a thr119) . Tento analog byl označen „NT-3(i117)RS1A, K64D. Za účelem vytvoření zmíněných analog byly do sekvence lidského NT-3 zavedeny pomocí polymerázové řetězcové reakce (PCR) odpovídající mutace. U analoga NT-3(in9)R61A,K64D byly použity páry chemicky syntetizovaných oligonukleotidů a s jejich využitím byly vytvořeny fragmenty genu NT-3 zahrnující (1) počáteční oblast až do místa mutací v kodonech odpovídajících pozicím aminokyselin 61 a 64 a (2) koncovou oblast zmíněného genu od místa mutací aŽ do konce sekvence. K vytvoření celé molekuly nukleové kyseliny kódující obě mutace v pozicích 61 a 64 byla provedena druhá reakce PCR, která sloučila počáteční a koncovou oblast připravené dříve. U analoga NT-3d-u7)R61A,K64D byl zopakován výše zmíněný.postup s výjimkou toho, že z koncové oblasti «φφφφ φφ φ φ · · φ φφ φφφφ φφ φφφ ··« φφ φφφφφ φ φ φφ φφφ φφ φφ φφ ·* byly vypuštěny kodony pro arginin a threonin v pozicích 118 a 119.
Exprese v E. coli
Z účelem exprese zmíněných analog v E. coli byla na 5 konec DNA molekul připravených postupem popsaným výše zavedena sekvence kódující methionin a na 3' konec pak stop kodon. Navíc byla ve vhodné vzdálenosti proti směru transkripce od místa startovního methioninu umístěna sekvence_ odpovědná za vazbu na ribozom a na 5' a 3' konce byla genu zavedena místa rozpoznávaná restrikčními enzymy Xbal (5' konec) a HindlII (3' konec). Vzniklé synteticky připravené fragmenty genů byly na 5' konci hraničeny restrikčním místem Xbal a na 3' konci restrikčním místem HindlII, obsahovaly místo odpovědné za vazbu na ribozomy, startovní kodon ATG (kódující methionin), sekvenci kódující příslušný analog a stop kodon. Fragmenty byly štěpeny restrikčními endonukleázami Ndel a BamHI a zaligovány do vektoru pAMG12.
Expresívní plazmid pAMG12 může být odvozen z plazmidu pCFMl656 (přístupové číslo ATCC 69576, uložený 24. února
Ί O O 71 τολΙ τ* τη γππγ\γ7Ο+-ιτί mí ·Ρ Ί 7^ Virgin *7 3 ΓΠΖ&ΤΊ
V iiluvíj »— V í -J v i ~ Ci 4, JL uskutečněných substitucí sekvence DNA a mutagenezí metodou PCR s využitím překrývajících se oligonukleotidů. Od restrikčního místa BglII (pár baží ě. 180), nacházejícího se na 5' konci počátku replikace PcopB plazmidu pCFM1656, byly, ve směru k replikačním genům plazmidu, provedeny následující záměny párů baží (bp):
4*4 · · 4 4 · · · • 4 4 4 · * · · »444
4 44» · · 4 444 44 4
4 4 «*· * ·
4* 444 4* 44 *4 *4
pár baží číslo (v pAMG12) pár baží V pCFM1656 pár baží zaměněn za (v pAMG12)
204 T/A C/G
428 G/C
509 G/C á/t-
617 - - inzerce dvou párů baží G/C
6 zy G/C T/A
980 T/A C/G
994 g7č A/T
1004 A/T c7g
1007 C/G T/A
1028 A/T T/A
1047 C/G T/A
1178 G/Č T/A
1466 G/C T/A
2028 delece páru baží
2187 č7g ť7á
2480 A/T T/A
2499 - 2502 AGTG.......... TCAC .......GTCA-------------- CAGT
2642 TCCGAGC AGGGTCG delece párů baží
3435 G/C . A/T
3446 G/C A/T
3643 Á7Ť
Navíc sekvence DNA nacházející se mezi jedinečnými restrikčními místy AatlI (pozice 4364 v plazmidů pCFM1656) a • · • ··· * · «
• ·
··
Sadí (pozice 4585 v plazmidu pCFM1656) byla nahrazena následující sekvencí DNA:
[kohézní konec AatlI] ‘ CGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA3 ' GCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT- TAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG -ATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC-ACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG- TGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC -CCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAG-GGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC-CCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAT-CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTAAatlI
- AC ATTC ÁAAT AT.GG ACGTCTC AT AATTTTT AAAAAATTC ATTTGACAAATGCT AAAATTC - tgtaagtttátacctgcagagtattaaaaattttttaac-taaactGtttacgattttaag -TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGAGT- AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA -TTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGT-AAATTGAAAATCTTCCTCCTTAŤTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCASacII-GTCGACCTGCAGGGTACCATGGÁAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAG-CAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTC-AAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA-TTCTTTCGGGCŤTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATT-CCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTT- GGGG AAC C CCGGAGATTTGC CCAGAACTCCC C AAA AAACG ACTTTC GTCCTTGGCGAGAA-CACGCTCTTCACGC 3'
-GTGCGAGAAGTG 5' [kohézní konec SacII]
Produktem ligační reakce byly transformovány kompetentní buňky E. coli kmene FM15. U narostlých kolonií byla testová24
4444 ·4 ·♦·♦ »· ·♦
4* 4* 4 4 4 4 4 ····· · 4 4 4 · · 4
444* 4 4 44· ··*
44444 4 4
444 44 44 44 44 na produkce rekombinantního proteinu a u kolonií produkujících protein o správné velikosti byla stanovena sekvence DNA vloženého genu. Kmen nesoucí „správný gen byla zaočkován do kultivačního média Luria Broth (10 g/1 Trypticase-Pepton, 10 g/1 kvasničný autolyzát, 5 g/1 chlorid sodný) a kultivace probíhala 16 hodin při 37°C za stálého míchání o intenzitě 250 otáček za minutu. Takto získaná kultura byla přenesena do sterilního média (sterilizováno přímo ve fermentoru) a za stálého—pří sunu-glukózy^a-organického-dusíku—byly—buňkynamnoženy a následně indukovány prostřednictvím laktózy. Po indukci byla fermentace zastavena, buňky byly centrifugovány, supernatant po centrifugací odstraněn a zbylá buněčná pasta zamražena.
Purifikace proteinu
Buňky z buněčné pasty byly rozbity homogenizací při vysokém tlaku a inkluzní tělíska byla izolována centrifugací. Takto získaná inkluzní tělíska byla rozpuštěna v roztoku guanidin-HCl a následně zředěna do roztoku močoviny. Po několikadenním stání bylo pH roztoku upraveno na hodnotu 3, hvl ron i- -rí -Fi ΐΛτΓλΤ7·£·η a τη i v *i f *i Ir ran no*inrve chromatografii na katexové koloně a poté chromatografii na hydrofobní koloně. Frakce obsahující požadovaný protein byly spojeny a sterilovány filtrací.
Izoelektrický bod.a náboj proteinu .
Hodnoty izoelektrických bodů lidského NT-3 divokého typu (r-metHuNT-3, SEK. ID. Č: 1) a jeho analog (tj. SEK. ID. Č:
a SEK. ID. Č: 5) byly spočítány s využitím softwarového balíku pro sekvenční analýzu proteinů/DNA označovaného „CGC od společnosti Genetics Computer Group, lne., Madison, Wisconsin. Náboj zmíněných molekul při fyziologickém pH (předpokládá se hodnota pH .,7,4) byl odhadnut, s využitím stejného
9444 44 ·*·» ·* 4» • 9 · «4 4 444«
44444 44 4 4444
4* 449* 49444 944
44444 4 4 • 4 44« 4» «4 44 44 programového balíku. Hodnota pí prvního analoga (NT-3(1. 119)R61A, K64D, SEK. ID. Č: 3) byla spočítána na hodnotu o přibližně 0,9 jednotek pH nižší než je tomu u NT-3 divokého typu (8,5 ve srovnání s 9,4). Náboj pro tento analog při fyziologickém pH (7,4) byl snížen o přibližně 2,5 jednotky pH vzhledem k NT-3 divokého typu (tj . přibližně z hodnoty +7 na hodnotu +4,5). Vypočítaná hodnota pí druhého analoga (NT3 (1-117)R61A, K64D, SEK. ID. Č: 5) byla 8,2, což bylo o při-bl-ižně—1-,-2—jednotek—pH—méně—než-je—hodnota—pI-NT^3—divokéhotypu (9,4). Náboj pro tento (druhý) analog pří fyziologickém pH (7,4) byl snížen o přibližně 3,5 jednotky pH (na hodnotu přibližně +3,5) vzhledem k hodnotě pro NT-3 divokého typu (+7) .
Stanovení metodou ELISA
Stanovení metodou ELISA bylo prováděna na 96-ti jamkových destičkách pokrytých monoklonální protilátkou proti .. lidskému NT-3. Jako sekundární protilátka byla použita králičí polyklonální protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou. Před vlastním stanovením byly vzorky séra, kalibrační standardy a vzorky pro ověření kvality zředěny fosfátovým pufrem a před stanovením obsahovaly přibližně 50% séra.
Objem použitých vzorků byl 100 mikrolitrů (μ1) na jednu jamku. Každý vzorek byl analyzován ve dvou paralelních stanoveních. Mezní limity pro kvantifikaci byly 0,65 ng/ml (NT.3 divokého typu), 4,00 ng/ml (NT-3(i-n9)R61A,K64D) a 4,05 ng/ml (NT-3 (1.117)R61A,K64D) .
Gelová chromatografie (SEC-HPLC)
Gelová chromatografie každého vzorku byla provedena s využitím systému Waters 600 spolu s. kolonou G2000SWXL (TosoHaas). Vzorky byly eluovány při průtoku 0,7 mililitrů za minutu (ml/min) pufrem o složení 100 mM fosforečnan sod26 ««4 44 4 ι*44
44444 44 4 »444
4 444 4 « « *14444
44444 4 4
4*4 44 44 14 1» ný, 0,5 M NaCl, pH 6,09. Píky byly detekovány při vlnové délce 230 nanometrů (nm).
Chromatografie na katexu (CEX-HPLC)
Chromatografie na katexu byla provedena s využitím systému Waters 625 spolu s kolonou Resource S (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Vzorky byly eluovány při průtoku 1 mililitr za minutu gradientem chloridu sodného od 0 do 1 M v pufru obsahujícím 20 mM Tris-HCl, pH 8,5.—Píky—byly—detekovány—při vlnové délce 220 nanometrů (nm).
SDS-PAGE barvená stříbrem
Proteiny byly naředěny roztokem 2% SDS, smíchány se vzorkovým pufrem a po dobu pěti minut zahřívány ve vroucí vodě. Vlastní elektroforetické dělení bylo prováděno postupem doporučeným výrobcem za použití prefabrikovaných gradientových gelů TRIS-Tricin, 10 až 20%, zakoupených od společnosti ISS (Integrated Separation Systems, Natick, MA). Barvení stříbrem bylo prováděno postupem popsaným v publikaci Blum a další, Electrophoresis, svazek 8, strany 93 až 99,
Biologické stanovení mitogenní aktivity s využitím buněk 3T3trkC
Biologická aktivita r-metHuNT-3 jako referenčního standardu je stanovována prostřednictvím biostanovení mitogenní aktivity s využitím buněk 3T3trkC. Tyto buňky jsou získány transfekcí buněk 3T3 (ATCC), které normálně na svém povrchu neexprimují receptor trkC, plazmidem pcDNAl/neo (Invitrogen, San Diego, CA) modifikovaným tak, že obsahuje sekvenci kódující lidský receptorový protein trkC. Sekvence genu trkC je popsána v publikaci Shelton a další, Journal of Neuroscience, svazek 15, strany 477 až 491, 1995; a příklad φφφ Φ φ ΦΦΦΦ· • * φ φφ φ · » · φ · φ • φ φφφ· · φ φφφ φφφ φφ «φφφφ φ φ φφ φφφ φφ φφ φ» φφ provedení transfekce je popsán v publikaci Valenzuela a další, Neuron, svazek 10, strany 963 až 974, 1993. Transfekované buňky jsou kultivovány při teplotě 37 + 2°C v inkubátoru s vysokou vlhkostí v atmosféře obsahující 5,5 + 1,0% CO2 v Dulbeccově minimálním médiu doplněném fetálním bovinním sérem a G-418 se síranovým aniontem. Při každém stanovení byly buňky rozděleny na 96-ti jamkové destičky. Po přibližně 24 hodinové inkubaci za stejných podmínek bylo -k-u-itřvační— médium-nahrazeno-médienuRPMI—leAO-a-k-buňkánubyXypřidány testované vzorky. V médiu RPMI 1640 byly v různých koncentracích připraveny standardní a testované vzorky rmetHuNT-3 a získaná směs byla přidána do příslušných jamek. Destičky pro tkáňové kultury byly umístěny zpět do inkubátoru a přibližně po 24 hodinách byl počet živých buněk stanoven barvením solí 3 -(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)2H tetrazolu, sloučeninou tétrážolu (MTS). Následně byly-destičky pro tkáňové, kultury umístěny zpět do inkubátoru a po uplynutí přibližně 5 hodin byla v každé jamce měřena optická hustota při vlnové délce 490 nm. Byla vytvořena standardní křivka závislosti optické hustoty na dávce přidaného pólypeptidu a lineární úsek této standardní křivky byl podroben lineární regresní analýze. Poté byly stanoveny koncentrace testovaných vzorků u ředění, jejichž naměřená optická hustota spadá do lineárního úseku standardní křivky.
Biologické testování in vivo
Vliv aminokyselinových záměn na biologické vlastnosti molekul byl stanovován in vivo na samcích potkanů Sprague Dawley v křížovém experimentu. Přesněji řečeno, devět pokusných zvířat bylo rozděleno do tří skupin po třech a každému potkanu ze skupiny byla aplikována dávka 1 miligram na kilogram tělesné hmotnosti (mg/kg) bud' pólypeptidu NT-3 divokého • * ··· * * * · · · · • « · · · u· «· *···♦· » « · · · · · · ·· 999 *· ·» ·· ·· typu (3 potkani), NT-3 (1.lig)R61A, K64D (jiní 3 potkani) nebo NT-3(i.h7)R61A,K64D (zbylí 3 potkani). Testovaný materiál byl aplikován buď (1) intravenózně (IV) jako první dávka a následně subkutánně (SC) 24 hodin po první dávce; nebo (2) v obráceném pořadí. Vzorky krve byly odebírány před podáním a v časech 1, 5, 15 a 30 minut a 1, 2, 4 a .8 hodin po intravenózní aplikaci. Koncentrace NT-3 v krevním séru byly stanovovány metodou ELISA (viz. výše). Protilátky použité při .s.t a nove n í ch_s 1 ou ž i ly^k e_k va ntifikaci NT-3 divokého typu._
Ačkoliv nebyly podmínky experimentu plně optimalizovány, vykazovaly zmíněné protilátky dostatečnou křížovou reaktivitu s NT-3 {1.119)R61A, K64D a NT-3 (1-1i7)R61A, K64D, čímž byla umožněna rovněž kvantifikace těchto analog. Pro jednotlivé proteiny byly vytvořeny standardní křivky (viz. obrázek 4).
Výsledky testů:
Charakterizace analog polypeptidu NT-3
Při biostanovení prováděném in vitro na buňkách PC-12 bylo pozorováno, že si obě analoga (jak s NT-3 (i-n9)R61A, K64D tak NT-3(1.117!R61A,K64D) zachovávají aktivitu proteinu NT-3 divokého typu (r-metHuNT-3) (tabulka 1). Ve skutečnosti se zdá, že biologická aktivita zmíněných analog (jak byla naměřena při tomto stanovení) je poněkud vyšší než aktivita NT-3 divokého typu, což snad naznačuje jejich zvýšenou afinitu vůči.receptoru trkC (receptor pro NT-3).
• ·
Tabulka 1. Biologická aktivita proteinů NT-3 stanovovaná in vitro
4' Analog NT-3 Aplikovaná koncentrace (mg/ml) Naměřená koncentrace (mg/ml) Očekávaná aktivita (v procentech)
NT-3 divokého typu 0,32 0,23 72
h ........... NT-3u....... 117)R61A, K64D 0,36 1,18 328
NT-3(1. 119)R61A, K64D 0,25 1,31 524
Obě analoga byla při gelové vylučovací chromatografii v provedení HPLC eluována jako nekovalentně spojené dimery, stejně jako NT-3 divokého typu (viz. obrázek 5). Jak se předpokládalo, v molekulových hmotnostech jednotlivých proteinů nebyl pozorován žádný podstatný rozdíl. U žádného' z analog nebyla detekována významná agregace molekul proteinů. Výsledky HPLG na koloně katexu (viz. obrázek 6) byly v souladu se sníženou hodnotou pí obou analog. Nepatrný posun při SDS-PAGE (viz; obrázek 7) 'je patrně důsledkem.....
změny v náboji analog vzhledem k NT-3 divokého typu. Obě analoga si zachovávají biologickou aktivitu a strukturu nekovalentně spojených dimerů polypeptidu NT-3 divokého typu.
Farmakokinetické chování
Bylo pozorováno, že křivky sérové koncentrace po intravenózní aplikaci jsou dvojfázové (viz. obrázek 8). Mezi jednotlivými typy NT-3 byly podstatné rozdíly v počáteční distribuční fázi. Poločasy (ocTi/2) byly 3,3 minuty pro NT-3 divokého typu, 5,4 minut pro NT-3 (1.i19)R61A,K64D a 7,6 minut * « 9 · 9 · *
9 9 4 4 ·
9 * · · 4 «'* 9·· 4 9 · «>
4 9 •99 4·9
9
94 pro NT-3 (i-i17)R61A, K64D (viz. tabulka 2). Pozorované snížení clearence po intravenózni aplikaci může být zapříčiněno toliko pomalejší distribucí analog NT-3. Nejvýraznější snížení koncentrace v průběhu této fáze bylo pozorováno u NT-3 divokého typu. Poločasy koncové fáze (βΤι/2) byly podobné pro všechny tři zmíněné typy a pohybovaly se v rozmezí 0,9 až 1,0 hodina což naznačuje, že mechanizmus odstraňování může být pro všechny zmíněné typy totožný. Plochy pod křivkami znázorňujícími čásóvóu závislostkoncentrací (tTAUCinf)“Byly pro analoga NT-3(i-n7)R61A,K64D a NT-3(1.119)R61A,K64D přibližně 1,2 až 2-krát větší než tomu bylo u NT-3 divokého typu.
Tabulka 2. Farmakokinetické parametry získané u potkanů, kterým byla intravenózně aplikována jedna dávka proteinů NT3 v koncentracích 1 mg/kg.
Typ NT-3 t-AUC(inf)1 (ng-hod/ml) CL2 [ml/kg-hod) CtT1/2 3 (min) βτ1/2 4 (hodin)
NT-3 divokého typu 724,1 + 151,0 1411,7 + 294,4 3,3 ± 0,3 1,0 + 0,6
ΝΤ-3α. U>.)R61A, K64D .880., 7 .+..320.,.3 1276,2 +.581,8 5.,4 + .1,.9.. 0,9. +. 0,6.
NT-3(1. 117)R61A, K64D 1420,7 ± 117,9 706,3 + 58,7 7,6 + 0,0 1,0 ± 0,0
1 Plocha pod křivkou časové závislosti sérové koncentrace v časech nula až nekonečno. Plocha je vypočítána lichoběžníkovou metodou.
2 Rychlost clearence vypočítána jako: dávka : AUC 3 Poločas distribuční fáze (αΤι/2) 4 Poločas koncové fáze (βΤι/2)
Po subkutánní injekci NT-3 divokého typu došlo k rychlému zvýšení sérové koncentrace tohoto peptidu (viz.
» v « - v - - . I i • · » · · · · · ·· ··· .· ·· ·· ·· obrázek 9) . Maximální koncentrace bylo dosaženo v čase (Tmax) přibližně 0,17 hodin (viz. Tabulka 3). U modifikovaných polypeptidů byl pozorován pozvolnější profil absorpce. Přesněji řečeno, hodnoty Tmax- byly 0,67 hodin pro NT-3(i119)R61A, K64D a 1,33 hodin pro NT-3 (1.117)R61A, K64D. Maximální pozorované sérové koncentrace polypeptidů NT-3 (1.119)R61A, K64D a NT-3(i-h7)R61A,K64D byly ve srovnání s NT-3 divokého typu 6-ti až 10-ti násobně vyšší, což naznačuje, že. zmíněná ana-loga~vykazuj-í—vyšá-í-stupeň-absorpce-z-mí sta..in j.ekční.aplikace. Stupeň nebo rozsah absorpce (biologická dostupnost) je obvyklej i stanovován z poměru ploch pod křivkami časových závislostí sérových koncentrací pro subkutánní a intravenózní aplikaci (Tabulka 3). Biologické dostupnosti byly 2,2% pro NT-3 divokého typu, 28,2% pro NT-3(1.ii9)R61A,K64D a 43,22% pro NT-3d-uvjRGlA, K64D. Poločasy koncových fází pro zmíněná analoga se jevily delší ve srovnání s polypeptidem divokého typu.
Tabulka 3 Farmakokinetické parametry získané u potkanů, kterým byla subkutánně aplikována jedna dávka proteinů NT-3 v koncentracích l mg/kg= ‘4
Typ NT-3 t-AUC (inf)1 (ng-hod/ml) F 2 (%) CMAX 3 (ng/ml) T 4 J-MAX (hod) βτ1/2 5 (hod)
NT-3 divoké- ho typu 15,2±9,5 2,2±1,3 17,8+11,6 0,2±0t 0 0,4+0,0
NT-3(1. 119)R61A, K64D 241,3±74,8 28,5+6,3 106,5±47,1 0,7+0,3 1,4+0,6
NT-3(1. 117)R61A, K64D 632,9+38,0 43,2+2,0 180,1+51,2 l,3±0,6 1,4+0,8
• 44 4 4 * · · · · « 444 4 · · 4 · 4 *
4 444 · · 4 ·»♦*·♦
4 4 ··· · *
444 44 «· *· * · 1 Plocha pod křivkou časové závislosti sérové koncentrace v časech nula až nekonečno. Plocha je vypočítána lichoběžníkovou metodou.
2 Biologická dostupnost (P) je vypočítána jako: (t-AUCsc / t-AUCiv) x 100%, kde byly obě plochy získány ze stejného živočicha.
3 Ckax je maximální koncentrace 4 Tmax je poločas pro dosažení maximální koncentrace
-Po-ločas—koncové-fáze—í-pTr/ž*)-Výsledky z těchto experimentů ukazují, že snížením hodnoty pí polypeptidu NT-3 může být dosaženo snížení rychlosti clearence po intravenózní aplikaci (alespoň na počátku) a rovněž může být dosaženo zvýšení absorpce po subkutánním podání. Získané výsledky rovněž ukazují, že náboj daného proteinu hraje důležitou úlohu při stanovování farmakokinetických vlastností. V případe bazických proteinů jako například NT-3 a rovněž jiných kationaktivních proteinů může mít snížení izoelektrického bodu (nebo náboje při fyziologické hodnotě pH) za následek podstatné zlepšení absorpce a biologické dostupnosti dané molěkuly po súbkutánní aplikaci. Tato znalost a popis uvedený v této přihlášce umožňují navrhnout nové molekuly se zlepšenými terapeutickými vlastnostmi.
Mělo by být zřejmé, že analoga popsaná v předchozím textu jsou uvedena pouze jako příklady, .a že je možné, s využitím popisu uvedeného v této přihlášce, vytvořit jiná analoga NT-3, jakož i analoga jiných proteinů, vyznačující se nižší hodnotou izoelektrického bodu a delším setrváním v krevním oběhu a/nebo vyšší absorpcí. V jedné variantě mohou být například vytvořena analoga proteinů SEK. ID. Č: 3 a 5 tak, že je provedena exprese v savčích buňkách nebo sekretujících bakteriálních buňkách takovým způsobem, že je získán produkt „Meť (tj . methioninový zbytek na. N-konci je » M« »
odstraněn a výsledkem jsou polypeptidy o sekvencích SEK. ID. Č: 6 a 7). Totéž bude platit v případě analog BDNF-faktoru popsaných v dalším textu.
Analoga BDNF-faktoru
S využitím postupů popsaných výše (pro polypeptid NT-3) byla připravena analoga BDNF-faktoru, která byla purifikována z E. coli. U každého z těchto analog byla stanovena hodnota-izoelektrického-bodu-{pl)—a—(-př-i-b-l-i-ž-ný·}—výsledný-riáboj— při fyziologickém pH (7,4). Pro srovnání jsou rovněž uvedeny hodnoty izoelektrického bodu a náboje při fyziologickém pH pro BDNF-faktor divokého typu (tj. BDNF-faktor o přirozeně se vyskytující sekvenci; viz. Patentová přihláška US 5180820, obrázek 5; SEK. ID. Č: 8). Místa substitucí jsou číslována s počátkem na prvním aminokyselinovém zbytku následujícím po methioninu v maturované formě proteinu exprimovaného v E. coli (tj . počáteční methioninový zbytek není započítán).
BDNF-faktor K65D,K73D,K95A,R97A
Px^veudiyíllj. Su.t>stj-tu.Ccuij_ j sou ΖαΠΐβΠα iysirm asparágovou v pozicích 65 a 73, záměna lysinu za alanin v pozici 95 a záměna argininu za alanin v pozici 97. (SEK. ID. Č: 9)
Vypočtená hodnota pí: 8,46
Náboj: +4,0
BDNF-faktor P60E,K65D,K73D,K95A
Provedenými substitucemi jsou záměna prolinu za kyselinu glutamovou v pozici 60, záměna lysinu za kyselinu asparágovou v pozicích 65 a 73 a záměna lysinu za alanin v pozici 95. (SEK. ID. Č: 10) • φφφφ φ φ Β φφφ φ φ φφφ φ · ΦΦΦ φ φ φ Φφφ « φ φ φ
Φ «4
Vypočtená hodnota pí: 8,45
Náboj : +4,0
BDNF-faktor divokého typu Vypočtená hodnota pí: 10,23
Náboj: +9,5
Popis- 3“ν-γ3-1θ€ΐλ-γ·“^ίθ-1-©5Ϊθ^γθ1ΐ-”&β8&ύ--”
1) Stanovení biologické aktivity in vitro; biologické stanovení mitogenní aktivity s využitím buněk 3T3trkC
V tomto experimentu je biologická aktivita BDNF-faktoru divokého typu a biologická aktivita analog BDNF-faktoru stanovována kvantitativně měřením inkorporace (MTS) do buněk PC-12 (ATCCj, které byly transformovány tak, aby exprimovaly receptor trkB (vysokoafinitní receptor pro BDNF-faktor).
Tyto transformované buňky byly kultivovány, v Dulbeccově minimálním médiu obsahujícím fetální bovinní a koňské sérum a 1% L-glutaminu. Kultivace probíhala při teplotě 37°C + 2°C v inkubátoru s vysokou vlhkostí vzduch a obsahem oxidu uhličitého 7,5 ± 1%. Pro vlastní experiment byly buňky přeneseny do destiček pro tkáňové kultury a dále kultivovány. Po uplynutí přibližně 48 hodin bylo kultivační médium nahrazeno médiem RPMI 1640, k buňkách byly přidány testované vzorky a inkubace probíhala za stejných podmínek dalších 48 hodin. Následně byly buňky obarveny pomocí MTS, inkubovány dalších pět hodin za stejných podmínek a s využitím čtečky destiček byla v každé jamce změřena optická hustota při vlnové délce 490 nm. Získané výsledky biologické aktivity zmíněných dvou analog BDNF-faktoru (vzhledem k BDNF-faktoru divokého typu) jsou znázorněny v Tabulce 4.
• 4 44
4 4 4 * 4 44
Tabulka 4. Biologická aktivita BDNF-faktorů stanovovaná in vitro
Biologická aktivita (mg/mg)
BDNF-faktor divokého typu 0,61
BDNF-faktor K65D,K73D, K95A, R97A 1,24
BDNF-faktor P60E, K65D, K73D, K95A 0,61
2) Biologické testování in vivo a získané výsledky Biologické vlastnosti zmíněných analog byly hodnoceny in vivo na samcích potkanů Sprague Dawley a to v dávkách 3,0 miligramy na kilogram tělesné hmotnosti pro BDNF-faktor K65D,K73D, K95A, R97A a 1,7 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti pro BDNF-faktor P60E, K65D, K73D, K95A. Testované látky byly podávány intravenózně a subkutánně a poté následovaly odběry vzorků séra a měření koncentrací zmíněných analog v krevním séru (byl uplatněn stejný postup jako u NT3 a analog NT-3). Pro každou formu podání jsou níže uvedeny farmakokínetické vlastnosti jednotlivých proteinů.
Tabulka 5. Farmakokínetické vlastnosti měřené na potkanech; jedna intravenózní dávka BDNF-faktorů . - .
Typ BDNF-faktoru t-AUC (inf) (ng-hod/ml)
BDNF-faktor divokého typu 8652,8 + 833,6
BDNF-faktor K65D, K73D, K95A, R97A . 12932,8 ± 913,0
BDNF-faktor P60E, K65D, K73D, K95A 14097,2 ± 949,8
»«·«· 9 9 · »999 * t ··«* · « ··· 999
9« » · · 9 » * * •9 9·« *> 9·' 9« 9·
Tabulka_6. Farmakokinetické vlastnosti měřené na potkanech; jedna subkutánní dávka BDNF-faktorů
Typ BDNF-faktoru t-AUC (inf) (ng-hod/ml) F (%)
BDNF-faktor divokého typu 462,5 +1 30,3 4,7 + 2,0
BDNF-faktor K65D, K73D, K95A, R97A 2401,6 ± 297,1 16,8 + 0/1
BDNF-faktor P60E, K6SD, K73D, K95A 2049,2 + 357,4 13,9 + 2,0
Získané výsledky ukazují, že zavedení mutací do BDNFfaktoru divokého typu má měřitelný vliv na farmakokinetickévlastnosti. Jedná se zvláště o dosažení větší biologické dostupnosti zmíněných dvou analog BDNF-faktoru (ve srovnání s BDNF-faktorem) in vivo, což se odráží ve vyšších hodnotách t-AUC(inf) po intravenózním podání těchto analog a vyšších hodnotách t-AUC(inf) a F% po subkutánní aplikaci.
Tento vynález je definován připojenými patentovými nároky.
··· · · * ♦ · * · * » « · · * ·*·· • » · 9 « · »» ·»·»« «· · · » · » * « »t ··« · · « · ·· · *
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Boone, Thomas C.
Cheung, Ellen N.
Hershenson, Susan I.
Young, John D.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů (iii) POČET SEKVENCÍ: 10 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kan-
celář
(B) ULICE: Národní 32
(C) MĚSTO: Praha 1
(D) STÁT: Česká Republika
(E) PSČ: 116 66
(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní . .. .. (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PCr.DOS./MS-DOS. .. . .....
(D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.25 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) ZATŘÍDĚNÍ:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: Mazza, Richard J.
(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO:
(C> ČÍSLO SPISU: A-411 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
« 4
444 · 4 « 4
4 · 4 «4 ·<<
4 4 4 * · 4 «4 · 44 4 (A) TELEFON:
(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:
(2) INFORMACE 0 SEK. ID. Č.:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků
'.....“(B')“TYPT“po*lýpeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:l:
Met Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg
20 23 30
Gly His 01 n Val Thr Val Lcj. Gly Glu Ile T.vc ··j Thr Πΐΐ7 Asn Ser Pxo
35 40 ~45 -
Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val
50 55 60
Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys
65 70 75 80
Lys Thr Ser Gin Thr Tyr val Arg Ala Leu Thr Ser GlU Asn Asn Lys
85 90 95
Leu Val Gly Trp Arg Trp ile Arg Ile ASP Thr Ser Cys Val Cys Ala
100 105 110
Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr
11S 120
* »»»· ·· 4*44 4* 4« • 4 4 44 . 4 «4*4
444· 4 · « 4 · 4 4 44 4 4 « 4 44 *44 444
4 44444 4 4
444 44 44 4· 44 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ij) TYP MOLEKULY: cDNA_ ______________ (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. C.:2:
aegtacgcfcg aacacaaatc tcaccgtgge gaatactctg. tttgcgactc tgaatctctg 60 :tgggttaccg acaaatcttc tgctatcgac atccgtggtc accaggctac cgttctgggt 120 .gaaaccaaaa ccggtaactc tecggttaaa cagtacttct acgaaacccg ttgcaaagaa .180 gctgcáccgg ttgacaacgg ttgccgtggt atcgacgaca aacactggaa ctctcagtgc 240 !naaacctctc agacctacgt tcgtgctctg acctctgaaa acaacaagct tgttggttgg 300 cgttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggtegtacc 360 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein « 4 4 44 4 · · 4 4 4 4
V 4444 44 444 444
4444 4 4 4
4 444 44 44 44 ··
(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.: 3 :
Met 1 Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly 5 10 Glu Tyr Ser Val Cys 15 Asp
Ser. Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser 20 25 Ser Ala Ile Asp 30 Ile Arg
Gly His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu Ile 35 40 Lys Thr Gly Asn 45 Ser Pro
Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys 50 55 AsnGlyCys 'Arg Gly Ile 'AspA'spLys 70 Lys 'His 75 Glu 60 Ala Ala Pro val
ASP' 65 Trp Asn ser u±n cys 80
Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu 85 90 Thr Ser Glu Asn Asn 95 Lys
Leu Leu Val Gly Trp Arg Trp ile Arg Ile Asp 100 105 Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr Thr Ser cys Val 110 Cys Ala
115 120 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
f Ti \ πτ?τ ΤΛΤΙ . -Λ f“ A — £. -A-·. V. A. ~ f i O3*± U. Ud2,_L (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:4:
atgtacgctg aacacaaatc tcaccgtggt gaatactctg tttgcgactc tgaatetctg 60 tgggttaccg acaaatcttc tgctatcgac atccgtggtc accaggttac cgttctgggt 120 gaaatcaaaa ccggtaactc tccggttaaa cagtacttct acgaaacccg ttgcaaagaa 160 gctgcadcgg ttgacaacgg ttgccgtggt atcgacgaca aacactggaa ctctcagtgc 240 aaaacctctc agacctacgt tcgtgctctg acctctgaaa acaacaagct tgttggttgg 300 : cgttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggt 354.
i · B B « · B B B
B 4 4 4 4 * · ♦ ··· ··· • > B * · · B · B «Β ♦♦· ·♦ ·♦ ·« ·· (2) INFORMACE O SEK. ID. C*:5:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 118 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden
-CD )“TOPOLOGTE-:—neznámá---(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:5:
Met Tyť Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys 15 Asp
1 5 . 10
Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala. Ile ASp He Arg
20 25 30
Gly His Gin val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro
35 40 45
Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cya Lys Glu Ala Ala Pro Val
50 55 60
'Asp Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp - Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys
.65 70 75 80
Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys
85 $0 95
Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala
100 105 110
Leu Ser Arg Lys Ile Gly 115
9, • · ι • ·Μ » 9 · • · · »9 · ··· (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:6:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 119 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden
-(-D)—T0POLOOíE-:—neznámá(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:6:
Tyr 1 Ala Glu His Lys 5 Ser His Arg Gly Glu 10 Tyr Ser Val Cys Asp .15 Ser
Glu Ser Leu Trp 20 Val Thr Asp Lys Ser 25 Ser Ala Ile Asp ile 30 Arg Gly
His Gin Val 35 Thr Val Leu Gly Glu 40 Ile Lys Thr Gly Asn 45 Ser Pro Val
tys Gin cn i v Tyr Phe Tyr Glu Thr cc to* to* Arg Cys Lys Glu Ala 50 Ala Pro Val Asp
Asn 65 Gly Cys Arg Gly ile 70 Asp Asp Lys His Trp 75 Asn Ser Gin Cys Lys 80
Thr Ser Gin Thr Tyr 85 Val Arg Ala Leu Thr 90 Ser Glu Asn Asn Lys 95 LeU
Val Gly Trp Arg 100 Trp' Ile Arg Ile Asp 105 Thr Ser Cys Val Cys 110 Ala Leu
Ser Arg tys 115 Ile Gly Arg Thr
4 4 4 * 4 · 44 4 · « 4, 4 • » *4
444 ··· 44 4 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:7:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 117 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden ' (ό·)““ΤΟΡΟΕΟΟιετ~ neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:7:
1 Tyr Ala Glu His tys Ser His Arg Gly Glu Tyr ser Val Cys Asp Ser
i 1 5 10 15
Glu Ser LčU. Trp Val Thr ASp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly
20 25 30
HÍS Gin Val Thr val Leu Gly Glu Πο Lys Thr Gly Asn Ser Pro val
35 40 45
Lvs Gin Tvr Phe Tv.if Glu Thr Arcr Cvs Lvs Glu Ala Ala Pro Val Asn
-50 55 - 60
Asn Gly Cys Arg Gly lle ASp Asp Lys Hís Trp Asn Ser Gin Cys Lys
65 70 75 80
Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu
85 90 95
Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ile Gly
115
φ · φ Φ φ a > > * φ φ φφφ φφφ • φφφ φ φ φφ ·· · · φ« (2) INFORMACE Ο SEK. ID. Č.:8:
(ί)· CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (‘Εί^ΤΟΡΟΕΟΘΤΕΊ—ηε známá----(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:8:
Met His 1 . Sér Asp Pro 5 Ala- Arg Arg Gly Glu Leu Ser val Cys Asp Ser
10 15
Ile Ser Glu Trp val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro val Ser Lys Gly
35 40 45
Gin. Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr tys Cys Λ&Π T\_ rxu «OL Pil, U-Jt ΓΡι * J *
50 55 60
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin
65 70 75 80
Cys Arg Thr Thr Gin 85 Ser Tyr Val Arg Ala 90 Leu Thr Met Asp Ser 95 Lys
tys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys
100 105 110
Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115 120
*« «»· • · · · • · 4 «* * · * · · · » · a a a a ·· a·· »· a« aaaa » ♦ *
aa ·· 99 • 9 9 9 a a a 9
999 9 99 • · a· áa (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:9:
(i). CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
. (A) DÉLKA:. 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden
--(-£) )—TOPOLOGIE-:—ne známá--(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. C.:9:
Met 1. His Ser Asp Pro s Ala Arg Arg Gly Glu Leu ser Val Cys Asp Ser
10 15
Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly
35 40 45
Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys CyS Asn Pro Met Gly Tyr
50 55 60
Thr Asp Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Arg His Trp Asn Ser Gin
65 70 75 80
Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Ala
05 90 95
Lys Ala ílc Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys
100 105 •110
Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115 120
• · • ♦·· « · · · · · « • v · · · · · ·· ··« »· · »· * »· · ♦ t« (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselinových zbytků (B) TYP: polypeptid (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (DjTOPOL'OUIETliěžňaiňá (ii) TYP MOLEKULY: protein
xi) POPIS SEKVEN CE: SEK. I :d. Č. : 10 :
Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser
1 5 10. 15
Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro val Ser Lys Gly
35 40 45
Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr GlU Thr Lys cye Asn Glu Met Gly Tyr
50.. 55 60
Thr Asp GlU Gly cys Arg Gly Ile Asp Asp Arg His Trp Asn ser Gin
65 70 75 80
Cy<3 Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Ala
85 90 95
Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys
100 105 110
Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115 120

Claims (44)

1. Polypeptídový analog kationaktivního pólypeptidu, kde zmíněný analog má aminokyselinovou sekvenci, která se liší od nativní sekvence původního pólypeptidu v jednom nebo více aminokyselinových zbytcích nebo se od nativní sekvence původního pólypeptidu liší chemickou modifikací jednoho nebo více aminokyselinových zbytků nativní sek..................
hodnoty izoelektrického bodu a zvýšení doby setrvání v oběhu in vivo a/nebo zvýšení absorpce zmíněného analoga vzhledem k těmto vlastnostem u nemodifikovaného kationaktivního pólypeptidu.
2. Polypeptid podle nároku 1, kde tento- polypeptid je rovněž charakterizován, ve srovnání s nemodifikovaným kationaktivním polypeptidem, nižším nábojem za fyziologických podmínek.
3. Polypeptid podle nároku 1, kde tento polypeptid je ana.logem kationaktivního pólypeptidu vybraného ze skupiny zahrnující neurotrofický faktor-3 (NT-3), neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDNF-faktor), růstový a diferenciační faktor makrofágů (MGDF-faktor) a růstový faktor keratinocytů (KGF) ..
4. Polypeptid podle nároku 3, kde tento polypeptid je analogem NT-3 .
5. Polypeptid podle nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 3.
44 »444 4» 4444 4» 4«
4 4 4 4 · 4 4*44 • * *·· 4 · 4 4 4 4 4 44 4*44 44 «44 444
44 44444 4 4
44 40« 44 44 44 Μ
6. Polypeptid podle nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 5.
7. Polypeptid podle nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 6.
8. Polypeptid podle nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 7.
9. Polypeptid podle nároku 3, kde tento polypeptid je analogem BDNF-faktoru.
10. Polypeptid podle nároku 9, kde tento polypeptid má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 9.
11. Polypeptid podle nároku 9, kde tento polypeptid má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 10.
12. Molekula DNA kódující polypeptidový analog kationaktivního polypeptidu, kde kódovaný analog má aminokyselino.....vou sekvenci, která, se od nativní sekvence původního polypeptidu liší v jednom nebo více aminokyselinových zbytcích nebo se od nativní sekvence původního polypeptidu liší chemickou modifikací jednoho nebo více aminokyselinových zbytků nativní sekvence, přičemž důsledkem těchto odlišností je snížení hodnoty izoelektrického bodu a zvýšení doby setrvání v oběhu in vivo a/nebo zvýšení absorpce zmíněného analoga vzhledem k těmto vlastnostem u nemodifikovaného kationaktivního polypeptidu.
13. Molekula DNA podle nároku 12, kde tato molekula kóduje analog kationaktivního polypeptidu vybraného ze skupiny • 4
44 4 zahrnující NT-3, BDNF-faktor
MGDF a KGF.
Molekula DNA podle nároku 13, kde tato molekula kóduje polypeptidový analog NT-3.
15.. Molekula DNA podle nároku 14, kde tato molekula kóduje polypeptid o aminokyselinové sekvenci popsané jako SEK. ID. Č: 3.
16. Molekula DNA podle nároku 14, kde tato molekula kóduje polypeptid o aminokyselinové sekvenci popsané jako SEK. ID. Č: 5.
17. Molekula DNA podle nároku 15, kde tato molekula má nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 2.
18. Molekula DNA podle nároku 16, kde tato molekula má nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 4.
19. Molekula DNA podle nároku 13, kde tato molekula kóduje polypeptidový analog BDNF-fakcóru.
20. Molekula DNA podle nároku 19, kde tato molekula kóduje polypeptid o aminokyselinové sekvenci popsané jako SEK. ID. Č: 9.
21. Molekula DNA podle nároku 19, kde tato molekula kóduje polypeptid o aminokyselinové sekvenci popsané jako SEK. ID. Č: 10.
22. Biologicky funkční expresívní vektor, kde tento vektor zahrnuje molekulu DNA podle nároku 12, která je funkčně
9« 9·9* «9 ···· • · ► · · ► 9 9 • 9 9 ♦
9 9 * připojena k sekvencím regulujícím expresi.
23. Prokaryotická nebo eukaryotická hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná nějakým expresívním vektorem podle nároku 22 tak, že je této hostitelské buňce umožněno exprimovat polypeptid kódovaný zmíněnou molekulou DNA.
24'. Třáňsřormo va'ňé“ňěbb ”t r áňšf éko vané^Bak teriálňí_hostite Γ7 ské buňky podle nároku 23.
25. Transformované nebo transfekované hostitelské buňky E.coli podle nároku 24.
26. Transformované nebo transfekované savčí'hostitelské' buňky podle nároku 23.
27. Transformované nebo transfekované buňky CHO podle nároku.
26.
28. Transformované nebo transfekované buňky COS podle nároku 26 .
29. Postup pro produkci polypeptidového analoga kationaktivního polypeptidů vyznačuj ící .se tím, že zmíněný analog má aminokyselinovou sekvenci, která se liší od nativní sekvence původního polypeptidů v jednom nebo více aminokyselinových zbytcích, přičemž důsledkem těchto odlišností je snížení hodnoty izoelektrického bodu a zvýšení doby setrvání v oběhu in vivo a/nebo zvýšení absorpce zmíněného analoga vzhledem k těmto vlastnostem u nemodifikovaného kationaktivního polypeptidů, kde tento postup zahrnuje kultivaci {za
444 ··· • · * *4«
4* .4444 · ·« 44« 4· ·· ·· ·· vhodných nutričních podmínek) prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky transformované nebo transfekované nějakým expresívním vektorem zahrnujícím molekulu DNA kódující zmíněný polypeptid tak, aby mohla zmíněná hostitelská buňka tento polypeptid exprimovat, a kde tento postup může rovněž zahrnovat izolaci exprimovaného polypeptidového produktu.
SOv^Postup-poďte-nároku—29-v-y-z-n-a—č-u—j—í—c—í-s—e—— tím, že zmíněným polypeptidem je analog NT-3.
31. Postup podle nároku 30 vyznačující se tím, že molekula DNA byla připravena místně specifickou mutagenezí.
32. Postup podle nároku 30 vyznačující se t í m, že zmíněný analog má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 3,
33. Postup podle nároku 30 vyznačující se tím, že zmíněný analog má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 5.
34. Postup podle nároku 30 vyznačující se t í m, že zmíněný analog má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 6.
35. Postup podle nároku 30 vyznačující se tím, že zmíněný analog má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 7.
»4 ·4♦· * ♦
4 4 4 · * 4444 4 · 4 4 4 · • « · < 4 4 44 «4444
44 44444 *
44 444 · · 44 44 ·4
36. Postup podle nároku 29 vyznačující se tím, že zmíněným polypeptidem je analog BDNF-faktoru.
37. Postup podle nároku 36 vyznačující se tím, že molekula DNA byla připravena místně specifickou mutagenezí.
38. Postup podle nároku 30 vyznačující se --—že—zmíněný“analOg_má—aminOkyse-binovou^sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 9.
39. Postup podle nároku 30 vyznačující s é tím, že zmíněný analog má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 10.
40. Postup podle nároku 29 vyznačující se
t. í m, že zmíněnou hostitelskou buňkou je bakteriální buňka.
41. Postup podle nároku 40 vyznačující se tím, že zmíněnou bakteriální hostitelskou buňkou E.coli.
42. Polypeptidový produkt exprimovaný v eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňce z molekuly DNA podle nároku 12 . '
43. Protilátka proti polypeptidu podle nároku 1.
44. Protilátka podle nároku 43, kde tato protilátka je pólyklonální.
• · · · ·
45. Protilátka podle nároku 43, kde tato protilátka je monoklonální.
Derivát polypeptidu podle nároku 1 s navázanou molekulou/molekulami polyethylenglykolu.
47. Farmaceutický přípravek zahrnující terapeuticky účinné množství polypeptidu podle nároku.1 a farmaceuticky při-j-a t e-1 ný—no s-i-ě—ne b o—r o z pou š t ěďl-o-48. Způsob léčby neuropatií periferních nervů zahrnující podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároků 4 nebo 9 pacientovi postiženému danou poruchou.
CZ993A 1996-07-19 1997-07-17 Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů CZ399A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68435396A 1996-07-19 1996-07-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ399A3 true CZ399A3 (cs) 1999-06-16

Family

ID=24747700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ993A CZ399A3 (cs) 1996-07-19 1997-07-17 Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů

Country Status (11)

Country Link
US (4) US6211150B1 (cs)
EP (1) EP0938499A1 (cs)
AU (1) AU720232B2 (cs)
CA (1) CA2259163C (cs)
CZ (1) CZ399A3 (cs)
IL (1) IL127872A0 (cs)
NO (1) NO990059L (cs)
NZ (1) NZ333650A (cs)
SK (1) SK1499A3 (cs)
WO (1) WO1998003546A1 (cs)
ZA (1) ZA976326B (cs)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1284143A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-19 Sifi S.p.A A process for the preparation of pharmaceutical formulations containing lactoferrin description
PL378582A1 (pl) 2003-03-19 2006-05-02 Biogen Idec Ma Inc. Białko wiążące receptor Nogo
WO2004111233A1 (ja) 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
EP1720564A1 (en) * 2004-02-20 2006-11-15 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5
JP4960865B2 (ja) 2004-06-24 2012-06-27 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 脱髄に関連する状態の処置
US7476331B2 (en) * 2005-02-09 2009-01-13 E I Du Pont Nemours And Company Compositions comprising 1,1,1,2,2,3,4,5,5,6,6,7,7,7-tetradecafluoroheptane and uses thereof
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
EP2298813A3 (en) 2005-06-06 2012-03-21 Wyeth LLC Anti-TRKB monoclonal antibodies and uses thereof
KR101245462B1 (ko) 2005-07-08 2013-03-20 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｓｐ35 항체 및 그의 용도
WO2007058843A2 (en) * 2005-11-15 2007-05-24 Lentigen Corporation Web based vector design
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
EP4342995A3 (en) 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
DK2202245T3 (en) * 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
AR066172A1 (es) * 2007-09-28 2009-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para la preparacion de un anticuerpo antiglipicano 3 con modulada cinetica plasmatica mediante variacion de la semivida plasmatica.
CN101980603A (zh) * 2007-10-11 2011-02-23 比奥根艾迪克Ma公司 LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途
CA2702630C (en) * 2007-11-08 2017-11-21 Biogen Idec Ma Inc. Use of lingo-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination
KR101840994B1 (ko) 2007-12-05 2018-03-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ｎｒ１０ 항체 및 그의 이용
EP3056513A1 (en) 2008-04-11 2016-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US8058406B2 (en) 2008-07-09 2011-11-15 Biogen Idec Ma Inc. Composition comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
US9340615B2 (en) 2009-05-15 2016-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-AXL antibody
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
BR112013012213A2 (pt) 2010-11-17 2020-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha moléculas de ligação a antígeno mul tlespecíficas tendo função alternativa à função dos fatores viii, ix e x de coagulação sanguínea, e anticorpo bies- 5 pecífico, seus usos na prevenção ou tratamento de hemorragia, ácido nucleico, vetor, célula, método para produzir as referidas moléculas de ligação, composição farmacêutica e kit
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
MX352889B (es) 2011-02-25 2017-12-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo de fc especifico para fcyriib.
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
EA030716B1 (ru) 2012-05-14 2018-09-28 Байоджен Ма Инк. Антагонисты lingo-2 для лечения заболеваний, в которых участвуют двигательные нейроны
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
EP3712166A1 (en) 2013-09-05 2020-09-23 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
EP3143404B1 (en) 2014-05-16 2018-08-29 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
KR20180054923A (ko) 2014-12-19 2018-05-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
TW201809008A (zh) 2014-12-19 2018-03-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ｃ５抗體及使用方法
AU2016205197B2 (en) 2015-01-08 2021-10-21 Biogen Ma Inc. LINGO-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
EP3816179A3 (en) 2015-02-05 2021-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant comprising a modified fcrn-binding domain
SG11201705093UA (en) 2015-02-27 2017-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composition for treating il-6-related diseases
JP7082484B2 (ja) 2015-04-01 2022-06-08 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
CA2993645A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Otonomy, Inc. Trkb or trkc agonist compositions and methods for the treatment of otic conditions
WO2017019905A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Otonomy, Inc. Treatment using truncated trk b and trk c antagonists
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
CN108368166B (zh) 2015-12-28 2023-03-28 中外制药株式会社 提高含fc区多肽纯化效率的方法
SG10202007025PA (en) 2016-03-14 2020-08-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
CN109689027A (zh) 2016-06-29 2019-04-26 奥德纳米有限公司 甘油三酯耳用制剂及其用途
TW202300168A (zh) 2016-08-05 2023-01-01 日商中外製藥股份有限公司 Il-8相關疾病之治療用或預防用組成物
SG11201908328XA (en) 2017-03-14 2019-10-30 Amgen Inc Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
EP3620531A4 (en) 2017-05-02 2021-03-17 National Center of Neurology and Psychiatry METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS
EP3775251A1 (en) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
WO2021062372A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
KR20230087539A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 암젠 인크 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
JP2024521219A (ja) 2021-06-07 2024-05-28 アムジエン・インコーポレーテツド グリコシル化タンパク質の非フコシル化レベルを制御するためのフコシダーゼの使用
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5322678A (en) 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US6247647B1 (en) * 1988-09-19 2001-06-19 Symbol Technologies, Inc. Scan pattern generator convertible between multiple and single line patterns
US5229500A (en) * 1989-08-30 1993-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brain derived neurotrophic factor
JPH0595786A (ja) 1991-10-07 1993-04-20 Green Cross Corp:The 変異ヒトプロウロキナーゼ
US5349055A (en) * 1992-03-06 1994-09-20 Persson Hakan B Nerve growth factor having altered receptor binding specificities
SG79882A1 (en) * 1994-02-14 2001-04-17 Kirin Brewery Protein having tpo activity
HUT78069A (hu) * 1994-10-13 1999-08-30 Amgen Inc. Keratinocita növekedési faktor analógok
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5830857A (en) * 1995-07-14 1998-11-03 Amgen Inc. Method of treating epilepsy

Also Published As

Publication number Publication date
AU720232B2 (en) 2000-05-25
US20020010135A1 (en) 2002-01-24
CA2259163C (en) 2004-07-06
NZ333650A (en) 2000-02-28
CA2259163A1 (en) 1998-01-29
US20010027179A1 (en) 2001-10-04
AU3671297A (en) 1998-02-10
EP0938499A1 (en) 1999-09-01
US6211150B1 (en) 2001-04-03
IL127872A0 (en) 1999-10-28
US20050143294A1 (en) 2005-06-30
NO990059D0 (no) 1999-01-07
WO1998003546A1 (en) 1998-01-29
US6500429B2 (en) 2002-12-31
US6723701B2 (en) 2004-04-20
ZA976326B (en) 1998-02-03
NO990059L (no) 1999-03-19
SK1499A3 (en) 1999-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ399A3 (cs) Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů
JP2020033366A (ja) 高可溶性レプチン
US8673858B2 (en) Method for treating wrinkles using a paralytic peptide from the shrew Blarina brevicauda
EP3060238A1 (en) Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use
CN114671941B (zh) 神经生长因子突变体
EP3285798A2 (en) Fibroblast growth factor (fgf) 1 with mutation in the heparin binding domain and methods of use to reduce blood glucose
EP3285793A2 (en) Fibroblast growth factor (fgf) 1 mutants and methods of use to reduce blood glucose
CN113383012A (zh) 人肝细胞生长因子突变体及其应用
WO2015031316A1 (en) Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
Kanematsu-Yamaki et al. Potent body weight-lowering effect of a neuromedin U receptor 2-selective PEGylated peptide
CN109111517B (zh) 一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用
RU2727715C2 (ru) Слитый белок, содержащий вариант CCL3, и его применение
US6271364B1 (en) Analogs of NT-3
JP2001523113A (ja) ナトリウムチャンネルレセプター
US6387875B1 (en) Method of use for murine leukaemia inhibitory factor-binding protein (mLBP)
KR20050065519A (ko) 알부민-융합 섬모 신경영양 인자
JP2004041175A (ja) ヒトｌｉｇ−１相同体（ｈｌｉｇ−１）
MXPA99000372A (en) Products analogues of proteins cationi
KR20220163872A (ko) 화물분자 수송 도메인 rmmr1, 이의 변이체, 이를 포함하는 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법
EP0596034A1 (en) Purification of recombinant ciliary neurotrophic factor and c-terminal truncated ciliary neurotrophic factor and methods for treating peripheral nerve damage
JP2002330793A (ja) 重炭酸ナトリウム共輸送体ファミリーのメンバーであるｈｎｂｃ１ａ
CA2079291A1 (en) Activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic