CN115867649A - Tie2结合剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供Tie‑2抗体及其片段以及缀合物及其使用方法。

Description

TIE2结合剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请案请求于2020年3月24日递交的美国临时专利申请案第62/993930号及于2020年6月30日递交的美国临时专利申请案第63/046318的优先权，这些申请案通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并以引用方式以其全部内容并入本文。所述ASCII副本创建于2021年3月17日，命名为P35891-WO_SeqList.txt，大小为107,354字节。
技术领域
当前公开的主题涉及包括抗Tie2抗体的Tie2结合剂，以及使用该结合剂的缀合物及方法。
背景技术
Tie2为用于治疗各种眼部疾病的有前景的治疗靶标(参见，例如，Campochiaro与Peters,2016,Curr Diab Rep,16:126，Whitehead等人，2019,J Diabetes Res,2019:5140521，Hussain等人，2019,Expert Opin Investig Drug,28:861-869)。Tie2为一种通过内皮细胞特异性表达的受体酪氨酸激酶，并且已经显示促进内皮稳定以及降低血管通透性。已知血管渗漏导致几种常见眼部疾病的视觉损害，包括但不限于糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病变(DR)及年龄相关性黄斑变性(AMD)。
经最广泛研究的Tie2配体为血管生成素1(Ang1)及血管生成素2(Ang2)。Ang1为一种Tie2强激动剂，并且其已经显示抑制眼部新血管形成以及血液视网膜屏障的分解(参见，例如，Nambu等人，2004,Gene Therapy,11:865-873)。Ang2为Tie2的上下文相关拮抗剂，并且其表达的增加与多种眼部疾病相关，包括DME、湿性AMD、DR、转移、败血症和发炎。除此之外，Ang2竞争性地与Tie2结合并且抑制Ang1信号传导，导致内皮及血管不稳定、血液视网膜屏障的分解以及发炎(Klaassen等人，2013,Prog Retin Eye Res,34:19-48，Saharinen等人，2017,Nat Rev Drug Discov,16:635-661)。
Tie受体，包括Tie1和Tie2，是第1型跨膜蛋白受体酪氨酸激酶(RTK)(Ramsauer,M.&D’Amore,P.A.J.Clin.Invest.(2002)；110:1615–1617)。Tie代表具有免疫球蛋白和EGF同源结构域的酪氨酸激酶受体。Tie2位于所有形成血管的内皮细胞中以及小鼠胚胎的心内膜中(Korhonen等人，Blood(1992)；80:2548-2555)。Tie2的胞外域或细胞外结构域(“ECD”)包括三个免疫球蛋白(Ig)结构域(Ig1、Ig2和Ig3)、三个表皮生长因子(EGF)结构域及III型纤连蛋白结构域(FNIII)。Tie2的Ig-EGF区介导血管生成素识别及结合(Fiedler,U.等人，J.Biol.Chem.(2003)；278:1721–1727；Barton,W.A.,等人，Structure(2005)；13:825–832)。
已经鉴定了Tie2受体的两个配体：血管生成素-1(Ang1)及血管生成素-2(Ang2)。Ang-1为一种Tie2激动剂，其结合以及诱导Tie2的酪氨酸磷酸化，并且其在体内的表达与血管发育密切相关(Davis等人，Cell(1996)；87:1161-1169)。缺乏Ang-1的小鼠表现出血管生成缺陷，会让人联想到在缺乏Tie2的小鼠中观察到的那些缺陷，这支持Ang-1为Tie2的主要生理配体以及Tie2具有关键的体内血管生成作用(Suri等人，Cell(1996)；87:1171-1180)。Ang-1为抗发炎性，促进血管完整性，并且降低血管通透性。Ang2被识别为Tie2的天然出现的拮抗剂。Ang2的基因转殖过度表达破坏了小鼠胚胎中的血管形成(Maisonpierre等人，Science 277:55-60,1997)。Ang2可为促炎性，破坏EC静止，并且增加血管通透性。总体而言，研究支持Ang1/Ang2/Tie2***在血管生成中起着关键作用。鉴于Tie2在血管生成中的重要作用，需要识别Tie2的试剂以及使用这些试剂的方法。此外，用作Tie2激动剂并且可降低血管通透性或增加血管完整性的组合物具有作为治疗剂，尤其用于治疗眼部疾病的极大潜能。
发明内容
本发明提供抗Tie2抗体，包含该抗Tie2抗体或其片段的组合物(例如，缀合物)，及其使用方法。
当前公开的主题提供特异性结合Tie2的经分离的抗体，或其抗原结合片段，包含至少一种或多种抗Tie2抗体或其抗原结合片段的组合物，及其使用方法。在一个示例性实施例中，抗Tie2抗体为Fab。
在一个方面，提供特异性结合Tie2的抗体或其抗原结合片段，其中，该抗Tie2抗体包含重链(HC)可变结构域(VH结构域)及轻链(LC)可变结构域(VL结构域)，其中，该VH结构域包含：包含NTDIS(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H1，包含RISPSDGNTYYADSVKG(SEQID NO:4)的氨基酸序列的CDR-H2，以及，包含(a)RTRWASX1AX2DY(SEQ ID NO:5，其中，X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W，且/或X2为F、Y、L、Q、I、K或H)、(b)RTRWASWAMDY(SEQ ID NO:6)或(c)RTRWASWAFDY(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的CDR-H3；该VL结构域包含：包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的CDR-L1，包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的CDR-L2，以及，包含QQSYTTPPT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施例中，CDR-H3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。在特定的实施例中，CDR-H3包含SEQ ID NO:7。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:11的VH框架FR1序列，SEQ ID NO:12的VH框架FR2序列，SEQ ID NO:13的VH框架FR3序列，和/或SEQ ID NO:14的VH框架FR4序列。在其他实施例中，该抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:15的VL框架FR1序列，SEQ ID NO:16的VL框架FR2序列，SEQ ID NO:17的VL框架FR3序列，和/或SEQ ID NO:18的VL框架FR3序列。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体包含VH结构域和VL结构域，其中，该VH结构域包含：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2，以及，包含(a)SEQ ID NO:5(其中，X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W，且/或X2为F、Y、L、Q、I、K或H)、(b)SEQ ID NO:6或(c)SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H3；该VL结构域包含：包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2，以及，包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的CDR-L3。在其他实施例中，CDR-H3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。在特定的实施例中，CDR-H3包含SEQ ID NO:7。在其他实施例中，该VH结构域与SEQ ID NO:20具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，以及，该VL结构域与SEQ ID NO:21具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:22的VH结构域序列以及SEQ ID NO:21的VL结构域序列。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:20的VH结构域序列。在其他实施例中，该抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:21的VL结构域序列。在其他实施例中，该抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:20的VH结构域序列和SEQ ID NO:21的VL结构域序列。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体或其片段包含SEQ ID NO:55的重链(HC)结构域序列和SEQ ID NO:25的轻链(LC)结构域序列。在其他实施例中，该抗Tie2抗体或其片段包含SEQ ID NO:23的重链(HC)结构域序列和SEQ ID NO:56的轻链(LC)结构域序列。
在一些方面，提供特异性结合Tie2的抗体或其抗原结合片段，其包含VH结构域和VL结构域，该VL结构域包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3；该VL结构域包含：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2，以及包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施例中，该VH结构域包含与SEQ IDNO:31具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及，该VL结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其他实施例中，该VH结构域包含SEQ ID NO:31，以及，该VL结构域包含SEQ ID NO:21。在其他实施例中，该HC包含SEQ ID NO:32，以及，该LC包含SEQ ID NO:25。
在一些方面，提供特异性结合Tie2的抗体或其抗原结合片段，其包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含：包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3；该VL结构域包含：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2，以及包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施例中，该VH结构域包含与SEQ IDNO:36具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及，该VL结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其他实施例中，该VH结构域包含SEQ ID NO:36，以及，该VL结构域包含SEQ ID NO:21。在其他实施例中，该HC包含SEQ ID NO:37，以及，该LC包含SEQ ID NO:25。
在一些方面，提供特异性结合Tie2的抗体或其抗原结合片段，其包含VL结构域和VH结构域，该VH结构域包含：包含SEQ ID NO:8的CDR-L1，包含SEQ ID NO:9的CDR-L2，以及包含SEQ ID NO:10的CDR-L3；该VH结构域包含：(a)包含g SEQ ID NO:38的CDR-H1、包含SEQID NO:39的CDR-H2以及包含SEQ ID NO:40的CDR-H3；(b)包含SEQ ID NO:43的CDR-H1、包含SEQ ID NO:44的CDR-H2以及包含SEQ ID NO:45的CDR-H3；或(c)包含SEQ ID NO:48的CDR-H1、包含SEQ ID NO:49的CDR-H2以及包含SEQ ID NO:50的CDR-H3。在其他实施例中，该VL结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及，该VH结构域包含：包含分别与(d)SEQ ID NO:41、(e)SEQ ID NO:46或(f)SEQ IDNO:51具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的(a)、(b)或(c)。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21的LC以及包含SEQID NO:42、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:52的HC。
在一些方面，提供特异性结合Tie2的抗体或其抗原结合片段，其包含2个VH结构域以及2个VL结构域，该VH结构域包含：在N末端至C末端方向上，包含SEQ ID NO:6的CDR-H1、包含SEQ ID NO:8的CDR-H2、包含SEQ ID NO:9的CDR-H3、包含SEQ ID NO:48的CDR-H1、包含SEQ ID NO:49的CDR-H2以及包含SEQ ID NO:50的CDR-H3；该VL结构域包含：在N末端至C末端方向上，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3、包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2以及包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施例中，该HC包含SEQ ID NO:54，以及，该LC包含SEQ ID NO:53。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体或其抗原结合片段包含工程化半胱氨酸，其中，该工程化半胱氨酸位于HC恒定结构域中和/或LC恒定结构域中。在其他实施例中，该工程化半胱氨酸选自重链中的T120C、G166C、G178C、T187C和T209C，以及轻链中的Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C和K149C，其中，该残基号是根据EU编号。在其他实施例中，该抗Tie2抗体或其抗原结合片段为Fab，其中，该Fab的HC终止于氨基酸CDKTHTSPPC(SEQID NO:83)处。在一些实施例中，该Fab终止于SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86的氨基酸序列处。
在一些方面，抗Tie2拮抗剂抗体为单克隆抗体。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体为人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体为全长IgG1或全长IgM抗体。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体或其片段与Tie2结合，其中，Tie2为与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白质。
在优选的实施例中，该抗Tie2抗体或其片段为Fab。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体为抗体或Fab，其与包含SEQ ID NO:22的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列的抗Tie2抗体竞争。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体或其片段不与Tie2的Ig1结构域结合。在其他实施例中，该抗Tie2抗体或其片段不与Tie2的EGF结构域结合。在其他实施例中，该抗Tie2抗体或其片段不与Tie2的Ig3结构域结合。在其他实施例中，该抗Tie2抗体或其片段不与Tie2蛋白质的FNIII结构域结合。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段的与食蟹猴Tie2结合。在其他实施例中，该食蟹猴Tie2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其变体。
在一些实施例中，该与Tie2结合的抗体或其抗原结合片段为多特异性抗体。在其他实施例中，该多特异性抗体与Tie2和VEGF结合。在其他实施例中，该多特异性抗体与Tie2和因子D结合。在其他实施例中，该多特异性抗体与Tie2和Ang2结合。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体为多特异性抗体，其激活Tie2。在其他实施例中，该多特异性抗体与Tie2和VEGF结合，其中，该多特异性抗体可以激活Tie2。在其他实施例中，该多特异性抗体与Tie2及因子D结合，其中，该多特异性抗体可以激活Tie2。在其他实施例中，该多特异性抗体与Tie2和Ang2结合，其中，该多特异性抗体可以激活Tie2。
在一个方面，提供编码抗Tie2抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸。
在一个方面，提供包含编码抗Tie2抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸的宿主细胞。
在一个方面，提供制备结合Tie2的抗体或其抗原结合片段的方法。在一些实施例中，该方法包括，在适用于抗Tie2抗体表达的条件下，培养包含编码该抗Tie2抗体的核酸的宿主细胞。在其他实施例中，该方法进一步包括从该宿主细胞回收该抗Tie2抗体。
在一个方面，提供通过上述方法制备的抗Tie2抗体。
在一个方面，提供缀合物，其包含根据本文所公开的实施例所述的至少两个特异性结合Tie2的抗体或其抗原结合片段，以及多臂部分。在优选的实施例中，该至少两个抗Tie2抗体各自为Fab。
在一些实施例中，该缀合物包含结合Tie2的抗Tie2抗体，以及多臂部分，其中，该多臂部分与至少2个抗Tie2 Fab连接。在一些实施例中，该多臂部分与至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个抗Tie2 Fab连接。在其他实施例中，该多臂部分与2、3、4、5、6、7、8、9或10个抗Tie2Fab连接。在其他实施例中，该多臂部分与6或8个抗Tie2 Fab连接。在其他实施例中，该多臂部分与8个抗Tie2 Fab连接。在优选的实施例中，该多臂部分与6个抗Tie2 Fab连接。
在一个方面，该缀合物结合并且激活Tie2活性。
在一些实施例中，该结合Tie2的缀合物激活AKT磷酸化。在其他实施例中，AKT磷酸化的激活通过体外测定中经磷酸化的AKT蛋白质增加而得以证明。在其他实施例中，该Tie2结合剂激活Tie2的磷酸化。在其他实施例中，该Tie2磷酸化的激活在体外测量。
在一些实施例中，将Tie2表达细胞暴露于该缀合物并不降低这些细胞中的Tie2蛋白水平。在其他实施例中，该暴露并不将这些细胞中的Tie2蛋白水平降低超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或75％。在其他实施例中，该暴露将这些细胞中的Tie2蛋白水平降低少于5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或75％。在其他实施例中，该暴露将该细胞中的Tie2蛋白水平降低超过约25％但少于约75％，超过约50％但少于约75％，或超过约60％但少于约80％。在一些实施例中，在将该Tie2结合剂与Tie2表达细胞一起体外孵育之前及之后，通过蛋白质印迹法测量Tie2蛋白水平。在其他实施例中，该孵育在37℃下进行10至36小时或12至24小时。
在一些实施例中，该抗Tie2抗体或其抗原结合片段具有从0.1uM至10uM、从0.01uM至10uM或从0.1uM至100uM范围的平衡解离常数(Kd)。
在一些实施例中，包含该多臂部分及该抗Tie2抗体或其抗原结合片段的缀合物增加Tie2至细胞-细胞连接的易位。
在一些实施例中，该缀合物降低血管通透性。
在一些实施例中，该缀合物促成血管稳定性和/或增加血管完整性。
在一些实施例中，该缀合物并不抑制或降低Ang1与Tie2的结合。
在一些实施例中，该缀合物抑制或降低Ang2与Tie2的结合。
在一些实施例中，该缀合物活性使用体外测定法测量。
在一些实施例中，该多臂多元醇选自由二聚体、四聚体、六聚体和八聚体所组成的组。在优选的实施例中，该多臂多元醇为六聚体或八聚体。在更优选的实施例中，该多臂多元醇为六聚体。
在一些实施例中，该多元醇为聚(环氧烷)聚合物。在其他实施例中，该多元醇为聚(烷二醇)聚合物。在其他实施例中，该多元醇为聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，该PEG为经官能化的多臂PEG。
在一些实施例中，该PEG具有通式(Ia)的结构：
Figure BDA0003856685280000091
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立为约45至约1000、约20至约1000、约10至约1000、约3至约250、约3至约200、约3至约100、约10至约50、约10至约30、约20至约30、约50至约200或约100至约150的整数；以及，n为约1至约10的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团。在一些实施例中，R2独立地选自硫醇反应性基团、氨基反应性基团及其组合。
在一些实施例中，该PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为1至3的整数。
在一些实施例中，该PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为1，以及，该多臂PEG为四聚体。
在一些实施例中，该PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为2，以及，该多臂PEG为六聚体。在此类实施例中，该六聚体具有通式(Ib)的结构：
Figure BDA0003856685280000101
其中，每个m独立地为约45至约1000、约20至约1000、约10至约1000、约3至约250、约3至约200、约3至约100、约10至约50、约10至约30、约20至约30、约50至约200或约100至约150的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团并且与如上所述的抗Tie2抗体片段或Fab共价连接。在一些实施例中，每个m独立地为约15至35或约20至30的整数。在其他实施例中，每个m独立地为约22的整数。
在一些实施例中，R1与R2一起具有结构
Figure BDA0003856685280000102
其中，R2为马来酸二胺；
在一些实施例中，该PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为3，以及，该多臂PEG为八聚体。在此类实施例中，该八聚体具有通式(Ic)的结构：
Figure BDA0003856685280000103
其中，每个m独立地为3至250的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团并且与如上所述的抗Tie2 Fab共价连接。在一些实施例中，每个m独立地为15至35的整数。在其他实施例中，每个m独立地为约22的整数。
在一些实施例中，本文所述的至少两个抗Tie2抗体片段或Fab与该多臂多元醇共价连接。在其他实施例中，该缀合物的多臂多元醇通过半胱氨酸氨基酸的游离巯基基团与该至少两个抗Tie2抗体片段或Fab共价连接。在其他实施例中，该半胱氨酸氨基酸为工程化半胱氨酸。在其他实施例中，该半胱氨酸氨基酸位于该抗Tie2恒定结构域中。在其他实施例中，该半胱氨酸氨基酸位于该抗Tie2 Fab的重链(HC)或轻链(LC)的C末端。在优选的实施例中，该半胱氨酸氨基酸不位于HC或LC的N末端或C末端。
在一些实施例中，包含抗Tie2抗体或其抗原结合片段的缀合物包含位于其HC和/或LC中的工程化半胱氨酸。在其他实施例中，该工程化半胱氨酸选自HC中的T120C、G166C、G178C、T187C和T209C；或者该工程化半胱氨酸选自LC中的Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C和K149C，其中，该工程化半胱氨酸的残基号是根据EU编号。
在一些实施例中，该缀合物包含多臂多元醇，其通过赖氨酸氨基酸的游离氨基基团与该至少两个抗Tie2抗体片段或Fab共价连接。在其他实施例中，该赖氨酸氨基酸位于该抗Tie2抗体片段或Fab的恒定区中。在其他实施例中，该赖氨酸氨基酸位于该抗Tie2抗体片段或Fab的重链或轻链的C末端。在另选的实施例中，该Tie2结合剂并不通过赖氨酸的游离氨基基团与该至少两个抗Tie2 Fab共价连接。
在一些实施例中，在体外生理条件下，每月有少于20％、少于15％或少于10％的该缀合物去缀合。在其他实施例中，在体内生理条件下，每月有少于20％、少于15％或少于10％的该缀合物去缀合。
在一些实施例中，该缀合物随着时间延长而稳定，在生理条件下，其Tie2结合能力每月损失少于20％、少于15％或少于10％。
在一个方面，提供包含抗Tie2抗体或其抗原结合片段以及多臂部分的缀合物，其中，该多臂部分包含IgM分子。在其他实施例中，该IgM分子包含J链，并且该多臂部分包含5个抗Tie2 Fab，其中，该5个抗Tie2Fab的大约每个都与该IgM分子连接。在其他实施例中，该IgM分子不包含J链，并且该多臂部分包含6个抗Tie2 Fab，其中，该6个抗Tie2 Fab中的每个都与该IgM分子连接。
在一些实施例中，该缀合物包含IgM分子，该IgM分子为具有氨基酸取代的IgM变体，由此，该IgM变体降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在优选的实施例中，该IgM变体包含基于EU编号的P436G取代。
在一个方面，提供包含抗Tie2抗体或其抗原结合片段及多臂部分的缀合物，其中，该多臂部分包含至少2、4、6、8或10个肽，其中，这些肽的大约每个都与抗Tie2 Fab共价连接。在一些实施例中，该抗Tie2 Fab序列终止于残基221、222、223、224或225(EU编号)处。在其他实施例中，这些肽的每个都为核苷二磷酸激酶(NDK)肽。在其他实施例中，这些NDK肽的每个包含与SEQ ID NO:71具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，这些NDK肽的每个在其N末端处与该抗Tie2 Fab重链或轻链的C末端连接。在其他实施例中，接头存在于Fab重链或轻链与该肽之间。在其他实施例中，该接头为氨基酸接头。在其他实施例中，该氨基酸接头包含2、3、4、5、6、7、8、2至20、5至10或4至10个氨基酸。在其他实施例中，该接头包含甘氨酸。
在一些实施例中，该多臂部分包含6或8个肽。在其他实施例中，该多臂部分包含6个肽。在优选的实施例中，该多臂部分包含6个NDK肽。
在一个方面，提供包含抗体或其抗原结合片段以及多臂部分的缀合物，其中，该多臂部分包含IgM分子。在其他实施例中，该IgM分子包含J链，并且该多臂部分包含5个抗体片段、Fab或其抗原结合片段，其中，该5个抗体片段、Fab或其抗原结合片段中大约每个都与该IgM分子连接。在其他实施例中，该IgM分子不包含J链，并且该多臂部分包含6个抗体片段、Fab或其抗原结合片段，其中，该6个抗体片段、Fab或其抗原结合片段中每个都与该IgM分子连接。
在一些实施例中，该缀合物包含IgM分子，该IgM分子为具有氨基酸取代的IgM变体，由此，该IgM变体降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在优选的实施例中，该IgM变体包含基于EU编号的P436G取代。
在一个方面，提供包含抗体、抗体片段、Fab或其抗原结合片段及多臂部分的缀合物，其中，该多臂部分包含至少2、4、6、8或10个肽，其中，这些肽的大约每个都与该抗体、抗体片段、Fab或其抗原结合片段共价连接。在一些实施例中，该抗体、抗体片段、Fab或其抗原结合片段序列终止于残基221、222、223、224或225(EU编号)处。在其他实施例中，这些肽的每个都为核苷二磷酸激酶(NDK)肽。在其他实施例中，这些NDK肽的每个包含与SEQ ID NO:71具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，这些NDK肽的每个都在其N末端处与该抗体、抗体片段、Fab或其抗原结合片段的重链或轻链的C末端连接。在其他实施例中，接头存在于Fab重链或轻链与该肽之间。在其他实施例中，该接头为氨基酸接头。在其他实施例中，该氨基酸接头包含2、3、4、5、6、7、8、2至20、5至10或4至10个氨基酸。在其他实施例中，该接头包含甘氨酸。
在一些实施例中，该多臂部分包含6或8个肽。在其他实施例中，该多臂部分包含6个肽。在优选的实施例中，该多臂部分包含6个NDK肽。
在一个方面，提供药物组合物，其包含根据本公开的抗Tie2抗体或其片段以及药用载体、赋形剂或稀释剂。在一些实施例中，该药物组合物包含如本文所述的抗Tie2结合剂以及药用载体，该抗Tie2结合剂包含多个与多臂部分连接的抗Tie2 Fab。
在一些实施例中，该包含抗Tie2抗体或Tie2结合剂的药物组合物进一步包含另外的治疗剂。在其他实施例中，该另外的治疗剂选自由抗VEGF抗体、抗Tie2抗体及抗Ang2抗体所组成的组。在一些实施例中，该另外的治疗剂选自Ang2拮抗剂、VEGF拮抗剂、VEGF捕捉剂、抗VEGF抗体、抗Ang2抗体以及补体组分拮抗剂。
在一些实施例中，前述药物组合物的任何一个可用作药物。
在一些实施例中，前述药物组合物的任何一个可用于制造用于治疗受试者眼部疾病的药物。
在一些实施例中，前述药物组合物的任何一个可用于降低或抑制患有眼部疾病的受试者的病理性血管通透性。
在另一方面，前述药物组合物的任何一个可用于治疗受试者眼部疾病。
在一个方面，提供用于治疗需要进行治疗的个体的方法，其包括向该患者施用如本文所述的抗Tie2抗体和/或Tie2结合剂。在一些实施例中，该方法包括向该个体施用如本文所述的药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的抗Tie2缀合物。
在一些实施例中，该个体已经诊断为患有血管疾病。在其他实施例中，该个体已经诊断为患有眼部血管疾病。
在另一方面，本发明的特征在于抑制患有与不良的血管通透性相关疾病的患者血管通透性的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的前述抗体或缀合物的任一种，从而抑制该受试者的血管通透性。
在另一方面，本发明的特征在于治疗与不良的血管通透性相关的疾病的方法，该方法包括向需要此治疗的受试者施用有效量的前述抗体或缀合物的任一种。
在一些实施例中，该个体已经诊断为患有与Tie2途径相关的疾病。
在一些实施例中，该个体已经诊断为患有选自由以下各项组成的组的眼部疾病：糖尿病性黄斑水肿(DME)、年龄相关性黄斑变性(AMD)(包括干性及湿性(非渗出性和渗出性)形式)、脉络膜新生血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、缺血相关视网膜病、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成、青光眼、无水肿的视网膜病、以及视网膜新生血管形成。
在一些实施例中，该个体已经接受使用抗VEGF抗体治疗。在其他实施例中，该个体并未经历抗VEGF抗体的治疗功效，经历了降低的抗VEGF抗体的治疗功效，和/或停止经历抗VEGF抗体的治疗功效。
在一些实施例中，该方法进一步包括向该个体施用第二治疗剂。在其他实施例中，该第二治疗剂选自由抗VEGF抗体、抗Ang2抗体、抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体、VEGF拮抗剂和Ang2拮抗剂所组成的组。
附图说明
图1提供于平移VH文库中使用的Tie2结构域的示意图。
图2A至2B显示了评估抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.10、Tie2.11和Tie2.12与小鼠Tie2ECD5结构域的结合(图2A)以及与人Tie2 ECD5结构域的结合(图2B)的测定结果。该ECD5结构域包含Tie2的Ig1、Ig2、EGF和Ig3结构域。
图3A至3B显示了评估抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.10、Tie2.11和Tie2.12(图3A)以及Tie2.2、Tie2.3、Tie2.4、Tie2.5、Tie2.7、Tie2.9、Tie2.15、Tie2.16、Tie2.17和Tie2.20(图3B)与人Tie1的结合的测定结果。
图4A至4B显示了评估通过抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.12和Tie2.20阻断Tie2与Ang1间相互作用(图4A)和Tie2与Ang2间相互作用(图4B)的测定结果。
图5A至5B显示了评估抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.10、Tie2.11和Tie2.12结合到HUVEC上(图5A)以及RAEC上(图5B)的测定结果。
图6A至6B显示了评估抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.4、Tie2.5和Tie2.20于RAEC中激活AKT磷酸化(图6A)以及评估抗Tie2抗体的抗IgG交联在AKT磷酸化上的效应(图6B)的测定结果。经磷酸化的AKT的水平通过蛋白质印迹分析测定。
图7A至7B显示了评估抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.22、Tie2.23、Tie2.24、Tie2.27、Tie2.28、Tie2.31、Tie2.33、Tie2.34、Tie2.34、Tie2.38和Tie2.1激活AKT磷酸化的测定结果(图7A)。图7B显示了抗Tie2抗体聚集或抗IgG交联在抗Tie2抗体Tie2.1的诱导AKT磷酸化的活性上的效应。经磷酸化的AKT的水平通过FRET分析测定。
图8A至8B示出了使用ELISA进行抗Tie2抗体的分类研究的方法(图8A)及结果(图8B)。
图9为示意图，其示出了本公开的抗Tie2抗体所结合至的Tie2上的表位组。
图10A和10B显示了抗Tie2抗体Tie2.1(SEQ ID NO:22)、Tie2.1.M100cF(SEQ IDNO:20)、Tie2.12(SEQ ID NO:31)、Tie2.24(SEQ ID NO:36)、Tie2.33(SEQ ID NO:41)和Tie2.38(SEQ ID NO:51)的重链可变区(VH)(图10A)与抗Tie2抗体Tie2.1(SEQ ID NO:21)、Tie2.1.M100cF(SEQ ID NO:21)、Tie2.12(SEQ ID NO:21)、Tie2.24(SEQ ID NO:21)、Tie2.33(SEQ ID NO:21)和Tie2.38(SEQ ID NO:21)的轻链可变区(VL)(图10B)的氨基酸序列的序列比对。
图11A至11B示出了使用经由噬菌体展示或动物免疫作用生成的各种抗Tie2.1抗体进行的分类测定的结果。图11A提供了经共价固定化的抗体及处于溶液中的几种这些抗体的列表，而图11B提供了处于溶液中的该系列抗体中的剩余列表。
图12A至12B显示了评估多聚体抗Tie2抗体的激动剂活性的测定结果。图12A比较了作为PEG六聚体及作为双表位FabIgG(1.38)的Tie2.1的AKT磷酸化活性。图12B比较了抗Tie2抗体的多聚体形式。
图13A至13B显示了各种比率的huIgM重链与轻链(不具有或具有J链)在亲和力柱分离出的蛋白质总产量上的效应，如通过总蛋白质A280(图13A)和SEC曲线(图13B)所测量的。
图13C显示了IgM的流变学测量，与靶向因子D(fD)的眼部多价PEG形式进行比较。
图13D显示了非结合IgM及非结合Fab的玻璃体药代动力学分析。
图13E显示了IgM的全身药代动力学分析，将非结合重组hIgM五聚体及重组hIgM六聚体与从人血清分离的IgM进行比较，药物经静脉内注射入雌性SCID小鼠体内。图13E显示了血清IgM水平。
图13F显示了来自血清样品的总体N-连接的聚糖的LC-MS分析。
图13G至13H显示了特征IgM多聚体形式表征抗Tie2抗体的测定结果。图13G显示了评估IgM恒定结构域中的突变的补体测定结果。图13H示出了IgM六聚体形式的抗Tie抗体的激动剂活性。
图14A至14B显示了经由肽部分连接的六聚体形式的抗Tie2抗体的设计及分析。图14A为多聚体设计的示意图。图14B显示了AKT磷酸化测定结果，将经由NDK肽、IgM及多臂PEG连接的六聚体形式的抗Tie2抗体进行比较。
图15A至15B显示了评估六聚体形式的各种抗Tie2抗体的激动剂活性的AKT磷酸化测定结果。显示了针对Tie2.1、Tie2.38、Tie2.33(图15A)以及Tie2.1、Tie2.1.M100cF、Tie2.12、Tie2.24(图15B)的结果。
图16A至16C显示了评估抗Tie2抗体于体外测定法中在Tie2蛋白质的细胞水平上的效应的测定结果。图16A、图16B及图16C分别对将HUVEC暴露于经由噬菌体展示及动物免疫作用生成的抗Tie2抗体时的Tie2水平进行比较。图16A、图16B及图16C中的所有测定都通过蛋白质印迹法分析。
图17显示了评估抗Tie2抗体在该Tie2蛋白水平的细胞水平上的效应的体内测定结果。
图18A至18B示出了研究抗Tie2.1抗体在内皮细胞屏障通透性上的效应的体外内皮细胞测定法的测定方法(图18A)及结果(图18B)。
图19A至19B示出了研究抗Tie2.1抗体在VEGF诱导型血管渗漏上的效应的体内血管通透性测定法的测定方法(图19A)及结果(图19B)。
图20A至20B示出了研究抗Tie2.1抗体或抗VEGF抗体在VEGF诱导型血管渗漏上的效应的体内血管通透性测定法的测定方法(图20A)及结果(图20B)。
图21A至21B示出了通过蛋白质印迹分析测得的双表位抗Tie2激动剂(抗Tie2Fab-IgF 1.38)在Tie2的蛋白水平上的体内效应(图21A)，以及研究抗Tie2 Fab-IgG 1.38在VEGF诱导型血管渗漏上的效应的体内血管通透性测定结果(图21B)。
图22显示了抗Tie2激动剂于经培养的HUVEC中在VE钙黏蛋白(上图)和F肌动蛋白(下图)的细胞组织化上的效应。
图23显示了评估IG1形式的Tie2.1抗Tie2抗体变体的激动剂活性的AKT磷酸化测定结果。
图24显示了评估六聚体形式的Tie2.1抗Tie2缀合物变体的激动剂活性与非PEG缀合Tie2.1 Fab(无六聚体)相比的AKT磷酸化测定结果。
图25显示了抗Tie2 Fab六聚体缀合物于眼部注射到食蟹猴体内后的药代动力学。
图26至27显示了抗Tie2.1 PEG缀合物的电泳图分析，其中单体峰计入(图26)或不计入(图27)相对定量中。
图28显示了取自食蟹猴玻璃体液的样品中抗Tie2.1 PEG缀合物的电泳图分析。
图29显示了抗Tie2 PEG缀合物六聚体与五聚体的相对量。
图30A至30B提供示出了在21天内取自食蟹猴眼部的样品(图30B)中的M100c氧化(图30A)的数据。
图31显示了氧化在pAKT活性上的效应。
图32至33显示了解缀合在pAKT活性上的效应(图32)，标准化值图示于图33中。
图34示出了PEG缀合位点位置对解缀合的影响。
图35A显示了PEG缀合位点位置对活性的影响。
图35B显示了PEG缀合位点位置对活性的影响。
图36显示了不同Tie2.1M100cF PEG缀合物的药代动力学。
图37比较了不同Tie2.1M100cF PEG缀合物的体内稳定性。
图38A至38B比较了不同Tie2.1M100cF PEG缀合物的活性。图38A显示了pAKT活性，而图38B显示了经由ELISA测定的总缀合物水平。
图39显示了PEG缀合物六聚体核心分子的结构，其与根据本公开的抗Tie2抗体缀合。
具体实施方式
I.定义
除非本文另做定义，否则术语“包含”应包括术语“由...组成”。
如本文所用的与具体值(例如，温度、浓度、时间等)关联使用的术语“约”应指该术语“约”所指的具体值的+/-1％的变更。
就本文目的而言，“受体人框架(acceptor human framework)”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者其可含有氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变更数量为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些实施例中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列的序列相同。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所使用的“结合亲和力”，是指反映结合对成员(例如抗体及抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常规方法测量亲和力，包括那些本文所述的方法。下面描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施例。
术语“亲和力成熟”的抗体是指在一或多个高变区(HVR)中具有一种或多种变化的抗体，与不具有这种变化的亲本抗体相比，此类变化引起该抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“抗Tie2抗体”、“与Tie2结合的抗体”和“与Tie2特异性结合的抗体”指能够以足够亲和力结合Tie2的抗体，因此该抗体可用作靶向Tie2的治疗剂和/或诊断剂。在一个实施例中，抗Tie2拮抗剂抗体与无关、非Tie2蛋白质结合的程度低于该抗体与Tie2结合约10％，其通过例如放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施例中，结合至Tie2的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9至10-13M)。在某些实施例中，抗Tie2拮抗剂抗体结合至Tie2的表位，其在不同物种的Tie2是保守的。
本文中的术语“抗体”以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及抗体片段，只要它们展示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab’)2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)及抗原片段形成的多特异性抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。
如本文所用，“Fab”指包含重链恒定区的抗体，其包含CH1结构域或CH1结构域的足够部分以与轻链恒定区形成二硫键，但不含CH2结构域或CH3结构域。如本文所用，Fab可以包含铰链区的一个或多个氨基酸。因此，如本文所用，术语“Fab”涵盖Fab’抗体。Fab可以包含另外的非天然氨基酸，例如C末端半胱氨酸，在这种情况下，其可能是指为Fab-C。如下文所述，术语Fab-C也涵盖包含铰链区的天然氨基酸(包括位于C末端处的天然半胱氨酸)的Fab。在一些实施例中，Fab包含工程化半胱氨酸(即，Fab可以为THIOMAB)。在一些实施例中，工程化半胱氨酸为位于Fab HC和/或LC多肽序列中的半胱氨酸氨基酸残基，其被取代为非半胱氨酸氨基酸残基。
“Fab-C”指具有C末端半胱氨酸的Fab，其可以为出现在该残基位置处的天然半胱氨酸(例如来自铰链区的半胱氨酸)，或者可以为添加到C末端的不对应于天然半胱氨酸的半胱氨酸。
“Fab-SH”指具有游离硫基基团的Fab。在一些实施例中，该游离巯基基团定位在Fab的C末端的最后10个氨基酸处。Fab-C抗体通常也为Fab-SH抗体。
与参考抗体“结合在相同表位的抗体”所指的抗体，是在竞争性测定中阻断参考抗体与其抗原结合50％或更多，且反之，参考抗体在竞争性测定中阻断该抗体与其抗原结合50％或更多。本文提供了一种示例性的竞争测定。
术语“嵌合”抗体指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别(class)”是指为其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且那些中的几种可进一步分为亚类(同种型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文中使用的术语“缀合物”，根据其最广泛的定义，意为接合或连接在一起。当分子如同它们接合在一起那样动作或操作时，则分子“经缀合”。“缀合物”为与一个或多个异源分子缀合的抗体(例如，Fab)，该异源分子包括但不限于多元醇。在特定的实施例中，“缀合物”指与多臂部分共价结合的抗体(例如，抗体片段，如本文中详述)。在特定的实施例中，该多臂部分为多元醇、IgM分子或多聚体(例如，六聚体)形式的肽。
除非另有说明，否则如本文所使用的术语“Tie2”指来自任何脊椎动物来源的任何天然Tie2，该脊椎动物包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如，人)以及啮齿类动物(例如，小鼠及大鼠)。该术语涵盖“全长”、未处理的Tie2以及在细胞处理中得到的任何形式的Tie2。该术语也涵盖天然生成的Tie2变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性人Tie2蛋白的氨基酸序列具有NCBI参考号NP_000450(SEQ ID NO:1)。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)，阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如核酸酶；抗生素；毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及以下公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应子功能(effector function)”，是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
药剂例如药物制剂的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fc区”，用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号***(也称为EU指数)进行，如Kabat等人所述(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版中所述Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)(另见上文)。
“框架(framework)”或“FR”是指除高变区(hypervariable region)(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以如下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”及“宿主细胞培养物”可互换使用，是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞及由其衍生的子代，而与传代次数无关。子代细胞的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物活性的突变子代细胞。
“人抗体(human antibody)”为具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或自利用人抗体库(antibody repertoire)或其他人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特定地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表一系列人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷)中所述的亚组。在一个实施例中，对于VL，亚组为如Kabat等人在上述文献中所述的亚组κI。在一个实施例中，对于VH，亚组为如Kabat等人在上述文献中所述的亚组III。
“人源化(humanized)”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基及来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括基本上所有至少一个(且通常两个)可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，及所有或基本上所有FR对应对于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式(humanized form)”是指已经历人源化的抗体。
术语“可变区(variable region)”或“可变结构域(variable domain)”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链及轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有类似的结构，且每个域均包含四个保守性框架区(FR)及三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)。)单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结构域中序列具有高变性(本文中也称为“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上界定的环的区域。一般而言，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，及三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3在六个HVR中表现出最多的多样性，尤其是据信H3在赋予抗体优良特异性方面发挥独特的作用。参见例如Xu等人，Immunity 13:37-45(2000)；Johnson与Wu,in Methods inMolecular Biology 248:1-25(Lo,编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。实际上，在不存在轻链的情况下，仅由重链组成的天然骆驼科抗体具有功能和稳定性。参见例如Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
HVR的许多描述在使用中，并涵盖于本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性，且为最常用者(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia替代地提及结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的中间物，并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所采用。“接触”HVR基于对可用复杂晶体结构的分析。这些HVR中的每一个的残基如下所示。
Figure BDA0003856685280000241
HVRs可包含如下“延长HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，和VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。关于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等人(见上文)编号。
术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于上文的Kabat等人中抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际线性氨基酸序列可包含较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后单个氨基酸***(根据Kabat为残基52a)和在重链FR残基82之后的***残基(例如，根据Kabat为残基82a、82b和82c等)。可通过比对给定抗体的序列同源区域与“标准”Kabat编号序列来确定该抗体的残基的Kabat编号。
当提到可变结构域中的残基时，一般使用Kabat编号***(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)(例如，Kabat等人，上文)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号***”或“EU索引”(例如，Kabat等人，上文中所报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体可变结构域中的残基编号是指Kabat编号***的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体恒定结构域中的残基编号是指EU编号***的残基编号(例如，参见美国专利申请公开第2008/0181888号，针对EU编号的图式)。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体，其包括但不限于细胞毒性剂。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人及非人类灵长类动物例如猴)、兔以及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。于某些实施例中，个体或受试者为人类。
“经分离的”抗体是从其自然环境的组分中分离出来的抗体。在一些实施例中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，通过(例如)电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或与自然染色***置不同的染色***置。
“分离的编码抗体例如抗Tie2抗体的核酸”指编码抗体重链及轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的这种核酸分子，并且这种核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。
如本文中所使用的术语“单克隆抗体(monoclonal antibody)”，指获自基本上同质抗体群体的抗体，即群体中包含的个别抗体为相同的和/或结合相同表位，但不包括(例如)含有天然生成的突变或产生于单克隆抗体制剂生产过程中的可能的变异抗体，这种变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体是针对于抗原上的单一决定簇。因此，修饰词“单克隆”表示抗体的特征是获自基本上同质的抗体群体，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，意欲根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制造，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法，本文描述这些方法及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。
“裸抗体”是指未与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然生成的免疫球蛋白分子。例如，Ig天然IgG抗体为约150,000道耳顿、由二条相同的轻链及二条相同的重链经二硫键键合所构成的异四聚体糖蛋白。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是轻链恒定(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可被归类为两种类型中的一种，称为卡帕(κ)及兰姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明，该说明包含有关使用这种治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告等信息。
相对于参照多肽序列所述的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，定义为候选序列中氨基酸残基与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，在比对序列并引入差异后(如有必要)，可实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。为确定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行的比对可通过本领域中技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech，Inc.)编写，源代码已与用户文文件一起存盘于美国版权局，华盛顿特区，20559，并以美国版权注册号TXU510087进行注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚南旧金山的基因泰克公司(Genentech，Inc.)公开获得，也可以从源代码进行编译。ALIGN-2程序应编译为在UNIX操作***(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，并且没有变化。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对、与、或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其或者表述为给定氨基酸序列A，其对、与、或相对于既定氨基酸序列B具有或包含一定％的氨基酸序列同一性)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是序列比对程序ALIGN-2在A与B程序比对中评分为同一匹配的氨基酸残基数，Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，否则如前一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得本文使用的所有％氨基酸序列同一值。
术语“药物制剂”是指以下制剂，其形式为允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不包含对制剂将施用的受试者具有不可接受的毒性的其他成分。
“药用载体”是指药物制剂中除对受试者无毒的活性成分以外的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“多元醇”广义上是指多羟基之醇化合物。例如，多元醇可以为任何水溶性聚(环氧烷)聚合物，并且可具有线性链或分支链。优选的多元醇包括那些在一个或多个羟基位置经化学基团例如具有介于一个与四个之间的碳的烷基取代的。典型地，多元醇为聚(烷二醇)，优选为聚乙二醇(PEG)。然而，本领域技术人员将认识到，其他多元醇类例如聚丙二醇及聚乙二醇-聚丙二醇共聚物，可使用本文针对PEG描述的用于缀合的技术采用的。本公开的多元醇包括那些本领域众所周知的以及那些可例如从可商业获得的来源公开获得的。
如本文中所使用的“治疗(treatment)”(及其语法变体，例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)，是指试图改变受治疗受试者的疾病自然病程的临床干预，并且可进行预防或在临床病理过程中执行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
如本文所用，术语“载体”是指能够传递与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入该宿主细胞的基因体中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。
“端口递送***”或“PDS”为用于眼部的可植入装置，其具有可再填充的储器，允许在延长的时间内进行治疗剂的递送。植入物是构造为具有与储器连通的再填充端口以及决定将药物释放至眼内的速率的释放控制元件。参见，例如，US20100174272、8,277,830、8,399,006、8,795,712和8,808,727。
“小口径针”是指用于流体组合物的注射用针，其为约30、29、28、27、26、25、24、23或22号或更高，例如30号针。在一些实施例中，该小口径针具有标准尺寸的针壁。在另一实施例中，该小口径针具有薄针壁，其对于黏性溶液可能为优选的。
Ⅱ.组合物及方法
本文提供新颖Tie2激动剂，其激活Tie2功能，如通过例如Tie2的磷酸化而得以证明。在内源性激动剂Ang1不足或不存在的情况下，直接促效更有效地激活Tie2信号传导，驱动视力改善，从而可能在治疗上具有优势。因为Tie2的激活剂可能既阻断Ang2的结合(阻断Ang2拮抗剂功能)也直接结合Tie2以激活Tie2活性，例如，增加Tie2和/或Akt的磷酸化，故其可能比Ang2的抑制剂更具优势。已经表明，Tie2的激活需要Tie2在与配体结合时聚集，据此，本文提供的Tie2激动剂为多聚的，优选为六聚的或八聚的。本文所述的多聚Tie2激动剂可具有额外的出乎意料的优势，即，在体外或体内不显著降低细胞Tie2水平。此外，本文所述的多聚Tie2激动剂可经调配以进行玻璃体内注射，并且具备赋予优势药代动力学并因此赋予药效动力学的分子尺寸。提供数据以显示，多聚Tie2激动剂降低内皮细胞膜渗透性并强化细胞-细胞接合(参见，例如，实例10)。
在一个方面，本发明部分地基于结合Tie2的抗体。特别地，本文提供结合剂(本文中也指缀合物)，其包含超过一种抗Tie2抗体或其抗原结合片段，例如(但不限于)抗Tie2Fab。可能优选的是，该结合剂包含超过4个(例如，包含5、6、7、8、9或10个)抗Tie2抗体，例如，超过4个抗Tie2 Fab，使得Tie2结合剂与定位在细胞表面上的Tie2的结合与Tie2激活相关联。Tie2聚集也可在该结合剂与Tie2结合时发生。
在一些实施例中，具有Tie2结合剂是有利的，当其与蛋白质表面上的Tie2结合时，其并不造成该细胞表面上的Tie2蛋白水平的显著降低。在一些实施例中，激活Tie2的Tie2结合剂包含抗Tie2抗体(Fab)，该抗体对Tie2的亲和力在约0.1μM至10μM范围内。
Tie2蛋白质的激活可在体外通过使用普通技术人员已知的材料及方法测量Tie2蛋白质的磷酸化的增加(例如，通过蛋白质印迹法)或测量相关Akt蛋白质(AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1，例如，GenBank登录号NP_001014431)的磷酸化的增加而测量。在某些实施例中，提供与Tie2结合的抗体以及包含超过一种结合Tie2的抗体的组合物。本发明的抗体及包含多个抗体的组合物可用于例如诊断或治疗与Tie2功能相关的血管通透性疾病，尤其是眼部疾病。
A.示例性抗Tie2结合剂
在一个方面，本发明提供Tie2结合剂，其包含与Tie2结合的分离抗体。在一些实施例中，该Tie2结合剂包含多臂部分，其中，这些臂的每一个与抗Tie2抗体或其片段缀合或连接。在优选的实施例中，该抗Tie2抗体或其片段为抗Tie2 Fab。多臂部分的实例包括但不限于多臂多元醇(例如，聚乙二醇(PEG))、IgM以及多聚体例如六聚肽。在某些实施例中，提供Tie2结合剂，其包含超过一个抗Tie2抗体或其片段，其中，该抗Tie2抗体(当并非该Tie2结合剂的一部分，但任选形式化为全长抗体)与Tie2结合，结合亲和力为例如小于100μM、或小于50μM或小于10μM的KD和/或超过1μM的KD。应理解，亲和力是使用抗体而非包含超过一种抗Tie2抗体的Tie2结合剂测量的。在一些实施例中，亲和力为单价亲和力。此外，提供Tie2结合剂和Tie2抗体，其激活Tie2活性(例如，作为Tie2激动剂而发挥作用)。例如，Tie2的激活是通过在体外测定中测量Tie2的磷酸化的增加和/或AKT的磷酸化的增加而测量的。在一些实施例中，该Tie2结合剂并不将细胞中的Tie2蛋白质水平下调(降低)超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或85％。在另选的实施例中，该Tie2结合剂将细胞中的Tie2蛋白水平降低少于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或75％。在一些实施例中，该Tie2结合剂降低血管通透性。血管内皮细胞渗透性的降低可在体内或体外测量。在一些实施例中，Tie2结合剂可增加Tie2至细胞-细胞接合的易位和/或促成肌动蛋白和/或钙黏蛋白的结构组织化。在优选的实施例中，该Tie2结合剂包含六聚PEG分子，其中，该6个臂的每一个与抗Tie2 Fab结合。可替代地，该PEG分子包含8个臂。在一些实施例中，该Tie2结合剂包含超过1个本文所述的抗Tie2抗体或其片段。本发明还提供结合Tie2的抗Tie2抗体或其片段。在一些实施例中，该抗Tie2抗体或其片段与Tie2的Ig2结构域结合(例如，与至少部分地存在于SEQ ID NO:1的氨基酸残基23至120内的表位结合)。
在一个方面，本发明提供特异性结合Tie2的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下列的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含(a)SEQ ID NO:5(其中，X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W，且/或者X2为F、Y、L、Q、I、K或H)、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L2，以及(f)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-L3。在特定的实施例中，该CDR-H3包含SEQ ID NO:7。
在一个方面，本发明提供包含选自下列的至少一个、至少两个或全部三个VH结构域CDR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3，其中，X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W且/或X2为F、Y、L、Q、I、K或H。上述取代的全部可能组合都为SEQ ID NO:5的共有序列所涵盖。在一个实施例中，该CDR-H3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一实施例中，该CDR-H3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列
在另一方面，本发明提供包含选自下列的至少一个、至少两个或全部三个VL结构域CDR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施例中，该VL结构域包含(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含：(a)VH结构域，该VH结构域包含选自下列的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(i)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2；和(iii)包含SEQ ID NO:5(其中，X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W且/或X2为F、Y、L、Q、I、K或H)、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H3；以及(b)VL结构域，该VL结构域包含选自下列的至少一个、至少两个或全部三个VLCDR序列：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，本发明提供包含VH结构域和VL结构域的抗体，其中，该VH结构域包含：(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:5(其中，X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W，且/或者X2为F、Y、L、Q、I、K或H)、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H3；该VL结构域包含：(d)包含SEQID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2，以及(f)包含选自SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施例中，该VH结构域包含与SEQ IDNO:20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，并且该VL结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在以上任何实施例中，抗Tie2抗体可为人源化的。在一个实施例中，抗Tie2抗体包含如上述实施例中任一个所述的CDR，并且复包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一实施例中，该抗Tie2抗体包含如上述实施例中任一个中所述的CDR，并且复包含SEQ ID NO:11的VH框架FR1序列，SEQ ID NO:12的VH框架FR2序列，SEQ ID NO:13的VH框架FR3序列，和/或SEQ ID NO:14的VH框架FR4序列。在其他实施例中，该抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:15的VL框架FR1序列，SEQ ID NO:16的VL框架FR2序列，SEQ ID NO:17的VL框架FR3序列，和/或SEQ ID NO:18的VL框架FR3序列。
在另一方面，抗Tie2抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)序列，该VH序列与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在某些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗Tie2抗体保留与Tie2结合的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:20中，共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在某些实施例中，取代、***或缺失发生在CDR以外的区域(即，在FR中)。任选地，抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:20中的VH序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施例中，该VH包含选自下列的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一方面，提供抗Tie2抗体，其中，该抗体包含轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在某些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗Tie2抗体保留与Tie2结合的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:21中，共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在某些实施例中，取代、***或缺失发生在HVR以外的区域(即，在FR中)。任选地，抗Tie2抗体包含SEQ ID NO:21中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施例中，该VL包含选自下列的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，提供抗Tie2抗体，其中，该抗体包含上文提供的实施例中任一个中的VH及上文提供的实施例中任一个中的VL。在一个实施例中，该抗体包含分别为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的VH和VL序列，其包括这些序列的翻译后修饰。
在又一方面，本发明提供了一种与本文提供的抗Tie2抗体结合至同一表位的抗体。例如，在某些实施例中，提供与抗Tie2抗体结合至同一表位的抗体，其包含SEQ ID NO:20的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列。在某些实施例中，提供与Tie2片段例如Tie2的Ig1结构域内的表位结合的抗体，其中该Ig1结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸23-120。
在本发明的又一方面，根据以上实施例中的任一的抗Tie2抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施例中，抗Tie2抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一实施例中，抗体为全长抗体，例如本文所定义的完整IgG1抗体或其他抗体类别或同种型。
在又一方面，如以下章节1-7中所述，根据以上实施例中的任一的抗Tie2抗体可单独或组合地结合任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施例中，本文提供的抗体的解离常数(Kd)为≤10μM、≤100μM、≤10μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM和/或≥0.01μM、0.1μM或1μM(例如，10-5M或更低、10-6M或更多、10-8M或更低，例如，1μM至10μM，例如，0.1μM至10μM，例如，10-6M至10-9M，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一实施例中，Kd是通过放射性标记的抗原结合测定(adiolabeled antigenbinding assay，RIA)来测量。在一个方面，RIA是用所关注的抗体的Fab形式及其抗原来进行。例如，通过在滴定系列的无标记抗原的存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体涂布的平板捕获结合抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为确定测定的条件，用溶于50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)将
Figure BDA0003856685280000341
多孔板(ThermoScientific)涂布过夜，然后在室温(约23℃)下用溶于PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目标Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta等人在Cancer Res.57:4593-4599(1997)中所述的抗VEGF抗体Fab-12的评估结果一致)。然后将目标Fab过夜孵育；但是，可继续孵育更长时间(例如约65小时)，以确保达到平衡。此后，将混合物转移的捕获板上，在室温下进行孵育(例如，孵育1小时)。然后除去溶液，用溶于PBS中的0.1％聚山梨醇酯20/>
Figure BDA0003856685280000342
将板洗涤八次。当平盘干燥后，添加150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将平盘在TOPCOUNTTM伽玛计数器(Packard)上计数十分钟。选择提供小于或等于最大结合浓度的20％的各种Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一实施例，使用
Figure BDA0003856685280000343
表面等离振子共振测定法测量Kd。例如，使用
Figure BDA0003856685280000344
或/>
Figure BDA0003856685280000345
(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)在25℃用固定化抗原CM5芯片以约10反应单位(RU)进行测定。在一个方面，根据供货商的说明，用N-乙’-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚醣生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入，以获得大约10反应单位(RU)的偶联蛋白。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。在动力学测量中，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)在25℃下以约25μl/min的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。使用简单的一对一朗缪尔结合模型(one-to-one Langmuirbinding model)(/>
Figure BDA0003856685280000351
评估软件3.2版)，通过同时拟合结合及解离传感器图谱来计算缔合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon的比率。参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面电浆子共振分析测定的缔合速率超过106M-1s-1，则缔合速率可使用荧光淬灭技术测量，该技术在如光谱仪(例如具有搅拌式比色管的止流装备型分光亮度计(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光亮度计(ThermoSpectronic))中所测量的浓度增加的抗原存在下，在25℃测量PBS(pH值7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
2.抗体片段
在某些实施例中，本文提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段以及下文所述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；也可参见WO 93/16185；及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。关于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的论述，参见美国第5,869,046号专利。
在一些实施例中，Fab片段的重链的C末端终止于氨基酸“CDKTHT”(SEQ ID NO:75)、“CDKTHL”(SEQ ID NO:76)、“CDKTH”(SEQ ID NO:77)、“CDKT”(SEQ ID NO:78)、“CDK”或“CD”处。在一些实施例中，Fab片段的重链的C末端终止于序列CDKTHX(SEQ ID NO:79)处，其中，X为除T之外的氨基酸。位于C末端处的截短和/或突变可能能够降低或消除针对Fab的AHA反应活性，而不破坏热稳定性或表达。在一些实施例中，Fab片段的重链的C末端终止于氨基酸“CDKTHTC”(SEQ ID NO:80)、“CDKTHTCPPC”(SEQ ID NO:81)、“CDKTHTCPPS”(SEQ IDNO:82)、“CDKTHTSPPC”(SEQ ID NO:83)、“CDKTHTAPPC”(SEQ ID NO:84)、“CDKTHTSGGC”(SEQID NO:85)或“CYGPPC”(SEQ ID NO:86)处。在一些此类实施例中，C末端氨基酸中的游离半胱氨酸可能适于例如与聚合物例如PEG缀合。
双体抗体为具有两个抗原结合位点(其可是二价或双特异性的)的抗体片段。参见，例如，EP404097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体及四功能抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham,MA；参见例如美国第6,248,516B1号专利)。
抗体片段可通过各种技术制造，包括但不限于如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的产生。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施例中，本文所提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物如猴的可变区)及人恒定区。在又一个实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类或亚类相比于其亲本抗体已发生变更。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些方面，嵌合抗体为人源化抗体。通常，非人抗体为人源化抗体以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性及亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR如CDR(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的对应残基取代，以例如恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如：Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；US专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(具体描述了决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)；和Klimka等人，Br.J.Cancer，83:252-260(2000)(描述了FR改组的“指导选择”法)。
可以用于人源化的人抗体框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚群的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等人J.Immunol.，151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro与Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)；和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施例中，本文所提供的抗体为人抗体。可使用此领域中所公知的各种技术生产人抗体。人抗体一般性描述于：van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)；和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这种动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。有关从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。另见例如：美国专利号6,075,181和6,150,584(描述了XENOMOUSETM技术)；美国专利号5,770,429(描述了
Figure BDA0003856685280000381
技术)；美国专利号7,041,870(描述了K-M/>
Figure BDA0003856685280000382
技术)；及美国专利申请公开号US 2007/0061900(描述了/>
Figure BDA0003856685280000383
技术)。由这些动物产生的来源于完整抗体的人可变区可被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区结合来修饰。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法进行制备。用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有描述。(参见例如：Kozbor J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147:86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括描述于例如以下文献中的那些：美国第7,189,826号专利(描述了由杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)，和Ni，Xiandai Mianyixue，226(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于以下文献中：Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3):927-937(2005)；和Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology，27(3):185-91(2005)。
人抗体也可以通过分离选自人源性噬菌体展示库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将这种可变结构域序列与所需的人恒定结构域结合。下文描述了从抗体库中选择人抗体的技术。
5.来源于文库的抗体
用于本发明的抗体可通过筛选组合文库中具有所需的一种或多种活性的抗体来分离。例如，此领域中所知的多种方法用于产生噬菌体展示库并筛选这些库中具有所需的结合特性的抗体。这些方法综述于例如：Hoogenboom等人，收录于Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等人主编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中，并且进一步描述于例如：McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，收录于Methodsin Molecular Biology 248:161-175(Lo主编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体库中随机重组，然后可按照以下文献所述的方法筛选抗原结合噬菌体：Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段展示抗体片段。来自免疫源的库无需构建杂交瘤即可向免疫原提供高亲和力抗体。可替代地，可以在不进行任何免疫作用的情况下克隆所有天然组成成分(例如，来自人)以向各种非自身以及自身抗原提供抗体的单一来源，如Griffiths等人在EMBO J.12:725-734(1993)中所述。最后，还可以通过克隆干细胞中未重排的V基因片段，并使用包含随机序列的PCR引子来编码高变异性CDR3区并在体外完成重排，由此合成天然库，如Hoogenboom和Winter在J.Mol.Biol.，227:381-388(1992)中所述。描述人抗体噬菌体库的专利公开包括例如：美国第5,750,373号专利及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体库分离的抗体或抗体片段在本文中被任务是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
于某些实施例中，本文提供的抗体为多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，结合特异性之一为对Tie2的结合特异性，而其他特异性则为针对任何其他抗原。在一些方面，双特异性抗体可与Tie2的两个不同表位结合。双特异性抗体可与Tie2的两个不同表位结合。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见：Milstein等人，Nature 305:537，1983；WO 93/08829；和Traunecker等人，EMBO J.10:3655，1991)和“突出物入孔”工程化(参见例如美国第5,731,168号专利)。多特异性抗体也可通过以下方法制备：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程静电转向效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，美国专利第4,676,980号；和Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双链抗体片段(参见，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及按照例如Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所述的方法制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(Octopus antibodies)(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与Tie2以及另一不同抗原结合的抗原结合位点(例如，参见US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些方面，考虑到本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这种修饰包括例如抗体的氨基酸序列中的残基的缺失和/或***和/或取代。可实施缺失、***和取代的任何组合以得到最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合特征。
a)取代、***和删除变体
在某些方面，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目标位点包括HVR和FR。保守取代列于表1的“优选取代”标题下。表1中的“示例性取代”标题下提供了更多实质性变更，并且下文将参考氨基酸侧链类别进行进一步描述。可将氨基酸取代引入目标抗体中，并筛选具有所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合特征、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA0003856685280000411
氨基酸可根据常见的侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守性替换需要将这些类别中的一类的成员交换为另一类的成员。
一种类型的取代变体涉及取代一个或多个亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如提高亲和力、降低免疫原性)上具有修饰(例如，改善)和/或基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文所述的那些。简言之，一个或多个HVR残基发生突变，并且变异抗体在噬菌体上展示并筛选出特定的生物活性(例如，结合亲和力)。
可以在CDR中进行更改(例如，取代)，以改善抗体亲和力。这种修改可以在CDR“热点”中进行，即由密码子编码的残基在体细胞成熟过程中经历发生高频突变(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基，并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并从二级文库中重新选择以实现亲和力成熟，例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人主编，HumanPress，Totowa，NJ，(2001))中所述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建第二库。然后筛选该库，以识别具有所需的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法是CDR定向方法，其中将几个CDR残基(例如，每次4-6个残基)随机化。可通过例如丙氨酸扫描诱变或建模以特异性识别参与抗原结合的CDR残基。特别地，CDR-H3和CDR-L3经常成为靶点。
在某些方面，在一个或多个CDR内可能发生取代、***或缺失，只要此等修改不显著降低抗体以结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，本文所提供的保守性取代)。例如，这种修改可能在CDR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个CDR均未改变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham与Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于识别可能诱变的抗体残基或区域的一种有用的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。可替代地或另外地，可使用抗原-抗体复合物的晶体结构来识别抗体与抗原之间的接触点。这种接触残基和邻近残基可靶向或消除为取代的候选物。可筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端融合体的长度，从一个残基到包含一百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括与抗体的N末端或C末端融合的酶(例如，对于ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽。
b)醣基化变体
在某些实施例中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。抗体中添加或删除醣基化位点可通过改变氨基酸序列以使得产生或去除一个或多个醣基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，可改变与其相连的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支化的双触角寡糖，其通常通过N键连接至Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在双触角寡糖结构的“茎”中连接至GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施例中，提供了具有缺少(直接或间接地)连接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这种抗体中的岩藻糖含量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算Asn297糖链中岩藻糖的平均含量来测定岩藻糖相对于通过MALDI-TOF质谱测得的连接至Asn 297的所有糖结构(例如复杂型、杂合型和高甘露糖型)的总和的含量，例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区297位附近的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；但是，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸处，即由于抗体的微小序列变化而介于294和300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是在实例11中)；和敲除细胞系，例如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng，94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供了具有二等分的寡糖的抗体变体，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc平分。这种抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这种抗体变体的实例描述于例如：WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国第6,602,684号专利(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在寡糖上具有至少一个连接至Fc区的半乳糖残基的抗体变体。这种抗体变体可具有改善的CDC功能。这种抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在某些实施例中，可在本文所提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如，取代)。
在某些实施例中，本发明考虑了一种具有一部分但非全部效应子功能的抗体变体，使其成为以下应用中所需的候选抗体：其中抗体体内半衰期很重要，但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要或有害的。可实施体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的下降/耗尽。例如，可实施Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞则表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。FcR在造血细胞上的表达汇总于Ravetch和Kinet的论文(Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991))的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定方法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362中(参见例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可采用非放射性测定方法(参见例如：用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox
Figure BDA0003856685280000451
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于这种测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可在例如Clynes等人在Proc.Natl Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中在体内评估目标分子的ADCC活性。还可实施C1q结合测定以确认该抗体无法结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可实施CDC测定(参见例如：Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合及体内清除率/半衰期测定也可使用本领域中已知的方法进行(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能下降的抗体包括一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329被取代的抗体(美国第6,737,056号专利)。这种Fc变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个取代的Fc变体，包括所谓的“DANA”Fc变体，其中残基265和297被丙氨酸取代(美国专利号7,332,581)。
其中描述了某些与FcR的结合能力得到改善或减弱的抗体变体。(参见，例如，美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施例中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，这些取代改善了ADCC，例如Fc区的298、333和/或334位(残基的EU编号)处的取代。
在一些实施例中，在Fc区中进行修改，得到修改(即改善或减少)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)所述。
具有更长半衰期并改善了与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移给胎儿，见Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，其改善了Fc区与FcRn的结合。这种Fc变体包括在一个或多个Fc区残基上发生取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
另参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351涉及Fc区变体的其他实例。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施例中，可能希望创建半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代残基出现在抗体的可进入的位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性巯基团由此被定位在抗体的可进入的位点，并可用于使抗体与其他部分(例如药物部分或接头-药物部分)缀合，以形成免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施例中，以下任何一个或多个残基可被半胱氨酸取代：轻链的V205(EU编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可按照例如美国第7,521,541号专利所述的方法产生。
e)抗体衍生物
在某些实施例中，可进一步修饰本文所提供的抗体，以使其包含本技术领域中已知且容易获得的附加的非蛋白质部分。适用于抗体的衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)以及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其水中的稳定性而可能在制造中具有优势。该聚合物可具有任何分子量，并且可以为支链聚合物或非支链聚合物。连接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接的聚合物超过一种，则它们可以为相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，这些考虑因素包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗中等。
在另一个实施例中，提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质部分为纳米碳管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605，2005)。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但是将非蛋白质部分加热至接近抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用重组方法和组合物来生产抗体，例如US 4,816,567中所述。在一个实施例中，提供编码如本文中抗Tie2抗体的经分离的核酸。这种核酸编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在进一步实施例中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步实施例中，提供包含此核酸的宿主细胞。在此实施例中，宿主细胞包含(例如，已转化)：(1)包含核酸的载体编码包含抗体的VL的氨基酸序列及包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体编码包含抗体的VL的氨基酸序列及包含核酸的第二载体编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施例中，宿主细胞为真核细胞，例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个方面，提供了一种制备抗Tie2抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含如上所述的编码抗体的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收该抗体。
在重组生产抗Tie2抗体时，将例如上述的编码抗体的核酸分离并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可通过常规方法(例如，使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)轻易地分离并定序。
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可能在细菌中产生，特别是在无需醣基化和Fc效应子功能的情况下。有关抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国第5,648,237、5,789,199和5,840,523号专利。(另见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo主编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其中描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达后，抗体可与细菌细胞糊中的可溶性部分分离，并可经过进一步纯化。
除原核生物以外，真核微生物(如丝状真菌或酵母菌)也为合适的抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而导致具有部分或完全人糖基化模式的多肽的产生。参见：Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在基因转殖植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，可使用适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系。可用哺乳动物宿主细胞系的其他实例包括：由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(例如，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(例如，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人子***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(例如，Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)所述)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。有关某些适用于抗体生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如：Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo主编，HumanaPress，Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定
可采用此领域中所已知的各种测定法对本文所提供的抗Tie2抗体的物理/化学性质和/或生物活性进行鉴别、筛选或表征。
1.结合测定及其他测定
在一个方面，通过已知方法例如ELISA、
Figure BDA0003856685280000491
FACS或蛋白质印迹法测试本发明的抗体的抗原结合活性。
在另一方面，可使用竞争测定来鉴定与抗Tie2抗体竞争的抗体，该抗Tie2抗体(本文中称为Tie2.1M100cF)包含用于与Tie2结合的VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:20的序列，而该VL包含SEQ ID NO:21的序列。在某些实施例中，此竞争性抗体与为抗Tie2抗体所结合的同一表位(例如，线性或构形表位)结合，该抗Tie2抗体包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:20的序列，而该VL包含SEQ ID NO:21的序列。用于将表位映射至抗体结合的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”(在Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中)。
在一种示例性竞争测定中，将固定化Tie2置于包含与Tie2结合的第一标记抗体(例如，Tie2.1M100cF)及第二无标记抗体(正在测试其与第一抗体竞争与Tie2结合的能力)的溶液中孵育。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化Tie2置于包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中进行孵育。在允许第一抗体与Tie2结合的条件下孵育后，去除多余的未结合抗体，并测量与固定化Tie2相关联的标记物的量。如果测试样品中与固定化Tie2相关的标记物的数量相对于对照样品而言明显减少，则表明第二抗体正在与第一抗体竞争与Tie2的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定
在一个方面，提供鉴定以辨认具有所需生物活性的其抗Tie2抗体的测定法。生物活性可能包括，例如，在体内、体外或拟体内，与Tie2或其片段结合、与Ang1和/或Ang2竞争与Tie2的结合、激活Tie2蛋白质的磷酸化、激活Akt的磷酸化和/或降低血管内皮细胞通透性。还提供了在体内和/或体外具有这种生物活性的抗体。在某些实施例中，测试本发明的抗体的这种生物活性。
在一些实施例中，提供用于测定Tie2激活(抗Tie2缀合物)活性的测定法，例如通过磷-AKT(pAKT)测定法，其中，通过Tie2缀合物激活AKT磷酸化指示该缀合物具有激活(激动剂)活性。如普通技术人员已知的以及如下文实例3中所述，AKT的激活可通过各种方法予以证明，包括例如使用对经磷酸化的AKT为特异性的抗体进行对经磷酸化的AKT的蛋白质印迹检测或通过FRET测定法。
在一些实施例中，提供用于测定抗Tie2抗体或抗体缀合物、融合蛋白或其聚合性制剂的稳定性(例如，热稳定性)的测定法。例如，抗体或抗体缀合物、融合蛋白或其聚合性制剂的稳定性可使用本领域中已知的任何方法测定，例如，差示扫描荧光测定法(DSF)、圆二色光谱法(CD)、蛋白质内源荧光、差示扫描热量法、光谱法、光散射(例如，动态光散射(DLS)及静态光散射(SLS))、自相互作用色谱法(SIC)。
在一些实施例中，提供用于测定抗Tie2缀合物的稳定性的测定法。测定的稳定性可如本文所述者测定，例如，使用毛细管电泳激光诱导荧光(CE-LIF)，如例如实例13中所述的进行。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含如本文所述的抗Tie2抗体的免疫缀合物，其缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂，例如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，来源于细菌、真菌、植物或动物的蛋白毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
E.缀合物
本发明还提供缀合物，其包含与一种或多种异源分子例如多元醇缀合的本文所提供的任何抗Tie2抗体或其Tie2缀合片段。
1.多臂聚合物
在一些实施例中，本公开的缀合物可通过下述作成：通过将抗Tie2Fab或其变体与多臂聚合物缀合而将本文所述的抗Tie2抗体衍生化。应当理解，提供具有所需尺寸或所选平均分子量的本文所述的缀合物的任何多臂聚合物为适用于在构建本发明的抗体-聚合物缀合物中使用。
多种聚合物适用于医药中。参见，例如，Davis等人，Biomedical Polymers:Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use,pp.441-451(1980)。在本公开的一些实施例中，使用非蛋白质性聚合物来形成本公开的缀合物。该非蛋白质性聚合物通常为亲水性合成聚合物，即，自然界中尚未发现的聚合物。然而，自然界中存在以及通过重组或体外方法制造的聚合物也可能是可用的，从天然来源分离的聚合物也可能是可用的。
在一些实施例中，通过将Fab或其变体与多臂多元醇缀合(例如，共价连接)而将抗Tie2 Fab衍生化。因此，在一些实施例中，本公开针对包含与一种或多种多臂多元醇(优选六臂多元醇)共价连接的本文所公开的一种或多种抗Tie2 Fab或其变体的缀合物。所采用的多元醇可以为任何水溶性聚(环氧烷)聚合物，并且可具有直链或支链。合适的多元醇包括那些在一个或多个羟基位置经化学基团例如具有介于一个与四个之间的碳的烷基取代的那些。典型地，该多元醇为聚(烷二醇)，例如聚乙二醇(PEG)，因此，为了易于描述，讨论的剩余部分为关于一种示例性实施例，其中所采用的多元醇为PEG，并且将该多元醇与多肽缀合的制程称为“PEG化”。然而，本领域技术人员将认识到，其他多元醇类例如聚丙二醇及聚乙二醇-聚丙二醇共聚体，可使用类似于本文针对PEG描述的那些的用于缀合的技术采用的。
用来形成本公开的缀合物的多元醇为多臂多元醇。如本文所用，“多臂多元醇”是指包含核心结构的多元醇，并且至少两个臂附接至该核心结构。该多臂多元醇可为，例如，二聚体(两个臂)、四聚体(四个臂)、六聚体(六个臂)、八聚体(八个臂)等。在一些方面，该多臂多元醇为多臂PEG。
在抗Tie2抗体或抗体变体的PEG化中使用的多臂PEG的重均分子量可变，并且通常可为约500至约300,000道尔顿(D)的范围。在一些实施例中，该多臂PEG的重均分子量为约1,000至约100,000D、约1,000至约40,000D、约1,000至约20,000D、约1,000至约10,000D、约10,000至约20,000D、约5,000至约10,000D或约1,000至5,000D。在优选的实施例中，使用重均分子量为约6,000D的多臂PEG进行PEG化。
多种用于蛋白质PEG化的方法为本领域中已知的。制造与PEG缀合的蛋白质的具体方法包括美国专利第4,179,337号、美国专利第4,935,465号及美国专利第5,849,535号中所述的方法，这些美国专利全部通过引用而以其整体并入本文。通常，该蛋白质经由该蛋白质的氨基酸残基中的一者或多者与该聚合物上的末端反应性基团共价结合。本文中，具有这些反应性基团的聚合物涉及为经激活或官能化的聚合物(例如，经官能化的PEG)。该反应性基团选择性地与该抗体或抗体变体上的游离巯基或氨基或其他反应性基团反应。该多臂PEG聚合物可以随机或位点特异性方式与该抗体或抗体变体上的巯基或氨基或其他反应性基团偶合。然而，应理解，为了获得最优结果，所选择的反应性基团的类型及量以及所采用的聚合物的类型及量将取决于所采用的特定抗体或抗体变体，以限制并优选基本上阻止该反应性基团与该抗体上太多的活性基团反应。由于在一些情况下或许不可能充分限制或阻止这一点，对于每摩尔的抗体，通常可采用约0.05至约1000摩尔或在一些实施例中约0.05至约200摩尔的经官能化的聚合物，取决于抗体浓度。对于每摩尔抗体，经官能化的聚合物的最终量为下述的评估：维持最优活性，同时优化(如果可能)该抗体于玻璃样液、视网膜和/或眼房液中的半衰期。
尽管残基可以为该抗体或抗体变体上的任何氨基酸，例如N末端氨基酸基团，但在一些实施例中，该反应性基团为半胱氨酸，其通过其游离巯基团与经官能化的聚合物的反应性基团连接，例如，如WO 99/03887、WO 94/12219、WO 94/22466、美国专利第5,206,344号、美国专利第5,166,322号及美国专利第5,206,344号中所示，该等专利全部通过引用而以其整体并入本文。在此类实施例中，该聚合可包含能够与亲本抗体上的巯基或巯基团特异性反应的至少一个末端反应性基团。此类基团包括但不限于，马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、环氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀酰亚胺基酯、-NH2、醛、卤代乙酸酯、卤代乙酰胺及对硝基苯基碳酸酯等。该聚合物可使用适用于所选偶合***化学特性的任何方案与亲本抗体偶合，例如美国专利第4,179,337号、美国专利第7,122,636号和Jevsevar,等人，Biotech J.,Vol.5,pp.113-128(2010)中所述的方案及***。可替代地，该反应性氨基酸可以为赖氨酸，其通过其游离ε-氨基基团(参见，例如，通过引用并入本文的WO93/00109)与经官能化的聚合物的反应性基团连接；或谷氨酸或天冬胺酸，其通过酰胺键与聚合物连接。然后，该聚合物的反应性基团可与例如蛋白质的α(alpha)和ε(epsilon)胺或巯基基团反应以形成共价键。应当理解，本公开并不限于在抗体或抗体片段与聚合物之间使用特定类型的连接的缀合物。
适用于制备本公开的缀合物的经官能化的多臂PEG可通过大量常规反应制造。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯(M-NHS-PEG)可从PEG-单甲醚通过与N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应而制备，根据Buckmann与Merr,Makromol.Chem.,Vol.182,pp.1379-1384(1981)的方法进行。此外，PEG末端羟基基团可转化为与氨基基团，例如，通过与亚硫酰溴反应以形成PEG-Br，之后通过使用过量的氨进行氨解以形成PEG-NH2。然后，可使用标准偶合试剂例如Woodward氏试剂K将PEG-NH2与感兴趣的抗体或抗体变体缀合。此外，可例如通过使用MnO2进行氧化而将PEG末端CH2OH基团转化为醛基团。可通过使用试剂例如氰基硼氢化物进行还原性烷基化而将该醛基团与抗体或抗体变体缀合。
在一些实施例中，用来制备本公开的缀合物的多臂PEG具有通式(I)的结构：
Figure BDA0003856685280000541
其中，该PEG为相同或不同的–(CH2CH2O)m-，其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立地为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200或约100至约150的整数；并且l为≥2的整数，优选为2或3。
在一些实施例中，该多臂PEG具有通式(I)的结构，其中，l为2，以及，该多臂PEG为六聚体。在另一实施例中，该多臂PEG具有通式(I)的结构，其中，l为3，以及，该多臂PEG为八聚体。
可使用上揭的任何技术将具有通式(I)的结构的多臂PEG官能化以产生经官能化的多臂PEG，以例如附接适用于与抗体(例如，抗体片段)反应或缀合的末端反应性基团。然而，在其他实施例中，该多臂PEG可通过多官能交联剂与抗Tie2抗体共价连接，该交联剂与待交联的该PEG以及该抗体或抗体变体的一个或多个氨基酸残基反应，如例如美国专利第7,122,636号中所述，该专利通过引用而以其整体并入本文。
在其他方面，用来制备本公开的缀合物的多臂PEG为包含至少一个末端反应性基团的经官能化的多臂PEG。该末端反应性基团可直接与抗Tie2抗体缀合以形成本公开的缀合物。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构：
Figure BDA0003856685280000542
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200、或约20至30或约100至约150的整数；以及，n为约1至约10的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团。在一些实施例中，R2独立地选自硫醇反应性基团、氨基反应性基团及其组合。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为2至3的整数。在优选的实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为2，以及，该多臂PEG为六聚体。在另一实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为3，以及，该多臂PEG为八聚体。在优选的实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为2，如第39图中所示。
在另一实施例中，用来制备本公开的缀合物的多臂PEG具有通式(II)的结构：
Figure BDA0003856685280000551
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立地为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200或约100至约150的整数；并且n为约1至约10的整数。
在一些实施例中，该多臂PEG具有通式(II)的结构，其中，n为2，以及，该多臂PEG为四聚体。在另一实施例中，该多臂PEG具有通式(II)的结构，其中，n为4，以及，该多臂PEG为六聚体。在另一实施例中，该多臂PEG具有通式(II)的结构，其中，n为6，以及，该多臂PEG为八聚体。
在另一实施例中，用来制备本公开的缀合物的多臂PEG具有通式(III)的结构：
Figure BDA0003856685280000561
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立地为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200或约100至约150的整数；并且n为约1至约10的整数。
在一些实施例中，该多臂PEG具有通式(III)的结构，其中，n为2，以及，该多臂PEG为四聚体。在另一实施例中，该多臂PEG具有通式(III)的结构，其中，n为4，以及，该多臂PEG为六聚体。在另一实施例中，该多臂PEG具有通式(III)的结构，其中，n为6，以及，该多臂PEG为八聚体。
在另一实施例中，用来制备本公开的缀合物的多臂PEG具有通式(IV)的结构：
Figure BDA0003856685280000562
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立地为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200、或约100至约150的整数。
可使用上述的任何技术将具有通式(I)至(IV)中任一者的结构的多臂PEG官能化以产生经官能化的多臂PEG，以例如附接适用于与抗体(例如，抗体片段)反应或缀合的末端反应性基团。然而，在其他实施例中，该多臂PEG可通过多官能交联剂与抗Tie2抗体共价连接，该交联剂与待交联的该PEG以及该抗体或抗体变体的一个或多个氨基酸残基反应，如例如美国专利第7,122,636号中所述，该专利通过引用而以其整体并入本文。
在其他方面，用来制备本公开的缀合物的多臂PEG为包含至少一个末端反应性基团的经官能化的多臂PEG。该末端反应性基团可直接与抗Tie2抗体缀合以形成本公开的缀合物。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构：
Figure BDA0003856685280000571
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200或约100至约150的整数；以及，n为约1至约10的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团。在一些实施例中，R2独立地选自硫醇反应性基团、氨基反应性基团及其组合。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为1至3的整数。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为1，以及，该多臂PEG为四聚体。于另一实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为2，以及，该多臂PEG为六聚体。在另一实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)的结构，其中，n为3，以及，该多臂PEG为八聚体。在此类实施例中，该六聚体具有通式(Ib)的结构：
Figure BDA0003856685280000572
其中，m、R1和R2如上文所定义。
具有通式(Ib)的结构的多臂PEG具有二季戊四醇(DP)核心结构，并且本文中也称为DP六聚体。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ib)或(Ic)的结构，其中，每个R1当存在时为相同或不同，并且当R1与R2合并在一起时选自
Figure BDA0003856685280000581
Figure BDA0003856685280000582
Figure BDA0003856685280000583
以及/>
Figure BDA0003856685280000584
及其组合；其中，每个i独立地为0至10的整数；j为0至10的整数；以及R2如本文中所定义。在一些实施例中，每个R1为连接基团。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ib)或(Ic)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000585
其中，i、j和R2如本文中所定义。在一些实施例中，当R1与R2合并在一起时为/>
Figure BDA0003856685280000586
其中，i为2；j为2或3，以及，R2如本文中所定义。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ib)的结构，其中，每个R2独立地选自马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、过氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀酰亚胺基酯、-NH2、醛、卤代乙酸酯、卤代乙酰胺、及对硝基苯基碳酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其组合的卤代乙酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、氯乙酰胺及其组合的卤代乙酰胺。在一些实施例中，R2为马来酰亚胺。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)的结构，其中每个R2为马来酰亚胺。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000591
其中，i和j如上文中所定义。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为/>
Figure BDA0003856685280000592
其中，i为2且j为2。
在另一方面，用来制备本公开的缀合物的经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构
Figure BDA0003856685280000593
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200或约100至约150的整数；以及，n为约1至约10的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团。在一些实施例中，R2独立地选自硫醇反应性基团、氨基反应性基团及其组合。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，n为2至6的整数。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，n为2，以及，该多臂PEG为四聚体。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，n为3。在另一实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，n为4，以及，该多臂PEG为六聚体。在另一实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，n为6，以及，该多臂PEG为八聚体。具有通式(IIa)的结构的八聚体具有六甘油(HG)核心结构，并且本文中也称为HG八聚体。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，每个R1当存在时为相同或不同，并且当R1与R2合并在一起时选自
Figure BDA0003856685280000601
Figure BDA0003856685280000602
以及/>
Figure BDA0003856685280000603
及其组合；其中，每个i独立地为0至10的整数；j为0至10的整数；以及R2如本文中所定义。在一些实施例中，每个R1为连接基团。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000604
其中，i、j和R2如本文中所定义。在一些实施例中，当R1与R2合并在一起时为/>
Figure BDA0003856685280000605
其中，i为2；j为2或3，以及，R2如本文中所定义。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，每个R2独立地选自马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、过氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀酰亚胺基酯、-NH2、醛、卤代乙酸酯、卤代乙酰胺、及对硝基苯基碳酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其组合的卤代乙酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、氯乙酰胺及其组合的卤代乙酰胺。在一些实施例中，R2为马来酰亚胺。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中每个R2为马来酰亚胺。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000611
其中，i和j如上文中所定义。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为/>
Figure BDA0003856685280000612
其中，i为2且j为2。
于另一方面，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构：
Figure BDA0003856685280000613
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立为约45至约1000、或约3至约250、或约50至约200或约100至约150的整数；以及，n为约1至约10的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团。在一些实施例中，R2独立地选自硫醇反应性基团、氨基反应性基团及其组合。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，n为2至6的整数。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，n为2，以及，该多臂PEG为四聚体。在另一实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，n为4，以及，该多臂PEG为六聚体。在另一实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，n为6，以及，该多臂PEG为八聚体。具有通式(IIIa)的结构的八聚体具有六甘油(HGEO)核心结构，并且本文中也称为HGEO八聚体。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，每个R1当存在时为相同或不同，并且当R1与R2合并在一起时选自
Figure BDA0003856685280000621
Figure BDA0003856685280000622
以及/>
Figure BDA0003856685280000623
及其组合；其中，每个i独立地为0至10的整数；j为0至10的整数；以及R2如本文中所定义。在一些实施例中，每个R1为连接基团。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000624
其中，i、j和R2如本文中所定义。在一些实施例中，当R1与R2合并在一起时为/>
Figure BDA0003856685280000625
其中，i为2；j为2或3，以及，R2如本文中所定义。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，每个R2独立地选自马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、过氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀酰亚胺基酯、-NH2、醛、卤代乙酸酯、卤代乙酰胺、及对硝基苯基碳酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其组合的卤代乙酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、氯乙酰胺及其组合的卤代乙酰胺。在一些实施例中，R2为马来酰亚胺。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中每个R2为马来酰亚胺。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000631
其中，i和j如上文中所定义。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IIIa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000632
其中，i为3且j为2。
于另一方面，该经官能化的多臂PEG具有通式(IVa)的结构：
Figure BDA0003856685280000633
其中，每个m表示该多元醇(PEG)的特定臂的长度或尺寸并且独立为约45至约1000、约3至约250、或约50至约200或约100至约150的整数；每个R1独立地或不存在或为连接基团；以及，每个R2独立地或为氢或为末端反应性基团；其中，至少一个R2为末端反应性基团。在一些实施例中，R2独立地选自硫醇反应性基团、氨基反应性基团及其组合。
具有通式(IVa)的结构的多臂PEG具有丁二醇核心结构，并且本文中也称为DX八聚体。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IVa)的结构，其中，每个R1当存在时为相同或不同，并且当R1与R2合并在一起时选自
Figure BDA0003856685280000641
Figure BDA0003856685280000642
以及/>
Figure BDA0003856685280000643
及其组合；其中，每个i独立地为0至10的整数；j为0至10的整数；以及R2如本文中所定义。在一些实施例中，每个R1为连接基团。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IVa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000644
其中，i、j和R2如本文中所定义。在一些实施例中，当R1与R2合并在一起时为/>
Figure BDA0003856685280000645
其中，i为2；j为2或3，以及，R2如本文中所定义。
在一些实施例中，每个R2独立地选自马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、过氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀酰亚胺基酯、-NH2、醛、卤代乙酸酯、卤代乙酰胺、及对硝基苯基碳酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其组合的卤代乙酸酯。在一些实施例中，每个R2独立地为选自溴乙酰胺、碘乙酰胺、氯乙酰胺及其组合的卤代乙酰胺。在一些实施例中，R2为马来酰亚胺。
在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IVa)的结构，其中每个R2为马来酰亚胺。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IVa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000651
其中，i和j如上文中所定义。在一些实施例中，该经官能化的多臂PEG具有通式(IVa)的结构，其中，当R1与R2合并在一起时为
Figure BDA0003856685280000652
其中，i为3且j为2。
适用于本公开的其他经官能化的多臂PEG描述于美国专利申请案公开第2011/0286956号及美国专利申请案公开第2015/0073155号中，两者都通过引用而以其整体并入本文。
适用于本公开的经官能化的多臂PEG也可自多个供货商购得。例如，JenKemTechnology,USA贩卖经马来酰亚胺官能化的PEG六聚体及八聚体(例如，6ARM(DP)-PEG-MAL和8ARM(TP)-PEG-MAL)。NOF America Corp.也贩卖经马来酰亚胺官能化的PEG八聚体(例如，
Figure BDA0003856685280000653
HGEO-400MA；/>
Figure BDA0003856685280000654
DX-400MA)及四聚体(例如，/>
Figure BDA0003856685280000655
PTE-400MA)。
在特定的实施例中，所述的多臂PEG的活性衍生物为多臂PEG的活性NHS酯衍生物，具有下述通式(IV)的结构：
Figure BDA0003856685280000656
其中，R为二季戊四醇。
1.多元醇缀合物
在一些实施例中，本公开针对包含一个或多个本文所公开的抗Tie2抗体或抗体变体以及一个或多个多臂多元醇的缀合物(例如，Tie2结合剂)，其中，该缀合物通过将至少一个抗Tie2 Fab或Fab变体与多元醇共价连接而制备。在一些实施例中，该多臂多元醇为PEG。在优选的实施例中，该PEG为六聚体。在其他实施例中，该PEG为八聚体。在一些实施例中，该PEG具有通式(Ia)的结构。
本公开的缀合物可通过与每个多臂PEG缀合的抗Tie2抗体(Fab)的数量进行特征。本文中，此被称为“fab化”或“fab化程度”。与每个PEG缀合的抗Tie2 Fab的数量可依据多种因素而变，包括：1)PEG中臂的数量；2)PEG上的末端反应性基团的数量和/或反应活性；3)PEG的核心结构；和/或4)PEG化反应条件。用于制备缀合物的多臂PEG的高度多分散性在一些情况下可能使得对最终缀合物的分析复杂化，特别是使得准确地确定每个PEG的Fab数量更为困难且不确定。据此，用来形成缀合物的PEG通常将具有约1至约1.35范围内的多分散性(使用本领域已知方法测定)，并且于多个实施例中将具有约1至约1.25、约1至约1.2、约1至约1.15、约1至约1.1、约1.05或甚至约1的多分散性。
在一些实施例中，本公开的缀合物包含六臂PEG，其中，至少一个抗Tie2 Fab或变体与该PEG共价连接。在另一实施例中，本公开的缀合物包含六臂PEG，其中，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个抗Tie2 Fab与该PEG共价连接。在另一实施例中，本公开的缀合物包含八臂PEG，其中，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个抗Tie2 Fab与该PEG共价连接。在另一实施例中，本公开的缀合物包含六臂PEG，其中，至少4个、至少5个或至少6个抗Tie2 Fab与该PEG共价连接。在一些实施例中，本公开的缀合物包含六臂PEG，其中，4至6个或5至6个抗Tie2 Fab与该PEG共价连接。在另一实施例中，本公开的缀合物包含六臂PEG，其中，4至6个抗Tie2Fab与该PEG共价连接。在另一实施例中，本公开的缀合物包含六臂PEG，其中，4至6个或5个抗Tie2 Fab与该PEG共价连接。
在一些实施例中，本公开的缀合物包含具有通式(Ia)、(IIa)、(IIIa)或(IVa)中任一者的结构的多臂PEG。在此类实施例中，至少一个R2与本文所述的抗Tie2 Fab或变体共价连接。在一些实施例中，具有通式(Ia)、(IIa)、(IIIa)或(IVa)中任一个的结构的多臂PEG为六聚体，并且至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个R2基团与本文所述的抗Tie2Fab或变体共价连接。
在一些实施例中，本公开的缀合物包括其中该多臂多元醇共价附接至亲本抗体上一个或多个特定位点的品种，即，聚合物附接为以亲本抗体或抗体片段中的特定区域或者一个或多个特定氨基酸残基为靶标。可使用标准诱变技术来改变亲本抗体或抗体片段中潜在PEG化位点的数量和/或位置。因此，在氨基酸取代引入或取代氨基酸例如半胱氨酸及赖氨酸的程度上，本公开的抗Tie2抗体及其变体可含有比天然序列抗Tie2更大或更小数量的潜在PEG化位点。
如上文所述，聚合物的位点特异性缀合最常通过附接至亲本抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基而实现。在此类实施例中，偶合化学法可例如利用亲本抗体中半胱氨酸残基的未处于二硫键中的游离巯基基团。
在一些实施例中，天然存在于亲本Fab中的一个或多个半胱氨酸残基用作附接位点进行聚合物缀合。在其他实施例中，Fab或变体上的游离氨基基团可使用2-亚胺基-硫杂环戊烷(Traut氏试剂)硫醇化，然后与例如经马来酰亚胺官能化的PEG偶合，如Pedley,等人，Br.J.Cancer,Vol.70,pp.1126-1130(1994)中所述。在另一实施例中，出于向聚合物提供一个或多个特异性附接位点的目的，将一个或多个半胱氨酸残基改造到亲本Fab的选定的一个或多个位点中。
经半胱氨酸改造的抗体先前已经有所述(美国专利公开第2007/0092940号及Junutula,J.R.,et al,J.Immunol Methods,Vol.332(l-2),pp.41-52(2008)，其全部通过引用而以其整体并入本文)。在一些实施例中，经半胱氨酸改造的抗体可为亲本抗体。这些为有用于生成在特定位置(通常在恒定区内，例如，CL或CH1内)具有游离半胱氨酸的抗体片段。工程化为含有半胱氨酸的亲本抗体于本文中是指为“ThioMab”，而无论制造方法如何，自此类经半胱氨酸改造的抗体制造的Fab片段于本文中是指为“ThioFab”。如先前所述(参见，例如，美国专利公开第2007/0092940号和Junutula,J.R.,等人，J.Immunol Methods,Vol.332(l-2),pp.41-52(2008))，对于具有被替换(“改造”)的半胱氨酸(Cys)残基的突变体，评估新引入的工程化半胱氨酸巯基团的反应活性。巯基反应活性值为0至1.0范围内的相对数值项，并且可针对任何经半胱氨酸改造的抗体测量。除了具有反应性巯基团之外，应选择ThioMab使得它们保持抗原结合能力。经半胱氨酸改造的抗体的设计、选择及制备先前得以详细描述(参见，例如，WO 2011/069104，其通过引用而并入本文)。在一些实施例中，工程化半胱氨酸被引入重链或轻链的恒定结构域中。因此，经半胱氨酸改造的抗体保持其野生类型、亲本抗体对应物的抗原结合能力，并且因此能够与抗原特异性结合。
在一些实施例中，本公开为关于抗体片段-聚合物缀合物，其中，该抗体片段为Fab，以及，该聚合物附接至Fab片段的轻链或重链中的一个或多个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基一般将会形成连接轻链与重链的链间二硫键。
在另一方面，本公开为关于抗体片段-聚合物缀合物，其中，该抗体片段为Fab-C，以及，该聚合物附接为以Fab-C片段的铰链区为靶标。在一些实施例中，天然存在于抗体片段铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基被用来附接聚合物。在另一实施例中，出于向聚合物提供一个或多个特异性附接位点的目的，将一个或多个半胱氨酸残基改造到Fab-C片段的铰链区中。在一些实施例中，出于提供一个用于聚合物缀合的附接位点的目的，通过将一个半胱氨酸添加到C末端末端而修饰本文所公开的抗Tie2Fab。在另一实施例中，出于提供两个用于聚合物缀合的附接位点的目的，通过将四个另外残基CPPC(SEQ ID NO:87)添加到C末端末端而修饰本文所公开的抗Tie2 Fab。在又另一实施例中，出于提供一个用于聚合物缀合的附接位点的目的，通过将四个另外残基SPPC(SEQ ID NO:88)添加到C末端末端而修饰本文所公开的抗Tie2 Fab。
PEG化的程度及位点也可通过调节反应条件例如经官能化的PEG与蛋白质的相对浓度以及pH而控制。用于所需程度的PEG化的合适条件可通过改变标准PEG化反应的参数而经验性地确定。
抗Tie2 Fab及变体的PEG化是通过任何传统方法实施。合适的PEG化条件详述于WO2011/069104和WO 03/029420中，两者都通过引用而以其整体并入本文。
3.多元醇缀合物的表征
经PEG化的蛋白质可通过SDS-PAGE、凝胶过滤、NMR、肽图谱、液相色谱-质谱及体外生物学测定法表征。典型地，首先通过SDS-PAGE显示fab化的程度。在10％SDS中的聚丙烯酰胺凝胶电泳通常在10mM Tris-HCl pH 8.0中运行，以100mM NaCl作为洗脱缓冲液。为了证明哪一个残基被PEG化，可使用蛋白酶例如胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶执行肽图谱分析。因此，经PEG化及未经PEG化的抗体的样品可使用蛋白酶例如Lys-C蛋白酶消化，并通过例如反相HPLC的技术分离所得的肽。所产生的肽的层析图可与先前针对抗Tie2多肽测定的肽谱比较。
然后，每个峰可通过质谱法分析以验证该峰中缀合物的尺寸。依据缀合中所使用的PEG以及该峰中缀合物的尺寸，可评估与PEG缀合的抗体或其变体的数量。与PEG基团缀合的片段于进样后往往不保留在HPLC柱上并且从色谱图中消失。这种从色谱图中消失为在应含有至少一个可PEG化的氨基酸残基的特定片段上PEG化的标志。可使用本领域中已知的方法，经进一步测定PEG化的抗Tie Fab与Tie2相互作用的能力以及其他生物活性。
PEG化改变抗体药物的物理及化学特性，并且可导致改善的药代动力学行为例如改善的稳定性、降低的免疫原性、延长的循环时间以及增加的眼内滞留时间。
在一些实施例中，与相对应的未缀合的抗Tie2 Fab相比，本公开的缀合物在经由单次玻璃体内注射施用至哺乳动物(例如，人)眼睛内之后具有增加的半衰期。在一些实施例中，半衰期的增加为相对应的未缀合的抗Tie2 Fab半衰期的至少1.4倍、或至少1.8倍或至少2倍。
3.作为缀合物的IgM多聚体
在一些实施例中，本公开的Tie2结合剂可通过将超过一个本文所述的抗Tie2抗体与IgM分子的CH1结构域连接而作成，例如，使用重组表达方法以(经由肽键)将IgM CH1结构域的C末端融合至如本文所述的抗Tie2抗体的N末端。IgM被证实为可抗体治疗剂的可行形式(参见，例如，Hanala,2012,MAbs,4:555-561)。IgM的“单体”成分由两个各自含有两个Ig结构域的轻链(LC)以及两个含有五个Ig结构域及短的经截短的C末端尾部的重链(HC)组成。这四条链组成以形成HC-LC同源二聚体的异源二聚体。接着，这些同源二聚体共价关联为含有五个均二聚体和J链(JC)(五聚体)或六个均二聚体(六聚体)的环状结构，五聚体及六聚体分别含有十个及十二个结合位点。不受缚于理论，可能多个可变片段(Fv)的密切结合使得IgM能够结合靶标而无需亲和力成熟，并因此能够用作前哨适应性免疫受体。
在特定的实施例中，抗Tie2抗体为Fab。IgM蛋白质(多聚体)可包括或不包括J链，使得在J链存在下能够形成五聚体(并且可包含至多5个抗Tie2抗体)，并且在J链不存在下形成六聚体(并且可包含至多5个抗Tie2抗体)。在一些实施例中，通过改变IgM重链或轻链的比率(以形成六聚体)或重链与轻链与J链的比率(以形成五聚体)而生产六聚体。因此，在一些实施例中，该Tie2结合剂为多聚体，其包含IgM蛋白质及至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个本文所述的抗Tie2抗体以形成能够激活Tie2的多聚体。抗Tie2 IgM分子为经设计并显示以激活Tie2活性(参见，实例7)。
使用如本文所述的重组IgM形式构建的抗Tie2多聚体缀合物，由于其相对于单一Fab的相对大的分子半径潜在地导致分子扩散出玻璃体液进入眼房液内及血液内的速度较慢，故可用于眼部治疗剂。如下文实例7中所述，通过光散射评估发现流体动力学半径(Rh)为大约12nM，并且六聚体的预测分子量(～1050kD)略超过五聚体的分子量(～950kD)
还探究了重组IgM分子的全身性半衰期，因为可能所希望具有快速的全身清除以限制眼部治疗剂对于眼睛的活性。如实例7中所述，于静脉内注射后，经重组表达的IgM五聚体及六聚体比自人血清分离的IgM被更快速地清除。进一步确定，这些重组IgM分子相对于N-连接的聚糖的唾液酸百分比低于自血清分离的IgM，暗示重组抗Tie2 IgM分子的清除速率可能通过设计表达***而得以控制，该表达***修饰N连接糖基化中的唾液酸水平。
先前已经报告，IgM经由补体依赖性细胞毒性(CDC)有效地招募C1q以及诱导靶标细胞杀伤。此活性对于眼部治疗剂可能是不理想的。据此，如实例7中所述，为设计IgM变体P434G(EU编号)，并且其显示已经移除全部可检测的补体活性。
3.六聚肽多聚体作为缀合物
本公开还涵盖包含多个抗原结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的缀合物，每个抗原结合剂连接至自然地形成多聚体的肽，例如，NDK肽。在一些实施例中，本公开的Tie2结合剂可通过将超过一个本文所述的抗Tie2 Fab与肽多聚体连接而作成。肽多聚体包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个肽，当于重组表达***中表现时，该等多个肽自然地折迭以形成单个多臂结构。常规分子改造技术及材料为用以表达该肽，其将会形成作为融合体的多聚体，其中，抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)表达于形成多聚体的肽的N末端或C末端。在特定的实施例中，多聚体中多个肽为相同，并且表达载体为构建为将该肽的C末端或N末端分别与抗Tie2抗体或其片段(例如，经由肽键)连接，如本公开所教导。
在特定的实施例中，多聚肽的肽为具有同源六聚四级结构的真核生物核苷二磷酸激酶(NDK)酶的部分。存在几种可用来设计多聚体的NDK酶，包括NDK1(例如，SEQ ID NO:69)、NDK2(例如，SEQ ID NO:70)、NDK3(例如，SEQ ID NO:71)、NDK4(例如，SEQ ID NO:72)、NDK5(例如，SEQ ID NO:73)。在优选的实施例中，该NDK为衍生自例如UniProt登录号P22887的NDK3肽。SEQ ID NO:74提供于其C末端与NDK3 N末端连接的Tie2.1.M100cF的序列。在这一优选实施例中，Fab轻链包含SEQ ID NO:21。(参见，例如，下述实例8。)
E.用于诊断和检测的方法及组合物
在某些实施例中，本文提供的任何抗Tie2抗体可用于检测生物样品是否存在Tie2。如本文所用的术语“检测”，涵盖定量或定性检测。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织，例如视网膜组织(光受器及下方视网膜色素上皮细胞(RPE)及脉络膜毛细管)。
在一个实施例中，提供了一种用于诊断或检测方法中的抗Tie2抗体。在另一方面，提供了一种检测生物样品中是否存在Tie2的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许抗Tie2抗体与Tie2结合的条件下使生物样品与本文所述的抗Tie2抗体接触，并检测抗Tie2抗体与Tie2之间是否形成复合物。这种方法可为体外或体内方法。在一个实施例中，使用抗Tie2抗体来选择适合使用抗Tie2抗体进行治疗的受试者，例如Tie2为用于选择患者的生物标志物。
在某些方面，提供了标记的抗Tie2抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测(例如，通过酶促反应或分子相互作用)的部分，例如酶或配体。示例性标记包括但不限于：放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，例如稀土螯合物或荧光素及其衍生物；罗丹明及其衍生物；丹酰；伞形酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)；荧光素；2,3-二氢二氮杂萘二酮；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，例如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢氧化染料前体(例如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶)的酶结合使用；生物素/抗生物素蛋白；纺丝标记；噬菌体标记；稳定自由基等。
F.药物制剂
通过将具有所需纯度的磁力抗Tie2抗体或Tie2缀合物与冻干制剂或水溶液形式的一种或多种视需要的药用载体(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.Ed.(1980))混合来制备如本文所述的抗Tie2抗体或Tie2缀合物的药物制剂。药用载体在采用的剂量和浓度下通常对受体无毒，其包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基芐基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或芐醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(例如EDTA)；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子界面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本申请中的示例性药用载体还进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003856685280000731
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP及用法(包括rHuPH20)描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种附加的糖胺聚醣酶例如软骨素酶结合在一起。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利第6,267,958号中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文所述的制剂还可包含适合于所治疗的特定适应症的多于一种活性成分，优选地，为那些相互无不利影响的具有互补活性成分。例如，可能所需要进一步提供选自由以下各项组成的组的第二生物分子：IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；β细胞素(betacellulin)；apelin/APJ；红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；以及在基因上与AMD风险关联的蛋白质，例如补体途径成分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及TNFRSF10A。可替代地或另外地，第二生物分子为与选自由以下各项组成的组的子特异性结合的抗体或其片段：IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；β细胞素(betacellulin)；apelin/APJ；红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；以及在基因上与AMD风险关联的蛋白质，例如补体途径成分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及TNFRSF10A。在某些实施例中，另外的化合物为与VEGF和/或Ang2和/或IL-1β结合的抗体，或其抗原结合片段。这种活性成分适宜地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这种技术公开在Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可易于例如通过无菌滤膜过滤来实现。
本文所述的用于预防或治疗眼部疾病或病症的缀合物通常通过眼部、眼内和/或玻璃体内注射、和/或巩膜后注射、和/或筋膜下注射、和/或脉络膜上注射、和/或以滴眼液和/或软膏形式外用施用而施用。本公开的此类组合物可通过多种方法递送，例如，作为允许将化合物缓慢释放入玻璃体中的装置和/或储库进行玻璃体内递送，包括参考文献例如Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,and Pearson,editors,Taylor&Francis(March2006)中描述的那些。在一个实例中，该装置可以为微型泵和/或基质和/或被动扩散***和/或经胶囊化的单元，其在延长的时间段内释放该化合物(IntraocularDrug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,and Pearson,editors,Taylor&Francis(March2006)。也可使用其他施用方法，包括但不限于，外用、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内及病变内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
用于眼部、眼内或玻璃体内施用的制剂可通过本领域中已知的方法并使用本领域中已知的成分制备。对于有效治疗的主要要求为通过眼睛的适当的渗透。不同药物可外用递送的眼睛前部疾病，视网膜疾病需要位点特异性更高的途径。滴眼液及软膏极少渗透到眼后部，并且血眼屏障阻碍全身性施用的药物渗透到眼部组织中。因此，一般选择以治疗视网膜疾病例如DME和AMD的用于药物递送的方法为直接玻璃体内注射。玻璃体内注射一般以一定间隔重复，该间隔取决于患者状况以及所递送的药物的特性及半衰期。对于眼内(例如，玻璃体内)渗透，较小尺寸的分子一般为优选者。
在一些实施例中，本文所述的抗体及缀合物可调配为用于使用可植入端口递送***(PDS)递送。如前所述，PDS为可再填充的装置，其中，释放入玻璃体内为收到包含钛玻料的多孔金属膜的控制。在一些实施例中，由于储器的体积小，故使用PDS进行有效递送要求蛋白质浓度高。因此，在一些实施例中，本文所述的抗体及缀合物以高浓度调配。在一些实施例中，本文所述的抗体及缀合物可以至少150mg/ml、至少160mg/ml、至少170mg/ml、至少180mg/ml、至少190mg/ml、至少200mg/ml、或至少210mg/ml、或至少220mg/ml、或至少230mg/ml、或至少240mg/ml、或至少250mg/ml、或至少260mg/ml、或至少270mg/ml、或至少280mg/ml、或至少290mg/ml或至少300mg/ml的浓度调配。在一些实施例中，本文所述的抗体及缀合物可以介于150mg/ml与350mg/ml、介于150mg/ml与300mg/ml、介于170mg/ml与300mg/ml、介于200mg/ml与300mg/ml或介于170mg/ml与220mg/ml之间的浓度调配。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗Tie2抗体或缀合物皆可用于治疗方法中。根据本文的任一实施例的“个体”、“患者”或“受试者”可以为人。
本公开的抗Tie2缀合物可用于治疗哺乳动物。在一些实施例中，例如，抗Tie2缀合物施用至非人哺乳动物以用于获得临床前数据。待治疗的示例性非人哺乳动物包括对其执行临床前研究的非人灵长类动物、狗、猫、猪、啮齿动物及其他哺乳动物。此类哺乳动物可以为关于待使用该抗体治疗的疾病而建立的动物模型，或者可用以研究感兴趣的抗体的毒性。在每一个这些实施例中，可对哺乳动物执行剂量递增研究。
抗Tie2缀合物可通过任何合适手段施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、玻璃体内、肺内及鼻内施用，以及，如果需要进行局部免疫抑制治疗，病变内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、玻璃体内及皮下施用。此外，该缀合物适用于通过脉冲输注施用，尤其是对于递减剂量的抗体或其抗体变体或其片段(例如，抗原结合片段)。在一些实施例中，给药可通过注射例如静脉内或皮下注射进行，部分地取决于短暂施用还是长期施用。
对于疾病的预防或治疗，抗Tie2抗体或缀合物的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重度及病程、为了预防还是治疗目的而施用该抗体、先前治疗、患者的临床病史及对该抗体的反应以及主治医生的判断。
依据疾病的类型及严重程度，约1-25mg/眼(每只眼睛0.015mg/kg–0.36mg/kg)的抗体可以为例如通过一次或多次分开施用或通过连续输注来对患者施用的初始候选剂量。对于在几天或更长时间内重复施用，根据病情而定，持续治疗直至出现所需的疾病症状抑制。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定很容易监测此治疗的进展。示例性给药方法公开于WO 94/04188中。
在一个方面，提供用作药剂的抗Tie2抗体或缀合物。在进一步的方面，提供用于治疗眼部疾病或疾病的抗Tie2抗体或缀合物。在某些实施例，提供用于治疗方法中的抗Tie2抗体或缀合物。在某些实施例中，本发明提供用于治疗患有眼部疾病或疾病的个体的方法中的抗Tie2抗体，该方法包含向该个体施用有效量的抗Tie2抗体或缀合物。在一个此类实施例中，该方法进一步包括将有效量的至少一种另外的治疗剂(例如下文所述)施用至个体。在进一步的实施例中，本发明提供用于增加血管内皮细胞膜完整性和/或降低血管渗漏的抗Tie2抗体或缀合物。在某些实施例中，本发明提供用于在个体中增加血管内皮细胞膜完整性和/或降低血管渗漏的方法中使用的抗Tie2抗体或缀合物，该方法包括向该个体施用有效的抗Tie2抗体或缀合物以增加血管内皮细胞膜完整性和/或降低血管渗漏。根据上述任一实施例的“个体”优选地为人。
如本文中所用，术语“眼部疾病”包括与病理性血管生成和/或萎缩相关的任何眼部疾病(本文中亦可互换地称为“眼部疾病”)。眼部疾病的特征可以为经改变或不受调控的新血管扩增和/或侵入眼部组织例如视网膜或角膜的结构内。眼部疾病的特征可以为视网膜组织(光受器及下方视网膜色素上皮细胞(RPE)及脉络膜毛细管)的萎缩。
糖尿病性黄斑水肿(DME)为由被称为糖尿病性视网膜病变(DR)的糖尿病并发症引起。这一眼部病症可发生在被诊断为第1型或第2型糖尿病的人中。DME定义为中央凹视网膜增厚2实盘直径以内，并且可为局部性或弥散性者。DME与伴有血液视网膜屏障破坏的视网膜微血管改变相关联，造成血浆成分渗漏进入周围的视网膜内，导致视网膜水肿。
非限制性眼部疾病包括，例如，糖尿病性黄斑水肿(DME)(例如，局部性非中心性DME及涉及中央凹的弥散性DME)、糖尿病性视网膜病变(DR)(例如，增殖性DR(PDR)、非增殖性DR(NPDR)及高海拔DR)、无水肿的视网膜病变、其他缺血相关性视网膜病变、AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD及地图状萎缩(GA))、黄斑退化、黄斑水肿、视网膜病变、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央性(CRVO)及分支性(BRVO)形式)、CNV(例如，近视性CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、中心性浆液性脉络膜视网膜病变(CSR)、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织浆菌症、FEVR、Coats氏病、Norrie氏病、与骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)相关的视网膜异常、结膜下出血、皮肤发红、眼部新血管病、新血管青光眼、色素性视网膜炎(RP)、高血压性视网膜病变、视网膜血管瘤性增殖、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜退化、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎(包括但不限于CMV视网膜炎)、眼部黑色素瘤、视网膜胚细胞瘤、结膜炎(例如，感染性结膜炎及非感染性(例如，过敏性)结膜炎)、莱伯氏先天性黑蒙(也称为Leber氏先天性黑蒙或LCA)、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如，多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑炎、干眼症、创伤性眼损伤、
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氏病及其他眼科疾病，其中，该疾病或疾病与眼部新血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿或视网膜萎缩相关联。另外示例性眼部疾病包括视网膜劈裂症(视网膜神经感觉层的异常***)、与皮肤发红相关的疾病(睑角的新血管形成)以及由纤维血管或纤维组织的异常增殖造成的疾病(包括全部形式的增殖性玻璃体视网膜病变)。
与角膜新生血管形成相关的示例性疾病包括但不限于，流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、隐形眼镜过度磨损、特应性角膜炎、上缘性角膜炎、翼状干燥性角膜炎(terygium keratitis sicca)、干燥综合征(sjogrens)、痤疮、小水疱病(phylectenulosis)、梅毒、分枝杆菌感染、脂质退化、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹病毒感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角膜溃疡、特里昂边缘性角膜变性、边缘性角质层分离、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、多发性动脉炎、创伤、韦格纳结节病、巩膜炎、史蒂芬约翰逊综合征(Steven's Johnson disease)、类天疱疮放射状角膜切开术和角膜移植排斥(corneal graph rejection)。
与脉络膜新生血管形成及视网膜血管系缺陷(包括增加的血管渗漏、动脉瘤及毛细血管滴落)相关的示例性疾病包括但不限于，糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰状细胞贫血、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、佩吉特氏病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、***性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、伊尔斯病、***、视网膜炎或脉络膜炎造成的感染、假定眼组织胞浆菌病、贝斯特氏病(卵黄样黄斑变性)、近视、视窝(optic pits)、睫状体扁平部炎、视网膜脱离(例如，慢性视网膜脱离)、高粘滞综合征、弓形体病、创伤及激光后并发症。
与视网膜组织(光受器及下方RPE)相关的示例性疾病包括但不限于，萎缩性或非渗出性AMD(例如，地图状萎缩或晚期干性AMD)、黄斑萎缩(例如，与新血管形成相关的萎缩和/或地图状萎缩)、糖尿病性视网膜病变、斯特格氏病、Skorsby眼底萎缩症、视网膜劈裂症及色素性视网膜炎。
例如，在某些实施例中，前述任何方法进一步包括施用一种或多种另外的化合物。在某些实施例中，Tie2结合剂或缀合物或其聚合物制剂与另外化合物同步施用。在某些实施例中，Tie2结合剂或缀合物或其聚合物制剂于另外化合物之前或之后施用。在某些实施例中，该另外化合物与选自由以下各项组成的组的第二生物分子结合：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；β细胞素(betacellulin)；apelin/APJ；红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；以及在基因上与AMD风险关联的蛋白质，例如补体途径成分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及TNFRSF10A。在某些实施例中，该另外化合物为抗体或其抗原结合片段。于根据(或如应用于)上述任何实施例的某些实施例中，该眼部疾病为选自由以下各项组成的组的眼内新血管疾病：增生性视网膜病、脉络膜新生血管形成(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性及其他缺血相关性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼组织胞浆菌病、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括CRVO和BRVO)、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成及早产儿视网膜病变(ROP)。例如，在一些情况下，该另外化合物为双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，例如RG-7716或WO 2010/069532或WO2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或其变体。在另一实例中，在一些情况下，该另外化合物为抗IL-6抗体，例如，EBI-031(十一种生物治疗剂，参见，例如，WO 2016/073890)、司妥昔单抗(siltuximab
Figure BDA0003856685280000791
)、奥洛组单抗(olokizumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、OPR-003、MEDI5117、PF-04236921或其变体。在再进一步的实例中，在一些情况下，该另外化合物为抗IL-6R抗体，例如，托珠单抗(tocilizumab/>
Figure BDA0003856685280000792
)(参见，例如，WO 1992/019579)、沙立芦人单抗(sarilumab)、ALX-0061、SA237或其变体。
在一些情况下，本公开的Tie2结合剂或缀合物和/或其聚合性制剂可与至少一种另外的治疗剂联合施用，以用于治疗眼部疾病例如本文所述的眼部疾病(例如，DME、DR、AMD(例如，湿性AMD)、RVO或GA)。在用于治疗眼部疾病的联合疗法中使用的示例性另外的治疗剂包括而不限于，抗血管生成剂例如VEGF拮抗剂，包括例如抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab
Figure BDA0003856685280000793
(兰尼单抗(ranibizumab)))、可溶性受体融合蛋白(例如，重组可溶性受体融合蛋白/>
Figure BDA0003856685280000794
(阿柏西普(aflibercept)，也称为VEGF Trap Eye；Regeneron/Aventis))、适体(例如，抗VEGF peg化的适体/>
Figure BDA0003856685280000801
(哌加他尼钠(pegaptanibsodium)；NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals))和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦塔拉尼(vatalanib(PTK787))、色玛米尼(semaxaminib)(SU5416；SUGEN)和/>
Figure BDA0003856685280000802
(舒尼替尼(sunitinib)))；色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)；角鲨胺；/>
Figure BDA0003856685280000803
(用于储库悬浮体的阿奈可他(anecortave)；Alcon,Inc.)；康普瑞汀(Combretastatin)A4前驱药(CA4P)；/>
Figure BDA0003856685280000804
(美服培酮-ru486)；曲安奈德；玻璃体内晶形曲安奈德；基质金属蛋白酶抑制剂(例如，普林斯他(Prinomastat)(AG3340；Pfizer))；氟轻松(包括氟洛皮质醇眼内移植物；Bausch&Lomb/控制递送***)；力诺胺(linomide)；整合素β3功能的抑制剂；血管抑素及其组合。可与本发明的Tie2结合剂或缀合物联合施用的此类及其他治疗剂描述于美国专利申请第US 2014/0017244中，该专利申请通过引用而以其整体并入本文。
可与Tie2结合剂或缀合物和/或其聚合性制剂联合施用以治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)的另外的治疗剂的进一步实例包括但不限于，
Figure BDA0003856685280000805
(维替泊芬(verteporfin)；一种光激活的药物，其通常与使用非热学激光进行的光动力治疗协同使用)、PKC412、恩多维昂(Endovion)(NS 3728；NeuroSearch A/S)、神经滋养因子(例如，源自胶细胞的神经滋养因子(GDNF)及睫状神经滋养因子(CNTF))、地尔硫卓(diltiazem)、多佐胺(dorzolamide)、/>
Figure BDA0003856685280000806
9-顺式视黄醛、眼部药物(例如，碘磷灵(phospholine iodide)、二乙氧磷酰硫胆碱(echothiophate)或碳酸酐酶抑制剂)、维沃司他(veovastat)(AE-941；AEterna Laboratories,Inc.)、Sirna-027(AGF-745；SimaTherapeutics,Inc.)、神经滋养素(包括，仅作示例，NT-4/5，Genentech)、Cand5(AcuityPharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整合素拮抗剂(包括那些来自Jerini AG和Abbott Laboratories者)、EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、沙利多迈(例如EntreMed,Inc.所用)、心肌营养素-1(Genentech)、2-甲氧基***(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫代钼酸盐(University of Michigan)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany,Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，那些来自Allergan、SUGEN或Pfizer者)、NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、视网膜细胞神经节神经保护剂(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、环孢菌素A、用于光动力治疗中的治疗剂(例如，/>
Figure BDA0003856685280000811
受体靶向的PDT，Bristol-Myers Squibb,Co.；用于与PDT一起注射的卟吩姆钠(porfimer sodium)；维替泊芬，QLTInc.；与PDT合用的罗他泊芬(rostaporfin)，Miravent Medical Technologies；与PDT合用的塔拉泊芬钠(talaporfin sodium)，Nippon Petroleum；以及莫特沙芬镏(motexafinlutetium)，Pharmacyclics、Inc.)、反义寡核苷酸(包括，例如，由Novagali Pharma SA测试的产品以及ISIS-13650，Ionis Pharmaceuticals)及其组合。
Tie2结合剂或缀合物和/或其聚合性制剂可与治疗或手术过程联合施用以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)的，该治疗或手术过程包括，例如，激光光凝(例如，全视网膜光凝(PRP))、隐结激光作用、黄斑裂孔手术、黄斑易位手术、可植入袖珍望远镜、PHI-运动血管造影(也称为微激光治疗及分支血管治疗(feeder vessel treatment))、光子束治疗、微刺激治疗、视网膜脱落及玻璃体手术、巩膜屈曲(scleral buckle)、黄斑下手术、经瞳孔热疗、光***I治疗、RNA干扰(RNAi)的使用、体外流变过程(也称为膜过滤及流变治疗)、微芯片植入、干细胞治疗、基因替换治疗、核糖核酸酵素基因治疗(包括用于缺氧反应元件的基因治疗，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；以及PDEF基因治疗，GenVec)、光受器/视网膜细胞移植(包括可移植视网膜上皮细胞，Diacrin,Inc.；视网膜细胞移植物，例如，Astellas Pharma US,Inc.,ReNeuron,CHA Biotech)、针灸术及其组合。
在一些情况下，本发明的Tie2结合剂或缀合物和/或其聚合性制剂可与抗血管生成剂联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。任何合适的抗血管生成剂可与本发明的Tie2结合剂或缀合物联合使用，包括但不限于，Carmeliet等人Nature407:249-257,2000中所列述的那些。在一些实施例中，该抗血管生成剂为VEGF拮抗剂，包括但不限于，抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab
Figure BDA0003856685280000821
(兰尼单抗)、RTH-258(以前名为ESBA-1008，一种抗VEGF单链抗体片段；Novartis)或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体例如RG-7716；Roche)、可溶性重组受体融合蛋白(例如，
Figure BDA0003856685280000822
(阿柏西普))、VEGF变体、可溶性VEGFR片段、能够阻断VEGF的适体(例如，哌加他尼)或VEGFR、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、抗VEGF/>
Figure BDA0003856685280000823
(例如，阿比西帕聚乙二醇(abicipar pegol)，Molecular Partners AG/Allergan)、抑制VEGF或VEGFR的表达的小干扰RNA、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦塔拉尼(PTK787)、色玛米尼(SU5416；SUGEN)和/>
Figure BDA0003856685280000824
(舒尼替尼)及其组合)。在一些情况下，抗Tie2抗体或其片段可与靶向第二生物分子的抗体或其片段或其他治疗剂合用，该第二生物分子包括但不限于IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；β细胞素；apelin/APJ；红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；ST-2受体；以及在基因上与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险关联的蛋白质，例如补体途径成分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及TNFRSF10A。例如，在一些情况下，该另外化合物为双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，例如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或其变体)。
可与抗Tie2缀合物和/或其聚合性制剂联合施用以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)的其他合适抗血管生成剂包括皮质类固醇、血管生成抑制性类固醇、醋酸阿奈可他、血管抑素、内皮抑素、酪氨酸激酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、似胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、源自基质细胞的因子(SDF-1)拮抗剂(例如，抗SDF-1抗体)、源自色素上皮细胞的因子(PEDF)、似γ-分泌酶δ配体4、整合素拮抗剂、缺氧诱导因子(HIF)-1α拮抗剂、蛋白质激酶CK2拮抗剂、抑制位于新血管形成位点处的干细胞(例如，内皮祖细胞)的药物(例如，抗血管内皮钙黏蛋白(CD-144)抗体和/或抗SDF-1抗体)及其组合。
在进一步的实例中，在一些情况下，Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与具有抗新血管形成活性的药物联合施用以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)，该药物为例如抗炎药物、哺乳动物靶向的雷帕霉素(mTOR)抑制剂(例如，雷帕霉素、
Figure BDA0003856685280000831
(依维莫司(everolimus))和/>
Figure BDA0003856685280000832
(西罗莫司(temsirolimus)))、环孢素、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂(例如，抗TNFα抗体或其抗原结合片段(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)及戈利木单抗)或可溶性受体融合蛋白(例如，依那西普(etanercept)))、抗补体剂、非甾体抗炎剂(NSAID)或其组合。
在再进一步的实例中，在一些情况下，Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与神经保护性药物联合施用，该药物可有效地降低干性AMD到湿性AMD的进展，例如被称为“神经类固醇类”的一类药物，其包括药物例如去氢表雄固酮(DHEA)(商标名：PRASTERATM和
Figure BDA0003856685280000833
)、去氢表雄固酮硫酸酯及孕烯醇酮硫酸酯。
任何合适的AMD治疗剂可作为另外的治疗剂与本发明的Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂联合施用以治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)，包括但不限于，VEGF拮抗剂，例如，抗VEGF抗体(例如，
Figure BDA0003856685280000834
(兰尼单抗(ranibizumab))、RTH-258(以前名为ESBA-1008，一种抗VEGF单链抗体片段；Novartis)或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体例如RG-7716；Roche))、可溶性VEGF受体融合蛋白(例如，/>
Figure BDA0003856685280000841
(阿柏西普))、抗VEGF/>
Figure BDA0003856685280000842
(例如，阿比西帕聚乙二醇(abiciparpegol)；Molecular Partners AG/Allergan)或抗VEGF适体(例如，/>
Figure BDA0003856685280000843
(哌加他尼钠))；源自血小板的生长因子(PDGF)拮抗剂，例如，抗PDGFR抗体(例如，REGN2176-3)、抗PDGF-BB peg化适体(例如/>
Figure BDA0003856685280000844
Ophthotech/Novartis)、可溶性PDGFR受体融合蛋白或双重PDGF/VEGF拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗PDGF/抗VEGF抗体)；与光动力治疗合用的/>
Figure BDA0003856685280000845
(维替泊芬)；抗氧化剂；补体***拮抗剂，例如，补体因子C5拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，ARC-1905；Opthotech)或抗C5抗体(例如，LFG-316；Novartis)、备解素拮抗剂(例如，抗备解素抗体，例如，CLG-561；Alcon)或补体因子D拮抗剂(例如，抗补体因子D抗体，例如，兰帕利珠单抗(lampalizumab)；Roche)；C3封闭肽(例如，APL-2,，Appellis)；视觉循环修饰剂(例如，盐酸艾米司他(emixustat hydrochloride))；角鲨胺(例如，OHR-102；OhrPharmaceutical)；维生素及矿物质补充剂(例如，那些描述于Age-Related Eye DiseaseStudy 1(AREDS1；锌和/或抗氧化剂)和Study 2(AREDS2；锌、抗氧化剂、叶黄素、玉米黄素和/或ω-3脂肪酸))；基于细胞的治疗，例如，NT-501(Renexus)；PH-05206388(Pfizer)、huCNS-SC细胞移植(StemCells)、CNTO-2476(脐带干细胞系；Janssen)、OpRegen(RPE细胞的悬浮液；Cell Cure Neurosciences)或MA09-hRPE细胞移植(Ocata Therapeutics)；组织因子拮抗剂(例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-肾上腺素性受体激动剂(例如，酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate)；Allergan)；肽疫苗(例如，S-646240；Shionogi)；β淀粉样蛋白拮抗剂(例如，抗β淀粉样蛋白单克隆抗体，例如，GSK-933776)；S1P拮抗剂(例如，抗S1P抗体，例如，iSONEPTM；Lpath Inc)；ROBO4拮抗剂(例如，抗ROBO4抗体，例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表达内皮抑素及血管抑素的慢病毒载体(例如，RetinoStat)及其组合。在一些情况下，AMD治疗剂(包括前述任何AMD治疗剂)可共同调配。例如，抗PDGFR抗体REGN2176-3可与阿柏西普/>
Figure BDA0003856685280000846
共同调配。在一些情况下，此共制剂可与本发明的Tie2结合剂或缀合物联合施用。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA0003856685280000851
(兰尼单抗)联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA0003856685280000852
(阿柏西普)联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA0003856685280000853
(哌加他尼钠)联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA0003856685280000854
(维替泊芬)及与的合用的光动力治疗联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与PDGF拮抗剂联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。可与本发明的Tie2结合缀合物联合施用的示例性PDGF拮抗剂包括抗PDGF抗体、抗PDGFR抗体、小分子抑制剂(例如，角鲨胺)、抗PDGF-B peg化适体例如
Figure BDA0003856685280000855
(E10030；Ophthotech/Novartis)或双重PDGF/VEGF拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗PDGF/抗VEGF抗体)。例如，/>
Figure BDA0003856685280000856
可作为本发明的Tie2结合剂或缀合物的辅助治疗而施用。OHR-102可与VEGF拮抗剂例如/>
Figure BDA0003856685280000861
或/>
Figure BDA0003856685280000862
联合施用。在一些实施例中，本发明的Tie2结合剂或缀合物可与OHR-102、/>
Figure BDA0003856685280000863
和/或/>
Figure BDA0003856685280000864
联合施用。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与RTH-258联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。例如，RTH-258可通过玻璃体内注射或眼部输注施用。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与阿比西帕聚乙二醇联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与阿比西帕聚乙二醇联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
任何合适DME和/或DR治疗剂可与Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂联合施用，以用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、DME、RVO或GA)，包括但不限于，VEGF拮抗剂(例如，
Figure BDA0003856685280000865
或/>
Figure BDA0003856685280000866
)、皮质类固醇(例如，皮脂类故障植入物(例如，
Figure BDA0003856685280000867
(***玻璃体内植入物)或/>
Figure BDA0003856685280000868
(氟轻松丙酮玻璃体内植入物))或经调配用于通过玻璃体内注射施用的皮质类固醇(例如，丙酮特安皮质醇))或其组合。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA0003856685280000869
(兰尼单抗)联合施用，以用于治疗DME和/或DR(例如，NPDR或PDR)。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA00038566852800008610
(阿柏西普)联合施用，以用于治疗DME和/或DR(例如，NPDR或PDR)。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA0003856685280000871
(***玻璃体内植入物)联合施用，以用于治疗DME和/或DR。
Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂可与
Figure BDA0003856685280000872
(***玻璃体内植入物)联合施用，以用于治疗DME和/或DR。
在一些情况下，TAO/PRN治疗方案或TAE治疗方案可用来施用与Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂合用的AMD治疗剂(例如，兰尼单抗或阿柏西普)。在一些情况下，该眼部疾病为DME和/或DR。在一些情况下，该眼部疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，该眼部疾病为GA。
上文述及的此等联合疗法涵盖联合施用(其中两种或多种治疗剂包含在同一或单独的药物组合物中)，以及单独施用，在这种情况下，本发明的Tie2集合缀合物的施用可在施用附加的一种或多种治疗剂之前、同时和/或之后发生。在一个实施例中，Tie2结合缀合物或聚合性制剂的施用以及另外的治疗剂的施用彼此于约1、2、3、4或5个月内、或约1、3或4周内或约1、2、3、4、5或6天内发生。
进一步预期，Tie2结合缀合物和/或其聚合性制剂用于治疗青光眼。青光眼为一组以至少部分地由于眼内压力(IOP)升高所致的眼睛进行性损伤为特征的眼部疾病(MerckManual of Diagnosis and Therapy(1999))。另外地，青光眼的特征为视网膜神经节细胞(RGC)死亡、轴突丧失以及视神经头部的出现率提高(Alward,"Medical Management ofGlaucoma,"N Eng J Med,1998；339:1298-1307)。可于视力丧失发生之前通过视野测试并且通过对视神经的检眼镜检查以检测“杯凹”(cupping)，从而诊断青光眼。正常成年人的均值IOP为15至16mm Hg；正常范围为10至21mm Hg。一种形式的青光眼管理为基于使用典型应用的药品降低IOP(“Glaucoma”,Lancet,1999；354:1803-1810)。
当前存在五个主要类别的用以降低IOP的药品：β-肾上腺素性拮抗剂、肾上腺素性激动剂、拟副交感神经剂、似***素类似物及碳酸酐酶抑制剂。尽管大多数药品为外部适用于眼睛，但它们可造成严重的全身性副作用并且对患者的生活质量造成负面影响。如果指示IOP的额外降低或如果药品没能成功降低IOP，则下一步一般为激光小梁成形术(lasertrabeculoplasty)。如果IOP仍未得到充分控制，则指示进行切开式青光眼手术。IOP的降低虽然显著降低神经元丧失的程度，但并不确保疾病进展的停止，因为RGC可能继续丧失。对于IOP调控与医学或手术干预后视野丧失间的关联的近期研究显示，如果IOP较低，则反映于视野测试中的持续神经元丧失可以减少。青光眼性视神经病变可能是由于RGC及其轴突的特异性病理生理学改变及后续死亡所致。RGC死亡制程被认为是两个阶段的制程，主要损伤造成损害的启动，之后为缓慢的继发性退化，该继发性退化可归因于退化细胞周围的恶劣环境。
本发明的另一方面提供了本发明的抗Tie2缀合物在药剂的制造或制备中的用途。在一个实施例中，该药剂用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)。在优选的实施例中，该药剂用于治疗DME和/或DR。在进一步的实施例中，该药剂用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)的方法中，该方法包括向患有该眼部疾病的个体施用有效量的药剂。在一个此类实施例中，该方法进一步包括将有效量的至少一种另外的治疗剂(例如下文所述)施用至个体。在进一步的实施例中，该药剂用于降低尤其是眼睛内的血管通透性。在进一步的实施例中，该药剂用于降低个体尤其是眼睛内的血管通透性的方法中，该方法包括向该个体施用有效量的药剂以降低血管通透性，尤其是在眼睛内。根据上述任一实施例的“个体”可以是人。
在进一步的方面，本发明提供用于治疗眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)的方法。在一个实施例中，该方法包括向患有此类眼部疾病(例如，DME、DR、AMD、RVO或GA)的个体施用有效量的本发明的Tie2结合缀合物。在一个这样的实施例中，该方法进一步包含将有效量的至少一种额外的治疗剂(如下文所述)施用个体。根据上述任一实施例的“个体”可以是人。
在进一步的方面，本发明提供用于降低个体尤其是眼睛内的血管通透性的方法。在一个实施例中，该方法包括向个体施用有效量的本发明的Tie2结合缀合物以降低尤其是眼睛内的血管通透性。在一个实施例中，“个体”为人。
在进一步的方面，本发明提供包含本文所提供的本发明的任何Tie2结合缀合物的药物制剂，例如用于以上任何治疗方法。在一个实施例中，药物制剂包含本文所提供的本发明的任何Tie2结合缀合物及药用载体。在另一实施例中，药物制剂包含本文所提供的本发明的任何Tie2结合缀合物及至少一种另外的治疗剂，例如，如上文所述。
上面提到的这种联合疗法涵盖联合施用(其中两种或多种治疗剂包含在同一或单独的药物组合物中)，以及单独施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可在施用附加的一种或多种治疗剂之前、同时和/或之后发生。在一个实施例中，抗Tie2缀合物的施用及另外的治疗剂的施用彼此发生在约1个月内，或约1、2或3周内，或约1、2、3、4、5或6天内。
本发明的Tie2缀合物(及任何其他治疗剂)可通过任何合适手段施用，包括肠胃外、肺内及鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则可以采用病变内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何合适的途径进行，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于短暂给药还是长期施用。本文中考虑各种给药方案，其包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。
本发明的Tie2结合缀合物将按照与良好医学实践一致的方式进行配制、给药及施用。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的原因、递送药物的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。该抗体并非必须、但可以任选与一种或多种目前用于预防或治疗所述疾病的药剂一起配制。这些其他治疗剂的有效量取决于存在于调制剂中存在的抗体量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文中所述相同的剂量和施用途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以经验上/临床上确定为适当的任何剂量和通过任何途径使用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的缀合物的适当剂量(单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用)将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重度和病程、为了预防或是治疗的目的施用该缀合物、之前的治疗、患者的临床病史及对该抗体的反应及主治医师的判断。在一次或一系列的治疗中适合地对患者施用缀合物。根据疾病的类型及严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg–10mg/kg)的缀合物可为例如通过一次或多次分开施用或通过连续输注来对患者施用的初始候选剂量。根据上述因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于在几天或更长时间内重复施用，根据病症而定，治疗通常将持续直至出现所需的疾病症状抑制。缀合物的一种示例性剂量将在从0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任何组合)。这种剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2种至约20种或例如约6种剂量的缀合物)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一种或多种较低的剂量。通过常规技术和测定很容易监测此治疗的进展
应理解，上述任何制剂及数据方法都可使用代替本发明的Tie2结合缀合物或除本发明的Tie2结合缀合物外的本发明的免疫缀合物进行。
H.制成品
本发明的另一方面提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述疾病的制成品。制成品包括容器及容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。该容器可容纳组合物，该组合物本身或与有效治疗、预防和/或诊断疾病的另一组合物结合使用，并可能具有无菌入口(例如，容器可为具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的Tie2结合剂或缀合物。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的疾病。此外，该制品可能包括(a)其中包含有组合物的第一容器，其中，该组合物包含本发明的Tie2结合剂或缀合物；和(b)其中包含有组合物的第二容器，其中，组合物包含其他细胞毒性或其他治疗剂。本发明的此实施例中的制成品可以进一步包含指示组合物可以用于治疗具体疾病的包装插页。可替代地或另外地，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含药用缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液及葡萄糖溶液。从商业和使用者的角度来看，它可以进一步包含其他材料，其中包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应理解，上述任何制品皆可包括代替Tie2结合缀合物或除Tie2结合缀合物外的本发明的免疫缀合物。
Ⅰ本发明的具体实施例
下文中列述本发明的具体实施例。
1.一种特异性结合至Tie2的经分离的抗体或其片段，其中该抗体包含：
重链可变结构域(VH)，该重链可变结构域包含(a)CDR-H1，其包含氨基酸序列NTDIS(SEQ ID NO:3)，(b)CDR-H2，其包含氨基酸序列RISPSDGNTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)，和(c)CDR-H3，其包含氨基酸序列RTRWASX1AX2DY(SEQ ID NO:5)，其中X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W且/或X2为F、Y、L、Q、I、K或H；及轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包含(d)CDR-L1，其包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)，(e)CDR-L2，其包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:9)，和(f)CDR-L3，其包含氨基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO:10)。
2.如前述实施例的抗体，其中，该CDR-H3包含氨基酸序列RTRWASWAMDY(SEQ IDNO:6)。
3.如实施例1的抗体，其中该CDR-H3包含氨基酸序列RTRWASWAFDY(SEQ ID NO:7)。
4.如前述实施例中任一项的抗体，其为单克隆抗体。
5.如前述实施例中任一项的抗体，其为人源化抗体或嵌合抗体。
6.如前述实施例中任一项的抗体，其为与Tie2结合的抗体片段。
7.如前述实施例中任一项的抗体，其为Fab片段。
10.如实施例1至7中任一项的抗体，其包含：VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；以及VH结构域，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
11.如实施例1至7中任一项的抗体，其包含：VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；以及VH结构域，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。
12.如实施例1至7中任一项的抗体，其包含：VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；以及VH结构域，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
13.如实施例1至7中任一项的抗体，其包含：VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；以及VH结构域，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
14.如实施例1至7中任一项的抗体，其包含：VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；以及VH结构域，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
15.如前述实施例中任一项的抗体，其中，该抗体包含：SEQ ID NO:21的VL序列和SEQ ID NO:19的VH序列；SEQ ID NO:21的VL序列和SEQ ID NO:22的VH序列；或SEQ ID NO:21的VL序列和SEQ ID NO:20的VH序列。
16.如前述实施例中任一项的抗体，其中，该抗体包含工程化半胱氨酸。
17.如实施例16的抗体，其中
该工程化半胱氨酸选自HC中的T120C、G166C、G178C、T187C和T209C；或者该工程化半胱氨酸选自LC中的Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C和K149C；其中，该工程化半胱氨酸的残基号是根据EU编号。
18.如实施例16或17的抗体，其中该工程化半胱氨酸选自HC中的T209C和LC中的T206C。
19.如实施例16至18中任一项的抗体，其中该工程化半胱氨酸为LC中的T206C。
20.如实施例16至18中任一项的抗体，其中该工程化半胱氨酸为HC中的T209C。
21.如前述实施例中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
22.如前述实施例中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。
23.如前述实施例中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
24.如前述实施例中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
25.如前述实施例中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
26.如前述实施例中任一项的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:25的序列的LC及包含SEQ ID NO:55的序列的HC。
27.如实施例1至25中任一项的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:25的序列的LC及包含选自SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的序列的HC。
28.如实施例1至20中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
29.如实施例1至20中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。
30.如实施例1至20中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
31.如实施例1至20中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
32.如实施例1至20中任一项的抗体，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
33.如实施例1至20中任一项的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:56的序列的LC及包含SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:23的序列的HC。
34.一种与Tie-2特异性结合的抗体，其中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:55的序列的HC及包含SEQ ID NO:25的序列的LC。
35.一种经分离的核酸，其编码如前述实施例中任一项的抗体。
36.一种经分离的宿主细胞，其包含如实施例38的核酸。
37.一种制造与Tie-2结合的抗体的方法，其包括在适合于表达该抗体的条件下培养如实施例39的宿主细胞。
38.一种结合至Tie2的缀合物，其中，该缀合物包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种如实施例1至34中任一项的抗体，其中，该等抗体中的每一者连接至多聚化部分。
39.如实施例38的缀合物，其中，该缀合物于体外或体内细胞测定中激活Tie2的磷酸化。
40.如实施例38或39的缀合物，其中，该缀合物于体外测定中造成Tie2蛋白水平降低少于25％、少于50％或少于75％；或者其中，该缀合物于体外测定中并不造成Tie-2蛋白水平降低超过25％、超过50％或超过75％。
41.如实施例38至40的缀合物，其中，该缀合物降低血管通透性，如通过体外屏障功能测定法所测定。
42.如实施例38至42中任一项的缀合物，其中，该多聚化部分包含多元醇、多肽和/或肽。
43.如实施例42的缀合物，其中，该多元醇为多臂多元醇，其选自二聚体、四聚体、六聚体和八聚体。
44.如实施例43的缀合物，其中，该多臂多元醇为六聚体。
45.如实施例43或44的缀合物，其中，该多臂多元醇为八聚体。
46.如实施例42至45中任一项的缀合物，其中，该多元醇为聚乙二醇(PEG)。
47.如实施例42至45中任一项的缀合物，其中，该多元醇通过半胱氨酸氨基酸的游离巯基基团与至少两个抗体共价连接。
48.如实施例47的缀合物，其中，该半胱氨酸氨基酸为工程化半胱氨酸。
49.如实施例48的缀合物，其中，该工程化半胱氨酸位于抗体的HC和/或LC恒定区内。
50.如实施例48或49的缀合物，其中该工程化半胱氨酸选自HC中的T120C、G166C、G178C、T187C和T209C；或者该工程化半胱氨酸选自由以下所组成的组：LC中的Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C和K149C；其中，该残基号是根据EU编号。
51.如实施例48至50中任一项的缀合物，其中，该工程化半胱氨酸为LC中的T206C，其中该残基号是根据EU编号。
52.如实施例48至50中任一项的缀合物，其中，该工程化半胱氨酸为HC中的T209C，其中该残基号是根据EU编号。
53.如实施例42至45中任一项的缀合物，其中，该多元醇通过赖氨酸氨基酸的游离氨基与至少一个抗体共价连接。
54.如实施例53的缀合物，其中，该赖氨酸氨基酸位于抗体的HC或LC恒定区内，和/或该赖氨酸氨基酸位于抗体的重链或轻链的C末端处。
55.如实施例46至54中任一项的缀合物，其中，该PEG具有约500道尔顿(Da)至约300,000Da或约500Da至约20,000Da的重均分子量。
56.如实施例46至55中任一项的缀合物，其中，该PEG具有约6000Da的重均分子量。
57.如实施例46至56中任一项的缀合物，其中，该PEG包含二季戊四醇六聚体或八聚体核心。
58.如实施例46至57中任一项的缀合物，其中，该PEG具有通式(Ia)的结构：
Figure BDA0003856685280000961
其中，n为1至10的整数；每个m独立地为3至250的整数；每个R1独立地不存在或为连接基团；且每个R2独立地为氢或末端反应性基团；
其中，至少一个R2为末端反应性基团且与根据权利要求1至14中任一项的抗体共价连接。
59.如实施例46至57中任一项的缀合物，其中，该PEG具有通式(Ib)的结构：
Figure BDA0003856685280000962
其中，每个m独立地为3至250的整数；每个R1独立地不存在或为连接基团；且每个R2独立地为氢或末端反应性基团；
其中，至少一个R2为末端反应性基团且与根据权利要求1至14中任一项的抗体共价连接。
60.如实施例59的缀合物，其中，每个m独立地为15至35的整数，优选为约20至30。
61.如实施例43至60中任一项的缀合物，其中，该缀合物系通过将至少一个如实施例1至34中任一项的抗体与多臂多元醇共价连接而制备。
62.一种包含与Tie-2特异性结合的抗体的缀合物，其中，该抗体包含SEQ ID NO:20的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列，其中，该抗体与具有通式(Ib)的结构的聚乙二醇共价连接：
Figure BDA0003856685280000971
其中，每个m独立地为3至250的整数；每个R1独立地不存在或为连接基团；且每个R2独立地为氢或末端反应性基团；
其中，至少一个R2为末端反应性基团且与抗体共价连接。
63.如实施例62的缀合物，其中，m为10至200的整数。
64.如实施例62或63的缀合物，其中，m为20至30的整数。
65.如实施例58至64中任一项的缀合物，其中，R1为不存在，或者，其中，R1选自由以下各项组成的组：
Figure BDA0003856685280000972
Figure BDA0003856685280000973
Figure BDA0003856685280000981
Figure BDA0003856685280000982
及其组合；其中每个i独立地为0至10的整数；j为0至10的整数；且R2为选自由以下各项所组成的组的末端反应性基团：硫醇反应性基团、胺基反应性基团及其组合。
66.如实施例58至65中任一项的缀合物，每个R2独立地选自由以下各项组成的组：马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、过氧化物、吡啶基二硫化物、琥珀酰亚胺基酯、-NH2、醛、卤代乙酸酯、卤代乙酰胺、及对硝基苯基碳酸酯。
67.如实施例58至66中任一项的缀合物，其中，R2为马来酰亚胺。
68.如实施例43至67中任一项的缀合物，其中，该缀合物是通过将至少一个根据权利要求1至34中任一项的抗体与多臂多元醇共价连接而制备。
69.一种药物组合物，其包含：根据实施例38至68中任一项的缀合物；以及药用载体。
70.根据实施例69的药物组合物，其中该缀合物的浓度为约50mg/ml至约300mg/ml。
71.根据实施例69或70的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
72.根据实施例71的药物组合物，其中该另外的治疗剂选自由以下各项组成的组：VEGF拮抗剂、Ang2拮抗剂、HtrA1拮抗剂、和IL33拮抗剂、补体组分拮抗剂和第二Tie2激动剂。
73.根据实施例72的药物组合物，其中，该VEGF拮抗剂选自由VEGF捕捉剂及抗VEGF抗体所组成的组。
74.一种用于经眼部递送的长效递送装置，其包含根据实施例79至73的药物组合物及用于将该组合物经玻璃体内递送至患者的元件，其中该组合物在原位维持有效达延长的时间段。
75.一种治疗有需要的受试者的Tie2通路介导的疾病的方法，其包括向该受试者施用有效量的如实施例1至34中任一项的抗体、如实施例38至68中任一项的缀合物或如实施例69至73中任一项的药物组合物。
76.如实施例75的方法，其中，该Tie2通路介导的疾病为血管通透性疾病。
77.如实施例75或76的方法，其中，该Tie2通路介导的疾病为眼部病症。
78.如实施例77的方法，其中，该眼部病症选自糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性(AMD)(包括干性及湿性(非渗出性和渗出性)形式)、脉络膜新生血管形成(CNV)、葡萄膜炎、缺血相关性视网膜病变、病理性近视、希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成、青光眼、及视网膜新生血管形成。
79.如实施例75至78中任一项的方法，其中，该眼部病症为DME。
80.如实施例75至79中任一项的方法，其中，该方法包括使用可植入端口递送***施用抗体、缀合物或药物制剂。
81.如实施例75至79中任一项的方法，其中，该方法包括通过静脉内施用来施用抗体、缀合物或药物制剂。
82.如实施例81的方法，其中，该静脉内施用通过窄口径针进行。
83.如实施例82的方法，其中，该窄口径针为约30、29、28、27、26、25、24、23或22号。
84.如实施例第75项至第83项中任一项的方法，其进一步包含将另外的治疗剂施用该个体。
Ⅲ实例
以下为本发明的方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文给出的一般描述，可以实施各种其他实施例。
实例1–源自天然噬菌体库的抗Tie 2抗体的生成
与Tie2的细胞外结构域(ECD)结合的抗体初始为选自噬菌体展示合成抗体库，该库是通过如下文所述将合成多样性引入重链CDR内的溶剂暴露位置处而于单一人框架上构建。针对ECD以及ECD的多种亚结构域而筛查噬菌体。
用于库构造的噬菌质体
噬菌质体pV0350-2b和pV0350-4设计为用以分别将Fab模板单价地或二价地展示于M13噬菌体颗粒的表面上。Fab模板为基于h4D5抗体，该抗体为人源化抗体，其识别被称为Her-2(erbB2)的癌症相关抗原。h4D5序列通过聚合酶连锁反应使用humAb4D5版本8(“humAb4D5-8”)序列获得(Carter等人，(1992)PNAS 89:4285-4289)。h4D5核酸序列编码来自小鼠单克隆抗体的经修饰CDR区，该单克隆抗体具有对于人类共有序列Fab框架中的Her-2的特异性。具体而言，该序列含有位于VH和CH1结构域(HC区)上游的κ轻链(LC区)。作成抗Her-2抗体的方法以及可变结构域序列的一致性提供于美国专利第5,821,337号及第6,054,297号中。
通过在phoA启动子的控制下修饰先前所述的已经用于人生长激素(hGH)的噬菌体展示的噬菌质体(pHGHam-gIII)，构造载体pV0350-2b。编码stII分泌信号序列的以及与M13次要外壳蛋白P3(cP3)的C末端域融合的hGH的phGHam-gIII中的开放阅读框被替换为含有两个开放阅读框的DNA片段。第一开放阅读框编码h4D5轻链(版本8)，而第二开放阅读框编码与cP3融合的h4D5重链的可变结构域(VH)及第一恒定结构域(CH1)；每个蛋白质通过N末端stII信号序列引导分泌。位于重链片段与cP3之间的琥珀终止密码子(amber stopcodon)被删除，因为已经证明这一修饰增加展示于噬菌体上的Fab水平。将表位标签添加到h4D5轻链的C末端(gD标签)。用于双价展示的载体(pV0350-4)与pV0350-2b相同，但将编码GCN4亮氨酸拉链的DNA片段***重链CH1结构域cP3直接，如所述者。于两种噬菌质体中在三个位置处进一步修饰轻链基因，以编码最常见于天然抗体序列的Kabat数据库中的氨基酸；具体而言，将Arg66改变为Gly，并且将Asn30和His91改变为Ser。发现此等改变增加Fab于噬菌体上的表达及展示。使用Kunkel等人的方法执行定点诱变(Kunkel,J.D.,等人，(1987)Methods Enzymol 154:367-82)。
如所述，使用寡核苷酸定点诱变和pV0350-2b或pV0350-4的“终止模板”生成噬菌体展示库(Lee,C.V.,等人，(2004)J.Immunol.Methods284:119-132；Lee,C.V.,等人，(2004)JMB 340:1073-1093)。终止密码子(TAA)包埋于全部三个重链CDR中。此等于诱变反应过程中由简并退化寡核苷酸的混合物修复，这些寡核苷酸于编码CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列上退火，并且将位于被选择进行随机化的位置处的密码子替换为定制的简并密码子。诱变反应为电穿孔于大肠杆菌SS320细胞内，并且令培养物于30℃在以h KO7辅助噬菌体、50g/ml的羧苄青霉素和50g/ml的卡那霉素补充的2YT培养液中生长过夜。如所述，通过使用PEG/NaCl沉淀而从培养基中收获噬菌体(Sidhu,S.S.等人，(2000),MethodsEnzymol.328:333-363)。每个电穿孔反应使用～1011个大肠杆菌细胞以及～10ug的DNA，并且导致1×109–5×109个转形体。
使用定制的简并寡核苷酸作成特殊库以模拟CDR-H1己基CDR-H2的天然多样性(如上的Lee,C.V,等人，(2004),JMB中的表1)：具有Fab.zip模板的库3(Lib-3)。参见，如上的Lee,C.V,等人，(2004)中描述的Lib-3。将用于CDR-H1和CDR-H2的两个至四个寡核苷酸合并以增加天然多样性的覆盖率。Lib-3使用分别用于CDR-H1和CDR-H2的寡核苷酸H1a和H1b(比率2:1)和H2a-c(比率1:2:0.1)(参见，如上的Lee,C.V.等人(2004),JMB的表1，关于寡核苷酸的描述)。
对于CDR-H3中的95–100位，Lib-3由一组具有经扩张的CDR-H3长度的包含NNS密码子(或NNK密码子)或NNS密码子的经修饰版本(XYZ密码子)的库组成，该等库在密码子三联体的每个位置处含有不相等的核苷酸比率。NNS密码子涵盖32个密码子并且编码全部20种氨基酸。X含有38％G、19％A、26％T和17％C；Y c含有31％G、34％A、17％T和18％C；以及Z含有24％G和76％C。关于Lib-3的CDR-H3设计描述于如上的Lee,C.V.等人，(2004)的表5中。对于每个CDR-H3长度执行独立的诱变反应并且进行电穿孔，但对于7个和8个残基的长度一起进行电穿孔。
每个库中的完全Fab的噬菌体展示水平系通过测量48种随机拾取的克隆与抗gD抗体的结合而检查。对于Lib-3，针对不同的CDR-H3长度观察到相似的展示水平，但合并有最长CDR-H3(15–19个残基)的库具有降低的Fab展示克隆的百分比(15–30％)。这可能反映了当使用超长合成寡核苷酸时降低的诱变效率。
噬菌体分选
针对多种Tie2细胞外结构域(ECD)蛋白质，对上述的Lib-3进行分选。Tie2 ECD由下列构成：从膜远端到膜近端，3个IgG结构域(Ig1和Ig2)、3个EGF结构域(EGF1-3)、第三IgG结构域(Ig3)以及3个III型纤连蛋白结构域(FN3)(参见，例如，图1)。生成构造体以编码全细胞外结构域(ECD)、膜近端FN3结构域或不具有FN3结构域的ECD(称为ECD5)。因此，配体结合结构域Ig2由ECD构造体和ECD5构造体两者编码，但不由FN3构造体编码。所编码的蛋白质在C末端融合至hIgG1(对于人及食蟹猴蛋白质)或mIgG2a(对于鼠及大鼠蛋白)的Fc区或融合至C末端Flag标签(对于所有物种)。图1示出了用于淘选的蛋白质。也使用两种C末端Fc融合体或Flag标签生成用于人、鼠及大鼠Tie1受体的全ECD构造体。
Tie2 ECD蛋白质的表达及纯化
从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞条件化培养基中表达并纯化经flag标签化的Tie2ECD。于11-14天之后，收获该条件化培养基并浓缩大约十倍。将浓缩物上样到抗flag-标签柱上，并且用结合缓冲液洗涤，该缓冲液含有25mM TRIS、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％Triton X-114和0.1％Triton X-110，pH 7.5。然后，经flag标签化的蛋白质用pH 3.0的50mM N柠檬酸盐和150mM NaCl洗脱，然后使用1M精氨酸、pH 9.0的400mM琥珀酸中和至pH5.0。将经洗脱的蛋白质上样到处于磷酸盐缓冲盐水中的尺寸排阻柱(Superdex 200或Superdex 75)上并收集级分；将单体峰级分合并，浓缩，并进行0.2um过滤。
对于淘选，于4℃，用处于PBS中的靶标Tie2抗原(5ug/ml)以100ul/孔将96孔NuncMaxisorp板包被过夜。用65ul 1％阻断蛋白质将该板阻断30分钟(min)，并且用40ul 1％Tween20再阻断30min(阻断蛋白质：第1轮：牛血清白蛋白(BSA)；第2轮：酪蛋白；第3轮：牛血清白蛋白(BSA)；第4轮：酪蛋白)。之后，用具有0.1％Tween 20的1％BSA将噬菌体库稀释至～3-5OD/ml(1OD＝1.13x1013个噬菌体/ml)。通常，噬菌体输入为：第1轮3-5OD/ml，第2轮3OD/ml，第3轮～0.5-1OD/ml及第4轮～0.1-0.5OD/ml。将经稀释的噬菌体在室温下孵育30min。用PBS和0.05％Tween 20将该等孔连续洗涤至少5次。在室温下，将经阻断的噬菌体库以100ul/孔添加到8个经靶标抗原包被的孔和2个未包被的孔，添加时间为2小时(hr)。用PBS和0.05％Tween 20将这些板连续洗涤至少10次。从淘选的第3轮开始，将1uM奥玛珠单抗作为含无关Fc的蛋白质、Tie2.ECD5或抗体抗Tie2.20(配体阻断)添加到噬菌体库中，添加时间一小时，然后将混合物施加到经Tie2包被的孔上，结合2hr。用100ul/孔的100mM HCl在室温下将噬菌体稀释20min。将经稀释中噬菌体(来自经包被的孔)及背景噬菌体(来自未包被的孔)收集到独立的管中。通过添加1/10体积1M Tris pH 11.0到两个管中而中和经稀释的收集物。将BSA以0.1％的最终浓度添加到经稀释的噬菌体的管中。为了测定噬菌体的效价，将90ul的对数期XL-1(OD 600nm～0.1-0.3)用10ul经稀释的噬菌体或背景噬菌体在37℃感染30min。之后，用90ul 2YT将经感染的细胞以10倍增量进行连续稀释。将经感染的细胞的10ul等量小样铺板于羧苄青霉素板上。
为了在淘选轮次之间传播噬菌体，使用大约400ul的经稀释的噬菌体于37℃将～4ml对数期XL-1(OD 600nm～0.1-0.3)感染30-45min。在37℃下，将辅助噬菌体KO7及羧苄青霉素以1x1010pfu/ml KO7和50ug/ml羧苄青霉素的最终浓度添加到感染中，添加时间一小时。令培养物于最终体积为20～25ml的具有羧苄青霉素50ug/ml和50ug/ml卡那霉素的2YT培养基中生长，于37℃生长4hr并且于30℃生长过夜(或至少18hr)。次日，通过将细胞以8000rpm旋转沉降10min而纯化库噬菌体。收集上清液。以1/5的上清液体积添加20％PEG/2.5M NaCl，混合，并于冰上静置5min。将噬菌体以12000rpm离心成球丸15min。球丸再次以5000rpm旋转5min。将球丸再悬浮于1ml PBS中并且以12000rpm旋转沉降15min以澄清碎片，并添加PEG/NaCl进行沉淀。将噬菌体球丸再悬浮于PBS中。在268nm处读取再悬浮的噬菌体球丸的OD。
筛查性ELISA测定法
通过ELISA对来自第四轮的克隆进行Tie2结合及特异性的筛查。通过使用Tie2蛋白质或无关蛋白质以65ul/孔(1ug/ml，在包被缓冲液中)于4℃将96孔微量滴定板的孔包被过夜，执行筛查性ELISA。于96管板中，令来自第四轮的克隆于37℃在具有50ug/ml羧苄青霉素及辅助噬菌体KO7的400ul 2YT培养基中生长过夜。将这些板以3000rpm旋转沉降10min。将30ul的培养物上清液与60ul的ELISA缓冲液(PBS，具有0.5％BSA和0.05％Tween20)一起添加到经Tie2包被的板中，并且在室温下孵育1hr。将板用PBS-0.05％Tween20和100ul/孔的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗M13抗体(1/5000稀释于PBS加上0.5％BSA和0.05％Tween20中)在室温下洗涤30min(Sidhu等人，见上文)。用PBS-0.05％Tween20洗涤该等孔，然后将100ul/孔的1:1比率的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物及过氧化物酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg,MD))添加到每孔中，并且在室温下孵育5min。通过添加100ul 1M磷酸(H3PO4)到每孔中而终止反应，并使用标准ELISA读板器于450nm测定这些孔的OD。
进一步分析具有与上述背景结合的Tie2并且具备Tie2结合物种特异性及与含无关Fc的蛋白质的低结合的克隆(奥玛珠单抗)。下表2至5汇总了结合数据。表2至5中无一显示结合至奥马珠单抗。
表2
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表3
Figure BDA0003856685280001052
/>
表4
Figure BDA0003856685280001053
表5
Figure BDA0003856685280001054
Figure BDA0003856685280001061
抗Tie2 IgG表达及纯化
将上文鉴定的具有所需物种特异性及低无关蛋白质结合的阳性结合剂测序，并且将抗Tie2重链的可变结构域克隆到先前涉及用于在哺乳动物细胞内进行短暂的人IgG1表达的载体中。(Lee等人，2004a)。
使用由上文生成的构造物编码的重链和4D5轻链(SEQ ID NO:25)进行293短暂的转染，从而表达所得抗Tie2人IgG。使用蛋白质A亲和力层析术将IgG从转染上清液中纯化，并通过ELISA针对Tie2结合证实、Tie1结合及表位谱进行筛查。八种抗体未进一步分析，因为hIgG蛋白质或未表达或表达极差。
实例2–源自噬菌体库的抗Tie 2抗体的表征
Tie2结合
为了证实通过抗Tie2抗体进行的Tie2结合，使用ELISA形式，其中，于4℃，将被构造为如上所述的IgG1形式的Tie2外构造体以2ug/ml在65ul PBS中在Maxisorp免疫板上固定过夜。将抗Tie2 IgG的连续稀释物施加到具有经固化的Tie2的板上，该板先前已经使用1％BSA于PBS中的溶液阻断并在室温下孵育20min。洗涤该板，并使用上述方法用抗huFC缀合的HRP二级抗体检测。图2A及图2B显示了多种克隆与人Tie2ECD结合。
也使用经固定化的Tie1蛋白质使用结合ELISA来评估Tie1结合。提供于图3A及图3B中的结果显示了几种抗Tie2抗体与Tie1结合的缺乏，证明这些抗Tie2抗体特异性结合Tie2。
配体阻断
为了评估抗Tie2抗体的Ang1和Ang2配体阻断活性，使用竞争性ELISA形式。在此测定法中，将hAng2(GenBank登录号NP_001137)或hAng1(GenBank登录号NP_000450)固定在Maxisorp免疫板上(2ug/ml)，并将经生物素化的huTie2ECD.Fc与具有抗Tie2抗体的连续稀释物的溶液中平衡，然后用经固定化的hAng1或hAng2捕获未结合的生物素-Tie2.ECD.Fc，并使用链霉亲和素缀合的HRP检测。这些结果显示了，Ang1和Ang2两者至少抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.12和Tie2.20阻断(参见，图4A及图4B)。
实例3–抗Tie2抗体的功能分析
进一步分析上文鉴定为能够特异性结合Tie2的抗Tie2抗体，以鉴定那些能够发挥作为Tie2激动剂的功能。使用两者都已知表达Tie2的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)，评估具有经证实的Tie2结合的抗Tie2 IgG的功能活性(参见，图5A及图5B)。
磷-AKT(pAKT)的刺激
执行实验以评估抗Tie2抗体关于Tie2激活的功能。作为Tie2激动剂的根据本公开的Tie2缀合物预期结合至并且激活Tie2，导致下游的AKT酶激活。AKT的激活可通过AKT蛋白质磷酸化以产生pAKT而得以证明，如下文所述。AKT的磷酸化是通过使用对于经磷酸化的AKT具有特异性的抗体的蛋白质印迹分析或通过FRET测定法测定，如下文所述。
细胞及抗体：HUVEC购自Lonza(目录号CC-2517；Lonza,Ltd.,Basel,Switzerland)。RAEC购自VEC Technologies并且于生长培养基(目录号MCDB-131 10；VECTechnologies,Inc.,Rensselaer,NY)中培养。抗Tie2抗体于基因泰克公司(Genentech,Inc.)(South San Francisco,CA)制备。多克隆山羊抗hIgG用作交联剂(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)。
HUVEC的制备：HUVEC(人血管内皮细胞)系经胰蛋白酶化并以0.4x105细胞/孔在100μl培养基中种植于无菌96孔板(
Figure BDA0003856685280001081
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目录号3997)中，将该板于37℃、5％CO2孵育箱中孵育过夜。去除培养基，将100μL预热的血清饥饿培养基(Basal MediumEndoGROTM；目录号SCME-BM，MilliporeSigma)添加到该板的每个孔中。将该板于37℃、5％CO2孵育箱中孵育3hr，然后用抗Tie2抗体孵育。
RAEC的制备：将RAEC(大鼠主动脉内皮细胞)以12,000个细胞/孔的密度种植在96孔细胞培养板中，并且于100μl EGM2 MV培养基(Lonza,Ltd.)中在37℃和5％CO2培养过夜。过夜培养之后，将细胞于具有0.1％BSA的EBM2基础培养基(Lonza,Ltd.)中饥饿培养3小时，然后用抗Tie2抗体孵育。
为了测试交联抗Tie2抗体的效应，将处于测定缓冲液(基础培养基+0.2％BSA)中的20μg/ml交联剂(多克隆山羊抗hIgG1)与相等体积的60μg/ml抗Tie2二价抗体混合，并于RT孵育1hr。孵育之后，对hIgG1与抗Tie2-IgG抗体的混合物进行3倍连续稀释。
为了测试其他Tie2抗体剂，将这些分子在测定缓冲液中稀释至起始的高原液浓度(通常为30--1000μg/ml)，然后进行(通常为2至10倍)连续稀释。在去除血清饥饿培养基之后，将这些稀释物(50μl)添加到每孔中，并将该板于37℃、5％CO2孵育15分钟。去除溶液，并将含有来自磷-AKT1/2/3Ser473细胞试剂盒(目录号64AKSPEH；Cisbio,Codolet,France)的阻断缓冲液的50μl裂解缓冲液添加到细胞中。在轻柔摇动下，将该板在室温下孵育约30min至45min，于-80℃冷冻直到使用为止，或直接用于FRET测定中。
蛋白质印迹测定法：将HUVEC细胞以1x106个细胞/孔铺板于Endogro培养基中，并且于37℃孵育16-18小时。将培养基改变为0.1％BSA Endogro基础培养基，持续时间为4-5小时，然后进行刺激。将细胞在37℃用相关Tie-2激动剂孵育30min，用pH 7.4的冷磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。将细胞置于冰上并且用含有Roche完全蛋白酶及磷酸酶抑制剂(ThermoScientific，目录号1861281)的100ul/孔的RIPA缓冲液(Sigma，目录号20-188)孵育5min。使用细胞刮棒从孔中收获裂解液，并以17,800x g离心10min。通过SDS-PAGE(8％NuPAGEBis-Tris(Invitrogen,NW800085))评估上清液，然后转移至硝化纤维素膜。将膜在室温下用处于TBS-T中的5％BSA阻断1hr，并且使用兔抗pAKT(Cell Signaling Technologies，目录号9271S)于阻断缓冲液中探查。用TBS-T洗涤4次之后，用HRP抗兔Ig(1:10,000)(GEHealthcare，NA934V)于RT对膜探查1hr。将膜用TBS-T洗涤3次，并且用ECL试剂(ThermoScientific，32132)在室温下孵育5min，然后将印迹暴露于膜上。
FRET测定法：将细胞裂解物(15μl)在冰上融化，然后在384孔微量板(目录号784080；Greiner Bio-One North America,Inc.,Monroe,NC)中与5μl的来自磷-AKTSer473试剂盒的每个磷-AKT d2抗体及磷-AKT穴状化合物(Cryptate)抗体的1:40稀释物混合，并将该板在室温下孵育4hr或于4℃孵育过夜，并且在CLARIOstar(BMG LABTECH，软件版本：5.01R2)上于620nm和665nm读取。对于每个体孔，数据计算为接纳者与供者发射信号的比率乘以104。
在一试图鉴定抗Tie2抗体能够激活Tie2活性的尝试中，如上文详细鉴定的结合Tie-2的抗体是形式化为人IgG1(hIgG1)抗体并且测试其刺激AKT磷酸化(以生成pAKT)的能力，该磷酸化位于Tie2激活的下游。使用下列重组抗Tie2抗体(hIgG1)测试RAEC：Tie2.1、Tie2.4、Tie2.5、Tie2.16和Tie.2.20，测试时间10分钟。对细胞裂解液进行pAKT的蛋白质印迹(WB)分析。图6A显示，在这一基于细胞的体外测定中，抗Tie2抗体Tie2.1和Tie2.20的孵育增加了AKT磷酸化，并且Tie2.1具有比Tie2.20更强的Tie2激动剂效应。
之后，执行实验以评估交联在抗Tie2抗体的激动剂活性上的效应。在pAKT测定中，用Tie2.1或Tie2.20孵育抗hIgG1交联抗体。如图6B中所示，Tie2.1的交联进一步增加了其激活Tie2的能力，如通过增加的AKT磷酸化所测定。
在一试图鉴定另外促效性抗Tie2抗体的尝试中，还使用了基于HTRF的测定(Cisbio)。将RAEC用重组抗Tie2抗体(hIgG1)处理10分钟。对细胞裂解液进行pAKT的HTRF分析(cisbio)。如图7A中所示，发现显著增加pAKT水平(用作Tie2激动剂)的抗体至少包括Tie2.24、Tie2.31、Tie2.32、T2.33、Tie2.38和Tie2.1，其中Tie2.1具有强活性。
据认为，当被Tie2 IgG(全长)抗体结合时的Tie2激活水平可能部分地由于反应混合物内IgG分子的非特异性聚集所致。如图7B中所示，与具有较低百分比(例如，0.15％)的聚集体的Tie2.1抗体制剂相比，具有较高百分比(例如，3.5％)的聚集体的Tie2.1抗体制剂展现更强的促效活性。图7B进一步显示，交联抗hIgG1增强了Tie2.1的促效活性。不受缚于理论，据信，Tie2被抗Tie2激动剂抗体激活可能受到Tie2结合抗体的交联的促进。
实例4–源自天然噬菌体库的抗Tie2抗体的分类
使用噬菌体ELISA和Octet测量两者执行抗Tie2抗体的分类，以进一步特征抗Tie2抗体与Tie2受体蛋白质的结合并且鉴定具有共有表位的那些抗体。
对于噬菌体ELISA，将huTie2ECD.Fc蛋白质以2ug/ml于65ul PBS中在Maxisorp免疫板上在4℃固定过夜。将形式化为IgG的抗Tie2抗体Tie2.1、Tie2.20、Tie2.34或抗Tie2抗体13H10(抗Tie2受体激动剂抗体，描述于美国专利第6,365,154号中)的连续稀释物施加到具有经固定化huTie2ECD.Fc的板上，该板先前已经使用1％BSA于PBS中阻断并且在室温下孵育1小时。将抗Tie2噬菌体在室温下以0.1的OD268nm/mL添加15min。然后洗涤该板，并使用上述方法用抗M13缀合的HRP二级抗体检测。信号随着连续稀释的抗体降低而增加，指示测试噬菌体与连续稀释的抗体竞争，表明它们结合相同的位点或表位。
如通过上述ELISA测定的表位结合是通过Octet表位分类测定法使用OctetRED384(Pall Forte Bio Corporation,Menlo Park,CA)及标准夹心形式分类测定法予以证实。具体而言，以经生物素化的hTie2.ECD.Fc蛋白质(10ug/mL)包被链霉亲和素生物传感器(Pall Forte Bio Corporation)，然后暴露于基准抗Tie2 hIgG1(50ug/mL Ab1、Ab20、13H10)，之后暴露于第二(测试)抗Tie2 hIgG1。使用Forte Bio’s数据分析软件处理数据。被第二(测试)抗体额外结合指示未被占据的表位(非竞争者)，而无结合指示表位阻断(竞争者)。具有从Ab20(Tie2.20)获得的数据的实验的图示提供于图8A及图8B中。关于其他抗Tie2抗体的数据未显示。
ELISA和Octet分类测定分析的结果汇总并示出了于图9中，显示哪些抗Tie2抗体彼此竞争并且可能结合相同或相似表位。具体而言，上文描述的结合测定法证，源自噬菌体的抗体Tie2.1(Ab1)、Tie2.12(Ab12)、Tie2.24(Ab24)和Tie2.33(Ab33)全部与Tie2 IgG2结构域结合，阻断Ang1和Ang2与Tie2的结合，并且为Tie2激动剂(例如，增强AKT和/或Tie2的磷酸化，和/或增强血管内皮细胞膜完整性)。
总体而言，结果指示，存在至少3个被本文所述的抗Tie2抗体结合的表位类别。这些至少3个表位类别示出于图9中。
抗Tie2 IgG抗体的亲和力测定
使用Biacore T200仪器(GE Life Sciences)测定所选抗Tie2 hIgG的单价亲和力。将抗人Fc共价固定在Series S CM5 Biacore传感器芯片上以使得能够进行对抗Tie2抗体的非共价捕获，并且使用多循环动力学实验形式于25℃实时监控人或大鼠Tie2ECD.flag的结合。在循环之间，使用3M MgCl2将表面再生。使用Biacore评估软件(GE LifeSciences)以将1:1结合模型拟合至数据，通过动力学分析测定单价亲和力。结果汇总于表6中。
表6
Figure BDA0003856685280001111
实例5–抗Tie2抗体的体内生成
除了噬菌体库之外，也通过动物免疫作用进行可用于治疗性应用的抗Tie2抗体的生成。
兔免疫作用。使用人及食蟹猴Tie2的ECD(SEQ ID NO:1，残基23-442)将新西兰白兔作用\免疫，并使用与公开文献相关的修订方案分离单个B细胞，例如，参见，Seeber等人，PLoS ONE 9(2),2014。通过ELISA分析B细胞培养物上清液与人、大鼠及食蟹猴Tie2以及无关对照蛋白质的结合，并通过FACS分析与HUVEC细胞的结合。裂解Tie2特异性B细胞，立即在-80℃冷冻保存，直至进行分子克隆。如前所述，将来自兔B细胞的各种单克隆抗体的可变区(VH和VL)克隆到所提取的mRNA的表达载体中，例如，参见，Seeber等人，PLoS ONE 9(2),2014。个别的重组兔抗体在Expi293细胞中表达，然后用蛋白A纯化，然后对纯化的抗Tie2抗体进行功能活性测定及动力学筛选。
大鼠免疫作用。以类似方式将大鼠作用\免疫，并且使用经修饰的融合配偶体生成杂交瘤(例如，参见，Price等人，J Immunol Methods31；343(1):28-41(2009))。对多种条件进行优化，以使得能够将个体IgG+huTie2融合融分选到单个孔内，然后于分选后进行另外培养。通过ELISA分析所得的杂交瘤上清液与人、鼠及食蟹猴Tie2以及无关对照蛋白质的结合，并通过FACS分析与HUVEC细胞的结合，使用蛋白质A纯化阳性样品以进行后续的功能及动力学表征。
使用抗IgG交联剂急性大鼠及兔克隆的功能筛查。
关于Tie2促效作用下游的pAKT诱导来表征上述的从大鼠及兔免疫作用生成的抗体。
细胞及抗体：人脐静脉内皮(HUVEC)细胞购自Lonza(目录号CC-2517；批号0000321046)，而大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)购自VEC Technologies并于生长培养基(VECTechnologies,INC，目录号MCDB-13110)中培养。抗Tie2抗体于Genentech制备。用作交联剂的物种特异性抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc。
HUVEC的制备：HUVEC为经胰蛋白酶化并以0.4x105细胞/孔在100μl培养基中种植于无菌96孔板(Costar，目录号3997)中，将该板于37℃、5％CO2孵育箱中孵育过夜。去除培养基，将100μL预热的血清饥饿培养基(Basal Medium EndoGROTM；目录号SCME-BM)添加到该板的每个孔中。将该板于37℃、5％CO2孵育箱中孵育3小时，然后用Tie-2激动剂孵育。
RAEC的制备：将RAEC以12,000个细胞/孔的密度种植在96孔细胞培养板中，并且于100μl EGM2 MV培养基中在37℃和5％CO2培养过夜。过夜培养之后，将细胞于具有0.1％BSA的EBM2基础培养基中饥饿培养3小时，然后用Tie-2激动剂孵育。
为了测试经交联的抗Tie2抗体，即将处于测定缓冲液(来自GNE培养基制备工厂的基础培养基+0.2％BSA)中的20μg/ml交联剂与相等体积的60μg/ml抗Tie2二价抗体混合，并于RT孵育1hr。孵育之后，对抗体进行3倍连续稀释。
为了测试其他Tie2激动剂，将这些分子在测定缓冲液中稀释至起始的高原液浓度(通常为30--1000μg/ml)，然后进行(通常为2至10倍)连续稀释。于去除血清饥饿培养基之后，将这些稀释物(50μl)添加至每个孔中，并将该板于37℃、5％CO2孵育15min。去除溶液，将50ul的含有来自pAKT Ser473试剂盒(Cisbio，参考号64AKSPEH)的阻断缓冲液的裂解缓冲液添加到细胞中。在轻柔摇动下，将该板在室温下孵育约30min至45min，于-80℃保存直到使用为止，或直接用于FRET测定中。
FRET测定法：将细胞裂解物(15μl)于冰上融化，然后在384孔微量板(GreinerBio-One North America,Inc.，目录号784080)中与5μl的来自pAKT Ser473试剂盒的每个磷-AKT d2抗体及磷-AKT穴状化合物(Cryptate)抗体的1:40稀释物混合，并将该板在室温下孵育4hr或于4℃冰箱中过夜，并且在CLARIOstar(BMG LABTECH，软件版本：5.01R2)上于620nm和665nm读取。对于每个体孔，数据计算为接纳者与供者发射信号的比率乘以104。
重组抗体生成。
通过基因合成生成编码重链可变结构域及轻链可变结构域的DNA，并将其分别***用于IgG1抗体重链及轻链表达的哺乳动物载体中。编辑一下可变结构域序列以去除明显未配对的半胱氨酸残基以及NX[S/T]N-醣基化模体。通过使用编码该抗体重链及轻链的哺乳动物表达载体对Expi293细胞进行短暂的转染而产生重组抗体。重链及轻链在独立的载体上编码，并且使用1:2比率的重链表达载体与轻链表达载体转染。通过亲和力层析术从细胞培养上清液纯化抗体。在一些情况下，对抗体进行基于SEC的另外纯化步骤。
使用Biacore T200仪器(GE Life Sciences)筛查与人及食蟹猴Tie2结合的抗体。简而言之，使用S系列CM5芯片、人抗体捕获试剂盒及胺偶联试剂盒(GE Life Sciences)生成人抗体捕获芯片。使用10μl/分钟的流速和20秒的接触时间捕获了稀释至5μg/ml的抗体。300nM和1500nM重组人及食蟹猴Tie2细胞外结构域与所捕获的抗体的结合为于37℃使用单周期动力学方法以50μl/分钟的流速、60秒的接触时间和120秒的解离时间进行分析。在周期之间，使用3M MgCl2以30μl/分钟注射30秒来再生芯片。使用Biacore T200评估软件(GELife Sciences)评估数据。使用将参数RI设定为零的1:1结合模型获得动力学常数。取所选择的抗体(表7A至表7B；ch表示兔Ab；TEK表示大鼠Ab)继续进行Fab-NDK形式的二级活性筛查(参见，下文的实例8)。
表7A
Figure BDA0003856685280001141
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表7B
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Figure BDA0003856685280001171
HTP表位分类。
将通过动物免疫作用生成的抗体以及所选的实例1中描述的源自噬菌体的抗体形式化为hIgG1骨干，并且使用配备DA v6.19.3,IBIS SUIT,SprintX&Carterra表位工具软件的CFM2/MX96 SPR***(Wasatch Microfluidics，现为Carterra)执行分类。使用pH 4.5的10mM醋酸钠固定化缓冲液，通过胺偶联将抗体固定SPR传感器棱镜CMD 200M(XantecBioanalytics)上。使用CFM2仪器执行固定化，然后将传感器棱镜转移到IBIS MX96仪器以进行基于SPR的竞争分析。使用HBS-EP运行缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05％Tween20，pH 7.4，1mM EDTA)，将经固定化的抗体首先暴露于1μM重组人类Tie2细胞外结构域，然后暴露于20ug/ml溶液中的抗体。结果显示于图11A至11B中，并且指示几种不同的Tie2夹心特征。图11A至11B中的结果通常解释为证明所分析的抗体组中多个(例如，至少8个)不同Tie2表位的存在。有趣的是，数据显示，Tie2.1、Tie2.1M100cF(描述于后文实例11中)、Tie2.12和Tie2.24全部能够发挥Tie2激动剂的作用，归类到一起。
实例6–生成PEG缀合的抗Tie2 Fab多聚体
如上文实例3中所示，抗Tie2抗体对Tie2的激活被经结合至抗Tie2抗体的交联促进。据此，设计并生成多聚Tie2结合组合物以测定将具有优化治疗功效的多聚体构型。
所采用的一种多聚方法为使用多臂聚乙二醇(PEG)分子作为核心，其中每个臂连接或缀合至单个抗Tie2 Fab分子。使用显示以高亲和力与Tie2特异性结合并且发挥Tie2激动剂作用(当与Tie2相互作用时激活AKT磷酸化)的Tie2.1 Fab来测试各种多聚体构型。具体而言，Tie2.1 Fab经修饰，使得重链的C末端经修饰以包括氨基酸残基SPPC(SEQ ID NO:89)，提供PEG部分可缀合至的接头及半胱氨酸。该“Tie2.1-SPPC”Fab缀合至具有数量及长度可变的臂的PEG-马来酰亚胺骨干(多臂PEG-马来酰亚胺获自JenKem Technology USA,Plano,TX)。
Fab纯化及去阻断
全部色谱树脂都来源于GE Healthcare。
Fab于大肠杆菌中表达。将大肠杆菌球丸再次以1.5L/Kg悬浮在pH7.5的25mMTrisHCl、150mM NaCl、5mM EDTA(EQ)中，并且以1000巴微流控两次。将PEI缓慢添加至最终浓度为0.4％，然后在4℃下搅拌过夜。然后将悬浮液以15,000g离心60min并将上清液0.22um过滤。然后将大肠杆菌滤液上样到1.2L Gammabind Plus(GBP)柱上，以30ml/min于EQ中平衡，然后用2CV的EQ以30ml/min洗涤，以4CV的含有0.1％TX114和0.1％TX100的EQ以5ml/min洗涤。之后用2CV的EQ以30ml/min洗涤，然后用2CV的25mM琥珀酸盐pH 6.0以30ml/min洗涤，并且用0.15M醋酸以30ml/min洗脱。随着洗脱液流出柱，用pH 9.0的1M Tris将其中和至pH 5.0。
可替代地，将大肠杆菌滤液上样到1.7L Capto L柱上，在EQ中以35ml/min平衡，然后用2CV的EQ以50ml/min洗涤，用5CV的含有0.1％(v/v)Triton X114和0.1％(v/v)TritonX100的EQ以4ml/min洗涤，然后用50ml/min 2CV EQ洗涤，然后用pH 6.0的25mM琥珀酸盐以50ml/min洗涤，并且用0.15M醋酸以50ml/min洗脱。随着洗脱液流出柱，用pH 9.0的1M Tris将其中和至pH 5.0。
用pH 5.0的20mM醋酸钠(A)将经中和的GBP或Capto L洗脱液稀释一倍至三倍，并且上样到阳离子交换树脂(SPHP)上。用含有0.1％Triton X114和0.1％Triton X100的2CV(A)5CV(A)洗涤柱，之后用2CV(A)洗涤，然后使用含有1M NaCl(B)的(A)的10CV 0-20％梯度进行梯度洗脱，收集级分。将含有Fab峰的级分合并。
使用pH 8.5的1M Tris将经纯化的Fab池调节至pH 8.0，并将EDTA添加至最终浓度为2mM。为了降低Fab，将50倍过量的DTT添加到溶液中，然后于22℃孵育过夜，并通过质谱法检查加成物的去除。
使用10％醋酸将pH调节至5.2之后，将降低的Fab结合至SPHP，用10CV的pH 5.0的25mM醋酸钠洗涤，并且用pH 8.0的50mM Tris、150mM NaCl洗脱。用pH 8.5的1M Tris将经洗脱的Fab池带至pH 8.0，添加2mM EDTA，并且使用15倍摩尔过量的DHAA进行再氧化。在通过质谱检查Fab的再氧化之后1.5小时；如果必要，添加另外10倍摩尔过量的DHAA，将样品孵育1小时并再次检查。然后，使用10％醋酸将经再氧化的Fab的pH调节至5，并且于如上所述的SPHP柱纯化，但使用20CV10--60％梯度(B＝25mM醋酸钠，300mM氯化钠，pH 5.0)洗脱，将主要峰进行10kD浓缩并0.2um过滤。其他Fab可经纯化，并以基本相同的方法去阻断。
六聚体缀合及纯化
在pH 5.0的25mM NaOAC、150mM NaCl、2mM EDTA中，将Tie2.1-SPPC缀合至10mg/mL左右的浓度的来自JenKem的6KDa PEG六聚体。在平衡至室温之后，将来自JenKem的6KDaPEG六聚体以3mM的浓度悬浮于pH 5.0的25mM醋酸钠中。将pH保持为低于pH 6以避免马来酰亚胺开环。一旦PEG可溶解，即将其以9:1(Fab:PEG)的摩尔比率添加至Tie2.1-SPPC其阻断的Fab中。然后，在轻柔摇动下，将混合物在室温下放置过夜。在缀合之后，使用尺寸排阻色谱法(SEC)在Superdex-200柱上以pH 5.5的20mM His-醋酸盐、150mM NaCl纯化Tie2.1 FabPEG六聚体，该纯化步骤从缀合混合物中去除过量Fab及聚集体。运行经还原剂未经还原的NuPage 4--12％Bis tris凝胶，以确定哪些缀合物级分需要进一步纯化以富集六聚体。将缀合物级分合并，并且使用来自GE的SP Sepharose高效能强阳离子交换树脂的阳离子交换法(CEX)进一步纯化，以富集6种Fab/PEG。CEX在pH 5.0的25mM醋酸钠中运行，并且使于缓冲液B中20％至33.4％的梯度(缓冲液B为pH 5.0的25mM NaOAC、300mM NaCl)在44.5CV洗脱，然后以33.4％--50％B的梯度洗脱10min，并最终用100％B洗脱。少数不同的不同级分的迷你池如上所述于凝胶上运行，并使用该数据来决定合并哪些级分。将迷你池3合并，然后以40mg/mL调配在pH 7.2的PBS中。
然后，最终样品于分析性SEC上运行，使用TSKgel G3000SW xl柱，以0.2M KPO4、pH6.2的0.25M KCl、15％异丙醇作为缓冲液，测定所存在的聚集体的百分比。其也如早前所述于凝胶上运行。
FabIgG纯化
将CHO条件化培养基在MabSelect Sure亲和力柱(GE Healthcare)上纯化，之后在尺寸排阻色谱法(SEC)S200柱上纯化。可替代地，将亲和力洗脱液稀释并上样到阳离子交换柱(SPHP)上，然后洗涤并用盐梯度洗脱。然后，将经纯化的单体峰浓缩并透析到制剂缓冲液中，并且经0.2um无菌过滤。
FabIgG与六聚体pAKT活性的比较
Tie2.1.38为双表位Fab-IgG，其激活Tie2(HC于本文中提供为SEQ ID NO54，LC于本文中提供为SEQ ID NO53)。执行实验以评估PEG-六聚体形式的Tie2.1(6kDa PEG于HC的C末端经由SPPC连接)以及Tie2.1.38(通过IgG形式提供交联)的能力。使用Tie2.1-PEG-六聚体观察到了更高效力的激活(图12A)。
经由多臂PEG多聚化的抗Tie2 Fab的激动剂活性
用RAEC孵育10μg/ml的PEG-多聚体，并如所述者评估pAKT水平的改变(实例3)。具有更多臂和/或具有较短臂者具有更高活性的倾向，其中6-臂、6kDa核心和8臂、20kDa核心者显示接近最大的活性(图12B)。
实例7–使用IgM格式的抗Tie2 Fab的多聚化
使用IgM形式发展了另一种将抗Tie2 Fab多聚化的方法。将编码来自Tie2.1的VH的DNA融合到IgM CH1上。不受缚于理论，据信，多个可变片段(Fv)的密切结合使得IgM能够结合靶标而无需亲和力成熟(Boes,2000,Mol Immunol,37:1141-1149)。
IgM表达及纯化的优化。
如制造商所推荐，人IgM(huIgM)表达于30ml的Expi293细胞培养物中(例如，参见，“Expi293 Expression System,User Guide”，印行号MAN0007814，来自ThermoFisherScientific)。将多种比率的IgM重链与轻链(六聚体)或重链与轻链与J链(五聚体)转染到细胞内。根据制造商的建议，使用Capto L树脂(GE healthcare)对多收获的上清液进行亲和力纯化(例如，参见Lombana等人，2019,mAbs,11:1122-1138)。通过A280评估蛋白质的总产量，并且通过分析性SEC使用Waters Xbridge BEH SEC 450埃柱评估纯度。图13A显示多种比率的huIgM重链与轻链与J链(如果包括)对于从亲和力柱分离出的蛋白质总产量的影响。
通过使用比率为1:1或2:1的包含LC和HC的质体与质体DNA转染细胞而继续进行六聚体优化。每个比率导致相似的总蛋白质产量(2.5--3mg，来自30ml表达)，然而，1:1比率下的产物质量似乎有所改善且存在的LC二聚体的量降低。通过将J链包括于转染中而实施推定五聚体的表达。在4:4:1LC:HC:JC的最优比率下，表达及产物质量都得以最大化(图13A至13B)。值得注意的是，在最优条件下，相对于JC的LC和HC DNA的高水平接近于最终IgM五聚体中的10:10:1链比率。
由于五聚及六聚IgM的表达具有优化的链比率，故放大了人及鼠六聚及五聚IgM的表达及纯化。经由两步纯化，从CHO细胞分离了大约20mg/L的经纯化的六聚或五聚IgM。尽管在该制程下表达的IgG的短暂的产量比典型低3至4倍，但相对容易的纯化与对于眼部药物的低材料要求一起应促进制造的可行性。通过SDS-PAGE证实人IgM的链组成，并且对经还原剂去糖基化的物质的LC-MS显示LC、HC和JC(如果有)的存在。尺寸排阻色谱法显示对应于五聚及六聚鼠IgM的单分散峰以及对应于六聚人IgM的单分散峰。从SEC洗脱出的五聚人IgM处于两个靠近的相关峰中，两者皆含有J链并且具有高的SEC表达分子量。通过光散射评估发现流体动力学半径(Rh)为大约12nM，并且六聚体的预测分子量(～1050kDa)略超过五聚体的那些(～950kDa)(下表9)。
表9
Figure BDA0003856685280001211
Figure BDA0003856685280001221
回转半径与流体动力学半径的比率(Rg/Rh)提供了对于分子形状的一些见解，球形分子平均为～0.775，而更加伸长的分子倾向于更高。单分散IgM的分散度为0.85-0.91的范围，与预期结构一致。为了进一步评估IgM的聚合物鉴定特征，使用负染色TEM及无参照物2D归类法来描述IgM颗粒的架构，结果似乎与颗粒的预期几何学相匹配。在对应于推定人五聚体的两个峰之间没有观察到明显差异。选择人IgM六聚体峰进行进一步探究。人工收集110张TEM显微照片，得到总计1500个颗粒。使用Relion套件(Scheres,2015,J StructBiol,189:114-122)进行三轮无参照物2D归类之后，发现大部分颗粒组织化为六聚体结构。少量颗粒(<2％)被细化为五聚体。与先前对IgM五聚体的结构探究一致(Czajkowsky与Shao,2009,Proc Natl,Acad Sci USA,106:14960-14965)，CH3和CH4结构域似乎形成与影像平面正交的茎状结构域。此外，尽管附接至相同Fc的多对Fab似乎是共平面的，但存在一些标志标明位于相邻Fc上的Fab偏移。部分偏移可能允许六聚体将所有链容纳在空间拥挤的环境中。基于这些数据，选择人六聚IgM作为优选的治疗支架，因为改善的生产纯度和JC的不存在两者都简化了制造并避免了对于考虑聚合性Ig受体介导的体内结合的需求。
用于眼内施用的IgM的表征
之后，使用新西兰白兔作为模型***探究了IgM对于眼部应用的适用性。先前已经将兔体内的PK参数与食蟹猴及人体内的结果关联。为了最小化抗药物抗体干扰IgM的药代动力学评估的风险，生成了全兔IgM六聚体(兔IgM Fc，其具有靶向细胞内表位置兔Fv)。为了避免频繁重复注射，将所注射的蛋白质的量最大化，并因此将所注射的蛋白质的浓度最大化。据此，蛋白质黏度是相当重要的。评估IgM六聚体的黏度并与先前已经探索的其他多价化合物比较(Shatz等人，2019,PLoS ONE,14:e0218613-e0218613)，具体而言，8-臂40kDa分支链PEG及四臂20kDa分支链PEG分别终止于8个和4个Fab(图13C)。全部三种物质的黏度计读数显示预期的对数线性响应。在容易进行玻璃体内施用而无患者疼痛或注射器过度背压(～10-50cP)的黏度下，与其他形式相比，可施用大约两倍质量的IgM。
对rabIgM的SEC-MALS分析发现流体动力学半径为12.9+/-1.1nM，明显超过先前针对Fab观察到的2.5nM半径。为了评估分子尺寸的该增加的功能性后果，用Alexafluor 488标记兔Fab和IgM，并分别将0.5mg或1.2mg经玻璃体内施用至新西兰白兔。在28天中取得活体定量荧光测量，表明两种治疗剂中每一种的持续性(图13D)。在该实验中，Fab显示3.5天的半衰期，与针对其他Fab在兔玻璃体内观察到的～3.4天的典型半衰期相当(Crowell等人，2019,Trans Vis Sci Tech,8:1-9)。IgM显示7.8天的基本上延长的暴露，与其更大的尺寸一致。
IgM的全身性暴露也引起关注，因为快速全身性清除帮助将眼部治疗剂的活性限定于眼睛处。尽管先前对从血清或腹水中分离的IgM的探究已经报告了为期几天的半衰期(例如，Maiorella等人，Biotechnology(NY),1993,11:387-392)，重组生产的材料的清除快得多(例如，Rasche等人，2015,Haematologica,100:377-384)。为了证实这些发现，将非结合重组人IgM五聚体及六聚体的PK于从人血清分离的IgM比较(图13E)。经静脉内注射入SCID小鼠之后，重组IgM五聚体及六聚体被快速清除(t1/2分别为0.25和0.50天)，而所分离的IgM显示更为延长的暴露(t1/2＝2.1-2.9d)。假设快速清除可能是由于IgM的差异性聚醣占据率或组成。每个人五聚体中存在至多51个N-连接的聚糖，而每个人六聚体中为60个。为了支持该理论，聚醣分析显示，从人血清纯化的IgM上的聚醣有75％含有至少一个唾液酸，相比之下，重组六聚体及五聚体中分别为24％和29％(图13F)。
用以最小化huIgM突变体的补体活性的蛋白质改造。
IgM具有充分建立的补体依赖性细胞毒性(CDC)，这对于Tie-2激动剂而言可能是不期望的。为了鉴定将会降低潜在CDC的hIgM Fc突变体，将来自利妥昔单抗(抗CD20抗体)的可变区融合至hIgM的恒定区上。利妥昔单抗IgG为习知诱导CDC。该利妥昔单抗-IgM与所选的Fc突变一起表达为hIgM六聚体并纯化。为了研究IgM的影响，基本上如所述评估补体活性(例如，参见Gazzano-Santoro等人，J Immunol Meth,22,163-171(1997))。简言之，在1/5人补体稀释液(最终体积为100uL)的存在下，将IgM的3倍连续稀释物添加到50,000Wil-2S细胞中，并将混合物于37℃孵育2h。将阿尔玛蓝(Alamar Blue(Aldrich))50uL添加到板中，并将它们在37℃再孵育5h。将板冷却至RT，持续10min。使用于530nM激发并且于590nM发射的96孔荧光仪读取荧光，荧光的降低指示CDC介导的细胞裂解。用共通N连接醣基化模体中的突变评估四个位点(N171Q、N332Q、N395Q、N563Q)(图13G)。
尽管这些突变可改善可制造性或全身性PK，但它们并不影响CDC。另外地，显示降低小鼠IgM的CDC的S406N突变(例如，参见，Wright等人J Biol Chem,265(18),10506-10513,(1990))并不影响人IgM。重要的是，P434G突变体完全消除了CDC活性，使得IgM六聚体可用作眼部治疗剂
IgM与PEG-六聚体活性的比较。
表征IgM用于眼部施用的适用性之后，我们接下来转而探究它们激活相关信号传导途径的能力。表达以Tie2为靶标的IgM六聚体，并分析它们驱动Tie2下游的磷-AKT信号传导的能力。用递增剂量的以内皮细胞为靶标的Tie2.1-hIgM六聚体、Tie2.1 PEG六聚体(Tie2.1 Fab，终止于缀合至PEG-六聚体的SPPC)或未靶向的抗CD20 hIgM六聚体将大鼠主动脉内皮细胞处理15分钟，裂解，并使用均相时间解析荧光评估细胞内磷-AKT水平。仅在使用Tie2.1-hIgM和Tie2.1 PEG六聚体时见到了细胞磷-AKT水平的增加(图13H)。在不存在交联的情况下，使用相对应的IgG时没有见到活性(数据未显示)。有趣的是，尽管Tie2.1hIgM六聚体和Tie2.1PEG六聚体在皮摩尔浓度下有活性，但pAKT的产生于高浓度下受到部分抑制。据推测，六聚体于细胞表面上的超饱和降低Tie2的集簇程度，并因此降低下游信号传导。不过，在100nM IgM(大约100ug/ml)，达到大约30％的最大活性。这些数据表明，Tie2.1六聚体似乎在至少3个数量级的蛋白质浓度范围内驱动Tie2信号传导。
实例8–用于鉴定及比较Tie2激动剂抗体的代用六聚体形式的研发
在试图增加备选抗体筛查方法的通量及相关性的尝试中，检索并鉴定均六聚性蛋白质，其可通过在基因上将Fab重链的C末端融合至六聚体的抑制亚基的N末端而用作抗Tie2 Fab与六聚体多臂PEG的缀合的替代物(参见，图14A)。据此推断，此融合蛋白将会促进用于体外分析的Fab六聚体的生产而无需将纯化的Fab的化学缀合。此外，此融合蛋白将会用作PEG-Fab六聚体的体外替代物，进行潜在新的抗Tie2激动剂抗体备选物的体外活性评估。
真核生物核苷二磷酸激酶(NDK)酵素具有均六聚性四级结构(Lascu等人，2000,JBioenerg Biomembr,32:227-236)，且具有暴露的N-端(Moréra等人，1994,J Mol Biol,243:873-890)。此外，已经报道了无半胱氨酸的高度热稳定NDK序列(Akanuma等人，2013,Proc Natl Acad Sci USA,110:11067-11072)。据此推断，源自该酵素家族的氨基酸序列与测试Fab的C末端的基因性融合可能使得能够进行Fab六聚体的表达及纯化，该六聚体具有与PEG-Fab六聚体类似的几何学但更适于常规表现及纯化方法，从而促进例如在HUVECpAKT测定法中对多种备选抗体进行基于细胞的活性分析。
Fab-NDK融合蛋白的设计及生成。
因此，生成了一组Fab-NDK融合蛋白，其中，编码Tie2.1或阴性对照抗体(gD.5B6)的Fab的重链C末端在基因上融合至5种不同备选NDK序列中之一。NDK序列选自文献(表10)，如下文所述修饰，并且经由基因合成构造编码与NDK序列融合的Fab重链的表达载体。重链表达载体与轻链表达载体的比率为2:1、1:1和1:2，并且分别由栏标题H2L1、H1L1和H1L2指示。表10提供融合蛋白产量。
表10
Figure BDA0003856685280001261
*SEQ ID NO仅用于NDK肽序列
在每个情况下，Fab HC包括且终止于氨基酸KTHT(氨基酸222-225，根据EU编号)，并且由4个甘氨酸残基组成的短接头序列被***Fab重链NDK序列之间以提供另外的柔软。还通过去除N末端甲硫氨酸残基并且通过组氨酸118到苯丙氨酸的突变而编辑NDK序列，该突变为文献中报道的用以令催化活性失活的突变(Postel与Ferrone,1994,J Biol Chem,269:8627-8630)。Fab轻链编码于独立表达载体上而无需另外修饰。
使用Fab-NDK重链及轻链表达载体对Expi293细胞进行共转染，并且使用亲和力层析树脂Capto L树脂(GE Healthcare)纯化产物，该树脂为设计用于含有κ轻链的抗体片段的纯化。选择Fab-NDK3和Fab-NDK5融合蛋白通过尺寸排阻色谱法进行另外的纯化，并且通过分析性尺寸排阻色谱法(SEC)使用基于磷酸盐的运行缓冲液(200mM KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0)和TSK3000柱(Tosoh Biosciences)确认所得样品的纯度。
通过多角度光散射(MALS)测定格式化为Fab-NDK3或Fab-NDK5的Tie2.1的流体动力学半径，结果汇总于下表11中。明显可见，与针对Tie2.1 PEG-Fab六聚体而独立测定者相比，形式化为Fab-NDK3或Fab-NDK5的Tie2.1的流体动力学半径为有利。
表11
Figure BDA0003856685280001271
Tie2.1 Fab-NDK构造体的功能评估
然后，使用实例3中描述的方法，在HUVEC pAKT测定中评估Fab-NDK3和Fab-NDK5形式的Tie2激活。于HUVEC pAKT测定中，以Fab-NDK3和Fab-NDK5形式评估Tie2.1及阴性对照抗体的Tie2激活。结果提供在图14B中。
Fab-NDK3和Fab-NDK5形式的Tie2.1显示了与PEG-Fab六聚体形式的Tie2.1相似的响应特征。当以Fab-NDK3形式评估时，阴性对照抗体显示与其他阴性对照抗体例如缓冲液及阴性对照PEG-Fab六聚体相似的响应特征，但当以Fab-NDK5形式评估时，阴性对照在一些浓度下造成pAKT信号传导。因此，吾等决定使用Fab-NDK3形式进行新抗Tie2抗体的二级筛查，并且更通常也作为PEG-Fab六聚体的体外替代物。
在HUVEC pAKT测定中针对Tie2促效作用筛查蛋白质六聚体。
在HUVEC细胞中，筛查代用六聚体Fab-NDK3形式的抗Tie2抗体的pAKT信号传导活性。除了2个例外，抗体在8个浓度下评估，这些浓度由从30μg/ml的最高浓度开始的三倍稀释组成，并且覆盖超过三个数量级。2个例外是由于样品可用性，并且由TEK-1053(其仅在较低浓度下评估)和ch18E7(其不能以Fab-NDK3形式生成)。如图14A所表明，Tie2.1 Fab-PEG六聚体的活性与Tie2.1 Fab-NDK分子非常类似，证实NDK六聚体缀合物作为六聚PEG缀合物替代物是有效的。据此，NDK六聚体形式可用于评估作为多聚体的抗Tie2多种抗体Fab的激动剂活性(例如，参见，图14A及图14B)。
实例9–抗Tie2抗体在Tie2细胞水平上的效应
如本文中详细描述的，抗Tie2激动剂抗体的治疗性用途部分地依赖于抗体与Tie2受体蛋白的结合。据此，进行试验以确定将抗Tie2施用至细胞样品或动物是否在Tie2蛋白水平上具有任何效应。评估包含如上文所述者生成中抗Tie2抗体的组合物，并使用HUVEC比较它们在体外诱导细胞Tie2含量降低的能力。
抗Tie2抗体在Tie2水平上的效应的体外分析。
将HUVEC(Millipore，目录号SCCE001)以1x106每孔于Endogro培养基中接种在6孔板中。添加抗Tie2抗体至最终浓度为10ug/ml，并且在37℃孵育16至18小时。然后用冰冷的PBS将细胞洗涤三次，在冰上于以蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂混合液(ThermoScientific，目录号1861281)补充的100ul RIPA缓冲液(Sigma，目录号20-188)中裂解。将细胞裂解液以14,000rpm在4℃离心10min，然后进行抗Tie2蛋白质印迹(WB)分析。使用小鼠抗Tie2一级抗体(BD，目录号557039)及二级检测抗体(HRP抗小鼠Ig，GE Healthcare，目录号NA931V)执行标准WB分析。结果显示在图16A至16C中。如图16A中可见，通过动物免疫作用生成的抗Tie2抗体(大鼠抗体TEK-1A5、TEK-166、TEK-535、TEK-1248、TEK-69、TEK233-V2，以及兔抗体ch1B7.C90Q、CH6H6.3)显著降低了Tie2水平，如当以六聚体形式评估时通过WB检测的。相比之下，抗Tie2结合剂Tie2.12、Tie2.24、Tie2.1.M100cF和Tie2.1-PEG-六聚体造成Tie2蛋白水平的降低要小得多(图16A至16C)。
抗Tie2抗体在Tie2水平上的效应的体内分析。
为了于体外测定中评估抗Tie2抗体在Tie2水平上的效应，向8至9周龄C57BL/6小鼠(Charles River)经由IP注射以20mg/kg施用Tie2激动剂。在抗Tie2抗体施用之后的不同时间点，将小鼠CO2实施安乐死。解剖出小鼠肺组织，并且在速冻后于-80℃储存。将约20mg的小鼠肺组织于含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合液(Thermo Scientific，目录号1861281)的1ml冰冷RIPA缓冲液(Sigma，目录号20-188)中均质化。通过离心澄清之后，施用抗Tie2(BD，目录号557039)与作为二级检测抗体的HRP抗小鼠IgG Ab(GE Healthcare，目录号NA931V)一起对组织裂解液进行WB分析。施用化学发光(EC)试剂(Thermo Scientific，目录号32132)将WB膜开发。如图17中所示，Fab2.1 PEG六聚体抗体在降低Tie2蛋白水平上的效应比通过抗Tie2 Fab-IgG 1.38发挥的效应小得多。
实例10–抗Tie2抗体的保护效应
抗Tie2激动剂在内皮完整性上的效应
激活Tie2的保护性效应是假定降低内皮细胞屏障的破坏。施用HUVEC渗透性测定法来测量当前公开的抗Tie2促效抗体Tie2.1的内皮细胞(EC)渗漏。测定方法示出在图18A中。
HUVEC细胞(Millipore，目录号SCCE001)为以0.1x106每孔接种在24跨孔(trans-well)板(Millipore，目录号：ECM644)中，该接种于完全Endogro培养基(Millipore，目录号SCME002)中进行。三天后，将培养基改变为基础Endogro培养基，之后孵育16小时。然后，添加10ug/ml中促效Tie2抗体。孵育30min或16至18小时后，将50ul的5mg/ml FITC-聚葡糖(Sigma，目录号FD40)添加到每个嵌入物中。在不同时间点，从每个孔的接收盘取50ul的培养基，并通过酶标仪测量(激发滤光片：485nm，发射滤光片535nm)。
图18B中的结果显示，Tie2.1 PEG六聚体在保护HUVEC细胞免于饥饿诱导的渗漏中是有效的。使用重组Ang1(其为一种促效性Tie2配体)作为阳性对照。
使用Tie2激动剂的全身性施用进行的体内血管通透性测定。
向五至八周龄Balb/c小鼠(Charles River)经腹膜内(IP)或静脉内(IV)注射给药Tie2激动剂。18小时之后，经由IV注射给予1％的伊文思蓝(Sigma，目录号206334)。十分钟后，将小鼠于异氟烷下麻醉，将VEGF(内部制备)注射到小鼠耳部。注射VEGF后三十分钟，通过CO2将动物安乐死并切下小鼠耳朵。用甲酰胺(Sigma，目录号47670-1L-F)提取已经外渗至耳部组织内的伊文思蓝，并于620nm进行分光光度计定量。测定方法示出在图19A中。如图19B中所示，Tie2.1-PEG-六聚体降低了伊文思蓝到耳部组织内的渗漏。
使用Tie2激动剂的局部施用进行的体内血管通透性测定。
向五至八周龄Balb/c小鼠(Charles River)经由IV注射给药1％的伊文思蓝(Sigma，目录号206334)。十分钟后，将小鼠在异氟烷下麻醉，将抗VEGF G6.31或Tie2激动剂六聚体PEG Fab2.1与VEGF(内部制备)经皮下注射到小鼠耳朵内。三十分钟后，通过CO2将小鼠安乐死并切下小鼠耳朵。用甲酰胺(Sigma，目录号47670-1L-F)提取已经外渗至耳部组织内的伊文思蓝，并于620nm进行分光光度计定量。测定方案示出在图20A中。图20B显示，Tie2.1-PEG-六聚体能够降低VEGF诱导的血管通透性。
使用Tie2激动剂的全身性施用进行的体内血管通透性测定。
向五至八周龄Balb/c小鼠(Charles River)经由腹膜内给药抗Tie2 Fab-IgG1.38。7天后，收获肺组织，并通过蛋白质印迹法分析Tie2蛋白水平(图21A)。
向五至八周龄Balb/c小鼠(Charles River)经由腹膜内给药抗Tie2 Fab-IgG1.38。4小时至24小时之后，经由IV注射给予1％的伊文思蓝(Sigma，目录号206334)。十分钟后，将小鼠于异氟烷下麻醉，将VEGF(内部制备)或LPS(igma，目录号L3012)注射到小鼠耳部。注射VEGF或LPS三十分钟后，通过CO2将动物安乐死并切下小鼠耳朵。用甲酰胺(Sigma，目录号47670-1L-F)提取已经外渗至耳部组织内的伊文思蓝，并于620nm进行分光光度计定量。图21B显示，抗Tie2.1.38IgG抗体降低VEGF诱导的血管通透性。
抗Tie2激动剂在VE-钙黏蛋白和F-肌动蛋白上的效应。
将HUVEC细胞(Millipore，目录号SCCE001)以0.2x106每孔于Endogro培养基中接种在4孔腔室载玻片中。三天后，将培养基改变为基础Endogro培养基。孵育3小时后，添加10ug/ml Tie2促效抗体。在抗体处理之后，将细胞用冰冷PBS洗涤3次并且用3％聚甲醛(PFA)(Electron Microscopy Sciences，目录号15710-S)在室温下(RT)固定20分钟。经固定的细胞用冰冷PBS洗涤3次，并且用0.1％Triton-PBS于RT透化10min。用阻断缓冲液(10％正常驴血清+PBS+0.1％Triton-X100)于RT阻断1小时后，将细胞用小鼠抗人VE-钙黏蛋白(BD，目录号555661)以1:250的稀释度于4℃孵育过夜。使用Alexa FluorTM 633蝇虎蕈碱(Invitrogen，目录号A22284)进行F-肌动蛋白染色。载玻片用PBS-T于RT洗涤5次，然后用1:500稀释的Alexa Fluor 549驴抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，目录号715-505-150)于黑暗中在RT孵育2小时。在室温下，将载玻片PBS-T洗涤4次，之后用PBS洗涤2次。然后，将载玻片用1:10000稀释的5mg/ml DAPI(Sigma，目录号D9542-1MG)于RT染色10min，用Prolong Gold不变色试剂(Invitrogen，目录号P36930)封固。使用Leica共焦显微镜获得荧光图像。图22显示，暴露于抗Tie2 Tie2.1-PEG-六聚体或Tie1.1.38导致从动态细胞-细胞接合到线性细胞-细胞接合的改变(上图)，以及降低的F肌动蛋白应力纤维及增加的皮层肌动蛋白(下图)。
实例11–治疗性Tie2结合分子的设计
稳定性，例如，化学稳定剂及氧化稳定的，对于可行治疗剂是重要的。当设计可能具有最优制造、储存及体内半衰期的治疗剂时，应理解独特生物制剂的稳定性特征。
化学稳定性。
为了评估蛋白质可发育性及体内稳定性两者的化学稳定性，将Tie2.1Fab(HC具有SEQ ID NO:90，LC具有SEQ ID NO:25)经缓冲液交换到低离子强度缓冲液中并浓缩至1mg/ml，经缓冲液交换到pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并浓缩至1mg/ml，或经缓冲液交换到具有聚山梨醇酯的高离子强度赖氨酸缓冲液中并浓缩至150mg/ml(参见，例如，Xu等人MolPharm,2018,15:4529-4537)。将样品于40℃(组氨酸缓冲液)或37℃(PBS)孵育2周，通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析，并且用成像毛细管等电聚焦(iCIEF)对主峰的消失及另外峰的出现成像。还通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及/LysC消化热应力材料，并通过LC-MS/MS分析含有CDR残基的肽，以证明天冬酰胺去酰胺化和/或天冬胺酸异构化。
在这些条件下，在组氨酸缓冲液中的1mg/ml Tie2.1 Fab显示，通过SEC主峰无损失并且通过iCIEF测得1.3％的主峰损失。于150mg/ml，其分别显示0.3％和3.0％的损失。于PBS应力下，主峰损失0.1％和9.6％。CDR中的所有可检测的天冬酰胺及天冬胺酸皆显示，于测试条件下，修饰的水平改变少于0.2％。
Tie2.1的氧化稳定性
为了评估蛋白质可发育性及体内稳定性两者的氧化稳定性，将Tie2.1Fab(与上文相同)经缓冲液交换到低离子强度组氨酸缓冲液中并使用2,2’-偶氮-双-(2-胺基丙烷)二盐酸盐(AAPH)施加应力(例如，参见，Xu等人，2018,Mol Pharm,15:4529-4537)。也通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及/LysC消化应力材料，并通过LC-MS/MS分析含有CDR残基的肽，以证明蛋氨酸和/或色氨酸氧化。
在这种条件下，Tie2.1 Fab显示W98和W100a的氧化增加39.3％，并且M100c的氧化增加3.1％。
具有改善的氧化稳定性的变体的设计
表达并纯化hIgG1形式的Tie2.1 W98和W100a的多种变体。将抗Tie-2变体与山羊抗人IgG Fc交联，并将该混合物一式两份添加到大鼠主动脉内皮细胞中，最终浓度分别为20ug/ml和7ug/ml。如上文所述(实例3)评估磷-AKT水平的改变，并绘制为磷-AKT信号的平均改变
图23显示，Tie2.1 hIgG1的色氨酸98和100a变体对于驱动Tie-2下游的磷-AKT信号传导的影响。在这一组25个所测试的突变中，于W98处的突变无一维持活性。在单个点处，位于W100a处的突变似乎维持活性。具体而言，至少变体Tie2.1.W100aL、Tie2.1.W100aK、Tie2.1.W100aM、Tie2.1.W1001F、Tie2.1.W100aY、Tie2.1.W100aR、Tie2.1.W100aN、Tie2.1.W100aN、Tie2.1.W100aQ、Tie2.1.W100aH维持激活磷-AKT信号传导的能力(作为Tie2激动剂)。
如所述(实例6)，将两种W100a变体(W100aL和W100aK)表达为具有C末端SPPC序列的Fab并且缀合至六臂6kDa PEG核心。如所述(实例3)，将多种浓度的PEG-六聚体与原代人视网膜微血管内皮细胞(ACBRI 181，Cell Systems Inc.,Kirkland,WA)一起孵育，并评估磷-AKT水平的改变。W100aL和W100aK两者都在较低浓度下显示轻微降低的活性(图24)
实例12–抗Tie2抗体缀合物的体内研究
使用食蟹猴进行非临床研究以评估受试者耐受抗Tie2抗体缀合物施用的能力并且确定是否发生任何副作用。将具有6kDa PEG-六聚体核心的Tie 2.1Fab-SPPC(HC具有SEQID NO:89并且LC具有SEQ ID NO:25)经由每2周50ul玻璃体内(ITV)注射(2mg剂量)施用至2只雄性食蟹猴的双眼内，总计施用3个剂量。剂量由委员会认证的兽医眼科医师施用。为了模拟临床给药，于颞下象限中向眼睛给药。对动物观察5周，并且耐受性评估为基于综合性临床眼科评估(裂隙灯生物显微镜检查、间接检眼镜及眼压测量)、眼睛的临床及解剖病理学。
该5周ITV重复给药研究显示，施用具有6kDa PEG-马来酰亚胺六聚体核心的Tie2.1Fab-SPPC在猴体内耐受性良好。短暂的眼部发炎峰值于第3天出现，第8天降低，并随着重复给药而减少。在眼部组织病理学评估中注意到的微小至轻微的单核发炎细胞与对于人源化蛋白质的免疫原性反应一致。
实例13–抗Tie2抗体缀合物的体内研究
在另一临床前研究中，在以2mg/眼进行单次双侧玻璃体内(ITV)注射之后，在雄性食蟹猴中研究抗Tie2.1 PEG-六聚体的眼部PK。执行该研究以测量Tie2.1 PEG-六聚体于玻璃体液、眼房液及血清中的水平。另外地，对玻璃体样品评估Tie2.1 Fab分子的体内氧化以及该氧化在该分子的离体活性上的效应。动物护理是根据《动物福利法》、《实验动物护理和使用指南》以及科文斯实验室动物福祉办公室(Office of Laboratory Animal Welfareof Covance)的规定进行。
抗gD Fab六聚体-SPPC用作对照组，并且也以相同剂量水平(2mg/眼)测试。为了分离动物的组，通过IV以4mg/动物给药Tie2.1 PEG六聚体。将体重2至4kg的大约2至4岁的天然雄性食蟹猴分配至多个剂量组。对于ITV剂量组，将测试品及对照品经由单次ITV注射施用至每只眼睛，并且对其进行长达21天的观察。由兽医眼科医师于大约7点钟位置对右眼执行眼部剂量施用，并且于大约5点钟位置对左眼执行眼部剂量施用。注射体积限制为50μL/眼。ITV给药之后，在第1天(给药后4小时)、第2天(仅测试品组)、第7天、第14天及第21天将动物安乐死(每个时间点每个组2只动物)，以收集眼部样品(玻璃体液及眼房液)进行PK估计。还在0.25小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天，从全部存活动物收集血液样品并收集在血清分离管中，以进行PK估计。在IV组的情况下，剂量为经由隐静脉施用，于0.083小时、0.25小时、0.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、2天、第3天、第4天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天收集非末端血液样品(但并非眼部样品)进行PK估计。收集之后，将血液样品静置60min，并旋转沉降以将血清慢慢倒入2D条形码管中。
全部血清样品都在-70℃储存，直到使用人IgG ELISA进行药物浓度测定为止。将
Figure BDA0003856685280001341
MaxiSorpTM 384孔板(Nalge Nunc International,Rochester,NY)用稀释于包被缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.6)中的0.5μg/mL绵羊抗人IgG抗体(BindingSite,San Diego,CA,USA)包被，并且在4℃下孵育过夜。该板用洗涤缓冲液(0.5％Tween-20于PBS缓冲液中，pH 7.4)洗涤3次，并且用阻断缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppm Proclin，pH7.4)在RT下处理1至2小时。该板用洗涤缓冲液洗涤3次，然后将稀释于样品缓冲剂(PBS/0.5％BSA/0.05％Tween 20/5mM EDTA/0.25％CHAPS/0.35M NaCl/15ppm Proclin，pH 7.4)中的样品添加到孔中，并且在RT下孵育2小时。该板用洗涤缓冲液洗涤6次之后，将检测抗体山羊抗人IgG(H+L)-辣根过氧化物酶(HRP)(Bethyl Laboratories,Inc.,Montgomery,TX,USA)在测定缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppm Proclin/0.05％Tween 20，pH7.4)中稀释至100ng/mL并添加到孔中。将板在振荡器上在RT孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤6次，使用TMB过氧化物酶受质显影(Moss Inc.,Pasadena,Maryland)20分钟，之后添加1M磷酸以终止反应。相对于620nm的参考波长，在450nm测量吸光度。样品浓度为从标准曲线的4参数拟合中推断而得。可报告的测定范围为0.16ng/mL至5ng/mL(食蟹猴血清的LLOQ为2ng/mL，而眼房液及玻璃体液的LLOQ则为16ng/mL)。
还在第-7天、第7天、第14天及第21天从所有组收集血清样品进行抗药物抗体(ADA)估计。通过下述测定ADA：将1ug/mL在包被缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.6)中的抗Tie2六聚体或抗gD六聚体以直接包被到
Figure BDA0003856685280001351
MaxiSorpTM 384孔板(NalgeNunc International,Rochester,NY)上，并且在4℃下孵育过夜。该板用洗涤缓冲液(0.5％Tween-20于PBS缓冲液中，pH 7.4)洗涤3次，并且用阻断缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppmProclin，pH 7.4)在RT下处理1至2小时。该板再次用洗涤缓冲液洗涤3次，然后将稀释在样品缓冲剂(PBS/0.5％BSA/0.05％Tween 20/5mM EDTA/0.25％CHAPS/0.35M NaCl/15ppmProclin，pH 7.4)中的样品添加到孔中，并且在RT下孵育2小时。该板用洗涤缓冲液洗涤6次之后，将检测抗体山羊抗人IgG(Fcγ)-辣根过氧化物酶(HRP)(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)在测定缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppm Proclin/0.05％Tween 20，pH7.4)中稀释至80ng/mL并添加到孔中。将板在振荡器上在RT孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤6次，使用TMB过氧化物酶受质显影(Moss Inc.,Pasadena,Maryland)20分钟，之后添加1M磷酸以终止反应。相对于620nm的参考波长，在450nm测量吸光度。基于天然个体动物的分布，统计性地导出切断点。结果报告每个样品的效价，其为样品OD跨越切断点OD处的稀释度的对数。该测定的最小稀释度为1:100。<2.0的对数效价意味着其低于最小稀释度下的切断点，因此，该动物为阴性。
除了上文述及的组之外，该研究中还测试了眼部联合组，其中，抗gD Fab六聚体与Tie2.1 PEG-六聚体通过ITV注射一起给药(间隔10min；Tie2.1 PEG-六聚体，之后为抗gDFab六聚体)。该组的目标为评估预给药测试品对于对照组的眼部PK的潜在影响。两种化合物都以与单一药剂组中相同的剂量水平(即，2mg/眼)给药，并且这些组中的剂量体积为限制为100μL/眼(包括两种化合物)。
使用抗Tie2 ELISA测定抗Tie2 Fab六聚体浓度的水平。将
Figure BDA0003856685280001352
MaxiSorpTM384孔板(Nalge Nunc International,Rochester,NY)用稀释在包被缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)中的1.0μg/mL重组人Tie2抗体(Abcam,Cambridge,MA)包被，并且在4℃下孵育过夜。该板用洗涤缓冲液(0.5％Tween-20于PBS缓冲液中，pH 7.4)洗涤3次，并且用阻断缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppm Proclin，pH 7.4)在RT下处理1至2小时。该板再次用洗涤缓冲液洗涤3次，然后将稀释在样品缓冲剂(PBS/0.5％BSA/0.05％Tween 20/5mMEDTA/0.25％CHAPS/0.35M NaCl/15ppm Proclin，pH 7.4)中的样品添加到孔中，并且在RT下孵育2小时。该板用洗涤缓冲液洗涤6次，然后将检测抗体山羊抗人IgG(H+L)-辣根过氧化物酶(HRP)(Bethyl Laboratories,Inc.,Montgomery,TX,USA)在测定缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppm Proclin/0.05％Tween 20，pH7.4)中稀释至100ng/mL并添加到孔中，并且在RT在振荡器上孵育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤6次，使用TMB过氧化物酶受质显影(MossInc.,Pasadena,Maryland)20分钟，之后添加1M磷酸以终止反应。相对于620nm的参考波长，在450nm测量吸光度。样品浓度为从标准曲线的4参数拟合中推断而得。可报告的测定范围为0.31ng/mL至10ng/mL(食蟹猴血清的LLOQ为6ng/mL，而眼房液及玻璃体液的LLOQ则为31ng/mL)。
使用抗gD ELISA测定抗gD Fab六聚体浓度的水平。将
Figure BDA0003856685280001361
MaxiSorpTM 384孔板(Nalge Nunc International,Rochester,NY)用稀释于包被缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)中的1.0μg/mL gD(内部制备，Req 361937)包被，并且在4℃下孵育过夜。该板用洗涤缓冲液(0.5％Tween-20于PBS缓冲液中，pH 7.4)洗涤3次，并且用阻断缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppm Proclin，pH 7.4)在RT下处理1至2小时。该板再次用洗涤缓冲液洗涤3次，然后将稀释在样品缓冲剂(PBS/0.5％BSA/0.05％Tween 20/5mM EDTA/0.25％CHAPS/0.35M NaCl/15ppm Proclin，pH 7.4)中的样品添加到孔中，并且在RT下孵育2小时。该板用洗涤缓冲液洗涤6次之后，将检测抗体山羊抗人IgG(H+L)-辣根过氧化物酶(HRP)(Bethyl Laboratories,Inc.,Montgomery,TX,USA)在测定缓冲液(PBS/0.5％BSA/15ppmProclin/0.05％Tween 20，pH7.4)中稀释至100ng/mL并添加到孔中。将板在振荡器上在RT孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤6次，使用TMB过氧化物酶受质显影(Moss Inc.,Pasadena,Maryland)20分钟，之后添加1M磷酸以终止反应。相对于620nm的参考波长，在450nm测量吸光度。样品浓度为从标准曲线的4参数拟合中推断而得。可报告的测定范围为0.31ng/mL至10ng/mL(食蟹猴血清的LLOQ为6ng/mL，而眼房液及玻璃体液的LLOQ则为31ng/mL)。
使用非隔室分析方法(在Phoenix WinNonlin版本6.4上，Pharsight Corp,Mountain View,CA)并采用标称时间及剂量执行跨多种基质的浓度-时间数据的PK分析。在眼部隔室中，Tie2.1 PEG-六聚体及抗gD Fab六聚体两者都显示相当的PK特征。两种化合物在玻璃体液中的半衰期为大约5天，而在眼房液中为大约4天(表12)。这与Shatz等人(2016,Mol Pharm,13:2996-3003)和Crowell等人(2019,Transl Vis Sci Technol 8(6):1)提出的基于尺寸的眼部动力学一致，在这些文献中，作者已经在兔体内证明，生物制剂在ITV注射后的眼部PK主要受分子尺寸即Rh的影响(Shatz等人，2016，见上文)。
图25提供抗Tie2.1 Fab六聚体及抗gD Fab六聚体在单次玻璃体内或静脉内给药至雄性食蟹猴之后的药代动力学曲线。
下表12详述抗Tie2.1 Fab六聚体及抗gD Fab六聚体在单次玻璃体内或静脉内给药至雄性食蟹猴之后的药代动力学参数。
表12
Figure BDA0003856685280001371
IV-静脉内；ITV–玻璃体内；NA-不可用。
Cmax、AUC和CL描述为值±SE(如果可能)
第1组施用抗gD Fab六聚体(40mg/mL)。
第2组施用抗Tie 2.1Fab六聚体(40mg/mL)
第3组施用抗Tie2.1 Fab六聚体(4mg/mL)
有趣的是，跨包括具有4至5天的半衰期的血清在内的全部基质，抗gD六聚体Fab的PK是相当的。与此相比，抗Tie2.1 Fab六聚体在眼部及血清隔室中具有截然不同的PK特征，即，与眼部PK(半衰期为4至5天)，全身性PK(血清半衰期为大约2.3天)相对较快。不受缚于理论，该研究的观察结果(抗Tie2.1 Fab六聚体在ITV给药后的较快的全身性PK)可归因于药物-靶标相互作用导致对PK的影响，该相互作用一般是指为靶标介导的药物沉积(TMDD)。除了眼部隔室之外，靶标(Tie2)也在血管组织中表达。由于血管组织的丰富性，与眼部组织相比，TMDD的影响可能在血清隔室中而不是在眼部隔室中更为明显。对血清样品的ADA分析显示，关于测试品及对照品两者都观察到了最小ADA，并且ADA对于血清PK没有明显影响。未收集ADA样品以评估对眼部动力学的影响。该研究中未探究ADA对于眼部基质中的PK的影响。Tie2.1 PEG-六聚体在IV推注给药后在血清中的PK也相对更快，如通过大约0.3天的半衰期所指示。在IV和IVT施用后的血清半衰期的这一差异已经明确地证明了Tie2.1 PEG-六聚体在ITV给药后在血清中的误换动力学(flip-flop kinetics)的出现。Tie2.1 PEG六聚体在ITV给药后的绝对生物可用度为29％。该研究中ITV剂量组的结果表明，对于新颖形式，在ITV后的血清PK可能不总是充分代表眼部PK。因此，除了血清PK之外，尤其是对于新颖形式及动作机制，就选择用作眼部治疗剂的分子而言，探究眼部PK至关重要。
来自联合组的两种化合物(抗gD Fab六聚体+Tie2.1 PEG-六聚体共同给药)的跨多种基质的PK与其各自单一药剂治疗组相当(数据未显示)。在任何基质中，共同给药对于每个化合物的PK都没有显著的影响。
对来自体内研究的样品中的体内Tie2.1 PEG-六聚体去缀合产物进行定量去缀合 产物的下限定量。
使用毛细管电泳激光诱导型荧光(CE-LIF)，对在将Tie2.1 PEG-六聚体经玻璃体内施用至食蟹猴后生成的Tie2.1 PEG-六聚体去缀合产物进行定量。为了评估Tie2.1 PEG-六聚体及其降解物的定量下限，作成了Tie2.1PEG-六聚体、Tie2.1 PEG-五聚体及未缀合的Tie2.1 Fab单体标准品，以1:1:1质量比率混合，并且以500μg/mL至10μg/mL范围内的不同浓度掺入到PBS缓冲液或VH基质中。使用先前报道的方案并做微小修饰而制备样品(Salas-Solano等人，2006,Anal Chem,78:6583-6594)。简言之，首先以1:1的体积比率将样品与pH6.7的Na3PO4混合。然后将4％十二烷基硫酸钠(SDS)与150mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)一起添加到样品混合物中，并在70℃下孵育5分钟。冷却至室温后，添加3-(2-呋喃甲酰基)喹啉酮-2-甲醛(FQ)染料(ThermoFisher Scientific)，然后添加***。然后将样品混合物在50℃下孵育10min。冷却至室温后，将样品上样到PA 800plus毛细管电泳仪(Sciex)上。使用先前描述的CE-LIF方法(Michels等人，2007,Anal Chem,79:5963-5971)并对样品注射时间做微小修饰，以最大化对于体内样品的灵敏度。对于LIF检测，激发波长为488nm并且检测波长为600nm。
如图26中所示，在缓冲剂掺入实验中，在来自全部掺入浓度的重叠电泳图上，六聚体、五聚体及单体完全分离。
使用经积分的峰面积计算每个物质的丰度百分比。具有以1:1:1质量比率以不同浓度掺入到缓冲液中的完整Tie2.1 PEG-六聚体、Tie2.1 PEG-五聚体和Tie2.1 Fab单体的相对百分比呈现在下表13中(其他微量物质未显示)。
表13
每个物质的掺入浓度(ug/ml) 单体％：五聚体％：六聚体％
500 30:33:34
250 31:32:34
100 31:32:34
50 31:32:34
10 31:32:34
这些数据表明，低至10μg/mL为止，六聚体、五聚体及单体Fab始终可以定量(在比率接近1:1:1的这一情况下)。因为基质蛋白干扰，单体峰未计入VH掺入实验的相对定量中，如图27中所示。然而，在重叠的电泳图上，六聚体峰与五聚体峰完全分离并且显示可忽略不计的基质干扰，这要感谢它们的大尺寸及较晚的迁移时间。
当使用经积分的峰面积计算两种物质的相对丰度时，完整六聚体与五聚体的比率始终接近1:1，如下表14中所示。
表14
每个物质的掺入浓度(ug/ml) 五聚体％：六聚体％
500 46:50
250 46:49
100 46:49
50 47:49
10 48:50
抗Tie2六聚体及其降解物在食蟹猴药代动力学样品中的相对定量。
在来自上文所述的食蟹猴研究的样品中测量Tie2.1 PEG-六聚体及其降解物。在几个时间点，包括第1、3、8、15和22天，从食蟹猴的玻璃体液(VH)组织收集PK样品。所收集的样品以与上述相同的方式处理。来自在不同时间点收集的PK样品的重叠的CE-LIF e电泳图显示在图28中，其重叠了来自不同时间点的Tie2.1-PEG-六聚体PK样品。
使用经积分的峰面积将完整六聚体峰及降解物五聚体峰定量，并显示在下表15中(将其他微量物质定量但数据未显示)。
表15
PK采样时间点 五聚体％ 六聚体％
起始材料 10％ 80％
第1天 17％ 71％
第5天 27％ 57％
第8天 31％ 50％
第15天 33％ 50％
第22天 32％ 49％
将抗Tie2六聚体及五聚体相对丰度对不同时间点作图，显示在图29中。这些结果表明，起始材料中存在一些五聚体，并且体内发生去缀合，这进一步增加了五聚体的相对丰度，但相对丰度在第8天左右开始稳定。
从食蟹猴样品获得的Tie2.1-PEG六聚体的分析性表征。
分析来自食蟹猴的样品以评估Tie2.1缀合物的氧化。如下所述，测定对Tie2.1缀合物的以氨基酸残基水平存在的氧化的检测及定量。将40uL含有Tie2.1缀合物的生物基质(例如，玻璃体液)与80uL的变性溶液(8M尿素、25mM 1,4-二硫苏糖醇、100mM碳酸氢铵，全部溶于水中)。将混合物在25℃下孵育30分钟。然后，将10uL的500mM碘乙酰胺添加到混合物中，并将混合物在黑暗中在25℃下孵育30分钟。然后，将10uL Asp-N(Promega)以0.1mg/mL浓度(在水中)添加到混合物中。另外地，将180uL的水添加到混合物中。然后将混合物在37℃下孵育1小时。将10uL胰蛋白酶/Lys-C(Promega)以0.2mg/mL浓度(在水中)添加到混合物中。将混合物在37℃下孵育3小时。将35uL的混合物进样到与Thermo Orbitrap Elite MS偶合的Waters Nanoacquity LC中。然后，使用Thermo Fisher Scientific BioPharmaFinder软件分析所收集的原始数据。使用该软件，通过高分辨率质量数据与CID断裂数据的组合来鉴定氨基酸水平上的修饰(例如，氧化)。具体而言，通过观察+16Da的质量偏移(或整数倍数)鉴定氧化。使用串联MS(CID断裂模式)通过肽测序测定具***置。数据显示，体内氧化的具***置为位在图30A的M100c处(本文中也公开为位于SEQ ID NO:22的107位的M)。对来自食蟹猴的样品的该分析中未观察到色氨酸残基的氧化。
此外，通过观察在CID断裂后的特征性-64Da质量偏移而证实甲硫氨酸氧化。通过将与经氧化物质相关的离子强度除以天然(未氧化物质)离子强度，经由MS测定定量。定量数据示出了在图30B中，显示了在2只不同食蟹猴的眼睛中存在令人惊奇的高程度的M100c氧化。由于未在体外观察到该程度的M100c氧化(参见，实例11)，这些数据出乎意料。
M100c氧化在体外在Tie2.1的活性上的效应。
为了证实Tie2.1 M100c的氧化可造成这一抗Tie2分子功能的降低，令Tie2.1经历氧化条件以生成这些在M100c处经氧化的分子。将抗Tie2Fab及六聚体的制剂经缓冲液交换到pH 5.5的20mM组氨酸醋酸酯中。两种样品都稀释至1mg蛋白质/ml。将30％(w/v)过氧化氢稀释在水中以提供5％(w/v)原液。将过氧化氢原液添加到每个样品中，以给出0.06％(w/v)的最终H2O2浓度。向每个样品的单独等量小样掺入相等体积的缓冲液以用作对照。所有样品都经保护免于光照，并且在5℃孵育15小时。经由添加T 20倍摩尔过量的L-甲硫氨酸将氧化反应淬灭，之后使用PD-10柱脱盐。使用上述LC-MS方法测得六聚体的氧化程度为约65％。通过先前描述的pAKT测定法，评估多种浓度的经氧化的六聚体、经缓冲液处理(未氧化)的六聚体及多种对照。如图31中所示，发现氧化将经氧化的材料的活性降低了大约50％。
从食蟹猴玻璃体液分离的六聚体的特异性活性。
为了理解体内氧化对于六聚体功能的影响，通过将食蟹猴玻璃体样品与给药至食蟹猴玻璃体分离物中的给药方案的标准曲线比较，测定活性Tie2.1 PEG-六聚体的量。将这些数字与通过ELISA发现的浓度(上述)比较。图32显示了通过ELISA测定的Tie2.1 PEG-六聚体的量以及通过pAKT测定法测定的该分子的总活性。图33显示了从食蟹猴玻璃体样品分离的Tie2.1 PEG-六聚体的具体活性。经标准化的活性(活性浓度/总浓度)显示，21天内食蟹猴玻璃体中具体活性的逐渐损失，导致在最终时间点时保留47％活性。
实例14–稳定Tie2.1 M100c变体的选择
使用基因合成生成了编码Tie2.1的19种变体的IgG1重链表达载体，其中，VH残基M100c被替换为19种可选天然氨基酸的每一个。通过使用编码所需的重链及轻链序列的表达载体对Expi293细胞进行短暂的共转染而将Tie2.1变体以IgG形式表现达，并且通过亲和力层析术纯化抗体蛋白质。
使用表面等离子体共振重组(SPR)，在Biacore T200仪器(GE Life Sciences)上评估人及食蟹猴Tie2与Tie2.1 hIgG1变体的结合。使用S系列CM5芯片(GE LifeSciences)、人抗体捕获试剂盒(GE Life Sciences)及胺偶联试剂盒(GE Life Sciences)生成人抗体捕获芯片。使用20秒的接触时间和10μl/min的流速，非共价地捕获在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％Tween 20、1mM EDTA，pH 7.4)中稀释至5μg/ml的抗体。在37℃，使用单周期动力学方法分析与300nM和1500nM重组Tie2的结合，所使用的接触时间为60秒，解离时间为120秒，并且流速为50μl/min。在周期之间，通过以30μl/min的流速进行30秒的3M MgCl2注射而将表面再生。从报告点表(Report Point Table)(Biacore评估软件v3.0，GE Life Sciences)获得抗体捕获水平及分析物结合水平的值。通过下述分析结果：将抗体捕获水平的传感器图标准化，然后比较所观察的Tie2结合信号的幅度。结果显示为经标准化的结合信号，通过将分析物结合反应(以任意反应单位测量)除以抗体捕获水平(以任意反应单位测量)而计算。显示来自2个实验的结果，提供Tie2.1和Tie2.1变体与重组Tie2 ECD结合的SPR分析结果。表16：实验A；表17：实验B。
表16
Figure BDA0003856685280001431
表17
Figure BDA0003856685280001432
Figure BDA0003856685280001441
Tie2.1.M100cF的设计。
通过SPR对VH.M100c变体进行的初始筛查指示，几个不同的氨基酸可替换残基VH.M100c，同时保持与Tie2结合(参见上文)。人种系抗体序列常常在对应于源自噬菌体的抗体Tie2.1中VH.M100c的位置处含有甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)(www.IMGT.org，Giudicelli等人，2005,Nucleic Acids Res,33:D256-D261)。我们因此推断，变体Tie2.1.M100cF可能比其他变体更不可能引起抗药物免疫反应，并且对该变体进行了更深入的分析性。
Tie2.1.M100cF的高分辨率亲和力评估。
为了证实M100cF突变导致具有类似或改善的对于人及食蟹猴Tie2的亲和力的抗体，重复上述的SPR实验并进行旨在改善结果的分辨率的大量修饰。将Tie2.1和Tie2.1变体hIgG1抗体稀释到0.5μg/ml，并各自以15秒、30秒和45秒的接触时间进行非共价捕获，生成三种针对每个所测试抗体的不同表面密度。使用高效多周期动力学形式分析与重组人及食蟹猴Tie2的结合，所使用的接触时间为60秒，解离时间为60秒，流速为100μl/min，并且Tie2浓度为5μM、2.5μM、1.25μM、625nM、313nM和156nM。浓度为5μM、2.5μM和1.25μM的Tie2注射两次。使用Biacore T200评估软件v3.0(GE Life Sciences)分析结果。使用具有多个Rmax的1:1结合模型并将RI设定为零，将来自所有三种表面密度的结果一起分析。获得与Tie2.1和Tie2.1.M100cF两者结合的人Tie2的具有高置信度的动力学常数(对于Rmax1、Rmax2、Rmax3、ka和kd，T值>100)(表18)。
表18
Figure BDA0003856685280001451
对相同数据集的稳态分析导致与那些经由动力学分析获得的相似的KD值(表18)。对于结合至重组食蟹猴Tie2，观察到相似的Ka、Kd和KD值(表19)。
表19
Figure BDA0003856685280001452
Figure BDA0003856685280001461
实例15–变体抗Tie2 PEG缀合物的分析
尽管本文所提供的公开证明，包含与多臂部分缀合并且可激活Tie2活性的抗Tie2.1抗体的组合物具有有益的活性及治疗价值例如在治疗眼疾中，但所需鉴定具有最优特性包括稳定性的缀合物。出于这一原因，设计不同的Tie2.1 PEG六聚体缀合物并测试，以评估不同缀合位点的效应。在该实例中，将6kDa PEG-六聚体马来酰亚胺与工程化Tie2.1Fab(ThioFab)缀合，以在Fab蛋白质内的关键位置处含有半胱氨酸。
通过替换重链或轻链的位于所指示位置处的氨基酸残基而引入半胱氨酸，例如，HC T120C意为Tie2.1M100cF的HC工程化使得位于位置120处的Thr被改变为Cys。“SPPC”指示一种ThioFab分子，其中，重链C1结构域的C末端工程化以将Tie2.1M100cF的位置226-229(EU)处的残基CPPC改变为SPPC。
将变体Tie2.1M100cF ThioFab分子与商业上可获得的具有图39所示核心结构的马来酰亚胺官能化的六臂PEG(JenKem Technology，产品号6ARM(DP)-MAL-6000)缀合。
制备变体Tie2.1M100cF缀合物，并将其以1mg/ml浓度在37℃下储存4周。如实例13中所述测量去缀合。每个缀合物在21天内的去缀合百分比。结果提供在表34中。
使用如实例3中所述的HUVEC pAKT测定法测量这些缀合物中每一个种的活性，并将结果显示在图35A及图35B中。
实例16–变体抗Tie2 PEG缀合物的体内稳定性
为了研究上文所述的变体抗Tie2 PEG缀合物的体内稳定性，选择3种缀合物，将其在单剂量研究中施用至食蟹猴。该3种缀合物为Tie2.1M100cF Fab-SPPC、Tie2.1M100cF,LCT206C和Tie2.1M100cF,HC T209C。具体而言，以2mg/眼进行双侧注射而施用。总计18只动物包括在3个组中：第1组：施用Tie2.1M100cF Fab-SPPC的6只动物；第2组：施用Tie2.1M100cF,LC T206C的6只动物；第3组：施用Tie2.1M100cF,HC T209C的6只动物。评估除了包括缀合物稳定性分析之外，还包括眼部及血清PK、血清ADA及血压(在第1组的2只动物中)。
在血清、玻璃体液及眼房液样品中的PK特征提供在图36中，并且PK参数报告在表20中。
尽管在眼房液中针对Tie2.1M100cF HC-T209C Fab-PEG六聚体观察到微小差异例如轻微较低的Cmax，但所有3种测试缀合物之间的总体眼部PK(在玻璃体液及眼房液中)在很大程度上是相当的。与在猕猴玻璃体液中报告的典型Fab t1/2(～2-3天，基于来自Genentech进行的ITV研究的食蟹猴中Fab的历史数据(Crowell等人(2019,Transl Vis SciTechnol8(6):1))相比，所有3种缀合物都显示相对更长的在眼部隔室中的滞留时间(t1/2在3.20至3.76天的范围)并且具有相对较高的t1/2，指示六聚体缀合物在眼部隔室中的基于尺寸的PK。
ThioFab缀合物(Tie2.1M100cF LC-T206C Fab-PEG六聚体和Tie2.1M100cF HC-T209C Fab-PEG六聚体)的血清PK优于SPPC缀合物(Tie2.1M100cF SPPC Fab-PEG六聚体)。由于缀合方法差异所致的体内稳定性差异可能会是缀合物之间这一***性PK差异的驱动因子。看起来，对于所有3种测试缀合物，翻转动力学可能在ITV给药后发生在血清中(基于PK)，并且示出了药物从玻璃体液中释放可能是速率限制步骤，而该步骤可能驱动血清隔室中的PK。
表20
Figure BDA0003856685280001471
Figure BDA0003856685280001481
Cmax和AUC描述为值±SE。第1组：抗-Tie2.1_M100cF_SPPC_Fab-PEG六聚体
第2组：抗-Tie2.1_M100cF_LCT206C_Fab-PEG六聚体
第3组：抗-Tie2.1_M100cF_HCT209C_Fab-PEG六聚体
*：CL为针对玻璃体液，CL/F为针对眼房液及血清
a：Cmax用于计算t1/2。
使用取自动物的玻璃体液样品评估ThioFab缀合物的稳定性，其中，在第0、7和21天测量样品中完整缀合物的百分比。结果呈现在图37中。
也在第0、7和21天测量样品中缀合物的活性。通过在如实例3中描述的pAkt FRET测定法中测试玻璃体液而测量pAkt活性。通过使用pAkt FRET测定法中的标准曲线，将活性六聚体定量。如图38A和39A中所示，在21天内，所有缀合物在玻璃体液中都保留拟体内活性。
序列表
Figure BDA0003856685280001482
/>
Figure BDA0003856685280001491
/>
Figure BDA0003856685280001501
/>
Figure BDA0003856685280001511
/>
Figure BDA0003856685280001521
/>
Figure BDA0003856685280001531
/>
Figure BDA0003856685280001541
/>
Figure BDA0003856685280001551
/>
Figure BDA0003856685280001561
/>
Figure BDA0003856685280001571
/>
Figure BDA0003856685280001581
/>
Figure BDA0003856685280001591
尽管为了清楚理解起见，通过说明和实例的方式对上述发明进行了详细描述，但是所述发明和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均以引用的方式明确纳入其全部内容。
序列表
<110> 基因泰克公司
<120> TIE2 结合剂及其使用方法
<130> P35891-WO
<150> 62/993930
<151> 2020-03-24
<150> 63/046318
<151> 2020-06-30
<160> 92
<170> PatentIn 3.5 版
<210> 1
<211> 689
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Phe Thr Met Thr Arg Ala Met Glu Glu Ala Leu Phe Gln His Phe
1 5 10 15
Met His Gln Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Ala Ile His Lys Pro Phe Pro
20 25 30
Phe Phe Glu Gly Leu Leu Asp Asn Ser Ile Ile Thr Lys Arg Met Tyr
35 40 45
Met Glu Ser Leu Glu Ala Cys Arg Asn Leu Ile Pro Val Ser Arg Val
50 55 60
Val His Asn Ile Leu Thr Gln Leu Glu Arg Thr Phe Asn Leu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Val Thr Leu Phe Ser Gln Ile Asn Leu Arg Glu Tyr Pro Asn Leu
85 90 95
Val Thr Ile Tyr Arg Ser Phe Lys Arg Val Gly Ala Ser Tyr Glu Trp
100 105 110
Gln Ser Arg Asp Thr Pro Ile Leu Leu Glu Ala Pro Thr Gly Leu Ala
115 120 125
Glu Gly Ser Ser Leu His Thr Pro Leu Ala Leu Pro Pro Pro Gln Pro
130 135 140
Pro Gln Pro Ser Cys Ser Pro Cys Ala Pro Arg Val Ser Glu Pro Gly
145 150 155 160
Thr Ser Ser Gln Gln Ser Asp Glu Ile Leu Ser Glu Ser Pro Ser Pro
165 170 175
Ser Asp Pro Val Leu Pro Leu Pro Ala Leu Ile Gln Glu Gly Arg Ser
180 185 190
Thr Ser Val Thr Asn Asp Lys Leu Thr Ser Lys Met Asn Ala Glu Glu
195 200 205
Asp Ser Glu Glu Met Pro Ser Leu Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Ala
210 215 220
Ser Asp Asn Leu Ile Pro Gln Ile Arg Asp Lys Glu Asp Pro Gln Glu
225 230 235 240
Met Pro His Ser Pro Leu Gly Ser Met Pro Glu Ile Arg Asp Asn Ser
245 250 255
Pro Glu Pro Asn Asp Pro Glu Glu Pro Gln Glu Val Ser Ser Thr Pro
260 265 270
Ser Asp Lys Lys Gly Lys Lys Arg Lys Arg Cys Ile Trp Ser Thr Pro
275 280 285
Lys Arg Arg His Lys Lys Lys Ser Leu Pro Gly Gly Thr Ala Ser Ser
290 295 300
Arg His Gly Ile Gln Lys Lys Leu Lys Arg Val Asp Gln Val Pro Gln
305 310 315 320
Lys Lys Asp Asp Ser Thr Cys Asn Ser Thr Val Glu Thr Arg Ala Gln
325 330 335
Lys Ala Arg Thr Glu Cys Ala Arg Lys Ser Arg Ser Glu Glu Ile Ile
340 345 350
Asp Gly Thr Ser Glu Met Asn Glu Gly Lys Arg Ser Gln Lys Thr Pro
355 360 365
Ser Thr Pro Arg Arg Val Thr Gln Gly Ala Ala Ser Pro Gly His Gly
370 375 380
Ile Gln Glu Lys Leu Gln Val Val Asp Lys Val Thr Gln Arg Lys Asp
385 390 395 400
Asp Ser Thr Trp Asn Ser Glu Val Met Met Arg Val Gln Lys Ala Arg
405 410 415
Thr Lys Cys Ala Arg Lys Ser Arg Leu Lys Glu Lys Lys Lys Glu Lys
420 425 430
Asp Ile Cys Ser Ser Ser Lys Arg Arg Phe Gln Lys Asn Ile His Arg
435 440 445
Arg Gly Lys Pro Lys Ser Asp Thr Val Asp Phe His Cys Ser Lys Leu
450 455 460
Pro Val Thr Cys Gly Glu Ala Lys Gly Ile Leu Tyr Lys Lys Lys Met
465 470 475 480
Lys His Gly Ser Ser Val Lys Cys Ile Arg Asn Glu Asp Gly Thr Trp
485 490 495
Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Val Glu Gly Lys Gly Arg Asn Ala Lys
500 505 510
Asn Trp Lys Arg Asn Ile Arg Cys Glu Gly Met Thr Leu Gly Glu Leu
515 520 525
Leu Lys Arg Lys Asn Ser Asp Glu Cys Glu Val Cys Cys Gln Gly Gly
530 535 540
Gln Leu Leu Cys Cys Gly Thr Cys Pro Arg Val Phe His Glu Asp Cys
545 550 555 560
His Ile Pro Pro Val Glu Ala Lys Arg Met Leu Trp Ser Cys Thr Phe
565 570 575
Cys Arg Met Lys Arg Ser Ser Gly Ser Gln Gln Cys His His Val Ser
580 585 590
Lys Thr Leu Glu Arg Gln Met Gln Pro Gln Asp Gln Leu Ile Arg Asp
595 600 605
Tyr Gly Glu Pro Phe Gln Glu Ala Met Trp Leu Asp Leu Val Lys Glu
610 615 620
Arg Leu Ile Thr Glu Met Tyr Thr Val Ala Trp Phe Val Arg Asp Met
625 630 635 640
Arg Leu Met Phe Arg Asn His Lys Thr Phe Tyr Lys Ala Ser Asp Phe
645 650 655
Gly Gln Val Gly Leu Asp Leu Glu Ala Glu Phe Glu Lys Asp Leu Lys
660 665 670
Asp Val Leu Gly Phe His Glu Ala Asn Asp Gly Gly Phe Trp Thr Leu
675 680 685
Pro
<210> 2
<211> 1124
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 2
Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu
20 25 30
Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly
35 40 45
Trp His Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu
50 55 60
Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg
65 70 75 80
Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile
85 90 95
Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg
100 105 110
Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr
115 120 125
Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys
130 135 140
Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser
145 150 155 160
Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val
165 170 175
His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg
180 185 190
Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val
195 200 205
Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn Arg Leu Cys
210 215 220
Thr Val Cys Val Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys
225 230 235 240
Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu
245 250 255
Arg His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Asp
260 265 270
Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser
275 280 285
Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His His
290 295 300
Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Ser Asn Gly
305 310 315 320
Glu Thr Cys Asp Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Arg Gln
325 330 335
Gly Leu Gln Cys Glu Arg Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile
340 345 350
Val Asp Leu Pro Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro
355 360 365
Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr
370 375 380
Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His
385 390 395 400
Thr Asp His Phe Ser Val Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro
405 410 415
Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Ala Asn Thr Val Ala Gly Met
420 425 430
Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu
435 440 445
Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn
450 455 460
Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Arg His Ile Gln
485 490 495
Val Thr Asn Glu Ile Val Thr Leu Asn His Leu Glu Pro Arg Thr Glu
500 505 510
Tyr Glu Leu Cys Val Gln Leu Val Arg Arg Gly Glu Gly Gly Glu Gly
515 520 525
His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro
530 535 540
Pro Pro Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn
545 550 555 560
Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val
565 570 575
Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys
580 585 590
Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg
595 600 605
Glu Gln Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu
610 615 620
Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro
625 630 635 640
Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val
645 650 655
Ile Ser Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile
660 665 670
Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Ile Asp Val Lys
675 680 685
Ile Lys Asn Ala Thr Ile Thr Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro
690 695 700
Glu Thr Ala Tyr Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser
705 710 715 720
Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Glu
725 730 735
Ala Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu Ile Ala Ile Leu
740 745 750
Gly Ser Ala Gly Met Thr Cys Leu Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile
755 760 765
Ile Leu Gln Leu Lys Arg Ala Asn Val Gln Arg Arg Met Ala Gln Ala
770 775 780
Phe Gln Asn Val Arg Glu Glu Pro Ala Val Gln Phe Asn Ser Gly Thr
785 790 795 800
Leu Ala Leu Asn Arg Lys Val Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr Ile Tyr
805 810 815
Pro Val Leu Asp Trp Asn Asp Ile Lys Phe Gln Asp Val Ile Gly Glu
820 825 830
Gly Asn Phe Gly Gln Val Leu Lys Ala Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu
835 840 845
Arg Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp
850 855 860
Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly
865 870 875 880
His His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly
885 890 895
Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp
900 905 910
Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile
915 920 925
Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu His Phe
930 935 940
Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe
945 950 955 960
Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr
965 970 975
Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr
980 985 990
Val Lys Lys Thr Met Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Ile Glu
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Ser Leu Asn Tyr Ser Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser
1010 1015 1020
Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro
1025 1030 1035
Tyr Cys Gly Met Thr Cys Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gln
1040 1045 1050
Gly Tyr Arg Leu Glu Lys Pro Leu Asn Cys Asp Asp Glu Val Phe
1055 1060 1065
Asp Leu Met Arg Gln Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu Arg Pro
1070 1075 1080
Ser Phe Ala Gln Ile Leu Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu Glu
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Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr
1100 1105 1110
Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala
1115 1120
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Asn Thr Asp Ile Ser
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 为 Met、Leu、Lys、Phe、Tyr、Arg、Asn、Gln、His 或 Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa 为 Phe、Tyr、Leu、Gln、Ile、Lys 或 His
<400> 5
Arg Thr Arg Trp Ala Ser Xaa Ala Xaa Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
1 5
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(105)
<223> Xaa 可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> Xaa 可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Xaa Ala Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 24
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Ser Tyr Trp Ile His
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Ala Ile Ser Pro Asn Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Ser Arg Tyr Tyr Gly Gln Arg Leu Val Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 31
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Pro Asn Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Tyr Gly Gln Arg Leu Val Tyr Tyr Val Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Pro Asn Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Tyr Gly Gln Arg Leu Val Tyr Tyr Val Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Lys Ser Cys Asp
225
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Ser Ser Gly Ile Ser
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Thr Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Phe Tyr Arg Phe Leu Ser Ser Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Arg Phe Leu Ser Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Arg Phe Leu Ser Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gly Ser Trp Ile Ser
1 5
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Arg Ile Asn Pro Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Asn Asn Arg Phe Pro Thr Trp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asn Pro Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asn Asn Arg Phe Pro Thr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asn Pro Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Asn Arg Phe Pro Thr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Val Ile Tyr Pro Asp Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Glu Phe Ala Cys Ala Arg Cys Val Tyr Gly
1 5 10
<210> 46
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Pro Asp Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
85 90 95
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Phe Ala Cys Ala
100 105 110
Arg Cys Val Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
165 170 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
195 200 205
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235
<210> 47
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Pro Asp Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
85 90 95
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Phe Ala Cys Ala
100 105 110
Arg Cys Val Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Asn Ser Ala Ile His
1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Ser Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Arg Gln Ser Tyr Ser Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gln Ser Tyr Ser Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gln Ser Tyr Ser Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 53
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 54
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln Leu Val
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser Ala Ile His Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Pro
275 280 285
Tyr Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gln Ser
325 330 335
Tyr Ser Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
340 345 350
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
355 360 365
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
370 375 380
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
385 390 395 400
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
405 410 415
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
420 425 430
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
435 440 445
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
465 470 475 480
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val
485 490 495
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
500 505 510
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
515 520 525
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
530 535 540
Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
545 550 555 560
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
565 570 575
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
580 585 590
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
595 600 605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
610 615 620
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
625 630 635 640
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
645 650 655
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala
660 665 670
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 55
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 56
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Cys Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 57
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys
225 230
<210> 58
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 59
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Cys Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 60
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Cys Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 61
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Cys Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Cys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 63
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Cys Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Cys Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 65
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Cys Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 66
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Cys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Cys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 68
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 69
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Glu Arg Thr Phe Val Met Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Lys Gly Leu Lys Ile Val
20 25 30
Ala Met Lys Met Met Arg Ile Ser Arg Glu Met Ala Glu Lys His Tyr
35 40 45
Ala Glu His Arg Glu Lys Pro Phe Phe Ser Ala Leu Val Asp Tyr Ile
50 55 60
Thr Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Leu Glu Gly Lys Asn Ala Val
65 70 75 80
Glu Val Val Arg Lys Met Val Gly Ala Thr Asn Pro Lys Glu Ala Ala
85 90 95
Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Gly Leu Asp Val Gly Lys Asn Val
100 105 110
Ile Phe Ala Ser Asp Ser Pro Glu Ser Ala Glu Arg Glu Ile Ser Leu
115 120 125
Phe Phe Lys Asp Glu Glu Leu Val Glu Trp
130 135
<210> 70
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Glu Arg Thr Phe Val Met Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Lys Gly Phe Lys Ile Val
20 25 30
Ala Met Lys Leu Met Arg Ile Ser Gln Glu Leu Ala Glu Lys His Tyr
35 40 45
Ala Glu His Arg Glu Lys Pro Phe Phe Ser Gly Leu Val Asp Phe Ile
50 55 60
Thr Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Leu Glu Gly Lys Asn Val Val
65 70 75 80
Glu Val Val Arg Lys Met Ile Gly Ala Thr Asn Pro Lys Glu Ala Ala
85 90 95
Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Gly Met Ser Val Gly Lys Asn Val
100 105 110
Ile Phe Gly Ser Asp Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Glu Ile Ser Leu
115 120 125
Phe Phe Lys Asp Glu Glu Leu Val Glu Trp
130 135
<210> 71
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Ser Thr Asn Lys Val Asn Lys Glu Arg Thr Phe Leu Ala Val Lys Pro
1 5 10 15
Asp Gly Val Ala Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Ala Arg Tyr Glu
20 25 30
Lys Lys Gly Phe Val Leu Val Gly Leu Lys Gln Leu Val Pro Thr Lys
35 40 45
Asp Leu Ala Glu Ser His Tyr Ala Glu His Lys Glu Arg Pro Phe Phe
50 55 60
Gly Gly Leu Val Ser Phe Ile Thr Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val
65 70 75 80
Phe Glu Gly Lys Gly Val Val Ala Ser Ala Arg Leu Met Ile Gly Val
85 90 95
Thr Asn Pro Leu Ala Ser Ala Pro Gly Ser Ile Arg Gly Asp Phe Gly
100 105 110
Val Asp Val Gly Arg Asn Ile Ile Phe Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser
115 120 125
Ala Asn Arg Glu Ile Ala Leu Trp Phe Lys Pro Glu Glu Leu Leu Thr
130 135 140
Glu Val Lys Pro Asn Pro Asn Leu Tyr Glu
145 150
<210> 72
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Ala Asn Ser Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln
1 5 10 15
Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe
20 25 30
Arg Leu Val Gly Leu Lys Phe Leu Gln Ala Ser Glu Asp Leu Leu Lys
35 40 45
Glu His Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Thr Gly Leu Val
50 55 60
Lys Tyr Met His Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala
85 90 95
Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly
100 105 110
Arg Asn Ile Ile Phe Gly Ser Asp Ser Val Lys Ser Ala Glu Lys Glu
115 120 125
Ile Ser Leu Trp Phe Gln Pro Glu Glu Leu Val Glu Tyr Lys Ser Cys
130 135 140
Ala Gln Asn Trp Ile Tyr Glu
145 150
<210> 73
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Ala Asn Leu Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln
1 5 10 15
Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe
20 25 30
Arg Leu Val Ala Met Lys Phe Leu Arg Ala Ser Glu Glu His Leu Lys
35 40 45
Gln His Tyr Ile Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Pro Gly Leu Val
50 55 60
Lys Tyr Met Asn Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala
85 90 95
Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly
100 105 110
Arg Asn Ile Ile Phe Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys Glu
115 120 125
Ile His Leu Trp Phe Lys Pro Glu Glu Leu Ile Asp Tyr Lys Ser Cys
130 135 140
Ala His Asp Trp Val Tyr Glu
145 150
<210> 74
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asn Lys Val Asn Lys Glu
225 230 235 240
Arg Thr Phe Leu Ala Val Lys Pro Asp Gly Val Ala Arg Gly Leu Val
245 250 255
Gly Glu Ile Ile Ala Arg Tyr Glu Lys Lys Gly Phe Val Leu Val Gly
260 265 270
Leu Lys Gln Leu Val Pro Thr Lys Asp Leu Ala Glu Ser His Tyr Ala
275 280 285
Glu His Lys Glu Arg Pro Phe Phe Gly Gly Leu Val Ser Phe Ile Thr
290 295 300
Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Phe Glu Gly Lys Gly Val Val Ala
305 310 315 320
Ser Ala Arg Leu Met Ile Gly Val Thr Asn Pro Leu Ala Ser Ala Pro
325 330 335
Gly Ser Ile Arg Gly Asp Phe Gly Val Asp Val Gly Arg Asn Ile Ile
340 345 350
Phe Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Asn Arg Glu Ile Ala Leu Trp
355 360 365
Phe Lys Pro Glu Glu Leu Leu Thr Glu Val Lys Pro Asn Pro Asn Leu
370 375 380
Tyr Glu
385
<210> 75
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Cys Asp Lys Thr His Leu
1 5
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Cys Asp Lys Thr His
1 5
<210> 78
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Cys Asp Lys Thr
1
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 可以为除 Thr 外的任何氨基酸
<400> 79
Cys Asp Lys Thr His Xaa
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser
1 5 10
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Gly Gly Cys
1 5 10
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Cys Tyr Gly Pro Pro Cys
1 5
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Ser Pro Pro Ser
1
<210> 89
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys
225 230
<210> 90
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 91
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(105)
<223> Xaa 为 Met、Leu、 Lys、Phe、Tyr、Arg、Asn、Gln、His 或 Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> Xaa 为 Phe、Tyr、Leu、Gln、Ile、Lys 或 His
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Xaa Ala Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 92
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(105)
<223> Xaa 为 Met、Leu、Lys、Phe、Tyr、Arg、Asn、Gln、His 或 Trp
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<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> Xaa 为 Phe、Tyr、Leu、Gln、Ile、Lys 或 His
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220

Claims (48)

1.一种与Tie2特异性结合的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含：
重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含(a)CDR-H1，其包含氨基酸序列NTDIS(SEQ ID NO:3)，(b)CDR-H2，其包含氨基酸序列RISPSDGNTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)，和(c)CDR-H3，其包含氨基酸序列RTRWASX1AX2DY(SEQ ID NO:5)，其中X1为M、L、K、F、Y、R、N、Q、H或W且/或X2为F、Y、L、Q、I、K或H；及轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包含(d)CDR-L1，其包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)，(e)CDR-L2，其包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:9)，和(f)CDR-L3，其包含氨基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO:10)。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H3包含氨基酸序列RTRWASWAMDY(SEQ ID NO:6)。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H3包含氨基酸序列RTRWASWAFDY(SEQ ID NO:7)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段和/或嵌合抗体。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为结合Tie2的Fab片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及VH结构域，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：VL结构域，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；以及VH结构域，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQID NO:21的VL序列和SEQ ID NO:20的VH序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含工程化半胱氨酸，其中
所述工程化半胱氨酸选自HC中的T120C、G166C、G178C、T187C和T209C；或
所述工程化半胱氨酸选自LC中的Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C和K149C；
其中所述工程化半胱氨酸的残基号是根据EU编号。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述工程化半胱氨酸选自所述HC中的T209C及所述LC中的T206C。
11.根据权利要求9或10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述工程化半胱氨酸为所述LC中的T206C。
12.根据权利要求9或10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述工程化半胱氨酸为所述HC中的T209C。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQID NO:55的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：LC，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；和HC，其包含与SEQID NO:55的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：LC，其包含SEQ ID NO:25的序列；和HC，其包含SEQ IDNO:55的序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述HC恒定区终止于221位(EU编号)。
17.一种与Tie-2特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:55的HC序列和SEQ ID NO:25的LC序列。
18.一种与Tie-2特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:23的HC序列和SEQ ID NO:56的LC序列。
19.一种经分离的核酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
20.一种宿主细胞，其包含根据权利要求19所述的核酸。
21.一种与Tie2结合的缀合物，其中所述缀合物包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段中的每一者连接至多聚化部分。
22.根据权利要求21所述的缀合物，其中所述缀合物使得体外测定中的Tie2蛋白水平降低小于25％、小于50％或小于75％。
23.根据权利要求21或22所述的缀合物，其中所述缀合物不使得体外测定中的Tie-2蛋白水平降低超过25％、超过50％或超过75％。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的缀合物，其中所述多聚化部分包含多元醇、多肽和/或肽。
25.根据权利要求21至24中任一项所述所述的缀合物，其中多聚化部分包含多元醇，其中所述多元醇为多臂多元醇，其选自二聚体、四聚体、六聚体和八聚体。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述多臂多元醇为六聚体。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的缀合物，其中所述多元醇为聚乙二醇(PEG)。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的缀合物，其中所述多元醇通过工程化半胱氨酸氨基酸的游离巯基基团共价连接至至少两种抗体或其抗原结合片段，其中所述工程化半胱氨酸选自由以下各项组成的组：
HC中的T120C、G166C、G178C、T187C和T209C；或
所述工程化半胱氨酸选自由以下各项组成的组：LC中的Q124C、R142C、Q155C、L201C、T206C、K107C、K126C和K149C；
其中所述残基号是根据EU编号。
29.根据权利要求28所述的缀合物，其中所述工程化半胱氨酸为所述LC中的T206C，其中所述残基号是根据EU编号。
30.根据权利要求28所述的缀合物，其中所述工程化半胱氨酸为所述HC中的T209C，其中所述残基号是根据EU编号。
31.根据权利要求25至27中任一项所述的缀合物，其中所述多元醇经由赖氨酸氨基酸的游离氨基共价连接至至少一种抗体。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的缀合物，其中所述PEG具有约500道尔顿(Da)至约300,000Da的重均分子量。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的缀合物，其中所述PEG具有通式(Ib)的结构：
Figure FDA0003856685270000041
其中每个m独立地为3至250的整数；每个R1独立地不存在或为连接基团；且每个R2独立地为氢或末端反应性基团；
其中至少一个R2为末端反应性基团且共价连接至根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
34.根据权利要求33的缀合物，其中至少一个R1为连接基团，其中R1和R2在合在一起时选自：
Figure FDA0003856685270000042
Figure FDA0003856685270000043
Figure FDA0003856685270000051
及其组合；其中每个i独立地为0至10的整数；j为0至10的整数；且R2为选自由以下各项组成的组的末端反应性基团：硫醇反应性基团、氨基反应性基团及其组合。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的缀合物，其中至少1个R2为马来酸二胺且共价连接至所述抗体或其抗原结合片段。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的缀合物，其中每个R2为马来酸二胺。
37.一种结合Tie2的缀合物，其包含：
Fab，其包含具有SEQ ID NO:55的HC和具有SEQ ID NO:25的LC；
缀合至具有式1(b)结构的多元醇：
Figure FDA0003856685270000052
其中每个m独立地为20至30的整数，其中R1和R2合在一起具有结构
Figure FDA0003856685270000053
其中R2为马来酸二胺；且
其中所述多元醇在残基C209(EU编号)处连接至Fab HC。
38.一种药物组合物，其包含：根据权利要求21至37中任一项所述的缀合物；和药用载体。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂，其中所述另外的治疗剂选自由以下各项组成的组：VEGF拮抗剂、Ang2拮抗剂、HtrA1拮抗剂、和IL33拮抗剂、补体组分拮抗剂和第二Tie2激动剂。
40.一种用于经眼部递送的长效递送装置，其包含根据权利要求38或39所述的药物组合物及用于将所述组合物经玻璃体内递送至患者的工具，其中所述组合物在原位维持有效达延长的时间段。
41.一种治疗有需要的受试者的Tie2通路介导的疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求21至36中任一项所述的缀合物或根据权利要求37至38中任一项所述的药物组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述Tie2通路介导的疾病为血管通透性疾病。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述Tie2通路介导的疾病为眼部病症。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述眼部病症选自糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病变、包括干性及湿性(非渗出性和渗出性)形式的年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成(CNV)、葡萄膜炎、缺血相关性视网膜病变、病理性近视、希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成、青光眼和视网膜新生血管形成。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述眼部病症为DME。
46.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或根据权利要求21至39中任一项所述的缀合物，其用作药物。
47.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或根据权利要求21至39中任一项所述的缀合物，其用于治疗有需要的受试者的Tie2通路介导的疾病和/或眼部疾病。
48.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或根据权利要求21至39中任一项所述的缀合物在制备用于治疗有需要的受试者的Tie2通路介导的疾病和/或眼部疾病的药物中的用途。
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