TW202043260A - 製備gip/glp1雙重促效劑之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供可用於製造替則帕肽(tirzepatide)或其醫藥上可接受之鹽之新穎中間體及方法。

Description

製備GIP/GLP1雙重促效劑之方法
本發明提供用於製備GIP/GLP1雙重促效劑肽替則帕肽(tirzepatide)或其醫藥上可接受之鹽之製程及中間體。
糖尿病係一種慢性病症，其特徵在於因胰島素分泌、胰島素作用或此二者之缺陷所導致之高血糖症。在2型糖尿病(「T2D」)中，胰島素分泌受損及胰島素抗性之組合效應與血糖含量升高有關。在美國專利9474780 (「780專利」)中闡述且主張GIP/GLP1雙重促效劑替則帕肽。替則帕肽可用於治療T2D。
US9474780總體性地闡述用於製備GIP/GLP1雙重促效劑之肽及方法。
需要使得能夠以醫藥上優良之方式產生具有商業期望純度之替則帕肽之經改良製程及中間體。需要用以在較少純化步驟下有效提供替則帕肽之有效環保性「綠色」製程及穩定中間體。期望替則帕肽製造製程產生最少廢物流以提高環境及操作者之安全性。大規模製備醫藥上美觀之替則帕肽將呈現諸多可影響整體產率及純度之難題。
本發明試圖藉由提供可用於製造替則帕肽(SEQ ID NO:1)或其醫藥上可接受之鹽之新穎中間體及製程來滿足該等需要。
本發明提供具有下式之化合物：
Figure 02_image003
或其醫藥上可接受之鹽。(製劑18；SEQ ID NO:17)
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image005
(製劑11；SEQ ID NO:11)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image007
或其醫藥上可接受之鹽。(製劑22；SEQ ID NO:22)
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image009
或其醫藥上可接受之鹽。(製劑21；SEQ ID NO:21)
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image011
或其醫藥上可接受之鹽。(製劑20；SEQ ID NO:20)
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image013
或其醫藥上可接受之鹽。(製劑17)
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image015
, 或其醫藥上可接受之鹽。(製劑1；SEQ ID NO:2)
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image017
或其醫藥上可接受之鹽。(製劑6)
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image019
(製劑3；SEQ ID NO:4)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image021
(製劑7；SEQ ID NO:7)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image023
(製劑14；SEQ ID NO:14)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image025
(製劑34；SEQ ID NO:33)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image027
(製劑33；SEQ ID NO:32)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image029
(製劑35；SEQ ID NO:34)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image031
(製劑36；SEQ ID NO:35)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image033
(製劑39；SEQ ID NO:36)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image035
(製劑41；SEQ ID NO:38)或其醫藥上可接受之鹽。
提供具有下式之化合物：
Figure 02_image037
(製劑42；SEQ ID NO:39)或其醫藥上可接受之鹽。
提供使用奈米過濾製備替則帕肽之製程。
提供製備替則帕肽之製程，其包括使具有下式之化合物或該化合物之醫藥上可接受之鹽去保護：
Figure 02_image039
(製劑22；SEQ ID NO:22)。
提供選擇性醯化肽中之離胺酸胺基酸之製程，其包括使經結合樹脂之肽-離胺酸-NH2 與第三丁基-二十烷二醯基- Glu-(O-第三丁基)- (8-胺基-3,6-二氧雜辛酸) -(8-胺基-3,6-二氧雜辛酸)-OH (製劑6)進行偶合。
本申請案在35 U.S.C. §119(e)下主張以下美國臨時申請案之權益：2019年1月29日提出申請之第62/797,963號、2019年3月7日提出申請之第62/815,053號及2019年3月14日提出申請之第62/818,342號；其揭示內容以引用方式併入本文中。
如本文中所使用，下列縮寫具有如本文所陳述之含義：「SPPS」意指固相肽合成，「Fmoc」意指茀基甲基氧基羰基氯，「Pip」意指六氫吡啶，「DIC」意指二異丙基碳化二亞胺，「Oxyma」意指氰基羥基亞胺基乙酸乙酯，「DCM」係指二氯甲烷，「IPA」意指異丙醇，「MTBE」意指甲基-第三丁基醚，「TFA」意指三氟乙酸，「TIPS」意指三異丙基矽烷，「DTT」意指二硫蘇糖醇，「UPLC」意指超高效液相層析，「HFIP」意指六氟異丙醇，「CTC」意指氯腈，「HATU」意指六氟磷酸(1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-***并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物，「TFET」意指2,2,2-三氟乙烷硫醇，「DIEA」意指N,N-二異丙基乙基胺，「AEEA」意指17-胺基-10-側氧基-3,6,12,15四氧雜-9-氮雜十七烷酸，「TCEP」意指參(2-羧基乙基)膦，「DCU」意指二環己基脲，「DCC」意指二環己基-碳化二亞胺，「TMSA」意指三甲基烯基醯胺，「HOBt」意指羥基苯并***，「HRMS」意指高解析度質譜，「LPPS」意指液相肽合成，「MSMPR」意指混合產物混合懸浮液反應器，「MPA」意指移動相A，「MPB」意指移動相B，「L-GSH」意指還原型L-麩胱甘肽溶液，「AP」意指活性醫藥，且「API」意指活性醫藥成分。如本文中所呈現，單字母胺基酸縮寫係以粗體形式呈現，而原子係以未加粗文字形式且通常以較小字體形式來呈現以與單字母胺基酸縮寫加以區分。如本文中所使用，在胺基酸縮寫呈現為在胺基酸上方具有數字時，該數字係指最終替則帕肽產物中之相應胺基酸位置。提供數字係出於便利性且該等數字在序列中之出現或不存在並不影響胺基酸序列或該序列中所指示之肽。
熟習此項技術者應瞭解，存在用於構建本文所呈現之肽之替代樹脂。舉例而言，Sieber及Rink醯胺樹脂為熟習此項技術者所熟知且可用於製備本文所揭示之肽；然而，可選擇替代樹脂來製備本文所闡述之肽。舉例而言(但不限於)，可使用2-CTC及相關樹脂來製備靶肽，隨後進行C末端醯胺化步驟。
用於製劑 1 、 2 、 4 、 6 ( 方法 2) 、 16 、 18 及 19 之一般固相肽合成 (SPPS) 程序 ： 使用標準茀基甲基氧基羰基氯(Fmoc)肽化學技術採用順序偶合利用自動化肽合成器來達成固相肽合成(SPPS)構建。使用DMF溶脹樹脂，然後使用20%六氫吡啶(Pip)/DMF (3 × 30 min)去保護。後續Fmoc去保護使用20% Pip /DMF (3 × 30 min)處理且使用4 × 30 min處理進行較難偶合。在去保護之後，使用10體積DMF洗滌劑(5 × 2 min)洗滌樹脂。胺基酸預活化使用二異丙基碳化二亞胺(DIC) /氰基羥基亞胺基乙酸乙酯(Oxyma) DMF溶液且在室溫下進行30 min。對於每一個別胺基酸而言，使活化胺基酸與樹脂結合肽偶合指定時間。在每一偶合之後，使用10體積DMF溶劑洗滌(5 × 2 min)。為分離最終產物，使用10體積二氯甲烷(DCM)洗滌樹脂結合產物(5 × 2 min)以去除DMF。使用10體積異丙醇(IPA)洗滌樹脂(2 × 2 min)以去除DCM，使用10體積甲基-第三丁基醚(MTBE)洗滌(5 × 2 min)，然後在40℃及真空下乾燥產物。將樹脂結合產物冷存(-20℃)。對於分析而言，使用由三氟乙酸(TFA)/H2 O/TIPS (三異丙基矽烷)/DTT (二硫蘇糖醇)以下列比率：(0.93v/0.04v/0.03v/0.03w)組成之酸性混合劑自樹脂裂解肽。使用DCM (4-5 mL, 3 × 30 min)溶脹樹脂並瀝乾。將裂解混合劑(4-5 mL)添加至預溶脹樹脂中且將懸浮液在室溫下攪拌2 hr。過濾溶液，然後使用少量DCM洗滌樹脂並與裂解溶液合併。將所得溶液傾倒至7-10體積冷(0℃)甲基-第三丁基醚(MTBE)中。將懸浮液在0℃下陳化30 min，然後離心所得沈澱物並傾析澄清溶液。將殘餘物懸浮於相同體積之MTBE中，且再次離心所得懸浮液並傾析。在傾析之後，將沈澱肽之澄清MTBE溶液在真空中於40℃下乾燥過夜。
製劑 1 之合成：
Figure 02_image041
製劑 1 (SEQ ID NO:2) 該合成使用0.71 mmol/g載量之Fmoc - Sieber醯胺樹脂。使用具有下列修改之一般SPPS程序：
循環 胺基酸 SPPS條件 用於偶合之溶劑：DMF
1 Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
2 Fmoc-L-Pro-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
3 Fmoc-L-Pro-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
4 Fmoc-L-Pro-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
5 Fmoc-L-Ala-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
6 Fmoc-Gly-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
7 Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
8 Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
9 Fmoc-L-Pro-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
10 Fmoc-Gly-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
製劑1軟裂解： 平行運行10個相同去保護反應，每一反應係以約0.5 mmol規模之樹脂結合製劑1使用下列方案進行：1)向40 ml燒結反應器中添加1.55 g (約0.5 mmol)樹脂結合製劑1。2)使用3 × 15 ml DMF (各15 min)溶脹，3)使用3 × 15 mL (各30 min) 20% Pip/DMF進行處理。4)使用4 × 15 ml DMF洗滌，隨後使用4 × 15 ml DCM洗滌。5)將1.5 ml TFA及28.5 ml二氯甲烷添加至5個40 ml反應小瓶中之每一者中。6)將1/5之樹脂結合製劑1 (2.75 g)添加至每一TFA溶液小瓶中且封蓋小瓶，並在旋轉輪上混合5分鐘。7)過濾混合物並使用100 ml二氯甲烷洗滌以得到總體積為500 mL之濾液。8)合併濾液並轉移至含有1000 mL MTBE之圓底燒瓶中。9)將所得懸浮液濃縮成淺黃色油狀物，使用200 mL MTBE研磨，並在冰浴中冷卻30分鐘。10)過濾固體，使用50 ml冷MTBE洗滌，並在33℃下於真空烘箱中乾燥過夜以產生5.35 g (91%產率)白色固體。使用超高效液相層析(UPLC)分析所分離固體(98.57面積%，含有0.99%之合併t-Bu去保護副產物)。
製劑 2 之合成：
Figure 02_image043
製劑 2 (SEQ ID NO:3) 該合成使用0.61 mmol/g載量之Fmoc-Gly-OH 2-CTC樹脂。使用具有下列修改之一般SPPS程序：
循環 胺基酸 SPPS條件-用於偶合之溶劑：DMF
1 Fmoc-L-Ala-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
2 Fmoc-L-Ile-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
3 Fmoc-L-Leu-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
4 Fmoc-L-Trp(Boc)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
5 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
6 Fmoc-L-Val-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
7 Fmoc-L-Phe-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 8 h, rt.
8 Fmoc-L-Ala-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
9 Fmoc-Lys(Alloc)-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 8 h, rt.
10 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
11 Fmoc-L-Ala-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
12 Fmoc-L-Ile-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
13 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
14 Fmoc-L-Asp(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
製劑 2 軟裂解 ： 向40 mL玻璃閃爍小瓶中添加樹脂結合製劑2  (3.06 g, 1.12 mmol)及30 mL 30%六氟異丙醇(HFIP)/DCM溶液，其中觀察到紅色變化。藉由在環境溫度下於輪上旋轉1 hr來攪動小瓶。過濾掉樹脂並使用3 × 10 mL DCM洗滌。在真空中去除溶劑以形成玻璃狀泡沫(35℃浴，10托，2.34 g)並以小部分IPA (24 mL)代替，且然後在室溫下經25 min逐滴添加水(24 mL)。將所得溶液攪拌30 min.且然後過濾。使用3 × 10 mL H2 O洗滌濾餅且然後在25托及35℃下於真空烘箱中乾燥過夜。此產生白色固體形式之製劑2 (1.81 g)。
製劑 4 之合成：
Figure 02_image045
製劑 4 (SEQ ID NO: 4) 該合成使用0.68 mmol/g載量之Fmoc-Leu-OH 2-CTC樹脂)。使用具有下列修改之一般SPPS程序：
循環 胺基酸 SPPS條件 用於偶合之溶劑：DMF
1 Fmoc-Aib-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 8 h, rt.
2 Fmoc-L-Ile-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 18 h, rt.
3 Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
4 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
5 Fmoc-L-Asp(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
6 Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
7 Fmoc-L-Thr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
8 Fmoc-L-Phe-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
9 Fmoc-L-Thr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
10 Fmoc-Gly-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
11 Fmoc-L-Glu(tBu)-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 6 h, rt.
12 Fmoc-Aib-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 8 h, rt.
13 Boc-L-Tyr(tBu)-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 18 h, rt.
製劑 4 軟裂解 ： 向20 mL玻璃閃爍小瓶中添加樹脂結合製劑4 (2.0 g, 0.62 mmol)及10 mL 30% HFIP DCM溶液，其中觀察到紅色變化。藉由在環境溫度下於輪上旋轉來攪動小瓶，然後過濾掉樹脂，使用3 × 2 mL DCM洗滌，並在真空中去除溶劑以形成玻璃狀黏性泡沫。將泡沫溶於5.2 mL DMSO中。以相等流速(T ~15℃)經45 min向此溶液中添加6 mL水以及1 mL水。在完全添加肽溶液後，立即經45 min再添加6 mL水。在添加後沈澱出白色固體。將所得漿液在15℃下攪拌30 min。過濾固體，使用6 mL水洗滌，且然後轉移至處於35℃及25托下之真空烘箱中。此會產生白色鬆散固體形式之製劑4 (Boc-1-14-OH, 1.0763 g)。
藉由 LPPS 合成製劑 3 ： 向20 mL玻璃閃爍小瓶中添加製劑 2 (SEQ ID NO:3) (500 mg, 0.183 mmol)、製劑 1 (SEQ ID NO:2) (179 mg, 0.175 mmol)及DMSO (10 mL)。向此溶液中添加N ,N -二異丙基乙基胺(DIEA)(46微升，0.265 mmol)，隨後添加六氟磷酸PYBOP (苯并***-1-基氧基)三吡咯啶基鏻) (123 mg, 0.230 mmol)。然後將反應液攪拌2小時，添加二乙胺(DEA) (183微升，1.77 mmol)並將所得溶液攪拌2小時。將反應內容物抽取至注射器中並添加至經攪拌50 mL燒瓶中，同時經1小時逐滴添加水(12 mL)。在完成添加之後，藉由過濾收集沈澱產物且隨後使用水(2 × 4 mL)洗滌。將濕餅在真空及35℃下乾燥18小時以獲得白色固體形式之製劑 3 (SEQ ID NO:5) (0.6003 g, 88%產率，C184 H261 N31 O38 之計算HRMS：預期值3512.9444，實際值3512.9430)。
Figure 02_image047
藉由 LPPS 合成製劑 5 ：
Figure 02_image049
向20 mL玻璃閃爍小瓶中添加製劑 3 (SEQ ID NO:5) (338.8 mg, 0.091 mmol)、製劑 4 (SEQ ID NO:4) (192.1 mg, 0.091 mmol)及DMSO (10 mL)。向此溶液中添加PYBOP (63.5 mg, 0.118 mmol)，隨後添加DIEA (79微升，0.454 mmol)。將反應溶液攪拌2.5小時。將反應內容物抽取至注射器中並將該等內容物添加至經攪拌50 mL燒瓶中，同時經1小時逐滴添加水(12 mL)。在完成添加之後，藉由過濾收集沈澱產物且隨後使用水(2 × 4 mL)洗滌。將濕餅在真空及35℃下乾燥18小時以獲得白色固體形式之製劑 5 (SEQ ID NO:6) (0.3568 g, 70%產率，C293 H435 N45 O64 之計算HRMS：預期值5608.2168，實際值5608.2066)。
藉由方法1 (LPPS)合成製劑6 (3,6,12,15-四氧雜-9,18-二氮雜二十三烷二酸22-[[20-(1,1-二甲基乙氧基)-1,20-二側氧基二十烷基]胺基]-10,19-二側氧基-, 2,3-(1,1-二甲基乙基)酯，(22S))：
Figure 02_image051
製劑 6 將二十烷二酸1(1,1-二甲基乙基)酯(15.0 kg，限制試劑)及N-羥基-琥珀醯亞胺(1.2當量)在27℃下溶於乙酸乙酯中。添加DCC (二環己基-碳化二亞胺) (1.25當量)於乙酸乙酯中之溶液並將反應液在22℃下攪拌24 hr。過濾掉所得DCU(二環己基脲)副產物且然後使用5% NaCl水溶液將有機相萃取三次。在萃取之後，濃縮有機相，使用異丙醇共蒸發，且然後藉由添加庚烷來結晶。在過濾之後，使用庚烷沖洗濾餅並在25℃下乾燥以提供17.0 kg INT1 (87%產率及99%純度)。
將H-Glu-OtBu (7.7 kg, 1.1當量)在20℃下溶於DCM (54 L)中，然後添加三甲基烯基醯胺(TMSA) (11.3 kg.)溶於DCM (7L)中之溶液，然後將反應混合物在40℃下攪拌1 hr。在室溫下添加INT1 (17.0 kg)  DCM溶液並攪拌8 hr。在反應完成之後，藉由蒸餾將DCM交換為乙酸乙酯。使用2% KHSO4 /NaCl水溶液將有機相洗滌三次，然後使用2% NaCl水溶液洗滌4次。在分離且去除水相之後，使用異丙醇濃縮有機相，使用異丙醇稀釋，且然後藉由添加水來結晶。在過濾之後，使用水/異丙醇之混合物洗滌濾餅，且然後在30℃下乾燥以產生17.3 kg INT 2 (86%產率及99%純度)。
將INT 2 (17.3 kg)及N-羥基-琥珀醯亞胺(4.1 kg, 1.2當量)在27℃下溶於乙酸乙酯(336 kg)中。添加DCC (8.33 kg, 1.25當量)於乙酸乙酯中之溶液並將反應液在22℃下攪拌24 hr。過濾掉所得DCU副產物。濃縮有機相，使用異丙醇共蒸發，且然後藉由冷卻異丙醇溶液(約125 L)來結晶。然後，使用冷異丙醇沖洗濾餅並在25℃下乾燥以提供16.3 kg INT 3 (81%產率及96%純度)。
將17-胺基-10-側氧基-3,6,12,15四氧雜-9-氮雜十七烷酸(AEEA2)  (8.1 kg, 26.3 mol 1.10當量)在22℃下懸浮於DCM (54 L)中，添加TMSA (7.68 kg, 59.9 mol)於DCM (6.2 L)中之溶液，且然後將反應混合物在40℃下攪拌一小時。將INT 3 (16 kg)在35℃下懸浮於DCM (31 L)中並在22℃下添加至TMS保護(AEEA2)混合物中。將反應液攪拌12 hr，且在反應完成之後濃縮混合物，然後交換成乙酸乙酯。使用2% KHSO4 /NaCl水溶液(約200 L)將有機相洗滌三次，且然後使用2% NaCl水溶液(約200L)洗滌4次直至目標pH為 4.5。濃縮有機相並交換成乙腈。將乙腈溶液冷卻至-20℃且然後將所得懸浮液在-20℃下陳化15 hr。過濾混合物，使用冷乙腈沖洗濾餅，在＜0℃下乾燥以提供18.4 kg製劑6 (88%產率，96%純度)。總產率 = 53%。
藉由方法2 (SPPS)合成製劑6 或者，可使用固相肽合成且使用肽合成器來製備製劑6。
利用標準偶合程序。
標準偶合條件： 0.133 M，2.0當量HATU，5.0當量DIEA，環境溫度，3小時，使用20%六氫吡啶/DMF去保護3 × 15 min。
樹脂加載： 於2-CTC樹脂上之FmocNH-AEEA (0.99 mmol/g)：在每一平行反應中，1.01 g。
使用DMF溶脹、隨後使用Pip/DMF之自動程式；DMF洗滌；及胺基酸、DIEA、HATU混合物；及DMF洗滌循環，隨後乾燥。
藉由將組合批次在30% HFIP/CH2 Cl2 (240 mL)中攪拌1.5小時來裂解樹脂。過濾樹脂，洗滌且在真空中自濾液去除溶劑。將所得油狀物再溶於乙腈中且再次去除溶劑。此操作提供30.47 g (146%之理論產率)黏性黃色油狀物，其含有52.3面積%之期望產物(藉由UPLC分析)。藉由急速層析(500克矽膠，使用85%二氯甲烷/10%甲醇/5%乙酸洗脫，收集38 × 100 ml部分)純化粗產物。
將先前層析濃縮物(17.94 g)結晶以產生13.4 g (74.7%產率)，UPLC純度為91.65面積%。
實例 1 替則帕肽 (SEQ ID No: 1) 合成實例 1 ： 向第一HPLC小瓶中添加製劑5 (10.5 mg, 0.00187 mmol)及DCM (200微升，20 L/kg)。向此溶液中添加苯基矽烷(0.81 M於二氯甲烷中，22.1微升，0.0178 mmol)及(四(三苯基膦)-鈀(0)) Pd(PPh3 )4 (0.8 M於DCM中，22.1微升，0.00064 mmol)之溶液。將溶液在24℃下攪拌一小時以獲得製劑7 (SEQ ID NO:7)之未分離溶液。向第二HPLC小瓶中添加二氯甲烷(150微升)，隨後添加製劑6 (0.118 M於二氯甲烷中，16微升，0.00189 mmol)、PYBOP (0.186 M於二氯甲烷中，16微升，0.00298 mmol)及DIEA (0.573 M於二氯甲烷中，5當量)。將第二小瓶之內容物添加至第一小瓶中並將反應液攪拌1小時以獲得製劑8 (SEQ ID NO:8)之未分離溶液。在真空下濃縮製劑8之溶液且向所得固體中添加50微升三氟乙酸(4.65 mL)、三異丙基矽烷(20微升)及DTT (二硫蘇糖醇) (20 mg)之溶液。將漿液攪拌18小時並藉由HPLC監測以證實形成實例1 (SEQ ID NO:1) (C225 H348 N48 O68 之計算HRMS：預期值4810.5249，實際值4810.5257)。
Figure 02_image053
製劑 9 之合成
Figure 02_image055
製劑 9 (SEQ ID NO:9) 將Sieber醯胺樹脂(13.42 g, 0.75 mmol/g, 10.1 mmol)懸浮於DMF (130 mL, 10體積)中並保持約20 min，且然後瀝乾。使用DMF (80 mL, 6體積)將所得樹脂洗滌約5 min。藉由使用5 vol%六氫吡啶、1.25 vol% DBU、1.0 wt.% HOBt/DMF溶液(80 mL, 6體積)分別處理Fmoc-胺基酸樹脂兩次(10 min及20 min)來去除Fmoc基團。在瀝乾Fmoc去保護溶液之後，使用DMF (80 mL, 6體積)洗滌兩次，使用MTBE (80 mL, 6體積)洗滌兩次且使用DMF (80 mL, 6體積)再次洗滌兩次。
使用標準Fmoc化學，組裝胺基酸鏈。通常，將1.5當量Fmoc-胺基酸及羥基苯并***(HOBt) (2.47 g, 20%水濕，14.6 mmol, 1.46當量)溶於DMF (60 mL, 4.5體積)中，隨後添加DIEA (1.94 mL, 11.1 mmol, 1.11當量)。使用冰浴將所得溶液冷卻至＜ 5℃並藉由添加TBTU (4.83 g, 15.0 mmol, 1.5當量)來予以活化。在0℃ - 5℃下靜置約5分鐘。將DCM (60 mL, 1.5體積)添加至樹脂中，隨後添加活化Fmoc-胺基酸溶液。將所得混合物在約環境溫度下攪拌2小時。重複deFmoc程序並依序與其餘胺基酸偶合。在完成最後deFmoc程序之後，使用2-丙醇(130 mL, 10體積)將樹脂洗滌5 min (兩次)，隨後使用MTBE (130 mL, 10體積)洗滌6次。在35℃下於真空中乾燥樹脂以得到製劑9-Seiber (21.21 g, 0.435 mmol/g理論值，91.7%產率，基於質量增加)。
使用5 vol% TFA/DCM (101 mL, 10體積)溶液及DCM洗滌步驟處理一部分製劑9-樹脂複合物(10.15 g, 0.435 mmol/g, 4.41 mmol)。使用DIEA (26.29 g, 35.5 mL，相對於TFA之莫耳比率為1.01:1)中和裂解部分及洗滌液。合併該等部分並在真空下濃縮至原始體積之50%。使用NaHCO3 飽和水溶液(2 × 94 mL)洗滌DCM溶液。藉由無水MgSO4 乾燥所得溶液並濃縮至乾燥以產生膠狀固體。將此膠狀固體在＜ 5℃ MTBE (100 mL)中再製漿以粉碎膠，從而產生白色漿液產物。過濾，洗滌並乾燥白色粉末漿液以產生白色粉末形式之製劑9 (SEQ ID NO:9) (3.84 g, 92.3面積%, 37.8 wt% DIEA•TFA, 57.4 wt%, 2.29 mmol, 51.9%產率，C46 H78 N10 O12 之計算HRMS：預期值962.5801，實際值962.5806)。
製劑 10 之合成
Figure 02_image057
製劑 10 (SEQ ID NO:10) 將Fmoc-Gly-Gly-O-2CTC樹脂複合物(18.09 g, 0.57 mmol/g, 10.3 mmol)懸浮於DMF (180 mL, 10體積)中並保持20 min，且然後瀝乾。使用DMF (108 mL, 6體積)將所得樹脂洗滌5 min。藉由使用5 vol%六氫吡啶、1.25 vol% DBU、1.0 wt.% HOBt/DMF溶液(108 mL, 6體積)分別處理Fmoc-胺基酸樹脂兩次(10 min及20 min)來去除Fmoc基團。瀝乾Fmoc去保護溶液並使用DMF (110 mL, 6體積)將樹脂洗滌兩次，使用MTBE (110 mL, 6體積)洗滌兩次並使用DMF (110 mL, 6體積)再次洗滌兩次。使用標準Fmoc化學實施鏈組裝。
為偶合胺基酸，通常將1.5當量Fmoc-胺基酸及HOBt (2.54 g, 20%水濕，15.0 mmol, 1.5當量)溶於DMF (80 mL, 4.4體積)中，隨後添加DIEA (1.94 g, 15.0 mmol, 1.5當量)以偶合胺基酸。使用冰浴將所得溶液冷卻至0 - 5℃並藉由添加四氟硼酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨(TBTU) (4.84 g, 15.1 mmol, 1.5當量)來予以活化。在0 - 5℃下靜置5 min。然後向樹脂中添加DCM (35 g, 1.5體積)，隨後添加活化Fmoc-胺基酸溶液。將所得混合物在室溫下攪拌2 h。在完成合成步驟之後使用2-丙醇(180 mL, 10體積)將肽樹脂洗滌5 min (兩次)且然後使用MTBE (180 mL，各10體積，6次)洗滌，隨後在35℃下乾燥，從而產生製劑10樹脂複合物(25.52 g, 0.216 mmol/g, 53.6%產率)。
使用1 vol% TFA/DCM (100 mL, 10體積)溶液處理一部分製劑10樹脂複合物(10.075 g, 0.216 mmol/g, 2.18 mmol)三次並使用DCM (75 mL, 7.5體積)洗滌。中和裂解部分並使用吡啶(3.18 g，相對於TFA之莫耳比率為1.01:1)洗滌。合併該等部分並在真空及≤ 35℃下濃縮至乾燥。使用乙醇(40 mL，合併濾液之10% vol.)實施重構，隨後濃縮至乾燥。最後，在攪拌下於去離子水(150 mL，合併濾液之40% vol.)研磨肽。藉由離心收集固體粗製肽沈澱物並使用去離子水洗滌兩次(各150 mL)。使用正庚烷洗滌固體兩次(各100 mL)，分離並在40℃下於真空中乾燥以產生易碎淺黃色固體形式之製劑10 (SEQ ID NO:10) (4.10 g, 72.4面積%，3.0 wt%吡啶•TFA, 70.2 wt%, 1.85 mmol, 85.1%產率，C88 H103 N11 O15 之計算HRMS：預期值1553.7635，實際值1553.7656)。
製劑 11 之合成
Figure 02_image059
將H-丙胺酸-O-2CTC樹脂複合物(40.39 g, 0.5 mmol/g, 20.20 mmol)懸浮於DMF (400 mL, 10體積)中保持約20分鐘，且然後瀝乾。使用DMF (400 mL, 10體積)將所得樹脂洗滌5 min (兩次)。使用標準Fmoc化學組裝胺基酸鏈。通常，將1.5當量Fmoc-胺基酸及HOBt (5.51 g, 80 wt.%, 32.6 mmol, 1.6當量)溶於DMF (150 mL, 3.7體積)中，隨後添加DIEA (4.22 g, 32.7 mmol, 1.6當量)。使用冰浴將所得溶液冷卻至約＜ 5℃並藉由添加TBTU (10.39 g, 32.4 mmol, 1.6當量)來予以活化。在0 - 5℃下攪拌約5分鐘。將DCM (80 mL, 2體積)添加至樹脂中，隨後添加活化Fmoc-胺基酸溶液。將所得混合物在約環境溫度下攪拌2小時。
藉由使用5 vol%六氫吡啶、1.25 vol% DBU、1.0 wt% HOBt/DMF溶液(240 mL, 6體積)分別處理Fmoc-胺基酸樹脂兩次(10 min及20 min)來去除Fmoc基團。瀝乾Fmoc去保護溶液，使用DMF (240 mL, 6體積)將樹脂洗滌兩次，使用MTBE (240 mL, 6體積)洗滌兩次並使用DMF (240 mL, 6體積)再次洗滌兩次。在完成合成步驟之後，使用2-丙醇(400 mL, 10體積)將肽樹脂充分洗滌兩次並使用MTBE (400 mL，各10體積，6次)洗滌，隨後在35℃下於真空中乾燥以產生含有較少最後胺基酸之加載樹脂(74.82 g, 0.159 mmol/g, 11.90 mmol, 58.9%產率)。將最後胺基酸Fmoc-Leu-OH單獨添加至一部分樹脂(13.61 g, 0.159 mmol/g, 2.16 mmol)中。使用DMF (130 mL, 10體積，3次)各自溶脹此樹脂＞ 5 min，然後去保護(自5.6 g六氫吡啶、1.67 g DBU、1.3 g HOBt在120 mL DMF中製得之130 mL去保護混合物，10體積，兩次，10 min及20 min)。使用DMF (80 mL, 6體積，兩次)洗滌樹脂，隨後使用MTBE (80 mL, 6體積，兩次)洗滌，且然後使用DMF ( 80 mL, 6體積，兩次，各5 min)洗滌。為偶合Fmoc-Leu-OH，將Fmoc-Leu-OH (1.47 g, 4.16 mmol, 1.9當量)及HOBt (0.704 g, 80 wt.%, 4.17 mmol, 1.9當量)溶於DMF (50 mL, 3.7體積)中，隨後添加DIEA (0.54 g, 4.2 mmol, 1.9當量)。使用冰浴將所得溶液冷卻至＜ 5℃並藉由添加TBTU (1.34 g, 4.17 mmol, 1.9當量)來予以活化，且在0 - 5℃下攪拌5 min。將DCM (20 mL, 1.5體積)添加至樹脂中，隨後添加活化Fmoc-胺基酸溶液。將所得混合物在約環境溫度下攪拌2小時。使用DMF (180 mL, 13體積，兩次)、MTBE (180 mL, 13體積，兩次)及DMF (180 mL, 13體積，兩次)洗滌此樹脂(各5 min)。使用DCM (130 mL, 10體積，6次，各5 min)洗滌樹脂，然後在35℃下於真空中乾燥樹脂，從而產生加載樹脂(12.90 g, 0.203 mmol/g, 2.62 mmol, 121%產率)。
使用1 vol% TFA/DCM溶液(70 mL, 10體積)在約環境溫度下處理一部分樹脂(7.09 g, 0.203 mmol/g, 1.44 mmol)三次(各10 min)，隨後使用DCM (55 mL, 7.5體積)洗滌。中和裂解部分並使用吡啶(3.02 g，相對於TFA之莫耳比率為1.02:1)洗滌。合併該等部分並在真空及≤ 35℃下濃縮至乾燥。使用乙醇(28 mL，合併濾液之11% vol.)實施重構，隨後濃縮至乾燥。最後，在去離子水(105 mL，合併濾液之40% vol.)中攪拌肽。藉由過濾收集固體粗製肽沈澱物並使用去離子水(4 × 50 mL)洗滌。使用正庚烷(3 × 100 mL)洗滌固體，分離並在40℃下於真空中乾燥，從而產生白色粉末形式之製劑11 (SEQ ID NO:11) (4.54 g, 87.6面積%, 44.4 wt%吡啶•TFA, 48.7 wt%, 0.936 mmol, 65.0%產率，C127 H192 N14 O28 之計算HRMS：預期值2361.4031，實際值2361.4021)。在樹脂上製備製劑11 (SEQ ID NO:11)之總產率為71.3%。
製劑 12 之合成
Figure 02_image061
製劑 12 (SEQ ID NO:12) 將Fmoc-Aib-O-CTC樹脂複合物(19.16 g, 0.54 mmol/g, 10.35 mmol)在DMF (190 mL, 10體積)中懸浮20 min且然後瀝乾。使用DMF (190 mL, 10體積)將所得樹脂洗滌5 min且然後瀝乾。合併六氫吡啶(77.82 g)、DBU (23.16 g)、HOBt (18.09 g, 80 wt%)及DMF (1800 mL)以提供5%六氫吡啶、1.25% DBU、1.0% HOBt/DMF之溶液作為去保護溶液。藉由使用去保護溶液(190 mL, 10體積)處理Fmoc-胺基酸樹脂兩次(分別10 min及20 min)來去除Fmoc基團。瀝乾Fmoc去保護溶液，然後使用DMF洗滌樹脂兩次，使用MTBE洗滌兩次，並使用DMF再次洗滌兩次(每一次洗滌，190 mL, 10體積)。
將DIEA (2.62 g, 20.3 mmol, 2.0當量)添加至Fmoc-Ile-OH (7.11 g, 10.1 mmol, 2.0當量)於DMF (85 mL)中之溶液中。將所得溶液冷卻至0 - 5℃，添加六氟磷酸6-氯-苯并***-1-基氧基-參-吡咯啶基鏻(PyClock) (11.36 g, 20.06 mmol, 2.0當量)並使其完全溶解。靜置3至5分鐘之後，將活化溶液至預溶脹於DCM (30 mL, 1.5體積)中之H-Aib-O-CTC樹脂複合物中。使反應液升溫至環境溫度並攪拌2小時。未反應材料為約18%，如藉由分析評價所指示。使用DMF洗滌兩次，使用MTBE洗滌兩次，並使用DMF洗滌兩次(各190 mL、10體積)。將Fmoc-Ile-OH (10.63 g, 30.08 mmol, 6當量)於DMF (165 mL)中之溶液添加至Oxyma (50 mL, 0.6 M於DMF中，30 mmol, 6當量)及DIC (50 mL, 0.66 M於DMF中，33 mmol, 6.6當量)中。在約環境溫度下攪拌5 min，且然後添加至樹脂中並攪拌18小時。向樹脂中添加吡啶、乙酸酐及DMF之混合物並攪拌0.5小時。使用DMF (5 × 140 mL, 7體積)、額外DMF (2 × 180 mL, 9體積)、MTBE (2 × 180 mL, 9體積)、然後DMF (2 × 180 mL, 9體積)洗滌樹脂。
使用標準Fmoc化學依序實施關於剩餘胺基酸之其餘鏈組裝。通常，將Fmoc-胺基酸(2.0當量)、HOBt (3.42 g, 80 wt%, 2.0當量)溶於DMF (85 mL)中，隨後添加DIEA (2.64 g, 2.0當量)。使用冰浴將所得溶液冷卻至0 - 5℃並藉由添加TBTU (6.45 g, 2.0當量)來予以活化，且在0 - 5℃下靜置3 - 5 min。向樹脂中添加DCM (30 mL)，隨後添加活化Fmoc-胺基酸溶液。將所得混合物在室溫下攪拌2小時。使用DMF洗滌所得樹脂兩次，使用MTBE洗滌兩次並使用DMF再次洗滌兩次(每一次洗滌，190 mL, 10體積)。藉由使用去保護溶液(190 mL, 10體積)處理Fmoc-胺基酸樹脂兩次(分別10 min及20 min)來去除Fmoc基團。在瀝乾去除Fmoc溶液之後，使用DMF洗滌樹脂兩次，使用MTBE洗滌兩次，並使用DMF再次洗滌兩次(每一次洗滌，190 mL, 10體積)。
在DMF (50 mL)中使用Oxyma (30 mL，0.6 M於DMF中，20 mmol, 2當量)及DIC (33 mL，0.66 M, 22 mmol, 2.1當量)活化四聚體Boc-Y-Aib-E(tBu)G-OH (12.25 g, 2.0當量) 5 min以添加呈四聚體形式之最後4個胺基酸。向樹脂中添加此混合物並偶合18小時。在18小時結束時瀝乾混合物，並使用DMF (190 mL，各5 min，5次)洗滌樹脂。添加於DMF (40 mL)中之額外四聚體(6.21 g, 1.0當量)，使用PyBOP (5.77 g, 1.1當量)及DIEA (3.32 g, 2.6當量)活化5 min，然後將此混合物添加至樹脂中並攪拌4小時。在4小時結束時瀝乾混合物，使用DMF (190 mL，各5 min，5次)洗滌。藉由向樹脂中添加DMF (105 mL)、吡啶(13.48 g, 17當量)及乙酸酐(14.27 g, 14當量)之混合物來使樹脂封端並攪拌1 hr。在完成鏈組裝之後，使用DMF (每次190 mL)洗滌肽樹脂5次(各5 min)，使用DCM (每次190 mL)洗滌6次且然後在真空及35℃下乾燥，從而產生製劑12樹脂複合物(31.03 g, 0.2595 g/ mmol理論值，8.05 mmol, 77.8%產率)。使用1 vol% TFA/DCM溶液(160 mL, 10體積)在環境溫度下處理一部分製劑12樹脂複合物(15.975 g, 0.2595 mmol/g, 4.146 mmol)三次(各10 min)，隨後使用DCM (120 mL, 7.5體積)洗滌。中和裂解部分並使用吡啶(4.74 g，相對於TFA之莫耳比率為0.94:1)洗滌。合併該等部分並在真空及≤ 35℃下濃縮至乾燥。使用乙醇(30 mL，合併濾液之5% vol.)實施重構，隨後濃縮至乾燥。將肽在去離子水(242 mL，合併濾液之40% vol.)以機械方式攪拌10分鐘。藉由過濾收集固體粗製肽並使用去離子水(4 × 100 mL)洗滌。使用正庚烷(4 × 100 mL)洗滌固體，分離並在35℃下於真空中乾燥，從而產生白色粉末形式之製劑12 (SEQ ID NO:12) (9.38 g, 82.2面積%, 0.2 wt%吡啶•TFA, 82.1 wt%, 3.85 mmol, 92.8%產率，C103 H165 N13 O26 之計算HRMS預期值2000.1989，實際值2000.1968)。
製劑 13 之合成
Figure 02_image063
在N2 及攪拌下，向燒瓶中添加製劑 9 (2.887 g, 70.2 wt%, 1.30 mmol, 1.00當量)、製劑 10 (3.576 g, 57.4 wt%, 2.13 mmol, 1.63當量)、DMSO (18.1 g, 16.4 mL)、DMF (15.8 g, 16.7 mL)及DIEA (655 mg, 5.07 mmol, 3.89當量)直至產生金色溶液為止。在冰水中冷卻溶液，然後添加PyBOP (1.414 g, 2.72 mmol, 2.08當量)。去除冰浴並使混合物升溫至環境溫度。監測反應約5小時以確保適當轉化。將二乙胺(2.116 g, 28.9 mmol, 22.2當量)之等分試樣添加至環境溫度反應混合物中。將混合物攪拌約一小時以使約＞ 99%轉化成製劑 13 (SEQ ID NO:13) 。藉由向反應混合物中添加含有NaHCO3 飽和水溶液(50 mL)及去離子水(50 mL)之＜ 4℃混合物來沈澱產物。將混合物在冷條件下攪拌至少約15分鐘。過濾白色渾濁漿液。使用去離子水(3 × 50 mL)洗滌濕濾餅，隨後使用MTBE (6 × 50 mL)洗滌，並在40℃及N2 吹掃下於真空中乾燥約62 h。該製程產生淺黃色固體形式之製劑 13 (SEQ ID NO:13) (4.45 g, 60.4面積%, 16.4面積%二苯并富烯，1.18 mmol, 90.5%產率，C119 H169 N21 O24 之計算HRMS：預期值2276.2649，實際值2276.2550)。
製劑 14 之合成
Figure 02_image065
在N2 下，向燒瓶中添加製劑 11 (SEQ ID NO:11) (3.012 g, 48.7 wt%, 0.621 mmol, 1.00當量)之等分試樣以及製劑 13 (SEQ ID NO:13) (3.951 g, 60.4 wt%, 1.05 mmol, 1.69當量)、DMSO (9.8 g, 8.9 mL)、DMF (52.0 g, 55.0 mL)及DIEA (372 mg, 2.88 mmol, 4.63當量)。攪拌混合物直至產生金色溶液為止。使用冰水將混合物冷卻至＜ 10℃。向混合物中添加PyBOP (742 mg, 1.42 mmol, 2.30當量)之等分試樣。去除冰浴並使混合物升溫至約環境溫度。監測反應中製劑12 (SEQ ID NO:12)之轉化約22小時。此產生約＞ 96%之轉化。在溫度＜10℃時，將六氫吡啶(530 mg, 6.22 mmol, 10.0當量)添加至冷卻反應混合物中。將混合物在環境溫度下攪拌約2小時以使＞約99%轉化成製劑 14 (SEQ ID NO:14)。將反應混合物添加至含有 ＜ 4℃ 0.5 N HCl水溶液(12.72 g, 6.23 mmol, 10.0當量)及去離子水(16.71 g)之另一燒瓶中以使製劑14沈澱。將冷漿液攪拌約15分鐘且過濾白色漿液。使用去離子水(2 × 30 mL)、NaHCO3 飽和水溶液(2 × 30 mL)、去離子水(3 × 30 mL)及MTBE (4 × 45 mL)洗滌濕濾餅，並在40℃及N2 吹掃下於真空中乾燥約17 h。獲得白色粉末形式之產物製劑 14 (SEQ ID NO:14) (5.418 g, 48.9面積%, 0.603 mmol, 97.0%產率，C231 H349 N35 O49 之計算HRMS：預期值4397.5893，實際值4397.6057)。
製劑 15 ( 經保護替則帕肽 ) 之合成 製劑 15 ：
Figure 02_image067
在N2 下，向燒瓶中添加製劑 12 (671 mg, 82.1 wt%, 0.275 mmol, 1.23當量)之等分試樣。在攪拌下向燒瓶中添加製劑 14 (2.009 g, 48.9面積%, 10.7面積%異構體，0.223 mmol, 1.00當量)、DMSO (11.1 g, 10.0 mL)、DMF (19.0 g, 20.1 mL)及N,N -二異丙基乙基胺(76 mg, 0.588 mmol, 2.63當量)以產生金色溶液。添加0.6 M HOAt (619 mg, 0.384 mmol, 1.72當量)等分試樣，然後冷卻至-5℃。添加PyClock試樣(220 mg, 0.397 mmol, 1.78當量)。使混合物升溫至約環境溫度以使約84%轉化成製劑15。藉由將反應混合物添加至冰冷去離子水(548 mL)中經10 min來分離產物，從而使產物沈澱。使用DMF (5 mL)沖洗反應燒瓶並添加至漿液中。將漿液攪拌約15分鐘，升溫至約環境溫度，並過濾。使用去離子水(3 × 80 mL)洗滌濕濾餅，且將白色蠟狀
Figure 02_image069
固體在35℃下於真空中乾燥3.5天，從而產生白色粉末形式之製劑 15 (SEQ ID NO:15) ( 經保護 替則帕肽) (2.506 g, 41.6面積%, 0.163 mmol, 73.1%產率，C334 H512 N48 O74 之計算HRMS：預期值6379.7777，實際值6379.8652)。
實例 2 之合成 替則帕肽 (SEQ ID No: 1) 去保護製劑15： 在N2 下，向燒瓶中添加TFA (19.656 g, 13.03 mL)試樣以及DCM (815 mg, 0.62 mL)、DTT (434 mg)及TIPS (362 mg, 0.47 mL)。在冰水中冷卻混合物，然後添加水(468 mg, 0.47 mL)。在2℃下，向此混合物中添加製劑15-經保護實例2 (1016 mg, 39.0面積%, 0.0620 mmol)之試樣以提供溶液。將混合物升溫至約環境溫度並攪拌約2小時。將反應混合物添加至-15℃ MTBE (150 mL)中，使用MTBE (3 mL)沖洗反應器。在約10 min之後，離心漿液，傾析上清液。將濕濾餅在MTBE (3 × 50 mL)中再製漿，離心每一次洗滌液並傾析上清液。在35℃下於真空中乾燥濕濾餅以產生白色固體形式之實例 2- 替則帕肽 (SEQ ID NO:1) (784 mg, 26.5面積%, 0.0432 mmol, 69.7%產率，C225 H348 N48 O68 之計算HRMS：預期值4810.5249，實際值4810.5642)。
製劑 16 之合成：
Figure 02_image071
製劑 16 (SEQ ID NO:16) 該合成使用載量為0.61 mmol/g之Fmoc-Gly-OH 2-氯三苯甲基樹脂。一般SPPS程序實質上如本文所闡述。製劑16源自如本文所闡述使用熟習此項技術者已知之方法對樹脂上肽之軟裂解。
使用乙醇(合併濾液之5% vol.)來重構濃縮材料並濃縮至乾燥。在攪拌下於水(合併濾液之40% vol.)中研磨肽。分離固體並在真空及40℃下乾燥至恆定重量以產生5.24 g (99%)白色粉末形式之製劑16 (SEQ ID NO:16)。
製劑 18 (SEQ ID NO:17) 之合成 ：
Figure 02_image073
該合成使用載量為0.50 mmol/g之Fmoc-Ala-OH 2-氯三苯甲基樹脂。使用實質上如本文所闡述之一般SPPS程序且進行下列修改：
循環 胺基酸 SPPS條件 用於偶合之溶劑：DMF 備註
1 (52S)-52-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-25-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,23,28,37,46-五側氧基-3,32,35,41,44-五氧雜-24,29,38,47-四氮雜五十三烷-53-酸 使用DBU/HOBt進行10及20 min Fmoc去保護循環 6 × 2 min去保護後洗滌， 1.7 AA/3.0 HOBt/ 3.0 TBTU/ 3.0 DIEA 2 h, rt. 製劑17
2 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH 10及20 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 1. 3.0 AA/3.0 HOBt/ 3.0 TBTU/ 3.0 DIEA, 2 h, rt. 2. 再偶合，1.5 AA/1.5 HOBt/ 1.5 TBTU/ 1.5 DIEA, 4 h, rt. 在結束時使用Ac2 O/Pyr混合物在室溫下實施封端，
3 Fmoc-L-Ala-OH 10及20 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 2.0 AA/2.0 HOBt/ 2.0 TBTU/ 2.0 DIEA, 2 h, rt.
4 Fmoc-L-Ile-OH 10及20 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 2.0 AA/2.0 HOBt/ 2.0 TBTU/ 2.0 DIEA, 2 h, rt.
5 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 10及20 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 2.0 AA/2.0 HOBt/ 2.0 TBTU/ 2.0 DIEA, 2 h, rt.
6 Fmoc-L-Asp(tBu)-OH 10及20 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 2.0 AA/2.0 HOBt/ 2.0 TBTU/ 2.0 DIEA, 2 h, rt.
製劑 18 軟裂解 ： 將42.13 g樹脂上肽中間體試樣置於燒瓶中並使用10體積(400 ml) 1% TFA/DCM處理10 min(3次)，在每次處理後使用DCM洗滌。藉由添加4.4 ml吡啶來終止每一處理。合併所得溶液，在真空中濃縮。使用乙醇(25 mL)實施重構，隨後濃縮至乾燥以提供56.6 g泡沫狀半固體。添加400 ml體積水10次以提供漿液。過濾漿液並使用水洗滌。分離固體並在真空及40℃下乾燥至恆定重量以產生23.3 g白色粉末形式之製劑18 (SEQ ID NO:17)。
製劑 17 之合成 ((52S)-52-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-25-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,23,28,37,46-五側氧基-3,32,35,41,44-五氧雜-24,29,38,47-四氮雜五十三烷-53-酸)：
Figure 02_image075
將製劑6 (80 g, 92 mmol)、DIEA(17.53 ml, 101 mmol)、TSTU (30.3 g, 101 mmol)及乙腈(1 L)裝填至器皿中並在23℃下攪拌17 h。濃縮溶液，然後將所得橙色殘餘物再溶於EtOAC (1.6 L)中，然後使用0.1 M HCl (2 × 1L)洗滌。使用水( 2 × 1L)洗滌有機層，然後藉由MgSO4 乾燥，過濾並在真空中濃縮以留下橙色油狀物(83 g)。以相同規模運行第二批次併合併以得到123g粗製油狀物。將中間體酯(123 g, 110 g活性物，113 mmol)溶於EtOH (700 mL)中，然後添加Fmoc-離胺酸(45.9 g, 125 mmol)及DIEA (21.70 ml, 125 mmol)並將反應液攪拌17 hr。在反應完成之後，在真空中去除EtOH以留下橙色油狀物(201 g)。將殘餘物溶於EtOAc (1.1 L)中並使用0.1 M HCl溶液(3 × 400 mL)洗滌，然後使用NaHCO3 水溶液(400 mL)洗滌。分離各層，然後使用鹽水(1 × 400 mL)洗滌有機層。濃縮有機物以產生橙色油狀物(約190 g)。添加丙酮(400 ml)，然後過濾所得懸浮液以去除無機物。濃縮混合物，然後藉由正相層析(經以60/40庚烷/丙酮預先處理製備之1.1 kg二氧化矽)純化並使用增加極性洗脫劑洗脫(收集約3L部分)。合併至少95 HPLC面積%之部分並濃縮以提供之較稠黃色油狀製劑17 (70g)。
藉由方法 1 使用假脯胺酸結構單元來合成製劑 19 ：
Figure 02_image077
該合成使用載量為0.65 mmol/g之Fmoc-Leu-OH 2-氯三苯甲基樹脂。可以類似於製劑19B之方式將假脯胺酸衍生製劑19A (SEQ ID NO:18)處理成實例3。使用具有下列修改之一般SPPS程序：
循環 胺基酸 SPPS條件 用於偶合之溶劑：DMF
1 Fmoc-Aib-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 8 h, rt.
2 Fmoc-L-Ile-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 18 h, rt.
3 Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
4 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
5 Fmoc-L-Asp(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
6 Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
7 Fmoc-L-Thr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
8 Fmoc-L-Phe-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
9 Fmoc-Gly-Thr(ψMe,Me Pro)-OH 4 x 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 18 h, rt.
10 Fmoc-L-Glu(tBu)-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 8 h, rt.
11 Fmoc-Aib-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 18 h, rt.
12 Boc-L-Tyr(tBu)-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 18 h, rt.
藉由方法 2 使用末端 Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(tBu)-Gly-OH 四聚體來合成製劑 19B ：
Figure 02_image079
製劑 19B (SEQ ID NO:19) 該合成使用載量為0.65 mmol/g之Fmoc-Leu-OH 2-氯三苯甲基樹脂。使用實質上如本文所闡述之SPPS程序來製備製劑19B。
循環 胺基酸 SPPS條件 用於偶合之溶劑：DMF 備註
1 Fmoc-Aib-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 8 h, rt.
2 Fmoc-L-Ile-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 18 h, rt.
3 Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
4 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
5 Fmoc-L-Asp(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
6 Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
7 Fmoc-L-Thr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt.
8 Fmoc-L-Phe-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt   
9 Fmoc-L-Thr(tBu)-OH 3 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 3.0 AA/3.3 DIC/ 3.0 Oxyma 4 h, rt
10 Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(tBu)-Gly-OH 4 × 30 min Fmoc去保護循環， 6 × 2 min去保護後洗滌， 1. 2.0 AA/2.2 DIC/ 2.0 Oxyma 6 h, rt. 2. 再偶合，1.0 AA/1.1 PyBOP/2.5 DIPEA, 4 h, rt 在結束時使用Ac2 O/Pyr混合物實施封端
製劑 19B 軟裂解 ： 使用實質上如本文所闡述樹脂結合性19B之軟裂解且使用熟習此項技術者已知之方法來製備製劑19B。例如參見劑18之方法製。分離所得固體並在真空及30-40℃下乾燥至恆定重量以產生2.94 g淺黃色粉末狀產物。
製劑 20 之合成 (LPPS) ：
Figure 02_image081
在環境溫度下，向製劑 1 (4.25g, 4.166 mmol)及製劑 16 (5.00 g, 3.340 mmol)於DMSO/DMF (1:1, 200 mL)中之溶液中添加PyBOP (2.60g, 5.00 mmol)及二異丙基乙基胺(1.75 mL, 10.0 mmol)。將溶液攪拌18小時且然後藉由添加過量二乙胺(10.0 mL)來驟冷。將驟***液攪拌2小時且然後在0℃下緩慢添加至碳酸氫鈉飽和水溶液/水(1:1, 300 mL)中。將所得沈澱物攪拌10分鐘且然後藉由過濾收集。使用水(3 × 150 mL)、隨後甲基第三丁基醚(3 × 150 mL)連續洗滌濾液。在真空及40℃下乾燥固體以提供白色固體形式之製劑 20 (SEQ ID NO:20) (5.30 g, 69%產率，C119 H169 N21 O24 之計算HRMS：預期值2276.2649，實際值2276.2652)。
製劑 21 之合成 (LPPS) ：
Figure 02_image083
在環境溫度下，向製劑 20 (1.00g, 0.44 mmol)及製劑 18 (0.90g, 0.40 mmol)於DMSO/DMF (1:1, 20 mL)中之溶液中添加PyBOP (314 mg, 0.30 mmol)及二異丙基乙基胺(0.21 mL, 1.20 mmol)。將溶液攪拌18小時且然後使用六氫吡啶(0.79 mL, 4.00 mmol)驟冷。將驟***液攪拌2小時且然後冷卻至0℃，並使用稀HCl溶液(50 mL)驟冷。將所得漿液攪拌10分鐘且藉由過濾收集固體。使用碳酸氫鈉飽和水溶液(2 × 50 mL)、水(3 × 50 mL)、隨後甲基第三丁基醚(3 × 50 mL)連續洗滌濾液。將固體在真空及40℃下乾燥18小時以提供白色固體形式之製劑21 (SEQ ID NO:21) (1.80g, 106%產率，C225 H338 N34 O48 之計算HRMS：預期值4284.5053，實際值4284.5062)。
製劑22之合成(LPPS)：
Figure 02_image085
在環境溫度下，向製劑 21 (214 mg, 0.05 mmol)及製劑 19B (116 mg, 0.055 mmol)於DMSO/DMF (1:1, 3 mL)中之溶液中添加PyBOP (57 mg, 0.11 mmol)及二異丙基乙基胺(58 μL, 0.33 mmol)。將溶液攪拌18小時且然後使用碳酸氫鈉飽和水溶液及水之1:1混合物(10 mL)驟冷。將所得漿液攪拌10分鐘且藉由過濾收集所得固體。使用水(3 × 10 mL)洗滌固體且在真空及40℃下乾燥固體以提供製劑 22 (SEQ ID NO:22) (285 mg, 89%產率，C334 H512 N48 O74 之計算HRMS：預期值6379.7777，實際值6379.7730)。
實例 3 替則帕肽 (SEQ ID No: 1)
Figure 02_image087
將TFA (2.3 mL)、水(0.1 mL)、三異丙基矽烷(0.1 mL)及DTT (75 mg)之溶液冷卻至0℃。向該溶液中裝填製劑 22 (100 mg, 0.015 mmol)且將反應混合物升溫至環境溫度並攪拌2小時。將所得混合物傾倒至甲基第三丁基醚(25 mL)之預冷卻(-20℃)溶液中。將所得沈澱物在-20℃下維持15分鐘且將漿液離心，並使用甲基第三丁基醚(2 × 25 mL)洗滌。將固體在真空及35℃下乾燥18小時以獲得白色固體形式之實例3 (SEQ ID NO:1) (71 mg, 93%產率，C225 H348 N46 O68 之計算HRMS：預期值4810.5249，實際值4810.5036)。
Figure 02_image089
反應圖 A.1 自製劑 25 及製劑 26 來合成製劑 27 步驟 1 連續合成製程闡述 ： 步驟 1 ： 在5體積DMSO/ACN (90:10 vol/vol)中製備製劑 25 (SEQ ID NO:25) (1.05當量)之進料溶液。在20體積DMSO/ACN (90:10 vol/vol)中製備製劑 26 (SEQ ID NO:26)之第二進料溶液。在3體積ACN中製備PyOxim (1.5當量)之第三進料溶液。製備二異丙基乙基胺(4當量)於ACN中之第四流。將前三股流抽吸至混合器中並在混合器出口處與N, N-二異丙基乙基胺合併，且使混合物抽吸穿過另一混合器並穿過於20℃恒溫浴中之栓塞流反應器(滯留時間為2 h)。在反應器出口處，可添加乙酸以消耗剩餘PyOxim。在＞ 2 h之後，添加純淨二乙胺(10當量)並經由混合器混合。使此流行進至於20℃恒溫浴中之第二栓塞流反應器中(滯留時間為1 h)。收集製劑 27 (SEQ ID NO:27) 之產物溶液並使用70/30 DMSO/ACN溶液進行奈米過濾以去除10-20透析體積之試劑。
步驟 1 連續合成製程闡述 ： 藉由以下方式來製備製劑 25 (SEQ ID NO:25) , 2.40 kg, 96.7 wt.%, 2.274 mol)之進料溶液：將固體溶於DMSO (13.88 kg, 12.62 L)中並使用ACN (1.09 kg, 1.39 L)稀釋溶液，從而產生製劑 25 (114.3 mg/mL, 0.112 M)於90:10 vol/vol DMSO:ACN中之溶液。藉由以下方式來製備製劑 26 (SEQ ID NO:26, 2.79 kg, 98.6 wt.%, 1.836 mol)之第二進料溶液：將固體溶於DMSO (54.8 kg, 49.8 L)中並使用ACN (4.3 kg, 5.47 L)稀釋，從而產生製劑 26 (45.5 mg/mL, 0.030 M)於90:10 vol/vol DMSO:ACN中之溶液。製備PyOxim (4.5 kg, 8.53 mol)於ACN (47.33 kg, 60.22 L)中之第三進料溶液且產生0.132 M溶液。添加呈純淨液體形式之二異丙基乙基胺。在20℃下，將製劑 25 (14.91 L, 1.704 kg, 1.670 mol, 0.95當量，5.9 g/min)及製劑 26 (58.46 L, 2.660 kg, 1.750 mol, 1.00當量，22.5 g/min)及PyOxim (1.4當量，5.4 g/min)流之溶液以及純淨N, N-二異丙基乙基胺(4.0當量，0.446 mL/min)抽吸至混合器中。使混合物抽吸穿過另一混合器並穿過於20℃溫度浴中之栓塞流反應器(滯留時間為3 h)，且經42.9 h進行收集，從而產生88.6 kg產物溶液。
奈米過濾闡述 奈米過濾係基於膜之過濾製程，其用於基於大小及分子量差異來分離化學物質。製劑 27 (SEQ ID NO:27) 之產物溶液含有試劑(二乙基胺、PyOxim、二異丙基乙基胺等)及不期望副產物(例如二苯并富烯)，期望在進行下一步驟之前去除該等不期望副產物。應用奈米過濾以去除不期望物質(分子量＜ 500 Da)。
將製劑 27 之產物溶液裝填至NF進料罐中並經由熱交換器及奈米過濾單元(含有適宜膜(陶瓷或聚合物)以引起期望分離)抽吸至再循環迴路中。去除滲透物中之不期望物質並單獨收集或作為廢物棄除。為維持NF罐中之恆定體積，連續抽入新鮮溶劑(亦即70:30 vol/vol DMSO/ACN)以匹配滲透物抽出速率。經由奈米過濾純化製劑 27 產物溶液並直接用於步驟2中。
奈米過濾 向反應器中添加Fmoc保護製劑 27 於DMSO/ACN (88.6 kg)及二乙胺(1.34 kg)中之溶液。將混合物在20℃下攪拌2 h，從而產生製劑 27 (87.6 L, 38.45 mg/mL, 3.37 kg製劑 27 , 1.48 mol製劑 27 )。將製劑 27 之產物溶液裝填至奈米過濾進料罐中且然後經由熱交換器及奈米過濾單元(含有適宜膜(陶瓷或聚合物)以引起期望分離)抽吸至再循環迴路中。在滲透物側去除不期望物質並單獨收集或作為廢物棄除。持續該操作直至充分去除不期望雜質為止。為維持奈米過濾罐中之恆定體積，連續抽入新鮮70:30 vol/vol DMSO/ACN以匹配滲透物抽出速率。此產生於DMSO / ACN中之製劑 27 (72.4 L, 40.8 mg /mL, 2.95 kg製劑 27 , 1.30 mol製劑 27 ，經由偶合、deFmoc及奈米過濾之產率為78.1%)。
步驟 1 例示 - 分析結果。 HPLC證實製劑 25 及製劑 26 已轉化形成製劑 27 。該分析方法使用65℃苯基己基固定相管柱(2.1 mm i.d. × 150 mm × 1.7微米粒度)以及於水及乙腈中之0.1% TFA之2-98% B梯度(經12分鐘)。使用214 nm下之UV檢測來檢測此材料。
表A.1展示針對步驟1偶合反應產物(Fmoc保護製劑 27 )及步驟1去保護反應產物(製劑 27 )所收集之高解析度質譜數據。質量準確度係用於證實所量測物質與預測物質之匹配性之度量。
化合物 化學 式 理論 單同位素 質量 ( 中性 ) 觀察 離子 m/z 電荷 狀態 計算 單同位素 質量 ( 中性 ) 質量 準確度 (ppm)
Fmoc 保護 製劑 27 C134 H179 N21 O26 2498.333 2499.3402 1 2498.3329 0.05
製劑 27 C119 H169 N21 O24 2276.2649 2277.2743 1 2276.267 0.9
表 A.1 經由使用高解析度質譜數據計算之質量準確度來證實所量測Fmoc保護製劑 27 及製劑 27 。
步驟 2 步驟 2 化學：
Figure 02_image091
反應圖 A.2 自製劑 27 (SEQ ID NO:27) 及製劑 28 (SEQ ID NO:28) 之片段來合成製劑 29 (SEQ ID NO:29) 。
步驟 2 連續合成製程闡述 ： 步驟 2 ： 在10體積DMSO/ACN (90:10 vol/vol)中製備製劑 28 (SEQ ID NO:28) (1.15當量)之進料溶液。在1體積ACN中製備PyOxim (2當量)之第二進料溶液。製備二異丙基乙基胺(3當量)於ACN中之第三流(5 wt%溶液)。將來自步驟1之製劑 27 (SEQ ID NO:27) 之溶液以 及製劑 28 及PyOxim流抽吸至混合器中並在混合器出口處與二異丙基乙基胺合併，且使混合物抽吸穿過另一混合器並穿過於20℃恒溫浴中之栓塞流反應器(滯留時間為2 h)。在反應器出口處，可添加乙酸以消耗殘餘PyOxim。在＞ 2 h之後，添加純淨二乙胺(10當量)並經由混合器混合。使此流行進至於20℃恒溫浴中之第二栓塞流反應器中(滯留時間為1 h)。收集製劑 29 (SEQ ID NO:29) 之產物溶液並使用DMF溶液作為滲濾劑進行奈米過濾以去除10-20透析體積之試劑。
步驟 2 連續合成製程闡述： 藉由以下方式來製備製劑 28 (4.68 kg, 98.9 wt.%, 2.058 mol)之進料溶液：將固體溶於DMSO (41.75 kg, 37.95 L)中並使用ACN (3.3 kg, 4.20 L)稀釋溶液，從而產生製劑 28 (94.7 mg/mL, 0.0421 M)於90:10 vol/vol DMSO:ACN中之溶液。製備PyOxim (3.0 kg, 5.69 mol)於ACN (11.81 kg, 15.03 L)中之第二進料溶液且產生0.327 M溶液。添加呈純淨液體形式之N, N-二異丙基乙基胺。將來自步驟1之製劑 27 (73.86 L, 41.2 mg/mL, 3.04 kg, 1.336 mol, 0.0181 M, 1.0當量，29.9 g/min)之溶液以及製劑 28 (1.3當量，17.7 g/min)及PyOxim (2.1當量，2.9 g/min)流抽吸至混合器中且在混合器出口處將流調節至20℃並與純淨N,N-二異丙基乙基胺(4.0當量，0.374 mL/min)在20℃下合併。使混合物抽吸穿過另一混合器並穿過於20℃溫度浴中之栓塞流反應器(滯留時間為3 h)，且經43.2 h進行收集，從而產生129.35 kg製劑29產物溶液。
奈米過濾闡述 實質上如上文所闡述之奈米過濾製程使用製劑29之產物溶液代替製劑27之產物溶液。
奈米過濾示範 實質上如本文所闡述來實施使用於DMSO/ACN中之Fmoc保護製劑 29 溶液之奈米過濾製程。將Fmoc保護製劑29 (129.35 kg)及二乙胺(2.0 kg)添加至反應器中進行奈米過濾。奈米過濾製程產生於DMF中之製劑 29 (98.85 L, 42.24 mg /mL, 4.18 kg製劑 29 , 0.974 mol製劑 29 ，經由偶合、deFmoc及奈米過濾之產率為73.1%)。
步驟 2 例示 - 分析結果。 HPLC證實自製劑 28 及製劑 27 合成製劑 29 。該分析方法使用65℃ C4固定相管柱(2.1 mm i.d. × 150 mm × 1.7微米粒度)以及於水及乙腈中之0.1% TFA之25-98% B梯度(經12分鐘)。使用214 nm下之UV檢測來檢測此材料。
表A.3展示針對步驟2偶合反應產物(Fmoc保護製劑 29 )及步驟2去保護反應產物(製劑 29 )所收集之高解析度質譜數據。質量準確度證實了所量測物質產物。使用中性物質之單同位素質量。
化合物 化學 式 理論 單同位素 質量 (中性) 觀察離子m/z 電荷狀態 計算單同位素質量(中性) 質量 準確度 (ppm)
Fmoc 保護 製劑 29 C240 H348 N34 O50 4506.5734 2254.294 2 4506.5735 0.02
製劑 29 C225 H338 N34 O48 4284.5053 2143.2596 2 4284.5046 0.17
表 A.3 經由使用高解析度質譜數據計算之質量準確度來證實所量測Fmoc保護製劑 29 及製劑 29 。
步驟 3 步驟 3 化學：
Figure 02_image093
反應圖 A.3 自製劑 30 (SEQ ID NO:30) 及製劑 29 (SEQ ID NO:29) 之片段來合成製劑 31 (SEQ ID NO:31) 。
步驟 3 分批製程闡述 ： 在-5℃下，向製劑 29 (2.249 g, 46.5 mg/g, 104.6 bmg, 0.0244 mmol)及製劑 30 (71.5 mg, 90.6面積%, 0.0306 mmol)於DMF (0.3068 g,  0.325 mL)中之奈米過濾DMF溶液中添加於DMF中之5.0 wt% N, N-二異丙基乙基胺溶液(114.0 mg, 5.70 mgDIEA, 0.0441 mmol, 1.8當量)及於DMF中之六氟磷酸(1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-***并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物(HATU)之10.1 wt%溶液(154.9 mg, 15.59 mg HATU, 0.0410 mmol, 1.7當量)。將溶液在-5℃下攪拌4小時且然後使用5 wt%碳酸氫鈉水溶液(5.295 g, 4.8 mL，經15分鐘添加)在環境溫度下驟冷。將所得漿液在0℃下攪拌15分鐘，且藉由過濾收集所得固體。使用水(4 × 2 mL)洗滌固體且然後使用MTBE (4 × 2 mL)洗滌。在真空及35℃下乾燥膠狀固體以提供製劑 31 (219.7 mg, 47.6面積%, 0.0164 mmol, 67.1%產率)。
步驟 3 連續合成製程闡述 ： 步驟 3 ： 在10體積DMF中製備製劑 30 之進料溶液。製HATU (1.8當量)於ACN中之第二進料溶液(10 wt.%溶液)。製備N, N-二異丙基乙基胺(2.5當量)於DMF中之第三流(5 wt.%溶液)。將來自步驟2之製劑 29 溶液以及製劑 30 及N, N-二異丙基乙基胺流抽吸至混合器中，且在混合器出口處冷卻流並與經冷卻HATU溶液合併。使混合物抽吸穿過另一混合器，且穿過於-5℃恒溫浴中之栓塞流反應器(滯留時間為3 h)並收集。製備鹽水/碳酸氫鹽之溶液(以重量計，19%鹽載量)。然後將製劑 31 於DMF中之產物溶液與鹽溶液一起抽吸至混合產物混合懸浮液反應器(MSMPR)中以形成沈澱。混合產物混合懸浮液反應器中之tau為1小時。使第二MSMPR在較冷狀態下運行1 h tau且將此漿液間歇性地裝填至過濾器中。使用水洗滌漿液並在真空及35℃下乾燥。
步驟 3 連續合成製程闡述： 步驟 3 ： 在DMF (54.12 kg)中製備製劑 30 (9.42 kg, 83.6 wt.%, 3.72 mol)之進料溶液且產生0.0563 M進料。製備HATU (1.15 kg, 3.02 mol)於ACN (10.4 kg)中之第二進料溶液且產生0.215 M進料。添加呈純淨液體形式之N, N-二異丙基乙基胺。將來自步驟2製劑 29 (98.85 L, 42.24 mg/mL, 4.18 kg, 0.975 mol, 0.0099 M, 1.0當量，40.2 g/min)之溶液以及製劑 30 (1.3當量，9.2 g/min)及N, N-二異丙基乙基胺(2.1當量，0.152 mL/min)流抽吸至混合器中。在混合器出口處，將流冷卻至0℃並與經冷卻HATU溶液(2.0當量，3.2 g/min)在0℃下合併。使混合物抽吸穿過另一混合器並穿過於0℃溫度浴中之栓塞流反應器(滯留時間為4 h)，且經42 h進行收集，從而產生131.8 kg產物溶液。產物溶液沈澱為兩部分。在惰性化反應器中合併17 wt.%NaCl水溶液/ 0.5 wt.% NaHCO3 水溶液(29 kg)與DMF (13.2 kg)並冷卻至不超過20℃。然後將於DMF中之產物溶液(66.6 kg)與17 wt.%NaCl水溶液/ 0.5 wt.% NaHCO3 水溶液(34.4 kg)經1 h共添加至反應器中並維持於20℃，從而沈澱產物(製劑 31 )。將漿液經1 h冷卻至5℃，然後分兩份添加水(總共32.2 kg)。將5℃漿液攪拌0.5 h，然後過濾漿液。將濕濾餅在水(63.9 kg)中再製漿0.5 h並過濾。使第二部分產物溶液以相當方式進行沈澱。在反應器中合併17 wt.% NaCl水溶液/ 0.5 wt.% NaHCO3 水溶液(29 kg)及DMF (13.55 kg)並冷卻至不超過20℃。將於DMF中之第二部分產物溶液(65.2 kg)與17 wt.%NaCl水溶液/ 0.5 wt.% NaHCO3 水溶液(36.8 kg)經1 h共添加至反應器中並維持於20℃，從而沈澱產物(製劑 31 )。將漿液經1.25 h冷卻至5℃，然後分兩份添加水(總共32.1 kg)。將漿液攪拌0.5 h，然後在第一濕濾餅頂部過濾漿液。使用水(各64 kg，各0.5 h)將合併之濕濾餅再製漿兩次並過濾。隨後使用水(各64 kg)進行兩次置換洗滌。使用N2 吹掃合併之經洗滌濕濾餅且然後在真空及38℃下乾燥直至K.F. ＜ 4 wt.%為止，從而產生製劑 31 (10.34 kg，假設60%功效，0.972 mol，假設100%產率)。
實例 3 替則帕肽 (SEQ ID No: 1)
Figure 02_image095
將TFA (2.3 mL)、水(0.1 mL)、三異丙基矽烷(TIPS, 0.1 mL)及二硫蘇糖醇(DTT, 75 mg)之溶液冷卻至0℃。向該溶液中加載製劑 31 (SEQ ID NO:31) (100 mg, 0.015 mmol)且將反應混合物升溫至環境溫度並攪拌2小時。將所得混合物傾倒至甲基第三丁基醚(MTBE, 25 mL)之預冷卻(-20℃)溶液中。將所得沈澱物在-20℃下維持15分鐘且離心漿液，並使用甲基第三丁基醚(2 × 25 mL)洗滌。將固體在真空及35℃下乾燥18小時以獲得白色固體形式之實例 3 (SEQ ID NO:1) (71 mg, 93%產率，C225 H348 N46 O68 之計算HRMS：預期值4810.5249，實際值4810.5036)。
步驟 4 合成製程闡述 ： 在15℃下，向惰性化反應器中添加二氯甲烷(DCM, 27.3 kg, 20.6 L)、水(4.1 kg)、製劑 31 (10.34 kg，假設60%功效，0.972 mol)及二硫蘇糖醇(DTT, 3.10 kg)。在單獨惰性化反應器中添加三氟乙酸(TFA, 154.1 kg, 103.4 L)及三異丙基矽烷(TIPS, 3.2 kg, 4.2 L)。在0.25 h內將TFA/TIPS溶液添加至製劑 31 、DCM、水及DTT之漿液中以形成無色溶液，且升溫並在20℃下保持3 h。在20℃下3 h之後，將反應器冷卻至-10℃。在單獨反應器中添加MTBE (甲基第三丁基醚，382.4 kg, 516.8 L)，冷卻至-20℃。將一部分此冷MTBE (91.8 kg, 124.1 L)經2 h添加至冷反應溶液中並維持於-5℃至-18℃。經1.5 h添加剩餘冷MTBE (294.3 kg, 397.7 L)並維持於-5℃至-18℃，從而沈澱實例 3 。將漿液調節至0℃並保＞ 0.5 h，然後分三份過濾。使用MTBE (114.7 kg, 155 L)將合併之濾餅再製漿兩次並過濾，然後實施最終MTBE置換洗滌(114.7 kg, 155 L)。在28℃下乾燥濕濾餅直至量測到MTBE ＜ 4.5 wt.%為止。此會產生實例 3 (7.77 kg, 46.8 wt.%, 0.755 mol, 77.7%產率)。
實例 4A ( 線性 SPPS) 替則帕肽 (SEQ ID No: 1)
Figure 02_image097
(製劑23係SEQ ID NO:23且製劑24係SEQ ID NO:24。) 將Fmoc Sieber樹脂(17 kg, 0.76 mmol/g)裝填至反應器中。使用DMF溶脹樹脂，攪拌2小時，然後自樹脂過濾掉DMF。然後使用DMF將樹脂洗滌總共兩次。然後使用20% PIP/NMP處理將Fmoc保護樹脂去保護。在最後PIP/NMP處理之後進行採樣以驗證Fmoc去除，從而經由UV分析證實＞99% Fmoc去除(IPC靶為＜1% Fmoc剩餘)。在最終20% w/w PIP/NMP處理之後，使用DMF將樹脂床洗滌多次。然後使用下列一般條件在每一胺基酸偶合及去保護中構建肽主鏈：
製程步驟 溶劑 / 試劑 體積 當量
Fmoc去保護 20% (v/v)六氫吡啶/NMP 9 ml/g樹脂   
去保護後洗滌 DMF 9 ml/g樹脂   
偶合反應溶液 NMP 7.25 ml/g樹脂   
胺基酸    3.0當量
Oxyma Pure    3.0當量
DIC    3.3當量
偶合後洗滌 DMF 9 ml/g樹脂   
ivDde去除 8%肼/DMF 9 ml/g樹脂   
ivDde去除後洗滌 DMF 9 ml/g樹脂   
構建體去溶脹後洗滌 IPA 1.8 mL/g樹脂   
Fmoc 去保護： 使用20% v/v PIP/NMP溶液之三或四個裝料處理肽反應器中之樹脂。在每一處理中攪拌樹脂30 min，隨後過濾以完成Fmoc保護基團去除。在最終20% v/v PIP/NMP處理之後，使用DMF在預定DMF體積載量下洗滌樹脂床最少6次。
胺基酸活化 ： 將12% w/w Oxyma Pure/NMP之預製溶液裝填至反應器中。然後添加所選Fmoc胺基酸。在20 ± 5℃下攪拌混合物直至Fmoc胺基酸已完全溶解為止。然後在活化之前將Fmoc-AA/Oxyma Pure/NMP溶液冷卻至15 ± 3℃以確保控制輕微放熱活化反應且將所得溶液溫度維持於20 ± 5℃之指定範圍內。然後藉由添加DIC來活化胺基酸溶液。然後將活化酯溶液攪拌20-30 min.，隨後將溶液轉移至含有樹脂上肽中間體之反應器中。
偶合 ： 在完成預活化步驟後，將活化酯溶液轉移至含有去保護樹脂上肽之反應器中以引發偶合反應。將肽偶合反應液在20 ± 5℃下攪拌至少4小時。在所需攪拌時間之後，對樹脂漿液進行採樣以完成偶合(IPC)。視需要以特定間隔重複採樣直至通過IPC結果為止。視需要實施再偶合操作。在偶合完成時，過濾肽反應器溶液內容物，然後使用DMF將樹脂上肽中間體洗滌數次以備用於下一偶合。
Ile (12) 與 Aib (13) 之 偶合 ： 使用對稱酐方式利用6當量Fmoc-AA、三當量DIC來偶合Fmoc-Ile(12)與Aib (13)。在此序列中將活化時間延長至40-60 min以確保形成活化對稱酐物質。需要延長之偶合攪拌時間(18 h)以完成反應(＜1%未偶合)，如藉由HPLC分析所測定。
Lys (20) ivDe 去保護 ( 製劑 23) ： 選擇性去保護樹脂Boc-Tyr(1)-Ser(39)肽主鏈上之經完全保護之胺基酸39之Lys(20) ivDde基團。使用8% w/w水合肼/DMF溶液在攪拌及環境溫度下經4 h來達成去保護。藉由HPLC監測去保護反應，其中靶IPC限值為在去保護之後剩餘＜1%之Lys(ivDde)組分。使用DMF重複洗滌(8×)所得肽片段(製劑23)以完全去除殘餘肼。使用IPA將全構建體製劑23片段洗滌4次，然後在≤40℃下乾燥直至達成LOD  ≤1%為止)。在與製劑6偶合之前，包裝製劑23並冷存(-20℃)。
製劑 6 與製劑 23 之偶合 ： 將製劑6 (1.5當量)及PyBOP (1.5當量)固體裝填至反應器中，隨後裝填DMF並攪拌混合物直至發生溶解為止。然後裝填可力丁(Collidine)以引發形成活性酯物質。將活化酯溶液攪拌60 min，然後轉移至含有製劑23中間體之反應器中。將反應漿液在25℃下攪拌18 h。對漿液進行採樣以完成偶合(IPC)且在需要時視需要以特定間隔重複採樣以通過IPC (＜1%製劑23)結果。在偶合完成時，將溶液內容物作為廢物過濾掉。使用DMF洗滌全構建體製劑24中間體多次，然後使用IPA洗滌。在≤40℃下乾燥製劑24直至達成LOD ≤1%為止。在自樹脂裂解之前，包裝製劑24並冷存(-20℃)。
樹脂裂解及實例 4A 粗分離 ： 製備由三氟乙酸(TFA)、三異丙基矽烷(TIPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、DCM及水組成之裂解混合劑。將裂解混合劑冷卻至15 ± 5℃。試劑載量展示於中下表中：
製程步驟 溶劑 / 試劑 體積 (/ 加載經結合樹脂 )
裂解混合劑 TFA 7.16 mL/g
水 0.34 mL/g
TIPS 0.24 mL/g
DTT 0.24 g/g
DCM 0.75 mL/g
淨混合劑電荷 n/a ~8.50 mL/g
用過的樹脂洗滌 DCM 3 mL/g
反溶劑 MTBE 14 g/g
器皿及濾餅洗滌 MTBE 3 g/g
將製劑24裝填至反應器中，隨後裝填裂解混合劑。攪拌混合物並在23℃下維持3 h。過濾混合物，然後使用DCM洗滌用過的樹脂。將DCM洗滌濾液與本體去保護溶液合併並將內容物冷卻至≤ -10℃。將MTBE冷卻至≤ -13℃。然後將冷MTBE分兩份供給至冷濾液中。控制MTBE進料速率以維持粗製溶液內部溫度≤5℃。初始MTBE裝料構成總MTBE裝料之約45%。在MTBE添加接近結束時會形成軟沈澱物，但可輕易地於再溶於溶液中。然後將沈澱溶液再冷卻至內部溫度為-15 ± 5℃。以大約5-10倍於初始MTBE進料速率之速率進行第二MTBE添加且構成總MTBE裝料之55%。在添加期間，將沈澱漿液內部溫度維持於≤ 0℃。將所得漿液在-8 ± 3℃下陳化最少6 h，然後升溫至0 ± 3℃並再陳化2h，隨後分離。
過濾冷粗製肽漿液，然後使用MTBE洗滌所得濕餅。然後將實例4A粗製濕餅乾燥至＜1%之IPC靶LOD值。包裝實例4A粗產物並儲存。冷存(-20℃)粗製中間體直至純化。總而言之，產生45.39 kg粗製實例4A (45 wt%及64%HPLC面積百分比純度)。基於Sieber樹脂之所含產率= 47%。
實例 4A 純化： 反相純化 1 (RP1) ： 將實例4A粗製物溶於90 wt% MPA及10 wt% MPB中。將溶液攪拌至少7 h以完成色胺酸去羧基化。過濾陳化粗製溶液並加載於預平衡Kromasil 100-10-C8填充管柱上。使用A (90%水、0.1% TFA及10% ACN)緩衝液及B (10%水、0.1% TFA及90% ACN)緩衝液之混合物(使兩管柱體積中產生30% ACN)洗滌管柱，且製備藉由將一管柱體積中ACN之混合濃度自30%增加至35%來進行洗脫。使用每管柱體積增加1.5% ACN洗脫出管柱中之替則帕肽直至洗脫完成為止。將洗脫液分級(fractionated)並使用RP-HPLC分析純度。藉由通過一個管柱體積中之ACN從47%增加至65%及藉由持續流入三管柱體積之65% ACN使管柱進行再生。在下一注入序列之前，使用兩管柱體積之30% ACN將管柱再平衡。
彙集符合主流納入之部分。可合併不滿足純度準則但具有大於50%純度之部分以在完成所有主要注入之後用於再循環注入。將再循環部分分離成前側部分及後側部分，使用緩衝液A稀釋並冷存。處理再循環注入液且使用主要注入準則彙集；然而，僅正向處理主峰部分且並不進一步實施再循環。在完成主流彙集後，分析中間體之濃度及純度。在RP2處理之前，稀釋材料並調節pH。RP1製程產生37 kg粗產物，且14277 g含有平均彙集純度為90.9%之產物。
反相純化2 將實例4A RP1溶液加載於預平衡Kromasil 100-10-C8填充管柱上。使用緩衝液C (90% NH4 OAc水溶液(pH 8.0)、10% ACN)及緩衝液D (10% NH4 OAc水溶液(pH 8.0)、90% ACN)之混合物(在兩管柱體積中產生20% ACN溶液)洗滌管柱。使用3.5% ACN增加/管柱自管柱洗脫替則帕肽直完成洗脫至為止。分級洗脫液並使用RP-HPLC分析純度。在洗脫後，藉由通過一個管柱體積中之ACN增加至80%且連續輸入三管柱體積中80% ACN進行管柱再生。在下一注入序列之前，使用20% ACN針對兩管柱體積再平衡管柱。
彙集符合主流納入之部分。可合併不滿足純度準則但具有大於60%純度之部分以在完成所有主要注入之後用於再循環注入。將再循環部分分離成前側彙集物及後側彙集物，使用緩衝液A稀釋並冷存。處理再循環注入液且使用主要注入準則彙集；然而，僅正向處理主峰部分且並不進一步實施再循環。在完成主流彙集後，分析中間體之濃度及純度。可將材料之pH調節至8.0以備用於TFF步驟。始於14.2 kg之RP2製程產生10.9 kg (含有產物，76.7%產率)。
離子交換層析 (IEX) ： 過濾實例4A RP2溶液並加載至Amberchrom CG‑300M管柱中。使用移動相E (10%乙酸銨水溶液，5% IPA, pH8)及移動相F (異丙醇)洗脫兩個部分。分析該等部分之肽含量且棄除 ＜3 mg/mL者。在之前沈澱，將所彙集濃縮部分儲存於-20℃下。IEX製程始於10.9kg RP2且產生14.3 kg (含有具有97.8%彙集純度之實例4A材料)。
純度 ： 過濾實例4A IEX溶液(333 kg)且然後加載異丙醇(850L)以將水含量減小至＜10% w/w水。將經稀釋溶液冷卻至0 ± 3℃以備用於MTBE加載及沈澱。將MTBE 2304 L (1708 kg)冷卻至0 ± 3℃。經由前約37%之MTBE裝料將冷MTBE以約0.69 kg/min速率供給至IEX溶液中。然後將進料速率增加至平均約2.3 kg/min以完成剩餘之約63% MTBE裝料。將進料期間之溫度維持於＜5℃。冷(≤ -10℃)過濾所得沈澱漿液。然後使用MTBE洗滌濾餅。將濾餅乾燥至LOD ＜ 2%。
加濕 4A ： 藉由使濕氮通過過濾過濾器來將實例4A加濕。每60 min監測自過濾器出口離開之氣體流之濕度。繼續加濕直至在濕餅中剩餘＜0.5% MTBE及＜ 0.2% IPA為止。在完成加濕製程之後，將氮流切換為使乾氮流經實例4A純產物濾餅。對材料進行採樣以針對特定IPC目標分析水及殘餘溶劑並繼續使用乾氮乾燥直至滿足期望5-7% w/w之靶水含量為止。總共分離12.9 kg實例4A，其中肽含量為＞ 95%純度。基於Sieber樹脂載量之總產率= 31%。
實例 4B ( 線性 SPPS)
Figure 02_image099
製劑 23 用以產生製劑23之製程係實質上如根據實例4A所陳述，只是在所有偶合及去保護中皆完全使用DMF代替NMP。另外，基於Siber樹脂之胺基酸 : Oxyma :DIC之化學計量減小至2.5:2.5:2.7莫耳當量。與DMF應用相關之唯一例外係Ile 12與Aib 13偶合，其中保留NMP。在此例示中，使製程中之17.6 kg Sieber樹脂與92.2 kg製劑23樹脂上肽中間體偶合。
製劑 24 實質上如根據實例4A所陳述之製程製得92.1 kg製劑23；進一步處理以得到97.3 kg製劑24樹脂上肽中間體。在自樹脂裂解之前，包裝製劑24並冷存(-20℃)。
樹脂裂解及實例 4B 粗分離 ： 以32 kg製劑24規模使用實質上如實例4A中所闡述之條件來運行兩個批次以得到24.4 kg實例4B (69.5% HPLC純度及52.6%產率)及21.3 kg實例4B (88.3% HPLC純度及45.2%產率)。冷存(-20℃)粗製中間體直至純化。
實例 4B 純化 ： 粗製物溶解 ： 將替則帕肽實例4B粗製物裝填至溶解器皿中並溶於1:1乙腈:水溶液中直至最終濃度為25 g固體/L溶液。使用氫氧化銨將所得溶液之pH調節至8.5-9.5以使引發Depsi肽異構體(10-15%)轉化成替則帕肽實例4B。將pH調節混合物攪拌至少一小時以容許發生Depsi轉化。然藉由添三氟乙酸後來將pH調節至1.5-2.5並稀釋至30%乙腈含量以備用於層析。總而言之，將粗製溶液攪拌至少7小時以將Trp CO2 鹽轉化成替則帕肽實例4B。
Depsi 肽至 API 之轉化：
Figure 02_image101
反相純化 1 (RP1) ： 可使用實質上如由實例4A呈現之RP1製程來將Depsi肽轉化成API。RP1純化製程與實例4A中所闡述實質上相同；然而，上述粗製物溶解步驟增強了RP1層析步驟之能力。此使得能夠在每L樹脂載量中獲得較高g替則帕肽且降低在實例4中所闡述條件下純化粗製替則帕肽所需之注入數。在此例示中，23.7 kg經含量校正之粗製實例4B在RP1之後生成25.4 kg實例4B (107%)。在8.72 g/L下之總溶液體積 = 2910L且在收集所有彙集部分後，立即攪拌混合物，採樣並保持至反相純化2 (RP2)。
反相純化 2 (RP2) ： 使用與實例4A中所闡述實質上相同且使用熟習此項技術者已知之方法之純化製程來進行反相純化2 (RP2)。在此例示中，將15.2 kg含有來自RP1之實例4B之產物在RP2之後純化至13.8 kg實例4B (約98%純度)。17.0 g/L下之總溶液體積 = 808 L。在切向流過濾(TFF)之前，儲存混合物。
切向流過濾 (TFF) ： 安置TFF膜並使用水沖洗。使用低內毒素純化水、乙酸及氫氧化銨製備乙酸銨緩衝液。然後加載異丙醇以得到5:95 100mM NH4 OAc (pH 8.0):IPA緩衝液。經由TFF將實例4B之17 g/L RP2溶液濃縮至約125 g/L。再循環RP2溶液以使溶劑滲透穿過膜，而使肽溶液以溶液形式保留於膜之滯留物側。在濃縮之後，將滲濾緩衝液供給至滯留物容納罐中，同時連續收集滲透物。繼續交換緩衝液直至滿足期望溶劑組成及肽濃度為止。自系統排出溶液，且自膜沖洗所得極化層並與肽濃縮液彙集。經由TFF處理兩部分RP2溶液(403.9 L，17 g/L, 9.87 kg API)。
共供給沈澱： 合併TFF部分(138.2 kg, 78.3 g/L)並量測KF (8.9%)以驗證 ＜10%水。將MTBE (243 kg)裝填至單獨器皿中並冷卻至0℃。將IPA (48 kg)、水(6 kg)及MTBE (100 kg)添加至沈澱器皿中並將溶液冷卻至0℃。將TFF及MTBE製程流分別以1.6-1.8 kg/min及2.9 -3.1 kg/min之速率共供給至沈澱器皿中。將所得漿液在0℃下再陳化0.7 hr.，然後升溫至15℃。將漿液在15℃下陳化1 hr，隨後添加MTBE (118 kg)。將漿液在15℃下陳化1 hr且然後冷卻至2.5℃。冷過濾漿液並使用MTBE (573 kg)洗滌濾餅。將濾餅乾燥至LOD ＜2%。
加濕 ： 將實質上如由實例4A所陳述且使用熟習此項技術者已知之方法之加濕應用於實例4B材料。總共分離14.5 kg實例4B (SEQ ID NO:1) (＞97.7% HPLC純度及88.4%肽含量)。基於Sieber樹脂載量之總產率= 46%。
實例5使用收縮流化學連續合成製劑 31 使用分批化學方式以及依序添加片段在管式流動反應器中自肽片段合成製劑31。一般合成方式涉及藉由將兩種溶液以及偶合劑摻和至管式反應器中來偶合兩個片段，然後進行添加鹼，並在管式反應器中滯留額外時間以去除FMOC保護基團。此製得用於添加下一片段之偶合物質。在連續偶合反應之間使用奈米過濾器去除過量試劑、鹼及溶劑，該奈米過濾器具有經定大小以保留肽且滲透較低分子量雜質之膜。在後續偶合步驟之前，使用滲濾完全去除較低分子量雜質。該等轉變之例示之闡述及分析結果包含於下文中。
步驟 3 例示 - 分析結果。 使用HPLC來證實自製劑29及製劑30合成製劑31。該分析方法使用65℃ C4固定相管柱(2.1 mm i.d. × 150 mm × 1.7微米粒度)以及於水及乙腈中之0.1% TFA之60-98% B梯度(經12分鐘)。使用214 nm下之UV檢測來檢測此材料。
表A.5展示針對流動製備之步驟3偶合反應產物(製劑31)收集之高解析度質譜數據。質量準確度可證實期望物質。
化合物 化學式 理論單同位素質量 ( 中性 ) 觀察離子 m/z 電荷狀態 計算單同位素質量 ( 中性 ) 質量準確度 (ppm)
製劑31 C334 H512 N48 O74 6379.7777 1595.9512 4 6379.775694 0.3
表 A.5 經由使用高解析度質譜數據計算之質量準確度來證實所量測製劑31。
實例 6 化學連接製程 替則帕肽
Figure 02_image103
Fmoc- 肼 -CTC 樹脂 ( 製劑 32) 之合成 ： 將2-CTC樹脂(10.7 g ,17.7 mmol )在0℃下於100 mL DCM中溶脹20 min。將肼基甲酸9-茀基甲基酯(15.6 g, 61.4 mmol, 3.5 當量 ) 溶於210 mL 2:1 DMF:DCM中。將N,N-二異丙基乙基胺(31 mL, 178 mmol, 10.1 當量 )添加至肼基甲酸9-茀基甲基酯溶液中。然後將此溶液在0℃下緩慢添加至樹脂中。在0℃下攪拌約一小時並升溫至室溫。將反應混合物在環境溫度下攪拌16小時。然後添加甲醇(10 mL)以將剩餘2-CTC樹脂驟冷並攪拌15 min。使用200 mL DMF、隨後DMF (2 × 100 mL)、水(3 × 100 mL)、DMF (3 × 100 mL)、甲醇(3 × 100 mL)及最後使用DCM (3 × 100 mL)沖洗樹脂。將樹脂在27℃下於真空烘箱中乾燥16小時。藉由定量NMR量測之樹脂載量為0.74 mmol/g 。
Figure 02_image105
肽醯肼 (17 聚體 ) ( 製劑 33 (SEQ ID NO:32)) 之合成 ： 將肼-CTC樹脂(1.01 g , 載量值：0.65 mmol/g )載入40 mL反應器器皿中並使用3 × 4 mL DCM (各30 s)、隨後使用2 × 10 mL DMF (各20 min)在肽合成器上溶脹。將Fmoc-Ile-OH (0.919 g, 2.60 mmol, 4當量)及HBTU (0.99 g, 2.61 mmol, 4當量)溶於7 mL DMF中。將DIPEA (0.91 mL, 5.22 mmol, 8當量)添加至胺基酸溶液中且使用DMF將體積補充至10 mL。將活化胺基酸溶液添加至樹脂中。將漿液與氮混合8小時。在8小時之後，使用5 × 10 mL DMF、5 × 10 mL DCM洗滌樹脂並乾燥12小時。藉由定量NMR量測之所得樹脂之載量為0.54 mmol/g。使用0.91 g此樹脂來合成製劑 33 (SEQ ID NO:32) 。
去保護 ： 4 × 9 mL於DMF中之20% v/v六氫吡啶，各30分鐘。
偶合 ： 使用3 當量胺基酸、 3 當量 OXYMA 及 3.3 當量 DIC 進行胺基酸偶合。
在每一偶合及最後一次去保護之後，使用5 × 9 mL DMF洗滌樹脂並與N2 混合1 min。
在肽醯肼合成結束時，使用DCM洗滌樹脂並與N2 混合。在合成器上乾燥樹脂。
去保護及裂解 ： 將25 mL裂解混合劑(使用5% w/v二硫蘇糖醇(DTT)、2.5% v/v水、2.5% v/v三異丙基矽烷(TIPS)及90%三氟乙酸(TFA)製得)添加至乾燥樹脂(2.37 g)中並在旋轉混合器上混合3小時。過濾樹脂並使用2 × 2.5 mL TFA洗滌。將濾液傾倒至175 mL冷MTBE中且立即沈澱出肽。使用2 × 2.0 mL TFA洗滌過濾燒瓶並傾倒至冷MTBE中。冷卻至-20℃並保持半小時，且然後離心。然後使用150 mL MTBE將肽沈澱物洗滌兩次並離心。將肽沈澱物在27℃下於真空烘箱中乾燥16小時。在乾燥之後獲得1.25 g 粗製製劑 33 (SEQ ID NO:33) 之試樣[預期(質量+2H+ )/2 = 968.4883，觀察(質量+2H+ )/2 = 968.4879]。
Figure 02_image107
藉由標準SPPS方案在Sieber醯胺樹脂上合成約0.62 mmol製劑34。使用Fmoc-Lys(ivDde)-OH實施正交去保護及離胺酸醯基化。
ivDde 去保護 ： 使用DMF將單水合肼 (64% w/w) (1.98 g, 25.3 mmol)稀釋至24.4 g且將20 g添加至樹脂中。在氮流下攪拌漿液。在約兩小時之後，使用5 × 9 mL DMF洗滌。再重複一次洗滌。
將 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5- 第三丁氧基 -4-[(20- 第三丁氧基 -20- 側氧基 - 二十烷醯基 ) 胺基 ]-5- 側氧基 - 戊醯基 ] 胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙醯基 ] 胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙酸 ( 製劑 6) (1094.4 mg, 1.252 mmol, 2當量)溶於10 mL無水DMF中。向其中添加TNTU (506.9 mg, 1.360 mmol, 2.2當量)及N,N-二異丙基乙基胺(0.24 mL, 1.4 mmol, 2.2當量)。使用無水DMF將體積補充至15 mL。在旋轉混合器上混合30 min。然後將製劑6之活化酯添加至樹脂中並在氮流下混合12小時。在12小時之後，將溶液瀝乾且使用5 × 10 mL DMF及7 × 10 mL DCM洗滌樹脂，並與N2 混合1 min。將樹脂在合成器上乾燥8小時。
去保護及裂解 ： 將20 mL裂解混合劑(使用5% w/v二硫蘇糖醇(DTT)、2.5% v/v水、2.5% v/v三異丙基矽烷(TIPS)及90%三氟乙酸(TFA)製得)添加至乾燥樹脂(2.42 g)中並在旋轉混合器上混合3小時。過濾樹脂並使用2 × 2.0 mL TFA洗滌。將濾液傾倒至200 mL冷MTBE中且立即沈澱出肽。使用2 × 2 mL TFA洗滌過濾燒瓶且傾倒至冷MTBE中。冷卻至-20℃並保持30 min，且然後離心。使用240 mL MTBE將肽沈澱物洗滌兩次並離心。將肽沈澱物在27℃下於真空烘箱中乾燥14小時。在乾燥之後獲得1.853 g 粗製製劑34。藉由RP-HPLC (在Kromasil 100-10-C8 10 µm管柱(30 mm × 250 mm)上，於環境溫度下，在前5 min內使用於水中之15%乙腈，然後在25 min內於水中之30-55%乙腈之線性梯度，且然後在30 min內恆定0.1% TFA)進行純化。獲得1.28 g 純化製劑34 (SEQ ID NO:33) [預期(質量+2H+ )/2 = 1470.7929，觀察(質量+2H+ )/2 = 1470.7885]。
硫基酯合成 ( 製劑 33 (SEQ ID NO:32) 至製劑 35 (SEQ ID NO:34) 之轉化 ) ： 將粗製肽醯肼(製劑 33 (SEQ ID NO:32) , 2.422 g, 1.251 mmol)溶於50 mL連接緩衝液(6 M胍鹽酸鹽及0.2 M磷酸二氫鈉，pH 3.35)中並在丙酮-冰浴中冷卻至-15℃。將9.4 mL 1 M亞硝酸鈉溶液(9.4 mmol, 7.5當量)添加至肽醯肼溶液中並在-15℃下攪拌20 min。同時，使用連接緩衝液(6 M胍鹽酸鹽及0.2 M磷酸二氫鈉，pH 7.0)將1 mL 2,2,2-三氟乙烷硫醇(TFET)補充至10 mL。在20 min之後，將10 mL TFET混合物添加至肽醯肼溶液中以原位硫解自製劑 33 生成之疊氮化肽。
Figure 02_image109
使用5 N氫氧化鈉溶液將反應混合物之pH調節至約6.95。使疊氮化肽硫解45 min且使用連接緩衝液(pH 7.0)將體積補充至100 mL。藉由RP-HPLC (在Waters X-Bridge C18 10 µm管柱(10 mm × 250 mm)上，於環境溫度下，對於28 min純化而言，在前2.8 min內使用於水中之10%乙腈，然後在25 min內於水中之25-42%乙腈之線性梯度，且然後使用恆定0.1% TFA)純化粗製硫基酯混合物。此產生1.03 g TFET硫基酯(製劑 35 (SEQ ID NO:34) ) [預期(質量+2H+ )/2 = 1010.4650，觀察(質量+2H+ )/2 = 1010.4620]。
天然化學連接： 6 M胍鹽酸鹽及0.3 M磷酸二氫鈉(pH 7.0)水溶液係用於天然化學連接之連接緩衝液。所有溶液皆係在此連接緩衝液中製得。將350.4 mg (0.174 mmol)肽硫基酯製劑 35 (SEQ ID NO:34)溶於50 mL連接緩衝液中。將8.0 mL部分之0.5 M 4-巰基苯基乙酸(MPAA)溶液添加至肽硫基酯溶液中。將含有N-末端半胱胺酸之肽(製劑 34 (SEQ ID NO:33) , 524.6 mg, 0.178 mmol, 1.03當量)溶於50 mL離心管中之48 mL連接緩衝液中。將製劑 34 之溶液添加至硫基酯溶液中。使用2 × 8 mL連接緩衝液(約pH 7.0)沖洗管並添加至反應混合物中。使用5 N NaOH溶液將反應混合物之pH調節至約7。將8.0 mL部分之參(2-羧基乙基)膦(TCEP, 0.5 M,  pH 7.0)添加至反應混合物中且使用0.2 mL 5 N氫氧化鈉溶液將pH再次調節至7.0。將反應液在室溫下攪拌24小時且然後儲存於冷凍器中。添加額外之3 mL 0.5 M TCEP溶液，然後純化。藉由RP-HPLC (在Kromasil C18 10 µm管柱(10 mm × 250 mm)，於環境溫度下，在28 min純化期間，在前4 min內使用於水中之10%乙腈，然後在23 min內使用於水中之20-50%乙腈(0.1%乙酸並滴定至pH 9.0)之線性梯度)純化製劑 36 (SEQ ID NO:35) 。在純化之後獲得約372 mg (44.3%)替則帕肽半胱胺酸類似物製劑 36 [預期(質量+3H+ )/3 = 1615.17263，觀察(質量+3H+ )/3 =1615.1686]。
Figure 02_image111
去硫 ： 6 M胍鹽酸鹽及0.3 M磷酸二氫鈉(pH 7.0)之水溶液係用於去硫之緩衝液。所有溶液皆係在此緩衝液中製得。將2,2'-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(製劑 37 , 808.2 mg, 2.5 mmol)溶於10 mL緩衝液中且使用5 N NaOH將pH調節至約7.0。使用緩衝液將體積補充至15 mL。將替則帕肽半胱胺酸類似物製劑 36 (105.2 mg, 0.022 mmol)溶於30 mL緩衝液中且向其中添加6 mL製劑 37 溶液。向其中添加5 mL 0.3 M還原型L-麩胱甘肽溶液(L-GSH, pH 7.0)及7.5 mL 0.5 M TCEP溶液(pH 7.0)。將溶液在44℃下加熱4.5小時，藉此藉由UPLC分析發現反應已完成[預期(質量+3H+ )/3 = 1604.5153，觀察(質量+3H+ )/3 = 1604.5122]。藉由UPLC使用替則帕肽(SEQ ID NO:1)參考標準來計算去硫產率。據估計，產率為47%。
Figure 02_image113
天然化學連接 ( 方式 2) ： 肽醯肼製劑 39 (SEQ ID NO:36) 之合成 ：
Figure 02_image115
將肼-CTC樹脂(2.03 g, 1.32 mmol，載量值：0.65 mmol/g )載入40 mL反應器器皿中並使用3 × 10 mL DCM (各30 s)、隨後使用2 × 10 mL DMF (各20 min)在Symphony合成器上溶脹。將HBTU (1.48 g, 3.90 mmol, 3.0當量)溶於13.1 mL (25S,52S)-52-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-25-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,23,28,37,46-五側氧基-3,32,35,41,44-五氧雜-24,29,38,47-四氮雜五十三烷-53-酸(製劑 17 , 365 mg/mL於DMF中)溶液(3.91 mmol, 3.0當量)中。將DIPEA (1.4 mL, 8.04 mmol, 6.1當量)添加至上述溶液中且使用DMF將體積補充至19 mL。將溶液在室溫下於旋轉混合器上混合30 min。將製劑 17 之活化酯溶液添加至樹脂中。將漿液與氮混合8小時。在8小時之後，使用5 × 10 mL DMF、5 × 10 mL DCM洗滌樹脂並乾燥12小時。藉由定量NMR量測之所得樹脂之載量為0.26 mmol/g。使用1.82 g此樹脂來合成肽醯肼製劑 39 (SEQ ID NO:36) 。
去保護 ： 4 × 9 mL於DMF中之20% v/v六氫吡啶，各30分鐘。
偶合 ： 使用3 當量胺基酸、 3 當量 OXYMA 及 3.3 當量 DIC 進行胺基酸偶合。
在每一偶合及最後一次去保護之後，使用5 × 9 mL DMF洗滌樹脂並與N2 混合1 min。在肽醯肼合成結束時，使用7 × 10 mL DCM洗滌樹脂並與N2 混合1 min。然後將樹脂在合成器上乾燥約12小時。
去保護及裂解 ： 將25 mL裂解混合劑(使用5% w/v二硫蘇糖醇(DTT)、2.5% v/v水、2.5% v/v三異丙基矽烷(TIPS)及90%三氟乙酸(TFA)製得)添加至乾燥樹脂中並在旋轉混合器上混合。過濾樹脂，使用TFA (2 × 2.5 mL)洗滌，且將濾液傾倒至175 mL冷MTBE中。使用TFA (2 × 2.5 mL)洗滌過濾燒瓶並將洗滌液傾倒至冷MTBE中。冷卻至-20℃並保持30 min，且然後離心。然後使用150 mL MTBE將肽沈澱物洗滌兩次並離心。將肽沈澱物在27℃下於真空烘箱中乾燥16小時。在乾燥之後獲得1.70 g 粗製肽醯肼製劑 39 (SEQ ID NO:36) 。藉由RP-HPLC (在Waters XSelectCSH C18 10 µm管柱(10 mm × 250 mm)上，於環境溫度下，對於28 min純化而言，在前3 min內使用於水中之10%乙腈，然後在23 min內使用於水中之20-55%乙腈之線性梯度，且然後使用恆定0.1% TFA)純化粗製肽醯肼製劑39。獲得約110 mg部分純化之醯肼製劑 39 (SEQ ID NO:36) 。
Figure 02_image117
藉由標準SPPS方案在Sieber醯胺樹脂上來合成約0.62 mmol製劑40 (SEQ ID NO: 37)。
去保護及裂解 ： 將25 mL裂解混合劑(使用5% w/v二硫蘇糖醇(DTT)、2.5% v/v水、2.5% v/v三異丙基矽烷(TIPS)及90%三氟乙酸(TFA)製得)添加至乾燥樹脂(2.92 g)中並在旋轉混合器上混合。過濾樹脂並使用2 × 2.5 mL TFA洗滌。將濾液傾倒至200 mL冷MTBE中且立即沈澱出肽。然後使用2 × 2 mL TFA洗滌過濾燒瓶且將洗滌液傾倒至冷MTBE中。冷卻至-20℃並保持30 min，且然後離心。然後使用240 mL MTBE將肽沈澱物洗滌兩次並離心。然後將肽沈澱物在27℃下於真空烘箱中乾燥16小時。獲得約1.7 g 粗製19聚體製劑 40 (SEQ ID NO:37) 。
天然化學連接 ： 6 M胍鹽酸鹽及0.3 M磷酸二氫鈉(pH 7.0)水溶液係用於天然化學連接之連接緩衝液。所有溶液皆係在此連接緩衝液中製得。將部分純化之肽醯肼 (製劑 39 , 56 mg, 0.019 mmol)溶於5 mL連接緩衝液(6 M胍鹽酸鹽及0.3 M磷酸二氫鈉，pH 3.35)中並在丙酮-冰浴中冷卻至-15℃。將0.25 mL 1 M亞硝酸鈉溶液(0.25 mmol, 13.2當量)添加至肽醯肼溶液中並在-15℃下攪拌10 min。在10 min之後，將0.8 mL 0.5 M 4-巰基苯基乙酸(MPAA)溶液添加至肽醯肼溶液中以原位硫解自製劑 39 生成之疊氮化肽。使用5 N氫氧化鈉溶液將反應混合物之pH調節至約7.0。使疊氮化肽硫解30 min。
Figure 02_image119
將含有N-末端半胱胺酸之製劑 40 (SEQ ID NO:37) (26.1 mg, 0.014 mmol, 0.74當量)溶於1 mL連接緩衝液中。將製劑 40 之溶液添加至硫基酯溶液中。使用1 mL連接緩衝液(pH 7.0)沖洗含有製劑 40 之小瓶並添加至反應混合物中。在15 min之後，將1.0 mL參(2-羧基乙基)膦(TCEP, 0.5 M, pH 7.0)添加至反應混合物中且使用5 N氫氧化鈉溶液將pH調節至7.0。將反應液在室溫下攪拌一小時。在反應混合物中觀察到替則帕肽半胱胺酸類似物製劑 42 (SEQ ID NO:39) 。
Figure 02_image121
序列 SEQ ID NO: 1 替則帕肽 YX1 EGTFTSDYSIX2 LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS 其中X1 係Aib；X2 係Aib；經由利用(2-[2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基)2 -(γGlu)1 -CO-(CH2 )18 -CO2 H偶聯至K側鏈之ε-胺基來以化學方式修飾位置20之K；且將C-末端胺基酸醯胺化為C-末端一級醯胺 SEQ ID NO: 2
Figure 02_image123
(製劑1) SEQ ID NO: 3
Figure 02_image125
(製劑2) SEQ ID NO: 4
Figure 02_image127
(製劑4) SEQ ID NO: 5
Figure 02_image129
(製劑3) SEQ ID NO: 6
Figure 02_image131
(製劑5) SEQ ID NO: 7
Figure 02_image133
(製劑7) SEQ ID NO: 8
Figure 02_image135
(製劑8) SEQ ID NO: 9
Figure 02_image137
(製劑9) SEQ ID NO: 10
Figure 02_image139
(製劑10) SEQ ID NO: 11
Figure 02_image141
(製劑11) SEQ ID NO: 12
Figure 02_image143
(製劑12) SEQ ID NO: 13
Figure 02_image145
(製劑13) SEQ ID NO: 14
Figure 02_image147
(製劑14) SEQ ID NO: 15
Figure 02_image149
(製劑15) SEQ ID NO: 16
Figure 02_image151
(製劑16) SEQ ID NO: 17
Figure 02_image153
(製劑18) SEQ ID NO: 18
Figure 02_image155
(製劑19A) SEQ ID NO: 19
Figure 02_image157
(製劑19B) SEQ ID NO: 20
Figure 02_image159
(製劑20) SEQ ID NO: 21
Figure 02_image161
(製劑21) SEQ ID NO: 22
Figure 02_image163
(製劑22) SEQ ID NO: 23
Figure 02_image165
(製劑23) SEQ ID NO: 24
Figure 02_image167
(製劑24) SEQ ID NO: 25
Figure 02_image169
(製劑25) SEQ ID NO: 26
Figure 02_image171
(製劑26) SEQ ID NO: 27
Figure 02_image173
(製劑27) SEQ ID NO: 28
Figure 02_image175
(製劑28) SEQ ID NO: 29
Figure 02_image177
(製劑29) SEQ ID NO: 30
Figure 02_image179
(製劑30) SEQ ID NO: 31
Figure 02_image181
(製劑31) SEQ ID NO: 32
Figure 02_image183
(製劑33) SEQ ID NO: 33
Figure 02_image185
(製劑34) SEQ ID NO: 34
Figure 02_image187
(製劑35) SEQ ID NO: 35
Figure 02_image189
(製劑36) SEQ ID NO: 36
Figure 02_image191
(製劑39) SEQ ID NO: 37
Figure 02_image193
(製劑40) SEQ ID NO: 38
Figure 02_image195
(製劑41) SEQ ID NO: 39
Figure 02_image197
(製劑42)
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 109102657-A0101-11-0001-1

Claims (22)

  1. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image199
    (製劑18；SEQ ID NO:17)或其醫藥上可接受之鹽。
  2. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image201
    (製劑11；SEQ ID NO:11)或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image203
    (製劑22；SEQ ID NO:22)或其醫藥上可接受之鹽。
  4. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image205
    (製劑21；SEQ ID NO:21)或其醫藥上可接受之鹽。
  5. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image207
    (製劑20；SEQ ID NO:20)或其醫藥上可接受之鹽。
  6. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image209
    (製劑17)或其醫藥上可接受之鹽。　
  7. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image211
    (製劑1；SEQ ID NO:2)或其醫藥上可接受之鹽。
  8. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image213
    (製劑6)或其醫藥上可接受之鹽。　
  9. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image215
    (製劑3；SEQ ID NO:4)或其醫藥上可接受之鹽。
  10. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image217
    (製劑7)或其醫藥上可接受之鹽。　
  11. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image219
    (製劑14)或其醫藥上可接受之鹽。　
  12. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image221
    (製劑34)或其醫藥上可接受之鹽。　
  13. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image223
    (製劑33)或其醫藥上可接受之鹽。　
  14. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image225
    (製劑35)或其醫藥上可接受之鹽。　
  15. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image227
    (製劑36)或其醫藥上可接受之鹽。　
  16. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image229
    (製劑39)或其醫藥上可接受之鹽。　
  17. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image231
    (製劑41)或其醫藥上可接受之鹽。　
  18. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image233
    (製劑42)或其醫藥上可接受之鹽。　
  19. 一種方法，其中替則帕肽(tirzepatide)係使用奈米過濾進行純化。
  20. 一種製備替則帕肽之方法，其包括使如請求項3之化合物或其醫藥上可接受之鹽(製劑22)去保護。
  21. 如請求項20之方法，其中去保護溶液包括二硫蘇糖醇、三異丙基矽烷及三氟乙酸。
  22. 一種選擇性醯化肽中之離胺酸胺基酸之方法，其包括使經結合樹脂之肽-離胺酸-NH2 與第三丁基-二十烷二醯基-Glu-(O-第三丁基)-(8-胺基-3,6-二氧雜辛酸)-(8-胺基-3,6-二氧雜辛酸)-OH (製劑6)偶合。
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