TW201305188A - 萃取胜肽之方法及其於液相胜肽合成之應用 - Google Patents

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Didier Monnaie
Luciano Forni
Mathieu Giraud
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Lonza Ag
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本發明係關於一種自由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中萃取胜肽之方法,該反應混合物含有該胜肽及選自由N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺及N-甲基-2-吡咯啶酮組成之群的極性非質子性溶劑,其中該方法包含步驟a)及步驟b):步驟a)包含向該反應混合物中添加組分a1)及組分a2),其中:組分a1)為甲苯;且組分a2)為水;以至於獲得具有有機層及水層之兩相系統;步驟b)包含隨後分離含有該胜肽之該有機層與該水層。在本發明之一個尤其較佳的具體實例中,對該萃取方法使用甲苯與選自由正庚烷、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙腈及四氫呋喃組成之群的有機溶劑1之組合。該萃取步驟較佳用於在液相中製備胜肽之方法中。

Description

萃取胜肽之方法及其於液相胜肽合成之應用
本發明係關於一種自由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中萃取胜肽之方法。此方法較佳用於液相胜肽合成(LPPS)方法中。自反應混合物中萃取胜肽之方法亦可用於其他類型之胜肽合成中,例如用於由固相胜肽合成(SPPS)所製備之合成胜肽的裂解後分離。此方法亦適用於混合型固相-液相胜肽合成。此外,該萃取胜肽之方法可用於自諸如酵母或細菌之天然來源分離胜肽,尤其用於分離重組表現之胜肽。
本發明之背景
在本申請案之正文中,若未另外陳述,則根據「Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides」,Pure & Appl.Chem.1984,第56卷,第5期,第595-624頁使用胺基酸及胜肽之命名。
若未另外陳述,則以下縮寫具有以下清單中所提供之含義:
萃取胜肽之方法一般用於各種類型之胜肽合成,諸如液相胜肽合成(LPPS)、固相胜肽合成(SPPS)以及混合型固相-液相胜肽合成。
LPPS尤其常用於胜肽之工業大規模製備。LPPS典型地涉及使兩種部分受保護之胺基酸或胜肽偶合,其中一者攜帶未受保護之C末端羧酸基,而另一者攜帶未受保護之N末端胺基。在完成偶合步驟之後,所得胜肽之N末端胺基或者C末端羧酸基可藉由特異性裂解其保護基(PG)之一而脫除保護基,以便可進行後續偶合步驟。LPPS通常以整體脫除保護基之步驟來結束,在該步驟中移除所有剩餘PG。
在LPPS期間對胜肽,尤其攜帶未受保護之C末端羧酸基及/或未受保護之N末端胺基之胜肽的處置往往因為胜肽在普通有機溶劑中之不良溶解度而受影響。一般而言,胜 肽在普通有機溶劑中之溶解度隨胜肽鏈之長度而降低。
二氯甲烷(DCM)通常在LPPS中用作適合反應溶劑。DCM具有良好溶劑性質、低沸點,且其與水之有限混溶性允許藉由用水溶液萃取來處理反應混合物。然而,按工業規模使用DCM由於環境原因而成問題,且一般由於其高密度而受限制,此使得用水溶液萃取DCM層耗時又費錢。
此外,一些最近開發且高度有效之偶合試劑,諸如六氟磷酸苯并***-1-基氧基-參(吡咯啶基)-鏻(PyBOP)及四氟硼酸O-(苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲(TBTU),在DCM中之溶解性不良。此等偶合試劑尤其有利於偶合兩個較大胜肽片段,據悉其在使用其他偶合試劑時產率較低。
此外,許多胜肽僅在中性及鹼性條件下在DCM中展現不良溶解度,且僅足以溶於極性非質子性溶劑中,諸如N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺(DMA)或N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)。因此,此等極性非質子性溶劑慣常單獨或呈與較低極性之溶劑(諸如四氫呋喃(THF))的混合物形式用作LPPS中之反應溶劑。
另一方面,對LPPS使用極性非質子性溶劑存在許多缺點。因為極性非質子性溶劑具有高沸點,因此難以藉由蒸發來濃縮反應混合物。此外,不可能藉由用水溶液萃取來直接處理反應混合物,因為極性非質子性溶劑可與水混溶。
當按工業規模進行LPPS時,通常藉由在各偶合步驟之後自反應混合物中直接沈澱來分離中間物胜肽,以便可分離雜質,諸如未反應之起始物質、副產物以及過量偶合試 劑及鹼等。在完成胜肽偶合反應之後,典型地將反應混合物傾入反溶劑(諸如***或水)中,藉此發生胜肽沈澱析出現象。不幸的是,已獲悉將反應混合物轉移至反溶劑中會引發凝膠形成問題。
此外,極性非質子性溶劑通常干擾胜肽沈澱過程,以至於所獲得之沈澱胜肽呈黏稠膠狀固體形式,其難以過濾且難以乾燥。在有些情況下,不可能過濾沈澱胜肽或甚至不可能將沈澱胜肽轉移至過濾器上。特定言之,按工業規模進行之胜肽沈澱通常難以進行且極其耗時,其中過濾時間決定前置時間(lead time)。此問題可藉由在沈澱過程中增加反溶劑:極性非質子性溶劑之體積比來部分克服,以至於實際上需要大量適合反溶劑來獲得呈可過濾形式之沈澱胜肽。
此外,已知沈澱胜肽中所存在之極性非質子性溶劑殘餘物干擾後續脫除保護基之步驟,該步驟涉及三氟乙酸(TFA)。因此,在可使酸可裂解型PG(諸如第三丁氧基羰基(Boc)、三苯甲基(Trt)、第三丁基(tBu)及第三丁氧基(OtBu))裂解之前,必需另一藉由用更具揮發性之溶劑洗滌沈澱胜肽來移除極性非質子性溶劑殘餘物之步驟。
WO 2005/081711係有關藥物-連接子-配位體結合物及藥物-連接子化合物以及使用其治療癌症、自體免疫疾病或傳染病之方法。該文獻尤其揭示製備基於胜肽之藥物的方法以及使用乙酸乙酯、二氯甲烷及tBuOH/CHCl3混合物萃 取胜肽之方法。
US 5,869,454係有關精胺酸酮醯胺酶抑制劑。該文獻尤其揭示此等抑制劑之合成及用乙酸乙酯萃取。
US 2005/0165215係關於合成胜肽之方法及在合成過程中分離胜肽之方法。該文獻進一步關於大規模合成胜肽之改良。該文獻提出,適用於胜肽萃取之溶劑包括鹵化有機溶劑,諸如二氯丙烷、二氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氟氯碳化物、氯氟烴及其混合物。較佳溶劑為二氯甲烷。
C.H.Schneider等人(Int.J.Peptide Protein Res.1980,15,第411至419頁)描述一種基於用於純化中間物之液-液萃取(雙相法)在溶液中合成胜肽之程序。該等胜肽萃取採用二氯甲烷作為溶劑。
J.W.van Nispen(Pure and Appl.Chem.1987,第59卷,第3期,第331-344頁)提供關於(聚)胜肽之合成及分析的概述。該文獻教示,為了發現胜肽組分之最佳分離法,有可能嘗試具有廣泛不同的性質之溶劑的許多組合。為此目的,通常採用所謂Craig機器,其中在乘法分佈時,下層相保持其位置,而上層相則可移動。
US 2010/0184952揭示一種自藉由經Fmoc基團保護之胺基酸化合物與胺反應所獲得之反應混合物中移除二苯富烯及/或二苯富烯胺加合物以脫除保護基的方法,該方法包含攪拌該反應混合物且使其分配在碳數為5或5以上之烴溶劑與不可與該烴溶劑混溶之極性有機溶劑(不包括有機醯胺溶劑)之間,且移除烴溶劑層,其中二苯富烯及/或二 苯富烯胺加合物係溶解於該烴溶劑層中。在此方法期間,將胺基酸酯或胜肽轉移至極性有機溶劑中。該等極性有機溶劑之實例包括乙腈、甲醇、丙酮及其類似物及其混合溶劑,較佳為乙腈及甲醇。
L.A.Carpino等人(Organic Process Research & Development 2003,7,第28-37頁)描述一種快速連續的溶液相胜肽合成。據顯示,在參(2-胺基乙基)胺存在下脫除胜肽片段之Fmoc及Bsmoc保護基的方法適用於以公克規模快速連續地在溶液中合成短胜肽以及合成相對較長(22聚體)之片段(hPTH 13-34)。在後一情況下,據報導,粗產物與經由固相方案獲得之樣品相比具有顯著更大的純度。藉由一項新技術優化Bsmoc方法,該技術涉及在各偶合脫除保護基週期中經由短矽膠柱過濾逐漸部分脫除保護基之胜肽。
然而,由L.A.Carpino等人所述之方法具有若干限制性。此方法採用DCM作為反應溶劑且因此,無法應用於製備在DCM中顯示不良溶解度之胜肽。此外,其採用大量高成本的參(2-胺基乙基)胺(TAEA),此進一步限制此方法工業規模化之適用性。
因此,強烈需要一種用於製備胜肽(尤其按工業規模製備胜肽)之具時間及成本效益的合成方法。該方法必須克服由在LPPS期間使用DCM及極性非質子性溶劑(諸如DMF、DMA及NMP)所產生之缺點。
本發明之作者意外發現大量結構不同之胜肽在較佳與選自由正庚烷、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙腈或四氫呋喃組成之群(此群組稱為有機溶劑1)的有機溶劑組合之甲苯中具有極佳溶解度。尤其是,胜肽在甲苯與有機溶劑1之組合中的溶解度一般高於在純甲苯中之溶解度。此外,其發現常用極性非質子性溶劑在很大程度上分配於包含水及甲苯或甲苯與有機溶劑1之組合的兩相系統中的水層中。
因此,水及純甲苯或甲苯與有機溶劑1之組合非常適用於自含有極性非質子性溶劑之混合物中萃取胜肽。在本發明具體實例之一中,將含有胜肽之所得有機層部分蒸發,且在添加適合反溶劑(此溶劑群組稱為有機溶劑2)後使其中所溶解之胜肽沈澱。因為在胜肽沈澱過程中實質上不存在極性非質子性溶劑,因此可容易地過濾所得胜肽。藉由應用本發明之萃取方法,可顯著減少胜肽過濾所需之時間。因此,藉由應用此種萃取方法,可成功克服在LPPS期間使用極性非質子性溶劑所致之缺點。
本發明係關於一種自由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中萃取胜肽之方法,該反應混合物含有該胜肽及選自由N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺及N-甲基-2-吡咯啶酮組成之群的極性非質子性溶劑,其中該方法包含步驟a)及步驟b):步驟a)包含向該反應混合物中添加組分a1)及組分a2),其中: 組分a1)為甲苯;組分a2)為水;以至於獲得具有有機層及水層之兩相系統;步驟b)包含分離含有該胜肽之有機層與水層,其中:步驟a)中所獲得之該兩相系統的特徵在於以下體積比:極性非質子性溶劑:甲苯=1:20至1:2;且極性非質子性溶劑:水=1:20至1:2。
本發明之較佳具體實例之一係關於一種自由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中萃取胜肽之方法,該反應混合物含有該胜肽及選自由N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺及N-甲基-2-吡咯啶酮組成之群的極性非質子性溶劑,其中該方法包含步驟a)及步驟b):步驟a)包含添加組分a1)、組分a2)及組分a3),其中:組分a1)為甲苯;組分a2)為水;組分a3)為有機溶劑1,該有機溶劑1係選自由正庚烷、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙腈及四氫呋喃組成之群;以至於獲得具有有機層及水層之兩相系統;步驟b)包含分離含有該胜肽之有機層與水層,其中:步驟a)中所獲得之該兩相系統的特徵在於以下體積比: 極性非質子性溶劑:甲苯=1:20至1:2;極性非質子性溶劑:有機溶劑1=1:5至30:1;極性非質子性溶劑:水=1:20至1:2;且甲苯:有機溶劑1=50:1至1:1。
在一個較佳具體實例中,步驟a)中所獲得之該兩相系統的特徵在於以下體積比:極性非質子性溶劑:甲苯=1:6至1:3;極性非質子性溶劑:有機溶劑1=1:1至4:1;極性非質子性溶劑:水=1:5至1:3;且甲苯:有機溶劑1=10:1至2:1。
在一個尤其較佳的具體實例中,極性非質子性溶劑為N,N-二甲基甲醯胺或N-甲基-2-吡咯啶酮。
在本發明之又一具體實例中,兩相系統中不存在有機溶劑1。
在本發明之較佳具體實例之一中,萃取胜肽而不是使其沈澱。作為替代,使胜肽之一個或若干個保護基裂解,且萃取所產生之部分未受保護之胜肽,且將包含該胜肽之有機層用於後續胜肽偶合反應。因此,本發明提供一種用於連續LPPS之有效合成方法,該方法適合於按工業規模製備胜肽。
本發明之連續LPPS非常適用於在使用Boc、Fmoc及Bzl作為保護基時之胜肽合成,正如下文之實施例所說明。
萃取方法
本發明係關於一種自由胜肽偶合反應所產生之反應混 合物中萃取胜肽之方法,該反應混合物含有該胜肽及極性非質子性溶劑,其中該方法包含步驟a)及步驟b):步驟a)包含向該反應混合物中添加組分a1)及組分a2),其中:組分a1)為甲苯;組分a2)為水;以至於獲得具有有機層及水層之兩相系統;步驟b)包含隨後分離含有該胜肽之有機層與水層。
本發明之較佳具體實例之一係關於一種自由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中萃取胜肽之方法,該反應混合物含有該胜肽及選自由DMF、DMA及NMP組成之群的極性非質子性溶劑,其中該方法包含步驟a)及步驟b):步驟a)包含添加組分a1)、組分a2)及組分a3),其中:組分a1)為甲苯;組分a2)為水;組分a3)為有機溶劑1,該有機溶劑1係選自由正庚烷、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙腈及四氫呋喃組成之群;以至於獲得具有有機層及水層之兩相系統;步驟b)包含分離含有該胜肽之有機層與水層。
視情況將組分a1)、組分a2)及組分a3)彼此混合,其中此步驟可以任何順序進行。三種組分亦可以兩種組分或所有組分之預混合混合物形式添加,只要在萃取過程中 不發生胜肽沈澱即可。
含有極性非質子性溶劑之混合物較佳為由胜肽偶合反應所產生之粗反應混合物。此混合物較佳不含可充當界面活性劑且在萃取過程中干擾相分離的任何化合物。在一個尤其較佳的具體實例中,該混合物不含先前技術中已知的任何界面活性劑,諸如陽離子型表面活性劑及非離子型表面活性劑。
向含有胜肽及極性非質子性溶劑之混合物中添加組分a1)、組分a2)及組分a3)可以任何順序進行,只要在萃取過程中不發生胜肽沈澱即可。舉例而言,可能組合含有胜肽及極性非質子性溶劑之混合物與甲苯,向其中添加水,且最後添加有機溶劑1。亦可能將含有胜肽及極性非質子性溶劑之混合物轉移至水及甲苯中,然後向其中添加有機溶劑1。
在本發明之尤其較佳的具體實例中,將含有胜肽及極性非質子性溶劑之混合物與甲苯及有機溶劑1組合,其中可以任何順序添加甲苯及有機溶劑1。隨後向其中添加水。
應瞭解,所添加之水(組分a2))可含有溶解之組分,諸如鹽,例如無機鹽。
較佳的是用力攪拌所獲得之兩相系統。可使用技術現狀下已知且常用於萃取之混合設備來進行攪拌所獲得之兩相系統的過程。舉例而言,在分批萃取的情況下,可採用噴射型或攪拌器型混合器來攪拌兩相系統。
適合萃取設備之選擇主要視所進行之萃取方法的規模 以及萃取溫度而定。可藉由使用分批萃取或連續萃取來進行萃取過程。需要時亦可重複萃取過程若干次,以至於達成對胜肽之最佳萃取。
在進行攪拌過程之後,較佳允許進行相分離,其中形成兩個液體層:有機層及水層。有機層與水層相比具有低密度。可使用沈降槽或利用離心來實現相分離。相分離所需之時間視所進行之萃取方法之規模及所用設備而定。相分離較佳需要不到1小時,更佳為不到10分鐘,尤其較佳為不到1分鐘。
在進行相分離之後,胜肽主要位於有機層中,有機層另外含有甲苯及視情況存在之有機溶劑1。將含有胜肽之上層有機層與水層分離。在萃取過程之後,超過90重量%之胜肽位於有機層中,且少於10重量%之胜肽位於水層中為較佳。在萃取過程之後,超過98重量%之胜肽位於有機層中,且少於2重量%之胜肽位於水層中為甚至更佳。在萃取過程之後,超過99重量%之胜肽位於有機層中,且少於1重量%之胜肽位於水層中為尤其較佳。
本發明之萃取方法允許自由胜肽偶合反應所產生之粗反應混合物中有效萃取胜肽。極性非質子性溶劑在有機層中之溶解度顯著低於在水層中之溶解度。因此,在萃取之後,含有胜肽之有機層僅另外含有低量極性非質子性溶劑。
在萃取過程之後,少於15體積%極性非質子性溶劑位於有機層中,且超過85體積%極性非質子性溶劑位於水層中為較佳。然而,在萃取過程之後,少於5體積%極性非質 子性溶劑位於有機層中且超過95體積%極性非質子性溶劑位於水層中為更佳。在萃取過程之後,少於2體積%極性非質子性溶劑位於有機層中且超過98體積%極性非質子性溶劑位於水層中為尤其較佳。此可能需要重複萃取。
重要的是,根據本發明之萃取方法不僅允許使胜肽與很大一部分的極性非質子性溶劑分離,而且可與起源於偶合試劑(脲類、四氟硼酸鹽等)之鹽及副產物分離。若在添加疏水性反溶劑(諸如正庚烷或***)後自由胜肽偶合反應所產生之粗反應混合物中直接沈澱,則通常無法移除此等鹽及副產物。然而,已知此等鹽及副產物會降低用於胜肽下游處理之層析管柱的容量。若所製備之胜肽用作活性醫藥成分,則有必要藉由管柱層析法進行此額外純化。
因此,在有需要時,隨後可藉由管柱層析法來純化沈澱胜肽。在胜肽用作活性醫藥成分的情況下,使用該等額外純化步驟。因此,根據本發明之萃取方法與使用自反應混合物中直接沈澱的方法相比允許以更高純度分離胜肽。
在萃取過程中所獲得之兩相系統之組成對胜肽及極性非質子性溶劑在有機層與水層之間的分佈係數有極大影響。在下文中,以體積:體積比率形式提供比率。
極性非質子性溶劑:甲苯之體積比在1:20至1:2範圍內為較佳。此體積比在1:10至1:2範圍內為較佳。此體積比在1:6至1:3範圍內為尤其較佳。
據顯示,胜肽在甲苯與有機溶劑1之組合中的溶解度高於在純甲苯中之溶解度。因此,當有機溶劑1之用量足 夠高時,在萃取過程中所獲得之胜肽在有機層中的溶解度尤其高。極性非質子性溶劑:有機溶劑1之體積比在1:5至30:1範圍內為較佳。此體積比在1:3至10:1範圍內為較佳。此體積比在1:1至4:1範圍內為尤其較佳。
甲苯:有機溶劑1之體積比在50:1至1:1範圍內為較佳。此體積比在20:1至2:1範圍內為較佳。此體積比在10:1至2:1範圍內為尤其較佳。
極性非質子性溶劑:水之體積比對萃取過程之效率及胜肽於水層中之溶解度有顯著影響。詳言之,若兩相系統中之極性非質子性溶劑:水體積比高於1:2,亦即若水層含有超過34體積%極性非質子性溶劑,則胜肽在水層中具有顯著較高的溶解度。因此,極性非質子性溶劑:水之體積比在1:20至1:2範圍內為較佳。此體積比在1:10至1:3範圍內為較佳。此體積比在1:5至1:3範圍內為尤其較佳。
含有胜肽之混合物中所存在之極性非質子性溶劑較佳係選自由DMF及NMP組成之群。
因此,純甲苯及甲苯與有機溶劑1之組合尤其適用於胜肽萃取方法。甲苯為容易再循環之低成本溶劑,其對人類及水生生物之毒性相對較低。因此,本發明宜按工業規模使用。
若有機溶劑1係選自由正庚烷、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯(EtOAc)、乙酸異丙酯、乙腈(ACN)及四氫呋喃(THF)組成之群,更佳選自由EtOAc、乙酸異丙酯、ACN及THF組成之群,尤其較佳選自由ACN及THF組成之群,則胜肽 在甲苯與有機溶劑1之組合中的溶解度尤其高。在胜肽萃取方法之一個尤其較佳的具體實例中,有機溶劑1係選自由ACN及THF組成之群。
對胜肽萃取方法所用之組分a2)可僅由水組成。然而,若組分a2)另外含有至少一種無機鹽,則會顯著降低組分a2)中之甲苯及有機溶劑1之可混溶性,且因此顯著降低胜肽於水層中之溶解度。此外,若組分a2)含有至少一種無機鹽,則降低有機層中之水含量。
在較佳具體實例之一中,組分a2)含有至少一種選自由氯化鈉、硫酸氫鈉、硫酸氫鉀、碳酸氫鈉及磷酸氫鈉組成之群的無機鹽。在其他具體實例中,組分a2)亦可含有其他化合物,諸如酸。
特定而言,組分a2)可含有在2至11之pH值範圍內不充當緩衝劑的無機鹽。添加該等無機鹽可降低胜肽於水層中之溶解度且減少萃取過程中之相分離所需之時間。舉例而言,組分a2)可含有氯化鈉或硫酸鈉。組分a2)中所存在之無機鹽之濃度較佳在1重量%至20重量%範圍內,甚至更佳為5重量%至15重量%。使用鹽(如氯化鈉)來促進兩相分離,且使用充當緩衝劑之鹽來選擇性地萃取水層中之酸或鹼。
組分a2)之pH值可對胜肽之溶解度以及水層中有些雜質之溶解度具有極大影響。此外,組分a2)之pH值之選擇視胜肽之化學穩定性以及其PG之化學穩定性而定。組分a2)之pH值較佳在2至11範圍內,尤其較佳為5至8,以 至於用於胜肽偶合反應之三級鹼在萃取過程中主要留在水層中。可藉由添加酸或鹼及/或使用緩衝劑來調節組分a2)之pH值。
可用於調節組分a2)之pH值之酸的選擇不受特別限制,只要組分a2)中所存在之酸不干擾胜肽萃取過程且不引起胜肽降解即可。舉例而言,布氏酸(Brnsted acid)可用於此目的,諸如有硫酸、鹽酸、磷酸、三氟乙酸或檸檬酸。
可用於調節組分a2)之pH值之鹼的選擇不受特別限制,只要組分a2)中所存在之鹼不干擾胜肽萃取過程且不引起胜肽降解即可。舉例而言,鹼金屬氫氧化物適用於調節組分a2)之pH值,諸如有氫氧化鈉、氫氧化鉀及氫氧化鋰。
組分a2)較佳含有緩衝劑,以便在萃取過程中將水層之pH值保持在所要範圍內。緩衝劑較佳選自由氯化銨、硫酸氫鈉、硫酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉及磷酸鈉組成之群。組分a2)中所存在之緩衝劑之濃度較佳在1重量%至10重量%範圍內,甚至更佳為3重量%至8重量%。
所獲得之含有胜肽之有機層視情況可另外用水溶液洗滌至少一次。用於此目的之水溶液之pH值較佳在2至11範圍內。
視胜肽偶合反應條件及所用試劑而定,有機層可含有呈雜質形式之具有自由一級胺基、二級胺基或三級胺基之 化合物,例如具有不受保護之N末端胺基之胜肽或三級鹼。在該等情況下,較佳用pH值為2至7之水溶液洗滌有機層。
在其他情況下,有機層可含有具有自由羧酸基之化合物,例如具有不受保護之C末端羧酸基之胜肽。在此等情況下,較佳用pH值為7至11之水溶液洗滌有機層。
宜進行胜肽萃取過程所處之溫度(在下文中稱為萃取溫度)視所用溶劑之選擇以及胜肽之性質而定。萃取溫度對所用溶劑之可混溶性及胜肽於有機層及水層中之溶解度具有極大影響。因此,以一定方式選擇萃取溫度,以至於在萃取過程中形成兩相系統且胜肽於有機層中之溶解度足夠高。胜肽萃取過程較佳在0℃至60℃之萃取溫度下進行。萃取溫度在20℃至30℃範圍內尤其較佳。
視胜肽偶合反應條件及所用偶合試劑而定,可在萃取過程之前及/或期間形成固體。舉例而言,若使用碳化二亞胺作為偶合試劑,則可能如此。為此,可能需要在組合含有胜肽、極性非質子性溶劑之混合物、甲苯、視情況選用之有機溶劑1及組分a2)之後,對所獲得之兩相系統進行過濾。因此,在本發明具體實例之一中,在分離含有胜肽之有機層之前對兩相系統進行過濾。
藉由本發明萃取方法萃取之胜肽可為任何胜肽。藉由該萃取方法萃取之胜肽較佳包含100或100個以下胺基酸殘基,更佳包含50或50個以下胺基酸殘基,最佳包含20或20個以下胺基酸殘基。胜肽之胺基酸可為D-α-胺基酸及/或L-α-胺基酸、D-β-胺基酸及/或L-β-胺基酸以及含有至少 一個一級胺基及/或二級胺基及至少一個羧酸基之其他有機化合物。胺基酸較佳為α-胺基酸,甚至更佳為L-α-胺基酸,其中蛋白型胺基酸尤其較佳。
製備胜肽
本發明之另一態樣係關於一種在液相中製備胜肽之方法,該方法包含步驟aa)、步驟bb)及步驟cc):在步驟aa)中,在存在偶合試劑及視情況選用之三級鹼的情況下,在選自由N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺及N-甲基-2-吡咯啶酮組成之群的極性非質子性溶劑中進行胜肽偶合反應;在步驟bb)中,根據上述方法萃取所產生之胜肽;及在步驟cc)中,將步驟bb)中所獲得之有機層的至少一部分蒸發。
作為用於根據步驟aa)之胜肽偶合反應的起始物質,採用兩種部分受保護之胺基酸的組合、兩種部分受保護之胜肽的組合或部分受保護之胺基酸與部分受保護之胜肽的組合。
根據本發明之在液相中製備胜肽之方法非常適合液相胜肽合成(LPPS)。在本發明具體實例之一中,根據步驟aa)之胜肽偶合反應採用藉由SPPS製備之兩種部分受保護之胜肽的組合。因此,本發明方法允許偶合胜肽片段且可與SPPS組合使用。
使用典型用於胜肽偶合反應之習知過程參數及試劑進行根據步驟aa)之胜肽偶合反應。
胜肽偶合反應習知在極性非質子性溶劑中且使用一或多種偶合試劑,較佳在存在一或多種偶合添加劑的情況下且較佳在存在一或多種三級鹼的情況下來進行。
以一定方式選擇用於胜肽偶合反應之偶合試劑,以至於偶合試劑在胜肽偶合反應條件下不與極性非質子性溶劑反應,且與活性羧酸基相鄰之立體對稱中心不發生實質性差向異構化。因此,較佳偶合試劑為O-1H-苯并***之鏻鹽或鹽及碳化二亞胺偶合試劑。
鏻鹽及鹽較佳選自由以下組成之群:BOP(六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-參-(二甲基胺基)-鏻);PyBOP(六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-參吡咯啶鏻);HBTU(六氟磷酸O-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲);HCTU(六氟磷酸O-(1H-6-氯-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲);TCTU(四氟硼酸O-(1H-6-氯苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲);HATU(六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲);TATU(四氟硼酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲);TBTU(四氟硼酸O-(苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲);TOTU(四氟硼酸O-[氰基(乙氧羰基)亞甲基胺基]-1,1,3,3-四甲); HAPyU(六氟磷酸O-(苯并***-1-基)氧基雙-(吡咯啶基)-);PyAOP(六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-參-吡咯啶鏻);COMU(六氟磷酸1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-側氧基亞乙基胺基氧基)-二甲基胺基-嗎啉基亞甲基)]-甲銨);PyClock(六氟磷酸6-氯-苯并***-1-基-氧基-參-吡咯啶鏻);PyOxP(六氟磷酸O-[(1-氰基-2-乙氧基-2-側氧基亞乙基)胺基]-氧基三(吡咯啶-1-基)-鏻);及PyOxB(四氟硼酸O-[(1-氰基-2-乙氧基-2-側氧基亞乙基)胺基]-氧基三(吡咯啶-1-基)-鏻)。
選自鏻或偶合試劑之較佳偶合試劑為TBTU、TOTU及PyBOP。
碳化二亞胺偶合試劑較佳選自由二異丙基碳化二亞胺(DIC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)及諸如1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺(EDC)之水溶性碳化二亞胺(WSCDI)組成之群。
水溶性碳化二亞胺作為碳化二亞胺偶合試劑尤其較佳,其中EDC最佳。
胜肽偶合反應中所用之三級鹼較佳與胜肽及偶合試劑相容,且藉由充當界面活性劑而不干擾萃取過程。
胜肽偶合反應中所用之該三級鹼之共軛酸較佳具有7.5至15、更佳為7.5至10之pKa值。該三級鹼較佳選自由以下組成之群:三烷基胺,諸如N,N-二異丙基乙胺(DIPEA) 或三乙胺(TEA);另外有N,N-二-C1-4烷基苯胺,諸如N,N-二乙苯胺;2,4,6-三-C1-4烷基吡啶,諸如柯林鹼(2,4,6-三甲基吡啶);或N-C1-4烷基嗎啉,諸如N-甲基嗎啉,其中任何C1-4烷基相同或不同且彼此獨立地為直鏈或分支鏈C1-4烷基。DIPEA、TEA及N-甲基嗎啉作為用於胜肽偶合反應之三級鹼尤其較佳。
偶合添加劑較佳為能夠形成活性酯、更佳具有酸性親核性N-羥基官能基之親核性羥基化合物,其中N為醯亞胺或為N-醯基或N-芳基取代之三氮烯基,該三氮烯基型偶合添加劑較佳為N-羥基苯并***衍生物(或1-羥基苯并***衍生物)或N-羥基苯并三衍生物。該等偶合添加劑已描述於WO 94/07910及EP 0 410 182中。
較佳偶合添加劑係選自由以下組成之群:N-羥基丁二醯亞胺(HOSu)、6-氯-1-羥基苯并***(Cl-HOBt)、N-羥基-3,4-二氫-4-側氧基-1,2,3-苯并三(HOOBt)、1-羥基-7-氮雜苯并***(HOAt)、1-羥基苯并***(HOBt)及2-氰基-2-羥基亞胺基乙酸乙酯(CHA)。CHA可以商標名OXYMAPURE®獲得。CHA已被證明是有效耦合添加劑,因為與基於苯并***之偶合添加劑相比,對活性羧酸立體對稱中心之差向異構化的抑制程度更高。此外,CHA與例如HOBt或Cl-HOBt相比***性較低,以至於其處理較為有利,且作為另一優勢,可藉由反應混合物之顏色變化在視覺上監測偶合進展情況。HOBt較佳用作胜肽偶合反應之偶合添加劑。
在本發明之較佳具體實例中,胜肽偶合反應中之試劑組合係選自由TBTU/HOBt/DIPEA、PyBOP/TEA、EDC/HOBt及EDC/HOBt/DIPEA組成之群。
用於胜肽偶合反應之反應溶劑係選自由DMF、DMA、NMP或其混合物組成之群。胜肽偶合反應之尤其較佳的反應溶劑係選自由DMF及NMP組成之群。
反應溶劑較佳實質上不含水。反應溶劑較佳含有少於1重量%之水,更佳含有少於0.1重量%之水,甚至更佳含有少於0.01重量%之水,且尤其較佳含有少於0.001重量%之水。溶劑中之水含量可藉由卡爾費雪滴定(Karl Fischer titration)根據先前技術中已知的標準測試方法ASTM E203-8來測定。
用於胜肽偶合反應之反應溶劑較佳實質上不含選自由一級胺及二級胺、羧酸及脂族醇組成之群的雜質。若以低於化學計算量之量或化學計算量使用之任何起始物質中少於1莫耳%在胜肽偶合反應期間與此等雜質發生不需要之反應,則用於胜肽偶合反應之反應溶劑被視為實質上不含此等雜質。
適當反應溫度之選擇視所用偶合試劑以及胜肽穩定性而定。胜肽偶合反應較佳在-15℃至50℃、更佳為-10℃至30℃、甚至更佳為0℃至25℃之反應溫度下進行。
胜肽偶合反應較佳在大氣壓下進行。然而,亦可在高於大氣壓或稍低於大氣壓之壓力下進行胜肽偶合反應。
較佳在環境氛圍下進行胜肽偶合反應。然而,諸如氮 氣或氬氣之保護性氣體氛圍亦較佳。
在本申請案中,術語「反應時間」係指直至實質上完成反應轉化所需之時間。以低於化學計算量之量或化學計算量使用之起始物質之量降至其初始量之5莫耳%以下、較佳降至其初始量之2莫耳%以下之後,認為反應轉化實質上完成。可藉由此項技術中已知之分析方法來監測反應進展情況,例如有分析型高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、質譜(MS)或HPLC-MS,其中HPLC尤其適宜用於此目的。
胜肽偶合反應之反應時間較佳在15分鐘至20小時範圍內,更佳為30分鐘至5小時,甚至更佳為30分鐘至2小時。
在有關胜肽偶合反應之反應條件的描述中,術語「份」意謂用作胜肽偶合反應之起始物質的胜肽及/或胺基酸之總重量的重量份數因子。較佳使用1至30份,更佳使用5至10份反應溶劑。
較佳使用0.9至5莫耳當量,更佳使用1至1.5莫耳當量之偶合試劑,莫耳當量係基於反應性C末端羧酸基之莫耳數。
較佳使用0.1至5莫耳當量,更佳使用0.5至1.5莫耳當量之偶合添加劑,莫耳當量係基於偶合試劑之莫耳數。
較佳使用1至10莫耳當量,更佳使用2至3莫耳當量之三級鹼,莫耳當量係基於偶合試劑之莫耳數。
任何胜肽均可藉由本發明之在液相中製備胜肽之方法 來獲得。
由本發明之在液相中製備胜肽之方法所獲得的胜肽較佳包含100或100個以下胺基酸殘基,更佳包含50或50個以下胺基酸殘基,最佳包含20或20個以下胺基酸殘基。胜肽之胺基酸可為D-α-胺基酸及L-α-胺基酸、D-β-胺基酸及L-β-胺基酸以及含有至少一個一級胺基及/或二級胺基及至少一個羧酸基之其他有機化合物。由本發明之在液相中製備胜肽之方法所獲得的胜肽之胺基酸較佳為α-胺基酸,甚至更佳為L-α-胺基酸,其中蛋白型胺基酸尤其較佳。
在萃取過程之後,較佳將含有胜肽之有機層部分蒸發。在本申請案中,所獲得之層因此被稱為「經部分蒸發之有機層」。進行部分蒸發所處之溫度不受特別限制,且可根據胜肽之熱穩定性以及甲苯或甲苯與有機溶劑1之混合物的性質加以選擇。較佳在30℃至50℃之溫度下部分蒸發有機層。在有需要時在20毫巴至1000毫巴(20 hPa至1000 hPa)之減壓下,較佳在50毫巴至200毫巴(50 hPa至200 hPa)之減壓下部分蒸發有機層。熟習此項技術者知道,較佳根據所要蒸發溫度來調節部分蒸發有機層所處之壓力。
因為甲苯及有機溶劑1具有足夠揮發性,因此可容易地部分蒸發含有胜肽之有機層。
在本發明具體實例之一中,直接蒸發含有胜肽之有機層直至乾燥,且將剩餘殘餘物溶解於與甲苯及有機溶劑1不同的溶劑中。然而,若含有胜肽之有機層包含超過30體積%之選自由MeTHF及THF組成之群的溶劑,則出於安全 原因較佳避免完全蒸發直至乾燥。作為替代,可部分蒸發含有胜肽之有機層,接著添加甲苯,隨後蒸發直至乾燥。
由於有機層中所存在之甲苯與水形成共沸物,因此在部分蒸發過程中有效移除含有胜肽之有機層中的痕量水。
在較佳具體實例之一中,在組合經部分蒸發之有機層與有機溶劑2時,較大部分胜肽沈澱。
在本發明之另一較佳具體實例中,直接蒸發含有胜肽之有機層直至乾燥,且將剩餘殘餘物溶解於與甲苯及有機溶劑1不同的溶劑中。隨後將所獲得之溶液與有機溶劑2組合,藉此發生胜肽沈澱。
在胜肽沈澱過程中所用之經部分蒸發之有機層:有機溶劑2的體積比對沈澱過程之完成程度及沈澱胜肽之性質具有極大影響。在下文中,以體積:體積比率形式提供比率。
經部分蒸發之有機層:有機溶劑2的體積比在1:20至1:1範圍內較佳。此體積比在1:12至1:2範圍內較佳。此體積比在1:6至1:3範圍內尤其較佳。
有機溶劑2較佳選自在大氣壓下之沸點低於160℃的有機溶劑。胜肽在有機溶劑2中之溶解度較佳低於在甲苯及/或甲苯與有機溶劑1之混合物中的溶解度。有機溶劑2較佳選自由乙腈、***、二異丙醚及正庚烷組成之群,更佳選自由乙腈、***及二異丙醚組成之群,尤其較佳選自由二異丙醚及正庚烷組成之群。
由於經部分蒸發之含有胜肽之有機層實質上不含極性非質子性溶劑,因此使胜肽沈澱所需之有機溶劑2的量顯 著低於先前技術之沈澱方法,先前技術之沈澱方法使用由胜肽偶合反應所產生之粗反應混合物。此外,與先前技術之沈澱方法相反,沈澱胜肽為無黏性固體物質。
在沈澱過程中,經部分蒸發之有機層中所存在之胜肽的至少80重量%以固體物質形式沈澱析出為較佳。經部分蒸發之有機層中所存在之胜肽的至少90重量%以固體物質形式沈澱析出為甚至更佳。經部分蒸發之有機層中所存在之胜肽的至少95重量%以固體物質形式沈澱析出為甚至更佳。經部分蒸發之有機層中所存在之胜肽的至少98重量%以固體物質形式沈澱析出為尤其較佳。
進行沈澱過程所處之溫度(此溫度在下文中稱為沈澱溫度)視經部分蒸發之有機層的組成、有機溶劑2之選擇及胜肽之性質而定。
沈澱溫度對胜肽沈澱之完全程度及沈澱胜肽之物理性質具有極大影響。較佳在-10℃至60℃之沈澱溫度下進行沈澱過程,其中-10℃至30℃之沈澱溫度甚至更佳。然而,沈澱溫度在-10℃至0℃範圍內尤其較佳。
由於經部分蒸發之含有胜肽之有機層實質上不含極性非質子性溶劑,因此可容易地藉由過濾來分離沈澱胜肽。因此,顯著縮短過濾過程所需之時間。較佳藉由過濾分離沈澱胜肽且在減壓下乾燥。
然而,亦可藉由離心來分離沈澱胜肽。
必要時可對過濾期間所收集之濾液再次進行部分蒸發,隨後沈澱,以至於可收集第二批沈澱胜肽。
在本發明之另一具體實例中,直接用可裂解胜肽之一或若干個PG之試劑處理經部分蒸發之含有胜肽之有機層。由於經部分蒸發之含有胜肽之有機層實質上不含極性非質子性溶劑,因此用於裂解胜肽之一或若干個PG之試劑的選擇不受特別限制。舉例而言,可用酸解試劑處理經部分蒸發之含有胜肽之有機層,其中未發生酸解試劑與極性非質子性溶劑之間的不需要之反應或未對裂解有抑制。若胜肽之N末端PG為第三丁氧基羰基(Boc),則本發明之此具體實例尤其較佳。
在本發明之其他具體實例中,經部分蒸發之有機層用於進行其他反應,諸如二硫橋形成。
在本發明之另一具體實例中,直接向由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中添加可裂解胜肽之一或若干個PG的試劑。在目標PG之裂解完成之後,自反應混合物中萃取所產生之胜肽。若胜肽之N末端PG為茀基-9-甲氧基羰基(Fmoc),則本發明之此具體實例尤其適合。
在一個特定具體實例中,在PG裂解之後用甲苯或用甲苯與有機溶劑1之混合物萃取胜肽。此典型地為經Fmoc保護之胜肽難以保持在不含NMP或DMF之溶液中的情況。在Fmoc裂解之後,可將此等胜肽萃取於含有甲苯及視情況存在之有機溶劑1的有機層中。
在經Boc保護之胜肽的情況下,相反的是,必須在Boc裂解之前移除NMP及DMF,但此等胜肽通常在存在TFA>5體積%的情況下可溶於甲苯、乙酸乙酯或可能存在之庚烷 中。
在本發明之又一具體實例中,如上文所述將含有胜肽之有機層蒸發直至乾燥,將剩餘殘餘物溶解於與甲苯及有機溶劑1不同的溶劑中,然後向其中添加可裂解胜肽之一或若干個PG之試劑。
保護基
出於本發明之目的,將用於保護胺基酸或胜肽側鏈中之官能基或用於保護胺基酸或胜肽之N末端胺基或C末端羧酸基的保護基(PG)分類為4個不同群組:1.可在鹼性裂解條件下裂解之PG,在下文中稱為「鹼型PG」;2.可在強酸性裂解條件下裂解而在中等酸性裂解條件下不可裂解之PG,在下文中稱為「強型PG」;3.可在中等酸性裂解條件下裂解之PG,在下文中稱為「弱型PG」;4.可在還原性裂解條件下裂解之PG,在下文中稱為「還原型PG」;及5.可在皂化裂解條件下裂解之PG,在下文中稱為「皂化型PG」。
習知用於本發明之在液相中製備胜肽之方法的PG及用於裂解PG之典型反應條件、參數及試劑在此項技術中為已知的,例如T.W.Greene,P.G.M.Wuts「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」John Wiley & Sons公司,2006;或P.Lloyd-Williams,F.Albericio,E.Giralt, 「Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins」CRC:Boca Raton,Florida,1997。
鹼性裂解條件涉及用鹼性裂解溶液處理胜肽。鹼性裂解溶液較佳由鹼性試劑及溶劑組成。用於本發明之鹼性試劑較佳為二級胺,鹼性試劑更佳選自由二乙胺(DEA)、哌啶、4-(胺基甲基)哌啶、參(2-胺基乙基)胺(TAEA)、嗎啉、二環己胺、1,3-環己烷雙(甲胺)-哌、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯及其混合物組成之群。本發明之在液相中製備胜肽之方法中所用的鹼性試劑甚至更佳選自由DEA、TAEA及哌啶組成之群。
鹼性裂解溶液亦可包含較佳選自由6-氯-1-羥基-苯并***、1-羥基-7-氮雜苯并***、1-羥基苯并***及2-氰基-2-羥基亞胺基乙酸乙酯及其混合物組成之群的添加劑。
鹼性裂解溶液之溶劑較佳與胜肽偶合反應所採用之極性非質子性溶劑相同。因此,鹼性裂解溶液之溶劑較佳選自由DMF、DMA及NMP組成之群。或者,藉由自由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中萃取胜肽之方法所獲得的含有胜肽之有機層可如上文所述被蒸發直至乾燥。可將剩餘殘餘物溶解於選自由DMF、DMA、吡啶、NMP、乙腈或其混合物組成之群的溶劑之一中,隨後用鹼性裂解溶液處理。可能必需用DMF或NMP將胜肽以溶液形式保持在Fmoc裂解反應混合物中,如實施例1中所示。
在有關鹼性、強酸性、中等酸性及還原性裂解條件之描述中,術語「份」及「重量%」意謂為攜帶正被裂解之相 應基團PG的胜肽之重量份數因子。舉例而言,表述「使用5份鹼性裂解溶液」意謂使用5 g鹼性裂解溶液來處理各1 g攜帶鹼型PG之胜肽。
較佳使用5至20份、更佳為5至15份鹼性裂解溶液。鹼性試劑之量較佳在1重量%至30重量%範圍內,更佳為10重量%至25重量%,甚至更佳為15重量%至20重量%,其中重量%係基於鹼性裂解溶液之總重量。
如本發明中所定義之強酸性裂解條件涉及用強酸性裂解溶液處理胜肽。強酸性裂解溶液包含酸解試劑。酸解試劑較佳選自由以下組成之群:布氏酸,諸如TFA、鹽酸(HCl)、鹽酸水溶液(HCl)、液體氫氟酸(HF)或三氟甲磺酸;路易斯酸(Lewis acid),諸如三氟硼酸***加合物或溴化三甲基矽烷;及其混合物。
強酸性裂解溶液較佳包含一或多種選自由二硫蘇糖醇、乙二硫醇、二甲基硫醚、三異丙基矽烷、三乙基矽烷、1,3-二甲氧基苯、苯酚、苯甲醚、對甲酚及其混合物組成之群的清除劑。強酸性裂解溶液亦可包含水、溶劑或其混合物,該溶劑在強裂解條件下穩定。
強酸性裂解溶液之溶劑較佳與經部分蒸發之含有胜肽之有機層中所存在的溶劑相同。因此,強酸性裂解溶液之溶劑為甲苯或甲苯與有機溶劑1之組合。或者,可如上文所述將含有胜肽之有機層蒸發直至乾燥且可將剩餘殘餘物溶解於選自由ACN、甲苯、DCM、TFA及其混合物組成之群的溶劑之一中。因為甲苯及有機溶劑1具有足夠揮發性, 因此可容易地蒸發有機層。
較佳使用10至30份、更佳為15至25份、甚至更佳為19至21份強酸性裂解溶液。酸解試劑之量較佳在30重量%至350重量%範圍內,更佳為50重量%至300重量%,甚至更佳為70重量%至250重量%,尤其為100重量%至200重量%,其中重量%係基於強酸性裂解溶液之總重量。較佳使用佔總量之1重量%至25重量%、更佳為5重量%至15重量%的清除劑,其中重量%係基於強酸性裂解溶液之總重量。
根據本發明之中等酸性裂解條件涉及用弱酸性裂解溶液處理胜肽。弱酸性裂解溶液包含酸解試劑。酸解試劑較佳選自由以下組成之群:布氏酸,諸如TFA、三氟乙醇、鹽酸(HCl)、乙酸(AcOH)、其混合物及/或與水之混合物。
弱酸性裂解溶液亦可包含水、溶劑或其混合物,該溶劑在弱裂解條件下穩定。弱酸性裂解溶液之溶劑較佳與經部分蒸發之含有胜肽之有機層中所存在的溶劑相同。因此,弱酸性裂解溶液之溶劑為甲苯或甲苯與有機溶劑1之組合。或者,可如上文所述將含有胜肽之有機層蒸發直至乾燥且可將剩餘殘餘物溶解於選自由ACN、甲苯、DCM、TFA及其混合物組成之群的溶劑之一中。
較佳使用4至20份、更佳為5至10份弱酸性裂解溶液。酸解試劑之量較佳在0.01重量%至5重量%範圍內,更佳為0.1重量%至5重量%,甚至更佳為0.15重量%至3重量%,其中重量%係基於弱酸性裂解溶液之總重量。
本發明具體實例之一中所用之還原性裂解條件涉及用還原性裂解混合物處理胜肽。還原性裂解混合物包含催化劑、還原劑及溶劑。
用於還原性裂解條件之催化劑係選自由Pd(0)衍生物、Pd(II)衍生物及含有金屬鈀之催化劑組成之群,更佳選自由Pd[PPh3]4、PdCl2[PPh3]2、Pd(OAc)2及鈀/碳(Pd/C)組成之群。Pd/C尤其較佳。
還原劑較佳選自由Bu4N+BH4 -、NH3BH3、Me2NHBH3tBu-NH2BH3、Me3NBH3、HCOOH/DIPEA、亞磺酸(包含PhSO2H、tolSO2Na及i-BuSO2Na)及其混合物以及分子氫組成之群;還原劑更佳為tolSO2Na或分子氫。
在還原性裂解條件下所用之溶劑較佳與經部分蒸發之含有胜肽之有機層中所存在的溶劑相同。因此,在還原性裂解條件下所用之溶劑較佳為甲苯或甲苯與有機溶劑1之組合。或者,可如上文所述將含有胜肽之有機層蒸發直至乾燥且可將剩餘殘餘物溶解於選自由NMP、DMF、DMA、吡啶、ACN及其混合物組成之群的溶劑之一中;溶劑更佳為NMP、DMF或其混合物。胜肽較佳可溶且將其溶解於還原性裂解條件下所用之溶劑中。
較佳使用4至20份、更佳為5至10份還原性裂解溶液。
皂化裂解條件涉及用皂化裂解溶液處理胜肽。皂化裂解溶液較佳由皂化試劑及溶劑組成。本發明所用之皂化試劑較佳為鹼金屬及鹼土金屬之氫氧化物,皂化試劑更佳選自由氫氧化鈉、氫氧化鋰及氫氧化鉀組成之群。本發明之 在液相中製備胜肽之方法中所用的皂化試劑甚至更佳為氫氧化鈉。
皂化裂解溶液之溶劑較佳包含水與選自由THF、MeTHF、乙醇、甲醇及二噁烷組成之群的溶劑之混合物。
根據本發明,鹼型PG在強酸性或中等酸性裂解條件下不可裂解。鹼型PG較佳在強酸性裂解條件、弱裂解條件或還原性裂解條件下不可裂解。
術語「強型PG」應理解為在中等酸性裂解條件或鹼性裂解條件下不可裂解之保護基。強型PG較佳在中等酸性裂解條件、鹼性裂解條件或還原性裂解條件下不可裂解。強酸性PG(如Bzl)通常藉由氫化來裂解。典型地藉由在非常溫和之條件下進行氫化來整體脫除胜肽之保護基。
弱型PG在鹼性裂解條件下不可裂解,但其可在強酸性裂解條件下裂解。弱型PG較佳在鹼性裂解條件或還原性裂解條件下不可裂解,但其可在強酸性裂解條件下裂解。
根據本發明具體實例之一,鹼型PG較佳為Fmoc。強型PG較佳選自由Boc、tBu、OtBu及Cbz組成之群。弱型PG較佳選自由Trt及2-氯苯基二苯基甲基組成之群。還原型PG較佳選自由Bzl、N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-胺基及Cbz組成之群。皂化型PG較佳為OMe。
在本發明之在液相中製備胜肽之方法中,在脫除保護基之反應中移除胜肽之N末端PG,接著進行後續胜肽偶合反應。根據本發明,N末端PG較佳為Fmoc及Boc。
在本發明具體實例之一中,Fmoc在LPPS中作為N末 端PG高度較佳,因為其可在鹼性條件下容易地移除。此外,Fmoc作為胜肽N末端之PG與側鏈PG相容以表示正交系統。術語「正交系統」定義於G.Baranay及R.B.Merrifield(JACS,1977,99,22,第7363-7365頁)中。
在本發明之又一具體實例中,Boc作為胜肽N末端PG用於在液相中製備胜肽之方法高度較佳。其移除可在強酸性條件下進行。使用N末端Boc PG亦與側鏈PG相容以表示正交系統。
根據本發明,在最終脫除保護基之步驟中移除胜肽之C末端PG。
較佳C末端PG為OtBu、Blz、OMe、NH2以及2-氯苯基-二苯基甲酯或N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-醯胺。
在本發明具體實例之一中,Bzl作為C末端PG用於在液相中製備胜肽之方法高度較佳,因為其可在上述還原性裂解條件下容易地移除。此外,C末端Bzl PG與側鏈PG相容以表示正交系統。
在本發明之另一具體實例中,OtBu作為C末端PG用於在液相中製備胜肽之方法。其移除可在如上文所述之強酸性裂解條件下進行。使用C末端OtBu PG亦與側鏈PG相容以表示正交系統。
在本發明之另一具體實例中,OMe作為C末端PG用於在液相中製備胜肽之方法。OMe可藉由皂化容易地裂解且若胜肽之N末端PG為Boc,則尤其適用。
在本發明之又一具體實例中,可另外藉由對胜肽C末 端使用疏水性PG來增加胜肽在有機層中之溶解度。為此目的,胜肽之C末端羧酸基可用弱型PG加以保護,該等弱型PG可在中等酸性條件下裂解,諸如2-氯苯基二苯基甲酯或N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-醯胺。此等PG尤其適用於合成胜肽片段,而胜肽片段又可用於彙集型胜肽合成。此等C末端羧酸保護基具有另一重要優勢:其在中等酸性條件下裂解,從而允許液相合成受保護之胜肽,作為SPPS之一項替代方案,該等受保護之胜肽可用作彙集型合成策略中之胜肽片段。實際上,2-氯苯基二苯基甲酯及N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-醯胺之化學功能為用作SPPS樹脂上之連接子以用於合成受保護之胜肽片段。
根據本發明,需要用適合PG保護藉由在液相中製備胜肽之方法所獲得之胜肽的胺基酸側鏈之羥基-、胺基-、硫基-及羧酸基,以便避免不需要之副反應。此外,使用側鏈PG一般可改良胜肽在極性非質子性溶劑中以及在甲苯中或/及在甲苯與有機溶劑1之組合中的溶解度。
一般而言,以一定方式選擇側鏈PG,以至於其在於液相中製備胜肽之方法中的脫除N末端胺基保護基之期間不會被移除。因此,N末端胺基或C末端羧酸基之PG及任何側鏈PG典型地不同,其較佳表示正交系統。
根據本發明,較佳側鏈基團為tBu、Trt、Boc、OtBu及Cbz。
一旦藉由在液相中製備胜肽之方法所獲得之胜肽的胺基酸序列與目標胜肽之胺基酸序列一致後,較佳移除N末 端PG、C末端PG及任何側鏈PG以便獲得不受保護之目標胜肽。此步驟稱為整體脫除保護基。在液相中製備胜肽之方法中所用之PG較佳經選擇以允許在如上文所定義之中等酸性、強酸性或還原性裂解條件下進行整體脫除保護基,此視PG之本質而定。
典型地保留任何側鏈PG,直至LPPS結束。整體脫除保護基可在適用於已使用之各種側鏈PG的條件下進行。在選擇不同類型之側鏈PG的情況下,其可相繼裂解;例如此為合成分枝胜肽時之情況。宜用使側鏈PG可同時裂解且更宜伴隨由LPPS製備之胜肽之N末端PG或C末端PG之方式選擇側鏈PG。
在本發明具體實例之一中,可直接移除經部分蒸發之有機層中之胜肽的N末端PG。因此,在此情況下,不需要使用有機溶劑2來使胜肽沈澱,且可在不分離中間物胜肽的情況下進行本發明之LPPS,例如呈連續LPPS形式。
視胜肽N末端PG之本質而定,可針對此步驟選擇適當裂解條件。
若胜肽之N末端PG為如上文所定義之強型PG或弱型PG,則較佳用TFA或HCl處理含有胜肽之有機層。由於含有胜肽之有機層實質上不含極性非質子性溶劑,因此移除胜肽之N末端PG不因TFA或HCl與極性非質子性溶劑之間不合需要的反應而受抑制。在本發明具體實例之一中,胜肽之N末端PG為Boc基團。
若胜肽之N末端PG為如上文所定義之鹼型PG,則胜 肽可使用有機鹼來脫除保護基,如先前技術中所知。為此目的,較佳直接用選自由DEA、TAEA及哌啶組成之群的鹼性試劑處理由胜肽偶合反應所產生之反應混合物,且自此反應混合物中萃取具有不受保護之N末端的胜肽。或者,用鹼性試劑處理含有胜肽之有機層。或者,可如上文所述將含有胜肽之有機層蒸發直至乾燥且可將剩餘殘餘物溶解於選自由DMF、DMA、吡啶、NMP或其混合物組成之群的溶劑之一中,隨後用鹼性試劑處理。
在本發明較佳具體實例之一中,胜肽之N末端PG為茀基-9-甲氧基羰基(Fmoc)。胜肽之Fmoc基團裂解伴隨二苯富烯形成。若使用DEA或哌啶作為鹼性試劑且鹼性裂解溶液之溶劑為乙腈,則隨後用烴(諸如正庚烷)洗滌含有具有不受保護之N末端之胜肽的所得溶液,以便實質上移除二苯富烯。若使用TAEA作為裂解Fmoc基團之鹼性試劑,則隨後對所得溶液進行本發明之萃取方法。因此,含有具有不受保護之N末端之胜肽的溶液在進行後續胜肽偶合反應之前實質上不含二苯富烯。
在使胜肽N末端PG裂解之後,可將含有具有不受保護之N末端之胜肽的溶液至少部分蒸發且用於後續胜肽偶合反應,或者用於整體脫除保護基之步驟。
因此,本發明提供連續LPPS方法,該方法與常用SPPS方法相比具有許多優勢。
在本發明之連續LPPS的情況下,在胜肽偶合反應及脫除保護基之反應期間反應混合物中所存在之試劑濃度高於 SPPS之情況。因此,相應反應時間較短,且可使用具有較小容量之分批反應器來合成指定量之目標胜肽。藉由本發明之連續LPPS來合成胜肽所需之總時間與使用SPPS進行其合成時所需之總時間幾乎相同。因此,使用本發明之連續LPPS可降低操作成本。
與SPPS中之相應胜肽偶合反應(1.5當量或1.5當量以上)相比,本發明LPPS中之胜肽偶合反應需要較低過量之胺基酸或具有不受保護之C末端羧酸基之胜肽(1.1當量至1.2當量)。此外,SPPS另外需要大量溶劑用於在各胜肽偶合步驟之後沖洗樹脂。因此,在SPPS情況下所需之溶劑量顯著高於本發明連續LPPS之情況。因此,與使用SPPS相比,使用本發明之連續LPPS可顯著降低材料成本。
除此以外,已知按比例擴大本發明之連續LPPS方法之規模與按比例擴大相應SPPS方法之規模相比更容易,且藉由本發明之連續LPPS製備之目標胜肽與由SPPS製備之相應胜肽相比具有更高純度。
總之,本發明之連續LPPS與先前技術中已知的其他胜肽合成方法相比提供許多優勢,且尤其適用於按工業規模製備胜肽。
實施例
以下非限制性實施例將詳細說明本發明之代表性具體實例。
若未另外規定,則所有實驗均在20±3℃之室溫及1013 ±50 kPa之大氣壓力下進行。
方法描述 A)HPLC分析
利用UV光電二極體陣列偵測器來進行HPLC方法A中之偵測。
步驟1樣品製備: 移動相A:0.1體積% TFA/水
移動相B:0.085體積% TFA/ACN
步驟2層析條件: 方法MIH-009-2TG11
管柱:Purospher Star RP18 55×4 mm
爐溫:40℃
流速:2.0 mL/min
偵測器波長:215 nm
梯度運作時間:15 min
梯度組成:2%至78% B,5 min;78%至98% B,10 min
驟3層析圖分析:藉由量測所有層析峰之面積來確定所分離產物之組成。預期產物之所測定純度對應於相應產物峰之面積%。
1.裝置及設備
氣相層析儀:裝備火焰電離偵測器及自動注射器系統且與資料採集軟體耦合之GC
分析型GC管柱:熔融二氧化矽管柱,長度50 m; 0.53 mm內徑;固定相:CP SIL 8CB DF=5.0 μm
試劑:甲醇(分析級)
2.樣品製備 測試溶液及參考溶液
在10 mL容量瓶中,精確添加400 μL樣品且用甲醇補足體積。
3.層析條件
載氣:氦氣30 kPa
爐溫:35℃,14分鐘,5℃/min,55℃,3分鐘,5℃/min,110℃,5分鐘,10℃/min,225℃,5分鐘
注射器溫度:225℃
偵測器溫度:260℃
注射體積:1 μL
注射模式:分流
分流流速:85 mL/min
比率:24
過濾性量測
將含有沈澱胜肽之混合物轉移至裝備20 μm孔徑過濾器之2.7 cm直徑過濾管柱中。在20℃下在50毫巴之壓力下進行過濾。量測流速及濾餅高度且如下計算過濾性係數K:K=母液體積(mL)×濾餅高度(cm)/過濾器表面(cm2)/壓力(巴)/過濾時間(min)。
實施例1萃取系統MeTHF/THF/NaCl溶液、EtOAc/THF/NaCl溶液及甲苯/THF/NaCl溶液中之NMP
將溶劑組合甲苯/THF(根據本發明)之萃取性質與組合MeTHF/THF及EtOAc/THF(比較)之萃取性質相比較。用含有150 g/L NaCl之水溶液進行實驗。本實施例之系統中不存在胜肽。
體積比如下: NMP:EtOAc:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
NMP:MeTHF:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
NMP:甲苯:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
藉由GC測定水層中之NMP分數。實驗結果彙總於以下表1中。
如自以上表1中可注意到,與使用EtOAc/THF及MeTHF/THF進行萃取相比,用組合甲苯/THF萃取使得水層中之NMP分數更高。因此,與用MeTHF/THF或EtOAc/THF萃取之後相比,用甲苯/THF萃取之後,有機層中之NMP含量較低。
實施例2 合成H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl 實施例2.1 Boc-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl之LPPS
在20℃下將Boc-Tyr(Bzl)-OH(4.7 g,12.7 mmol)及H-Leu-OBzl.Tos(5.0 g,12.7 mmol)溶解於DMF(25 mL)中。將反應混合物冷卻至-8℃,接著添加HOBt.H2O(2.0 g,13.1 mmol,1.0當量)及EDC.HCl(2.8 g,14.6 mmol)。將反應溫度保持在-5℃至-10℃範圍內直至反應完成,如藉由HPLC所測定。藉由以下方法監測反應進展:根據上述方法MIH-009-2TG11對在乙酸:水(9:1)中稀釋50倍之5 μL反應混合物樣品進行分析。
實施例2.2 Boc裂解:H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl
向根據實施例2.1製備之混合物中添加甲苯(90 mL)且用以下各物相繼萃取反應混合物:
1)含有20 g/L NaCl之水溶液(90 mL)
2)含有150 g/L NaCl及50 g/L NaHCO3之水溶液(90 mL)
3)含有20 g/L NaCl及50 g/L NaHCO3之水溶液(90 mL)
4)含有20 g/L NaCl及50 g/L NaHCO3之水溶液(90 mL)
5)含有150 g/L NaCl之水溶液(90 mL)。
接著在減壓下在35℃下濃縮所合併之有機層,以便將所合併之有機層的體積減至20 mL。
藉由在15℃下添加苯酚(0.25 g,2.6 mmol)及TFA(20 mL)來移除Boc保護基。在反應完成(如藉由HPLC所測定)之後,在減壓下在35℃下蒸發反應混合物。藉由與甲苯(3×25 mL)一起共同蒸發來移除殘餘TFA。藉由以下方 法監測反應進展:將5 μL反應混合物樣品在甲醇中稀釋30倍且根據上述方法MIH-009-2TG11進行分析。
實施例3(比較)殘餘DMF對移除Boc保護基之影響。 H-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl
將Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH(3.5 g)、H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl(5.0 g)及HOBt(0.88 g)溶解於DMF(20 mL)中。在-6℃至0℃下在攪拌下用EDCHCl(1.2 g)及TEA(1.5 mL)進行偶合反應隔夜。藉由HPLC(方法MIH-009-2TG11)驗證反應完成。
過濾反應混合物以移除不溶性鹽。將1 mL反應混合物樣品與如以下表2中所示之有機溶劑混合,接著用3 mL NaCl(15% w/v)及Na2CO3(2.5% w/v)之水溶液萃取。藉由GC測定有機層中之DMF含量。
Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Le u-OBzl
用EtOAc萃取(測試2)使得有機層中之DMF含量與用DCM萃取(測試1)相比較低。
進一步處理測試1及測試2之所獲得產物。分離有機 層,且藉由與甲苯一起共同蒸發三次(浴液溫度=40℃,壓力=50毫巴)來交換溶劑。完全蒸發揮發性溶劑之後,向蒸發殘餘物中添加甲苯(4 mL)及苯酚(0.05 g)。在0℃下,藉由添加3.5 mL TFA來進行Boc裂解。藉由HPLC(方法MIH-009-2TG11)監測反應。
所獲得之結果彙總於表3中且圖解呈現於圖1中。
Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl之保護基
結果
該等物質中之痕量DMF顯著抑制Boc保護基之移除。因此,與在藉由用EtOAc萃取所獲得之物質的情況下相比,藉由用DCM萃取所獲得之物質的Boc裂解顯著較慢。
本發明之萃取方法允許有效分離極性非質子性溶劑(諸如DMF)與所分離胜肽。因此,預期藉由本發明之萃取方法分離之胜肽物質的酸解裂解可順利進行。
實施例4(比較)使Boc-Ser(OBzl)-OH與H-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu (OBzl)偶合
在20℃下將Boc-Ser(OBzl)-OH(1.62 g,5.5 mmol)溶解於DMF(25 mL)中,且添加至粗製H-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)中。向其中添加HOBt.H2O(0.89 g,5.8 mmol)及EDC.HCl(1.2 g,6.3 mmol),且將反應混合物冷卻至5℃。將反應混合物保持在此溫度下直至藉由HPLC證實完全轉化。藉由以下方法監測反應進展:將5 μL反應混合物樣品在乙酸:水(9:1)中稀釋50倍且根據上述方法MIH-009-2TG11進行分析。
a)用MeTHF萃取及在DIPE中沈澱
將含有5 g Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)之25 mL反應混合物與MeTHF(75 mL)及含有100 g/L NaCl之水溶液(75 mL)組合。在充分混合且進行相分離(約4分鐘)之後,移除下層水層。用含有100 g/L NaCl之水溶液(3×75 mL)將上層有機層再萃取三次。最後分離有機層且在30℃、60毫巴下部分蒸發至殘餘體積為10 mL。在0℃下,在攪拌下將經部分蒸發之有機層逐滴添加至DIPE(250 mL)中,其中發生胜肽沈澱。將所得混合物轉移至裝備20 μm孔徑過濾器之2.7 cm直徑過濾管柱中。在50毫巴之壓力下進行過濾。在3分鐘45秒內過濾全部的沈澱母液(260 mL)。過濾後之濾餅高度為3.5 cm,得到過濾性係數K=848。收集固體且在減壓下乾燥。分離呈固體物質形式之4.5 g胜肽。
分離之胜肽的影像如圖2中所示(40倍放大)。
藉由HPLC分析由萃取過程產生之水層及沈澱母液。其中所偵測之胜肽量低於由實施例4產生之25 mL反應混合物中所存在之胜肽總量的0.5重量%。
b)比較實施例:向沈澱母液中添加DMF之影響
如以上a)所述進行萃取及沈澱程序,但在進行胜肽過濾之前向沈澱混合物中添加DMF(2.5 mL)。固體沈澱物立即變成不可過濾之膠狀固體。
c)比較實施例:在DIPE中直接沈澱
在0℃下,在攪拌下將實施例4中所獲得之含有5 g Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Lcu(OBzl)之25 mL反應混合物逐滴添加至DIPE(250 mL)中以進行沈澱。胜肽以黏稠膠狀固體形式沈澱。傾析之後,將清液抽出且用第二批DIPE(250 mL)替代。將所得混合物攪拌1小時以便將黏稠膠狀固體解聚集。傾析之後,再次用第三批DIPE(250 mL)替代清液。將混合物再攪拌1小時且最後將其轉移至過濾管柱中。然而,大部分固體仍呈黏稠膠狀固體形式黏著於沈澱容器上且因此無法轉移。在2分鐘30秒內過濾母液,產生1.75 cm高之濾餅。此獲得過濾係數K=636。在減壓下乾燥所收集之固體。
分離2.45 g胜肽。
d)比較實施例:在水中直接沈澱。
在0℃下,在攪拌下將由實施例4產生且含有5 g Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl )-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)之25 mL反應混合物逐滴添加至水(250 mL)中以進行沈澱。此產生極薄沈澱物,隨後將其轉移至過濾管柱中。過濾速率極低(<3 mL/h),大量沈澱物在過濾初期通過過濾器且在約65分鐘之後,過濾器明顯堵塞。此外,未明顯傾析沈澱物。因此,不可能收集所獲得之沈澱物。
結果
胜肽Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)在DMF存在下沈澱(實施例b)至實施例d))產生難以處理之膠狀固體。在實施例a)中,在已藉由萃取實質上移除痕量DMF之後,進行胜肽Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)之沈澱。所得產物可以良好產率分離且容易過濾。
本發明之萃取方法允許有效分離極性非質子性溶劑(諸如DMF)與胜肽。因此,可排除在胜肽沈澱方法中極性非質子性溶劑之不合需要之干擾。
圖1說明殘餘DMF對胜肽Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl之Boc保護基之移除速率的影響。
圖2展示不存在DMF時所沈澱之胜肽Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)的影像。
<110> 隆沙有限公司 隆沙布萊恩公司
<120> 萃取胜肽之方法及其於液相胜肽合成之應用
<130> LP2297TW00
<150> EP 11170094
<151> 2011-06-16
<150> US 61/497,642
<151> 2011-06-16
<150> US 61/498,100
<151> 2011-06-17
<160> 5
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工胜肽
<400> 1
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<223> 人工胜肽
<400> 5

Claims (25)

  1. 一種自由胜肽偶合反應所產生之反應混合物中萃取胜肽之方法,該反應混合物含有該胜肽及選自由N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺及N-甲基-2-吡咯啶酮組成之群的極性非質子性溶劑,其中該方法包含步驟a)及步驟b):步驟a)包含向該反應混合物中添加組分a1)及組分a2),其中:組分a1)為甲苯;組分a2)為水;以至於獲得具有有機層及水層之兩相系統;步驟b)包含分離含有該胜肽之該有機層與該水層,其中:步驟a)中所獲得之該兩相系統的特徵在於以下體積比:極性非質子性溶劑:甲苯=1:20至1:2;及極性非質子性溶劑:水=1:20至1:2。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法,其中在步驟a)中,向該反應混合物中添加另一組分a3),組分a3)為有機溶劑1,該有機溶劑1係選自由正庚烷、2-甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙腈及四氫呋喃組成之群;以至於獲得具有有機層及水層之兩相系統;其中步驟a)中所獲得之該兩相系統的特徵在於以下體積 比:極性非質子性溶劑:甲苯=1:20至1:2;極性非質子性溶劑:有機溶劑1=1:5至30:1;及極性非質子性溶劑:水=1:20至1:2。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法,其中步驟a)中所獲得之該兩相系統的特徵在於以下體積比:極性非質子性溶劑:甲苯=1:6至1:3;極性非質子性溶劑:有機溶劑1=1:1至4:1;及極性非質子性溶劑:水=1:5至1:3。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法,其中該極性非質子性溶劑係選自由N,N-二甲基甲醯胺及N-甲基-2-吡咯啶酮組成之群。
  5. 如申請專利範圍第2項或第3項之方法,其中該有機溶劑1係選自由乙腈及四氫呋喃組成之群。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法,其中該組分a2)含有至少一種選自由氯化鈉、硫酸氫鈉、硫酸氫鉀、碳酸氫鈉及磷酸氫鈉組成之群的無機鹽。
  7. 如申請專利範圍第4項之方法,其中該組分a2)含有至少一種選自由氯化鈉、硫酸氫鈉、硫酸氫鉀、碳酸氫鈉及磷酸氫鈉組成之群的無機鹽。
  8. 如申請專利範圍第5項之方法,其中該組分a2)含有至少一種選自由氯化鈉、硫酸氫鈉、硫酸氫鉀、碳酸氫鈉及磷酸氫鈉組成之群的無機鹽。
  9. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法,其 中該組分a2)之pH值在5至8範圍內。
  10. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法,其中在步驟b)之前對步驟a)中所獲得之該兩相系統進行過濾。
  11. 如申請專利範圍第4項之方法,其中在步驟b)之前對步驟a)中所獲得之該兩相系統進行過濾。
  12. 如申請專利範圍第5項之方法,其中在步驟b)之前對步驟a)中所獲得之該兩相系統進行過濾。
  13. 如申請專利範圍第6項之方法,其中在步驟b)之前對步驟a)中所獲得之該兩相系統進行過濾。
  14. 如申請專利範圍第7項之方法,其中在步驟b)之前對步驟a)中所獲得之該兩相系統進行過濾。
  15. 如申請專利範圍第8項之方法,其中在步驟b)之前對步驟a)中所獲得之該兩相系統進行過濾。
  16. 如申請專利範圍第9項之方法,其中在步驟b)之前對步驟a)中所獲得之該兩相系統進行過濾。
  17. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法,其中在20℃至30℃之溫度下進行步驟a)及步驟b)。
  18. 一種在液相中製備胜肽之方法,該方法包含步驟aa)、步驟bb)及步驟cc):在步驟aa)中,在選自由N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺及N-甲基-2-吡咯啶酮組成之群的極性非質子性溶劑中且在存在偶合試劑的情況下進行胜肽偶合反應;在步驟bb)中,根據如申請專利範圍第1項至第18項 中任一項之方法萃取所產生之胜肽;及在步驟cc)中,將步驟bb)中所獲得之有機層之至少一部分蒸發。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法,其中該偶合試劑係選自由O-1H-苯并***之鹽、鏻鹽及碳化二亞胺偶合試劑組成之群。
  20. 如申請專利範圍第18項之方法,其中三級鹼係選自由N,N-二異丙基乙胺、三乙胺及N-甲基嗎啉組成之群,且該三級鹼存在於步驟aa)之該胜肽偶合反應中。
  21. 如申請專利範圍第19項之方法,其中三級鹼係選自由N,N-二異丙基乙胺、三乙胺及N-甲基嗎啉組成之群,且該三級鹼存在於步驟aa)之該胜肽偶合反應中。
  22. 如申請專利範圍第18項至第21項中任一項之方法,其另外包含進一步的步驟dd)、步驟ee)及步驟ff),其中在步驟dd)中,將步驟cc)中所獲得之該有機層與選自由乙腈、***、二異丙醚及正庚烷組成之群的有機溶劑2組合;在步驟ee)中,使至少很大一部分之該胜肽沈澱;及在步驟ff)中,藉由過濾分離該沈澱之胜肽。
  23. 如申請專利範圍第18項至第21項中任一項之方法,其中在該胜肽之N末端保護基為第三丁氧基羰基保護基的情況下,用三氟乙酸處理步驟cc)中所獲得之該有機層,該第三丁氧基羰基保護基係藉由該三氟乙酸處理來移 除。
  24. 如申請專利範圍第18項至第21項中任一項之方法,其中在該胜肽之N末端保護基為茀基-9-甲氧基羰基保護基的情況下,用哌啶處理由該胜肽偶合反應產生且在步驟aa)中獲得之該反應混合物,該茀基-9-甲氧基羰基保護基係藉由該哌啶處理來移除。
  25. 如申請專利範圍第18項至第21項中任一項之方法,其中該胜肽之C末端羧酸基經保護而呈2-氯苯基二苯基甲酯或N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-醯胺形式。
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