CN116731154A - 一种全液相法制备替西帕肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，具体涉及一种全液相法制备替西帕肽的方法。本发明通过碳基可溶性多肽合成载体来制备多肽片段，克服了固相多肽合成单批次产量低和不能准确中控的缺点。同时在合成短肽片段过程中通过打浆纯化，获得较纯的片段；在合成长肽时由于长链烷烃载体的存在，杂质也可以通过乙腈低温打浆去除；该工艺简单高效，设备成本低。替西帕肽的主链合成完毕后，再将Ara(OtBu)‑Glu(ɑ‑OtBu)‑AEEA‑AEEA‑OH引入到第20位Lys的侧链，大幅节约了物料成本。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，具体涉及一种全液相法制备替西帕肽的方法。
背景技术
替西帕肽（Tirzepatide）是一款葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体双重激动剂，可通过双重作用机制激活参与血糖控制的激素受体-GIP和GLP-1两种肠促胰素受体。在2型糖尿病成人患者中，与诺和诺德注射用司美格鲁肽（Semaglutide，1mg，皮下注射，每周一次）相比，3种剂量替西帕肽（皮下注射，每周一次）在降低血糖（A1C）和体重方面均显示出优越性。在这项研究中，替西帕肽在控制血糖和减轻体重方面表现出了优异的效果，这2项指标都是衡量2型糖尿病患者健康状况的重要指标。与司美格鲁肽相比，替西帕肽具有更好的降低血糖和体重效果。重要的是，接受替西帕肽治疗的患者中，许多患者在没有经历低血糖（小于54mg/dL）的情况下实现A1C的显著降低。
替西帕肽具有以下的结构：
Tyr1-Aib-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr10-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp15-Lys-Ile-Ala-Gln-Lys20(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid)-Ala-Phe-Val-Gln-Trp25-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2。
礼来研发团队报道了固液合成方法，先用固相合成制备了4个片段，然后再用连续流液相反应、陶瓷膜纳滤除杂的方式，达到5kg级别地制备了替西帕肽（Kilogram-ScaleGMP Manufacture of Tirzepatide Using a Hybrid SPPS/LPPS Approach withContinuous Manufacturing. Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 7, 1628–1636），现有技术中又较多的替西帕肽的制备工艺专利（CN201911063432、CN202011642239、CN202080011536、CN202110359421、CN202110359495、CN202211588132、CN202211648825、CN202211685817），但这些专利均采用固相合成技术。对于制备替西帕肽这种长肽，固相合成的收率较低，成本很高。单批次生产1kg成品已经是很大的规模，其改进生产工艺也比原研团队的工艺逊色不少。
其次，无论是礼来研发团队还是上述制备工艺专利均通过Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu (α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH这个中间体把Lys20的侧链提前引入，较大的基团导致后续偶联其它氨基酸比较困难。合成Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedi oicacid(mon-tBu))-OH比Ara(OtBu)-Glu(ɑ-OtBu)-AEEA-AEEA-OH多出4步，收率较低。
Ara(OtBu)-Glu(ɑ-OtBu)-AEEA-AEEA-OH的结构式如下：
替西帕肽的临床数据显示其具有很好减肥效果，而且世界减肥市场规模很大，将来对此原料药的需求可能达到吨级。不论是上述的生产工艺还是基因编辑重组-发酵方法均很难实现替西帕肽的大规模化生产。与上述工艺特点不同，本发明提供了一种全液相合成方法制备替西帕肽的方法，多肽片段制备和片段偶联成长肽均采用液相合成，可以大幅提高替西帕肽的生产规模。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种全液相法制备替西帕肽的方法。通过碳基可溶性多肽合成载体来制备多肽片段，克服了固相多肽合成单批次产量低和不能准确中控的缺点。同时在合成短肽片段过程中通过打浆纯化，获得较纯的片段；在合成长肽时由于长链烷烃载体的存在，杂质也可以通过乙腈低温打浆去除；该工艺简单高效，设备成本低。替西帕肽的主链合成完毕后，再将Ara(OtBu)-Glu(ɑ-OtBu)-AEEA-AEEA-OH引入到第20位Lys的侧链，大幅节约了物料成本。
一方面，本发明提供了一种替西帕肽的全液相制备方法，该制备方法包括以下步骤：
（1）采用液相多肽合成法制备多肽片段a-f；
（2）将e脱Fmoc保护后与d偶联得到Fmoc-AA(22-39)-TAG2；
（3）将步骤（2）的Fmoc-AA(22-39)-TAG2脱Fmoc保护后与c偶联得到Fmoc-AA(15-39)TAG2；
（4）将b脱Fmoc保护后与a偶联得到Boc-AA(1-14)-TAG1；
（5）将步骤（4）的Boc-AA(1-14)-TAG1脱TAG1，得到Boc-AA(1-14)-OH；
（6）将步骤（3）的Fmoc-AA(15-39)TAG2脱Fmoc保护后与步骤（5）的Boc-AA(1-14)-OH偶联合成主链Boc-AA(1-39)-TAG2；
（7）将步骤（6）的Boc-AA(1-39)-TAG2脱PG1保护后与f偶联得到全保护的替西帕肽-TAG2，所述的全保护的替西帕肽-TAG2结构为：
Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile- Ala-Gln-Lys(AEEA-AEEA- Glu (ɑ-OtBu)-Ara(OtBu))-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro- Ser (tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH2；
（8）酸切割步骤（7）的全保护的替西帕肽-TAG2得到替西帕肽粗品；
（9）纯化替西帕肽粗品，干燥得到替西帕肽纯品，所述的替西帕肽纯品结构为：
Tyr1-Aib-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr10-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp15-Lys-Ile-Ala-Gln-Lys20(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid)-Ala-Phe-Val-Gln-Trp25-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2。
其中，所述的多肽片段a为：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH；
所述的多肽片段b为：
Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr[PSI(Me,Me)Pro]-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser[PSI(Me,Me)Pro]-Ile-Aib-Leu-TAG1；
所述的多肽片段c为：Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln-Lys(PG1)-Ala-OH；
所述的多肽片段d为：Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-OH；
所述的多肽片段e为：
Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-TAG2；
所述的多肽片段f为：Ara(OtBu)-Glu(ɑ-OtBu)-AEEA-AEEA-OH。
具体地，所述的TAG1为碳基多肽合成载体，结构如下：
。
优选地，所述的TAG1结构式中R为18-28个碳原子的烷基。
进一步优选地，所述的烷基为直链饱和烷基。
具体地，所述的PG1为胺基保护基Dde或ivDde。
具体地，所述的TAG2为碳基多肽合成载体，结构如下：
。
优选地，所述的TAG2结构式中R1为18-28个碳原子的烷基。
优选地，所述的烷基为直链饱和烷基。
具体地，步骤（2）、（3）、（4）、（6）和（7）偶联反应的介质可以是醚类或酰胺中的至少一种。
优选地，步骤（2）、（3）、（4）和（7）偶联反应的介质可以是醚类；步骤（6）偶联反应的介质可以是醚类和酰胺的混合溶液。
进一步优选地，步骤（2）、（3）、（4）和（7）偶联反应的介质可以是2-甲基四氢呋喃或四氢呋喃；步骤（6）偶联反应的介质为四氢呋喃和DMF的混合溶液。
更进一步优选地，步骤（2）偶联反应的介质为2-甲基四氢呋喃；（3）、（4）和（7）偶联反应的介质为四氢呋喃；步骤（6）偶联反应的介质为四氢呋喃：DMF=4：1。
具体地，前述的偶联反应中的缩合试剂包括：DIC/Oxyma pure、DIC/HOBt、T3P、T4P、DMT-MM、HBTU/HOBt、COMU、Pyoxime或HATU/HOAt中的一种或多种。
本发明所取得的技术效果：
（1）单批次产量高。本发明在通过碳基可溶性多肽合成载体来制备多肽片段，由于是均相反应，单批次可以实现公斤级到吨级生产，克服了固相多肽合成单批次产量低（克到公斤级）的问题。
（2）中控条件清晰。与固相合成不同，在液相制备片段或长肽的过程中，由于多肽-合成载体能够溶解在有机溶剂当中，可以用TLC、HPLC、质谱等准确地检测反应的进展情况，而固相合成全程仅凭经验，或者得到错误的结果，比如茚三酮显色标示偶联已经完全，但实际仍有5%胺基未形成酰胺键。
（3）纯化工艺简单。在合成短肽片段过程中通过打浆纯化，获得较纯的片段，在合成长肽时由于长链烷烃载体的存在，杂质也可以通过乙腈低温打浆去除，该工艺简单高效，设备成本低。
（4）物料成本低。替西帕肽的主链合成完毕后，再将Ara(OtBu)-Glu (ɑ-OtBu)-AEEA-AEEA-OH引入到第20位Lys的侧链，大幅节约了物料成本。
（5）易放大生产。可溶性碳基多肽合成载体引入替西帕肽的制备流程当中，使得反应检测准确，产品容易放大生产。
附图说明
图1为实施例7 替西帕肽粗品的高效液相色谱图。
图2为实施例7 替西帕肽纯品的液相色谱图。
图3为实施例7 替西帕肽粗品的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明使用的缩写及英文所对应的含义:
| Ara(OtBu) | 20-叔丁酯-正十九烷酰基 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| T3P | 1-丙基磷酸酐 |
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| DBU | 1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯 |
| DIC | N，N'-二异丙基碳二亚胺 |
| HOBt | 1-羟基苯并*** |
| HATU | 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
| HBTU | 苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| COMU | (2-肟基-氰基乙酸乙酯)-N，N-二甲基-吗啉基脲六氟磷酸酯 |
| TEA | 三乙胺 |
| DIEA | N，N-二异丙基乙胺 |
| DBU | 1,8-二偶氮杂双螺环[5.4.0]十一-7-烯 |
| tBu | 叔丁酯 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| ivDde | 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基 |
| Dde | 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| PCB | 2,6-二氯苯甲酰氯 |
| DMT-MM | 4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基氯化吗啉鎓盐 |
| Oxyma pure | 2-肟氰乙酸乙酯 |
| Pyoxime | 氰基(羟基亚氨基)醋酸乙酯基-O2]三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐 |
基础实验
多肽片段的合成步骤如下：
（1）TAG1的醇与Fmoc-AA1通过PCB缩合得到TAG1- Fmoc-AA1脂。
（2）TAG1-Fmoc-AA1脂用哌啶或DBU/哌啶脱除Fmoc保护基得到TAG1-AA1-NH2。
（3）用常规多肽缩合试剂把Fmoc-AA2与TAG1-AA1-NH2偶联得到TGA1-AA1-AA2-Fmoc。
（4）TAG1-AA1-AA2-Fmoc用哌啶或DBU/哌啶脱除Fmoc保护基得到TAG1-AA1-AA2-NH2。
（5）按照步骤2-4循环反应直到得到TAG1-AA1-AA2-……AAn-NH-PG3
此处根据不同片段的保护需求，PG3可选取Fmoc、Boc、CBZ、Dde、ivDde、Alloc等。
（6）TAG1-AA1-AA2-……AAn-NH-PG3用1%-2%的三氟乙酸，或0.2%-0.5%的氯化氢溶液脱除碳基多肽合成载体TGA1得到含保护基的多肽片段。
上述步骤（1）-（6）中所用到的反应溶剂选取二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、2-甲基四氢呋喃、DMF或者他们的组合。脱除Fmoc时采用10-20%哌啶或者1当量DBU/5%-10%哌啶。多肽偶联时缩合试剂选取DIC/Oxyma pure，DIC/HOBt，T3P，T4P，HBTU/HOBt，COMU的一种或多种。
反应后处理：偶联时反应完毕，减压旋干溶剂，加入乙腈打浆数次除掉反应原料和杂质，过滤后，滤饼直接用于下一步反应。脱Fmoc步骤，反应完毕，反应液冷却到0-10℃，然后加入85%磷酸或者盐酸调Ph到中性，减压旋干溶剂，先用水洗去盐分，再加入乙腈打浆数次除掉反应原料和杂质，过滤后，滤饼直接用于下一步反应。脱TAG1这步，反应结束，向反应液里面加入适量石油醚，多肽片段析出来，载体TAG1被石油醚溶走。除掉载体的多肽片段用水洗去残留的酸，然后溶于有机溶剂、干燥、减压旋干得到精制的中间体。
实施例1 Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH
1.1Fmoc-Gly-TAG1(C18)的合成
将Fmoc-Gly-OH 446g(1.5mol)、DIC 189.3g(1.5mol)、HOBt 202.6g(1.5mol)与2,4-二十八烷氧苯甲醇525g (1mol)混合于6500mL二氯甲烷中，室温下反应16小时，HPLC检测显示反应完全。减压旋干溶剂，得到的膏状物用6000mL乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤，得到的固体再用乙腈打浆一次，过滤和晾干后得到纯净的Fmoc-Gly-TAG1(C18) 687g，收率85.1%。
1.2H-Gly-TAG1(C18)合成
Fmoc-Gly-TAG1(C18) 804g溶于7200mL二氯甲烷，再加入800mL哌啶，反应液在室温下搅拌20分钟，Fmoc被脱除完全。将反应液冷却到5-10℃，加入294g 85%磷酸，减压旋干溶剂，得到的膏状物用乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤得到的固体再用水打浆二次以除尽哌啶盐，所得固体再用乙腈打浆2遍，过滤和晾干后得到H-Gly-TAG1(C18) 535g，收率92%。
1.3Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-TAG1(C18)合成
将Fmoc-Glu(OtBu)-OH 440.4g (1.04mol)、 DIC 131.2g (1.04mol)、Oxymapure147.8g (1.04mol)与H-Gly-TAG1(C18) 400g (0.69mol)混合在4L二氯甲烷中，室温下搅拌40分钟，HPLC检测显示反应完全。减压旋干溶剂，得到的膏状物用5升乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤得到的固体再用乙腈打浆二次，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-TAG1(C18) 635g，收率93%。
1.4Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-TAG1(C18)合成
以635g Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-TAG1(C18)为起始投料量，按照实施例1中1.2和1.3的方法合成得到Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-TAG1(C18) 409g ，四步总收率51%。
1.5Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH合成
Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-TAG1(C18) 604g （0.45mol）溶于700mL 2%TFA/二氯甲烷的混合溶剂中中，室温下搅拌40分钟，HPLC检测显示TAG1(C18)被脱除完全。向反应液中加入1200mL石油醚，析出大量膏状物。滗出溶剂层，膏状物再用石油醚打浆2次以便载体可以去除完全，然后用水来洗涤膏状物3次除去残留的三氟乙酸，最后用二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，减压蒸干后得到276g类白色固体产品，收率93.8%。
实施例2Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(ivDde)-Ala-OH合成
2.1Fmoc-Ala-TAG1(C22)的合成
将Fmoc-Ala-OH 467g (1.5mol)、2,6-二氯苯甲酰氯314.2g (1.5mol)、吡啶400mL混合于8000mL二氯甲烷，搅拌10分钟后，再加入2,4-二十二烷氧苯甲醇757.3g (1mol)，室温下反应7小时，HPLC检测显示反应完全。减压旋干溶剂，得到的膏状物用8L乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤，得到的固体再用乙腈打浆一次，过滤和晾干后得到纯净的Fmoc-Ala-TAG1(C22) 1006g，收率96%。
2.2H-Ala-TAG1(C22)合成
Fmoc-Ala-TAG1(C22) 1006g (0.96mol)溶于6000mL二氯甲烷，依次加入146gDBU、200mL哌啶，反应液在室温下搅拌20分钟，Fmoc被脱除完全。将反应液冷却到5-10℃，用浓盐酸将反应液的Ph调到7.0，减压旋干溶剂，得到的膏状物用乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤得到的固体再用乙腈打浆一次，过滤得到的固体再用水打浆二次以除尽哌啶盐，所得固体再用乙腈打浆2遍，过滤和晾干后得到H-Ala-TAG1(C22) 700g，收率88%。
2.3Fmoc-Lys(ivDde)-Ala-TAG1(C22)合成
将Fmoc-Lys(ivDde)-OH 724g (1.26mol)、 HBTU 455g (1.20mol)、HOBt 170g(1.26mol)与H-Ala-TAG1(C22) 700g (0.84mol)混合在二氯甲烷中，室温下搅拌40分钟，HPLC检测显示反应完全。减压旋干溶剂，得到的膏状物用乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤，得到的固体再用乙腈打浆二次，得到Fmoc-Lys(ivDde)-Ala-TAG1(C22)1047g，收率90%。
2.4Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln-Lys(ivDde)-Ala-TAG1(C22)合成
以1047g Fmoc-Lys(ivDde)-Ala-TAG1(C22)为起始投料量，按照实施例2中的2.2和2.3的方法合成得到Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln-Lys(ivDde)-Ala-TAG1(C22) 819g，10步总收率46%。
2.5Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln-Lys(ivDde)-Ala-OH合成
Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln-Lys(ivDde)-Ala-TAG1(C22) 819g(0.35mol) 溶于1L六氟异丙醇和8L 1%TFA二氯甲烷的混合液中，室温下搅拌40分钟，质谱检测显示TAG1(C22)被脱除完全。向反应液中加入8L石油醚，析出大量膏状物。滗出溶剂层，膏状物再用石油醚打浆2次以便载体可以去除完全，然后用水来洗涤膏状物3次除去残留的三氟乙酸，最后用二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，减压蒸干后得到434g类白色固体产品，收率78%。
实施例3 Boc-AA(1-14)-OH合成
3.1H-Thr(tBu)-Phe-Thr[PSI(Me,Me)Pro]-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser[PSI(Me,Me)Pro]-Ile-Aib-Leu-TAG1(C18)
Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr[PSI(Me,Me)Pro]-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser[PSI(Me,Me)Pro]-Ile-Aib-Leu-TAG1(C18)632g (0.27mol)溶于5L 2-甲基四氢呋喃，依次加入200mL DBU、250mL哌啶，反应液在室温下搅拌20分钟，Fmoc被脱除完全。将反应液冷却到5-10℃，用浓盐酸将反应液的Ph调到7.0，减压旋干溶剂，得到的膏状物用6L乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤得到的固体再用乙腈打浆一次，过滤得到的固体再用水打浆二次以除尽有机盐，所得固体再用乙腈打浆2遍，过滤和晾干后得到过滤和晾干后得到产品529g。
3.2Boc-AA(1-14)-TAG1(C18)
Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH 204g (0.32mol)、Pyoxime 168.7g(0.32mol)、DIEA 116g (0.9mol)混合于6000mL四氢呋喃当中，搅拌10分钟后加入H-Thr(tBu)-Phe-Thr[PSI(Me,Me)Pro]-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser[PSI(Me,Me)Pro]-Ile-Aib-Leu-TAG1(C18) 529g (0.24mol)，室温搅拌3小时，质谱检测显示偶联完全。向反应液中加入600g硅藻土，减压蒸干溶剂，得到的固体用6L乙腈搅拌10分钟后，再搅拌下降温到-5℃，迅速离心过滤，得到的固体再重复冷却离心二次，得到Boc-AA(1-14)-TAG1(C18)与硅藻土的混合物1240g。Boc-AA(1-14)-TAG1(C18) 与硅藻土的混合物用四氢呋喃提取3次，所得四氢呋喃减压蒸干得到Boc-AA(1-14)-TAG1(C18) 533g 收率83%。
3.3Boc-AA(1-14)-OH
533g Boc-AA(1-14)-TAG1(C18)溶于10L 1%TFA二氯甲烷中，室温下搅拌60分钟，TAG1(C18)被脱除完全。向反应液中加入10L石油醚，析出大量膏状物。滗出溶剂层，膏状物再用石油醚打浆2次以便载体可以去除完全，然后用水来洗涤膏状物3次除去残留的三氟乙酸，最后用二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，减压蒸干后得到357g白色固体产品，收率84%。
实施例4 .Fmoc-AA(15-39)- TAG2(C18)合成
4.1H-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)- TAG2(C18)合成
4.11Fmoc-Ser(tBu)-TAG2(C18)合成
Fmoc-Ser(tBu)-TAG2(C18) H-TAG2(C18)
Fmoc-Ser(tBu)-OH 230g (0.6mol)、HBTU 208.6g (0.55mol)、HOBt 81g(0.6mol)、DIEA 261mL (1.5mol)、混合于1600mL 二氯甲烷，室温下搅拌5分钟，向此反应液中加入1200mL含360g (0.5mol) H-TAG2(C18)的二氯甲烷溶液，室温下搅拌0.6小时，TLC检测显示偶联完全。得到的膏状物用8升乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤，得到的固体再用乙腈打浆一次，过滤和晾干后得到纯净的Fmoc-Ser(tBu)-TAG2(C18)510.4g，收率94%。
4.12H-Ser(tBu)-TAG2(C18)合成
Fmoc-Ser(tBu)-TAG2(C18) 500g (0.46mol)溶于4000mL二氯甲烷，依次加入70gDBU、400mL哌啶，反应液在室温下搅拌20分钟，Fmoc被脱除完全。将反应液冷却到5-10℃，用浓盐酸将反应液的Ph调到7.0，减压旋干溶剂，得到的膏状物用乙腈搅拌，形成固体。固体与乙腈搅拌10分钟后过滤得到的固体再用乙腈打浆一次，过滤得到的固体再用水打浆二次以除尽哌啶盐，所得固体再用乙腈打浆2遍，过滤和晾干后得到H-Ser(tBu)-TAG2(C18) 362g，收率91%。
4.13 H-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)- TAG2(C18)合成
以362g (0.42mol) H-Ser(tBu)-TAG2(C18)为起始投料量，按照实施例2.2和2.3的投料比例和处理方法合成得到H-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly- Ala-Pro- Pro-Pro-Ser(tBu)- TAG2(C18) 449g，18步总收率66%。
4.2Fmoc-AA(22-39)TAG2(C18)合成
Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-OH 382.9g (0.25mol)、HBTU 91g (0.24mol)、HOBt 34g (0.25mol)、DIEA 87mL (0.5mol)、混合于4000mL 2-甲基四氢呋喃，室温下搅拌10分钟，然后加入H-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly- Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)- TAG2(C18) 275.6g (0.17mol)，室温下搅拌4小时，质谱检测显示偶联完全。向反应液中加入700g硅藻土，减压蒸干溶剂，得到的固体用乙腈搅拌10分钟后，再搅拌下降温到-5℃，迅速离心过滤，得到的固体再重复冷却离心二次，得到Fmoc-AA(22-39)-TAG2(C18)与硅藻土的混合物。该混合物用四氢呋喃提取数次，过滤后，滤液减压蒸干，Fmoc-AA(22-39)-TAG2 (C18) 408g，收率79%。
4.3H-AA(22-39)-TAG2 (C18)合成
Fmoc-AA(22-39)-TAG2(C18) 408g (0.134mol)溶于7000mL二氯甲烷，加入10%哌啶，反应液在室温下搅拌20分钟，Fmoc被脱除完全。将反应液冷却到5-10℃，缓慢加入浓盐酸使反应液的Ph为7.0，减压旋干溶剂，得到的膏状物用乙腈搅拌，形成固体，过滤得到的固体再用水打浆二次以除尽哌啶盐，所得固体再用乙腈打浆2遍，过滤和晾干后得到产品305.8g，收率81%。
4.4Fmoc-AA(15-39)TAG2(C18)合成
Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(ivDde)-Ala-OH 255.5g(0.16mol)、T3P 57g(0.18mol)、DIEA 55.4mL (0.32mol)、混合于5600mL四氢呋喃，加入H-AA(22-39)-TAG2(C18) 300g (0.106mol)，室温下搅拌4小时，质谱检测显示偶联完全。向反应液中加入700g硅藻土，减压蒸干溶剂，得到的固体用乙腈搅拌10分钟，再搅拌下降温到-5℃，迅速离心过滤，得到的固体再重复冷却离心二次，得到Fmoc-AA(22-39)-TAG2(C18)与硅藻土的混合物。该混合物用四氢呋喃提取3次，过滤后，滤液减压蒸干，Fmoc-AA(15-39)-TAG2(C18) 374.6g, 收率80%。
4.5 H-AA(15-39)-TAG2(C18)合成
Fmoc-AA(15-39)-TAG2(C18) 370g (0.084mol)溶于4500mL二氯甲烷，分别加入12.8g DBU，400mL哌啶，反应液在室温下搅拌30分钟，Fmoc被脱除完全。将反应液冷却到5-10℃，再用浓盐酸调Ph到7.0，加入500g硅藻土，减压下旋干溶剂，得到的膏状物用乙腈搅拌，形成固体。搅拌10分钟后，冷却到-10℃，迅速离心过滤，得到的固体再用水打浆2次，所得固体再用乙腈打浆2遍，过滤后用四氢呋喃提取3次，过滤，滤液减压蒸干，得到产品296g，收率84%。
实施例5 Boc-AA(1-39)-TAG2(C18)合成
Boc-AA(1-14)-OH 218g (0.105mol)、DMT-MM 30.9g (0.105mol)、DIEA 36.6mL(0.21mol) 溶解于9000mL 4：1四氢呋喃/DMF混合溶液，搅拌10分钟后加入H-AA(15-39)-TAG2(C18基) 295g (0.07mol)，室温下搅拌6小时，质谱检测显示偶联完全，减压蒸馏，除去大部分四氢呋喃，得到胶状物，该胶状物用水打浆，析出固体，所得固体再用冷乙腈打浆2次，晾干后不经处理用于下一步反应。
实施例6 Boc-全保护替西帕肽-TAG2(C18)合成
6.1Boc-AA(1-39)-TAG2(C18)脱除ivDde保护
实施例5得到的Boc-AA(1-39)-TAG2(C18) 混合物350g溶于5000mL 含2%水合肼的2-甲基四氢呋喃溶液，反应2小时，ivDde被脱除干净。该反应液用浓盐酸调Ph为7.0，加入500g硅藻土，减压蒸馏除去溶剂，所得固体用乙腈打浆，冷却到-10℃再过滤，重复乙腈打浆过滤操作2次，晾干后得到产品-硅藻土820g。
6.2Boc-全保护替西帕肽-TAG2(C18)合成
Ara(OtBu)-Glu(ɑ-OtBu)-AEEA-AEEA-OH 69.6g (0.08mol)，COMU 34.2g(0.08mol)，DIEA 26mL (0.15mol)混合于6000mL四氢呋喃当中，搅拌10分钟后加入6.1得到的产品-硅藻土820g (0.053mol) ，室温反应5小时，质谱检测显示偶联完全。减压蒸馏除去溶剂，所得固体用乙腈打浆，冷却到-10℃再过滤，重复乙腈打浆过滤操作2次，晾干后得到产品-硅藻土用四氢呋喃提取3次，减压蒸出四氢呋喃，得到Boc-全保护替西帕肽-TAG2(C18) 293g，收率70%。
全保护的替西帕肽-TAG2结构为：
Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile- Ala-Gln-Lys(AEEA-AEEA- Glu (ɑ-OtBu)-Ara(OtBu))-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro- Ser (tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH2。
实施例7 替西帕肽合成
Boc-全保护替西帕肽-TAG2(C18) 293g(0.042mol)溶于4000mL 多肽切割液(80%TFA：5%茴香醚：5%苯酚：5%水：5%TIS)，室温搅拌3小时，往反应液中加入8000mL冷***，析出多肽固体。经过多次离心和甲叔醚洗涤，再室温真空抽干后得到多肽粗品163g，粗品纯度70.1%。得到的粗品用常见多肽纯化方法处理，得到多肽纯品91g，纯度99.1%。
替西帕肽纯品结构为：
Tyr1-Aib-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr10-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp15-Lys-Ile-Ala-Gln-Lys20(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid)-Ala-Phe-Val-Gln-Trp25-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征等同替换所组成的技术方案。本发明的未尽事宜，属于本领域技术人员的公知常识。
Claims (10)
1.一种替西帕肽的全液相制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用液相多肽合成法制备多肽片段a-f；
（2）将e脱Fmoc保护后与d偶联得到Fmoc-AA(22-39)-TAG2；
（3）将步骤（2）的Fmoc-AA(22-39)-TAG2脱Fmoc保护后与c偶联得到Fmoc-AA(15-39)TAG2；
（4）将b脱Fmoc保护后与a偶联得到Boc-AA(1-14)-TAG1；
（5）将步骤（4）的Boc-AA(1-14)-TAG1脱TAG1，得到Boc-AA(1-14)-OH；
（6）将步骤（3）的Fmoc-AA(15-39)TAG2脱Fmoc保护后与步骤（5）的Boc-AA(1-14)-OH偶联合成主链Boc-AA(1-39)-TAG2；
（7）将步骤（6）的Boc-AA(1-39)-TAG2脱PG1保护后与f偶联得到全保护的替西帕肽-TAG2；
（8）酸切割步骤（7）的全保护的替西帕肽-TAG2得到替西帕肽粗品；
（9）纯化替西帕肽粗品，干燥得到替西帕肽纯品；
其中，所述的多肽片段a为：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH；
所述的多肽片段b为：
Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr[PSI(Me,Me)Pro]-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser[PSI(Me,Me)Pro]-Ile-Aib-Leu-TAG1；
所述的多肽片段c为：Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln-Lys(PG1)-Ala-OH；
所述的多肽片段d为：Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-OH；
所述的多肽片段e为：
Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-TAG2；
所述的多肽片段f为：Ara(OtBu)-Glu(ɑ-OtBu)-AEEA-AEEA-OH。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的TAG1为碳基多肽合成载体，结构如下：
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的TAG1结构式中R为18-28个碳原子的直链饱和烷基。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的PG1为胺基保护基Dde或ivDde。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的TAG2为碳基多肽合成载体，结构如下：
。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的TAG2结构式中R1为18-28个碳原子的直链饱和烷基。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）、（7）偶联反应的介质为醚类或酰胺中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）偶联反应的介质为醚类和酰胺的混合溶液；步骤（7）偶联反应的介质为醚类。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）偶联反应的介质为四氢呋喃和DMF的混合溶液；步骤（7）偶联反应的介质为四氢呋喃或2-甲基四氢呋喃。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的偶联反应中的缩合试剂包括：DIC/Oxyma pure、DIC/HOBt、T3P、T4P、DMT-MM、HBTU/HOBt、COMU、Pyoxime或HATU/HOAt中的一种或多种。
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