TW201500372A - 對ｆａｐ及ｄｒ５具特異性之雙特異性抗體、對ｄｒ５具特異性之抗體及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點之雙特異性抗體、對DR5具特異性之抗體、其製造方法、包含該等抗體之醫藥組合物、及其用途。

Description

對FAP及DR5具特異性之雙特異性抗體、對DR5具特異性之抗體及使用方法
本發明係關於包含對死亡受體5(DR5)具特異性之第一抗原結合位點及對纖維母細胞活化蛋白(FAP)具特異性之第二抗原結合位點之雙特異性抗體、對DR5具特異性之抗體、其製造方法、包含該等抗體之醫藥組合物、及其用途。
單株抗體為治療癌症之強效治療劑，此乃因其選擇性地靶向差別性地表現於癌細胞上之抗原。藉由激動單株抗體靶向癌細胞上之TRAIL(與TNF相關之細胞凋亡誘導配體)死亡受體呈現新一代的單株抗體療法，此乃因其能夠直接誘導標靶細胞之細胞凋亡。
於TRAIL結合時，諸如DR4及DR5之TNFR-SF家族死亡受體即刻三聚化。該三聚化誘導非本徵細胞凋亡路徑及包括卡斯蛋白酶(Caspase)活化之一連串複雜事件，此最終導致殺死標靶細胞。若發生DR5之高度叢集(亦即，多重三聚物之叢集)，則進一步增強細胞凋亡誘導。雖然死亡受體廣泛地表現於各種細胞類型上，但藉由非本徵路徑誘導細胞凋亡係受限於腫瘤細胞。由於激動DR4或DR5結合抗體可與死亡受體交聯且因此誘導細胞凋亡，故該等受體為癌症治療中之受關注標靶。至少八種死亡受體標靶分子參與臨床開發且已在臨床試驗 中針對諸如(例如)結腸直腸癌或肺癌之晚期實體腫瘤之不同適應症之可行治療進行評估。此外，已嘗試治療諸如淋巴瘤及/或多發性骨髓瘤之其他適應症。
述於US2007/0031414 A1及WO2006/083971中之為全人類DR5激動抗體之卓西單抗(Drozitumab)於高濃度在不存在交聯下顯示部分活體外細胞凋亡活性。然而，活體內數據顯示一種不同的作用模式：於FcR突變小鼠(或當FcR結合受到抑制之情況使用抗體變型時)中，卓西單抗為非活性，指示該分子之活體內活性主要取決於FcR介導之交聯。對該分子進行測試直至臨床II期，其似乎安全(未達到高達20mg/kg之MTD)但未展現任何顯著療效。
卡那木單抗(Conatumumab)(述於EP1922337A中)為另一種全人類DR5激動抗體。卡那木單抗之活性嚴格地取決於藉由Fc受體之交聯。與卓西單抗相反，此抗體係非配體阻斷。此外，此分子在臨床試驗中僅顯示極有限之療效。
為嵌合DR5抗體之LBY-135展現與卡那木單抗在交聯相依活性及非配體阻斷性質方面的類似特徵及不展現在單藥治療方面之任何顯著療效。此外，LBY-135在I期試驗之部分入選患者中顯示免疫原性之徵兆。
為DR4及DR5之重組產生天然配體(TRAIL)之杜拉樂明(Dulanermin)於臨床試驗中僅顯示有限之客觀響應率。使用天然配體具有某些缺點：TRAIL靶向包括死亡受體及誘餌受體二者之多種受體，及因此，選擇性為一顧慮。此外，TRAIL具有遠比單株抗-DR抗體短的血液半衰期，其為影響劑量及時程參數之因素。與單株抗-DR抗體相比，TRAIL之極短的血液半衰期需要大量且頻繁之給藥。此外，重組TRAIL之製造極為困難且繁瑣。
已停止所有三種DR5激動抗體及上述配體之開發。
兩種其他全人類抗體麥妥木單抗(Mapatumumab)(抗DR4)及來沙木單抗(Lexatumumab)(抗DR5)仍在開發中，然而，該等分子亦不展現於單藥治療中之可靠藥效。
替加珠單抗(Tigatuzumab)為經描述為在不存在當然具有全身毒性問題風險之二次交聯情況下具活體外活性(已處於低濃度下)之人類化DR5激動抗體。然而，亦如所有其他所述之激動DR5抗體，到目前為止，此分子尚未於Ph I/Ph II研究中展示具說服力的藥效及僅展現至高8mg/kg之最大耐受劑量MTD。
一種藉由靶向死亡受體來誘導細胞凋亡之不同方法係以作為四聚DR5結合奈米抗體之分子TAS266來實行(WO2011098520A1)。歸因於DR5結合部分之四價組態，據認為DR5交聯相較於標準二價抗體增加，此會導致增加的活性。然而，歸因於其小尺寸，此等分子(相比抗體)具有極短半衰期之缺點。此外，存在增加之全身毒性風險，此乃因此四聚分子並非靶向腫瘤。
在雙特異性抗體平臺中將DR5抗體卓西單抗與存於腫瘤周圍基質中之腫瘤抗原結合部分或抗原組合已由本申請案發明人描述為一種達致兩種效應之新穎方法：首先，DR5結合抗體可靶向腫瘤位點，此可避免潛在全身毒性問題(尤其在使用展現交聯相依活性之DR5抗體時)。其次，該腫瘤或腫瘤基質靶向部分接著亦充作誘導DR5高度叢集及隨後之腫瘤位點特異性細胞凋亡之交聯單元。基本概念已使用靶向不同腫瘤類型之卓西單抗_scFv融合分子來展現(參見WO 2011/039126)。
其中雙特異性抗體結合DR5及人類纖維母細胞活化蛋白(FAP；GenBank登錄號AAC51668)特別受到關注。最初係在培養纖維母細胞中使用單株抗體(mAb)F19識別出人類FAP(述於WO 93/05804中，ATCC編號HB 8269)。於若干物種(包括小鼠)中發現蛋白質的同源物 (Niedermeyer等人，Int J Cancer 71，383-389(1997)，Niedermeyer等人，Eur J Biochem 254，650-654(1998)；GenBank登錄號AAH19190)。FAP具有獨特的組織分佈：發現其之表現於包括肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巢癌及乳癌之所有原發性及轉移性上皮腫瘤之大於90%的反應性基質纖維母細胞上高度向上調節，然而其一般不存於正常成人組織中(Rettig等人，Proc Natl Acad Sci USA 85，3110-3114(1988)；Garin-Chesa等人，Proc Natl Acad Sci USA 87，7235-7239(1990))。後來的報告顯示FAP不僅在基質纖維母細胞中表現而且在某些類型之上皮源性惡性細胞中表現，且FAP表現直接與惡性表現型相關聯(Jin等人，Anticancer Res 23，3195-3198(2003))。令人意外地，本發明人發現靶向基質中之FAP及腫瘤細胞上之DR5之雙特異性抗體實際上誘導細胞凋亡，儘管該等標靶係位於不同細胞上。
於進一步的研究之後，本申請案發明人發現述於WO2011/039126中之含scFv之雙特異性分子均具有一些關於生產力、穩定性及聚集形成之導致次優非特異性活性之內因性問題。
於本申請案中，提供靶向FAP及DR5之新穎雙特異性抗體。本申請案發明人開發出僅在交聯之後具活性之新穎DR5結合部分。因此，腫瘤細胞細胞凋亡之誘導係取決於藉由FAP之DR5超高交聯及取決於Fc/FcR相互作用。因此，除了對FAP及DR5具特異性之雙特異性抗體之外，其中亦提供與DR5結合之新穎抗體。
相對地，上述習知DR5靶向分子之活性係取決於Fc受體(FcR)介導之高度叢集，及會受腫瘤中之免疫浸潤及活化狀態影響(Li與Ravetch，PNAS 2012；Wilson，Cancer Cell 2011；WO2011098520A1)。Fc/FcR相互作用會受生理人類IgG水平損害。因此，習知DR5標靶分子之活性經常受限於一些浸潤細胞(Moessner，Blood 2010)。藉由使用靶向DR5及FAP二者之雙特異性抗體，可經由 透過FAP之超高交聯顯著地增加敏感腫瘤細胞之百分比及減低對DR5激動劑之內因性抗性的風險。新穎DR5結合部分僅在與FAP交聯之後具活性，此可導致相較於DR5結合物阿普單抗(Apomab)及替加珠單抗經改良之安全性及毒理學性質。到目前為止已經過測試之DR5激動劑在臨床上具安全性，然而，DR5靶向分子之低療效已阻礙該等臨床程序。
此外，較佳之新穎DR5結合部分係與不同於卓西單抗的抗原決定基結合。
重要地，新穎DR5結合部分可用於包括新穎及已確認之雙特異性形式之許多種雙特異性DR5-FAP靶向抗體形式中。相對地，僅FAP結合部分之C端可與基於卓西單抗之雙特異性DR5-FAP靶向抗體形式融合，此乃因與卓西單抗之任何N端融合均會導致無活性分子。新穎DR5結合部分之提供因而明顯地擴大將DR5靶向部分用於各種雙特異性DR5-FAP靶向抗體形式中之可能性。此點因一些雙特異性抗體形式具有在生產性及活性方面之優異特性而尤其具重要性。
其中提供包括新穎DR5結合部分及親和力成熟FAP結合部分之新穎雙特異性抗體。
本發明之雙特異性抗體係以雙特異性抗體形式提供，其中一或多個交越-Fab片段係融合至IgG分子。交越Fab片段為重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者經交換之Fab片段。包括交越Fab片段之雙特異性抗體形式已述於(例如)WO2009080252、WO2009080253、WO2009080251、WO2009080254、WO2010/136172、WO2010/145792及WO2013/026831中。
到目前為止，僅呈含scFv形式之DR5-FAP雙特異性抗體經描述(WO2011/039126)。除了揭示於其中之新穎DR5結合物的有利性質之外，使用交越-Fab基雙特異性形式導致於生產期間之改良產率及減少 之聚集物及副產物。此外，scFv-及scFab基DR5-FAP靶向雙特異性抗體展現形成聚集物之傾向，及因此甚至於不存在FAP下亦具有較高之非特異***聯DR5之風險。因此，該等形式具有潛在性地誘導非標靶細胞(即，健康細胞)中細胞凋亡之缺點。
本文所提供新穎雙特異性抗體之DR5及FAP結合部分相較於習知之DR5抗體展現優異之活體內療效。本發明之較佳雙特異性抗體以高親和力與腫瘤基質上之FAP結合及以較低親和力與腫瘤細胞上之DR5結合。此外，本文所提供之DR5及FAP靶向雙特異性抗體不與密切相關之蛋白DR4、DcR1、DcR2(與DR5密切相關)及DPPIV(與FAP密切相關)交叉反應。此外，現首次可提供一種呈不同雙特異性形式之對各結合特異性之價數沒有限制之DR5-FAP雙特異性抗體。
總言之，本文所提供之新穎雙特異性DR5-FAP抗體具高度特異性及效力：其藉由以FAP相依方式在腫瘤細胞中達成DR5高度叢集且對正常細胞具低結合力，來選擇性地誘導細胞凋亡。
本發明係關於將靶向抗原結合位點之死亡受體5(DR5)與靶向纖維母細胞活化蛋白(FAP)之第二抗原結合位點組合之雙特異性抗體。藉此，死亡受體變成經交聯及標靶腫瘤細胞之細胞凋亡經誘導。該等雙特異性死亡受體激動抗體優於習知死亡受體靶向抗體之優點為僅在FAP表現之位點誘導細胞凋亡之特異性以及該等雙特異性抗體因誘導DR5高度叢集所致之較高效力。此外，提供與DR5結合之新穎抗體。如上所述，本發明之發明人開發出相較於已知的DR5結合物具有優異性質之新穎DR5結合部分，其經併入至新穎且有利的DR5-FAP雙特異性抗體中。
於一個實施例中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下 項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)由SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：17及SEQ ID NO.：75組成之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：25及SEQ ID NO.：83之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：84、SEQ ID NO.：96、SEQ ID NO.：98、SEQ ID NO.：104及SEQ ID NO.：108之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：20、SEQ ID NO.：27及SEQ ID NO.：86之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：21及SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：6、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：87、SEQ ID NO.：99、SEQ ID NO.：105、SEQ ID NO.：109及SEQ ID NO.：97之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9及SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10及SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11及SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12及SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13及SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14及SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗體，其中對DR5具特異性之抗原結合位點包括以下項：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2； (c)SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3及對FAP具特異性之抗原結合位點包括以下項：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個包括包含以下胺基酸序列之可變重鏈及可變輕鏈之對DR5具特異性之抗原結合位點：SEQ ID NO.：7及SEQ ID NO.：8；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：29；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：32；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：82及SEQ ID NO.：85；SEQ ID NO.：100及SEQ ID NO.：101；SEQ ID NO.：102及SEQ ID NO.：103；SEQ ID NO.：106及SEQ ID NO.：107；SEQ ID NO.：94及SEQ ID NO.：95；及至少一個包括包含SEQ ID NO.：15及SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之可變重鏈；及包含SEQ ID NO.：16及SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之可變輕鏈之對FAP具特異性之抗原結合位點。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個包括包含SEQ ID NO.：7之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO.：8之胺基酸序列之 可變輕鏈之對DR5具特異性之抗原結合位點；及至少一個包括包含SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區之對FAP具特異性之抗原結合位點。
較佳地，該雙特異性抗體為人類或人類化。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個該等Fab片段係經輕鏈(VLCL)連接至Fc結構域之第一或第二子單元及至少一個Fab片段係經重鏈(VHCH1)與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含：a)Fc結構域，b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定輕鏈(CL)的C-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該兩Fab片段係在恆定重鏈(CH1)的C-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含：a)Fc結構域，b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定重鏈(CH1)的C-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該 兩Fab片段係在恆定輕鏈(CL)的C-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，該雙特異性抗體針對DR5及FAP二者為二價。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，該雙特異性抗體針對DR5為二價及針對FAP為單價。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、三個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，該雙特異性抗體針對DR5為三價及針對FAP為單價。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區 或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，該雙特異性抗體針對DR5為單價及針對FAP為單價。
於一個實施例中，該雙特異性抗體包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之該等Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，至少一個該等Fab片段係經肽連接子與Fc結構域連接。
於一個實施例中，該雙特異性抗體包含包括減低與Fc受體之結合及/或效應子功能之一或多個胺基酸取代之Fc結構域。於一個實施例中，該一或多個胺基酸取代係在一或多個選自L234、L235、及P329之群之位置處。於一個實施例中，Fc結構域之各個子單元包括消除與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之三個胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其中第一重鏈之Fc部分包含第一二聚合模組及第二重鏈之Fc部分包含容許抗體之該兩重鏈異二聚合之第二二聚合模組。於一個實施例中，依照結進孔策略(knobs into holes strategy)，該第一二聚合模組包含結及該第二二聚合模組包含孔。
於另一個實施例中，提供一種與DR5特異結合之抗體，其包含：(a)選自由SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：17及SEQ ID NO.：75組成之群之重鏈互補決定區1(CDR1)；(b)選自SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：25及SEQ ID NO.：83之群之重鏈互補決定區2(CDR2)； (c)選自SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：84、SEQ ID NO.：96、SEQ ID NO.：98、SEQ ID NO.：104及SEQ ID NO.：108之群之重鏈互補決定區3(CDR3)；(d)選自SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：20、SEQ ID NO.：27及SEQ ID NO.：86之群之輕鏈CDR1；(e)選自SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：21及SEQ ID NO.：28之群之輕鏈CDR2；及(f)選自SEQ ID NO.：6、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：87、SEQ ID NO.：99、SEQ ID NO.：105、SEQ ID NO.：109及SEQ ID NO.：97之群之輕鏈CDR3；於另一個實施例中，提供一種與DR5特異結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3
於另一個實施例中，提供一種與DR5特異結合之抗體，其包括包含選自以下之群之胺基酸序列之可變重鏈及可變輕鏈：SEQ ID NO.：7及SEQ ID NO.：8；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：29；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：32；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：82及SEQ ID NO.：85；SEQ ID NO.：100及SEQ ID NO.：101；SEQ ID NO.：102及SEQ ID NO.：103；SEQ ID NO.：106及SEQ ID NO.：107；SEQ ID NO.：94及SEQ ID NO.：95； 於另一個實施例中，提供一種與DR5特異結合之抗體，其包括包含SEQ ID NO.：7之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO.：8之胺基酸序列之可變輕鏈。
於第二標的中，本發明係關於一種包含本發明之雙特異性抗體或與DR5特異結合之抗體之醫藥組合物。
於第三標的中，本發明係關於一種用於治療癌症之本發明之靶向DR5及FAP之雙特異性抗體或與DR5特異結合之抗體。於一個較佳實施例中，該癌症為胰癌或結腸直腸癌。於另一個實施例中，提供一種以雙特異性抗體或與DR5特異結合之抗體作為藥物之用途。較佳地，該用途係用於治療癌症，較佳係胰癌或結腸直腸癌。
於其他標的中，本發明係關於一種包含編碼本發明之雙特異性抗體或與DR5特異結合之抗體之重鏈之序列之核酸序列，一種包含編碼本發明之雙特異性抗體或與DR5特異結合之抗體之輕鏈之序列之核酸序列，一種包含本發明之核酸序列之表現載體，及關於一種包含本發明之載體之原核或真核宿主細胞。此外，提供一種包括培養宿主細胞以便產生出抗體之抗體製造方法。
圖1：兩種不同細胞株(SW872及GM05389)針對人類纖維母細胞活化蛋白(FAP)表現水平之FACS結合分析(a)。以不同濃度之抗FAP抗體測得之螢光強度顯示在三個量值範圍(黑色柱、灰色柱及影線柱)。作為二次抗體及僅細胞之陰性對照組反應分別示為點畫柱及白色柱。雖然GM05389細胞在所有受測試抗體濃度展現高於背景之FAP表現，但SW872細胞之FAP表現僅可以所使用的最高抗體濃度(10μg/ml)偵測到，表明該等細胞不適用於基於FAP的結合/細胞凋亡誘導實驗。此外，經顯示此細胞株幾乎不會經歷卓西單抗介導之細胞凋亡(b)。單獨的卓西單抗或另一種市售抗DR5抗體不會誘導相關之DNA斷裂。只 有當卓西單抗與抗人類Fc抗體交聯時，才可觀測到可偵測的低水平之細胞凋亡誘導。
圖2：透過與卓西單抗之FACS結合及隨後以經標記抗Fc抗體偵測來偵測於兩種不同人類腫瘤細胞株(乳癌細胞株MDA-MB-231及腎癌細胞株ACHN)上之DR5表現。兩種細胞株顯示人類DR5之相當的低表現水平。
圖3：用於偵測細胞凋亡之DNA斷裂ELISA分析。ACHN(A)或MDA-MB-231(B)標靶細胞係單獨地或在相等數目之表現GM05389纖維母細胞之FAP的存在下進行培養。分別以0.1μg/ml(A)及0.7nM(B)之濃度添加DR5-FAP雙特異性抗體(scFv融合)及在偵測DNA斷裂之前將細胞培養24h。關於卓西單抗之交聯，使用0.1μg/ml二次抗Fc抗體。
圖4：用於偵測細胞凋亡之DNA斷裂ELISA分析。於存在或不存在表現纖維母細胞(GM05389)之FAP下藉由雙特異性DR5-FAP抗體(具有融合scFab之卓西單抗)於ACHN細胞上誘導細胞凋亡。將具有不同FAP結合部分之雙特異性分子之活性與經或未經二次抗Fc抗體交聯之卓西單抗進行比較。以兩種不同濃度(1.0μg/ml及0.1μg/ml)使用抗體。於該等設置中，包含4G8 scFab融合之雙特異性分子(B)相較於包含3F2 scFab之分子(A)於DNA斷裂檢測中顯示優異之細胞凋亡誘導活性。
圖5：抗FAP CrossFab部分經標準(G4S)4連接子融合至卓西單抗IgG的C-端之兩種不同雙特異性DR5-FAP分子之示意圖。於一種情況(A)中，VHCL CrossFab係融合至卓西單抗IgG，而於(B)中，VLCH1鏈係如所示與IgG連接。這兩種分子僅為使用亦用於包含新單離DR5結合物之雙特異性分子之IgG-CrossFab組合之可能形式之實例。其他可能性包括於分子之IgG部分中之交叉，實施鹽橋及帶電殘基以穩定 CrossFab或使用不同連接子長度及順序。
圖6：於純化不同雙特異性DR5-FAP抗體形式期間聚結物含量的比較。所有形式係由具有融合至C-端之FAP結合域(純系4G8)之卓西單抗IgG組成。FAP結合部分係由二硫鍵穩定的scFv(A)、scFab(B)或CrossFab(C)中任一者組成。製備型尺寸篩除層析之層析圖顯示三種建構間之明顯差異。雖然scFv及CrossFab分子之製造相當，但包含scFab之建構顯示較低之產率及較高之聚結物含量。由此比較，包含CrossFab之分子看來最具前景。
圖7：重組人類FAP表現HEK293細胞上FACS結合之分析。將新穎CrossFab形式之DR5-FAP雙特異性分子與scFab分子、親本4G8 IgG及非相關陰性對照組卓西單抗進行比較。經顯示兩種CrossFab分子至少在與IgG對照組相同的範圍內與FAP結合。
圖8：雙特異性卓西單抗-FAP分子(CrossFab)同時與重組人類DR5及FAP結合之表面電漿共振(SPR，Biacore)分析。將作為配體之生物素化人類DR5-Fc固定至鏈黴親和素(streptavidin)晶片上，接著注射第一分析物(雙特異性CrossFab分子)。在與DR5-Fc結合(90秒的締合)及一短的解離時段(10秒)之後，添加不同濃度(100nM、500nM)之重組可溶性FAP(人類或鼠科)作為第二分析物及測量其他響應。將卓西單抗-X-FAP_A形式(A及B)之結合與卓西單抗-X-FAP_B(C及D)進行比較。測量各種建構與DR5及人類(A、C)或鼠科FAP(B、D)之結合。藉由針對所有受測試分子之此分析，可證實同時與DR5及人類/鼠科FAP結合。
圖9：用於偵測細胞凋亡之DNA斷裂ELISA分析。細胞凋亡誘導實驗中將兩種CrossFab分子(卓西單抗-X-Fab-A及卓西單抗-X-Fab-B)與卓西單抗及超高交聯卓西單抗在兩種細胞株(MDA-MB-231及GM05389)共培養分析中進行比較之結果。(A)於24小時後利用細胞死 亡偵測ELISA來偵測細胞凋亡之誘導。所有受測試建構係以7nM及0.7nM之濃度使用。將標靶及效應細胞之細胞凋亡誘導與單獨標靶細胞之細胞凋亡進行比較。(B)細胞死亡偵測ELISA(DNA斷裂)中利用卓西單抗(+/-Fc交聯)相對由融合至卓西單抗重鏈的C-端之FAP CrossFab組成之雙特異性DR5-FAP分子之共培養旁觀者細胞凋亡誘導的比較。包含親和力成熟FAP結合部分(28H1)之分子相較於包含較低親和力FAP結合物之分子顯示優異之活性。
圖10：用於偵測細胞凋亡之DNA斷裂ELISA分析。經由雙特異性卓西單抗-FAP CrossFab分子誘導細胞凋亡係取決於經由FAP之交聯。圖10顯示藉由經塗佈至ELISA盤之重組人類FAP交聯之CrossFab分子於MDA-MB-231細胞上誘導細胞凋亡之結果。雖然對照組分子(經抗Fc抗體交聯之卓西單抗)顯示類似的細胞凋亡誘導，與FAP或非相關對照組蛋白之塗佈無關，但雙特異性建構僅在塗佈FAP時展現顯著的細胞凋亡活性。藉由塗佈對照組質體，僅於最高建構濃度(7nM)下才可偵測到細胞凋亡，此可能係歸因於MDA-MB-231細胞株之基礎FAP表現。兩種受測試CrossFab分子之細胞凋亡活性類似及係在與超高交聯卓西單抗所觀察到的相同範圍內。
圖11：在利用表現人類纖維母細胞GM05389之FAP的共培養實驗中於不同人類腫瘤細胞株上之細胞凋亡誘導(DNA斷裂)的比較。將卓西單抗及超高交聯卓西單抗與雙特異性卓西單抗-4G8 CrossFab分子(其濃度均在7.0及0.7nM)進行比較。所使用的腫瘤細胞株為MDA-MB-231(乳癌)、U-87MG(神經膠質母細胞瘤)、FaDu(鱗狀細胞癌)或A549(肺癌)。所有四種細胞株於7nM濃度下之細胞凋亡誘導相似，而於0.7nM下在細胞株間觀察到較顯著的差異。
圖12：用於單離、篩選及表徵新穎DR5結合物之人類DR5抗原建構的示意圖。對於所有建構，相同DR5域(胞外域ECD；aa 56-207)係 利用結進孔技術單獨地使用(A)作為二聚Fc融合(B)或作為單體Fc融合(C)。所有抗原係在HEK293 EBNA細胞中經瞬時轉染並製得。
圖13a至d：46種獨特的DR5結合物(經噬菌體展示單離)在與二次抗Fc抗體超高交聯後在MDA-MB-231細胞上誘導細胞凋亡(DNA斷裂分析)之篩選。抗體係以7nM(黑色柱)及0.7nM(影線柱)之濃度使用。大多數DR5結合物(42/46)可在超高交聯後誘導DNA斷裂至不同程度。
圖14a至c：透過DNA斷裂ELISA分析藉由所選系列的新穎DR5結合物於存在或不存在二次交聯抗Fc抗體下測量於MDA-MB-231細胞中之細胞凋亡誘導，來評估新穎DR5抗體在無二次交聯下是否展現細胞凋亡活性。將新穎DR5結合物與已知在無交聯下具某種程度活性之抗體卓西單抗進行比較。
圖15：三種不同人類腫瘤細胞(DLD-1、NCI H460及MDA-MB-231)在以7nM濃度之不同交聯DR5抗體處理後之細胞增生抑制(細胞TiterGlo檢驗)之分析。
圖16：於三種人類腫瘤細胞株(DLD-1、NCI H460及MDA-MB-231)中在以7nM濃度之交聯DR5抗體處理後藉由卡斯蛋白酶(Caspase)8活化測得之細胞凋亡誘導之評估。
圖17：藉由表面電漿共振(Biacore)之抗原決定基表位框并(binning)實驗的結果。在使第一抗體與人類DR5結合之後，分析欲測試之其他抗體之進一步結合。除了可能與卓西單抗抗原決定基重疊的純系422之外，經測試之新穎DR5結合物似乎均不與DR5上與卓西單抗抗原決定基重疊的區結合，同時在彼此當中其等可能共享至少重疊的抗原決定基。
圖18A與B：確定配體阻斷抗體相對配體非阻斷抗體之TRAIL競爭性分析。將人類TRAIL固定於CM5晶片上。接著，使用由人類DR5-Fc及DR5抗體組成之複合物作為分析物及分析該複合物與經固定之 TRAIL之結合。雖然來自噬菌體展示之大多數新穎結合物為TRAIL阻斷分子，但來自兔之免疫之許多DR5抗體為非阻斷類型。
圖19：人類TRAIL於經不同DR5激動抗體處理後對DLD-1標靶細胞之增生抑制之效應。DLD-1標靶細胞於不存在(實線)或存在(點畫線)不同濃度之人類TRAIL下經交聯DR5抗體培養。取決於由DR5抗體識別之抗原決定基，TRAIL之添加會(非配體阻斷)或不會(配體阻斷)增加細胞生長抑制。包含單獨的TRAIL及已知不會阻斷TRAIL之抗體作為對照組。
圖20a與b：用於偵測細胞凋亡之DNA斷裂ELISA分析。不同DR5-FAP雙特異性抗體(FAP純系28H1)於存在或不存在經塗佈於96孔盤上之重組人類FAP下在作為標靶細胞株之MDA-MB-231上誘導細胞凋亡之活性。於此設置中，經塗佈之FAP應模擬表現於腫瘤基質中之FAP。於兩種濃度(7.0及0.7nM)下測試雙特異性抗體。就包含新穎DR5結合物之雙特異性分子而言，僅於存在FAP下偵測到細胞凋亡之濃度相依誘導，而包含卓西單抗之對照組分子亦於不存在FAP下顯示部分活性，證實新穎DR5抗體之活性嚴格言之係與交聯相關。
圖21：雙特異性DR5-FAP分子(2+2 CrossFab形式)在使用MDA-MB-231作為DR5表現標靶細胞及用於交聯之GM05389(FAP+纖維母細胞)之共培養檢定中之旁觀者細胞凋亡誘導活性。將包含不同新單離DR5結合物之分子與於三種濃度(7.0、0.7及0.07nM)下之包含卓西單抗之建構進行比較。於該等條件下，並非所有經測試之雙特異性建構均展現與經由抗Fc mAb或經由重組FAP交聯相同的活性。此顯示並非每種可主要地在交聯之後誘導細胞凋亡之抗體亦將於更自然的條件下達成相同目的(其中抗原-DR5及FAP-係表現於不同細胞類型上)。
圖22：經融合至人類Fc的C-端之新穎DR5結合Fab處理、相較於經卓西單抗處理(均在與抗Fc抗體交聯之後)之MDA-MB-231標靶細胞 之細胞死亡偵測ELISA(DNA斷裂)。所有經測試之Fc融合分子可賦予標靶細胞在與交聯卓西單抗相同範圍內之細胞凋亡誘導，表明其結合及活性能力並未受到Fc於其N-端之定位之妨礙。A：衍生自噬菌體展示之DR5結合物，B：衍生自免疫之人類化DR5結合物。
圖23A與B：雙特異性DR5-FAP抗體(具有C-端28H1 CrossFab融合之新穎DR5結合物)在使用GM05389纖維母細胞之共培養檢定(用於偵測細胞凋亡之DNA斷裂ELISA分析)中針對以MDA-MB-231作為標靶細胞株之細胞凋亡誘導之比較。
圖24A與B：於旁觀者檢測中雙特異性DR5-FAP抗體在G401細胞上誘導細胞凋亡，此可在細胞死亡偵測ELISA中藉由DNA斷裂確定。
圖25：針對生產力及品質評估之其他雙特異性DR5-FAP CrossFab形式之示意圖。這四種分子於DR5及FAP結合部分之位置及價鍵性上相異：評估兩種2+1分子、一種3+1及一種1+1建構。一種2+1分子包含一個融合至DR5(5E11)重鏈的C-端之FAP(28H1)CrossFab(A)，而第二種2+1形式係由兩個融合至具有28H1 CrossMab對應物之Fc的N-端之DR5(5E11)Fab組成(B)。第三個分子(C)包含融合在重鏈的C-端處之三個DR5標靶Fab及一個28H1 CrossFab。於1+1形式(D)中，DR5結合物#174係與CrossFab配置中之FAP結合部分4B9組合。所有建構係取決於利用結進孔技術之異二聚合。
圖26：雙特異性DR5-FAP分子(A：5E11-28H1；B：18F11-28H1)於不同形式中之細胞凋亡活性，此係由在經與GM05489纖維母細胞共培養之MDA-MB-231細胞中針對DNA斷裂之細胞死亡偵測ELISA測得。將卓西單抗-28H1之標準2+2形式與5E11-28H1及18F11-28H1分子於三種不同濃度下之2+2、2+1及3+1形式進行比較。
圖27：5E11-28H1分子(2+2形式)與三種其他雙特異性形式：2+1、新穎2+1(頭-至-尾之融合)及3+1之旁觀者細胞凋亡誘導的比較。 使用MDA-MB-231作為標靶細胞，針對FAP相依交聯共培養GM05389纖維母細胞及於自700至0.007nM之濃度下評估雙特異性抗體。
圖28：用於評估生產力、副產物分佈及活性之新穎雙特異性5E11-28H1形式(2+2)。該等分子於交叉之位點及類型上相異。
A：28H1(CH1CL)之C-端交叉B：整體N-端5E11 Fab之交叉
C：5E11之N-端VHVL交叉D：5E11之N-端CH1CL交叉
E：C-端28H1 Fab之完全交叉F：C-端28H1 Fab(VHVL)之交叉
圖29：5E11-28H1 CrossFab之三種不同形式在自0.0037至60nM之濃度範圍內於MDA-MB-231上之FACS結合結果。使用PE結合山羊-抗-人類Fc(Fab)2來進行偵測。
圖30：用於偵測細胞凋亡之DNA斷裂ELISA分析。4種不同CrossMab變型於共-(A)及單-培養(B、C)設置中藉由DNA斷裂所偵測之細胞凋亡誘導。所有4種不同變型於共培養設置中以相當的劑量相依方式誘導腫瘤細胞中之細胞凋亡。於單-培養設置中，既不在MDA-MB231腫瘤細胞株中亦不在GM05389纖維母細胞細胞株中誘導細胞凋亡，指明所有4種變型之細胞凋亡誘導之特異性及FAP-相依性。
圖31：小鼠異種移植腫瘤模型中之活體內療效，其中將DLD-1(A；裸小鼠)或MDA-MB-231(B；SCID-灰棕色小鼠)細胞共同注射表現3T3纖維母細胞之mu FAP，以確保腫瘤基質中之FAP表現。於腫瘤已經移植後，藉由i.v.注射雙特異性卓西單抗-28H1分子(三角形)或單獨的卓西單抗(正方形)或媒劑對照組(菱形)進行10mg/kg的治療。藉由相較於媒劑對照組之腫瘤生長抑制(TGI)判定療效。
圖32：製得之雙特異性DR5-FAP分子針對其細胞凋亡誘導活性之活體內療效實驗之評估。在細胞死亡偵測ELISA中針對DLD-1細胞之DNA斷裂測試四種不同分子。在針對交聯之共培養檢定中使用表現鼠科FAP之3T3或重組3T3細胞。相較於未經處理之細胞，顯示細胞凋亡 之倍率增加。
圖33：經與3T3細胞或表現鼠科FAP之3T3細胞共培養檢定後之DR5-FAP雙特異性抗體處理後之DLD-1細胞之存活力(細胞TiterGlo)。給出與未經處理之對照組相比的存活力百分比。
圖34A與B：小鼠異種移植模型，其中將2+2形式之不同DR5-FAP雙特異性分子(10mg/kg)與媒劑對照組作比較。所有建構均包含融合至不同DR5結合物：5E11、174及422之28H1 FAP CrossFab。此外，包括一種分子(5E11-28H1)，其中Fc帶有突變以抑制任何FcR相互作用(PGLALA)。療效係以腫瘤生長抑制(TGI)來判定。
圖35：DNA斷裂檢測。抗-DR5抗體在受體高度叢集後以劑量相依方式誘導細胞死亡。產生之兔抗-DR5抗體可以不同效力誘導MDA-MB231細胞之細胞凋亡，然始終係以劑量相依方式及僅在DR5分子之Fc-介導交聯之後(上圖)。於不存在抗-兔Fc-特異性二次抗體下，未偵測到明顯的細胞死亡(下圖)。
圖36：抗-DR5抗體於受體高度叢集後以劑量相依方式減低細胞存活力。產生之兔抗-DR5抗體可以不同效力減低MDA-MB231細胞之存活力，然始終係以劑量相依方式及僅在DR5分子之Fc-介導交聯之後(上圖)。於不存在抗-兔Fc-特異性二次抗體下，細胞存活力於任何抗體濃度下均不受影響(下圖)。
圖37：三種不同人類腫瘤細胞(DLD-1、NCI H460及MDA-MB-231)在經7nM濃度之不同交聯DR5抗體處理後之細胞增生抑制分析(細胞TiterGlo檢驗)。
圖38：藉由三種人類腫瘤細胞株(DLD-1、NCI H460及MDA-MB-231)在經7nM濃度之交聯DR5抗體處理後之卡斯蛋白酶8活化測得之細胞凋亡誘導之評估。
圖39：逆境DR5抗體樣本之相對有效濃度：例示性響應曲線。
圖40：衍生自免疫之初始及逆境DR5抗體之相對有效濃度。
圖41：衍生自噬菌體展示之初始及逆境DR5抗體之相對有效濃度。
圖42：不同DR5-FAP雙特異性抗體同時與兩種重組標靶結合之表面電漿共振(SPR，Biacore)分析。於第一反應中，確定雙特異性抗體與重組人類DR5-Fc之結合，接著分析與重組人類(上部圖)或鼠科FAP(下部圖)之結合。
圖43：在共培養檢定中藉由2+2雙特異性建構在DLD-1及H460腫瘤細胞株中誘導細胞凋亡，此係藉由DNA斷裂來偵測。雖然包含卓西單抗作為DR5-結合組分之雙特異性建構已於不存在FAP下誘導細胞凋亡，但包含藉由免疫衍生得之新穎DR5結合物之所有建構僅在存在FAP下誘導細胞凋亡。諸如0011-28H1及0016-28H1之具有新開發得之DR5結合物之建構可尤其在相比包含卓西單抗之雙特異性建構低的濃度下誘導細胞凋亡至較高程度。
圖44：抗-DR5-FAP雙特異性2+2建構與DR5-表現腫瘤細胞株MDA-MB-231之結合，此係藉由流式細胞儀分析測得。
圖45：A人類化變型在交聯後之細胞凋亡誘導，此係藉由DNA斷裂來偵測(細胞死亡偵測ELISA)：DR5TAA-0011之人類化變型(DR5TAA-0066-DR5TAA-0075，黑色線)在與二次抗體交聯後以劑量相依方式誘導細胞凋亡。諸如DR5TAA-0067、DR5TAA-0071、DR5TAA-0074及DR5TAA-0075之若干種人類化變型可以與嵌合變型(DR5TAA-0052，灰色線)類似的關於最大化誘導及劑量相依性之方式誘導細胞凋亡。B在無額外交聯下，不存在人類化變型之細胞凋亡誘導，此係藉由DNA斷裂來偵測(細胞死亡偵測ELISA)：DR5TAA-0011之人類化變型(DR5TAA-0066-DR5TAA-0075)若未經二次抗體交聯則不誘導細胞凋亡。
圖46：共培養系統中藉由雙特異性抗-DR5-FAP抗體以1+1及2+2形式誘導細胞死亡的比較。
圖47：雙特異性抗-DR5-FAP抗體僅在腫瘤細胞及纖維母細胞二者存在下誘導細胞死亡之極度特異性。
圖48：雙特異性抗-DR5-FAP(DR5結合物：VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)於基於DLD-1 CRC共注射細胞株之異種移植模型中之療效。
圖49：雙特異性抗-DR5-FAP(DR5結合物：VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)於基於Co5896 CRC片段之患者源性異種移植模型(PDX)中之療效。
I．定義
用於本文目的之「受體人類架構」為包含如下定義衍生自人類免疫球蛋白架構或人類一致架構之輕鏈可變域(VL)架構或重鏈可變域(VH)架構之胺基酸序列之架構。「衍生自」人類免疫球蛋白架構或人類一致架構之受體人類架構可包含其相同的胺基酸序列，或其可包含胺基酸序列改變。於一些實施例中，胺基酸改變的數量為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。於一些實施例中，VL受體人類架構之序列與VL人類免疫球蛋白架構序列或人類一致架構序列相同。
「親和力」係指分子之單一結合位點(例如，抗體)及其結合搭配物(例如，抗原)間非共價性相互作用總體的強度。除非另作指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如，抗體與抗原)間1：1相互作用之內因性結合親和力。分子X針對其搭配物Y之親和力可大致上以解離常數(Kd)來表示。可藉由包括述於本文中者之相關 技藝中已知的常用方法來測定親和力。於隨後描述用於測定結合親和力之具體示例性及例示性實施例。
「親和力成熟」抗體係指在一或多個超變區(HVR)中具有一或多處變化之抗體，相較於不具有該等變化之親本抗體，該等變化導致抗體對抗原之親和力的改善。
術語「與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)特異結合之雙特異性抗體」係指能夠與DR5及FAP以足以致使抗體在表現DR5及FAP之標靶細胞中適用為診斷及/或治療劑之親和力結合之雙特異性抗體。明確言之，「與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)特異結合之雙特異性抗體」係指靶向腫瘤細胞上之DR5及該腫瘤周圍基質中之FAP之雙特異性抗體。於一個實施例中，如(例如)藉由酶聯免疫吸收劑分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)、基於表面電漿共振(SPR)之分析(例如Biacore)或流式細胞儀(FACS)測得，與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)特異結合之雙特異性抗體與非相關非-FAP或非-DR5蛋白結合之程度係小於抗體與DR5或FAP之結合之約10%。於某些實施例中，與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)特異結合之雙特異性抗體具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM(例如10-8M或更小，例如，自10-8M至10-13M，例如，自10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。於某些實施例中，與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)特異結合之雙特異性抗體係與DR5或FAP之保留於來自不同物種之DR5或FAP當中之抗原決定基結合。較佳地，該雙特異性抗體係與人類及馬來猴DR5及與人類、馬來猴及小鼠FAP結合。
術語「與死亡受體5(DR5)特異結合之抗體」係指能夠以足以致使抗體在靶向表現DR5之細胞中適用為診斷及/或治療劑之親和力與DR5結合之抗體。於一個實施例中，如(例如)藉由放射免疫測定法 (RIA)或流式細胞儀(FACS)測得，與死亡受體5(DR5)特異結合之抗體與非相關非-DR5蛋白之結合程度係小於抗體與DR5之結合之約10%。於某些實施例中，與死亡受體5(DR5)特異結合之抗體具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM(例如10-8M或更小，例如，自10-8M至10-13M，例如，自10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。於某些實施例中，與死亡受體5(DR5)特異結合之抗體係與DR5之保留於來自不同物種之DR5當中之抗原決定基結合。較佳地，該抗體係與人類及馬來猴DR5結合。術語「與死亡受體5(DR5)特異結合之抗體」亦包括能夠與DR5及第二抗原結合之雙特異性抗體。
術語「抗體」在本文中係以最寬廣意義使用及包含各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、及抗體片段，只要其展現所欲抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除了完整抗體以外的分子，其包含完整抗體之與完整抗體所結合之抗原結合之部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；雙功能抗體(diabody)、交叉-Fab(cross-Fab)片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。scFv抗體(例如)述於Houston,J.S.，Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。此外，抗體片段包括具有VH域(亦即，可與VL域組裝在一起至功能性抗原結合位點)、或VL域(亦即，可與VH域組裝在一起至功能性抗原結合位點)之特徵及藉此提供全長抗體之抗原結合性質之單鏈多肽。
如本文所用，「Fab片段」係指包括包含VL域及輕鏈(CL)之恆定域、及VH域及重鏈之第一恆定域(CH1)的輕鏈片段之抗體片段。於一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含至少一個Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。歸因於可變區或恆定區 中任一者之交換，該Fab片段亦被稱為「交叉-Fab片段」或「xFab片段」或「交越Fab片段」。交越Fab分子可有能兩種不同的鏈組成且係包含於本發明之雙特異性抗體中：在一方面，Fab重及輕鏈之可變區係經交換，亦即，交越Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈、及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈。該交越Fab分子亦稱為CrossFab(VLVH)。另一方面，當Fab重及輕鏈之恆定區經交換時，交越Fab分子包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈、及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈。該交越Fab分子亦稱為CrossFab(CLCH1)。
「單鏈Fab片段」或「scFab」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1(CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體域及該連接子具有其中一種以下N-端至C-端方向之順序：a)VH-CH1-連接子-VL-CL，b)VL-CL-連接子-VH-CH1，c)VH-CL-連接子-VL-CH1或d)VL-CH1-連接子-VH-CL；及其中該連接子為至少30個胺基酸、較佳32至50個胺基酸之多肽。該等單鏈Fab片段a)VH-CH1-連接子-VL-CL，b)VL-CL-連接子-VH-CH1，c)VH-CL-連接子-VL-CH1及d)VL-CH1-連接子-VH-CL係經介於CL域及CH1域間之天然二硫鍵穩定。此外，該等單鏈Fab分子可進一步藉由透過***半胱胺酸殘基(例如，依據Kabat編號，可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)建立鏈間二硫鍵而穩定。術語「N-端」表示N-端的最後一個胺基酸。術語「C-端」表示C-端的最後一個胺基酸。
所謂「融合」或「連接」意指組分(例如Fab分子及Fc結構域子單元)係經由肽鍵直接地或經一或多個肽連接子鍵聯。
術語「連接子」如本文所用係指肽連接子及較佳係包含具有至少5個胺基酸之長度、較佳具有5至100個、更佳10至50個胺基酸之長度之胺基酸序列之肽。於一個實施例中，該肽連接子為(GxS)n或 (GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，及(x=3，n=3、4、5或6，及m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5及m=0、1、2或3)，較佳地，x=4及n=2或3，更佳地，其中x=4，n=2。於一個實施例中，該肽連接子為(G4S)2。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然生成抗體的結構之蛋白質。例如，IgG類別之免疫球蛋白為約150,000道耳頓之異源四聚糖蛋白，其係由經二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈組成。從N-端至C-端，各個重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，接在其後的是三個恆定域(CH1、CH2、及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從N-端至C-端，各個輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，接在其後的是恆定輕(CL)域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可歸類為稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、或μ(IgM)之五種類型之一，其中一些可進一步細分為子類型，例如，γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。免疫球蛋白之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸類為稱為卡帕型(κ)及蘭姆達型(λ)之兩種類型之一。免疫球蛋白基本上由經免疫球蛋白絞鍵區鍵聯之兩個Fab分子及一個Fc結構域組成。
作為參照抗體之「與相同抗原決定基結合之抗體」係指在競爭性分析中阻斷參照抗體與其抗原之結合50%或更大之抗體，及反之，參照抗體在競爭性分析中阻斷抗體與其抗原之結合50%或更大。本文中提供一種例示性競爭性分析。
術語「抗原結合域」係指包含與抗原之部分或全部特異結合並互補之區之抗原結合分子之一部分。在抗原大之情況下，抗原結合分子可僅與抗原之特定部分結合，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由(例如)一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。較佳地，抗原結合域包括抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
術語「嵌合」抗體係指通常藉由重組DNA技術製得之其中重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分衍生自不同來源或物種之抗體。較佳為包含兔可變區及人類恆定區之嵌合抗體。本發明所涵蓋之「嵌合抗體」之其他較佳形式為恆定區經過改質或改變而區別於初始抗體之恆定區，以獲得根據本發明之尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面的性質之彼等。該等嵌合抗體亦稱為「類別轉換抗體」。嵌合抗體為經表現免疫球蛋白基因之包含編碼免疫球蛋白可變區之DNA片段及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA片段之產物。製造嵌合抗體之方法涉及習知之重組DNA及在相關技藝中熟知基因轉染技術。參見：例如，Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美國專利案第5,202,238及5,204,244號。
術語「細胞毒性劑」如本文所用係指抑制或阻礙細胞功能且/或導致細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如，甲胺喋呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花屬生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酵素及其片段，諸如溶核酵素(nucleolytic enzyme)；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酵素活性毒素，包括其片段及/或變型；及揭示於下文之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「效應子功能」係指隨抗體同型物改變之可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴 性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)；抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞激素分泌、由抗原呈現細胞捕捉之免疫複合物介導之抗原；細胞表面受體(例如B細胞受體)之向下調節；及B細胞活化。
如本文所用，術語「改造(engineer、engineered、engineering)」被認為包括自然生成或重組多肽或其片段之肽主鏈或轉譯後修飾之任何處理。改造包括胺基酸序列、醣基化模式、或個別胺基酸之側鏈基之修飾，以及該等方法之組合。
術語「胺基酸突變」如本文所用意欲包括胺基酸取代、刪除、***、及修飾。可進行取代、刪除、***、及修飾之任何組合以達成最終建構，其限制條件為最終建構具有例如減低之與Fc受體之結合、或增加之與另一個肽之締合之所欲特徵。胺基酸序列刪除及***包括胺基酸之胺基-及/或羧基-端刪除及***。特定胺基酸突變為胺基酸取代。就改變(例如)Fc區之結合特徵之目的而言，尤佳係非守恆胺基酸取代，亦即，以另一個具有不同結構及/或化學性質之胺基酸取代一個胺基酸。胺基酸取代包括以非自然生成之胺基酸或以二十種標準胺基酸(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)之自然生成之胺基酸衍生物替代。可採用相關技藝中熟知的基因或化學方法產生胺基酸突變。基因方法可包括定點突變、PCR、基因合成及類似者。預期藉由除基因改造外的方法(諸如化學修飾)改變胺基酸之側鏈基之方法亦可係有用的。在本文可使用不同命名來指示相同的胺基酸突變。例如，由Fc結構域之位置329處之脯胺酸取代成甘胺酸可表示為329G、G329、G329、P329G、或Pro329Gly。
例如醫藥調配物之藥劑之「有效量」係指可在給藥並持續所需時段下有效達成所欲治療或預防結果之量。
術語「Fc結構域」或「Fc區」在本文中用於定義包含恆定區之 至少一部分之免疫球蛋白重鏈之C-端區。該術語包括天然序列Fc區及變型Fc區。雖然IgG重鏈之Fc區之邊界可能略為不同，但人類IgG重鏈Fc區通常係定義成自Cys226、或自Pro230延伸至重鏈之羧基-端。然而，可或可不存在Fc區之C-端離胺酸(Lys447)。除非於本文中另作指明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係依照EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda,MD，1991中所述。Fc結構域之「子單元」如本文所用係指形成二聚Fc結構域之兩個多肽中之可穩定自締合之一個多肽，即，包含免疫球蛋白重鏈之C-端恆定區之多肽。例如，IgG Fc結構域之子單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進Fc結構域之第一及第二子單元之締合之修飾」乃減低或阻礙包含Fc結構域子單元之多肽與相同多肽締合形成同型二聚物之Fc結構域子單元之肽主鏈或轉譯後修飾之處理。促進締合之修飾如本文所用尤其包括個別的針對意欲締合之兩個Fc結構域子單元各者(即，Fc結構域之第一及第二子單元)進行之修飾，其中該等修飾係彼此互補以促進該兩Fc結構域子單元之締合。例如，促進締合之修飾可改變一或兩個該等Fc結構域子單元之結構或電荷以分別使其締合係空間或靜電有利的。因此，在包含第一Fc結構域子單元之多肽及包含第二Fc結構域子單元之多肽之間發生(異)二聚合，此在融合至各個該等子單元之其他組分(例如抗原結合部分)不相同之意義上可能係不相同的。於一些實施例中，促進締合之修飾包括Fc結構域中之胺基酸突變，特定言之係胺基酸取代。於一個特定實施例中，促進締合之修飾包括個別的胺基酸突變，特定言之係Fc結構域之兩個子單元各者中之胺基酸取代。
「架構」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變域殘基。可 變域之FR大致上係由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3、及FR4。因此，HVR及FR序列一般係呈以下序列出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」、及「全抗體」在本文中可互換使用以指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有包含如本文定義之Fc區之重鏈之抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及「宿主細胞培養」可互換使用及係指已引入外源性核酸之細胞(包括該等細胞之子代)。宿主細胞包括「轉形體」及「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及衍生自其之子代(不管代數為何)。子代之核酸含量可能不與親本細胞完全相同，而係可包含突變。本文中包括具有與如在原始轉形細胞中所篩選或所選擇者相同功能或生物活性之突變子代。
「人類抗體」為具有對應於由人類或人類細胞所產生或衍生自利用人類抗體譜系之非人類來源之抗體之胺基酸序列或其他人類抗體-編碼序列之胺基酸序列者。人類抗體之該定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。如針對根據本發明之嵌合及人類化抗體亦提到的術語「人類抗體」如本文中所用亦包括在恆定區中(例如)藉由「類別轉換」(即，Fc部分之改變或突變(例如，自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4突變))修飾，以獲得根據本發明之尤其在C1q結合及/或FcR結合方面之性質之該等抗體。
術語「重組人類抗體」如本文中所用意欲包括經製造、表現、建立或以重組方式單離之所有人類抗體，諸如，自諸如NS0或CHO細胞之宿主細胞或自針對經使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之人類免疫球蛋白基因或抗體轉基因的動物(例如小鼠)單離之抗體。該等重組人類抗體具有呈重排形式之可變及恆定區。根據本發明之該等重組人類抗體已經過活體內體細胞超突變。因此，重組抗體之VH 及VL區之胺基酸序列為雖然係衍生自及關於人類生殖細胞系VH及VL序列，但不可自然存於活體內人類抗體生殖細胞系譜系之序列。
「人類一致架構」為代表精選的人類免疫球蛋白VL或VH架構序列中最常出現之胺基酸殘基的架構。一般而言，該精選的人類免疫球蛋白VL或VH序列係來自可變域序列之子群組。一般而言，該序列子群組為如述於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1至3卷中之子群組。於一個實施例中，VL之子群組為如述於Kabat等人(前述)中之子群組κ I。於一個實施例中，VH之子群組為如述於Kabat等人(前述)中之子群組III。
「人類化」抗體係指包含源自非人類HVR之胺基酸殘基及源自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。於某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個(及通常兩個)其中所有或實質上所有HVR(例如，CDR)對應於非人類抗體之彼等、及所有或實質上所有該等FR對應於人類抗體之彼等之可變域的實質上全部。人類化抗體視需要可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經過人類化之抗體。本發明所涵蓋之「人類化抗體」之其他形式為其中恆定區已另外經修飾或改變而區別於原始抗體之恆定區來獲得根據本發明之尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面之性質之彼等。
術語「超變區」或「HVR」如本文中所用係指序列上超變且/或形成結構界定迴路(「超變迴路」)之抗體可變域之各個區。一般而言，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，及三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含源自超變迴路及/或源自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具最高序列可變性及/或係與抗原識別相關。例示性超變迴路發生在胺基酸殘基26-32(L1)、50- 52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及96-101(H3)處。(Chothia與Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、及CDR-H3)發生在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35B(H1)、50-65(H2)、及95-102(H3)處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。超變區(HVR)亦稱為互補決定區(CDR)，及提及形成抗原結合區之可變區之部分使用之該等術語在本文中係可互換使用。Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)已描述該特定區，其中該等定義包括胺基酸殘基相對彼此比較時之重疊或子組。然而，應用任一種定義來指示抗體或其變型之CDR意欲屬於本文所定義並使用之術語之範疇。將包含如上文引述之各參考文獻所定義之CDR之適宜胺基酸殘基記述於下表A中作為對照。包含特定CDR之確切殘基編號將根據CDR之序列及尺寸改變。熟習此項技藝者可慣常地根據抗體之可變區胺基酸序列確定包含特定CDR之殘基。
1表A中所有CDR定義之編號係依照Kabat等人所述之編號約定(請參見下文)。
2如表A中所用具有小寫「b」之「AbM」係指如依Oxford Molecular's「AbM」抗體模型化軟體所定義之CDR。
Kabat等人亦定義一種適用於任何抗體之針對可變區序列之編號系統。熟習此項技藝者可明確地應用此「Kabat編號」之系統於任何可變區序列，而無需依靠除了其序列外之任何實驗數據。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所描述之編號系統。除非另作指明，否則所提及之抗體可變區中特定胺基酸殘基位置之編號係依照Kabat編號系統。
除了VH中之CDR1以外，CDR大致包含形成超變迴路之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為與抗原接觸之殘基。SDR包含於CDR(簡稱為-CDR、或a-CDR)之區中。例示性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、及a-CDR-H3)存在於胺基酸殘基31-34(L1)、50-55(L2)、89-96(L3)、31-35B(H1)、50-58(H2)、及95-102(H3)處。(參見Almagro與Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另作指明，否則HVR殘基及可變域中之其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係依照Kabat等人(前述)編號。
「免疫偶聯物」為與一或多個異種分子結合之抗體，包括(但不限於)細胞毒性劑。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家畜(例如，牛、羊、貓、狗、及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物(諸如猴))、兔及囓齒動物(例如，小鼠及大鼠)。於某些實施例中，個體或受試者為人類。
「單離」抗體為已自其自然環境之組分分離出的抗體。於一些實施例中，抗體係經純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析法(例如，離子 交換或逆相HPLC)測得。關於用於評估抗體純度的方法之回顧，請參見：例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「單離」核酸係指已自其自然環境之組分分離出的核酸分子。單離核酸包括包含於通常包含核酸分子之細胞中之核酸分子，但該核酸分子係以染色體外方式存在或係存於與其天然染色體位置不同的染色體位置處。
「編碼與DR5及FAP抗體特異結合之雙特異性抗體之單離核酸」係指一或多個編碼抗體重及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括於單一載體或個別載體中之該(等)核酸分子、及存於宿主細胞中之一或多個位置處之該(等)核酸分子。
術語「單株抗體」如本文所用係指獲自實質上均質抗體群體之抗體，即，組成該群體之個別抗體係相同及/或與相同抗原決定基結合，但不包括(例如)包含自然生成之突變或於單株抗體製劑之製備期間產生之可能變異抗體，該等變型一般係以少量存在。與通常包括導向不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係導向抗原上之單一決定子。因此，修飾詞「單株」指示獲自實質上均質抗體群體之抗體之特徵，及不應解釋為需要藉由任何特定方法製造抗體。例如，意欲根據本發明使用之該等單株抗體可藉由多種技術進行製造，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、及利用包含所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，本文中描述該等方法及其他用於製造單株抗體之例示性方法。
「裸抗體」係指未與異種部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。該裸抗體可存於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之自然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體為由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相 同重鏈組成之約150,000道耳頓之異源四聚醣蛋白。從N-至C-端，各重鏈具有亦稱為可變重域或重鏈可變域之可變區(VH)，接在其後的是三個恆定域(CH1、CH2、及CH3)。類似地，從N-至C-端，各輕鏈具有亦稱為可變輕域或輕鏈可變域之可變區(VL)，接在其後的是恆定輕(CL)域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸類於稱為卡帕型(κ)及蘭姆達型(λ)之兩種類型之一。
術語「包裝插頁」係用於指示習慣上包含於治療產品之市售包裝中之使用說明，其包含關於適應症、用法、劑量、投藥、組合治療、禁忌及/或關於該等治療產品之使用之警語之資訊。
「無實質的交叉反應性」意指分子(例如，抗體)不識別或不與不同於分子之實際標靶抗原(例如，與標靶抗原密切相關之抗原)的抗原特異結合，尤其係在相較於該標靶抗原之情況下。例如，抗體之小於約10%至小於約5%可與不同於實際標靶抗原的抗原結合，或可以由小於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、或0.1%、較佳小於約2%、1%、或0.5%、及最佳小於約0.2%或0.1%組成之量與不同於實際標靶抗原的該抗原結合。
相對於參照多肽序列之「胺基酸序列相同度百分比(%)」係經定義為候選序列中之胺基酸殘基與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分率，在比對該等序列及視需要引入間隙以達成最大序列相同度百分比後，及不考慮任何守恆取代作為序列相同度之部分。用於確定胺基酸序列相同度百分比之目的之比對可以於本技藝技術中之各種方式，例如使用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體之可公開取得的電腦軟體達成。熟習此項技藝者可確定用於比對序列之適宜參數，包括在所比較序列的全長度達成最大比對所需之任何演算法。然而，基於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來獲得%胺基酸序列相同度值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由 Genentech,Inc.開發，及原始碼係在美國版權局(U.S.Copyright Office)(華盛頓D.C.，20559)與用戶文件一起申請，其中其登錄在美國版權登錄號TXU510087下。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開取得，或可從原始碼彙整。ALIGN-2程式應經編輯用於包括數位UNIX V4.0D之UNIX操作系統上。所有序列比對參數係由ALIGN-2程式設定且不改變。
在將ALIGN-2用於胺基酸序列比較之情況中，如下計算所給胺基酸序列A相對、與、或對比所給胺基酸序列B之胺基酸序列相同度%(此可替代地寫為具有或包含相對、與、或對比所給胺基酸序列B之特定胺基酸序列相同度%之所給胺基酸序列A)：100乘以分率X/Y
其中X為依照序列比對程式ALIGN-2在A及B之程式比對中以相同匹配得分之胺基酸殘基的數量，及其中Y為B中胺基酸殘基的總數。應瞭解在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等的情況下，A相對B之胺基酸序列相同度%將不等於B相對A之胺基酸序列相同度%。除非另作明確敘述，否則用於本文中之所有%胺基酸序列相同度值係如上一段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈使得包含於其中之活性成分之生物活性有效之形式，及不含其他對將被投與該調配物之受試者具有不可接受毒性之組分之製劑。
「醫藥可接受載劑」係指醫藥調配物中除活性成分外之對受試者無毒之成分。醫藥可接受載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。
術語「死亡受體5(DR5)」如本文所用係指源自包括諸如靈長類動物(例如，人類)及囓齒動物(例如，小鼠及大鼠)之哺乳動物之任何脊椎動物之任何天然DR5，除非另作指明。該術語包括「全長」未經 處理之DR5以及源自細胞中之處理之DR5之任何形式。該術語亦包括DR5之自然生成之變型，例如，剪接變型或對偶基因變型。例示性人類DR5之胺基酸序列以SEQ ID NO.：155顯示。
術語「纖維母細胞活化蛋白(FAP)」如本文所用係指源自包括諸如靈長類動物(例如，人類)及囓齒動物(例如，小鼠及大鼠)之哺乳動物之任何脊椎動物之任何天然FAP，除非另作指明。該術語包括「全長」未經處理之FAP以及源自細胞中之處理之FAP之任何形式。該術語亦包括FAP之自然生成之變型，例如，剪接變型或對偶基因變型。較佳地，本發明之抗-FAP抗體係與FAP之胞外域結合。例示性人類、小鼠及馬來猴FAP胞外域(具有C-端聚離胺酸及6x His-tag)之胺基酸序列分別以SEQ ID NO.：156、SEQ ID NO.：157、及SEQ ID NO.：158顯示。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變型，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然病程之臨床干預，及可針對於預防性投藥或在臨床病理病程期間進行。治療之期望效應包括(但不限於)防止疾病出現或復發、緩解症狀、消除疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、減低疾病進展之速率、改善或減輕疾病狀態、及緩解或改善預後。於一些實施例中，本發明之抗體係用於延遲發展出疾病或減緩疾病之進展。
術語癌症如本文所用係指增生性疾病，諸如淋巴瘤、淋巴性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰癌、皮膚癌、頭部或頸部癌症、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、輸卵管癌瘤、子宮內膜癌、子宮頸癌、***癌、陰門癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿 道癌、陰莖癌、***癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌症、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽囊癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、脊椎軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、星狀細胞瘤、神經鞘瘤(schwanomas)、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症之難治類型、或一或多種上述癌症之組合。
術語「可變區」或「可變域」係指參與抗體與抗原結合之抗體重或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之可變域一般具有類似的結構，其中各個域包含四個保留架構區(FR)及三個超變區(HVR)。(參見：例如，Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。另外，與特定抗原結合之抗體可使用VH或VL域自與抗原結合之抗體單離，以分別篩選互補VL或VH域之庫。參見：例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
術語「抗體之抗原結合位點」在用於本文中時係指抗體之負責抗原結合之胺基酸殘基。抗體之抗原結合部分包括來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「架構」或「FR」區為彼等除如本文所定義之超變區殘基外之可變域區。因此，抗體之輕及重鏈可變域從N-至C-端包括域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。尤其地，重鏈之CDR3為主要促成抗原結合及界定抗體性質之區。CDR及FR區係依照Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda,MD(1991)之標準定義確定及/或為彼等來自「超變迴路」之殘基。
抗體特異性係指抗體對於抗原之特定抗原決定基之選擇性識 別。例如，天然抗體為單特異性。根據本發明之「雙特異性抗體」為具有兩種不同抗原結合特異性之抗體。本發明之抗體係對兩種不同抗原(即，作為第一抗原之DR5及作為第二抗原之FAP)具特異性。
術語「單特異性」抗體如本文所用表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點各自係與相同抗原之相同抗原決定基結合。
術語「雙特異性」抗體如本文所用表示具有至少兩個結合位點之抗體，該至少兩個結合位點各自係與相同抗原或不同抗原之不同抗原決定基結合。
提供於本文中之抗體為多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體為具有針對至少兩個不同位點之結合特異性之單株抗體。本文提供一種具有針對FAP及DR5之結合特異性之雙特異性抗體。於某些實施例中，雙特異性抗體可與DR5之兩個不同抗原決定基結合。雙特異性抗體亦可用於定位細胞毒性劑至表現DR5之細胞。雙特異性抗體可經製備為全長抗體或抗體片段。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein與Cuello，Nature 305：537(1983))、WO 93/08829、及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))、及「結進孔」改造(參見：例如，美國專利案第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式製造：改造靜電操作作用以製備抗體Fc-異二聚分子(WO 2009/089004A1)；交聯兩個或更多個抗體或片段(參見：例如，美國專利案第4,676,980號、及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈以產生出雙特異性抗體(參見：例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術以製造雙特異性抗體片段(參見：例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444- 6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚物(參見：例如，Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；及如(例如)Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述製造三特異性抗體。
本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之改造抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(參見(例如)US 2006/0025576A1)。
本文中抗體或片段亦包括包含至少一個與FAP或DR5以及另一個不同抗原結合之抗原結合位點之「雙重作用FAb」或「DAF」(參見：例如，US 2008/0069820)。
用於本申請案中之術語「價」表示抗體分子中存在指定數目之結合位點。因此，術語「二價」、「四價」、及「六價」表示抗體分子中分別存在兩個結合位點、四個結合位點、及六個結合位點。根據本發明之雙特異性抗體為至少「二價」及可為「三價」或「多價」(例如，「四價」或「六價」)。
本發明之抗體具有兩個或更多個結合位點及為雙特異性。換言之，該等抗體甚至在存在多於兩個結合位點(即，抗體為三價或多價)之情況中亦可為雙特異性。本發明之雙特異性抗體包括(例如)多價單鏈抗體、雙功能抗體及三功能抗體、以及具有全長抗體之經一或多個肽連接子與其他抗原結合位點(例如，單鏈Fv、VH域及/或VL域、Fab、或(Fab)2)鍵聯之恆定域結構之抗體。該等抗體可為源自單一物種之全長，或為嵌合或人類化。
術語「載體」如本文所用係指可傳送其所鍵聯的另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞的基因組中之載體。某些載體可導向其以操作方式鍵聯的核酸之表現。該等載體於本文中稱為「表現載體」。
術語「胺基酸」如本申請案中所用表示包括以下之自然生成之 羧基α-胺基酸之群：丙胺酸(三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺酸(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、***酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)、及纈胺酸(val，V)。
如本文所用，詞句「細胞」、「細胞株」、及「細胞培養」係可互換使用及所有該等命名包括子代。因此，詞語「轉染子」及「轉染細胞」包括原代個體細胞及衍生自其(不考慮轉移數量)之培養物。亦應明瞭所有子代的DNA含量可能因故意或非有意突變而不完全相同。包括具有與如在原始轉形細胞中所篩選者相同功能或生物活性之變異子代。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間之總體非共價性相互作用之強度。除非另作指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)間之1：1相互作用之內因性結合親和力。分子X針對其搭配物Y之親和力可大致上由解離常數(Kd)表示。可藉由包括述於本文中彼等之相關技藝中已知之常用方法來測量親和力。下文描述用於測量結合親和力之特定示例性及例示性實施例。
如本文所用，術語「結合」或「特異結合」係指於活體外分析中，較佳在表面電漿共振分析(SPR，BIAcore，GE-Healthcare，Uppsala，瑞典)中，抗體與抗原之抗原決定基之結合。結合之親和力係由術語ka(來自抗體/抗原複合物之抗體之締合速率常數)、kD(解離常數)、及KD(kD/ka)定義。結合或特異結合意指10-8mol/l或更小、較佳10-9M至10-13mol/l之結合親和力(KD)。
可藉由BIAcore分析(GE-Healthcare，Uppsala，瑞典)研究抗體與死亡受體之結合。結合之親和力係由術語ka(來自抗體/抗原複合物之抗體之締合速率常數)、kD(解離常數)、及KD(kD/ka)定義。
術語「抗原決定基」包括可與抗體特異結合之任何多肽決定子。於某些實施例中，抗原決定基決定子包括諸如胺基酸之分子之化學活性表面原子團、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，及於某些實施例中，可具有特定三維結構特徵、及/或特定電荷特徵。抗原決定基為抗體所結合之抗原之區。
如本文所用，特定言之具有前綴「糖基-」之術語「改造」、以及術語「糖基化改造」被視為包括自然生成或重組多肽之糖基化形式或其片段之任何處理。糖基化改造包括細胞之糖基化機械之代謝改造，包括達成表現於細胞中之糖蛋白之改變糖基化之寡糖合成途徑之基因處理。另外，糖基化改造包括突變及細胞環境對糖基化之效應。於一個實施例中，糖基化改造為糖基轉移酶活性之改變。於一個特定實施例中，改造導致改變之葡糖胺基轉移酶活性及/或岩藻糖基轉移酶活性。
II.組合物及方法
於一個態樣中，本發明係基於包含對TRAIL死亡受體5(DR5)具特異性之第一抗原結合位點及對纖維母細胞活化蛋白(FAP)具特異性之第二抗原結合位點之雙特異性抗體。於另一個實施例中，提供靶向DR5之新穎抗體。本發明之抗體適用於，例如，癌症之治療或診斷。
A.與DR5及FAP結合之例示性雙特異性抗體
於一個態樣中，本發明提供與DR5及FAP結合之單離雙特異性抗體。FAP結合部分已述於其全文以引用方式包含之WO 2012/020006中。欲用於DR5-FAP雙特異性抗體中之特別受關注的FAP結合部分述於以下實施例中。
於某些實施例中，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體特異地交聯死亡受體及誘導標靶細胞之細胞凋亡。該等雙特異性死亡受體激動抗體優於習知死亡受體靶向抗體之優點在於僅在FAP經表現之位點處誘導細胞凋亡之特異性。如上所述，本發明之發明者開發出具有較已知之可併入新穎且有利之DR5-FAP雙特異性抗體中之DR5結合物優異性質之新穎DR5結合部分。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)由SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：17及SEQ ID NO.：75組成之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：25及SEQ ID NO.：83之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：84、SEQ ID NO.：96、SEQ ID NO.：98、SEQ ID NO.：104及SEQ ID NO.：108之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：20、SEQ ID NO.：27及SEQ ID NO.：86之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：21及SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f) SEQ ID NO.：6、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：87、SEQ ID NO.：99、SEQ ID NO.：105、SEQ ID NO.：109及SEQ ID NO.：97之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9及SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10及SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2； (c)SEQ ID NO.：11及SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12及SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13 and SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14及SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3； (d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：21之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：21之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：21之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1； (b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：21之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：27之輕鏈CDR1； (e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：27之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點： (a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1； (e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點： (a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原決定位點：(a)SEQ ID NO.：75之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：83之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：84之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：86之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：87之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：75之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：83之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：84之重鏈CDR3； (d)SEQ ID NO.：86之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：87之輕鏈CDR3及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：96之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：99之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗 體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：96之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：99之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：104之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO：105之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3； (d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：104之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO：105之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：108之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1； (e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO：109之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：108之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO：109之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗 體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：98之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：97之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：98之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：97之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1； (b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：27之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含：至少一個包括以下項之對DR5具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2； (c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：27之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3；及至少一個包括以下項之對FAP具特異性之抗原結合位點：(a)SEQ ID NO.：33之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：34之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：35之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：36之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：37之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：38之輕鏈CDR3。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個包括含有選自以下之群之胺基酸序列之可變重鏈及可變輕鏈之對DR5具特異性之抗原結合位點：SEQ ID NO.：7及SEQ ID NO.：8；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：29；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：32；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：82及SEQ ID NO.：85；SEQ ID NO.：100及SEQ ID NO.：101；SEQ ID NO.：102及SEQ ID NO.：103；SEQ ID NO.：106及SEQ ID NO.：107；SEQ ID NO.：94及SEQ ID NO.：95；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有選自：SEQ ID NO.：15及SEQ ID NO.：39之群之胺基酸序列之可變重鏈；及含有選自SEQ ID NO.：16及SEQ ID NO.：40之群之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之 抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：7之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：8之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：7之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：8之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：24之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：24之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：24之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈 及含有SEQ ID NO.：24之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：29之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：29之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：30之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：30之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：31之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP 具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：31之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：32之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：32之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：30之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：30之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列 之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：31之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：31之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：82之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：85之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：82之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：85之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：100之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：101之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：100之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：101之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：102之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：103之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：102之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：103之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：106之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：107之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：106之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：107之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之 抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：94之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：95之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：94之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：95之胺基酸序列之可變輕鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包括含有SEQ ID NO.：39之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包括含有SEQ ID NO.：151之胺基酸序列之重鏈恆定區。
於一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包括含有SEQ ID NO.：152之胺基酸序列之重鏈恆定區。
於另一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包括含有SEQ ID NO.：153之胺基酸序列之輕鏈恆定區。
於一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包括含有SEQ ID NO.：151之胺基酸序列之重鏈恆定區，其中C-端離胺酸已經移除。
於一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包括含有SEQ ID NO.：152之胺基酸序列之重鏈恆定區，其中C-端離胺酸已經移除。
於一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包括包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點之第一抗體，該第一抗體包含SEQ ID NO.：7之可變重鏈及SEQ ID NO.：8之可變輕鏈、及包含選自SEQ ID NO.：151或SEQ ID NO.：152之胺基酸序列之重鏈恆定區、及包含SEQ ID NO.：153之胺基酸序列之輕鏈恆定區，及對FAP具特異性之第二抗體，其包含一或多個如任何上述實施例中所定義之胺基酸序列。於一個實施例中，該重鏈恆定區之胺基酸序列之C-端離胺酸已經移除。
於一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包括包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點之第一抗體，該第一抗體包含SEQ ID NO.：7之可變重鏈及SEQ ID NO.：8之可變輕鏈、及包含選自SEQ ID NO.：151或SEQ ID NO.：152之胺基酸序列之重鏈恆定區、及包含SEQ ID NO.：153之胺基酸序列之輕鏈恆定區，及對FAP具特異性之第二抗體，其包含SEQ ID NO.：15之可變重鏈及SEQ ID NO.：16之可變輕鏈。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：131、SEQ ID NO.：132及SEQ ID NO.：124。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：133、SEQ ID NO.：132及SEQ ID NO.：124。
於一個較佳實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：134、SEQ ID NO.：132及SEQ ID NO.：124。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：262、SEQ ID NO.：263及SEQ ID NO.：132。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：135、SEQ ID NO.：136及SEQ ID NO.：137。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：138、SEQ ID NO.：139及SEQ ID NO.：137。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：274、SEQ ID NO.：275、及SEQ ID NO.：137。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：276、SEQ ID NO.：277、及SEQ ID NO.：132。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：278、SEQ ID NO.：279及SEQ ID NO.：132。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：142、SEQ ID NO.：143、SEQ ID NO.：124及SEQ ID NO.：132。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：145、SEQ ID NO.：146、SEQ ID NO.：124及SEQ ID NO.：132。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：144、SEQ ID NO.：143、SEQ ID NO.：124及SEQ ID NO.：132。
於一個實施例中，提供一種雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO.：159、SEQ ID NO.：160、SEQ ID NO.：161及SEQ ID NO.：162。
於另一個態樣中，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含至少一個包含相對SEQ ID NO.：7之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列相同度之重鏈可變域(VH)序列之對DR5具特異性之抗原結合位點、及至少一個包含SEQ ID NO.：15之可變重鏈及SEQ ID NO.：16之可變輕鏈之對FAP具特異性之抗原結合位點。
於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆取代)、***、或刪除，但包含該序列之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體保留與FAP及DR5結合之能力。於某些實施例中，在SEQ ID NO.：7中總計1至10個胺基酸已經取代、***及/或刪除。於某些實施例中，取代、***、或刪除係發生在HVR外部之區中(亦即，於FR中)。視情況，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體在SEQ ID NO.：7中包含VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含至少一個包含相對SEQ ID NO.：8之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列相同度之輕鏈可變域(VL)序列之對DR5具特異性之抗原結合位點、及至少一個包含SEQ ID NO.：15之可變重鏈及SEQ ID NO.：16之可變輕鏈之對FAP具特異性之抗原結合位點。
於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆取換)、***、或刪除，但包含該序列之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體保留與DR5及FAP結合之能力。於某些實施例中，在SEQ ID NO.：8中總計1至10個胺基酸已經取代、***及/或刪除。於某些實施例中，取代、***、或刪除係發生在HVR外部之區中(亦即，在FR中)。視情況，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體在SEQ ID NO：8中包含VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，其包含SEQ ID NO.：8之可變輕鏈及SEQ ID NO.：7之可變重鏈；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，其包含相對SEQ ID NO.：15之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列相同度之重鏈可變域(VH)序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆取換)、***、或刪除，但包含該序列之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體保留與FAP及DR5結合之能力。於某些實施例中，在SEQ ID NO.：15中總計1至10個胺基酸已經取代、***及/或刪除。於某些實施例中，取代、***、或刪除係發生於HVR外部之區中(亦即，在FR中)。視情況，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體在SEQ ID NO.：15中包含VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其包含至少一個包含SEQ ID NO.：8之可變輕鏈及SEQ ID NO.：7之可變重鏈之對DR5具特異性之抗原結合位點、及至少一個包含相對SEQ ID NO.：16之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、或100%序列相同度之輕鏈可變域(VL)之對FAP具特異性之抗原結合位點。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆取代)、***、或刪除，但包含該序列之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體保留與DR5及FAP結合之能力。於某些實施例中，在SEQ ID NO.：16中總計1至10個胺基酸已經取代、***及/或刪除。於某些實施例中，取代、***、或刪除係發生在HVR外部之區中(亦即，在FR中)。視情況，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體在SEQ ID NO：16中包含VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，其中該抗體包含如任何上文所提供實施例中之VH、及如任何上文所提供實施例中之VL。於一個實施例中，抗體分別在SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8、及SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16中包含VH及VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。
於本發明之另一個態樣中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體為單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之該雙特異性抗體為人類抗體。
B.與DR5結合之例示性抗體
於一個態樣中，本發明提供與DR5結合之單離抗體及抗體片段。該等死亡受體激動抗體具有較已知之可併入靶向DR5及第二抗原之新穎且有利之雙特異性抗體中之DR5結合物優異的性質。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)由SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：17及SEQ ID NO.：75組成之重鏈 CDR1；(b)SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：25及SEQ ID NO.：83之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：84、SEQ ID NO.：96、SEQ ID NO.：98、SEQ ID NO.：104及SEQ ID NO.：108之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：20、SEQ ID NO.：27及SEQ ID NO.：86之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：21及SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：6、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：87、SEQ ID NO.：99、SEQ ID NO.：105、SEQ ID NO.：109及SEQ ID NO.：97之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3； (d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：21之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：21之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：27之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：18之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及 (f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：17之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：25之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：19之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：20之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；及(f)SEQ ID NO.：22之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：75之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：83之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：84之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：86之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：28之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：87之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：96之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：99之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗 體，其包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：104之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO：105之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：108之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO：109之輕鏈CDR3。
於一個態樣中，本發明提供一種與死亡受體5(DR5)結合之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：98之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：97之輕鏈CDR3。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包含：包含選自以下之群之胺基酸序列之可變重鏈及可變輕鏈：SEQ ID NO.：7及SEQ ID NO.：8；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：29；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：32；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：82及SEQ ID NO.：85；SEQ ID NO.：100及SEQ ID NO.：101；SEQ ID NO.：102及SEQ ID NO.：103；SEQ ID NO.：106及SEQ ID NO.：107；SEQ ID NO.：94及SEQ ID NO.：95。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包含：包含SEQ ID NO.：7之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO.：8之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：24之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：24之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：29之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：30之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：31之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：32之胺基酸序 列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：26之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：30之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：23之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：31之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：82之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：85之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：100之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：101之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：102之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：103之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：106之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：107之胺基酸序列之可變輕鏈。
於一個實施例中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包括含有SEQ ID NO.：94之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO.：95之胺基酸序列之可變輕鏈。
於另一個態樣中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包含相對SEQ ID NO.：7之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列相同度之重鏈可變域(VH)序列。
於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆取代)、***、或刪除，但包含該序列之與DR5結合之抗體保留與DR5結合之能力。於某些實施例中，在SEQ ID NO.：7中總計1至10個胺基酸已經取代、***及/或刪除。於某些實施例中，取代、***、或刪除係發生在HVR外部之區中(亦即，在FR中)。視情況，與DR5結合之抗體在SEQ ID NO.：7中包含VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，與死亡受體5(DR5)結合之抗體包含相對SEQ ID NO.：8之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列相同度之輕鏈可變域(VL)序列。
於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆取代)、***、或刪除，但包含該序列之與DR5結合之抗體保留與DR5結合之能力。於某些實施例中，在SEQ ID NO.：8中總計1至10個胺基酸已經取代、***及/或刪除。於某些實施例中，取代、***、或刪除係發生在HVR外部之區中(亦即，在FR中)。視情況，與DR5結合之抗體在SEQ ID NO：8中包含VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種與DR5及第二抗原結合之雙特異性抗體，其中該抗體包含如在任何上文所提供實施例中之VH、及如在任何上文所提供實施例中之VL。於一個實施例中，抗體分別在SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8中包含VH及VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。於一個實施例中，提供一種與DR5及第二抗原結合之雙特異性抗體，其中該抗體包含如在任何上文所提供實施例中之VH、及如在任 何上文所提供實施例中之VL，及其中該抗體具有如下文部分C中針對DR5-FAP雙特異性抗體所述之形式。於另一個實施例中，提供與DR5及第二抗原結合之該雙特異性抗體，其包含如在任何上文所提供實施例中之VH、及如在任何上文所提供實施例中之VL，及其包含一或多個如下文部分D及E中針對DR5-FAP雙特異性抗體所述之Fc結構域修飾。
於本發明之另一個態樣中，根據任何上述實施例之與DR5結合之抗體為單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5結合之該抗體為人類抗體。
C.與DR5及FAP結合之雙特異性抗體之例示性形式
於一個實施例中，與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、xFab、scFab、雙功能抗體、或F(ab’)2片段。於另一個實施例中，抗體包括全長抗體(例如完整IgG1抗體)或其他如本文定義之抗體類別或同型物。
根據本發明之雙特異性抗體為至少二價及可為三價或多價，例如，四價或六價。
本發明之雙特異性抗體包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者經交換。
於另一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個該等Fab片段係經輕鏈(VLCL)與Fc結構域之第一或第二子單元連接及至少一個Fab片段係經重鏈(VHCH1)與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於任何該等實施例中，該等Fab片段可直接或經包含一或多個胺 基酸、通常約2至20個胺基酸之肽連接子融合至Fc結構域或彼此。肽連接子為相關技藝中已知並述於本文中。適宜之非免疫原性肽連接子包括(例如)(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子。「n」一般為介於1及10之間、通常介於2及4之間之數值。一個用於使第一及第二抗原結合部分之Fab輕鏈彼此融合之特別適宜的肽連接子為(G4S)2。一個適用於連接第一及第二抗原結合部分之Fab重鏈之例示性肽連接子為EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO.：318)。另外，連接子可包括免疫球蛋白絞鍵區(之一部分)。尤其在抗原結合部分係融合至Fc結構域子單元之N-端之情況下，其可於存在或不存在其他肽連接子下經免疫球蛋白絞鍵區或其一部分融合。
較佳地，該等雙特異性抗體為四價，其分別具有兩個各自靶向FAP及DR5之結合位點(2+2形式)。於另一個實施例中，該等雙特異性抗體為四價，其具有三個針對DR5之結合位點及一個針對FAP之結合位點(3+1形式)。該3+1形式可例如藉由將一個靶向FAP之Fab片段及一個靶向DR5之Fab片段融合至具有兩個DR5結合位點之IgG分子之重鏈的C-端來獲得。此更詳細地概述於下文中。
於另一個較佳實施例中，該等雙特異性抗體為三價(2+1形式)，其具有兩個各自靶向DR5之結合位點及一個靶向FAP之結合位點。該2+1形式可例如藉由將靶向FAP之Fab片段融合至具有兩個DR5結合位點之IgG分子之重鏈的C-端來獲得，其中第一抗體之該Fc部分係依照如下文所述之結進孔策略修飾。
於另一個較佳實施例中，該等雙特異性抗體為二價(1+1形式)，亦即，針對各DR5及FAP而言為單價。本發明之二價抗體具有一個靶向DR5之結合位點及一個靶向FAP之結合位點。該1+1形式可例如藉由述於Schaefer等人，Proc Natl Acad Sci USA 2011；108：11187-92中及如下文所述之Crossmab技術來獲得。
本發明雙特異性抗體之例示性形式提供於圖25及28中。
本文中提供包含根據任何上述實施例之任何序列之與DR5及FAP結合之不同雙特異性抗體形式。
1.呈2+2形式之雙特異性DR5-FAP抗體
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
由於上述雙特異性抗體針對FAP及DR5二者為二價，故其具有2個各自針對FAP及DR5之結合位點，此形式亦稱為「2+2」形式。具有2+2形式之雙特異性抗體之例示性結構描繪於圖28中。歸因於可變區或恆定區中任一者之交換，上述該等Fab片段亦稱為「交叉-Fab片段」或「xFab片段」或「交越Fab片段」。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之兩個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於另一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域， 兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對DR5具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段之重及輕鏈之可變區係經交換。
於另一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對DR5具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段之重及輕鏈之可變區係經交換。
歸因於Fab重及輕鏈之可變區之交換，對FAP具特異性之交越Fab片段各自包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈、及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈。該等交越Fab片段亦稱為CrossFab(VLVH)及各自包含VLCH1及VHCL鏈。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段， 及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段之重及輕鏈之恆定區係經交換。
於另一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及兩個各自包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對DR5具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段之重及輕鏈之恆定區係經交換。
歸因於Fab重及輕鏈之恆定區之交換，對FAP具特異性之交越Fab片段各自包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈、及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈。該等交越Fab片段亦稱為CrossFab(CLCH1)及包含VHCL及VLCH1鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之該雙特異性抗體包含N-端融合兩個Fab片段及C-端融合兩個Fab片段之Fc結構域，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。於一個實施例中，兩個Fab片段係經免疫球蛋白絞鍵區融合至Fc結構域之N-端。於一個實施例中，該免疫球蛋白絞鍵區為人類IgG1絞鍵區。於一個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段及Fc結構域為免疫球蛋白分子之一部分。於一個特定實施例中，該免疫球蛋白分子為IgG類別免疫球蛋白。於一個甚至更特定的實施例中，該免疫球蛋白為IgG1子類別免疫球蛋白。於另一個實施例中，該免疫球蛋白為IgG4子類別免疫球蛋白。於另一個特定實施例中，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。於其他實施例中，該免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
於一個實施例中，包含對FAP具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段係經肽連接子與Fc結構域連接。於一個實施例中，包含對FAP具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段係經肽連接子與Fc結構域之第一或第二子單元的C-端連接。於一此種實施例中，包含對FAP具特異性之抗原結合位點之該等Fab片段係經肽連接子與Fc結構域之第二子單元(CH3鏈)的C-端連接。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之該雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(即，兩個對DR5具特異性之Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於另一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子 及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換，其中該兩Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈的C-端。於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的恆定重鏈(CH1)之C-端。
於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換，其中該兩Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈的C-端。於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的恆定重鏈(CH1)之C-端。於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換，其中該兩Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈的C-端。於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的恆定重鏈(CH1)之C-端。於一個實施例中，該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於另一個較佳實施例中，對FAP具特異性之該兩Fab片段係經肽連接子、較佳具有約10至30個胺基酸長度之肽連接子融合至IgG分子。較佳地，該肽連接子為(G4S)2或(G4S)4連接子。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈的C-端。於一個實施例中，該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的恆定重鏈(CH1)之C-端。
於一個實施例中，該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子 之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈的C-端。
於一個實施例中，該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的恆定重鏈(CH1)之C-端。
於一個實施例中，該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個該等Fab片段係經輕鏈(VLCL)與Fc結構域之第一或第二子單元連接及至少一個Fab片段係經重鏈(VHCH1)與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含Fc結構域、兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個該等Fab片段係經輕鏈(VLCL)融合至Fc結構域之第一或第二子單元及至少一個Fab片段係經重鏈(VHCH1)與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含：a)Fc結構域， b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定輕鏈(CL)的C-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該兩Fab片段係在恆定重鏈(CH1)的C-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含：a)Fc結構域，b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定輕鏈(CL)的C-端與Fc結構域之第一子單元的N-端連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該兩Fab片段係在恆定重鏈(CH1)的C-端與Fc結構域之第二子單元(CH3)連接。
於一個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之該兩Fab片段各自經免疫球蛋白絞鍵區融合至Fc結構域。於一個具體實施例中，該免疫球蛋白絞鍵區為人類IgG1絞鍵區。於一個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之該兩Fab片段及Fc結構域為免疫球蛋白分子之一部分。於一個特定實施例中，該免疫球蛋白分子為IgG類別免疫球蛋白。於一個甚至更特定的實施例中，該免疫球蛋白為IgG1子類別免疫球蛋白。於另一個實施例中，該免疫球蛋白為IgG4子類別免疫球蛋白。於另一個特定實施例中，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。於其他實施例中，該免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
於一個實施例中，包含對FAP具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段係經肽連接子與Fc結構域連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含：a)Fc結構域，b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定重鏈(CH1)的C-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該兩Fab片段係在恆定輕鏈(CL)的N-端與Fc結構域之第一或第二子單元連接。
於一個實施例中，雙特異性抗體包含：a)Fc結構域，b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定重鏈(CH1)的C-端與Fc結構域之第一子單元的N-端連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該兩Fab片段係在恆定輕鏈(CL)的N-端與Fc結構域之第二子單元的N-端連接。
於一個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之該兩Fab片段各自係經免疫球蛋白絞鍵區融合至Fc結構域。於一個具體實施例中，該免疫球蛋白絞鍵區為人類IgG1絞鍵區。於一個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之該兩Fab片段及Fc結構域為免疫球蛋白分子之一部分。於一個特定實施例中，該免疫球蛋白分子為IgG類別免疫球蛋白。於一個甚至更特定的實施例中，該免疫球蛋白為IgG1子類別免疫球蛋白。於另一個實施例中，該免疫球蛋白為IgG4子類別免疫球蛋白。於另一個特定實施例中，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。於其他實施例中，該免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
具有2+2形式之例示性抗體
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包括：SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3；及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括：SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3；其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包括： SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3；及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括：SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3；其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQ ID NO.：7之可變重鏈及SEQ ID NO.：8之可變輕鏈；及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區；其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含： a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQ ID NO.：7之可變重鏈及SEQ ID NO.：8之可變輕鏈；及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區；其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於另一個實施例中，本發明之該雙特異性抗體包含如下所述之IgG分子之Fc部分中之修飾。
於一個實施例中，提供一種具有如上所述2+2形式之雙特異性抗體，其包含兩個SEQ ID NO.：131之VH(DR5)-Fc部分-VH(FAP)-CL鏈、兩個SEQ ID NO.：132之VL(DR5)-卡帕型輕鏈及兩個SEQ ID NO.：124之VLCH1(FAP)鏈。
於一個實施例中，提供一種具有如上所述2+2形式之雙特異性抗體，其包含兩個SEQ ID NO.：133之VH(DR5)-Fc部分-VH(FAP)-CL鏈、兩個SEQ ID NO.：132之VL(DR5)-卡帕型輕鏈及兩個SEQ ID NO.：124之VLCH1(FAP)鏈。
於一個實施例中，提供一種具有如上所述2+2形式之雙特異性抗體，其包含兩個SEQ ID NO.：134之VH(DR5)-Fc部分-VH(FAP)-CL鏈、兩個SEQ ID NO.：132之VL(DR5)-卡帕型輕鏈及兩個SEQ ID NO.：124之VLCH1(FAP)鏈。
於一個實施例中，提供一種具有如上所述2+2形式之雙特異性抗體，其包含兩個SEQ ID NO.135之VL(DR5)-CH1-Fc部分-VH(FAP)-CH1鏈、兩個SEQ ID NO.：136之VH(DR5)-CL鏈及兩個SEQ ID NO.：137之VL(FAP)-卡帕型輕鏈。
於一個實施例中，提供一種具有如上所述2+2形式之雙特異性抗 體，其包含兩個SEQ ID NO.：138之VH(DR5)CL-Fc-肽連接子-VH(FAP)-CH1鏈、兩個SEQ ID NO.：139之VL(DR5)-CH1鏈及兩個SEQ ID NO.：137之VL(FAP)-卡帕型輕鏈。
2.呈2+1形式之雙特異性DR5-FAP抗體
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
由於上述雙特異性抗體為三價，其具有一個針對FAP之結合位點及兩個針對DR5之結合位點，故此形式亦稱為「2+1」形式。因此，提供於此部分中之雙特異性抗體針對DR5為二價及針對FAP為單價。
具有2+1形式之雙特異性抗體之一種例示性結構描繪於圖25a)及b)中。歸因於可變區或恆定區中任一者之交換，上述該等Fab片段亦稱為「交叉-Fab片段」或「xFab片段」或「交越Fab片段」。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含： Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之可變區係經交換。
歸因於Fab重及輕鏈之該等可變區之交換，對FAP具特異性之交越Fab片段各自包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈、及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈。該交越Fab片段亦稱為CrossFab(VLVH)及包含VLCH1及VHCL鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，兩個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之兩Fab片段之重及輕鏈之恆定區係經交換。
歸因於Fab重及輕鏈之恆定區之交換，對FAP具特異性之交越Fab片段各自包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈、及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈。該等交越Fab片段亦稱為CrossFab(CLCH1)及包含VHCL及VLCH1鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之該雙特異性抗體包含N-端融合兩個Fab片段之Fc結構域。
於一個實施例中，兩個Fab片段係經免疫球蛋白絞鍵區融合至Fc結構域的N-端。於一個實施例中，該免疫球蛋白絞鍵區為人類IgG1絞鍵區。於一個特定實施例中，該免疫球蛋白分子為IgG類別免疫球蛋白。於一個甚至更特定的實施例中，該免疫球蛋白為IgG1子類別免疫 球蛋白。於另一個實施例中，該免疫球蛋白為IgG4子類別免疫球蛋白。於另一個特定實施例中，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。於其他實施例中，該免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
具有融合至C-端之FAP結合物之呈2+1形式之雙特異性DR5-FAP抗體
於一個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之兩個Fab片段及Fc結構域為免疫球蛋白分子之一部分。於一個實施例中，一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段係經肽連接子融合至Fc結構域之第一或第二子單元的C-端。於一該種實施例中，包含對FAP具特異性之抗原結合位點之該Fab片段係經肽連接子融合至Fc結構域之第二子單元(CH3鏈)的C-端。具有融合至C-端之FAP結合物之呈2+1形式之雙特異性DR5-FAP抗體之一種例示性結構描繪於圖25a)中。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等可變區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙 特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等恆定區係經交換。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換，其中該Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，b)之該對FAP具特異性之Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的C-端。於一個實施例中，b)之該Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等可變區係經交換，其中該Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，b)之該對FAP具特異性之Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的C-端。於一個實施例中，b)之該Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等恆定區係經交換，其中該Fab片段係融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，b)之該對FAP具特異性之Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的C-端。於一個實施例中，b)之該Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
具有融合至N-端的FAP結合物之呈2+1形式之雙特異性DR5-FAP抗體
於另一個實施例中，一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段及Fc結構域為免疫球蛋白分子之一部分。於一個實施例中，另一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段係經肽連接子融合至IgG分子之包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段的N-端。具有融合至N-端之FAP結合物之呈2+1形式之雙特異性DR5-FAP抗體之一種例示性結構描繪於圖25b)中。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有一個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)及一個對FAP具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中該對FAP具特異性之Fab片段為Crossfab片段(即，重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換)。
b)一個對DR5具特異性之Fab片段。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中該對FAP具特異性之Fab片段為CrossFab(VLVH)片段(即，重及輕鏈之該等可變區係經交換)。
b)一個對DR5具特異性之Fab片段。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中該對FAP具特異性之Fab片段為CrossFab(CLCH1片段(即，重及輕鏈之該等恆定區係經交換)。
b)一個對DR5具特異性之Fab片段。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中該對FAP具特異性之Fab片段為Crossfab片段(即，重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換)。
b)一個對DR5具特異性之Fab片段，其中該Fab片段係融合至IgG分子之可變重或輕鏈的N-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有一個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中該對FAP具特異性之Fab片段為CrossFab(VLVH)片段(即，重及輕鏈之該等可變區係經交換)。
b)一個對DR5具特異性之Fab片段，其中該Fab片段係融合至IgG分子之可變重或輕鏈的N-端。
於一個實施例中，b)之該對DR5具特異性之Fab片段係融合至a)之該對DR5具特異性之Fab片段之可變重或輕鏈的N-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中該對FAP具特異性之Fab片段為CrossFab(CLCH1)片段(即，重及輕鏈之該等恆定區係經交換)。
b)一個對DR5具特異性之Fab片段，其中該Fab片段係融合至IgG分子之可變重或輕鏈的N-端。
於一個實施例中，b)之該對DR5具特異性之Fab片段係融合至a)之該對DR5具特異性之Fab片段之可變重或輕鏈的N-端。
於另一個較佳實施例中，對DR5具特異性之Fab片段係經肽連接子、較佳具有約10至30個胺基酸長度之肽連接子融合至IgG分子。較佳地，該肽連接子為(G4S)2或(G4S)4連接子。
於另一個實施例中，本發明之該雙特異性抗體包含如下所述之IgG分子之Fc部分中之修飾。
3.呈3+1形式之雙特異性DR5-FAP抗體
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，三個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
由於上述雙特異性抗體為四價，其具有一個針對FAP之結合位點及三個針對DR5之結合位點，故此形式亦稱為「3+1」形式。因此，述於此部分中之雙特異性分子針對DR5為三價及針對FAP為單價。
具有3+1形式之雙特異性抗體之一種例示性結構描繪於圖25 c)中。歸因於可變區或恆定區中任一者之交換，上述該等Fab片段亦稱為「交叉-Fab片段」或「xFab片段」或「交越Fab片段」。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，三個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，三個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之該等可變區係經交換。
歸因於Fab重及輕鏈之該等可變區之交換，對FAP具特異性之交越Fab片段包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈、及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈。該交越Fab片段亦稱為CrossFab(VLVH)及包含VLCH1及VHCL鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含： Fc結構域，三個各自包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之該等恆定區係經交換。
歸因於Fab重及輕鏈之該等恆定區之交換，對FAP具特異性之交越Fab片段各自包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈、及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈。該交越Fab片段亦稱為CrossFab(CLCH1)及包含VHCL及VLCH1鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之該與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含N-端融合兩個Fab片段及C-端融合兩個Fab片段之Fc結構域，其中該一個對FAP具特異性之Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，兩個Fab片段係經免疫球蛋白絞鍵區融合至Fc結構域的N-端。於一個實施例中，該免疫球蛋白絞鍵區為人類IgG1絞鍵區。於一個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之該兩Fab片段及Fc結構域為免疫球蛋白分子之一部分。於一個特定實施例中，該免疫球蛋白分子為IgG類別免疫球蛋白。於一個甚至更特定的實施例中，該免疫球蛋白為IgG1子類別免疫球蛋白。於另一個實施例中，該免疫球蛋白為IgG4子類別免疫球蛋白。於另一個特定實施例中，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。於其他實施例中，該免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及 b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
c)一個對DR5具特異性之Fab片段。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等可變區係經交換。
c)一個對DR5具特異性之Fab片段。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等恆定區係經交換。
c)一個對DR5具特異性之Fab片段。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換，c)一個對DR5具特異性之Fab片段，其中b)及c)之該等Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元的C-端。
於一個實施例中，b)及c)之該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等可變區係經交換。
c)一個對DR5具特異性之Fab片段，其中b)及c)之該等Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元。
於一個實施例中，b)及c)之該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點(Fab片段)之免疫球蛋白G(IgG)分子及b)一個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等恆定區係經交換。
c)一個對DR5具特異性之Fab片段，其中b)及c)之該等Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第一或第二子單元。
於一個實施例中，b)及c)之該兩Fab片段係融合至該IgG分子之Fc結構域之第二子單元(CH3)的C-端。
於另一個較佳實施例中，此部分中所述任何實施例之b)及c)之兩Fab片段係經肽連接子、較佳具有約10至30個胺基酸長度之肽連接子 融合至IgG分子。較佳地，該肽連接子為(G4S)2或(G4S)4連接子。
於另一個實施例中，本發明之該特異性抗體包含如下所述之IgG分子之Fc部分中之修飾。
4.呈1+1形式之雙特異性DR5-FAP抗體
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
由於上述雙特異性抗體為二價，其具有一個針對FAP之結合位點及一個針對DR5之結合位點，故此形式亦稱為「1+1」形式。因此，述於此部分中之該等雙特異性抗體針對DR5為單價及針對FAP為單價。具有1+1形式之雙特異性抗體之一種例示性結構描繪於圖25 d)中。歸因於可變區或恆定區中任一者之交換，上述Fab片段亦稱為「交叉-Fab片段」或「xFab片段」或「交越Fab片段」。呈1+1形式之IgG分子亦稱為Crossmab形式(參見Schaefer等人，Proc Natl Acad Sci USA 2011；108：11187-92)。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之該等可變區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：Fc結構域，一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，及一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段之重及輕鏈之該等恆定區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之該雙特異性抗體包含N-端融合兩個Fab片段之Fc結構域，其中至少一個Fab片段之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。於一個實施例中，該兩Fab片段係經免疫球蛋白絞鍵區融合至Fc結構域的N-端。於一個實施例中，該免疫球蛋白絞鍵區為人類IgG1絞鍵區。於一 個實施例中，包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段及Fc結構域為免疫球蛋白分子之一部分。於一個特定實施例中，該免疫球蛋白分子為IgG類別免疫球蛋白。於一個甚至更特定的實施例中，該免疫球蛋白為IgG1子類別免疫球蛋白。於另一個實施例中，該免疫球蛋白為IgG4子類別免疫球蛋白。於另一個特定實施例中，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。於其他實施例中，該免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子之一個臂(Fab片段)之重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子之一個臂(Fab片段)之重及輕鏈之該等可變區係經交換。此抗體形式亦稱為CrossMab(VHVL)。
於一個實施例中，包含對FAP具特異性之結合位點之IgG分子之一個臂(Fab片段)之重及輕鏈之該等可變區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子之一個臂(Fab片段)之重及輕鏈之該等恆定區係經交換。此抗體形式亦稱為CrossMab(CH1CL)。
於一個實施例中，包含對FAP具特異性之結合位點之IgG分子之一個臂(Fab片段)之重及輕鏈之該等恆定區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含具有一個對DR5具特異性之結合位點及一個對FAP具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子之一個臂(Fab片段)之完整VH-CH1及VL-CL域係經交換。此意指至少一個該等Fab片段係經輕鏈(VLCL)融合至Fc結構域的N-端。於一個實施例中，另一個Fab片段係經重鏈(VHCH1)融合至Fc結構域的N-端。
此抗體形式亦稱為CrossMabFab。於一個實施例中，兩個Fab片段係經免疫球蛋白絞鍵區融合至Fc結構域的N-端。
D.減低Fc受體結合及/或效應子功能之Fc結構域修飾
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含Fc部分經修飾之免疫球蛋白G(IgG)分子。該經修飾之Fc部分相較於野生型Fc部分具有減低之對Fcγ受體之結合親和力。
本發明雙特異性抗體之Fc結構域係由一對包含免疫球蛋白分子之重鏈域之多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子之Fc結構域為二聚物，該二聚物之各子單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc結構域之該兩子單元可彼此穩定締合。
於根據本發明之一個實施例中，本發明雙特異性抗體之Fc結構域為IgG Fc結構域。於一個特定實施例中，該Fc結構域為IgG1 Fc結構域。於另一實施例中，該Fc結構域為IgG4 Fc結構域。於一個較特定實施例中，該Fc結構域為在位置S228(Kabat編號)包含胺基酸取代(特別是胺基酸取代S228P)之IgG4 Fc結構域。於一個較特定實施例中，該Fc結構域為包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G之IgG4 Fc結構域。此胺基酸取代減低IgG4抗體之活體內Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91(2010))。於另一個特定實施例中，該Fc結構域為人類Fc結構域。人類IgG1 Fc區之一種 例示性序列係示於SEQ ID NO.：151。
Fc結構域賦予本發明之雙特異性抗體之有利藥物動力性質，包括造成良好累積於標靶組織中之長血清半衰期及有利的組織-血液分佈比。然而，其同時可導致本發明之雙特異性抗體不期望地靶向表現Fc受體之細胞而非靶向較佳的帶有抗原之細胞。因此，於特定實施例中，本發明之雙特異性抗體之Fc結構域相較於天然IgG1 Fc結構域展現減低之與Fc受體之結合親和力及/或減低之效應子功能。於該實施例中，Fc結構域(或包含該Fc結構域之本發明之雙特異性抗體)相較於天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域之本發明之雙特異性抗體)展現小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%及最佳小於5%之與Fc受體之結合親和力，及/或相較於天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域之本發明之雙特異性抗體)展現小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%及最佳小於5%之效應子功能。於一個實施例中，Fc結構域(或包含該Fc結構域之本發明之雙特異性抗體)實質上不與Fc受體結合且/或誘導效應子功能。於一個特定實施例中，該Fc受體為Fcγ受體。於一個實施例中，該Fc受體為人類Fc受體。於一個實施例中，該Fc受體為活化Fc受體。於一具體實施例中，該Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之係人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之係人類FcγRIIIa。於一個實施例中，該Fc受體為抑制性Fc受體。於一具體實施例中，該Fc受體為抑制性人類Fcγ受體，更特定言之係人類FcgRIIB。於一個實施例中，該效應子功能為CDC、ADCC、ADCP、及細胞激素分泌中之一或多者。於一個特定實施例中，該效應子功能為ADCC。於一個實施例中，Fc結構域相較於天然IgG1 Fc結構域展現實質上類似的對新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力。實質上類似的與FcRn之結合係於Fc結構域(或包含該Fc結構域之本發明之雙特異性抗體)展現天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域之本發明之雙特 異性抗體)對FcRn之結合親和力之大於約70%、特定言之大於約80%、更特定言之大於約90%時達成。
於某些實施例中，Fc結構域係經改造以相較於未經改造之Fc結構域具有減低之與Fc受體之結合親和力及/或減低之效應子功能。於特定實施例中，本發明雙特異性抗體之Fc結構域包含一或多個減低Fc結構域與Fc受體之結合親和力及/或效應子功能之胺基酸突變。通常，該相同的一或多個胺基酸突變係存於Fc結構域之兩個子單元之各者中。於一個實施例中，該胺基酸突變使Fc結構域與Fc受體之結合親和力減低。於一個實施例中，該胺基酸突變使Fc結構域與Fc受體之結合親和力減低至少2-倍、至少5-倍、或至少10-倍。於存在多於一個使Fc結構域與Fc受體之結合親和力減低之胺基酸突變之實施例中，該等胺基酸突變之組合可使Fc結構域與Fc受體之結合親和力減低至少10-倍、至少20-倍、或甚至至少50-倍。於一個實施例中，包含經改造之Fc結構域之本發明之雙特異性抗體相較於包含未經改造之Fc結構域之本發明之雙特異性抗體展現小於20%、特定言之小於10%、更特定言之小於5%之與Fc受體之結合親和力。於一個特定實施例中，該Fc受體為Fcγ受體。於一些實施例中，該Fc受體為人類Fc受體。於一個實施例中，該Fc受體為抑制性Fc受體。於一具體實施例中，該Fc受體為抑制性人類Fcγ受體，更特定言之係人類FcgRIIB。於一些實施例中，該Fc受體為活化Fc受體。於一具體實施例中，該Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之係人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之係人類FcγRIIIa。較佳地，與該等受體各者之結合減低。於一些實施例中，與補體組分之結合親和力、特定言之與C1q之結合親和力亦減低。於一個實施例中，與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力未減低。實質上類似的與FcRn之結合(即，保持Fc結構域與該受體之結合親和力)係於Fc結構域(或包含該Fc結構域之本發明之雙特異性抗體)展現大 於Fc結構域之未經改造形式(或包含該Fc結構域之未經改造形式之本發明雙特異性抗體)與FcRn之結合親和力之約70%時達成。Fc結構域、或包含該Fc結構域之本發明之雙特異性抗體可展現該親和力之大於約80%及甚至大於約90%。於某些實施例中，本發明雙特異性抗體之Fc結構域係經改造以相較於未經改造之Fc結構域具有減低之效應子功能。減低之效應子功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：減低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、減低之抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)、減低之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、減低之細胞激素分泌、減低之由抗原呈現細胞捕捉之免疫複合物介導之抗原、減低之與NK細胞之結合、減低之與巨噬細胞之結合、減低之與單核細胞之結合、減低之與多形核細胞之結合、減低之直接誘導細胞凋亡信號傳導、減低之樹突細胞成熟、或減低之T細胞致敏。於一個實施例中，減低之效應子功能為減低之CDC、減低之ADCC、減低之ADCP、及減低之細胞激素分泌中之一或多者。於一個特定實施例中，減低之效應子功能為減低之ADCC。於一個實施例中，減低之ADCC小於由未經改造之Fc結構域(或包含未經改造之Fc結構域之本發明雙特異性抗體)所誘導ADCC之20%。
於一個實施例中，減低Fc結構域與Fc受體之結合親和力及/或效應子功能之胺基酸突變為胺基酸取代。於一個實施例中，該Fc結構域包含在E233、L234、L235、N297、P331及P329位置處之胺基酸取代。於一較具體實施例中，該Fc結構域包含在L234、L235及P329位置處之胺基酸取代。於一些實施例中，該Fc結構域包含胺基酸取代L234A及L235A。於一該種實施例中，該Fc結構域為IgG1 Fc結構域，特定言之係人類IgG1 Fc結構域。於一個實施例中，該Fc結構域包含在位置P329處之胺基酸取代。於一較具體實施例中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之係P329G。於一個實施例中，該Fc結構域 包含在位置P329處之胺基酸取代及在選自E233、L234、L235、N297及P331之位置處之另一胺基酸取代。於一較具體實施例中，該另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。於特定實施例中，該Fc結構域包含在位置P329、L234及L235處之胺基酸取代。於更特定實施例中，Fc結構域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G(「P329G LALA」)。於一該種實施例中，該Fc結構域為IgG1 Fc結構域，特定言之係人類IgG1 Fc結構域。「P329G LALA」組合之胺基酸取代幾近完全地消除人類IgG1 Fc結構域之Fcγ受體結合，如PCT專利申請案第PCT/EP2012/055393號中所述，該案係以全文引用方式併入本文中。PCT/EP2012/055393亦描述製備該等突變Fc結構域之方法及確定其諸如Fc受體結合或效應子功能之性質之方法。
IgG4抗體相較於IgG1抗體展現減低之與Fc受體之結合親和力及減低之效應子功能。因此，於一些實施例中，本發明雙特異性抗體之Fc結構域為IgG4 Fc結構域，特定言之係人類IgG4 Fc結構域。於一個實施例中，IgG4 Fc結構域包含在位置S228處之胺基酸取代，特定言之係胺基酸取代S228P。為進一步減低其與Fc受體之結合親和力及/或其效應子功能，於一個實施例中，IgG4 Fc結構域包含在位置L235處之胺基酸取代，特定言之係胺基酸取代L235E。於另一個實施例中，IgG4 Fc結構域包含在位置P329處之胺基酸取代，特定言之係胺基酸取代P329G。於一個特定實施例中，IgG4 Fc結構域包含在位置S228、L235及P329處之胺基酸取代，特定言之係胺基酸取代S228P、L235E及P329G。該等IgG4 Fc結構域突變及其Fcγ受體結合性質述於PCT專利申請案第PCT/EP2012/055393號中，該案係以全文引用方式併入本文中。
於一個特定實施例中，相較於天然IgG1 Fc結構域展現減低之與 Fc受體之結合親和力及/或減低之效應子功能之該Fc結構域為包含胺基酸取代L234A、L235A且視情況包含P329G之人類IgG1 Fc結構域、或包含胺基酸取代S228P、L235E且視情況包含P329G之人類IgG4 Fc結構域。
於某些實施例中，已除去Fc結構域之N-糖基化。於一該種實施例中，該Fc結構域包含在位置N297處之胺基酸突變，特定言之係以丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)取代天冬醯胺酸之胺基酸取代。
除了述於上文及於PCT專利申請案第PCT/EP2012/055393號中之Fc結構域外，具有減低之Fc受體結合及/或效應子功能之Fc結構域亦包括具有Fc結構域殘基238、265、269、270、297、327及329中一或多者之取代之彼等(美國專利案第6,737,056號)。該等Fc突變包括具有在胺基酸位置265、269、270、297及327中兩或更多者處之取代之Fc突變，包括具有殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變(美國專利案第7,332,581號)。
突變Fc結構域可利用相關技藝中熟知的基因或化學方法藉由胺基酸刪除、取代、***或修飾來製備。基因方法可包括編碼DNA序列之定點突變、PCR、基因合成、及類似方法。正確的核苷酸變化可例如藉由定序來驗證。
與Fc受體之結合可簡單地例如藉由ELISA，或藉由表面電漿共振(SPR)使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準測量儀器來確定，及Fc受體諸如可藉由重組表現來獲得。本文中描述適宜之該種結合檢測。或者，Fc結構域或包含Fc結構域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體之結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株，諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞來評估。
Fc結構域、或包含Fc結構域之本發明雙特異性抗體之效應子功能可藉由相關技藝中已知的方法測量。本文中描述一種用於測量 ADCC之適宜檢測。活體外檢測以評估所關注分子之ADCC活性之其他實例述於美國專利案第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502(1985)；美國專利案第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166，1351-1361(1987)中。或者，可採用非放射性檢測方法(參見(例如)就流式細胞儀而言之ACTITM非放射性細胞毒性檢測(CellTechnology,Inc.，Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢測(Promega，Madison,WI))。用於該等檢測之有用的效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，所關注分子之ADCC活性可例如在諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656(1998)中所揭示之動物模型中進行活體內評估。
於一些實施例中，Fc結構域與補體組分，特定言之與C1q之結合經減低。因此，於其中Fc結構域經改造以具有減低之效應子功能之一些實施例中，該減低之效應子功能包括減低之CDC。可進行C1q結合檢測以判定本發明之雙特異性抗體是否可與C1q結合且因此具有CDC活性。參見：例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC檢測(參見：例如，Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202，163(1996)；Cragg等人，Blood 101，1045-1052(2003)；及Cragg與Glennie，Blood 103，2738-2743(2004))。
下一部分描述包含減低Fc受體結合及/或效應子功能之Fc結構域修飾之本發明雙特異性抗體之較佳實施例。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分 子，其中Fc結構域相較於天然IgG1 Fc結構域展現減低之與Fc受體之結合親和力及/或減低之效應子功能，及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc結構域包含一或多個減低與Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代。
b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中該一或多個胺基酸取代係在L234、L235、及P329之一或多個位置處，b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G。
b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G。
b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之該等可變區係經交換。
於一個較佳實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：
a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc結構域之各子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G。
b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc結構域之各子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙 特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包括：由SEQ ID NO.：1組成之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3；其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化及抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括：SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3； SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3；其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包括：由SEQ ID NO.：1組成之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3；其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括：SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3； 其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包括：由SEQ ID NO.：1組成之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3；其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括：SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3；SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3；其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙 特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQ ID NO.：7之可變重鏈及SEQ ID NO.：8之可變輕鏈；其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區，其中重及輕鏈之可變區或恆定區中任一者係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQ ID NO.：7之可變重鏈及SEQ ID NO.：8之可變輕鏈；其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區，其中Fab重及輕鏈之恆定區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含：a)具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分 子，其包含SEQ ID NO.：7之可變重鏈及SEQ ID NO.：8之可變輕鏈；其中Fc結構域之各個子單元包含三個減低與活化或抑制性Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G及b)兩個對FAP具特異性之Fab片段，其包括含有SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區，其中Fab重及輕鏈之可變區係經交換，其中該兩Fab片段係經肽連接子融合至該IgG分子之恆定重鏈。
E.促進異二聚合之Fc結構域修飾
本發明之雙特異性DR5-FAP抗體包含融合至Fc結構域之兩個子單元之一者或另一者之不同抗原結合部分，因而Fc結構域之兩個子單元通常包含於兩個非相同多肽鏈中。該等多肽之重組共表現及後續二聚合導致兩個多肽之若干種可能組合。為提高重組生產中本發明雙特異性抗體之產率及純度，因此在本發明雙特異性抗體之Fc結構域中引入促進所需多肽之締合之修飾將極為有利。
因此，於特定實施例中，本發明雙特異性抗體之Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之締合之修飾。人類IgG Fc結構域之兩個子單元間最為廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用之位點係在Fc結構域之CH3域中。因此，於一個實施例中，該修飾係在Fc結構域之CH3域中。
於一具體實施例中，該修飾為所謂的「結進孔」修飾，其包括在Fc結構域之兩個子單元之一者中之「結」修飾及在Fc結構域之兩個子單元之另一者中之「孔」修飾。
結進孔技術述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621(1996)及Carter，J Immunol Meth 248，7- 15(2001)中。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「結」)及在第二多肽之界面處引入對應凹穴(「孔」)，以致隆凸可定位於凹穴中來促進異二聚物形成及位阻同型二聚物形成。隆凸係藉由從第一多肽之界面以較大側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)置換小胺基酸側鏈來建構。在第二多肽之界面經由以較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來建立與隆凸相同或類似大小的互補凹穴。
因此，於一個特定實施例中，在本發明雙特異性抗體之Fc結構域之第一子單元之CH3域中，以具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換胺基酸殘基，因而於第一子單元之CH3域中產生可定位於第二子單元之CH3域中之凹穴內之隆凸，及在Fc結構域之第二子單元之CH3結構域中，以具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換胺基酸殘基，因而於第二子單元之CH3域中產生第一子單元之CH3域中之隆凸可定位於其中之凹穴。
可藉由改變編碼多肽之核酸，例如，藉由定點突變、或藉由肽合成，製得隆凸及凹穴。
於一具體實施例中，在Fc結構域之第一子單元之CH3域中，以色胺酸殘基(T366W)置換位置366處之蘇胺酸殘基，及在Fc結構域之第二子單元之CH3域中，以纈胺酸殘基(Y407V)置換位置407處之酪胺酸殘基。於一個實施例中，在Fc結構域之第二子單元中，另外地，以絲胺酸殘基(T366S)置換位置366處之蘇胺酸殘基及以丙胺酸殘基(L368A)置換位置368處之白胺酸殘基。
又於另一個實施例中，在Fc結構域之第一子單元中，另外地，以半胱胺酸殘基(S354C)置換位置354處之絲胺酸殘基，及在Fc結構域之第二子單元中，另外地，以半胱胺酸殘基(Y349C)置換位置349處之酪胺酸殘基。該兩半胱胺酸殘基之引入導致在Fc結構域之兩個子單元 之間形成二硫橋，進一步穩定二聚物(Carter，J Immunol Methods 248，7-15(2001))。
於一替代實施例中，促進Fc結構域之第一及第二子單元之締合之修飾包括介導靜電操作作用之修飾，例如，如PCT公開案WO 2009/089004中所述。一般而言，此方法涉及在兩個Fc結構域子單元之界面處以帶電荷的胺基酸殘基置換一或多個胺基酸殘基，以致同型二聚物之形成變得在靜電上不利而異二聚合在靜電上有利。
於一個實施例中，根據任何上述實施例之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體包含具有兩個對DR5具特異性之結合位點之免疫球蛋白G(IgG)分子，其中第一重鏈之Fc部分包含第一二聚合模組及第二重鏈之Fc部分包含容許IgG分子之兩個重鏈異二聚合之第二二聚合模組。
於另一個較佳實施例中，依照結進孔策略，第一二聚合模組包含結及第二二聚合模組包含孔(參見Carter P.；Ridgway J.B.B.；Presta L.G.：Immunotechnology，第2卷，編號1，1996年2月，第73至73頁(1))。
F.核酸序列、載體及方法
本發明進一步提供編碼如本文所述之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體或其片段之單離的多核苷酸。編碼本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之多核苷酸可經表現為編碼整體雙特異性抗原結合分子或與DR5結合之整體抗體之單一多核苷酸或作為經共同表現之多個(例如，兩個或更多個)多核苷酸。由經共同表現之多核苷酸編碼之多肽可藉由例如二硫鍵或其他方式締合，以形成功能性雙特異性抗體或與DR5結合之抗體。例如，Fab片段之輕鏈部分可藉由來自包含Fab片段之重鏈部分、Fc結構域子單元及視情況另一Fab片段(之一部分)之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體部分之個別多核苷酸編碼。在共同表現之情況下，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成Fab片段。於另一 個實例中，其中所提供之包含兩個Fc結構域子單元中之一者且視情況包含一或多個Fab片段(之一部分)之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體部分可藉由來自其中所提供之包含兩個Fc結構域子單元中之另一者且視情況包含Fab片段(之一部分)之該雙特異性抗體或該與DR5結合之抗體部分之個別多核苷酸編碼。在共同表現之情況下，Fc結構域子單元將締合形成Fc結構域。
於一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之雙特異性抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼如以SEQ ID NO 167、175、183、191、199、207及209所顯示之可變重鏈序列之序列。
於一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之雙特異性抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該核苷酸包含編碼如以SEQ ID NO 171、179、187、195、203、208及210所顯示之可變輕鏈序列之序列。
於另一個實施例中，本發明係關於一種編碼雙特異性抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼如以SEQ ID NO 222、224、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、258、259、260、261、264及265所顯示之多肽序列之序列。
於一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之與DR5結合之抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼如以SEQ ID NO 167、175、183、191及199所顯示之可變重鏈序列之序列。
於一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之與DR5結合之抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼如以SEQ ID NO 171、179、187、195及203所顯示之可變輕鏈序列之序列。
於另一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之雙特異性抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO 167、175、183、191、199、207或209中之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之可變重鏈序列之序列。
於另一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之雙特異性抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO 171、179、187、195、203、208或210中之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之可變輕鏈序列之序列。
於另一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之與DR5結合之抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO 167、175、183、191或199中之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之可變重鏈序列之序列。
於另一個實施例中，本發明係關於一種編碼本發明之與DR5結合之抗體或其片段之單離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO 171、179、187、195或203中之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同度之可變輕鏈序列之序列。
於某些實施例中，該多核苷酸或核酸為DNA。於其他實施例中，本發明之多核苷酸為例如呈信使RNA(mRNA)形式之RNA。本發明之RNA可為單股或雙股。
於其他標的中，本發明係關於一種包含本發明之核酸序列之表現載體及關於一種包含本發明載體之原核或真核宿主細胞。此外，提供一種包括培養宿主細胞以便產生出抗體之產生抗體之方法。
G.抗體變型
於某些實施例中，除了以上所述之彼等外，尚涵蓋本文所提供之雙特異性抗體及與DR5結合之抗體之胺基酸序列變型。例如，可能期望改良雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之結合親和力及/或其他生物性質。雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之胺基酸序列變型可藉由引入適宜之修飾至編碼雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之核苷酸序列中、或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)刪除形式、及/或至抗體胺基酸序列中之***及/或殘基取代。可進行刪除、***、及取代之任何組合以達成最終建構，其限制條件為最終建構具有例如抗原結合之所欲特徵。
1.取代、***、及刪除變型
於某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變型。用於取代突變之相關位點包括HVR及FR。守恆取代顯示於表B中之標題「守恆取代」下。更多實質改變提供於表B中之標題「例示性取代」下，及如參照胺基酸側鏈類別進一步論述於下文。胺基酸取代可經引入至相關抗體及針對所欲活性(例如經保留/改良之抗原結合、經減低之免疫原性、或經改良之ADCC或CDC)所篩選之產品中。
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非守恆取代將需要將該等類別之一者交換成另一類別。
取代變型之一種類型涉及取代親本抗體(例如，人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。一般而言，針對進一步研究所選擇的所得變型將具有相對於親本抗體在某些生物性質(例如，增加之親和力、減低之免疫原性)方面之修飾(例如，改善)且/或將具有親本抗體之實質上經保留之某些生物性狀。一種例示性取代變型為親和力成熟抗體，其可方便地例如利用諸如本文所述彼等之基於噬菌體展示之親 和力成熟技術來產生。簡言之，一或多個HVR殘基經變異及該等變異抗體呈現於噬菌體上及針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
可在HVR中進行改變(例如，取代)，例如，以提高抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點」(即，由在體細胞成熟過程中於高頻率下經歷突變之密碼子編碼之殘基)(參見：例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))、及/或SDR(a-CDR)中進行，且針對結合親和力對所得變異VH或VL進行測試。藉由建構及從二級庫再選擇之親和力成熟已述於(例如)Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，Human出版社，Totowa,NJ(2001))中。於親和力成熟之一些實施例中，藉由任何多種方法(例如，易錯PCR、鏈改組(chain shuffling)、或寡核苷酸誘導之突變)將多樣性引入至針對成熟所選擇的可變基因中。接著建立二級庫。該庫接著經篩選以鑒別具有所欲親和力之任何抗體變型。引入多樣性之另一種方法涉及HVR誘導之方法，其中使若干個HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)隨機分組。可例如利用丙胺酸掃描突變或模型化明確地鑒別出抗原結合中所涉及的HVR殘基。特定言之，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
於某些實施例中，可於一或多個HVR中發生取代、***、或刪除，只要該等改變實質上不減低抗體與抗原結合之能力即可。例如，可在HVR中進行實質上不減低結合親和力之守恆改變(例如，如提供於本文中之守恆取代)。該等改變可係在HVR「熱點」或SDR外部。於以上所提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR係未經改變，或包含不大於一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種可用於鑒別抗體之可經靶向以進行突變之殘基或區之方法稱為「丙胺酸掃描突變」，如由Cunningham與Wells(1989)Science， 244：1081-1085所述。於此方法中，鑑別標靶殘基(例如，帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys、及glu)之殘基或群及以中性或帶負電荷胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外地，抗原-抗體複合物之晶體結構係鑑定抗體與抗原之間之接觸點。該等接觸殘基及鄰近殘基可經靶向或消除以作為用於取代之候選。可篩選變型以確定其是否包含所欲性質。
胺基酸序列***包括長度範圍自一個殘基至包含一百個或更多個殘基之多肽之胺基-及/或羧基-端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內部***。末端***之實例包括具有N-端甲硫胺醯殘基之抗體。抗體分子之其他***變型包括抗體之N-或C-端融合至酵素(例如，ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽。
2.糖基化變型
於某些實施例中，提供於本文中之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體係經改變以增加或減低抗體糖基化之程度。對抗體新增或刪除糖基化位點可方便地藉由改變胺基酸序列，以致建立或移除一或多個糖基化位點來達成。
在雙特異性抗體或與DR5結合之抗體包含Fc區之情況下，可改變與其結合之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含一般經N-鍵與Fc區之CH2域之Asn297結合的分支鏈、雙觸寡糖。參見：例如，Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖、及唾液酸、以及在雙觸寡糖結構之「莖」中與GlcNAc結合之岩藻糖。於一些實施例中，可在本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體中進行寡糖之修飾以建立具有特定經改良性質之抗體變型。
於一個實施例中，提供具有缺乏(直接或間接地)與Fc區結合之岩 藻糖之碳水化合物結構之雙特異性抗體變型或與DR5結合之抗體之變型。例如，該抗體中之岩藻糖含量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。藉由相對於如(例如)WO 2008/077546中所述藉由MALDI-TOF質譜法測得之與Asn 297結合之所有糖基結構(例如，複合、混合及高甘露糖結構)之總和計算Asn297處糖鏈中岩藻糖的平均含量，來確定該岩藻糖含量。Asn297係指位於Fc區中之位置297(Fc區殘基之Eu編號)附近之天冬醯胺酸殘基；然而，Asn297亦可位於位置297上游或下游之±3個胺基酸附近，亦即，位於位置294及300之間，此乃歸因於抗體中之微小序列差異。該等岩藻糖基化變型可具有經改良之ADCC功能。參見：例如，美國專利公開案號US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖-缺乏」抗體變型相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。可產生出去岩藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案號US 2003/0157108 A1，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其係在實例11)、及基因剔除細胞株(諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞)(參見：例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
雙特異性抗體變型或與DR5結合之抗體之變型進一步具有(例如)其中與雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之Fc區結合之雙觸寡糖經GlcNAc二分之二分寡糖。該等雙特異性抗體變型或與DR5結合之抗體之變型可具有經減低之岩藻糖基化及/或經改良之ADCC功能。該等抗體變型之實例述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利案第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在與Fc區結合之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變型。該等抗體變型可具有經改良之CDC功能。該等抗體變型述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
3.經半胱胺酸改造之抗體變型
於某些實施例中，可能期望建立經半胱胺酸改造之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體，例如，「硫基MAb」，其中雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之一或多個殘基係經半胱胺酸殘基取代。於特定實施例中，經取代之殘基係出現在雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之可及位點。藉由以半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基因而定位於抗體之可及位點及可用於將抗體與諸如藥物部分或連接子-藥物部分之其他部分結合，以建立免疫偶聯物。於某些實施例中，可以半胱胺酸取代任何一或多個以下殘基：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如(例如)美國專利案第7,521,541號中所述獲得經半胱胺酸改造之抗體。
H.重組方法及組合物
可例如藉由固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組生產獲得本發明之雙特異性抗體及與DR5結合之抗體。就重組生產而言，將一或多個例如如上所述編碼雙特異性抗體或與DR5結合之抗體(或片段)之多核苷酸單離及***至一或多個用於宿主細胞中之進一步選殖及/ 或表現之載體中。該多核苷酸可輕易地利用習知之程序單離並定序。於一個實施例中，提供包含一或多種本發明多核苷酸之載體，較佳係表現載體。可使用熟習此項技藝者熟知的方法來建構包含雙特異性抗體(片段)或與DR5結合之抗體(片段)連同適宜轉錄/轉譯控制信號之編碼序列之表現載體。該等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見：例如，述於Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，紐約(1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，紐約(1989)中之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括編碼雙特異性抗體(片段)或與DR5(即，編碼區)結合之抗體(片段)之多核苷酸與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制成員以可操作締合選殖進入其中之表現匣。如本文所用，「編碼區」為由轉譯形成胺基酸之密碼子組成之核酸之一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA、或TAA)不轉譯形成胺基酸，但其可被視為編碼區之一部分，若存在，然而，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止劑、內含子、5'及3'未轉譯區、及類似者之任何側翼序列不為編碼區之一部分。兩個或更多個編碼區可存於(例如)在單一載體上之單一多核苷酸建構中，或存於(例如)在個別(不同)載體上之個別多核苷酸建構中。另外，任何載體可包含單一編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一或多個經蛋白質分解裂解以轉譯後或共轉譯方式分離為最終蛋白質之多肽。此外，本發明之載體、多核苷酸、或核酸可編碼經融合或未融合至編碼本發明之雙特異性抗體(片段)或與DR5結合之抗體(片段)、或其變型或衍生物之多核苷酸之異種編碼區。異種編碼區不受限制地包括特化成員或基元，諸如分泌信號肽或異種功能域。可操作締合乃是針對基因產物 (例如多肽)之編碼區與一或多個調控序列以使得基因產物於影響或控制該等調控序列下表現之方式締合之情況。假若啟動子功能之誘導導致編碼所欲基因產物之mRNA之轉錄及假若兩個DNA片段之間的鍵之性質不會干擾表現調控序列引導基因產物之表現之能力或不會干擾待轉錄DNA模板之能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合之啟動子)係「可操作締合」。因此，假若啟動子可達成該核酸之轉錄，則啟動子區將可操作地與編碼多肽之核酸締合。啟動子可為僅在預定細胞中引導DNA之實質轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子外之其他轉錄控制成員，例如增強子、操作子、抑制子、及轉錄終止信號，可以操作方式與引導細胞特異性轉綠之多核苷酸締合。本文中揭示適宜之啟動子及其他轉錄控制區。熟習此項技藝者已知各種轉錄控制區。其等不受限制地包括在脊椎動物細胞中發揮作用之轉錄控制區，諸如(但不限於)來自巨細胞病毒之啟動子及增強子片段(例如，與內含子-A結合之即刻早期啟動子)、來自猿病毒40之啟動子及增強子片段(例如，早期啟動子)、及來自逆轉錄病毒(諸如(例如)勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))之啟動子及增強子片段。其他轉錄控制區包括衍生自脊椎動物基因之彼等(諸如肌動蛋白、熱衝擊蛋白質、牛生長激素及兔â-球蛋白)、以及其他可控制真核細胞中之基因表現之序列。其他適宜轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及可誘導啟動子(例如，啟動子可誘導四環素)。類似地，熟習此項技藝者已知各種轉譯控制成員。其等包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯抑制及終止密碼子、及衍生自病毒系統之成員(特別是內部核糖體進入位點、或IRES，亦稱為CITE序列)。表現匣亦可包括諸如源自複製之其他特徵、及/或諸如逆轉錄病毒長末端重複(LTR)、或腺相關病毒(AAV)末端反向重複(ITR)之染色體整合成員。
本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼引導由本發明之多核 苷酸所編碼之多肽之分泌之分泌或信號肽之其他編碼區締合。例如，若期望雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之分泌，則可將編碼信號序列之DNA置於編碼本發明之雙特異性抗體或本發明之與DR5結合之抗體或其片段之核酸之上游。根據信號假說，由哺乳動物細胞所分泌之蛋白質在已啟動跨過粗內質網輸出增長蛋白質鏈時立刻具有自成熟蛋白質裂解之信號肽或分泌前導序列。熟習此項技藝者明瞭由脊椎動物細胞分泌之多肽一般具有融合至多肽的N-端之信號肽，該信號肽係自轉譯多肽裂解以產生多肽之分泌或「成熟」形式。於某些實施例中，使用天然信號肽(例如，免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)、或該序列之保留引導與其可操作地締合之多肽之分泌之能力之功能性衍生物。或者，可使用異種哺乳動物信號肽、或其功能性衍生物。例如，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶之前導序列取代。
可用於促進稍後純化(例如組胺酸標籤)或幫助標記雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之編碼短蛋白質序列之DNA可包含於雙特異性抗體(片段)或與編碼多核苷酸之DR5結合之抗體(片段)中或包含在其末端。
於另一個實施例中，提供包含一或多種本發明多核苷酸之宿主細胞。於某些實施例中，提供包含一或多種本發明載體之宿主細胞。多核苷酸及載體可單獨或呈組合方式併有本文中分別關於多核苷酸及載體所述之任何特徵。於一該種實施例中，宿主細胞包含(例如，已經轉形或轉染有)包含編碼本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體(之一部分)之多核苷酸之載體。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經改造以產生出本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體或其片段之任何類型的細胞系統。相關技藝中熟知適用於複製及適用於支持雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之表現之宿主細胞。該等細胞可 適宜地利用特定的表現載體來轉染或轉導及可生長大量的包含載體之細胞以接種大規模發酵槽來獲得其量足夠用於臨床應用之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體。適宜之宿主細胞包括諸如大腸桿菌之原核微生物、或諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞、或類似者之各種真核細胞。例如，可尤其當在不需要糖基化時於細菌中產生出多肽。於表現之後，可從細菌細胞漿將多肽單離於可溶性部分中及可進一步純化。除了原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為用於多肽編碼載體之適宜選殖或表現宿主，包括其糖基化路徑經過「人類化」導致產生出具有部分或全人類糖基化模式之多肽之真菌及酵母菌株。參見Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414(2004)，及Li等人，Nat Biotech 24，210-215(2006)。用於(糖基化)多肽之表現之適宜宿主細胞亦衍生自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞結合使用，尤其係用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。亦可使用植物細胞培養作為宿主。參見(例如)美國專利案號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978、及6,417,429(描述用於在轉基因植物中產生出抗體之PLANTIBODIESTM技術)。亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，適於生長在懸浮液中之哺乳動物細胞株可係有用的。有用的哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉形之猴腎CV1細胞株；人胚腎細胞株(如(例如)Graham等人，J Gen Virol 36，59(1977)中所述之293或293T細胞)、乳倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(如(例如)述於Mather，Biol Reprod 23，243-251(1980)中之TM4細胞)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人子宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)、人肺細胞(W138)、人肝細胞(Hep G2)、小鼠***腫瘤細胞(MMT 060562)、TRI細胞(如(例 如)Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68(1982)中所述)、MRC 5細胞、及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質生成之某些哺乳動物宿主細胞株之回顧，請參見：例如，Yazaki與Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana出版社，Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。宿主細胞包括培養細胞，例如，哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉幾例)，然亦包括包含於轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織中之細胞。於一個實施例中，該宿主細胞為真核細胞，較佳係哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。
相關技藝中已知在該等系統中表現外源基因之標準技術。表現包含抗原結合域之重或輕鏈中任一者之多肽(諸如抗體)之細胞可經改造以便亦表現另一抗體鏈，以致經表現之產物為具有重及輕鏈二者之抗體。
於一個實施例中，提供一種產生出根據本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之方法，其中該方法包括在適用於表現雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之條件下培養包含編碼如本文所提供之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之多核苷酸之宿主細胞，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收雙特異性抗體或與DR5結合之抗體。
雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之組分係在基因上彼此融合。雙特異性抗體或與DR5結合之抗體可經設計成使其組分直接彼此融合或透過連接子序列間接地融合。連接子之組成及長度可依照相關技藝中熟知的方法確定及可針對效力進行測試。介於雙特異性抗體之不同 組分間之連接子序列之實例見於提供於本文中之序列中。若需要，亦可包含其他序列，例如，肽鏈內切酶識別序列，以併入裂解位點來分離融合之個別組分。
於某些實施例中，形成雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之一部分之Fab片段包含至少一個可與抗原決定子結合之抗體可變區。可變區可形成自然或非自然生成之抗體及其片段之一部分及自其衍生。相關技藝中熟知產生出多株抗體及單株抗體之方法(參見(例如)Harlow與Lane，"Antibodies,a laboratory manual"，冷泉港實驗室，1988)。非自然生成之抗體可使用固相肽合成來建構，可重組產生(例如，如美國專利案第4,186,567號中所述)或可例如藉由篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合庫來獲得(參見(例如)McCafferty之美國專利案第5,969,108號)。
可將任何動物物種之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區用於本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體中。適用於本發明之非限制性的抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可源自於鼠科、靈長類動物、或人類。若雙特異性抗體或與DR5結合之抗體欲用於人類用途，則可使用嵌合形式之抗體，其中抗體之恆定區係源自於人類。亦可依照相關技藝中熟知的方法製得人類化或完全人類形式之抗體(參見(例如)Winter之美國專利案第5,565,332號)。人類化可藉由多種方法達成，包括(但不限於)：(a)將非人類(例如，供者抗體)CDR接枝至留存或不留存關鍵架構殘基(例如，對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能而言極為重要之彼等)之人類(例如接受者抗體)架構及恆定域上，(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對抗體-抗原相互作用具關鍵性之殘基)接枝至人類架構及恆定區上，或(c)移植整體非人類可變域，但藉由置換表面殘基以似人類部分「掩蔽」其等。人類化抗體及製造其等之方法回顧於例如Almagro與Fransson，Front Biosci 13，1619-1633(2008)中，及進一步述於(例如)Riechmann等人，Nature 332，323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86，10029-10033(1989)；美國專利案號5,821,337、7,527,791、6,982,321、及7,087,409；Jones等人，Nature 321，522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81，6851-6855(1984)；Morrison與Oi，Adv Immunol 44，65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239，1534-1536(1988)；Padlan，Molec Immun 31(3)，169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36，25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan，Mol Immunol 28，489-498(1991)(描述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36，43-60(2005)(描述「FR改組(FR shuffling)」)；及Osbourn等人，Methods 36，61-68(2005)及Klimka等人，Br J Cancer 83，252-260(2000)(描述FR改組之「導向選擇」方法)中。可利用相關技藝中已知的各種技術來獲得人類抗體及人類可變區。人類抗體大致敘述於van Dijk與van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5，368-74(2001)及Lonberg，Curr Opin Immunol 20，450-459(2008)中。人類可變區可形成由融合瘤方法(參見(例如)Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.，紐約，1987))獲得之人類單株抗體之一部分及衍生自該等人類單株抗體。人類抗體及人類可變區亦可藉由投與抗體原至已經過改造以產生出完整人類抗體或具有回應於抗原施予之人類可變區之完整抗體之轉基因動物製得(參見(例如)Lonberg，Nat Biotech 23，1117-1125(2005))。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自人類衍生噬菌體展示庫之Fv純系可變區序列來產生(參見(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178，1-37(O’Brien等人編輯，Human出版社，Totowa，NJ，2001)；及McCafferty等人，Nature 348，552-554；Clackson等人，Nature 352， 624-628(1991))。噬菌體通常呈現呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。
於某些實施例中，適用於本發明之Fab片段係依照(例如)揭示於美國專利申請公開案第2004/0132066號中之方法改造成具有經增強之結合親和力，該案之全部內容係以引用的方式併入本文中。可藉由酶聯免疫吸收分析(ELISA)或熟習此項技藝者悉知的其他技術(例如表面電漿共振技術(於BIACORE T100系統上進行分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17，323-329(2000)))、及傳統結合分析(Heeley，Endocr Res 28，217-229(2002))，來測量本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體與特異性抗原決定子結合之能力。可使用競爭性分析來鑑定與參考抗體競爭結合至特定抗原之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變域。於某些實施例中，該種競爭抗體係與參考抗體所結合的相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)結合。圖譜分析與抗體結合的抗原決定基之詳細的例示性方法提供於Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biology第66卷(Humana出版社，Totowa，NJ)中。於一種例示性競爭分析中，將固定抗原於包含與抗原結合之第一經標記抗體及針對其與第一抗體競爭結合至抗原之能力進行測試之第二未經標記抗體之溶液中進行培養。第二抗體可存於融合瘤上清液中。作為對照，將固定抗原於包含第一經標記抗體然不含第二未標記抗體之溶液中進行培養。於在允許第一抗體與抗原結合之條件下培養之後，移除過量的未結合抗體，及測量與固定抗原締合之標記的量。若測試樣本中與固定抗原締合之標記的量相對於對照樣本實質上減小，則此指明第二抗體與第一抗體競爭結合至抗原。請參見Harlow與Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(冷泉港實驗室，紐約冷泉港)。
可藉由本技藝已知的技術，諸如高效液相層析、離子交換層 析、凝膠電泳、親和層析、尺寸篩除層析、及類似者，來純化如本文所述製得之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分取決於諸如淨電荷、疏水性、親水性等等之因素，及將為具有本技藝中之技術者所明瞭。就親和層析純化而言，可使用雙特異性抗體或與DR5結合之抗體所結合的抗體、配體、受體或抗原。例如，就本發明之雙特異性抗體之親和層析純化而言，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可使用連續蛋白質A或G親和層析及尺寸篩除層析來基本上如實例中所述地分離雙特異性抗體。雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之純度可藉由包括凝膠電泳、高壓液相層析、及類似者之任何多種熟知分析方法測定。
I.分析
提供於本文中之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體及與DR5結合之抗體可針對其物理/化學性質及/或生物活性藉由本技藝中已知的各種分析法來鑑定、篩選、或表徵。
1.親和力分析
可使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準測量儀器，依照述於實例中之方法藉由表面電漿共振(SPR)測定其中所提供雙特異性抗體及與DR5結合之抗體針對DR5及/或FAP之親和力，及可藉由重組表現獲得(諸如)受體或標靶蛋白質。或者，可使用表現特定受體或標靶抗原之細胞株，(例如)藉由流式細胞儀(FACS)來評估其中所提供雙特異性抗體及與DR5結合之抗體與DR5及/或FAP之結合。測定結合親和力之一個具體示例性及例示性實施例述於下文及以下實例中。
根據一個實施例，藉由表面電漿共振使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)於25℃下測量KD。
為分析Fc-部分與Fc受體間之相互作用，藉由固定於CM5晶片上之抗-Penta His抗體(Qiagen)捕獲His標籤重組Fc-受體及使用雙特異性 建構作為分析物。簡言之，利用N-乙基-N’-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)依照供應商的指示來活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5，GE Healthcare)。抗Penta-His抗體在以5μl/min流速注射之前藉由10mM乙酸鈉(pH 5.0)稀釋至40μg/ml，以獲致約6500個響應單位(RU)之偶聯蛋白質。於注射配體後，注射1M乙醇胺以將未反應之基團阻斷。隨後，於4或10nM下捕獲Fc-受體歷時60s。就動力學測量而言，於25℃下以30μl/min流速將雙特異性建構之四倍連續稀釋(範圍在500nM及4000nM之間)注射於HBS-EP(GE Healthcare，10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20，pH 7.4)中持續120s。
為測定對標靶抗原之親和力，藉由如針對抗Penta-His抗體所述之固定於活化CM5-感測器晶片表面上之抗人類Fab特異性抗體(GE Healthcare)捕獲雙特異性建構。偶聯蛋白質之最終量為約12000 RU。於300nM下捕獲該等雙特異性建構歷時90s。標靶抗原於自250至1000nM之濃度範圍下以30μl/min流速通過流動細胞歷時180s。監測解離持續180s。
藉由減去於參考流動細胞上獲得之響應來校正體積折射率差。使用穩態響應來藉由Langmuir結合等溫線之非線性曲線擬合導出解離常數KD。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE® T100評估軟體1.1.1版)藉由同時擬合締合及解離感應圖計算得締合速率(k締合)及解離速率(k解離)。平衡解離常數(KD)係經計算為比值k解離/k締合。請參見：例如，Chen等人，J Mol Biol 293，865-881(1999)。
2.結合分析及其他分析
於一個態樣中，本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體係(例如)藉由諸如ELISA、西方墨點(Western blot)等等已知方法測試其抗原結合活性。
於另一個態樣中，可使用競爭分析來鑑定與特異性抗-FAP抗體或特異性抗-DR5抗體競爭分別結合至FAP或DR5之抗體。於某些實施例中，該種競爭抗體與特異性抗-FAP抗體或特異性抗-DR5抗體所結合的相同抗原決定基(例如，線性或構形抗原決定基)結合。圖譜分析抗體所結合的抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biology第66卷(Humana出版社，Totowa，NJ)中。於實例部分中描述其他方法。
3.活性分析
於一個態樣中，提供用於鑑定與DR5及FAP結合之雙特異性抗體或與其具有生物活性之DR5結合之抗體之分析。生物活性可包括(例如)DNA斷裂、細胞凋亡之誘導及標靶細胞之裂解。亦提供具有該活體內及/或活體外生物活性之抗體。
於某些實施例中，本發明之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體係針對該生物活性進行測試。相關技藝中熟知用於偵測細胞裂解(例如，藉由測量LDH釋放)或細胞凋亡(例如，採用TUNEL分析)之分析。用於測量ADCC或CDC之分析亦述於WO 2004/065540中(參見其中之實例1)，該案之全部內容係以引用的方式併入本文中。
J.醫藥調配物
如本文所述之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體或與DR5結合之抗體之醫藥調配物係藉由使該具有所欲純度之雙特異性抗體或抗體與一或多種可選醫藥可接受載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980))呈凍乾調配物或水溶液形式混合而製得。醫藥可接受載劑於所採用的劑量及濃度下一般對接受者無毒，及其包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄銨；氯化六羥季銨；氯化苄二甲烴銨；氯化苄乙氧銨 (benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、二醣、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥可接受載劑進一步包括填隙藥物分散劑，諸如可溶性中性-活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)述於美國專利公開案號2005/0260186及2006/0104968中。於一個態樣中，將sHASEGP與一或多種其他葡糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物述於美國專利案第6,267,958號中。水性抗體調配物包括述於美國專利案號6,171,586及WO2006/044908中之彼等，述於WO2006/044908中之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文中之調配物亦可包含多於一種所治療之特定適應症所需之活性成分，較佳係具有不會不利地相互影響之互補活性之彼等活性成分。該等活性成分係適宜地呈組合形式以可有效用於所欲目的的量存在。
活性成分可陷留在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製得之微膠囊(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、陷留在膠態藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或陷留在粗乳液中。該等技術 揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適宜實例包括包含抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質係呈例如膜、或微膠囊之成形物件之形式。
欲用於活體內投與之調配物一般係無菌。無菌性可例如藉由通過無菌過濾膜之過濾輕易地達成。
K.治療方法及組合物
提供於本文中之任何與DR5及FAP結合之雙特異性抗體及新穎的與DR5結合之抗體可用於治療方法中。
於一個態樣中，提供一種作為藥物使用之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體。於其他態樣中，提供一種用於治療癌症之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體。於某些實施例中，提供一種用於治療方法中之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體。於某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法中之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體，該方法包括向該個體投與有效量之該與DR5及FAP結合之雙特異性抗體。於一該種實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種例如如下所述之其他治療劑。根據任何上述實施例之「個體」較佳係人類。於一個較佳實施例中，該癌症為胰癌或結腸直腸癌。
於一個態樣中，提供一種作為藥物使用之與DR5結合之抗體。於其他態樣中，提供一種用於治療癌症之與DR5結合之抗體。於某些實施例中，提供一種用於治療方法中之與DR5結合之抗體。於某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法中之與DR5結合之抗體，該方法包括向該個體投與有效量之該與DR5結合之抗體。於一該種實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種 例如如下所述之其他治療劑。根據任何上述實施例之「個體」較佳係人類。於一個較佳實施例中，該癌症為胰癌或結腸直腸癌。
於另一個態樣中，本發明提供一種以與DR5及FAP結合之雙特異性抗體於製造或製備藥物之用途。於另一個態樣中，本發明提供一種以與DR5結合之抗體於製造或製備藥物之用途。於一個實施例中，該藥物係用於治療癌症。於另一個實施例中，該藥物係用於治療癌症之方法中，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之該藥物。於一該種實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種例如如下所述之其他治療劑。根據任何上述實施例之「個體」可係人類。
於另一個態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法。於一個實施例中，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體。於一該種實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種如下所述之其他治療劑。根據任何上述實施例之「個體」可係人類。於一個較佳實施例中，該癌症為胰癌或結腸直腸癌。
於另一個態樣中，本發明提供(例如)用於任何上述治療方法中之包含提供於本文中之任何與DR5及FAP結合之雙特異性抗體之醫藥調配物。於一個實施例中，醫藥調配物包含提供於本文中之任何與DR5及FAP結合之雙特異性抗體及醫藥可接受載劑。於另一個實施例中，醫藥調配物包含提供於本文中之任何與DR5及FAP結合之雙特異性抗體及至少一種例如如下所述之其他治療劑。
於另一個態樣中，本發明提供(例如)用於任何上述治療方法中之包含提供於本文中之任何與DR5結合之抗體之醫藥調配物。於一個實施例中，醫藥調配物包含提供於本文中之任何與DR5結合之抗體及醫藥可接受載劑。於另一個實施例中，醫藥調配物包含提供於本文中之任何與DR5結合之抗體及至少一種例如如下所述之其他治療劑。
本發明之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體可藉由包括非經腸、肺內、及鼻內之任何適宜方式投與，及若需要，用於局部治療、病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下投與。給藥可藉由任何適宜途徑，例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分地取決於投藥是短期還是長期。本文中包含包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點之多次投藥、快速注射(bolus)投與、及脈衝輸注之各種給藥時程。
本發明之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體將經調配、計量加入、及以與優良醫藥實務一致之方式投與。本發明上下文中之考量因素包括所治療的特定疾病、所治療的特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、疾病之病因、傳遞藥物之部位、投藥方法、投藥時程表、及其他為醫療專業者已知的因素。雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體不需要，然可視需要經一或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑調配。該等其他藥劑之有效量係取決於存於調配物中之抗體的量、疾病或治療之類型、及述於上文之其他因素。其等一般係以與本文所述者相同的劑量及投藥途徑、或本文所述劑量之約1至99%、或以經驗上/臨床上確定為適宜之任何劑量及藉由任何途徑使用。
就預防或治療疾病而言，本發明之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體之適宜劑量將取決於意欲治療之疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重度及過程、是否投與雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體來達成預防或治療目的、先前的治療、患者的臨床病史及對雙特異性抗體或對新穎的與DR5結合之抗體之反應、及主治醫師的判斷。雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體適宜地以一次性或在一連串治療期間投與患者。取決於疾病之類型及嚴重度，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體可係無論(例如)藉由一或多次個別投與、或藉由連續輸注 之候選用於投與患者之初始劑量。一種典型的日劑量範圍可為約1μg/kg至100mg/kg或更大，取決於上述因素而定。就數天或更長時間內之重複投藥而言，取決於病況，一般將持續治療直到發生疾病症狀之期望抑制。雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體之一種例示性劑量將係在自約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可投與患者約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg之一或多個劑量。該等劑量可斷續性地(例如，每週或每三週)投與(例如，以致患者接受約二至約二十，或例如約六個劑量的雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體)。可投與初始較高負載劑量，接著再投與一或多個較低劑量。然而，其他劑量療法可係有用的。可輕易地藉由習知技術及分析監測該療法之進展。
應明瞭任何上述調配物或治療方法可使用本發明之免疫偶聯物替代本發明之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體或在本發明之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體之外再使用本發明之免疫偶聯物來進行。
L.製品
於本發明之另一個態樣中，提供一種包含適用於治療、預防及/或診斷上述疾病之物質的製品。該製品包括容器及於該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。適宜之容器包括(例如)瓶、小瓶、針筒、IV溶液袋等等。容器可由諸如玻璃或塑料之多種材料形成。容器盛裝組合物本身或與可有效用於治療、預防及/或診斷病況之另一種組合物組合及可具有無菌接入端口(例如，容器可為具有皮下注射針可刺穿之塞之靜脈內注射溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體。標籤或包裝插頁指示組合物係用於治療所選擇的病況。此外，製品可包括(a)其中裝納組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之雙特異性抗體 或新穎的與DR5結合之抗體；及(b)其中裝納組合物之第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步包括指明組合物可用於治療特定病況之包裝插頁。或者或另外地，製品可進一步包括含有諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液之醫藥可接受緩衝液的第二(或第三)容器。其可進一步包括從商業及使用者觀點上期望之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、及針筒。
應明瞭任何上述製品可包含本發明之免疫偶聯物來替代本發明之與DR5及FAP結合之雙特異性抗體或新穎的與DR5結合之抗體或在其之外再使用。
III.實例
隨後為本發明之方法及組合物之實例。應明瞭考慮到提供於上文之一般描述，可實施各種其他實施例。
雖然已基於清楚理解之目的藉由示例及實例相當詳細地論述前述發明內容，但該等說明及實例不應被理解為限制本發明之範疇。本文引述之所有專利案及科學文獻之揭示內容係以其全文引用的方式明確地併入。
實例1：DR5-FAP死亡受體激動雙特異性抗體可經由第二細胞株之交聯介導一種細胞株之細胞凋亡。
一種藉由使如DR5之死亡受體交聯(除了藉由由腫瘤細胞表現之抗原交聯之外)來誘導細胞凋亡之方法係靶向腫瘤周圍之基質。於該情況中，標靶抗原並非直接藉由腫瘤細胞，而是藉由第二種不同細胞類型呈現。此類型抗原之一個實例將為FAP(纖維母細胞活化蛋白)。此蛋白表現於活化纖維母細胞上，此乃因其係存於腫瘤基質中。
為了研究使用靶向人類DR5及源自腫瘤基質之抗原之雙特異性死 亡受體激動抗體以腫瘤標靶誘導細胞凋亡之可能性，產生由識別DR5之IgG1部分及融合至抗體之重鏈的C-端之FAP結合scFv組成之雙特異性分子。DR5靶向IgG之序列係取自如US2007/0031414 A1中所述之卓西單抗序列。FAP結合scFv部分之可變重及輕鏈之序列係取自如WO2012/020006A1中所述藉由噬菌體展示單離的Fab抗FAP分子(3F2或4G8)。FAP scFv係經(G4S)2連接物融合至抗DR5 IgG重鏈或輕鏈的C-端。兩種抗FAP抗體與纖維母細胞活化蛋白(FAP)上之不同抗原決定基結合及與人類、鼠科及馬來猴抗原交叉反應。
於此類型設置中，必須使用兩種不同細胞株來進行活體外活性檢測：一種細胞株(標靶細胞株)應表現人類DR5，須要勝任細胞凋亡但不需表現FAP。第二細胞株(效應細胞株)須為細胞凋亡負性(藉由細胞凋亡抗性或藉由不表現DR5)但需要在表面上表現FAP。
一種達成期望標準之可能的效應細胞株為人類纖維母細胞細胞株GM05389。如圖1a中所顯示，此細胞株相較於僅顯示FAP表現之細胞株SW872以最高測試抗體濃度(10μg/ml)表現顯著FAP含量，但從圖1b中可觀察到不經歷藉由非交聯卓西單抗之細胞凋亡。因此，此細胞株似乎是標靶細胞株之DNA斷裂係經由表現於第二細胞株上之抗原交聯誘導之細胞凋亡檢測中之可能的效應細胞株。
使用人腎腺癌細胞株ACHN或人乳癌細胞株MDA-MB-231作為標靶細胞株。其表現相當的低DR5含量(圖2)及對DR5介導之細胞凋亡誘導敏感。於圖3中，概述與ACHN及GM05389細胞株之組合相比，藉由FAP腫瘤標靶交聯DR5誘導ACHN細胞之DNA斷裂之結果。於兩種細胞株中，對照組抗體(卓西單抗)於藉由靶向Fc部分之第二抗體交聯後立刻誘導細胞凋亡(白色柱)，但在無交聯下亦顯示部分活性。雙特異性DR5-FAP分子於標靶及效應細胞株二者的存在下顯示細胞凋亡之顯著誘導(黑色柱)。於不存在表現纖維母細胞(GM05389)之FAP下，相較於非交聯卓西單抗，細胞凋亡略有增加(灰色柱)。吾人以ACHN細胞上之DR5受體在與由纖維母細胞細胞株GM05389表現之FAP抗原結合後立刻交聯之方式解釋此結果。所有分子顯示相當的最大細胞凋亡活性。
實例2：具有與卓西單抗融合之呈scFab形式之交叉反應性FAP結合物之DR5雙特異性激動抗體在共培養檢定法中展現細胞凋亡活性
如在實例1中證實，其中呈scFv形式之FAP靶向部分與卓西單抗重或輕鏈的C-端融合(2×2形式)之DR5-FAP雙特異性激動抗體可誘導其中一種細胞株表現FAP(效應細胞)而第二細胞株充作DR5受體標靶之兩細胞株共培養設置中之細胞凋亡。
由於包含scFv融合之該等分子顯示一些不利的性質(低產出率及形成聚集物之傾向)，故產生出其中FAP結合單元經單鏈Fab實體 (scFab)置換，融合至卓西單抗之重或輕鏈的C-端而產生出如表2中所述之四種不同分子之建構。scFab單元與雙特異性分子之IgG部分之連接係藉由(G4S)4序列發生，而scFab內部連接子係由32個胺基酸組成。
藉由標準重組技術短暫地產生出該等分子及以足夠量及良好品質純化來進行FAP與DR5結合之詳細測試(FACS；Biacore，未顯示)。
DR5表現標靶細胞株(例如腎癌細胞株ACHN)於存在及不存在第二FAP表現「效應」細胞株(例如纖維母細胞株GM05389)下之細胞凋亡誘導之分析顯示於圖4a及4b中。藉由DNA斷裂檢測來分析細胞凋亡誘導。於該等檢測中，使用1：1之標靶細胞對效應細胞比及在卓西單抗、超高交聯卓西單抗或雙特異性建構(均以1μg/ml及0.1μg/ml之濃度使用)的存在下共培養24h後，分析DNA斷裂。
針對所有測試建構，可證實雙特異性分子與所使用的呈融合至卓西單抗之scFab形式之FAP結合物(3F2或4G8)無關地顯示於ACHN標 靶細胞中僅在纖維母細胞效應細胞株的存在下增強之細胞凋亡誘導。然而，在高雙特異性分子濃度下，可於不存在表現纖維母細胞之FAP下觀察到低度細胞凋亡活性。一般而言且與所使用的FAP結合物無關地，具有融合至重鏈的C-端之scFab之分子比scFab係融合至輕鏈的C-端之分子更具活性。此外，含4G8建構似乎比含3F2分子更具效力。然而，scFab基形式之活性較類似的scFv基建構低。
不存在藉由抗Fc抗體之其他交聯的卓西單抗顯示低細胞凋亡誘導。然而，僅藉由二級抗Fc抗體超高交聯化(為高度人工情況)之卓西單抗顯示無法藉由任何測試分子達成之最高細胞凋亡活性。
實例3：呈CrossFab形式之DR5-FAP雙特異性激動抗體展現優於含scFab分子之特徵
由於所評估的含scFab雙特異性分子仍舊顯示部分不利特徵(例如，低表現產率、可最佳化的細胞凋亡活性)，故分析應可克服該等缺陷之新穎形式：呈CrossFab形式之FAP結合物(4G8)與卓西單抗重鏈的C-端融合。於此形式中，如表3中所描述及如圖5中所顯示，將FAP結合部分用於Fab片段中可變區之「交越」交換。CrossFab分子係經20聚物連接物((G4S)4)鍵聯至卓西單抗重鏈。
於HEK293 EBNA細胞中(於附著或懸浮細胞中)瞬時產生兩種CrossFab分子(關於建構之組成，亦參見圖5)及利用標準方法進行純化。相較於包含scFab及scFv之雙特異性建構，該等CrossFab分子展現明顯增加的表現程度，從而導致如表4中所顯示之高出約10倍的產物產率及可接受的低聚集物含量。
圖6顯示於產生不同雙特異性DR5-FAP分子期間之聚集物含量。針對融合至卓西單抗重鏈的C-端之scFv(A)、scFab(B)及CrossFab(C)展示純化期間之製備型尺寸篩除層析法之層析圖。scFv及scFab融合建構展現明顯高於含CrossFab分子之聚集物含量。在純化期間移除該等聚集物導致材料之高度損失，此點可輕易地從純化後獲得的產率看出。
藉由FACS分析偵測分子與表現於重組HEK293細胞上之人類FAP之結合。圖7顯示兩種卓西單抗-CrossFab分子(卓西單抗-X-FAP_A，帶點柱；及卓西單抗-X-FAP_B，白色柱)與類似的scFab建構(斜線柱)或對應FAP(4G8)IgG分子(黑色柱)比較的FACS結合結果。所有三種其中4G8 FAP結合部分係與卓西單抗重鏈的C-端融合之雙特異性分子係類似或以類似範圍地與表現於作為IgG建構之重組HEK細胞之膜上之人類FAP結合，指示此融合位置對受測試FAP結合物不具有N-端阻斷效應。此檢測中所使用的陰性對照組分子(二級偵測抗體與卓西單抗)並未以可偵測方式與表現HEK細胞的FAP結合。
於圖8中，顯示表面電漿共振分析(SPR，Biacore)之結果，其中評估雙特異性CrossFab分子同時與DR5及FAP之結合。對於此檢測， 將抗原(呈Fc融合之人類DR5，SEQ ID NO.：316)偶聯至Biacore晶片，接著注射CrossFab分子作為第一分析物。於scFab分子與DR5結合之後，使用重組可溶性人類或鼠科FAP(SEQ ID NO.：156及157)作為第二分析物。所有測試雙特異性分子均展現濃度相依的同時與DR5及人類及鼠科FAP之結合，此點如由於注射第二分析物後所獲得之在注射第一分析物後總體響應率之增加所指示。兩種四價雙特異性CrossFab分子(2×2；卓西單抗-X-FAP_A及卓西單抗-X-FAP_B)顯示類似的與DR5及人類及鼠科FAP之結合(圖8；A至D)。
圖9顯示藉由DNA斷裂檢測於24h後測得之卓西單抗相對兩種不同雙特異性卓西單抗-X-FAP分子及一種卓西單抗_4G8_scFab建構在乳癌細胞株MDA-MB-231上於不存在或存在表現纖維母細胞GM05389之FAP下之細胞凋亡之誘導。於所施用的條件下，超高交聯卓西單抗及雙特異性DR5-FAP分子展現濃度相依性的細胞凋亡誘導。儘管於低濃度下之雙特異性建構似乎係依賴於所謂的旁觀者細胞凋亡(僅存在與DR5及FAP表現細胞株之細胞凋亡活性)，然其亦於高濃度下單獨誘導MDA-MB-231細胞之細胞凋亡。當僅存在MDA-MB-231細胞時，超高交聯卓西單抗亦於低濃度下誘導高水平之細胞凋亡。兩種雙特異性分子已於0.7nM濃度下展現最大細胞凋亡誘導。
為了測試雙特異性建構關於其細胞凋亡誘導活性係依賴於藉由FAP之交聯之特異性，選擇一種不同的分析設置(圖10)。於此設置中，將重組人類FAP或非相關對照組蛋白質(白色柱)塗覆至ELISA板上。在添加標靶細胞(MDA-MB-231)及培養24h之前，由利用雙特異性分子或相關對照組培養該等蛋白質。如圖10所示，可針對超高交聯卓西單抗(灰色柱)、雙特異性scFab分子(斜線柱)及雙特異性CrossFab分子(黑色柱)展示指示細胞凋亡誘導之濃度相依性DNA斷裂。雖然利用交聯卓西單抗之細胞凋亡誘導始終是在與FAP或經塗覆之對照組蛋 白質(在整個測試濃度範圍)相同的範圍內，但CrossFab分子之細胞凋亡活性在將FAP塗覆至板上時較對照組蛋白質高。於0.7nM及更低之濃度下，僅可在經塗覆FAP的存在下偵測到顯著的細胞凋亡，指示DR5在標靶MDA-MB-231細胞上之特異***聯。如圖11所示，針對在共培養細胞凋亡檢測(DNA斷裂檢測)中於24h期間分析之不同腫瘤細胞株，包含作為CrossFab融合至卓西單抗重鏈的C-端之FAP部分之雙特異性卓西單抗-FAP建構於測試濃度下展現優於單獨卓西單抗之細胞凋亡誘導。於此檢測中，將表現纖維母細胞(GM05389)之FAP與一系列不同腫瘤細胞株(MDA-MB-231，乳癌，黑色柱；U-87MG、神經膠質母細胞瘤，灰色柱；FaDu，頭部及頸部癌，白色柱；及A549，肺癌，斜線柱)在卓西單抗、經抗-Fc抗體交聯之卓西單抗、或卓西單抗-X-FAP建構中任一者(均於7nM及0.7nM之濃度下)的存在下共培養。將7nM濃度下之交聯卓西單抗之細胞凋亡誘導設為100%及據此計算得其他測試分子之活性。對於所有測試細胞株，雖然7nM濃度下之單獨卓西單抗顯示至高50%活性(取決於所測試的腫瘤細胞株)，但CrossFab分子展現在超高交聯卓西單抗之75至90%範圍內的細胞凋亡誘導。0.7nM下之單獨卓西單抗展現低活性，而雙特異性分子呈現顯著的細胞凋亡誘導活性(對於FaDu細胞高達100%，對於其他測試細胞株介於60及90%之間)。
實例4：用於產生新穎DR5結合物之抗原及篩選工具的製備
歸因於呈雙特異性形式之卓西單抗之一些次優性質(低生產率、無交聯下具活性、N-端融合使抗體失活)，單離出克服該等缺陷之新穎DR5抗體。為產生欲用於單離新穎DR5結合物之適宜抗原及篩選及選擇彼等，建構一系列融合蛋白質。由各受體基因，藉由PCR擴增胞外域(ECD)編碼區並將其融合至一般蛋白質搭配物以產生以下形式(如圖12所描繪)：
1.在框架中與Avi-標籤及Hexahis-標籤融合之胞外域(ECD)
2.由絞鍵區及CH2及CH3域接著Avi標籤組成之融合至人類IgG1之Fc之ECD。在ECD與Fc之間***AcTev蛋白酶裂解位點(--(獲得二聚抗原)
3.如同2但ECD係融合至具有結進孔突變之Fc。抗原-Fc融合與Fc-孔對應物共表現以獲得單體抗原。
雖然人類DR5及鼠科DR5之序列為已知並註釋於SwissProt資料庫中，但其中尚未記述馬來猴同源物之序列。基於人類及恒河猴DR5基因序列間之同源性，引子已經過設計成適用於自由馬來猴PBMC製得之RNA單離馬來猴抗原。簡言之，使用來自Qiagen之RNeasy套組自新單離的馬來猴血液單離RNA。於RNA之DNAseI消解及洗脫之後，使用來自Qiagen之OneStep RT-PCR套組(cDNA合成及擴增)(目錄號210212)以作為引子之GAB-4039(GCTGGCTCCTGGACTTCCATTTCC；SEQ ID NO 163)及GAB4040(GACCCAGGGAGGCGCGGGGAG；SEQ ID NO 164)擴增馬來猴DR5基因，根據已知的恒河猴DR5序列進行設計。將PCR產物選殖至用於定序之pCR2.1 Topo(Invitrogen)中。序列之分析顯示相對人類DR5胞外域89%之同源性。使用引子GAB-4145(GTGCATTCCATCACCCGACAATCCCTAGATCCCCAGCG；SEQ ID NO 165)及GAB-4146(GCGTCGACTGATTCTTTGTGGACACACTCAATGTCAC；SEQ ID NO 166)，將馬來猴DR5基因之胞外域選殖至與人類Fc融合之一般表現載體中。
於MPSV啟動子之控制下發生期望基因之表現。另外，包含3’聚腺苷酸化位點及用於穩定維持質體於表現HEK293細胞之EBV核抗原(EBNA)中之oriP序列。
為產生抗原，將相關表現載體轉染至HEK293 EBNA細胞中(Ca2PO4介導型或PEI相依型轉染)。於5至7天的培養後，收集上清液 及透過蛋白質A結合(含Fc抗原)或藉由NI2+親和層析(含His標籤分子)及接續之尺寸篩除層析(SEC)純化。若需要，則藉由C-端Avi標籤對蛋白質進行生物素標記。此可在活體內藉由共轉染/共表現編碼質體之birA或於純化抗原之後在活體外使用來自Avidity目錄號BIRA之生物素化套組進行。藉由於HEK293 EBNA中之瞬時基因表現產生出以下抗原：
n.a.：不適用
重組人類DR4-Fc(目錄號347-DR/CF)、DcR1-Fc(目錄號630-TR/CF)、DcR2-Fc/目錄號633-TR/CF)及OPG-Fc(目錄號805-=S/CF)係購自R&D Biosystems。
實例5：從一般Fab庫單離新穎抗DR5結合物
具有針對人類DR5之特異性之抗體係選自呈Fab形式(DP47-3)之一般噬菌體展示抗體庫。基於人類生殖系基因使用在輕鏈(L3)之CDR3及重鏈(H3)之CDR3中包含隨機化序列空間之配對Vk3_20(卡帕型輕鏈)及VH3_23(重鏈)之V-域來建構該庫。藉由以重疊延伸 (SOE)PCR接合進行3個PCR-擴增片段之組合來進行庫之建立。片段1包含抗體基因的5’端，其包含隨機化L3，片段2為跨越L3至H3之中心恆定片段，而片段3包含隨機化H3及抗體基因的3’部分。分別使用以下引子組合來產生用於DP47-3庫之該等庫片段：片段1(LMB3-LibL1b_新)、片段2(MS63-MS64)及片段3(Lib2H-fdseqlong)。產生庫片段之PCR參數為94℃下5min的初始變性，25個1min 94℃、1min 58℃、1min 72℃的循環及72℃下10min的終點延長。對於組合PCR，使用等莫耳比的這3個片段作為模板，參數為94℃下3min的初始變性及5個30s 94℃、1min 58℃、及2min 72℃的循環。於此階段，添加外部引子及於72℃下10min的終點延長之前再進行20個循環。於足量的全長隨機化Fab建構之組合後，其為與經類似方式處理之受體噬菌粒(phagemid)載體並存的經消解之NcoI/NotI。將22.8μg Fab庫與16.2μg噬菌粒載體接合。使用經純化接合物達成68次轉化以獲得4.2×1010之最終庫大小。呈現Fab庫之噬菌粒顆粒經救援及藉由PEG/NaCl純化法純化以用於選擇。
針對與人類IgG1抗體之Fc-部分融合之HEK293表現單體或二聚人類DR5進行選擇。關於單體抗原之產生，將Fc結進孔形式應用於兩條不同CH2-CH3鏈之異二聚合(其中僅一者帶有人類DR5胞外域作為N-端融合)。該等抗原係藉由avi-標籤進行酵素活性生物素標記。在溶液中依照以下方式進行淘選週期(panning rounds)：1.使用經以10μg/ml塗覆至NUNC maxisorp板上之人類IgG1來預清除~1012個噬菌粒顆粒以避免Fc-結合物，2.使來自預清除反應之上清液之非Fc結合噬菌粒顆粒與100nM生物素標記人類DR5以1ml之總體積結合0.5h，3.捕獲生物素標記人類DR5及藉由培養將特異性結合噬菌體附著於經中性鏈親和素(neutravidin)塗覆之微量滴定板上10min，4.使用5×1ml PBS/吐溫(Tween)20及5×1ml PBS洗滌珠粒，5.藉由添加1ml 100mM TEA(三乙胺)洗脫噬菌體顆粒10min及藉由添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4來中和，6.進行於人類DcR2上之經洗脫噬菌體顆粒之後清除步驟以避免交叉反應性結合物，及7.使對數期大腸桿菌TG1細胞再感染上清液中之噬菌體顆粒，感染輔助噬菌體VCSM13及隨後進行欲用於接續選擇週期中之噬菌粒顆粒之PEG/NaCl沉澱。在3個週期內利用100nM之恆定抗原濃度進行選擇。於週期2中，抗原：噬菌體複合物之捕獲係藉由添加5.4×107個經鏈黴親和素塗覆之磁珠進行10min，來替代於經中性鏈親和素塗覆之微量滴定板上捕獲。如下藉由ELISA來鑑別特異性結合物：每孔將100μl之50nM生物素標記人類DR5或DcR2塗覆於中性鏈親和素板上。此外，將10μg/ml人類IgG1塗覆於NUNC maxisorp板上。添加含Fab細菌上清液及透過其旗標藉由使用抗-旗標/HRP二級抗體來偵測結合Fab。於人類DR5上展現信號但於人類DcR2及人類IgG1上未展現信號之純系經初選用於進一步分析。
於25℃下，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，利用藉由中性鏈親和素捕獲固定於NLC晶片上之生物素標記單價或二價DR5抗原，藉由表面電漿共振來測定所選Fab純系之親和力(KD)。抗原(配體)之固定：以PBST(10mM磷酸鹽、150mM氯化鈉pH 7.4、0.005%吐溫20)將重組抗原稀釋至10μg/ml，接著以30μl/分鐘在不同接觸時間點注射，以在垂直方向上達成200、400或800個響應單位(RU)之固定水平。分析物之注射：關於一次性動力學(one-shot kinetics)測量，將注射方向改為水平方向，同時地以50、60或100μl/min順著個別通道1至5注射經純化Fab(介於100及3.125nM之間之不同濃度範圍)之兩倍稀釋系列，締合時間為120、180或200s，及解離時間為200或240s。順著第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「線上」空白供參考用。利用簡單的一對一Langmuir結合模型在ProteOn Manager v3.1軟體中藉由同時擬合締合及解離感應圖，來計算得締合速率常數(k締合)及解離速率常數(k解離)。 平衡解離常數(KD)係經計算為比值k解離/k締合。使用50mM NaOH於100μl/min流速下持續18s的接觸時間在水平方向上進行再生。
實例6：所選DR5結合物於交聯後即可誘導細胞凋亡
為了鑑別出僅可在交聯後誘導所選標靶細胞之細胞凋亡之DR5結合物，將從Fab庫單離的抗體轉化為對應人類IgG1形式。簡言之，將選自噬菌體展示之46個獨特DR5結合物之可變重鏈及可變輕鏈使用Fab純系作為模板藉由標準PCR反應來擴增。將PCR產物純化及***(藉由限制性核酸內切酶及連接酶基選殖，或藉由使用來自Invitrogen之InFusion套組之「重組工程(recombineering)」)至其與適宜之人類恆定重鏈或人類恆定輕鏈融合之適宜表現載體中。該等載體中之表現匣係由嵌合MPSV啟動子及合成聚腺苷酸化位點組成。此外，質體包含源自於Epstein Barr病毒之oriP區以穩定維持質體於帶有EBV核抗原(EBNA)之HEK293細胞中。抗體瞬時地以50ml規模產生於所述HEK293 EBNA細胞中。針對快速且高通量的純化，將上清液中和及與蛋白質A瓊脂糖凝膠快速流動珠粒(GE Healthcare目錄號17-5138-01)培養16h。上清液/珠粒混合物接著藉由重力流動通過空的平衡PD-10管柱(GE Healthcare目錄號17-0435-01)上。將該等滯留珠粒洗滌兩次及利用低pH步驟洗脫抗體。最後，中和經洗脫之蛋白質及使用280nm處之吸光度及莫耳吸光係數計算其濃度。藉由使用Zorbax GF-250管柱(Agilent目錄號PSMO 845006)之分析型尺寸篩除層析分析抗體樣本之聚集物含量。
該純化程序之結果概述於表6中。
這種小規模轉染及生成接著透過蛋白質A珠粒純化，獲得合理量的具有極低聚集物含量之純抗體。於圖13(a-e)中，概述用於偵測細胞凋亡之標準DNA斷裂ELISA檢測之結果。各種抗體係以兩種不同濃度進行測試(1.0μg/ml：黑色柱及0.1μg/ml：斜線柱，針對交聯，分別為1.0及0.1μg/ml抗-Fc抗體)。將所獲得的數據針對設定為100%之交聯卓西單抗(於1.0μg/ml下)之最大活性標準化。大多數經分析之抗體可在交聯之後於MDA-MB-231細胞中誘導細胞凋亡之濃度相依誘導。46種結合物中的七種(15.2%)於兩種濃度下清楚顯示如卓西單抗的較高活性。十五種抗體(32.6%)係在與卓西單抗相同的活性範圍內及測試分子中的二十種(43.5%)於交聯後確實誘導細胞凋亡，然達成的交聯程度遠比卓西單抗低。其餘四種結合物(「20E3」、「19E6」、「1B12」及「19C12」，8.7%)無活性，及即使在藉由二級抗Fc抗體交聯之後亦不會誘導細胞凋亡。
實例7：新穎DR5結合物之特徵分析
基於細胞凋亡活性篩選之結果，選出46種經評估DR5抗體中的十二種來進行其他更詳細的分析及特徵分析。於瞬時轉染之HEK293 EBNA細胞中複製該等抗體及使用標準蛋白質A親和管柱接著進行所述尺寸篩除層析來純化。測定產率及單體/聚集物含量(表7)。針對標 靶特異性、物種交叉反應性及親和力對經純化抗體進行特徵分析(表8)。此外，藉由DLS分析熱穩定性及於存在或不存在二級交聯抗人類Fc抗體下比較細胞凋亡誘導活性。
所有經分析抗體特異性地識別人類DR5及不與來自TNFR超家族之最接近人類的同源物諸如DR4、誘餌受體(DcR1及DcR2)及骨保護素(OPG)結合。所有DR5抗體對人類及馬來猴DR5具交叉反應性但不識別鼠科對應物(此並不令人意外，歸因於僅約30%之序列同源性之故)。雖然對人類DR5之親和力係在相當寬廣範圍(自162至773nM)內，然所有結合性測定值係在低(一位數)奈莫耳範圍內。如由動態光散射(DLS)實驗測得，所有經測試DR5結合物顯示高熱穩定性，聚集溫度甚高於60℃。
為測定一系列所選DR5結合物之功能活性，利用特異性地偵測DNA斷裂之細胞死亡偵測ELISA檢測(Roche；#11 774 425 001)來分析細胞凋亡誘導。關於交聯，於相同濃度之二級抗人類Fc抗體的存在下以1.0及0.1μg/ml之濃度使用抗體。為作比較，於不存在二級抗體下以1.0μg/ml使用抗體，以評估所選DR5結合物之活性是否取決於交聯或其是否本身已具有活性。使用人乳癌細胞株MDA-MB-231作為標靶細胞株。於圖14中，概述不同DR5結合物之細胞凋亡誘導之結果。於交聯之後，所有新單離的DR5抗體在與對照組抗體卓西單抗相同的範圍誘導細胞凋亡。然而，與在無交聯下已展現顯著細胞凋亡誘導活性之卓西單抗不同，新穎DR5結合物之活性嚴格地取決於藉由二級抗體之交聯。細胞凋亡活性似乎與DR5結合物對其標靶之親和力無關，因為對人類DR5具有最高及最低親和力兩者之抗體的此活性類似。
利用兩種其他檢測來評估所選DR5結合物之活性：利用CellTiter- Glo檢驗(Promega #TB288)測定經交聯抗體處理後之增生抑制。此外，藉由卡斯蛋白酶8-Glo檢驗(Promega #G8202)測定卡斯蛋白酶8之誘導。圖15顯示三種不同腫瘤細胞株之藉由二級抗Fc抗體交聯之DR5結合物於7nM濃度下之最大增生抑制。將對人類結腸直腸腺癌細胞株DLD-1(黑色柱)之效應與大細胞肺癌細胞株HCI-H460(斜線柱)及人乳癌細胞株MDA-MB-231(白色柱)進行比較。對於所有三種細胞株，可偵測到顯著的增生抑制。雖然於7nM下之DLD-1之增生抑制似乎與DR5抗體之親和力相關，但NCI-H460之情況並非如此，且僅達到針對MDA-MB-231之特定程度。
圖16概述於經抗Fc交聯DR5抗體處理後卡斯蛋白酶8活化之結果。顯示於7nM之濃度下於三種不同腫瘤細胞株(DLD-1，黑色柱；NCI-H460，斜線柱；及MDA-MB-231，白色柱)中之最大卡斯蛋白酶8活化。對於所有抗體，可於所有三種細胞株中偵測到高卡斯蛋白酶8活化水平。對於不同細胞株，卡斯蛋白酶8之誘導係在相同範圍內，但卡斯蛋白酶8誘導水平與抗體之親和力的關聯不如在針對增生抑制之CellTiter-Glo檢驗中所觀察到者顯著。
實例8：抗原決定基分析
為更詳細地表徵由新單離的DR5結合物識別之抗原決定基之類型及相對定位，已併與經純化IgG實施西方/點墨分析及Biacore測定。西方墨點相對點墨法結果的比較將證實抗體是否識別線性或構形抗原決定基，而Biacore競爭實驗將顯示不同、相同或部分重疊抗原決定基。
為了在線性或構形抗原決定基間作出區別，藉由SDS-PAGE分離出人類DR5，吸漬至硝基纖維素膜上，與不同DR5結合物一起培養及利用二級抗-huFc-HRP抗體(Sigma A0170)偵測。並行地，將人類DR5點漬至膜上，添加DR5抗體及利用相同二級抗體偵測。僅於點墨實驗中抗原之結合將顯示構形抗原決定基，此乃因在此設置中，抗原係呈其天然三維構形進行分析，而在西方墨點實驗中，抗原已經過變性及應僅可接近線性抗原決定基。
基於該等結果，可推論大多數經分析抗體識別人類DR5上之構形抗原決定基，而在指示與線性抗原決定基結合之西方墨點分析中，僅兩種抗體(5F6、24B7)明顯地與變性抗原結合。於點墨法中之強力結合及於西方墨點法中之微弱結合亦提示為構形抗原決定基，但此可能包含經識別之線性延伸(18F11、18H6)。
在兩種不同設置中進行藉由表面電漿共振(SPR，Biacore)之結合競爭檢測。於傳統的夾層式檢測中，將第一DR5結合物固定於晶片上，接著添加人類DR5並與人類DR5結合。然後，注入第二DR5抗體及分析與DR5之額外結合。於串接式檢測中，將人類DR5固定於晶片上接著添加第一DR5結合物。然後，注入第二DR5結合物及分析額外之結合。圖17概述該等結合競爭檢測之結果(在四種新穎DR5抗體與卓西單抗間比較)。由該等競爭檢測可推論，純系5E11、22E9及174(VH SEQ ID NO.：88、VL SEQ ID NO.：89，參見(例如)實例26)可能共用一個共同抗原決定基，此乃因一旦其中一者已與DR5結合，則另外兩者不會與抗原結合。這三種抗體清楚地識別與卓西單抗不同的抗原決定基。純系422(VH SEQ ID NO：82、VL SEQ ID NO.：85，參見(例 如)實例26)之結合位點可能與5E11、22E9及卓西單抗之抗原決定基重疊，但一定不與純系174之抗原決定基重疊。可從共結晶實驗(DR5+mAb)接著結構分析獲得對該識別出的抗原決定基問題之確切答案。
為評估DR5抗體是否可識別出與DR5配體結合位點類似或重疊之抗原決定基，Biacore設置TRAIL競爭檢測。針對該目的，將重組人類TRAIL(Preprotech編號310-04)固定於CM5晶片上。使用由人類DR5-Fc及DR5結合物組成之預形成複合物作為分析物及測定與經固定TRAIL之結合。於圖18中，顯示TRAIL競爭實驗之結果。除了純系422(圖18b中之點線)以外，所有新單離的DR5結合物似乎皆與至少與DR5上之TRAIL結合位點重疊之抗原決定基結合，此乃因經測試複合物中無一者可與經固定之人類TRAIL結合(均以實線表示)。與此相反，單獨的DR5(虛線)或DR5與對照組抗體之複合物(短虛線)顯示與經固定配體之明顯結合。
實例9：非配體競爭DR5抗體在TRAIL存在下相較於配體競爭結合物顯示增加之活體外細胞凋亡活性
於新穎DR5結合物之單離及篩選期間，單離出識別人類DR5上不同抗原決定基之抗體。歸類抗體之一種可能的準則係將其分成配體阻斷及配體非阻斷分子。在所選結合物當中，選出一個可代表各個該等組者：已鑑別出純系5E11可阻斷TRAIL與DR5結合，而純系422為配體非阻斷抗體(圖18)。
為評估與至少與TRAIL結合重疊之抗原決定基結合之影響，針對於存在或不存在人類TRAIL下與二級抗Fc抗體交聯後對DLD-1CRC標靶細胞增生之抑制，分析該兩候選物。在添加交聯抗體之前於37℃下每孔培養4000個DLD-1標靶細胞過夜：抗體5E11、422及不阻斷TRAIL之對照組抗體係以六種不同濃度(從6.67nM開始，以2.5倍稀釋 步進減低至0.068nM)使用。藉由添加等莫耳濃度之抗Fc二級抗體達成交聯。相對各別抗體濃度，以10、4、1.6、0.64、0.256及0.102nM之濃度添加TRAIL。於48h的培養之後，添加Cell TiterGlo試劑。此生長抑制檢測之結果顯示於圖19中。經證實作為非配體阻斷抗體之純系422於添加人類TRAIL後相較於與和抗原決定基重疊之TRAIL結合位點結合之純系5E11展現明顯增加之抗增生活性。添加交聯5E11抗體對藉由單獨TRAIL之生長抑制沒有加成效應。相對地，使用與人類TRAIL組合之交聯純系422顯示對活性的顯著加成效應。
利用已知不會阻斷TRAIL結合於DR5上之相關對照組抗體，觀察到類似的結果。在活體外檢測中所觀察到的此效應是否可轉移至活體內情況仍有待評估。
實例10：於雙特異性2+2形式中之轉化
為評估新穎DR5結合物是否可用於產生藉由DR5之超高交聯標靶誘導腫瘤細胞之細胞凋亡之雙特異性抗體，將一組DR5抗體轉化成四價雙特異性分子。該等雙特異性抗體包含各自針對DR5及FAP(纖維母細胞活化蛋白)之兩個結合部分。將不同的所選DR5抗體與FAP抗體28H1組合，單離出高親和力人類/鼠科/馬來猴(hu/mu/cy)交叉反應性FAP結合物及藉由噬菌體展示親和力成熟化。於所使用的2+2形式中，使用(G4S)4連接物將28H1 CrossFab域(VHCL)融合至抗DR5重鏈的C-端。2+2形式之示意性結構顯示於圖28)中。下方為2+2形式中雙特異性抗體之例示性鏈。
表12a：雙特異性四價DR5-FAP CrossMab分子(其等均具有使用(G4S)4連接物融合至抗DR5重鏈的C-端之28H1 CrossFab域(VHCL)，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)
所有DR5-FAP雙特異性分子係於瞬時轉染之HEK293 EBNA細胞中產生及藉由蛋白質A及尺寸篩除層析純化。獲得之產物產率係在合理範圍內(約20mg/L)。所有分子於最終純化步驟後之單體含量高於96%。
藉由表面電漿共振(Biacore)之標靶結合分析顯示呈2+2形式之所有所選雙特異性抗體如圖42所描繪皆可同時地與重組DR5及FAP(人類 及鼠科)結合。
為評估DR5-FAP雙特異性分子是否可誘導MDA-MB-231標靶細胞株之細胞凋亡，以重組人類FAP塗覆96孔板，藉由隨後添加的雙特異性抗體交聯DR5於標靶細胞上。於添加標靶細胞(MDA-MB 231)及培養24h後，藉由標準DNA斷裂ELISA檢測確定細胞凋亡誘導。圖20顯示包含新單離的DR5結合物及C-端融合28H1 FAP CrossFab之七種雙特異性抗體於兩種不同濃度(7.0nM及0.7nM)下與卓西單抗相比的細胞凋亡誘導比較。所有分子係於存在及不存在FAP下進行測試。如所預期，於高濃度下，基於卓西單抗之雙特異性分子已於不存在交聯FAP下誘導細胞凋亡至明顯程度。相對地，使用新穎DR5結合物之DR5-FAP雙特異性分子僅在塗覆於板上之FAP的存在下展現細胞凋亡誘導活性，指示該活性係取決於藉由重組FAP之交聯。
為確定雙特異性分子是否亦可藉由表現在不同於DR5之細胞株上之FAP有效地交聯及藉此誘導細胞凋亡，設置所謂的旁觀者共培養檢定。圖21顯示於腫瘤細胞株(MDA-MB-231)及表現纖維母細胞(GM05389)之FAP之共培養實驗中利用三種不同濃度之雙特異性分子(7.0、0.7及0.07nM)之細胞凋亡誘導之結果。包含分別與28H1 FAP CrossFab融合之來自5E11、22E9及20F2之DR5結合部分的三種雙特異性建構顯示與利用對應的抗Fc交聯IgG分子亦可觀察到者相當程度的細胞凋亡誘導。與此相反地，包含6H4作為DR5結合部分之分子相較於交聯IgG展現減低之活性。經測試分子中的一者(18H6-28H1)於所有濃度下完全無活性(相對於交聯IgG)，指示並非所有DR5結合物皆適用於產生與腫瘤細胞上之DR5超高交聯的雙特異性分子。因此，需要小心地評估抗原決定基及雙特異性活性以選擇出用於標靶誘導細胞凋亡方法之正確DR5抗體。就此而言，展現對DR5相當低的親和力及在2+2雙特異性形式中之高結合性之DR5結合物係特別有利。對DR5之 低親和力防止雙特異性抗體與正常細胞結合且因此增加在腫瘤細胞中以FAP相依方式誘導細胞凋亡之選擇性。具有該等特徵之一種結合物為例如DR5結合物5E11。
如所述，卓西單抗之限制其以雙特異性形式使用之一個缺點在於此抗體不容許第二結合部分之N-端融合之事實。此組態會導致阻斷卓西單抗的N-端，抑制與DR5之適當結合且因此阻止誘導細胞凋亡。為測試新單離的DR5抗體是否可用於此類型形式，產生Fc-融合分子，其中所選DR5結合物之Fab係經(G4S)4連接物C-端融合至人類Fc區。該等分子係瞬時地產生於HEK293 EBNA細胞中，藉由蛋白質A珠粒純化及於細胞凋亡誘導檢測中進行測試。於圖22 a)中，概述於MDA-MB-231細胞中利用該等與二級抗Fc IgG交聯後之Fc-DR5融合分子之DNA斷裂檢測的結果。所有經測試分子皆可誘導標靶細胞株之細胞凋亡，指示所選DR5結合物並非N-端阻斷，其展現較寬廣範圍之可併與該等結合物使用之形式。
實例11：包含噬菌體展示衍生DR5結合物之2+2雙特異性形式之熱穩定性的表徵
使用Optim1000系統(Avacta Group plc)以散射光強度之改變測定經轉化成2+2雙特異性形式之噬菌體展示衍生DR5結合物之熱穩定性。於微透光管陣列中，以0.1℃/min之速率將1mg/mL濃度下之在20mM組胺酸、140mM NaCl中的9μL樣本(pH 6.0)從25℃加熱至90℃。每隔0.4℃記錄散射光強度(266nm雷射)及利用軟體IgorPro，6.23版(Avacta Group plc)處理。初始聚集溫度係經定義為散射強度開始增加時之溫度。
表13：包含噬菌體展示衍生DR5結合物之雙特異性抗體(2+2形式)之初始聚集溫度作為雙特異性建構之熱穩定性之量度
所有經測試DR5抗體亦在經選殖為2+2雙特異性建構之情況下顯示聚集溫度甚高於60℃之高熱穩定性。
實例12：DR5-FAP雙特異性抗體可於不同標靶細胞上誘導細胞凋亡
以利用GM05389人類FAP+纖維母細胞之共培養檢定法於並列實驗中比較九種包含新單離的融合至FAP 28H1 CrossFab部分之DR5結合物之呈2+2形式之DR5-FAP雙特異性抗體(四種係藉由噬菌體展示單離，五種係衍生自兔之免疫，如實例22至25中所描述)於兩種不同細胞株(MDA-MB-231及G401)上誘導細胞凋亡。在自0.0007至7nM之濃度範圍內測試該等雙特異性抗體。DNA斷裂檢測之結果概述於圖23(MDA-MB-231)及圖24(G401)中。所有經測試之雙特異性抗體皆於兩種細胞株上展現良好的細胞凋亡誘導活性。根據利用MDA-MB-231細胞獲得的結果，可將抗體分成兩組。由兔之免疫所獲得者在0.7nM之濃度下顯示最大細胞凋亡誘導且隨著抗體濃度之進一步增加，活性略微減低。相對地，呈雙特異性2+2形式之噬菌體展示衍生結合物未於高濃度下顯示活性之減低，而是維持恆定或甚至更增加達最高濃度。於兩組雙特異性抗體之以G401細胞與GM05389纖維母細胞共培養之實驗中，已於0.07nM之濃度達成最大細胞凋亡誘導且接著維持 恆定。於此設置中，所有分子就細胞凋亡誘導水平而言的表現類似。
實例13：不同雙特異性形式的比較
已證實呈2+2 CrossFab形式之DR5-FAP雙特異性分子極佳地以非常好的品質產生且可在兩種細胞株共培養情況介導濃度相依的特異性細胞凋亡誘導。該等雙特異性分子之細胞凋亡誘導程度係在與利用經二級抗Fc抗體超高交聯之對應DR5結合物所觀察到的相同範圍內。為評估其他不同DR5-FAP雙特異性分子之細胞凋亡誘導能力，產生以下建構，其中DR5及FAP結合實體係如圖25所顯示以不同形式及以不同價數組合。
所有分子係瞬時地產生於HEK293 EBNA細胞中及依照標準蛋白質A及尺寸篩除層析方案純化。藉由SDS-PAGE、SEC及測徑規分析法來分析分子之副產物分佈及品質。
如表15中概述，該等其他形式相較於2+2形式而言似乎更難製造及純化。除了形式(B16_E11A_001)之外，其皆顯示較類似2+2分子低的表現產率。然而，聚集物含量相當低(<2%)，然於大多數情況中，亦可能偵測到較低分子量物質，此可歸因於分子之純化或降解所致。
以纖維母細胞共培養檢定(DNA斷裂)於不同濃度(7.0；0.7及0.07nM)下測試於MDA-MB-231上之細胞凋亡誘導活性。圖26顯示三種不同形式(2+2；2+1及3+1)與呈2+2形式之雙特異性卓西單抗間細胞凋亡活性比較的結果。於此設置中，呈2+2形式之5E11-28H1雙特異性分子總體上顯示與卓西單抗對照組類似的活性。於最低濃度下，呈2+2形式之5E11-28H1雙特異性分子已展現甚至高於卓西單抗對照組之活性。相對地，2+1及3+1形式之活性似乎低於兩種2+2形式(卓西單抗及5E11)。若使用一不同DR5結合物(18F11)來分析該等相同形式，則所有三種分子均顯示相較於卓西單抗雙特異性抗體減低之細胞凋亡誘導活性。然而，就18F11雙特異性分子而言，最大細胞凋亡誘導發生在 較低濃度(0.07nM)下，而基於卓西單抗之分子展現隨濃度增加而變高之活性。
於第二組分子中，針對其中兩個DR5結合部分係以頭-尾連接方式與Fc-結部分融合，同時靶向Fab之FAP係與Fc-孔對應物組合之5E11-28H1雙特異性抗體評估另一種2+1形式。在與GM05389纖維母細胞之共培養中於DNA斷裂檢測中在寬廣濃度範圍(範圍自7.0至0.0007nM)內比較所有四種形式的MDA-MB-231之細胞凋亡誘導(圖27)。兩種2+1分子在0.7nM之濃度下具有最高細胞凋亡活性，而3+1分子已於低10倍的濃度下顯示最大細胞凋亡誘導。然而，新穎形式中似乎無一者優於習知的2+2形式。
實例14：於共培養檢定系統中1+1雙特異性形式之功能活性之測試
除了述於實例12中之不同形式及價數變化外，產生DR5結合物0011(=純系174)在非交叉Fab中及FAP結合物4B9在交叉Fab(SEQ ID NO.280至282)中之呈1+1形式的另一種建構(如圖25 D所描繪)。將1+1形式之功能活性與2+2形式(如圖28 A所描繪，其包含0011作為DR5結合物及28H1作為FAP結合物；SEQ ID NO 287至289)及與具有或不具有二次交聯之0011之嵌合IgG(SEQ ID NO 90至93)作比較。
藉由細胞死亡偵測ELISA(CDDE，Roche #11 774 425 001)，在利用抗-DR5及抗-DR5-FAP雙特異性抗體於存在或不存在交聯二級抗體下處理細胞後，於由腫瘤細胞(MDA-MB-231)及纖維母細胞(GM05389)組成之共培養系統中測量細胞凋亡誘導。
第1天：製備細胞。於經補充10%胎牛血清(Gibco)及2mM L-麩醯胺酸(PAA)之DMEM培養基(PAN)中生長附著MDA-MB-231細胞株(人類乳腺癌)，及通常每週裂解兩次(1：20)。於經補充15%胎牛血清(Gibco)、1×NEAS(PAN)及2mM L-麩醯胺酸(PAA)之MEM+Earle培養 基(Gibco)中生長GM05389纖維母細胞，及通常每週裂解兩次(1：3)。
對於共培養檢定，在第1天以1×104個細胞/100μl/孔之密度將纖維母細胞接種於96-孔板中及於37℃、5% CO2下培養過夜。在第2天添加腫瘤細胞及抗體。
對於單株培養測定，以相同密度將細胞株接種於不同板上，培養過夜及在第二天利用抗體處理。
第2天：誘導細胞凋亡。吸清培養基及單獨地或以1：1比併與交聯抗體(山羊抗人類IgG，Sigma #I2136)一起含於100μl培養基中地將抗體(抗-DR5 IgG或抗-DR5-FAP雙特異性抗體)以不同最終濃度添加至該等細胞(參見附圖)。
對於共培養檢定，在抗體之後立刻將腫瘤細胞添加(1×104個細胞/100μl/孔)於纖維母細胞上達到100μl之最終體積。
使培養物於37℃下培養24h。
第3天：細胞死亡偵測Elisa(CDDE)。依照製造商使用說明(Roche)以輕微改變地進行免疫測定。簡言之，於RT下利用100μl/孔2×-裂解緩衝液裂解細胞15分鐘。依照製造商使用說明製備由抗-組蛋白及抗-DNA抗體組成之主混合物及於96-孔經鏈黴親和素塗覆之平底微量滴定板(Roche)上與經1：4稀釋之裂解物混合。於RT下2小時的培養後，洗滌孔，添加ABTS受質及於RT下培養直到達成足夠用於光度分析之顯色(10至30min)。利用Tecan Spectra Rainbow讀取器於405nm下讀取吸光度。
結果顯示於圖46及47中。
雖然單特異性抗-DR5抗體(嵌合0011及卓西單抗二者)自身並不誘導顯著的細胞凋亡，但DR5分子在細胞表面上與二級抗體之高度叢集會導致於約0.7mM濃度下之細胞死亡。然而，在將抗-DR5-FAP雙特異性抗體(呈形式1+1或2+2中任一者)添加至共培養導致DR5藉由與存 於纖維母細胞之表面上之FAP結合之第二部分高度叢集於腫瘤細胞上時達成最佳細胞凋亡誘導(圖46)。
雖然單特異性抗-DR5抗體於交聯後立刻誘導MDA-MB-231細胞之細胞凋亡，但針對DR5及FAP之雙特異性分子僅在DR5-表現腫瘤細胞及FAP-表現腫瘤相關纖維母細胞的存在下發揮作用。此外，該等分子中無一者對纖維母細胞之存活力顯現任何影響。(相對於內部檢測陽性對照組之相對細胞凋亡，參見圖47)。
此活性數據證實亦可利用針對各標靶具有一個價數之呈1+1形式之DR5-FAP雙特異性抗體以如同2+2形式之相當效力達成FAP特異性細胞凋亡誘導。
實例15：作為一般平臺技術之2+2雙特異性形式
已證實其中28H1 VHCL與5E11重鏈的C-端融合之呈2+2形式之雙特異性DR5-FAP CrossFab分子係一種極佳的形式。對於不同DR5結合物，其已證實可以合理產物效價生產，其係穩定的，僅展現少量之失落或錯誤配對輕鏈及可再現地顯示良好活性。然而，為擴大形式平臺，已產生交叉點之類型及位置相異之其他雙特異性5E11-28H1分子。所評估的五種其他形式及親本分子描繪於圖28中。五種其他分子中的四種不再包含交叉28H1 Fab，而係包含與DR5(5E11)重鏈的C-端融合之標準Fab域(經(G4S)4連接物融合之VHCH1或VLCL)。
所有分子係以200ml規模瞬時地產生於HEK293 EBNA細胞中，經標準蛋白質A及尺寸篩除層析法純化及最終相較於初始形式(與5E11重鏈融合之28H1之C-端CH1CL交叉(分子A，圖28))進行分析及定性。
如表16中概述，該五種分子可分成兩組：一組包含其中整體Fab 經交叉之兩種形式(B+E)。這兩種分子提供極低產物效價及甚至在純化之後其仍包含高聚集物含量。因此，不對這兩種分子作進一步評估。其他三種(5E11 VHVL或CH1CL之交叉及作為VHVL之C-端28H1之交叉)在產率及聚集物含量方面展現甚佳的產物品質。亦藉由FACS測試分子C、及D於MDA-MB-231細胞上之標靶結合，與分子A進行比較，如圖29所顯示。此外，與形式A(實例22至25)比較就細胞凋亡誘導而言之功能活性、同時及獨立的標靶結合、穩定性及聚集傾向以及分子C、D、及F之副產物模式。
實例16：於共培養檢定系統中2+2雙特異性形式變型之功能活性測試
在四種不同2+2形式變型(圖28之形式A、C、D、F)間比較其藉由細胞死亡偵測ELISA(CDDE，Roche #11 774 425 001)在利用該等建構處理細胞後於由腫瘤細胞(MDA-MB-231)及纖維母細胞(GM05389)組成之共培養系統中測得之誘導細胞凋亡之功能活性。
第1天：製備細胞。於經補充10%胎牛血清(Gibco)及2mM L-麩醯胺酸(PAA)之DMEM培養基(PAN)中生長附著MDA-MB-231細胞株(人乳腺癌)，及通常每週裂解兩次(1：20)。於經補充15%胎牛血清(Gibco)、1×NEAS(PAN)及2mM L-麩醯胺酸(PAA)之MEM+Earle培養基(Gibco)中生長GM05389纖維母細胞，及通常每週裂解兩次(1：3)。
對於共培養檢定，在同一天分別以1×104個細胞/100μl/孔之密度將纖維母細胞及腫瘤細胞接種於96-孔板中及於37℃、5% CO2下培養過夜。對於單株培養測定，以相同密度將細胞株接種於不同板上。
第2天：誘導細胞凋亡。吸清培養基及將雙特異性抗體以不同最終濃度(參見附圖)添加至含於100μl培養基中之細胞。
使培養物於37℃下培養24h。
第3天：細胞死亡偵測Elisa(CDDE)。依照製造商使用說明 (Roche)以輕微改變地進行免疫測定。簡言之，於RT下利用100μl/孔2×-裂解緩衝液裂解細胞15分鐘。依照製造商使用說明製備由抗-組蛋白及抗-DNA抗體組成之主混合物及於96-孔經鏈黴親和素塗覆之平底微量滴定板(Roche)上與經1：4稀釋之裂解物混合。於RT下2小時的培養之後，洗滌孔，添加ABTS受質及於RT下培養直到達成足夠用於光度分析之顯色(10至30min)。利用Tecan Spectra Rainbow讀取器於405nm下讀取吸光度
結果顯示於圖30中。藉由DNA斷裂偵測到4種不同CrossMab變型在共培養(a)及單株培養(b、c)設置中之細胞凋亡之誘導。所有4種不同變型在共培養設置中以相當的劑量相依方式誘導腫瘤細胞中之細胞凋亡。於單株培養設置中，在MDA-MB231腫瘤細胞株及在GM05389纖維母細胞細胞株中皆未誘導細胞凋亡，指出所有4種變型之細胞凋亡誘導之特異性及FAP-相依性。此功能活性數據證實雙特異性2+2形式可以針對類型及交叉位點而言的不同組態使用。
實例17：2+2雙特異性形式變型之獨立及同時標靶結合測試
另外藉由SPR檢測在四種不同2+2形式變型(圖28之形式A、C、D、F)間比較其獨立及同時地與兩種標靶結合之能力。
DR5及FAP獨立地與不同Crossmab變型結合之評估
於pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應的胺偶聯套組將約3000個共振單位(RU)之捕獲系統(5μg/ml抗人類IgG(Fc)；GE Healthcare，BR-1008-39)耦合於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上。樣本及系統緩衝液為PBS-T(包含0.05%吐溫20之10mM磷酸鹽緩衝鹽水)pH 7.4。將流動細胞之溫度設為25℃及樣本塊之溫度設為12℃。於捕獲之前，利用操作緩衝液底塗流動細胞兩次。
藉由以5μl/min之流速注入5μg/ml溶液持續60s來捕獲雙特異性抗體。藉由針對依序或同時添加(10μl/min之流速)之各配體測定活性 結合能力來分析各配體與雙特異性抗體之獨立結合：
1.注入具有5μg/ml濃度之人類DR5持續180s(識別抗原之單一結合)。
2.注入具有5μg/ml濃度之人類FAP持續180s(識別抗原之單一結合)。
3.注入具有5μg/ml濃度之人類DR5及具有5μg/ml濃度之人類FAP持續180s(識別DR5及FAP於相同時間之結合)。
藉由利用3m MgCl2溶液以30μl/min流速之60s的洗滌再生表面。藉由減去自抗人類IgG表面獲得之響應來校正整體折射率差。
若方法3之所得最終信號等於方法1及2之個別最終信號的總和，則雙特異性抗體可相互獨立地與兩種抗原結合。
所有4種不同Crossmab變型可相互獨立地與DR5及FAP結合。
DR5及FAP同時與Crossmab結合之評估
首先，於pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶聯套組將約600個共振單位(RU)之DR5(20μg/ml)耦合於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上。樣本及系統緩衝液為PBS-T(包含0.05%吐溫20之10mM磷酸鹽緩衝鹽水)pH 7.4。將流動細胞設為25℃及樣本塊設為12℃及使用操作緩衝液底塗兩次。其次，以30μl/min流速注入雙特異性抗體之10μg/ml溶液持續30s。再者，以30μl/min流速注入hFAP(10μg/ml)持續30s。hFAP之結合響應取決於hDR5所結合的雙特異性抗體之量及顯示同時結合。藉由利用甘胺酸pH2溶液(GE Healthcare BR-1003-55)以30μl/min流速之70s的洗滌再生表面。由hFAP與先前DR5結合Crossmab之額外特異性結合信號證實同時結合。
四種Crossmab形式(DR5TAA-0057、DR5TAA-0078、DR5TAA-0077及DR5TAA-0081)同時與DR5及FAP結合之評估顯示所有4種不同的Crossmab變型皆可同時地與FAP及DR5二者結合。
實例18：2+2雙特異性形式變型之熱穩定性及聚集傾向之測試
另外在四種不同2+2形式變型(圖28之形式A、C、D、F)間分析其熱穩定性及其形成聚集物之傾向。
熱穩定性
初始聚集溫度：以1mg/mL濃度含於20mM組胺酸/組胺酸氯化物、140mM NaCl(pH 6.0)中製備樣本，藉由離心通過0.4μm過濾板轉移至光學384-孔板中及經石蠟油覆蓋。藉由動態光散射重複測量流體動力半徑，同時以0.05℃/min速率將樣本自25℃加熱至80℃。初始聚集溫度係定義為流體動力半徑開始增加時的溫度。
聚集傾向
將樣本透析至調配緩衝液(20mM His/HisCl、240mM海藻糖， pH 6.0)中及調整至1mg/mL之濃度。於0.22μm離心過濾裝置(Millipore)上無菌過濾之後，將樣本於40℃下儲藏2週，同時維持對照樣本於-80℃。藉由SE-HPLC使用TSK3000 SWXL管柱(Tosoh)監測聚集物形成及以40℃及-80℃樣本間之差值表示。
在形式C、D及F中相較於親本形式A而言其熱穩定性略有減低，但以61℃及60℃而言仍在良好範圍內。
形式A、C及F之聚集傾向相當低，而形式D略有增加。
實例19：藉由質譜法評估2+2雙特異性形式變型之副產物分佈
最終，另外藉由質譜法在四種不同2+2形式變型(圖28之形式A、C、D、F)間分析其副產物分佈。
藉由電噴霧離子化質譜法(ESI-MS)測定及確認不同建構之去糖基化總質量。此外，偵測及相對定量諸如LC過度表示之潛在副產物。簡言之，於37℃下利用在100mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7)中之14 U N-糖苷酶F(Roche)將蛋白質濃度高達3mg/ml之100μg經純化抗體去糖基化2h，及隨後透過HPLC於Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上脫 鹽。透過ESI-MS於配備TriVersa NanoMate(Advion)來源之maXis UHR-TOF(Bruker)MS系統上測定去糖基化總質量。
藉由質譜法分析不同DR5-FAP雙特異性抗體建構之去糖基化形式以評估產物同一性及完整性。可針對所評估的所有建構來確認同一性。此外，不同建構顯示若干種例如具有一種LC類型之過度表示或具有一或兩種LC之損耗之副產物。所有建構均具有定性及定量相似的副產物分佈。
實例13及30至33之所有結果清楚顯示雙特異性2+2形式可用於在交叉類型及位點方面不同的組態。此使得2+2 CrossFab形式成為寬泛適用的平臺技術。
實例20：卓西單抗-FAP雙特異性分子展現優於非靶向卓西單抗之活體內療效
已在活體外活性檢測中證實雙特異性卓西單抗-FAP展現相較未經交聯之單獨的卓西單抗優異之細胞凋亡誘導活性。已設置不同異種移植模型來評估此是否亦可轉化為相關小鼠腫瘤模型中之活體內療效。標準小鼠腫瘤模型之一個問題在於FAP表現通常極低且完全不反映人類情況。為建立更密切類似於人腫瘤基質中之FAP表現之模型，將重組表現小鼠FAP之經改造鼠科纖維母細胞(3T3細胞)與各別腫瘤細胞株(裸小鼠中之結腸直腸癌細胞株DLD-1及SCID小鼠中之乳癌細胞株MDA-MB-231)共同注射。為此目的，於MPSV啟動子之控制下將3T3纖維母細胞穩定地轉染帶有針對全長鼠科FAP基因之表現匣之質體。為選出穩定的純系，載體進一步帶有針對賦予嘌呤黴素抗性之嘌呤黴素乙醯基轉移酶之其他表現匣。已選出若干種如藉由FACS結合實驗判定表現不同鼠科FAP水平之純系。將一種所選鼠科FAP-3T3細胞株與腫瘤細胞株DLD-1共同注射，導致相較於不與鼠科FAP表現3T3細胞一起注射之DLD-1細胞明顯增進之腫瘤生長。此外，使用人 類/小鼠交叉反應性抗FAP抗體之IHC分析已證實如預期之在兩種細胞株之腫瘤周圍基質中之高度FAP表現水平。因此，使用此共移植皮下異種移植模型來評估雙特異性卓西單抗-FAP分子相較於初始非靶向卓西單抗抗體之活體內療效。將2×106個腫瘤細胞與表現鼠科FAP之20% 3T3纖維母細胞共植入。在腫瘤細胞植入後的第十二天(DLD-1)及第十天(MDA-MB-231)開始療法。對動物注射(i.v.)緩衝液、卓西單抗(10mg/kg)或卓西單抗-FAP(10mg/kg)中任一者。為補償卓西單抗相對雙特異性卓西單抗之分子量差(卓西單抗僅為雙特異性分子之分子質量之60%)，雙特異性卓西單抗係每週投與兩次，而卓西單抗僅每週投與一次。於圖31中，概述平均腫瘤體積(單位為mm3)隨時間之增加。圖31 A顯示DLD-1/鼠科FAP-3T3共同注射模型中卓西單抗-FAP相較於卓西單抗及緩衝液對照組之活體內療效。雖然卓西單抗僅展現中等抗腫瘤效力，相對於對照組產生36%之腫瘤生長抑制(TGI)，但雙特異性分子在研究結束時(第33天)展現99%之腫瘤生長抑制。於MDA-MB-231/鼠科FAP-3T3共同注射模型中，這種差異甚至更為顯著，此乃因在該模型中，單獨的卓西單抗不顯示任何較緩衝液對照組佳的療效，而卓西單抗-FAP雙特異性抗體在研究結束時(第32天)展現77%之腫瘤生長抑制(圖31 B)。此結果可能顯示MDA-MB-231細胞株如DLD-1細胞株般更具細胞凋亡誘導抗性。
實例21：併與28H1 FAP CrossFab使用新單離的DR5結合物來評估DR5-FAP雙特異性分子之抗腫瘤活性。
在分別與表現鼠科FAP之3T3纖維母細胞共同注射之DLD-1及MDA-MB-231異種移植模型中，並列地比較與呈CrossFab形式之抗FAP抗體28H1融合之呈雙特異性形式之三種不同DR5結合物(5E11、174及422)之活體內療效。包括由具有Fc區中完全消除與Fcγ受體結合(而對FcRn之親和力不改變)之突變之5E11-28H1 CrossFab組成之第四 種分子。為此目的，進行大規模瞬時轉染及生成以在HEK細胞中產生足量物質。
所有分子係以良好產率與在聚集物及內毒素含量方面極佳的品質製得。由概述於表21中之不同方法(SPR及FRET)來分析與相關抗原之結合。
在執行活體內實驗之前，先在該等物質間測試活體外細胞凋亡誘導活性。圖32概述四種不同DR5-FAP雙特異性分子於7.0、0.7及0.07nM之濃度下比較之細胞死亡偵測ELISA之結果。該分析係經設置為其中DLD-1細胞用作標靶細胞及表現鼠科FAP之3T3或重組3T3細胞充作用於交聯之效應細胞之共培養檢定。於DLD-1-3T3共培養實驗中，於DLD-1細胞中幾乎無法偵測到任何細胞凋亡誘導，而在利用FAP表現3T3細胞之情況中，觀察到細胞凋亡誘導之10倍增加，表明此活性係歸因於藉由FAP於重組3T3細胞之表面上之交聯。進行一個類似的實驗，其中使用相同雙特異性分子、標靶及效應細胞來確定細胞於經雙特異性激動DR5-FAP抗體處理後之存活力。此實驗之結果概述於圖33。此處，僅在FAP表現3T3細胞的存在下觀察到DLD-1細胞之細胞存活力的顯著減低，而就未經改質之3T3細胞(其不表現鼠科FAP)而言，未觀察到存活力之減低。
使用所有四種雙特異性DR5-FAP分子來評估於兩種不同的均與 20%鼠科FAP表現3T3纖維母細胞共同注射之腫瘤模型中之活體內療效。該等活體內療效實驗之結果顯示於圖34中。於植入腫瘤及纖維母細胞後，以每週兩次經靜脈內(i.v.)投與10mg/kg開始治療。的確，所有四種分子皆可於兩種模型中控制腫瘤生長，此點如由相較於媒劑對照組顯著的腫瘤生長抑制(TGI)所證實。所有四種分子於研究結束時腫瘤生長抑制之絕對百分率在相似範圍內。就DLD-1及MDA-MB-231模型而言，分別獲得以下結果：5E11_28H1(wt Fc)：75%/95%；5E11_28H1(PGLALA)：83%/99%；純系174：66%/87%及純系422：73%/89%。所有分子在MDA-MB-231模型中相較在DLD-1實驗中略為更具效力。
實例22至25：藉由免疫形成及表徵新穎DR5結合部分
除了從噬菌體展示庫(如上所述)選出具有經改良性質之新穎DR5抗體之外，亦可藉由兔之免疫(實例22至25)接著密集型特徵分析(實例26至28)產生出新穎DR5抗體。
實例22：兔之免疫
在第0天藉由皮內施用以經完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant)乳化之400μg重組人類DR5(單體Fc融合)，及在第7、第14、第35、第63及第91天藉由交替肌肉內及皮下施用以經完全弗氏佐劑乳化之各200μg DR5-huFc，來使一組兔免疫。在第21、第41、第69及第97天，採集血液(總血液體積估計值之10%)。製備用於藉由ELISA測定效價(參見下文)之血清，及單離周邊單核細胞，將其用作用於B細胞選殖方法(實例17)中之抗原-特異性B細胞來源。
使用編碼不包含細胞內死亡域之人類DR5之質體表現載體，藉由皮內施用400μg載體DNA，接著電穿孔(750V/cm之5個方形脈衝，持續時間10ms，間隔1s)，以基因方式使另一組兔免疫。在第0、第14、第28、第49、第77及第105天使該等兔接受6次連續免疫。在第35、第56、第84及第112天採集血液(總血液體積估計值之10%)。製備用於藉由ELISA測定效價(參見下文)之血清，及單離周邊單核細胞，將其用作用於B細胞選殖方法(實例23)中之抗原-特異性B細胞來源。
血清效價之測定
將人類DR5(單體Fc融合)以0.3125μg/ml、100μl/孔含於PBS中固定於96-孔NUNC Maxisorp板上，接著利用含於PBS中之2% Crotein C以200μl/孔封阻該板；以含於PBS中之0.5% Crotein C以100μl/孔重複施用抗血清之連續稀釋液；利用以1：16000稀釋於含於PBS中之0.5% Crotein C(100μl/孔)之HRP-結合驢抗-兔IgG抗體(Jackson Immunoresearch)偵測。對於所有步驟，使板於37℃下培養1h。在所 有步驟之間，利用0.05%吐溫20(含於PBS中)洗滌該等板3次。藉由添加可溶性BM藍色POD受質(Roche)(100μl/孔)顯現信號；及藉由添加1M HCl(100μl/孔)終止。以690nm作為參照，讀取450nm下之吸光度。效價係經定義為獲致半數最大信號之抗血清的稀釋度。
實例23：自兔之B-細胞選殖
兔周邊血液單核細胞(PBMC)之單離
使用三隻兔(述於實例「兔之免疫」中)作為血液來源。在依照製造商之規定使用哺乳動物淋巴溶解素(Cedarlane Laboratories，Burlington，加拿大安大略省)進行密度離心之前，利用1×PBS(PAA，Pasching，奧地利)將含EDTA之全血稀釋兩倍。利用1×PBS洗滌PBMC兩次。
EL-4 B5培養基
RPMI 1640(Pan Biotech，德國艾登巴赫(Aidenbach))，補充有10% FCS(Hyclone，Logan,UT,USA)、2mM麩醯胺酸、1%青黴素/鏈黴素溶液(PAA，Pasching，奧地利)、2mM丙酮酸鈉、10mM HEPES(PAN Biotech，德國艾登巴赫)及0.05mM b-巰基乙醇(Gibco，Paisley，蘇格蘭)
巨噬細胞/單核細胞之去除
使用無菌6-孔板(細胞培養等級)來藉由非特異性黏著去除巨噬細胞及單核細胞。將各孔填充最多4ml培養基及多達6×106個來自經免疫兔之PBMC及使其在培養箱中於37℃下結合1h。將上清液中之細胞(周邊血液淋巴細胞(PBL))用於抗原淘選步驟。
板之塗覆
關於蛋白質上之淘選，在室溫下將無菌鏈黴親和素塗覆之6-孔板(Microcoat，德國伯恩里德(Bernried))塗覆含於PBS中之2μg/ml生物素標記重組人類DR5(單體Fc融合)長達3h。關於人類表面DR5-陽性細胞 上之淘選，將G401細胞接種於無菌細胞培養6-孔板中及培養產生融合細胞單層。在淘選之前，利用無菌PBS洗滌該等6-孔板三次。
B細胞於人類DR5蛋白質上之富集
將經塗覆人類DR5蛋白質或經覆蓋人類DR5-陽性G401細胞之6-孔組織培養板接種每4ml培養基多達6×106個PBL及使其在培養箱中於37℃下結合1h。於DR5抗原上之富集步驟之後，藉由小心地以1×PBS洗滌該等孔1至2次來移去非黏附細胞。在培養箱中於37℃下藉由胰蛋白酶使殘留黏性細胞剝離10min。藉由EL-4 B5培養基終止胰蛋白酶化。將該等細胞維持於冰上直到進行免疫螢光染色。
免疫螢光染色及流式細胞儀分析
將抗-IgG FITC(AbD Serotec，德國杜塞爾多夫(Düsseldorf))用於單細胞分選。關於表面染色，利用含於PBS中之抗-IgG FITC抗體培養由去除及富集步驟獲得之細胞及在黑暗中於4℃下培養45min。於染色之後，利用冰冷PBS洗滌PBMC兩次。最後，將PBMC再懸浮於冰冷PBS中及立刻接受FACS分析。在FACS分析之前添加5μg/ml濃度之碘化丙啶(BD Pharmingen，美國加州聖地亞哥)以鑑別死亡細胞與活細胞。將配備電腦及FACSDiva軟體(BD Biosciences，USA)之Becton Dickinson FACSAria用於單細胞分選。
B-細胞培養
藉由與Zubler等人(1985)所述方法類似的方法製備兔B細胞之培養。簡言之，在培養箱中於37℃在5% CO2氛圍中將單一經分選的兔B細胞於具有包含Pansorbin細胞(1：100000)(Calbiochem(Merck)，德國達姆斯塔特(Darmstadt))、5%兔胸腺細胞上清液(charge TSN-M13(10242)，MicroCoat，德國伯恩里德)及γ-輻射鼠科EL-4-B5胸腺瘤細胞(2.5×104/孔)之200μl/孔EL-4 B5培養基之96-孔板中培養7天。移去B-細胞培養之上清液以供篩選及立刻收穫殘留細胞並於-80℃下冷 凍於100μl RLT緩衝液(Qiagen，德國希爾登(Hilden))中。
實例24：B-細胞PCR及重組表現
核糖核酸(RNA)之單離
先藉由離心粒化須要自其單離出RNA之細胞。藉由添加具有10μl/ml β-巰基乙醇之100μl RLT-緩衝液來裂解細胞集結粒。藉由利用吸移管多次混合使該等細胞再懸浮及將其轉移至多孔板。立刻以200×g離心該板及於-20℃下冷凍。利用NucleoSpin® 96 RNA套組(Macherey & Nagel)依照製造商使用說明進行RNA之單離。
反轉錄聚合酶鏈反應
利用SuperScript III第一股合成超混液(Invitrogen)依照製造商使用說明進行反轉錄。
聚合酶鏈反應
利用AccuPrime Pfx超混液(Invitrogen)依照製造商使用說明進行聚合酶鏈反應。於個別反應中擴增輕鏈及重鏈可變區。PCR-引子係以與相對標靶抗體表現載體之25 bp重疊併用。藉由NucleoSpin® 96 Extract II套組(Macherey & Nagel)純化PCR-產物。
定序及SLIC選殖
將PCR產物定序以確定重及輕鏈之可變區之DNA-序列。藉由Haun,R.S.等人在BioTechniques 13(1992)第515至518頁中所述及Li,M.Z.等人在Nature Methods 4(2007)第251至256頁中所述之所謂的SLIC-選殖法將PCR-產物選殖至表現載體中。藉由限制酶消化將用於抗體表現之質體線性化。藉由製備型瓊脂糖電泳純化線性化質體及將其自凝膠(Qiaquick凝膠萃取套組/Qiagen)中萃取。使用針對待選殖PCR-產物之重疊引子(bay 25 bp)將經純化質體添加至PCR-方案。利用T4 DNA聚合酶(Roche Applied Sciences)在dNTP不存在下處理載體及***物二者以產生突出物，接著利用RecA(New England Biolabs)蛋白 質及ATP培養載體及***物以促進重組。將產物轉化至大腸桿菌中。單離出輕鏈及重鏈之質體DNA及將每一對組合以供瞬時轉染。
用於HEK293細胞中之抗體表現的瞬時轉染
使HEK293細胞(Invitrogen)於F17-培養基(Gibco)中生長至1×10e6個細胞/ml。利用懸浮於293-free(Novagen)及OptiMEM®(Gibco)中之1μg HC+LC質體轉染2×10e6個HEK293細胞。於7天的培養後，收穫上清液，藉由蛋白質A純化及進行分析。
實例25：衍生自免疫之DR5抗體之篩選
藉由多重平行ELISA基結合檢測在384孔微量滴定板中篩選B-細胞培養上清液。選擇與DR5-表現細胞G401及與生物素標記重組人類DR5(單體Fc融合)及馬來猴DR5(二聚Fc融合)結合，但不與人類DR4(TNFRSF10A；R&D Systems目錄號347-DR-100)及人類IgG1結合之抗體作為主要目標物。於二次篩選中，再次對重組表現於HEK細胞中之微純化抗體針對與人類及馬來猴DR5結合及另外不與人類DR4、人類DcR1(內部)、人類Dc R2(內部)或人類骨保護素(OPG；R&D Systems目錄號805-05-100)結合進行測試。另外，在G401細胞上之功能細胞凋亡檢測(細胞死亡偵測Elisa)中於存在或不存在交聯抗人類Fc抗體下對抗體進行測試。僅選擇可在Fc-介導交聯後誘導細胞凋亡(但在不存在該交聯時不可誘導)之彼等抗體來進行進一步特徵分析及開發。
藉由次選殖及再定序可變輕及可變重鏈來驗證於二次篩選後所選擇及在表現質體中藉由SLIC選殖程序所選殖之抗體之序列。
接著將該等經次選殖及經序列驗證之表現質體用於HEK293F細胞之較大規模的瞬時轉染，接著用於蛋白質A純化，從而容許其他更密集的特徵分析步驟。
實例26：衍生自免疫之DR5抗體之結合性質之特徵分析
對自兔之免疫所選擇的DR5抗體進行其結合性質、物種交叉反應性及經結合ELISA及SPR分析之特異性之特徵分析。
單株抗體與TRAIL結合受體之結合(免疫測定)
於室溫下在含經補充0.05%吐溫®-20及0.5% BSA之PBS緩衝液(Roche Diagnostics GmbH)之384孔鏈黴親和素塗覆微量滴定板(MicroCoat Biotechnologie GmbH)上進行抗原結合免疫測定。將125ng/ml生物素標記人類DR5(單體Fc融合)蛋白質(內部)或63ng/ml生物素標記hFc馬來猴DR5蛋白質(內部)或63ng/ml生物素標記DcR2(TNFRSF10D)蛋白質(內部)添加至含經1：3000稀釋抗兔Fc-HRP結合物(GE Healthcare)及經1：50稀釋之B-細胞上清液之混合物之孔中。於90min的培養後，利用PBST(具有0.2%吐溫®-20之磷酸鹽緩衝鹽水)洗滌該板6次及於RT利用BM藍色® HRP受質溶液(BM藍色®：3,3'-5,5'-四甲基聯苯胺，Roche Diagnostics GmbH)顯影30分鐘。測定於370nm下之吸光度。在不添加上清液下界定空白試驗值。
關於針對抗原體之hFc標籤之陰性選擇，採用利用生物素標記抗人類IgG(Fab特異性)(來自Jackson ImmunoResearch)(目錄號109-066-006)、人類IgG1(內部)及抗兔Fc-HRP結合物之混合物之免疫測定及如所述處理。關於測試與例如人類DR4(TNFRSF10A；R&D Systems目錄號347-DR-100)、人類骨保護素(OPG；R&D Systems目錄號805-05-100)及人類DcR 1(TNFRSF10C；R&D Systems目錄號630-TR-100)之相關Trail結合受體之結合，藉由利用抗人類Fc抗體(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-006-098)在MaxiSorp 384孔微量滴定板(Sigma-Aldrich，Nunc)上捕獲各別的蛋白質-hFc嵌合體來建立免疫測定。
表22：如藉由生化ELISA(EC50[ng/ml])偵測得的由免疫所衍生之DR5抗體(兔IgG)與人類DR5(單體Fc融合)及馬來猴DR5之結合。未偵
自兔之免疫所選擇的DR5抗體在ELISA中顯示良好且與人類及馬來猴DR5相當的結合性質，然而其不識別鼠科DR5。所有所選擇的抗體皆對DR5具高度特異性，此乃因其在與人類DR4、DcR1、DcR2、及骨保護素之結合ELISA中不提供顯著的信號。
DR5動力學親和力
於pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶聯套組將約3000至5000個共振單位(RU)之捕獲系統(10μg/ml山羊抗兔；訂購代碼JIR111-005-046；Jackson Immuno Research)耦合於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上。樣本及系統緩衝液為PBS-T(包含0.05%吐溫20之10mM磷酸鹽緩衝鹽水)pH 7.4。將流動細胞設為25℃-及樣本塊設為12℃-及利用操作緩衝液底塗兩次。
藉由以10μl/min流速注入1μg/ml溶液持續30s來捕獲DR5抗體。 藉由於30μl/min流速下注入以各種濃度含於溶液中之始於100nM以1：3稀釋降至0.41nM之重組人類DR5(單體His-Avi融合蛋白質，內部)持續120s來測量締合。監測解離相長達300s及藉由自樣本溶液轉變為操作緩衝液來觸發。藉由利用100mM H3PO4(磷酸)溶液以30μl/min流速洗滌60s來再生表面。藉由減去自空白表面獲得之響應來校正整體折射率差。亦減去緩衝液注入(=雙重參照)。關於KD及其他動力學參數之計算，使用Langmuir 1：1模型。
實例27：自免疫衍生之DR5抗體之功能特徵
DNA斷裂及細胞存活力
藉由在經抗-DR5抗體於存在或不存在交聯抗體下處理後，分別如由細胞死亡偵測ELISA(CDDE，Roche #11 774 425 001)及Cell Titer Glo(CTG，Promega #G7573)測得評估細胞凋亡及細胞存活力，來對 DR5抗體進行功能定性。
細胞之製備：於經補充10%胎牛血清(Gibco)及2mM L-麩醯胺酸(PAA)之DMEM培養基(PAN)中生長附著MDA-MB-231細胞株(人乳腺癌)，及通常每週裂解兩次(1：10)。關於檢測，利用PBS洗滌細胞，藉由Accutase(PAA)從燒瓶脫離，以1×104個細胞/孔(CDDE)或0.25×104個細胞/孔(CTG)之密度(含於50μl中)接種於96-孔平底微量滴定板(Costar)中，及於37℃、5% CO2下培養過夜。
藉由兔抗-DR5抗體誘導細胞凋亡：將樣本(兔抗-DR5 IgG，DR5-TAA-#)以不同濃度單獨地或連同在PBS中之交聯抗體(山羊抗兔IgG，Jackson Immunoresearch)(以1：1比含於50μl中)一起添加至該等細胞，以引起DR5受體交聯而導致細胞凋亡。於37℃下培養細胞24h(CDDE)或48h(CTG)。
A)細胞死亡偵測Elisa(CDDE)：依照製造商使用說明(Roche)進行免疫測定。簡言之，小心地吸清上清液及於RT下利用200μl/孔裂解緩衝液裂解細胞30分鐘。依照製造商使用說明製備由抗組蛋白及抗-DNA抗體組成之主混合物及於96-孔鏈黴親和素塗覆平底微量滴定板(Roche)上與經1：4稀釋之裂解物混合。於RT下2小時的培養之後，洗滌孔，添加ABTS受質及於RT下培養直到達成足夠用於光度分析之顯色(10至30min)。利用Tecan Spectra Rainbow讀取器於405nm下讀取吸光度。
圖35顯示本實驗之結果：產生之兔抗-DR5抗體可以不同效力但始終以劑量相依方式及僅於DR5分子之Fc-介導交聯之後誘導MDA-MB231細胞之細胞凋亡。於不存在抗兔Fc-特異性二級抗體情況下，未偵測到顯著細胞死亡。
B)Cell Titer Glo(CTG)：依照製造商使用說明(Promega)進行免疫測定。簡言之，先於含發光受質之緩衝液(100μl)中裂解細胞。於振 動器上10分鐘的培養時段之後，利用TECAN Infinite Plus讀取器測量發光。
圖36顯示本實驗之結果：細胞存活力藉由抗-DR5抗體於受體高度叢集後以劑量相依方式減低。產生之兔抗-DR5抗體可以不同效力但始終以劑量相依方式及僅於DR5分子之Fc-介導交聯之後減低MDA-MB231細胞之存活力。於不存在抗-兔Fc-特異性二級抗體情況下，於任何抗體濃度下，細胞存活力皆不受影響。
細胞存活力與卡斯蛋白酶8活化
依照製造商使用說明進行卡斯蛋白酶8-Glo卡斯蛋白酶8活化檢定(Promega cat#G8202)及CellTiter-Glo細胞存活力檢定(Promega cat#TB288)。
對於卡斯蛋白酶8活化檢定，以每孔75μl將10,000個癌細胞接種於不透光白色96孔板(BD Falcon cat#BD353296)中及於37℃與5% CO2下培養過夜。接著，連同抗-兔Fc抗體之6個連續稀釋液一起添加抗-DR5抗體(相等莫耳濃度之DR5及兔Fc抗體，含於25μl中)。於37℃與5% CO2下在細胞上培養抗體3小時。接著，將在裂解緩衝液中之100μl卡斯蛋白酶8受質添加至各孔及均勻混合。於37℃下再培養30分鐘後，於Spectra Max M5板中讀取發光信號。
對於細胞存活力檢定，每孔將4,000個癌細胞接種於黑色/透明底部96孔板(BD Falcon cat#BD353220)中及於37℃與5% CO2下培養過夜。接著，連同抗-兔Fc抗體之6個連續稀釋液一起添加抗-DR5抗體(相等莫耳濃度之DR5及兔Fc抗體，含於25μl中)。於37℃與5% CO2下在細胞上培養抗體48小時。接著，將100μl CellTiter-Glo試劑添加至各孔及均勻混合。於室溫下再培養10分鐘之後，在Spectra Max M5板讀取器中讀取發光信號。
圖37顯示三種不同人類腫瘤細胞(DLD-1、NCI H460及MDA-MB- 231)在經7nM濃度之不同交聯DR5抗體處理後之細胞增生之抑制之分析(Cell TiterGlo檢驗)。圖38顯示藉由卡斯蛋白酶8活化測得之三種人類腫瘤細胞株(DLD-1、NCI H460及MDA-MB-231)在經7nM濃度之交聯DR5抗體處理後之細胞凋亡誘導。所有經測試DR5抗體於所有經測試腫瘤細胞株中誘導高度卡斯蛋白酶8活化。DR5抗體可以不同效力減低所有經測試細胞株之存活力。
實例28：藉由噬菌體展示及免疫衍生之DR5抗體之化學穩定性之評估
逆境DR5抗體樣本之產生
為測試DR5抗體之化學穩定性，產生逆境樣本及針對DR5結合功能定性。高-pH逆境尤其引起反應性Asn熱點之脫醯胺，而(例如)於pH 6.0下，可引起自反應性Asn及Asp殘基之琥珀醯亞胺形成。對於高-pH逆境，將樣本轉移至20mM Na-磷酸鹽pH 8.0中及於40℃下培養5天。對於低pH逆境，將樣本轉移至20mM His/HisCl、140mM NaCl(pH 6.0)中及於40℃下培養3週。將對照組樣本維持於-80℃。
逆境DR5抗體樣本之相對活性濃度之測定
於pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶聯套組將約5000個共振單位(RU)之捕獲系統(20μg/ml山羊抗兔；訂購代碼JIR111-005-046；Jackson Immuno Research)耦合於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上。樣本及系統緩衝液為PBS-T(包含0.05%吐溫20之10mM磷酸鹽緩衝鹽水)pH 7.4。將流動細胞之溫度設為25℃及樣本塊之溫度設為12℃。於捕獲之前，利用操作緩衝液底塗流動細胞兩次。
藉由以10μl/min流速注入50nM溶液持續60s來捕獲雙特異性抗體。藉由以30μl/min流速於200nM濃度下注入呈溶液之人類DR5持續90s來測量締合。監測解離相長達90s及藉由自樣本溶液轉變為操作緩衝液來觸發。藉由利用0.85% H3PO4(磷酸)溶液以30μl/min流速洗 滌60s來再生表面。藉由減去自空白表面獲得之響應來校正整體折射率差。
逆境抗體之相對活性濃度為從捕獲水平及結合水平計算得的比率(RU結合除以RU捕獲，相對於非逆境參照樣本)。
圖39顯示用於測定逆境DR5抗體樣本之相對活性濃度之例示性響應曲線。圖40及41顯示自免疫及自噬菌體展示衍生之初始及逆境DR5抗體之相對活性濃度。除了分別於pH6及pH8下之逆境後顯示略為減低之相對活性濃度之抗體DR5TAA-0013及DR5TAA-0010之外，所有其他DR5抗體於pH逆境之後未顯示任何相關之相對活性濃度減低。
實例29：共培養檢定中呈2+2雙特異性形式之藉由免疫及噬菌體展示衍生之DR5-結合物之功能特徵
為評估藉由免疫衍生之新穎DR5結合物是否可用於產生雙特異性抗體以供藉由DR5之超高交聯標靶誘導腫瘤細胞之細胞凋亡，將一組DR5抗體轉化成與FAP抗體28H1組合之2+2雙特異性分子(如圖18A描繪)。於共培養檢定中測試雙特異性建構之細胞凋亡誘導活性。
將DLD-1或H460腫瘤細胞(10,000個細胞/孔)接種至與3T3細胞或與經轉染以表現鼠科FAP之3T3細胞(2,500個細胞/孔)(總體積為150μl)共培養之96-孔板，以容許每次處理使用三份樣本。於24h後，利用50μl抗體(4X濃度)處理細胞24h(未經處理之對照組：50μl培養基)。
細胞死亡偵測ELISA：(Roche Applied Science目錄號11774 425 001)：程序確切地遵循如製造商協定中所規定。從持續10分鐘之每分鐘於405nm下之吸光度測量值(減去490nm下之參照波長值)外推得V最大值。自所有樣本減去三次重複背景值(僅裂解緩衝液)之平均值。數據以增加超出未經處理樣本中細胞凋亡之倍率表示。
圖43顯示在如由DNA斷裂檢測之共培養檢定中於DLD-1及H460腫瘤細胞株中藉由2+2雙特異性建構之細胞凋亡誘導。雖然包含卓西 單抗作為DR5-結合組分之雙特異性建構已於不存在FAP情況下誘導細胞凋亡，但包含藉由免疫衍生之新穎DR5結合物之所有建構僅可在FAP的存在下誘導細胞凋亡。具有諸如0011-28H1及0016-28H1之新開發DR5結合物之建構相較於含卓西單抗雙特異性建構可尤其於低濃度下誘導細胞凋亡至較高程度。
實例30：呈2+2雙特異性形式之藉由免疫及噬菌體展示衍生之DR5-結合物之細胞結合之特徵分析
於冰上利用24μg/ml之每種含於染色緩衝液(PBS+5% FCS)中之DR5-FAP建構或卓西單抗將細胞染色(5×104/50μl)1h。於洗滌兩次之後，以10μg/ml添加二級抗體山羊抗人類IgG-AF488(Invitrogen #A11013)及再次於經保護免受直接光影響之冰上將細胞培養1h。於另兩個洗滌步驟之後，於FACS Canto下測量細胞。
所有經測試建構顯示以不同強度與MDA-MB-231結合(參見圖44)。
實例31：藉由免疫衍生之DR5抗體之VH及VL域之人類化
使用與人類生殖系序列相同之架構將兔DR5-結合抗體DR5TAA-0011人類化。人類生殖系序列hVH_3_64(GenBank登錄號M99682)及hVH3_16(GenBank登錄號P01767)為2個用於VH人類化變型之受體及人類生殖系序列hVK1_93(登錄號P04431)及hVK1_5(GeneBank登錄號P01602)為用於VL人類化之受體。獲得八種包含選自SEQ ID NO.23及26之重鏈可變區建構、及選自SEQ ID NO 24、29、30、31、及32之輕鏈可變區建構之人類化DR5抗體及進一步進行特徵分析(實例27至29)。
實例32：藉由免疫衍生之人類化DR5-結合物之功能特徵分析
藉由於存在或不存在交聯抗體下經人類化抗-DR5抗體處理後評估如藉由細胞死亡偵測ELISA(CDDE，Roche #11 774 425 001)所測得之細胞凋亡來對人類化DR5抗體進行功能特徵分析。
細胞之製備：於經補充10%胎牛血清(Gibco)及2mM L-麩醯胺酸(PAA)之DMEM培養基(PAN)中生長附著MDA-MB-231細胞株(人乳腺癌)，及通常每週裂解兩次(1：10)。對於該檢測，利用PBS洗滌細胞，藉由Accutase(PAA)從燒瓶脫離，以1×104個細胞/孔(CDDE)(含於50μl中)接種於96-孔平底微量滴定板(Costar)中及於37℃、5% CO2下培養過夜。
藉由人類化抗-DR5抗體誘導細胞凋亡：以不同濃度單獨地或連同含於PBS中之交聯抗體(山羊抗人類IgG，Sigma #I2136)(1：1比，含於50μl中)一起將樣本(人類化抗-DR5 IgG，DR5-TAA-#)添加至該等細胞，以引起DR5受體之交聯而導致細胞凋亡。於37℃下培養細胞24 h(CDDE)。
細胞死亡偵測Elisa(CDDE)：依照製造商使用說明(Roche)進行免疫測定。簡言之，小心地吸清上清液及於RT下利用200μl/孔裂解緩衝液裂解細胞30分鐘。依照製造商使用說明製備由抗組蛋白及抗-DNA抗體組成之主混合物及於96-孔鏈黴親和素塗覆平底微量滴定板(Roche)上與經1：4稀釋之裂解物混合。於RT下培養2小時後，洗滌孔，添加ABTS受質及於RT下培養直到達成足夠用於光度分析之顯色(10至30min)。利用Tecan Spectra Rainbow讀取器讀取於405nm下之吸光度。針對在2μg/ml濃度下之嵌合抗-DR5抗體之細胞凋亡將細胞凋亡信號標準化。
結果顯示於圖45中：A DR5TAA-0011之人類化變型(DR5TAA-0066-DR5TAA-0075，黑色線)在經二級抗體交聯後以劑量相依方式誘導細胞凋亡。相較於嵌合變型(DR5TAA-0052，灰色線)，諸如DR5TAA-0067、DR5TAA-0071、DR5TAA-0074及DR5TAA-0075之若干種人類化變型可以類似的關於最大化誘導及劑量相依之方式誘導細胞凋亡。B DR5TAA-0011之人類化變型(DR5TAA-0066-DR5TAA-0075)若不經二級抗體交聯則不誘導細胞凋亡。因此，該等人類化變型亦適用於雙特異性形式中以僅在FAP的存在下特異性地誘導細胞凋亡。
所選人類化變型之Fab係在C-端經(G4S)4連接物與人類Fc區融合。該等分子係瞬時地產生於HEK293 EBNA細胞中，透過蛋白質A珠粒純化及於細胞凋亡誘導檢測中進行測試。於圖22 b)中，概述利用該等Fc-DR5融合分子於經二級抗Fc IgG交聯後在MDA-MB-231細胞中之DNA斷裂檢測之結果。所有經測試分子均可誘導標靶細胞株之細胞凋亡，指示所選擇的DR5結合物不在N-端阻斷，此展現較寬廣範圍之可併與該等結合物使用之形式。
實例33：藉由免疫衍生之人類化DR5-結合物之結合親和力之特徵分析
藉由SPR分析定性人類化DR5-結合物之結合親和力。BIAcore特徵分析：使用系統中安裝有CM5感測器之BIAcore 3000儀器(GE Healthcare)。該感測器係藉由以100μl/min注入0.1% SDS、50mM NaOH、10mM HCl及100mM H3PO4持續1min來預處理。系統緩衝液為10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.05%吐溫20。樣本緩衝液為經補充1mg/mL羧甲基聚葡萄糖(Sigma)之系統緩衝液。抗人類抗體捕獲系統係建立於生物感測器表面上。依照製造商使用說明利用EDC/NHS化學法來固定8000個相對響應單位之山羊抗人類Fcγ片段-特異性多株抗體(Jackson Laboratories)。使用1M乙醇胺來減活化感測器。
以10μl/min流速捕獲20nM各別抗體樣本持續1min。作為參照，將20nM多株人類正常IgG(Roche，識別號11717570)捕獲於參照流動細胞1上及監測減性信號。
於一個實施例中，於30μl/min下以0nM、3.3nM、11nM、2×33nM、100nM及300nM之濃度系列注入23.3kDa分析物DR5持續3min的締合時間。監測複合物解離5min。
以30μl/min藉由1min的10mM甘胺酸緩衝液pH 1.5之注入接著連續兩次1min的10mM甘胺酸緩衝液pH 1.7之注入來將系統再生。使用Biacore評估軟體依照製造商使用說明來評估動力學參數。
依照具有總體R最大之Langmuir模型計算得締合速率常數ka(1/Ms)、解離速率常數k d (1/s)及解離常數KD。
表25：DR5TAA-0011之人類化變型(DR5TAA-0067至DR5TAA-0075)相較於DR5TAA-0011之嵌合形式(DR5TAA-0052)針對單體人類
人類化變型之動力學結合性質相較於嵌合變型就KD及kd而言維持在約3的倍數內及就ka而言維持在約2的倍數內。
實例34：藉由免疫衍生之人類化DR5-結合物之熱及化學穩定性之特徵分析
人類化DR5-結合物針對其熱及化學穩定性進行特徵分析。以1mg/mL濃度在20mM組胺酸/組胺酸氯化物、140mM NaCl(pH 6.0)中製備樣本，藉由離心通過0.4μm過濾板轉移至光學384-孔板中及經石蠟油覆蓋。重複地藉由動態光散射測量流體動力半徑，同時以0.05℃/min速率將樣本從25℃加熱至80℃。初始聚集溫度係經定義為流體動力半徑開始增加時之溫度。
DR5TAA-0011之人類化變型顯示聚集溫度為68℃及更高之高熱穩定性。
化學穩定性
逆境DR5抗體樣本之產生：為測試DR5抗體之化學穩定性，產生逆境樣本及針對DR5結合進行功能定性。高-pH逆境尤其引起反應性Asn熱點之脫醯胺，而(例如)於pH 6.0下，可引起自反應性Asn及Asp殘基之琥珀醯亞胺形成。對於高-pH逆境，將樣本轉移至20mM Na-磷酸鹽pH 8.0中及於40℃下培養5天。對於低-pH逆境，將樣本轉移至20mM His/HisCl、140mM NaCl(pH 6.0)中及於40℃下培養3週。將對照組樣本維持於-80℃。
逆境DR5抗體樣本之分析：使用系統中安裝有CM5感測器之BIAcore 3000儀器(GE Healthcare)。該感測器係藉由以100μl/min注入0.1% SDS、50mM NaOH、10mM HCl及100mM H3PO4持續1min來預處理。系統緩衝液為10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.05%吐溫20。樣本緩衝液為經補充1mg/mL羧甲基聚葡萄糖(Sigma)之系統緩衝液。抗人類抗體捕獲系統係建立於生物感測器表面上。依照製造商使用說明利用EDC/NHS化學法來固定8000個相對響應單位之山羊抗人類Fcγ片段-特異性多株抗體(Jackson Laboratories)。使用1M乙醇胺使感測器減活化。
以10μl/min流速捕獲20nM各別抗體樣本持續1min。作為參照，將20nM多株人類正常IgG(Roche，識別號11717570)捕獲於參照流動細胞1上及監測減性信號。
於另一個實施例中，於100μl/min下以0nM及500nM注入分析物持續2min的締合時間。監測複合物解離5min。
以30μl/min藉由1min的10mM甘胺酸緩衝液pH 1.5之注入接著連續兩次1min的10mM甘胺酸緩衝液pH 1.7之注入來再生系統。利用Biacore評估軟體依照製造商使用說明來評估動力學參數。
根據公式ln(2)/(60*kd)計算得抗體/抗原複合物半衰期(單位分鐘)。計算得莫耳比：MW(抗體)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗體)。
緊接於抗體注入結束之前(抗體捕獲水平，CL)以及緊接於分析物注入之前(結合晚期，BL)記錄數據報告點。使用捕獲水平(CL)及結合晚期(BL)響應信號高度來定性抗體結合性能。計算相對結合商數BL/CL。自抗體樣本相對不受逆境影響之抗體樣本之相對結合商數(相對活性結合)形成商數。
結果顯示於表27中。使DR5TAA-0011之人類化變型進行逆境測試。該等人類化變型中無一者顯示相較於非逆境初始物質減損之與人類DR5之結合。
實例35：材料與方法
除非另外提及，否則上述實驗中使用下述材料及方法。
重組DNA技術
利用如Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述之標準重組DNA技術產生所有抗體及抗原表現載體。按照製造商的建議使用分子生物試劑。基因或基因片段係藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增，或係在Geneart AG(德國雷根斯堡(Regensburg))藉由自動化基因合成自合成寡核苷酸產生。由DNA定序(Synergene GmbH，瑞士)確認經PCR擴增或經次選殖之DNA片段。質體DNA係於適宜大腸桿菌宿主菌株中轉化及擴增，以供使用標準Maxiprep套組(Qiagen)來製備轉染級質體DNA。為製備雙特異性分子，利用標準基於聚乙烯亞胺(PEI)之方法以編碼各別基因之質體轉染HEK293 EBNA細胞。所使用的三種表現載體之質體比為1：1：1。在收穫上清液以進行純化之前，將經轉染之細胞培養7天。
轉染HEK293 EBNA細胞
用於本文中之所有(雙特異性)抗體及抗原(若非從商業來源獲得)係利用下述針對所需載體之PEI介導轉染程序瞬時地產生於HEK 293 EBNA細胞中。
將HEK293-EBNA細胞培養於懸浮無血清CD CHO培養基中。關於製備，在轉染前24小時將400百萬個HEK293-EBNA細胞接種於500ml搖瓶中。關於轉染，以210×g離心細胞5min，以經預熱的20ml CD CHO培養基置換上清液。將表現載體混合於20ml CD CHO培養基中 至最終量200μg DNA。於添加540μl後，PEI溶液渦轉15s及隨後在室溫培育10min。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，移至500ml搖瓶，及在具有5% CO2氛圍之培育箱中以37℃培育3小時。於該培育時間後，添加160ml F17培養基及培育細胞24小時。在轉染後一天，添加1mM丙戊酸(valporic acid)與7% Feed 1。於7天培養後，收集上清液以210×g離心15min純化，溶液係經無菌過濾(0.22μm過濾器)，及添加疊氮化鈉至最終濃度0.01% w/v，及維持在4℃。於產生之後，收穫上清液，及將含抗體之上清液經0.22μm無菌過濾器過濾及儲藏於4℃直到純化。
純化：標準+ProtA珠粒
由在HEK293 EBNA細胞中瞬時表現產生蛋白質。本文所述之所有雙特異性分子係以兩個步驟利用諸如蛋白質A親和層析(Äkta Explorer)及尺寸篩除層析(Superdex 200)之標準程序純化。
將上清液調整至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)及施用於填充在經緩衝液A(50mM磷酸鈉，pH 7.0，250mM NaCl)平衡之TricornTM 5/50管柱(GE Healthcare，管柱體積(cv)=1ml)中之Mabselect Sure樹脂(GE Healthcare)。藉由利用至少5個管柱體積(CV)的緩衝液A洗滌來移除非結合蛋白質。相關蛋白質以線性pH梯度從0至100%緩衝液B(50mM磷酸鈉，pH 7.0，1M NaCl)經12個CV洗脫。最終，包括利用10個CV的緩衝液B之另一步驟，接著係5個CV緩衝液A之平衡步驟。匯集包含相關蛋白質之部分及逐漸地調整pH至pH 6.0(使用2M TRIS pH 8.0)。使用超級濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY，Sartorius)將樣本濃縮為0.5至2ml，及隨後施用於經20mM組胺酸pH 6.0、140mM NaCl、0.01%吐溫-20平衡之HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200製備級管柱(GE Healthcare)。使用經在25℃下於25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3(pH 6.7)中平衡之 TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸篩除管柱(Tosoh)來分析經洗脫部分之聚集物含量。匯集包含少於2%寡聚物之部分及使用超級濃縮器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY，Sartorius)濃縮至1至1.5mg/ml之最終濃度。將經純化之蛋白質冷凍於液態N2中並儲藏於-80℃。
對於快速且高通量之純化，使用1/40管柱之2M Tris-HCl pH8中和上清液及於4℃下底蓋翻轉地與蛋白質A Sepharose快速流動珠粒(GE Healthcare目錄號17-5138-01))培養19h。上清液/珠粒混合物接著藉由重力流動通過空的經平衡PD-10管柱(GE Healthcare目錄號17-0435-01)上。利用結合緩衝液(10mM Tris，50mM甘胺酸，100mM NaCl，pH 8.0)將滯留珠粒洗滌兩次及利用低pH步驟(10mM Tris、50mM甘胺酸、100mM NaCl，pH2.5)洗脫抗體。最終，藉由添加1/40體積之2M Tris-HCl pH8.0來中和經洗脫之蛋白質。自280nm下之吸光度測量值計算得經純化抗體之蛋白質濃度及自胺基酸序列計算得莫耳消光係數。使用經在25℃下於操作緩衝液(200mM磷酸鈉、0.02%疊氮化鈉，pH 7.0)中平衡之Zorbax GF-250分析型尺寸篩除管柱(Agilent目錄號PSMO 845006)分析抗體樣本之聚集物含量。
FACS結合分析
在進行細胞凋亡檢測之前分析所使用的所有標靶細胞株中腫瘤相關抗原及DR5死亡受體之相對表現水平。
測量細胞之數目及存活力。為此，藉由細胞解離緩衝液(Gibco-Invitrogen # 13151-014)剝離附著生長細胞。藉由離心(4min，400×g)收穫細胞，利用FACS緩衝液(PBS/0.1% BSA)洗滌及將細胞數目調整為1.111×106個細胞/ml含於FACS緩衝液中。對96孔圓底板之每個孔使用180μl之此細胞懸浮液，獲致2×105個細胞/孔。於4℃下利用第一抗體之適宜稀釋液培養該等細胞30min。接著；藉由離心(4min，400×g)收穫該等細胞，完全移去上清液及利用150μl FACS緩衝液洗滌該 等細胞一次。於4℃下在黑暗中將該等細胞再懸浮於12μl經稀釋之二級抗體(在使用未經標記之第一抗體的情況)或FACS緩衝液中持續30min。於兩個利用FACS緩衝液之洗滌步驟後，將細胞再懸浮於200μl FACS緩衝液中及於HTS FACSCanto II(BD，Software FACS Diva)中分析。或者，可於4℃下利用含於FACS緩衝液中之200μl 2% PFA(多聚甲醛)固定該等細胞20min及在稍後進行分析。所有檢測係重複進行三次。
Biacore分析(表面電漿共振，SPR)
藉由表面電漿共振(SPR)評估呈IgG或呈雙特異性形式之各種抗-DR5結合物之結合。所有SPR實驗係於25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%表面活性劑P20，Biacore，弗萊堡(Freiburg)/德國)在Biacore T100上進行。
為確定DR5結合物之物種交叉反應性，使來自小鼠、人類及馬來猴之生物素化DR5直接耦合至鏈黴親和素(SA)感測器晶片之各自具有約300 RU固定程度之不同流動細胞。以30μl/min流速於500、100及25nM濃度下注入呈IgG之各種DR5結合物持續60s，接著經過90s的解離期。藉由減去於未固定蛋白質之參照流動細胞上獲得之響應來校正整體折射率差。
於第二實驗中，藉由經胺偶聯使人類DR4Fc、人類DcR1Fc、人類DcR2Fc及重組人OPGFc固定至CM5感測器晶片來確定DR5結合物之特異性。固定程度介於100與400 RU之間。使各結合物以30μl/min流速於500、100及25nM濃度下通過不同流動細胞之上持續60s及監測解離期90s。藉由減去於未固定蛋白質之參照流動細胞上獲得之響應來校正整體折射率差。
此外，於固定有人類及馬來猴DR5 ECD(固定程度為約100 RU)之 CM5晶片上測定IgG以及2+2形式之結合性。各建構或IgG在1：2稀釋步驟中於介於500至0.97nM間之濃度下以30μl/min通過不同流動細胞之上持續90s。分析解離120s。藉由減去於未固定蛋白質之參照流動細胞上獲得之響應來校正整體折射率差。利用Biacore T100評估軟體(vAA，Biacore AB，烏普薩拉(Uppsala)/瑞典)，以藉由數值積分法以動力學分析或穩態分析中任一者擬合針對1：1 Langmuir結合之速率方程式，來計算得動力學常數。
採用其中抗人類Fab或抗人類Fc抗體(Biacore，弗萊堡/德國)中任一者係於pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(Biacore，弗萊堡/德國)直接耦合於CM5晶片上之捕獲形式來評估親和力。固定程度為約8,000至10000 RU。呈IgG或2+2形式之DR5結合物係分別於50或30nM濃度下以30μl/min流速捕獲60s。對於2+2形式，實施於1：2稀釋步驟中在500至0.975nM(馬來猴DR5)或1000至0.975nM(人類DR5)之濃度範圍內以30μl/min注入人類或馬來猴DR5持續120s。對於人類DR5，僅在1：3稀釋步驟中於2000至20nM濃度下測定IgG之親和力。在120s時段內評估解離。藉由減去於未固定蛋白質之參照流動細胞上獲得之響應來校正整體折射率差。利用Biacore T100評估軟體(vAA，Biacore AB，烏普薩拉/瑞典)，以藉由數值積分法以動力學分析或穩態分析中任一者擬合針對1：1 Langmuir結合之速率方程式，來計算得動力學常數。
在兩種不同形式中利用傳統的夾層檢定或利用串接方法測量抗原決定基表位框并。於傳統的夾層檢定中，各DR5結合物係藉由胺偶聯以約500 RU之標靶固定程度直接固定至CM5晶片表面上之一個流動細胞。隨後，使人類DR5於500nM之濃度下通過各流動細胞之上持續60s(流速30μl/min)，接著於30nM之濃度下注入另一種DR5結合物持續60s(流速30μl/min)。在60s的時段內於相同流速下監測解離。使用注入與經固定者相同的DR5結合物作為對照組，因為若所有DR5係藉 由固定結合物結合，則應不會導致響應增加。
於串接方法中，將人類DR5ECD以250 RU之最終響應固定於CM5晶片上。第一DR5結合物接著於20nM之濃度下通過流動細胞之上持續90s，接著注入第二DR5結合物持續90s。在90s的時段內監測解離。對於所有步驟，流速為30μl/min。若兩種結合物識別一不同抗原決定基，則可觀測到響應單位之增加。使用相同DR5結合物之注入作為對照組，以確認所有DR5分子皆經第一次注入飽和及不可發生與相同抗原決定基之額外結合。
為進一步確定是否任何結合物為配體阻斷，藉由胺偶聯以2000 RU之固定程度將重組人類TRAIL(Peprotech目錄號310-04)固定於CM5晶片上。人類DR5 Fc或人類DR5 ECD與欲測試之各DR5結合物複合(具有500nM IgG之100nM DR5)及使該複合物以50μl/min流速通過流動細胞之上持續90s。在120s的時段內評估解離。此外，採用傳統的夾層檢定，其中先於100nM下注入人類DR5Fc或人類DR5 ECD，接著於500nM下注入各DR5結合物。對於30μl/min之流速，針對DR5之接觸時間為60s及針對IgG為90s。進行90s的解離步驟。除DR5之外可與TRAIL結合之結合物被視為是非配體阻斷，而不顯示任何額外結合之結合物被視為是配體阻斷。
在包含經固定人類DR5Fc生物素(固定程度為約1000 RU)之SA晶片上確認呈2+2形式之各種DR5結合物之同時結合。於第一步驟中，注入2+2建構持續90s，接著於500或100nM之濃度下注入人類或鼠科FAP中任一者持續90s。監測解離持續60s。對於所有步驟，流速為30μl/min。若於注入人類或鼠科FAP後觀察到響應單位之額外增加，則同時結合被認為係確定的。
在兩種不同形式中利用傳統的夾層檢定或利用串接方法測定抗原決定基表位框并。於傳統的夾層檢定中，各DR5結合物藉由胺偶聯 以約500 RU之標靶固定程度直接固定至CM5晶片表面上之一個流動細胞。接著，使人類DR5於500nM之濃度下通過各流動細胞之上持續60s(流速30μl/min)，接著於30nM之濃度下注入另一種DR5結合物持續60s(流速30μl/min)。在60s的時段內利用相同流速來監測解離。使用注入與經固定者相同的DR5結合物作為對照組，因為若所有DR5係藉由固定結合物結合，則此應不會導致響應增加。
於串接方法中，以250 RU之最終響應將人類DR5ECD固定於CM5晶片上。第一DR5結合物接著於20nM之濃度下通過流動細胞之上持續90s，接著注入第二DR5結合物持續90s。在90s的時段內監測解離。對於所有步驟，流速為30μl/min。若兩種結合物識別一不同抗原決定基，則可觀察到響應單位之增加。使用相同DR5結合物之注入作為對照組，以確認所有DR5分子係經第一次注入飽和及不可發生與相同抗原決定基之額外結合。
為進一步確定是否任何結合物為配體阻斷，藉由胺偶聯以2000 RU之固定程度將重組人類TRAIL(Peprotech目錄號310-04)固定於CM5晶片上。人類DR5 Fc或人類DR5 ECD與欲測試之各DR5結合物複合(具有500nM IgG之100nM DR5)及使該複合物以50μl/min流速通過流動細胞之上持續90s。在120s的時段內評估解離。此外，採用傳統的夾層檢定，其中先於100nM下注入人類DR5Fc或人類DR5 ECD接著於500nM下注入各DR5結合物。對於30μl/min之流速，針對DR5之接觸時間為60s及針對IgG為90s。進行90s的解離步驟。除DR5之外可與TRAIL結合之結合物被視為是非配體阻斷，而不顯示任何額外結合之結合物被視為是配體阻斷。
在包含經固定人類DR5Fc生物素(固定程度為約1000 RU)之SA晶片上確認呈2+2形式之各種DR5結合物之同時結合。於第一步驟中，注入2+2建構持續90s，接著於500或100nM之濃度下注入人類或鼠科 FAP中任一者持續90s。監測解離持續60s。對於所有步驟，流速為30μl/min。若於注入人類或鼠科FAP後觀察到響應單位之額外增加，則同時結合被認為是確定的。
DNA斷裂ELISA
使用來自Roche之細胞死亡偵測ELISAPLUS套組以測定經誘導之細胞凋亡。簡言之，對96-孔板之每個孔將104個FAP表現GM05389細胞(於剝離、及測定細胞數目及存活力之後)接種於200μl適宜培養基中及於37℃下在5% CO2氛圍中培養過夜。第二天，以100μl新製的以適宜濃度包含細胞凋亡誘導抗體、對照組抗體及其他對照組之培養基置換該培養基。
雙特異性抗體及IgG係以0.7及7nM或如所示之最終濃度使用；交聯抗體係以與一級抗體相同的莫耳濃度使用。於添加抗體後，每孔添加104個對細胞凋亡敏感的腫瘤細胞。
於37℃、5% CO2下培養該等細胞24h以容許誘導細胞凋亡。藉由離心(10min，200×g)收穫該等細胞及於室溫下在200μl裂解緩衝液(由套組供應)中培養1h。藉由離心(10min，200×g)使完整DNA及經裂解之細胞沉降及依照製造商的建議分析包含斷裂DNA之20μl上清液之細胞凋亡誘導。
增生之抑制(CellTiterGlo)
對於細胞存活力檢定，將4,000個腫瘤細胞/孔(含於75μl體積中)接種於黑色透明底部96孔板(BD Falcon cat#BD353220)中及於37℃下在增濕5% CO2氛圍中培養過夜。接著添加具有2.5×連續稀釋之6種濃度之25μl 4×DR5結合物加上/減去兔-Fc(等奈莫耳之DR5結合物及Fc)。於在37℃與5% CO2下培養48小時後，將100μl CellTiter-Glo試劑添加至各孔及均勻混合。於在室溫下再培養10分鐘後，利用Spectra Max M5分析盤讀取器於發光設置下測定細胞存活力。
卡斯蛋白酶8(卡斯蛋白酶Glo)之誘導
對於卡斯蛋白酶8活化檢測，將10,000個癌細胞/孔(含於75μl中)接種於不透光白色96孔板(BD Falcon cat#BD353296)中及於37℃下在具有5% CO2之增濕培養箱中培養過夜。接著，添加具有2.5×連續稀釋之6種濃度之25μl 4×DR5結合物加上/減去抗-Fc(等莫耳比之DR5結合物及抗Fc)。於在37℃與5% CO2下3小時的培養後，將含於裂解緩衝液中之100μl卡斯蛋白酶8受質添加至各孔。另於37℃下培養30分鐘後，在Spectra Max M5分析盤讀取器中於發光設置下讀取結果。
FRET分析
利用時間解析螢光共振能量轉移(TR-FRET)分析(稱為TagLite)測定雙特異性分子於細胞上之結合。生長Hek EBNA細胞至60至80%融合度及利用編碼與SNAP Tag及MalE TM融合之DR5 ECD之質體DNA轉染。簡言之，將2μg DNA與4ml OptiMEM培養基及30μl Lipofectamine 2000(Invitrogen目錄號11668-019)混合。於RT下將該混合物培養20min。同時，在添加轉染混合物及培養基(6ml)(DMEM、10% FCS、麩丙胺酸二肽(glutamax)、非必需胺基酸)之前先用5ml D-PBS洗滌生長於T75燒瓶中之附著Hek EBNA細胞。接著在增濕培養箱(5% CO2)中於37℃下將該等細胞培養過夜。利用5ml D-PBS洗滌細胞，接著添加包含100nM SNAP-Lumi4-Tb(Cisbio目錄號)之5ml TagLite緩衝液(Cisbio目錄號)之混合物。此導致螢光染料附著至與DR5融合之SNAP標籤。於37℃下經過1h的培養時間後，利用TagLite緩衝液洗滌該等細胞以移除未結合的染料。隨後，藉由測量384孔形式(Reader，Victor，Perkin Elmer)中10000個細胞於620nm(在343nm下激發)下之螢光信號來校驗標記效率。接著將細胞冷凍於經10% DMSO取代之培養基中及儲藏於-80℃。
為進行結合檢測，將預先經標記之細胞解凍，洗滌及將1000個 細胞/孔與最終濃度範圍自50至0.097nM(1：2稀釋步驟)之5μl建構及經標記之5μl抗-huFc-d2(最終濃度150nM)混合。於在RT下培養0h、1h及3h後，針對螢光供體(鋱)在620nm下及針對螢光受體染料在665nm下測定螢光信號。計算得665/620*1000之比，及減去參照(具有150nM抗-huFc-d2之細胞)。對於KD測定，以具有一位點擬合-特異性結合之Graph Pad Prism來分析該等結果。
藉由動態光散射(DLS)測定熱穩定性
藉由動態光散射(DLS)監測蛋白質之熱穩定性。將具有1mg/ml蛋白質濃度之30μg經過濾蛋白質樣本一式兩份地施用至Dynapro分析盤讀取器(Wyatt Technology Corporation；USA)。溫度以0.05℃/min從25漸增至75℃，收集半徑及總散射強度。
實例36：包含新單離的DR5結合物5E11與28H1 FAP CrossFab組合之DR5-FAP雙特異性抗體的活體內抗腫瘤效力
在移植於裸小鼠上之各種腫瘤來源(例如CRC及胰癌)之基於細胞及片段之患者衍生(PDX)模型中展示雙特異性抗體DR5-FAP(VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8)之活體內抗腫瘤效力。作為實例，展示CRC異種移植模型DLD-1(基於細胞株，共同注射模型)及Co5896(基於片段)之數據。
測試試劑
雙特異性抗體DR5-FAP(DR5結合物：VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)係以來自Roche(德國潘茨堡(Penzberg))之儲備溶液提供。抗體緩衝液包含組胺酸。抗體溶液係在注入之前自儲備溶液適宜地稀釋於緩衝液中。
細胞株及培養條件
DLD-1人類CRC細胞最初係自ATCC獲得。腫瘤細胞株慣常地於37℃下於水飽和的5% CO2氛圍中在經補充10%胎牛血清、2.0mM L-麩醯胺酸、10mM HEPES之具有1.0mM丙酮酸鈉之DMEM高葡萄糖培養基中培養。每隔兩天利用胰蛋白酶/EDTA 1×裂解進行繼代培養。另外，鼠科纖維母細胞NIH3T3係購自ATCC及在具有1.0mM丙酮酸鈉、FCS 10%及L-麩醯胺酸2.0mM之DMEM高葡萄糖中培養。
患者衍生之異種移植模型(PDX)
CRC腫瘤異種移植Co5896最初係自患者獲得繼而繼代培養約三至五次直到建立穩定生長模式。對於後續之活體內研究，自裸小鼠中連續繼代之異種移植獲得Co5896腫瘤片段。在從供體小鼠移除之 後，將腫瘤切成片段(4至5mm直徑)及放入PBS中直到進行皮下植入。經異氟烷(isofluorane)麻醉的小鼠在側腹接受單側皮下腫瘤植入物。
動物
裸小鼠係購自繁殖商(例如，Charles River，德國蘇爾茨費爾德(Sulzfeld))及根據規定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)飼養於具有每日12h照明/12h黑暗週期之無特殊病原體條件下。實驗研究方案係經地方政府審查及核准。於到達之後，將動物飼養於動物施設之檢疫站一週以習慣於新環境及供觀察。定期地進行連續健康監測。隨意提供膳食(Provimi Kliba 3337)及飲水(酸化pH 2.5至3)。
監測
每天控制動物的臨床症狀及偵測不良效應。對於監測，於整個實驗過程中記錄動物的體重。
動物之治療
在動物隨機分組後在細胞或片段移植後當腫瘤尺寸中位數為約100至200mm3時開始動物之治療。抗體係作為單一藥劑每週以10或30mg/kg i.v.投與一或兩次持續數週(取決於投藥模式)。於同一天投與對應的媒劑。
抗體療效
基於DLD-1 CRC共同注射細胞株之異種移植模型
從研究的第9至第20天以10及1.0mg/kg之劑量(分4次)利用雙特異性抗體DR5-FAP(DR5結合物：VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)來治療帶有DLD-1 CRC異種移植物之小鼠。結果，利用雙特異性抗體DR5-FAP(DR5結合物：VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)之治療顯示與劑量相關 之顯著抗腫瘤效力及針對於s.c.DLD-1異種移植物之強力抗腫瘤效力。分別計算得腫瘤生長抑制(TGI)為89%(10mg/kg)及79%(1.0mg/kg)。相對地，於利用DR5 Fc突變抗體卓西單抗PG、LALA(10mg/kg，每週一次)治療之後，未觀測到抗腫瘤效力(參見圖48)。利用高FAP含量(與DLD-1/NIH3T3纖維母細胞共同注射之研究；比值80/20，圖48)及低FAP含量(與DLD-1/MRC5纖維母細胞共同注射之研究；比值30/70，數據未顯示)獲得類似的結果。
基於Co5896 CRC片段之患者衍生之異種移植模型(PDX)
從研究的第18至第34天以30mg/kg之劑量(分6次)利用雙特異性抗體DR5-FAP(DR5結合物：VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)來治療帶有Co5896 CRC異種移植物之小鼠。結果，利用雙特異性抗體DR5-FAP(DR5結合物：VH SEQ ID NO.：7、VL SEQ ID NO.：8，FAP結合物：VH SEQ ID NO.：15、VL SEQ ID NO.：16)之治療顯示顯著的抗腫瘤效力與針對於s.c.Co5896患者衍生之異種移植物之強力抗腫瘤效力。計算得腫瘤生長抑制(TGI)為76%(參見圖49)。於其他CRC細胞模型中獲得類似的結果(數據未顯示)。
實例36：人腫瘤中之FAP盛行率
藉由IHC評估人腫瘤中FAP之盛行率以明瞭雙特異性DR5-FAP抗體之可能的臨床用途。
使用大鼠抗人類Seprase抗體(IgG2a，純系D8)(來自Vitatex)(MABS1001)來於Ventana Benchmark XT上免疫染色來自多種腫瘤適應症之2.5μm FFPET段。使該等段接受標準CC1處理，接著於37℃下以5μg/mL之濃度在Dako抗體稀釋劑(S3022)中進行抗體培養60'及利用Ultraview DAB偵測系統(Ventana #760-4456)偵測陽性染色。使用匹配的同型抗體(來自Abcam)(ab18450)作為陰性對照組。
於包括以下不同適應症之人腫瘤中存在FAP+基質浸潤：頭部及頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、乳癌、結腸直腸癌(CRC)、胰癌(PAC)、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及間皮瘤，對於雙特異性DR5-FAP抗體而言，潛在性地辨識受關注的臨床適應症(表30)。
序列
1.噬菌體展示衍生的DR5結合物之胺基酸序列
2.非功能性噬菌體展示衍生的DR5結合物之胺基酸序列
(CDRH1=SEQ ID NO.：1，CDRH2=SEQ ID NO.：2，CDRL1=SEQ ID NO：4及CDRL2=SEQ ID NO.：5)
3.FAP結合物之胺基酸序列
4.包含習知DR5結合物之雙特異性分子之胺基酸序列
5.包含噬菌體展示衍生的DR5結合物之雙特異性分子之胺基酸序列
6.Fc結構域及恆定輕鏈之胺基酸序列
7.衍生自兔之免疫之DR5結合物之胺基酸序列
純系DR5TAA-0005(別名：純系039)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：41)
CH1-3
(SEQ ID NO.： 42)
CDR1=sayms(SEQ ID NO.：43)
CDR2=yiysgsgstwyaswvkg(SEQ ID NO.：44)
CDR3=gystmgdl(SEQ ID NO.：45)
輕鏈
VL
(SEQ ID NO.：46) Cκ
(SEQ ID NO.：47)
CDR1=qasqsvynnrla(SEQ ID NO.：48)
CDR2=lastlas(SEQ ID NO.：49)
CDR3=aggysgnina(SEQ ID NO.：50)
純系DR5TAA-0006(別名：純系058)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：51)
CH1-3
(SEQ ID NO.：42)
CDR1=snhms(SEQ ID NO.：52)
CDR2=yiyagsgsayyaswakg(SEQ ID NO.：53)
CDR3=dagssywefnl(SEQ ID NO.：54)
輕鏈
VL
(SEQ ID NO.：55)
Cκ
(SEQ ID NO.：56)
CDR1=qasqsigssls(SEQ ID NO.：57)
CDR2=hastlas(SEQ ID NO.：58)
CDR3=lgvadarrddgfa(SEQ ID NO.：59)
純系DR5TAA-0010(別名：純系481)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：60)
CH1-3
(SEQ ID NO.：42)
CDR1=snais(SEQ ID NO.：61)
CDR2=iigssgytyyaswakg(SEQ ID NO.：62)
CDR3=gysgasdysfnl(SEQ ID NO.：63)
輕鏈
VL
(SEQ ID NO.：64)
Cκ
(SEQ ID NO.：47)
CDR1=qasqtigdala(SEQ ID NO.：65)
CDR2=rtstlas(SEQ ID NO.：66)
CDR3=qqgatynnvlnt(SEQ ID NO.：67)
純系DR5TAA-0013(別名：純系298)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：68)
CH1-3
(SEQ ID NO.：42)
CDR1=syhms(SEQ ID NO.：69)
CDR2=yiyagsastwyaswvkg(SEQ ID NO.：70)
CDR3=dagssywefnl(SEQ ID NO.：54)
輕鏈
VL
(SEQ ID NO.：71)
Cκ
(SEQ ID NO.：47)
CDR1=qasqsigssls(SEQ ID NO.：57)
CDR2=tasslas(SEQ ID NO.：72)
CDR3=lgiddvrrddgfa(SEQ ID NO.：73)
純系DR5TAA-0019(別名：純系461)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：74)
CH1-3
(SEQ ID NO.：42)
CDR1=nyams(SEQ ID NO.：75)
CDR2=iisssgttyyaswakg(SEQ ID NO.：76)
CDR3=etyygysyaagl(SEQ ID NO.：77)
輕鏈
VL
(SEQ ID NO.：78)
Cκ
(SEQ ID NO.：47)
CDR1=qasqniysnla(SEQ ID NO.：79)
CDR2=etsklas(SEQ ID NO.：80)
CDR3=qsswhsistdca(SEQ ID NO.：81)
純系DR5TAA-0016(別名：純系422)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：82)
CH1-3
(SEQ ID NO.：42)
CDR1=nyams(SEQ ID NO.：75)
CDR2=minkygtkyyatwtkg(SEQ ID NO.：83)
CDR3=vryagddyaewldv(SEQ ID NO.：84)
輕鏈
VL
(SEQ ID NO.：85)
Cκ
(SEQ ID NO.：47)
CDR1=qasqsisssyvs(SEQ ID NO.：86)
CDR2=kastlas(SEQ ID NO.：28)
CDR3=lygysdvssseyv(SEQ ID NO.：87)
純系DR5TAA-0011(別名：純系174)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：88)
CH1-3
(SEQ ID NO.：42)
CDR1=ryami(SEQ ID NO.：17)
CDR2=fitsdssayyaswakg(SEQ ID NO.：25)
CDR3=ytysdgtdl(SEQ ID NO.：19)
輕鏈
VL
(SEQ ID NO.：89)
Cκ
(SEQ ID NO.：47)
CDR1=qasqsistyls(SEQ ID NO.：27)
CDR2=kastlas(SEQ ID NO.：28)
CDR3=qpnsgiatygaa(SEQ ID NO.：22)
8.兔Mab DR5TAA-0011之嵌合變型之胺基酸序列
純系DR5TAA-0052(嵌合變型)
重鏈
VH
(SEQ ID NO.：90)
CH1-3
(SEQ ID NO.：91)
CDR1=ryami(SEQ ID NO.：17)
CDR2=fitsdssayyaswakg(SEQ ID NO.：25)
CDR3=ytysdgtdl(SEQ ID NO.：19)
輕鏈
VH
(SEQ ID NO.：92)
Cκ
(SEQ ID NO.：93)
CDR1=qasqsistyls(SEQ ID NO.：27)
CDR2=kastlas(SEQ ID NO.：28)
CDR3=qpnsgiatygaa(SEQ ID NO.：22)
9.兔Mab DR5TAA-0011之人類化變型之序列
人類化變型重鏈
VH7
VH
(SEQ ID NO.： 23)
CH1-3
(SEQ ID NO.：91)
CDR1=ryami(SEQ ID NO.：17)
CDR2=fitsdgstyyadsakg(SEQ ID NO.：18)
CDR3=ytysdgtdl(SEQ ID NO.：19)
VH17
VH
(SEQ ID NO.： 26)
CH1-3
(SEQ ID NO.：91)
CDR1=ryami(SEQ ID NO.：17)
CDR2=fitsdssayyaswakg(SEQ ID NO.：25)
CDR3=ytysdgtdl(SEQ ID NO.：19)
人類化變型輕鏈
VL2
VL
(SEQ ID NO.：32)
Cκ
(SEQ ID NO.：93)
CDR1=rasqsistyls(SEQ ID NO.：20)
CDR2=kasslas(SEQ ID NO.：21)
CDR3=qpnsgiatygaa(SEQ ID NO.：22)
VL3
VL
(SEQ ID NO.：30)
Cκ
(SEQ ID NO.：93)
CDR1=rasqsistyls(SEQ ID NO.：20)
CDR2=kastlas(SEQ ID NO.：28)
CDR3=qpnsgiatygaa(SEQ ID NO.：22)
VL10
VL
(SEQ ID NO.：31)
Cκ
(SEQ ID NO.：93)
CDR1=rasqsistyls(SEQ ID NO.：20)
CDR2=kastlas(SEQ ID NO.：28)
CDR3=qpnsgiatygaa(SEQ ID NO.：22)
VL11
VL
(SEQ ID NO.：29)
Cκ
(SEQ ID NO.：93)
CDR1=qasqsistyls(SEQ ID NO.：27)
CDR2=kastlas(SEQ ID NO.：28)
CDR3=qpnsgiatygaa(SEQ ID NO.：22)
VL15
VL
(SEQ ID NO.：24)
Cκ
(SEQ ID NO.：93)
CDR1=rasqsistyls(SEQ ID NO.：20)
CDR2=kasslas(SEQ ID NO.：21)
CDR3=qpnsgiatygaa(SEQ ID NO.：22)
10.包含兔衍生的DR5結合物之嵌合雙特異性建構之胺基酸序列
建構DR5TAA-0061(包含4B9及DR5TAA-0011之1+1嵌合Crossmab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：280)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：281)
HC(DR5)
(SEQ ID NO.：282)
交叉HC(FAP)
(SEQ ID NO.：283)
建構DR5TAA-0032(包含28H1及DR5TAA-0005之2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：284)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：285)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：286)
建構DR5TAA-0033(包含28H1及DR5TAA-0011之2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：287)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：288)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：289)
建構DR5TAA-0034(包含28H1及DR5TAA-0013之2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：290)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：291)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：292)
建構DR5TAA-0035(包含28H1及DR5TAA-0016之2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：293)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：294)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：295)
建構DR5TAA-0036(包含28H1及DR5TAA-0019之2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：296)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：297)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：298)
11.包含人類化兔衍生的DR5-結合物之雙特異性建構之胺基酸序列
建構DRSTAA-0117(包含28H1及DR5TAA-0067之2+2人類化CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：299)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：300)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：301)
建構DR5TAA-0118(包含28H1及DR5TAA-0071之2+2人類化CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：302)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：303)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：304)
建構DR5TAA-0119(包含28H1及DR5TAA-0075之2+2人類化CrossMab)
LC(DR5)
(SEQ ID NO.：305)
交叉LC(FAP)
(SEQ ID NO.：306)
HC(DR5-交叉FAP)
(SEQ ID NO.：307)
12.人類化兔衍生的DR5-結合物之C-端融合之胺基酸序列
13.DR5結合物之核酸序列及包含其之雙特異性分子
14.DR5序列
15.FAP序列
雖然本文顯示並描述本發明之目前較佳的實施例，但應清楚明瞭本發明並不侷限於此，而係可以其他方式不同地呈現及在隨後申請專利範圍之範疇內實施。
<110> 瑞士商羅齊克雷雅公司
<120> 對FAP及DR5具特異性之雙特異性抗體、對DR5具特異性之抗體及使用方法
<130> 31434 WO
<150> US 61/808128
<151> 2013-04-03
<160> 318
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物；VH之CDR1
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物；VH之CDR2
<400> 2
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物；VH之CDR3
<400> 3
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物；VH之CDR1
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物；VH之CDR2
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物；VH之CDR3
<400> 6
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物_可變重鏈(VH)
<400> 7
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)結合物_可變輕鏈(VL)
<400> 8
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物；VH之CDR1
<400> 9
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物；VH之CDR2
<400> 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物；VH之CDR3
<400> 11
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物；VL之CDR1
<400> 12
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物；VL之CDR2
<400> 13
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物；VL之CDR3
<400> 14
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物_可變重鏈(VH)
<400> 15
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)結合物_可變輕鏈(VL)
<400> 16
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VH7)與(174-VH17)結合物；VH之CDR1
<400> 17
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VH7)結合物；VH之CDR2
<400> 18
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VH7)與(174-VH17)結合物；VH之CDR3
<400> 19
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL15)、(174-VL10)、(174-VL3)及(174-VL2)結合物；VL之CDR1
<400> 20
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL15)及(174-VL2)結合物；VL之CDR2
<400> 21
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL15)、(174-VL11)、(174-VL10)、(174-VL3)及(174-VL2)結合物；VL之CDR3
<400> 22
<210> 23
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VH7)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 23
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL15)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 24
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VH17)結合物；VH之CDR2
<400> 25
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VH17)結合物；可變重鏈
<400> 26
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL11)結合物；VL之CDR1
<400> 27
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL11)、(174-VL10)及(174-VL3)結合物；VL之CDR2
<400> 28
<210> 29
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL11)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 29
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL3)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 30
<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL10)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 31
<210> 32
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(174-VL2)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 32
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物；VH之CDR1
<400> 33
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物；VH之CDR2
<400> 34
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物；VH之CDR3
<400> 35
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物；VL之CDR1
<400> 36
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物；VL之CDR2
<400> 37
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物；VL之CDR3
<400> 38
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物可變重鏈(VH)
<400> 39
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)結合物可變輕鏈(VL)
<400> 40
<210> 41
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物可變重鏈(VH)
<400> 41
<210> 42
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5結合物(兔)恆定重鏈(CH1)
<400> 42
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物；VH之CDR1
<400> 43
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物；VH之CDR2
<400> 44
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物；VH之CDR3
<400> 45
<210> 46
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物；VH之CDR1
<400> 46
<210> 47
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(兔)結合物恆定輕鏈(Cκ)
<400> 47
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物；VL之CDR1
<400> 48
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物；VL之CDR2
<400> 49
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0005)結合物；VL之CDR3
<400> 50
<210> 51
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 51
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；VH之CDR1
<400> 52
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；VH之CDR2
<400> 53
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；VH之CDR3
<400> 54
<210> 55
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 55
<210> 56
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；恆定輕鏈(Cκ)
<400> 56
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；VL之CDR1
<400> 57
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；VL之CDR2
<400> 58
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0006)結合物；VL之CDR3
<400> 59
<210> 60
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 60
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；VH之CDR1
<400> 61
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；VH之CDR2
<400> 62
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；VH之CDR3
<400> 63
<210> 64
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 64
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；VL之CDR1
<400> 65
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；VL之CDR2
<400> 66
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0010)結合物；VL之CDR3
<400> 67
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0013)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 68
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0013)結合物；VH之CDR1
<400> 69
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0013)結合物；VH之CDR2
<400> 70
<210> 71
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0013)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 71
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0013)結合物；VL之CDR2
<400> 72
<210> 73
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0013)結合物；VL之CDR3
<400> 73
<210> 74
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 74
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；VH之CDR1
<400> 75
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；VH之CDR2
<400> 76
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；VH之CDR3
<400> 77
<210> 78
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 78
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；VL之CDR1
<400> 79
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；VL之CDR2
<400> 80
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0019)結合物；VL之CDR3
<400> 81
<210> 82
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0016)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 82
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0016)結合物；VH之CDR2
<400> 83
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0016)結合物；VH之CDR3
<400> 84
<210> 85
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0016)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 85
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0016)結合物；VL之CDR1
<400> 86
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0016)結合物；VL之CDR3
<400> 87
<210> 88
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0011)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 88
<210> 89
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0011)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 89
<210> 90
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0052)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 90
<210> 91
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0052)結合物；恆定重鏈(CH1)
<400> 91
<210> 92
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0052)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 92
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(TAA-0052)結合物；恆定輕鏈(Cκ)
<400> 93
<210> 94
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)結合物_可變重鏈(VH)
<400> 94
<210> 95
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)結合物_可變輕鏈(VL)
<400> 95
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)結合物；VH之CDR3
<400> 96
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)結合物；VL之CDR3
<400> 97
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)結合物；VH之CDR
<400> 98
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)結合物；VL之CDR3
<400> 99
<210> 100
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 100
<210> 101
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 101
<210> 102
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 102
<210> 103
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 103
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)結合物；VH之CDR3
<400> 104
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)結合物；VL之CDR3
<400> 105
<210> 106
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)結合物；可變重鏈(VH)
<400> 106
<210> 107
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)結合物；可變輕鏈(VL)
<400> 107
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)結合物；VH之CDR3
<400> 108
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)結合物；VL之CDR3
<400> 109
<210> 110
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗_可變輕鏈(VL)
<400> 110
<210> 111
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-3F2 VHVL-scFv(HC)pETR6606
<400> 111
<210> 112
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VHVL-scFv(HC)pETR7342
<400> 112
<210> 113
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VHVL-scFv(LC)pETR7344
<400> 113
<210> 114
<211> 942
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-3F2VLCL_VHCH1-scFab(HC)pETR7369
<400> 114
<210> 115
<211> 703
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-3F2VLCL_VHCH1-scFab(LC)pETR7370
<400> 115
<210> 116
<211> 942
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VLCL_VHCH1-scFab(HC)pETR7371
<400> 116
<210> 117
<211> 703
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VLCL_VHCH1-scFab(LC)pETR7380
<400> 117
<210> 118
<211> 696
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VHCL2+2
<400> 118
<210> 119
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗LCpETR7303
<400> 119
<210> 120
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4G8)_VLCH1
<400> 120
<210> 121
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VLCH12+2
<400> 121
<210> 122
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4G8)_VHCL
<400> 122
<210> 123
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(28H1)VHCLpETR95512+2
<400> 123
<210> 124
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)_VLCH1pETR9537
<400> 124
<210> 125
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)-FAP(28H1)VHCLpETR97112+2
<400> 125
<210> 126
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)LCpETR9076
<400> 126
<210> 127
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)-FAP(28H1)VHCLpETR10626 2+2
<400> 127
<210> 128
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)LCpETR9075
<400> 128
<210> 129
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)-FAP(28H1)VHCLpETR10135 2+2
<400> 129
<210> 130
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)LC pETR9061
<400> 130
<210> 131
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)VHCL pETR10334 2+2
<400> 131
<210> 132
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)LCpETR9044
<400> 132
<210> 133
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)VHCL 2+2，移除在FcpETR11052中之C-端離胺酸
<400> 133
<210> 134
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)VHCL 2+2，移除在Fc P329G/LALA鼠科pETR11025中之C-端離胺酸
<400> 134
<210> 135
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHVL DR5(5E11)-FAP(28H1)pETR11827 2+2
<400> 135
<210> 136
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)VHCL pETR11484
<400> 136
<210> 137
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)VLCL pETR9366
<400> 137
<210> 138
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1CL DR5(5E11)-FAP(28H1)pETR11828 2+2
<400> 138
<210> 139
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)VLCH1pETR11480
<400> 139
<210> 140
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-FAP(28H1)VHCL2+2
<400> 140
<210> 141
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)LC
<400> 141
<210> 142
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)Fc結VHCL2+1pETR10427
<400> 142
<210> 143
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)Fc孔pETR10336
<400> 143
<210> 144
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-DR5(5E11)Fc孔pETR10429 3+1
<400> 144
<210> 145
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_Fc結Fab-Fab頭-尾連接2+1 pETR10662
<400> 145
<210> 146
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)_Fc孔VHCLpETR10130
<400> 146
<210> 147
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-FAP(28H1)Fc結VHCL2+1pETR9807
<400> 147
<210> 148
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)Fc孔pETR9808
<400> 148
<210> 149
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-FAP(28H1)VHCLFc結3+1pETR10333
<400> 149
<210> 150
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-DR5(18F11)Fc孔pETR10288
<400> 150
<210> 151
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu Fc_wt
<400> 151
<210> 152
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu Fc_P329G/LALA
<400> 152
<210> 153
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu卡帕型輕鏈
<400> 153
<210> 154
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu蘭姆達型輕鏈
<400> 154
<210> 155
<211> 439
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 155
<210> 156
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類FAP胞外域+聚-lys-標籤+his6-標籤
<400> 156
<210> 157
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠科FAP胞外域+聚-lys-標籤+his6-標籤
<400> 157
<210> 158
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 馬來猴FAP胞外域+聚-lys-標籤+his6-標籤
<400> 158
<210> 159
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)_Fc孔VHCLpETR10130
<400> 159
<210> 160
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)VLCH1pETR9537
<400> 160
<210> 161
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-Fc結
<400> 161
<210> 162
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_LCpETR9044
<400> 162
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子GAB-4039
<400> 163
<210> 164
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子GAB4040
<400> 164
<210> 165
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子GAB-4145
<400> 165
<210> 166
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子GAB-4146
<400> 166
<210> 167
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_VH DNA
<400> 167
<210> 168
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_CDRH1 DNA
<400> 168
<210> 169
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_CDRH2 DNA
<400> 169
<210> 170
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_CDRH3
<400> 170
<210> 171
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_VL DNA
<400> 171
<210> 172
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_CDRL1 DNA
<400> 172
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_CDRL2 DNA
<400> 173
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)_CDRL3 DNA
<400> 174
<210> 175
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_VH DNA
<400> 175
<210> 176
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_CDRH1 DNA
<400> 176
<210> 177
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_CDRH2 DNA
<400> 177
<210> 178
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_CDRH3 DNA
<400> 178
<210> 179
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_VL DNA
<400> 179
<210> 180
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_CDRL1 DNA
<400> 180
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_CDRL2 DNA
<400> 181
<210> 182
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)_CDRL3 DNA
<400> 182
<210> 183
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_VH DNA
<400> 183
<210> 184
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_CDRH1 DNA
<400> 184
<210> 185
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_CDRH2 DNA
<400> 185
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_CDRH3 DNA
<400> 186
<210> 187
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_VL DNA
<400> 187
<210> 188
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_CDRL1 DNA
<400> 188
<210> 189
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_CDRL2 DNA
<400> 189
<210> 190
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)_CDRL3 DNA
<400> 190
<210> 191
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列-
<220>
<223> DR5(5E11)_VH DNA
<400> 191
<210> 192
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_CDRH1 DNA
<400> 192
<210> 193
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_CDRH2 DNA
<400> 193
<210> 194
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_CDRH3 DNA
<400> 194
<210> 195
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_VL DNA
<400> 195
<210> 196
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_CDRL1 DNA
<400> 196
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_CDRL2 DNA
<400> 197
<210> 198
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_CDRL3 DNA
<400> 198
<210> 199
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_VH DNA
<400> 199
<210> 200
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_CDRH1 DNA
<400> 200
<210> 201
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_CDRH2 DNA
<400> 201
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_CDRH3 DNA
<400> 202
<210> 203
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_VL DNA
<400> 203
<210> 204
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_CDRL1 DNA
<400> 204
<210> 205
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_CDRL2 DNA
<400> 205
<210> 206
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)_CDRL3 DNA
<400> 206
<210> 207
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)_VH DNA
<400> 207
<210> 208
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)_VL DNA
<400> 208
<210> 209
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)_VH DNA
<400> 209
<210> 210
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)_VL DNA
<400> 210
<210> 211
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗_VH DNA
<400> 211
<210> 212
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗_VL DNA
<400> 212
<210> 213
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-3F2 scFv(HC)pETR6606 DNA
<400> 213
<210> 214
<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)scFv(HC)pETR7342 DNA
<400> 214
<210> 215
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)scFv(LC)DNA
<400> 215
<210> 216
<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-3F2 scFab(HC)pETR7369 DNA
<400> 216
<210> 217
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-3F2 scFab(LC)DNA
<400> 217
<210> 218
<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)scFab(HC)DNA
<400> 218
<210> 219
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)scFab(LC)DNA
<400> 219
<210> 220
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VHCL 2+2 DNA
<400> 220
<210> 221
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗LC pETR7303 DNA
<400> 221
<210> 222
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4G8)_VLCH1 DNA
<400> 222
<210> 223
<211> 2052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(4G8)VLCH1 2+2 DNA
<400> 223
<210> 224
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4G8)_VHCL DNA
<400> 224
<210> 225
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卓西單抗-FAP(28H1)VHCLpETR9551 2+2 DNA
<400> 225
<210> 226
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)_VLCH1pETR9537 DNA
<400> 226
<210> 227
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)-FAP(28H1)VHCLpETR9711 2+2 DNA
<400> 227
<210> 228
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(22E9)LCpETR9076 DNA
<400> 228
<210> 229
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)-FAP(28H1)VHCLpETR10626_2+2 DNA
<400> 229
<210> 230
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(21H3)LC_pETR9075 DNA
<400> 230
<210> 231
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)-FAP(28H1)VHCL_pETR10135_2+2 DNA
<400> 231
<210> 232
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20F2)LCpETR9061 DNA
<400> 232
<210> 233
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)VHCLpETR10334_2+2 DNA
<400> 233
<210> 234
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)LCpETR9044 DNA
<400> 234
<210> 235
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)VHCL 2+2，移除在Fc pETR11052 DNA中之C-端離胺酸
<400> 235
<210> 236
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)VHCL 2+2，移除在Fc P329G/LALA鼠科pETR11025 DNA中之C-端離胺酸
<400> 236
<210> 237
<211> 2043
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VHVL交叉DR5(5E11)-FAP(28H1)pETR11827 2+2 DNA
<400> 237
<210> 238
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)VHCL_pETR11484 DNA
<400> 238
<210> 239
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)VLCL_pETR9366 DNA
<400> 239
<210> 240
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1CL交叉DR5(5E11)-FAP(28H1)pETR118282+2 DNA
<400> 240
<210> 241
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)VLCH1_pETR11480 DNA
<400> 241
<210> 242
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-FAP(28H1)VHCL 2+2 pETR9801 DNA
<400> 242
<210> 243
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)LC_pETR9070 DNA
<400> 243
<210> 244
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)Fc結VHCL 2+1 pETR10427 DNA
<400> 244
<210> 245
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)Fc孔pETR10336 DNA
<400> 245
<210> 246
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-FAP(28H1)Fc結VHCL 3+1 pETR10427 DNA
<400> 246
<210> 247
<211> 2061
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)-DR5(5E11)Fc孔pETR10429 DNA
<400> 247
<210> 248
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_Fc結Fab-Fab頭-尾連接2+1 pETR10662 DNA
<400> 248
<210> 249
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)_Fc孔VHCL交叉pETR10130 DNA
<400> 249
<210> 250
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-FAP(28H1)Fc結VHCL 2+1 pETR9807 DNA
<400> 250
<210> 251
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)Fc孔pETR9808 DNA
<400> 251
<210> 252
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-FAP(28H1)VHCL Fc結3+1 pETR10333 DNA
<400> 252
<210> 253
<211> 2061
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(18F11)-DR5(18F11)Fc孔pETR10288 DNA
<400> 253
<210> 254
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu Fc_wt DNA
<400> 254
<210> 255
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu Fc_P329G/LALA DNA
<400> 255
<210> 256
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu卡帕型輕鏈DNA
<400> 256
<210> 257
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu蘭姆達型輕鏈DNA
<400> 257
<210> 258
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1_Fc孔VHCL pETR10130 DNA
<400> 258
<210> 259
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 28H1VLCH1pETR9537 DNA
<400> 259
<210> 260
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11_4B9 VHCL pETR11060 DNA
<400> 260
<210> 261
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B9_VLCH1_pETR10020 DNA
<400> 261
<210> 262
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(5E11)_FAP(4B9)VHCL_pETR11060
<400> 262
<210> 263
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)_VLCH1_pETR10020
<400> 263
<210> 264
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11-Fc結DNA
<400> 264
<210> 265
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11_LC pETR9044 DNA
<400> 265
<210> 266
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(1B12)_CDR H3
<400> 266
<210> 267
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(1B12)_CDR L3
<400> 267
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(19C12)_CDR H3
<400> 268
<210> 269
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(19C12)_CDR L3
<400> 269
<210> 270
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(19D6)_CDR H3
<400> 270
<210> 271
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(19D6)_CDR L3
<400> 271
<210> 272
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20E3)_CDR H3
<400> 272
<210> 273
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR5(20E3)_CDR L3
<400> 273
<210> 274
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 118265E11(VLCL)-Fc-28H1(VHCH1)
<400> 274
<210> 275
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11478_5E11 VHCH1
<400> 275
<210> 276
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11829 5E11-28H1 VHCH1
<400> 276
<210> 277
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11830 28H1 VHCH1
<400> 277
<210> 278
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12207 5E11-28H1(VLCH1)
<400> 278
<210> 279
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12152 28H1(VHCL)
<400> 279
<210> 280
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0061(包含4B9及DR5TAA-0011之1+1嵌合Crossmab)LC(DR5)
<400> 280
<210> 281
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0061(包含4B9及DR5TAA-0011之1+1嵌合Crossmab)LC(FAP)
<400> 281
<210> 282
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0061(包含4B9及DR5TAA-0011之1+1嵌合Crossmab)LC(FAP)
<400> 282
<210> 283
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0061(包含4B9及DR5TAA-0011之1+1嵌合Crossmab)HC(FAP)
<400> 283
<210> 284
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0032(包含28H1及DR5TAA-0005之2+2嵌合CrossMab)LC(DR5)
<400> 284
<210> 285
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0032(包含28H1及DR5TAA-0005之2+2嵌合CrossMab)交叉LC(FAP)
<400> 285
<210> 286
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0032(包含28H1及DR5TAA-0005之2+2嵌合CrossMab)HC(DR5-交叉FAP
<400> 286
<210> 287
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0033(包含28H1及DR5TAA-0011之2+2嵌合CrossMab)LC(DR5)
<400> 287
<210> 288
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0033(包含28H1及DR5TAA-0011之2+2嵌合CrossMab)交叉LC(FAP)
<400> 288
<210> 289
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0033(包含28H1及DR5TAA-0011之2+2嵌合CrossMab)HC(DR5-交叉FAP)
<400> 289
<210> 290
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0034(包含28H1及DR5TAA-0013之2+2嵌合CrossMab)LC(DR5)
<400> 290
<210> 291
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0034(包含28H1及DR5TAA-0013之2+2嵌合CrossMab)交叉LC(FAP)
<400> 291
<210> 292
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0034(包含28H1及DR5TAA-0013之2+2嵌合CrossMab)HC(DR5-交叉FAP)
<400> 292
<210> 293
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0035(包含28H1及DR5TAA-0016之2+2嵌合CrossMab)LC(DR5)
<400> 293
<210> 294
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 294
<220>
<223> 建構DR5TAA-0035(包含28H1及DR5TAA-0016之2+2嵌合CrossMab)交叉LC(FAP)
<210> 295
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0035(包含28H1及DR5TAA-0016之2+2嵌合CrossMab)HC(DR5-交叉FAP)
<400> 295
<210> 296
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0036(包含28H1及DR5TAA-0019之2+2嵌合CrossMab)LC(DR5)
<400> 296
<210> 297
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0036(包含28H1及DR5TAA-0019之2+2嵌合CrossMab)交叉LC(FAP)
<400> 297
<210> 298
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0036(包含28H1及DR5TAA-0019之2+2嵌合CrossMab)HC(DR5-交叉FAP)
<400> 298
<210> 299
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0117(包含28H1及DR5TAA-0067之2+2人類化CrossMab)LC(DR5)
<400> 299
<210> 300
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0117(包含28H1及DR5TAA-0067之2+2人類化CrossMab)交叉LC(FAP)
<400> 300
<210> 301
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0117(包含28H1及DR5TAA-0067之2+2人類化CrossMab)HC(DR5-交叉FAP)
<400> 301
<210> 302
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0118(包含28H1及DR5TAA-0071之2+2人類化CrossMab)LC(DR5)
<400> 302
<210> 303
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0118(包含28H1及DR5TAA-0071之2+2人類化CrossMab)交叉LC(FAP)
<400> 303
<210> 304
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0118(包含28H1及DR5TAA-0071之2+2人類化CrossMab)HC(DR5-交叉FAP)
<400> 304
<210> 305
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0119(包含28H1及DR5TAA-0075之2+2人類化CrossMab)LC(DR5)
<400> 305
<210> 306
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0119(包含28H1及DR5TAA-0075之2+2人類化CrossMab)交叉LC(FAP)
<400> 306
<210> 307
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 建構DR5TAA-0119(包含28H1及DR5TAA-0075之2+2人類化CrossMab)HC(DR5-交叉FAP)
<400> 307
<210> 308
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huFc-VH007
<400> 308
<210> 309
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVL015
<400> 309
<210> 310
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huFc-VH017
<400> 310
<210> 311
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hVL011
<400> 311
<210> 312
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huFc-hVH007 DNA
<400> 312
<210> 313
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hVL015 DNA
<400> 313
<210> 314
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huFc-hVH017DNA
<400> 314
<210> 315
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hVL011 DNA
<400> 315
<210> 316
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu DR5(ECD)-AcTev-Fc-Avi
<400> 316
<210> 317
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 馬來猴DR5(ECD)-AcTev-Fc-Avi
<400> 317
<210> 318
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子
<400> 318

Claims (43)

  1. 一種與死亡受體5(DR5)及纖維母細胞活化蛋白(FAP)結合之雙特異性抗體，其包含至少一個對DR5具特異性之抗原結合位點，該位點包含：(a)選自由SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：17及SEQ ID NO.：75組成之群之重鏈互補決定區1(CDR1)；(b)選自SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：25及SEQ ID NO.：83之群之重鏈互補決定區2(CDR2)；(c)選自SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：84、SEQ ID NO.：96、SEQ ID NO.：98、SEQ ID NO.：104及SEQ ID NO.：108之群之重鏈互補決定區3(CDR3)；(d)選自SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：20、SEQ ID NO.：27及SEQ ID NO.：86之群之輕鏈CDR1；(e)選自SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：21及SEQ ID NO.：28之群之輕鏈CDR2；及(f)選自SEQ ID NO.：6、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：87、SEQ ID NO.：99、SEQ ID NO.：105、SEQ ID NO.：109及SEQ ID NO.：97之群之輕鏈CDR3；及至少一個對FAP具特異性之抗原結合位點，該位點包含：(a)選自SEQ ID NO.：9及SEQ ID NO.：33之群之重鏈CDR1；(b)選自SEQ ID NO.：10及SEQ ID NO.：34之群之重鏈CDR2；(c)選自SEQ ID NO.：11及SEQ ID NO.：35之群之重鏈CDR3；(d)選自SEQ ID NO.：12及SEQ ID NO.：36之群之輕鏈CDR1；(e)選自SEQ ID NO.：13及SEQ ID NO.：37之群之輕鏈CDR2；(f)選自SEQ ID NO.：14及SEQ ID NO.：38之群之輕鏈CDR3。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中該對DR5具特異性之抗原結合位點包含選自以下之群之胺基酸序列之可變重鏈及可變輕鏈：SEQ ID NO.：7及SEQ ID NO.：8；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：29；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：32；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：82及SEQ ID NO.：85；SEQ ID NO.：100及SEQ ID NO.：101；SEQ ID NO.：102及SEQ ID NO.：103；SEQ ID NO.：106及SEQ ID NO.：107；SEQ ID NO.：94及SEQ ID NO.：95；及其中該對FAP具特異性之抗原結合位點包含選自SEQ ID NO.：15及SEQ ID NO.：39之群之胺基酸序列之可變重鏈；及包含選自SEQ ID NO.：16及SEQ ID NO.：40之群之胺基酸序列之可變輕鏈。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該對DR5具特異性之抗原結合位點包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3及該對FAP具特異性之抗原結合位點包含：(a)SEQ ID NO.：9之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：10之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：11之重鏈CDR3； (d)SEQ ID NO.：12之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：13之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：14之輕鏈CDR3。
  4. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該對DR5具特異性之抗原結合位點包含SEQ ID NO.：7之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO.：8之胺基酸序列之可變輕鏈；及該對FAP具特異性之抗原結合位點包含SEQ ID NO.：15之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO.：16之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  5. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該抗體為人類。
  6. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該抗體為人類化。
  7. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段。
  8. 如請求項7之雙特異性抗體，其中該等Fab片段中至少一者係經輕鏈(VLCL)與該Fc結構域之第一或第二子單元連接及至少一個Fab片段係經重鏈(VHCH1)與該Fc結構域之第一或第二子單元連接。
  9. 如請求項7之雙特異性抗體，其包含：a)Fc結構域，b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定輕鏈(CL)之C-端與該Fc結構域之第一或第二子單元連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該兩個Fab片段係在恆定重鏈(CH1)之C-端與該Fc結構域之第一或第二子單元連接。
  10. 如請求項7之雙特異性抗體，其包含： a)Fc結構域，b)兩個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該等Fab片段係在恆定重鏈(CH1)之C-端與該Fc結構域之第一或第二子單元連接，c)兩個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中該兩個Fab片段係在恆定輕鏈(CL)之C-端與該Fc結構域之第一或第二子單元連接。
  11. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其包含Fc結構域、至少一個包含對DR5具特異性之抗原結合位點之Fab片段、及至少一個包含對FAP具特異性之抗原結合位點之Fab片段，其中至少一個Fab片段之重鏈及輕鏈之可變區或恆定區交換。
  12. 如請求項11之雙特異性抗體，其包含兩個Fab片段各包含對DR5具特異性之抗原結合位點、及兩個Fab片段各包含對FAP具特異性之抗原結合位點。
  13. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體對DR5及FAP二者均為二價。
  14. 如請求項11之雙特異性抗體，其包含兩個Fab片段各包含對DR5具特異性之抗原結合位點、及一個Fab片段包含對FAP具特異性之抗原結合位點。
  15. 如請求項14之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體對DR5為二價及對FAP為單價。
  16. 如請求項14之雙特異性抗體，其另外包含一個Fab片段包含對DR5具特異性之抗原結合位點。
  17. 如請求項16之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體對DR5為三價及對FAP為單價。
  18. 如請求項11之雙特異性抗體，其包含一個Fab片段包含對DR5具 特異性之抗原結合位點、及一個Fab片段包含對FAP具特異性之抗原結合位點。
  19. 如請求項18之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體對DR5為單價及對FAP為單價。
  20. 如請求項11之雙特異性抗體，其中包含對FAP具特異性之抗原結合位點之該(等)Fab片段之重鏈及輕鏈之可變區或恆定區交換。
  21. 如請求項7之雙特異性抗體，其中該等Fab片段中至少一者係經肽連接子與Fc結構域連接。
  22. 如請求項7之雙特異性抗體，其中該Fc結構域包含一或多個胺基酸取代減低結合至Fc受體及/或效應子功能。
  23. 如請求項22之雙特異性抗體，其中該一或多個胺基酸取代係在一或多個選自L234、L235、及P329之群之位置。
  24. 如請求項23之雙特異性抗體，其中該Fc結構域之各子單元包含三個胺基酸取代減低結合至活化或抑制性Fc受體及/或效應子功能，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G。
  25. 如請求項7之雙特異性抗體，其中第一重鏈之Fc部分包含第一二聚合模組及第二重鏈之Fc部分包含第二二聚合模組容許第一抗體之兩個重鏈異二聚合(heterodimerization)。
  26. 如請求項25之雙特異性抗體，其中依據結進孔(knobs into holes)策略，該第一二聚合模組包含結(knobs)及該第二二聚合模組包含孔(holes)。
  27. 一種與DR5特異結合之抗體，其包含：(a)選自由SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：17及SEQ ID NO.：75組成之群之重鏈互補決定區1(CDR1)；(b)選自SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：25及SEQ ID NO.：83之群之重鏈互補決定區2(CDR2)； (c)選自SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：84、SEQ ID NO.：96、SEQ ID NO.：98、SEQ ID NO.：104及SEQ ID NO.：108之群之重鏈互補決定區3(CDR3)；(d)選自SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：20、SEQ ID NO.：27及SEQ ID NO.：86之群之輕鏈CDR1；(e)選自SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：21及SEQ ID NO.：28之群之輕鏈CDR2；及(f)選自SEQ ID NO.：6、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：87、SEQ ID NO.：99、SEQ ID NO.：105、SEQ ID NO.：109及SEQ ID NO.：97之群之輕鏈CDR3。
  28. 如請求項27之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO.：1之重鏈CDR1；(b)SEQ ID NO.：2之重鏈CDR2；(c)SEQ ID NO.：3之重鏈CDR3；(d)SEQ ID NO.：4之輕鏈CDR1；(e)SEQ ID NO.：5之輕鏈CDR2；(f)SEQ ID NO.：6之輕鏈CDR3。
  29. 如請求項27之抗體，其包含選自以下之群之胺基酸序列之可變重鏈及可變輕鏈：SEQ ID NO.：7及SEQ ID NO.：8；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：24；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：29；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：32；SEQ ID NO.：26及SEQ ID NO.：30；SEQ ID NO.：23及SEQ ID NO.：31；SEQ ID NO.：82及SEQ ID NO.：85；SEQ ID NO.：100及SEQ ID NO.：101；SEQ ID NO.：102及SEQ ID NO.：103；SEQ ID NO.：106及SEQ ID NO.：107；SEQ ID NO.：94及 SEQ ID NO.：95。
  30. 如請求項27至29中任一項之抗體，其包含SEQ ID NO.：7之胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO.：8之胺基酸序列之可變輕鏈。
  31. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至26中任一項之雙特異性抗體或如請求項27至30中任一項之抗體。
  32. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其係用於治療癌症。
  33. 如請求項27至29中任一項之抗體，其係用於治療癌症。
  34. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其係用作藥物。
  35. 如請求項27至29中任一項之抗體，其係用作藥物。
  36. 一種如請求項1至26中任一項之雙特異性抗體或如請求項27至30中任一項之抗體於製造藥物之用途。
  37. 如請求項36之用途，其中該藥物係用於治療癌症。
  38. 如請求項36之用途，其中該藥物係用於治療胰癌或結腸直腸癌。
  39. 一種核酸序列，其包含編碼如請求項1至26之雙特異性抗體之重鏈或如請求項27至30之抗體之重鏈之序列。
  40. 一種核酸序列，其包含編碼如請求項1至26之雙特異性抗體之輕鏈或如請求項27至30之抗體之輕鏈之序列。
  41. 一種包含如請求項39或40之核酸序列之表現載體。
  42. 一種包含如請求項41之載體之原核或真核宿主細胞。
  43. 一種製造抗體之方法，其包含培養如請求項42之宿主細胞以產生抗體。
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