KR20130101047A - 신규한 항원 결합 단백질 - Google Patents

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KR20130101047A
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네일 제임스 클라케
경 오 요한슨
츠덴카 루드밀라 요나크
알렉산더 에이취. 테일러
크리스토퍼 비. 홉슨
스티븐 에이취. 트룰리
츠덴카 하스코바
유디탄 엠. 리
존 알. 화이트
유 쉐
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글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
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Abstract

본 개시내용은 HER3에 결합하는 항원 결합 단백질, 예컨대 항체, 상기 항원 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항원 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 흑색종, 및 HER3을 과다발현하는 다른 암과 연관된 질환의 치료 또는 예방에서의 상기 항원 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 항원 결합 단백질{NOVEL ANTIGEN BINDING PROTEINS}
관련 출원
본원은 2010년 9월 3일 출원된 US 특허 가출원 61/379,840 및 2011년 2월 8일 출원된 US 특허 가출원 61/440,460을 기초로 한 이익을 주장한다. 상기 밝힌 출원의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 HER3 수용체에 결합하는 항원 결합 단백질, 예컨대 항체, 그러한 항원 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항원 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 다양한 암과 연관된 질환의 치료 또는 예방에서 상기 항원 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
HER3 (ErbB3으로도 불림) (서열 21)은 ErbB/HER 단백질 패밀리 또는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리의 수용체를 포함하는 4개의 구조상 관련된 수용체 티로신 키나제 중의 하나이다. 이들 수용체는 약 620개의 아미노산을 함유하는 세포외 영역, 단일 막횡단 영역, 및 세포질 티로신 키나제 도메인으로 이루어진다. 각각의 패밀리 구성원의 세포외 영역은 4개의 하위도메인, 즉 L1, S1 (CR1), L2 및 S2 (CR2)로 이루어지고, 여기서 "L"은 류신-풍부 반복 도메인을 의미하고, "CR"은 시스테인-풍부 영역을 의미한다. 이들 수용체의 활성화는 대개 리간드-유도된 수용체 이량체화를 필요로 한다. HER3은 리간드 (뉴레굴린-1, NRG; 헤레굴린, HRG; 표 1 참조) 결합 도메인을 갖지만, 키나제 도메인 내에 특정 아미노산 변화의 존재 때문에 고유한 티로신 키나제 활성을 갖지 않는다는 점에서 상기 패밀리 중에서 특유하다. 따라서, 이것은 리간드에 결합할 수 있지만, 동종이량체로서, 단백질 인산화를 통해 신호를 세포 내로 전달하지 않는다. 그러나, 이것은 활성 신호전달능 모이어티를 형성하기 위해 키나제 활성을 갖는 다른 EGF 수용체 패밀리 구성원과 이종이량체 (예를 들어, HER1/HER3; HER2/HER3; HER3/HER4)를 형성한다. HER2와의 쌍형성이 특히 중요하고, 그 이유는 HER2/HER3 조합물이 PI3K/pAKT 경로를 포함한 다양한 세포내 경로를 통해 최고 증식 가능성을 갖는 것으로 보이기 때문이다. HER3이 HER2와 이량체를 형성할 때, 생성되는 신호전달 복합체는 HER2 성분에 대해 작용하는 항체, 예컨대 퍼투주맙에 의해 파괴될 수 있다. 추가로, HRG에 대한 HER3의 친화도는 HER2와 공동발현될 때 증가할 수 있다. 최근에, HER3과 다른 세포 표면 수용체 (HER 패밀리 외의 것, 예컨대 c-MET 포함)와의 상호작용이 특정 항암제에 대한 내성에 대한 중요한 탈출 메카니즘으로서 부각되었다. HER3의 상이한 이소형을 코딩하는 교대 전사 스플라이스 변이체의 특성이 완전히는 아니지만 결정되었다. 하나의 이소형은 막간 (intermembrane) 영역을 갖지 않고, 세포 외부로 분비된다. 이 형태는 리간드를 격리시킴으로써 막-결합형의 활성을 조정하는 작용을 할 수 있다. HER3과 다른 수용체와의 이종이량체화는 세포 성장 및 생존에 중요한 경로의 활성화를 유도한다. 따라서, 이들 경로의 제어된 발현 및 활성화는 유기체의 정상적인 성장을 위해 필요하고, 이것이 손상되면 질환을 야기할 수 있다.
HER 단백질 패밀리의 4개의 구성원은 잠재적인 성장 인자 리간드의 하위세트에 의한 활성화시에 동종이량체, 이종이량체, 및 보다 고차 올리고머를 형성할 수 있다. 아래 표 1은 HER 패밀리의 수용체의 공지의 리간드를 나열한 것이다.
ErbB (HER) 수용체 리간드
EGFR 표피 성장 인자 (EGF)
전환 성장 인자 알파 (TGFa)
암피레굴린 (AR)
에피겐
EGFR & HER4 베타셀룰린 (BTC)
헤파린-결합 성장 인자 (HB-EGF)
에피레굴린 (EPR)
HER2 없음
HER3 & HER4 뉴레굴린 1/헤레굴린 (NRG-1; HRG)
뉴레굴린 2 (NRG-2)
HER4 뉴레굴린 3 (NRG-3)
뉴레굴린 4 (NRG-4)
토모레굴린
마우스에서, ErbB 패밀리의 임의의 구성원에 의한 신호전달의 손실은 폐, 피부, 심장 및 뇌를 비롯한 장기 내의 결손이 있는 배아 치사를 일으킨다. 다른 한편으로, 과도한 ErbB/HER 신호전달은 매우 다양한 고형 종양 종류의 발생과 연관된다. ErbB-1 (EGFR/HER1) 및 ErbB-2 (HER2)는 많은 인간 암에서 발견되고, 이들의 과도한 신호전달은 이들 종양의 발생 및 악성에 중대한 인자일 수 있다. 예를 들어, EGFR은 폐 및 결장을 비롯한 많은 암에서 과다발현된다. 세툭시맙, 게피티닙, 엘로티닙과 같은 약물이 이들 상황에서 상기 수용체의 활성을 억제하기 위해 사용된다. HER2 유전자는 현재 특히 헤르셉틴, 타목시펜 및 라파티닙으로 치료되고 있는 유방암에서 증폭되고 단백질 과다발현된다. 이들 치료에 대한 감수성으로부터의 탈출이 암에 있어서 증가하는 문제이고, 보다 신규하고 효과적인 치료가 요구되는 주요 이유이다. HER3 유전자의 증폭 및/또는 그의 단백질의 과다발현이 많은 암에서 보고되었다. 최근에, 예를 들어, 게피티닙에 대한 획득된 내성이 HER3의 고활성에 연관될 수 있는 것으로 나타났다. 이것은 HER3을 인산화하고 다시 PI3K/Akt 경로 (핵심 세포 성장/생존 경로)를 활성화시키는 c-MET의 획득된 과다발현에 연관된다.
HER3 수용체 (서열 21)는 특유한 특성을 갖고, HER 수용체 패밀리에 의해 매개되는 세포 신호전달 경로에서 핵심점을 차지한다. 이것은 또한 일반적인 암 치료제에 대한 내성의 메카니즘에서 점점 더 관련되고 있다. 이것은 기능상 활성 키나제 도메인이 결여되므로, 통상적인 소분자를 사용하여 '약품으로 개발가능 (druggable)'하지 않다. 그러나, 다양한 핵심 성장, 생존 및 분화 경로에서 그의 활성을 위해 다른 세포 표면 수용체와의 상호작용에 의존하는 세포 표면 수용체로서, 이것은 생물제약 방안을 위한 매력적인 표적이다.
따라서, HER3 수용체를 표적으로 하는 치료 항체, 및 그러한 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법이 필요하다.
개시내용의 개요
본 개시내용의 한 측면은 서열 2, 서열 3, 및 서열 4로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 6, 서열 7, 및 서열 8로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 23, 서열 24, 및 서열 25로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 27, 서열 28, 및 서열 29로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 45, 서열 46, 및 서열 47로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 49, 서열 50, 및 서열 51로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 31, 서열 32, 및 서열 33으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 35, 서열 36, 및 서열 37로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 10, 서열 11, 및 서열 12로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 12, 서열 7, 서열 8, 서열 18, 서열 19, 및 서열 20으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 13에 제시된 아미노산 서열 및 서열 17에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 57에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 27에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열 29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열 37에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 45에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 46에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 49에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 50에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열 51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 단리된 핵산, 발현 벡터, 재조합 숙주 세포, 항원 결합 단백질의 생산 방법, 제약 조성물, 암의 치료 방법, 모두 본 개시내용의 이들 측면에 관련되는 항원 결합 단백질의 용도 및 생산 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 100에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 갖는 중쇄 서열 및 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 갖는 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 102에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 갖는 중쇄 서열 및 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 갖는 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 100에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 코딩하는 단리된 핵산이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 코딩하는 단리된 핵산이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 102에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 코딩하는 단리된 핵산이다.
도 1. BxPC3 췌장암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 2. CHL-1 흑색종 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 3. N87 위암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 4. SK-BR-3 유방암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 5. BT-474 유방암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 6. MCF-7 유방암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 7. BxPC3 췌장암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 Akt 인산화의 억제.
도 8. CHL-1 흑색종 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 Akt 인산화의 억제.
도 9. N87 위암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 Akt 인산화의 억제.
도 10. SK-BR-3 유방암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 Akt 인산화의 억제.
도 11. SK-BR-3 유방암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 표피 성장 인자 (EGF) 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 12. SK-BR-3 유방암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 베타셀룰린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 13. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 HER3으로 형질도입된 CHO 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 이종이량체 형성 및 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 14. HER2 및 HER3으로 형질도입된 CHO 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 이종이량체 형성 및 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 15. HER4 및 HER3으로 형질도입된 CHO 세포에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 이종이량체 형성 및 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
도 16. 암 세포주에서 항-HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제 (포스포-HER3 ELISA IC50 값).
도 17. 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 전장 인간 HER3 ECD 및 인간 HER3 도메인 III에 결합한다.
도 18. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 전장 인간 HER3 ECD 및 인간 HER3 도메인 II에 결합한다.
도 19. 인간화 1D9 포텔리겐트(POTELLIGENT)™ 항체는 전장 인간 HER3 ECD 및 인간 HER3 도메인 III에 결합한다.
도 20. 인간화 1D9 아크레타맙(ACCRETAMAB)™ 항체는 전장 인간 HER3 ECD 및 인간 HER3 도메인 III에 결합한다.
도 21. 인간화 1D9 항체는 전장 인간 HER3 ECD 및 인간 HER3 도메인 III에 결합한다.
도 22. (a) 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 유동 세포측정 분석에 의해 평가될 때 인간 MCF-7 유방암 세포 상의 HER3을 인식한다. (b) 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5) 항체는 유동 세포측정 분석에 의해 평가될 때 인간 BxPC3 췌장암 세포 상의 HER3을 인식한다.
도 23. (a) 인간화 1D9 항체, 인간화 아크레타맙™ 1D9 항체, 및 인간화 포텔리겐트™ 항체는 유동 세포측정 분석에 의해 평가될 때 인간 CHL-1 흑색종 세포 상의 HER3을 인식한다. (b) 인간화 1D9 항체, 인간화 아크레타맙™ 1D9 항체, 및 인간화 포텔리겐트™ 항체는 유동 세포측정 분석에 의해 평가될 때 인간 BxPC3 췌장암 세포 상의 HER3을 인식한다.
도 24. 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5) 및 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 헤레굴린 유도된 BxPC3 췌장암 세포 증식을 억제한다.
도 25. 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5) 및 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 항체는 헤레굴린 유도된 MCF-7 유방암 세포 증식을 억제한다.
도 26. 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 뮤린 1D9 항체는 헤레굴린 유도된 BxPC3 췌장암 세포 증식을 억제한다.
도 27. 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5), 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1), 뮤린24H5 항체 (M5.24H5.C2), 키메라 (chimeric) 1D9 항체 및 키메라 15D5 항체는 헤레굴린 유도된 BxPC3 췌장암 세포 침습을 억제한다.
도 28. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.H10) 및 인간화 1D9 항체는 인간 CHL-1 흑색종 세포에서 수용체 내재화를 유도하였다.
도 29. (a) 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 B16F10 세포 상에서 발현되는 뮤린 HER3과 교차 반응한다. (b) 뮤린 24H5 항체 (M5.24H5.C2)는 B16F10 세포 상에서 발현되는 뮤린 HER3과 교차 반응한다. (c) 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.1C1)는 B16F10 세포 상에서 발현되는 뮤린 HER3과 교차 반응한다.
도 30. B16F10 동계 (syngeneic) 종양 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 1D9 항체의 효능. 마우스 B16F10 흑색종 세포의 볼루스 (bolus) i.v. 주사를 투여한 C57BL/6 마우스를 폐에서 종양 세포 군집화 (colonization)에 대한 효과를 평가하기 위해서 이소형 대조군, 마우스 Her3 mAb (m1D9) 또는 겜자르(GEMZAR)™ (겜시타빈)로 처리하였다. 이소형 대조군 및 m1D9를 B16F10 주사 후 제3일 (25 또는 50 mg/kg, i.p.) 및 제7일 및 제11일 (5 또는 25 mg/kg, i.p.)에 투여하였다. 겜자르™는 제3일에만 투여하였다 (20 mg/kg, i.v.). 폐를 습식 중량 측정을 위해 제20일에 수거하였다. m1D9 처리는 이소형 대조군에 비해 폐 중량의 용량 의존적 감소를 야기하였다 (p<0.01; 던넷 (Dunnett) 사후 검정과 함께 일원 ANOVA). NTB = 비 종양 보유 마우스.
도 31. B16F10 동계 종양 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 15D5 항체의 효능. 마우스 B16F10 흑색종 세포의 볼루스 i.v. 주사를 투여한 C57BL/6 마우스를 폐에서 종양 세포 군집화에 대한 효과를 평가하기 위해서 이소형 대조군, 마우스 Her3 mAb (m15D5) 또는 겜자르™로 처리하였다. 이소형 대조군 및 m15D5를 B16F10 주사 후 제3일 (25 또는 50 mg/kg, i.p.) 및 제7일 및 제11일 (5 또는 25 mg/kg, i.p.)에 투여하였다. 겜자르™는 제3일에만 투여하였다 (20 mg/kg, i.v.). 폐를 습식 중량 측정을 위해 제20일에 수거하였다. 겜자르™ 및 m15D5 처리는 이소형 대조군에 비해 보다 낮은 폐 중량을 야기하였지만, 단지 25/5 mg/kg m15D5만이 통계적으로 유의하였다 (p<0.05; 던넷 사후 검정과 함께 일원 ANOVA). NTB = 비 종양 보유 마우스.
도 32. CHL-1 이종이식편 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 1D9 항체의 효능. 5 내지 100 mg/kg i.p.로 마우스 항-HER3 mAb, m1D9로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 CHL-1 종양 성장이 감소하였다. 이소형 대조군에 비해 용량 의존적 및 통계적으로 유의한 감소는 이식 후 제24일 및 제27일에 관찰되었다 (*p<0.05; ***p<0.001; 본페로니 (Bonferroni) 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 33. CHL-1 이종이식편 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 15D5 항체의 효능. 5 내지 100 mg/kg i.p.로 마우스 항-HER3 mAb, m15D5로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 CHL-1 종양 성장이 감소하였다. 이소형 대조군에 비해 용량 의존적 및 통계적으로 유의한 감소는 이식 후 제20일, 제24일 및 제27일에 관찰되었다 (*p<0.05; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 34. BxPC3 이종이식편 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 1D9 항체의 효능. 0.5 내지 50 mg/kg i.p.로 마우스 항-HER3 mAb, m1D9로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 BxPC3 종양 성장이 용량 의존적으로 및 통계적으로 유의하게 감소하였다 (**p<0.01; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 35. BxPC3 이종이식편 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 15D5 항체의 효능. 0.5 내지 50 mg/kg i.p.로 마우스 항-HER3 mAb, m15D5로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 BxPC3 종양 성장이 용량 의존적으로 및 통계적으로 유의하게 감소하였다 (**p<0.01; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 36. NCI-N87 이종이식편 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 1D9 항체의 효능. 75 또는 100 mg/kg i.p.로 m1D9로 CB-17 SCID 마우스를 매주 2회 처리하면 비히클 대조군에 비해 N87 종양 성장이 감소하였다. 유사한 감소가 이소형 대조군 마우스 IgG2b에서 관찰되었다 (**p<0.01; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 37. NCI-N87 이종이식편 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 뮤린 15D5 항체의 효능. 75 또는 100 mg/kg i.p.로 m15D5로 CB-17 SCID 마우스를 매주 2회 처리하면 비히클 또는 이소형 대조군에 비해 N87 종양 성장이 더 낮았지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
도 38. CHL-1 이종이식편 모델에서 마우스 항-HER3 mAb, 키메라 1D9 항체의 효능. 5 내지 50 mg/kg i.p.로 키메라 항-HER3 mAb, Ch1D9로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 CHL-1 종양 성장이 감소하였다. 이소형 대조군에 비해 용량 의존적 및 통계적으로 유의한 감소는 이식 후 제24일 및 제27일에 관찰되었다 (**p<0.05; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 39. CHL-1 이종이식편 모델에서 인간화 항-HER3 mAb, 인간화 15D5 항체의 효능. 5 내지 50 mg/kg i.p.로 인간화 항-HER3 mAb, h15D5로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 CHL-1 종양 성장이 감소하였다. 이소형 대조군에 비해 용량 의존적 및 통계적으로 유의한 감소는 이식 후 제24일 및 제27일에 관찰되었다 (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 40. CHL-1 이종이식편 모델에서 인간화 항-HER3 mAb, 인간화 1D9 RR 항체의 효능. 5 내지 50 mg/kg i.p.로 인간화 1D9RR로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 CHL-1 종양 성장이 감소하였다. 종양 성장의 감소는 이식 후 제29일 및 제34일에 이소형 대조군에 비해 모든 용량 수준에서 유사하고 통계적으로 유의하였다 (***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 41. CHL-1 이종이식편 모델에서 인간화 1D9 RR 아크레타맙™의 효능. 5 내지 50 mg/kg i.p.로 인간화 1D9 RR 아크레타맙™으로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 CHL-1 종양 성장이 감소하였다. 종양 성장의 감소는 이식 후 제29일 및 제34일에 이소형 대조군에 비해 모든 용량 수준에서 유사하고 통계적으로 유의하였다 (***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 42. CHL-1 이종이식편 모델에서 인간화 1D9 RR 포텔리겐트™의 효능. 5 내지 50 mg/kg i.p.로 인간화 1D9 RR 포텔리겐트™로 매주 2회 처리하면, CB-17 SCID 마우스에서 CHL-1 종양 성장이 감소하였다. 종양 성장의 감소는 이식 후 제29일 및 제34일에 이소형 대조군에 비해 용량 의존성이고, 통계적으로 유의하였다 (***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 43. BxPC3 이종이식편 모델 (피하 이식물)에서 키메라 항-HER3 mAb, 키메라 1D9 항체의 효능. BxPC3 종양 성장에 대한 효과를 평가하기 위해서 CB-17 SCID 마우스를 키메라 항-HER3 mAb, ch1D9로 0.5 내지 50 mg/kg i.p로 매주 2회 처리하였다. 종양 성장의 용량 의존적 및 통계적으로 유의한 감소는 이식 후 제33일에 이소형 대조군에 비해 0.5, 5 및 50 mg/kg 처리군에서 및 이식 후 제36일에 50 mg/kg 군에서 관찰되었다 (**p<0.01; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 44. BxPC3 이종이식편 모델 (피하 이식물)에서 인간화 항-HER3 mAb, 인간화 15D5의 효능. BxPC3 종양 성장에 대한 효과를 평가하기 위해서 CB-17 SCID 마우스를 인간화 항-HER3 mAb, h15D5로 0.5 내지 50 mg/kg i.p로 매주 2회 처리하였다. 종양 성장의 감소는 이식 후 제33일 및 제36일에 이소형 대조군에 비해 50 mg/kg 처리군에서 관찰되었다 (**p<0.01; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석).
도 45. BxPC3 이종이식편 모델 (피하 이식물)에서 인간화 1D9 RR 항체의 효능. 종양 세포 성장에 대한 효과를 결정하기 위해 BxPC3 종양 보유 CB-17 SCID 마우스에게 h1D9RR을 0.5 내지 50 mg/kg으로 매주 2회 i.p. 투여하였다. 20 mg/kg 군에서 관찰된 종양 부피의 감소는 제36일에 이소형 대조군 수준으로 복귀하였다 (*p<0.05; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 반복 측정 분석 비교).
도 46. BxPC3 이종이식편 모델 (동소 (orthotopic) 이식물)에서 키메라 1D9 항체 및 인간화 15D5 항체의 효능. BxPC3 췌장암 단편을 암컷 CB-17 SCID 마우스의 췌장 내로 동소에 이식하였다. 종양 부피가 80-100 mm3에 도달하면, HER3 mAb, h15D5 및 Ch1D9를 50 mg/kg로 매주 2회 투여하였다. 종양 부피는 매주 간격으로 초음파 (베보 이미지 어낼리시스 (Vevo Image Analysis))에 의해 결정하였다. 항-HER3 mAb 처리는 이식 후 제5, 6 및 7주에 이소형 대조군에 비해 종양 성장을 유의하게 감소시켰다 (**p<0.01; ***p<0.001; 본페로니 사후 검정 비교와 함께 이원 ANOVA).
도 47. NCI-N87 이종이식편 모델에서 인간화 1D9 RR 항체 및 변이체의 효능. N87 종양 세포 성장에 대한 효과를 결정하기 위해 CB-17 SCID 마우스에게 지시된 인간화 HER3 mAb (인간화 1D9 RR 항체, 인간화 1D9 RR 포텔리겐트™ 항체 및 인간화 1D9 RR 아크레타맙™ 항체)를 50 mg/kg로 매주 2회 i.p. 투여하였다. 종양 부피의 통계상 유의한 감소가 이소형 대조군에 비해 h1D9 RR 포텔리겐트™ 군에서 제37일에 및 h1D9RR 아크레타맙™ 군에서 제44일에 관찰되었다 (*p<0.05; 본페로니 사후 검정 비교와 함께 이원 ANOVA).
도 48. HER3 형질도입된 HEK293을 표적 세포로 및 인간 PBL을 효과기 세포 (공여자 2126)로 사용한 ADCC 검정.
도 49. CHL-1 세포를 표적 세포로 및 인간 PBL을 효과기 세포 (공여자 2126)로 사용한 ADCC 검정.
도 50. HER3 형질도입된 HEK293 세포를 표적 세포로 및 시노몰구스 원숭이 PBL을 효과기 세포 (70-105)로 사용한 ADCC 검정.
도 51. HER3 형질도입된 HEK293 세포를 표적 세포로 및 시노몰구스 원숭이 PBL을 효과기 세포 (70-113)로 사용한 ADCC 검정.
도 52. CHL-1 세포를 표적 세포로 및 시노몰구스 원숭이 PBL을 효과기 세포 (70-105)로 사용한 ADCC 검정.
도 53. CHL-1 세포를 표적 세포로 및 시노몰구스 원숭이 PBL을 효과기 세포 (70-113)로 사용한 ADCC 검정.
도 54. HER3 박맘(BACMAM)™ 형질도입된 HEK293 표적 세포 및 칼바이오켐(CALBIOCHEM)™ 토끼 보체를 사용한 CDC 검정.
도 55. 인간 HER3 ECD의 도메인 III (서열 66; 공동-결정화된 단편)과 뮤린 1D9 경쇄 가변 영역 및 뮤린 1D9 중쇄 가변 영역 (공동-결정화된 뮤린 1D9 항체 유래 Fab 내) 사이의 아미노산 접촉을 보여주는 X-선 결정 구조.
본 개시내용은 항원 결합 단백질 및 관련 내용을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "HER3" 및 "HER3 수용체"는 상호교환가능하고, 다음 중의 임의의 하나를 의미한다: HER3의 전장 비가공된 전구체 형태; C-말단 도메인의 번역후 절단에 의해 생성되는 성숙 HER3; 잠복 및 비-잠복 (활성) 형태. 용어 "HER3" 및 "HER3 수용체"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 또한 HER3 수용체와 연관된 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 HER3 수용체의 임의의 단편 및 변이체를 의미한다.
HER3 수용체의 전장 비가공된 전구체 형태는 신호 서열이 존재하거나 존재하지 않는 성숙 단백질을 형성하는 전구-펩티드 및 C-말단 도메인을 포함한다. 이 형태는 폴리단백질 (polyprotein)로도 알려져 있다. HER3 수용체 전구체는 단량체 또는 동종이량체로서 존재할 수 있다.
성숙 HER3은 C-말단 도메인으로도 알려진, HER3 전구체 단백질의 C-말단으로부터 절단되는 단백질이다. 성숙 HER3은 단량체, 동종이량체, 또는 HER3 잠복 복합체로 존재할 수 있다. 조건에 따라, 성숙 HER3은 이들 상이한 형태의 조합물 사이의 평형을 확립할 수 있다.
HER3 전구-펩티드는 신호 서열의 절단 후에 HER3 전구체 단백질의 N-말단 도메인으로부터 절단되는 폴리펩티드이다. 전구-펩티드는 잠복-연관 펩티드 (LAP)로도 알려져 있다. HER3 전구-펩티드는 성숙 HER3 상의 전구-펩티드 결합 도메인에 비-공유 방식으로 결합할 수 있다.
HER3 수용체 항원 결합 단백질은 HER3 수용체의 전구체, 성숙, 단량체, 이량체성, 잠복 및 활성 형태 중의 임의의 하나 또는 임의의 조합에 결합할 수 있다. 항원 결합 단백질은 그의 단량체 및/또는 이량체 형태의 성숙 HER3 수용체에 결합할 수 있다. 항원 결합 단백질은 전구-펩티드 및/또는 폴리스타틴과의 복합체로 존재할 때 HER3 수용체에 결합할 수 있다. 별법으로, 항원 결합 단백질은 HER2 수용체 또는 다른 HER3 상호작용 수용체와의 복합체 (예를 들어, HER3의 이종이량체)로 존재할 때 HER3 수용체에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단백질"은 HER3 수용체 (서열 21), 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 HER3 수용체의 도메인 II, 또는 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 HER3 수용체의 도메인 III에 결합할 수 있는 단리된 항체, 항체 단편, 항원 결합 단편 및 다른 단백질 구축물, 예컨대 도메인을 의미한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 이뮤노글로불린-유사 도메인을 갖는 분자를 의미하고, 모노클로날, 재조합, 폴리클로날, 키메라, 인간화, 이중특이적 및 이종접합체 항체, 예컨대 모노클로날 항체/도메인 항체 접합체; 단일 가변 도메인; 도메인 항체; 항원 결합 단편; 면역학상 활성 단편; 단일쇄 Fv; 디아바디 (diabody); 탄답스(TANDABS)™ 등을 포함한다 (다른 "항체" 형태의 요약에 대해서는 문헌 [Holliger, et al., Nature Biotechnology, Vol 23, No. 9: 1126-1136 (2005)]를 참조한다).
문구 "단일 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 바와 같이 상이한 가변 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 가변 도메인 (예를 들어, VH, VHH, VL)을 의미한다.
용어 "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 항원에 결합할 수 있는 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"과 동일한 것으로 간주될 수 있다. 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있지만, 또한 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인, 예를 들어 설치류 (예를 들어, WO 00/29004에 개시된 바와 같이), 수염 상어 및 낙타류 VHH dAb를 포함한다. 낙타류 VHH는 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생산하는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 상기와 같은 VHH 도메인은 당업계에 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 그러한 도메인은 "도메인 항체"로 간주된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, VH는 낙타류 VHH 도메인을 포함한다. NARV는 수염 상어를 포함하는 연골 어류에서 확인된 또 다른 종류의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이다. 이러한 도메인은 또한 신규한 항원 수용체 (Novel Antigen Receptor) 가변 영역 (일반적으로 V(NAR) 또는 NARV로 약칭함)으로도 알려져 있다. 추가의 상세한 내용은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)] 및 US20050043519A를 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "도메인"은 단백질의 나머지와 무관하게 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하고, 많은 경우에 단백질의 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 상실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질에 옮겨질 수 있다. 용어 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 바와 같이 항체 가변 도메인의 서열 특징을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이 용어는 완전한 항체 가변 도메인 및 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인에 특유하지 않은 서열로 교체된 변형된 가변 도메인, 또는 말단 절단되거나 또는 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 및 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 도메인은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "에피토프-결합 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인을 의미하거나, 이것은 도메인 항체 (dAb), 예를 들어 인간, 낙타류 또는 상어 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나 또는 천연 리간드 이외의 다른 리간드에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작처리된 CTLA-4 (에비바디 (Evibody)); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예컨대 단백질 A의 Z-도메인 (애피바디 (Affibody), SpA), A-도메인 (아비머 (Avimer)/맥시바디 (Maxibody)); 열 충격 단백질, 예컨대 GroEL 및 GroES; 트랜스페린 (트랜스-바디 (trans-body)); 안키린 반복 단백질 (DARPin); 펩티드 앱타머; C-형 렉틴 도메인 (테트라넥틴 (Tetranectin)); 인간 감마-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴 (아필린); PDZ 도메인; 전갈 독소, 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 (kunitz) 유형 도메인; 및 피브로넥틴 (애드넥틴)으로 이루어진 군 중에서 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.
항원 결합 단편은 비-항체 단백질 스캐폴드, 예컨대 도메인 상의 하나 이상의 CDR의 배열에 의해 제공될 수 있다. 도메인은 도메인 항체일 수 있거나, 또는 천연 리간드 이외의 다른 항원, 예컨대 HER3 수용체에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작 처리된, CTLA-4 (에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예컨대 단백질 A의 Z-도메인 (애피바디, SpA), A-도메인 (아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예컨대 GroE1 및 GroES; 트랜스페린 (트랜스-바디); 안키린 반복 단백질 (DARPin); 펩티드 앱타머; C-형 렉틴 도메인 (테트라넥틴); 인간-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴 (아필린); PDZ 도메인; 전갈 독소, 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴 (애드넥틴)으로 이루어진 군 중에서 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.
CTLA-4 (세포독성 T 림프구-연관 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포 상에 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 그의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴드 (fold)를 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 특성을 부여하기 위해 이종성 서열로 교체될 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 에비바디로도 알려져 있다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]를 참조한다.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예컨대 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 수송하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추 구조의 개방된 말단에 다수의 루프가 존재하는 경질-시트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린은 160-180개 아미노산 크기이고, 리포칼린으로부터 유래된다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Biochim Biophys Acta 1482:337-350 (2000)], US7250297B1 및 US20070224633을 참조한다.
애피바디는 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이고, 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선 다발로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위화에 의해 생성되었다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)] 및 EP1641818A1을 참조한다.
아비머는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 천연 도메인은 규정된 디술피드 결합된 구조를 취한다. 다양성은 A-도메인의 패밀리에 의해 보이는 천연 변이의 셔플링 (shuffling)에 의해 생성된다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)] 및 [Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조한다.
트랜스페린은 일지성 (monomelic) 혈청 수송 당단백질이다. 트랜스페린은 허용성 표면 루프 내의 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예는 트랜스-바디를 포함한다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조한다.
설계된 안키린 반복 단백질 (DARPin)은 통합 막 단백질의 세포골격에의 부착을 매개하는 단백질의 한 패밀리인 안키린으로부터 유래된다. 단일 안키린 반복체는 2개의 나선 및 a-턴 (turn)으로 이루어진 33개 잔기 모티프이다. 이들은 각각의 반복체의 제1-나선 및 a-턴 내의 잔기를 무작위화함으로써 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 계면은 모듈의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다 (친화도 성숙의 방법). 추가의 상세한 내용은 문헌 [J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003)], [PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)] 및 [J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US20040132028A1을 참조한다.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 타입 III (FN3)의 15개의 반복 단위의 제10 도메인의 천연 아미노산 서열의 백본으로 이루어진다. 샌드위치의 한 말단의 3개의 루프는 애드넥틴이 관심 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 문헌 [Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], US20080139791, WO2005056764 및 US6818418B1을 참조한다.
펩티드 앱타머는 일정한 스캐폴드 단백질, 일반적으로 활성 부위에 삽입된 속박 (constrained) 가변 펩티드 루프를 함유하는 티오레독신 (TrxA)으로 이루어진 조합 인식 분자이다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조한다.
마이크로바디 (microbody)는 3-4개의 시스테인 가교를 함유하는, 길이가 25-50개 아미노산인 천연 생성 미세단백질로부터 유래한다 - 미세단백질의 예는 KalataB1 및 코노톡신 (conotoxin) 및 노틴 (knottin)을 포함한다. 미세단백질은 미세단백질의 전체적인 폴드에 영향을 주지 않으면서 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 노틴 도메인의 추가의 상세한 설명에 대해서는, WO2008098796을 참조한다.
다른 에피토프 결합 도메인은 상이한 표적 항원 결합 특성을 조작하기 위한 스캐폴드로서 사용된 단백질을 포함하고, 인간-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴 (아필린), 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 전갈 독소 (카립도톡신), C-형 렉틴 도메인 (테트라넥틴)을 포함하고, 이는 문헌 [Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)]의 7장 및 [Protein Science 15:14-27 (2006)]에서 검토되었다. 본원의 에피토프 결합 도메인은 임의의 상기 대안 단백질 도메인으로부터 유래될 수 있다.
항원 결합 단편 또는 면역학상 효과적인 단편은 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 단편의 길이는 적어도 5, 6, 8 또는 10개 아미노산이다. 별법으로, 단편의 길이는 적어도 15, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 75, 또는 적어도 100개 아미노산이다.
항원 결합 단백질에 대해 본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다"는 항원 결합 단백질이 다른 (예를 들어, 비관련) 단백질에 결합하지 않거나 비유의한 결합을 보이면서, HER3 수용체뿐만 아니라 별개의 도메인, 또는 HER3 수용체 내의 별개의 아미노산 서열에 결합함을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 항원 결합 단백질이 또한 밀접하게 관련된 분자 (예를 들어, HER2 수용체)와 교차반응할 수 있다는 사실을 배제하지 않는다. 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 밀접하게 관련된 분자, 예컨대 HER2 수용체에 결합하는 것보다 적어도 2, 5, 10, 50, 100, 또는 1000배 더 큰 친화도로 HER3 수용체에 결합할 수 있다.
본원에서 제시되는 범위는 설명되는 특정 범위 내의 모든 값 및 특정 범위에 대한 종점 근처의 값을 포함한다.
항원 결합 단백질-HER3 상호작용의 결합 친화도 (KD)는 1 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 2 nM 이하 또는 1 nM 이하일 수 있다. 별법으로, KD는 5 내지 10 nM; 또는 1 내지 2 nM일 수 있다. KD는 1 pM 내지 500 pM; 또는 500 pM 내지 1 nM일 수 있다. 항원 결합 단백질의 결합 친화도는 회합 상수 (Ka) 및 해리 상수 (Kd)에 의해 결정된다 (KD = Kd/Ka). 결합 친화도는 비아코어(BIACORE)™에 의해, 예를 들어 단백질-A 코팅 센서 표면 상의 시험 항체의 포획 및 상기 표면 상의 HER3 수용체의 유동에 의해 측정될 수 있다. 별법으로, 결합 친화도는 포르테비오(FORTEBIO)™에 의해, 예를 들어 단백질-A 코팅 바늘 상에 시험 항체 수용체의 포획 및 상기 표면 상의 HER3 수용체의 유동에 의해 측정될 수 있다.
Kd는 1x10-3 Ms-1 이하, 1x10-4 Ms-1 이하, 또는 1x10-5 Ms-1 이하일 수 있다. Kd는 1x10-5 Ms-1 내지 1x10-4 Ms-1; 또는 1x10-4 Ms-1 내지 1x10-3 Ms-1일 수 있다. 느린 Kd는 항원 결합 단백질-리간드 복합체의 느린 해리 및 리간드의 개선된 중화를 야기할 수 있다. 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질에 대한 예시적인 결합 친화도 및 관련 데이터를 표 2에 제시한다.
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표 2에서, "뮤린 15D5 항체"는 서열 1-8에 제시된 가변 중쇄, 가변 경쇄, 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 의미하고; "인간화 15D5 항체"는 서열 22-29에 제시된 가변 중쇄, 가변 경쇄, 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 의미하고; "뮤린 1D9 항체"는 서열 44-51에 제시된 가변 중쇄, 가변 경쇄, 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 의미하고; "인간화 1D9 항체"는 서열 30-37에 제시된 가변 중쇄, 가변 경쇄, 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 의미한다. 특히, 표 2의 "인간화 1D9" 모노클로날 항체는 서열 30에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 57에 제시된 가변 경쇄 아미노산 서열 및 서열 30-33 및 서열 35-37에 제시된 상응하는 상보성 결정 영역을 포함한다.
용어 "ECD"는 세포외 도메인을 의미하고, HER3의 경우에는 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것과 같은 HER3 이소형의 도메인 I, II, III 및 IV를 포함하는 펩티드 사슬을 의미할 수 있다.
용어 "중화하다"는 본원에서 사용되는 바와 같이, HER3의 생물학적 활성이 시험관내 또는 생체내에서 항원 결합 단백질의 부재 하의 HER3의 활성에 비해 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 존재 하에서 감소됨을 의미한다. 중화는 그의 리간드에 대한 HER3 결합의 차단, HER3의 그의 리간드에 의한 활성화 방지, HER3 수용체 또는 그의 리간드의 하향조절, '활성' (예를 들어, 신호전달능의) 입체형태를 취하는 수용체의 능력 방해, 동종-, 이종 또는 올리고머화하는 수용체의 능력 차단 또는 다른 방식에 의한 수용체 활성 또는 효과기 기능에 대한 영향 중의 하나 이상 (이로 제한되지 않음)에 의한 것일 수 있다.
HER3 수용체 활성의 측정은 인산화된 수용체 (pHER3)의 수준, 인산화된 AKT (pAKT), HER3과 수용체의 HER (또는 다른) 패밀리의 구성원 사이의 복합체 형성, PI3 키나제, ERK2, c-Jun 또는 PYK2 활성의 감소, HER3 발현 종양 세포주의 증식, 연질 아가에서 성장하는 상기 세포주의 능력 (클론 성장), 리간드에 반응하여 막을 가로지르는 상기 세포주의 이동 등을 결정하는 방법을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
생물학적 활성의 감소 또는 억제는 부분적이거나 또는 전체적인 것일 수 있다. 중화 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질의 부재시의 HER3 활성에 비해 HER3 수용체의 활성을 적어도 20%, 30% 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중화할 수 있다. 기능적 검정에서, IC50은 생물학적 반응을 그의 최대치의 50%만큼 감소시키는 농도이다.
중화는 당업자에게 공지된 또는 본원에서 설명되는 하나 이상의 검정을 사용하여 결정하거나 측정될 수 있다. 예를 들어, HER3에 대한 항원 결합 단백질 결합은 샌드위치 ELISA, 비아코어™, FMAT, 포르테비오™, 또는 유사한 시험관내 검정으로 평가할 수 있다.
ELISA-기반 수용체 결합 검정은 항원 결합 단백질의 존재 하에 플레이트 상에 고정된 그의 리간드인 뉴레굴린 1 및 뉴레굴린 2에 대한 HER3 수용체 결합을 측정함으로써 항원 결합 단백질의 중화 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
별법으로, 세포-기반 수용체 결합 검정은 수용체 결합, 하류 신호전달, 및 유전자 활성화의 억제를 측정함으로써 항원 결합 단백질의 중화 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
생체 내 중화는 HER3 매개된 기능 및/또는 신호 전달, 예를 들어 인산화된 HER3 (pHER3), 인산화된 AKT (pAKT)의 감소, HER3과 수용체의 HER (또는 다른) 패밀리의 구성원 사이의 복합체 형성, PI3 키나제, ERK2, c-Jun 또는 PYK2 활성의 감소 중의 임의의 하나 또는 조합에서 변화를 보이는 동물에서 많은 상이한 검정을 사용하여 및 또한 예를 들어 종양 이종이식편 모델에서 종양 세포 성장을 방지하거나, 감소시키거나 다른 방식으로 저하시키는 항원 결합 단백질의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다.
용어 "효과기 기능"은 본원에서 사용되는 바와 같이 항체 의존 세포 매개 세포독성 활성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 활성 (CDC) 매개 반응, Fc-매개 식세포작용 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재순환 중의 하나 이상을 의미한다. 항체의 불변 영역과 다양한 Fc 수용체 (FcR) 사이의 상호작용은 항체의 효과기 기능을 매개하는 것으로 생각된다. 유의한 생물학적 효과는 효과기 기능성, 특히, 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC), 보체의 고정 (보체 의존 세포독성 또는 CDC), 식세포작용 (항체-의존 세포-매개 식세포작용 또는 ADCP) 및 항체의 반감기/클리어런스의 결과일 수 있다. 대체로, 효과기 기능을 매개하는 능력은 항원에 대한 항체의 결합을 필요로 하고, 모든 항체가 모든 효과기 기능을 매개하는 것은 아닐 것이다.
효과기 기능은 다수의 방법, 예를 들어, ADCC 효과기 기능을 측정하기 위한 천연 킬러 세포에 대한 FcγRIII의 결합, 또는 단핵구/대식세포에 대한 FcγRI의 결합을 통해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 천연 킬러 세포 검정에서 동등한 야생형 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대해 측정될 때 증가된 ADCC 효과기 기능을 갖는다. 상기 검정의 예는 문헌 [Shields et al., 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604]; [Chappel et al., 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131]; [Lazar et al., 2006 PNAS, 103; 4005-4010]에서 볼 수 있다. CDC 기능을 결정하기 위한 검정의 예는 문헌 [1995 J Imm Meth 184:29-38]에 기재된 것을 포함한다.
항체의 중쇄 불변 영역에 대한 다양한 변형이 목적하는 효과기 특성에 따라 수행될 수 있다. 본질적으로 a) 고전적인 경로에 의한 보체의 활성화, 및 b) 항체 의존 세포성 세포독성 매개 기능이 결핍된 인간 불변 영역은 IgG4 불변 영역 및 IgG2 불변 영역을 포함한다. 특정 돌연변이를 함유하는 IgG1 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 결합을 감소시킴으로써 ADCC 및 CDC를 감소시키는 것으로 개별적으로 기재되어 있다 (문헌 [Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564]; [Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662]; [Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040]; [Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84]; [Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324]; [Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168]). 잔기 Asn297에 특정 돌연변이 또는 변경된 글리코실화를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역이 또한 Fc 수용체에 대한 결합을 향상시키는 것으로 기재되어 있다. 이들은 또한 몇몇 경우에 ADCC 및 CDC를 향상시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010]; [Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604]; [Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817]).
IgG 항체에 대해, ADCC 및 ADCP를 포함하는 효과기 기능은 중쇄 불변 영역과 면역 세포의 표면에 존재하는 Fcγ 수용체의 패밀리의 상호작용에 의해 매개된다. 인간에서, 이들은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)를 포함한다. 항원에 결합된 항체와 Fc/Fcγ 복합체 형성 사이의 상호작용은 일련의 효과, 예를 들어, 세포독성, 면역 세포 활성화, 식세포작용 및 염증성 시토카인의 방출을 유도한다. 불변 영역에서의 특정 치환 (S239D/I332E 포함)은 특정 Fc 수용체에 대한 중쇄 불변 영역의 친화도를 증가시켜 항체의 효과기 기능을 향상시키는 것으로 공지되어 있다 (Lazar et al. PNAS 2006). 용어 "유래된"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 물질에 대한 물리적 기원의 의미로서의 공급원뿐만 아니라, 참조 공급원으로부터 유래되지 않은 물질과 구조적으로 동일한 물질을 규정하는 것으로 의도된 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, "공여자 항체에서 발견된 잔기"가 반드시 공여자 항체로부터 정제될 필요는 없다.
"단리된"은 분자, 예컨대 항원 결합 단백질 또는 핵산이 천연에서 발견될 수 있는 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 분자는 정상적으로는 그와 함께 천연에 존재하는 물질로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 샘플 내의 분자의 질량은 총 질량의 95%일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 본원에서 사용되는 바와 같이 관심 핵산을 세포, 예컨대 진핵 세포 또는 원핵 세포, 또는 관심 핵산 서열이 펩티드 사슬, 예컨대 단백질로서 발현되는 무세포 발현 시스템 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 단리된 핵산을 의미한다. 그러한 발현 벡터는 예를 들어 관심 핵산을 포함하는 코스미드, 플라스미드, 바이러스 서열, 트랜스포손 (transposon), 및 선형 핵산일 수 있다. 발현 벡터가 세포 또는 무세포 발현 시스템 (예를 들어, 망상적혈구 용해물) 내로 도입되면, 관심 핵산에 의해 코딩되는 단백질이 전사/번역 기구에 의해 생산된다. 본 개시내용의 범위 내의 발현 벡터는 진핵 또는 원핵 발현에 필요한 요소를 제공할 수 있고, 바이러스 프로모터 유도 벡터, 예컨대 CMV 프로모터 유도 벡터, 예를 들어 pcDNA3.1, pCEP4, 및 이들의 유도체, 바큘로바이러스 발현 벡터, 드로소필라 (Drosophila) 발현 벡터, 및 포유동물 유전자 프로모터, 예컨대 인간 Ig 유전자 프로모터에 의해 유도되는 발현 벡터를 포함한다. 다른 예는 원핵 발현 벡터, 예컨대 T7 프로모터 유도 벡터, 예를 들어, pET41, 락토스 프로모터 유도 벡터 및 아라비노스 유전자 프로모터 유도 벡터를 포함한다. 당업자는 다른 많은 적합한 발현 벡터 및 발현 시스템을 알 것이다.
용어 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 사용되는 바와 같이 그의 세포 내로의 도입 전에 단리된 관심 핵산 서열을 포함하는 세포를 의미한다. 예를 들어, 관심 핵산 서열은 발현 벡터에 존재할 수 있고, 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대 비제한적으로 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, HepG2, 653, SP2/0, NS0, 293, HeLa, 골수종, 림프종 세포 또는 그의 임의의 유도체이다. 가장 바람직하게는, 진핵 세포는 HEK293, NS0, SP2/0, 또는 CHO 세포이다. 이. 콜라이 (E. coli)는 예시적인 원핵 세포이다. 본 개시내용에 따른 재조합 세포는 형질감염, 세포 융합, 불멸화, 또는 당업계에 공지된 다른 절차에 의해 생성될 수 있다. 세포 내로 형질감염되는 관심 핵산 서열, 예컨대 발현 벡터는 염색체 외에 존재하거나 또는 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합될 수 있다.
"키메라 항체"는 수용자 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 회합된, 공여자 항체로부터 유래된 천연 발생 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 함유하는 조작된 항체 유형을 의미한다.
"인간화 항체"는 비-인간 공여자 이뮤노글로불린으로부터 유래된 그의 CDR을 가지며 분자의 나머지 이뮤노글로불린 유래 부분이 하나 이상의 인간 이뮤노글로불린(들)로부터 유래된 것인 조작된 항체 유형을 의미한다. 또한, 프레임워크 지지 잔기가 결합 친화도를 보존하기 위해 변경될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)], [Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)] 참조). 적절한 인간 수용자 항체는 공여자 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어, 카바트(KABAT)™ 데이터베이스, 로스 알라모스 (Los Alamos) 데이터베이스, 및 스위스 단백질 (Swiss Protein) 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여자 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성 (아미노산 기준)을 특징으로 하는 인간 항체는 공여자 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하는데 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적절한 수용자 항체가 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용자 항체 중쇄 및 경쇄가 동일한 수용자 항체로부터 유래되는 것이 필요하지 않음을 인지해야 한다. 종래 기술에는 상기 인간화 항체를 생성하는 여러 방법이 기재되어 있다 - 예를 들어, EP-A-0239400 및 EP-A-054951을 참조한다.
용어 "공여자 항체"는 제1 이뮤노글로불린 파트너에 그의 가변 영역, CDR 또는 그의 다른 기능적 단편 또는 유사체의 아미노산 서열을 제공하는 항체를 의미한다. 따라서, 공여자는 변경된 이뮤노글로불린 코딩 영역을 제공하고, 공여자 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특징을 갖는 발현된 변경된 항체를 제공한다.
용어 "수용자 항체"는 제1 이뮤노글로불린 파트너에 그의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 아미노산 서열의 전부 (또는 임의의 일부)를 제공하는, 공여자 항체에 대해 이종성인 항체를 의미한다. 인간 항체는 수용자 항체일 수 있다.
용어 "VH" 및 "VL"은 각각 항원 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
"CDR"은 항원 결합 단백질의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 규정된다. 이것은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역이다. 이뮤노글로불린의 가변 부분에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, "CDR"은 본원에서 사용되는 바와 같이 3개의 모든 중쇄 CDR, 3개의 모든 경쇄 CDR, 모든 중쇄 및 경쇄 CDR, 또는 적어도 하나의 CDR (여기서 적어도 하나의 CDR은 CDRH3임)을 의미한다.
본 명세서 전체에서, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열 내의 아미노산 잔기는 카바트 (Kabat) 넘버링 방식에 따라 넘버링된다. 유사하게, 실시예에서 사용되는 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"은 카바트 넘버링 방식을 따른다. 추가의 정보에 대해서는, 문헌 [Kabat, et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조한다.
가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열 내의 아미노산 잔기에 대한 다른 넘버링 방식이 존재함이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, CDR 서열에 대한 다른 넘버링 방식, 예를 들어 문헌 [Chothia, et al. (1989) Nature 342: 877-883]에 제시된 것이 존재한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 CDR 서열의 일부로 간주됨을 의미할 수 있고, 당업자에 의해 그와 같이 이해될 것이다.
당업자에게 이용가능한 CDR 서열에 대한 다른 넘버링 방식에는 "AbM" (유니버시티 오프 배쓰 (University of Bath)) 및 "접촉" (유니버시티 칼리지 런던 (University College London)) 방법이 포함된다. "최소 결합 단위"를 제공하기 위해, 카바트, 코티아 (Chothia), AbM 및 접촉 방법 중 적어도 2개를 사용하여 최소 중첩 영역을 결정할 수 있다. 최소 결합 단위는 CDR의 하위 부분일 수 있다.
하기 표 3은 각각의 CDR 또는 결합 단위에 대해 각각의 넘버링 방식을 사용한 하나의 정의를 나타낸다. 가변 도메인 아미노산 서열을 넘버링하기 위해 카바트 넘버링 방식이 표 3에서 사용된다. 몇몇의 CDR 정의는 사용된 개별 간행물에 따라 상이할 수 있음을 유의하여야 한다.
Figure pct00002
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 단백질 상의 부위를 의미한다. 이것은 단일 도메인 (예를 들어, 에피토프-결합 도메인), 또는 단일쇄 Fv (ScFv) 도메인이거나 또는 표준 항체에서 발견될 수 있는 바와 같이 쌍형성된 VH/VL 도메인일 수 있다.
용어 "에피토프"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 항원 결합 단백질의 특정 결합 도메인과 접촉하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 본질적으로 항원으로부터의 선형 아미노산 서열을 포함하는 선형일 수 있다. 별법으로, 에피토프는 입체형태이거나 또는 불연속적일 수 있다. 예를 들어, 입체형태적 에피토프는 구조적 제한 요소를 필요로 하는 아미노산 잔기를 포함한다. 불연속적 에피토프는 다른 서열에 의해 분리된, 즉, 항원의 1차 서열에 연속적인 서열로 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 항원의 3차 및 4차 구조의 측면에서, 불연속적 에피토프의 잔기는 항원 결합 단백질에 의해 결합되기에 충분히 서로 근접해 있다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한" 또는 "서열 동일성"은 최적으로 정렬되고 적절한 삽입 또는 결실을 적용하여 비교할 때 2개의 핵산 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다.
2개의 서열 사이의 동일성 %는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100). 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 %의 결정은 아래에서 설명되는 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 %는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 통합된 문헌 [Meyers, et al., Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 추가로, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 블로섬 (Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 문헌 [Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
예로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열에 100% 동일한 참조 폴리뉴클레오티드 서열에 동일할 수 있거나, 또는 참조 서열에 비해 특정 정수까지의 뉴클레오티드 변경을 포함할 수 있는데, 예컨대 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99% 동일할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 뉴클레오티드 결실, 전이 (transition) 및 전환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로부터 선택되고, 여기서 상기 변경은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생하거나, 참조 서열 내의 뉴클레오티드 중에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 기 내에 산재할 수 있다. 뉴클레오티드 변경의 수는 본원에서 설명되는 참조 폴리뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 총수에 각각의 동일성 % (100으로 나눔)의 수치 %를 곱하고 그 곱을 참조 폴리뉴클레오티드 서열 내의 상기 뉴클레오티드의 총수로부터 차감함으로써, 즉 nn ≤ xn - (xn·y)에 의해 결정되고, 여기서 nn은 뉴클레오티드 변경의 수이고, xn은 본원에서 설명되는 참조 폴리뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 총수이고 (예시적인 참조 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 "서열 목록" 내의 핵산 서열 참조), y는 50%의 경우 0.50, 60%의 경우 0.60, 70%의 경우 0.70, 75%의 경우 0.75, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 95%의 경우 0.95, 98%의 경우 0.98, 99%의 경우 0.99, 또는 100%의 경우 1.00이고, ·는 곱셈 연산자의 기호이고, xn 및 y의 임의의 비-정수 곱은 그를 xn으로부터 차감하기 전의 가장 가까운 정수로 반올림된다.
유사하게, 폴리펩티드 서열은 본원에서 설명되는 폴리펩티드 참조 서열 (예시적인 참조 폴리펩티드 서열에 대해서는 "서열 목록" 내의 아미노산 서열 참조)에 동일, 즉 100% 동일할 수 있거나, 또는 동일성 %가 100% 미만이도록, 예컨대 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99% 동일하도록 참조 서열에 비해 특정 정수까지의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 연속적 및 불연속적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 이루어진 군 중에서 선택된 선택되고, 여기서 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서 또는 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생하거나, 참조 서열 내의 아미노산 중에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 기 내에 산재할 수 있다. 제시된 동일성 %에 대한 아미노산 변경의 수는 폴리펩티드 참조 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 총수에 각각의 동일성 % (100으로 나눔)의 수치 %를 곱한 후, 그 곱을 본원에서 설명되는 폴리펩티드 참조 서열 (예를 들어, 서열 1-21 참조) 내의 상기 아미노산의 총수로부터 차감함으로써, 즉 na ≤ xa - (xa·y)에 의해 결정되고, 여기서 na는 아미노산 변경의 수이고, xa는 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 총수이고, y는 50%의 경우 0.50, 60%의 경우 0.60, 70%의 경우 0.70, 75%의 경우 0.75, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 95%의 경우 0.95, 98%의 경우 0.98, 99%의 경우 0.99, 또는 100%의 경우 1.00이고, ·는 곱셈 연산자의 기호이고, xa 및 y의 임의의 비-정수 곱은 그를 xa로부터 차감하기 전의 가장 가까운 정수로 반올림된다.
동일성 %는 서열의 길이에 걸쳐 결정할 수 있다. 본원에서 규정된 용어 "75% 초과로 동일한"은 75%, 80%, 85%, 95% 및 99% 초과의 동일성 및 상기 범위 내의 모든 별개의 값, 및 별개의 하위범위를 포함한다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 각각 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
특정 아미노산 치환은 "보존적인" 것으로 당업계에서 잘 인식되어 있다. 아미노산은 공통적인 측쇄 특성을 기초로 하여 여러 군으로 나뉘고, 모든 또는 실질적으로 모든 항원 결합 단백질의 결합 친화도를 유지하는 군 내의 치환은 보존적 치환이다. 표 4를 참조한다. 본원에 개시되는 항원 결합 단백질은 상기 "보존적" 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
Figure pct00003
본 개시내용의 한 측면은 서열 2, 서열 3, 및 서열 4로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 6, 서열 7, 및 서열 8로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 CDRH3, 예컨대 본원에서 개시된 뮤린 또는 인간화 1D9, 15D5, 22A5 모노클로날 항체로부터의 CDRH3을 포함하는 것이 바람직하다.
본 개시내용은 또한 HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공하고, 여기서 항원 결합 단백질은 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된다.
본 개시내용은 또한 서열 2에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 3에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 4에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 6에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 7에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 8에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329는 HER3의 도메인 II를 포함한다. HER3의 도메인 II는 이량체 형성, 예컨대 이종이량체화에 관여한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 23, 서열 24, 및 서열 25로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 27, 서열 28, 및 서열 29로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 서열 23에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 24에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 25에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 27에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 28에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 29에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 45, 서열 46, 및 서열 47로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 49, 서열 50, 및 서열 51로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 서열 45에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 46에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 47에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 49에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 50에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 51에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495는 HER3의 도메인 III을 포함한다. HER3의 도메인 III은 HER3 수용체에 의한 리간드 결합에 관여한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 31, 서열 32, 및 서열 33으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 35, 서열 36, 및 서열 37로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 31에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 32에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 33에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 35에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 36에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 37에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 10, 서열 11, 및 서열 12로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 12, 서열 7, 서열 8, 서열 18, 서열 19, 및 서열 20으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 서열 10에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 11에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 12에 제시된 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 12에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 7에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 8에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 또는 서열 18에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 19에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 20에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용은 또한 HER3에 특이적으로 결합하고 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 이량체의 형성을 억제하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 당업자가 알 바와 같이, 이량체 형성의 억제는 본 개시내용의 항원 결합 단백질의 존재 하 및 부재 하 둘 모두에서 이량체 양을 검정함으로써 결정할 수 있다. 상기 이량체 형성 검정은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 공동-침전 기반 검정 또는 이중-하이브리드 검정을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 13에 제시된 아미노산 서열 및 서열 17에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 57에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, HER3 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 38에 제시된 핵산 서열 및 서열 39에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 59에 제시된 핵산 서열 및 서열 60에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 40에 제시된 핵산 서열 및 서열 41에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 52에 제시된 핵산 서열 및 서열 53에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 42에 제시된 핵산 서열 및 서열 43에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 42에 제시된 핵산 서열 및 서열 58에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 54에 제시된 핵산 서열, 서열 55에 제시된 핵산 서열 및 서열 56에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 63에 제시된 핵산 서열, 서열 64에 제시된 핵산 서열 및 서열 65에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 치료 유효량의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 치료 유효량의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법의 또 다른 측면에서, 포유동물은 인간이다.
본 개시내용의 방법의 또 다른 측면에서, 암은 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종 중에서 선택된다.
한 실시양태에서, 또한 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종의 치료에 사용하기 위한 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 개시내용은 또한 a) 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 암을 가진 대상체를 확인하는 단계; 및 b) 치료 유효량의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 치료 방법을 제공한다. 상기 결정은 다양한 상이한 기술 및 시약, 예컨대 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 또는 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 코딩하는 핵산 서열에 특이적인 핵산 프라이머 또는 프로브에 의해 무손상 암 세포, 또는 상기 세포의 조제물, 예컨대 용해물 또는 면역조직화학 (IHC) 조제물의 검정에 의해 실시될 수 있다. 상기 결정은 예를 들어 유동 세포측정법, 예를 들어 형광 활성화 세포 분류 (FACS), ELISA, 서던 블로팅, 노던 블로팅 또는 핵산 마이크로어레이 분석의 사용에 의해 실시될 수 있다. 상기 결정은 적절한 양성 및 음성 대조군에 비교하여 또는 이전에 수집된 데이터 세트 (예를 들어, 특정 세포 또는 조직 유형에서 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329의 평균 발현)를 기초로 하여 실시될 수 있다.
본 개시내용은 또한 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 치료 방법을 제공한다. 본 개시내용의 치료 방법은 상기 대상체로부터의 적어도 하나의 종양 세포가 서열 21 또는 그의 일부, 예컨대 HER3의 도메인 II 또는 도메인 III을 코딩하는 유전자의 증폭, 또는 서열 21 또는 그의 일부를 코딩하는 RNA 전사체의 증폭을 갖는지 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 단백질을 발현하는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 치료 방법을 제공한다. 상기 결정은 다양한 상이한 기술 및 시약, 예컨대 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 또는 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 코딩하는 핵산 서열에 특이적인 핵산 프라이머 또는 프로브에 의해 무손상 암 세포, 또는 상기 세포의 조제물, 예컨대 용해물 또는 면역조직화학 (IHC) 조제물의 검정에 의해 실시될 수 있다. 상기 결정은 예를 들어 유동 세포측정법, 예를 들어 형광 활성화 세포 분류 (FACS), ELISA, 서던 블로팅, 노던 블로팅 또는 핵산 마이크로어레이 분석에 의해 실시될 수 있다. 상기 결정은 적절한 양성 및 음성 대조군에 비교하여 또는 이전에 수집된 데이터 세트 (예를 들어, 특정 세포 또는 조직 유형에서 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495의 평균 발현)를 기초로 하여 실시될 수 있다.
본 개시내용은 또한 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 상태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본원에서 설명되는 물질, 예컨대 항원 결합 단백질의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 뇌 (신경교종), 교모세포종, 바나얀-조나나 (Bannayan-Zonana) 증후군, 코우덴 (Cowden) 질환, 레르미트-두크로스 (Lhermitte-Duclos) 질환, 유방, 염증성 유방암, 윌름 (Wilm) 종양, 유잉 (Ewing) 육종, 횡문근육종, 상의세포종, 수모세포종, 결장, 두경부, 신장, 폐, 간, 흑색종, 난소, 췌장, 전립선, 육종, 골육종, 골의 거대 세포 종양, 갑상선, 림프모구성 T-세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모발상-세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 호중구 백혈병, 급성 림프모구성 T-세포 백혈병, 형질세포종, 면역모세포 대세포 백혈병, 외투 세포 백혈병, 다발성 골수종, 거대모세포성 백혈병, 다발성 골수종, 급성 거대모세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 적백혈병, 악성 림프종, 호지킨 (Hodgkin) 림프종, 비-호지킨 림프종, 림프모구성 T 세포 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종, 여포성 림프종, 신경모세포종, 방광암, 요로상피암, 폐암, 외음부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 중피종, 식도암, 타액선암, 간세포암, 위암, 비인두암, 협부암, 구강암, GIST (위장관 기질 종양) 및 고환암 중에서 선택된 암의 치료 또는 중증도의 완화 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 a) 본원에서 설명되는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 (여기서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자는 재조합 숙주 세포 내에서 불활성화되었다); 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하고; 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 항원 결합 단백질의 생산을 위한 그러한 방법은 예를 들어 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 CHOK1SV 세포가 기능적 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생산된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된 향상된 항체 의존 세포 매개 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 포텔리겐트™ 기술 시스템 (바이오와, 인크. (BioWa, Inc., 미국 뉴저지주 프린스턴)로부터 이용가능함)을 이용하여 수행할 수 있다. 포텔리겐트™ 기술 시스템의 측면은 그 모두가 본원에 참조로 포함되는 US7214775, US6946292, WO0061739 및 WO0231240에 기재되어 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 알 것이다. 추가로, 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 항원 결합 단백질의 회수 방법은 당업계에 공지되어 있고, 친화도 기반 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 기반 크로마토그래피를 포함한다.
본 개시내용의 항원 결합 단백질은 또한 항체-약물 접합체 (ADC)로서 제공될 수 있다. 항원 결합 단백질은 프로테아제 절단가능 펩티드 링커를 통해 화학요법 약물에 접합될 수 있다. 오리스타틴은 상기 화학요법제의 한 예이다. 적합한 오리스타틴의 예는 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F (MMAF)를 포함한다. 다른 적합한 화학요법제가 본원에서 설명된다. 당업자는 다른 적합한 화학요법제를 알 것이다. 접합체는 또한 반응성 기로부터 형성된 화학적 결합을 통해 화학요법 약물을 항원 결합 단백질에 연결함으로써 제조될 수 있다.
본 개시내용은 또한 재조합 숙주 세포가 CHOK1SV 세포인, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 개시된 항원 결합 단백질의 생산 방법에 의해 생산된, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용은 또한 a) 본원에서 설명되는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 (여기서, 발현 벡터는 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 코딩하는 Fc 핵산 서열을 포함한다); 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하고; 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 항원 결합 단백질의 생산을 위한 그러한 방법은 예를 들어 컴플리젠트(COMPLEGENT)™ 기술 시스템 (바이오와, 인크. (미국 뉴저지주 프린스턴) 및 교와 하꼬 고교 컴퍼니 리미티드 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) (현재 교와 하꼬 기린 컴퍼니 리미티드 (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)로부터 이용가능함)을 이용하여 수행할 수 있고, 여기서 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 코딩하는 Fc 핵산 서열이 항체 중쇄에 융합되어 있는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 발현되어, 상기 키메라 Fc 도메인이 결여된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된 향상된 보체 의존 세포독성 (CDC) 활성을 갖는 항원 결합 단백질을 생산한다. 컴플리젠트™ 기술 시스템의 측면은 각각 본원에 참조로 포함되는 WO2007011041 및 US20070148165에 기재되어 있다. 본 개시내용의 방법에서, CDC 활성은 서열 특이적 돌연변이를 IgG 사슬의 Fc 영역 내로 도입함으로써 증가될 수 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 알 것이다.
본 개시내용은 또한 Fc 핵산 서열이 서열 40에 제시된 핵산 서열 및 서열 42에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 인 프레임 (in frame)으로 융합되어 있는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 항원 결합 단백질의 생산을 위한 그러한 방법은 예를 들어 키메라 Fc 도메인이 결여된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된 ADCC 및 CDC 향상된 활성을 모두 갖는 항원 결합 단백질을 생산하기 위해 포텔리겐트™ 및 컴플리젠트™ 기술 시스템을 조합한 아크레타맙™ 기술 시스템 (바이오와, 인크. (미국 뉴저지주 프린스턴)로부터 이용가능함)을 이용하여 수행할 수 있다.
본 개시내용은 또한 a) 본원에서 설명되는 단리된 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 (여기서, 상기 발현 벡터는 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기를 모두 갖는 키메라 Fc 도메인을 코딩하는 Fc 핵산 서열을 추가로 포함하고, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자는 재조합 숙주 세포 내에서 불활성화되었다); 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하고; 이에 의해 기능적 FUT8 유전자를 갖는 세포 내에서 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 Fc 핵산 서열이 서열 40에 제시된 핵산 서열 및 서열 42에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 인 프레임으로 융합되어 있는, HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 치료 유효량의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고; 이에 의해 대상체에서 전암 상태가 치료되는 것인, 대상체에서 전암 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 a) 전암 상태가 존재하는 대상체를 확인하는 단계; 및 b) 치료 유효량의 본 개시내용의 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고; 이에 의해 대상체에서 전암 상태가 치료되는 것인, 대상체에서 전암 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 대상체에서 전암 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 대상체에서 전암 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 대상체에서 전암 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 27에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 37에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 45에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 46에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 49에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 50에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은, HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 의약에 사용하기 위한, 본원에서 설명되는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종의 치료에 사용하기 위한, 본원에서 설명되는 제약 조성물을 제공한다.
HER3에 특이적으로 결합하는 개시된 항원 결합 단백질은 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체일 수 있다. 15D5, 1D9 및 22A5 모노클로날 항체의 뮤린 버전 및 15D5 및 1D9 모노클로날 항체의 인간화 버전을 포함하는 몇몇의 상기 예시적인 항체가 본원에서 설명된다. 에피토프 맵핑 접근법은 15D5 모노클로날 항체가 HER3의 도메인 II에 결합하고, HER3과 및 다른 수용체, 예를 들어 표 1에 제시된 수용체 사이의 리간드-유도된 수용체 이량체화를 억제하거나 방해할 수 있음을 나타낸다. 이들은 HER2 및 다른 HER 패밀리 수용체, c-MET 및 다른 티로신 키나제 또는 세포 표면 수용체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이들 수용체와 상호작용하는 HER3의 능력의 억제 또는 방해의 결과는 HER3 의존성인 수용체-매개된 세포 신호 전달 과정 또는 경로의 억제 또는 약화이다.
에피토프 맵핑은 또한 1D9 모노클로날 항체가 HER3의 도메인 III에 결합하여 HER3 리간드 결합 및 이종이량체 형성을 억제함을 나타낸다.
HER3에 특이적으로 결합하는 개시된 항원 결합 단백질은 HER3 수용체 (ErbB3으로도 알려짐) (서열 21)에 결합하여 중화시키고, HER3 수용체에 대한 결합에 대해 서열 1 또는 9의 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 5, 13, 또는 17의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 참조 항체와 경쟁할 수 있다. HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 예컨대 뮤린 및 인간화 15D5 모노클로날 항체는 HER3 수용체의 도메인 II (서열 21의 잔기 184-329)에 결합하지만, HER3 수용체 (서열 21)의 도메인 I (서열 21의 잔기 20-183), III (서열 21의 아미노산 잔기 330-495), 또는 IV (서열 21의 아미노산 잔기 496-643)에 결합하지 않는다. HER3 수용체의 도메인 II는 본원에서 설명되는 2개의 항원 결합 단백질이 후보 이량체화 억제제가 되도록 수용체 이량체의 형성을 위한 중요한 계면이다. HER3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 예컨대 뮤린 및 인간화 1D9 항체는 또한 도메인 III에 결합하여 HER3 수용체에 대한 리간드의 결합을 방지할 수 있다. 또한, HER3에 특이적으로 결합하는 개시된 항원 결합 단백질은 본원에서 설명되는 뮤린 또는 인간화 15D5, 1D9 또는 22A5 모노클로날 항체와 경쟁할 수 있다.
본 개시내용의 항원 결합 단백질, 또는 이들을 포함하는 제약 조성물은 또한 많은 인자, 예컨대 HER3 발현을 기초로 하는 과다증식성 또는 HER3 연관 장애, 예컨대 암에 걸린 대상체의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 상기 종양 또는 암은 유방암, 난소암, 위장관암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 자궁내막암, 폐암, 신장암, 두경부암, 신경교종, 흑색종 및 비-흑색종 피부암, 및 다른 피부암, 및 다른 HER3 발현 또는 과다발현 암의 군 중에서 선택될 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 항원 결합 단백질은 또한 EGFR 표적화 요법, 예컨대 AG1478-트라스투주맙 조합물, 또는 HER2/HER3 이종이량체화를 억제하는 퍼투주맙에 대해 반응성인 HER3 양성 암을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lee-Hoeflich et al., 68 Cancer. Res. 5875 (2008)] 및 [Emlet et al., 94 Br. J. Cancer 1144 (2006)]을 참조한다. 추가로, 본 개시내용의 이점은 1) 항-HER2 mAb-내성 환자, 2) 항-HER2 mAb-부적격 환자, 3) 항 HER1 (EGFR) mAb-내성 또는 부적격 환자, 및 4) 티로신 키나제 (소분자)-내성 종양이 있는 환자를 포함하는 군에 속하는 사람에 의해 유도될 것이다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 단일요법에서 단독으로, 또는 작용제가 본원의 다른 곳에서 명시된 다른 작용제와 함께 투여되는 조합 요법 방식에서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 대상체에서 암성 종양의 억제 또는 퇴행, 연장된 환자 생존, 종양 진행까지의 시간 또는 환자 삶의 질을 유발할 수 있는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에서 규정된 항원 결합 단백질을 단독으로, 또는 다른 특이적 작용제와 조합으로 투여하는 단계를 포함한다.
트라스투주맙 엠탄신 (트라스투주맙-DM1 또는 트라스투주맙-MCC-DM1 (T-DM1로 약칭함)로도 불림)은 세포독소 메르탄신 (DM1)에 연결된 항체 트라스투주맙 (헤르셉틴 (HERCEPTIN)™)으로 이루어지는 항체-약물 접합체이다. 이것은 다음 구조를 갖는다.
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본 개시내용의 또 다른 실시양태는 치료 유효량의 본 개시내용의 항원 결합 단백질을 본원에서 설명되는 적어도 하나의 다른 작용제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암의 치료 방법이다. 상기 작용제는 예를 들어 본 개시내용의 식별번호 <0286> 내지 <0388>에 설명되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 다른 작용제는 트라스투주맙, 퍼투주맙 및 T-DM1로 이루어진 군 중에서 선택된다.
본 개시내용의 항원 결합 단백질은 또한 유방암, 난소암, 위장관암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 자궁내막암, 폐암, 신장암, 두경부암, 신경교종, 흑색종 및 비-흑색종 피부암, 및 다른 HER3 발현 또는 과다발현 암의 군 중에서 선택되고 이로 제한되지 않는 종양에 걸린 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 항원 결합 단백질은 또한 유방암, 난소암, 위장관암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 자궁내막암, 폐암, 신장암, 두경부암, 신경교종, 흑색종 및 비-흑색종 피부암, 및 다른 HER3 발현 또는 과다발현 암의 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
항원 결합 단백질은 HER3 수용체에 결합하여 중화시키고, HER3 수용체에 대한 결합에 대해 서열 1 또는 9의 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 5, 13, 또는 17의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 참조 항체와 경쟁할 수 있다.
별법으로, 항원 결합 단백질은 HER3 수용체에 결합하여 중화시키고, HER3 수용체에 대한 결합에 대해 서열 1 또는 9의 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 5, 13, 또는 17의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 참조 항체와 경쟁할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 HER2 수용체에 결합하지 않는다.
참조 항체는 다음 중쇄 및 경쇄 조합을 포함할 수 있다: (1) 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10; 뮤린 모노클로날 항체; 서열 1 및 5 포함); (2) 뮤린 22A5 항체 (M5.22A5.1G6.1 C10; 뮤린 모노클로날 항체; 서열 9, 13, 및 17 포함); (3) 인간화 15D5 항체 (인간화 모노클로날 항체; 서열 22 및 26 포함); (4) 인간화 1D9 항체 (인간화 모노클로날 항체; 서열 30 및 34 포함); (5) 뮤린 1D9 항체 (뮤린 모노클로날 항체; 서열 44 및 48 포함); (6) 인간화 1D9 RR (인간화 1D9_E 항체로도 불림, 인간화 모노클로날 항체; 서열 30 및 57 포함). 제2 항체인 뮤린 22A5 항체는 상이한 중쇄 및 경쇄 조합이 형성되도록 2개의 경쇄 가변 도메인 (서열 13 및 17)을 갖는다. 참조 항체는 또한 아래 표 17에 기재된 항체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질과 참조 항체 사이의 경쟁은 경쟁 ELISA에 의해 결정할 수 있다. HER3의 중화에 대한 경쟁은 다음 중의 임의의 하나 또는 조합에 의해 결정할 수 있다: 예를 들어 ELISA, FMAT 또는 비아코어™에 의해 결정되는 HER3에 대한 결합에 대한 경쟁; 뉴레굴린 1 및 뉴레굴린 2 리간드에 대한 HER3의 억제에 대한 경쟁; 및 A204 세포 기반 검정에서 루시퍼라제 발현을 야기하는 세포 신호전달의 억제에 대한 경쟁. 경쟁하는 항원 결합 단백질은 동일한 에피토프, 중첩되는 에피토프, 또는 참조 항체가 결합하는 에피토프에 매우 근접하는 에피토프에 결합할 수 있다.
항원 결합 단백질은 HER3 펩티드 단편 또는 인공 펩티드 서열에 유의하게 결합할 수 없다. 항원 결합 단백질은 각각 1:1 내지 1:10의 항원 결합 단백질 대 펩티드의 비율 범위로 HER3 펩티드 단편 또는 인공 펩티드 서열에 결합할 수 있다.
항원 결합 단백질과 HER3 수용체 펩티드 단편 또는 인공 펩티드 서열 사이의 결합 또는 결합의 결여는 ELISA 또는 환원 조건을 이용한 SDS PAGE에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질의 선형 전장 HER3 수용체 서열에 대한 결합 또는 결합의 결여는 환원 SDS PAGE에 의해 결정할 수 있다.
본 개시내용은 또한 HER3 수용체에 결합하여 중화시키고 서열 4, 15, 또는 20의 CDRH3 또는 그의 변이체 CDR을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
항원 결합 단백질은 CDRH1 (서열 2, 10, 또는 31), CDRH2 (서열 3, 11, 또는 32), CDRH3 (서열 4, 12 또는 33), CDRL1 (서열 6, 14, 18, 또는 35), CDRL2 (서열 7, 15, 19, 또는 36), 및 CDRL3 (서열 8, 16, 20, 또는 37); 또는 그의 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 CDR, 또는 모든 CDR을 임의의 조합으로 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원 결합 단백질은 CDRH3 (서열 4, 12 또는 33) 및 CDRH1 (서열 2, 10, 또는 31), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3 (서열 4, 12 또는 33) 및 CDRH2 (서열 3, 11, 또는 32), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH1 (서열 2, 10, 또는 31), CDRH2 (서열 3, 11, 또는 32), 및 CDRH3 (서열 4, 12 또는 33), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 CDRL1 (서열 6, 14, 18, 또는 35) 및 CDRL2 (서열 7, 15, 19, 또는 36), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRL2 (서열 7, 15, 19, 또는 36) 및 CDRL3 (서열 8, 16, 20, 또는 37), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRL1 (서열 6, 14, 18, 또는 35), CDRL2 (서열 7, 15, 19, 또는 36), 및 CDRL3 (서열 8, 16, 20, 또는 37), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 CDRH3 (서열 4, 12 또는 33) 및 CDRL3 (서열 8, 16, 20, 또는 37), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3 (서열 4, 12 또는 33), CDRH2 (서열 3, 11, 또는 32), 및 CDRL3 (서열 8, 16, 20, 또는 37), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3 (서열 4, 12 또는 33), CDRH2 (서열 3, 11, 또는 32), CDRL2 (서열 7, 15, 19, 또는 36), 및 CDRL3 (서열 8, 16, 20, 또는 37), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 CDRH1 (서열 2, 10, 또는 31), CDRH2 (서열 3, 11, 또는 32), CDRH3 (서열 4, 12 또는 33), CDRL1 (서열 6, 14, 18, 또는 35), CDRL2 (서열 7, 15, 19, 또는 36) 및 CDRL3 (서열 8, 16, 20, 또는 37), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 서열 1, 9 또는 30의 가변 도메인 서열의 상응하는 CDRH3 또는 변이체 CDRH3을 포함하는 키메라 또는 인간화 항체인, HER3 수용체에 결합하여 중화시키는 항원 결합 단백질을 제공한다.
키메라 또는 인간화 항원 결합 단백질은 서열 1, 서열 9, 서열 30의 가변 도메인 서열로부터 선택되는 상응하는 CDR, 또는 그의 변이체 CDR 중의 하나 이상, 또는 전부를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 상응하는 CDRH1, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 상응하는 CDRH2, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 별법으로, 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH1, 상응하는 CDRH2, 및 상응하는 CDRH3; 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL1 및 상응하는 CDRL2, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 상응하는 CDRL1, 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 상응하는 CDRL3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3, 상응하는 CDRH2 및 상응하는 CDRL3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 별법으로, 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3, 상응하는 CDRH2, 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH1, 상응하는 CDRH2, 상응하는 CDRH3, 상응하는 CDRL1, 상응하는 CDRL2 및 상응하는 CDRL3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
상응하는 CDR은 카바트 (1987), 코티아 (1989), AbM 또는 접촉 방법을 참조로 규정될 수 있다. 각각의 방법의 하나의 정의는 표 3에서 볼 수 있고, 상응하는 CDR을 결정하기 위해 서열 1, 9 또는 30의 참조 중쇄 가변 도메인 및 서열 5, 13, 17 또는 35의 참조 경쇄 가변 도메인에 적용될 수 있다.
예를 들어, 항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR H3 및 결합 단위 CDR H1, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR H3 및 결합 단위 CDR H2, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR H1, 결합 단위 CDR H2, 및 결합 단위 CDR H3; 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR L1 및 결합 단위 CDR L2, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR L2 및 결합 단위 CDR L3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR L1, 결합 단위 CDR L2, 및 결합 단위 CDR L3; 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR H3 및 결합 단위 CDR L3, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 별법으로, 항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR H3, 결합 단위 CDR H2, 및 결합 단위 CDR L3; 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR H3, 결합 단위 CDR H2, 결합 단위 CDR L2, 및 결합 단위 CDR L3; 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질은 결합 단위 CDR H1, 결합 단위 CDR H2, 결합 단위 CDR H3, 결합 단위 CDR L1, 결합 단위 CDR L2, 및 결합 단위 CDR L3; 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
CDR 변이체 또는 변이체 결합 단위는 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변형은 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적인 변경 (예를 들어, 10개 이하의 아미노산)일 수 있고, 변형은 변이체가 비변형된 서열의 생물학적 특징을 보유하도록 허용한다. 예를 들어, 변이체는 HER3에 결합하여 중화시키는 기능적 변이체이다. CDR 아미노산 서열의 부분적인 변경은 1 내지 몇 개의 아미노산의 결실 또는 치환에 의해, 또는 1 내지 몇 개의 아미노산의 부가 또는 삽입에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 이루어질 수 있다 (예를 들어, 10개 이하의 아미노산). CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열 내에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 임의의 조합으로 함유할 수 있다. CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열 내에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 임의의 조합으로 함유할 수 있다. 아미노산 잔기 내의 치환은 보존적 치환, 예를 들어 하나의 소수성 아미노산의 다른 소수성 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들어, 류신은 발린, 또는 이소류신으로 치환될 수 있다.
설명되는 CDR, 상응하는 CDR, 변이체 CDR, 결합 단위 또는 변이체 결합 단위를 포함하는 항원 결합 단백질은 본원에서 설명되는 참조 항체에 의해 제시되는 효능의 10배 내, 또는 5배 내의 ED50에 의해 입증되는 바, HER3에의 결합에 대한 효능을 보일 수 있다. ED50에 의해 입증되는 바 HER3에의 결합에 대한 효능은 ELISA 검정에 의해 실시할 수 있다.
항원 결합 단백질은 아미노산 위치 54에 아스파라긴 (N)으로부터 아스파르테이트 (D) 또는 글루타민 (Q)으로의 치환을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 항원 결합 단백질 변이체는 아미노산 위치 91에 시스테인 (C)로부터 세린 (S)으로부터의 치환을 갖거나 갖지 않을 수 있다.
본원에서 설명되는 하나 이상의 CDR, 상응하는 CDR, 변이체 CDR 또는 결합 단위는 인간 프레임워크, 예를 들어 인간화 또는 키메라 가변 도메인 내에 존재할 수 있다.
인간화 중쇄 가변 도메인은 서열 1 및 9 내의 인간 가변 도메인 서열에 대해 프레임워크 영역에서 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 수용자 항체 프레임워크 내에 서열 목록에 제시된 CDR, 상응하는 CDR, 결합 단위, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 인간화 경쇄 가변 도메인은 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 수용자 항체 프레임워크 내에 서열 6, 7, 8, 14, 15, 16, 18, 19, 또는 20에 열거된 CDR, 상응하는 CDR, 결합 단위, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질 가변 중쇄는 위치 28에 세린 (S) 아미노산 잔기 및/또는 위치 105에 트레오닌 (T) 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 항원 결합 단백질 가변 경쇄는 위치 16에 아르기닌 (R) 아미노산 잔기 및/또는 위치 71에 티로신 (Y) 아미노산 잔기 및/또는 위치 100에 알라닌 (A) 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 가변 중쇄의 위치 28에 세린 (S) 및 가변 경쇄의 위치 71에 티로신 (Y)을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 HER3에 결합하여 중화시키고 다음의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 조합 중의 임의의 하나를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다: (1) 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10; 뮤린 모노클로날 항체; 서열 1 및 5 포함); (2) 뮤린 22A5 항체 (M5.22A5.1G6.1 C10; 뮤린 모노클로날 항체; 서열 9, 13, 및 17 포함); (3) 인간화 15D5 항체 (인간화 모노클로날 항체; 서열 22 및 26 포함); (4) 인간화 1D9 항체 (인간화 모노클로날 항체; 서열 30 및 34 포함); (5) 뮤린 1D9 항체 (뮤린 모노클로날 항체; 서열 44 및 48 포함); (6) 인간화 1D9 RR (인간화 1D9_E 항체로도 불림, 인간화 모노클로날 항체; 서열 30 및 57 포함).
임의의 중쇄 가변 영역이 적합한 인간 불변 영역과 조합될 수 있다. 임의의 경쇄 가변 영역이 적합한 불변 영역과 조합될 수 있다.
상기 설명한 항원 결합 단백질, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 변형 및/또는 삽입, 결실 또는 치환에 의한 서열의 부분적인 변경을 갖는 변이체, 또는 상기 설명한 임의의 서열에 대해 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 것은 (1) M5 15D5 2A1 1H10 (뮤린 모노클로날 항체; 서열 1 및 5 포함); (2) M5_22A5 1G6 1 C10 (뮤린 모노클로날 항체; 서열 9, 13, 및 17 포함); (3) 인간화 15D5 (인간화 모노클로날 항체; 서열 22 및 26 포함); (4) 인간화 1D9 (인간화 모노클로날 항체; 서열 30 및 34 포함); (5) 뮤린 1D9 (뮤린 모노클로날 항체; 서열 44 및 48 포함); (6) 인간화 1D9_E (인간화 모노클로날 항체; 서열 30 및 57 포함)에 의해 제시되는 효능의 10배 내, 또는 5배 내의 ED50에 의해 입증되는 바 HER3에의 결합에 대한 효능을 보일 수 있다. ED50에 의해 입증되는 바 HER3에의 결합에 대한 효능은 ELISA 검정에 의해 실시할 수 있다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 HER3 수용체의 펩티드 단편에 결합하지 않을 수 있다. HER3 수용체의 펩티드 단편은 HER3 서열의 14개 이하의 아미노산으로 이루어지는 임의의 단편일 수 있다. HER3의 펩티드 단편은 선형일 수 있다. HER3의 펩티드 단편은 전장 서열을 포함하는 HER3 수용체 서열의 임의의 단편일 수 있고, 여기서 서열은 선형이다.
항원 결합 단백질과 HER3 펩티드 단편 또는 인공 펩티드 서열 사이의 결합 또는 결합의 결여는 ELISA 또는 환원 조건을 이용한 SDS PAGE에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질의 선형 전장 HER3 서열에 대한 결합 또는 결합의 결여는 환원 (즉, 변성) SDS PAGE에 의해 결정할 수 있다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질이 결합하는 HER3 수용체의 에피토프는 입체형태적 또는 불연속적 에피토프일 수 있다. 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 HER3 수용체 상의 선형 에피토프에 결합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 HER3 수용체의 환원된 또는 변성된 샘플에 결합하지 않을 수 있다. 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 HER3 수용체 결합 부위와 동일하거나, 유사하거나, 중첩될 수 있다. 에피토프는 HER3 수용체가 그의 성숙 형태이고 또 다른 수용체 분자와의 이량체의 일부로서 존재할 때 접근가능할 수 있다. 에피토프는 또한 HER3 수용체가 그의 성숙 형태이고 설명되는 바와 같은 다른 HER3 수용체 분자와의 사량체의 일부로서 존재할 때 접근가능할 수 있다. 에피토프는 2개의 HER3 수용체 폴리펩티드에 걸쳐 분포할 수 있다. 상기 유형의 불연속적 에피토프는 각각의 HER3 수용체 분자로부터의 서열을 포함할 수 있다. 서열은 이량체의 3차 및 4차 구조의 측면에서 에피토프를 형성하기 위해 서로 충분히 가깝고 항원 결합 단백질에 의해 결합될 수 있다. 입체형태적 및/또는 불연속적 에피토프는 공지의 방법, 예를 들어 클립스(CLIPS)™ (펩스캔 시스템즈 (Pepscan Systems))에 의해 확인될 수 있다.
항원 결합 단백질의 반감기는 인간, 또는 뮤린 동물 모델에서 생체내에서 적어도 6시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 7일, 또는 적어도 9일일 수 있다.
항체의 Fc 효과기 부분의 돌연변이 변화는 항체 턴오버 (turnover)를 조정하기 위해 FcRn과 항체 사이의 상호작용의 친화도를 변경하기 위해 사용될 수 있다. 항체의 반감기는 생체내에서 연장될 수 있다. 이것은 보다 긴 시간 동안 생체내 IC50을 유지한 결과로서 최대 용량 및 최대 투여 빈도가 달성될 수 있기 때문에 환자 집단에 유익할 것이다.
항원 결합 단백질이 결합하는 HER3 수용체 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. HER3 수용체는 용액에 존재할 수 있거나, 또는 고체 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, HER3 수용체는 비드, 예컨대 자기 비드에 부착될 수 있다. 추가로, HER3 수용체는 비오티닐화될 수 있다. HER3 수용체에 접합된 비오틴 분자는 비오틴/스트렙타비딘을 고체 표면 상에 커플링시킴으로써 HER3을 고체 표면 상에 고정시키기 위해 사용될 수 있다.
항원 결합 단백질은 래트, 마우스, 영장류 (예를 들어, 시노몰구스, 구세계 원숭이 또는 유인원), 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질은 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다.
항원 결합 단백질은 임의의 이소형 또는 하위클래스일 수 있는 불변 영역을 포함할 수 있다. 불변 영역은 IgG 이소형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그의 변이체일 수 있다. 항원 결합 단백질 불변 영역은 IgG1일 수 있다.
항원 결합 단백질은 항체가 향상된 효과기 기능/ADCC 및/또는 보체 활성화를 갖도록 돌연변이된 불변 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 문헌 [Shields, et al., J. Biol. Chem. (2001) 276:6591-6604], [Lazar, et al., PNAS (2006) 103:4005-4010] 및 US6737056, WO2004063351 및 WO2004029207에 기재되어 있다.
항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질이 향상된 효과기 기능/ADCC 및/또는 보체 활성화를 갖도록 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생산하는 적합한 방법의 예는 WO2003/011878, WO2006/014679, 및 EP1229125에 기재되어 있다.
본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 중쇄 가변 또는 전장 서열을 모두 코딩하는 서열; 및 경쇄 가변 또는 전장 서열을 포함할 수 있다. 별법으로, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 중쇄 가변 또는 전장 서열을 코딩하는 서열; 또는 경쇄 가변 또는 전장 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본원에서 설명되는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 또한 제공한다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 적합한 숙주 세포 내에서 생산될 수 있다. 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 생산 방법은 본원에서 설명되는 숙주 세포를 배양하고 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 재조합 형질전환된, 형질감염된, 또는 형질도입된 숙주 세포는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함할 수 있고, 여기서 상기 발현 카세트는 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드르르 추가로 포함한다. 별법으로, 재조합 형질전환된, 형질감염된 또는 형질도입된 숙주 세포는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함할 수 있고, 여기서 제1 발현 카세트는 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 카세트를 추가로 포함한다. 안정적으로 형질전환된 숙주 세포는 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 숙주 세포는 경쇄를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄를 코딩하는 제2 벡터를 포함할 수 있다.
숙주 세포는 진핵, 예를 들어, 포유동물 세포일 수 있다. 그러한 세포주의 예는 CHO 또는 NS0를 포함한다. 숙주 세포는 배양 배지, 예를 들어, 혈청-비함유 배양 배지에서 배양할 수 있다. 항원 결합 단백질은 숙주 세포에 의해 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질을 함유하는 상기 배양 배지에 대해 적어도 95% 이상 (예를 들어, 98% 이상)으로 정제할 수 있다. 상이한 배지 조성 및 주변 조건에서 세포를 배양하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
항원 결합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공할 수 있다. 제약 조성물을 사용설명서와 함께 포함하는 부분품 키트 (kit-of-parts)를 제공할 수 있다. 편의상, 키트는 사용설명서와 함께 예정량의 시약을 포함할 수 있다.
항체 구조
무손상 항체
대부분의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 및 람다로 불리는 두 유형 중의 하나로 지정될 수 있다. 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 인간 항체는 5개의 상이한 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM에 지정될 수 있다. IgG 및 IgA는 하위클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 IgA1 및 IgA2로 다시 세분될 수 있다. 종 변이체가 존재하고, 마우스 및 래트는 적어도 IgG2a, IgG2b를 갖는다.
가변 영역의 보다 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 무손상 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다.
불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 대한 참여, Fcγ 수용체에 대한 결합을 통한 식세포작용, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 통한 반감기/클리어런스율 및 보체 케스케이드의 C1q 성분을 통한 보체 의존적 세포독성을 보인다.
인간 IgG2 불변 영역은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키거나 또는 항체-의존 세포성 세포독성을 매개하는 능력이 본질적으로 결여된 것으로 보고되었다. IgG4 불변 영역은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력이 결여된 것으로 보되었고, 항체-의존 세포성 세포독성을 단지 약하게 매개한다. 상기 효과기 기능이 본질적으로 결여된 항체는 '비-용해성' 항체로 불릴 수 있다.
인간 항체
인간 항체는 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 생산될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용하여 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다 (문헌 [Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001] 및 [Brodeur, MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987] 참조). 다른 방법은 둘 모두 인간 가변 영역 레퍼토리를 이용하는 파지 라이브러리 또는 트랜스제닉 마우스의 사용을 포함한다 (문헌 [Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12:433-455]; [Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23] 참조).
그의 마우스 이뮤노글로불린 좌위가 인간 이뮤노글로불린 유전자 세그먼트로 교체된 트랜스제닉 마우스의 몇몇 주 (strain)가 현재 이용가능하다 (문헌 [Tomizuka (2000) PNAS 97:722-727]; [Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851], [Mendez (1997), Nature Genetics, 15, 146-156] 참조). 항원 시험접종시에, 상기 마우스는 그로부터 관심 항체를 선택할 수 있는 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있다.
인간 항원 결합 단백질 (및 그의 단편)를 생산하기 위해 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다 (문헌 [McCafferty (1990) Nature 348: 552-553] 및 [Griffiths, et al., EMBO 13: 3245-3260 (1994)] 참조).
친화도 성숙 기술 (Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783)은 결합 친화도를 개선하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 H 및 L 사슬 가변 영역을 순차적으로 천연 생성 변이체로 교체하고 개선된 결합 친화도를 기초로 하여 선택함으로써 1차 인간 항체의 친화도가 개선된다. "에피토프 임프린팅 (imprinting)"과 같은 상기 기술의 변형도 현재 이용가능하다 (예를 들어 WO 93/06213 및 문헌 [Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266] 참조).
키메라 및 인간화 항체
키메라 항체는 일반적으로 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산된다. 항체를 코딩하는 DNA (예를 들어, cDNA)는 통상적인 절차를 사용하여 단리되고 서열결정된다 (예를 들어, 항체의 H 및 L 사슬을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 일반적인 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 삽입된 후, 항체의 합성을 달성하기 위해 본래는 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이, COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염된다. DNA는 인간 L 및 H 사슬의 코딩 서열로 대응하는 비-인간 (예를 들어, 뮤린) H 및 L 불변 영역을 치환함으로써 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison (1984) PNAS 81: 6851] 참조).
인간화 항체를 생성하기 위해 단지 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 ("공여자" 항체)의 CDR만을 인간 프레임워크 ("수용자 프레임워크") 및 불변 영역 상에 그라프팅함으로써 면역원성의 큰 감소를 달성할 수 있다 (문헌 [Jones, et al., (1986) Nature 321, 522-525] 및 [Verhoeyen, et al., (1988) Science 239, 1534-1536] 참조). 그러나, CDR 그라프팅 그 자체는 항원 결합 특성의 완전한 보유를 달성할 수는 없고, 유의한 항원 결합 친화도가 회복되어야 할 경우, 공여자 항체의 일부 프레임워크 잔기 (때로 "역돌연변이"로 불림)가 인간화된 분자에 보존될 필요가 있음이 종종 밝혀졌다 (문헌 [Queen, et al. (1989) PNAS 86: 10,029-10,033], [Co, et al. (1991) Nature 351: 501-502] 참조). 이 경우에, 비-인간 공여자 항체에 대해 가장 큰 서열 상동성을 보이는 인간 가변 영역은 인간 프레임워크 (FR)를 제공하기 위해 데이터베이스로부터 선택된다. 인간 FR은 인간 컨센서스 또는 개별적인 인간 항체로부터 선택될 수 있다. 필요한 경우, 공여자 항체로부터의 핵심 잔기는 CDR 입체형태를 보존하기 위해 인간 수용자 프레임워크 내로 치환된다. 항체의 컴퓨터 모델링은 상기 구조적으로 중요한 잔기의 확인을 돕기 위해 사용될 수 있다 (WO 99/48523 참조).
별법으로, 인간화는 "베니어링 (veneering)" 과정에 의해 달성될 수 있다. 특유의 인간 및 뮤린 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 통계적 분석은 노출된 잔기의 정확한 패턴이 인간 및 뮤린 항체에서 상이하고, 대부분의 개별적인 표면 위치는 소수의 상이한 잔기를 강하게 선호함을 보여주었다 (문헌 [Padlan, et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498]; 및 [Pedersen, et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 959-973] 참조). 따라서, 인간 항체에서 일반적으로 발견되는 것과 상이한 그의 프레임워크 영역 내의 노출된 잔기를 교체함으로써 비-인간 Fv의 면역원성을 감소시키는 것이 가능하다. 단백질 항원성은 표면 접근성과 밀접하게 관련될 수 있기 때문에, 표면 잔기의 교체가 마우스 가변 영역을 인간 면역계에 대해 "보이지 않도록" 만들기에 충분할 수 있다 (또한, 문헌 [Mark, et al. (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134] 참조). 상기 인간화 절차는 항체의 표면만이 변경되고, 지지하는 잔기는 그대로 유지되기 때문에 "베니어링"으로 언급된다. 추가의 다른 방법은 WO04/006955에 제시된 것 및 박테리아 발현 시스템을 이용하고 서열이 인간 배선에 근접한 항체를 생산하는 휴머니어링(HUMANEERING)™ (칼로바이오스 (Kalobios)) 절차 (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California)를 포함한다.
이중특이적 항원 결합 단백질
이중특이적 항원 결합 단백질은 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항원 결합 단백질이다. 이러한 항원 결합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항원 결합 단백질의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 H 사슬-L 사슬쌍의 동시 발현에 기초하며, 여기서 두개의 H 사슬은 상이한 결합 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein, et al. (1983) Nature 305: 537-539]; WO 93/08829; 및 [Traunecker, et al. (1991) EMBO 10: 3655-3659] 참조). H 및 L 사슬의 무작위 분류로 인해, 10개의 상이한 항체 구조의 잠재적 혼합물이 생성되며, 이중 단지 하나만이 목적하는 결합 특이성을 갖는다. 대안적인 접근법은 목적하는 결합 특이성을 갖는 가변 도메인을 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역에 융합시키는 것을 포함한다. 경쇄 결합에 요구되는 부위를 함유하는 CH1 영역이 하나 이상의 융합체에 존재한다. 이러한 융합체를 코딩하는 DNA, 및 요구되는 경우, L 사슬이 별개의 발현 벡터로 삽입된 후, 적합한 숙주 유기체로 동시-형질감염된다. 또한, 2개 또는 3개의 모든 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터 내에 삽입하는 것이 가능하다. 하나의 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 (arm)에서의 제1 결합 특이성을 갖는 H 사슬 및 H-L 사슬쌍으로 이루어지고, 여기서 제2 결합 특이성은 다른 아암에 존재한다. WO 94/04690을 참조하고; 또한 문헌 [Suresh, et al. (1986) Methods in Enzymology 121: 210]을 참조한다.
항원 결합 단편
불변 영역이 결여된 단편에는 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키거나 또는 항체-의존 세포성 세포독성을 매개하는 능력이 결여된다. 전통적으로, 이러한 단편은 예를 들어, 파파인 소화에 의한 온전한 항체의 단백질 분해 소화에 의해 생산되지만 (예를 들어, WO 94/29348 참조), 재조합 방식으로 형질전환된 숙주 세포로부터 직접 생산될 수 있다. ScFv의 생산에 있어서는 문헌 [Bird, et al. (1988) Science, 242: 423-426]을 참조한다. 또한, 항원 결합 단편은 아래에서 설명되는 바와 같이 다양한 조작 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
Fv 단편은 Fab 단편보다 이들의 2개의 사슬의 상호작용 에너지가 더 낮은 것으로 보인다. VH와 VL 도메인의 회합을 안정화시키기 위해, 이들은 펩티드 (문헌 [Bird, et al. (1988) Science 242: 423-426]; [Huston, et al. (1988) PNAS 85(16): 5879-5883]), 디술피드 가교 (Glockshuber, et al. (1990) Biochemistry 29: 1362-1367) 및 "놉 인 홀 (knob in hole)" 돌연변이 (Zhu, et al. (1997), Protein Sci., 6: 781-788)로 연결되었다. ScFv 단편은 당업자에게 주지된 방법에 의해 생성될 수 있다 (문헌 [Whitlow, et al. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105] 및 [Huston, et al. (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217]). ScFv는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이 또는 진핵 세포에서 생성될 수 있다. ScFv의 한 단점은, 다가 결합에 의한 결합력 증가를 불가능하게 만드는 생성물의 1가성 및 이들의 짧은 반감기이다. 이들 문제점을 극복하기 위한 시도는 화학적 커플링 (문헌 [Adams, et al. (1993) Can. Res 53: 4026-4034] 및 [McCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8: 301-314]) 또는 쌍을 이루지 않은 C-말단 시스테인 잔기를 함유하는 ScFv의 자발적인 부위 특이적 이량체화에 의해 추가의 C-말단 시스테인을 함유하는 ScFv로부터 생산된 2가 (ScFv')2를 포함한다 (문헌 [Kipriyanov, et al. (1995) Cell. Biophys 26, 187-204] 참조). 별법으로, ScFv는 3 내지 12개 잔기로 펩티드 링커를 짧게 함으로써 다량체를 형성하여 "디아바디"를 형성하게 할 수 있다 (문헌 [Holliger, et al. (1993) PNAS 90: 6444-6448] 참조). 링커를 감소시키는 것은 추가로 ScFv 삼량체 ("트리아바디 (triabody)", 문헌 [Kortt, et al. (1997) Protein Eng 10: 423-433] 참조) 및 사량체 ("테트라바디 (tetrabody)", 문헌 [Le Gall, et al. (1999) FEBS Lett, 453: 164-168] 참조)를 발생시킬 수 있다. 2가 ScFv 분자의 구축은 또한 단백질 이량체화 모티프와의 유전적 융합에 의해 달성되어 "미니항체 (miniantibody)" (문헌 [Pack, et al. (1992) Biochemistry 31, 1579-1584] 참조) 및 "미니바디 (minibody)" (문헌 [Hu, et al. (1996) Cancer Res. 56, 3055-3061] 참조)를 형성할 수 있다. ScFv-Sc-Fv 탠덤 (tandem) ((ScFv)2)은 또한 제3 펩티드 링커에 의해 두개의 ScFv 단위를 연결함으로써 생성될 수 있다 (문헌 [Kurucz, et al. (1995) J. Immol. 154: 4576-4582] 참조). 이중특이적 디아바디는 한 항체의 VL 도메인에 짧은 링커에 의해 연결된 또 다른 항체의 VH 도메인으로 이루어진 2개의 단일쇄 융합 생성물의 비공유 회합을 통해 생성될 수 있다 (문헌 [Kipriyanov, et al. (1998), Int. J. Can 77: 763-772] 참조). 이러한 이중특이적 디아바디의 안정성은 상기 설명된 바와 같은 디술피드 가교 또는 "놉 인 홀" 돌연변이의 도입에 의해 또는 2개의 하이브리드 ScFv 단편이 펩티드 링커를 통해 연결된 단일쇄 디아바디 (ScDb)의 형성에 의해 향상될 수 있다 (문헌 [Kontermann, et al. (1999) J. Immunol. Methods 226: 179-188] 참조). 4가 이중특이적 분자는 예를 들어 ScFv 단편을 IgG 분자의 CH3 도메인 또는 Fab 단편에 힌지 영역을 통해 융합시킴으로써 이용가능하다 (문헌 [Coloma, et al. (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163] 참조). 별법으로, 4가 이중특이적 분자는 이중특이적 단일쇄 디아바디의 융합에 의해 생성되었다 (문헌 [Alt, et al. (1999) FEBS Lett 454: 90-94] 참조). 보다 작은 4가 이중특이적 분자는 또한 나선-루프-나선 (helix-loop-helix) 모티프를 함유하는 링커와의 ScFv-ScFv 탠덤 (DiBi 미니항체, 문헌 [Muller, et al. (1998) FEBS Lett 432: 45-49] 참조) 또는 분자내 쌍형성이 방지되는 배향으로 4개의 항체 가변 도메인 (VH 및 VL)을 포함하는 단일쇄 분자 (탠덤 디아바디, 문헌 [Kipriyanov, et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56] 참조)의 이량체화에 의해 형성될 수 있다. 이중특이적 F(ab')2 단편은 Fab' 단편의 화학적 커플링 또는 류신 지퍼를 통한 이종이량체화를 통해 생성될 수 있다 (문헌 [Shalaby, et al, (1992) J. Exp. Med. 175: 217-225] 및 [Kostelny, et al. (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553] 참조). 또한, 단리된 VH 및 VL 도메인 (도만티스 피엘시 (Domantis plc))이 이용가능하다. US 6,248,516; US 6,291,158; 및 US 6,172,197을 참조한다.
이종접합체 항체
이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 형성된 2개의 공유 연결된 항체로 이루어진다. 예를 들어, US 4,676,980을 참조한다.
다른 변형
본 개시내용의 항원 결합 단백질은 이들의 효과기 기능을 향상 또는 변화시키는 다른 변형을 포함할 수 있다. 항체의 Fc 영역과 다양한 Fc 수용체 (FcγR) 간의 상호작용은 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC), 보체의 고정, 식세포작용 및 항체의 반감기/클리어런스를 포함하는 항체의 효과기 기능을 매개하는 것으로 생각된다. 항체의 Fc 영역에 대한 다양한 변형이 목적하는 특성에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 용해 항체를 비-용해 항체가 되도록 하는 Fc 영역에서의 특이적 변이는 EP 0629 240 및 EP 0307 434에 기재되어 있거나, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 내에 편입시킬 수 있다 (US 5,739,277 참조). 인간 Fcγ 수용체는 FcγR(I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 신생아 FcRn을 포함한다. 문헌 [Shields, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604]은 IgG1 잔기의 공통된 세트가 모든 FcγR 결합에 관여하지만, FcγRII및 FcγRIII은 이러한 공통된 세트 이외의 별개의 부위를 이용함을 입증하였다. IgG1 잔기의 한 기가 알라닌으로 변경되는 경우 모든 FcγR에 대한 결합을 저하시킨다: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 및 Pro-239. 이들은 모두 IgG CH2 도메인에 위치하며, CH1 및 CH2를 결합시키는 힌지 근처에서 덩어리를 이룬다. FcγRI가 결합을 위해 단지 IgG1 잔기의 공통된 세트를 이용하는 반면, FcγRII및 FcγRIII은 공통된 세트에 더하여 별개의 잔기와 상호작용한다. 일부 잔기의 변경은 단지 FcγRII (예를 들어, Arg-292) 또는 FcγRIII (예를 들어, Glu-293)에 대한 결합을 저하시켰다. 일부 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대한 개선된 결합을 나타냈지만, 다른 수용체에 대한 결합에는 영향을 미치지 못하였다 (예를 들어, Ser-267Ala는 FcγRII에 대한 결합은 개선하였지만, FcγRIII에 대한 결합에는 영향을 미치지 못하였다). 기타 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대한 개선된 결합을 나타냈으며, 다른 수용체에 대한 결합은 저하되었다 (예를 들어, Ser-298Ala는 FcγRIII에 대한 결합을 개선하였지만, FcγRII에 대한 결합은 저하시켰다). FcγRIIIa에 있어서, 가장 우수한 결합 IgG1 변이체는 Ser-298, Glu-333 및 Lys-334에서 조합된 알라닌 치환을 가졌다. 신생아 FcRn 수용체는 항체 클리어런스 및 조직에 걸친 트랜스시토시스 (transcytosis) 둘 모두에 관여하는 것으로 생각된다 (문헌 [Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57] 및 [Ghetie, et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766] 참조). 인간 FcRn과 직접 상호작용하는 것으로 결정된 인간 IgG1 잔기는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다. 본 섹션에서 설명된 임의의 위치에서의 치환은 항체의 증가된 혈청 반감기 및/또는 변형된 효과기 특성을 가능하게 할 수 있다.
다른 변형은 항체의 글리코실화 변이체를 포함한다. 이들의 불변 영역에서 보존된 위치에서의 항체의 글리코실화는 항체 기능, 특히 상기 기술된 바와 같은 효과기 기능에 현저하게 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Boyd, et al. (1996), Mol. Immunol. 32: 1311-1318] 참조). 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 부가되거나, 치환되거나, 결실되거나 변형된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 글리코실화 변이체가 고려된다. 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 모티프의 도입은 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 부착을 위한 잠재적인 부위를 생성시키며, 따라서, 항체의 글리코실화를 조작하는데 사용될 수 있다. 문헌 [Raju, et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876]에서, TNFR-IgG 이뮤노어드헤신의 말단 시알릴화는 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 및/또는 알파, 2,3 시알릴트랜스퍼라제를 사용하여 재갈락토실화 및/또는 재시알릴화의 공정을 통해 증가되었다. 말단 시알릴화의 증가는 이뮤노글로불린의 반감기를 증가시키는 것으로 생각된다. 대부분의 당단백질과 함께 항체는 통상적으로 당형의 혼합물로서 생성된다. 이러한 혼합물은 특히 항체가 진핵생물, 특히 포유동물 세포에서 생산되는 경우 명백해진다. 규정된 당형을 제조하기 위한 다양한 방법이 개발되었다 (문헌 [Zhang, et al. Science (2004): 303: 371], [Sears, et al. Science, (2001) 291: 2344], [Wacker, et al. (2002) Science, 298: 1790], [Davis, et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579], [Hang, et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727] 참조). 본원에서 설명되는 항체 (아마도, IgG 이소형, 예를 들어, IgG1의)는 규정된 수 (예를 들어, 7개 이하, 예를 들어 5개 이하, 예를 들어, 2개 또는 1개)의 당형(들)을 포함할 수 있다.
항체를 비-단백질성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 커플링시킬 수 있다. PEG에 대한 단백질의 접합은 단백질의 반감기를 증가시키고, 단백질의 항원성 및 면역원성을 감소시키는 확립된 기술이다. 상이한 분자량 및 유형 (선형 또는 분지형)을 이용하는 PEG화의 이용이 무손상 항체 및 Fab' 단편을 사용하여 연구되었다. 문헌 [Koumenis et al., (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95]을 참조한다.
생산 방법
항원 결합 단백질은 트랜스제닉 유기체, 예컨대 염소 (문헌 [Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157] 참조), 닭 (문헌 [Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55] 참조), 마우스 (문헌 [Pollock, et al.] 참조) 또는 식물 (문헌 [Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204]; [Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606]; [Baez, et al. (2000) BioPharm 13: 50-54]; [Stoger, et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590] 참조)에서 생산될 수 있다.
항원 결합 단백질은 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 항원 결합 단백질은 통상적으로 당업자에게 공지된 재조합 세포 배양 기술을 이용하여 생산된다. 항원 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단리되고, 복제가능한 벡터, 예컨대 추가의 클로닝 (증폭) 또는 발현을 위한 플라스미드 내로 삽입된다. 하나의 발현 시스템은 글루타메이트 신테타제 시스템 (예를 들어, 론자 바이올로직스 (Lonza Biologics)에 의해 판매됨)이며, 특히 여기서 숙주 세포는 CHO 또는 NS0이다. 항원 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브)를 사용하여 용이하게 단리되고 서열결정된다. 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포손, 미니염색체를 포함하며, 여기서 플라스미드가 일반적으로 사용된다. 일반적으로, 이러한 벡터는 추가로 발현을 촉진하기 위해 항원 결합 단백질 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 벡터로 삽입되고, 예를 들어 동일한 숙주 세포 내로 동시에 또는 순차적으로 형질전환, 형질감염, 전기천공 또는 형질도입에 의해 도입되거나, 또는 필요한 경우 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 상기 도입 전에 동일한 벡터 내로 삽입될 수 있다.
코돈 최적화는 숙주 세포에 의해 생산된 단백질의 총 수준이 야생형 서열로 형질감염될 때의 수준에 비해 코돈-최적화된 유전자로 형질감염될 때 더 크다는 것을 고려하여 사용될 수 있다. 몇몇의 방법이 공개되었다 (문헌 [Nakamura, et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215]; W098/34640; W097/11086). 유전자 코드의 중복성으로 인해, 본원에 개시된 것에 대한 대안적인 폴리뉴클레오티드 (특히, 제시된 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)가 또한 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 코딩할 수 있다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질의 코돈 사용 빈도는 전사체 및/또는 생성물 수율을 증대시키기 위해 숙주 세포의 코돈 편향 (bias)을 수용하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoekema, et al., (1987), Mol Cell Biol 7(8): 2914-24]). 코돈은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 적합한 상용성을 기초로 하여 선택될 수 있다.
신호 서열
항원 결합 단백질은 성숙 단백질의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 이종성 신호 서열을 갖는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되어야 한다. 원핵 숙주 세포에 있어서, 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 또는 열 안정성 장독소 II 리더일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 전환효소 리더, α 인자 리더 또는 산 포스파타제 리더일 수 있다 (예를 들어, WO 90/13646 참조). 포유동물 세포 시스템에서, 바이러스 분비 리더, 예컨대 단순 헤르페스 gD 신호 및 천연 이뮤노글로불린 신호 서열이 적합할 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 결찰된다.
복제 기점
복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합한 pBR322, 대부분의 효모에 대한 2μ 플라스미드, 및 대부분의 포유동물 세포에 대한 다양한 바이러스 기원, 예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필수적이지 않으나, SV40은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.
선택 마커
전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구 결핍을 보완하거나 복합 배지에서 이용불가능한 영양소를 제공하거나, 또는 (c) 이 둘의 조합을 제공하는 단백질을 코딩한다. 선택 방식은 숙주 세포의 성장을 정지시키는 것을 수반할 수 있다. 항원 결합 단백질을 코딩하는 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 예를 들어 동시 전달된 선택 마커에 의해 부여된 약물 내성으로 인해 생존한다. 일례는 소위 DHFR 선택 마커이며, 여기서 형질전환체는 메토트렉세이트의 존재 하에 배양된다. 세포는 증가하는 양의 메톡트렉세이트의 존재 하에 배양되어 관심 외인성 유전자의 카피수를 증폭시킨다. CHO 세포는 DHFR 선택에 특히 유용한 세포주이다. 추가의 예는 글루타메이트 신테타제 발현 시스템이다 (론자 바이올로직스). 효모에 사용하기에 적합한 선택 유전자는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb, et al. (1979) Nature 282: 38] 참조).
프로모터
항원 결합 단백질을 발현하기에 적합한 프로모터는 항원 결합 단백질을 코딩하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 원핵 숙주용 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, Tac를 포함한다. 효모 세포에서 발현에 적합한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당작용 효소, 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스 6 포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 및 글루코키나제를 포함한다. 유도가능한 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 메탈로티오네인 및 질소 대사 또는 말토스/갈락토스 이용을 담당하는 효소를 포함한다.
포유동물 세포 시스템에서 발현을 위한 프로모터는 바이러스 프로모터, 예를 들어, 폴리오마, 계두 및 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스 (특히, 최조기 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터 및 초기 또는 후기 원숭이 바이러스 40을 포함한다. 물론, 프로모터는 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적합한 상용성을 기초로 하여 선택한다. 제1 플라스미드는 RSV 및/또는 SV40 및/또는 CMV 프로모터, 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩하는 DNA, κC 영역과 함께 네오마이신 및 암피실린 내성 선택 마커를 포함하고, 제2 플라스미드는 RSV 또는 SV40 프로모터, 중쇄 가변 영역 (VH)을 코딩하는 DNA, γ1 불변 영역을 코딩하는 DNA, DHFR 및 암피실린 내성 마커를 포함한다.
인핸서 요소
적절한 경우에, 예를 들어, 고등 진핵 세포에서의 발현을 위해, 벡터 내의 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 인핸서 요소가 사용될 수 있다. 포유동물 인핸서 서열은 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 태아단백질 및 인슐린으로부터의 인핸서 요소를 포함한다. 별법으로, 원핵 세포 바이러스로부터의 인핸서 요소, 예를 들어, SV40 인핸서 (bp 100-270), 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 바큘로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 좌위로부터의 인핸서 요소를 사용할 수 있다 (WO04/009823 참조). 인핸서는 프로모터의 상류 부위에서 벡터에 위치할 수 있다. 별법으로, 인핸서는 다른 부위에, 예를 들어 비번역 영역 내에 또는 폴리아데닐화 신호의 하류에 위치할 수 있다. 인핸서의 선택 및 위치는 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적합한 상용성을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
폴리아데닐화 /종결
진핵 시스템에서, 폴리아데닐화 신호는 항원 결합 단백질을 코딩하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 이러한 신호는 통상적으로 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치한다. 포유동물 시스템에서, 비제한적인 예는 성장 호르몬, 신장 인자-1 알파 및 바이러스 (예를 들어, SV40) 유전자 또는 레트로바이러스 긴 말단 반복체로부터 유래된 신호를 포함한다. 효모 시스템에서, 폴리아데닐화/종결 신호의 비제한적 예는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 및 알콜 데히드로게나제 1 (ADH) 유전자로부터 유래된 것을 포함한다. 원핵 시스템에서, 통상적으로 폴리아데닐화 신호가 요구되지 않으며, 대신 더 짧고 더욱 규정된 종결인자 서열의 사용이 일반적이다. 폴리아데닐화/종결 서열은 발현을 위해 사용된 숙주 세포와의 적합한 상용성을 기초로 하여 선택될 수 있다.
다른 방법/수율 향상을 위한 요소
상기 성분 이외에, 수율을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 다른 특징은 크로마틴 재형성 요소, 인트론 및 숙주 세포 특이적 코돈 변형을 포함한다.
숙주 세포
항원 결합 단백질을 코딩하는 벡터를 클로닝하고 발현시키기 위해 적합한 숙주 세포는 원핵, 효모 또는 고등 진핵 세포이다. 적합한 원핵 세포로는 유박테리아, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에, 예를 들어, 에스케리키아 (Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이 (예를 들어, ATCC 31,446; 31,537; 27,325), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 프로테우스 (Klebsiella Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 및 바실루스 (Bacilli), 예를 들어, 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) (DD 266 710 참조), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스 (Streptomyces)를 포함한다. 효모 숙주 세포 중에서, 사카로미세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) (예를 들어, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070, 문헌 [Peng, et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192] 참조), 칸디다 (Candida), 트리코더마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244 234), 페니실린, 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어, 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니게르 (A. niger)가 또한 고려된다.
고등 진핵 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장주 293, 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK) (ATCC CRL 1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO. CRL 1573), 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO (예를 들어, CHO-K1, ATCC NO: CCL 61), DHFR-CHO 세포주, 예컨대 DG44 (문헌 [Urlaub, et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12: 555-556] 참조), 특히 현탁 배양액에 적합한 CHO 세포주, 마우스 세르톨리 세포, 원숭이 신장 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개 신장 세포 (ATCC CCL 34), 인간 폐 세포 (ATCC CCL 75), Hep G2, 및 골수종 또는 림프종 세포, 예를 들어, NS0 (US 5,807,715 참조), Sp2/0, Y0을 포함한다.
상기 숙주 세포는 또한 항원 결합 단백질의 품질, 기능 및/또는 수율을 변형하기 위해 추가로 조작되거나 개조될 수 있다. 비제한적인 예는 특이적 변형 (예를 들어, 글리코실화) 효소 및 단백질 폴딩 샤페론 (chaperone)의 발현을 포함한다.
세포 배양 방법
항원 결합 단백질을 코딩하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 배양될 수 있다. 숙주 세포는 스피너 플라스크 (spinner flask), 롤러 병 (roller bottle) 또는 중공사 시스템에서 배양될 수 있으나, 대규모 생성을 위해서는, 교반 탱크 반응기가 특히 현탁 배양에 사용된다. 교반 탱커는 예를 들어 스파저 (sparger), 배플 (baffle) 또는 저전단 임펠러를 사용하여 폭기시키기 위해 개조될 수 있다. 기포 칼럼 및 에어리프트 반응기에 있어서, 공기 또는 산소 기포를 이용하는 직접 폭기가 이용될 수 있다. 숙주 세포가 혈청 비함유 배양 배지에서 배양되는 경우, 배지에는 세포 보호제, 예를 들어, 플루로닉 (pluronic) F-68이 보충되어 폭기 과정으로 인한 세포 손상의 방지를 돕는다. 숙주 세포 특징에 따라, 미세담체가 부착 의존성 세포주에 대한 성장 기질로서 사용될 수 있거나, 세포는 현탁 배양 (현탁 배양이 통상적임)에 적합화될 수 있다. 숙주 세포, 특히 무척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 작업 방식, 예를 들어, 유가식 (fed-batch), 반복 배치 공정 (문헌 [Drapeau, et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109] 참조), 연장 배치 공정 (extended batch process) 또는 관류 배양을 이용할 수 있다. 재조합 방식으로 형질전환된 포유동물 숙주 세포가 혈청 함유 배지, 예를 들어, 소 태아 혈청 (FCS) 중에서 배양될 수 있지만, 예를 들어, 이러한 숙주 세포는 필요에 따라 에너지 공급원, 예를 들어, 글루코스 및 합성 성장 인자, 예를 들어, 재조합 인슐린이 보충된, 예를 들어, 문헌 [Keen, et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 기재된 바와 같은 합성 혈청-비함유 배지 중 또는 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 ProCHO-CDM 또는 울트라CHO(UltraCHO)™ (캄브렉스 (Cambrex, 미국 뉴저지주))에서 배양된다. 숙주 세포의 혈청 비함유 배양은 이러한 세포가 혈청 비함유 조건에서 성장하기에 적합하게 되어야 할 필요가 있다. 한 적합화 방법은 이러한 숙주 세포를 혈청 함유 배지 중에서 배양하면서 배양 배지 중 80%를 혈청 비함유 배지로 반복적으로 교체하여, 숙주 세포를 혈청 비함유 조건에 적합화시키는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Scharfenberg, et al. (1995) in ANIMAL CELL TECHNOLOGY: DEVELOPMENTS TOWARDS THE 21ST CENTURY (Beuvery, et al., eds, 619-623, Kluwer Academic publishers)] 참조).
배지로 분비된 항원 결합 단백질은 다양한 기술을 이용하여 회수되고 정제되어 의도된 용도에 적합한 정제 정도를 제공한다. 예를 들어, 인간 환자의 치료를 위한 항원 결합 단백질의 사용은 일반적으로 95% 이상의 순도, 보다 일반적으로는 98% 또는 99% 또는 그 초과의 순도 (조 배양 배지에 비해)이어야 한다. 배양 배지로부터의 세포 잔해물은 일반적으로 원심분리에 이어서, 예를 들어, 미세여과, 한외여과 및/또는 심층 여과를 사용하여 상청액 정화 단계에 의해 제거된다. 다양한 다른 기술, 예컨대 투석 및 겔 전기영동 및 크로마토그래피 기술, 예컨대 히드록시아파타이트 (HA), 친화도 크로마토그래피 (임의로, 폴리히스티딘과 같은 친화도 태깅 (tagging) 시스템 포함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, US 5,429,746 참조)가 이용가능하다. 다양한 정화 단계 후에, 항체는 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피를 사용하여 포획할 수 있다. 추가의 크로마토그래피 단계, 예컨대 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전이 이어질 수 있다. 다양한 바이러스 제거 단계가 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, DV-20 필터를 사용한 나노여과). 이러한 다양한 단계 후, 적어도 75 mg/ml 또는 그 초과, 예를 들어, 100 mg/ml 또는 그 초과의 항원 결합 단백질을 포함하는 정제된 (바람직하게는, 모노클로날) 제제가 제공된다. 이러한 제제에는 항원 결합 단백질의 응집된 형태가 실질적으로 존재하지 않는다.
박테리아 시스템은 특히 항원 결합 단편의 발현을 위해 사용될 수 있다. 이러한 단편은 세포 내에서 주변세포질 내에 위치하거나 세포 외로 분비될 수 있다. 불용성 단백질은 당업자에게 공지된 방법에 따라 추출되고 재폴딩되어 활성 단백질을 형성할 수 있다 (문헌 [Sanchez, et al. (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20]; 및 [Cupit, et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277] 참조).
탈아미드화는 아미드 관능기가 제거되는 화학 반응이다. 생화학에서, 이 반응은 단백질의 분해에서 중요하고, 그 이유는 아미노산 아스파라긴 및 글루타민의 아미드-함유 측쇄를 손상시키기 때문이다. 탈아미드화 반응은 단백질의 유용 수명을 제한할 수 있는 인자 중 하나인 것으로 생각되고, 또한 치료 단백질의 제조 동안 발생하는 가장 흔한 번역후 변형 중의 하나이다. 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 생물학적 활성의 감소 또는 상실이 재조합 인간 DNAse 및 재조합 가용성 CD4에 대해 보고되었지만, 다른 재조합 단백질은 영향을 받지 않는 것으로 보인다. HER3에 결합하는 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 능력은 탈아미드화를 유도하는 스트레스 조건 하에서 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 따라서, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 생물학적 활성, 및 이들의 유용한 수명은 탈아미드화에 의해 영향을 받지 않는 것 같다.
제약 조성물
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 정제된 제제는 본원에서 설명되는 인간 질환, 장애 및 상태의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 용어 "질환", "장애", 및 "상태"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 제약 조성물은, HER3 수용체가 질환에 기여하거나 HER3 수용체의 활성의 중화가 유익할 질환의 치료에 사용될 수 있다. 치료 유효량의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물은 HER3 수용체의 중화에 반응성인 질환의 치료에 사용될 수 있다.
제약 제제는 항원 결합 단백질을 제약상 허용되는 담체와 조합하여 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 단독으로, 또는 제약 조성물의 일부로서 투여될 수 있다.
일반적으로, 상기 조성물은 허용되는 제약상 실무에 의해 요구되는 공지된 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition (1980) Mack Publishing Co.]을 참조한다. 이러한 담체의 예는 5 내지 8 범위의 pH로 적절한 완충제로 임의로 완충된 멸균 담체, 예컨대 염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
제약 조성물은 주사 또는 연속 주입 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피내, 피하, 근내, 또는 문맥내 (intraportal))에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 가시적인 입자형 물질이 존재하지 않는 것이 적합하다. 제약 조성물은 1 mg 내지 10 g의 항원 결합 단백질, 예를 들어, 5 mg 내지 1 g의 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. 별법으로, 조성물은 5 mg 내지 500 mg의 항원 결합 단백질, 예를 들어, 5 mg 내지 50 mg을 포함할 수 있다.
이러한 제약 조성물의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 제약 조성물은 1 mg 내지 10 g의 항원 결합 단백질을 단위 투여 형태로, 임의로 사용설명서와 함께 포함할 수 있다. 제약 조성물은 당업자에게 공지되거나 명백한 방법에 따라 투여 전에 재구성을 위해 동결건조 (건조되어 동결됨)될 수 있다. 항체가 IgG1 동형을 갖는 경우, 구리의 킬레이터, 예컨대 시트레이트 (예를 들어, 시트르산나트륨) 또는 EDTA 또는 히스티딘이 상기 이소형의 항체의 구리 매개 분해 정도를 감소시키기 위해 제약 조성물에 첨가될 수 있다. EP0612251을 참조한다. 또한, 제약 조성물은 가용화제, 예컨대 아르기닌 염기, 디터전트/항-응집 작용제, 예컨대 폴리소르베이트 80, 및 불활성 기체, 예컨대 바이알 상부 공간의 산소를 교체하기 위한 질소를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질을 투여하기 위한 유효 용량 및 치료 요법은 일반적으로 경험적으로 결정되고, 환자의 연령, 체중 및 건강 상태 및 치료되는 질환 또는 장애와 같은 요인에 따라 결정될 수 있다. 이러한 요인은 주치의의 판단에 의해 결정된다. 적절한 용량을 선택하기 위한 지침은 예를 들어 문헌 [Smith, et al. (1977) ANTIBODIES IN HUMAN DIAGNOSIS AND THERAPY, Raven Press, New York]에서 찾을 수 있다.
대상체에게 투여되는 항원 결합 단백질의 투여량은 일반적으로 1 ㎍/kg 내지 150 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 내지 25 mg/kg, 또는 1 내지 10 mg/kg (대상체의 체중)이다. 예를 들어, 용량은 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 60 mg/kg일 수 있다. 용량은 또한 10 mg/kg 내지 110 mg/mg, 15 mg/kg 내지 25 mg/kg 또는 15 mg/kg 내지 100 mg/kg일 수 있다. 항원 결합 단백질은 예를 들어 복강내, 피하, 정맥내, 또는 근육내 투여될 수 있다. 용량은 상기 투여량 범위 내의 임의의 별개의 하위 범위일 수 있다.
원하는 경우에, 치료 조성물의 유효 1일 용량은 임의로 단위 투여 형태로 1일에 걸쳐 적절한 간격으로 별개로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 하위-용량으로 투여될 수 있다.
용량의 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간, 또는 2 내지 6시간에 걸쳐 느린 연속 주입에 의해 시행될 수 있다. 그러한 투여는 감소된 독성 부작용을 야기할 수 있다.
용량의 투여는 필요에 따라 1회 이상 반복될 수 있고, 예를 들어, 1일 3회, 1일 1회, 2일마다 1회, 매주 1회, 2주 1회, 매월 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 또는 12개월마다 1회 시행될 수 있다. 항원 결합 단백질은 유지 요법, 예를 들어 매주 1회로 6개월 이상의 기간 동안 투여될 수 있다. 항원 결합 단백질은 간헐적 요법에 의해 투여될 수 있고, 예를 들어, 3 내지 6개월의 기간 동안 투여한 후, 3 내지 6개월 동안은 투여하지 않고, 이어서 3 내지 6개월 동안 항원 결합 단백질을 투여하는 바와 같이 주기적으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 용량은 각각의 투여일에 다수의 하위-용량의 형태로 14일 또는 28일마다 1회 피하 투여될 수 있다.
투여량은 항-HER3 항원 결합 단백질을 표적으로 하는 항-이디오타입 항체를 사용하여 생물학적 샘플에 투여한 후 순환하는 항-HER3 항원 결합 단백질의 양을 측정함으로써 결정하거나 조정할 수 있다. 항원 결합 단백질은 대상체에서 HER3 활성을 햐향 조절하기 위해 효과적인 양으로 및 기간 동안 투여될 수 있다.
항원 결합 단백질은 요법을 특정 부위로 표적화하기 위한 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 근육, 예를 들어 골격근 내로 국소 주사될 수 있다.
항원 결합 단백질은 하나 이상의 다른 치료 활성제, 예컨대 다른 수용체 티로신 키나제, 예컨대 비제한적으로 다른 HER 패밀리 구성원의 항체 또는 소분자 억제제, c-Met, IGF-IR, 수용체 리간드, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 세포독성제, 예컨대 독소루비신, 시스플라틴 또는 카르보플라틴, 시토카인 또는 항신생물제와 조합하여 사용될 수 있다. 후자의 예는 항체 또는 면역조정 단백질, 유사분열 억제제, 키나제 억제제, 알킬화제, 항대사산물, 삽입성 (intercalating) 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 항-생존제, 생물학적 반응 변경제, 항-호르몬, 예를 들어 항안드로겐 및 항혈관신생제로부터의 소분자 억제제 또는 화학요법제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항신생물제가 방사선일 경우, 치료는 내부 (근접 BT) 또는 외부 (외부 빔 방사선 요법: EBRT) 방사선원을 사용하여 달성될 수 있다. 본 개시내용의 항체는 본원에서 설명되거나 또는 그 전체 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 WO2007/077028에 기재된 바와 같이 화학적 결합, 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용 등을 포함하는 임의의 유형의 메카니즘에 의해 화학요법제 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다.
본 개시내용의 항체는 본원에서 설명되는 질환의 치료에서 다른 치료 활성제와 조합 사용될 수 있다. 상기 조합은 HER3 수용체가 질환에 기여하거나 HER3 수용체의 중화가 유익할 질환의 치료에 사용될 수 있다.
항원 결합 단백질이 다른 치료 활성제와 조합하여 사용될 경우, 개별 성분들은 별개의 또는 조합 제약 제제로, 임의의 편리한 경로에 의해 함께 또는 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 경우, 항원 결합 단백질 및 치료 활성제(들)는 임의의 순서로 투여될 수 있다.
상기 언급된 조합물은 임의로 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께, 상기 규정된 바와 같은 조합물을 포함하는 단일 제약 제제의 형태로 사용하기 위해 제시될 수 있다. 상기 제약상 허용되는 담체 또는 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 그 전체 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 WO2007/077028에 개시된 것을 포함한다. 추가로, 본원에서 확인되는 임의의 다른 문헌의 전체 개시내용은 본원의 개시내용에 참고로 포함된다.
동일한 제제에서 조합될 때, 성분은 안정하고 서로 및 제제의 다른 성분과 상용성이어야 하고 투여를 위해 제제화될 수 있음이 이해될 것이다. 개별적으로 제제화될 때, 이들은 임의의 편리한 제제로, 예를 들어 당업계에 항원 결합 단백질에 대해 공지된 방식으로 제공될 수 있다.
동일한 질환에 대해 활성을 보이는 제2 치료제와 조합될 경우, 각각의 성분의 용량은 항원 결합 단백질이 단독으로 사용될 때와 상이할 수 있다. 적절한 용량은 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다.
항원 결합 단백질 및 치료 활성제(들)는 상승작용적으로 작용할 수 있다. 즉, 항원 결합 단백질 및 치료 활성제(들)을 조합으로 투여하면, 이들은 각각 단독 투여시의 효과의 합보다 더 큰 효과를 본원에서 설명되는 질환, 장애, 또는 상태에 대해 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 예를 들어 연구자 또는 임상의가 연구하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 약물 또는 제약 작용제의 양을 의미한다. 제약 작용제는 하나 초과의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발할 수 있다. 또한, 용어 "치료 유효량"은 그 유효량을 투여받지 않은 상응하는 대상체에 비해 질환, 장애, 또는 부작용의 치유, 예방, 또는 개선, 또는 질환 또는 장애의 진행 속도의 감소 (이로 제한되지 않음)를 유도하는 임의의 양을 의미한다. 이 용어는 또한 그의 범위 내에 정상적인 생리학적 기능을 향상시키기 위해 효과적인 양 및 제2 제약 작용제의 치료 효과를 향상시키거나 돕는 생리학적 기능을 환자에서 유도하기 위해 효과적인 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암," "신생물," 및 "종양"은 상호교환가능하게 사용되고, 단수 또는 복수 형태에서, 숙주 유기체에 대해 병리 상태로 만드는 악성 전환을 겪은 세포를 의미한다. 원발성 암 세포 (즉, 악성 전환 부위 근처로부터 얻은 세포)는 잘 확립된 기술, 특히 조직 검사에 의해 비-암성 세포와 쉽게 구별될 수 있다. 암 세포의 정의는 본원에서 사용되는 바와 같이 원발성 암 세포뿐만 아니라 암 세포 조상으로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이것은 전이된 암 세포, 및 시험관내 배양액 및 암 세포로부터 유래된 세포주를 포함한다. 통상 고형 종양으로서 나타나는 암의 종류를 언급할 때, "임상상 검출가능한" 종양은 예를 들어 CAT 스캔, MR 영상화, X선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 종양 질량을 기초로 하여 검출가능한 것 및/또는 환자로부터 얻을 수 있는 샘플 내의 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현 때문에 검출가능한 종양이다. 종양은 액체 종양을 의미하는, 조혈 종양, 예를 들어, 혈액 세포의 종양 등일 수 있다. 그러한 종양을 기초로 한 임상 상태의 구체적인 예는 백혈병, 예컨대 만성 골수세포성 백혈병 또는 급성 골수세포성 백혈병; 골수종, 예컨대 다발성 골수종; 림프종 등을 포함한다.
용어 "처리" 및 그의 문법적 변형 용어는 본원에서 사용되는 바와 같이 치료적 요법을 의미한다. 특정 상태에 대해, 처리는 다음을 의미한다: (1) 상태의 하나 이상의 생물학적 징후의 개선, (2) (a) 상태를 야기하거나 상태의 원인이 되는 생물학적 케스케이드의 하나 이상의 지점 또는 (b) 상태의 하나 이상의 생물학적 징후의 방해, (3) 상태 또는 그의 치료와 연관된 하나 이상의 증상, 효과 또는 부작용의 완화, (4) 상태의 진행 또는 상태의 하나 이상의 생물학적 징후의 지연 또는 (5) 상태의 하나 이상의 생물학적 징후의 발생 방지. 예방 요법도 고려되는 요법이다. 당업자는 "예방"이 절대적인 용어가 아님을 이해할 것이다. 의학에서, "예방"은 상태 또는 그의 생물학적 징후의 가능성 또는 중증도를 실질적으로 감소시키거나, 또는 상기 상태 또는 생물학적 징후의 발생을 지연시키기 위한 약물의 예방적 투여를 의미하는 것으로 이해된다. 예방적 요법은 예를 들어 대상체가 암이 발생할 위험이 높은 것으로 간주될 때, 예컨대 대상체가 강한 암 가족력을 갖거나 대상체가 발암물질에 노출된 경우에 적절하다.
본 개시내용의 방법에서, 항원 결합 단백질은 "동시-투여될" 수 있고, 이것은 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질, 및 화학요법 및 방사선 치료를 포함하여 암의 치료에 유용한 것으로 공지된 추가의 활성 성분(들)의 동시 투여 또는 임의의 방식의 별개의 순차적인 투여를 의미한다. 용어 추가의 활성 성분(들)은 본원에서 사용되는 바와 같이 암 또는 관절염의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 유리한 특성을 보이는 것으로 알려져 있거나 보이는 임의의 화합물 또는 치료제를 포함한다. 바람직하게는, 투여가 동시 투여가 아닌 경우, 화합물은 서로 근접한 시간에 투여된다. 또한, 화합물이 동일한 투여 형태로 투여되는지의 여부는 중요하지 않고, 예를 들어 한 화합물은 국소 투여될 수 있고, 또 다른 화합물은 경구 투여될 수 있다.
대개, 치료되는 감수성 종양에 대해 활성을 갖는 임의의 항신생물제가 본 개시내용에서 암의 치료에서 동시-투여될 수 있다. 그러한 작용제의 예는 문헌 [Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 찾을 수 있다. 당업자는 약물의 특정 특징 및 관련된 암에 기반하여 어떠한 작용제의 조합물이 유용할 것인지 파악할 수 있을 것이다. 본원에서 유용한 전형적인 항신생물제는 항-미세소관제, 예컨대 디테르페노이드 및 빈카 알칼로이드; 백금 배위 착체; 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드, 옥사자포스포린, 알킬술포네이트, 니트로소우레아, 및 트리아젠; 항생제, 예컨대 안트라사이클린, 악티노마이신 및 블레오마이신; 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 에피포도필로톡신; 항대사물질, 예컨대 퓨린 및 피리미딘 유사체 및 항폴레이트 화합물; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 캄프토테신; 호르몬 및 호르몬 유사체; 신호 전달 경로 억제제; 비-수용체 티로신 키나제 혈관신생 억제제; 면역요법제; 아폽토시스촉진제; 및 세포 주기 신호전달 억제제를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 항원 결합 단백질과 조합으로 사용하거나 동시-투여하기 위한 추가의 활성 성분(들) (항신생물제)의 예는 화학요법제이다. 그러한 화학요법제, 및 치료 방법에서 동시-투여에 의해 또는 조성물 내에서 본원의 항원 결합 단백질과 조합될 수 있는 다른 부류의 치료제를 아래에서 설명한다.
항-미세소관제 또는 항-유사분열제는 세포 주기의 M기 또는 유사분열기 동안 종양 세포의 미세소관에 대해 활성인 기 특이적 작용제이다. 항-미세소관제의 예는 디테르페노이드 및 빈카 알칼로이드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
천연 공급원으로부터 유래하는 디테르페노이드는 세포 주기의 G2/M 기에서 작용하는 기 특이적 항암제이다. 디테르페노이드는 이 단백질과 결합함으로써 미세소관의 β-튜불린 서브유닛을 안정화시키는 것으로 생각된다. 이어서, 단백질의 해체가 억제되는 것으로 보이고, 여기서 유사분열이 정지되고 세포 사멸이 이어진다. 디테르페노이드의 예는 파클리탁셀 및 그의 유사체 도세탁셀을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
파클리탁셀 ((2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5β,20-에폭시-1,2α,4,7β,10β,13α-헥사-히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르)은 태평양 주목 나무 탁수스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia)로부터 단리된 천연 디테르펜 생성물이고, 주사 용액 탁솔 (TAXOL)™으로서 상업적으로 입수가능하다. 이것은 탁산 패밀리의 테르펜의 구성원이다. 이것은 1971년에 와니 등 (Wani et al. J. Am. Chem, Soc, 93:2325. 1971)에 의해 처음 단리되었고, 와니 등은 화학 및 X-선 결정학 방법에 의해 그의 구조를 특징분석하였다. 그의 활성에 대한 하나의 메카니즘은 튜불린에 결합하여, 암 세포 성장을 억제하는 파클리탁셀의 능력에 관련된다 (문헌 [Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77: 1561-1565 (1980)]; [Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979)]; [Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981)]). 일부 파클리탁셀 유도체의 합성 및 항암 활성에 대한 검토에 대해서는 문헌 [D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, entitled "New trends in Natural Products Chemistry 1986", Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235]을 참조한다.
파클리탁셀은 미국에서 불응성 난소암의 치료를 위해 (문헌 [Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991]; [McGuire et al., Ann. Intern, Med., 11:273, 1989]) 및 유방암의 치료를 위해 (Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83: 1797, 1991) 임상 용도로 승인받았다. 이것은 피부 내의 신생물 (Einzig et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46) 및 두경부 암종 (Forastire et al., Sem. Oncol., 20:56, 1990)의 치료를 위한 잠재적인 후보이다. 이 화합물은 또한 다낭성 신장 질환 (Woo et al., Nature, 368:750. 1994), 폐암 및 말라리아의 치료를 위한 가능성을 보인다. 파클리탁셀을 사용한 환자의 치료는 역치 농도 (50 nM)를 초과한 투약의 지속기간 (Kearns, C.M. et al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995)에 관련된 골수 억제 (다수의 세포 계통, 문헌 [Ignoff, R.J. et al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998])를 일으킨다.
도세탁셀 (5β-20-에폭시-1,2α,4,7β,10β,13α-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4-아세테이트 2-벤조에이트, 삼수화물을 갖는 (2R,3S)-N-카르복시-3-페닐이소세린, N-tert-부틸 에스테르, 13-에스테르)은 탁소테레 (TAXOTERE)™로서 주사 용액으로서 상업적으로 입수가능하다. 도세탁셀은 유방암의 치료에 지시된다. 도세탁셀은 유럽 주목 나무의 침엽으로부터 추출된 천연 전구체 10-데아세틸-박카틴 III을 사용하여 제조된 파클리탁셀 q.v.의 반합성 유도체이다. 도세탁셀의 용량 제한 독성은 호중구감소증이다.
빈카 알칼로이드는 빈카 (periwinkle) 식물로부터 유래하는 기 특이적 항신생물제이다. 빈카 알칼로이드는 튜불린에 특이적으로 결합함으로써 세포 주기의 M 기 (유사분열)에서 작용한다. 그 결과, 결합된 튜불린 분자는 미세소관으로 중합되지 못한다. 유사분열은 중기에 정지되는 것으로 생각되고, 세포 사멸이 이어진다. 빈카 알칼로이드의 예는 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
빈블라스틴 (빈카류코블라스틴 술페이트)은 벨반 (VELBAN)™으로서 주사 용액으로서 상업적으로 입수가능하다. 이것은 다양한 고형 종양의 제2선 요법으로서 가능한 적응증을 갖지만, 주로 고환암 및 호지킨 질환을 비롯한 다양한 림프종; 및 림프구 및 조직구 림프종의 치료에 지시된다. 골수억제가 빈블라스틴의 용량 제한 부작용이다.
빈크리스틴 (빈카류코블라스틴, 22-옥소-, 술페이트)은 온코빈 (ONCOVIN)™으로서 주사 용액으로서 상업적으로 입수가능하다. 빈크리스틴은 급성 백혈병의 치료에 지시되고, 또한 호지킨 및 비-호지킨 악성 림프종에 대한 치료 요법에서 용도가 발견된다. 탈모 및 신경학적 효과가 빈크리스틴의 가장 흔한 부작용이고, 보다 적은 정도로 골수억제 및 위장관 점막염 부작용이 발생한다.
비노렐빈 (3',4'-디데히드로-4'-데옥시-C'-노르빈카류코블라스틴 [R-(R*,R*)-2,3-디히드록시부탄디오에이트 (1:2)(염)], 비노렐빈 타르트레이트의 주사 용액 (나벨빈(NAVELBINE)™)으로서 상업적으로 입수가능함)은 반합성 빈카 알칼로이드이다. 비노렐빈은 다양한 고형 종양, 특히 비-소세포 폐암, 진행 유방암 및 호르몬 불응성 전립선암의 치료에서 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제, 예컨대 시스플라틴과 조합으로 지시된다. 골수억제가 비노렐빈의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
백금 배위 착체는 DNA와 상호작용성인 비-기 특이적 항암제이다. 백금 착체는 종양 세포에 들어가, 아크오화 (aquation)를 거쳐, DNA와 사슬내 및 사슬간 가교결합을 형성하여 종양에 유해한 생물학적 효과를 일으킨다. 백금 배위 착체의 예는 시스플라틴 및 카르보플라틴을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
시스플라틴 (시스-디아민디클로로백금)은 플라티놀(PLATINOL)™로서 주사 용액으로서 상업적으로 입수가능하다. 시스플라틴은 전이성 고환암 및 난소암, 및 진행 방광암의 치료에 주로 지시된다. 시스플라틴의 주요 용량 제한 부작용은 신독성 (이것은 수분공급 및 이뇨에 의해 제어될 수 있다) 및 귀독성이다.
카르보플라틴 (백금, 디아민 [1,1-시클로부탄-디카르복실레이트(2-)-O,O'])은 파라플라틴(PARAPLATIN™)으로서 주사 용액으로서 상업적으로 입수가능하다. 카르보플라틴은 진행 난소 암종의 제1선 및 제2선 치료에 주로 지시된다. 골수 억제가 카르보플라틴의 용량 제한 독성이다.
알킬화제는 비-기 항암 특이적 작용제 및 강한 친전자체이다. 대개, 알킬화제는 DNA 분자의 친핵성 모이어티, 예컨대 포스페이트, 아미노, 술프히드릴, 히드록실, 카르복실 및 이미다졸 기를 통해 알킬화에 의해 DNA에 공유 연결기를 형성한다. 상기 알킬화는 핵산 기능을 파괴하여, 세포 사멸을 일으킨다. 알킬화제의 예는 질소 머스타드, 예컨대 시클로포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴; 및 트리아젠, 예컨대 다카르바진을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
시클로포스파미드 (2-[비스(2-클로로에틸)아미노]테트라히드로-2H-1,3,2-옥사자포스포린 2-옥시드 일수화물)은 사이톡산(CYTOXAN)™으로서 주사 용액 또는 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 시클로포스파미드는 악성 림프종, 다발성 골수종, 및 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 탈모, 오심, 구토 및 백혈구감소증이 시클로포스파미드의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
멜팔란 (4-[비스(2-클로로에틸)아미노]-L-페닐알라닌)은 알케란(ALKERAN)™으로서 주사 용액 또는 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 멜팔란은 다발성 골수종 및 난소의 비-절제가능 상피 암종의 고식적 치료에 지시된다. 골수 억제가 멜팔란의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
클로람부실 (4-[비스(2-클로로에틸)아미노]벤젠부타논산)은 류케란(LEUKERAN)™ 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 클로람부실은 만성 림프성 백혈병, 및 악성 림프종, 예컨대 림프육종, 거대 여포성 림프종, 및 호지킨 질환의 고식적 치료에 지시된다. 골수 억제가 클로람부실의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
부술판 (1,4-부탄디올 디메탄술포네이트)은 밀레란(MYLERAN)™ 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 부술판은 만성 골수성 백혈병의 고식적 치료에 지시된다. 골수 억제가 부술판의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
카르무스틴 (1,3-[비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아)는 BiCNU™로서 단일 바이알의 동결건조 물질로서 상업적으로 입수가능하다. 카르무스틴은 뇌 종양, 다발성 골수종, 호지킨 질환, 및 비-호지킨 림프종에 대해 단일 작용제로서 또는 다른 작용제와 조합으로 고식적 치료에 지시된다. 지연 골수억제가 카르무스틴의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
다카르바진 (5-(3,3-디메틸-1-트리아제노)-이미다졸-4-카르복스아미드)는 DTIC-Dome™으로서 단일 바이알의 물질로서 상업적으로 입수가능하다. 다카르바진은 전이성 악성 흑색종의 치료에, 및 다른 작용제와 조합으로 호지킨 질환의 제2선 치료에 지시된다. 오심, 구토, 및 식욕부진이 다카르바진의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
항생제 항신생물제는 DNA에 결합하거나 삽입되는 비-기 특이적 작용제이다. 일반적으로, 그러한 작용은 안정한 DNA 복합체 또는 가닥 파괴를 일으키고, 이것은 핵산의 일상적인 기능을 파괴하여 세포 사멸을 일으킨다. 항생제 항신생물제의 예는 악티노마이신, 예컨대 닥티노마이신, 안트로사이클린, 예컨대 다우노루비신 및 독소루비신; 및 블레오마이신을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
닥티노마이신 (악티노마이신 D로서도 공지됨)은 코스메겐(COSMEGEN)™으로서 주사 형태로 상업적으로 입수가능하다. 닥티노마이신은 윌름 종양 및 횡문근육종의 치료에 지시된다. 오심, 구토 및 식욕부진이 닥티노마이신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
다우노루비신 (8S-시스-)-8-아세틸-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥소피라노실피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-1-메톡시-5,12 나프타센디온 히드로클로라이드)은 다우녹솜(DAUNOXOME)™으로서 리포솜 주사 형태로 또는 세루비딘(CERUBIDINE)™으로서 주사 형태로 상업적으로 입수가능하다. 다우노루비신은 급성 비-림프구성 백혈병 및 진행 HIV 연관 카포시 (Kaposi) 육종의 치료에서 관해 유도를 위해 지시된다. 골수억제가 다우노루비신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
독소루비신 ((8S,10S)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥소피라노실)옥시]-8-글리콜로일,7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-1-메톡시-5,12 나프타센디온 히드로클로라이드)은 루벡스(RUBEX)™ 또는 아드리아마아신(ADRIAMYCIN) RDF™으로서 주사 형태로 상업적으로 입수가능하다. 독소루비신은 급성 림프모구성 백혈병 및 급성 골수모구성 백혈병의 치료에 주로 지시되지만, 일부 고형 종양 및 림프종의 치료에서 또한 유용한 성분이다. 골수억제가 독소루비신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
블레오마이신 (스트렙토미세스 베르티실루스 (Streptomyces verticillus)의 균주로부터 단리된 세포독성 당펩티드 항생제의 혼합물)은 블레녹산(BLENOXANE)™으로서 상업적으로 입수가능하다. 블레오마이신은 단일 작용제로서 또는 다른 작용제와 조합으로 편평 세포 암종, 림프종, 및 고환 암종의 고식적 치료에 지시된다. 폐 및 피부 독성이 블레오마이신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
토포이소머라제 II 억제제는 에피포도필로톡신을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
에피포도필로톡신은 맨드레이크 (mandrake) 식물로부터 유래하는 기 특이적 항신생물제이다. 에피포도필로톡신은 대개 토포이소머라제 II 및 DNA와 3원 복합체를 형성함으로써 세포 주기의 S 및 G2 기에 세포에 영향을 미쳐서, DNA 가닥 파괴를 유발한다. 가닥 파괴가 누적되고, 세포 사멸이 이어진다. 에피포도필로톡신의 예는 에토포시드 및 테니포시드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
에토포시드 (4'-데메틸-에피포도필로톡신 9[4,6-0-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드])는 베페시드 (VePESID)™로서 주사 용액 또는 캡슐로서 상업적으로 입수가능하고, VP-16으로서 일반적으로 알려져 있다. 에토포시드는 고환암 및 비-소세포 폐암의 치료에서 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 골수억제가 에토포시드의 가장 흔한 부작용이다. 백혈구감소증의 발생은 혈소판감소증보다 더 중증인 경향이 있다.
테니포시드 (4'-데메틸-에피포도필로톡신 9[4,6-0-(R)-테닐리덴-β-D-글루코피라노시드])는 부몬(VUMON)™으로서 주사 용액으로 상업적으로 입수가능하고, VM-26으로서 일반적으로 알려져 있다. 테니포시드는 아동에서 급성 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 골수억제가 테니포시드의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다. 테니포시드는 백혈구감소증 및 혈소판감소증을 모두 유발할 수 있다.
항대사물질 항신생물제는 DNA 합성을 억제함으로써 또는 퓨린 또는 피리미딘 염기 합성을 억제하여 DNA 합성을 제한함으로써 세포 주기의 S 기 (DNA 합성)에 작용하는 기 특이적 항신생물제이다. 그 결과, S 기는 진행하지 않고, 세포 사멸이 이어진다. 항대사물질 항신생물제의 예는 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 시타라빈, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 및 겜시타빈을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
5-플루오로우라실 (5-플루오로-2,4-(1H,3H)피리미딘디온)은 플루오로우라실로서 상업적으로 입수가능하다. 5-플루오로우라실의 투여는 티미딜레이트 합성의 억제를 일으키고, 또한 RNA 및 DNA 모두 내로 편입된다. 결과는 대개 세포 사멸이다. 5-플루오로우라실은 유방, 결장, 직장, 위 및 췌장의 암종의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 골수억제 및 점막염이 5-플루오로우라실의 용량 제한 부작용이다. 다른 플루오로피리미딘 유사체는 5-플루오로 데옥시우리딘 (플록수리딘) 및 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트를 포함한다.
시타라빈 (4-아미노-1-β-D-아라비노푸라노실-2(1H)-피리미디논)은 사이토사(CYTOSAR)-U™로서 상업적으로 입수가능하고, Ara-C로서 일반적으로 알려져 있다. 시타라빈은 성장하는 DNA 사슬 내로 시타라빈의 말단 포함에 의해 DNA 사슬 연장을 억제함으로써 S-기에서 세포 기 특이성을 보이는 것으로 생각된다. 시타라빈은 급성 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 다른 시티딘 유사체는 5-아자시티딘 및 2',2'-디플루오로데옥시시티딘 (겜시타빈)을 포함한다. 시타라빈은 백혈구감소증, 혈소판감소증, 및 점막염을 유도한다.
메르캅토퓨린 (1,7-디히드로-6H-퓨린-6-티온 일수화물)은 퓨리네톨(PURINETHOL)™로서 상업적으로 입수가능하다. 메르캅토퓨린은 아직까지 명시되지 않은 메카니즘에 의해 DNA 합성을 억제함으로써 S-기에 세포 기 특이성을 보인다. 메르캅토퓨린은 급성 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 골수억제 및 위장관 점막염이 고용량에서 메르캅토퓨린의 예상되는 부작용이다. 유용한 메르캅토퓨린 유사체는 아자티오프린이다.
티오구아닌 (2-아미노-1,7-디히드로-6H-퓨린-6-티온)은 타블로이드(TABLOID)™로서 상업적으로 입수가능하다. 티오구아닌은 아직까지 명시되지 않은 메카니즘에 의해 DNA 합성을 억제함으로써 S-기에 세포 기 특이성을 보인다. 티오구아닌은 급성 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 백혈구감소증, 혈소판감소증, 및 빈혈을 비롯한 골수억제가 티오구아닌 투여의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다. 그러나, 위장관 부작용이 발생하고, 이는 용량 제한적일 수 있다. 다른 퓨린 유사체는 펜토스타틴, 에리트로히드록시노닐아데닌, 플루다라빈 포스페이트, 및 클라드리빈을 포함한다.
겜시타빈 (2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (β-이성질체))은 겜자르™로서 상업적으로 입수가능하다. 겜시타빈은 G1/S 경계를 통해 세포의 진행을 차단함으로써 및 S-기에 세포 기 특이성을 보인다. 겜시타빈은 국소 진행 비-소세포 폐암의 치료에 시스플라틴과 조합으로, 및 국소 진행 췌장암의 치료에 단독으로 지시된다. 백혈구감소증, 혈소판감소증 및 빈혈을 비롯한 골수억제가 겜시타빈 투여의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
메토트렉세이트 (N-[4[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-L-글루탐산)는 메토트렉세이트 나트륨으로서 상업적으로 입수가능하다. 메토트렉세이트는 퓨린 뉴클레오티드 및 티미딜레이트의 합성에 요구되는 디히드로폴산 리덕타제의 억제를 통해 DNA 합성, 복구 및/또는 복제를 억제함으로써 S-기에서 특이적으로 세포 기 효과를 보인다. 메토트렉세이트는 융모막암종, 수막 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 유방, 두부, 경부, 난소 및 방광의 암종의 치료에서 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합으로 지시된다. 골수억제 (백혈구감소, 혈소판감소증 및 빈혈) 및 점막염이 메토트렉세이트 투여의 예상되는 부작용이다.
캄프토테신 및 캄프토테신 유도체를 비롯한 캄프토테신은 토포이소머라제 I 억제제로서 이용가능하거나 개발되고 있다. 캄프토테신 세포독성 활성은 그의 토포이소머라제 I 억제 활성에 관련된 것으로 생각된다. 캄프토테신의 예는 이리노테칸, 토포테칸, 및 아래 설명되는 다양한 광학 형태의 7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20-캄프토테신을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
이리노테칸 HCl ((4S)-4,11-디에틸-4-히드록시-9-[(4-피페리디노피페리디노)카르보닐옥시]-1H-피라노[3',4',6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 히드로클로라이드)은 주사 용액 캄프토사르(CAMPTOSAR)™로서 상업적으로 입수가능하다.
이리노테칸은 그의 활성 대사산물 SN-38과 함께 토포이소머라제 I-DNA 복합체에 결합하는 캄프토테신의 유도체이다. 세포독성은 토포이소머라제 I:DNA:이리노테칸 또는 SN-38 3원 복합체와 복제 효소의 상호작용에 의해 유발되는 회복할 수 없는 이중 가닥 파괴의 결과로서 발생하는 것으로 생각된다. 이리노테칸은 결장 또는 직장의 전이성 암의 치료에 지시된다. 이리노테칸 HCl의 용량 제한 부작용은 호중구감소증을 비롯한 골수억제, 및 설사를 비롯한 GI 부작용이다.
토포테칸 HCl ((S)-10-[(디메틸아미노)메틸]-4-에틸-4,9-디히드록시-1H-피라노[3',4',6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14-(4H,12H)-디온 모노히드로클로라이드)은 주사 용액 하이캄틴 (HYCAMTIN)™으로서 상업적으로 입수가능하다. 토포테칸은 토포이소머라제 I-DNA 복합체에 결합하고 DNA 분자의 비틀림 변형에 반응하여 토포이소머라제 I에 의해 유발된 단일 가닥 파괴의 재결찰을 방해하는 캄프토테신의 유도체이다. 토포테칸은 난소의 전이성 암종 및 소세포 폐암의 제2선 치료에 지시된다. 토포테칸 HCl의 용량 제한 부작용은 골수억제, 주로 호중구감소증이다.
화학명 "7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(R,S)-캄프토테신 (라세미 혼합물) 또는 "7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(R)-캄프토테신 (R 거울상이성질체) 또는 "7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신 (S 거울상이성질체)으로 공지된 라세미 혼합물 (R,S) 형태와 R 및 S 거울상이성질체를 비롯한, 현재 개발되고 있는 다음 화학식 A의 캄프토테신 유도체가 또한 중요하다:
Figure pct00005
.
제조 방법을 비롯하여 그러한 화합물 및 관련된 화합물은 미국 특허 6,063,923; 5,342,947; 5,559,235; 5,491,237 및 계류중인 미국 특허 출원 08/977,217 (1997년 11월 24일 출원)에 설명되어 있다.
호르몬 및 호르몬 유사체가 암을 치료하기 위해 유용한 화합물이고, 여기서 호르몬(들) 및 암의 성장 및/또는 성장의 결여 사이에 상관성이 있다. 암 치료에 유용한 호르몬 및 호르몬 유사체의 예는 악성 림프종 및 아동에서 급성 백혈병의 치료에 유용한 부신피질스테로이드, 예컨대 프레드니손 및 프레드니솔론; 부신피질 암종 및 에스트로겐 수용체를 포함한 호르몬 의존성 유방 암종의 치료에 유용한 아미노글루테티미드 및 다른 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트로졸, 레트라졸, 보라졸, 및 엑스메스탄; 호르몬 의존성 유방암 및 자궁내막 암종의 치료에 유용한 프로제스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트; 전립선 암종 및 양성 전립선 비대증의 치료에 유용한 에스트로겐, 안드로겐, 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 니루타미드, 비칼루타미드, 시프로테론 아세테이트 및 5α-리덕타제, 예컨대 피나스테리드 및 두타스테리드; 호르몬 의존성 유방 암종 및 다른 감수성 암의 치료에 유용한 항-에스트로겐, 예컨대 타목시펜, 토레미펜, 라록시펜, 드로록시펜, 요독시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERMS), 예컨대 미국 특허 5,681,835, 5,877,219, 및 6,207,716에 기재된 것; 및 전립선 암종의 치료를 위한 황체형성 호르몬 (LH) 및/또는 여포 자극 호르몬 (FSH)의 방출을 자극하는 성선자극호르몬-방출 호르몬 (GnRH) 및 그의 유사체, 예를 들어, LHRH 효능제 및 길항제, 예컨대 고세렐린 아세테이트 및 류프롤리드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
신호 전달 경로 억제제는 세포내 변화를 불러일으키는 화학 과정을 차단하거나 억제하는 억제제이다. 본원에서 사용될 때 상기 변화는 세포 증식 또는 분화이다. 본 발명에서 유용한 신호 전달 억제제는 수용체 티로신 키나제, 비-수용체 티로신 키나제, SH2/SH3 차단제, 세린/트레오닌 키나제, 포스포티딜 이노시톨-3 키나제, 미오-이노시톨 신호전달, 및 Ras 종양유전자의 억제제이다.
몇몇 단백질 티로신 키나제는 세포 성장의 조절에 관여하는 다양한 단백질에서 특이적 티로실 잔기의 인산화를 촉매한다. 그러한 단백질 티로신 키나제는 수용체 또는 비-수용체 키나제로서 넓게 분류될 수 있다.
수용체 티로신 키나제는 세포외 리간드 결합을 갖는 막횡단 단백질, 막횡단 도메인, 및 티로신 키나제 도메인을 갖는다. 수용체 티로신 키나제는 세포 성장의 조절에 관여하고, 일반적으로 성장 인자 수용체로서 칭한다. 예를 들어 과달-발현 또는 돌연변이에 의한 이들 키나제 중 많은 것들의 부절하거나 제어되지 않는 활성화, 즉, 이상 키나제 성장 인자 수용체 활성은 제어되지 않는 세포 성장을 일으키는 것으로 나타났다. 따라서, 그러한 키나제의 이상 활성은 악성 조직 성장에 연관되었다. 그 결과, 그러한 키나제의 억제제는 암 치료 방법을 제공할 수 있다. 성장 인자 수용체는 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체 (EGFr), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFr), erbB2, erbB4, 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFr), 이뮤노글로불린-유사 및 표피 성장 인자 상동성 도메인 (TIE-2)을 갖는 티로신 키나제, 인슐린 성장 인자-I (IGFI) 수용체, 대식세포 콜로니 자극 인자 (cfms), BTK, ckit, cmet, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체, Trk 수용체 (TrkA, TrkB, 및 TrkC), 에프린 (eph) 수용체, 및 RET 원종양유전자를 포함한다. 성장 수용체의 몇몇 억제제가 개발되고 있고, 리간드 길항제, 항체, 티로신 키나제 억제제 및 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 성장 인자 수용체 및 성장 인자 수용체 기능을 억제하는 작용제는 예를 들어, 문헌 [Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818]; [Shawver et al., DDT Vol 2, No. 2 February 1997]; 및 [Lofts, F.J. et al., "Growth factor receptors as targets", New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. Workman, Paul and Kerr, David, CRC press 1994, London]에 설명되어 있다.
성장 인자 수용체 키나제가 아닌 티로신 키나제는 비-수용체 티로신 키나제로 칭한다. 항암 약물의 표적 또는 잠재적인 표적인, 본 발명에 사용하기 위한 비-수용체 티로신 키나제는 cSrc, Lck, Fyn, Yes, Jak, cAbl, FAK (국소 부착 키나제), 브루톤스 (Brutons) 티로신 키나제, 및 Bcr-Abl을 포함한다. 상기 비-수용체 키나제 및 비-수용체 티로신 키나제 기능을 억제하는 작용제는 문헌 [Sinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8(5): 465-80]; 및 [Bolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404]에 설명되어 있다.
SH2/SH3 도메인 차단제는 PI3-K p85 서브유닛, Src 패밀리 키나제, 어댑터 (adaptor) 분자 (Shc, Crk, Nck, Grb2) 및 Ras-GAP을 포함한 다양한 효소 또는 어댑터 단백질에서 SH2 또는 SH3 도메인 결합을 파괴하는 작용제이다. 항암 약물에 대한 표적으로서 SH2/SH3 도메인은 문헌 [Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32]에 논의되어 있다.
세린/트레오닌 키나제의 억제제는 Raf 키나제 (rafk), 미토겐 또는 세포외 조절된 키나제 (MEK), 및 세포외 조절된 키나제 (ERK)의 차단제를 또한 포함하는 MAP 키나제 케스케이드 차단제; 및 PKC (알파, 베타, 감마, 엡실론, 뮤, 람다, 이오타, 제타), IkB 키나제 패밀리 (IKKa, IKKb), PKB 패밀리 키나제, akt 키나제 패밀리 구성원, 및 TGF 베타 수용체 키나제의 차단제를 포함하는 단백질 키나제 C 패밀리 구성원 차단제를 포함한다. 상기 세린/트레오닌 키나제 및 그의 억제제는 문헌 [Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803]; [Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107]; [Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64]; [Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27], [Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226]; 미국 특허 6,268,391; 및 [Martinez-Iacaci, L., et al., Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52]에 설명되어 있다.
PI3-키나제, ATM, DNA-PK, 및 Ku의 차단제를 비롯한 포스포티딜 이노시톨-3 키나제 패밀리 구성원의 억제제가 또한 본 발명에서 유용할 수 있다. 상기 키나제는 문헌 [Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8(3) 412-8]; [Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17(25) 3301-3308]; [Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29(7):935-8]; 및 [Zhong, H. et al., Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545]에 논의되어 있다.
미오-이노시톨 신호전달 억제제, 예컨대 포스포리파제 C 차단제 및 미오이노시톨 유사체가 본원의 개시내용에서 또한 중요하다. 상기 신호 억제제는 문헌 [Powis, G., and Kozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, London]에 설명되어 있다.
또 다른 군의 신호 전달 경로 억제제는 Ras 종양유전자의 억제제이다. 상기 억제제는 파르네실트랜스퍼라제, 제라닐-제라닐 트랜스퍼라제, 및 CAAX 프로테아제의 억제제뿐만 아니라 안티-센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 면역치료를 포함한다. 상기 억제제는 야생형 돌연변이체 ras를 함유하는 세포에서 ras 활성화를 차단하여 항증식제로서 작용하는 것으로 나타났다. Ras 종양유전자 억제는 문헌 [Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8]; [Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9(2) 99-102]; 및 [BioChim. Biophys. Acta, (19899) 1423(3): 19-30]에 논의되어 있다.
수용체 키나제 리간드 결합에 대한 항체 길항제가 또한 신호 전달 억제제로서 기능을 한다. 상기 군의 신호 전달 경로 억제제는 수용체 티로신 키나제의 세포외 리간드 결합 도메인에 대한 인간화 항체의 사용을 포함한다. 예를 들어 임클론 (Imclone) C225 EGFR 특이적 항체 (문헌 [Green, M.C. et al., Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286] 참조); 헤르셉틴™ erbB2 항체 (문헌 [Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183] 참조); 및 2CB VEGFR2 특이적 항체 (문헌 [Brekken, R.A. et al., Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124] 참조).
비-수용체 키나제 혈관신생 억제제가 또한 본 발명에서 유용할 수 있다. 혈관신생 관련 VEGFR 및 TIE2의 억제제는 신호 전달 억제제에 관련하여 상기 논의되었다 (두 수용체는 수용체 티로신 키나제이다). erbB2 및 EGFR의 억제제는 혈관신생, 주로 VEGF 발현을 억제하는 것으로 나타나므로, 혈관신생은 erbB2/EGFR 신호전달에 연관된다. 따라서, 비-수용체 티로신 키나제 억제제는 본원의 화합물과 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, VEGFR (수용체 티로신 키나제)를 인식하지 않지만 리간드에 결합하는 항-VEGF 항체; 혈관신생을 억제할 인테그린 (알파v 베타3)의 소분자 억제제; 엔도스타틴 및 안지오스타틴 (비-RTK)은 또한 개시된 화합물과 조합으로 유용한 것으로 입증될 수 있다 (문헌 [Bruns CJ et al (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935]; [Schreiber AB, Winkler ME, and Derynck R. (1986), Science, 232: 1250-1253]; [Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469] 참조).
면역치료 요법에 사용되는 작용제가 또한 본원의 항원 결합 단백질과 조합으로 유용할 수 있다. 면역 반응을 생성하기 위한 많은 면역학적 전략이 존재한다. 이들 전략은 일반적으로 종양 백신접종의 영역 내에 있다. 면역학적 방안의 효능은 소분자 억제제를 사용하는 신호전달 경로의 조합된 억제를 통해 크게 향상될 수 있다. erbB2/EGFR에 대한 면역학/종양 백신 방안의 논의는 문헌 [Reilly RT et al. (2000), Cancer Res. 60: 3569-3576]; 및 [Chen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J, and Kipps TJ. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971]에서 발견된다.
아폽토시스촉진 요법에 사용되는 작용제 (예를 들어, bcl-2 안티센스 올리고뉴클레오티드)가 또한 본 발명의 조합에서 유용할 수 있다. Bcl-2 패밀리의 단백질의 구성원은 아폽토시스를 차단한다. 따라서, bcl-2의 상향조절은 항암제내성 (chemoresistance)에 연관되었다. 연구에서는 표피 성장 인자 (EGF)가 bcl-2 패밀리의 항-아폽토시스 구성원 (즉, mcl-1)을 자극하는 것을 보여주었다. 따라서, 종양에서 bcl-2의 발현을 하향조절하도록 설계된 전략은 임상적 이익을 나타내고, 현재 II/III상 시험 중이다 (즉 겐타 (Genta) G3139 bcl-2 안티센스 올리고뉴클레오티드). bcl-2에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 전략을 이용하는 상기 아폽토시스촉진 전략은 문헌 [Water JS et al. (2000), J. Clin. Oncol. 18: 1812-1823]; 및 [Kitada S et al. (1994), Antisense Res. Dev. 4: 71-79]에 논의되어 있다.
세포 주기 신호전달 억제제는 세포 주기의 제어에 관여되는 분자를 억제한다. 시클린 의존 키나제 (CDK)로 불리는 단백질 키나제의 패밀리, 및 이들과 시클린으로 불리는 단백질의 패밀리와의 상호작용은 진핵 세포 주기를 통한 진행을 제어한다. 세포 주기를 통한 정상적인 진행을 위해 상이한 시클린/CDK 복합체의 조화된 활성화 및 불활성화가 필요하다. 세포 주기 신호전달의 몇몇 억제제가 개발되고 있다. 예를 들어, CDK2, CDK4, 및 CDK6을 포함한 시클린 의존 키나제 및 그에 대한 억제제의 예는 예를 들어 문헌 [Rosania et al., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230]에 설명되어 있다. 추가로, p21WAF1/CIP1이 시클린-의존 키나제 (Cdk)의 강력하고 보편적인 억제제로서 설명되었다 (Ball et al., Progress in Cell Cycle Res., 3: 125 (1997)). p21WAF1/CIP1의 발현을 유도하는 것으로 알려진 화합물은 세포 증식의 억제에 연루된 것으로 시사되고, 종양 억제 활성을 갖는 것으로 시사되고 (Richon et al., Proc. Nat Acad. Sci. U.S.A. 97(18): 10014-10019 (2000)), 세포 주기 신호전달 억제제로서 포함된다. 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제는 p21WAF1/CIP1의 전사 활성화에 연루된 것으로 시사되고 (Vigushin et al., Anticancer Drugs, 13(1): 1-13 (Jan 2002)), 본원에 사용하기 위해 적합한 세포 주기 신호 억제제이다.
그러한 HDAC 억제제의 예는 다음의 것들을 포함한다:
1. 그의 제약상 허용되는 염을 포함한 보리노스타트 (문헌 [Marks et al., Nature Biotechnology 25, 84 to 90 (2007)]; [Stenger, Community Oncology 4, 384-386 (2007)]).
보리노스타트는 다음 화학 구조 및 명칭을 가진다:
Figure pct00006
2. 그의 제약상 허용되는 염을 포함한 로미뎁신 (Vinodhkumar et al., Biomedicine & Pharmacotherapy 62 (2008) 85-93).
로미뎁신은 다음 화학 구조 및 명칭을 가진다:
Figure pct00007
- (1S,4S,7Z,10S,16E,21R)-7-에틸리덴-4,21-디(프로판-2-일)-2-옥사-12,13-디티아-5,8,20,23-테트라비시클로[8.7.6]트리코스-16-엔-3,6,9,19,22-펜톤.
3. 그의 제약상 허용되는 염을 포함한 파노비노스타트 (Drugs of the Future 32(4): 315-322 (2007)).
파노비노스타트는 다음 화학 구조 및 명칭을 가진다:
Figure pct00008
-(2E)-N-히드록시-3-[4-({[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸]아미노}메틸)페닐]아크릴아미드.
4. 그의 제약상 허용되는 염을 포함한 발프로산 (Gottlicher, et al., EMBO J. 20(24): 6969-6978 (2001)).
발프로산은 다음 화학 구조 및 명칭을 가진다:
Figure pct00009
2-프로필펜탄산
5. 그의 제약상 허용되는 염을 포함한 모세티노스타트 (MGCD0103) (Balasubramanian et al., Cancer Letters 280: 211-221 (2009)).
모세티노스타트는 다음 화학 구조 및 명칭을 가진다:
Figure pct00010
N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸]벤즈아미드.
상기 HDAC 억제제의 추가의 예는 아래 나타낸 바와 같이 문헌 [Bertrand European Journal of Medicinal Chemistry 45, (2010) 2095-2116], 특히 이 문헌의 표 3의 화합물에 포함되어 있다.
Figure pct00011
본 개시내용의 암 치료 방법은 본 개시내용의 항원 결합 단백질 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물, 용매화물 또는 전구-약물, 및 적어도 하나의 항신생물제, 예컨대 항-미세소관제, 백금 배위 착체, 알킬화제, 항생제, 토포이소머라제 II 억제제, 항대사물질, 토포이소머라제 I 억제제, 호르몬 및 호르몬 유사체, 신호 전달 경로 억제제, 비-수용체 티로신 키나제 혈관신생 억제제, 면역요법제, 아폽토시스촉진제, 및 세포 주기 신호전달 억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 항신생물제의 동시-투여를 또한 포함한다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 MEK 억제제, 예컨대, 예를 들어, N-{3-[3-시클로프로필-5-(2-플루오로-4-아이오도-페닐아미노)-6,8-디메티-2,4,7-트리옥소-3,4,6,7-테트라히드로-2H-피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐}아세트아미드, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물 (디메틸 술폭시드 용매화물 포함) (이것은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 PCT/JP2005/011082 (국제 출원일: 2005년 6월 10일; 국제 특허 출원 공개 WO 2005/121142, 국제 공개일: 2005년 12월 22일)에 개시되고 청구되어 있다)와 조합으로 사용될 수 있다. N-{3-[3-시클로프로필-5-(2-플루오로-4-아이오도-페닐아미노)-6,8-디메티-2,4,7-트리옥소-3,4,6,7-테트라히드로-2H-피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐}아세트아미드는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 US 2006/0014768 (2006년 1월 19일 공개)에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 본원의 항원 결합 단백질은 B-Raf 억제제, 예컨대, 예를 들어, N-{3-[5-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-(1,1-디메틸에틸)-1,3-트리아졸-4-일]-2-플루오로페닐}-2,6-디플루오로벤젠술폰아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염 (이것은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 PCT/US2009/042682 (국제 출원일: 2009년 5월 4일)에 개시되고 청구되어 있다)와 조합으로 사용될 수 있다. N-{3-[5-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-(1,1-디메틸에틸)-1,3-트리아졸-4-일]-2-플루오로페닐}-2,6-디플루오로벤젠술폰아미드는 국제 특허 출원 PCT/US2009/042682에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 Akt 억제제, 예컨대, 예를 들어, N-{(1S)-2-아미노-1-[(3,4-디플루오로페닐)메틸]에틸}-5-클로로-4-(4-클로로-1-메틸-1H-피라졸-5-일)-2-푸란카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염 (이것은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 PCT/US2008/053269 (국제 출원일: 2008년 2월 7일; 국제 특허 출원 공개 WO 2008/098104, 국제 특허 출원 공개일: 2008년 8월 14일)에 개시되고 청구되어 있다)과 조합으로 사용될 수 있다. N-{(1S)-2-아미노-1-[(3,4-디플루오로페닐)메틸]에틸}-5-클로로-4-(4-클로로-1-메틸-1H-피라졸-5-일)-2-푸란카르복스아미드는 국제 특허 출원 PCT/US2008/053269에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 또한 Akt 억제제, 예컨대, 예를 들어, N-{(1S)-2-아미노-1-[(3-플루오로페닐)메틸]에틸}-5-클로로-4-(4-클로로-1-메틸-1H-피라졸-5-일)-2-티오펜카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염 (이것은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 PCT/US2008/053269 (국제 출원일: 2008년 2월 7일; 국제 특허 출원 공개 WO 2008/098104, 국제 특허 출원 공개일: 2008년 8월 14일)에 개시되고 청구되어 있다)와 조합으로 사용될 수 있다. N-{(1S)-2-아미노-1-[(3-플루오로페닐)메틸]에틸}-5-클로로-4-(4-클로로-1-메틸-1H-피라졸-5-일)-2-티오펜카르복스아미드는 실시예 96의 화합물이고, 국제 특허 출원 PCT/US2008/053269에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. N-{(1S)-2-아미노-1-[(3-플루오로페닐)메틸]에틸}-5-클로로-4-(4-클로로-1-메틸-1H-피라졸-5-일)-2-티오펜카르복스아미드는 히드로클로라이드 형태로 존재한다. 이 염 형태는 국제 특허 출원 PCT/US2010/022323 (국제 출원일: 2010년 1월 28일)의 기재으로부터 당업자가 제조할 수 있다.
파조파닙은 본 개시내용의 항원 결합 단백질과 동시-투여될 수 있는 또 다른 조성물이다. 파조파닙 (보트리엔트(VOTRIENT)™로서 상업적으로 입수가능함)은 티로신 키나제 억제제 (TKI)이다. 파조파닙은 히드로클로라이드 염으로서 제공되고, 화학명은 5-[[4-[(2,3-디메틸-2H-인다졸-6-일)메틸아미노]-2-피리미디닐]아미노]-2-메틸벤젠술폰아미드 모노히드로클로라이드이다. 파조파닙은 진행 신세포 암종의 환자의 치료를 위해 승인되었다.
리툭시맙은 본 개시내용의 항원 결합 단백질과 동시-투여될 수 있는 또 다른 조성물이다. 리툭시맙은 리툭산(RITUXAN)™ 및 맙테라(MABTHERA)™로서 시판되는 키메라 모노클로날 항체이다. 리툭시맙은 B 세포 상의 CD20에 결합하고, 아폽토시스를 유발한다. 리툭시맙은 정맥내 투여되고, 류마티스 관절염 및 B-세포 비-호지킨 림프종의 치료를 위해 승인되었다.
오파투무맙은 본 개시내용의 항원 결합 단백질과 동시-투여될 수 있는 또 다른 조성물이다. 오파투무맙은 알제라(ARZERRA)™로서 시판되는 완전 인간 모노클로날 항체이다. 오파투무맙은 B 세포 상의 CD20에 결합하고, 플루다라빈 (플루다라 (Fludara)) 및 알렘투주맙 (캠파스 (Campath))을 사용한 치료에 불응성인 성인에서 만성 림프구성 백혈병 (CLL; 백혈구의 암의 일종)를 치료하기 위해 사용된다.
mTOR 억제제도 본 개시내용의 항원 결합 단백질과 동시-투여될 수 있다. mTOR 억제제는 라파마이신 및 라파로그, RAD001 또는 에베로리무스 (아피니토르 (Afinitor)), CCI-779 또는 템시로리무스, AP23573, AZD8055, WYE-354, WYE-600, WYE-687 및 Pp121을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
벡사로텐은 본 개시내용의 항원 결합 단백질과 동시-투여될 수 있는 또 다른 조성물이다. 벡사로텐은 타그레틴(Targretin)™으로서 시판되고, 레티노이드 X 수용체 (RXR)를 선택적으로 활성화시키는 레티노이드의 하위부류의 구성원이다. 이들 레티노이드 수용체는 레티노산 수용체 (RAR)와 구분되는 생물학적 활성을 가진다. 화학명은 4-[1-(5,6,7,8-테트라히드로-3,5,5,8,8-펜타메틸-2-나프탈레닐)에테닐]벤조산이다. 벡사로텐은 그의 질환이 적어도 하나의 다른 의약으로 성공적으로 치료되지 못한 사람에서 피부 T-세포 림프종 (CTCL, 피부암의 일종)을 치료하기 위해 사용된다.
소라페닙은 본 개시내용의 항원 결합 단백질과 동시-투여될 수 있는 또 다른 조성물이다. 소라페닙은 넥사바(Nexavar)™로서 시판되고, 멀티키나제 억제제로 불리는 의약의 부류에 속한다. 그의 화학명은 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드이다. 소라페닙은 진행 신세포 암종 (신장에서 시작하는 암의 일종)을 치료하기 위해 사용된다. 소라페닙은 또한 절제불가능한 간세포 암종 (수술로 치료될 수 없는 간암의 일종)을 치료하기 위해 사용된다.
본 개시내용은 암의 치료 방법을 제공한다. 개시된 방법에서 치료되는 암은 뇌 (신경교종), 교모세포종, 성상세포종, 다형성 교모세포종, 바나얀-조나나 증후군, 코우덴 질환, 레르미트-두크로스 질환, 유방, 염증성 유방암, 윌름 종양, 유잉 육종, 횡문근육종, 상의세포종, 수모세포종, 결장, 두경부, 신장, 폐, 간, 흑색종, 난소, 췌장, 전립선, 육종, 골육종, 골의 거대 세포 종양, 갑상선, 림프모구성 T 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모발상-세포 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 호중구 백혈병, 급성 림프모구성 T 세포 백혈병, 형질세포종, 면역모세포 대세포 백혈병, 외투 세포 백혈병, 거대모세포성 백혈병, 다발성 골수종, 급성 거대모세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 및 적백혈병, 악성 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 림프모구성 T 세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 신경모세포종, 방광암, 요로상피암, 폐암, 외음부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 중피종, 식도암, 타액선암, 간세포암, 위암, 비인두암, 협부암, 구강암, GIST (위장관 기질 종양) 및 고환암 중에서 선택될 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 전암 상태는 자궁경부 상피내 신생물, 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 골수이형성 증후군, 재생불량성 빈혈, 자궁경부 병변, 피부 모반 (전-흑색종), 전립선 상피내 (관내) 신생물 (PIN), 관상피내 암종 (DCIS), 결장 폴립 및 중증 간염 또는 간경변증일 수 있다.
제약 조성물은 다른 의약과 함께, 임의로 사용설명서와 함께 항원 결합 단백질의 부분품의 키트를 구성할 수 있다. 편의상, 키트는 사용설명서와 함께 예정량의 시약을 포함할 수 있다.
용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 대상체는 대개 인간이다. 대상체는 또한 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 또는 영장류 (예를 들어, 마모셋 또는 원숭이)일 수 있다. 대상체는 비-인간 동물일 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 수의과적 용도를 가질 수 있다. 치료될 대상체는 농장 동물, 예를 들어, 암소 또는 황소, 양, 돼지, 숫소, 염소 또는 말일 수 있거나, 가축 동물, 예컨대 개 또는 고양이일 수 있다. 동물은 임의의 연령이거나 성숙한 성체 동물일 수 있다. 대상체가 실험실 동물, 예컨대 마우스, 래트 또는 영장류인 경우에, 동물은 유방, 난소, 전립선 또는 방광암과 연관된 질환 또는 상태를 유도하도록 처리될 수 있다.
처리는 치료적, 예방 또는 억제적일 수 있다. 대상체는 그를 필요로 하는 대상체일 것이다. 처리를 필요로 하는 개체는 미래에 질환이 발생할 수 있는 개체에 추가로 특정 의학적 질환에 이미 걸린 개체를 포함할 수 있다.
따라서, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 예방 또는 억제적 처리를 위해 사용될 수 있다. 이 경우에, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 질환의 하나 이상의 측면 또는 증상의 발병을 억제하거나 지연시키기 위해 개체에게 투여된다. 대상체는 무증상일 수 있다. 대상체는 질환에 대한 유전적 소인을 가질 수 있다. 예방 유효량의 항원 결합 단백질이 상기 개체에게 투여된다. 예방 유효량은 본원에서 설명되는 질환의 하나 이상의 측면 또는 증상의 발병을 억제하거나 지연시키는 양이다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 또한 치료 방법에서 사용될 수 있다. 용어 "치료"는 본원에서 사용될 때 질환의 적어도 하나의 측면 또는 증상의 완화, 감소, 또는 억제를 포함한다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 본원에서 설명되는 질환의 하나 이상의 측면 또는 증상을 개선하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 치료적, 예방 또는 억제적 처리를 위해 유효량으로 사용된다. 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 치료 유효량은 질환의 하나 이상의 측면 또는 증상을 개선하거나 감소시키기 위해 효과적인 양이다. 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 또한 본원에서 설명되는 질환을 처리, 억제, 또는 치유하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 대상체의 건강에 대해 전반적으로 유익한 효과를 가질 수 있고, 예를 들어 대상체의 예상 수명을 증가시킬 수 있다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 완전한 치유에 영향을 주거나 또는 실행가능한 치유적 처리를 구성하기 위해 질환의 모든 증상 또는 징후를 근절할 필요는 없다. 관련 분야에서 인식되는 바와 같이, 치료제로서 사용되는 약물은 제시된 질환 상태의 중증도를 감소시킬 수 있지만, 유용한 치료제로서 간주되기 위해 질환의 모든 징후를 제거할 필요는 없다. 유사하게, 예방상 투여되는 처리는 실행가능한 예방제를 구성하기 위해 질환의 발병을 예방하는데 완전히 효과적일 필요는 없다. 단순히 질환의 충격 감소 (예를 들어, 그의 증상의 수 또는 중증도를 감소시킴으로써, 또는 또 다른 치료의 유효성을 증가시킴으로써, 또는 또 다른 유익한 효과를 생성함으로써), 또는 대상체에서 질환이 발생할 가능성의 감소 (예를 들어, 질환의 발병을 지연시킴으로써)면 충분하다.
장애, 질환, 또는 상태는 유방암, 난소암, 전립선암, 및 방광암을 포함한다. 질환은 고수준의 HER3과 연관될 수 있다. 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 HER3의 수준 및/또는 HER3의 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
진단적 사용 방법
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 진단 목적을 위해 시험관내에서 또는 생체내에서 생물학적 샘플 내에서 HER3을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-HER3 항원 결합 단백질, 예컨대 뮤린 또는 인간화 15D5 모노클로날 항체는 배양된 세포, 조직 또는 혈청에서 HER3을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 조직은 먼저 인간 또는 동물 신체로부터 제거된다 (예를 들어, 생검). ELISA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 또는 면역침전을 비롯한 통상적인 면역검정을 이용할 수 있다.
HER3의 존재 또는 수준을 질환과 상호관련시킴으로써, 당업자는 연관된 질환을 진단할 수 있다. 또한, 대상체에서 증가된 수준의 HER3의 검출은 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 사용한 처리에 반응성일 환자 집단을 지시하는 것일 수 있다. HER3 수준, 기능 또는 신호 전달 능력의 감소의 검출은 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 사용하여 처리되는 대상체에서 감소된 종양 크기의 생물학적 효과를 지시하는 것일 수 있다.
항원 결합 단백질은 하나 이상의 항원 결합 단백질, 검출가능한 표지, 및 키트의 사용설명서를 포함하는 진단 키트 내에 제공될 수 있다. 편의상, 키트는 사용설명서와 함께 예정량의 시약을 포함할 수 있다.
유전자 요법
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 핵산 분자는 적절한 스캐폴드 또는 도메인 내의 CDR, 가변 도메인, 또는 전장 항체를 발현할 수 있다. 핵산 분자는 인간 또는 동물 세포에서의 발현을 허용하는 벡터에 포함될 수 있다. 핵산 분자 또는 벡터는 제약상 허용되는 부형제 및/또는 상기 논의된 하나 이상의 치료 활성제와 함께 투여를 위해 제제화될 수 있다.
본원의 또 다른 측면은 서열 100에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 갖는 중쇄 서열 및 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 갖는 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 푸코실화 글리칸을 포함하는 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용은 또한 푸코실화 글리칸이 G0, G2, G0F, G2F, G1, Man5, G1F 및 G1F'로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본원은 또한 비-푸코실화 글리칸을 포함하는 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용은 또한 비-푸코실화 글리칸이 G0, G2, G1 및 Man5로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 102에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 갖는 중쇄 서열 및 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 갖는 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 100에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 코딩하는 단리된 핵산이다.
본 개시내용은 또한 서열 101에 제시된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 코딩하는 단리된 핵산이다.
본 개시내용은 또한 서열 105에 제시된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 서열 102에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 코딩하는 단리된 핵산이다.
본 개시내용은 또한 서열 103에 제시된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 존재하는 본원에서 설명되는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 개시내용은 또한 CHOK1 세포인 본원에서 설명되는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 용어 CHOK1은 모 CHOK1 세포, 및 상기 모 세포주로부터 유래한 임의의 세포주의 세포 (예를 들어, 유전자 조작, 클로닝 선택 등에 의해)를 포함한다.
본 개시내용은 또한 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 불활성화된 본원에서 설명되는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 개시내용은 또한 a) 본원에서 설명되는 항체 중쇄를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하고 본원에서 설명되는 항체 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 (여기서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자는 재조합 숙주 세포 내에서 활성이다); 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하고; 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산하는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 a) 본원에서 설명되는 항체 중쇄를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하고 본원에서 설명되는 항체 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 (여기서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자는 재조합 숙주 세포 내에서 불활성화되었다); 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하고; 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본원은 또한 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 상태의 치료에 사용하기 위한 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 제공한다.
실시예
실시예 1
1. 개요
뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5), 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10), 키메라 1D9 항체 및 키메라 15D5 항체를 전장 인간 HER3 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 하위-도메인에 대한 결합에 대해 비아코어™ 분석에 적용하였다.
2. 도입
본 실시예의 목적은 뮤린 1D9 항체, 뮤린 15D5 항체, 키메라 1D9 항체, 및 키메라 15D5 항체의 친화도를 결정하기 위한 것이었다.
3. 방법
3.1. 실험 프로토콜(들)
분석은 각각의 새로운 칩의 제조 전에 시스템 점검으로 시험하고 통과한 비아코어™ 2000 기기 (SN#33-0901-2420 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))에서 수행하였다. 모든 진행은 진행 완충제로서 HBS-EP (지이 헬쓰케어 BR-1006-69 / 5 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, pH 7.4)를 사용하여 25℃에서 이루어졌다. 마우스 모노클로날 항체는 1차 아민 화학 (NHS/EDC 활성화된) (지이 헬쓰케어 아민 커플링 키트 BR-1000-50)에 의해 비아코어™ CM5 칩 (지이 헬쓰케어 BR-1000-14)에 공유 커플링된 토끼 항-마우스 (RAM) IgG (지이 헬쓰케어 BR-1008-38)를 사용하여 분석하였다. 키메라 및 인간화 경쟁자 모노클로날 항체는 유사하게 커플링된 항-인간, Fc 특이적 모노클로날 (지이 헬쓰케어 BR-1008-39)을 사용하여 분석하였다. 각각의 칩은 또한 포획 시약 항체가 커플링되어 있지 않은 참조 표면을 갖도록 제조하였다. 상이한 분석물 농도를 사용하여 진행한 주기에 대한 센소그램 (sensorgram)을 동역학 분석을 위해 획득한다. 주기는 표면 상에 모노클로날을 포획하고, 진행 완충제를 유동시키는 짧은 안정화 기간 후에, 규정된 농도의 분석물 (ECD 또는 하위-도메인 단백질)을 결합시키는 것으로 이루어진다. 표면 결합을 위한 분석물의 주입 (3-4분)은 곡선의 회합 부분을 생성한다. 이어서, 완충제만을 유동시키고 (3-4분), 이것은 해리 데이터의 기록을 허용한다. 이어서, 주기를 마감하고, 포획 키트에 제공된 재생 용액 (RAM에 대한 약산성 용액 및 항-인간 포획물에 대한 3M MgCl2)의 주입은 포획된 항체/분석물을 제거하지만, 후속적인 주기를 위한 모노클로날의 또 다른 포획을 수행하는 포획 항체의 능력에 유의하게 영향을 미치지 않는다.
친화도 분석을 위한 일반적인 방법은 다음과 같다. 먼저, 칩을 제조하고, 몇몇 모노클로날 항체 농도에 대해 포획된 공명 단위 (RU)에 대해 시험하였다. 이어서, 동역학 주기를 진행하였고, 여기서 모노클로날 항체를 약 100RU의 수준으로 포획한 후, 분석물 단백질을 결합시키고, 해리시키고, 공유 커플링된 것을 제외한 모든 단백질을 제거하기 위해 표면을 재생하였다. RAM 칩은 포획 키트에 제공된 100 mM 글리신 pH 1.7을 사용하여 재생하고, 항-인간 칩은 포획 키트에 제공된 3M MgCl2를 사용하여 재생하였다. 일련의 이들 주기를 6가지 상이한 농도의 분석물 단백질 (대체로 256 nM, 128 nM, 64 nM, 32 nM, 16 nM 및 8 nM)에서 진행하였다. 주기 일관성을 보장하기 위해 분석물 단백질 전에 몇몇 완충제 주기를 진행하였고, 일부 실험에서, 완충제 주기를 "이중 참조"에 사용한다. 사용된 분석물은 인간 전장 HER3 세포외 도메인 (ECD), 인간 HER3의 세포외 부분의 별개의 하위-도메인 (D1, D2, D3, D4), 또는 조합 HER3 도메인 단백질 (D1-2 및 D2-3)이었다. 모든 인간 HER3 ECD 분석물은 표준 기술을 이용하여 발현시키고 제조하였다.
동역학 실험 주기 동안, 모의 커플링된 표면은 완충제 인공물을 제거하기 위해 진행에서 특이적 항체-분석물 RU 데이터로부터 공제되는 참조를 제공한다. 일부 진행에 대한 이중 참조는 동역학 곡선의 세트에서 각각의 농도에 대한 분석물 함유 주기 데이터로부터 완충제 단독 주기를 공제함으로써 수행하였다. 생성되는 곡선 데이터를 비아이밸류에이션(BIAEVALUATION)™ 소프트웨어 (v.3.2)를 이용하여 1:1 랭뮈어 (Langmuir) 모델에 포괄적으로 피팅시켰다.
3.2. 약물 및 물질
본 실시예에 사용된 시약의 부분적인 목록은 다음과 같다:
뮤린 1D9 항체 (4.77 mg/ml)
뮤린 15D5 항체 (4.23 mg/ml)
키메라 1D9 항체
키메라 15D5 항체
모든 항체는 포스페이트 완충 염수 (pH 7.0) 내에 제제화하고 제조하였다.
4. 결과
각각의 상호작용에 대한 센소그램을 생성하였다. 이들을 비아이밸류에이션™ 소프트웨어를 사용하는 동역학 평가를 위해 사용하였다. 총 KD를 포함한 진행 및 동역학 파라미터를 아래 표 5 및 표 6에 제시한다.
Figure pct00012
Figure pct00013
5. 논의
인간 HER3 세포외 도메인에 대한 모노클로날 뮤린 1D9 항체 및 뮤린 15D5 항체를 생성하였다. 뮤린 1D9 항체는 전장 인간 HER3 ECD, 및 인간 HER3 ECD의 하위-도메인 3에 결합한다. 뮤린 15D5 항체는 전장 인간 HER3 ECD, 및 인간 HER3 ECD의 하위-도메인 2에 결합한다.
전장 인간 HER3 ECD 및 선택된 인간 HER3 ECD 하위-도메인과의 상호작용에 대해 모든 항체의 나노몰농도 및 나노몰농도 미만의 친화도를 결정하였다. 뮤린 1D9 항체 및 뮤린 15D5 항체 모두에 대해 유사한 총 친화도 (KD)가 보이고, 여기서 뮤린 1D9 항체가 보다 빠른 온 속도 (ka) 및 오프 속도 (kd)를 갖는다. 뮤린 15D5 항체는 면역검정 및 경쟁적 면역세포화학에 의해 인간 HER3 ECD의 하위-도메인 2, 1-2 및 2-3에 결합하지만, 하위-도메인 1, 3 또는 4에 결합하지 않는 것으로 나타났다. 비아코어™ 분석은 전장 인간 HER3 ECD (하위-도메인 1-4)에 비해 HER3 ECD의 이들 부분 (즉, 인간 HER3 ECD의 하위-도메인 2, 1-2 및 2-3)에 대해 증대된 친화도를 보여준다. 상기 효과는 인간 HER3 ECD 단백질 구축물을 함유하는 3개의 모든 하위-도메인 2 (D2, D1-2 및 D2-3)에서 보이고, 이론에 매이기를 바라지 않지만, 이것은 보다 작은 하위-도메인 단백질 내의 도메인 2 내에서 에피토프의 보다 큰 접근가능성 때문인 것으로 생각된다. 또한, 이론에 매이기를 바라지 않지만, 구조적 고려사항이 뮤린 15D5 항체가 HER3 수용체의 개방 입체형태에 대한 보다 큰 친화도를 갖도록 하는 것으로 생각된다. 상기 개방 입체형태는 수용체가 헤레굴린 리간드와 맞물릴 때의 상태인 것으로 보인다. 키메라 15D5 항체 및 키메라 1D9 항체는 모 뮤린 1D9 항체 및 뮤린 15D5 항체와 유사한 친화도를 보유한다.
실시예 2
뮤린 1D9 항체 및 그의 변이체에 대한 결합 계면을 예측하기 위해 X-선 결정학적 분석을 컴퓨터내 (in silico) 모델링과 커플링시켰다. 이들 분석은 또한 뮤린 1D9 항체를 사용할 때 관찰되는 기능적 중화에 대한 기계적 통찰력을 제공하고, 합리적 항체 성숙을 촉진하였다. 인간 HER3 ECD의 도메인 III에 결합된 뮤린 1D9 항체 유래된 Fab를 포함하는 복합체의 고해상도 (3.0 Å) 구조를 확립하였다. 이를 위해, 인간 HER3 ECD의 도메인 III 및 뮤린 1D9 항체를 CHO 세포 내에서 발현시키고, 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 표준 방법을 이용하는 파파인 절단에 의해 뮤린 1D9 항체의 Fab 단편을 생성하였다. 인간 HER3 ECD의 도메인 III에 결합된 뮤린 1D9 항체 유래 Fab를 포함하는 복합체는 1:1.2 몰비의 뮤린 1D9 항체 유래 Fab를 인간 HER3 ECD의 도메인 III과 혼합함으로써 생성하였다. 이어서, 상기 단백질 혼합물을 부유 액적 증기 확산법을 이용하여 농축하고 결정화하였다. X-선 회절 데이터는 아르곤 내셔널 래보래토리 (Argonne National Laboratory) 내의 진보된 광자원 (Advanced Photon Source)에서 수집하였다. HKL2000 소프트웨어 (HKL 리서치, 인크. (HKL Research, Inc.))를 이용하여 회절 데이터를 색인을 만들고 스케일링하였다. 구조는 프로그램 X-PLOR에서 분자 치환에 의해 결정하였다. 이어서, 생성된 초기 분자 치환 솔루션을 CNS에서 다수 라운드의 분자 역학 세밀화로 처리하고, 프로그램 WINCOOT를 이용하여 재구축하였다. 이어서, 인간 HER3 ECD의 도메인 III에 결합된 뮤린 1D9 유래 Fab를 포함하는 복합체에 대한 원자 좌표 파일을 생성하고, 생성되는 구조를 분석하였다.
상기 분석으로부터 인간 HER3 ECD 도메인 III의 도메인 III 상의 에피토프는 서열 21의 아미노산 잔기 20 내지 643을 포함하는 단편 내에서 발견할 수 있는, 서열 66의 Ile346, Asn350, Gly351, Asp352, Pro353, Trp354, His355, Lys356, Ile357, Pro358 및 Ala359를 포함하는 것으로 결정되었다. 표 7 참조. 상호작용 잔기들 사이의 접촉을 표 7 및 도 55에 기재한다.
Figure pct00014
이론에 의해 제한되기를 바라지 않지만, 상기 고해상도 결정 구조에 기반하여, 뮤린 1D9 항체 Fab 단편은 인간 HER3 ECD의 도메인 III에 배타적으로 결합하고, HER3 ECD의 개방 입체형태 내에 존재하는 헤레굴린 결합 부위와 부분적으로 겹치는 에피토프를 덮는 것으로 생각된다. 이론에 의해 제한되기를 바라지 않지만, 뮤린 1D9 항체 Fab는 수용체가 이량체화를 위해 요구되는 연장된 입체형태를 취하는 것을 입체적으로 방해하기 위한 밀폐된 입체형태로 존재할 때 HER3 ECD에 결합할 수 있는 것으로 또한 생각된다. 뮤린 1D9 항체 Fab는 부분적으로, 인간 HER3 ECD의 도메인 1이 이량체화를 위해 요구되는 입체형태를 취하는 것을 방지함으로써 그의 효과를 생성하는 것으로 생각된다. 이론에 의해 제한되기를 바라지 않지만, 본원에 설명되는 구조적 효과는 뮤린 1D9 항체 및 그의 변이체에 의해 생성된 HER3 활성의 강력한 억제에 기여하는 것으로 추가로 생각된다.
실시예 3
개방 입체형태로 HER3 ECD와 결합된 뮤린 15D5 항체의 상호작용의 컴퓨터에 의한 구조 모델링을 로제타 독 (Rosetta Dock) 소프트웨어 (RosettaCommons.org)를 사용하여 수행하였다. 이 소프트웨어에 의해 실행된 알고리즘의 제1 단계는 강체 (rigid-body) 몬테 카를로 (Monte Carlo) 탐색을 수행하고 잔기-스케일 상호작용 잠재력을 사용하여 항원을 항체의 표면 주위에 이동시키고 회전시키는 것이다. 정렬 스코어는 항원을 항체 CDR 루프를 향하여 유도한다. 상기 저해상도 탐색 후에, 명백한 측쇄를 백본-의존성 회전이성질체 충전 알고리즘을 이용하여 단백질 백본에 부가한다. 이어서, 몬테 카를로-플러스-최소화 방식은 측쇄 입체형태 및 강체 위치를 동시에 최적화함으로써 도킹 입체형태 공간의 작은 영역 내의 국소 최저치의 세트를 효율적으로 샘플링한다. 105개 구조를 생성하기 위해 탐색 절차를 상이한 무작위 출발 배향으로부터 반복한 후, 반 데르 발스 상호작용에 의해 지배되는 에너지 기능, 묵시적 용매화 (implicit solvation) 모델 및 배향-의존 수소 결합 잠재력을 사용하여 평가한다. 스코어 컷오프를 통과한 상위 1000개의 디코이 (decoy)를 유지하였다. 측쇄 예측의 해상도를 개선하기 위해, 미결합된 회전 이성질체 입체형태를 회전 이성질체 라이브러리에 포함시키고, 측쇄 비틀림 각에 대한 구배-기반 최소화를 사용하였다. 상기 고해상도 탐색의 종료시에 200개의 최상-스코어링 디코이는 계층 군집화 알고리즘을 사용하여 짝 방식 (pair-wise) 평균 제곱근 편차 (rmsd)를 기초로 하여 군집화한다. 2.5 Å 군집화 역치 내의 구조는 세트로 지정되고, 세트 내의 최소-스코어링 디코이는 군집을 나타낸다.
인간 HER3 ECD에 결합한 뮤린 15D5 항체의 생성되는 모델은 상기 항체가 개방 입체형태의 HER3 ECD에 결합하고 이량체화 아암 근처에 입체 장애를 생성함을 예측한다. 이론에 의해 제한되기를 바라지 않지만, 이것은 뮤린 15D5 항체가 HER3 이량체화를 억제함을 제안한다.
실시예 4
1. 개요
뮤린 1D9 항체 및 뮤린 15D5 항체의 일련의 인간화 RR 변이체를 분자 생물학 기술을 이용하여 생성하고 발현시켰다. 이어서, 이들 항체를 전장 인간 HER3 세포외 도메인 (ECD)에의 결합에 대해 비아코어™ 분석에 적용하였다.
2. 도입
본 실시예의 목적은 뮤린 1D9 및 15D5 항체의 인간화 변이체의 친화도를 결정하기 위한 것이었다.
3. 방법
3.1. 실험 프로토콜(들)
3.2. 비아코어 ™ 분석
표준 분자 생물학 기술을 이용하여 생성되고 발현된 뮤린 1D9 항체 및 뮤린 15D5 항체의 인간화 변이체의 결합 친화도를 결정하기 위해 비아코어™ 분석을 이용하였다. 인간화 변이체는 1D9 H6L2 RR 항체 (서열 30 및 서열 57 포함), 1D9 H0L7 RR 항체 (서열 67 및 서열 85 포함), 1D9 H2L2 RR 항체 (서열 71 및 서열 57 포함), 1D9 H6L6 RR 항체 (서열 38 및 서열 83 포함), 1D9 H6L3 RR 항체 (서열 30 및 서열 77 포함), 1D9 H3L6 RR 항체 (서열 73 및 서열 83 포함), 1D9 H0L9 RR 항체 (서열 67 및 서열 87 포함), 1D9 H2L6 RR 항체 (서열 71 및 서열 83 포함), 1D9 H6L4 RR 항체 (서열 30 및 서열 79 포함), 1D9 H6L5 RR 항체 (서열 30 및 서열 81 포함), 1D9 H6L0 RR 항체 (서열 30 및 서열 75 포함), 1D9 H3L2 RR 항체 (서열 73 및 서열 57 포함), 1D9 H6L9 RR 항체 (서열 30 및 서열 87 포함), 15D5 H1L3 항체 (서열 90 및 서열 98 포함), 15D5 H2L2 항체 (서열 92 및 서열 96 포함), 15D5 H1L1 항체 (서열 90 및 서열 26 포함), 15D5 H3L1 항체 (서열 94 및 서열 26 포함), 15D5 H2L1 항체 (서열 92 및 서열 26 포함) 및 15D5 H3L3 항체 (서열 94 및 서열 98 포함)이었다. 키메라 15D5 항체 (ch15D5)를 또한 분석하였다.
이들 항체의 결합 동역학을 비아코어™ 3000을 이용하여 평가하였다. 항체를 공급된 커플링 완충제 (9000 RU)를 사용하여 고정된 항-인간 IgG (Fc 특이적) 비아코어™ (지이 헬쓰케어 cat# BR-1008-39) 모노클로날 항체가 접합된 CM5 비이오센서 칩 상에 포획하였다. 전장 인간 HER3 ECD 농축물을 120s 동안 30 ㎕/min의 유량으로 주입하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 비이오센서 칩을 재생하였다. 비아코어™ 평가 소프트웨어를 이용하여 1:1 랭뮈어 모델에 대한 데이터의 포괄적 피팅에 의해 동역학을 결정하였다. 진행 완충제로서 HBS-EP를 사용하여 25℃에서 분석 진행을 실시하였다.
비아코어™ 분석 방법의 기본 단계를 아래에 개략한다:
1) 항-인간 Fc 항체 (9000-1000RU; 25 ㎍/ml, 아세트산나트륨 완충제, pH 5.0 사용)를 사용한 고정화;
2) 관심 항체의 포획 (400 ng/ml);
3) 포획된 항체에 대한 분석물의 회합 (예를 들어, 512 nM 내지 16 nM의 HER ECD);
4) 분석물의 해리 (예를 들어, 완충제 사용);
5) 비아코어 동역학 진행 주기 단계: 완충제, 512 nM HER3 ECD, 256 nM HER3 ECD, 128 nM HER3 ECD, 64 nM HER3 ECD, 32 nM HER3 ECD 및 16 nM HER3 ECD. 완충제 주기 및 이중 참조는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다;
5) 비아코어™ 최적화 완충제를 사용한 비이오센서 칩의 재생.
4. 결과 및 논의
아래 표 8 및 표 9는 얻어진 데이터를 보여주고, 인간화 1D9 RR 항체 (H6L2) 및 인간화 15D5 항체 (H4L1)이 모 분자에 대해 생성된 모든 인간화 항체의 전장 인간 HER3 ECD에 대한 최상의 친화도를 갖는 것으로 나타남을 보여준다.
Figure pct00015
Figure pct00016
실시예 5
1. 개요
인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 Fc 디세이블드 (disabled) 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체를 분자 생물학 기술을 사용하여 생성하고 발현시켰다. 이어서, 이들 항체를 아래 지시된 바와 같이 전장 인간 HER3 세포외 도메인 (ECD), 전장 래트 HER3 세포외 도메인 (ECD), 및 전장 시노몰구스 원숭이 HER3 세포외 도메인 (ECD)에의 결합에 대해 비아코어™ 분석에 적용하였다.
2. 도입
본 실시예의 목적은 인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체의 친화도를 결정하기 위한 것이었다.
3. 방법
3.1. 실험 프로토콜(들)
3.2. 비아코어 ™ 분석
인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체, 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해 비아코어™ 분석을 사용하였다.
단백질 A를 ~1300 공명 단위 (RU)의 수준으로 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정시킨 후, 인간화 항체를 상기 칩 상에 포획하였다. 모든 항체는 유사한 수준 (100-200 RU)으로 포획되었다. 이어서, 전장 인간 HER3 ECD를 아래 지시된 바와 같이 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM 및 1.5625 nM로 칩 위로 통과시켰다. 별법으로, 전장 래트 HER3 ECD 또는 전장 시노몰구스 원숭이 ECD를 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM, 0.625 nM 및 0.3125 nM로 칩 위로 통과시켰다. 완충제 단독의 주입은 실시예 1에 지시된 바와 같이 결합 곡선을 이중 참조하기 위해 사용하였다. 상기 표면의 재생은 10 mM 글리신 완충제 pH 1.5를 사용하여 달성하였다. 결합 데이터를 비아코어™ 평가 소프트웨어를 이용하여 1:1 모델에 피팅시켰다. 진행 완충제로서 HBS-EP를 사용하여 비아코어™ T3000 상에서 25℃에서 진행을 실시하였다.
4. 결과 및 논의
아래 표 10 및 표 11은 아래 지시된 바와 같이 전장 인간 HER3 세포외 도메인 (ECD), 전장 래트 HER3 세포외 도메인 (ECD) 및 전장 시노몰구스 원숭이 HER3 세포외 도메인 (ECD)에 대한 인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체의 결합에 대해 얻어진 데이터를 보여준다.
Figure pct00017
Figure pct00018
인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™의 특징분석은 전장 인간 HER3 ECD에 대한 특이적 결합을 입증한다. 교차 종 상동성 예측에 기반하여, 래트 HER3 ECD의 도메인 III 및 시노몰구스 원숭이 HER3 ECD의 도메인 III은 인간화 1D9 항체 및 그의 변이체에 의해 결합되는 도메인 III 인간 HER3 ECD 에피토프에 약 95% 상동성이다. 이것은 기능적 교차 반응성에 대한 강한 가능성을 지시한다. 이것과 일치하게, 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체는 비아코어™ 분석에 의해 평가할 때 전장 시노몰구스 원숭이 HER3 ECD 및 전장 래트 HER3 ECD와 대등한 수준으로 교차-반응하는 것으로 관찰되었다 (위의 표 10 및 표 11 참조).
실시예 6
1. 개요
본 실시예는 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제하고, 하류 AKT 신호전달을 감소시키고, 활성화된 EGFR이 HER3과 이종이량체화하는 것을 방지하는 이종이량체화 억제제로서 역할을 하고, 헤레굴린 유도된 EGFR-HER3, HER2-HER3 및 HER4-HER3 이종이량체화 형성을 방지하고, 후속적인 HER3 인산화를 방지하는 1D9 항체 (예를 들어, 뮤린 1D9 항체 및 그의 인간화 변이체) 및 15D5 항체 (예를 들어, 뮤린 15D5 항체 및 그의 인간화 변이체)의 능력을 입증한다.
2. 도입
헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제하고, 하류 AKT 신호전달을 감소시키고, 활성화된 EGFR이 HER3과 이종이량체화하는 것을 방지하는 이종이량체화 억제제로서 역할을 하고, 헤레굴린 유도된 EGFR-HER3, HER2-HER3 및 HER4-HER3 이종이량체화 형성을 방지하고, 후속적인 HER3 인산화를 방지하는 1D9 항체 (예를 들어, 뮤린 1D9 항체 및 그의 인간화 변이체) 및 15D5 항체 (예를 들어, 뮤린 15D5 항체 및 그의 인간화 변이체)의 능력을 검사하였다.
3. 방법
3.1. 실험 제제(들)
본 연구에 사용된 모델은 영국 내무성 (Home Office)에서 규정한 동물 실험의 UK 표준 (UK standards of animal care)에 따른다.
3.2. 실험 프로토콜(들)
3.2.1. 암 세포 주에서 항- HER3 mAb 를 사용한 헤레굴린 유도된 HER3 수용체 인산화의 억제
약 80% 융합도 (confluency)에서 BxPC3, CHL-1, N87, SK-BR-3, BT-474, 또는 MCF-7 세포를 트립신을 사용하여 수거하고, 10% FBS/배지 내에서 세척하고, 10% FBS/배지 내에 3-5x105개 세포/ml로 재현탁하였다. 100 ㎕/웰을 96 웰 조직 배양액 처리된 평저 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 5% CO2 분위기에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 흡인하고, 혈청 비함유 배지로 교체하고, 혈청 고갈을 위해 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, mAb 원액을 혈청 비함유 배지에 준비하고, 1/2 로그 (half log) 연속 희석액을 제조하였다. 10 ㎕의 mAb 원액을 8 점 농도 곡선을 위해 96 웰 세포 플레이트에 이중으로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 HRGβ1을 이어서 30 또는 100 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 배지를 흡인하고, 세포를 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 저온의 용해 완충제 내에서 용해시키고, 얼음 상에서 30분 동안 흔들었다. 용해물을 즉시 사용하거나, -80℃에서 동결하고, 인간 포스포-ErbB3 ELISA (R&D 시스템즈 (R&D Systems) 카탈로그 번호 DYC1769)에서 사용하기 위해 나중에 얼음 상에서 해동하였다. ELISA는 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 데이터 분석은 그래프패드(GRAPHPAD)™ 프리즘(PRISM)™ 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
3.2.2. 암 세포 주에서 항- HER3 mAb 를 사용한 헤레굴린 유도된 Akt 인산화의 억제
약 80% 융합도에서 BxPC3, CHL-1, N87, SK-BR-3, 또는 BT-474 세포를 트립신을 사용하여 수거하고, 10% FBS/배지 내에서 세척하고, 10% FBS/배지 내에 3-5x105개 세포/ml로 재현탁하였다. 100 ㎕/웰을 96 웰 조직 배양액 처리된 평저 플레이트 내로 플레이팅하고, 37℃에서 5% CO2 분위기에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 배지를 흡인하고, 혈청 비함유 배지로 교체하고, 혈청 고갈을 위해 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 mAb 원액을 혈청 비함유 배지에 준비하고, 1/2 로그 연속 희석액을 제조하였다. 10 ㎕의 mAb 원액을 8 점 농도 곡선을 위해 96 웰 세포 플레이트에 이중으로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 HRGβ1을 이어서 30 또는 100 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 배지를 흡인하고, 세포를 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 저온의 용해 완충제 내에서 용해시키고, 얼음 상에서 30분 동안 흔들었다. 용해물을 즉시 사용하거나, -80℃에서 동결하고, 인간/마우스/래트 포스포-Akt (S473) 판 스페시픽 (Pan Specific) ELISA (R&D 시스템즈 카탈로그 번호 DYC887B))에서 사용하기 위해 나중에 얼음 상에서 해동하였다. ELISA는 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 데이터 분석은 그래프패드™ 프리즘™ 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
3.2.3. SK - BR -3 유방암 세포에서 항- HER3 mAb 를 사용한 표피 성장 인자 또는 베타셀 룰린 유도된 HER3 수용체 인산화의 억제
표피 성장 인자 (EGF) 또는 베타셀룰린이 헤레굴린 대신에 활성화 리간드인 것을 제외하고 인간 포스포-ErbB3 ELISA R&D 시스템즈 카탈로그 번호 DYC1769에서 사용하기 위해 본 실시예의 섹션 3.2.1 (상기)에 기재된 바와 같이 SK-BR-3 세포를 검정하였다.
3.2.4. HER 패밀리 수용체 박맘 ™ 형질도입된 CHO 세포에서 헤레굴린 유도된 이종이량체 형성 및 HER3 수용체 인산화의 억제
이종이량체화 검정은 헤레굴린-베타1 자극 후에 EGFR, HER2 및 HER4에 의한 HER3 수용체 인산화의 항-HER3 mAb 매개된 억제를 검사하기 위해 퍼킨엘머 (PerkinElmer) 알파리사(ALPHALISA)™ 검정 기술을 이용하여 개발되었다. 시약은 퍼킨엘머 프로토콜에 따라 제조하였다. 간단히 설명하면, 포스포-티로신 특이적 마우스 mAb (P-Tyr-100 세포 신호전달 기술 (Cell Signaling Technology) 카탈로그 #9411 PBS 단독 제제)를 알파리사™ 수용자 비드 (퍼킨엘머 카탈로그 #6772002)에 접합하였다. 1 mg의 수용자 비드를 100 ㎍의 항체에 48시간 동안 접합시킴으로써 10:1의 커플링 중량비를 사용하였다. 100 ㎍의 항체당 7.6 ㎕의 2 mg/ml 크로마링크(CHROMALINK)™ 비오틴 354 (술포 NHS, 솔루링크 (SoluLinK) 카탈로그 #B-1007-105)를 이용함으로써 비오틴 대 항체의 30:1 몰비를 사용하여 상업적으로 입수가능한 항-인간 HER3 항체 (R&D 시스템즈 MAB3481)를 비오티닐화하였다. 이어서, 항-HER3 mAb는 96 웰 플레이트에서 EGFR + HER3, HER2 + HER3 및 HER4 + HER3의 특이적 박맘™ 쌍형성과 함께 차이니즈 햄스터 난소 세포를 3x105개 세포/ml로 밤새 형질도입함으로써 평가하였다. 다음날 항-HER3 mAb를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 헤레굴린-β1를 100 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 흡인시키고, 세포를 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 저온의 용해 완충제 내에서 용해시켰다. 용해물을 얼음 상에서 30분 동안 흔들고, 즉시 사용하거나, -80℃에서 동결하고, 알파리사™ 검정을 수행하기 위해 얼음 상에서 해동하였다. 이어서, 2.5 ㎕의 용해물을 384 웰 플레이트에서 10 ㎕의 2.5 nM 비오티닐화 항-인간 ErbB3 항체 (R&D 시스템즈 MAB3481)에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 5 ㎕/웰의 50 ㎍/ml 포스포-티로신 특이적 마우스 mAb (P-Tyr-100 세포 신호전달 기술 카탈로그 #9411)를 첨가하고, 암소에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 12.5 ㎕/웰의 80 ㎍/ml 제제의 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드 (퍼킨엘머 카탈로그 #6760002)를 첨가하고, 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 엔비젼(ENVISION)™ 2103 다중표지 플레이트 판독기 상에서 판독하고, 데이터 분석은 그래프패드™ 프리즘™을 이용하여 수행하였다.
3.3. 약물 및 물질
인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체 (12.68 mg/ml)
인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 (7.45 mg/ml)
인간화 1D9 항체 (1.88 mg/ml)
인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체 (3.713 mg/ml)
뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5; 4.77 mg/ml)
뮤린 15D5 항체 (3.19 mg/ml)
뮤린 IgG1 이소형 대조군 항체 (R&D 시스템즈 500 ㎍/ml cat# MAB002)
뮤린 IgG2b 이소형 대조군 (R&D 시스템즈 500 ㎍/ml cat# MAB004)
인간 항-말라리아 mAb (인간 이소형 대조군; 5.74 mg/ml)
헤레굴린-β1 (HRGβ1; 1.88 mg/ml)
3.4. 데이터 분석
본 실시예에 제시된 모든 데이터는 최소 2회의 실험으로부터의 평균을 나타낸다. 항체 값을 양성 대조군 헤레굴린 처리된 세포 값으로 나누고 100을 곱하여 "헤레굴린 대조군 포스포 HER3의 %" 또는 "헤레굴린 대조군 포스포 AKT의 %"를 계산하였다. 표피 성장 인자 또는 베타셀룰린 양성 대조군 처리된 세포 값을 표피 성장 인자 또는 베타셀룰린 처리된 SK-BR-3 세포의 경우에 비교를 위해 사용하였다. 개별 실험으로부터 데이터를 평균하고, 그래프패드™ 프리즘™ 분석 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
4. 결과
4.2.1. 암 세포에서 항- HER3 항체를 사용한 헤레굴린 유도된 HER3 수용체 인산화의 억제
항-HER3 1D9 및 15D5 항체는 BxPC3 (도 1), CHL-1 (도 2), N87 (도 3), SK-BR-3 (도 4), BT-474 (도 5), 및 MCF-7 (도 6) 암 세포에서 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제하였다. 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체 및 인간화 아크레타맙™ 항체를 포함한 모든 1D9 항체 구축물은 강력한 억제를 보였고, 여기서 IC50 값은 표 12에 제시된 바와 같이 2.5 내지 40.6 ng/ml IC50 값 범위였다.
Figure pct00019
4.2.2. 암 세포에서 항- HER3 mAb 를 사용한 헤레굴린 유도된 Akt 인산화의 억제.
항-HER3 1D9 항체 및 15D5 항체는 BxPC3 (도 7), CHL-1 (도 8), N87 (도 9), 및 SK-BR-3 (도 10) 암 세포에서 헤레굴린 유도된 AKT 인산화를 감소시켰다. AKT 인산화의 가장 강력한 억제는 BxPC3 세포에서 보였고, 여기서 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체는 헤레굴린 유도된 포스포-AKT 형성을 억제하였고, IC50 값은 2.6 ng/ml이었다 (표 13).
Figure pct00020
4.2.3. SK - BR -3 유방암 세포에서 항- HER3 mAb 를 사용한 표피 성장 인자 및 베타셀룰린 유도된 HER3 수용체 인산화의 억제
항-HER3 1D9 항체 및 15D5 항체는 SK-BR-3 유방암 세포에서 표피 성장 인자 및 베타셀룰린 유도된 HER3 인산화를 모두 억제하였다. 1D9 뮤린 구축물은 리간드 유도된 HER3 수용체 인산화를 억제하였고, IC50 값은 사용된 활성화 리간드와 상관 없이 약 3 ng/ml이었다 (표 14).
SK-BR-3 유방암 세포에서 항-HER3 항체를 사용한, 표피 성장 인자 (EGF), 베타셀룰린 (BTC) 및 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제.
항체 포스포 - HER3 알파리사 ™ ELISA IC50 값 ( ng / ml )
표피 성장 인자 베타셀룰린 헤레굴린
뮤린 1D9 항체 3.0 3.6 3.2
뮤린 15D5 항체 23.3 36.8 19.1
4.2.4. HER3 박맘 ™ 형질도입된 CHO 세포에서 EGFR , HER2 또는 HER4 의 조합에서 헤레굴린 유도된 이종이량체 형성 및 HER3 수용체 인산화의 억제
항-HER3 1D9 항체 및 15D5 항체는 나타낸 바와 같이 인간 HER3 수용체 및 EGFR, HER2, 또는 HER4 수용체로 동시-형질도입된 CHO 세포에서 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제하였다. 이들 항체는 EGFR-HER3, HER2-HER3, 또는 HER4-HER3 이종이량체의 헤레굴린 유도된 형성을 억제할 수 있었다. IC50 값을 표 15에 제시한다.
항-HER3 항체를 사용한, 헤레굴린 유도된 인간 HER3 수용체 인산화의 억제
항체 포스포 - HER3 알파리사 ™ ELISA IC50 값 ( ng / ml )
CHO EGFR + HER3 CHO HER2 + HER3 CHO HER4 + HER3
뮤린 1D9 항체 43.5 141.7 129.6
뮤린 15D5 항체 102.8 342.9 140.7
5. 논의
HER3 수용체 티로신 키나제는, EGFR (HER1), HER2, 및 HER4를 또한 포함하는 인간 표피 성장 인자 수용체 패밀리에 속한다. HER3은 헤레굴린 리간드에 결합하지만, 본질적으로 키나제 활성을 갖지 않는다. 이것은 그의 세포내 C-말단 도메인에서 티로신 잔기의 인산전이를 허용하기 위해 다른 패밀리 구성원과 이량체화하여야 한다. 활성화된 인산화 HER3 수용체에 의한 후속적인 하류 신호전달은 PI3K/AKT 생존 경로를 포함한다.
본 실시예의 데이터는 항-HER3 1D9 항체 및 15D5 항체가 헤레굴린 유도된 HER3 수용체 인산화를 억제할 수 있음을 입증한다. 헤레굴린 자극 전에 1D9 항체를 사용한 암 세포주의 치료는 헤레굴린-유도된 HER3 인산화의 완전한 억제를 유도하였다. 도 16은 상이한 암 세포주에 걸쳐 HER3 인산화를 억제하기 위한 상이한 1D9 항체의 IC50 값을 보여준다. 하류 AKT 인산화도 1D9 항체 및 15D5 항체 처리에 의해 감소하였다. 따라서, 1D9 항체 및 15D5 항체는 헤레굴린-유도된 HER3 인산화를 억제하고, 하류 AKT 신호전달을 감소시킨다.
표피 성장 인자 및 베타셀룰린은 EGFR의 리간드이고, EGFR-HER3 이종이량체 형성을 유도할 수 있다. SK-BR-3 유방암 세포는 이들 EGFR 리간드 중 하나로 처리할 때 HER3 인산화의 유도를 보여주었다. 1D9 항체 또는 15D5 항체를 사용한 SK-BR-3 세포의 처리는 표피 성장 인자 또는 베타셀룰린 유도된 HER3 인산화를 억제하였다 (도 11 및 도 12). 이것은 이들 항체가 이종이량체화 억제제로서 작용하고, 활성화된 EGFR이 HER3과 이량체화하는 것을 방지할 수 있음을 나타낸다.
1D9 항체 및 15D5 항체는 EGFR-HER3, 또는 HER2-HER3, 또는 HER4-HER3 헤레굴린-유도된 이종이량체 형성을 특이적으로 억제하였다. CHO 세포는 HER3 + 이종이량체 형성시에 HER3을 인산전이시킬 수 있는 단지 하나의 다른 패밀리 구성원으로 형질도입되었다. EGFR, 또는 HER2, 또는 HER4가 이량체화 파트너로서 사용되었는지와 무관하게, 1D9 항체 및 15D5 항체는 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제하였다 (도 13, 도 14 및 도 15). 이것은 1D9 항체 및 15D5 항체가 상기 다른 패밀리 구성원과의 헤레굴린 유도된 이종이량체 형성을 방지하고, HER3 인산화를 방지함을 나타낸다.
실시예 7
1. 개요
항-인간 HER3 항체를 몇몇 시험관내 검정에서 프로파일링하였다. 이것은 전장 HER3 ECD 및 특이적 HER3 도메인에 대한 이들 mAb의 결합에 대한 검정, 종양 세포에 대한 이들 mAb의 결합에 대한 검정, 증식 검정, 침습 검정, 내재화 검정, 및 이들 mAb의 종간 (cross-species) 특이성 (뮤린 및 시노몰구스 원숭이)에 대한 검정을 포함하였다. 뮤린 1D9 항체, 인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체 및 인간화 아크레타맙™ 항체를 평가하였다. 결과는 항-인간 HER3 1D9 항체의 뮤린 및 인간화 구축물 둘 모두가 인간 HER3 ECD 전장을 인식하고, HER3 ECD의 도메인 3에 특이적으로 결합함을 보여주었다. 이들 mAb는 헤레굴린 유도된 종양 세포 증식을 용량 의존 방식으로 억제한다. 이들 mAb는 또한 헤레굴린 유도된 종양 세포 침습을 억제한다. 1D9 항체는 종양 세포 내로의 HER3 수용체 내재화를 유도한다. 이들 mAb는 또한 뮤린 HER3과 교차반응한다.
2. 도입
본 실시예는 항-인간 HER3 항체에 대해 수행된 시험관내 프로파일링을 요약한 것이다. 이것은 두 뮤린 1D9 항체, 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체 및 인간화 아크레타맙™ 항체에 대한 데이터를 포함한다. 다음 검정의 결과를 상세하게 설명한다: 전장 인간 HER3 ECD 및 도메인 결합, 종양 세포에 대한 결합, 증식, 침습, 내재화, 및 교차-특이성 (뮤린).
3. 방법
3.1 HER3 전장 ECD 및 도메인 결합 검정
목적: 이들 검정의 목적은 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체 및 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체가 전장 HER3 세포외 도메인에 결합함을 확인하기 위한 것이었다다. 이들 검정의 또 다른 목적은 mAb가 또한 HER3 도메인 III에 특이적으로 결합하는 것을 확인하기 위한 것이었다.
HER3 세포외 도메인 (ECD)에 대한 항-HER3 항체의 검출을 위해 해리 향상된 란탄족 원소 형광 면역검정 (델피아 (DELFIA))을 사용하였다. 델피아 절차는 다음과 같았다: 백색 맥시소르프 (Maxisorp) 96-웰 플레이트 (눈크 (Nunc) #437796)를 밤새 4℃에서 0.1 M 카르보네이트 완충제 (pH 9.5) 내에서 100 ㎕/웰의 1 ㎍/ml HER-3 ECD 전장 또는 HER3 도메인 I, II, III 및 IV로 코팅하였다. 이들 플레이트를 TBS 내의 카제인 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific) #37532 로트# JD121074)으로 차단하였다. 순수한 (neat) 하이브리도마 상청액, 또는 10 ㎍/ml (또는 100 ㎍/ml)로부터 0.01 ㎍/ml로 퍼킨 엘머 #4002-0010 검정 완충제 내에 희석된 정제된 항-HER3 항체, 또는 최소 3개의 희석액 (100 ㎕/웰)의 PK 혈청 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 이들 샘플을 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 또는 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 100 ㎕/웰의 항-마우스 Eu 항체 (PE 델피아 #AD-0124 로트 326-949-A, 1:1000 = 50 ng/ml에서 사용) 또는 Eu-표지된 항-인간 IgG 제2 항체 (월락 (Wallac) #1244-330 50 ㎍/ml, 정제된 항체의 경우 1:4,000 희석액 또는 PK 시험의 경우 1:2,000에서 사용)를 사용하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 각각의 항체 인큐베이션 단계 후에 바이오테크(BIOTEK)™ 플레이트 세척기에서 트리스-완충제 + 0.05% 트윈-20 (퍼킨 엘머 #4010-0010)으로 4회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 델피아 증진 용액 (퍼킨 엘머 1244-105)을 실온에서 5분 동안 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 유로퓸 시간-분할 형광측정 (TRF) 프로토콜을 사용하여 빅토르 (VICTOR)™ 1420 플레이트 판독기에서 판독하였다. 항체 결합은 웰당 유로퓸 계수로서 기록하였다.
결과: 도 17은 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)의 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III 둘 모두에 대한 특이적 결합을 보여준다. 도 18은 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 II 둘 모두에 대한 특이적 결합을 보여준다. 도 19는 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체의 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III에 대한 특이적 결합을 보여준다. 도 20은 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체의 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III에 대한 특이적 결합을 보여준다. 도 21은 인간화 1D9 항체의 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III에 대한 특이적 결합을 보여준다. 도 17, 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21을 참조한다.
결론: 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 II 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체는 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III에 특이적으로 결합한다. 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체는 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III에 특이적으로 결합한다. 인간화 1D9 항체는 전장 HER3 ECD 및 HER3 도메인 III에 특이적으로 결합한다. 도 17, 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21을 참조한다.
3.2 항-인간 HER3 항체는 유동 세포측정 검정에서 인간 암 세포주에 결합한다
목적: HER3 양성 세포주인 것으로 알려된 인간 암 세포주에 대한 항-인간 HER3 항체의 결합 프로파일의 결정.
시약:
FACS 완충제: PBS, 0.2% BSA, 0.1% 아지드화 나트륨
항체: 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)
인간화 1D9 항체
인간화 1D9 아크레타맙™ 항체
인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체
PE 염소 항-마우스 IgG (H+L) - 칼태그 래보래토리스 (Caltag Laboratories) (M30004-4)
염소 항-인간 IgG 알렉사플루오르(ALEXAFLUOR)647™ - 인비트로겐 (Invitrogen) (A21445)
세포주: CHL1, BxPC3
방법: HER3 수용체에 대해 이전에 스크리닝된 세포주로부터의 5x106개 세포를 유동 세포측정법 튜브에 첨가하였다. 용량 반응 농도의 시험되는 각각의 항체를 적절한 튜브에 첨가하였다. 세포 및 항체를 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 1 ml의 염색 완충제로 1회 세척한 후, 적절한 2차 항체를 적절한 튜브에 첨가하였다. 세포를 다시 얼음 상에서 암소에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세척하고 FACS 완충제 내에 재현탁하였다. 세포를 팍스칸토(FACSCANTO)™ 유동 세포측정기 상에서 분석하였다.
데이터 분석: 분석은 팍스디바(FACSDIVA)™ 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences)에서 개발됨)를 이용하여 수행하였다. 세포 집단을 전방 대 측면 산란을 사용하여 게이팅하고, 형광 강도의 히스토그램을 생성하였다.
결과: 각각의 세포주에 대한 항체 결합의 히스토그램은 이소형 대조군 항체 히스토그램으로부터 우측으로의 이동에 의해 인간화 항-HER3 mAb의 특이적 결합을 보여준다. 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 MCF7 인간 유방암 세포 및 BxPC3 인간 췌장 종양 세포에 의해 발현되는 인간 HER3에 결합하였다. 도 22를 참조한다. 인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체는 모두 CHL-1 인간 흑색종 세포 및 BxPC3 인간 췌장 종양 세포 상에 발현된 인간 HER3에 결합하였다. 도 23을 참조한다.
결론: 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5) 항체는 MCF7 인간 유방암 세포 및 BxPC3 인간 췌장 종양 세포에 의해 발현된 인간 HER3을 인식하였다. 도 22를 참조한다. 인간화 1D9 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체는 모두 CHL-1 (흑색종) 및 BxPC3 (췌장) 인간 암 세포주 상에 발현된 인간 HER3을 인식한다. 도 23을 참조한다.
3.3 헤레굴린 유도된 세포 증식에 대한 M5 .1 D9 억제를 사용한 헤레굴린 유도된 종양 세포 증식의 억제
목적: 임의의 항-인간 HER3 항체가 MCF7 또는 BxPC3 세포주에서 헤레굴린-1β 유도된 세포 증식을 억제할 수 있는지를 결정하기 위함.
시약:
완전 배지: RPMI, 10% FBS, 글루타민
세포주: MCF7
BxPC3 - ATCC
항체: 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)
뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)
뮤린 24H5 항체 (M5.24H5.C2)
인간화 1D9 항체
인간화 1D9 아크레타맙™ 항체
인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체
세포 역가 96 비-방사성 세포 증식 검정 (MTT) - 프로메가 (Promega) G4000.
방법: 각각 1x103 또는 1x104개 세포/웰의 MCF7 또는 BxPC3 세포주를 10% 혈청을 함유하는 완전 배지 내에서 평저 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 혈청-비함유 RPMI로 교체하였다. 10 ㎕의 스크리닝되는 각각의 항체를 적절한 웰에 사중으로 첨가하였다. 항체 및 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 30 ng/ml의 헤레굴린-1β를 각각의 웰에 첨가하였다. 인간화 항체 실험을 위해, 100 ng/ml 헤레굴린을 p-HER3 및 pAkt 검정에 사용되는 조건에 대한 비교를 위해 사용하였다. 플레이트를 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 증식은 프로메가의 MTT 키트를 사용하여 결정하였고, 플레이트는 엔비젼™ 2103 다중 표지 판독기로 분석하였고, 데이터는 마이크로소프트 (Microsoft) 엑셀(EXCEL)™로 분석하였다. 데이터를 헤레굴린 유도된 성장 백분율 대 항체 농도로 그래프화하였다.
결과: MCF7 세포에서 헤레굴린-1β에 반응하여 양호한 증식의 유도가 존재하였다 (약 40%). 그러나, BxPC3 세포에서는 제한된 반응이 존재하였다 (약 10%). 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 및 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5) 둘 모두는 헤레굴린-1β 유도된 MCF7 세포 증식을 억제하였다. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 및 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 실제로 BxPC3 증식을 세포 단독의 수준 아래로 억제하였다. 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체는 BxPC3 세포에서 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)와 유사한 억제 효능을 보였다. 도 24, 도 25 및 도 26을 참조한다.
결론: 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 및 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 MCF7 및 BxPC3 세포 증식을 억제하는 능력에서 대등하였다. 도 24 및 도 25를 참조한다. 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체는 BxPC3 종양 세포 증식을 억제한다. 도 26을 참조한다.
3.4 종양 세포 침습의 억제
목적: 본 연구의 목적은 임의의 항-인간 HER3 항체가 헤레굴린 자극 후에 종양 세포 침습을 억제할 수 있는지를 결정하는 것이다.
방법: HER 패밀리 발현에 대해 이전에 프로파일링된 인간 종양 세포주를 침습 검정에 사용하였다. BXPC3 세포는 HER-2, 및 보다 적은 정도로, HER3 둘 모두를 발현하는 것으로 밝혀졌다. BXPC3 세포 침습에 대한 HER3 항체의 효과는 트레비겐 (Trevigen) 컬트렉스 (CULTREX)™ 세포 침습 검정 (카탈로그 번호 3455-096-K)을 사용하여 결정하였다. 간단히 설명하면, BXPC3 세포를 60% 융합도까지 성장시키고, 밤새 혈청 고갈시킨 후, 베르센(VERSENE)™ 킬레이팅제 (EDTA) 및 트립신을 사용하여 배양 플라스크로부터 제거하였다. 세포를 켄칭 완충제 (RPMI + 2% BSA)로 세척하고, 생존성을 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 결정하고, 세포를 검정에 사용하기 위해 FBS 또는 BSA를 함유하지 않는 RPMI 배지 내에 1 백만개의 세포/ml로 현탁하였다. 항체를 침습 플레이트의 상부 웰에 첨가하기 전에 세포와 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 하부 웰은 RPMI 배지 + 10% 비-열 불활성화된 FBS를 함유하였다. 그러나, 하부 웰의 한 칼럼에는 무작위 이동을 고려하기 위해 FBS가 없는 RPMI를 첨가하였다. 이동한 세포는 칼세인-암 (calcein-am)으로 표지되었고, 하부 챔버를 빅토르™ IV 플레이트 판독기로 판독하였다. 형광 (RFU)은 이동한 세포의 양을 나타낸다. 각각의 항체에 대한 RFU를 이소형 대조군 항체에 대한 RFU로 나누고 100을 곱하여 "% 대조군 침습" 값을 얻었다.
결과: 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5), 키메라 1D9 항체 및 키메라 15D5 항체는 모두 BXPC3 세포 침습을 40% 억제하였다. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 세포 침습을 30% 억제하였다. 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)는 종양 세포 침습을 20% 억제하였다. 도 27을 참조한다.
결론: 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5), 키메라 1D9 항체 및 키메라 15D5 항체는 종양 세포 침습을 억제하였다. 도 27을 참조한다.
3.5 인간 종양 세포에 대한 뮤린 1 D9 항체의 결합은 HER3 수용체 내재화를 유도하였다.
목적: 임의의 항-인간 HER3 항체가 결합시에 HER3 수용체의 내재화를 유도하는지를 결정하기 위함.
시약:
염색 완충제: PBS, 0.2% BSA, 0.1% 아지드화 나트륨
항체: IgG1 대조군 - R&D 시스템즈 MAB002
IgG2b 대조군 - R&D 시스템즈 MAB004
뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) - (3.19 mg/ml)
Hz10 - (9.82 mg/ml)
인간화 1D9 항체 - (1.88 mg/ml)
2차 항체:
PE 염소 항-마우스 IgG (H+L) - 칼태그 래보래토리스 M30004-4
염소 항-인간 IgG 알렉사플루오르647™ - 인비트로겐 A21445
방법: 100 ㎕의 5x106개 세포/ml를 10 ㎍의 항-HER3 항체를 함유하는 유동 세포측정법 튜브에 첨가하였다. 각각의 항체를 이중으로 첨가하였다. 각각의 항체의 하나의 튜브를 얼음 상에서 인큐베이션하고, 다른 튜브는 37℃에서 인큐베이션하였다. 2시간 후에, 세포를 1 ml의 염색 완충제로 세척하고, PE-표지된 염소 항-마우스 2차 항체로 30분 동안 대조염색하였다. 1 ml의 염색 완충제로 추가로 세척한 후에, 세포를 팍스칸토™ 세포측정기로 분석하였다. 데이터 분석은 팍스디바™ 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스에서 개발됨)를 이용하여 수행하였다. 세포 집단을 전방 대 측면 산란을 사용하여 게이팅하고, 형광 강도의 히스토그램을 생성하였다.
결과: 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 및 인간화 1D9 항체를 CHL-1 세포 상의 HER3 수용체의 내재화에 대해 스크리닝하였다. 37℃에서 인큐베이션한 후, 항체는 검출되지 않았고, 이것은 수용체가 세포 표면에 존재하지 않음을 나타낸다. 도 28을 참조한다.
결론: 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 및 인간화 1D9 항체는 수용체에 결합 시에 HER3 수용체의 내재화를 유도하였다. 도 28을 참조한다.
3.6 뮤린 1 D9 항체는 뮤린 종양 세포 상의 뮤린 HER3 과 교차반응한다
목적: 임의의 항-인간 HER3 항체가 뮤린 HER3 양성 세포주와 교차반응하는지를 결정하기 위함.
시약:
FACS 완충제: PBS, 0.2% BSA, 0.1% 아지드화 나트륨
항체: EGFR-바이오사이언스 44783M
HER2 - 바이오사이언스 AHO1011
HER3 - 업스테이트 (Upstate) 05-471
뮤린 15D5 항체
뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5)
뮤린 24H5 항체 (M5.24H5.C2)
세포주: B16
B16F10
제논(ZENON)™ 표지화 키트:
마우스 IgG1 PE - 인비트로겐 Z25021
마우스 IgG1 APC - 인비트로겐 Z25051
마우스 IgG2b APC - 인비트로겐 Z25151
방법: 상업적으로 입수가능한 항-인간 EGFR 및 HER2 항체를 제공받았다. 인간 HER3을 인식하는 것으로 공급자에 의해 제시된 상업적으로 입수가능한 HER3 항체를 제공받았다. 뮤린 15D5 항체, 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5), 뮤린 24H5 항체 (M5.24H5.C2) 항체도 제공받았다. 이들 항체를 제논™ 표지화 키트 (인비트로겐)를 사용하여 PE 또는 APC로 표지하였다. 5x 106개 B16, 또는 B16F10, 뮤린 흑색종 세포를 표지된 항-HER3 항체를 함유하는 유동 세포측정법 튜브에 첨가하였다. 세포 및 항체를 30분 동안 얼음 상에서 암소에서 인큐베이션하고, 세척하고, FACS 완충제 내에 재현탁하였다. 이어서, 세포를 팍스칸토™ 유동 세포측정기로 분석하였다. 데이터 분석은 팍스디바™ 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스에서 개발됨)을 이용하여 수행하였다. 세포 집단을 전방 대 측면 산란을 사용하여 게이팅하고, 형광 강도의 히스토그램을 생성하였다.
결과: 상업적으로 입수가능한 EGFR, HER2 및 HER3 항체는 뮤린 세포 표면 상의 이들 수용체를 인식하지 못하였다 (데이터는 제시하지 않음). 뮤린 15D5 항체, 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5), 및 뮤린 24H5 항체 (M5.24H5.C2)는 모두 B16 및 B16F10 세포의 표면 상의 HER3을 인식하였다. 도 29를 참조한다.
결론: 뮤린 15D5 항체, 뮤린 1D9 항체 (M5.1D9.1F5), 및 뮤린 24H5 항체 (M5.24H5.C2)는 뮤린 HER3과 교차반응한다. 도 29를 참조한다.
실시예 8
1. 개요
인간 암의 마우스 모델은 새로운 항암 약물의 생체내 활성을 입증하기 위해 전임상 상황에서 활발하게 이용되고 있다. 본 연구에서, 마우스 항-HER3 모노클로날 항체 (mAb)를 활성을 확립하고 인간 임상 시험에 적용가능한 추가의 개발을 위한 선도 후보의 우선순위를 정하기 위해서 마우스 동계 폐 군집화 모델에서 및 몇몇 인간 이종이식편 모델에서 평가하였다.
항-HER3 mAb로 처리하거나 처리하지 않으면서 폐에서 폐 군집화를 평가하기 위해 C57BL/6 마우스에게 B16F10 흑색종 세포를 단일 i.v. 주사로 투여하였다. B16F10 주사 후 제3일에 50 mg/kg으로 i.p. 및 제7일 및 제11일에 25 mg/kg으로 i.p. 투여한 뮤린 1D9 항체는 연구 종료, 즉, B16F10 주사 후 제20일에 폐 중량의 유의한 감소를 야기하였다 (p<0.001). 뮤린 15D5 항체는 또한 폐 내로의 종양 세포 군집화를 억제하였으나 (p<0.05), 25 및 5 mg/kg, i.p.의 보다 저용량 요법이 50/25 mg/kg 용량 요법에 비해 더 큰 활성을 보였다. 마우스 1D9 및 15D5 mAb 둘 모두를 인간 종양에 대한 활성을 평가하기 위해 이종이식편 모델에서 후속적으로 평가하였다.
마우스 항-HER3 mAb는 CB-17 SCID 마우스 내로 이식된 진행 HER3+ 인간 이종이식편의 성장을 지연시켰다. 0.5 내지 100 mg/kg, i.p.로 뮤린 1D9 항체 또는 뮤린 15D5 항체를 매주 2회 처리하면, CHL-1 흑색종 종양 성장이 용량 의존적 및 통계적으로 유의하게 감소하였다 (≥5 mg/kg에서 p<0.001). CB-17 SCID 마우스에서 피하 이식 후에 BxPC3 췌장 종양 성장에 대해 유사한 활성이 관찰되었다 (≥5 mg/kg에서 p<0.001).
1D9 항체 및 15D5 항체는 5 내지 50 mg/kg의 용량에서 CHL-1 흑색종 이종이식편 모델에서 유의한 및 용량 의존적 항종양 활성을 보유하였다 (p<0.001). 또한, 인간화 1D9 RR 항체 및 인간화 1D9 RR 아크레타맙™ 항체는 5, 25 및 50 mg/kg의 용량에서 유의하고 동등하게 강력한 활성을 가졌다 (p<0.001).
피하 및 동소 BxPC3 이종이식편 모델에서, 50 mg/kg의 키메라 1D9 항체 또는 인간화 15D5 항체는 연구 종료시까지 종양 성장을 유의하게 억제한 반면 (p<0.001), 50 mg/kg 인간화 1D9 RR 항체는 피하 BxPC3 모델에서 종양 성장에 대한 유의하지만 (p<0.001) 일시적인 효과를 보였다. 성장 억제 지속 기간의 차이는 연구 편차 (즉, 이식된 BxPC3 단편의 특징)에 의한 것일 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유전적으로 조작된 mAb의 종양 성장에 대한 효능은 입증되었다.
마지막으로, NCI-N87 위 모델에서 인간화 1D9 RR 항체, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체, 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체의 평가는 CHL-1 흑색종 이종이식편에 대한 향상된 mAb의 활성을 나타내었다.
2. 도입
본 연구에서, 뮤린 모 또는 인간화 HER3 모노클로날 항체를 진행 HER3+ 인간 이종이식편, 즉, CHL-1 흑색종, BxPC3 췌장 종양, 및 NCI-N87 위 종양에 대한 항-종양 활성에 대해 평가하였다. 마우스 B16F10 흑색종 세포를 사용한 동계 폐 군집화 모델이 뮤린 모 항-HER3 mAb의 활성을 평가하기 위해 예비 평가에 포함되었다.
3. 방법
3.1. 실험 제제(들)
본 연구에 사용된 모델은 영국 내무성에서 규정한 동물 실험의 UK 표준에 따른다.
인간 이종이식편 종양 모델 연구는 체중이 대략 15-20 g인 6-8주령 암컷 CB-17 SCID 마우스 (타코닉 (Taconic, 미국 인디내아주 인디애나))에서 수행하였다. 마우스는 연구 개시시에 10-12주령이었다. 동계 폐 군집화 모델 연구는 체중이 대략 15-20 g인 6-8주령 C57B1 암컷 마우스에서 수행하였다.
마우스 (B16F10), 및 인간 (BxPC3, NCI N87 및 CHL-1) 종양 세포주는 세포 보관소로부터 얻었다.
3.2. 실험 프로토콜(들)
3.2.1. 마우스 B16F10 흑색종 동계 모델
C57BL/6 암컷 마우스에게 2x105개 B16F10 세포를 i.v. 주사하였다. 마우스 항-HER3 항체 또는 이소형 대조군은 종양 세포 주사 후 제3일에 50 또는 25 mg/kg으로 i.p., 후속적으로 제7일 및 제11일에 25 또는 5 mg/kg으로 i.p. 투여하였다. 주사후 제3일에 겜자르™ (NDC 0002-7502-01; 겜시타빈)을 i.v. 투여하였다. 동물을 제20일에 안락사시키고, 습식 중량 측정을 위해 폐를 수거하였다.
3.2.2. 인간 CHL -1 흑색종 이종이식편 모델
마트리겔(MATRIGEL)™ 내의 CHL-1 세포 (5x105 내지 5x106개)를 CB-17 SCID 마우스의 옆구리 내에 피하 (s.c.) 주사하였다 . 일단 종양 이종이식편이 80-120 mm3의 평균 부피에 도달했을 때, 마우스를 무작위로 치료군 (n=6마리 마우스/군)으로 분류하고, 항-HER3 mAb 또는 이소형 대조군을 투여하였다. 0.5 내지 100 mg/kg의 용량을 매주 2회 i.p. 투여하였다. 비히클-처리된 마우스는 종양 성장에 대한 대조군으로서 사용하였다.
종양 폭 (W) 및 길이 (L)를 수동 캘리퍼스로 매주 측정하고, 종양 부피 (V)를 다음 식을 이용하여 계산하였다: V = 1/2(LxW2). 이소형 대조군의 평균 종양 부피가 1000 mm3을 초과할 때 연구를 종료하였다.
3.2.3. 인간 BxPC3 췌장 이종이식편 모델: 피하 및 동소 이식
BxPC3 세포 (5x106개/마우스)에게 공여자로서 기능하는 CB-17 SCID 마우스에게 s.c. 주사하였다. 종양이 800-1000 mm3의 부피에 도달할 때, BxPC3 종양 보유 공여자 마우스를 안락사시킨 후; 종양을 수거하고 3 mm3 종양 단편으로 나누었다. 새로 수거한 BxPC3 종양 단편을 수용자 마우스의 옆구리 내로 s.c. 이식하였다. 동소 모델에서, 단편은 수용자 마우스의 췌장 내로 수술에 의해 이식하였다.
일단 수용자 마우스의 종양 이종이식편이 80-120 mm3의 평균 부피에 도달했을 때, 마우스를 무작위로 치료군 (n=6마리 마우스/군)으로 분류하고, 항-HER3 mAb 또는 이소형 대조군으로 처리하였다. 0.5 내지 100 mg/kg의 용량을 매주 2회 i.p. (피하 이식물 모델) 또는 i.v. (동소 이식물 모델) 투여하였다. 비히클-처리된 마우스는 종양 성장에 대한 대조군으로서 사용하였다.
종양 부피는 상기한 바와 같이 수동 캘리퍼스로 매주 측정하였다. 동소 모델에서, 종양은 초음파로 측정하고, 부피는 비주얼 소닉스 베보 (VISUAL SONICS VEVO)™ 770 영상 분석 시스템을 사용하여 결정하였다.
3.2.4. 인간 NCI - N87 위 이종이식편 모델
NCI-N87 세포를 공여자 마우스의 우측 옆구리 내로 동물당 ~1x106개 세포로 이식하였다. 종양 단편을 공여자 마우스로부터 수거하고, 10-12주령 수용자 마우스의 옆구리 내로 s.c. 이식하였다. 마우스 항-HER3 mAb를 사용한 처리는 종양 이종이식편이 50-80 mm3의 평균 부피에 도달할 때, 또는 단편 이식 후 제29일에 개시하였다. 유전자 조작된 항-HER3 mAb를 사용한 처리는 종양 이종이식편이 80-1003 mm의 평균 부피에 도달할 때, 또는 이식 후 제15일에 개시하였다.
종양 부피는 상기한 바와 같이 수동 캘리퍼스로 매주 측정하였다.
3.3. 약물 및 물질
본 연구에 사용된 항-HER3 항체 및 이소형 대조군을 아래 표에 제시한다. 또한, 본원에서 사용되는 약칭 명명도 포함된다. 모든 항체는 투여를 위해 포스페이트 완충 염수 (pH 7.0)를 사용하여 제제화하고 제조하였다.
Figure pct00021
3.4. 데이터 분석
군 평균 및 평균의 표준 오차를 대조군 및 처리군에 대해 결정하였다. 데이터를 그래프로 표시하고, 인간 이종이식편 모델에 대해 본페로니 사후 검정을 사용한 이원 ANOVA 및 마우스 동계 모델에 대해 던넷 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA를 사용하여 분석하였다 (그래프패드™ 프리즘™ 소프트웨어, v.5).
4. 결과
4.1. 마우스 항- HER3 mAb 의 생체내 효능
뮤린 1D9 항체 및 뮤린 15D5 항체를 종양 세포 성장에 대한 효능을 입증하기 위해 마우스 동계 모델에서, 및 몇몇 인간 이종이식편 모델에서 평가하였다.
4.1.1. 마우스 B16F10 흑색종 동계 모델
항-HER3 뮤린 1D9 항체로의 처리는 C57BL/6 마우스의 폐에서 B16F10 종양 군집화를 감소시켰다. 50/25 mg/kg 군은 이소형 대조군에 비해 폐 중량의 유의한 감소를 보였다 (p<0.01) (도 30). 또한, 뮤린 15D5 항체는 이소형 대조군에 비해 25/5 mg/kg 군에서 폐의 종양 군집화의 감소를 보였다 (p<0.05; 도 31).
4.1.2. 인간 CHL -1 흑색종 이종이식편 모델
항-HER3 뮤린 1D9 항체 또는 뮤린 15D5 항체를 5 내지 100 mg/kg의 용량에서 i.p.로 매주 2회 투여한 CB-17 SCID 마우스는 이들의 각각의 이소형 대조군에 비해 인간 CHL-1 종양 성장에서 용량 의존적이고 통계적으로 유의한 감소 (p<0.001)를 보였다 (도 32 및 도 33).
4.1.3. 인간 BxPC3 췌장 이종이식편 모델
뮤린 1D9 항체를 0.5 내지 50 mg/kg의 용량에서 i.p.로 매주 2회 투여한 CB-17 SCID 마우스는 이소형 대조군에 비해 BxPC3 종양 성장에서 유의한 감소를 보였다 (≥5 mg/kg에서 p<0.001) (도 36). 유사하게, 뮤린 15D5 항체를 사용한 처리는 이소형 대조군에 비해 5 내지 50 mg/kg 군에서 BxPC3 종양 성장을 감소시켰다 (p<0.001) (도 35).
4.1.4. 인간 NCI - N87 위 이종이식편 모델
뮤린 1D9 항체를 75 또는 100 mg/kg의 용량에서 i.p.로 매주 2회 투여한 CB-17 SCID 마우스는 비히클 대조군에 비해 종양 부피의 유의한 감소를 보였다 (p<0.001) (도 36). 비히클 및 이소형 대조군에 비교한 NCI-N87 종양 성장에 대한 뮤린 15D5 항체의 효과를 도 37에 도시한다.
4.2. 키메라 및 인간화 항- HER3 mAb 의 생체내 효능
인간화 15D5 항체, 키메라 1D9 항체, 및 인간화 1D9 RR 항체를 생성하고 평가하였다. 다양한 시험관내 및 생체내 모델에서 인간화 1D9 RR 항체의 활성에 기반하여, 추가의 공학처리를 사용하여 IgG1 mAb (인간화 1D9 RR 아크레타맙™ 항체)의 항체 의존 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존 세포독성 (CDC) 특질, 또는 CDC 단독 (인간화 1D9 RR 포텔리겐트™ 항체)을 향상시켰다. 아래에 인간 이종이식편 모델에서 다양한 항체의 활성을 요약한다.
4.2.1. 인간 CHL -1 이종이식편 모델
키메라 1D9 항체를 5 내지 50 mg/kg에서 i.p.로 매주 2회 투여한 CB-17 SCID 마우스는 이소형 대조군에 비해 CHL-1 종양 성장에서 용량 의존적 감소를 보였다. 이식 후 제24일에, 감소는 25 및 50 mg/kg 군에서 통계적으로 유의하였고 (p<0.05), 이식 후 제27일에, 모든 처리군에서 유의한 감소가 관찰되었다 (p<0.001) (도 38). 인간화 15D5 항체 처리군에서 유사한 발견이 관찰되었다 (도 39).
인간화 H1D9 RR 항체, 인간화 H1D9 RR 아크레타맙™ 항체 및 인간화 H1D9 RR 포텔리겐트™ 항체를 5 내지 50 mg/kg의 용량에서 CHL-1 이종이식편 모델에서 평가하였다. 인간화 H1D9 RR 항체, 인간화 H1D9 RR 아크레타맙™ 항체 및 인간화 H1D9 RR 포텔리겐트™ 항체는 유사한 활성 프로파일을 가졌다. 이식 후 제29일에 시작하여 제34일에 연구 종료까지 모든 용량 수준에서 종양 성장에서 유의한 감소가 관찰되었다 (p<0.001) (도 40, 도 41 및 도 42).
4.2.2. 인간 BxPC3 이종이식편 모델 (피하 및 동소 이식물 )
피하 BxPC3 이식후 ch1D9를 0.5 내지 50 mg/kg에서 i.p.로 매주 2회 투여한 CB-17 SCID 마우스는 50 mg/kg 군 (p<0.001) 및 5 및 0.5 mg/kg 군 (p<0.01)에서 제33일에 시작하여 종양 성장에서 통계적으로 유의한 용량 의존적 감소를 보였다. 유의하게 더 낮은 종양 부피는 50 mg/kg 군에서 제36일까지 지속하였다 (p<0.001) (도 43). 0.5 내지 50 mg/kg에서 h15D5를 사용한 처리는 50 mg/kg 군에서 이식후 제33일 및 제36일에 검출가능한 종양 성장 지연을 일으켰다 (p<0.01) (도 44). 0.5 내지 50 mg/kg에서 인간화 1D9 RR 항체의 매주 2회 처리 후 BxPC3 종양 성장의 관찰된 감소의 특징을 도 45에 제시한다.
키메라 1D9 항체 및 인간화 15D5 항체를 피하 이식에 비해 임상 성과을 더욱 더 예측하는 것으로 여겨지는 BxPC3 수술에 의한 동소 이식 모델에서 평가하였다. 매주 2회 i.v. 경로에 의해 50 mg/kg 키메라 1D9 항체 또는 인간화 15D5 항체를 사용한 처리는 이식후 제5주 내지 제7주에 이소형 대조군에 비해 유의한 종양 성장 지연을 일으켰다 (p<0.01) (도 46).
4.2.3. 인간 NCI - N87 위 이종이식편 모델
인간화 H1D9 RR 항체, 인간화 H1D9 RR 아크레타맙™ 항체 및 인간화 H1D9 RR 포텔리겐트™ 항체의 항-종양 활성을 인간 NCI-N87 위 모델에서 평가하였다. CB-17 SCID 마우스에게 50 mg/kg를 i.p.로 매주 2회 투여하였다. 50 mg/kg에서 투여된 인간화 H1D9 RR 아크레타맙™ 항체는 종양 부피를 감소시켰고, 이것은 이식후 제44일에 통계적 유의성에 도달하였다 (p<0.05) (도 47).
5. 논의
인간 암의 마우스 모델은 새로운 항암 약물의 생체내 활성을 입증하기 위해 전임상 상황에서 광범하게 활용되었다. 본 연구에서, 마우스 항-HER3 모노클로날 mAb를 활성을 확립하고 및 인간 임상 시험에 적용가능한 추가의 개발을 위한 선도 후보를 우선적으로 하기 위해 마우스 동계 폐 군집화 모델에서 및 몇몇 인간 이종이식편 모델에서 평가하였다.
마우스 항-HER3 mAb는 C57BL/6 마우스의 폐에서 마우스 B16F10 종양 세포 군집화의 유의한 감소를 일으켰다. 뮤린 1D9 항체의 유효 용량 요법은 50/25 mg/kg i.p.인 한편, 뮤린 15D5 항체를 사용한 25/5 mg/kg i.p. 요법이 보다 고용량 수준에 비해 더 큰 효능을 가졌다. 두 마우스 항-HER3 mAb를 인간 종양에 대한 활성을 평가하기 위해 이종이식편 모델에서 후속적으로 평가하였다.
마우스 항-HER3 mAb는 진행 HER3+ 인간 이종이식편에서 확립된 종양의 성장을 지연시켰다. CHL-1 흑색종 세포 이식 후 용량 > 5 mg/kg에서 매주 2회 뮤린 1D9 항체 또는 뮤린 15D5 항체를 사용한 처리는 종양 성장에서 유의하고 용량 의존적 감소를 일으켰다. 피하 BxPC3 췌장 이종이식편 모델에서 유사한 활성이 관찰되었다.
1D9 항체 및 15D5 항체는 CHL-1 흑색종 이종이식편 모델에서 ≥5 mg/kg에서 용량 의존적인 항-종양 활성을 보유하였다. 더욱이, 5 mg/kg에서 인간화 1D9 RR 항체 또는 인간화 1D9 RR 아크레타맙™ 항체를 사용한 처리는 용량 ≥25 mg/kg에 대등한 종양 성장 지연을 일으켰다.
피하 및 동소 BxPC3 이종이식편 모델에서, 50 mg/kg 키메라 1D9 항체 또는 인간화 15D5 항체는 연구 종료까지 종양 성장의 유의한 억제를 일으킨 한편, 20 mg/kg 인간화 1D9 RR 항체는 피하 BxPC3 모델에서 종양 성장에 대해 유의한 효과를 보였다. 종양 성장에 대한 항체의 효능이 입증되었다.
마지막으로, NCI-N87 위 모델에서 인간화 1D9 RR 항체, 인간화 1D9 RR 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 RR 포텔리겐트™ 항체의 평가는 CHL-1 흑색종 이종이식편에 대한 활성에 비해 향상된 mAb의 일부 활성을 지시하였다.
6. 결론
0.5 내지 100 mg/kg의 농도로 매주 2회 투여한 뮤린 모 및/또는 인간화 HER3 모노클로날 항체를 사용한 요법은 CHL-1 흑색종 및 BxPC3 췌장 인간 이종이식편 모델에서 확립된 HER3+ 인간 종양의 성장을 지연시킬 수 있었다.
실시예 9
1. 개요
항체 의존 세포-매개 세포독성 (ADCC) 검정 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 검정은 모두 야생형 항-HER3 항체 및 이들 항체의 향상된 버전의 기능성을 평가하기 위해 사용되었다.
본 실시예는 야생형 항체 및 향상된 버전의 항체의 기능성을 평가하기 위해 사용된 시험관내 검정을 설명한다. 이들 검정은 그의 표적에 결합하는 항체의 능력을 평가하고, 이어서, 항체의 기능적 Fc 영역을 평가하기 위해 보체 또는 "효과기" 세포의 첨가하기 위해 다양한 HER3 발현 "표적" 세포를 사용하였다.
2. 도입
본 실시예는 비-향상된 "야생형" 항체에 비해 항-HER3 "향상된 항체"의 증가된 기능성/효능을 보여준다.
3. 방법
3.1. 실험 제제(들)
3.2. 실험 프로토콜(들)
3.2.1. 항체 의존 세포-매개 세포독성
정제된 인간 말초 혈액 단핵 세포를 본 ADCC 검정에서 효과기 세포로서 프로파일링하였다. 간단히 설명하면, 헤파린 나트륨을 사용하여 수거한 인간 전혈을 밀도 구배 분리 원심분리관 (유니-셉맥스 (UNI-SEPMAX)™, 애큐레이트 서지컬 앤드 사이언티픽 (Accurate Surgical and Scientific))을 사용하여 정제하였다. 이어서, 이들 정제된 말초 혈액 단핵 세포를 세척하고, 페놀 레드 + 10% FBS 부재하의 RMPI 1640 내에 재현탁하였다 (1:50의 T:E 비에 대해 1 x 107개 세포/ml). 이어서, HER3 수용체 양성 세포 (HER3 박맘™ 형질도입된 HEK293 MSRII 또는 CHL-1 세포)에 표적 세포로서 사용하기 위해 유로퓸을 부가하였다. 형질도입된 세포는 고 HER3-발현 세포주로서 역할을 한 한편, CHL-1 세포는 저-발현 세포주로서 역할을 하였다. 이들 부하된 표적 세포를 8 x 105개 세포/ml로 페놀 레드 + 10% FBS 부재하의 RMPI 1640으로 재현탁하였다.
몇몇 항-HER3 항체 (25 ㎕/웰)을 96-웰 환저 플레이트 내로 부가하였다. 이어서, 유로퓸 부하된 표적 세포 (25 ㎕/웰)를 항체를 함유하는 플레이트 내로 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 30분 인큐베이션 후에, 100 ㎕/웰의 효과기 세포를 플레이트에 첨가하고, 추가로 2시간 동안 다시 인큐베이터에 넣었다. 특이적 세포 용해의 측정은 상기 실험 플레이트로부터 25 ㎕/웰의 상청액을 제거하고 이를 100 ㎕/웰의 델피아™ 증진 용액을 함유하는 96-웰 맥시소르프 플레이트 내로 옮김으로써 실시하였다. 이어서, 실온에서 5분 인큐베이션 후에, 플레이트를 월락 빅토르™ V 플레이트 판독기 상에서 시간-분할 형광을 이용하여 판독하였다. 용해된 표적 세포로부터 둘러싸는 상청액으로 방출된 임의의 유로퓸 (세포 세포독성)을 형광 단위로서 측정하였다. 이 값을 % 특이적-용해로 전환시키고, 그래프패드™ 프리즘™ 소프트웨어를 이용하여 % 용해 대 항체 농도로서 그래프화하였다. % 특이적 세포독성을 계산하기 위해 사용된 식은 다음과 같았다:
% 세포독성 = [(실험적 방출) - (자발적 방출)] x 100
[(최대 방출) - (자발적 방출)]
대조 웰: 세포 사멸 및 유로퓸의 후속적인 방출을 유도하기 위해 디터전트 트리톤 (TRITON) X™의 1% 용액을 "최대 방출" 웰에 첨가하였다. "자발적" 유로퓸 방출의 수준을 측정하기 위해 몇몇 추가의 대조 웰은 효과기 세포 없이 표적 세포를 함유하였다.
형질도입: 적절한 박맘™ 바이러스 (인간 HER3, 시노몰구스 원숭이 HER3, 또는 래트 HER3)를 24 hr 동안 8-15% 바이러스 (v/v)에 대응하는 100의 moi에서 HEK293 MSRII 세포에 첨가하였다. 이어서, 형질도입된 세포를 TrypLE를 사용하여 조직 배양 플라스크로부터 제거하고, 수회 세척하고, ADCC 검정에서 표적 세포로서 사용하기 전에 유로퓸을 부가하였다.
원숭이 혈액: 밀도 구배 분리 완충제 (피콜 (FICOLL)™)을 Ca2 및 Mg2 부재하의 PBS를 사용하여 10% (v/v)로 희석한 후, 원숭이 말초 혈액 림프구 (효과기 세포)에 대해 밀도 원심분리를 수행하였다.
확립된 정책에 일치하여 인간 혈액을 본 연구에 사용하였다. 원숭이 혈액은 확립된 프로토콜 하에 얻었다. 본 연구에 사용된 모델은 동물 실험의 UK 표준에 따른다.
3.2.2 보체 의존 세포독성
본 실험은 표적으로서 사용된 hHER3 박맘™ 형질도입된 HEK 293 MSR II 세포주를 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 이들 세포를 T175 배양 플라스크 내에서 ~21시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 형질도입시켰다 (moi 100). 이어서, 부착 세포를 TrypLE를 사용하여 플라스크로부터 제거하고, 수회 세척한 후, 1x105개 세포/50 ㎕/웰로 96-웰 플레이트 내로 플레이팅하였다. 25 ㎕/웰의 항-인간 HER3 mAb를 즉시 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후에, 칼바이오켐™으로부터의 20 ㎕/웰의 토끼 보체 (최종 20%)를 실험 플레이트에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 추가로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생육성의 평가는 100 ㎕의 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)™을 멀티채널 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하면서 각각의 웰에 첨가함으로써 실시하였다. 이어서, 플레이트를 월락 빅토르™ V 플레이트 판독기 상에서 발광 신호에 대해 판독하였다 (생존성 세포는 증가된 신호를 가진다).
3.3. 약물 및 물질
인간 HER3 박맘™
원숭이 (시노몰구스) HER3 박맘™
피콜™ 지이 헬쓰케어 #17-1440-02
트리톤 X-100™ 시그마 (Sigma) #T9284
분리 튜브 애큐레이트 서지컬 앤드 사이언티픽 #UN-10
유로퓸 플루카 (Fluka) #207128
96-웰 환저 플레이트 코스타 (Costar) #3799
96-웰 평저 플레이트 써모 사이언티픽 #436110
인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체
인간화 1D9 항체
인간화 1D9 아크레타맙™ 항체
인간화 1D9 1D9 포텔리겐트™ 항체
보체 칼바이오켐™ #234400
셀타이터-글로™ 프로메가 #G7571
델피아™ 증진 용액 #4001-0010
3.4. 데이터 분석
그래프패드™ 프리즘™ 소프트웨어를 특이적 용해 대 항체 농도 그래프를 그리고 EC50 값을 계산하기 위해 사용하였다.
4. 결과
4.1 ADCC 검정
인간화 1D9 항체 (일부 경우에 HZ1D9 또는 H6L2로서 확인됨), 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체, 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체 및 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체를 평가한 인간 PBL ADCC 검정으로부터 얻어진 결과를 도 48 및 도 49에 제시한다. 이들 결과는 표적 세포로서 HER3 박맘™ 형질도입된 HEK293 세포 및 효과기 세포로서 인간 말초 혈액 림프구를 사용하여 얻었다 (도 48). 상기 실험 설비를 동일한 인간 PBL 효과기 세포를 사용하고 표적 세포 집단으로서 CHL-1 세포를 사용하여 동시에 수행하였다 (도 49). 이들 결과는 야생형 (비-향상된) 항체에 비해 향상된 항체를 사용하여 증가된 효능 및 증가된 최대 용해가 모두 얻어졌음을 명백하게 보여준다.
인간화 1D9 항체 (일부 경우에 HZ1D9 또는 H6L2로서 확인됨), 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체, 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체 및 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체를 평가한 시노몰구스 원숭이 PBL (말초 혈액 림프구) ADCC 검정으로부터의 결과를 도 50 내지 도 53에 제시한다. 이들 결과는 표적 세포로서 HER3 박맘™ 형질도입된 HEK293 세포 및 효과기 세포로서 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 림프구를 사용하여 얻어졌다 (도 50 및 도 51). 상기 실험 설비를 동일한 시노몰구스 PBL 효과기 세포를 사용하고 표적 세포 집단으로서 CHL-1 세포를 사용하여 동시에 수행하였다 (도 52 및 도 53). 이들 결과는 야생형 (비-향상된) 항체에 비해 향상된 항체를 사용하여 증가된 효능 및 증가된 최대 용해가 모두 얻어졌음을 명백하게 보여준다.
4.2. CDC 검정
도 54에 제시된 결과는 인간 HER3 형질도입된 HEK293 표적 세포 및 토끼 보체를 사용하여 CDC 검정으로부터 얻어졌다. 결과는 인간화 1D9 항체 (일부 경우에 HZ1D9 또는 H6L2로서 확인됨), 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체가 각각 유사한 수준의 보체 매개 표적 세포 용해를 일으켰음을 보여준다. 그 반면에, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체는 이들 다른 항체를 사용하여 보인 것에 비해 초과하여 보체 매개 용해에서 적어도 10배 개선을 보여주었다. 인간화 1D9 Fc 디세이블드 항체는 임의의 측정가능한 보체 매개 용해를 보이지 않았다.
5. 논의
본원에 제시된 결과는 인간화 1D9 항체의 "Fc 향상된" 버전 (예를 들어, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체)이 항체-의존 세포-매개 세포독성 검정 및 보체-의존 세포독성 검정 모두에서 개선된 기능을 보였음을 입증한다. 이것은 고 (ADCC 및 CDC) 및 저 (ADCC) 인간 HER3-발현 세포주 및 시노몰구스 원숭이 HER3 발현 세포 (ADCC) 모두에서 입증되었다.
ADCC/CDC 반응성을 보장하기 위해 선택 기준이 사용되지 않으므로, 인간 효과기 세포 데이터는 인간 집단에서 보일 수 있는 것과 관련된다. 개별 인간 공여자 (고-특이적 용해 대 저-특이적 용해) 사이에서 차이가 보이지만, "Fc-향상된" 항체는 야생형 모 항체보다 더 높은 효능을 일관적으로 보여주었다. 시노몰구스 원숭이 효과기 세포 데이터를 이용하여 전체 독성 연구에서 사용된 실제 원숭이로부터 효과기 세포를 프로파일링할 수 있었다.
요약하면, 인간화 1D9 아크레타맙™ 항체 및 인간화 1D9 포텔리겐트™ 항체는 모두 개선된 ADCC 및 ADCC/CDC 기능성을 (각각) 보였다.
실시예 10
1. 개요
뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 인간 HER3 수용체의 도메인 II 세포외 영역에 결합하는 뮤린 항-HER3 항체이다. 상기 항체는 면역조직화학을 통해 동결된 및 포르말린-고정되고 파라핀 포매된 (FFPE) 암성 인간 조직 모두와 잘 결합하는 것으로 나타났다.
2. 도입
뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 HER3 발현의 평가를 위한 동반 (companion) 진단제로서의 그의 잠재적인 용도에 대해 입증되었다. 상기 동반 진단제는 항-HER3 모노클로날 항체 요법이 임상상 유익할 수 있는 환자를 확인하는 것을 돕도록 사용될 것이다. 동반 mAb는 종양 조직에 걸친 종양의 HER3 발현 수준, 및/또는 종양의 HER3 수용체 발현의 강도를 기초로 하여 종양을 특정 범주로 분류하기 위해 사용될 수 있다.
본 실시예는 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 특이성 입증을 돕기 위해 사용되는 핵심 실험의 일부를 개략적으로 설명할 것이다. 본 실시예에서 실험은 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 HER3 및 다른 HER 패밀리 구성원 (예를 들어, HER1, HER2 및 HER4)에 대한 면역반응성 및 특이성을 검사할 것이다. 본 실시예는 동결되고 포르말린-고정되고 파라핀-포매된 조직에 대한 면역조직화학; 4개의 HER 패밀리 구성원 (예를 들어, HER1, HER2, HER3 및 HER4)의 면역세포화학, 면역침전; 세포 용해물 및 정제된 HER3 세포외 도메인 영역의 특이성을 확인하기 위한 경쟁 검정 및 웨스턴 블로팅의 결과를 설명한다.
3. 방법
3.1. 실험 제제(들)
3.2. 실험 프로토콜(들)
3.2.1. Her 패밀리 구성원의 웨스턴 블롯
HEK 293 MSRII 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 22 hr 동안 HER1, HER2, HER3 또는 HER4 박맘™으로 100 감염다중도 (moi)로 형질도입하였다. 각각의 세포주를 베르센을 사용하여 수거한 후, 세포를 트리판 블루 배제 염색을 이용하여 계수하였다. 세포 현탁액을 10 ml의 PBS로 세척한 후에, 3x107개 세포를 수거하고, 1 ml의 RIPA 용해 용액 (원액 RIPA 용해 용액: 10 ml 1x RIPA 용해 완충제 + 미니 홀트 (mini halt) 프로테아제 억제제의 정제 1개) 내에 넣었다. 이어서, 상기 제제를 2분 동안 볼텍싱하고, 원심분리하고, 상청액 (세포 용해물)을 4℃에서 저장하였다.
세포 용해물을 LDS 샘플 완충제 및 환원제와 합한 후, 70℃로 10분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 용해물을 퀴아쉬레더(QIASHREDDER)™ 내에 넣고, 2분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하였다. 이어서, 용해물을 4-12% 구배 비스-트리스 (Bis-Tris) 겔의 레인 (lane) 내로 부가하고, 단백질 분리를 허용하도록 전기영동하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스로 옮긴 후, 0.1% 트윈 (Tween)-20을 함유하는 차단 용액과 함께 밤새 인큐베이션하였다. HER1, HER2, HER3 또는 HER4 패밀리 구성원에 대한 1차 항체를 5시간 동안 실온에서 첨가하였다. 이어서, IR-접합된 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 리-코르(LI-COR)™ 오디세이(ODYSSEY)™ 영상 분석기 기기를 사용하여 가시화하였다.
3.2.2. 뮤린 15 D5 항체를 사용한 면역침전
상기한 바와 같이 3x107개 세포/ml의 현탁액으로부터 제조된 200 ㎕의 용해물을 10 ㎍의 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)와 합하고, 4℃에서 회전 장치 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 항원-항체 복합체를 50 ㎕의 침강된 고정된 단백질 A/G 수지 (100 ㎕ 수지 슬러리)와 합하고, 부드럽게 혼합하면서 2시간 동안 실온에서 회전 장치 상에서 인큐베이션하였다. 5,000 rpm (~1,000xg)에서 5분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 면역-침전물을 수거하였다. 이어서, 펠릿을 1 ml RIPA 완충제로 4회 세척하였다. 세척한 펠릿을 20 ㎕의 1X LDS 로딩 완충제 (100 ㎕의 RIPA 완충제, 33 ㎕의 LDS 샘플 완충제 (4X), 13.3 ㎕의 환원제 (10X))로 재현탁하고, 샘플을 100℃에서 5분 동안 비등시켰다. 샘플을 얼음 상에서 냉각시킨 후에, 5,000 rpm (~1,000xg)에서 1분 동안 원심분리하였다. 이어서, 이들 샘플을 겔에 로딩하고 (0.4 ㎍/레인의 HER3 항원, 10 ㎕/레인의 HER 패밀리 박맘™ 형질도입된 HEK293 MSRII 용해물 및 20 ㎕/레인의 CHL-1 세포 용해물), 200V에서 약 50분 동안 전개시켰다. 겔 분리된 단백질을 니트로셀룰로스로 이동시킨 후, 생성되는 블롯을 상업적으로 입수가능한 항-HER3 1차 mAb (R&D 시스템 MAB3482), 이어서 IR-접합된 염소 항-마우스 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 리-코르™ 오디세이™ 영상 분석기 기기를 사용하여 가시화하였다.
3.2.3. Her 패밀리 구성원의 면역세포화학
HEK293 MSRII 세포를 Her3 박맘™으로 37℃ 및 5% CO2에서 24 hr 동안 100 moi로 형질도입하였다. 이어서, 세포를 TrypLE를 사용하여 수거하고, 세포를 계수하고, PBS를 사용하여 세척하였다. PBS 내의 0.5x106개 세포/ml의 현탁액을 이어서 제조하고, 100 ㎕의 상기 현탁액을 현미경 슬라이드가 부착된 사이토스핀 (cytospin) 깔때기에 첨가하였다. 이들을 5분 동안 500 rpm에서 원심분리하여 50,000개 세포를 함유하는 세포 스팟을 생성하였다. 슬라이드를 생물 후드 내에서 밤새 건조시키고, 다음날 실온 아세톤으로 2분 동안 고정시켰다. 2시간 동안 건조시킨 후에, 슬라이드를 사란 랩 (Saran wrap)으로 감싸고, 면역염색을 위해 준비할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
6개의 슬라이드를 -20℃ 동결기로부터 꺼내고, 실온으로 만든 후, 공기 건조시켰다. 일단 건조되면, 각각의 세포 스팟을 염색을 위한 소수성 장벽을 형성하도록 팝 (Pap) 펜으로 표시하였다. 슬라이드를 수화시키기 위해 TBST (트리스 완충 염수 + 0.05% 트윈-20™) 내에 10분 동안 넣고, 단백질 차단 용액에 30분 동안 첨가하였다. 1 ㎍/ml의 뮤린 15D5 항체 (1차 항체로서)를 2시간 동안 실온에서 슬라이드에 직접 적용하였다. 슬라이드를 TBST로 3회 세척하고, HRP-접합된 항-마우스 2차 항체를 2시간 동안 실온에서 직접 적용하였다. 슬라이드를 TBST를 사용하여 각각 5분 동안 3회 세척한 후, DAB 기질을 2분 동안 첨가하였다. 이어서, 슬라이드를 물로 각각 5분 동안 3회 세정하고, 2분 동안 헤마톡실린에 넣었다. 이어서, 슬라이드를 물로 각각 5분 동안 3회 세척하고, 슬라이드를 완전히 건조시킨 후, 관찰을 위해 커버슬립으로 덮었다.
3.2.4. HER3 의 세포외 도메인 II 영역을 사용한 경쟁 검정
HEK293 MSRII 세포를 HER3 박맘™으로 37℃ 및 5% CO2에서 24 hr 동안 100 moi로 형질도입하였다. 상기 인큐베이션 시간 후에, 세포를 TrypLE를 사용하여 수거하고, 세포를 계수하고, 세포를 PBS를 사용하여 세척하였다. 세포를 PBS 내에 0.5x106개 세포/ml로 재현탁하고, 100 ㎕를 현미경 슬라이드가 부착된 사이토스핀 깔때기에 첨가하였다. 이들을 5분 동안 500 rpm에서 원심분리하여 50,000개 세포를 함유하는 세포 스팟을 생성하였다. 슬라이드를 생물 후드 내에서 밤새 건조시키고, 다음날 실온 아세톤으로 2분 동안 고정시켰다. 2시간 동안 건조시킨 후에, 슬라이드를 사란™ 랩으로 감싸고, 면역염색을 위해 준비할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
이어서, 2개의 슬라이드를 동결기로부터 꺼내고, 실온으로 가온한 후, 공기 건조시켰다. 일단 건조되면, 각각의 세포 스팟을 염색을 위한 소수성 장벽을 형성하도록 팝 펜으로 원으로 표시하였다. 슬라이드를 수화시키기 위해 TBST (트리스 완충 염수 + 0.05% 트윈-20™) 내에 10분 동안 넣고, 단백질 차단 용액에 30분 동안 첨가하였다. 1 ㎍/ml의 1차 항체, 또는 1:1 몰비의 1차 항체 및 인간 HER3 도메인 II를 2시간 동안 실온에서 슬라이드에 직접 적용하였다. 슬라이드를 TBST로 3회 세척하고, HRP-접합된 항-마우스 2차 항체를 1시간 동안 실온에서 직접 적용하였다. 슬라이드를 TBST를 사용하여 각각 5분 동안 3회 세척한 후, DAB 기질을 5분 동안 첨가하였다. 이어서, 슬라이드를 물로 각각 5분 동안 3회 세척하고, 슬라이드를 완전히 건조시킨 후, 관찰을 위해 커버슬립으로 덮었다.
3.2.5. HER3 세포외 도메인의 웨스턴 블롯
HER3의 4개의 세포외 도메인을 환원제가 존재하는 LDS (리튬 도데실 술페이트) 샘플 완충제와 합하고, 70℃로 10분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후에, 용해물을 4-12% 구배 비스-트리스 겔의 레인 내로 부가하고, 단백질 분리를 위해 전기영동하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스로 옮겨 블로팅하여 블롯을 생성하고, 블롯을 0.1% 트윈-20™을 함유하는 차단 용액과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 희석된 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)와 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 IR-접합된 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 리-코르™ 오디세이™ 영상 분석기 기기를 사용하여 가시화하였다.
3.2.6. 동결된 조직 및 FFPE 조직의 면역조직화학
동일한 절제된 종양으로부터의 인간 유방암 조직 (16943a1d, 16945a1o, 22687a1p, 23110a1k)을 동결된 샘플 및 포르말린-고정되고 파라핀 포매 (FFPE) 샘플로서 보존하였다.
보존된 인간 유방암 조직을 HER3 수용체 발현의 면역조직화학 (IHC) 평가를 위해 절편화하였다. 간단히 설명하면, FFPE 조직을 6 ㎛로 절편화하고, 파라핀을 제거하고, 바리스테인(VARISTAIN)™ 제미니 (Gemini) ES 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 일련의 크실렌 교체 및 알콜 단계를 거침으로써 재수화하였다. 다양한 조건의 비교를 위해 몇몇 항원 회수 (에피토프 회복) 방법을 데클로킹 챔버 (DECLOAKING CHAMBER)™를 사용하여 적용하였다. 트리스-0.05% 트윈-20™ 완충제를 사용한 세척 단계 후에, 조직을 퍼옥시다제 차단과 함께 5 min 동안 인큐베이션한 후, 단백질 차단 용액으로 차단하였다. 1차 항체를 조직 절편에 30-60분 동안 적용하였다. 세척 단계 후에, 2차 항체를 30-60분 동안 적용하였다. 추가의 세척 단계 후에, 특이적 면역반응성은 DAB (디아미노벤지딘)와 함께 5분 동안 인큐베이션한 후에 가시화되었다. 이어서, 조직 절편을 물로 세정하고, 헤마톡실린으로 1분 동안 대조염색하였다. 모노클로날 항체 염색은 다코 (Dako) 자동염색기 시스템을 이용하여 수행하였다.
동결된 조직을 6 마이크로미터로 현미경 슬라이드 상에 절편화하고, 2시간 동안 실온에서 건조시켰다. 이어서, 슬라이드 상의 절편 조직을 2분 동안 실온에서 아세톤으로 고정시키고 건조시켰다. 트리스-0.05% 트윈-20™ 완충제를 사용하여 세척한 후에, 조직을 퍼옥시다제 차단과 함께 5 min 동안 인큐베이션하고, 단백질 차단 용액을 첨가하였다. 염색을 FFPE 조직에 대해 상기 개략한 바와 같이 계속하였다.
3.2.7. 다중-종양 TMA 의 면역조직화학 평가
슬라이드를 표준 매뉴얼 또는 자동 염색 프로토콜을 사용하여 염색하였다. 종양을 절편화하고 파라핀을 제거하였다. 절편을 내인성 퍼옥시다제 및 비-특이적 항체 결합 차단 용액과 함께 인큐베이션하고, 에피토프 회복을 거친 후, 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 사이에 세척 단계를 수행하였다. 비-특이적 결합에 대한 표준 차단 단계를 수행하였다. 표준 항원 회복 기술을 수행하였다. 수동 염색을 위해 결합은 ABC™ HRP 키트 (벡터 래보래토리스, 인크. (Vector Laboratories, Inc.))와 함께 2차 비오티닐화 항체, 또는 엔비젼™ HRP 접합된 중합체 키트 (다코 노쓰 아메리카, 인크. (Dako North America, Inc.)) 및 디아미노벤지딘 기질 반응 생성물을 제조자의 지시에 따라 사용하여 가시화하였다. 자동 염색을 위해 가시화는 옴니맵 (OMNIMAP)™ HRP 중합체 화학 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크. (Ventana Medical Systems, Inc.))를 사용하여 달성하였다. 절편을 표준 헤마톡실린 또는 적절한 경우 메틸 그린 핵 대조염색 기술을 이용하여 대조염색하였다.
3.3. 약물 및 물질
HER1 박맘™ 비론스 (virons)
인간 HER2 박맘™ 비론스
인간 HER3 박맘™ 비론스
인간 HER4 박맘™ 비론스
LDS 샘플 완충제 (인비트로겐 NP0007)
퀴아쉬레더™ (퀴아겐 (Qiagen) 79656)
미니-홀트(MINI-HALT)™ 프로테아제 억제제 (로슈 다이아그노스틱스 (Roche diagnostics) 13535400)
웨스턴 블록 완충제 (록랜드 (Rockland) MB-070)
니트로셀룰로스 막 (인비트로겐 LC2000)
토끼 항-인간 ErbB2 (인간 HER2) (다코 A0485)
마우스 항-인간 EGFR (인간 HER1) 다코 M3563 클론 H11
염소 항-마우스 IR-DYE800™ 항체 (록랜드 610-131-121)
염소 항-토끼 IR-DYE680™ 항체 (리-코르 오디세이 827-88367)
항-인간 HER3 모노클로날 항체 (R&D 시스템 MAB3482)
트리스-완충 염수 (다코 #S1968)
엔비젼™ 시스템-HRP DAB 키트 (다코 #K4007)
뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) (3.19 mg/ml)
인간 HER3 도메인 II (경쟁을 위해 사용) (1.66 mg/ml)
단백질 차단 용액 (다코 X0909 로트 10037797)
써모 샨돈 이제트 더블 사이토푸넬(THERMO SHANDON EZ DOUBLE CYTOFUNNEL)™ (#A78710005)
VWR 수퍼프로스트 플러스(SUPERFROST PLUS)™ #48311-703
트리플(TRYPLE)™ 셀렉트 (Select) (깁코 (Gibco) 12563-011)
RIPA 완충제 (시그마 R0278)
다중-종양 인간 조직 마이크로 어레이 (TMA) Hu80357 (CAMB12-GSK-TMA-오리겐 (Origene))
4. 결과
4.1.1.
4개의 HER 패밀리 구성원을 발현한 세포 용해물에 대한 웨스턴 블로팅은 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)가 인간 HER1, 인간 HER2 및 인간 HER4에 대한 교차-반응성을 거의 내지 전혀 갖지 않으면서 인간 HER3을 선택적으로 인식함을 보여주었다. HER2 및 HER1 발현을 확인하고, 비교를 위해, HER2 (다코) 및 HER1 (다코)에 대한 시판 항체를 또한 이들 용해물 상에서 시험하였다. 결과는 인간 HER2 및 인간 HER1이 HEK293 세포를 사용하여 수행된 형질도입을 통해 발현되었음을 확인하였다. 결과는 또한 항-HER2 항체 (다코)와의 일부 교차-반응성을 보여주었다.
4.1.2.
인간 HER3 형질도입된 HEK293 세포 및 CHL-1 세포를 사용하는 면역침전 실험은 높은 및 낮은 HER3-발현 세포주를 검사하기 위한 기회를 제공하였다. 이들 실험은 면역침전물 내에 인간 HER3의 검출을 위한 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 또는 시판 항-HER3 항체 (R&D 시스템즈)를 사용하는 면역반응성의 유사한 밴딩 (banding) 패턴을 보여주었다.
4.1.3.
뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)를 사용하는 인간 HER1, 인간 HER2, 인간 HER3 및 인간 HER4 박맘™ 형질도입된 세포의 면역세포화학 분석은 다른 HER 패밀리 구성원에 대한 면역반응성을 거의 내지 전혀 갖지 않으면서 인간 HER3에 대한 강한 면역반응성을 보였다. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 인간 HER3에 우선적으로 결합한다.
4.1.4.
등몰 농도의 인간 HER3 도메인 II ECD와 조합으로 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 또는 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)를 사용하는 경쟁 검정은, 인간 HER3의 도메인 II와 함께 예비-인큐베이션함에 의해 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 면역반응성이 완전히 차단되었음을 보여주었다. 이들 결과는 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)가 인간 HER3 수용체의 세포외 도메인 II 영역에 특이적으로 결합한다는 것을 확인한다.
4.1.5.
HER3 세포외 도메인의 웨스턴 블롯 분석은 인간 HER3의 도메인 II에 대한 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 특이성 및 인간 HER3의 도메인 I, III, 및 IV에 대한 상기 항체의 면역반응성의 결여를 입증하였다.
4.1.6.
동결된 및 FFPE 매칭된 암성 유방 조직 (n=4)의 면역조직화학 염색은 일치한 염색 패턴을 보여주었다. FFPE 조직의 구조적 통합성은 동결된 샘플보다 더 잘 보존되지만, 막성 염색 패턴은 이들 2가지 보존 방법에 가로질러 유사하였다. 도 6은 이들 동결되고 고정된 유방 조직을 가로질러 보이는 막성 염색의 하나의 대표적인 사진을 보여준다 .
4.1.7.
종양 및 대표적인 정상 조직을 함유하는 다중-종양 어레이 (Hu80357)를 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)를 사용하는 HER3 발현에 대해 평가하였다. 지시된 결장, 전립선, 유방, 자궁내막, 뇌 및 피부 종양 중심의 정성적 평가는 모두 인간 HER3 발현을 보였다. 1개의 신장 종양 샘플 및 1개의 폐암 샘플은 인간 HER3 발현을 보였다. 인간 HER3의 가장 강력한 발현은 흑색종 및 전립선 종양 샘플에서 보였다. 7개의 흑색종 및 7개의 전립선 종양 샘플은 강력한 인간 HER3 발현을 나타냈다. 8개의 유방암 샘플은 또한 인간 HER3 발현을 보였다. 정상 조직 샘플은 종양 샘플에 비해 상당히 더 적은 신호를 보이지만, 3개의 정상 결장 샘플 및 1개의 정상 유방 샘플은 중간정도의 신호를 보였다.
5. 논의 및 요약
본 보고서에 설명된 실험은 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 감수성 및 특이성을 입증한다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 초기에 예비 ELISA 스크린에 기반한 HER3의 세포외 영역에 대한 그의 특이성에 대해 하이브리도마의 패널로부터 선택하였다. HER3에 대한 추가의 특이성은 박맘™ 형질도입된 세포를 사용하는 웨스턴 블로팅 및 면역세포화학에 의해 실시하였다. 본 실험에서, 인간 HER3 형질도입된 세포는 특이적 면역반응성을 보인 반면, 다른 인간 HER 패밀리 구성원을 발현하는 세포는 반응성을 거의 또는 전혀 보이지 않았다. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)를 또한 HER3의 특이적 "끌어내림 (pulldown)"을 보여주는, 시판 항체와 조합한 면역침전 검정에서 사용하였다. 추가로, 면역세포화학은 인간 HER3 형질도입된 세포의 사이토스핀 제제 및 이들 세포의 동결된 제제에 대해 수행하였고, 이것은 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)가 검정 전체에서 HER3을 인식하고 면역세포화학 검정에서 HER3에 결합할 수 있음을 확인하였다. 인간 HER3 수용체에 대한 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 결합은 항체를 인간 HER3의 세포외 도메인 II 영역과 함께 예비-인큐베이션함으로써 차단될 수 있고, 이것은 HER3의 상기 영역에 대한 그의 특이성을 확인한다.
포르말린 고정되고 파라핀으로 처리한 유사한 바큘로바이러스 형질도입된 세포 상에서 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)에 대한 추가의 면역조직화학 프로토콜이 개발되었고, 이것을 세포 제제에 무관하게 IHC를 통해 HER3을 검출하는 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 능력을 추가로 입증한다. 본 실시예에 기재된 실험은 유방 선암종의 동결된 및 FFPE 샘플의 매칭된 쌍에서 인간 HER3 면역반응성을 입증함으로써 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 거동의 상기 교차 플랫폼 일관성을 엄밀하게 확인한다. 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)에 의해 검출된 인간 HER3 신호의 풍부도 및 상대적인 발현은 두 시료 제제 모두에서 동일하였다. 상이한 종양 종류의 패널 상에서 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)를 이용하는 면역조직화학 표적 검증 연구는 발현에서 차이를 보여주었지만, HER3의 패턴 및 상대적인 풍부도는 특정 종양 종류 (예를 들어, 흑색종, 전립선, 유방) 내에서 일관성을 나타냈다. 추가로, 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 상이한 프로토콜 및 염색 시스템에서 HER3을 검출하는데 성공하였다. 상기 발견은 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)가 프로토콜 및 시료 보존에 무관하게 종양 절편 내에서 면역조직화학에 의해 인간 HER3을 일관적이고 정확하게 검출할 수 있음을 입증한다.
뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 또한 다양한 검정에서 HER3의 세포외 도메인을 특이적으로 검출한다. 본 실시예에서 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)가 변동에도 불구하고 이들 검정에서 일관적으로 작동함이 또한 설명되었다. 특히, 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 면역조직화학을 통해 조직 절편 내에서 인간 HER3을 검출하기 위해 높은 정도의 특이성 및 감수성을 나타냈다. 추가로, 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)는 상이한 검정을 이용하여 동일한 샘플 내에서 동등한 수준의 인간 HER3을 검출할 수 있었다 (뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10) 신호 및 존재하는 인간 HER3의 양 사이의 정비례를 입증함). 종합하면, 본 실시예에 기재된 결과는 뮤린 15D5 항체 (M5.15D5.2A1.1H10)의 성능, 특이성 및 일관성을 입증하고, 인간 HER3 진단 분석 (예를 들어, IHC 검정)에서 항체 시약으로서 그의 적합성을 지지한다.
실시예 11
비공식적인 서열 목록
아래의 밑줄은 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 부분 내의 CDR 서열, 또는 이들 CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 서열 1에서 프레임워크 및 CDR은 제시된 서열의 아미노 근위 부분으로부터 카르복시 말단 부분으로의 순서로 평문 (plaintext) 프레임워크1, 밑줄친 CDR1, 평문 프레임워크2, 밑줄친 CDR2, 평문 프레임워크3, 밑줄친 CDR3 및 평문 프레임워크4로서 제시된다. 아래의 이탤릭체는 신호 서열을 나타낸다. 단문자 아미노산 코드의 문자 우측의 별표는 좌측의 아미노산 잔기가 잠재적인 N-글리코실화 부위임을 나타낸다. 이러한 방식은 예를 들어 서열 5, 9, 13, 17, 22, 26, 30, 34, 38-43, 44, 48, 57 등에 사용된다. 본원에 개시되는 다양한 항체에 대한 상세한 내용을 제시하는 표가 또한 제공된다. 아래 표 17을 참조한다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
인간화 1 D9 H6 전장 중쇄 아미노산 서열 ( FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비- 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 인간화 1 D9 H6L2 항체의 발현을 위해 사용되고 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 CHOK1SV 세포에서 인간화 1 D9 H6L2 포텔리겐트 ™ 항체의 발현을 위해 사용됨)
서열 100
Figure pct00039
인간화 1 D9 H6 전장 중쇄 핵산 서열 ( FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비-포텔리겐트™ 시스템 세포에서 인간화 1 D9 H6L2 항체의 발현을 위해 사용되고 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 CHOK1SV 세포에서 인간화 1 D9 H6L2 포텔리겐트 ™ 항체의 발현을 위해 사용됨). MGWSCIILFLVATATGVHS 신호 서열을 코딩하는 부분은 생략될 수 있다.
서열 101
Figure pct00040
인간화 1 D9 H6 컴플리젠트 ™ ( FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비- 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 인간화 1 D9 H6L2 컴플리젠트 ™ 항체의 발현을 위해 사용될 때) 또는 아크레타맙™ ( FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 CHOK1SV 세포에서 인간화 1 D9 H6L2 아크레타맙 ™ 항체의 발현을 위해 사용될 때) IgG1/IgG3 이소형 키메라 전장 중쇄 아미노산 서열
서열 102
Figure pct00041
인간화 1 D9 H6 컴플리젠트 ™ ( FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비- 포텔리 겐트™ 시스템 세포에서 인간화 1 D9 H6L2 컴플리젠트 ™ 항체의 발현을 위해 사용될 때) 또는 아크레타맙 ™ ( FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 CHOK1SV 세포에서 발현될 때 인간화 1 D9 H6L2 아크레타맙 ™ 항체의 발현을 위해 사용될 때) IgG1 / IgG3 이소형 키메라 전장 중쇄 핵산 서열. MGWSCIILFLVATATGVHS 신호 서열을 코딩하는 부분이 생략될 수 있다.
서열 103
Figure pct00042
인간화 1 D9 L2 전장 경쇄 아미노산 서열 (인간화 1 D9 H6L2 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비- 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 서열 100과 동시 발현을 위해 사용되고, 인간화 1 D9 H6L2 포텔리겐트 ™ 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 CHOK1SV 세포에서 서열 100과 동시 발현을 위해 사용되고, 인간화 1 D9 H6L2 컴플리젠트 ™ 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비- 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 서열 102와 동시 발현을 위해 사용되고, 인간화 1 D9 H6L2 아크레타맙 ™ 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 서열 102와 동시 발현을 위해 사용됨).
서열 104
Figure pct00043
인간화 1 D9 L2 전장 경쇄 핵산 서열 (인간화 1 D9 H6L2 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비- 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 서열 100과 동시 발현을 위해 사용되고, 인간화 1 D9 H6L2 포텔리겐트 ™ 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 CHOK1SV 세포에서 서열 100과 동시 발현을 위해 사용되고, 인간화 1 D9 H6L2 컴플리젠트 ™ 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피를 갖는 비- 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 서열 102와 동시 발현을 위해 사용되고, 인간화 1 D9 H6L2 아크레타맙 ™ 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 포텔리겐트 ™ 시스템 세포에서 서열 102와 동시 발현을 위해 사용됨). MGWSCIILFLVATATGVHS 신호 서열을 코딩하는 부분은 생략될 수 있다.
서열 105
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
본 발명은 이제 충분히 설명되었으므로, 첨부된 청구항의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 그에 대해 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백해질 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CLARK, Neil James HASKOVA, Zdenka HOPSON, Christopher B. LEE, jUDITHANN m. JOHANSON, Kyung Oh JONAK, Zdenka Ludmila TAYLOR, Alexander H. TRULLI, Stephen H. WHITE, John R. XUE, Yu <120> NOVEL ANTIGEN BINDING PROTEINS <130> PU64334 <150> 61/379,840 <151> 2010-09-03 <150> 61/440,460 <151> 2011-02-08 <160> 105 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Val Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ile Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Thr Thr Ile Val Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Phe Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Thr Ser Gly Ser Ser Glu Ile Tyr Tyr Val Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Cys 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Asp Tyr Gly Met His 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Tyr Ile Thr Ser Gly Ser Ser Glu Ile Tyr Tyr Val Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gly Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr 1 5 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Val Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 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Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr 85 90 95 Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp 100 105 110 Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser 115 120 125 His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser 130 135 140 Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr 145 150 155 160 Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val 165 170 175 Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly 180 185 190 Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr 195 200 205 Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn 210 215 220 Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp 225 230 235 240 Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val 245 250 255 Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu 260 265 270 Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala 275 280 285 Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala 290 295 300 Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys 305 310 315 320 Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser 325 330 335 Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val 340 345 350 Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu 355 360 365 Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu 370 375 380 Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln 385 390 395 400 Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr 405 410 415 Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile 420 425 430 Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu 435 440 445 Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr 450 455 460 His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu 465 470 475 480 Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu 485 490 495 Gly Lys Val 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Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe 705 710 715 720 Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys 725 730 735 Ile Pro Val Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser 740 745 750 Phe Gln Ala Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His 755 760 765 Ala His Ile Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln 770 775 780 Leu Val Thr Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg 785 790 795 800 Gln His Arg Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val 805 810 815 Gln Ile Ala Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His 820 825 830 Arg Asn Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val 835 840 845 Gln Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys 850 855 860 Gln Leu Leu Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu 865 870 875 880 Glu Ser Ile His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser 885 890 895 Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr 900 905 910 Ala Gly Leu Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu 915 920 925 Arg Leu Ala Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met 930 935 940 Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu 945 950 955 960 Leu Ala Asn Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu 965 970 975 Val Ile Lys Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro 980 985 990 His Gly Leu Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu 995 1000 1005 Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr 1010 1015 1020 Thr Thr Leu Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg 1025 1030 1035 1040 Pro Arg Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro 1045 1050 1055 Met Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser 1060 1065 1070 Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met Pro 1075 1080 1085 Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu Gly His Val Thr Gly Ser 1090 1095 1100 Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val Ser Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg 1105 1110 1115 1120 Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly Asp Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg 1125 1130 1135 His Ser Leu Leu Thr Pro Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Leu Glu 1140 1145 1150 Glu Glu Asp Val Asn Gly Tyr Val Met Pro Asp Thr His Leu Lys Gly 1155 1160 1165 Thr Pro Ser Ser Arg Glu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser 1170 1175 1180 Val Leu Gly Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met 1185 1190 1195 1200 Asn Arg Arg Arg Arg His Ser Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser 1205 1210 1215 Leu Glu Glu Leu Gly Tyr Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser 1220 1225 1230 Ala Ser Leu Gly Ser Thr Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile 1235 1240 1245 Met Pro Thr Ala Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met Asn 1250 1255 1260 Arg Gln Arg Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly 1265 1270 1275 1280 Ala Cys Pro Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln 1285 1290 1295 Gly Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr Ala Arg Leu Lys Thr 1300 1305 1310 Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp Tyr 1315 1320 1325 Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr 1330 1335 1340 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ile Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 23 Asp Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 24 Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 25 Met Thr Thr Ile Val Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 27 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 28 Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 29 Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 31 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 32 Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 33 Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr 1 5 <210> 34 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 35 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln 1 5 10 15 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 36 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 37 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 38 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 gagttccagc tgcagcagag cggccccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatc 60 agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc gactacaaca tgaactgggt gaagcagaac 120 aacggcaaga gcctggagtg gatcggcggc atcaacccca actacggcac caccgtgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggacc agagcagcag caccgcctac 240 atgcagctgg tgagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc caggatgacc 300 accatcgtgc ccttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgag cagc 354 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 39 gacatccaga tgacccagac caccttcagc ctgagcgcca gcctgggcga cagggtgacc 60 atcagctgca gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 gacggcaccg tgaagctgct gatctactac accagcaccc tgcacagcgg cgtgcccagc 180 aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac tacttcctga ccatcaggaa cctggaggag 240 gaggacatcg ccacctactt ctgccagcag ggctacaccc tgccctggac cttcggcggc 300 ggcaccaagc tggacatcaa g 321 <210> 40 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequene designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 40 caggtccagc tcgtgcagtc tggggccgag gtgaagaaac ccggcgctag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcaacccca actacggcac caccgtgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggtgaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcaggctgag gagcgacgat accgccgtgt actattgcgc caggatgacc 300 accatcgtgc ccttcgacta ctggggacag ggcaccactg tgacagtgtc aagccgu 357 <210> 41 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequene designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 41 gacatccaga tgacccagtc acccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgca gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctccaccc tgcacagcgg cgtgccctct 180 aggttctccg gcagcggcag cggcaccgac tacaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacatcg ccacctacta ttgccagcag ggctacaccc tcccctggac tttcggaggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 42 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequene designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 42 caggtgcagc tggtgcagtc cggcgcagag gtgaagaagc ccggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggccagg gcctggagtg gatgggcgtg atcgacccca gcgacgggta cagccactac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggtcaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactca gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actattgcgc cggaggcctg 300 gctggcaccc tggattactg gggccagggc accacagtga ccgtgagcag c 351 <210> 43 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequene designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 43 gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 ttccagcaga aacccggcaa ggctcccaag ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc cctctcgctt ctcaggcagc ggctccggca ccgatttcac cctgaccatc 240 agctcactgc agcccgagga cttcgccgtc tactactgct tccagggaag ccacgtgccc 300 tggacttttg gccagggcac caagctcgag atcaagagg 339 <210> 44 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr 1 5 <210> 48 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln 1 5 10 15 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 52 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 caggtgcagc tgcagcagcc cggcgccgag ctggtgaggc ccggcaccag cgtgaagctg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cccggccagg gcctggagtg gatcggcgtg atcgacccca gcgacggcta cagccactac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggaca ccagcagcag caccgcctac 240 atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cggcggcctg 300 gccggcaccc tggactactg gggccagggc accaccctga ccgtgagcag c 351 <210> 53 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 53 gacgtgctga tgacccagac ccccctgagc ctgcccgtga gcctgggcga ccaggccagc 60 atcagctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 ttcctgcaga agcccggcca gagccccaag ctgctgatca gcaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaggatc 240 agcagggtgg aggccgagga cctgggcctg tactactgct tccagggcag ccacgtgccc 300 tggaccttcg gcggcggcac caagctggag atcaag 336 <210> 54 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggcag cctgaagctg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gactacggca tgcactggct gaggcaggcc 120 cccgagaagg gcctggagtg ggtggcctac atcaccagcg gcagcagcga gatctactac 180 gtggacaccg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtgc 240 ctgcagatga ccagcctgag gagcgaggac accgccatgt accactgcgc caggggctac 300 ggctacaggg agggctactt cgacgtgtgg ggcaccggca ccaccgtgac cgtgagcagc 360 <210> 55 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 55 gacgtggtga tgacccagac ccccctgacc ctgagcgtga ccatcggcca gcccgccagc 60 atcagctgca agagcagcca gagcctgctg gacagcgacg gcaagaccta cctgaactgg 120 ctgctgcaga ggcccggcca gagccccaag aggctgatct acctggtgag caagctggac 180 agcggcgtgc ccgacaggtt caccggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactactgct ggcagggcac ccacttcccc 300 cagaccttcg gcggcggcac caagctggag atcaag 336 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 56 gacatccaga tgacccagag ccccgccagc ctgagcgtga gcgtgggcga gaccgtgacc 60 atcacctgca ggaccagcga gaacgtgtac agcaacctgg cctggtacca gcagaagcag 120 ggcaggagcc cccagctgct ggtgtacggc gccaccaggc tgcccgacgg cgtgcccgcc 180 aggttcagcg gcagcggcag cggcacccag tacagcctga agatcaacag cctgcagagc 240 gaggacttcg gcacctacta ctgccagctg ttctggggca tccccctgac cttcggcgcc 300 ggcaccaagc tggagctgaa g 321 <210> 57 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Arg <210> 58 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 58 gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 ttccagcaga aacccggcaa ggctcccaag ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc cctctcgctt ctcaggcagc ggctccggca ccgatttcac cctgaccatc 240 agctcactgc agcccgagga cttcgccgtc tactactgct tccagggaag ccacgtgccc 300 tggacttttg gccagggcac caagctcgag atcaagaggc gt 342 <210> 59 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 59 gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cctctggtta ctcatttact gactacaata tgaactgggt gaaacagaac 120 aatggaaaga gccttgagtg gattggagga attaatccta actatggtac tactgtttac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagacc aatcttccag cacagcctac 240 atgcagctcg ttagtctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagaatgacc 300 acgatagttc cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 60 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 60 gatatccaga tgacacagac tacattctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaacat tacactcagg agtcccatca 180 agattcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattttctca ccattaggaa cctggaggaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagt tggacatcaa a 321 <210> 61 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 61 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cctctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt aaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagtg attgatcctt ctgatggtta tagtcactac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccactttg actgtagaca catcctccag tacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aggaggctta 300 gctgggacgc ttgactactg gggccagggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 62 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 62 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagttctg gaaacaccta tttacaatgg 120 ttcctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ccaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaggatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggactt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagttggaa atcaaa 336 <210> 63 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 63 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ccggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatggaa tgcactggct tcgtcaggct 120 ccagagaagg ggctggagtg ggttgcatac attactagtg gcagtagtga aatctactat 180 gtagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtgc 240 ctgcaaatga ccagtctgag gtctgaggac acggccatgt atcactgtgc aaggggctac 300 ggttatagag aggggtactt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 64 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 64 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300 cagacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 65 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 65 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gaacaagtga gaatgtttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaagatctc ctcagctcct ggtctatggt gcaacaaggt taccagatgg tgtgccagca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240 gaagattttg ggacttatta ctgtcaactt ttttggggta tcccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 66 <211> 624 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 66 Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly 1 5 10 15 Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu 35 40 45 Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val 50 55 60 Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe 85 90 95 Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu 100 105 110 Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val 115 120 125 Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp 130 135 140 Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn 145 150 155 160 Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp 165 170 175 Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala 180 185 190 Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys 195 200 205 His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys 210 215 220 Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys 225 230 235 240 Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn 245 250 255 Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro 260 265 270 His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro 275 280 285 Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys 290 295 300 Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg 305 310 315 320 Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr 325 330 335 Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp 340 345 350 Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe 355 360 365 Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro 370 375 380 Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly 385 390 395 400 Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn 405 410 415 Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala 420 425 430 Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser 435 440 445 Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp 450 455 460 Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val 465 470 475 480 Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly 485 490 495 Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr 500 505 510 His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala 515 520 525 Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala 530 535 540 Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe 545 550 555 560 Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly 565 570 575 Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg 580 585 590 Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln 595 600 605 Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr His Leu Thr 610 615 620 <210> 67 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 68 caggtgcagc tggtgcagtc cggcgcagag gtgaagaagc ccggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggccagg gcctggagtg gatgggcgtg atcgacccca gcgacgggta cagccactac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtcaccatg accagggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactca gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actattgcgc caggggcctg 300 gctggcaccc tggattactg gggccagggc accacagtga ccgtgagcag c 351 <210> 69 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 70 caggtgcagc tggtgcagtc cggcgcagag gtgaagaagc ccggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggccagg gcctggagtg gatgggcgtg atcgacccca gcgacgggta cagccactac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtcaccatg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactca gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actattgcgc caggggcctg 300 gctggcaccc tggattactg gggccagggc accacagtga ccgtgagcag c 351 <210> 71 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 72 caggtgcagc tggtgcagtc cggcgcagag gtgaagaagc ccggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggccagg gcctggagtg gatgggcgtg atcgacccca gcgacgggta cagccactac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtcaccatg accagggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactca gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actattgcgc cggaggcctg 300 gctggcaccc tggattactg gggccagggc accacagtga ccgtgagcag c 351 <210> 73 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 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351 <210> 75 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 75 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 76 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 76 gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 taccagcaga aacccggcaa ggctcccaag ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc cctctcgctt ctcaggcagc ggctccggca ccgatttcac cctgaccatc 240 agctcactgc agcccgagga cttcgccgtc tactactgct tccagggaag ccacgtgccc 300 tggacttttg gccagggcac caagctcgag atcaagagg 339 <210> 77 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 77 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 78 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 78 gacgtgcaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 taccagcaga aacccggcaa ggctcccaag ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc cctctcgctt ctcaggcagc ggctccggca ccgatttcac cctgaccatc 240 agctcactgc agcccgagga cttcgccgtc tactactgct tccagggaag ccacgtgccc 300 tggacttttg gccagggcac caagctcgag atcaagagg 339 <210> 79 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 79 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 80 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 80 gacatcctga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 taccagcaga aacccggcaa ggctcccaag ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc cctctcgctt ctcaggcagc ggctccggca ccgatttcac cctgaccatc 240 agctcactgc agcccgagga cttcgccgtc tactactgct tccagggaag ccacgtgccc 300 tggacttttg gccagggcac caagctcgag atcaagagg 339 <210> 81 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 81 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 82 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 82 gacgtgctga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 ttccagcaga aacccggcaa ggctcccaag ctgctgatca gcaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc cctctcgctt ctcaggcagc ggctccggca ccgatttcac cctgaccatc 240 agctcactgc agcccgagga cttcgccgtc tactactgct tccagggaag ccacgtgccc 300 tggacttttg gccagggcac caagctcgag atcaagagg 339 <210> 83 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 83 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 84 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 84 gacgtggtga tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga ccctgggcca gcccgccagc 60 attagctgca ggagcagcca gtccatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 ttccagcaga ggcccggcca gagccccagg aggctgatct acaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc ccgacagatt cagcggctca ggcagcggca ccgacttcac cctcaagatc 240 agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtc tactactgct tccaggggag ccacgtgccc 300 tggacctttg gacagggcac caagctggag atcaagagg 339 <210> 85 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 85 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 86 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 86 gacgtggtga tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga ccctgggcca gcccgccagc 60 attagctgca ggagcagcca gtccatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 ttccagcaga ggcccggcca gagccccagg aggctgatca gcaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc ccgacagatt cagcggctca ggcagcggca ccgacttcac cctcaagatc 240 agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtc tactactgct tccaggggag ccacgtgccc 300 tggacctttg gacagggcac caagctcgag atcaagagg 339 <210> 87 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 87 Asp Val Val 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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 89 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 89 gacgtggtga tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga ccctgggcca gcccgccagc 60 attagctgca ggagcagcca gtccatcgtg cacagcagcg gcaacaccta cctgcagtgg 120 ttccagcaga ggcccggcca gagccccaag ctgctgatca gcaaggtgag caacaggttc 180 agcggcgtgc ccgacagatt cagcggctca ggcagcggca ccgacttcac cctcaagatc 240 agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtc tactactgct tccaggggag ccacgtgccc 300 tggacctttg gacagggcac caagctcgag atcaagagg 339 <210> 90 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 90 Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ile Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 91 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 91 cagttccagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggagccag cgtcaaagtg 60 agctgcaagg cctccggcta cagcttcacc gactacaaca tgaactgggt gaagcaggcc 120 cccgggcagg gcctggagtg gatcggcggc atcaatccca actacggcac caccgtgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggacc agagcatcag caccgcctac 240 atggaactca gcaggctgag gagcgacgat accgccgtgt actactgcgc taggatgacc 300 accatcgtgc ccttcgacta ttggggccag ggcacaaccg tgactgtgag cagc 354 <210> 92 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 92 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ile Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 93 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 93 caggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgaaaaagc ccggcgctag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tgaactgggt gaagcaggca 120 cccggccagg gcctggagtg gatcggcggc atcaacccca actacggcac taccgtctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggatc agagcatcag caccgcctac 240 atggaactgt ctaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actattgcgc caggatgacc 300 accatcgtgc ccttcgacta ctggggccag ggaaccacag tcaccgtgag cagc 354 <210> 94 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 94 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Thr Thr Ile Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 95 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 95 caggtgcagc tggtccagag cggagccgag gtgaaaaagc ccggcgcaag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gcctcgagtg gatgggaggc atcaacccca actacggcac caccgtgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggacc agagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt actattgcgc caggatgacc 300 accatcgtgc ccttcgacta ctggggccag ggcacaaccg tgaccgtgtc tagc 354 <210> 96 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 96 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 97 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 97 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcct cagtgggcga tagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 gggaaggccc ccaagctgct gatctactac acctccaccc tgcacagcgg cgtgccctca 180 aggttctccg gcagcggcag cggcaccgac tacactctga ccatcagcag cctccagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctataccc tgccctggac cttcggccag 300 ggcaccaagc tggagattaa gagg 324 <210> 98 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 98 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 99 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 99 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60 attacctgca gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctccactc tgcacagcgg cgtgccctct 180 aggttctccg gctcaggcag cggaaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctccagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctataccc tgccttggac cttcggccag 300 ggcaccaaac tggagatcaa gagg 324 <210> 100 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 100 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu 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Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 101 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 101 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggtgt gcacagccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgcagaggtg aagaagcccg gagcctctgt gaaggtgagc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgag gcaggcccct 180 ggccagggcc tggagtggat gggcgtgatc gaccccagcg acgggtacag ccactacaac 240 cagaagttca agggcaaggt caccctgacc gtggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300 gaactcagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact attgcgccgg aggcctggct 360 ggcaccctgg attactgggg ccagggcacc acagtgaccg tgagcagcgc cagcaccaag 420 ggccccagcg tgttccccct ggcgcccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgcc 480 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagccagtga ccgtgtcctg gaacagcgga 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttccca gctgtcctgc agagcagcgg cctgtacagc 600 ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca cccagaccta catctgtaac 660 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgtgac 720 aagacccaca cctgcccccc ctgccctgcc cccgagctgc tgggaggccc cagcgtgttc 780 ctgttccccc ccaagcctaa ggacaccctg atgatcagca gaacccccga ggtgacctgt 840 gtggtggtgg atgtgagcca cgaggaccct gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagccc agggaggagc agtacaacag cacctaccgg 960 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaagga gtacaagtgt 1020 aaggtgtcca acaaggccct gcctgcccct atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc 1080 cagcccagag agccccaggt gtacaccctg ccccctagca gagatgagct gaccaagaac 1140 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgat 1260 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac 1320 gtgttcagct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca gaagagcctg 1380 agcctgtccc ctggcaag 1398 <210> 102 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 102 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser His Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Leu Ala Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 103 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 103 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggtgt gcacagccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgcagaggtg aagaagcccg gagcctctgt gaaggtgagc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgag gcaggcccct 180 ggccagggcc tggagtggat gggcgtgatc gaccccagcg acgggtacag ccactacaac 240 cagaagttca agggcaaggt caccctgacc gtggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300 gaactcagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact attgcgccgg aggcctggct 360 ggcaccctgg attactgggg ccagggcacc acagtgaccg tgagcagcgc cagcaccaag 420 ggcccaagcg tgtttcccct ggcccccagc agcaagtcta ccagcggcgg cacagccgcc 480 ctgggctgcc tggtcaaaga ctacttcccc gagcccgtca ccgtgagctg gaatagcggc 540 gcactgacca gcggcgtgca cacctttccc gccgtgctgc agagctcagg cctgtatagc 600 ctgagcagcg tggtgaccgt gccttctagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtcaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag tggagcccaa gagctgcgac 720 aagacccaca cctgcccccc ctgtccagct ccggagctgc tgggcggccc cagcgtgttc 780 ctcttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatctcta gaacccccga ggtgacctgc 840 gtggtggtgg acgtcagcca cgaagacccc gaggtgcagt tcaagtggta cgtggacggg 900 gtggaggtgc acaacgccaa gactaagccc agggaggagc agttcaactc caccttcagg 960 gtggtgagcg tcctgaccgt gctgcatcag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtgagca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatcagcaa aaccaagggc 1080 cagcctaggg aaccccaggt gtacaccctg cccccctcca gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtgagcc tcacctgcct ggtgaagggc ttctacccca gcgacattgc cgtggagtgg 1200 gagtcaagcg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccatgct cgatagcgac 1260 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gccggtggca gcagggcaac 1320 atcttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1380 agcctgagcc ccggaaag 1398 <210> 104 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody amino acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 104 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 105 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody nucleic acid sequence designed in silico and made using molecular biology synthetic techniques. <400> 105 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgac 60 atccagatga cccagagccc ctctagcctg agcgccagcg tgggcgacag ggtgaccatt 120 acctgcagga gcagccagag catcgtgcac agcagcggca acacctacct gcagtggttc 180 cagcagaaac ccggcaaggc tcccaagctg ctgatctaca aggtgagcaa caggttcagc 240 ggcgtgccct ctcgcttctc aggcagcggc tccggcaccg atttcaccct gaccatcagc 300 tcactgcagc ccgaggactt cgccgtctac tactgcttcc agggaagcca cgtgccctgg 360 acttttggcc agggcaccaa gctcgagatc aagcgtacgg tggccgcccc cagcgtgttc 420 atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 480 aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 540 ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 600 agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 660 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 714

Claims (137)

  1. 서열 2, 서열 3, 및 서열 4로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 6, 서열 7, 및 서열 8로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항원 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 서열 2에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 3에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 4에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 6에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 7에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 8에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질
  4. 제3항에 있어서, 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질.
  5. 서열 23, 서열 24, 및 서열 25로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 27, 서열 28, 및 서열 29로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항원 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 서열 23에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 24에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 25에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 27에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 28에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 29에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질.
  9. 서열 45, 서열 46, 및 서열 47로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 49, 서열 50, 및 서열 51로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항원 결합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 서열 45에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 46에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 47에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 49에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 50에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 51에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질.
  13. 서열 31, 서열 32, 및 서열 33으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 35, 서열 36, 및 서열 37로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항원 결합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 서열 31에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 32에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 33에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 35에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 36에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 37에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질
  16. 제15항에 있어서, 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질.
  17. 서열 10, 서열 11, 및 서열 12로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 12, 서열 7, 서열 8, 서열 18, 서열 19, 및 서열 20으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항원 결합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 서열 10에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 11에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 12에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 12에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 7에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 8에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 또는 서열 18에 제시된 CDR 아미노산 서열, 서열 19에 제시된 CDR 아미노산 서열, 및 서열 20에 제시된 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 이량체의 형성을 억제하는 항원 결합 단백질.
  21. 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  22. 서열 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  23. 서열 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  24. 서열 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  25. 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 13에 제시된 아미노산 서열 및 서열 17에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  26. 서열 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 57에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  27. 제1항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  28. 제27항에 있어서, 서열 38에 제시된 핵산 서열 및 서열 39에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  29. 제27항에 있어서, 서열 59에 제시된 핵산 서열 및 서열 60에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  30. 제5항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  31. 제30항에 있어서, 서열 40에 제시된 핵산 서열 및 서열 41에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  32. 제9항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  33. 제32항에 있어서, 서열 52에 제시된 핵산 서열 및 서열 53에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  34. 제32항에 있어서, 서열 61에 제시된 핵산 서열 및 서열 62에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  35. 제13항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  36. 제35항에 있어서, 서열 42에 제시된 핵산 서열 및 서열 43에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  37. 제26항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  38. 제37항에 있어서, 서열 42에 제시된 핵산 서열 및 서열 58에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  39. 제17항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  40. 제39항에 있어서, 서열 54에 제시된 핵산 서열, 서열 55에 제시된 핵산 서열 및 서열 56에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  41. 제39항에 있어서, 서열 63에 제시된 핵산 서열, 서열 64에 제시된 핵산 서열 및 서열 65에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  42. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  43. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  44. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  45. 제1항, 제5항, 제9항, 제13항, 제17항, 및 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  46. 치료 유효량의 제1항, 제5항, 제9항, 제13항, 제17항, 및 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 암의 치료 방법.
  47. a) 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 암을 가진 대상체를 확인하는 단계; 및
    b) 치료 유효량의 제22항에 따른 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 암의 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서, c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  50. a) 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 암을 가진 대상체를 확인하는 단계; 및
    b) 치료 유효량의 제24항의 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 암의 치료 방법.
  51. 제50항에 있어서, c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  53. 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제1항, 제5항, 제9항, 제13항, 제17항, 및 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 물질의 용도.
  54. 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질.
  55. 제54항에 있어서, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항원 결합 단백질.
  56. 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 펩티드 사슬 도메인에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질.
  57. 제56항에 있어서, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항원 결합 단백질.
  58. a) 제29항, 제35항 및 제38항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 불활성화된 것인 단계; 및
    b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  59. 제58항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 CHOK1SV 세포인 방법.
  60. 제58항에 따른 방법에 의해 생산된 항원 결합 단백질.
  61. a) 제29항, 제35항 및 제38항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 코딩하는 Fc 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및
    b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  62. 제61항에 있어서, Fc 핵산 서열이 서열 40에 제시된 핵산 서열 및 서열 42에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 인 프레임으로 융합되는 것인 방법.
  63. 제62항에 따른 방법에 의해 생산된 항원 결합 단백질.
  64. a) 제29항, 제35항 및 제38항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 함유하는 발현 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 코딩하는 Fc 핵산 서열을 추가로 포함하고, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 불활성화된 것인 단계; 및
    b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  65. 제64항에 있어서, Fc 핵산 서열이 서열 40에 제시된 핵산 서열 및 서열 42에 제시된 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 인 프레임으로 융합되는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 CHOK1SV 세포인 방법.
  67. 제64항에 따른 방법에 의해 생산된 항원 결합 단백질.
  68. 치료 유효량의 제1항, 제5항, 제9항, 제13항, 제17항, 및 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 전암 상태가 치료되는 것인, 대상체에서 전암 상태의 치료 방법.
  69. a) 전암 상태가 존재하는 대상체를 확인하는 단계; 및
    b) 치료 유효량의 제22항의 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 전암 상태가 치료되는 것인, 대상체에서 전암 상태의 치료 방법.
  70. 제69항에 있어서, c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 184 내지 329를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 제69항에 있어서, 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  72. a) 전암 상태가 존재하는 대상체를 확인하는 단계; 및
    b) 치료 유효량의 제24항의 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 전암 상태의 치료 방법.
  73. 제72항에 있어서, c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  75. HER3 수용체에 특이적으로 결합하고 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  76. HER3 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  77. HER3 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 27에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  78. HER3 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 35에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 37에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  79. HER3 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 45에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 46에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 49에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 50에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  80. HER3 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  81. HER3 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항원 결합 단백질.
  82. 제45항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 제약 조성물.
  83. 제45항에 있어서, 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  84. 치료 유효량의 제1항, 제5항, 제9항, 제13항, 제17항, 및 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암의 치료 방법.
  85. 제84항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  87. 서열 100에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 갖는 중쇄 서열 및 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 갖는 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  88. 제87항에 있어서, 푸코실화 글리칸을 포함하는 항원 결합 단백질.
  89. 제88항에 있어서, 푸코실화 글리칸이 G0, G2, G0F, G2F, G1, Man5, G1F 및 G1F'로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항원 결합 단백질.
  90. 제87항에 있어서, 비-푸코실화 글리칸을 포함하는 항원 결합 단백질.
  91. 제90항에 있어서, 비-푸코실화 글리칸이 G0, G2, G1 및 Man5로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항원 결합 단백질.
  92. 서열 102에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 갖는 중쇄 서열 및 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 갖는 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
  93. 제92항에 있어서, 푸코실화 글리칸을 포함하는 항원 결합 단백질.
  94. 제93항에 있어서, 푸코실화 글리칸이 G0, G2, G0F, G2F, G1, Man5, G1F 및 G1F'로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항원 결합 단백질.
  95. 제92항에 있어서, 비-푸코실화 글리칸을 포함하는 항원 결합 단백질.
  96. 제95항에 있어서, 비-푸코실화 글리칸이 G0, G2, G1 및 Man5로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항원 결합 단백질.
  97. 서열 100에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 코딩하는 단리된 핵산.
  98. 제97항에 있어서, 서열 101에 제시된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  99. 서열 104에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 238을 코딩하는 단리된 핵산.
  100. 제99항에 있어서, 서열 105에 제시된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  101. 서열 102에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 20 내지 466을 코딩하는 단리된 핵산.
  102. 제101항에 있어서, 서열 103에 제시된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  103. 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  104. 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  105. 제104항에 있어서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 존재하는 것인 재조합 숙주 세포.
  106. 제105항에 있어서, CHOK1 세포인 재조합 숙주 세포.
  107. 제104항에 있어서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 불활성화된 것인 재조합 숙주 세포.
  108. 제107항에 있어서, CHOK1SV 세포인 재조합 숙주 세포.
  109. 제87항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  110. 치료 유효량의 제87항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 암의 치료 방법.
  111. a) 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 암을 가진 대상체를 확인하는 단계; 및
    b) 치료 유효량의 제87항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암이 치료되는 것인, 대상체에서 암의 치료 방법.
  112. 제111항에 있어서, c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  113. 제112항에 있어서, 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  114. 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제87항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 물질의 용도.
  115. a) 제97항 또는 제98항에 따른 단리된 핵산을 포함하고 제97항 또는 제100항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 활성을 보이는 것인 단계; 및
    b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  116. 제115항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 CHOK1 세포인 방법.
  117. 제115항의 방법에 의해 생산된 항원 결합 단백질.
  118. a) 제97항 또는 제98항에 따른 단리된 핵산을 포함하고 제97항 또는 제100항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 불활성화된 것인 단계; 및
    b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  119. 제118항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 CHOK1SV 세포인 방법.
  120. 제118항에 따른 방법에 의해 생산된 항원 결합 단백질.
  121. a) 제99항 또는 제100항에 따른 단리된 핵산을 포함하고 제101항 및 제102항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 활성을 보이는 것인 단계; 및
    b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  122. 제121항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 CHOK1 세포인 방법.
  123. 제121항에 따른 방법에 의해 생산된 항원 결합 단백질.
  124. a) 제99항 또는 제100항에 따른 단리된 핵산을 포함하고 제101항 및 제102항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 불활성화된 것인 단계; 및
    b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 항원 결합 단백질이 생산되는 것인, 항원 결합 단백질의 생산 방법.
  125. 제124항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 CHOK1SV 세포인 방법.
  126. 제124항에 따른 방법에 의해 생산된 항원 결합 단백질.
  127. 치료 유효량의 제87항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 전암 상태가 치료되는 것인, 대상체에서 전암 상태의 치료 방법.
  128. a) 전암 상태가 존재하는 대상체를 확인하는 단계; 및
    b) 치료 유효량의 제87항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 전암 상태가 치료되는 것인, 대상체에서 전암 상태의 치료 방법.
  129. 제128항에 있어서, c) 유체를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  130. 제128항에 있어서, c) 암이 서열 21의 아미노산 잔기 330 내지 495를 포함하는 단백질을 발현하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  131. 제130항에 있어서, 단백질이 서열 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  132. 제109항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 제약 조성물.
  133. 제109항에 있어서, 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  134. 치료 유효량의 제87항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암의 치료 방법.
  135. 제134항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  137. 유방암, 난소암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 피부암, 위암 및 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된 상태의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제136항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE029026T2 (en) 2009-12-22 2017-01-30 Roche Glycart Ag Anti-HER3 antibodies and their applications
EA036314B1 (ru) 2010-08-20 2020-10-26 Новартис Аг Выделенные антитела к рецептору эпидермального фактора роста-3 (her3) и их фрагменты, фармацевтическая композиция, содержащая эти антитела и фрагменты, и их применение для лечения рака
DK2797957T3 (da) 2011-11-23 2019-09-23 Medimmune Llc Bindingsmolekyler specifikke for her3 og anvendelser deraf
EA036739B1 (ru) 2011-12-05 2020-12-15 Новартис Аг Антитела к рецептору эпидермального фактора роста 3 (her3)
JP2015500830A (ja) * 2011-12-05 2015-01-08 ノバルティス アーゲー 上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）のドメインｉｉｉおよびドメインｉｖに対するｈｅｒ３の抗体
EP2807272A1 (en) * 2012-01-27 2014-12-03 Ventana Medical Systems, Inc. Devices and methods for detecting bio-analytes using optically decipherable patterns
CN104755500B (zh) 2012-11-08 2020-10-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 结合HER3 β-发夹的HER3抗原结合蛋白
JP6537970B2 (ja) 2012-11-08 2019-07-03 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ３のベータヘアピン及びｈｅｒ４のベータヘアピンに結合する抗ｈｅｒ３／ｈｅｒ４抗原結合タンパク質
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
WO2015048008A2 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medimmune, Llc Binding molecules specific for her3 and uses thereof
DK3036259T3 (en) 2013-10-04 2018-05-14 Hoffmann La Roche ANTIBODIES SPECIFICALLY BINED TO HER3
US10844127B2 (en) 2014-02-28 2020-11-24 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and ErbB3
RS61129B1 (sr) * 2014-02-28 2020-12-31 Merus Nv Antitelo koje vezuje erbb-2 i erbb-3
US10745490B2 (en) 2014-04-11 2020-08-18 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ErbB antibodies and methods of use thereof
WO2015164723A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
JP6433511B2 (ja) 2014-05-14 2018-12-05 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ３のベータヘアピンに結合する抗ｈｅｒ３抗体
EP3160518A4 (en) * 2014-06-30 2018-05-23 Tarveda Therapeutics, Inc. Targeted conjugates and particles and formulations thereof
WO2016011080A2 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
US10526416B2 (en) 2014-09-08 2020-01-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-HER3 antibodies and uses of same
WO2016038610A1 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating cancer resistant to a tyrosine kinase inhibitor (tki)
WO2016059602A2 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Glaxo Group Limited Methods of treating cancer and related compositions
MX2018004988A (es) 2015-10-23 2018-11-09 Merus Nv Moleculas de union que inhibe el crecimiento de cancer.
AU2016343817B2 (en) 2015-10-28 2021-05-27 Tva (Abc), Llc SSTR-targeted conjugates and particles and formulations thereof
TWI778491B (zh) 2015-11-30 2022-09-21 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
CN108602890A (zh) 2015-12-11 2018-09-28 瑞泽恩制药公司 用于减少或预防对egfr和/或erbb3阻滞剂具有抗性的肿瘤生长的方法
US20190091227A1 (en) 2016-03-15 2019-03-28 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating er+, her2-, hrg+ breast cancer using combination therapies comprising an anti-erbb3 antibody
WO2017211964A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-14 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts The core domain of annexins and uses thereof in antigen delivery and vaccination
CN106543286A (zh) * 2016-12-07 2017-03-29 上海邦耀生物科技有限公司 一种去岩藻糖抗her2抗体及其应用
BR112019020508A2 (pt) 2017-03-31 2020-08-04 Merus N.V. anticorpos biespecíficos de ligação a erbb-2 e erbb3 para utilização no tratamento de células que possuem um gene de fusão nrg1
CN110753703B (zh) * 2017-05-23 2024-04-09 德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心（有限公司） 新的cd73抗体、其制备和用途
JP2020530028A (ja) 2017-08-09 2020-10-15 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ ＥＧＦＲ及びｃＭＥＴに結合する抗体
CN111886024A (zh) * 2018-03-08 2020-11-03 东莞凡恩世生物医药有限公司 抗tip-1抗体及其用途
US20210130495A1 (en) * 2019-09-27 2021-05-06 Agenus Inc. Heterodimeric proteins
CN116286828B (zh) * 2023-05-12 2023-08-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种寡聚核酸siRNA及其在制备用于预防和治疗肝癌的药物中的应用

Family Cites Families (238)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US6639061B1 (en) 1999-07-07 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. C3′-methylene hydrogen phosphonate oligomers and related compounds
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
WO1996014864A1 (en) 1994-11-09 1996-05-23 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
CA2589421C (en) 1996-03-27 2012-12-18 Genentech, Inc. Erbb3 antibodies
EP0896586B2 (en) 1996-03-27 2015-05-20 Genentech, Inc. ErbB3 ANTIBODIES
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
NZ333325A (en) 1996-07-12 2000-06-23 Genentech Inc Recombinant chimeric heteromultimer adhesins comprising extracellular domains of ErbB receptors
US20020002276A1 (en) 1997-02-10 2002-01-03 Genentech, Inc. Chimeric heteromultimer adhesins
US6723694B1 (en) 1997-05-21 2004-04-20 The Children's Medical Center Corp. Short peptides which selectively modulate intracellular signalling
US6416168B1 (en) 1997-07-15 2002-07-09 Silverbrook Research Pty Ltd Pump action refill ink jet printing mechanism
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
ATE276756T1 (de) 1998-02-04 2004-10-15 Genentech Inc Verwendung des heregulins als epithelzellenwachstumsfaktor
AU2003203831B2 (en) 1998-02-04 2006-08-10 Genentech, Inc. Use of heregulin as an epithelial cell growth factor
US20010023241A1 (en) 1998-02-04 2001-09-20 Sliwkowski Mark X. Use of heregulin as a growth factor
US6417168B1 (en) 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
ES2389387T3 (es) 1998-03-17 2012-10-25 Genentech, Inc. Polipéptidos homólogos de VEGF y de BMP1
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
CA2332331A1 (en) 1998-05-15 1999-11-25 Francisco Robert Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases
AU2004200705A1 (en) 1998-05-15 2004-03-18 Imclone Systems Incorporated Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
WO2001060397A1 (en) 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
EP1126873A1 (en) 1998-11-07 2001-08-29 Genentech, Inc. Method for enhancing proliferation of inner ear hair cells using ligands for her2 and/or her3 receptors
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2002544123A (ja) * 1999-04-14 2002-12-24 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション エリトロポイエチン受容体抗体
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US6710186B2 (en) 1999-06-14 2004-03-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Oligomers and polymers of di-substituted cyclic imino carboxylic acids
AUPQ105799A0 (en) 1999-06-18 1999-07-08 Victor Chang Cardiac Research Institute, The Cell growth inhibition
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
HU230586B1 (hu) 1999-06-25 2017-02-28 Genentech, Inc. Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására
BR122014028365B8 (pt) 1999-06-25 2021-07-06 Genentech Inc artigo industrializado compreendendo um primeiro recipiente que compreende uma composição de humab4d5-8 nele contida e um segundo recipiente que compreende uma composição rhumab 2c4 nele contida
DE60042693D1 (de) 1999-08-27 2009-09-17 Genentech Inc Dosierung für die behandlung mit anti erbb2-antikörpern
US7732157B1 (en) 1999-09-30 2010-06-08 Tumor Biology Investment Group Soluble epidermal growth factor receptor-like proteins and their uses in cancer detection methods
US7390632B2 (en) 1999-09-30 2008-06-24 Tumor Biology Investment Group, Inc. Soluble ErbB3 receptor isoforms
US7651703B2 (en) 1999-10-15 2010-01-26 Genentech, Inc. Injection vehicle for polymer-based formulations
WO2001051928A1 (en) 2000-01-12 2001-07-19 Ventana Medical Systems, Inc. Method for quantitating a protein by image analysis
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6632979B2 (en) 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
AU2007216733A1 (en) 2000-04-11 2007-09-27 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US7255999B2 (en) 2001-05-21 2007-08-14 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
AUPQ903400A0 (en) 2000-07-27 2000-08-17 Oh, Young June Navigable search engine
US6277640B1 (en) 2000-07-31 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of Her-3 expression
CA2429640C (en) 2000-11-24 2007-02-13 Carl Freudenberg Kg Floor mop
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2008200400B2 (en) 2001-01-17 2012-06-07 Aptevo Research And Development Llc Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1228766A1 (en) 2001-01-31 2002-08-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PYK2 phosphorylation by HER3 induces tumor invasion
CA2437814C (en) 2001-02-12 2008-05-13 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to fc alpha receptor (cd89)
US7638598B2 (en) 2001-04-06 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania ErbB interface peptidomimetics and methods of use thereof
US20040116330A1 (en) 2001-04-27 2004-06-17 Kenichiro Naito Preventive/therapeutic method for cancer
US7745398B2 (en) 2001-05-31 2010-06-29 Tumor Biology Investment Group, Inc. Soluble ErbB3 and treatment of cancer
US7744882B2 (en) 2001-05-31 2010-06-29 Tumor Biology Investment Group, Inc. Soluble ErbB3 methods of detection and antibodies
WO2002102854A2 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
WO2003001602A2 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Akzo Nobel N.V. Manufacturing a solar cell foil connected in series via a temporary substrate
WO2003011897A1 (en) 2001-07-27 2003-02-13 The Regents Of The University Of California Modulation of heregulin and her3 interaction
DE10137374A1 (de) 2001-07-31 2003-02-27 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure in transgenen Organismen
AU2002326531A1 (en) 2001-08-03 2003-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies to activated erbb family members and methods of use thereof
AU2008200654B2 (en) 2001-08-09 2010-04-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Inhibitors of HER3 activity
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP4132912B2 (ja) 2002-03-26 2008-08-13 日東電工株式会社 ゲル電解質とその製造方法とその利用
US7919098B2 (en) 2002-03-26 2011-04-05 Zensun ( Shanghai ) Sci & Tech Co., Ltd. ErbB-3 based methods and compositions for treating neoplasms
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US7323553B2 (en) 2002-04-26 2008-01-29 Genentech, Inc. Non-affinity purification of proteins
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US20040229380A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US20040229294A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US20040229293A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui Surface receptor complexes as biomarkers
US20040229299A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Badal M. Youssouf Intracellular complexes as biomarkers
US20040132097A1 (en) 2002-06-19 2004-07-08 Bacus Sarah S. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
MXPA05000403A (es) 2002-07-15 2005-07-22 Genentech Inc Metodos para identificar tumores que responden al tratamiento con anticuerpos contra erbb2.
JP4443407B2 (ja) 2002-07-25 2010-03-31 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド レセプターオリゴマー形成の検出
GB0225282D0 (en) 2002-10-31 2002-12-11 Astrazeneca Ab assay
CA2513113A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
BRPI0409554A (pt) 2003-04-04 2006-04-25 Univ Lausanne peptacorpo de fusão isolado e recombinante, seqüência de dna, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica e seu uso, kits, método para a produção do peptacorpo de fusão e seqüência de intensificador
WO2004094463A2 (en) 2003-04-18 2004-11-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. Peptide inhibitors of autophosphorylation protein kinases
EP2348110B1 (en) 2003-05-30 2013-03-27 OncoTherapy Science, Inc. Process for screening a drug response in cancer patients
PL1636593T3 (pl) 2003-06-06 2009-08-31 Genentech Inc Modulowanie oddziaływania pomiędzy łańcuchem beta HGF i c-met.
US20040254108A1 (en) 2003-06-13 2004-12-16 Jing Ma Preparation and application of anti-tumor bifunctional fusion proteins
AU2004252465A1 (en) 2003-06-13 2005-01-06 Oncomax Acquisition Corp. Preparation and application of anti-tumor bifunctional fusion proteins
US20050232931A1 (en) 2003-06-13 2005-10-20 Oncomax Acquisition Corp. Preparation and application of anti-tumor bifunctional fusion proteins
US6836094B1 (en) 2003-07-01 2004-12-28 International Truck Intellectual Property Company, Llc Motor vehicle battery disconnect switch circuits
US7531649B2 (en) 2003-07-18 2009-05-12 The Regents Of The University Of California Aptamers to human epidermal growth factor receptor-3
PT3095793T (pt) 2003-07-28 2020-05-04 Genentech Inc Redução da lixiviação de proteína a durante a cromatografia por afinidade com proteína a
WO2005013804A2 (en) 2003-08-05 2005-02-17 Euro-Celtique S.A. ErbB RECEPTOR METHODS AND KITS FOR MONITORING CHEMOTHERAPY RESISTANCE
WO2005014618A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
CA2535510C (en) 2003-08-11 2013-10-15 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
WO2005037071A2 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Monogram Biosciences, Inc. Receptor tyrosine kinase signaling pathway analysis for diagnosis and therapy
CA2543830A1 (en) 2003-10-27 2005-05-19 Monogram Biosciences, Inc. Detecting human anti-therapeutic antibodies
JP2007510708A (ja) 2003-11-06 2007-04-26 ファイザー・プロダクツ・インク 癌の治療における選択的ｅｒｂＢ２阻害剤／抗ｅｒｂＢ抗体の組合せ
US7754441B2 (en) 2003-11-17 2010-07-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
CA2551813C (en) 2003-12-24 2014-08-12 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US8323987B2 (en) 2004-02-17 2012-12-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modulation of epidermal growth factor heterodimer activity
JP2007528725A (ja) 2004-02-20 2007-10-18 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 結合ペルオキシダーゼ模倣物及びその使用
EP1796711A2 (en) 2004-04-22 2007-06-20 Oregon Health and Science University Herstatin or intron 8-encoded domain thereof for modulating signaling mediated by igf-1 receptor and erbb receptors
WO2005117973A2 (en) 2004-05-05 2005-12-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
KR20120133403A (ko) 2004-06-01 2012-12-10 도만티스 리미티드 증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체
SV2006002143A (es) 2004-06-16 2006-01-26 Genentech Inc Uso de un anticuerpo para el tratamiento del cancer resistente al platino
WO2006000034A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Conjugates and therapeutic uses thereof
US7560111B2 (en) 2004-07-22 2009-07-14 Genentech, Inc. HER2 antibody composition
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
WO2006042002A2 (en) 2004-10-05 2006-04-20 Oregon Health And Science University Compositions and methods for treating disease
DK1817340T3 (da) 2004-11-12 2012-08-13 Xencor Inc Fc-varianter med ændret binding til fcrn
EP1814883A1 (en) 2004-11-22 2007-08-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Bicyclic inhibitors or rho kinase
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US7811562B2 (en) * 2004-12-03 2010-10-12 Schering Corporation Biomarkers for pre-selection of patients for anti-IGF1R therapy
CN101115849A (zh) 2004-12-07 2008-01-30 健泰科生物技术公司 选择her抑制剂疗法的患者
WO2006068640A1 (en) 2004-12-21 2006-06-29 Cell Signaling Technology, Inc. Protein phosphorylation in egfr-signaling pathways
US7807789B2 (en) 2004-12-21 2010-10-05 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in EGFR-signaling pathways
CN101098891B (zh) 2005-01-05 2014-05-21 F-星生物技术研究与开发有限公司 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域
EP1838730A4 (en) 2005-01-11 2015-04-29 Molecular Logix Inc PAN-HER ANTAGONISTS AND METHODS OF USE
US7449184B2 (en) 2005-01-21 2008-11-11 Genentech, Inc. Fixed dosing of HER antibodies
WO2006084018A2 (en) 2005-02-02 2006-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Methods for determining responsiveness to cancer therapy
EP2402374A1 (en) 2005-02-07 2012-01-04 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US7718626B2 (en) 2005-02-17 2010-05-18 University Of Maryland, Baltimore ErbB3 binding protein compositions and methods of use
CA2599606A1 (en) 2005-02-23 2006-08-31 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
PT1850874E (pt) 2005-02-23 2013-12-02 Genentech Inc Extensão de tempo até a progressão da doença ou sobrevivência em pacientes com cancro de ovário usando pertuzumab
US7210618B2 (en) 2005-03-03 2007-05-01 Nokia Corporation Mobile communication terminal
KR20080004480A (ko) 2005-03-07 2008-01-09 타게티드 몰레큘라 다이아그노스틱스, 엘엘씨 티로신 키나제 억제제 조성물, 그의 제조 방법 및 이를이용한 질병 치료 방법
WO2006096861A2 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Genentech, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING TUMORS RESPONSIVE TO TREATMENT WITH HER DIMERIZATION INHIBITORS (HDIs)
EP1874824A4 (en) 2005-04-06 2009-12-30 Ibc Pharmaceuticals Inc METHODS OF GENERATING STABLE COMPOUND RELATED COMPLEXES OF HOMODIMERS, HOMOTRATEERS OR DIMER SIZES AND USES THEREOF
ES2417065T3 (es) 2005-04-26 2013-08-05 Trion Pharma Gmbh Combinación de anticuerpos con glucocorticoides para el tratamiento del cáncer
EP1913160A2 (en) 2005-07-29 2008-04-23 Bayer Healthcare LLC Diagnostic methods for the prediction of therapeutic success, recurrence free and overall survival in cancer therapy
CN101291954B (zh) 2005-08-26 2013-03-27 罗氏格黎卡特股份公司 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子
US20070172844A1 (en) 2005-09-28 2007-07-26 University Of South Florida Individualized cancer treatments
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
US20090252681A1 (en) 2005-10-11 2009-10-08 Ablynx N.V. Nanobodies and Polypeptides Against EGFR and IGF-IR
US20110052570A1 (en) 2005-10-26 2011-03-03 Children's Medical Center Corporation Method to prognose response to anti-egfr therapeutics
EP1792622A1 (en) 2005-11-11 2007-06-06 GPC Biotech AG Anti-proliferative combination therapy comprising a platinum-based chemotherapeutic agent and EGFR inhibitors or pyrimidine analogues
PL2481753T3 (pl) * 2005-12-13 2018-09-28 Eli Lilly And Company Przeciwciała anty-IL-17
EP1800695A1 (en) 2005-12-21 2007-06-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Immuno-RNA-constructs
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US7498142B2 (en) 2006-01-31 2009-03-03 Yeda Research And Development Co., Ltd. Methods of identifying combinations of antibodies with an improved anti-tumor activity and compositions and methods using the antibodies
CA2641026A1 (en) 2006-02-01 2007-08-09 The Johns Hopkins University Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
JP2009532393A (ja) 2006-04-07 2009-09-10 コペンハーゲン ユニバーシティ ＥｒｂＢ受容体由来ペプチド断片
KR20090019890A (ko) 2006-06-05 2009-02-25 제넨테크, 인크. Ｅｇｆ 또는 ｔｇｆ-알파 수준이 상승된 암 환자의 생존 연장
CN101627053A (zh) * 2006-06-12 2010-01-13 西福根有限公司 泛细胞表面受体特异的治疗剂
MX363905B (es) 2006-06-12 2019-04-08 Aptevo Res & Development Llc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
WO2007145832A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Shulman Zachary J Infant harness support
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
US20100316626A1 (en) 2006-08-11 2010-12-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Methods for treatment and diagnosis of psychiatric disorders
US10118970B2 (en) 2006-08-30 2018-11-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US8936780B2 (en) 2006-08-30 2015-01-20 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Stimuli responsive polyester amide particles
AU2007291501B2 (en) 2006-08-31 2012-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the production of insulin-like growth factor-I
MX2009003048A (es) 2006-09-21 2009-09-07 Prometheus Lab Inc Disposiciones a base de anticuerpo para detectar transductores de multiple señal en celulas circulantes raras.
BRPI0717416A2 (pt) 2006-09-21 2013-11-12 Prometheus Lab Inc Método para realizar um imunoensaio complexo de alta produtividade, e, arranjo
US20080076139A1 (en) 2006-09-21 2008-03-27 Sharat Singh Methods and compositions for detecting the activation states of multiple signal transducers in rare circulating cells
US20080112961A1 (en) 2006-10-09 2008-05-15 Macrogenics, Inc. Identification and Engineering of Antibodies with Variant Fc Regions and Methods of Using Same
WO2008069881A2 (en) 2006-11-06 2008-06-12 Source Precision Medicine, Inc. Gene expression profiling for identification, monitoring and treatment of melanoma
EP2091975A4 (en) 2006-11-21 2013-05-22 Univ California ANTIBODIES TO THE EGFR FAMILY, BICE-SPECIFIC ANTIBODIES TO THE EGFR FAMILY AND METHOD FOR THEIR USE
WO2008064884A1 (en) 2006-11-28 2008-06-05 U3 Pharma Gmbh Activated her3 as a marker for predicting therapeutic efficacy
SG177225A1 (en) 2006-12-01 2012-01-30 Agency Science Tech & Res Cancer-related protein kinases
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
US8362217B2 (en) 2006-12-21 2013-01-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
US8569464B2 (en) 2006-12-21 2013-10-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
US20100267933A1 (en) 2006-12-21 2010-10-21 Moya Wilson Purification of proteins
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
JP2010516675A (ja) 2007-01-17 2010-05-20 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 治療薬剤のポリマー担体および疾病部位の抗体に基づく標的化のための認識部分
SI2129396T1 (sl) 2007-02-16 2013-12-31 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Protitelesa proti ErbB3 in njihove uporabe
PE20090681A1 (es) 2007-03-02 2009-06-10 Genentech Inc Prediccion de respuesta a un inhibidor her
AR065803A1 (es) 2007-03-23 2009-07-01 Smithkline Beecham Corp Uso de un polipeptido de il- 18 humana y un anticuerpo anti- cd para preparar unmedicamento
US20100119457A1 (en) 2007-03-30 2010-05-13 Helmut Lenz Composition of labeled and non-labeled monoclonal antibodies
DK2076289T3 (da) 2007-04-13 2015-02-09 Dana Farber Cancer Inst Inc Fremgangsmåder til behandling af cancerresistens over for ErbB-lægemider
FR2915115B1 (fr) 2007-04-23 2010-09-10 Sames Technologies Organe de pulverisation,dispositif de projection comportant un tel organe,installation de projection et methode de nettoyage d'un tel organe
CA2688477C (en) 2007-06-01 2020-12-22 The Regents Of The University Of California Multigene prognostic assay for lung cancer
WO2008148546A2 (en) 2007-06-06 2008-12-11 F.Hoffmann-La Roche Ag Composition of a first non-labeled monoclonal antibody binding to a tumor antigen and a non-cross reactive second monoclonal antibody labeled with a nir fluorescence label
WO2009045579A2 (en) 2007-06-14 2009-04-09 The Regents Of The University Of California Multimodal imaging probes for in vivo targeted and non-targeted imaging and therapeutics
WO2009003082A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Vanderbilt University Immunological compositions as cancer biomarkers and/or therapeutics
US20110038865A1 (en) 2007-06-26 2011-02-17 University Of Miami Antibody- endostatin fusion protein and its variants
US20090053786A1 (en) 2007-07-09 2009-02-26 Yung-Hsiang Kao Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides
KR101553723B1 (ko) 2007-07-13 2015-09-16 네스텍 소시에테아노님 항체­기반 어레이를 사용한 폐 암 치료를 위한 약물 선별법
WO2009023266A1 (en) 2007-08-14 2009-02-19 Ludwig Institute For Cancer Research Generation of antibodies to cell-surface receptors and cancer-associated proteins including egfr family members
MX2010003099A (es) 2007-09-21 2010-05-17 Univ California Interferon de objetivo demuestra actividades potentes apoptoticas y antitumorales.
US20110091473A1 (en) 2007-10-22 2011-04-21 Genmab A/S Novel antibody therapies
JP5620106B2 (ja) 2007-10-24 2014-11-05 株式会社糖鎖工学研究所 増強されたエフェクター機能を有するポリペプチド
ES2545760T3 (es) 2008-02-25 2015-09-15 Nestec S.A. Selección de fármacos para terapia del cáncer de mama utilizando matrices de anticuerpos
WO2009111707A1 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Genentech, Inc. Combination therapy with c-met and her antagonists
EP2106806A1 (en) 2008-03-31 2009-10-07 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der Angewandten Forschung e.V. Nanoparticles for targeted delivery of active agents to the lung
CA2721093A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2276506A4 (en) 2008-04-30 2014-05-07 Immunogen Inc EFFICIENT CONJUGATES AND HYDROPHILIC BINDER
WO2009134870A1 (en) 2008-04-30 2009-11-05 Immunogen, Inc. Potent cell-binding agent drug conjugates
UY31800A (es) 2008-05-05 2009-11-10 Smithkline Beckman Corp Metodo de tratamiento de cancer usando un inhibidor de cmet y axl y un inhibidor de erbb
WO2010008726A1 (en) 2008-06-16 2010-01-21 Immunogen Inc. Novel synergistic effects
EP2138511A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. HER3 as a determinant for the prognosis of melanoma
NZ590074A (en) * 2008-07-08 2012-12-21 Abbott Lab Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009273540A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Merck Patent Gmbh Method of determination of receptor binding saturation effected by monoclonal antibodies
US8056451B2 (en) 2008-07-28 2011-11-15 Irwin Industrial Tool Company Locking pliers
US20100033482A1 (en) 2008-08-11 2010-02-11 Interactive Relighting of Dynamic Refractive Objects Interactive Relighting of Dynamic Refractive Objects
US8623592B2 (en) 2008-08-15 2014-01-07 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for predicting response of cells to a therapeutic agent
US8080415B2 (en) 2008-09-26 2011-12-20 Eureka Therapeutics, Inc. Modified host cells and uses thereof
WO2010051530A2 (en) 2008-10-31 2010-05-06 The General Hospital Corporation Compositions and methods for delivering a substance to a biological target
AU2009308707A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. LIGHT targeting molecules and uses thereof
WO2010059315A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
US20100169729A1 (en) 2008-12-30 2010-07-01 Datta Shamanna M Enabling an integrated memory controller to transparently work with defective memory devices
WO2010083252A2 (en) 2009-01-14 2010-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ratio based biomarkers and methods of use thereof
WO2010083463A1 (en) 2009-01-15 2010-07-22 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-2 expression
WO2010083470A1 (en) 2009-01-15 2010-07-22 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-3
PT3903829T (pt) 2009-02-13 2023-06-02 Immunomedics Inc Imunoconjugados com uma ligação intracelular clivável
WO2010097186A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Roche Diagnostic Gmbh Use of s-erbb-3 as a marker for cancer
EP2400984A4 (en) 2009-02-25 2013-01-23 Merck Sharp & Dohme HER2 ANTIBODY COMPOSITIONS
ES2572728T3 (es) 2009-03-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-HER biespecíficos
CA2759792A1 (en) 2009-04-29 2010-11-04 Trellis Bioscience, Inc. Improved antibodies immunoreactive with heregulin-coupled her3
JP5705836B2 (ja) 2009-05-29 2015-04-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ２を発現する胃癌患者のｈｅｒ２シグナル伝達のためのモジュレーター
US20120213705A1 (en) 2009-06-22 2012-08-23 Medimmune, Llc ENGINEERED Fc REGIONS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION
AU2010273319B2 (en) 2009-07-15 2015-01-22 Nestec S.A. Drug selection for gastric cancer therapy using antibody-based arrays
RU2573894C2 (ru) 2009-08-06 2016-01-27 Дженентек, Инк. Способ усовершенствования процесса удаления вирусов при очистке белков
US20110039300A1 (en) 2009-08-10 2011-02-17 Robert Bayer Antibodies with enhanced adcc functions
CA2771744A1 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against the ectodomain of erbb3 and uses thereof
WO2011031840A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Quintiles Transnational Corp. Methods and compositions for the treatment of receptor tyrosine kinase mediated diseases or disorders
WO2011044368A1 (en) 2009-10-07 2011-04-14 Macrogenics, Inc. Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use
AU2010303443A1 (en) 2009-10-09 2012-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-Her 3 antibodies
AU2010306774A1 (en) 2009-10-14 2012-05-03 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting IGF-1R and ErbB3 signalling and uses thereof
EP2719708B1 (en) 2009-11-13 2017-10-25 Daiichi Sankyo Europe GmbH Material and methods for treating or preventing HER-3 associated diseases
US9556249B2 (en) 2010-02-18 2017-01-31 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
US20130225424A1 (en) 2010-03-03 2013-08-29 Targeted Molecular Diagnostics, Llc Methods for determining responsiveness to a drug based upon determination of ras mutation and/or ras amplification
EA201201186A1 (ru) 2010-03-11 2013-11-29 Мерримак Фармасьютикалс, Инк. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ErbB3 ИНГИБИТОРОВ В ЛЕЧЕНИИ ТРИЖДЫ НЕГАТИВНОГО И БАЗАЛЬНО-ПОДОБНОГО ВИДОВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
BR112012025730B1 (pt) 2010-04-09 2020-12-08 Aveo Pharmaceuticals, Inc anticorpo isolado que se liga ao erbb3 humano, seus usos, seu processo de produção e vetor de expressão
WO2011139629A2 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
EP2569334A4 (en) 2010-05-13 2014-01-22 Fox Chase Cancer Ct RECOMBINANT-PRODUCED ANTIBODIES FOR THE TARGETING OF ERBB SIGNALING MOLECULES AND METHOD FOR THEIR USE FOR DISEASE DIAGNOSIS AND TREATMENT
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
EP3546483A1 (en) 2010-05-20 2019-10-02 Ablynx N.V. Biological materials related to her3
WO2012103341A1 (en) 2011-01-27 2012-08-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Treatment of advanced solid stage tumors using anti-erbb3 antibodies
WO2012106578A1 (en) 2011-02-04 2012-08-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services HIV NEUTRALIZING ANTIBODIES HAVING MUTATIONS IN CONSTANT DOMAIN (Fc)
CA2825064C (en) 2011-02-04 2022-08-30 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
AU2012214643B2 (en) 2011-02-07 2016-12-15 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides
ES2687771T3 (es) 2011-03-06 2018-10-29 Merck Serono Sa Líneas de células con bajo nivel de fucosa y sus usos
EP3553527A1 (en) 2011-03-17 2019-10-16 Cernostics, Inc. Systems and compositions for diagnosing barrett's esophagus and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
CL2013000566A1 (es) 2014-01-24
NZ607680A (en) 2015-02-27
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EA201390328A1 (ru) 2013-08-30
TW201302793A (zh) 2013-01-16
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CA2809443A1 (en) 2012-03-08
PE20140133A1 (es) 2014-02-09
MA34555B1 (fr) 2013-09-02
EP2611829A2 (en) 2013-07-10
AU2011295726A1 (en) 2013-03-21
CO6690769A2 (es) 2013-06-17
SG187930A1 (en) 2013-03-28
CR20130128A (es) 2013-06-28
WO2012031198A3 (en) 2012-05-18
CN103189391A (zh) 2013-07-03
BR112013005242A2 (pt) 2016-06-28
JP2013544492A (ja) 2013-12-19
UY33591A (es) 2012-03-30

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