CN114787186A

CN114787186A - 异二聚体蛋白

Info

Publication number: CN114787186A
Application number: CN202080065322.8A
Authority: CN
Inventors: D.S.钱德; Z.贾瓦德; V.F.伊尔科夫
Original assignee: Agenus Inc
Current assignee: Agenus Inc
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2022-07-22
Also published as: MX2022003149A; BR112022004789A2; WO2021062382A1; US20210130495A1; JP2022549351A; KR20220069935A; AU2020355253A1; EP4034570A1; IL291618A; EP4034570A4; CA3151574A1

Abstract

本文提供了异二聚体蛋白(例如，多特异性抗体)，其相对于天然存在的抗体表现出增强的与人Fcγ受体IIIA(FcγRIIIA)的结合，并且保留良好的可制造性。此类异二聚体蛋白尤其可用作多特异性结合蛋白(例如，多特异性抗体)。还提供了药物组合物，其包含这些异二聚体蛋白、编码这些异二聚体蛋白的核酸和用于制备这些异二聚体蛋白的表达载体和宿主细胞。

Description

异二聚体蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月27日提交的美国临时申请第62/906,918号的权益，所述临时申请通过引用整体并入本文中。

技术领域

本公开涉及异二聚体蛋白(例如，多特异性抗体)及其制备方法。

背景技术

包含两种或更多种结合特异性的多特异性结合分子(例如，多特异性抗体)作为治疗剂具有很大的前景，因为这些分子能够在体内调节多个靶标的活性。用于产生多特异性抗体的一个常见方法是异二聚化两种不同抗体的重链。为了促进这种异二聚化，两种抗体的CH3结构域被工程化以含有互补的突变集合，所述突变集合相对于同二聚化产生对重链异二聚化的偏好(参见例如，Ridgway J.B.等人,1996,Protein Eng.,9:617-621；和美国专利第9,409,989号，其各自通过引用整体并入本文)。

在某些情况下，相对于对应天然存在的抗体的Fc区的结合，需要增强多特异性抗体的Fc区与人Fcγ受体IIIA(FcγRIIIA)的结合。根据EU索引，实现这种增强的FcγRIIIA结合的一种方法是工程化多特异性抗体的Fc区以包含在Fc区的氨基酸位置239、330和332处的特定氨基酸突变(参见例如，Lazar,G.A.等人,2006,PNAS,103(11):4005-4010)。然而，申请人已发现，根据EU索引，在氨基酸位置366、368和407处将这些Fc突变与异二聚化增强的Fc突变组合可负面影响包含这些突变的多特异性抗体的可制造性。

因此，本领域需要改进的多特异性抗体，其表现出增强的与FcγRIIIA的结合，同时保留良好的可制造性。

发明内容

本公开提供了异二聚体蛋白(例如，多特异性抗体)，其相对于对应天然存在的抗体表现出增强的与FcγRIIIA的结合，并且表现出良好的可制造性。异二聚体蛋白一般包含第一Fc多肽，其包含分别在氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸；和第二Fc多肽，其分别包含在氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置332处的谷氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。在某些实施方案中，所述异二聚体蛋白包含第一Fc多肽，其包含分别在氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸；和第二Fc多肽，其包含分别在氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别在氨基酸位置330和332处的亮氨酸和谷氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。此类异二聚体蛋白作为多特异性结合蛋白(例如，多特异性抗体)特别有用。还提供了药物组合物，其包含这些异二聚体蛋白、编码这些异二聚体蛋白的核酸和用于制备这些异二聚体蛋白的表达载体和宿主细胞。不希望受理论束缚，申请人认为，相对于包含在根据EU索引编号的氨基酸位置239、330、332、366、368和407处的突变的相应Fc多肽，本文公开的异二聚体蛋白的第二Fc多肽具有改善的热稳定性。

因此，在一个方面，本公开提供了异二聚体蛋白。

在某些实施方案中，所述异二聚体蛋白包含第一Fc多肽和第二Fc多肽，其中：所述第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且所述第二Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置332处的谷氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。在某些实施方案中，第一Fc多肽还包含在氨基酸位置330处的亮氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。在某些实施方案中，第二Fc多肽不包含在氨基酸位置330处的亮氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在某些实施方案中，第一Fc多肽包含第一抗原结合部分和/或第二Fc多肽包含第二抗原结合部分。在某些实施方案中，第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分包含抗体可变结构域、细胞表面受体的胞外结构域、可溶性T细胞受体(例如，缺少内源性跨膜和细胞质区的T细胞受体)或配体。在某些实施方案中，第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分包含VH、VL、VHH、VH/VL对、scFv、双体抗体(diabody)和/或Fab。在某些实施方案中，细胞表面受体是肿瘤坏死因子超家族受体、血管内皮生长因子受体或转化生长因子受体。在某些实施方案中，可溶性T细胞受体包含通过一个或多个工程化的二硫键稳定化的T细胞受体的胞外抗原结合部分。在某些实施方案中，可溶性T细胞受体包含单链T细胞受体，其包含通过柔性接头(例如，肽接头)连接在一起的T细胞受体的可变区。在某些实施方案中，配体是激素或生长因子。在某些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分特异性结合至相同或不同的靶分子。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含抗体重链。在某些实施方案中，抗体重链缺少CH1结构域和/或铰链区的一部分。在某些实施方案中，抗体重链是全长抗体重链。在某些实施方案中，抗体重链是人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂重链。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含抗体轻链。在某些实施方案中，抗体轻链是人κ或λ轻链。

在某些实施方案中，第一Fc多肽包含含有第一抗体重链和第一抗体轻链的第一半抗体；和/或第二Fc多肽包含含有第二抗体重链和第二抗体轻链的第二半抗体。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含含有第一抗体重链和第一抗体轻链的第一半抗体；和第二Fc多肽包含含有第二抗体重链和第二抗体轻链的第二半抗体。在某些实施方案中，第一半抗体和第二半抗体结合至不同靶分子或同一靶分子的不同区。

在某些实施方案中，第一Fc多肽包含与选自由SEQ ID NO:1-3、6-7、10-11、24-27、48-51和62-65组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列；和/或第二Fc多肽包含与选自由SEQ ID NO:1-3、5、12-13、36-37、60-61和66-67组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽包含与选自由SEQ ID NO:1-3、6-7、10-11、24-27、48-51和62-65组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列；和/或第二Fc多肽包含与选自由SEQ ID NO:1-3,5,12-13,36-37,60-61和66-67组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽包含选自由SEQ ID NO:1-3、6-7、10-11、24-27、48-51和62-65组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含选自由SEQ IDNO:1-3、5、12-13、36-37、60-61和66-67组成的组的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽包含分别与SEQ ID NO:24和36；24和37；25和36；25和37；26和36；26和37；27和36；27和37；48和60；48和61；49和60；49和61；50和60；50和61；51和60；51和61；62和66；62和67；63和66；63和67；64和66；64和67；65和66；或65和67的氨基酸序列至少75％相同(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽分别包含SEQ ID NO:24和36；24和37；25和36；25和37；26和36；26和37；27和36；27和37；48和60；48和61；49和60；49和61；50和60；50和61；51和60；51和61；62和66；62和67；63和66；63和67；64和66；64和67；65和66；或65和67的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQID NO:50中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQID NO:61中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ IDNO:63中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，其中第一Fc多肽包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQID NO:67中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ IDNO:24中所示的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的异二聚体蛋白。在某些实施方案中，药物组合物包含本文公开的异二聚体蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一方面，本公开提供了编码本文公开的Fc多肽的分离的多核苷酸、包含多核苷酸的载体和包含本文公开的多核苷酸、载体和Fc多肽的重组宿主细胞。在某些实施方案中，分离的多核苷酸编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽。在某些实施方案中，载体包含编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽的多核苷酸。

在某些实施方案中，重组宿主细胞包含：

a)多核苷酸，其编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽；

b)载体，其包含编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽的多核苷酸；

c)第一多核苷酸，其编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽；和第二多核苷酸，其编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第二Fc多肽；

d)第一载体，其包含编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一多核苷酸；和第二载体，其包含编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二多核苷酸；

e)第一多核苷酸，其编码本文公开的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一抗体重链；和第二多核苷酸，其编码本文公开的异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二抗体重链；和任选地，第三多核苷酸，其编码第一Fc多肽的第一抗体轻链；和/或第四多核苷酸，其编码第二Fc多肽的第二抗体轻链；

其中第一Fc多肽包含含有第一抗体重链和第一抗体轻链的第一半抗体；和第二Fc多肽包含含有第二抗体重链和第二抗体轻链的第二半抗体；或

f)第一载体，其包含编码本文公开的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一抗体重链的第一多核苷酸；和第二载体，其包含编码本文公开的异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二抗体重链的第二多核苷酸；和任选地，第三载体，其包含编码第一Fc多肽的第一抗体轻链的第三多核苷酸；和/或第四载体，其包含编码第二Fc多肽的第二抗体轻链的第四多核苷酸，

其中第一Fc多肽包含含有第一抗体重链和第一抗体轻链的第一半抗体；和第二Fc多肽包含含有第二抗体重链和第二抗体轻链的第二半抗体。

在另一个方面，本公开提供了用于产生本文所述的异二聚体蛋白的方法。

在某些实施方案中，所述方法包括在细胞中表达编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一多核苷酸；和编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二多核苷酸，其中条件是产生所述异二聚体蛋白。

在某些实施方案中，所述方法包括在细胞中表达：

a)编码本文公开的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一抗体重链的第一多核苷酸；

b)编码本文公开的异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二抗体重链的第二多核苷酸；

c)编码第一Fc多肽的第一抗体轻链的第三多核苷酸；和

c)编码第二Fc多肽的第二抗体轻链的第四多核苷酸

，其中条件是产生所述异二聚体蛋白。

在某些实施方案中，所述方法包括：

a)在第一细胞中表达编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一多核苷酸，其中条件是产生所述第一Fc多肽；

b)在第二细胞中表达编码本文公开的任何异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二多核苷酸，其中条件是产生所述第二Fc多肽；和

c)使步骤(a)和(b)中产生的第一Fc多肽和第二Fc多肽接触，其中条件是所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽异二聚化以产生所述异二聚体蛋白。

在某些实施方案中，所述方法包括：

a)在第一细胞中表达编码本文公开的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一抗体重链的第一多核苷酸和编码第一抗体轻链的第二多核苷酸，其中条件是产生所述第一Fc多肽；

b)在第二细胞中表达编码本文公开的异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二抗体重链的第三多核苷酸和编码第二抗体轻链的第四多核苷酸，其中条件是产生所述第二Fc多肽；和

c)使步骤(a)和(b)中产生的第一Fc多肽和第二Fc多肽接触，其中条件是所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽异二聚化以产生所述异二聚体蛋白，

在某些实施方案中，所述方法包括使本文公开的任何异二聚体蛋白的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽接触，其中条件是所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽异二聚化以产生所述异二聚体蛋白。

附图说明

图1是示出表3中所述的Fc多肽的子集的表达水平的图。

图2A和2B是示出如通过测量热展开转变(thermal unfolding transition)确定的异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113和BA114(图2A；“抗靶标1抗体”)和BA115、BA116、BA117和BA118(图2B；“抗靶标2抗体”)的热稳定性的图。

图3是示出异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113、BA114、BA119和IgG₁同种型对照抗体与工程化以表达高水平的细胞表面靶标1的Jurkat细胞的结合的图。在每种情况下，通过中值荧光强度(MFI)评估的与Jurkat细胞结合的程度相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白(“抗体”)的浓度作图。

图4是示出异二聚体蛋白BA115、BA116、BA117、BA118、BA120和IgG₁同种型对照抗体与工程化以表达高水平的细胞表面靶标2的CHO细胞的结合的图。在每种情况下，通过中值荧光强度(MFI)评估的与CHO细胞结合的程度相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白(“抗体”)的浓度作图。

图5是示出使用异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113、BA114、BA119或IgG₁同种型对照抗体测量由靶标1阻断产生的T细胞活化的相对量的IL-2-荧光素酶报告基因测定的结果的图。荧光素酶表达(以平均RLU测量)(IL-2基因活化的替代标记)相对于异二聚体蛋白(“抗体”)浓度作图。

图6是示出使用异二聚体蛋白BA115、BA116、BA117、BA118、BA120或IgG₁同种型对照抗体测量由靶标2阻断产生的T细胞活化的相对量的IL-2-荧光素酶报告基因测定的结果的图。荧光素酶表达(以平均RLU测量)(IL-2基因活化的替代标记)相对于异二聚体蛋白(“抗体”)浓度作图。

图7A-7P是示出异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113、BA114、BA119和参考同二聚体蛋白2通过SEA刺激的PBMC在三个不同供体(供体1(图7A-7D和图7I-7L)、供体2(图7E-7H)和供体3(图7M-7P))中诱导IL-2分泌的能力的图。使用包含S239D/A330L/I332E突变(“Fc增强”)的同二聚体同种型蛋白作为同种型对照。IL-2浓度相对于异二聚体蛋白(“抗体”)浓度绘作图。

图8A-8X是示出BA115、BA116、BA117、BA118和参考同二聚体蛋白1通过SEA刺激的PBMC在三个不同供体(供体1(图8A-8D和图8M-8P)、供体2(图8I-8L和8U-8X)和供体3(图8E-8H和8Q-8T))中诱导IL-2分泌的能力的图。使用包含S239D/A330L/I332E突变(“Fc增强”)的同二聚体同种型蛋白作为同种型对照。IL-2浓度相对于异二聚体蛋白(“抗体”)浓度绘作图。

图9A和9B是示出异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113和BA114与表达细胞表面人FcγRIIIA V/V的CHO细胞(图9A)或表达细胞表面人FcγRIIIA F/F的CHO细胞(图9B)的结合的一组图。通过几何平均荧光强度(MFI)评估的与细胞结合的异二聚体蛋白的水平相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白(“Ab”)的浓度作图。

图10A和10B是示出异二聚体蛋白BA115、BA116、BA117和BA118与表达细胞表面人FcγRIIIA V/V的CHO细胞(图10A)或表达细胞表面人FcγRIIIA F/F的CHO细胞(图10B)的结合的一组图。通过几何平均荧光强度(MFI)评估的与细胞结合的异二聚体蛋白的水平相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白(“Ab”)的浓度作图。

图11A-11G是示出抗靶标1异二聚体蛋白与表达细胞表面人FcγRIIIA F/F的CHO细胞的结合的一组图。通过几何平均荧光强度(MFI)评估的与细胞结合的异二聚体蛋白的水平相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白的浓度作图。

图12A-12G是示出抗靶标2异二聚体蛋白与表达细胞表面人FcγRIIIA F/F的CHO细胞的结合的一组图。通过几何平均荧光强度(MFI)评估的与细胞结合的异二聚体蛋白的水平相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白的浓度作图。

具体实施方式

本文提供了异二聚体蛋白(例如，多特异性抗体)，其相对于对应天然存在的抗体表现出增强的与FcγRIIIA的结合，并且表现出良好的可制造性。异二聚体蛋白一般包含第一Fc多肽，其包含分别在氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸；和第二Fc多肽，其分别包含在氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置332处的谷氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。在某些实施方案中，所述异二聚体蛋白包含第一Fc多肽，其包含分别在氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸；和第二Fc多肽，其包含分别在氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别在氨基酸位置330和332处的亮氨酸和谷氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。此类异二聚体蛋白作为多特异性结合蛋白(例如，多特异性抗体)特别有用。还提供了药物组合物，其包含这些异二聚体蛋白、编码这些异二聚体蛋白的核酸和用于制备这些异二聚体蛋白的表达载体和宿主细胞。

5.1定义

如本文所用，术语“异二聚体蛋白”是指包含两种不同Fc多肽的共价或非共价连接的二聚体的蛋白质。

如本文所用，术语“Fc多肽”是指包含CH2结构域和CH3结构域的多肽，其中CH2结构域的C末端(直接地或间接地)连接至CH3结构域的N末端。术语“Fc多肽”包括通过二硫键连接至抗体轻链的抗体重链(例如，以形成半抗体)。

如本文所用，术语“CH1结构域”是指抗体重链的第一恒定结构域(例如，根据EU索引，人IgG₁的氨基酸位置118-215)。所述术语包括天然存在的CH1结构域和天然存在的CH1结构域的工程化变体(例如，相对于天然存在的CH1结构域，包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰的CH1结构域)。

如本文所用，术语“CH2结构域”是指抗体重链的第二恒定结构域(例如，根据EU索引，人IgG₁的氨基酸位置231-340)。所述术语包括天然存在的CH2结构域和天然存在的CH2结构域的工程化变体(例如，相对于天然存在的CH2结构域，包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰的CH2结构域)。

如本文所用，术语“CH3结构域”是指抗体重链的第三恒定结构域(例如，根据EU索引，人IgG₁的氨基酸位置341-447)。所述术语包括天然存在的CH3结构域和天然存在的CH2结构域的工程化变体(例如，相对于天然存在的CH3结构域，包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰的CH3结构域)。

如本文所用，术语“铰链区”是指包含半胱氨酸残基(例如，根据EU索引，人IgG₁的氨基酸位置226和229处的半胱氨酸残基)的抗体重链的部分，其介导完整抗体中的两条重链之间的二硫键。所述术语包括天然存在的铰链区和天然存在的铰链区的工程化变体(例如，相对于天然存在的铰链区，包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰的铰链区)。根据EU索引，示例性全长IgG₁铰链区包含人IgG₁的氨基酸位置216-230。

如本文所用，术语“EU索引”是指抗体的恒定区的EU索引惯例，如Edelman,GM.等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)和Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Dept.Health and Human Services,第5版,1991中所描述，其中的每一个以全文引用的方式并入本文。本文使用的Fc多肽或其片段的氨基酸位置的所有编号都是根据EU索引。

如本文所用，术语“抗原结合部分”是指与抗原特异性结合的分子，因为本领域的技术人员理解这种结合。例如，特异性结合至抗原的抗原结合部分通常以较低的亲和力与其他分子结合，如通过例如免疫测定、

KinExA 3000仪器(SapidyneInstruments,Boise,ID)或本领域已知的其他测定所确定。在某些实施方案中，特异性结合至抗原的抗原结合部分以比在分子非特异性结合至另一种抗原时的_A高至少2个对数(例如，10倍)、2.5个对数、3个对数、4个对数或更高的K_A结合抗原。

如本文所用，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段和包含抗体CDR、VH区和/或VL区的分子。抗体的实例包括但不限于单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体(intrabody)、异源缀合物抗体、抗体-药物缀合物、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fvs(scFv)、骆驼化抗体、亲和体(affibody)、Fab片段、F(ab’)₂片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、抗二型(抗Id)抗体(包括例如抗抗Id抗体)和和上述任一种的抗原结合片段。在某些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群体。抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂)或任何亚类别(例如，IgG_2a或IgG_2b)。在某些实施方案中，本文所述的抗体是IgG抗体，或其一类别(例如，人IgG₁或IgG₄)或其亚类别。

如本文所用，术语“VH”和“VL”分别指抗体重链和轻链可变结构域，如Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(NIH公开号91-3242，Bethesda)，其通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“VHH”是指驼科仅重链抗体(HCAb)的重链可变结构域及其人源化变体，如Hamers-Casterman C.等人，Nature(1993)363:446–8.10.1038/363446a0中所描述，其通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“VH/VL对”是指一起形成抗原的结合位点的VH和VL的组合。

如本文所用，术语“重链”在用于指抗体时可以指任何不同的类型，例如α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)和μ(mu)，基于恒定结构域的氨基酸序列，其分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG的亚类，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

如本文所用，术语“全长抗体重链”是指从N至C末端包含VH、CH1区、铰链区、CH2结构域和CH3结构域的抗体重链。

如本文所用，术语“轻链”在用于指抗体时可以指任何不同的类型，例如基于恒定结构域的氨基酸序列的κ(kappa)或λ(lambda)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体实施方案中，抗体轻链是人轻链。

如本文所用，术语“半抗体”指以与完整野生型免疫球蛋白的重链和轻链相同的方式相互连接的抗体重链和抗体轻链。在某些实施方案中，通过还原全长抗体的铰链区的重链间二硫键来产生半抗体。在某些实施方案中，通过在细胞中表达本文公开的Fc多肽来产生半抗体。

5.2异二聚体蛋白

在一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋，其中：所述第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、332和366处的氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且所述第二Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、366、368和407处的氨基酸天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置332处的氨基酸谷氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。在某些实施方案中，第一Fc多肽还包含在氨基酸位置330处的氨基酸亮氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。在某些实施方案中，第一Fc多肽还包含在氨基酸位置330处的氨基酸亮氨酸，并且第二Fc多肽不包含在氨基酸位置330处的氨基酸亮氨酸，其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：所述第一Fc多肽包含在氨基酸位置366处的氨基酸色氨酸，但不包含分别在氨基酸位置239、330和332处的氨基酸天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且所述第二Fc多肽包含：

(a)分别在氨基酸位置366、368和407处的氨基酸丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别在氨基酸位置239、330和332处的氨基酸天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；

(b)分别在氨基酸位置239、330、366、368和407处的氨基酸天冬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置332处的氨基酸谷氨酸；

(c)分别在氨基酸位置330、332、366、368和407处的氨基酸亮氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置239处的氨基酸天冬氨酸；

(d)分别在氨基酸位置239、332、366、368和407处的氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置330处的氨基酸亮氨酸；

(e)分别在氨基酸位置239、366、368和407处的氨基酸天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别在氨基酸位置330和332处的氨基酸亮氨酸和谷氨酸；

(f)分别在氨基酸位置330、366、368和407处的氨基酸亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别在氨基酸位置239和332处的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；

(g)分别在氨基酸位置332、366、368和407处的氨基酸谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别在氨基酸位置239和330处的氨基酸天冬氨酸和亮氨酸；

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：所述第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、330、332和366处的氨基酸天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且所述第二Fc多肽包含：

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：所述第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、330和366处的氨基酸天冬氨酸、亮氨酸和色氨酸，但不包含在氨基酸位置332处的氨基酸谷氨酸；并且所述第二Fc多肽包含：

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置330、332和366处的氨基酸亮氨酸、谷氨酸和色氨酸，但不包含在氨基酸位置239处的氨基酸天冬氨酸；并且第二Fc多肽包含：

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、332和366处的氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸，但不包含在氨基酸位置330处的氨基酸亮氨酸；并且第二Fc多肽包含：

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：所述第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置239和366处的氨基酸天冬氨酸和色氨酸，但不包含分别在氨基酸位置330和332处的氨基酸亮氨酸和谷氨酸；并且所述第二Fc多肽包含：

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置330和366处的氨基酸亮氨酸和色氨酸，但不包含分别在氨基酸位置239和332处的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；并且第二Fc多肽包含：

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

在另一个方面，本公开提供了包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚体蛋白，其中：所述第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置332和366处的氨基酸谷氨酸和色氨酸，但不包含分别在氨基酸位置239和330处的氨基酸天冬氨酸和亮氨酸；并且所述第二Fc多肽包含：

其中氨基酸位置根据EU索引进行编号。

本文所述的Fc多肽通常包含CH2结构域和CH3结构域，其中CH2结构域的C末端(直接地或间接地)连接至CH3结构域的N末端。任何天然存在的或变体CH2和/或CH3结构域都可以用于本文所述的Fc多肽中。例如，在某些实施方案中，CH2和/或CH3结构域是来自IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链，例如人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链的天然存在的CH2或CH3结构域。CH2和CH3结构域可以来自相同或不同的抗体重链。在某些实施方案中，Fc多肽包含来自单个抗体重链的含CH2和CH3结构域的部分。在某些实施方案中，CH2和/或CH3结构域分别是天然存在的CH2或CH3结构域的变体。在某些实施方案中，CH2和/或CH3结构域是分别相对于天然存在的CH2或CH3结构域包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰的变体。在某些实施方案中，CH2和/或CH3结构域分别是一个或多个CH2或CH3结构域的嵌合体。在某些实施方案中，根据EU索引，CH2结构域包含天然存在的铰链区(例如，人IgG₁)的氨基酸位置231-340。在某些实施方案中，根据EU索引，CH3结构域包含天然存在的铰链区(例如，人IgG₁)的氨基酸位置341-447。

在某些实施方案中，本文所述的Fc多肽还包含铰链区，其中铰链区的C末端(直接地或间接地)连接至CH2结构域的N末端。例如，在某些实施方案中，铰链区是来自IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链，例如人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链的天然存在的铰链区。铰链区可以来自与CH2和/或CH3结构域相同或不同的抗体重链。在某些实施方案中，铰链区是分别相对于天然存在的铰链区包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰的变体。在某些实施方案中，铰链区是一个或多个铰链区的嵌合体。在某些实施方案中，根据EU索引，铰链区包含天然存在的铰链区(例如，人IgG₁)的氨基酸位置226-229。在某些实施方案中，根据EU索引，铰链区包含天然存在的铰链区(例如，人IgG₁)的氨基酸位置216-230。在某些实施方案中，根据EU索引，铰链区包含天然存在的铰链区(例如，人IgG₁)的氨基酸位置216-230。在某些实施方案中，根据EU索引，铰链区是包含在氨基酸位置228处的丝氨酸(S)的变体IgG₄铰链区。

在某些实施方案中，本文所述的Fc多肽还包含CH1结构域，其中CH1结构域的C末端(直接地或间接地)连接至铰链区的N末端。例如，在某些实施方案中，CH1结构域是来自IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链，例如人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链的天然存在的CH1结构域。CH1结构域可以来自与铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域相同或不同的抗体重链。在某些实施方案中，CH1结构域是分别相对于天然存在的CH1结构域包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰的变体。在某些实施方案中，CH1结构域是一个或多个CH1结构域的嵌合体。在某些实施方案中，根据EU索引，CH1结构域包含天然存在的铰链区(例如，人IgG₁)的氨基酸位置118-215。

示例性Fc多肽或其部分的氨基酸序列示于本文表1中。

表1.示例性Fc多肽或其部分的氨基酸序列

在某些实施方案中，异二聚体蛋白包含：第一Fc多肽，其包含与SEQ ID NO:24、25、26、27、48、49、50、51、62、63、64或65的氨基酸序列至少75％相同(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列；和/或第二Fc多肽，其包含与SEQ ID NO:36、37、60、61、66或67的氨基酸序列至少75％相同(例如，至少或75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100％相同)的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多核苷酸包含SEQ ID NO:24、25、26、27、48、49、50、51、62、63、64或65的氨基酸序列；和/或第二Fc多核苷酸包含SEQ ID NO:36、37、60、61、66或67的氨基酸序列。可以并入异二聚体蛋白中的第一Fc多肽和第二Fc多肽的示例性氨基酸序列对示于本文表2中。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽分别包含表2任一行的第一和第二列中所示的氨基酸序列。

表2.可以并入第一Fc多肽和第二Fc多肽中的示例性氨基酸序列对

在一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:30、34、36、71、72、73或74的氨基酸序列。

在一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。在另一实施方案中、第一Fc多肽包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。在另一实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66、79、80、81、82、86或87的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含一个或多个抗原结合部分。抗原结合部分可以(直接地或间接地)连接至Fc多肽的任何部分。例如，抗原结合部分可以(直接地或间接地)连接至Fc多肽的N和/或C末端。另外或替代地，抗原结合部分可以在Fc多肽中串联连接在一起。

在某些实施方案中，异二聚体蛋白中的第一Fc多肽和第二Fc多肽各自包含一个或多个抗原结合部分。在此类实施方案中，每个抗原结合部分可以结合至相同或不同的抗原。在某些实施方案中，异二聚体蛋白包含：第一Fc多肽，其包含结合至第一抗原的第一抗原结合部分；和第二Fc多肽，其包含结合至第二抗原的第二抗原结合部分，其中第一和第二抗原是不同的(例如，不同分子或相同分子的不同区)。

可连接至Fc多肽的任何类型的结合部分均适合在本文公开的异二聚体蛋白中使用。在某些实施方案中，结合部分包含抗体可变结构域。包含抗体可变结构域的示例性结合部分包括但不限于VH、VL、VHH、VH/VL对、scFv、双体抗体或Fab。在某些实施方案中，结合部分包含配体。示例性配体包括但不限于激素和生长因子及其类似物和模拟物。在某些实施方案中，结合部分包含细胞表面受体的胞外结构域。示例性细胞表面受体包括但不限于肿瘤坏死因子超家族受体、血管内皮生长因子受体或转化生长因子受体。细胞表面受体的此类胞外结构域是本领域众所周知的，其可用于螯合受体的天然配体。适合在本文所公开的异二聚体蛋白中使用的其他结合部分包括但不限于脂质运载蛋白(参见例如Gebauer M.等人,2012,Method Enzymol503:157–188，其通过引用整体并入本文)、纤连蛋白(adnectin)(参见例如Lipovsek D.,2011,Protein Eng Des Sel 24:3–9，其通过引用整体并入本文)、高亲和性多聚体(avimer)(参见例如Silverman J等人,2005,Nat Biotechnol23:1556–1561，其通过引用整体并入本文)、非诺莫(fynomer)(参见例如Schlatter D等人,2012,mAbs 4:497–508，其通过引用整体并入本文)、kunitz结构域(参见例如Hosse R.J.等人,2006,Protein Sci 15:14–27，其通过引用整体并入本文)、打结素(knottin)(参见例如Kintzing J.R.等人,2016,Curr Opin Chem Biol 34:143–150，其通过引用整体并入本文)、亲和体(参见例如Feldwisch J.等人,2010J Mol Biol 398:232–247，其通过引用整体并入本文)和锚蛋白重复蛋白(DARPin)(参见例如Pluckthun A.,2015,Annu RevPharmacol Toxicol 55:489–511，其通过引用整体并入本文)。

在某些实施方案中，异二聚体蛋白中的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽各自包含抗体重链。抗体重链可以是全长抗体重链或变体抗体重链，其相对于天然存在的全长抗体重链包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或修饰。在某些实施方案中，抗体重链缺少CH1结构域或包含CH1结构域或重链可变结构域中的突变，其防止重链与抗体轻链的缔合。在某些实施方案中，抗体重链缺少铰链区的一部分。

抗体重链的任何物种和同种型可用于本文公开的异二聚体蛋白中。在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链或其变体。在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂抗体重链。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含抗体重链和抗体轻链(例如，人κ或λ轻链)。轻链可以(直接或间接地)连接至抗体重链的任何部分。在某些实施方案中，抗体重链和抗体轻链通过二硫键彼此连接，使得其形成半抗体。

在某些实施方案中，异二聚体蛋白包含：第一Fc多肽，其包含形成第一半抗体的第一抗体重链和第一抗体轻链；和第二Fc多肽，其包含形成第二半抗体的第二抗体重链和第二抗体轻链。第一半抗体和第二半抗体可以结合至相同的抗原或不同的抗原(例如，不同分子或相同分子的不同区)。

在某些实施方案中，本文公开的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽中的任一个的CH3结构域还包含C末端赖氨酸。例如，在某些实施方案中，表1中公开的含CH3结构域的氨基酸序列中的任一个还可以包含CH3结构域的C末端处的赖氨酸。

在某些实施方案中，本文公开的异二聚体蛋白相对于对应的现有技术异二聚体蛋白(例如，多特异性抗体)表现出改善的生物物理特性(例如，表达水平、溶解度、热稳定性、可制造性和/或免疫原性)。在某些实施方案中，本文公开的异二聚体蛋白表现出改善的热稳定性和可制造性。

5.3药物组合物

本文提供了包含异二聚体蛋白的组合物，所述异二聚体蛋白在生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂中具有所需的纯度(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且包括包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐以及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chlorid)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

在一具体实施方案中，药物组合物在药学上可接受的载体中包含本文公开的异二聚体蛋白和任选的一种或多种另外的预防剂或治疗剂。在一具体实施方案中，药物组合物在药学上可接受的载体中包含有效量的本文所述的异二聚体蛋白和任选的一种或多种另外的预防剂或治疗剂。在某些实施方案中，异二聚体蛋白是包括于药物组合物中的唯一活性成分。本文所述的药物组合物可用于治疗病症，例如癌症或感染性疾病。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物，其包含用作药剂的本发明的异二聚体蛋白。在另一实施方案中，本发明涉及一种用于用于在治疗癌症或感染性疾病的方法中使用的本发明的药物组合物。

用于肠胃外制剂中的药学上可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequestering/chelating agent)和其他药学上可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格氏注射液(Lactated Ringers Injection)。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂添加到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述多剂量容器包括苯酚或甲酚、汞、苄醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞(thimerosal)、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(

80)。金属离子的螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水可混溶媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。

药物组合物可以针对受试者的任何施用途径进行配制。施用途径的具体实例包括鼻内、口服、经肺、透皮、皮内和肠胃外。本文还考虑了以皮下、肌内或静脉内注射为特征的肠胃外施用。可注射物可以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液、适用于在注射之前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式，或作为乳液。可注射物、溶液和乳液也含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，待施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂和其他此类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。

用于异二聚体蛋白的肠胃外施用的制剂包括：准备用于注射的无菌溶液；准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产物，例如冻干粉，包括皮下注射片剂；准备用于注射的无菌悬浮液；准备在使用前与媒介物组合的无菌干燥不溶性产物；和无菌乳剂。溶液可以是水性或非水性的。

如果静脉内施用，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。

如针对局部和全身施用所述，制备包含异二聚体蛋白的局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，并且可以配制成乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、膏剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或适合于局部施用的任何其他配方。

本文公开的异二聚体蛋白可以配制成用于局部施加的气雾剂，例如通过吸入(参见例如，美国专利第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号，其描述了用于递送可用于治疗发炎性疾病，特别是哮喘的类固醇的气雾剂并且通过引用整体并入本文)。用于施用至呼吸道的这些配方可以呈用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式，或作为用于吹入的微细粉末，单独或与惰性载体(例如乳糖)组合。在此类情况下，配方的颗粒在一个实施方案中将具有小于50微米的直径，在一个实施方案中小于10微米的直径。

本文公开的异二聚体蛋白可以被配制以凝胶、乳膏和洗剂的形式用于局部或局部施加，例如用于局部施加于皮肤和粘膜，例如在眼睛中，以及用于施加于眼睛或用于脑池内或脊柱内施加。考虑局部施用用于透皮递送并且也用于施用于眼睛或粘膜，或用于吸入疗法。还可施用仅异二聚体蛋白或与其他药学上可接受的赋形剂组合的鼻用溶液。

包括离子电泳和电泳装置的透皮贴片是本领域技术人员众所周知的，并且可用于施用异二聚体蛋白。例如，此类贴片公开于美国专利第6,267,983,6,261,595,6,256,533,6,167,301,6,024,975,6,010715,5,985,317,5,983,134,5,948,433号和第5,860,957号中，所述专利全部通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，包含本文所述的异二聚体蛋白的药物组合物是冻干粉末，其可以重构以作为溶液、乳液和其他混合物施用。其还可重构且配制为固体或凝胶。通过将本文所述的异二聚体蛋白或其药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中来制备冻干粉末。在某些实施方案中，冻干粉末是无菌的。溶剂可含有赋形剂，其改善由粉末制备的粉末或重构溶液的稳定性或其他药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的试剂。在一个实施方案中，溶剂还可以含有本领域技术人员已知的约中性pH的缓冲剂，例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其他此类缓冲剂。随后对溶液进行除菌过滤，随后在本领域技术人员已知的标准条件下进行冻干，提供了所需配方。在一个实施方案中，将所得溶液分配到小瓶中以用于冻干。每瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可存储在适当条件下，例如约4℃至室温。用注射用水重构这种冻干粉末提供了用于肠胃外施用的配方。为了重构，将冻干粉末添加至无菌水或其他合适的载体中。精确量取决于所选择的化合物。此量可以凭经验确定。

本文提供的异二聚体蛋白和其他组合物还可以配制成靶向待治疗的受试者的身体的特定组织、受体或其他区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员众所周知的。本文考虑用于本发明的组合物中的所有此类靶向方法。对于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利第6,316,652,6,274,552,6,271,359,6,253,872,6,139,865,6,131,570,6,120,751,6,071,495,6,060,082,6,048,736,6,039,975,6,004,534,5,985,307,5,972,366,5,900,252,5,840,674,5,759,542号和第5,709,874号，所述专利全部通过引用整体并入本文。在一具体实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白靶向肿瘤。

用于体内施用的组合物可以是无菌的。这容易通过过滤，例如无菌过滤膜来实现。

5.4多核苷酸、载体和产生异二聚体蛋白的方法

在另一个方面，本文提供了包含编码本文所述的Fc多肽的核苷酸序列的多核苷酸，和载体，例如包含用于在宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)和哺乳动物细胞)中重组表达的此类多核苷酸的载体。本文提供了包含编码本文提供的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸序列的载体，例如用于在宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)中有效表达的表达载体。

如本文所用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源(例如，在小鼠或人中)中的其他核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)在通过重组技术产生时可基本上不含其他细胞材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。例如，语言“基本上不含”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是小于约10％)的其他材料，例如细胞材料、培养基、其他核酸分子、化学前体和/或其他化学物质的多核苷酸或核酸分子的制剂。在一具体实施方案中，分离或纯化编码本文所述的Fc多肽的核酸分子。

在具体方面，本文提供了包含编码Fc多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在某些方面，本文提供了包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的核苷酸序列的多核苷酸。

本文还提供了编码Fc多肽的多核苷酸，其例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列替换以及消除mRNA不稳定性元件而被优化。通过在mRNA中引入密码子改变和/或消除抑制性区来产生编码用于重组表达的Fc多肽的优化核酸的方法可以通过采用例如美国专利第5,965,726号；第6,174,666号；第6,291,664号；第6,414,132号；和第6,794,498号中所描述的优化方法来进行，因此，所有这些文献通过引用整体并入本文。例如，RNA内的潜在剪接位点和不稳定元件(例如，富含A/T或A/U的元件)可以突变，而不改变由核酸序列编码的氨基酸，以增加用于重组表达的RNA的稳定性。改变利用遗传密码的简并性，例如，使用相同氨基酸的替代密码子。在某些实施方案中，可能需要改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如具有相似化学结构和特性和/或充当原始氨基酸的类似氨基酸。相对于由未优化的多核苷酸编码的Fc多蛋白的表达，此类方法可使Fc多蛋白的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍。

在某些实施方案中，编码Fc多肽的优化多核苷酸序列可以与编码本文所述的Fc多肽的未优化多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。在具体实施方案中，编码本文所述的Fc多肽的优化核苷酸序列在高严格性条件下与编码本文所述的Fc多肽的未优化多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在一具体实施方案中，编码本文所述的Fc多肽的优化核苷酸序列在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文所述的Fc多肽的未优化核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。已描述关于杂交条件的信息，参见例如美国专利申请公开第US 2005/0048549号(例如，第72-73段)，其通过引用整体并入本文。

多核苷酸可通过本领域已知的任何方法获得，并且确定多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述的Fc多肽和这些Fc多肽的修饰型式的核苷酸序列可使用本领域众所周知的方法来确定，即已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码Fc多肽的核酸的方式进行组装。编码Fc多肽的此类多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier G等人，(1994),BioTechniques 17:242-6中所述，通过引用整体并入本文)，简言之涉及合成含有编码Fc多肽的序列的部分的重叠寡核苷酸，使那些寡核苷酸退火和接合，然后通过PCR扩增接合的寡核苷酸。

或者，编码本文所述的Fc多肽的多核苷酸可以使用本领域众所周知的方法(例如，PCR和其他分子克隆方法)由来自合适来源的核酸产生。PCR扩增方法可以用于获得包含编码异二聚体蛋白的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达并且用于进一步的克隆。

如果含有编码特定Fc多肽的核酸的克隆不可用，但Fc多肽分子的序列是已知的，那么编码Fc多肽的核酸可以通过使用可与序列的3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增或通过使用对于特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆而化学合成或从合适来源获得(例如，从表达Fc多肽的任何组织或细胞产生的cDNA文库，或从表达Fc多肽的任何组织或细胞分离的核酸，优选poly A+RNA)，以鉴定例如来自编码Fc多肽的cDNA文库的cDNA克隆。然后，可使用本领域已知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。

编码本文所述的Fc多肽的DNA可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码异二聚体蛋白的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。一旦分离后，可以将DNA置于表达载体中，其随后被转染到宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞)或不另外产生Fc多肽的骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得Fc多肽的合成。

还提供了在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文所述的Fc多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。在具体实施方案中，本文所述的多核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文提供的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的多核苷酸杂交。

杂交条件已描述于本领域中并且是本领域技术人员已知的。例如，在严格条件下的杂交可以涉及在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交至过滤结合的DNA，然后在约50-65℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中进行一次或多次洗涤；在高度严格条件下的杂交可以涉及在约45℃下在6xSSC中杂交至过滤结合的核酸，然后在约68℃下在0.1xSSC/0.2％SDS中进行一次或多次洗涤。在其他严格杂交条件下的杂交是本领域技术人员已知的并且已经描述于参见例如Ausubel FM等人编,(1989)Current Protocols in Molecular Biology,第I卷,Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York,第6.3.1-6.3.6和2.10.3页，其通过引用整体并入本文。

在某些方面，本文提供了表达(例如，重组)本文所述的Fc多肽和相关多核苷酸和表达载体的细胞(例如，宿主细胞)。本文提供了包含多核苷酸的载体(例如，表达载体)，所述多核苷酸包含编码用于在宿主细胞、优选哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)中进行重组表达的Fc多肽的核苷酸序列。本文还提供了包含用于重组表达本文所述的Fc多肽的此类载体的宿主细胞。在一具体方面，本文提供了用于产生本文所述的Fc多肽的方法，其包括从宿主细胞中表达此类Fc多肽。

本文所述的Fc多肽的重组表达通常涉及构建含有编码Fc多肽的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码本文所述的Fc多肽的多核苷酸，那么可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术产生用于产生Fc多肽分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的Fc多肽的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建含有Fc多肽编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了包含编码可操作地连接至启动子的本文所述的Fc多肽的核苷酸序列的可复制载体。

表达载体可以通过常规技术转移到细胞(例如，宿主细胞)，并且所得细胞随后可以通过常规技术培养以产生本文所述的Fc多肽。因此，本文提供了含有多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码可操作地连接至启动子以在宿主细胞中表达此类序列的本文所述的Fc多肽。在某些实施方案中，分别编码异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽两者的载体可以在宿主细胞中共表达以用于表达整个异二聚体蛋白，如下文详述。在某些实施方案中，宿主细胞含有载体，所述载体包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽两者的多核苷酸。在具体实施方案中，宿主细胞含有两种不同的载体，即包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的多核苷酸的第一载体和包含编码异二聚体蛋白的第二Fc多肽的多核苷酸的第二载体。在某些实施方案中，宿主细胞包含以下四种载体：第一载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第一半抗体的第一抗体重链的多核苷酸；第二载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第二半抗体的第二抗体重链的多核苷酸；第三载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第一半抗体的第一抗体轻链的多核苷酸；和第四载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第二半抗体的第二抗体轻链的多核苷酸。在某些实施方案中，分别编码第一半抗体的第一抗体重链、第二半抗体的第二抗体重链、第一半抗体的第一抗体的第一抗体轻链和第二半抗体的第二抗体的第二抗体轻链的载体可以在宿主细胞中共表达以产生异二聚体蛋白。

在其他实施方案中，第一宿主细胞包含含有编码本文所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的多核苷酸的第一载体，并且第二宿主细胞包含含有编码本文所述的异二聚体蛋白的第二Fc多肽的多核苷酸的第二载体。在具体实施方案中，由第一细胞表达的第一Fc多肽与第二细胞的第二Fc多肽缔合，以形成本文所述的异二聚体蛋白。在某些实施方案中，第一宿主细胞包含：第一载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第一半抗体的第一抗体重链的多核苷酸；和第二载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第一半抗体的第一抗体轻链的多核苷酸，并且第二宿主细胞包含：第三载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第二半抗体体的第二抗体重链的多核苷酸，和第四载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白的第二半抗体的第二抗体轻链的多核苷酸。在某些实施方案中，由第一细胞表达的第一半抗体与第二细胞的第二半抗体缔合，以形成本文所述的异二聚体蛋白。在某些实施方案中，本文提供了包含此类第一宿主细胞和此类第二宿主细胞的宿主细胞群体。

可以使用多种宿主表达载体***来表达本文所述的Fc多肽(参见例如美国专利第5,807,715号，其通过引用整体并入本文)。此类宿主表达***表示可产生并随后纯化所关注的编码序列的媒介物，但还表示在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文所述的异二聚体蛋白分子的细胞。这些包括但不限于微生物，例如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，其用例如含有异二聚体蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化；酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))，其用用例如含有异二聚体蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞***，用例如含有异二聚体蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒(baculovirus))感染；植物细胞***(例如绿藻，例如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))，用例如重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus)，TMV)或用例如含有异二聚体蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化；或哺乳动物细胞***(例如，COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)，其具有例如重组表达构建体，所述构建体包含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。在一具体实施方案中，用于表达本文所述的异二聚体蛋白的细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在一特定实施方案中，用于表达本文所述的异二聚体蛋白的细胞是人细胞，例如人细胞系。在一具体实施方案中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一特定实施方案中，细菌细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞)用于表达异二聚体蛋白。例如，哺乳动物细胞(例如CHO细胞)连同载体(例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)是蛋白质(例如抗体)的有效表达***(Foecking MK&Hofstetter H(1986)Gene45:101-5；和Cockett MI等人,(1990)Biotechnology 8(7):662-7，其各自通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白由CHO细胞或NS0细胞产生。在一具体实施方案中，本文所述的编码异二聚体蛋白的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。

在细菌***中，可以根据预期用于所表达的异二聚体蛋白的用途而有利地选择多种表达载体。例如，当为了产生异二聚体蛋白的药物组合物而生产大量此类蛋白质时，指导易于纯化的高水平融合蛋白产物的表达的载体可能是理想的。此类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U&Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794)，其中蛋白质编码序列可以与lac Z编码区一起框内单独地接合到载体中以使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S&Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13:3101-3109；Van Heeke G&SchusterSM(1989)J Biol Chem 24:5503-5509)；等等，所有这些文献均通过引用整体并入本文。例如，pGEX载体还可以用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过通过吸附并结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而容易地从裂解细胞纯化。pGEX载体被设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分中释放。

例如，在昆虫***中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus；AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。蛋白质编码序列可以单独克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白(polyhedrin)基因)中并处于AcNPV启动子(例如聚多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达***。在腺病毒用作表达载体的情况下，所关注的蛋白质编码序列可以接合至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三方前导序列。然后，可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因***腺病毒基因组中。***病毒基因组的非必需区(例如，区El或E3)将产生重组病毒，所述重组病毒是可存活的并且能够在感染的宿主中表达异二聚体蛋白(例如，参见Logan J&Shenk T(1984)PNAS81(12):3655-9，其通过引用整体并入本文)。对于***的蛋白质编码序列的有效翻译，也可能需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的读框同相，以确保整个***物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，包括天然的和合成的。可以通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强表达效率(参见例如Bitter G等人,(1987)Methods Enzymol.153:516-544，其通过引用整体并入本文)。

另外，可以选择调节***序列的表达，或以所需的特定方式修饰和处理基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和处理(例如裂解)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后处理和修饰的特征和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主***以确保所表达的外来蛋白质的正确修饰和处理。为此，可以使用真核宿主细胞，其具有用于适当处理基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(一种不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白在哺乳动物细胞，例如CHO细胞中产生。

在一具体实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白具有减少的岩藻糖含量或无岩藻糖含量。此类蛋白质可以使用本领域技术人员已知的技术产生。例如，本文所述的Fc多肽可以在缺乏或缺少岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一具体实例中，基因敲除具有α1,6-岩藻糖转移酶的两个等位基因的细胞系可用于产生岩藻糖含量降低的Fc多肽。

***(Lonza)是可用于产生岩藻糖含量降低的Fc多肽的此类***的实例。

对于重组蛋白的长期高产率生产，可以产生稳定的表达细胞。例如，可以工程化稳定表达本文所述的Fc多肽的细胞系。在具体实施方案中，本文提供的细胞稳定地表达缔合以形成本文所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽。在某些实施方案中，本文提供的第一细胞稳定地表达第一Fc多肽，并且本文提供的第二细胞稳定地表达第二Fc多肽。在某些实施方案中，由第一细胞表达的第一Fc多肽与第二细胞的第二Fc多肽缔合，以形成本文所述的异二聚体蛋白。

在某些方面，不使用含有复制的病毒起源的表达载体，宿主细胞可以用通过适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标记进行转化。在引入外源DNA/多核苷酸后，工程化的细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其的染色体中并生长以形成病灶，所述病灶又可被克隆并扩增到细胞系中。所述方法可以有利地用于工程化表达本文所述的Fc多肽的细胞系。此类工程化的细胞系在筛选和评估与Fc多肽直接或间接相互作用的组合物中特别有用。

可以使用许多选择***，包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)Cell 11(1):223-32)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska EH&Szybalski W(1962)PNAS 48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy I等人,(1980)Cell 22(3):817-23)，所有这些文献均通过引用整体并入本文。此外，抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性(Wigler M et al.,(1980)PNAS 77(6):3567-70；O’Hare K et al.,(1981)PNAS 78:1527-31)；gpt，其赋予对霉酚酸(mycophenolic acid)的抗性(Mulligan RC&Berg P(1981)PNAS 78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷类(aminoglycoside)的抗性(G-418(Wu GY&Wu CH(1991)Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573-596；Mulligan RC(1993)Science 260:926-932；and Morgan RA&Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62:191-217；Nabel GJ&Felgner PL(1993)Trends Biotechnol 11(5):211-5)；和hygro，其其赋予对潮霉素(hygromycin)的抗性(Santerre RF等人,(1984)Gene30(1-3):147-56)，所有这些文献均通过引用整体并入本文。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以常规地应用于选择所需重组克隆，并且此类方法例如在Ausubel FM et al.,(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler M,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；和第12章和第13章中描述Dracopoli NC et al.,(eds.),Current Protocols inHuman Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colbère-Garapin F et al.,(1981)J MolBiol 150:1-14，所有这些文献均通过引用整体并入本文。

蛋白质的表达水平可以通过载体扩增来增加(关于综述，参见Bebbington CR&Hentschel CCG,The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(AcademicPress,New York,1987)，其通过引用整体并入本文)。当表达Fc多肽的载体***中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增区与Fc多肽基因缔合，因此Fc多肽的产生也将增加(Crouse GF等人,(1983)Mol CellBiol 3:257-66，其通过引用整体并入本文)。

宿主细胞可以用本文所述的两种或更多种表达载体共转染，所述表达载体是编码第一Fc多肽的第一载体和编码第二Fc多肽的第二载体。所述两种载体可以含有相同的选择性标记，其使得第一Fc多肽和第二Fc多肽能够同等表达。宿主细胞可以用不同量的两种或更多种表达载体共转染。例如，宿主细胞可以用第一表达载体和第二表达载体的以下比率中的任一种转1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,1:10,1:12,1:15,1:20,1:25,1:30,1:35,1:40,1:45或1:50。

或者，可以使用编码异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽并且能够表达其的单一载体。第一Fc多肽和第二Fc多肽的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可以编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基因/核苷酸序列，或在2-5、5-10或10-20个基因/核苷酸序列的范围内。例如，双顺反子核酸构建体可以按以下顺序包含启动子、第一基因(例如，本文所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽)、第二基因和(例如，本文所述的异二聚体蛋白的第二Fc多肽)。在此表达载体中，两个基因的转录都可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以由cap依赖性扫描机制驱动，并且来自第二基因的mRNA的翻译可以由cap非依赖性机制，例如通过IRES驱动。

一旦本文所述的异二聚体蛋白或Fc多肽已通过重组表达产生，就可以通过本领域已知的用于蛋白质纯化的任何方法对其进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和分级柱色谱法)、离心、差别性溶解或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术纯化。此外，本文所述的异二聚体蛋白和Fc多肽可以融合至本文所述的或本领域已知的异源多肽序列，以促进纯化。

在具体实施方案中，分离或纯化本文所述的异二聚体蛋白或Fc多肽。通常，分离的蛋白质是基本上不含其他蛋白质的蛋白质。例如，在一特定实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白或Fc多肽的制备基本上不含细胞材料和/或化学前体。语言“基本上不含细胞材料”包括蛋白质制剂，其中蛋白质从分离或重组产生其的细胞的细胞成分中分离。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白质(本文也称为“污染蛋白质”)和/或蛋白质变体(例如，蛋白质的不同翻译后修饰形式或蛋白质的其他不同型式(例如，蛋白质片段))的蛋白质制剂。当重组产生蛋白质时，其通常也基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当蛋白质通过化学合成产生时，其通常基本上不含化学前体或其他化学物质，即其与化学前体或参与蛋白质合成的其他化学物质分离。因此，除所关注的蛋白质以外，此类蛋白质制剂具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或化合物。在一具体实施方案中，分离或纯化本文所述的异二聚体蛋白和Fc多肽。

本文所述的异二聚体蛋白和Fc多肽可以通过本领域已知的用于合成蛋白质的任何方法，例如通过化学合成或通过重组表达技术产生。除非另有说明，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域内的相关领域中的常规技术。这些技术例如在本文引用的参考文献中描述，并且在文献中充分解释。参见例如Maniatis T et al.,(1982)MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J etal.,(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Sambrook J et al.,(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987年和年度更新)Gait(ed.)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(ed.)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRLPress；Birren B et al.,(eds.)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,，所有这些文献均通过引用整体并入本文。

6.实施例

实施例通过说明提供而非限制。

6.1实施例1：Fc多肽的合成和异二聚化

本实施例描述了对靶标1或靶标2具有特异性的Fc多肽(存在于人T细胞表面上的两种不同抗原)的合成和异二聚化。

6.1.1Fc多肽合成

在CHO细胞中表达十二种Fc多肽(各自包含对靶标1或靶标2具有特异性的半抗体)，并且使用蛋白质A亲和色谱法(GE Healthcare)纯化。表3中描述了十二种Fc多肽中的每一种的抗原结合部分的结合特异性和重链恒定区的氨基酸序列。

表3：Fc多肽

*这些重链恒定区中的每一个的核酸编码序列包括C末端处的赖氨酸。

测量并比较Fc多肽编号4、5、2、10、11和8的蛋白质表达水平。如图1所示，相对于测试的其他Fc多肽，Fc多肽4和10(其含有S239D/A330L/I332E突变和T366S/L368A/Y407V突变两者)以可忽略的水平表达。

6.1.2Fc多肽的异二聚化

表3中所示的Fc多肽异二聚化以形成表4中所描述的异二聚体蛋白。简言之，在50mM还原剂(2-MEA)的存在下，将表4中所示的第一Fc多肽和第二Fc多肽以等摩尔量混合至少2小时，以还原重链间二硫键。然后使用脱盐PD-10柱将Fc多肽的混合物缓冲液交换到再氧化缓冲液(10mM柠檬酸钠pH 6.0，115mM NaCl)中以去除还原剂，并且在室温下孵育24小时以促进第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚化。然后将所得Fc多肽混合物缓冲液交换至存储缓冲液(10mM组氨酸pH 6和115mM NaCl)中。通过SDS-PAGE和二聚体形成确定纯度和质量，并且通过绝对尺寸排阻色谱法(ASEC)评估异二聚化百分比。

表4：异二聚体蛋白

6.1.3热稳定性

评估异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113、BA114、BA115、BA116、BA117和BA118的热稳定性。将1μl的Sypro橙色荧光染料(5x最终Sypro浓度)添加到稀释于PBS中的4μg蛋白质中。使用在10℃至95℃下开始的热升温(thermal ramp)，在热循环仪(Biorad CFX96 Real-Time System C1000 PCR检测***)上分析Sypro Orange荧光，并且在CFX Maestro软件上分析蛋白质热偏移。在prism中创建条形图。

图2A显示了抗靶标1异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113和BA114的熔融温度。BA114的熔融温度低于BA111、BA112或BA113。

图2B显示了抗靶标2异二聚体蛋白BA115、BA116、BA117和BA118的熔融温度。BA118的熔融温度低于BA115、BA116或BA117。

6.2实施例2：靶标结合

本实施例显示了表4中所示的异二聚体蛋白结合其预期靶标的能力。

6.2.1靶标1

评估异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113、BA114、同二聚体蛋白BA119(WT IgG₁)和IgG₁同种型对照抗体结合至靶标1的能力。

简言之，将工程化以表达人靶标1的Jurkat细胞的冷冻等分试样在37℃下解冻，并且在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中在37℃和5％CO2下培养过夜。使用Muse装置(Luminex Corp.)通过将20μl细胞等分试样与380μl存活力染料混合，对细胞进行计数并评估其存活力。然后通过以1500rpm离心五分钟沉淀细胞，并且在补充有2％FBS(FACS缓冲液)的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再悬浮至1×10⁶细胞/毫升的最终浓度。将细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在96孔U底组织培养板中，并且用FACS缓冲液洗涤两次。

将异二聚体蛋白在FACS缓冲液中以1:10连续稀释，总共8次工作稀释，范围从50g/ml至0.000005g/ml。将细胞再悬浮于50μl异二聚体蛋白溶液中，并且在4℃下孵育30分钟。

为了检测异二聚体蛋白结合，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且再悬浮于含有呈1:200最终稀释度的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG(H+L)二抗的FACS缓冲液和呈1:1000最终稀释度的活/死染色溶液中。然后将细胞在4℃下孵育30分钟，用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且通过流式细胞术(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析。使用FlowJo(第10版，FLOWJO)软件通过依次选通FSC-A与SSC-A、SSC-H与SSC-A和SSC-A与活-死来分析数据。计算FITC染色的平均荧光强度(MFI)值，并且使用GraphPad Prism软件(第7版，GraphPad Software Inc.)对数据作图。

如图3中所示，BA111、BA112、BA113、BA114和BA119显示出与表达靶标1的细胞的强效和相当的结合。

6.2.2靶标2

评估异二聚体蛋白BA115、BA116、BA117、BA118、同二聚体蛋白BA120(WT IgG₁)和IgG₁同种型对照抗体结合靶标2的能力。

简言之，将工程化以表达人靶标2的CHO细胞的冷冻等分试样在37℃下解冻，并且在补充有10％胎牛血清(FBS)的F-12培养基中在37℃和5％CO2下培养过夜。使用Vi-XCell装置对细胞进行计数并评估其存活力。然后通过以1500rpm离心五分钟沉淀细胞，并且在补充有2％FBS(FACS缓冲液)的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再悬浮至1×10⁶细胞/毫升的最终浓度。将细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在96孔U底组织培养板中，并且用FACS缓冲液洗涤两次。

将异二聚体蛋白在FACS缓冲液中以1:3连续稀释，总共8次工作稀释，范围从30μg/ml至0.013717μg/ml。将细胞再悬浮于50μl异二聚体蛋白溶液中，并且在4℃下孵育30分钟。

为了检测异二聚体蛋白结合，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且再悬浮于含有呈1:200最终稀释度的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG(H+L)二抗的FACS缓冲液和呈1:1000最终稀释度的活/死染色溶液中。然后将细胞在4℃下孵育30分钟，用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且通过流式细胞术(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析。使用FlowJo软件通过依次选通FSC-A与SSC-A、SSC-H与SSC-A和SSC-A与活-死来分析数据。计算FITC染色的平均荧光强度(MFI)值，并且使用GraphPad Prism软件对数据作图。

如图4中所示，BA115、BA116、BA117、BA118和BA120显示出与表达靶标2的细胞的强效和相当的结合。

6.3实施例3：靶标阻断

本实施例展示了表4中所示的异二聚体蛋白阻断表达其预期靶标的细胞中的信号传导的能力。

6.3.1靶标1

使用Jurkat报告基因测定评估异二聚体蛋白BA111、BA112、BA113、BA114、同型蛋白BA119(WT IgG₁)和IgG₁同种型对照抗体通过结合靶标1阻断信号传导的能力。

简言之，根据制造商的方案，将工程化以表达具有荧光素酶报告基因的人靶标1的人T细胞系(Jurkat)接种在96孔平底白板中，并且用BA111、BA112、BA113、BA114、BA119和IgG₁同型对照抗体的剂量滴定处理，在培养基中以1:2.5从50μg/ml连续稀释至0.015μg/ml，所述荧光素酶报道基因由可对TCR活化和抑制活化的抑制性共受体信号传导(Promega)两者作出反应的天然启动子驱动。为了评估所示异二聚体蛋白的功能活性，在37℃和5％CO2下，将工程化以表达靶标1的天然配体的CHO-K1细胞和被设计成以抗原非依赖性方式活化T细胞受体(TCR)复合物的工程化细胞表面蛋白与经异二聚体蛋白处理的Jurkat报告细胞系共培养6小时。为了评估异二聚体蛋白阻断靶标1与其天然配体的相互作用并增强T细胞活化基因活性的能力，使用Bio-GloTM试剂和Envision板读取光度计定量荧光素酶表达。

如图5中所示，细胞系的共培养导致靶标1(在Jurkat细胞上表达)的抑制性共受体与其天然配体CD80和CD86(在Raji细胞上表达)的接合，其抑制T细胞活化，如通过缺少荧光素酶表达所示。在添加增加浓度的BA111、BA112、BA113、BA114或同二聚体蛋白BA119后，这种抑制得到缓解。BA111、BA112、BA113、BA114和BA119在增强的T细胞活化方面在功能上相当，如通过IL-2报告基因活性所确定。

6.3.2靶标2

使用Jurkat报告基因测定评估异二聚体蛋白BA115、BA116、BA117、BA118、同型蛋白BA120(WT IgG₁)和IgG₁同种型对照抗体通过结合靶标2阻断信号传导的能力。

简言之，将内源性表达靶标2的抑制性共受体的人T细胞系(Jurkat)工程化为组成性表达细胞表面靶标2和由IL-2启动子(Promega)驱动的荧光素酶报告基因。根据制造商的方案，将细胞接种在96孔平底白板中，并且用所示抗靶标2异二聚体蛋白或同种型对照IgG₁抗体的剂量滴定处理。将异二聚体蛋白在培养基中以1:2.5连续稀释，浓度范围为50μg/ml至0.015μg/ml。根据制造商的说明书制备内源性表达靶标2的天然配体并且工程化以表达专有T细胞活化子的抗原呈递细胞系(Raji)，并且在37℃和5％CO2下与经异二聚体蛋白处理的Jurkat细胞共培养6小时。为了评估异二聚体蛋白阻断靶标2相互作用并增强IL-2报告基因活性的能力，使用Bio-GloTM试剂和Envision板读取光度计来定量荧光素酶表达。

如图6中所示，细胞系的共培养导致靶标2(在Jurkat细胞上表达)的抑制性共受体与其天然配体(在Raji细胞上表达)的接合，其抑制T细胞活化，如通过缺少荧光素酶表达所示。在添加增加浓度的BA115、BA116、BA117、BA118或同二聚体蛋白BA120后，这种抑制得到缓解。BA115、BA116、BA117、BA118和BA120在增强的T细胞活化方面在功能上相当，如通过IL-2报告基因活性所确定。

6.4实施例4：SEA刺激测定

本实施例展示了异二聚体蛋白通过SEA刺激的PBMC引发IL-2分泌的能力。

6.4.1靶标1

研究了对靶标1具有特异性的异二聚体蛋白通过SEA刺激的PBMC引发IL-2分泌的能力。

简言之，在1.2mL子弹管中制备足以供每个供体进行三次重复的5×浓缩的异二聚体蛋白中间储备液。首先，在R10培养基中制备420μL的500μg/mL的每种异二聚体蛋白。然后将异二聚体蛋白以1∶10连续稀释，总共8次稀释，然后将20μl异二聚体蛋白混合物添加至圆底96孔板的相应孔中。从液氮中取出人PBMC的冷冻等分试样，并且立即在37℃水中解冻。将细胞转移到9mL预热的R10培养基中，并且立即以2000rpm离心两分钟。然后将细胞计数，并且评估存活力。将细胞以2000rpm离心两分钟，并且再悬浮。

通过将10μL的10μg/mL的SEA稀释于90μL的R10中来制备中间储备液浓度的SEA，以制备1μg/mL的中间浓度。为了刺激细胞，将35μL的1μg/mL的SEA中间储备液添加至28mL细胞中。将80μL的细胞和SEA混合物添加至相应孔中，并且在37℃和5％CO₂的潮湿腔室中孵育四天。使用总共0.1×10⁶个细胞/孔和最终浓度为1ng/mL的SEA。

在孵育四天后，从孵育箱中取出平板，手动轻轻搅动，然后以2000rpm离心两分钟。将5μL上清液转移到384孔AlphaLISA板(Perkin Elmer)中以进行细胞因子分析。AlphaLISA试剂盒用于根据制造商说明书测量IL-2。简言之，通过将2.5mL的10×AlphaLISA免疫测定缓冲液添加至22.5mL水中来制备测定缓冲液。使用人IL-2分析物根据制造商说明书制备标准稀释液。在测定缓冲液中制备1.6×AlphaLISA抗IL-2受体珠粒和生物素化抗体抗IL-2混合物的混合物。8μL添加到每个孔中并在室温下避光孵育，以500rpm旋转90分钟。在测定缓冲液中制备2.3×链霉亲和素供体珠粒中间物储备液。10μL添加到每个孔中并在室温下避光孵育，以500rpm旋转20分钟。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。使用AlphaScreen方案在EnVision板读取器测量相对光单位(RLU)。

如图7A-7P中所示，BA113以剂量依赖性方式有效地增强IL-2分泌，这与参考同二聚体蛋白2相当的，也对靶标1具有特异性。与BA112和BA111相比，BA113显示出优异的功能活性。BA111在用包含S239D/A330L/I332E突变(“Fc增强”)的同二聚体同种型对照蛋白处理的细胞上不诱导显著水平的IL-2分泌，并且用作同种型对照。与BA113相比，BA114在增强IL-2分泌方面显示明显降低的效力。图7A-7P中呈现的结果使用来自3个不同供体，即供体1(图7A-7D和图7I-7L)、供体2(图7E-7H)和供体3(图7M-7P)的PBMC获得。

6.4.2靶标2

研究了对于靶标2具有特异性的异二聚体蛋白通过SEA刺激的PBMC引发IL-2分泌的能力。

如以上实例6.4.1所述，利用BA115、BA116、BA117、BA118和参考同二聚体蛋白1进行实验。使用包含S239D/A330L/I332E突变(“Fc增强”)的同二聚体同种型蛋白作为同种型对照。

如图8A-8X中所示，与BA116和BA115以及参考同二聚体蛋白1相比，BA117以剂量依赖的方式有效地增强IL-2分泌并表现出更优异的功能活性，也对靶标2具有特异性。与BA117、BA118或BA116相比，BA115显示明显降低的效力。BA115和BA118变体在增强来自SEA刺激的PBMC供体的IL-2分泌方面显示出相当的功能活性。

6.5实施例5：Fc结合

6.5.1FcγRIIIA(CD16)结合

6.5.1.1靶标1

使用细胞结合测定评估BA111、BA112、BA113和BA114结合FcγRIIIA的能力。

简言之，从冷冻解冻表达hFcγRIIIA(V/V)或hFcγRIIIA(F/F)的CHO细胞，并且以4x10⁶个细胞/毫升的密度再悬浮于5ml FACS缓冲液(DPBS、BSA 0.5％、Azide 0.05％)中。将细胞以2x10⁵个细胞/孔的密度分配在96孔U底组织培养板中，然后在4℃下与在FACS缓冲液中稀释的浓度为60μg/mL至7ng/mL的BA111、BA112、BA113和BA114的系列稀释液一起孵育45分钟。对于抗体染色，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且以1:800稀释度再悬浮于含有山羊抗人IgG-PE(F(ab)2抗Fc)(JIR，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在4℃下孵育45分钟后，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且通过流式细胞术(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。通过FlowJo软件通过依次选通FSC-A与SSC-A、SSC-H与SSC-A和计数与PE来分析数据。计算几何平均荧光强度(gMFI)值，并且通过GraphPad Prism软件对数据作图。数据来自三个单独的实验；误差条表示平均值的标准误差。

如图9A和9B所示，BA112、BA113和BA114结合至在CHO细胞上表达的FcγRIIIA V/V(图9A)和F/F(图9B)。与BA111相比，BA113显示增强的结合FcγRIIIA V/V(图9A)和F/F(图9B)。

6.5.1.2靶标2

使用细胞结合测定评估BA115、BA116、BA117和BA118结合FcγRIIIA的能力。

除异二聚体蛋白BA115、BA116、BA117和BA118以60μg/mL至7ng/mL的浓度使用以外，如章节6.5.1.1所述进行实验。数据来自三个实验；误差条表示平均值的标准误差。

如图10A和10B所示，BA116、BA117和BA118结合至在CHO细胞上表达的FcγRIIIAV/V(图10A)和F/F(图10B)。与BA115相比，BA117显示增强的结合FcγRIIIA V/V(图10A)和F/F(图10B)。

6.5.2其他Fc受体

还使用细胞结合测定评估BA112、BA113、BA114、BA115、BA116、BA117和BA118结合FcγRI、FcγRIIa H/H、FcγRIIa R/R和FcγRIIb的能力，并且未观察到显著的差异。

6.5.3额外异二聚体蛋白的FcγRIIIA(CD16)结合

本实施例描述了对靶标1或靶标2(存在于人T细胞表面上的两种不同抗原)具有特异性的额外Fc多肽的合成、异二聚化和Fc受体结合。

在CHO细胞中表达额外Fc多肽(各自包含对靶标1或靶标2具有特异性的半抗体)，并且使用蛋白质A亲和色谱法(GE Healthcare)纯化。表5中描述了十二种Fc多肽中的每一种的抗原结合部分的结合特异性和重链恒定区的氨基酸序列。

表5：Fc多肽

表3和/或5中所示的Fc多肽被异二聚化以形成表6中所述的单特异性异二聚体蛋白。如实施例6.1.2所述进行异二聚化。

表6：异二聚体蛋白

使用细胞结合测定评估表6中的异二聚体蛋白结合FcγRIIIA F/F的能力，如实施例6.5.1中所述，不同之处在于用于评估图11和表7中所示的抗靶标1异二聚体蛋白的检测抗体是山羊抗人IgG-Alexa Fluor 488、Fcγ片段特异性(JIR，目录号109-546-098)。图11和图12中所使用的稀释范围是100μg/ml-0μg/ml，具有1:4的逐步稀释。在每种情况下，使用含有S239D/A330L/I332E突变(“Fc增强”)的参考同二聚体蛋白以进行比较。

具有各种Fc多肽的抗靶标1异二聚体蛋白结合表达细胞表面人FcγRIIIA F/F的CHO细胞的能力示于图11A-11G中。如通过几何平均荧光强度(MFI)评估的与细胞结合的异二聚体蛋白的水平相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白的浓度作图。表7中呈现了每种异二聚体蛋白的曲线下面积。

具有各种Fc多肽的抗靶标2异二聚体蛋白结合表达细胞表面人FcγRIIIA F/F的CHO细胞的能力示于图12A-12G中。如通过几何平均荧光强度(MFI)评估的与细胞结合的异二聚体蛋白的水平相对于与细胞一起孵育的异二聚体蛋白的浓度作图。表8中呈现了每种异二聚体蛋白的曲线下面积。

表7：图11A-11G中呈现的异二聚体蛋白的曲线下面积

表8：图12A-12G中呈现的异二聚体蛋白的曲线下面积

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本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，根据上述说明和附图，除所述的那些修改之外，本文公开的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落在所附权利要求的范围内。

本文引用的所有参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)通过引用整体并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)被具体和单独地指示为通过引用整体并入以用于所有目的。其他实施方案在以下权利要求范围内。

Claims

1.一种异二聚体蛋白，其包含第一Fc多肽和第二Fc多肽，其中：

a)所述第一Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且

b)所述第二Fc多肽包含分别在氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含在氨基酸位置332处的谷氨酸，

其中所述氨基酸位置根据EU索引进行编号。

2.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽还包含在氨基酸位置330处的亮氨酸，其中所述氨基酸位置根据EU索引进行编号。

3.如权利要求1或2所述的异二聚体蛋白，其中所述第二Fc多肽不包含在氨基酸位置330处的亮氨酸，其中所述氨基酸位置根据EU索引进行编号。

4.如权利要求1至3中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含第一抗原结合部分和/或所述第二Fc多肽包含第二抗原结合部分。

5.如权利要求4所述的异二聚体蛋白，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分包含抗体可变结构域、细胞表面受体的胞外结构域、可溶性T细胞受体或配体。

6.如权利要求5所述的异二聚体蛋白，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分包含VH、VL、VHH、VH/VL对、scFv、双体抗体和/或Fab。

7.如权利要求5所述的异二聚体蛋白，其中所述细胞表面受体是肿瘤坏死因子超家族受体、血管内皮生长因子受体或转化生长因子受体。

8.如权利要求5所述的异二聚体蛋白，其中所述配体是激素或生长因子。

9.如权利要求4至8中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分特异性结合至相同或不同的靶分子。

10.如权利要求1至9中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含人IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。

11.如权利要求10所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含抗体重链。

12.如权利要求11所述的异二聚体蛋白，其中所述抗体重链缺少CH1结构域和/或铰链区的一部分。

13.如权利要求11所述的异二聚体蛋白，其中所述抗体重链是全长抗体重链。

14.如权利要求11至13中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述抗体重链是IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂重链。

15.如权利要求11至14中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽还包含抗体轻链。

16.如权利要求15所述的异二聚体蛋白，其中所述抗体轻链是人κ或λ轻链。

17.如权利要求1至6和9至14中任一项所述的异二聚体蛋白，其中：

a)所述第一Fc多肽包含含有第一抗体重链和第一抗体轻链的第一半抗体；和/或

b)所述第二Fc多肽包含含有第二抗体重链和第二抗体轻链的第二半抗体。

18.如权利要求1至6和9至15中任一项所述的异二聚体蛋白，其中：

a)所述第一Fc多肽包含含有第一抗体重链和第一抗体轻链的第一半抗体；并且

19.如权利要求17或18所述的异二聚体蛋白，其中所述第一半抗体和所述第二半抗体结合至不同靶分子或同一靶分子的不同区。

20.如权利要求1至11和13至19中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含与与选自由SEQ ID NO:1-3,6-7,10-11,24-27,48-51和62-65组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列；和/或所述第二Fc多肽包含与选自由SEQ ID NO:1-3、5、12-13、36-37、60-61和66-67组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。

21.如权利要求20所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含与选自由SEQ IDNO:1-3,6-7,10-11,24-27,48-51和62-65组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100％相同)的氨基酸序列；并且所述第二Fc多肽包含与选自由SEQ ID NO:1-3、5、12-13、36-37、60-61和66-67组成的组的氨基酸序列至少75％相同(任选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。

22.如权利要求1至11和13至21中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽包含分别与SEQ ID NO:24和36；24和37；25和36；25和37；26和36；26和37；27和36；27和37；48和60；48和61；49和60；49和61；50和60；50和61；51和60；51和61；62和66；62和67；63和66；63和67；64和66；64和67；65和66；或65和67至少75％相同(任选地至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。

23.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:51中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。

24.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:50中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。

25.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:51中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。

26.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:50中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。

27.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:49中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。

28.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:48中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。

29.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:49中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。

30.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:48中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。

31.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:65中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。

32.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:64中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。

33.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:65中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。

34.如权利要求1至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:64中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。

35.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:63中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。

36.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:62中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。

37.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:63中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。

38.如权利要求2至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ IDNO:62中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列。

39.如权利要求1至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。

40.如权利要求1至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。

41.如权利要求1至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。

42.如权利要求1至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。

43.如权利要求2至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。

44.如权利要求2至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。

45.如权利要求2至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。

46.如权利要求2至11和13至22中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。

47.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。

48.一种分离的多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽。

49.一种载体，其包含如权利要求48所述的多核苷酸。

50.一种重组宿主细胞，其包含：

a)如权利要求48所述的多核苷酸；

b)如权利要求49所述的载体；

c)第一多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽；和第二多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白的第二Fc多肽；

d)第一载体，其包含编码如前述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一多核苷酸；和第二载体，其包含编码如前述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二多核苷酸；

e)第一多核苷酸，其编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体重链；第二多核苷酸，其编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体重链；和任选地，第三多核苷酸，其编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体轻链；和/或第四多核苷酸，其编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体轻链；或

f)第一载体，其包含编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体重链的第一多核苷酸；和第二载体，其包含编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体重链的第二多核苷酸；和任选地，第三载体，其包含编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体轻链的第三多核苷酸；和/或第四载体，其包含编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体轻链的第四多核苷酸。

51.一种产生异二聚体蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达：

a)编码如权利要求1至46中任一项所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽的第一多核苷酸；和

b)编码如权利要求1至46中任一项所述的异二聚体蛋白的第二Fc多肽的第二多核苷酸，

其中条件是产生所述异二聚体蛋白。

52.一种产生异二聚体蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达：

a)编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体重链的第一多核苷酸；

b)编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体重链的第二多核苷酸；

c)编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体轻链的第三多核苷酸；和

d)编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体轻链的第四多核苷酸，

其中条件是产生所述异二聚体蛋白。

53.一种产生异二聚体蛋白的方法，所述方法包括：

a)在第一细胞中表达编码如权利要求1至46中任一项所述的异二聚体蛋白的所述第一Fc多肽的第一多核苷酸，其中条件是产生所述第一Fc多肽；

b)在第二细胞中表达编码如权利要求1至46中任一项所述的异二聚体蛋白的所述第二Fc多肽的第二多核苷酸，其中条件是产生所述第二Fc多肽；并且

c)使步骤(a)和(b)中产生的所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽接触，其中条件是所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽异二聚化以产生所述异二聚体蛋白。

54.一种产生异二聚体的方法，所述方法包括：

a)在第一细胞中表达编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体重链的第一多核苷酸和编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第一抗体轻链的第二多核苷酸，其中条件是产生第一Fc多肽；

b)在第二细胞中表达编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体重链的第三多核苷酸和编码如权利要求18所述的异二聚体蛋白的第二抗体轻链的第四多核苷酸，其中条件是产生第二Fc多肽；并且

55.一种产生异二聚体蛋白的方法，所述方法包括使如权利要求1至46中任一项所述的异二聚体蛋白的第一Fc多肽和第二Fc多肽接触，其中条件是所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽异二聚化以产生所述异二聚体蛋白。