TW200936160A - Monoclonal antibodies that bind to anexelekto and uses thereof - Google Patents

Description

200936160 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於與AXL蛋白（anexe 1 ekto )結合之單株 抗體、包含作為活性成份之該抗體；以及使用該抗體的方 法。 【先前技術】

Anexelekto (又名 “AXL” 、 “UFO” 、 “ARK” 或 ❹

“ TYR07” ’本文統稱 “ AXL”）係由慢性粒細胞白血病 (chronic myelogenors leukemia，CML)病患選殖出來， 為一致癌基因，其高度表現能使鼠NIH3T3細胞轉移（Liu， et al., Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. (1988) 85, 1952-6; Janssen, et al., Oncogene (1991) 6, 2113-20)。AXL蛋白為140-kDa酪胺酸激酶受體（receptor tyrosine kinase) (0* Bryan, etal., Mol. Cell. Biol. (1991) 11，5016-31)，其與配體生長停滯特異性基因6 (growth arrest specif ic gene 6, Gas6)結合後產生自體 磷酸化（autophosphorylation)，啟動下游分子訊息傳 導途徑（Varnum，Nature (1995) 373，623-626)。 酪胺酸激酶受體，如Sky、Mer及AXL，為熟知之與Gas6 配體結合之酪胺酸激酶受體 （Hafizi，eia/.，FEBSJ. (2006) 273， 523卜5244)。 AXL被認為具有分子功能，包括細胞生長增強、細胞 〉周亡（apoptos i s )抑制、細胞、細胞移轉（ce 11 mi grat i on ) 及細胞附著（ce 11 adhes ion )。實驗發現，以Gas6蛋白 2125-10145-PF 5 200936160 處理之細胞具有該現象而支持該假設。已報導過之實驗結 果包括對大鼠血管平滑肌抑制其細胞死亡及促進細胞生 長（Nakano，ei «3/.，FEBS Lett. (1996) 387，78-80; Nakano, etal., J. Biol. Chem. (1995)270, 5702-5)； 在移除血清（serum starvation)後對小鼠NIH3T3細胞 具促進細胞生長及抑制細胞死亡（Goruppi，a/. , Mol. Cell. Biol. (1997) 17, 4442-53; Bellosta, et al., Oncogene (1997) 15，2387-97);對小鼠心臟纖維母細胞 Ο 具細胞生長促進（81^1111〇亡『，以3/.，61〇(^6111.61〇?1^5·

Res. Commun. (2004) 319，87卜8);對人類***癌細 胞具細胞生長促進 （Sainaghi， a人，J. Cel 1.

Physiol. (2005) 204，36-44);對人類胃癌細胞具細胞 生長及浸潤促進和細胞死亡抑制（Sawabu，ei a厶，Mo 1. Carcinog. (2007) 46，155-164);促進人類及大鼠血管 平滑肌細胞移轉能力（migration ability) (Fridell, ❿ <3人，J. Biol. Chem. ( 1 998) 273，7123-6);促進大鼠 神經元細胞轉移能力（Allen, e fa/.，Mol· Cell. Biol. (2002) 22，599-61 3);以及高度表現大鼠AXL之細胞聚 集（aggregation)(McCloskey，a/.，J. Bi〇l. chem. (1997) 272， 23285-91)。 相同地，基於胞内訊息分子分析，以Gas6處理後， AXL引介活化訊息傳遞的下游途徑PI3K - Akt途徑及MAPK 途徑 （Hafizi, et al. , FEBS J. (2006) 273, 5231-5244)。使用AX胞内部位作為引誘物以酵母雙雜交 2125-10145-PF 6 200936160 法（yeast two-hybrid method)分析確認與這些下由途 控直接分子交互作用。因而發現GrbB2/PI3K/p55 r /SOCS-l/NcK2/RanBP2/Cl-TEN 分子群（Hafizi，以 s/.，

Biochem· Biophys. Res. Commun. (2002) 299, ❹ 793-800)。這些分子交互作用顯示從axl的下游胞内訊息 傳遞途徑之存在。因此，發現知交互作用支持Axl在細胞 生長促進、細胞死亡抑制、細胞轉移及細胞貼附之功能的 假設。亦已發現當小鼠纖維母細胞之TNFa誘發細胞死亡為 IL-15抑制時，AXL為高度表現之基因。TNFot誘發細胞死 亡抑制以抑制AXL表現而受到抑制，而Il- 15受體及AXL 礙酸化經IL-15處理而增強。這些實驗發現亦暗示axl與 IL-15受體共軛結合引介訊息傳遞。 由於在過度表現該AXL顯性抑制型（dominant negative f〇rm)之人類神經膠腫瘤細胞株中axl磷酸化 受Gas6抑制’而裸鼠腔瘤生長（^jjjorigenicity)已為 報導（VajkoczyP eia 人，Proc. Natl Acad. Sci. ϋ. S. Α· (2006) 103，5799-804)。然而，並尚無報導或顯示任 何抑制磷酸化之抗-AXL抗體是否存在，這仍是不清楚。 AXL為單一穿膜酪胺酸激酶受體，該細胞膜外區從Ν_ 端由兩個免疫球蛋白樣結構域（domain)(稱之IgD1及 IgD2)及兩個纖維粘連蛋白第三型結構域（稱之FND1 、 FND2 )所組成（〇’ Bryan a人，Mol. Cel 1. Biol. (1991) 11，501 6-31)。雖然FND為已知於分子上的表現，如參與 細胞間枯附的神經細胞粘附分子（neural cell adhesion

2125-10145-PF 200936160 molecules, NCAM)及 nephrin 跨膜蛋白，然 FND 於 AXL 詳 細功仍未清楚（Yamagataeia 人，Curr. Opin. Cell. Biol. (2003) 15， 621-632)。 AXL發現為維持轉形細胞之天生能力的致癌基因 (oncogene)，亦為癌化相關分子。AXL表現已有很多分 析報導於該蛋白及mRNA層次。AXL蛋白高度表現已有所報 導於人類癌組織及細胞，包括肺癌 （Shieh，ei a/.， Neoplasia (2005) 7, 1058-1064), breast cancer (Meric, ❹ a人，Clin. Cancer Res. (2002) 8，36卜367)、卵巢 癌（Sun,以 a厶，Oncology (2004) 66，450-457)、甲 狀腺癌（Ito，eis/·，Thyroid (2002) 12，971-975)、 黑色素瘤（Ito，ei a/.，Thyroid (2002) 12，971-975)、 腎癌（Chung, et aJ., DNA Cell Biol. (2003) 22,

533-540)、胃癌（Sawabu, ei a/.，Mol. Carcinog. (2007) 46， 155-164)及神經膠質瘤（Vajkoczy，ef a/.，Proc. Φ Natl Sci. U. S. A. (2006) 1 03，5799-804)。再者，AXL 蛋白高度表現藉由於食道癌（Nemoto， et al.,

Pathobiology (1997) 65, 195-203), col on cancer (Craven, et al., Int. J. Cancer (1995) 60, 791-797) 及急性骨髓性白血病（Neubauer, eia/. , Bl〇〇d(1994) 84, 1931-1 941 )存在AXL mRNA高度表現量推測之。亦發現： 於HUVEC中以干擾性核醣核酸（rnA Interference; RNAi) 抑制AXL表現而抑制管腔形成（Holland，以3/.，Cancer » .

Res. (2005) 65，9294-9303);持續性抑制AXL表現導致 2125-10145-PF 8 200936160 於小鼠中降低人類乳癌細胞腫瘤形成能力（Hoi land， a7., Cancer Res. (2005) 65，9294-9303);以及顯性抑 制突變株持續性高度表現導致小鼠中降低人類神經膠質 瘤細胞腫瘤形成能力（Vajkoczy, eia/.，Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A· (2006) 103， 5799-804)。因此，強烈推 測AXL分子功能參與腫瘤生長。 已報導對AXL細胞外區域之多株抗體在高度侵襲性乳 癌細胞株具有細胞轉移抑制作用（W02004/008147)。麸 Ό 而，非臨床實驗顯示呈現癌細胞轉移抑制作用之藥物不需 呈現抗腫瘤活性。如，基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP)已知促進腫瘤浸潤及轉移。因 此’注意力集中於抑制MMP酵素活性之各種基質金屬蛋白 酶抑制劑，各種醫藥如巴馬司他（Batimastat)、馬立馬 司他（Marimastat)及比諾馬司他（Prinomastat)已進 行臨床試驗。然而，於臨床試驗中並未發現抗腫瘤作用 ❸(Pavlaki et al., Cancer Metastasis Rev. (2003) 22 177-203)。 ’ 因此，並無報告或推測抗-AXL抗體是否具有抗腫瘤 作用，特別是在體内，是否可抑制血管新生以及可抑制 癌，而這些都仍是未知的。 【發明内容】 .本發明目的係提供抗—AXL抗體及其使用方法。更特別 地，本發明目的係提供使用抗_AXL抗體抑制血管新生之方 2125-10145-PF 9 200936160 法，抑制細胞生長之方法，抑制ML功能之方法，增強AXL 功能之方法；以及減少AXL表現量之方法。本發明又一目 的係提供具新穎作用之抗-AXL抗體。 由於專注研究，本發明人已成功地生產具有特異功能 之抗-AXL抗體，亦發現該抗體具有血管新生抑制作用及抗 腫瘤作用，藉此完成本發明。更具體地，本發明包括： [1 ] 一種與AXL蛋白結合之單株抗體； φ [2 ] 如[1 ]所述之抗體，該抗體具有細胞生長抑制活性； [3] 如[1]所述之抗體，該抗體抑制癌細胞生長； [4] 如[1]至[3]任一所述之抗體’該抗體與FND1結合； [5 ] 一種抗體，其製備作為抗原，係以包括整個FND1之 胜肽或其包括至少五或多個保守胺基酸之序列； [6 ] 如[1 ]至[5 ]任一所述之抗體，該抗體對AXL具有增 效活性（agonistic activity); [7] 如[1]至[5]任一所述之抗體，該抗體對於AXL具有 φ 拮抗活性； [8] 如[7]所述之抗體，其係以下述之方法獲得者：將一 抗體與AXL配體和AXL-表現細胞互相接觸，筛選在AXL 未偵測到磷酸化酪胺酸之抗體； [9] 如[1]至[8]任一所述之抗體，該抗體具有降低AXL 表現量之活性； [10] 如[1]至[9]任一所述之抗體，該抗體具有血管新生 抑制活性； • · [11] 如下列（a)至（j)任一所述之抗體：

2125-10145-PF 10 200936160 (a) 由寄存編號FERM BP-1 0858融合瘤（hybridoma)所生 產之抗體（Ax285); (b) 由寄存編號FERM BP-10859融合瘤所生產之抗體 (Ax292)； (c) 由寄存編號FERM BP-10853融合瘤所生產之抗體 (Ax223)； (d) 由寄存編號FERM BP-10852融合瘤所生產之抗體 (Ax96)； φ (e) 由寄存編號FERM BP-1 0856融合瘤所生產之抗體 (Ax258); (f) 由寄存編號FERM BP-10857融合瘤所生產之抗體 (Ax284)； (g) 由寄存編號FERM BP-1 0850融合瘤所生產之抗體 (Ax7); (h) 由寄存編號FERM BP-1 0851融合瘤所生產之抗體 鲁 (Ax51); (i) 由寄存編號FERM BP-10854融合瘤所生產之抗體 (Ax225);以及 (j ) 由寄存編號FERM BP-1 0855融合瘤所生產之抗體 (Ax232)； [12] 與一抗原決定位（epi tope )結合之抗體，該抗原 決定位與如[11 ]所述之任一抗體結合之抗原決定位相同； [13] 与 括一互 補性決 定區域 (complementarity-determing region, CDR)序列之抗體， 2125-10145-PF 11 200936160 該CDR序列與如[11]所述之任一抗體所包括之CDR序列一 樣； [14] —抗體，其重鏈CDR1、2及3序列分別為seq id N0: 4、5 及 6 ; [15] 一抗體’包括含有具一或多個胺基酸取代、刪除、 ***和/或添加之如[14]所述之抗體之重鏈序列的胺基酸 序列，且功能等同如[14 ]所述之抗體； φ [16] 一抗體’其輕鏈CDiH、2及3序列分別為SEQ ID N0: 8、9 及 1 〇 ; [17] —抗體，包括含有具一或多個胺基酸取代、刪除、 ***和/或添加之如[丨6]所述之抗體之輕鏈序列的胺基酸 序列，且功能等同如[16 ]所述之抗體； [18] 如[13]至[17]任一所述之抗體，該抗體為一嵌合抗 涯， [19] 如[13]至[17]任一所述之抗體，該抗體為一人源化 〇 抗體（humani zed ant ibody ); [20] 如下列（a)至（j)任一所述之融合瘤： (a) 寄存編號 FERM BP-1 0858(Ax285)融合瘤； (b) 寄存編號 FERM BP-10859(Ax292)融合瘤； (c) 寄存編號 FERM BP-1 0853 (Ax223)融合瘤； (d) 寄存編號 FERM BP-1 0852 (Ax96)融合瘤； (e) 寄存編號 FERM BP-10856 (Ax258)融合瘤； (f) 寄存編號 FERM BP-1 0857 (Ax284)融合瘤； (g) 寄存編號FERM BP-1 0850 (Ax7)融合瘤； 2125-10145-PF 12 200936160 (h) 寄存編號 FERM BP-1 085 1 (Ax51)融合瘤； (i) 寄存編號FERM BP-10854 (Ax225)融合瘤；以及 (j) 寄存編號 FERM BP-10855 (Ax232)融合瘤； [21] —血管新生抑制劑，包含抗-AXL抗體作為活性成 份； [22] 如[21]所述之血管新生抑制劑，其中該抗體為如[1] 至[19]任一所述之抗體；

[23] 一細胞生長抑制劑，包含抗-AXL抗體作為活性成 份； [24 ]如[23 ]所述之抑制劑，其中該細胞為癌細胞； [25] 如[23]所述之抑制劑，其中該抗體為如[1]至[19] 任一所述之抗體； [26] 如[23]所述之抑制劑，其中該抗_AXL抗體為與 FND1結合之抗體； [27] 如[23]所述之抑制劑，其含有作為活性成份之抗 體’該抗體與I gD2結合且具抑制磷酸化活性作用； [28] 一 磷酸化活性誘發劑（inducer )，包含抗_Αχ[ 抗體作為活性成份； [29] 如[28]所述之誘發劑，其中該抗-AXL抗體為與igD 結合之抗體； [30] 如[28 ]所述之誘發劑，其中該抗體為如[6]所述之 抗體； [31]

AXL·鱗酸化活.性抑制劑，該抑制劑含有一抗_ML 抗體作為活性成份；

2125—10145-PF 13 200936160 [32 ] 如[31 ]所述之抑制劑，其中該抗-AXL抗體為與 IgD2結合之抗體； [33] 如[31 ]所述之抑制劑’其中該抗體為如[7 ]或[8 ] 所述之抗體； [ 34 ] 一降低AXL表現量之藥劑，包含抗-AXL抗體作為 活性成份； [35] 如[34]所述之降低AXL表現量之藥劑’其中該抗 -AXL抗體為與FND1結合之抗體； [36] 如[34]所述之降低AXL表現量之藥劑’其中，其中 該抗體為如[9]所述之抗體； [37] 一種誘發AXL磷酸化之方法，係使用抗-AXL抗體； [38] 一種降低AXL表現量之方法’係使用抗- AXL抗體； [39] 一種抑制AXL磷酸化之方法，係使用抗-AXL抗體； [40] —抗癌藥劑，含有一抗-AXL抗體作為活性成份； [41] 如[40]所述之抗癌藥劑，其中該抗體為如[1]至[19] φ 任一所述之抗體； [42] 如[40 ]所述之抗癌藥劑，其中含有作為活性成份之 抗體與IgD2結合且具抑制磷酸化活性作用； [43] 如[40]所述之抗癌藥劑，其中該癌症為胰臟癌 (pancreatic cancer)、胃癌（gastric cancer)、肺 癌、骨肉瘤（osteosarcoma)、大腸癌（colon cancer)、 ***癌（prostate cancer )、黑色素瘤（meianoma )、 子宮内膜癌（endometrial cancer)、印巢癌（〇varian cancer)、子宮肌瘤（uterine leiomyoma)、甲狀腺癌 2125-10145-PF 14 200936160 (thyroid cancer )、癌症幹細胞（cancer stem ce 11 )、 乳癌（breast cancer)、膀胱癌（bladder cancer)、 腎癌（renal cancer)、神經朦質瘤（glioma)、神經母 細胞瘤（neuroblastoma )或食道癌（esophageal cancer ); [44] 如[42 ]所述之抗癌藥劑，其中該癌症為神經膠質 瘤、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌（non-smal 1 -ce 11 lung cancer)、騰臟腺癌（pancreatic adenocarcinomas)

或乳癌； [45] 如[43]所述之抗癌藥劑，其中該癌症為胰臟腺癌或 乳癌； [46] 如[1 ]所述之抗體，該抗體具抑制AXL磷酸化活性； [47] 使用抗-AXL抗體抑制血管新生之方法； [48 ] 使用一抗-AXL抗體於製備血管新生抑制劑之方法； [49] 使用抗-A X L抗體抑制細胞生長之方法； [50] 使用抗-AXL抗體治療和/或預防癌症之方法； [51] 使用一抗-AXL抗體於製備細胞生長抑制劑之方法； [52 ] 使用一抗- AXL抗體於製備抗癌藥劑之方法； [53] 使用一抗-AXL抗體於製備磷酸化誘發劑之方法； [54 ] 使用一抗-AXL抗體於製備磷酸化抑制劑之方法； [55] 使用一抗-AXL抗體於製備降低該AXL表現量之藥 劑的方法；以及 [56] 一種產生抗AXL之專一性抗體（anti—AXL specific antibody)的方法，包括 (a)使具有包括整個FND1之胜肽或其包括至少五或多 2125-10145-PF 15 200936160 個保守胺基酸之序列的非人類動物免疫；以及 (b)收集該非人類動物中抗體或收集抗體產生細胞 (antibody-producing ceU)以收集由抗體產生細胞所 產之抗體。 【實施方式】 本發明提供一新穎之抗-AXL抗體。本發明更提供抗 -AXL抗體之新穎用途。 對於本發明抗-AXL抗體並無限制，只要能與AXL結 合；亦無限定於起源（如人、大鼠、小鼠、兔或雞）、類 型（多株抗體或單株抗體）、型式（如經改變之抗體、經修 飾之抗體、抗體片段或微型抗體（minib〇dy)[低分子量抗 體])等。雖然對於本發明抗-AXL抗體並無限制，該抗體 較佳為專一與anexelekto結合，且較佳為單株抗體。 本發明抗-AXL抗體較佳亦為具有細胞生長抑制活性。 較佳實施例中，本發明抗_ Axl抗體為與結合之 抗-AXL抗體。 稍後實施例清楚地知道，與FND1結合之抗_AXL抗體 特別地較其它抗體具有顯著高體内（如^>〇)抗腫瘤活 性。 抗-AXL抗體與FND1間結合活性可以熟悉該項技藝者 熟知方法評估，如下列方法所述。抗_AXL抗體與fndi間 結合活性以FND1進行電泳及與抗4几西方墨點轉潰以確 認0 2125-10145-PF 16 200936160 八有增效活性之抗-AXL抗體係本發明抗_axl 抗體之較佳實施例之案例。對AXL具有增效活性之抗—AXL 抗體意指當該抗'AXL抗體與AXL結合，誘a AXL介導之磷 酸化，特別是當該抗—AXL抗體與AXL結合，誘發酪胺酸磷 酸化反應。雖然對於因對AXL具有增效活性之抗_AXL抗體 所誘發之磷酸化反應並無特別限制，但案例包括自體 磷酸化。 φ 無論是否具有增效活性之抗-AXL抗體可為熟悉該項 技藝者熟知方法所判斷，如下列方法所述可用。將測試抗 -AXL抗體與表現AXL細胞（如Calu-1，MM-MB-231或 DU-145細胞）接觸’接著從該細胞萃取AXL。於經萃取axl 中，以抗-鱗酸赂胺酸抗體（anti-ph〇Sph〇tyrosine antibody)確認酪胺酸是否磷酸化。更特別是，以實施例 所述方法，可確認抗-AXL抗體具有增效活性。 具有增效活性之抗-AXL抗體案例包括下列（a)至（g) φ 之抗體： (a) 由寄存編號FERM BP-l〇858(Ax285)融合瘤所生產之 抗體； (b) 由寄存編號FERM BP-10852(Ax96)融合瘤所生產之 抗體； (c) 由寄存編號FERM BP-10856( Ax258)融合瘤所生產之 抗體；

(d) 由寄存編號FERM BP-1〇859(Αχ292)融.合瘤所生產之 抗體； 2125-10145-PF 17 200936160 (e) 由寄存編號FERM BP-1 0 853(Ax223)融合瘤所生產之 抗體， (f) 可辨識與（a)至（e)任一抗體所辨識之抗原決定位相 同之抗原決定位的抗體；以及 (g) 具有與（a)至（e)任一抗體之CDR序列一樣CDR序列 的抗體。 可辨識與上述抗體所辨識之抗原決定位相同之抗原 ❿ 決疋位的抗體可按照如下列所述之方法得到。 無論測試抗體與特定抗體共同分享一抗原決定位，可 由這兩抗體對相同抗原決定位競爭而確定。抗體間競爭可 以父叉阻斷法（cross-blocking assay)或其它偵測。如， 競爭性ELISA ( competitive ELISA)為較佳之交又阻斷 法。特別地，在交又阻斷法，AXL蛋白塗佈於微量培養盤 孔穴中，在候選競爭抗體有或無存在下前培養，然後加入 上述所述抗-AXL抗體。在穴盤中與該AXL蛋白結合之上述 ® 抗-AXL抗體的數量與競爭結合相同抗原決定位之候選競 爭抗體（測試抗體）結合能力有間接關聯。因此，該測試 抗體對相同抗原決定位親合力越大，結合至塗佈axl蛋白 之孔穴之上述抗-AXL抗體減少的數量越多，而結合至塗佈 AXL蛋白之孔穴之測試抗體增加的數量越多。 結合至孔穴的抗體數量可輕易以預先標定該抗體而 測得。舉例來說，生物素（bi〇tin )標定抗體可以抗生物 素爹白（avidin)-過氧化酶共軛物及適當受質而測得。具 體來說，使用酵素標誌如過氧化酶之交又阻斷法即競爭性 2125-10145-PF 18 200936160 EL ISA。該抗體可以其它可被偵測或測量之標定物質標 定。具體來說，放射性標定及螢光標定為熟知。 當該測試抗體具衍生自一種物種且不同於上述抗 -AXL抗體之固定區（constant regi〇n)，結合至孔穴的抗 體數量亦可以可辨識該抗體固定區之標定抗體測得。另 外’當該測試抗體具衍生自同種但不同屬物種之固定區， 結合至孔穴的抗體數量可以可辨識每一屬之抗體測得。 ❹ 相較對照組於無候選競爭抗體存在下結合活性，該候 選競爭抗體可阻斷該抗-AXL抗體結合至少2 〇%，較佳至少 20% - 50%，更佳至少50%，即該候選競爭抗體為實質與上 述抗-AXL抗體所結合之相同抗原決定位之抗體或與上述 抗AXL抗體競子結合之相同抗原決定位之抗體。 CDR序列判斷以獲得具特定抗體CDR序列相同之CDR 序列的抗體可為熟悉該項技藝者熟知方法執行。舉例來 說，CDR序列可藉由判斷抗體全長胺基酸序列或可變部位 ® ( variable region )胺基酸序列，並將已測定之胺基酸 序列與Kabat等人發展之抗體胺基酸序列資料庫 (Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept, of Health and Human Services, 1 983)檢測該 同一性（homology)。架構區域上數目及CDR序列上數目 可按照 Kabat 定義判斷（Rabat，A. E. 4 <3/.，US Dept, of Health and Human Services, US Government Printing Off ices，1991)。 •. 抗體之全長胺基酸序列或可變部位胺基酸序列可為 2125-10145-PF 19 200936160 熟悉該項技藝者熟知方法判斷。 現有抗體有六個CDR，具與特定抗體相同之cdr序列 抗體可具有至少一個CDR相同序列。然而，該抗體較佳具 有所有於重鏈二個CDR之相同序列或所有於輕鏈三個cdr 之相同序列，甚至更佳為，該抗體具有所有於該抗體六個 CDR之相同序列。 具與特定抗體相同之CDR序列的抗體包括嵌合抗體及 e 人源化抗體 。嵌合抗體及人源化抗體敘述如下。 本發明抗-AXL抗體另一較佳實施例之案例為對axl 具拮抗活性之抗-AXL抗體。對 AXL具拮抗活性之抗 抗體意指具抑制磷酸化反應活性之抗體，其磷酸化反應係 AXL配體(如Gas6 )輿AXL ·结！锺益a ντ化人掛_______

應’但案例包括AXL自體磷酸化。

2125-10145-PF 20 200936160 (a) 由寄存編號FERM BP-1 0850 (Ax7)融合瘤所生產之 抗體； (b) 由寄存編號FERM BP-10851 (Ax51)融合瘤所生產之 抗體； (c) 可辨識與（a)至（b)任一抗體所辨識之抗原決定位相 同之抗原決定位的抗體；以及 (d) 具有與（a)至（c)任一抗體之CDR序列一樣cdr序列 的抗體。 可辨識相同抗原決定位之抗體及具相同CDR序列之抗 體可如先前所述之方法得到。 具拮抗活性抗體可用於抑制血管新生、抑制細胞生長 等。 本發明抗體另一較佳實施例之案例為具降低AXL表現 量之活性的抗體。本發明中，AXL表現量降低可表明透過 AXL降解等已現存AXL數量減少或可表明因抑制AXL表現 新表現AXL數量減少。可由熟悉該項技藝者所熟知方法判 斷該AXL表現量是否降低，如下列之方法。將測試抗體與 表現 AXL 細胞（如 Calu-1，MDA_MB_231 或 Du_145 細胞） 接觸，接著以免疫墨渍（immunobl〇tting)等方法偵測該細 胞現存AXL數量。然後比較該測試抗體有接觸而測到之 AXL數量與該測試抗體未接觸而測到之數量間差異。 更特別是，以實施例所述方法，可確認此狀況。 ” 抗體案例包括下 具有降低AXL表現量活性之抗_axl 列（a)至（j)之抗體： 2125-10145-PF 21 200936160 (a) 由寄存編號FERM BP-1 0858 (Ax285)融合瘤所生產 之抗體； (b) 由寄存編號FERM BP-10852 (Ax96)融合瘤所生產< 抗體； (c) 由寄存編號FERM BP-10856 (Ax258)融合痛所生產 之抗體； (d) 由寄存編號FERM BP-1 0850 (Ax7)融合瘤所生產之 ❹

沉遐， (e) 由寄存編號FERM BP-1 0859 (Αχ 292)融合瘤所生產 之抗體； (f) 由寄存編號FERM BP-10853 (Ax223)融合瘤所生產 之抗體； (g) 由寄存編號FERM BP-10854 (Ax225)融合瘤所生產 之抗體； (h) 由寄存編號FERM BP-10857 (Ax284)融合瘤所生產 之抗體； (i) 可辨識與（a)至（h)任一抗體所辨識之抗原決定位相 同之抗原決定位的抗體；以及 (j) 具有與（a)至（i)任一抗體之CDR序列一樣CDR序列 的抗體。 可辨識相同抗原決定位之抗體及具相同CDR序列之抗 體可如先前所述之方法得到。 具降低AXL表現量笋性抗體可用於抑制血管新生、抑 制細胞生長等。 2125-10145-PF 22 200936160 本發明抗體另一較佳實施例之案例為具血管新生抑 制作用的抗體。雖然沒有特別限定本發明血管新生抑制， 但只要血管新形成被抑制就是，包括血管内皮細胞 (vascular endothelial cells)鈾欲 轉移活性抑制作用、血 管内皮細Μ亡誘發作用&血管内皮細胞血管型態發生 (vascuiar morphogenesis)抑制作用。具血管新生抑制

魯 作用的抗體較佳案例為對腫瘤組織具血管新生抑制作用 的抗體。腫瘤組織無特別限^，案例包括騰臟癌組織（如 騰臟腺癌組織）、胃癌、组織、肺癌組織（小細胞肺癌、非小 細胞肺癌等組織）、骨肉瘤組織、大腸癌組織、***癌 組織、黑色素瘤組織、子宮内膜癌組織、卵巢癌組織子宮 肌瘤組織、甲狀腺癌組織、癌症幹細胞組織、乳癌組織、 膀胱癌組織、腎癌組織、神㈣f瘤組織、神經母細胞瘤 組織及食道癌組織。較佳組織為神經膠f瘤組織、胃癌组 織、子宮㈣癌組織、非小細胞肺餘織、騰臟腺癌組織 及乳癌組織，更佳為胰臟腺癌組織及乳癌組織。 可由熟悉該項技藝者所熟知方法確認抗體是否具有 血管新生㈣作用，如’此可用商業血管新生套組確認。 更特別是，以實施例所述方法，可確認此狀況。 具血管新生抑制作用抗體具體案例包括先前所述之 本發明抗體另 制作用的抗體。 —較佳實施例之案例為具細胞生長抑

該抗-AXL 雖然沒有特別限定 抗體抑制之生長的細

2125-10145-PF 23 200936160 胞’較佳細胞係關於— 關於疾病，更佳為癌細胞。當 細胞，並不特別限定I 虽該細胞為癌 隈疋癌症的種類，如包括胰 胰臟腺癌組織）、胃瘰 癌組織（如 月癌組織、肺癌組織（小細胞腧戚 細胞肺癌等組織）、A南 胞肺癌、非小 ;月肉瘤組織、大腸癌組織、·- s，成 組織、黑色素瘤组織 、剛列腺癌 織、子宫内膜癌組織、卵巢癌組織子宮 肌瘤組織、甲狀腺癌組織癌症幹細胞組織、乳癌組織^ 胱癌組織、腎癌組織、神經膠臉 」《 & 2 > τ'母細胞瘤細

織及艮道癌組織。較佳組織為神經膠質瘤組織、胃癌、 織、子宮内膜癌組織、非小細胞肺癌組織、姨臟腺癌組織 及乳癌組織，更佳為胰臟腺癌組織及乳癌組織。 ' 對於本發明抗體所引起細胞生長抑制機制並不限 定’該細胞生長可為任何機制所抑制，如血管新生抑制、 磷酸化抑制、磷酸化誘發或該AXL表現量降低。 下列方法較佳地用於評估或測試抗_AXL抗體對該細 胞生長抑制作用。 S平估或測試體外（/77 F/fr幻細胞生長抑制活性方法， 其中一種方法係採用添加[3H]_標定胸腺嘧啶至培養基，使 活細胞吸收以測試作為DNA複製活性指標。更單簡的方法 為染色（dye expulsion)法，其於顯微鏡下觀察該細胞 排出染料（如剛果藍（Trypan Blue))之能力，或Μττ 法。MTT法係利用活細胞將噻唑藍【3_(4, 5—二甲基噻唑 基 ）2,5- 二 苯 基 溴 化 四 氮 唾 (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)，ΜΤΤ】，嗔峰鹽，轉換成藍色甲騰 2125-10145-PF 24 200936160 (f ormazan )產物的能力。具體來說，測試抗體與配體一 起加至該測試細胞之培養液，培育預定時間後，MTT溶液 家至該培養液竟至一段預定時間使MTT進入該細胞中。黃 色化合物MTT可以被細胞中線粒體内的琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase)還原生成藍色產物。此藍 色產物溶解呈色後，測定吸光值，用以作為活細胞數量之 指標。除MTT，染料如商業可獲得之MTS、XTT、WST-1及 ❸ WST 8 (Nacalai Tesque等）亦適合使用。測量此活性時， 對照組抗體亦可使用。 攜帶腫瘤小鼠模型可用以評估或測量體内細胞生長 抑制活性。如，表現AXL癌細胞皮内下或皮下移植至非人 類測試動物胞後，從移植日開始或隔天開始每天或幾天間 斷腹腔注射或肌内注射測試抗體。該細胞生長抑制活性可 測量時間該腫瘤大小變化作為評估。體外評估相似方法 鲁 中，細胞生長抑制活性可透過投予對照組抗體並觀察該抗 -AXL抗體給藥組之踵瘤大小是否顯著小於該對照組抗體 給藥組以作為評估。當大鼠用作為非人類測試動物，仙/仙 裸鼠可適用，該鼠由於胸腺素基因缺陷因此τ_淋巴功能缺 》。使用&些大鼠使得給藥之抗體細胞生長抑制活性評估 及測量其間，可以消除該測試動物中τ_淋巴之參與。 包括前述之抗體。 具細胞生長抑制之抗-AXL抗體案例 本發明抗-AXL單株抗體可以習知方法取得。衍生自哺 乳動物之單株抗體較佳地作為本發發明抗—ML單株抗 體。衍生自哺乳動物之單株抗體包括融合瘤產生之抗體及 2125-10145-PF 25 200936160 使用基因工程技術將含有該抗體基因之表現載體轉殖至 宿主產生之抗體。

生產單株抗體之融合瘤可以習知技術獲得，如下所 述。首先’按照-般免疫方法，以AXL蛋白作為免疫致敏 原（sensitizing antigen)。然後，將獲自免疫後動物 之免疫細胞以一般細胞融合方法與已知親本細胞融合以 獲得融合瘤。以-般篩選方法，利用生產該標的抗體之細 胞篩選將那些融合瘤篩選出生產該抗^辽抗體之融合瘤。 更特別地單株抗體可以按照如下列方法所獲得。首 先，為獲得該抗體作為致敏原^AXLi白可藉由表現皿 基因所獲得。人類AXL基因之核苦酸序列已為習知（基因 銀行編號M76125 )。編碼AXL之基因序列***習知表現載 體，轉殖至適當宿主細胞後，所要之人類AXL蛋白可由該 宿主細胞或從該培養懸浮液以習知方法純化。經純化天然 存在之AXL蛋白亦可使用。純化可採用數種層析，如一般 離子交換層析及親和層析，執行—次或多：欠，組合使用或 單獨使用。該AXL蛋白之所要部分多肽融合至不同多肽的 融口蛋白亦可作為免疫原（immun〇gen )。抗體Fc片段或 胜肽標記（peptide tag)等可用以製備融合蛋白以作為 免疫原。生產表現融合蛋白之載體可藉兩種或多種編碼多 肽片段之所要的的基因融合於同—個讀框，錢將該融合 基因***表現載體，如前述。製備融合蛋白之方法敘述於

Molecular Cloning, 2nd edition (Sambrook, J. etaL, Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring 2125-10145-PF 26 200936160

Harbor Laboratory Press，1989)。以這方法純化之 AXL 蛋白可用作為哺乳動物免疫之致敏原。 AXL的部份胜肽也可作為一致敏原。AXL的部份胜肽包 括一具化學合成之人類AXL胺基酸序列的胜肽、合併人類 AXL基因部份至一表現載體中，進行表現所獲得之一胜 狀、以及以蛋白質水解酶分解人類AXL蛋白所獲得之一胜 肽。此部份胜肽並無特別的限制，例如，也可使用Axl的 胞外部份。 ❹ 再者’具有完整FND1序列或含有至少它的五個保守 胺基酸之胜肽可為較佳地作為部分胜肽。含有至少五個保 守胺基酸之序列意指較佳含有六或多個，更加為八或多個 保守胺基酸的那些。此外，含有至少五或多個保守胺基酸 之序列意指具有抗原性（ant i geni ci ty)之胺基酸序列。 以致敏原使免疫之哺乳動物並不限定。為由細胞融合 獲得單株抗體，在考量與親本細胞細胞融合相容性後，最 © 好是篩選可被免疫之動物。一般而言，嚅齒動物是較佳作 為免疫動物。具體地說，大鼠、小鼠、倉鼠或兔子可用作 為免疫動物。猴子等亦可用作為免疫動物。 前述動物可用習知方法以致敏原使免疫。如’ 一般的 方法’該哺乳動物腹腔注射（intraperit〇neally，ip)或皮 下注射（subcutaneous，sc)致敏原使之免疫。具體地說， 投該過敏原予動物每四天數次，至21天。該過敏原以酸 緩衝液（phosphate-buffered saline，PBS)、生理鹽水 等稀釋至適當稀釋比例後可用以免疫用。該過敏原亦可與 2125-10145-PF 27 200936160 ¥ 佐劑投藥。如，它可以與弗氏完全佐劑（Freund’ s complete adjuvant)混合及使用時乳化作為該過敏原。 當以該過敏原使之免疫，亦可使用適當載體。特別地，低 分子量部分胜肽作為該過敏原，用以免疫較佳為該過敏原 結合至載體蛋白，如白蛋白、鑰孔蟲戚血藍蛋白（keyho 1 e 1 impel: hemocyanin，KLH)等。 該哺乳動物以這方法使之免疫及確認在血清所要之 φ 抗體水準增加後，該免疫細胞由該哺乳動物採集用作細胞 融合。具體地說，脾臟細胞較佳作為免疫細胞。 哺乳動物骨髓瘤細胞作為該細胞與該免疫細胞融 合。該骨髓瘤細胞較佳具有適當篩選標誌作為篩選之用。 篩選標誌意指在特定培養條件下，允許細胞活與不活之指 標。已知篩選標誌包括次黃嘌呤一鳥嘌呤一磷酸核糖轉移 酶缺乏（hypoxanthine - guanine phosphoribosyl transferase deficiency)(簡稱 “HGPRT 缺乏”）及胸腺 © ，咬激酶缺乏（thymidine kinase deficiency )(簡稱 “TK 缺乏）。HGPRT或TK缺乏之細胞為次黃嘌呤-胺基喋 吟 - 胸 腺嘧啶 敏感性 (hypoxanthine- aminopterin- thymidine sensitive) (簡稱HAT敏感（HAT sensitivity) ) HAT敏感細胞於 HAT篩選培養基無法合成DNA並死亡。然而，與正常細胞 融合，它們可以正常細胞回收利用路徑（salvage pathway) 繼續合成DNA，因此它們閜始生長於HAT篩選培養基。 HGPRT-缺乏細胞及TK-缺乏細胞可以含有6-硫鳥嘌呤 2125-10145-PF 28 200936160 Μ (6-thioguanine)、8-氮鳥嗓呤（8-azaguanine, 8AG) 或5r-溴脫氧尿苷（5^bromodeoxyuridine)之培養基篩 選。雖然正常細胞吸收這些嘧啶類似物至它們DMA而死 亡，缺之這些酵素的細胞無法吸收這些喊咬類似物，因此 可於該篩選培養基存活下來。G418抗藥性（G418 resistance ) 篩選標諸意指對 2-脫氧鏈霉胺 (2-deoxystreptamine)型抗生素之抵抗性，因為它為抗 紐奥黴素（neomycin)基因。適用細胞融合之各種骨髓瘤 細胞為習知，可用之骨趫瘤細胞案例包括 P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550)' P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) ' NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519)' MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415) ' SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) ❹ 276, 269-270) ' FO (de St. Groth, S. F. et al., J.

Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ) ' S194 (Trowbridge, I. S.，J. Exp. Med. (1978) 148，313-323)及 R210 細胞 (Galfre，G. ei a/·，Nature (1979) 277，131-133)。 前述免疫細胞與骨髓瘤細胞融合可依照習知方法執 行’如 Kohler 及 Mi lstein 方法（Kohler, G. and Milstein， C.， Methods Enzymol. (1981) 73， 3-46)。 更具體地’該前述細胞融合可於一般營養培養基於細 胞融合促進劑（cell fusion promoter)存在下進行。可 2125-10145-PF 29 200936160 用之細胞融合促進劑案例包括聚乙 —(polyethylene glycol, PEG)及仙台病毒（Sendai v; 毋、naai Vlrus，HVJ)。助劑 (auxiliary agent )，如二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide’DMSO)，亦可添加以進一步增強融合效率。 使用之免疫細胞及骨髓瘤細胞比例可以任意組合。 如，較佳為免疫細胞超過骨髓瘤細胞倍以上。可用 於前述細胞融合之培養基案例包括較佳用於前述骨髓瘤 ❹細胞株生長之MEM及RPMH640培養基和這類型細胞培養 之一般培養基。血清補充物，如胎牛血清（fetai serum，FCS) ’亦可添加至該培養基。 於培養基將預定量該免疫細胞及骨髓瘤細胞完全混 合，然後於預熱約37°C之PEG溶液混合，進行細胞融合以 形成標的融合細胞（融合瘤）。細胞融合期間，pEG平均 分子量約1 000 - 6000,正常添加濃度3〇%_6〇% (w/v)。 隨後，以如上述適當培養基連續稀釋、離心及移除懸浮液 ® 將該細胞融合劑及其它不負責融合瘤生長之藥劑清除。 然後，獲得之融合瘤以篩選培養基篩選，該篩選培養 基相對應用以細胞融合之骨髓瘤細胞所擁有之篩選標 誌。如HGPRT-或TK-缺乏之細胞可培養於HA培養基（培 養基含有次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶）以篩選。當hat_ 敏感骨髓瘤細胞用以細胞融合，已成功與正常細胞融合之 那些細胞可於HAT培養基選擇性生長。於HAT培養基持續 培養一適當量時間’使非標的融合瘤非融合細胞）死亡。 具體地，該標的融合瘤一般為培養數天至數週篩選。之 2125-10145-PF 30 200936160 後，生產該標的抗體之融合瘤篩選及單株化可以一般限數 稀釋法（limiting dilution method)進行。另外，辨識 AXL之抗體可以使用敘述如國際公開號之 方法製備。 標的抗體篩選及單株化較佳以習知基於抗原_抗體反 應之篩選方法進行。如，抗原結合至載體，如聚苯乙稀微 球或商業化之96-穴微量滴定板，及與該融合瘤培養懸浮 〇 液反應。然後清洗該載體，與酵素標定二級抗體或其它反 應。假如與該過敏原反應之標的抗體存在於培養懸浮液， 該二級抗體透過這抗體與該載體結合。最後，無論該標的 抗體疋否存在於培養懸浮液可以偵測結合至該載體之二 級抗體判斷。生產可與該抗原結合之所要抗體的融合瘤可 以如限數稀釋法選殖。這時用以免疫之抗原或實質上等同 AXL蛋白可優先作為該抗原。 除了使除人類之動物以抗原使之免疫產生融合瘤 ® 外，標的抗體亦可藉由以該抗原使人類淋巴球敏化獲得。 具體地，人類淋巴球於體外（…以AXL蛋白第一 次敏化。然後該免疫敏化淋巴球融合至適當融合伙伴。 如，具有持續***能力之人類器官骨趙瘤細胞可作為融合 伙伴（參閱日本專利申請公開號（JP_B) Η1-59878 (經審 查。獲准曰本專利申請用以異議之公開）。以這種方法生 產之抗-AXL抗體為具AXL蛋白結合能力之人類抗體。 • 抗—AXL人類抗體亦可藉由投予具完整人類抗體基因 庫之轉殖動物作為抗原之AXL蛋白而獲得。經免疫動物之 2125-10145-PF 31 200936160 抗體產生之細胞可藉由處理如與適當融合伙伴融合或感 染艾伯斯坦-巴爾病毒（Eps_tein_Barr virus，膽）而不死 化。抗-AXL抗體亦可藉由以這方法獲得之不死化細胞分離 直接抗AXL蛋白之人類抗體（參閱國際公開號 94/25585 、 W0 93/12227 、 W0 92/03918 及 W0 94/〇26〇2)。 生產具標的反應專一十生之抗體的細胞亦可藉由選瘦該不 死化細胞而選殖出。當使用基因轉殖動物作為經免疫動 φ 物，該動物之免疫系統視人類AXL為外來物。因此，直接 抗人類AXL之人類抗體可輕易獲得。以這種方法製備之生 產單株抗體的融合瘤於一般培養基繼代培養。該融合瘤亦 可儲存於液態氮以延長時間。 該融合瘤按一般方法培養以從它的培養懸浮液獲得 該標的單株抗體。另外，該單株抗體可藉由將該融合瘤接 種至與它相容之哺乳動物中’使該融合瘤生長，使用因而 產生之腹水（ascites)作為單株抗體。前者較適合獲得 • 高純度抗體。 本發明中，選殖自抗體產生細胞之抗體基因所編碼之 抗體亦可使用。經選殖抗體基因可藉由嵌入適合載體，導 入該載體至宿主以表現抗體《單離該抗體基因的方法、將 該基因導入至載體及將該載體轉殖至宿主細胞已建立（參 閱’如 Vandamme，A.M·以沒人，Eur. J. Biochem. (1990) 192， 767-775)。 如’編碼該抗- AXL抗體可變部位（v region)可字生產 • · 該抗-AXL抗體融合瘤所獲得。為完成這，通常首先自該融 2125-10145-PF 32 200936160 合瘤萃取總RNA。從細胞萃取mRNA之方法例子包括胍超離 心(guanidine ultracentrifugation) (Chirgwin, J. Μ. a厶，Biochemistry (1979) 18，5294-5299)及硫氰酸 胍-齡-氯仿（acid-guanidine-phenol - chloroform, AGPC ) 法(Chomczynski， P. et al. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)〇 該經萃取之mRNA可使用mRNA純化套組（GE ❿ Healthcare Bio-sciences)等純化。另外，套組，如

QuickPrep mRNA 純化套組（GE Healthcare Bio-sciences) 為商業可獲得，用以直接從細胞萃取所有mRNA。這些套組 可用於獲得所有從融合瘤之mRNA。編碼抗體可變部位之 cDNA可自所得之mRNA以逆轉錄酶合成。該cMA可以如 AMV逆轉錄酶第一股cDNA合成套組（AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit ) (Seikagaku Corp.)合成。5，-Ampli FINDER RACE Kit 參 （Clontech)及 5’-RACE 法（Frohman, Μ· A. ei a/.，Proc Natl Acad. Sci. U. S. A. (1 988) 85，8998-9002,

Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)使用PCR可用以合成及放大該cDNA。適當限制 位置（restriction site)，敘述如下，亦可於cDNA合 成期間導入該cDNA兩端。 標的cDNA片段自因而產生PCR產物純化並接至載體 DNA ,。因而製備重組載體，之後將之導入大腸桿菌 (π//)等，菌落篩選，所要之重組載體可 2125-10145-PF 33 200936160 自形成大腸桿菌菌落製備。無論該重組載體是否有該標的 cDNA核苷酸序列可以習知方法確認，如雙去氧核苷鏈終止 法（Dideoxynucleotide chain termination)。 使用放大可變部位基因之引子的PCR亦可獲得編碼可 變部位基因。首先，使用該經萃取之mRNA做為模版合成 cDNA以建立cDNA庫。使用商業化之套組合成該cDNA庫是 很方便。因為自僅少量細胞所獲得mRNA量是相當少，直 φ 接純化導致低產量。因此，添加絕不含有抗體基因之載體 RNA後’再純化mRNA。另外，萃取RNA —定量為可能時， 自僅抗體產生之細胞之RNA可有效被萃取出來。如，對於 從10或更多’ 30或更多，或較佳50或更多抗體產生之細 胞萃取RNA，添加載體RNA則可能不需要。 然後，該抗體基因使用該cDNA庫作為模版以pCR放 大。用以該抗體基因PCR放大之引子（primer)為習知。 如放大人類抗體基因之引子可依照文獻設計（如j. 工 〇 Blol_ (1991 ) 222，58卜597)。這些引子具不同免疫求蛋 白亞類之核苷酸序列。因此，當未知亞類之cDNA庫作為 模版，進行PCR時須考量所有可能性。 如，為獲得編碼人類igG之基因放大編碼重鏈γ丨至 r5及輕鏈κ和λ鏈可用作為引子。為放大IgG可變部 位基因，通常用鍊合至相對應關節（hinge regi〇n)之序列 的引子為3’端之引子。相反地，可用相對應每亞類之引子 為Y端之引子。 將放大重鏈及輕鏈每一亞類之基因的引子所放大之 2125-10145-PF 34 200936160 PCR產物做成獨立基因庫。使用以這方式合成之基因庫將 使得重新構築含有重鏈及輕鏈組合的免疫求蛋白為可 能。然後，可篩選標的抗體以作重築免疫求蛋白對AXL結 合活性之指標。 獲得編碼該標的抗-AXL抗體V部分的cDNA後，將該 cDNA以可辨識***該cDNA兩端之限制位置的限制酶切 割。較佳限制酶辨識及切割不可能發生在構築該抗體基因 藝之核苷序列上的核苷序列。當將單一已切割片段於適當方 向***至載體時，具黏端之限制酶為較佳。抗體表現載體 可藉由將該編碼該標的抗_ AXL抗體V部分的cDNA，以前 述切割，***至適當表現載體而製備。此時，嵌合抗體可 藉由融合編碼抗體恆定部位（c〇nstant regi〇n，c ) 及編碼前述v部分而製備。此處，「嵌合抗體（chimeric antibody)」意指含有來自不同物種之恆定部位及可變部 位的抗體。因此，本發明抗體包括異種嵌合抗體 > (xenogeneic chimeric antibody),如鼠-人抗體及人 _ 人異體嵌合抗體（all〇geneic chimeric antibody)。嵌 合抗體表現載體亦可藉由將該V部分基因***至原具有恆 定部位之表現載體而構築。 具體地’切割該V部分基因之限制酶的辨識序列可被 女排在保有編碼所要抗體怪定部位（C region)之DNA的表 現載體的5’端。嵌合抗體表現載體藉由將兩者以相同限制 酶組合切割，箏後融合一起而構築。 該抗體基因可***表現載體在表現控制區域控制下 2125-10145-PF 35 200936160

制區域可包括 >增強子 (promoter)。表現編碼該抗— 坑體。抗體表現之表現控 enhancer ) 及啟動子 AXL抗體之DNA的重組細 胞可藉由以這表現栽體轉殖適當宿主細胞而獲得。 抗體基因表現中，編碼該抗體重鏈（Hchain)及輕鏈 (L chain)之DNA可個別***不同表現載體。該載體同時 轉殖（共同轉染）至相同宿主細胞後，***該重鏈或輕鏈 φ 之載體可表現具重鏈及輕鏈抗體分子。另外，編碼該抗體 重鏈及輕鏈之DNA可***單一表現載體，轉殖至宿主細胞 (參閱國際公開號W0 94/1 1523 )。 透過先單離抗體基因，然後導入適當宿主以製備抗體 的的宿主及表現載體組合為習知。所有這些表現系統可應 用於本發明。當使用真核細胞作為宿主時，動物細胞、植 物細胞或真菌細胞可用。本發明可用動物細胞具體案例包 括哺乳動物細胞（如CH0、C0S、骨髓瘤、幼倉鼠腎細胞 ❹ [baby hamster kidney，BHK]、Hela 及 Vero 細胞）、兩棲 類細胞（如爪墙印母細胞（oocytes ))及昆蟲細 胞（如sf9、sf21及Tn5細胞）。 用以抗體基因表現系統之植物細胞已知案例為煙草 Mt U概，如泰專{ Nicotiana tabacum、。％合玲秦細紙 可用於植物細胞轉殖。 可用之真菌細胞案例包括酵母菌（酵母菌屬 (Saccharomyces )，如酿酒酵母（历jres· ceref/5/3e))及嗜甲醇酵母菌（methanol-utilizing

2125-10145-PF 36 200936160 yeast )(比齊酵母菌屬（/7 )，如巴斯德畢赤酵母 ()) 及絲狀真菌（麴菌屬 (Aspergillus)，如黑麴菌（/j/ge/*))。 使用原核細胞之抗體基因表現系統亦為習知。如，細 菌，如大腸桿菌（及 CO// )或枯草桿菌（如C///M •Si/办ί///·?)細胞可用於本發明。 當使用哺乳動物細胞時，常用啟動子、表現之抗體基 ©因及下游Υ端polyA訊號可操作地連接以構築表現載體。 啟動子/增強子案例為人類巨細胞病毒啟動子/增強子 ( human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer) ° 可用以表現本發明抗體之啟動子/增強子其它案例包 括病毒啟動子/增強子或哺乳動物細胞啟動子/增強子，如 人類延長因子 la (human elongation factor la，HEF1 α)。啟動子/增強子有用之病毒具體案例包括反錄病毒 ⑩ （retrovirus)、多瘤病毒（polyomavirus)、腺狀病毒 (adenovirus )及猿猴病毒 40 (SV40)。 使用SV40啟動子/增強子時’ Mulligan <9厶方法 可用（Nature (1979) 277，108) ^HEFla 啟動子 / 增強子 亦可按Mizushima a/.方法用於表現標的基因 (Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322)。 於五.α/i，抗體基因可藉由操作連結一般有用之啟 動子、抗體分泌訊號序列，及表現之抗體基因而表現。啟動 子案例包括1 acZ啟動子及araB啟動子。使用iacZ啟動 2125-10145-PF 37 200936160 * 子時，可用 Ward eia人方法（Nature (1989) 341，544-546; FASEB J. (1992) 6，2422-2427)。可按照 Better ei aA 方法使用araB啟動子表現標的基因（Science (1988) 240，104卜 1043)。 用於i1· co//胞外質（periplasm)生產之抗體分泌訊 號序列案例為pelB訊號序列（Lei，S. P. ei aA，J. Bacteriol. ( 1 987) 1 69，4379)。分離生產於胞外質之抗 ❹ 體’然後使用蛋白質變性劑（protein denaturant )，如 尿素（urea)或胍鹽酸鹽（guanidinehydrochloride)， 結構性重疊以便該抗體具有所要結合活性。 可***表現載體之有用複製起始點（replicati〇n origin)的案例包括起源於SV40、多瘤病毒、腺狀病毒及 牛隻乳頭狀腫瘤病毒（bovine papillomavirus) (BPV)的 那些。篩選標誌亦可***至該表現載體於宿主細胞系統以 放大基因份數。可用篩選標誌具體案例包括胺基糖苷轉移 © 酶（amin〇glyc〇side transferase) (ΑΡΗ)基因、胸腺嘴 唆激酶（thymidine kinase)(TK)the i7. co"黃嗓呤-烏糞 σ示吟磷酸核糖轉移酶（xanthine - guanine phosphoribosyl transferase) (Ecogpt)基因及二氫葉酸 還原酶（dihydrof〇late reductase) (dhfr)基因。 標的抗體藉由導入這些表現載體至宿主細胞並於體 外或體内培養該轉殖宿主細胞而產生。該宿主細胞培養按 習知方法進行。可用培養基案例包括DMEM、MEM、RPMn64〇 及IMDM ;且這些可與血清補充物如FCS、組合使用。 2125-10145-PF 38 200936160 以上述方法表現及生產之抗體可以習知方法純化，該 習知方法係一般用於蛋白純化，可單獨或適當組合使用。 如’抗體可藉適當篩選及親和管柱（蛋白A管柱）如，管 柱層析、過滤、薄膜超過滤（uliiraf i ltration)、鹽析及 透析組合分離及純化 （Antibodies _ A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) ° ©除前述宿主細胞’基因轉殖動物亦可用於生產該重組 蛋白。標的抗體可由已導入編碼該標的抗體之基因的動物 所獲得。如’抗體基因可藉由***該基因至編碼原生產於 乳汁之蛋白質的基因，以構築作為融合基因。如，山羊β 酪蛋白（Goat β casein)可作為分泌在乳汁之蛋白。將 含有已***該抗體基因之融合基因的DNA片段注射至山羊 胚胎，將該經注射胚胎導入雌山羊。可自出生自接種該胚 胎之山羊的基因轉殖山羊（或其後代）產生之乳汁，獲得 ® 融合至乳蛋白之融合蛋白形式的所要抗體。贺爾蒙可適當 給予該基因轉殖山羊以增家含有該所要抗體之乳汁量 (Ebert, Κ· Μ· et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。起源動物抗體之恆定部位可用於本發明重組抗 體之怪定部位。可用鼠抗體Η鏈C部位案例包括Cyl、

CY2a、CY2b、CY3、Cn、CS、C α 1、C α 2、及 Cs ; L 鏈 C 部位案例包括Ck及（：λ。非鼠抗體而可用動物抗體案例包 括小鼠、兔子、山羊、綿羊、駱駝尽猴子抗體。這些抗體 序列為習知。該C部位亦可修飾以改善該抗體或生產之穩 2125-10145-PF 39 200936160 « 定性。本發明中，投予人類該抗體時，為如降低於人類中 異種抗原性，可製成人工修飾重組抗體。重組抗體案例包 括嵌合抗體及人源化抗體。 這些修飾抗體可以習知方法製備。嵌合抗體意指不同 來源可變部位及恆定部位連接的抗體。如，具鼠抗體重鍵 及輕鏈可變部位與人類抗體重鏈及輕鏈恆定部位之抗體 為鼠-人異種礙合抗體。表現嵌合抗體之重組載體可藉由 ❹ 連接編碼鼠抗體可變部位之DNA與編碼人抗體恆定部位之 DNA，然後將它***至表現載體而製備。培養經該載體轉 殖之重組細胞，於培養基中，該***之DNA表現而獲得該 嵌合抗體。人類C部位用作為嵌合抗體及人源化抗體之^ 部位。如 ’ Cyl、Cy2a、Cy2b、 Cy3 ' 0μ > C8 ' C α 1 > C α 2、及Cs可用作H鏈C部位。Ck及（：λ可用作為L鏈C部位。 這些C部位胺基酸序列及編碼這些之核苷酸序列為習知。 人類抗體C部位亦可修飾以改善該抗體或生產之穩定性。 ® —般嵌合抗體由源自非人類動物抗體之V部位及源自

人類動物抗體之C部位所組成。相對地，人源化抗體由源 自非人類動物抗體之互補決定區段（complementarity determining region，CDR)、源自人類動物抗體之框架區 (framework region, FR)及所組成源自人類動物抗體之C 部位所組成。因為人源化抗體於人體中降低抗原性，因此 它們可用作為本發明治療藥劑之活性成份。 , 抗體可變部位一般由四個FR連接三個CDR所組成。 CDR實質上為決定抗體結合專一性的部位。CDR胺基酸序 2125-10145-PF 40 200936160 列富有多樣性。相反地’架構FR之胺基酸序列通常顯示 高度相似性（homology )，甚至在具不同結合專一性的抗 體中。因此，一般會考量特定抗體結合專一性可藉由嫁接 該CDR而嫁接至另一抗體。 人源化抗體亦指改造之人類抗體。具體地，非人類動 物，如鼠，抗體CDR已嫁接至人類抗體的人源化抗體為習 知。一般生產人源化抗體之基因重組技術亦為習知。 . 習知嫁接鼠CDR至人FR的方法具體案例為重疊延伸 PCR( over lap extension PCR)。重疊延伸 PCR 中，嫁接用 編碼該鼠抗體之CDR核苦酸序列加至用以合成人類抗體 FR的引子。引子製備以為四個fr每一個。一般，認為嫁 接鼠CDR至人類FR時，為維持該CDR功能去篩選具與該 鼠FR有高度相似性的人類FR是有好處的。也就是說，一 般較偏好去使用胺基酸序列與鄰近欲嫁接該鼠Cdr之fr 胺基酸序列具高度相似性的人FR。 © 連接之核苷酸序列可設計以便它們互相連接於同一 個讀框（in frame)。人FR個別以特意引子組合成。因 此’可獲得編碼鼠CDR之DNA已加入至每一個FR的產物。 編碼該產物之鼠CDR的核苷酸序列設計為舆另一個重疊。 然後以該人類抗體基因為模版合成之產物，互相鍊合該產 物重疊CDR部分，進行互補股合成反應。這反應結果人類 FR透過該鼠CDR序列連接。 最後’三個CDR及四個FR已連接之V部位全長，其 有加入適當限制酶辨識序列，以鍊合該5'及3,端的引子放 2125-10145-PF 41 200936160 大…：後表現該人源化抗體之載體藉由***以上述方法 所獲得DNA及編碼人類抗體。部位至表現載體，以便將它 門融合於同-個讀框。接著’培養細胞培養中生產該人源 化抗體係其藉由導入該重組載體至宿主以建立重組細 胞，隨之培養該重組細胞並表現該編碼該人源化抗體之 MA (參閱歐洲專利公開號Ep 2394〇〇及國際公開號恥 96/02576)。 e 透過該CDR連接時，偏好選擇人抗體FR以便該cdr 形成有利的抗原結合位置，其係以定量或定性測量及評估 它對於以前述方法製備之人源化抗體的抗原結合活性。若 有需要，該FR胺基酸殘基可以被取代，以便該重塑人類 抗體的CDR形成適當抗原結合位置。如，胺基酸序列突變 可藉由採用PCR使該鼠CDR嫁接至該人類吓而導入至 FR /、體地，β卩分核苷酸序列突變可導入至與該ρβ鍊合 之引子。將經突變之核苷酸序列導入至以這引子合成之 FR。具所要特性之突變FR可以使用上述方法測量及評估 該胺基酸取代之抗體對該抗原之、结合能力而筛選之 (Sato, K. etaL, Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 〇 獲得人類抗體的方法亦為習知。如，人類淋巴球以所 要抗原或於體外以表現該抗原之細胞使之敏化。之後，具 對該抗原之結合活性的所要人類抗體可藉使該敏化淋巴 球與人類骨髓瘤細胞融合而獲得（參閱jp_B耵―59以8)。 如，！Γ用U266作為人類骨髓瘤細胞，扮演該融合伙伴。 所要人類抗體亦可藉以所要抗原使具完整人類抗體 2125-10145-PF 42 200936160 基因庫之轉殖動物免疫而獲得（參閱國際公開號w〇 93/12227 、 W0 92/03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 WO 96/34096及WO 96/33735)。而，藉使用人類抗體庫篩 選獲得人類抗體技術亦為習知。如，人類抗體V部位可採 用嗟菌體顯現法（phage di splay method )使之以單鏈抗 體（single-chain antibody, scFv)形式表現在病毒的表 面上’進而篩選與抗原結合之病毒。分析經選擇病毒的基 因，可確認編碼與該抗原結合之人類抗體V部位的DNA序 列。確認與該抗原結合之scFv的DNA序列，將v部位序 列與所要人類抗體C部位序列融合於同一個讀框，然後將 之***適當載體以製備表現載體。該人類抗體可將該表現 載體導入至如前述較佳表現細胞，表現編碼該人類抗體之 基因而獲得（國際公開號W0 92/01 047、W0 92/20791、W0 93/06213 、 W0 93/11236 、 W0 93/19172 、 95/01438 及 W0 95/15388)。 本發明抗體包括二價抗體’如I gG ’及單價抗體或多 價抗體，如IgM，只要它們能與該AXL蛋白結合。本發明 多價抗體包括具有相同抗原結合位置那些及部分或全部 抗原結合位置不同的那些。本發明抗體不限定於完整抗體 分子，亦可為其微型抗體或經修飾抗體，只要它們能與該 AXL蛋白結合。 微型抗體包括抗體片段，其為該完整抗體（如完整 IgG)部分切除。允許抗體分子部分缺少只要與該格 原結合之能力能維持。本發明抗體片段較佳包括該重鍵可 2125-10145-PF 43 200936160 變部位（VH)及輕鏈可變部位（VL)之一或兩者。vh或几胺 基酸序列可包括取代、删除、***和/或添加。而，vh或 之一或兩者部分可被刪除，只要與該AXL抗原結合之能 力能維持。該可變部位亦可為嵌合或人源化。抗體片段具 體實例包括如Fab、Fab， 、F(ab，）2&Fv。微型抗體具 體實例包括 Fab、Fab， 、F(ab，）2、Fv、scFV (單鏈 Fv)、 微型雙4貝抗體（diabody) 、sc(Fv)2 (單鏈（Fv)2)等。本 ❹發明微型抗體亦包括這些抗體之多聚體（如二聚體、三聚 體、四聚體或多聚體）。 抗體片段可以酵素處理該抗體產生抗體片段而獲 得。用以產生抗體片段之酵素習知案例包括木瓜酵素 (papain )、胃蛋白酶（pepSin)、纖維蛋白分解酵素 (plasmin)等。另外’編碼這些抗體片段之基因可經構 築’導入至表現在體，然後於適當宿主細胞表現（參閱如 Co, M. S. etal., J. Immunol. (1 994) 152, 2698-2976; O Better, M. and Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496； Lamoyi, E.， Methods in Enzymology (1989) 121， 652-663;

Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; and Bird, R.E. et al. , TIBTECH (1991) 9， 132-137)。 消化酶切割抗體片段特定位置以產生具特別結構之 •- 抗體片段，如下所示。抗體任意部分可利用以酵素處理獲 2125-10145-PF 44 200936160 得抗體片段之基因工程技術而將之刪除。 木瓜酵素處理：F(ab)2或Fab 胃蛋白酶處理：F(ab’ ）2或Fab’ 纖維蛋白分解酵素處理：Facb

「微型雙價抗體（Diabody)」意指藉基因融合構築 之雙價抗體（參閱 Holliger，P. eis/.，proc. NatlAcad. Sci. U. S. A. (1993) 90， 6444-6448 ; EP 494,097 ; WO φ 93/11161等）。微型雙價抗體為二聚體，由兩條胜肽鏈所 組成。正常地，形成二聚體之胜肽鏈中同一條内VL及VH 利用連接子（1 i nker )將兩者銜接。在微型雙價抗體中連 接子一般太短而無法讓該VL及VH互相銜接。具體地，構 築連接子之胺基酸殘基數目如大約五個殘基。因此，編碼 於同一胜肽鏈之VL及VH無法形成單鏈可變部位片段，但 可形成具不同單鍵可變部位片段之二聚體。因此，微型雙 價抗體具有兩個抗原結合位置。 & scFv藉連接抗體！1鏈v部位及[鏈v部位而獲得。scFv 中，Η鏈V部位及L鏈V部位透過連接子連接，較佳為胜 肽連接子（Huston，J.s· Pr〇c. Natl Acad Sci. U· S. A· (1988) 85, 5879-5883) qscFv 中，Η 鍵 V 部位 及L鏈V部位可衍生自本發明所述之任何抗體。連接該ν 部位之胜肽連接子並無特別限定。如，包括大約3到託 個殘基之任何任意單鏈單鏈胜肽可作為連接子。該¥部位 可藉如前述PCR方法連接。為使用pcR方法連接該v部位， 編碼凡整或所要部分編碼前述抗體H鏈或11鏈v部位之

2125-10145-PF 45 200936160

"I DNA序列及編碼前述抗體L鍵或^ ν部位之觀序列的 胺基酸序列的DNA序列作為模版。 編碼該Η鏈及L鏈之V部位的DNA之兩者以pcR方法 使用引子對進行放大，其引子對具有相對於欲放大之臟 兩端的序列之序歹，J。接|，準備編碼該胜狀連接子部分之 DNA。編碼該胜肽連接子之DNA亦可以p(：R合成。將可連 接每個各自合成V部位的放大產物之核普酸序列添加至引 〇 子的y端。然後，以該H鏈v部位dna、該胜肽連接子DNA 及L鏈V部纟DNA-起與該用作為組合式聚合酶連鎖反應 (ASSeinbly PCR)之引子進行pcR反應。用作為組合式聚合 酶連鎖反應之引子由與該H鏈v部位醒5,端鍊合之引子 及與該L鍵V部位DNA 3，端鍊合之引子組合所組成。因此， 用作為組合式聚合酶連鎖反應之引子由可放大編碼用以 合成該scFv完整序列之DNA的引子組所組成。相對地， 可連接至每一 V部位DNA的核苷酸序列添加至該“胜肽連 © 接子DNA”。因此，這些DNA連接一起，最後產出全長的 scFv作為用作為組合式聚合酶連鎖反應之引子的放大產 物。一旦製備編碼scFv之dNA，包括該DNA之表現載體及 具該表現載體之轉形重組細胞可以一般方法獲得。該scFv 亦可藉由培養該重組細胞而表現編碼該scFv而獲得之。 sc(Fv)2為微型抗體，其中兩個VH及兩個VL以連接 子等連接形成單鏈（Hudson, ei a/.， J. Immunol.

Methods ( 1999) 231，1 了7-189)。sc(Fv)2 可藉如以連接 子連接製備。 2125-10145-PF 46 200936160 sc(Fv)2較佳為抗體，其中兩個VH及兩個vl使用單 鏈多肽N—端作為起始點以VH、VL、VH、VL (VH -連接 子-VL-連接子— VH_連接子_ VL)順序安排。 可藉由基因工程導入之任何任意胜肽連接子，合成複 〇 連接子（如揭露於 pr〇tein Engineering, (1996) 9(3), 2 99 305 )等可用作為該連接子以連接抗體可變部位。本 發明較佳為胜肽連接子。該胜肽連接子長度並無特別限 φ 疋該長度較適合為熟悉該向技藝者依照用途目的去選 擇。正常地，構築胜肽連接子之胺基酸殘基數目範圍從丄 至100個胺基酸，較佳為3至50個胺基酸，更佳為5至 30個胺基酸，特佳為12至18個胺基酸（如15個胺基酸）。 構築胜肽連接子之胺基酸序列可為任何任意序列，只 要它不會抑制該scFv結合功能。 另外，V部位可利用合成化學連接子（化學交聯劑）連 接。交聯劑一般用作為交聯胜肽化合物，此可用於本發明 參 中。可用交聯劑案例包括N-經基琥ϊό醯亞胺 (N-hydroxysuccinimide，NHS)、二琥珀醯亞胺辛二酸酯 (disuccinimidylsuberate，DSS)、雙（磺基琥珀醯亞胺） 辛二酸酯（bis(sulfosuccinimidyl)suberate，BS3)、二硫 代雙 （琥珀 醯亞胺 丙酸酯 ） (dithiobis(succinimidylpropionate)，DSP)、二硫代雙 (磺 基琥珀 醯亞胺 丙酸酯 ） (dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)，DTSSP)、乙 二醇雙（號ϊό醯亞胺琥珀酸酯）（ethyleneglycol 2125-10145-PF 47 200936160 bis(succinimidylsuccinate)，EGS)、乙二醇雙（續基琥 王白 醯 亞胺破 ίό 酸’醋 ) (ethyleneglycol bis(sulfosuccinimidylsuccinate)，sulfo-EGS)、二破 ί白 醢亞胺酒石酸酯（disuccinimidyl tartrate, DST)、二績 基琥ίό醯亞胺酒石酸醋（disulfosuccinimidyl tartrate, sulfo-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧基羰基氧基） 乙基] 礙 (bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone,B S0C0ES)以及雙[2-(磺基琥珀醯亞胺氧基羰基氧基）乙基] 職 (bis[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy)ethy1]sulf one,sulfo-BSOCOES)。 正常地，當連接四個抗體可變部位，需三個連接子。 多個連接子可用相同或不同連接子。本發明較佳微型抗體 為微型雙價抗體或sc(Fv)2。為獲得這些微型抗體，抗體 φ 以酵素處理，如木瓜酵素、胃蛋白酶，以產出抗體片段。 另外，構築編碼這些抗體片段之DNA ;導入表現載體；以 及於適當宿主細胞表現，以獲得這些抗體（參閱如Co，M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2698-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. ( 1 989) 178, 497-515; Lamoyi, E. , Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. ( 1 986) 1 21, 663-669; and Bird, R. E. 2125-10145-PF 48 200936160 and Walker, B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9 132-137)。 本發明抗體亦可用與各種分子，如聚乙二醇（PEG)或 細胞毒殺劑（cytotoxic substances)鍵結作為經修御之 抗體。這經修飾之抗體可易化學修飾本發明抗體而獲得。 抗體修飾方法於該技術領域已建立。 本發明抗體亦可為雙特異性抗體。「雙特異性抗體 ❹ （bispecific antibody)」意指具有在同一抗體分子内 辨識不同抗原決疋位之可變部位的抗體。該抗原決定位可 存在於不同分子或相同分子。本發明中，雙特異性抗體可 具辨識AXL分子不同抗原決定位的抗原結合位置。另外， 雙特異性抗體可透過一辨識位置辨識AXL，另一個辨識位 置辨識細胞毒殺劑。本發明抗體亦包括這些抗體。 辨識非AXL之抗原的雙特異性抗體可結合於本發明。 如’辨識非AXL之抗原的雙特異性抗體可結合使用，其中 © 該抗原為如同AXL專一性表現於標的言細胞之表面。 製備雙特異性抗體的方法為習知。如，雙特異性抗體 可藉由連接兩種辨識不同抗原之抗體而製備。每一經連接 抗體可為具有該Η及L鏈的半個分子或包括只有η鏈的四 分之一分子。另外，生產雙特異性抗體的融合細胞可藉由 融合生產不同單株抗體之融合瘤而製備。雙特異性抗體亦 可以基因工程技術製備。 •- 抗體、性（Binding act i vi tv of an antibody ) 2125-l〇i45_pp 49 200936160 習知方法可用隅測量抗體之抗原結合活性 (Antibodies A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。可用方 法案例包括酵素連結免疫吸附分（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )、酵素免疫分析（enzyme immunoassay, El A) 、 放射免 疫分析 (radioimmunoassay, RIA)、螢光免疫分析(fluorescent immunoassay )等。用已測量抗體對細胞中表現之抗原之 結合活性方法案例包括“Antibodies A Labotatofy Manual” 一書359 - 420頁所述之方法。 使用流式細胞儀（flow cytometer)的方法特佳用於 測量懸浮在緩衝液中表現於細胞表Φ的抗原與對該抗原 之抗體間的結合。可用之流式細胞儀案例包括 FACSCan to™ 11、FACS Aria™、FACS Array™、FACS Vantage™ SE 及 FACSCalibur™ (全來自 BD Biosciences)和 EPICS 0 ALTRA HyPerSort 、 Cytomics FC 500 、 EPICS XL-MCL ADC 、 EPICS XL ADC 及 Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (全 來自 Beckman Coulter)。

測量對抗原之測試AXL抗體結合活性較佳方法之案例 為以FITC標定之二級抗體染色，其抗體辨識與表現AXL 之細胞反應的測試抗體，然後以 FACSCalibur (BD

Biosciences)測量，再以 Cell Quest 軟體（BD Biosciences) 分析螢光密度。 2125-10145-PF 50 200936160 融合瘤(Hvbr i domas ) 本發明亦提供融合瘤，寄存編號FERM BP-10858 (AX285)'FERM BP-10859 (AX292), FERM BP-10853 (AX223), FERM BP-10852 (AX96), FERM BP-10856 (AX258), FERM BP-10857 (AX284), FERM BP-10850 (Ax7), FERM BP-10851 (Ax51)， FERM BP-10854 (Ax225)及 FERM BP-10855 (Ax232)。這些融合瘤產出具增效活性的抗_AXL抗體、具 0 有拮抗活性的抗-AXL抗體、具降低AXL表現量之活性的抗 -AXL抗體、具有血管新生抑制活性的抗—AXL抗體和/或細 胞生長抑制活性的抗-AXL抗體。 管新生抑制劑（Angin^nesis inhihi+M。 本發明亦提供金管新生抑制劑，係包括抗_AXL抗體。 對於血管新生抑制機制並無特定限定。該機制案例包括血 管内皮細胞轉移活性抑制仙、血f内皮細胞社誘發作 用及血管内皮細胞血管型態發生抑制作用。本發明血管新 生抑制劑較佳為對腫瘤組織抑制血管新生。膣瘤組織無特 別限定。該腫瘤組織案例包括胰臟癌組織(騰臟腺癌組織 等）、胃癌組織、肺癌組織(小細胞肺癌、非小細胞肺癌 等組織）、骨肉瘤組織、大腸癌組織、***癌組織、黑 色素瘤組織、子宮内膜癌組織、印巢癌Μ織子宮肌瘤組 織、甲狀腺癌組織、癌症幹細胞組織、乳癌組織、膀胱癌 組織織、神㈣f瘤組織、神經母細胞瘤組織及 食道癌組織。較佳組織為神經膠質瘤組織、胃癌組織、子 2125-10145-PF 51 200936160 s内膜癌組織、非小細胞肺癌組織、姨卿n織及乳癌 組織’更佳為胰臟腺癌組織及乳癌組織。 —作為本發明血管新生抑制劑之抗體並無特定限定，只 要匕們具有血管新生抑制作用。如，可用前述抗體（具增 效活性的抗體、具有拮抗活性的抗體、具降低AXL表現量 之活性的抗體等）。 包括本發明抗_AXL抗體之血管新生抑制劑可體現在 參使用抗-AXL抗體抑制血管新生的方法。包括本發明抗―退 抗體之血管新生抑制劑亦可體現在使用抗-AXL抗體製備 血管新生抑制劑。 細胞生 一 Cell-growth sm ires sants

本發明亦提供細胞生長抑制劑，係包括抗_AXL抗體。 對於細胞生長抑制機制並無特定限定。該機制案例包括基 於血管新生抑制作用的那些、基於該抗體細胞毒殺活性的 那些及基於鍵結於該抗體之細胞毒殺劑的那些；較佳為基 於血管新生抑制作用的那些。 抗-AXL抗體抑制生長的細胞並無特定限定。該細胞較 佳為與疾病相關的那些，更佳為癌細胞。本發明細胞生長 抑制劑較佳實施例的案例為包括抗_AXL抗體之抗癌藥 劑。當該細胞為癌細胞，並不特別限定癌症的種類，如包 括胰臟癌組織（如胰贜腺癌組織）、胃癌組織、肺癌組織（小 細胞肺癌、非小細胞肺癌等組織）、骨肉瘤組織、大腸癌 組織、***癌組織、黑色素瘤組織、子宮内膜癌組織、 2125-10145-PF 52 200936160 卵巢癌組織子宮肌痼细嫉 m α & 痛，織、甲狀腺癌組織癌症幹細胞組 織、乳癌組織、膀脱痒細維 ffit r*· , 飛組織、腎癌組織、神經膠質瘤組織、 神經母細胞瘤组織及舍增亦 ’ 赏道癌組織。較佳組織為神經膠質瘤 、織月癌組織、子呂内膜癌組織、非小細胞肺癌組織、 騰臟腺癌組織及乳癌組織，更佳為騰臟腺癌組織及乳癌組 織。 作為本發明細胞生長抑制劑之抗體並無特定限定，只 ❹要匕們具有細胞生長抑制劑作用。如，可用前述抗體（具 增效活性的抗體、具有拮抗活性的抗體、具降低ML表現 量之活性的抗體等）。 包括本發明抗-AXL抗體之細胞生長抑制劑可體現在 使用抗-AXL抗體抑制細胞生長的方法。當生長被抑制的那 些細胞為癌細胞，包括本發明抗_AXL抗體之抗癌藥劑可體 現在使用抗-AXL抗體治療和/或預防癌症之方法。包括本 發明抗-AXL抗體之抗癌藥劑可體現在使用抗-AXL抗體製 © 備細胞生長抑制劑。當生長被抑制的那些細胞為癌細胞， 它們可體現在使用抗-AXL抗體製備抗癌藥劑。 鱗酸化活性诱發劑（Phosphorv 1 at i on i nducers ) 本發明亦提供磷酸化活性誘發劑，係包括抗-AXL抗 體。本發明磷酸化活性誘發劑正常誘發表現AXL細胞中碟 酸化。雖然磷酸化誘發標的並無特別限定，該標的正常為 具有酪胺酸之多肽，較佳為AXL。 •- 作為本發明磷酸化活性誘發劑之抗體並無特定限 2125-10145-PF 53 200936160 定。如’前述具增效活性的抗體。 包括本發明抗-AXL抗體之磷酸化活性誘發劑可體現 在使用抗-AXL抗體誘發磷酸化的方法。包括本發明抗 抗體之磷酸化活性誘發劑亦可體現在使用抗_a汀抗體製 備碗酸化活性誘發劑。

0 本發明亦提供磷酸化活性抑制劑，係包括抗-AXL抗 體。本發明磷酸化活性抑制劑正常抑制AXL配體（如Gas6 ) 與AXL結合所誘發之磷酸化。雖然磷酸化抑制標的並無特 別限定，該標的正常為具有酪胺酸之多肽，較佳為axl。 作為本發明磷酸化活性抑制劑之抗體並無特定限 定。如’前述具有拮抗活性的抗體。 包括本發明抗-AXL抗體之磷酸化活性抑制劑可體現 在使用抗AXL抗體抑制碟酸化的方法。包括本發明抗_axl ❿ 抗體之磷酸化活性抑制劑亦可體現在使用抗—AXL抗體製 備破酸化活性抑制劑。 降低 AXL 表現量之藥劑（Agents for 1 owering the AXL expression level ) 本發明亦提供降低AXL表現量之藥劑，係包括抗-axl 抗體。降低AXL表現量之藥劑降低表現AXL之細胞中AXL 表現量。表現AXL之細胞並無特別限定。這些細胞案例包 括癌細胞（Calu-1、MDA-MB-231、DU-145 等）。 2125-10145-PF 54 200936160 AXL表現量降低可為透過AXL降解等已現存axl數量 減少或可因抑制AXL表現新表現AXL數量減少。 包括本發明抗_AXL抗體之降低AXL表現量之藥劑可 體現在使用抗-AXL抗體降低AxL表現量的方法。包括本發 明抗-AXL抗體之降低AXL表現量之藥劑亦可體現在使用 抗-AXL抗體製備降低axl表現量之藥劑。

φ 本發明血管新生抑制劑、胞生長抑制劑、磷酸化活性 誘發劑、磷酸化活性抑制劑或降低AXL表現量之藥劑可口 服或非經腸道（parenteral)給藥。較佳為非經腸道給藥。 這給藥方法具體案例包括注射給藥、經鼻腔給藥 (transnasal administration )、經肺給藥 (transpulmonary administration )及經皮給藥 (transcutaneous administration)。本發明醫藥組合 物可以注射給藥，如靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮 ® 下注射等系統或局部給藥。給藥適合方法可按病患年紀及 症狀而選擇。劑量選擇如於每次給藥每公斤體重〇 〇〇〇1 mg至1 000 mg範圍内。另外，劑量選擇如每病患〇. 〇〇1 至1 00, 000 m範圍内。然而，本發明醫藥組合物劑量此處 並不限。 本發明血管新生抑制劑、胞生長抑制劑、磷酸化活性 誘發劑、磷酸化活性抑制劑或降低AXL表現量之藥劑可按 一般方法（如 Remington，s Pharmaceutical Science， latest edition， Mark Publishing Company， Easton， USA) 2125-10145-PF 55 200936160 調配’並可包括醫藥可接受載體或添加劑。該載體及添加 劑案例包括但不限定於界面活性劑、載體、著色劑、香料、 防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張劑、接著劑、崩 散劑、潤滑劑、流動促進劑（fluidity promoter)及芳 香劑。其它常用載體亦可用。這載體具體實例包括輕矽酐 (light silicic anhydride )、乳糖、結晶纖維素 (crystal 1 ine cel lulose )、甘露酵、澱粉、羧甲基纖 ❹ 維素鈣（carmel lose calcium)、羧曱基纖維素鈉、羥丙 基纖維素（hydroxypropyl cellulose)、經丙基曱基纖 維素、聚乙稀醇縮乙酸二乙胺基乙酸酯（p〇lyVinylacetai diethylaminoacetate )、聚乙烯吡咯烷酮 (Polyvinylpyrrolidone )、明膠、中鏈甘油三醋 (medium-chain fatty-acid triglycerides)、聚氧乙 稀氫化 t 麻子油 60 ( polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60)、蔗糖（saccharose)、羧甲基纖維素 β ( carboxymethyl cellulose)、玉蜀黍澱粉（cornstarch) 及無機鹽等。 發明者首先發現抗-AXL抗體具有血管新生抑制作用 及抗腫瘤作用。本發明抗-AXL抗體可用作血管新生抑制劑 及用以細胞生長抑制劑。使用本發明抗體，亦可誘發或抑 制磷酸化活性。使用本發明抗體，亦可降低AXL表現量。 所有引證前案結合於此做為參考。 2125-10145-PF 56 200936160 本發明將透過以下實施例而被更加地瞭解，然此僅用 以說明，並非限制本發明範圍。 實施例1 1-1 抗原製備 倉鼠卵巢細胞（CHO (dhfr -)細胞）以融合蛋白 (hAXL-ECDiIgG2aFc)之表現載體轉染，其融合蛋白係人 ❹ 類AXL胞外區域及小鼠igG2a Fc區域融合；生產 hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白之CH0細胞株以G418篩選選殖。 收集培養於無血清培養基（CH0_S_SFM n; Gibco)之生產 hML-ECDiIgG2aFc蛋白的CH0細胞株懸浮液添加至G蛋 白親和性管柱（HiTrap Protein G HP, GE Healthcare)以 結合緩衝液（20 mM磷酸緩衝液，PH 7. 0)平衡。以結合緩衝 液洗去未結合之蛋白後，以沖提緩衝液（1 〇〇禮甘油-ye 1， pH 2.7)收集hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白層至含有中性緩衝 Ο 液（1 M Tris-HCl，pH 9. 0)之管中。然後，經純化蛋白之 緩衝液以磷酸緩衝生理鹽水 （pH 7.35 - 7.65; Takara

Bio)取代’經純化蛋白以截留分子量i〇 kDa超濾濃縮套 組（Centricon (註冊商標），Millipore)濃縮。經純化蛋 白濃度計算波長280 nm吸光值（absorbance)，按pace aA (Prof. Sci. (1 995) 4，2411-2423)計算式計算莫耳 吸收係數（mol ar absorption coefficient) ° • · 1-2 生產抗-AXL-抗體融合瘤製備 2125-10145-PF 57 200936160 四種BALB/c小鼠（雄性，免疫開始六週大，Charles River Laboratories Japan)及兩隻 MRL/lpr 小鼠（雄性， 免疫開始六週大 ’ Charles River Laboratories Japan) 以前段製備之抗原ChAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白）使之免疫。 抗原以弗氏完全佐劑（Freund’ s complete adjuvant) (H37 Ra，Difco Laboratories)乳化，皮下注射 40 pg / 頭作為初始免疫。兩週後，再以弗氏完全佐劑（Di f co O Laboratories)乳化之抗原皮下注射40 pg /頭。該動物後 續使之免疫一週内三次以上。以EL ISA確認反應該抗原之 血清中抗體效價（antibody titer)消長，如下節所述， 隨後，抗原以磷酸緩衝生理鹽水（無鈣離子或鎂離子之磷 酸緩衝生理鹽水 ’ PBS( - ); Nissui Pharmaceutical )稀 釋，靜脈注射10 gg/頭作最後免疫。最後免疫後三天，將 小鼠脾臟細胞及小鼠骨髓瘤細胞P3X63Ag8U. 1 (參閱P3U1， ATCC CRL-1597)按一般方法以 PEG 1500 (Roche ❹ Diagnostics)融合。該融合細胞培養於含有 1〇% FBS (Invitrogen)之 RPMI 1 640 培養基（Invitrogen)(此處稱 之10% FBS/RPMI 1640)。融合後一天，該融合細胞懸浮於 半流體培養基（StemCe 11s)，隨之進行該融合瘤篩選培養 及選殖。融合後10天或9天，從培養基挑出融合瘤細胞 群落，並種植於含有HAT篩選培養基（10% FBS/RPMII 640, 2 vol% HAT 50χ 濃度[Dainippon Pharmaceutical]及 5 , vol% BM-Condimed HI [Roche Diagnostics])之 96 穴盤， 每一穴一細胞群落。培養3-4天後，收集每穴之懸浮液，

2125-10145-PF 58 200936160 以纟帛選具對人axl胞外區域之結合活性的融合瘤，篩選係 以測量它們對前述抗原及以小鼠I gG2a之Fc區域融合的 對fe蛋白之結合活性’如下節所述。 經篩選融合瘤懸浮液之結合活性如表1所示。 [表1] AXL 2nd SC Abs 2nd SC Abs 2nd SC Abs 2nd SC Abs IgG 群落編號 AXL-mFc FGFR2-mFc AbsA AXL-His Binding 7 2. 053 0.057 1.996 1.118 0,66 51 1.844 0.058 1.786 0.538 0.55 232 1.353 0.061 1.292 1.204 0.575 96 2,122 0. 058 2.064 1.554 0.635 119 2.208 0. 063 2.145 1.527 0. 668 223 2.076 0. 071 2.005 1.542 0.339 225 0.629 0.055 0.574 0.642 0.859 258 2.005 0.078 1.927 1.028 0. 74 284 0.619 0.064 0.555 0.124 0.857 285 1.804 0.058 1.746 0.914 0.965 292 1.877 0.069 1.808 1.234 1.052 φ 本發明者篩選之融合瘤已寄存於日本產業技術綜合 研究所特許生物寄託中心。下列針對寄存塑提供之敘述内 容： (a) 寄存機構单位及住址 單位：日本產業技術综合研究所特許生物寄託中心 (International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) 住址：Tsukuba Central 6，卜卜i Higashi，Tsukuba， 2125-10145-PF 59 200936160

Ibaraki, Japan 305-8566 (b) 接受曰期（寄存曰期）：2007年7月5曰 (c) 寄存編號： AXL No. 7 #070402 (Ax7)(寄存編號 FERM BP-1 0850)

(Ax51)(寄存編號 FERM (Ax232)(寄存編號FERM (Ax96)(寄存編號 FERM AXL No. 51 BP-10851) AXL No. 232 BP-10855) AXL No. 96 BP-10852) AXL No. 223 BP-10853) AXL No. 225 BP-10854) AXL No. 258 BP-10856) AXL No. 284 BP-10857) AXL No. 285 BP-10858) AXL No. 292 BP-10859)

#070406 #070406 #070402 #070402 (Ax223) #070402 (Ax225) #070402 (Ax258) #070402 (Ax284) #070402 (Ax285) #070411 (Ax292) (寄存編號 FERM (寄存編號 FERM (寄存編號 F E R Μ (寄存編號 FERM (寄存編號 FERM (寄存編號 FERM 1-3 與人AXL之結合活性

2125-10145-PF 60 200936160 將以覆附緩衝液（coating buffer) (100 mM碳酸氫 納[pH 9·6]’ 0.02% 叠氮化納（s〇dium azide))稀釋至 1 pg/mL 抗原（hAXL-ECD-mIgG2aFc)或以小鼠 lgG2a 之 Fc 區域融合的對照蛋白對照放入96穴盤（Nunc_Immun〇™ 96 M i croWe11 Max i Sorp™ plate; Nalge Nunc

International)80 gL/穴，隨之，培育於4。〇至少過夜。 以含有0.05 vol°/D Tween (註冊商標）磷酸緩衝液20 (tPBS[-])清洗三次後，該穴盤以稀釋缓衝液 (BlockingOne 1/5 稀釋液；Nacalai Tesque)於 4°C 至少 過夜阻斷。移去換緩衝液後’小鼠抗血清或以稀釋緩衝液 稀釋之融合瘤懸浮液家至穴盤中80 μίν穴，隨之於室溫培 育一個小時。該穴盤以tPBS(-)清洗三次後，HRP -標定 抗-鼠IgG抗體（Stressgen)以稀釋緩衝液稀釋ι/5〇〇〇,80 jxL/穴加入之，隨之於室溫培育一個小時。該穴盤以 tPBS(-)清洗五次後’呈色基質（chrom0genic φ substrate)，過氧化酶基質（Kirkegaad & Perry Laboratories)，80 μί/穴加入之，隨之於室溫培育2〇分 鐘。添加80 μίν穴過氧化酶中止溶液（ peroxidase Stop Solution) (Kirkegaad & Perry Laboratories)，以微量 盤測讀儀機型 3550 (Bio-Rad Laboratories).於波長 405 nm讀取吸光值。 1-4 自融合瘤培養懸浮液之抗體純化 上述因而產生之融合瘤培養於使用低IgG胎牛血清 2125-10145-PF 61 200936160 (Invitrogen)之HAT篩選培養基中。溶劑以清洗緩衝液 (20 mM醋酸鈉，pH 5.0)取代，G蛋白小珠（pharmacia)加 至20 - 50 mL該培養懸浮液，50 μί/1〇 mL培養懸浮液， 隨之於4°C倒轉混合過夜。回收G蛋白小珠及以清洗緩衝 液清洗後，該抗體以沖提緩衝液（5 〇 mM醋酸鈉緩衝液，pH 3.3)沖提，遂後立即以中和緩衝液（Tris_HC1緩衝液，pH 7.8)中和。該緩衝液以璘酸緩衝生理鹽水π ?. _ Nissui Pharmaceutical)取代，經純化蛋白以截留分子量 10 kDa超濾濃縮套組（Centricon (註冊商標），Mi 11 ipore) 濃縮，隨後以 0·22μιη 滅菌濾器（MilliporeGV，Millipore) 滅菌。 實施例 2 :抗體讀發磷酸化分析 測試實施例1所獲得之抗-AXL單株抗體誘發癌細胞 中AXL填酸化反應的能力。細胞（人類非小細胞肺癌細胞 Φ 株Calu-1、人類乳癌細胞株MDA-MB-231及人類***癌 細胞株DU-145)種植於六穴盤，密度4 X 105細胞/穴， 24小時後，該培養基以移去血清之培養基（血清饑餓培養 基（serum-starved medium))取代，該細胞培養過夜。接 著，添加2 pg/mL上述製備抗-AXL單株抗體；及添加200 ng/mL重組GAS6 (R&D)作為正對照組，隨後於37°C培育 30分鐘。接著，該細胞以PBS (-)清洗，以細胞分解液（ce 11 lysis buffer) (137 mM NaCl, 20 raM Tris-HCl [pH 8. 0], • · 10% 甘油，2 mM EDTA, 1 mM 鈒酸納[sodium vanadate], 2125-10145—PF 62 200936160 1 vol% NP-40, 1 mM 苯甲基磺醯化氟 [phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF]，10 pg/mL 牛蛋 白[aprotinin]，lOgg/mL 亮肽素[leupeptin])，l〇eg/mL 胃酶抑素[peps tat i n ])於冰上將細胞溶解。該細胞溶液混 合物以超音波均質機（Tomy Seiko)使均勻，隨後於4°C離 心（20, 000 X g) 10分鐘。該混合物懸浮液與〇. 〇5體積 G蛋白質洋菜膠（Roche Diagnost i cs)混合30分鐘。於4 ⑩ °C離心（2, 300 X g)l分鐘後，添加1. 2 抗-AXL單株 抗體（R&G)至該懸浮液，於4°C搖1小時。然後，添加10 pLG 蛋白質洋菜膠，該溶液再於搖1小時。於4°C離心 (2，300 X g)l分鐘後’清洗該免疫沉澱物，使懸浮於

NuPAGE-LDS樣本緩衝液（Invitrogen)，然後於70。加熱10 分鐘。該免疫沉殿物使用7% NuPAGE (111'^1；1*〇层611)電泳， 15 0 V 1小時。 免疫沈澱及於7% NuPAGE電泳後，將該蛋白於轉印緩 ❿ 衝液（transfer buff er )( Invitrogen)(該緩衝液含有 2 0 vo 1 %甲醇），以3 0 mA轉印1小時，轉印至〇 · 45 μπι 聚偏二氟乙烯（polyvinylidenedifluoride，PVDF)濾膜 (Immobilon-FL，Millipore)。該濾膜以 TBS (50 mM Tris-HCl [pH 7.6]， 150 mM NaCl)清洗四次，然後於

Odyssey 阻隔緩衝液（Odyssey blocking buffer)(Li-COR) 培育過夜。該濾膜清洗四次，每次以TBST (含〇. 05 vol% Tween (註冊商標）20之TBS)清洗五分鐘，然後與生物素 4G10抗磷酸化酪胺酸抗體（以TBST稀釋1:1, 〇〇〇; Upstate) 2125-10145-PF 63 200936160 a 及抗-AXL 抗趙（以 TBST 稀釋 i:15, 〇〇〇; Santa Cruz)於 室溫培育2小時。 該濾、膜清洗四次，每次以TBST清洗五分鐘後，該濾 膜與 Alexa 680-標定卵白素（Alexa 680-labeled 3什6?土3¥1(^11)(11^11：1'0§611)(以了851'稀釋1:1〇,〇〇〇)及 IRDye 800-標疋抗山羊二級抗體（R〇ckiand)(以tbsT稀 釋1:1 0 ’ 0 0 0)培育1小時。該濾膜清洗四次，每次以Τβςτ ❹清洗五分鐘後，它再以TBST清洗五分鐘一次，然後以 Odyssey近紅外光影像系統（u_c〇K)掃瞄。 該免疫沈澱胞内AXL與抗-AXL抗體進行免疫墨點轉 潰所獲得之條帶和它與抗磷酸化酪胺酸抗體進行免疫墨 點轉潰所獲得之條帶重疊，添加抗-AXL單株抗體Αχ285、 Αχ292、Αχ223、Αχ96及Αχ258後及添加重組GAS6作為正 對照組後（圖la、b、c、d及e)，發現該條帶酪胺酸磷酸 化之AXL條帶增強。因此，添加本發明者所獲得之抗 ® 單株抗體可發現AXL之酪胺酸磷酸化增強。是以，這些抗 -AXL單株抗體可誘發AXL激酶區域磷酸化。 宜^例. 3 :抗體對配體依摄抑制分耕 細胞内配體依賴碟 細胞株Calu-1、人 測試該抗-AXL單株抗體對抑制癌 酸化的能力。細胞（人類非小細胞肺癌 類乳癌細胞株ΜΜ-ΜΒ-231及人類***癌細胞株 DU-145)種植於六穴盤，，密度4 χ 1〇5細胞/穴’ 24小時 後，該培養基以移去血清之培養基（血清譏餓培養基）取 2125-10145-PF 64 200936160 代，該細胞培養過夜。接著，添加2 實施例i製備 之抗-AXL單株抗體及同時添加2〇〇 ng/mL重組GAS6 (R&D) ’於37°C培育30分鐘。接著，該細胞以PBS(-)清 洗，以前述之細胞分解液萃取該蛋白。該細胞分解產物與

市售抗-AXL抗體（Santa Cruz™)免疫沈澱，於7% NuPAGE (Invitrogen)分離，以西方墨點法進行免疫墨點轉潰及進 行赂胺酸磷酸化分析。該免疫沈澱胞内AXL與以它的配體 之GAS6處理的抗磷酸化酪胺酸抗體進行墨點轉潰。然而， 該抗-AXL單株抗體Ax7及Ax51使該抗磷酸化酪胺酸抗體 墨潰變弱（圖2a及b)。因此，確認AXL之配體依賴酪胺 酸磷酸化因暴露於該本發明者所獲得之該抗_AXL單株抗 體而被抑制。這些抗-AXL單株抗體可抑制AXL激酶區域配 體依賴磷酸化。 1_施例4 :抗體誘發AXL I白分解分妍 © 測試該抗_AXL單株抗體對抑制癌細胞内AXL蛋白分 解的能力。細胞（人類非小細胞肺癌細胞株Ca丨u_丨、人類 乳癌細胞株MDA-MB-231及人類***癌細胞株DU-145 ) 種植於六穴盤’密度4 X 1 〇5細胞/穴，24小時後，該培 養基以移去血清之培養基（血清饑餓培養基）取代，該細 胞培養過夜。接著，添加2 pg/mL前述製備之抗-AXL單株 抗體及添加200 ng/mL重組GAS6 (R&D)作為正對照組，隨 後於37。(：培育24小時。接著，該細胞以pbs(-)清洗， 以前述之細胞分解液萃取該蛋白。該細胞分解產物與市售 2125-10145-PF 65 200936160 抗-AXL 抗體（Santa Cruz™)免疫沈澱，於 7% NuPAGE (Invitrogen)分離，以西方墨點法進行免疫墨點轉潰及進 行酪胺酸磷酸化分析。 每蛋白溶液25 pg使懸浮於NuPAGE-LDS樣本緩衝液 (Invitrogen)，於 70。加熱 10 分鐘。於 7% NuPAGE (Invitrogen)電泳，150 V 1小時。經電泳分離之膠體於 NuPAGE轉印緩衝液（InvitrogenX該緩衝液含有20 vol% 曱醇），以30 mA轉印1小時，轉印至0. 45 μιη聚偏二氟 乙烯渡膜（Immobi 1 on-FL，Mi 11 ipore)。該遽膜以 TBS (50 mM Tris-HCl [pH 7. 6]，150 mM NaCl)清洗，然後於 Odyssey 阻隔緩衝液（Li-COR)培育過夜。該濾膜清洗四次，每次以 TBST清洗五分鐘，然後與抗-AXL抗體（以TBST稀釋 1:1 5,000; Santa Cruz)及抗-肌動蛋白抗體（anti-actin antibody )(以 TBST 稀釋 1 :5, 000; TBST)於室溫培育 2 小時。該濾膜清洗四次，每次以TBST清洗五分鐘後，該 滤媒與Alexa 680-標疋抗兔二級抗體（Invitrogen)(以 TBST稀釋1:1 0,000 )及IRDye 800-標定抗山羊二級抗體 (Rockland)(以TBST稀釋1 :1 0, 〇〇〇)培育1小時。該滤膜 清洗三次，每次以TBST清洗五分鐘後，它再以TBST清洗 五分鐘一次，然後以Odyssey近紅外光影像系統（Li_C0R) 掃瞄。 AXL墨潰暴露該抗-AXL單株抗體Αχ285、Αχ292、 Αχ223、Αχ96、Αχ258、Αχ284 ' Αχ7·及 Ax225，發現 AXL 墨

潰變弱（圖3a、b、c、d、e、f、g及h)。因此，這些抗-AXL 2125-10145-PF 66 200936160 單株抗體可誘發AXL蛋白分解。 -實施例—:_抗-AXL抗體體外tfa管新生抑告丨活性 以市售Kurabo Industries血管新生套組測試抗—axl 抗體抑制人類臍靜脈内皮細胞（human umbi 1 ical vein endothelial cell，HUVEC)管腔形成之活性。該實驗步驟 ❹

係按套組所提供說明書，摘要如下。HUVEC及纖維母細胞 共培養，含早期管腔形成成長階段之細胞的24穴盤（套 組提供）放置於培養箱，37t於5% c〇2濕潤空氣下培養3 小時。二瓶含25 mL·特殊目的培養基（套組提供）之容 器瓶蓋轉鬆，放置於於培養箱，3rc於5% CL濕潤空氣下 培養約30分鐘。然後從培養箱將穴盤移出，去掉孔穴蓋 片…後以新的蓋片（套組提供）蓋住穴盤。於顯微鏡下 觀察。，確認該細胞是否正常。培養基（>12mL/盤）加溫 至371，裝入Falcon管，加入vegf_a (2叫/此）至該培 養基’稀釋2GG倍，最後濃度1Gng/mL。添加前述製備抗 -AXL抗體至倒人該管中之培養基，最後濃度1()叫/以。 PBS(-)代替抗體作為負對照組。於2扣穴盤中空穴之培養 基緩慢抽氣移除’然後緩慢添加5〇〇吣含藥培養基。於 顯微鏡下觀察該細胞狀況’然後將它們轉回該培養箱。該 培養基以相同步驟於第4、7及9天替換，抗體加入為第i 天以管腔染色套組 之說明書進行，摘 固定該細胞層，添加抗體後第U (KUrab〇)染色。該步驟按該套組所提供

2125-10145-PF 67 200936160 要如下。於顯微鏡觀察該細朐接 ^ ^ ^ X阳飑後，培養基緩慢抽氣移除， 添加“L清洗緩衝液(PBS(')PH7.4;Sigma)至每一孔

穴以清洗該穴；錢抽氣移除該清洗緩衝液。添加i mL 冰冷固定溶液（70%乙醇）至每一 ^芏母穴，於室溫停留30分鐘。 移除固定溶液’添加1 mL阻隔镑俺^ ±

Uh丨且知緩衝液至每一穴，清洗該 穴，抽氣移除該阻隔緩衝液。套組提供之初級抗體按說明 書稀釋’ 0.5 加至每一穴，隨後於於抓培育丄小 ❹時。抽乳移除該初級抗體，以丄mL阻隔緩衝液（含i% bsa 之PBS(- )，PH 7.4; Sigma)清洗三次。套組提供之二級 抗體按說明書稀釋，0.5 mL添加至每一穴，隨後於3rc 培育1小時。抽氣移除該二級抗體，以丨蒸餾水清洗 三次。0.5 raL套組提供之受質溶液添加至每一穴，於37 °C培育10 - 30分鐘，直到該管腔變成黑紫色。抽氣移除 該受質溶液，以1 mL蒸餾水清洗三次，風乾。每一固定 穴顯微影像以CCD照相機（Nikon Digital Camera， ❿ dxml 200)捕捉5個位置；該管區域使用血管新生定量分析 軟體計算（Ver. 1.0，Kurabo)。 添加抗-AXL抗體相對於添加負對照pbs(-)之管腔中 形成血管減少區域比率作為抗體抑制活性之指標，

Ax232、Ax292、Ax285及Ax284顯示該抑制活性（圖4)。 實施例 6 :該抗-AXL抗體對小鼠AXI.娃A、壬把 小鼠胞外區域（此處稱mAXL-ECD; R&D )以覆附緩衝 液（100 mM sodium碳酸氫鈉，pH 9.6)稀釋至2 pg/mL後，

2125-10145-PF 68 200936160 100 从裝入 96 穴盤（Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM MaxiSorp plates; Nalge Nunc International)。該穴 盤放置於冰箱過夜，移出該穴盤中抗體溶液，倒入200 μι/ 八稀釋緩衝液（BlockingOne; Nacalai Tesque)，然後於 室溫阻斷2小時。移除該稀釋緩衝液後，前述製備抗-AXL 抗體以稀釋緩衝液稀釋至3 pg/mL，放入1〇〇 穴，於 室溫靜置1 · 5小時。移除該抗體溶液後，該穴以tPBS(-) 清洗三次。包含鹼性磷酸酶標定山羊抗小鼠IgGl抗體 (alkaline-phosphatase-labeled goat anti-mouse IgGl antibody)、鹼性磷酸酶標定山羊抗小鼠igG2a抗體及鹼 性麟酸酶標定山羊抗小鼠IgG2b抗體（SouthernBiotech) 之標定抗體雞尾酒製備成每一抗體最後稀釋比例為 1/2250:1/4000 : 1/4000，倒入 100 μί/穴，於室溫靜置 1 小時。移除該抗體溶液後，該穴以tPBS(-)清洗三次。倒 入 100 μι/穴鹼性磷酸酶呈色基質溶液（BluePhos 粵 Microwell Phosphatase Substrate System, Kirkegaad & Perry Labor at or i es)，隨後於室溫顯色。以微量盤測讀 儀（Emax，MolecularDevices)於波長 650nm 讀取吸光值。 確認 Ax96、Axll9、Ax223、Ax225 及 Ax284 對於小鼠 AXL之結合。 實施例 7 :抗-AXL抗體體外癌細胞生長抑制活性 使用購自 ATCC 之 HCT-116 (CCL-247) 、 Calu-1 •-

(HTB-54)、DU-145 (HTB-81)及 T-47D (HTB-133)與購自大 2125-10145-PF 69 200936160 日本住友製藥之pANC—i進行評估。該細胞以提供者所建 議之條件維持培養。前述製備抗_AXL抗體以10% FBS/RPMI 1640系列稀釋，2〇吣倒至96穴盤（平底）。 HCT-116 ^ Calu-1 ^ DU145 ^ T-47D ^ AsPC-1 ' MDA-MB-231 及PANC 1細胞每一懸浮液個別製備成每穴2〇〇〇、、 2000、5000、3000、5000 及 3,〇〇〇 個細胞，18〇 吣細胞 懸浮液加至每穴，培養於3rc 5% c〇2培養箱。4天後， ❹添加10 pL WST-8 (細胞計數試劑套組_8，D〇jind〇 Laboratories)至每穴中，按套組說明書以微量盤測讀儀 (Model 3550 UV，Bio-Rad)於波長 45〇nm 讀取吸光值。 該抗AXL抗體細胞生長抑制活性（％)計算以指定當無測試 物質於内所測值為0%抑制；已指定當無無測試物質或細胞 於内所測值為1〇〇%抑制。

Ax51顯示對於HCTU6細胞之3〇%以上cgi活性。 [表2] ---------- HCT116 1st 9.ηά TOP 1/3 1/9 TOP 1/10 Αχ51 31 11 10 12 15

瘤作用測晋 1 · 製備人類胰臟腺癌小鼠模型 購自大日本住友製藥之人類胰臟腺癌細胞株以％」 以HBSS製備成5 X 1〇7個細胞/以。以皮下注射200 μί 2125-10145-PF 70 200936160 細胞懸浮液（1 X 107 個細胞/小鼠）至 CAnN.Cg-Foxnl<nu>/CrlCrlj nu/nu (BALB-nu/nu)小鼠 (購自 Charles River Laboratories, Japan)鼠蹊部 位。該小鼠腫瘤體積達約21 0 mm3即可作實驗。 2. 抗體製備及投藥 表1抗體以PBS製備2 mg/mL，兩週每週注射兩次20 ing/kg至該人類胰臟腺癌小鼠模型腹膜腔。以相同方式注 _ 射 PBS 作負對照組。健擇（Geinzar) (EH Ully Japan) 以生理食鹽水製備成12 mg/mL，作為正對照組，兩週每週 腹膜内注射兩次120mg/kg腹膜内注射。 3 · 抗腫瘤作用評估 計算人類胰臟腺癌小鼠模型抗腫瘤作用以最後給藥 後四天比較抗體處理組腫瘤生長與負對照組腫瘤生長作 為腫瘤生長抑制作用（圖5)。 > 腫瘤生長抑制作用（％)= (1 __枋 沉體處理組腫瘤生長量 /對照組腫瘤生長）χ 1〇〇 4 · 統計分析

腫瘤體積以平均值士標車葚志_ g ϋ Λ # 、 不。統計分析為使用SAS 臨床别期套裝軟體版本5 〇中τςη Α 租門#显來分析對照組及處理 組間差異。咖度(*: p<0.05)判定為顯著水準。

5. 結果 2125-10145-PF 71 200936160 所有抗體抑制腫瘤生長並顯示抗腫瘤作用（圖5 )。 實施例_9 :抗-AXL抗體對人類胰臌腺戚，丨、鼠模型之 抗腫瘤作用測量（2) 1 · 製備以人類胰臟腺癌小鼠模型 購自大日本住友製藥之人類胰臟腺癌細胞株PANC4 以HBSS製備成5 X 107個細胞/mL。以皮下注射200 μΐ^ 細胞懸浮液（1 X 107個細胞/小鼠）至 CAnN.Cg-Foxnl<nu>/CrlCrlj nu/nu (BALB-nu/nu)小鼠 (購自 Charles River Laboratories, Japan)鼠蹊部位。 該小鼠平均腫瘤體積達約270 mm1即可作實驗。 2. 抗體製備及投藥 抗-AXL抗體以PBS製備2 mg/mL，兩週每週注射兩次 20 mg/kg至該人類騰臟腺癌小鼠模型腹膜腔。以相同方式 © 注射 PBS 作負對照組。健擇（Gemzar) (Eli Lilly japan) 以生理食鹽水製備成12 mg/mL ’作為正對照組，兩週每週 腹膜内注射兩次12〇mg/kg腹膜内注射。 1 抗腫瘤作用評估 計算人類胰臟腺癌小鼠模型抗腫瘤作用以最後給藥 後四天比較抗體處理組腫瘤生長與負對照組腫瘤生長作 為Μ瘤生長抑制作用。 腔瘤生長抑制作用（％) = (1 _抗體處理組腫瘤生長量 2125-10145-PF 72 ° 200936160 /對照組腫瘤生長）χ 4. 結果 腫瘤生長抑制結果如圖6所示。低於30%之腫瘤生長 抑制作用以“-”表示；30%或以上之腫瘤生長抑制作用 以‘‘ +”表示；以及60%或以上之腫瘤生長抑制作用以 鲁 ❹ + +表不。實施例3中抗體對配體依賴磷酸化抑制分析 結果亦如圖6所示。 與FND-1結合之抗體顯示6〇%或以上之TGI活性，甚 至當平均腫瘤體積達約.270 mm3此時開始給藥。這發現與 FND1結合之抗-AXL抗體於體内具這樣顯著抗腫瘤作用， 這疋首見於本研究’完全無法被預期。 此外’與IgD2結合之抗體顯示磷酸化抑制作用及體 内抗腫瘤作用，如實施例3、8及9所示，這是首見於本 研究’亦完全無法被預期。 實施例10 :剩·人類AXL-FND1及人類AXL-IgD2之結 合活性 1· 對人類AXL-FND1及人類AXL-IgD2之結合活性 測試抗-AXL單株抗體對AXL纖維粘連蛋白第三型第 一結構區（AXL-fibronectin type 3 domain 1，AXL-FND1) 及免疫求蛋白豕族第二結構區（AXL immunoglobulin fami ly domain 2, AXL-IgD2)AXL-IgD2 之結合活性。 2125-10145-PF 73 200936160 2. 製備人類重組AXL-FND1及人類重組AXL-IgD2表現載 體 製備人類重組AXL-FND1以PCR放大等同全長人類AXL cDNA第225至331個胺基酸的部位（〇’ Bryan, ei aA， Mol. Cell. Biol. (1991) 11, 5016-5031) (GenBank No. NM 021913)，選殖該放大之產物至 pET-41a( + ) (Novagen)，以表現帶有GST標籤的融合蛋白並構築 pET-AXL-FNDl。製備其它結構區以PCR放大等同第137至 224個胺基酸的部位’選殖該放大之產物至pET-41a( + )， 以表現帶有GST標籤的融合蛋白。每一製備載體（5 μ1)以 熱浴（heat shock)轉形至 DH5a (Toyobo Co.，Ltd.，Cat. No. DNA-903) ’然後培養於S0C培養基。細胞群落於37 °C培養於含卡那毒素（kanamycin)的LB盤過夜後，篩選 之0

3.人類重組AXL-FND1及人類重組AXL-IgD2純化 每一所產出之細胞群落前培養於37<>c在含卡那毒素 (kanamycin)的20 mLLB培養基過夜，然後轉移到5〇〇mL 培養基。每一細胞群落培養至A_ 〇f 〇 5 ± 〇.〇5，加入 IPTG調整成濃度0.5 mM。於371培養1小時後，收集 該細菌細胞，使懸浮於緩衝液A (Buffer A) (5〇墟

Tris HC1 (pH 8· 0)，1 ㈣ EDTA，〇· 5 mM PMSF 及 1 mM DTT)。 使用液態氮冷束及解來重複兩：欠。然後加入Np_4〇至 0. 5%，該細胞以超音波的暫撒姑> & 〕貝機使之均勻（30秒X 5)並離

2125-10145-PF 200936160 心於240, 0 00 x G 30分鐘，然後回收懸浮物。 人類重組AXL-FND1使用該因而產生之懸浮物以下述 方法純化。溶解之[co/i·懸浮物與穀胱苷肽瓊脂糖凝膠 (Glutathione Sepharose™ 4 Fast Flow ) (GE Healthcare) ’以攪拌機於4°攪拌1小時。於500 x G離 心5分鐘後，該懸浮物丟棄，加入緩衝液a清洗 Glutathione Sepharose™ 4B。這清洗步驟重複三次。將 該人類重組 AXL-FND1 從 Glutathione Sepharose™ 4 Fast ❹

Flow轉移至微型柱（mini-column)後，將它分離並以〇 111肘11'13-11(^1(卩117.5)及25 11^榖胱普肽自6111131111〇116

Sepharose™ 4 Fast Flow沖提出。每一其它AXL結構區 以相同方法表現、分離及沖提。 4. 以西方墨點轉潰法（Western Blotting )評估抗-AXL 抗體對AXL-FND1之結合活性 _ 自 Glutathione Sepharose™ 4 Fast Flow 分離及沖 提出之人類重組 AXL-FND1 及 AXL - IgDl、AXL - IgD2、 AXL-FND2、AXL - IgDl + IgD2、AXL - IgD2 + FNDl、及 AXL - FND1 + FND2 使用 BIO-RAD Dc Protein Assay 定量。 每一蛋白1 pg與NuPAGE®樣本緩衝液（invitrogen)混 合，以NuPAGE® 10% Bis-TrisGel膝體跑電泳。該電泳交 醴轉印至 ImmobilonTM-FL (Millipore) PVDF 膜。含該轉 印之蛋白的PVDF膜以Odyssey p导隔緩衝液（Li-COR)阻 隔’浸於初級抗體溶液’其抗-AXL抗體稀釋至5 pg/mL， 2125-10145—PF 75 200936160 於4°C培育過夜。含該轉印之蛋白並浸於初級抗體溶液的 PVDF膜清洗四次，每次以0.1% TBS-T (TBS (含0.1%

Tween-20 之 Tris-Buffered Saline (Takara)))清洗 5 分

鐘。將浸於初級抗體溶液之PVDF膜浸於稀釋至80 ng/mL 的 Alexa Fluor® 680 山羊抗小鼠 IgG (H+L) (Invitrogen) 二級抗體溶液，於室溫培育1小時。浸於二級抗體溶液之 PVDF膜清洗三次，每次以〇. 1% TBS-T清洗5分鐘後，該 ❿ 膜以含0.01% SDS之TBS-T清洗5分鐘，然後以TBS清洗 5分鐘。之後’經清洗PVDF膜以Odyssey近紅外光影像系 統掃瞄評估其結合。 5. 結果 該評估結果如圖6所示。

寄存編號FERM BP-1 0854 (Ax225)之融合瘤所產之抗 -AXL抗體顯示可辨識AXL之FND1 (圖6)。寄存編號FERM ® BP—10857 (Ax284)之融合瘤所產之抗-AXL抗體被認為可 辨識AXL之FND1及IgD2(圖6)。寄存編號FERMBP-10850 (Ax7)之融合瘤所產之抗-AXL抗體及寄存編號FERM BP-10851 (Ax51)之融合瘤所產之抗-AXL抗體顯示可辨識 AXL 之 IgD2 (圖 6)。 實施例—11 .__扣» ~~AXL抗體對人類乳癌小窟,模型之抗贐 瘤作用測詈 1 ·製備人類乳癌小鼠模型 2125-10145-PF 76 200936160 獲自ATCC之人類乳癌細胞株MDA-MB-435S以HBSS製 備成5 X 107個細胞/mL。以皮下注射200 μί細胞懸浮液 (1 X 107 個細胞/小鼠）至 CAnN.Cg-Foxnl<nu>/CrlCrlj nu/nu (BALB-nu/nu)小鼠（購自 Charles River Laboratories，Japan)鼠蹊部位。該小鼠腫瘤體積達約 200 mm3即可作實驗。 2. 抗體製備及投藥 抗體以PBS製備2 mg/mL，兩週每週注射兩次20 mg/kg 至該人類乳癌小鼠模型腹膜腔。以相同方式注射ΡΒς作負 對照組。 3. 抗腫瘤作用評估 计算人類乳癌小鼠模型抗腫瘤作用以最後給藥後四 天比較抗體處理組腫瘤生|盘A Jkt οη Λα . ❹ ’王责興負對照組腫瘤生長作為腫 瘤生長抑制作用（圖5 )。 腫瘤生長抑制作用（％)= (i /對照組腫瘤生長）X 1〇〇 抗體處理組腫瘤生長量 4. 統計分析 腫瘤體積以平均值 臨床前期套裝軟體版本 組間差異。9 5 %信度（* . -標準差表示。料分析為使用SAS .〇.中LSD來分析對照組及處理 P<0· 〇5)判定為顯著.水準。

2125^10145-PF 200936160 5 · 結果 經使用抗-AXL抗體抑制腫瘤生長，顯示具抗腫瘤作用 (圖7)。因此，與FND1結合之抗-AXL抗體期望對各種腫 瘤具有抗腫瘤作用。 實施例 12 :抗艚cDNA序列分析 1. 後合抗體表現載體之製備

以 RNeasy Mini Kit (Qiagen)萃取寄存編號 FERM ^40854 (Ax225)之融合瘤細胞的總RNA，cDNA以SMART w RACE cDNA放大套組（BD Biosciences)合成。抗體可變部 位基因使用下列抗體各自恆定部位引子（Η鏈，MHCgl ; L 鍵，MLCk)及 SMART RACE cDNA 放大套組（BD Bi osci ences) 提供之 10X Universal Primer A Mix 以 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶（Takara)進行PCR而單離之。 MHCgl: 5,-GGGCCAGTGGATAGACAGATG-3, (SEQ IDN0:1) MLCk: 5,-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG-3, (SEQ ID ❹ NO:2) 每早離之DNA片段核普酸序列以BigDye Terminator

Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)試劑組使 用 ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer 或 ABI PRISM 3700 DNA

Sequencer (Applied Biosystems)按儀器所述方法定序。 2. 結果 .因而產生之AXL225小鼠抗體之胺基酸序列之重鏈可 變部位如SEQ ID N0 : 3所示。該部位CDR1如SEQ ID NO: 4 2125-10145-PF 78 200936160

所示’該部位CDR2如SEQ ID NO: 5所示及CDR3如SEQ ID N0:6所示。因而產生之AXL225小鼠抗體之胺基酸序列之 輕鍵可變部位如SEQ ID N0: 7所示’該部位CDR1如SEQ ID

N0:8 所不 ’ CDR2 如 SEQ ID N0:9 所示及 CDR3 如 SEQ ID NO: 10所示。 【圖式簡單說明】 圖1A為本發明抗-AXL單株抗體（Αχ292)誘發癌細胞 中AXL磷酸化活性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘發 AXL激酶區域磷酸化。 圖1B為本發明抗_AXL單株抗體（Αχ258)誘發癌細胞 中AXL磷酸化活性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘發 A XL激6#區域碟酸化。 圖1C為本發明抗_AXL單株抗體（Αχ285)誘發癌細胞 中AXL磷酸化活性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘發 AXL激酶區域磷酸化。 ® 圖1D為本發明抗—AXL單株抗體（Αχ223)誘發癌細胞 中AXL填酸化活性評话實驗結果的相片。該抗體顯示誘發 AXL激酶區域鱗酸化。 圖1Ε為本發明抗''AXL單株抗體（Αχ96)誘發癌細胞中 AXL磷酸化活性評估督私从su

w貫驗結果的相片。該抗體顯示誘發AXL 激酶區域磷酸化。 圖2 A為本發明> 抗-AXL單株抗體（Αχ51)於細胞中配體 依賴磷酸化抑制活性埤斗举认从田[ κ汗估實驗結果的相片。該抗體顯乎抑 制AXL激酶區域配體依賴磷酸化。 ’

2125-10145-PF 79 200936160 $⑼為本發明抗_AXL單株抗體（Αχ7)於細胞中配體 依賴鱗酸化抑制活 II汗估實驗結果的相片。該抗體顯示抑 制A L激酶區域配體依賴磷酸化。 圖3A為本發 中AXL蛋白分解活 發AXL蛋白分解。 明抗-AXL單株抗體（aX292)誘發癌細胞 性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘 B為本發明抗-AXL單株抗體（Ax284)誘發癌細胞

白刀解活性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘 發AXL蛋白分解。 圖3C為本發明抗—AXL單株抗體（Αχ285)誘發癌細胞 中A XL蛋白公魅^本 /性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘 發AXL蛋白分解。 圖3D為本發明抗-AXL單株抗體（Ax223)誘發癌細胞 中L蛋白刀解活性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘 發AXL蛋白分解。 圖3E為本發明抗-AXL單株抗體（Αχ7)誘發癌細胞中 蛋白刀解活杜評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘發 AXL蛋白分解。 圖3F為本發明抗-AXL單株抗體（Αχ225)誘發癌細胞 中AXL蛋白刀解/舌性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘 發AXL蛋白分解。 為本發月抗-AXL早株抗體（Αχ 96)誘發癌細胞中 AXL蛋白分鮮活性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘發 AXL蛋白分解。

2125-1014 5-PF 80 200936160 圖3H為本發明抗-AXL單株抗體（Ax258)誘發癌細胞 中AXL蛋白分解活性評估實驗結果的相片。該抗體顯示誘 發AXL蛋白分解。 圖4為本發明抗-AXL單株抗體（Ax232、Ax292、Ax285 及Ax284)抑制體外血管新生活性評估實驗結果的圖及相 片。該抗體顯示具抑制體外血管新生活性。 圖5為本發明抗-AXL單株抗體（Ax223、Ax285、Ax96、 Ax292、Ax258、Ax7、Ax51、Ax284 及 Ax225)對人類胰臟 腺癌小鼠模型之抗腫瘤作用評估結果之圖。 圖6為本發明（2)抗-AXL單株抗體（Ax223、Ax285、 Ax96、Ax292、Ax258、Ax7、Ax51、Ax284 及 Ax225)對人 類胰臟腺癌小鼠模型之抗腫瘤作用評估結果之表，概述每 一抗體之結合區域及每一抗體之磷酸化抑制活性。 圖7為本發明抗-AXL單株抗體（Ax225)對人類乳癌小 鼠模型之抗腫瘤作用評估結果之圖。 φ 【主要元件符號說明】 無 2125-10145-PF 81 200936160 mm <110> 中外製藥股份有限公司 <120> 與AXL蛋白結合之單株抗體及其使用方法 <130> C1-A0704 <150> <151〉 JP 2007-297168 2007-11-15 <160> 10 <170> Patent In version 3.4 ® <210> <211> <212> <213> 1 21 ΕΝΑ ΛΧ合成 <220> <223> ΛΧ合歧引子靜J <400> 1 gggccagtgg atagacagat g 21 <210> ❹ <211〉 <212> <213> 2 23 ENA ΛΧ合成 <220> <223> <400> ΛΧ合贬引子麵 2 gctcactgga tggtgggaag atg 23 <210> <211> <212> <213> 3 138 FRT . ΛΧ合成 2125-10145-PF 1 200936160 <220> <223〉ΛΧ合 <40Q> 3

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 15 10 15 lie Leu Ser Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30

Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu 35 40 45

Thr Ser Phe Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin 85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110

Tyr Cys Ala Gly Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 115 120 125

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 4 .

<211> 5 <212> FKT 2

2125-10145-PF 200936160 <213〉人工合成 <220> <223〉人工合成之胜肽^ <400> 4

Ser Phe Gly Val Asp 1 5

<210> 5 <211> 16 <212> FKT <213〉ΛΧ合成 <220> <223> AX合 <40Q> 5

Val lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 6 <211> 11 <212> FKT <213〉ΛΧ合成 <220> <223>人工合撖靜U <400> 6

Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 131 <212> FKT <213〉ΛΧ合成

2125-10145-PF 3° 200936160 <220> <223〉ΛΧ合脑™ <400> 7

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp lie Pro Ala 15 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie 35 40 45

Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60

Gly Gin Ser Pro Glu Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110

Phe Gin Gly Ser His lie Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Glu lie Lys 130

<210> 8 <211> 16 <212> FRT

2125-10145-PF 4 200936160 <213〉ΛΧ合成 <22Q> <223〉人工合成烈细辟列 <400> 8

Arg Ser Ser Gin Asn lie Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15

<210> 9 <211> 7 <212> PRT <213〉人工合成 <22Q> <223> ΛΧ-β-jCTmi^O <40Q> 9

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <21Q> 10 <211> 9 <212> m <213〉ΛΧ合成 <220> <223〉ΛΧ合脑 <400> 10

Phe Gin Gly Ser His lie Pro Phe Thr 1 5

2125-10145-PF 5

Claims (1)

1. 200936160 十、申請專利範圍： I —種單株抗體，其係與AXL蛋白結合。 2.如申請專利範圍第1項所述之抗體’該抗體具有 細胞生長抑制活性。 3 ·如申請專利範圍第1項所述之抗體，該抗體抑制 癌細胞生長。 4*如申請專利範圍第1至3項任一項所述之抗體， ❹ 該抗體與FND1結合。 5· 一種抗體，其製備作為抗原’係以包括整個FND1 之胜肽或包括其至少五或多個保守胺基酸之序列。 6·如申請專利範圍第1至5項任一項所述之抗體， 該抗體對AXL具有增效活性（ag〇n istic activity)。 7·如申請專利範圍第1至5項任一項所述之抗體， 該抗體對於AXL具有拮抗活性。 8. 如申請專利範圍第7項所述之抗體，其係以下述 〇 之方法獲得者：將一抗體與AXL配體和AXL-表現細胞互相 接觸’篩選在AXL未偵測到鱗酸化酪胺酸之抗體。 9. 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之抗體， 該抗體具有降低AXL表現量之活性。 10·如申請專利範圍第1至9項任一項所述之抗體’ 該抗體具有血管新生抑制活性。 11. 一種抗體’如下列（a)至（j)任一所述之抗體： (a)由寄存編號 FERM.BP-1 0858 融合瘤（hybr idoma) 所生產之抗體（Ax285); 2125-10145-PF 1 200936160 (b) 由寄存編號FERM BP-1 0859融合瘤所生產之抗 體（Ax292); (c) 由寄存編號FERM BP-10853融合瘤所生產之抗 體（Ax223); (d) 由寄存編號FERM BP-10?52融合瘤所生產之抗 體（Ax96); (e) 由寄存編號FERM BP-1 0856融合瘤所生產之抗 體（Ax258); ❹ (f) 由寄存編號FERM BP-10857融合瘤所生產之抗 體（Ax284); (g) 由寄存編號FERM BP-1 0850融合瘤所生產之抗 體（Ax7); (h) 由寄存編號FERM BP-10851融合瘤所生產之抗 體（Ax51); (i) 由寄存編號FERM BP-10854融合瘤所生產之抗 φ 體（Ax225);以及 (j ) 由寄存編號FERM BP-1 0855融合瘤所生產之抗 體（Ax232)。 12. —種與一抗原決定位結合之抗體，該抗原決定位 與如申請專利範圍第11項所述之抗體所結合之抗原決定 位相同。 13. 一種包括一互補性決定區域 (complementarity-determing region, CDR)序列之抗體， 該CDR序列與如申請專利範圍第11項所述之抗體所包括 2125-10145-PF 2 200936160 之CDR序列一樣。 I4· 一抗體’其重鏈咖、2及3序列分別為SEQID NO : 4 、 5 及 6 。 15.抗體，包括含有一或多個胺基酸取代、刪除、 ***和/或添加之如申請專利範圍第14項所述之抗體之重 鏈CDR序列的胺基酸序列， 汁〜且功症等同如申請專利範圍第 14項所述之抗體。 _ I6. 一抗體，其輕鏈CDR1、2及3序列分別為SEQ ID NO : 8 、 9 及 10 。 17. 一種抗體，包括含有具一或多個胺基酸取代、刪 除、***和/或添加之如申請專利範圍第16項所述之抗體 之輕鏈CDR序列的胺基酸序列，且功能等同如申請專利範 圍第16項所述之抗體。 18. 如申請專利範圍第13至I?項任一項所述之抗 體’該抗體為一嵌合抗體。 ® 19·如申請專利範圍第13至n項任一項所述之抗 體’該抗體為一人源化抗體（humanized antibody)。 20. —種融合瘤，如下列（a)至（j)任一所述之融合 瘤： (a) 寄存編號 FERM BP-10858(Ax285)融合瘤； (b) 寄存編號 FERM BP-10859(Ax292)融合瘤； (c) 寄存編號 FERM BP-1 0853 (Ax223)融合瘤； (d) 寄存編號 FERM BP-1 0852 (Ax96)融合瘤； (e) 寄存編號 FERM BP-10856 (Ax258)融合瘤； 2125-10145-PF 200936160 (f) 寄存編號 FERM BP-10857 (Ax284)融合瘤； (g) 寄存編號FERM BP-10850 (Ax7)融合瘤； (h) 寄存編號 FERM BP-1 0851 (Ax51)融合瘤； (i) 寄存編號FERM BP-10854 (Ax225)融合瘤；以 及 (D 寄存編號 FERM BP-10855 (Ax232)融合瘤。 21. —種血管新生抑制劑，包含抗_AXL抗體作為活 性成份。 ❹ 22. 如申請專利範圍第21項所述之血管新生抑制 劑’其中該抗體為如申請專利範圍第1至19項任一所述 之抗體。 23. —種細胞生長抑制劑，包含抗_AXL抗體作為活 性成份。 24. 如申請專利範圍第23項所述之細胞生長抑制 劑，其中該細胞為癌細胞。 Φ 25.如申請專利範圍第23項所述之細胞生長抑制 劑，其中該抗體為如申請專利範圍第1至19項任一所述 之抗體。 26. 如申請專利範圍第23項所述之細胞生長抑制 劑’其中該抗-AXL抗體為與fND1結合之抗體。 27. 如申請專利範圍第23項所述之細胞生長抑制 劑，其含有作為活性成份之抗體，該抗體與IgD2結合， • I且具有抑制填酸化活性的作用。 28. 種AXL磷酸化活性誘發劑（丨nducer )，包含抗 2125-10145-pp 4 200936160 -AXL抗體作為活性成份。 29. 如申請專利範圍第28項所述之誘發劑，其中該 抗-AXL抗體為與igD結合之抗體。 30. 如申請專利範圍第28項所述之誘發劑，其中該 抗體為如申請專利範圍第6項所述之抗體。 31 · —種AXL璘酸化活性抑制劑，其含有一抗-AXL 抗體作為活性成份。 32.如申請專利範圍第μ項所述之誘發劑，其中該 抗-AXL抗體為與I gj)2結合之抗體。 33_如申請專利範圍第μ項所述之誘發劑，其中該 抗體為如申請專利範圍第7或8項所述之抗體。 34. —種降低axl表現量之藥劑，其包含抗-AXL抗 體作為活性成份。 35. 如申請專利範圍第34項所述之降低axl表現量 之藥劑’其中該抗-AXL抗體為與FND1結合之抗體。 Ο 36.如申請專利範圍第34項所述之降低AXL表現量 之藥劑’其中該抗體為如申請專利範圍第9項所述之抗體。 37. 一種 誘發 AXL 磷酸化之 方 法， 係使 用 抗 -AXL 抗 體< 38. 一種 降低 AXL 表現量之 方 法， 係使 用 抗 -AXL 抗 體‘ 39. 一種抑制 AXL 磷酸化之 方 法， 係使 用 抗 -AXL 抗 體C > 40. 一種 抗癌 藥劑 ，其含有: i/U -AXL •- 抗體作為 活性 成 2125-10145-PF 5 200936160 份。 41. 如申請專利範圍第4()項所述之抗癌藥劑，其中 該抗體為如申請專利範圍第1至19項任一項所述之抗體。 42. 如申請專利範圍第4〇項所述之抗癌藥劑，其含 有作為活性成份之抗體，該抗體與IgD2結合，且具獠抑 制填酸化活性的作用。 43. 如申請專利範圍第4〇項所述之抗癌藥劑，其中 該癌症為姨臟癌（pancreaticcancer)、胃癌（ cancer)、肺癌、骨肉瘤（osteosarcoma)、大腸癌（c〇1〇n cancer )、***癌（prostate cancer )、黑色素瘤 (melanoma)、子宮内膜癌（end〇metriai cancer)、印 巢癌（ovarian cancer )、子宮肌瘤（uterine leiomyoma)、 甲狀腺癌（thyroid cancer)、幹細胞癌症（stem cell cancer)、乳癌（breast cancer)、膀胱癌（bladder cancer )、腎癌（renal cancer )、神經膠質瘤（gi i〇ma )、 ❿ 神經母細胞瘤（neuroblastoma )或食道癌（esophageal cancer) ° 44. 如申請專利範圍第42項所述之抗癌藥劑，其中 該癌症為神經膠質瘤、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌 (non-small-cell lung cancer)、胰臟腺癌（pancreatic adenocarcinomas)或乳癌。 45. 如申請專利範圍第43項所述之抗癌藥劑，其中 該癌症身胰臟腺癌或乳癌。 46. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，該抗體具抑 2125-10145-PF 6 200936160 制AXL雄酸化活性。

   2125-10145-PF