UA125136C2 - Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну - Google Patents

Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну Download PDF

Info

Publication number
UA125136C2
UA125136C2 UAA201800574A UAA201800574A UA125136C2 UA 125136 C2 UA125136 C2 UA 125136C2 UA A201800574 A UAA201800574 A UA A201800574A UA A201800574 A UAA201800574 A UA A201800574A UA 125136 C2 UA125136 C2 UA 125136C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
variable domain
antibody
heavy chain
light chain
zeo
Prior art date
Application number
UAA201800574A
Other languages
English (en)
Inventor
Рьонн Ларс Крістіан Білманн
Рённ Ларс Криситан Билманн
Ібрагім Джон Малік
Ибрагим Джон МАЛИК
Джеффрі Бі. Ставенхаґен
Джеффри Б. СТАВЕНХАГЕН
Сьорен Крістенсен
Сёрен Кристенсен
Ян Еґебьєрґ
Ян Эгебьерг
Арно Ґеррітсен
Арно Герритсен
ден Брінк Едвард ван
Ден Бринк Эдвард Ван
Пол ПАРРЕН
Йонґ Роб де
Йонг Роб Де
Original Assignee
Х. Луннбек А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Х. Луннбек А/С filed Critical Х. Луннбек А/С
Publication of UA125136C2 publication Critical patent/UA125136C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Цей винахід відноситься до моноклональних антитіл до сортиліну, застосовних в корекції дефіцитного рівня програнуліну (РОКМ). Зокрема, ці антитіла можна застосовувати при лікуванні лобно-скроневої деменції (ЕТО) і бічного аміотрофічного склерозу (А 5). Крім того, передбачається, що моноклональні антитіла також можуть бути застосовні для лікування нейродегенеративних порушень, таких як хвороба Альцгеймера (АБ).
Посилання на перелік послідовностей
Ця заявка містить один або декілька переліків послідовностей згідно з параграфами 1.821 і наступними розділу 37 СЕК, які розкриті на машинопрочитуваних носіях (назва файлу: 0993
ЗТ25.ІхХї, створений 22 червня 2016 року і має розмір 144 кБ), при цьому даний файл включений в даний опис шляхом посилання у його повному обсязі.
Рівень техніки
Сортилін є рецептором, який, як повідомлялося, опосередковує проапоптичні ефекти пронейротрофінів і опосередковує транспорт і сортування нейротрофінових рецепторів (МуК/)гег еїаї,2012, Тгепавз Мешговзсі. 2012;35(4):261-70; СПегир еї а), Напад Ехр Ріаптасої, 2014:220:165- 89, Сапо еї аі, У Мої Мей (Вей). 2014 Ббер;92(9):905-11). Був ідентифікований ряд лігандів сортиліну, включаючи нейротензин, розташування високоафінного сайту зв'язування якого, як було визначено за допомогою рентгенівської кристалографії, знаходиться в молекулі сортиліну в порожнині бета-пропелера (Оці5щаага еї аї, Маї Зігисі Мої Віої. 2009 дап; 16(1):96-8; Оцізідаата еї аї, Ргоїєїпй сі. 2014, бер;/23(9):1291-300). Зовсім недавно було показано, що сортилін функціонує як високоафінний рецептор для фактора зростання програнуліну (РОКМ, Ни еї а).
Мешгоп. 2010 Мом 18;68(4):654-67.
РОМ (проепітелін, попередник грануліну-епітеліну, фактор росту, що походить від клітин
РС, акрогранін) є глікозилованим білком, що секретується, з протизапальними діями і діями, подібними до нейротропічних (для недавнього огляду див. Мдиуеп, Тгепа5 ЕпаосгіпоЇ! Меїаб. 2013 Оес24(12):597-606). РОКМ розщеплюється протеолітичним шляхом до гранулінів, проте багато що ще належить дізнатися про фізіологічну роль РОЕМ і гранулінів і ідентичності їх рецепторів. РОКМ був залучений в декілька клітинних функцій, включаючи регуляцію клітинного циклу їі рухову активність клітин (Не, 7. 5 Ва(етап, А., У. МОЇ. Мед. 57:600-612 (2003); Мопаті,
Зо С, еї аі., Сапсег Вез. (5(5:7103-7110 (2006)), загоєння ран, запалення (7Пи, «)., еї аї., Сеї 777:867-878 (2002)), індукцію синтезу факторів росту, таких як ендотеліальний фактор росту судин (МЕСЕ) (ТапоКеаподзітвіп, УМ. 5 Зеїтего, о, Сагсіподепев5і5 25.1587-1592 (2004), і онкогенез (Не, 7. 5 Вагетап, А., У). МОЇ. Мей. 81:600-612 (2003), Мопаті, С.., єї а!І., Сапсег Вев5 (5(5:7103-7110 (2006); Зегтего, С., Віоспет Віорпуз. Ве5. боттип. 505-409-413 (2003), Її и, А 8 Зетего, С., Ргос. Маї!Ї Асай 5сі О.5А 98 142-147 (2001); Пай, І М., єї аІ., Сапсег Вев. 60:1353- 1360 (2000)). Повідомлялося, що РОКМ зв'язується з рецептором ТМЕ (Тапд М еї а!., зсіепсе 2011, 332(6028):478-84), проте інші автори ставлять під сумнів це спостереження (СпПеп еї аї.,
Мешговзсі. 2013, 39(21):9202-9213).
Зв'язування РОКМ з сортиліном було картовано в сайті нейротензину, і повідомлялося, що воно опосередковується виключно за рахунок С-кінцевого домену РОКМ (2Пепа єї а. РГо5 Опе. 2011; 6(6):е21023; Її ее еї аКІ. Нит Мої Сепеї. 2013) подібним до нейротензину чином, і, відповідно, було показано, що нейротензин блокує взаємодію сортиліну з РОКМ і іншими лігандами. Після зв'язування сортилін опосередковує виведення РОКМ лізосомами і за рахунок цього регулює рівні позаклітинного РОМ (Ни еї аІ. 2010). Таким чином, було показано, що нокдаун або надекспресія сортиліну регулює рівні позаклітинного РОМ в культурі клітин (Сатаздційо еї а». Ат ) Нит Сепеї. 2010 Оес 1087(6):890-7) і у мишей, при цьому повідомлялося, що дефіцит сортиліну підвищує рівні РОКМ і відновлює рівні РОКМ в плазмі крові і головному мозку у РОКМж/- мишей (Ни сеї аїЇ. 2010). Цікаво відзначити, що однонуклеотидний поліморфізм (ЗМР) в гені сортиліну був асоційований із зниженими рівнями
РОККМ в плазмі крові і підвищеними рівнями мРНК сортиліну (Сагтаздиійно еї аІ. Ат У Нит Сепеї. 2010 Оес 10; 87(6):890-7). Ці спостереження дають підставу припустити, що сортилін є ключовим регулятором позаклітинного РОКМ.
Був знайдений зв'язок РОКМ з лобно-скроневою деменцією (ЕТО), прогресуючою формою деменції, що характеризується змінами в поведінці і здатності розуміння значення слів, а також лобно-скроневою лобарною дегенерацією (ЕТІ О) і наявністю включень в нейронах, що містять включення ТАК-ДНК-зв'язувального білка 43 (ТОР-43) або тау-білка (ВакКег еї аї, 2006, Маїиге. 2006 Ацд 24:442(7105):916-9; Стиїв еї а!ї, Майте 442: 920-924 (2006); Ат У Нит Сепеї. 2010 Оес 10;87(6):890-7,М еї аїЇ, Тгтепаз іп Сепеїісв 24: 186-194 (2008)). В більшості випадків спорадичної і спадкової форми ЕТО спостерігається патологія ТОР-43 (-50 95), подібна тій, що зустрічається бо при АЇ 5, і деякі автори вважають, що ЕТО-ТОРАЗ і А 5 є захворюваннями одного спектру (По Ю
Меишгоіоду. 2011 Осі 25; 77(17):1636-43; Вохег АЇ еї аї, АІ2пеітет5 Оетепі. 2013 Маг; 9(2):176-88;
Вадетаке!"з єї аї, Маї Нем Мешгої. 2012 А!йдиві; 8(8): 423-434) внаслідок однакових патологічних процесів і генетичних факторів, а також деякого збігу в симптоматиці. Для ЕТО не існує ніяких варіантів симптом-модифікувальної терапії. У деякої частини страждаючих лобно-скроневою деменцією пацієнтів з патологією ТОР-43 спостерігаються мутації в гені грануліну (СКМ), що забезпечують втрату функції, що приводить до гаплонедостатності РОКМ. На сьогоднішній день 69 різних мутацій в гені грануліну, всі з яких приводять до знижених рівнів РОКМ і/або функції, були асоційовані з ЕТО, і вважають, що підвищення рівня позаклітинного РОЕМ в плазмі крові і головному мозку протидіятиме хворобливому процесу.
Також був знайдений зв'язок мутацій РОКМ з хворобою Альцгеймера (АВ) (Зпепод еї аї., 2014, Сепе. 2014 дип 1; 542(2):141-5; Вгошуегв єї а!., 2008, Метоіоду. 2008 Ацд 26; 71(9):656- 64), що дає підставу припустити, що дефіцит РОКМ може грати важливу роль в патогенезі АЮ.
Крім того, в мишачих моделях АО були відмічені нейропротекторні ефекти РОЕМ (Міпаті еї аї, 2014, Маї Меа. 2014 Ос 20(10):1157-64), які підкріплюють думку, що підвищені рівні РОМ можуть бути корисними при Аб і, ймовірно, інших нейродегенеративних станах.
У цій заявці описано отримання і ідентифікацію антитіл до сортиліну людини, які можуть регулювати РОКМ в клітинних моделях і на мишах. Такі антитіла, несподівано, зв'язуються з ділянкою в сортиліні, яка віддалена від сайту зв'язування програнуліну, про який раніше повідомлялося, так званого сайту нейротензину, і при цьому здатні пригнічувати взаємодію сортилін-РОКМ і за рахунок цього підвищувати рівень позаклітинного РОКМ.
Автори цього винаходу визначили шість ділянок зв'язування сортиліну і несподівано ідентифікували, що найбільш ефективні антитіла зв'язують певну ділянку ("ділянку Ю"). Оскільки
РОКМ має нейропротекторний і протизапальний ефекти, то отримані авторами цього винаходу результати указують, що такі націлені на сортилін антитіла, ймовірно, матимуть корисний ефект при лікуванні ряду нейродегенеративних порушень, зокрема ЕТО/ЕТІ 0. У деякої частини даних пацієнтів є мутація в гені, що кодує РОКМ, яка приводить до гаплонедостатності. Отже, антитіла до сортиліну, ймовірно, матимуть подібні терапевтичні переваги для пацієнтів, страждаючих іншими протеїнопатіями ТОР-43 і захворюваннями, при яких рівні РОКМ можуть впливати на функцію ТОРА4З і патологію, включаючи АЇ 5 і АЮ.
Зо Суть винаходу
Автори цього винаходу отримали моноклональні антитіла, які здатні пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном і які несподівано зв'язуються з новою ділянкою сортиліну, яку назвали "ділянкою ОО", визначеною в 5ЕО ІЮ МО:170. Декілька антитіл, ідентифікованих авторами цього винаходу, характеризуються властивостями, подібними властивостям антитіл до ділянки 0, і експериментальні дані указують, що їх зв'язування також відбувається в ділянці р, і такі антитіла в даному описі називаються як антитіла до Юк. Відповідно, в одному аспекті цей винахід відноситься до таких антитіл, до композицій і/або наборів, що містять такі антитіла, а також до пов'язаних з ними способів і шляхів застосування.
Цей винахід також відноситься до способу попередження або лікування захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта, який включає введення ефективної дози антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, які зв'язуються з ділянкою
О сортиліну. Такі захворювання включають серед інших ЕТО, АГ 5 і протеїнопатії ТОРАЗ, як, наприклад, АЮ.
Стислий опис ілюстративних матеріалів
На фігурі 1 представлений загальний огляд, що стосується співвіднесення ділянок антитіл людини на підставі зв'язування ділянки сортиліну, ефекту щодо зв'язування РОКХМ і рівнів РОКМ і щодо перехресного блокування між антитілами.
Антитіла, що зв'язують сортилін, відбирали і співвідносили з ділянками А-Е на підставі зв'язування з конструктами, отриманими перетасовуванням, в яких послідовність відповідала послідовності сортиліну голкочеревних в межах вибраних ділянок білка (приклад 1, фігура 2).
Відібрали 20 антитіл, які пригнічували зв'язування сортилін-РОКМ (що вимірювали за допомогою аналізу НТКЕ) (див. приклад 10, фігуру 5 і фігуру 6). З цих антитіл 15 були антитілами до ділянки О, тоді як З були антитілами до Ю- (фігура 6). Подальший аналіз перехресного блокування підтвердив, що 18 антитіл до ділянки ОО і Ю- (антитіла до Юя характеризувалися іншим профілем зв'язування З конструктами, отриманими перетасовуванням, в порівнянні з антитілами до ділянки О; проте, антитіла до Юж- не можуть бути з точністю віднесені до ділянок зв'язування А-Е, як викладено вище, проте вони мають загальні функціональні характеристики (у клітинних аналізах і т. д.), подібні характеристикам антитіл до ділянки 0), при цьому усі, перехресно блокували один одного, підтверджуючи те, що бо вони взаємодіяли з однією і тією ж ділянкою сортиліну (приклад 9, фігура 7). При тестуванні антитіл до сортиліну із класів відповідності іншим ділянкам в аналізі НТКЕ по зв'язуванню сортиліну-«ТОКМ тільки два з 41 антитіла демонстрували пригнічувальний ефект. Одне з цих двох антитіл перехресно блокувало 0 і Ю-ж, але воно характеризувалося нетиповим профілем зв'язування з конструктом, отриманим перетасовуванням (подібно 0, за винятком того, що воно зв'язувало ділянку пПВО1-05), тоді як інше антитіло перехресно не блокувало інші антитіла, які пригнічують зв'язування РОКМ-сортилін, підтверджуючи таким чином твердження, що воно зв'язується з іншою ділянкою сортиліну.
Ці спостереження показують, що антитіла, що зв'язуються з ділянкою в сортиліні, визначеною як ділянка 0, мають потенціал пригнічувати зв'язування сортилін-РЕВМ. 19 перехресно блокуючих антитіл, з яких 18 були антитілами до ділянки 0 і Ок, підвищували рівень позаклітинного РОКМ в клітинному аналізі (приклад 13, фігура 10 ії фігура 11). Три з цих антитіл тестували іп мімо і виявили, що вони підвищують рівень РОКМ в плазмі крові (фігура 13, приклад 15).
Блоки на фігурі 1 ілюструють стадії відбору антитіл. А-Е означають ділянки, до яких відносили відповідні антитіла, що зв'язують сортилін, на основі конструктів, отриманих перетасовуванням, як описано в прикладі 1 і 5ЕБЕО ІЮ МО:171-179. "Інше" відноситься до антитіла, яке не можна співвіднести ні з однією ділянкою і яке може зв'язуватися в межах граничної поверхні між ділянками А і В. Теї відноситься до антитіл, що зв'язують також сортилін голкочеревних.
На додаток до показаних антитіл людини отримували і характеризували так само певну кількість антитіл миші до сортиліну людини. Два з цих антитіл відносили до ділянки 0, і було показано, що їх перехресно блокують антитіла людини до ділянки О і Юж, що вони пригнічують зв'язування сортилін-РОКМ і підвищують рівень позаклітинного РОКМ (див. фігуру 4).
На фігурі 2 показано співвіднесення антитіл з ділянками на підставі зв'язування з конструктами сортиліну, отриманими перетасовуванням.
На панелі А показана ілюстрація в лінійному вигляді конструктів, отриманих перетасовуванням, вживаних для співвіднесення антитіл з ділянками, як описано в прикладі 1.
Конструкти сортиліну, отримані перетасовуванням, отримували на основі послідовності сортиліну людини (5ЕО ІЮ МО:169) (відрізки показані сірим кольором), в якій амінокислотні
Зо залишки замінювали на відповідну амінокислоту із послідовності сортиліну голкочеревних (показана чорним кольором) (ЗЕО ІЮ МО:173) (приклади 1-3).
На панелі В показана передбачена структура конструктів, отриманих перетасовуванням, проілюстрованих в лінійному вигляді на панелі А. Залишки темного кольору указують на залишки, змінені на відповідні послідовності голкочеревних в конструктах, отриманих перетасовуванням.
На панелі С проілюстрований профіль зв'язування антитіл, віднесених до класів відповідності ділянки ОО і ділянки Е, відповідно. Знак "-" указує на зв'язування з вказаним конструктом, отриманим перетасовуванням, а знак "-" указує на відсутність зв'язування. На підставі профілю зв'язування з різними конструктами, отриманими перетасовуванням, антитіла співвідносили з ділянками. Класи відповідності ділянкам отриманих антитіл позначені А-Е. Що стосується проілюстрованих антитіл до ділянок О і Е, то обидва зв'язували людські послідовності (повністю сірі), на що указує "- і жодне не зв'язувало послідовність голкочеревних (повністю чорні), на що указує "-", тоді як антитіло до ділянки Е зв'язувало конструкт пВ45678, отриманий перетасовуванням, при цьому антитіло до ділянки О не зв'язувало її в результаті локалізації ділянки зв'язування, як проілюстровано на панелі А. Що стосується антитіл до ділянки 0, спостерігали зв'язування з наступними ділянками, отриманими перетасовуванням: й5огі, ПВО6-10, В12390. Антитіла не зв'язувалися з пВО1-05, В45678, їеї. Що стосується антитіл до Ю-, спостерігали зв'язування з наступними ділянками, отриманими перетасовуванням: й5огі, В12390. Антитіла не зв'язувалися з пПВО1-05, пВО6-10, 845678, Ії.
Профіль зв'язування ЕР був подібним до профілю зв'язування ЮО, за винятком того, що для антитіл до Ю.- не спостерігали зв'язування з пПВОб6-10.
Антитіла не зв'язувалися з повним білком сортиліну голкочеревних, за винятком двох. Два антитіла, здатні зв'язуватися з послідовністю голкочеревних, позначено як "Че. "Інше" відноситься до антитіла, яке не можна співвіднести ні з однією ділянкою.
На фігурі З показані показники афінності зв'язування для антитіл людини до ділянки О і Ок.
Показники афінності зв'язування з конструктами сортиліну, отриманими перетасовуванням, отримані за допомогою інтерферометрії біошару із застосуванням Осієї 384КЕО, як описано в прикладі 8 (ЕС5О, нг/мл). Відсутність затінювання указує на значення ЕС5О, що становить 0,1-10 нг/мл, затінювання світло-сірим кольором указує на значення ЕС50О, що становить 210 нг/мл, і бо затінювання сірим кольором указує на відсутність зв'язування (МВ). Співвіднесення з ділянками,
засноване на профілях зв'язування, проілюстровано на фігурі 2. Конструкти, отримані перетасовуванням, проілюстровані на фігурі 2, і послідовності наведені в ХЕО ІЮ МО:171-179. тАбБ - моноклональне антитіло.
На фігурі 4 показані показники афінності зв'язування антитіл миші до сортиліну людини з конструктами, отриманими перетасовуванням, отримані за допомогою інтерферометрії біошару із застосуванням Осієї 384КЕО, як описано в прикладі 8 (ЕС5О, нг/мл). Відсутність затінювання указує на зв'язування, а затінювання сірим кольором указує на відсутність зв'язування (МВ).
Співвіднесення з ділянками, засноване на профілях зв'язування, проілюстровано на фігурі 2.
На фігурі 5 показаний ефект антитіла до сортиліну щодо зв'язування сортиліну з РОКМ.
Моноклональне антитіло 45 людини (питАбБ) до ділянки Ю сортиліну (зафарбовані кола) запобігало зв'язуванню РОКМ з сортиліном на відміну від контрольного антитіла до ділянки Е сортиліну (зафарбовані трикутники) і контролю Ідс, Ідс1-р12 (незафарбовані трикутники), які не перешкоджали зв'язуванню. Зв'язування антитіл визначали шляхом вимірювання зсуву зв'язування РОКМ з сортиліном за допомогою гомогенної флуоресценції з розрізненням за часом (НТКРЕ) (приклад 10). Оцінку залежності доза-відповідь для антитіл виконували при десяти концентраціях, що охоплюють діапазон від 50 пМ до 1 мкМ, за кривими, побудованими при З-кратному розведенні. Значення концентрації напівмаксимального пригнічення (ІС50) розраховували за допомогою нелінійної регресії з використанням сигмоїдальної кривої концентрація-відповідь (із змінною крутизною) в ХІ її 4 (ІОВ5, Великобританія).
На фігурі 6 стисло представлені результати ефекту антитіл щодо зв'язування сортилін-
РОЕМ, визначені за допомогою аналізу методом гомогенної флуоресценції з розрізненням за часом (НТР), як показано на фігурі 5. В цілому тестували 62 антитіла - при цьому було виявлено, що 15 антитіл до ділянки ЮО і З антитіла до ділянки Ю- пригнічують зв'язування сортилін-РОКМ, а також визначали значення ІС50. Для двох додаткових антитіл (до Е і інших ділянок) спостерігали пригнічувальний ефект. Решта антитіл показала негативний результат в тесті. " ефект антитіла був дуже слабким для підбирання кривої залежності доза-відповідь, 6 95 пригнічення при 1 мкМ. "7" ефект контрольного (контр.) антитіла був дуже слабким для підбирання кривої залежності доза-відповідь, 37 95 пригнічення при 1 мкМ.
Ці спостереження показують, що антитіла до сортиліну, що охарактеризовані їх віднесенням
Зо до ділянки Ю або О-, пригнічують безпосереднє зв'язування сортиліну з РОКМ і здатні пригнічувати зв'язування сортилін-РЕАВМ.
На фігурі 7 показано перехресне блокування між антитілами. Всі з антитіл людини і антитіл миші тестували в одному експерименті, в якому кожне антитіло зв'язувалося з сортиліном людини дикого типу (М/Т) (фігура 7). Потім всі інші антитіла тестували щодо зв'язування із попередньо утвореним комплексом сортилін:антитіло (приклад 9). Усі з вибраних 15 антитіл людини до ділянки О і З антитіл людини до ділянки О-- (на підставі їх ефекту в аналізі НТКЕ, що проводиться щодо РОЖКМ-сортилін (фігура 5 і фігура 6) і двох антитіл миші до ділянки О пригнічували один одного щодо зв'язування з сортиліном людини М/Т.
Антитіла перехресно не блокувалися антитілами, віднесеними до класів відповідності іншим ділянкам (як проілюстровано для антитіл, що розпізнають ділянку А, ділянку Е і сортилін голкочеревних, вказаних в таблиці як АБА1-х, АБЕ1-х і Абієї, відповідно), за винятком одного перехресно блокуючого антитіла до ділянки А, одне антитіло з невідомим співвіднесенням з ділянкою ("інше"), і при цьому їх частково блокувало антитіло 548 до О.к. Ці дані підтверджують, що всі антитіла до ділянки О ії Юж, здатні пригнічувати зв'язування сортилін-РОКМ в аналізі
НТЕРЕ, взаємодіяли з однією і тією ж ділянкою сортиліну.
Перехресне блокування між антитілами до однієї і тієї ж або різних ділянок сортиліну (ділянки, визначені на підставі зв'язування з конструктами, отриманими перетасовуванням, як проілюстровано на фігурі 2) визначали шляхом аналізу перешкоджання зв'язуванню антитіла- сортиліну. Зв'язування антитіл з сортиліном-ЕСО-Ні5 визначали за допомогою інтерферометрії біошару із застосуванням Осієї 384КЕЮО (приклад 9). У лівому стовпці вказані первинні (іммобілізовані) антитіла, а у верхньому рядку вказані вторинні антитіла (антитіла, що випробовуються стосовно іммобілізованих антитіл). Зв'язування як первинних, так і вторинних антитіл з сортиліном-ЕСО-Ніх приводитиме до значення відповіді більше 0,1 і вказуватиме, що обидва антитіла зв'язалися з різними ділянками білка. Значення відгуку менше 0,1 показує відсутність зв'язування вторинного антитіла і ефективне перехресне блокування іммобілізованим (первинним) антитілом, що свідчить про те, що обидва антитіла зв'язуються з однією і тією ж ділянкою сортиліну.
На фігурі 8 показаний ефект антитіл до ділянки Ю ії Ю- сортиліну щодо зв'язування з сортиліном селективного ліганду АЕ38469, що є малою молекулою. Було показано, що сайт бо зв'язування АЕ38469 аналогічний сайту зв'язування нейротензину, і його характеризували за допомогою рентгенівської кристалографії (Зспгодег еї а. Вісогда Мед Спет Гей. 2014 дап 1;24(1):177-80). Повідомлялося, що РОККМ зв'язується з одним і тим же сайтом (ГІ ее єї аІ. Нит
Мо! Сепеї. 2013), що й антитіла 45 і 68, які зв'язуються з ділянкою О і О-, відповідно, не пригнічуючи зв'язування АЕЗ38469 з сортиліном. Ці дані свідчать про те, що ці антитіла мають сайт зв'язування сортиліну, відмінний від сайту зв'язування АЕ38469. Отже, антитіла 45 і 68 пригнічують зв'язування РОЖКМ-сортилін за рахунок сайту зв'язування, відмінного від передбачуваного раніше сайту зв'язування РОКХМ в сортиліні.
Фігура 9. Ефект антитіл 45 і 68 щодо клітинного зв'язування і ендоцитозу РОКМ (приклад 12). Антитіла 45 і 68 пригнічували зв'язування і/або ендоцитоз РОКМ клітинами, що надекспресують сортилін. Додавання нейротензину (МТ, 10 мкМ) так само знижувало зв'язування або ендоцитоз РОКМ, що відображалося в зниженій інтенсивності флуоресценції, при цьому, як і очікувалося, ізотипічне контрольне антитіло В12 не впливало на рівні флуоресценції РОКМ.
Антитіла (100 нМ), які слід тестувати, додавали до клітин 518 за 30 хвилин перед додаванням рекомбінантного РОКМ на 4 години. Потім клітини фіксували, забарвлювали для виявлення РОКМ і аналізували за допомогою СеПотіс5. Флуоресценцію РОКМ вимірювали у вигляді середньої флуоресценції в розрахунку на одну клітину. Дані представлені у вигляді середнього значення х 50. Дані аналізували за допомогою однофакторного Апома з подальшим аналізом з використанням критерію Даннета, при цьому всі групи порівнювали з РОКМ. "р«0,05; р-0,01.
Фігура 10. Рівні позаклітинного РОКМ, визначені за допомогою ЕГІЗА в середовищах від культур клітин НЕК (518), що надекспресують сортилін. Антитіла до ділянки О (45, 811) і О-- (68) сортиліну підвищували рівні РОКМ і подібний ефект спостерігали для ліганду сортиліну нейротензину, тоді як контрольне антитіло В12 не надавало ефекту. Ці спостереження указують на те, що антитіла до ділянки ЮО ії Ю- сортиліну були здатні пригнічувати опосередковане сортиліном виведення РОКМ, підвищуючи за рахунок цього рівень позаклітинного РОКМ. Всі антитіла тестували при концентрації 100 нМ. Нейротензин тестували при концентрації 10 мкМ.
Рівні РОКМ нормалізували щодо контролю (СТКІ). Дані представлені у вигляді середнього значення х 50. Дані аналізували за допомогою однофакторного Апома з подальшим аналізом з
Зо використанням критерію Даннета, при цьому всі групи порівнювали з контролем "р«О0,05; яхр«0,01 (приклад 13).
На фігурі 11 показаний ефект антитіл щодо рівня позаклітинного РОКМ в клітинах НЕК людини, що надекспресують сортилін, виміряного за допомогою ЕГІЗА, як описано в прикладі 13. Всі відібрані антитіла до ділянки ЮО і три відібрані антитіла до Ю- підвищували рівень позаклітинного РОКМ. Рівні РОКМ аналізували так само, як вказано вище. Рівні РОКМ нормалізували щодо необроблених контролів і переводили в 9о. Два антитіла до сортиліну людини отримували від миші (124 і 5Е1Еб), а решта були антитілами людини. Аб - моноклональне антитіло.
На фігурі 12 (верхня і нижня панелі) показаний ефект антитіла до сортиліну щодо рівня позаклітинного РОКМ в диференційованих з клітин іРЗС нейронах (приклад 14). Антитіло 45 до ділянки О сортиліну і антитіло 68 до Ю-- підвищували рівні РОКМ, тоді як контрольні антитіла
В12 і антитіло до НЕЇ. не надавали ефекту.
Диференційовані з клітин ІР5С нейрони висівали в 9б-лунковий планшет. Через один тиждень до клітин додавали антитіла. Середовище від клітин збирали через 48 годин або 96 годин і аналізували за допомогою ЕГІЗА для РОКМ людини (Еп2о І їе зсіепсев), і при цьому зразки аналізували згідно з інструкціями виробника. Антитіла людини до сортиліну 45 і 68 підвищували рівні РОМ в середовищах, зібраних в обидва моменти часу. Контрольні ізотипічні антитіла В12 і антитіло до Неї (негативний контроль) не змінювали рівень позаклітинного РОКМ.
Дані представлені у вигляді середнього значення ж 50. Дані аналізували за допомогою однофакторного Апома з подальшим аналізом з використанням критерію Даннета "р«0,05; яхр«0,01 (приклад 14).
На фігурі 13 (панелі А-С) показані рівні РОКМ в плазмі крові у мишей з нокіном (КІ), за рахунок якого у них експресується сортилін людини, оброблених антитілом до сортиліну людини (приклад 15). Антитіло до сортиліну 45 підвищувало рівні РОКМ в плазмі крові, тоді як контрольне антитіло не надавало ефекту.
А. Дослідження в динаміці. Після введення шляхом ін'єкції антитіла 45 (антитіла до ділянки
Ор) спостерігали підвищені рівні РОКМ в плазмі крові Мишам вводили 5с шляхом ін'єкції антитіло 45 (п-5) або контрольне антитіло (п-3) в дозі 10 мг/кг. Кожну групу виводили з експерименту в різні моменти часу. У мишей, оброблених контрольними антитілами (антитілами бо до Неї), не спостерігали зміни щодо рівня РОЕМ в плазмі крові, тоді як у мишей, оброблених антитілом 45, спостерігали поступове підвищення рівнів РОКМ. Ефект досягав свого піку в проміжку від 24 до 48 годин і поступово знижувався до днів 4-7.
В. Дослідження середньої тривалості. Мишей обробляли двічі на тиждень за допомогою 10 мг/кг антитіла 45 і контрольного антитіла (антитіла до Неї). Зразки збирали з щічної вени кожного тижня. Рівень РОКМ в плазмі крові був підвищений на 1-му тижні і залишався приблизно на тому ж рівні впродовж всього дослідження в порівнянні з тваринами, обробленими контрольним антитілом (п--20).
С. Дослідження залежності доза-відповідь. Різні дози (4 дози: 0,1, 0,4, 2 і 10 мг/кг) антитіла до сортиліну (45) і контрольних антитіл (антитіл до Неї) вводили шляхом ін'єкції і мишей убивали на 2-й день. Рівень РОКМ в плазмі крові був підвищений у мишей, оброблених антитілом 45 (10 і 2 мг/кг), при цьому нижчі дози (0,4 і 0,1 мг/кг) не надавали ефекту щодо рівня
РОККМ в плазмі крові. Дані представлені у вигляді середнього значення х 50. Дані аналізували за допомогою двофакторного Апома з подальшим аналізом з використанням критерію
Бонферроні "р«0,05; ххр«0,01; ир«е0,001 (приклад 15).
На фігурі 14 представлена ілюстрація ділянок сортиліну, визначених на основі конструктів сортиліну, отриманих перетасовуванням, накладених на передбачену структуру сортиліну.
Ділянки є частиною сегментів білка сортиліну, в яких зміна вибраних амінокислотних залишків з людської послідовності на характерні для послідовності голкочеревних приводить до пригнічення зв'язування з антитілами класу відповідності такій ділянці. Стрілюкою показаний високоафінний сайт зв'язування нейротензину і РОКМ, про який раніше повідомлялося (Оцівідаага Маї бігисі Мої Вісі. 2009 дап;16(1):96-8, І ее єї а), Нит Мої Сепеї. 2013).
На фігурах 15а (панелі 1-6) і 156 (панелі 1-3) показані ілюстративні пептиди, що охоплюють конформаційний епітоп антитіла 45, 68 і 811. Всі з показаних пептидів характеризуються ступенем захисту від обміну більш 0,50, за винятком пептиду 115-125. Пептид 115-125 є прикладом пептиду, на який не впливає наявність антитіла 45, 68 або 811, і тому вони не є частиною конформаційного епітопу зв'язування (приклад 16).
На фігурах 16а (панелі 1-6) і 166 (панелі 1-3) показані ілюстративні пептиди, що охоплюють конформаційний епітоп антитіла 30. Всі з показаних пептидів характеризуються ступенем захисту від обміну більш 0,50), за винятком пептиду 563-572, пептиду 646-656 і пептиду 704-714.
Ці три пептиди є прикладами пептидів, на які не впливає наявність антитіла 30, і тому вони не є частиною, що відповідає за конформаційне зв'язування (приклад 16)
На фігурі 17 показана ілюстрація процедури мікродіалізу.
На фігурі 182 показана динаміка щодо ефекту системного введення антитіла 45 або РВЗ (50 мг/кг, 10 мл/кг, 5.с.) за 24 години до проведення мікродіалізних експериментів щодо рівнів РКОМ в гіпокампі мишей ЯБОКТІ, що вільно рухаються, за часом (24 години) (приклад 17).
На фігурі 186 показані об'єднані результати 24 годин діалізу: початковий рівень РКОМ в гіпокампі мишей П5ОКТІ1, що вільно рухаються, у мишей, оброблених тармМе45 і РВ5 в дозі 3,320,3 нг/мл і 1,120,1 нг/мл, відповідно, оцінені за допомогою двотактного мікродіалізу (приклад 17).
На фігурі 18с представлена таблиця, що демонструє рівні РЕОМ (середні значення х- 5ЕМ) в гіпокампі мишей П5ОКТІ1, що вільно рухаються, які вимірювали кожні 2 години протягом 24 годин через 1 день після обробки тварин за допомогою тарме45 (п-10) або РВЗ (п-8) (приклад 17).
Докладний опис винаходу
Використовуваний в даному описі винаходу термін "сортилін" є синонімом "білка сортиліну" (ідентифікованого, наприклад, в ОпіРгої як 299523, 1 їі 2). Нумерація амінокислот сортиліну наведена відносно ЗЕО ІЮ МО:169, показаною нижче, при цьому Меї є амінокислотою 1:
МЕНРУСААОИ І ЗАМУРНОИЇ СГ ГІ ОГГ РРО ТІ ЗО0ОВІ ОАР РРРААРІ РАМУ зарішуУБМСІ ВАДААСаАгРє ВСАМААЗАР СЕОЕЕСОИВМУВА ЕМАКІ АММТ
НОНМУРООІ Ва 5УБІ Мур ТОМІ МІТТЕ НУРІМІМТРОа О5КІ МАЕ У
СКМЕКОІТОЇ. ІММТРІАТЕЄ СМАІСРЕМЗОа КУМ ТАЕМ5а СЗАОСаИаВІЕНО
ЗОЕАКМЕМОТ ОСРЕНРГТОМ МУЗБРОМБЗОМІ ГАЇ ЗТЕМСГ М М5КМЕСаИТкумЕ
ЕІНКАМСІ АК М/ЯЗОМТІЕЕТ ТМАМИаЗСКАО І САГЕГЛМ/ВТ5 І ОаКЗЕКТІС
УКІБРаЇ се ВР РАБУМАО КОТТАВІНУЗ ТРОСОГМУЗМА ОЇ РОЄМООБОГ
УБІГААМОЮМ МЕМНУСЕРОЮ ТтаєРатІєт5о рваІмУЗКОїІ ОвнІ УТТТаС
ЕТОЕТММУТ5І. ВамУмМІТ5МІ 5 ЕОМОІОТМІТ ЕрРОСО,РМУУТНІ. ВКРЕМБЕСВА
ТАКМКМЕС5БІ. НІНА5ЗУ5БІБЗО КІ МУРМАРІ 5 ЕРМАМИаІМІА НаЗУСаВАЇВМ
МУРОМУМІЗрО СОМЗУУТКМІЕ РНУМТІ 05 ССПМАЇЕН5 ЗА РІММІКЕ5
ТОЕСОСУОТУ ТЕТВОРІМЕТ С АБЕРСЕАНО ММІБІМСЕТЕ ЗЕ ТОМ УБУ
60 ТІОРКОІГЕВ МСЕЕКОМТІМ ГАНЗТОРЕОМ ЕрССІ СУКЕ ОРІ ВІ ВКМ
СОМавормУМмт КОРБІСІ С51 ЕОР СОРаМУ ВРЕМОЗКОСМЕ ОРЕ! КОаНнОЇ Е
ЕС УаВЕЕНІ ТТМаУАКІРИ ОКСОСИТмММРМУ ВЕМКОЇ КККО Т5МЕІ ЗРЕКО
МОКЗМЗУРІЇ ГАЇМОаї ММТ МУМАаМ УкКК УУбасАРІ МН ВУЗМІ ООНАЕ
АМмаУрамрАїІ ртТАЗНТМКБа унроОБОБЕВІІ Е.
Під використовуваним в даному описі терміном "ділянка Ю" мається на увазі ділянка сортиліну (відповідна залишкам 523-610 в 5ЕО ІЮ МО:169), що складається з амінокислот за
ЗЕО ІЮ МО:170, як показано нижче:
НУМТІ О5асі ПМАТЕНОЗА РІММІКЕ5ТО ЕСОСУМОТУТЕ ТАОРІМЕТаї.
АБЕРСЕАВЗММ ІБІМ/ЯЕТЕБЕ ГТЗОММ5МТІ ОЕКОП ЕВ.
Що стосується антитіл до ділянки О, спостерігали зв'язування з наступними ділянками, отриманими перетасовуванням: Ппзогі, 2806-10, 812390. Антитіла не зв'язувалися з пПВО1-05,
В45678, їеї. Що стосується антитіл до Юк, спостерігали зв'язування з наступними ділянками, отриманими перетасовуванням: Ппзогі, В12390. Антитіла не зв'язувалися з пВО1-05, пВОб6-10,
В45678, їі. Для антитіл, названих "Ок", спостерігали подібний профіль зв'язування як у антитіл до ділянки "ОО", за винятком того, що для антитіл до Ю- не спостерігали зв'язування з пПВОб6-10.
Не дивлячись на різний профіль зв'язування з конструктами, отриманими перетасовуванням, антитіла до Ю- мали спільні з антитілами до ділянки Ю функціональні характеристики (у клітинних аналізах і т. д.).
Певні антитіла, що зв'язують 0 і Ю., зокрема, зв'язують ділянку, визначену в ЗЕО ІЮ МО:185, 186 або 187. Таким чином, цей винахід відноситься в певних варіантах здійснення до антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язуються з послідовністю ділянки Ю за 5ЕО ІЮ 170 ї послідовностями за 5ЕО ІЮ МО:185, 186 або 187 в межах цієї ділянки. За рахунок зв'язування ці антитіла або антигензв'язувальні фрагменти впливають на рівні РОКМ, і тому їх можна застосовувати для лікування захворювань, що асоціюються з РОЕКМ, таких як ЕТО, АІ 5 і
Ар.
Шляхом додаткового аналізу зв'язування антитіл до ОО і Ож за цим винаходом було ідентифіковано часткове зв'язування деяких з антитіл з суміжною ділянкою (ділянкою А). Ця ділянка відповідає амінокислотам 78-254 з 5ЕО ІЮ МО:169, як показано в 5ЕО ІЮ МО:180 і нижче:
Коо) ЗАРОЕОЕЕСО, ВМАОЕМАКІ А ММТНОНМУБОрО і вазмувівзмумМ авретамі мі
ТТЕНУРІ МІМ ТРЕО5КІ УАЗ ЕОМОаКкМЕКОЇ ТОГІММТРІВ ТЕРОМАІСРЕ
МБаКУМІ ТАЕ уУзааазВасЬні ЕВЗЗОБАКМЕ МОТО РЕНРІ ТОММУ5БРОМ5
ОМ АЇ 5ТЕМ С М УЗКМЕСО КМ/ЕБЇІНК.
Ця ділянка була названа "ділянкою А".
Таким чином, в певних варіантах здійснення цей винахід відноситься до антитіл або їх антигензв'язувальних Фрагментів, які зв'язують ділянку О, визначену вище і в зЕО ІЮ МО: 170, 185, 186 або 187, і додатково мають афінність до ділянки А, ідентифікованої в ЗЕО ІЮ МО: 180.
В межах ділянки А певні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти мають афінність до амінокислот ділянки А, ідентифікованих в 5ЕО ІЮ МО: 181, 182, 183 або 184.
РОККМ (проепітелін, попередник грануліну-епітеліну, фактор росту, що походить від клітин
РС, акрогранін) кодує глікопротеїн, що секретується, розміром 68,5 кДа, який містить 7,5 повторів мотивів грануліну меншого розміру, що знаходяться в діапазоні 6-25 кДа, які можуть бути відщеплені ферментативним шляхом від попередника РОЕМ (Не, 2. 5 Вагетап, А., у). МОЇ.
Меа. 81:600-6 х 2 (2003)). У відмінних від нейронів клітинах РОМ був асоційований з рядом явищ, як, наприклад, регуляцією клітинного циклу і рухливістю клітин (Не, 7. 5 Вагетап, А., 5.
МОЇ. Меа. 57:600-612 (2003); Мопаті, Сх., єї аІ, Сапсег Вез. (5(5:7103-7110 (2006)), загоєнням ран, запаленням (2пПи, .-., еї аї, Сеї! 777:867-878 (2002)), індукуванням синтезу факторів росту, таких як ендотеліальний фактор росту судин (МЕСЕ) (ТапдКеапобітвіп, УМ. 5 Зеїтего, 0,
Сагсіподепевів 25.1587-1592 (2004)), і онкогенезом (Не, 7. 5 Ваїетап, А., У. МОЇ. Меа. 81:600- 612 (2003), Мопаті, С.., еї аІ., Сапсег Вев (5(5:7103-7110 (2006); Зетего, с., Віоспет Віорпув.
Вез. боттип. 505-409-413 (2003), и, А 4 бЗеїтего, С., Ргос. Майї Асад За Ш.5А 98 142-147 (2001); Мацй, І М., еі а!., Сапсег Вез. 60:1353-1360 (2000)).
Мутації РОКМ приводять до гаплонедостатності (Вакег, М., еї аїЇ, Маїшге 442:916-919 (2006);
Стиїв, М., єї аї, Майте 442:920-924 (2006)) і, як відомо, мають місце в близько 50 95 випадків спадкової форми ЕТО, що робить мутацію РОКМ головним генетичним фактором, відповідальним за розвиток ЕТО (Стгцї5, М. 5 Мап Вгоескпомеп, С, Тгепаб5 Сепеї. 24:186-194 (2008); І е Вег", І., єї аї, Вгаіп 129:3051-3065 (2006)). Гетерозиготний характер мутацій РОКМ, що забезпечують втрату функції, означає те, що у здорових індивідуумів експресія РОМ грає важливу роль з дозозалежним характером в забезпеченні захисту здорових індивідуумів від бо розвитку ЕТО.
Термін "антитіло" (АБ) в контексті цього винаходу відноситься до молекули імуноглобуліну або, відповідно до деяких варіантів здійснення цього винаходу, фрагменту молекули імуноглобуліну, що має здатність специфічно зв'язуватися з епітопом молекули ("антигену").
Антитіла, що зустрічаються в природі, зазвичай являють собою тетрамер, який зазвичай складається щонайменше з двох важких (Н) ланцюгів і щонайменше з двох легких (І) ланцюгів.
Кожен важкий ланцюг складається з варіабельного домену важкого ланцюга (скорочено позначеного в даному описі винаходу як МН) і константного домену важкого ланцюга, що зазвичай складається з трьох доменів (СНІ, СН2 і СНЗ). Важкі ланцюги можуть відноситися до будь-якого ізотипу, включаючи Ідс (підтипи Їдс1, Ідс2, доз і Ідс4), ІдДА (підтипи ІдА1 і ІдЧА2),
ІЗ9М і ІМЧЕ. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельного домену легкого ланцюга (скорочено позначеного в даному описі як МІ) і константного домену легкого ланцюга (СІ). Легкі ланцюги включають каппа-ланцюги і лямбда-ланцюги. Варіабельний домен важкого і легкого ланцюгів зазвичай відповідає за розпізнавання антигену, тоді як константний домен важкого і легкого ланцюгів може опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, зокрема з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (С14) класичної системи комплементу. МУН- і Мі -домени можна додатково підрозділити на ділянки гіперваріабельності, що називаються "ділянками, що визначають комплементарність (гіперваріабельні ділянки)", які чергуються з доменами з більш консервативною послідовністю, що називаються "каркасними ділянками" (ЕК). Кожен МН і мМ. складається з трьох СОК-доменів і чотирьох ЕК-доменів, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в наступному порядку: ЕК1-СОВ81-ЕН2-СОН2-ЕВЗ3-СОВЗ3-ЕК4. Варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. На особливу увагу заслуговують антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, які були "виділені" так, щоб вони існували у фізичному середовищі, відмінному від середовища, в якому вони можуть зустрічатися в природі, або які були модифіковані так, щоб вони відрізнялися за амінокислотною послідовністю від антитіла, що зустрічається в природі.
Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з антитілом. Епітопи зазвичай складаються з поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і зазвичай мають специфічні характеристики тривимірної структури, а
Зо також специфічні характеристики заряду. Конформаційні і лінійні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першими, але не з останніми, завжди втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Епітоп може містити амінокислотні залишки, що безпосередньо беруть участь в зв'язуванні, і інші амінокислотні залишки, які безпосередньо не беруть участь в зв'язуванні, такі як амінокислотні залишки, які ефективно блокуються пептидом, що специфічно зв'язується з антигеном (іншими словами, амінокислотний залишок знаходиться в межах ділянки розпізнавання пептиду, що специфічно зв'язується з антигеном).
Використовуваний в даному описі винаходу термін "антигензв'язувальний фрагмент антитіла" означає фрагмент, частину, ділянку або домен антитіла (незалежно від того, як він отриманий (наприклад, за допомогою розщеплювання, рекомбінантним шляхом, за допомогою синтезу і т. д.)), який може зв'язуватися 3 епітопом, і, таким чином, термін "антигензв'язувальний" означає те ж саме, що і "епітопзв'язувальний", так що, наприклад, термін "антигензв'язувальний фрагмент антитіла" призначений позначати те ж, що і "епітопзв'язувальний фрагмент антитіла". Антигензв'язувальний фрагмент може містити 1, 2, 3, 4, 5 або усі 6 СОК-доменів такого антитіла і, не дивлячись на те, що він здатний зв'язуватися з таким епітопом, він може проявляти специфічність, афінність або селективність відносно такого епітопу, який відрізняється від епітопу такого антитіла. Переважно, проте, щоб антигензв'язувальний фрагмент містив усі 6 СОК-доменів такого антитіла.
Антигензв'язувальний фрагмент антитіла може бути частиною одного поліпептидного ланцюга (наприклад, 5сЕм), або містити його, або може представляти собою частину двох або більше поліпептидних ланцюгів, або містити їх, причому кожний з них має амінокінець і карбоксильний кінець (наприклад, діатіло, Рар-фрагмент, Раро-фрагмент і т. д.). Фрагменти антитіл, які проявляють антигензв'язувальну здатність, можна отримати, наприклад, шляхом розщеплювання інтактних антитіл протеазами. Переважніше, щоб, не дивлячись на те, що два домени Ему-фрагмента, МІ ії МН, в природних умовах кодуються окремими генами або полінуклеотидами, які кодують такі послідовності генів (наприклад, їх кодуючою КкДНК), можна було з'єднати за допомогою рекомбінантних способів гнучким лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у вигляді одного білкового ланцюга, в якому Мі- і МН-ділянки асоціюються з утворенням оодновалентних антигензв'язувальних молекул (відомих як одноланцюгові Ем (5СЕм), див., наприклад, Віга еї аї., (1988) 5сіепсе 242:423-426 і Нивіоп еї аї. 60 (1988) Ргос. Маї). Асад. 5сі. (0.5.А.) 85:5879-5883). Як альтернатива, шляхом використання гнучкого лінкера, який є дуже коротким (наприклад, має довжину менш ніж приблизно 9 залишків) для того, щоб забезпечити можливість асоціації Мі- і МН-доменів одного поліпептидного ланцюга один з одним, можна утворити біспецифічне антитіло, діатіло або аналогічну молекулу (у якій два такі поліпептидні ланцюги асоціюються один з одним з утворенням двовалентної антигензв'язувальної молекули) (див., наприклад, РМАБ ОА 90(14), б444-8 (1993) відносно опису діатілу. Приклади антигензв'язувальних фрагментів, що охоплюються цим винаходом, включають (ї) Габ'- або Гар-фрагмент - одновалентний фрагмент, що складається з МІ-, МН-, СІ- і СНІ-доменів, або одновалентне антитіло, описане в
МО2007059782; (ії) Е(ав)2-фрагменти - двовалентні фрагменти, що містять два ГЕар-фрагменти, сполучені дисульфідним містком в шарнірному домені; (ії) Ба-фрагмент, що по суті складається з МН- і СНІ-доменів; (ім) Ем-фрагмент, що по суті складається з МІ- і МН-доменів, (м) аАбБ- фрагмент (Мага еї аї., Мафиге 341, 544-546 (1989)), який по суті складається з МН-домену і також називається доменними антитілами (Ної еї аї!; Тгтепаз Віоїесппої. 2003 Мом;2і(І): 484-90); (мі) антитіла верблюжих або нанотіла (Кемеїв еї аї; Ехрегі Оріп Віо! Тег. 2005 дап;5 (І): І 11-24) і (мії) виділену ділянку, що визначає комплементарність (СОК). Крім того, не дивлячись на те, що два домени Ем-фрагмента, МІ ї МН, кодуються окремими генами, вони можуть бути з'єднані за допомогою рекомбінантних способів з синтетичним лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у вигляді одного білкового ланцюга, в якому МіІ- і МН-домени знаходяться в парі з утворенням одновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Ем (5СЕм), див., наприклад, Віга еї аї., 5сіепсе 242, 423-426 (1988) і Нивіоп еї аІ., РМАБ БА 85, 5879-5883 (1988)). Ці і інші фрагменти антитіл, застосовні в контексті цього винаходу, додатково обговорюються в даному описі винаходу. Також слід розуміти, що термін "антитіло", якщо не вказане інше, також включає антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла і гуманізовані антитіла, і фрагменти антитіл, що зберігають здатність зв'язуватися з антигеном (антигензв'язувальні фрагменти), отримувані за допомогою будь-якої відомої методики, такої як ферментативне розщеплювання, синтез пептидів і рекомбінантні методики. Отримане антитіло може мати будь-який ізотип. Як використовується в даному описі винаходу, "ізотип" відноситься до класу імуноглобуліну (наприклад, ІдсС1, Ідс2, ІдОСЗ або Ідс4), що кодується генами константних доменів важких ланцюгів. Такі фрагменти антитіл отримують за допомогою
Зо традиційних методик, відомих фахівцям в даній галузі техніки; при цьому відповідні фрагменти, здатні зв'язуватися з бажаним епітопом, можна без зусиль піддати скринінгу стосовно корисності таким же чином, як і інтактне антитіло.
Термін "біспецифічне антитіло" відноситься до антитіла, що містить два незалежні антигензв'язувальні фрагменти, кожен з яких націлений на незалежні мішені. Ці мішені можуть бути епітопами, присутніми в різних білках, або різними епітопами, присутніми в одній і тій же мішені. Молекули біспецифічних антитіл можна отримати за допомогою компенсаторних амінокислотних змін в константних доменах НС початкових молекул моноспецифічних двовалентних антитіл. Отримане в результаті гетеродимерне антитіло містить один Раб, внесок в утворення якого вносять два різні початкові моноспецифічні антитіла. Амінокислотні зміни в
Ес-домені приводять до підвищеної стабільності гетеродимерного антитіла з біспецифічністю, яка стабільна за часом. (Кіадулау еї аї., Ргоївіп Епаіпеегіпд 9, 617-621 (1996), СипазекКагап ес! аї., вс 285, 19637-1(2010), Мооге еї аІ., МАБрев 3:6 546-557 (2011), Змор еї аї., УМВ 420, 204-219 (2012), Меї? єї аї., Ргоївїп Епдіпеегіпд 25:10 571-580 (2012), І абгі)п єї аі., РМАБ 110:113, 5145- 5150 (2013), бргеїег Моп Кгейдепвівїп єї аіІ., МАБ5 5:5 646-654 (2013)). Біспецифічні антитіла також можуть включати молекули, які отримані за допомогою злиття СЕМ. Потім два моноспецифічні 5сїм незалежно з'єднують з Ес-доменами, які можуть утворювати стабільні гетеродимери, з отриманням однієї біспецифічної молекули (Мабгу еї аІ., РЕО5 23:3 115-127 (2010). Біспецифічні молекули мають здатність до подвійного зв'язування. "Антитіло проти сортиліну" або "антитіло до сортиліну" (використовувані в даному описі винаходу взаємозамінним чином залежно від контексту, в якому вони написані) являють собою антитіло, його антигензв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язуються з сортиліном, і особливо з ділянкою Ю сортиліну, ЗЕО ІЮ МО:170. Антитіло до сортиліну, яке зв'язується з ділянкою Ю сортиліну, зазвичай зв'язуватиметься з конформаційним епітопом або лінійним епітопом з 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот, розташованих в межах ділянки О (наприклад, ЗЕО ІЮ МО:185, 186 або 187), з афінністю (ІС50), що становить 22 нМ або менше, як, наприклад, від 22 нМ до 1 нМ, від 10 нМ до 1 нМ або від 5 нМ до 1 нМ. Відповідно до деяких варіантів здійснення антитіла до сортиліну можуть також зв'язуватися з ділянкою А (ЗЕО ІЮ
МО:180, 181, 182, 183 або 184), проте слід підкреслити, що їх основна біологічна функція, як вважають, досягається за рахунок зв'язування з ділянкою О. бо Ідентифікований сайт зв'язування є досить унікальним, як показано на прикладі зв'язування селективного ліганду АЕ38469, що є малою молекулою, з сортиліном. Було показано, що сайт зв'язування АЕ38469 аналогічний сайту зв'язування нейротензину, і його характеризували за допомогою рентгенівської кристалографії (Зспгодег еї аІ. Віоогд Мей Спет Гей. 2014 ап 1;24(1):177-80). Повідомлялося, що РОКМ зв'язується з тим же сайтом (Гее єї аІ. Нит Мої
Сепеї. 2013). Антитіла 45 і 68, що зв'язуються з ділянкою О і Ох, відповідно, не пригнічували зв'язування АЕЗ38469 з сортиліном. Ці дані свідчать про те, що ці антитіла мають сайт зв'язування сортиліну, відмінний від сайту зв'язування АЕ38469 і нейротензину. Отже, в певних варіантах здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, здатних специфічно зв'язуватися з сортиліном і пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном, але при цьому їх зв'язування не пригнічує або не пригнічує в значній мірі зв'язування нейротензину або АЕ38469 з сортиліном. Це може бути показано за допомогою, наприклад, зсуву зв'язування з сортиліном із застосуванням сцинтиляційного аналізу зближення (РА) (приклад 11). Один із способів пояснення цього результату може полягати в тому, що антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з поверхневими ділянками сортиліну, тоді як малі молекули, такі як нейротензин, зв'язуються усередині зв'язуючої кишені.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "антитіло людини" (який може бути скорочений до "питАбБ" або "НиМар") призначений включати антитіла, що мають варіабельні і константні домени, отримані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Антитіла людини за цим винаходом можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, мутації, введені за допомогою випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп міїго, або під час перебудови гена, або за допомогою соматичної мутації іп мімо).
Використовувані в даному описі терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл" відносяться до препарату з молекул антитіл єдиного молекулярного складу. Традиційна композиція на основі моноклональних антитіл характеризується єдиною специфічністю зв'язування і афінністю до конкретного епітопу. У певних варіантах здійснення моноклональне антитіло може складатися із понад одного Еар- домену, за рахунок чого підвищується специфічність більш ніж до однієї мішені. Терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл" не призначені для обмеження будь-яким конкретним способом отримання (наприклад, рекомбінантним, трансгенним, гібридомним і т. д.).
Антитіла за цим винаходом і їх антигензв'язувальні фрагменти, що зв'язують сортилін, переважно будуть людськими або, наприклад, мишачими антитілами (позначені як 1Е2, 5Е1), зокрема "гуманізованими" у разі використання в терапевтичних цілях. Термін "гуманізований" відноситься до молекули, що отримується, як правило, з використанням рекомбінантних методик, яка має антигензв'язувальний сайт, отриманий з імуноглобуліну від виду, відмінного від людини, і решту структури імуноглобуліну, в основі якої лежить структура і/або послідовність імуноглобуліну людини. Антигензв'язувальний сайт може містити або повні варіабельні домени антитіла, відмінного від людського, злиті з людськими константними доменами, або тільки гіперваріабельні ділянки (СОК) таких варіабельних доменів, прищеплені до відповідних людських каркасних ділянок варіабельних доменів людини. Залишки каркасних ділянок таких гуманізованих молекул можуть бути дикого типу (наприклад, повністю людськими), або вони можуть бути модифіковані так, щоб містити одну або декілька амінокислотних замін, які не зустрічаються в антитілі людини, послідовність якого послужила основою для гуманізації.
Гуманізація зменшує або усуває вірогідність того, що константний домен молекули виступатиме в ролі імуногена у людей, але зберігається можливість імунної відповіді на чужорідний варіабельний домен (І оВидіїйо, А.Р. еї аї. (1989) "Моизе/Нитап Спітегіс Мопосіопа! Апіїбоду Іп
Мап: Кіпеїїс5 Апа Іттипе НКезропзе", Ргос. Маї!. Асай. сі. (0О.5.А.) 86:4220-4224). Інший підхід фокусується не тільки на отриманні константних доменів людського походження, але також і на модифікації варіабельних доменів, з тим щоб реконструювати їх якомога ближче до людської форми. Відомо, що варіабельні домени як важкого, так і легкого ланцюгів містять по три гіперваріабельні ділянки (СОК), які розрізняються за відповіддю на дані антигени і визначають здатність до зв'язування, фланковані чотирма каркасними ділянками (ЕК), які є відносно консервативними у даного виду і які імовірно виконують роль остову для СОК. Якщо відмінні від людських антитіла отримують до певного антигену, варіабельні домени можна "реконструювати" або "гуманізувати" шляхом щеплення СОК, отриманих з антитіла, відмінного від людського, до ЕК, присутніх в антитілі людини, що підлягає модифікації. Про застосування такого підходу до різних антитіл повідомлялося в зай, К. еї аї. (1993) Сапсег Ке5 53:851-856.
Віесптапп, Г. еї аї. (1988) "Незпаріпд Нитап Апііродіез Тог ТПегару", Маїше 332:323-327; 60 Метоеуєп, М. єї аї. (1988) "ВезПпаріпд Нитап Апіїродіеє: Стайіпуд Ап АпШувзогуте Асіїмйу",
Зсіепсе 239:1534-1536; Кешерогоцои, С. А. єї аї. (1991) "Нитапігайоп ОЇ А Моизе Мопосіопаї
Апіїроду Ву СОВ-Стайіпд: Те Ітропапсе ОЇ Егатеулю/ик Везідиев Оп І оор Сопіоптаїйоп", Ргоївіп
Епдіпеетіпд 4:773-3783; Маеда, Н. еї аї. (1991) "Сопвігисіоп ОЇ Везпаред Нитап Апіїродіез5 МИ
НІМ-Мецігаїїгіпуд Асіїміу", Нитап Апіїродіеєв Нубгідота 2:124-134; Соптап, 5. 0. єї аї. (1991) "Везпаріпд А ТПегарешіс СО4 Апіїбоду", Ргос. Маї!. Асад. Зсі. (0.5.А.) 88:4181-4185; Тетревзві,
Р.В. єї аї. (1991) "Везпаріпу А Нитап Мопосіопа! Апіїроду То Іппірії Нитап Резрігаюгу Зупсуйаї!
Мігиз Іптесійоп іп мімо", Віо/Тесппоїоду 9:266-271; Со, М. 5. еї аї. (1991) "Нитапігей Апііродієв Рог
Апіїміга, Трегару", Ргос. Май. Асай. зЗсі. (0.5.А.) 88:2869-2873; Сапег, Р. еї аї. (1992) "Нитапігайоп ОЇ Ап Апії-рі85Нег2 Апіїбоду Рог Нитап Сапсег ТНегару", Ргос. Май). Асад. зсі. (О.5.А.) 89:4285-4289; і Со, М.5. еї а. (1992) "Спітегіс Апа Нитапілеа Апііродіез М/Кп Зресійсну
Еог Тне СОЗ33 Апіїдеп", 9. Іттипої. 148:1149-1154. У деяких варіантах здійснення гуманізовані антитіла зберігають всі послідовності СОК (наприклад, гуманізоване антитіло миші, яке містить усі шість СОК антитіл миші). У інших варіантах здійснення гуманізовані антитіла містять одну або декілька СОК (одну, дві, три, чотири, п'ять, шість), які змінені відносно початкового антитіла і які також називаються однією або декількома СОК, "отриманими з" одного або декількох СО початкового антитіла. Можливість гуманізації антигену добре відома (див., наприклад, патенти
США МоМо 5225539, 5530101, 5585089, 5859205, 6407213, 6881557).
Термін "антитіло "ХХ" призначений позначати антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент (наприклад, антитіло "БЕ1"), що містять легкий ланцюг, варіабельний домен легкого ланцюга або СОК1-3 варіабельного домену легкого ланцюга, визначені за їх відповідними 5ЕО
ІЮО МО, і важкий ланцюг, варіабельний домен важкого ланцюга або СОК1-3 варіабельного домену важкого ланцюга, визначені за їх відповідними 5ЕО ІЮО МО, або що складаються з них. У певних варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент визначені їх повним варіабельним доменом важкого ланцюга, визначеним за його 5ЕБО ІЮ МО, і їх варіабельним доменом легкого ланцюга, визначеним за його ЗЕО ІЮ МО, що містяться в них.
Нумерація амінокислотних залишків в цій ділянки відповідає ІМОСТФ, міжнародній інформаційній системі ІтМипосепетіс5о або КаБбаї, Е. А., УмМи, Т. Т., Реггу, Н. М., сойезтапп, К.
З. б БоеїІег, С. (1991). Зедиєпсе5 ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгевії, 5-е видання, Ц.5.
Рераптепі ої Неайп апа Нитап 5егмісе5, публікація МІН Мо 91-3242; Споїпіа, С. 8. І е5К, А. М.
Зо (1987). Сапопіса! вігисіиге5 Рог Те Нурегуапаріе дотаїнз ОЇ Іттиподіобиїїпв. У. Мої. Вісі. 196, 901-917.
Як використовується в даному описі винаходу, говорять, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент "специфічно" зв'язуються з ділянкою іншої молекули (тобто епітопом), якщо вони реагують або асоціюють з цим епітопом частіше, швидше, з більшою тривалістю і/або з більшою афінністю або авідністю в порівнянні з альтернативними епітопами.
У одному варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом зв'язуються щонайменше в 10 разів сильніше зі своєю мішенню (сортиліном), ніж з іншою молекулою; переважно щонайменше в 50 разів сильніше і переважніше щонайменше в 100 разів сильніше. Переважно, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язуються у фізіологічних умовах, наприклад, іп мімо. Таким чином, під "специфічним зв'язуванням з сортиліном" мається на увазі здатність антитіла або його антигензв'язувального фрагмента зв'язуватися з сортиліном з такою специфічністю і/або в таких умовах. Способи, відповідні для визначення такого зв'язування, будуть відомі фахівцям в даній галузі техніки, і ілюстративні способи описані в прикладах, що додаються. Використовуваний в даному описі винаходу термін "зв'язування" в контексті зв'язування антитіла із попередньо визначеним антигеном зазвичай відноситься до зв'язування з афінністю, відповідною КО, що становить приблизно 10-77 М або менше, як, наприклад, приблизно 108 М або менше, як, наприклад, приблизно 109 М або менше, при визначенні за допомогою, наприклад, технології поверхневого плазмонного резонансу (ЗРЕ) на приладі ВіІАсоге?ж 3000 або 1200 із застосуванням антигену як ліганду і антитіла як аналізованої речовини, і до зв'язування із попередньо визначеним антигеном з афінністю, відповідною КО, щонайменше вдесятеро нижчою, як, наприклад, щонайменше в 100 разів нижчою, наприклад, щонайменше в 1000 разів нижчою, як, наприклад, щонайменше в 10000 разів нижчою, наприклад, щонайменше в 100000 разів нижчою, ніж його афінність при зв'язуванні з неспецифічним антигеном (наприклад, ВЗА, казеїном), відмінним від попередньо визначеного антигену, або близькоспорідненим антигеном. Ступінь, на яку афінність є нижчою, залежить від КО антитіла, так що якщо КО антитіла є дуже низькою (тобто антитіло є високоспецифічним), то ступінь, на яку афінність до антигену є нижчою, ніж афінність до неспецифічного антигену, може бути щонайменше 10000-кратною. Зокрема, цей винахід відноситься до антитіл до сортиліну, які проявляють афінність зв'язування, що становить 22 нм 60 або менше, як, наприклад, від 22 нМ до 1 нМ, від 10 нМ до 1 нМ або від 5 нМ до 1 нМ, при визначенні, наприклад, за допомогою інтерферометрії біошару із застосуванням Осієеї 384КЕЮО (приклад 8).
У певних варіантах здійснення цього винаходу цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, здатних конкурувати з питАб антитілом 45 або пПитАр антитілом 68 за зв'язування з сортиліном. У іншому варіанті здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, які здатні конкурувати з антитілом 45 за зв'язування з ділянкою Ю сортиліну, визначеною в 5БЕО ІЮ МО:170. Таке конкурентне пригнічення зв'язування можна визначити за допомогою аналізів і способів, добре відомих з рівня техніки, наприклад, із застосуванням чипів ВіАсогеф з іммобілізованим сортиліном людини і інкубації з еталонним антитілом (таким як антитіло "45" або "68") з поліпептидом антитіла, що підлягає тестуванню, або без нього. Як альтернативу можна застосовувати підхід попарного картування, при якому еталонне антитіло (таке як антитіло "45" або "68") іммобілізують на поверхні чипа ВІАсогефФ, при цьому антиген сортиліну людини зв'язується з іммобілізованим антитілом, а потім друге антитіло тестують щодо здатності одночасного зв'язування з людським сортиліном (див. "Керівництво з аналізу ВіІАсогефу, СЕ Неайпсаге І Ше Зсіепсе5, 29-0194-00 АА 05/2012; розкриття якого включено в даний опис шляхом посилання).
Використовуваний в даному описі винаходу термін "Ка" (с-1 або 1/с) відноситься до константи швидкості дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену. Вказане значення також називають значенням Коїї.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "Ка" (М-1 х с-1 або 1/М.с) відноситься до константи швидкості асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "КО" (М) відноситься до рівноважної константи дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, отримуваної шляхом ділення
Ка на Ка.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "КА" (М-1 або 1/М) відноситься до рівноважної константи асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, отримуваної шляхом ділення Ка на Ка.
У одному варіанті здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, які проявляють одне або декілька з наступних властивостей:
Зо афінність зв'язування (Ко) з сортиліном, що становить 0,5-10 нМ, як, наприклад, 1-5 нМ або 1-2 нм; здатність знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном; здатність знижувати і/або пригнічувати виведення РОКМ клітинами, експресуючими сортилін; здатність знижувати і/або пригнічувати ендоцитоз РОКМ клітинами, експресуючими сортилін; здатність підвищувати кількість і/або концентрацію РОКМ в плазмі крові у мишей з нокіном, за рахунок якого у них експресується сортилін людини.
Під терміном "здатність знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном" мається на увазі антитіло, яке має здатність пригнічувати зв'язування з РОКМ при значенні
ІС5О, що становить менше 50 нМ, але переважно від 10 нМ до 0,2 нМ, яке визначають за допомогою флуоресцентного аналізу з розрізненням за часом (НТЕК), розкритого в прикладі 10.
Під терміном "здатність знижувати і/або пригнічувати виведення РОКМ клітинами, експресуючими сортилін" мається на увазі здатність підвищувати концентрацію РОКМ в середовищі щонайменше на 25 95, як, наприклад, від 25 95 до 500 95, від 25 95 до 400 95 або від 25 95 до 200 96, що вимірюють за допомогою аналізу ЕГІЗА, як розкрито в прикладі 13.
Під "здатністю знижувати і/або пригнічувати ендоцитоз РОКМ клітинами, експресуючими сортилін' мається на увазі здатність знижувати внутріклітинну концентрацію РОКМ щонайменше на 10 95, але переважно від 20 до 100 95, що вимірюють за допомогою аналізу, заснованого на сеїотісв5, як розкрито в прикладі 12.
Під "здатністю підвищувати кількість і/або концентрацію РОКМ в плазмі крові у мишей з нокіном, за рахунок якого у них експресується сортилін людини" мається на увазі здатність підвищувати концентрацію РОКМ в плазмі крові щонайменше на 25 95, але переважно від 50 до 500 відсотків, що вимірюють за допомогою аналізу ЕГІЗА, як розкрито в прикладі 15.
Передбачається, що здатність підвищувати рівень РОМ в головному мозку можна також аналізувати, наприклад, за допомогою мікродіалізу. Таким чином, під "здатністю підвищувати кількість і/'або концентрацію РОКМ в головному мозку" мається на увазі здатність підвищувати концентрацію РОКМ в головному мозку щонайменше на 25 9565, але переважно від 50 до 500 відсотків, що вимірюють за допомогою мікродіалізу. бо У деяких антитілах для збереження зв'язування в гуманізованому антитілі необхідна лише частина СОК, а саме підмножина залишків СОК, необхідних для зв'язування, що називаються
ЗОК. Залишки СОК, що не контактують з відповідним епітопом і не містяться в 5ОК, можна ідентифікувати на підставі попередніх досліджень (наприклад, залишки НбО-Нб5 в СОК Нн2 часто не є необхідними), із ділянок СОЕК за Кабаї, розташованих зовні гіперваріабельних петель за Споїпіа (див. Кабаї єї аїЇ. (1992) бБедиепсе5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодіса! Іпіегев5і, Мабопаї!
Іпзійше5 ої Неакй, публікація Мо 91-3242; Споїпйіа, С. еї аї. (1987) "Сапопіса! бігисіштев Рог Те
Нурегчапаріє Аедіопе ОЇ Іттиподіобиййпе", 0). Мої. Віої. 196:901-917), за допомогою молекулярного моделювання, і/або емпіричним шляхом, або як описано в Соплаїе5, М.К. еї аї. (2004) "ОВ Стгацйіпа ОЇ А Мигіпе Апіїрбоду Овіпа Мийіріе Нитап Септіїпе Тетріайез То Міпітіге 5 Іттиподепісйцу", Мої. Іттипої. 41:863-872. У таких гуманізованих антитілах в положеннях, в яких відсутні один або декілька залишків донорної СОК. або в яких відсутня вся донорна СОБК, амінокислота, що займає положення, може бути амінокислотою, що займає відповідне положення (згідно з нумерацією за Кара)д в акцепторній послідовності антитіла. Кількість таких замін акцепторних амінокислот на донорні в СОК, які потрібно включити, відображає баланс альтернативних думок. Такі заміни є потенційно переважними для зниження кількості амінокислот миші в гуманізованому антитілі і, отже, для зниження потенційної імуногенності.
Проте, заміни також можуть викликати зміну афінності, а переважним є уникати значних зменшень афінності. Положення для заміни в межах СОК і амінокислоти, що підлягають заміні, також можна вибрати емпіричним шляхом.
Той факт, що зміна однієї амінокислоти в залишку СОК може привести до втрати функціонального зв'язування (Киаїкоїй, 5. еїс. (1982) "Біпдіе Атіпо Асій Зирзійшіоп АКегіпа
Апіідеп-Віпаіпу Зресіїісйу", Ргос. Маї!. Асай. сі. (О5А) 79(6):1979-1983), забезпечує можливість систематичної ідентифікації альтернативних функціональних послідовностей СОК. У одному переважному способі отримання таких варіантів СОМ полінуклеотид, що кодує СОК, піддають мутації (наприклад, шляхом випадкового мутагенезу або за допомогою сайт-спрямованого способу (наприклад, з ампліфікацією, опосередкованою полімеразною ланцюговою реакцією, з праймерами, які кодують мутантний локус)) з отриманням СОжЖ, що має замінений амінокислотний залишок. Шляхом порівняння ідентичності початкової (функціональної) послідовності СОК за відповідним залишком з ідентичністю варіанта послідовності СОК із
Зо заміною (нефункціональної) для цієї заміни можна визначити вагу заміни згідно з ВГОБИМбО. Ії).
У системі ВГОБИОМ представлена матриця амінокислотних замін, що створюється шляхом аналізу бази даних послідовностей відносно достовірних вирівнювань (Едау, 5.Е. (2004) "УУпеге рій Те В'О5БИОМб2 АїЇїдптепі Зсоге Майїх боте Егот?", Маїште Віоїесн. 22(8):1035-1036;
Непікоїйї, 9У.сх. (1992) "Атіпо асіа зиб5ійшіоп таїйгісе5 їот ргоївіп БіосКв8", Ргос. Маї!. Асай. 5сі. (ОА) 89:10915-10919; Капіп, 5. єї а. (1990) "Меїнодз Рог Азз5еззіпуд Те еіаїїзіїса! бідпітісапсе ОЇ
МоїІесшаг Зедиепсе Еєаїштез Ву Овіпд Сепега! бсогіпд 5спетев", Ргос. Маї!. Асад. 5сі. (О5А) 87:2264-2268; Айїбвспиї, 5.РЕ. (1991) "Атіпо Асіа з!иБ5ійшіоп Майісев гот Ап Іпіогтаїйоп ТНеогеїїс
Реггресіїме", у. Мої. Віої. 219, 555-565. В даний час найбільш досконалою базою даних В О5ИОМ є база даних ВІ О5ИОМб62 (ВІ ОЗИМЄб2.Її|). У таблиці 1 представлені значення ваги замін згідно з
ВГОБИМбаІ. Її) (чим більше вага, тим консервативнішою є заміна і, таким чином, тим ймовірніше, що заміна не впливатиме на функцію). Якщо, наприклад, антигензв'язувальний фрагмент, що містить отриману в результаті СОК, не може зв'язуватися з сортиліном, то вагу заміни згідно з
В'ОоБИМб2.Її| вважають недостатньо консервативною і вибирають і проводять нову кандидатну заміну, що має більшу вагу заміни. Так, наприклад, якщо початковим залишком був глутамат (Е), а нефункціональним замінюючим залишком був гістидин (Н), то вага заміни згідно з
В'ОоБИМБб2.ії дорівнюватиме 0, а консервативніші зміни (наприклад, аспартат, аспарагін, глутамін або лізин) є переважними.
Таблиця 1 ГА|ВнНІМІо|СсСІО | ЕЇСІНІ! у укКІМ є РІЗ|т| М ХМ
А|т я 220 лі л|10|2 лили 2 1 ного вілов' о г2г|з ного 3221132 1 3 | 2 з міг2г10 бініз о 010 з 93012 3 2 10 4 | 2| з 0212 но ч2е|л| 134 113 3 10111 4 | з со 1333159 31 4| 3/3 131213 11 2 о |лініої|о|з 5 ч2| 203 2 но 3 1011 е2г|І 2
Ел 101 0|-2| 4 2 5| 2103 3 2 3101 3 | 2 2 сао 210113 2 21462144 213 3 2 012 2 | З| з нігіо ніч оо 28 3193 112 1121-1121 2 || з 11313193 331 4| 3 за за Зно 13211 3
ЕЕ 213|4|11 21 3|4| З зай 2121013 211 2 | лі ні кіл ол з нні гл 5 я 311011 312 2 міліліе| зло е2|з3| 2 нія лів о 1217 | лін
ЕЕ 21-31 3|3| 213 3|3|11010 310 6 421 2 м
РІЛЛІ 2|ч| 31221313 11214 и 11 4 || 2
Інілініо|л 10 010 21210112 1 мі || 2 то лот тер лілія нів е|г2|о
Міо з3| || 2 е2|з| зн гніт 2 го) з
Таким чином, цей винахід передбачає застосування випадкового мутагенезу для ідентифікації поліпшених СОМ. У контексті цього винаходу консервативні заміни можуть бути визначені як заміни в межах класів амінокислот, відображених в одній або декількох з наступних 5 трьох таблиць.
Класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Таблиця 2
Азр (0) і Сім (Е)
Гуз (К), Аго (БК) і Нів (Н)
Зег (5), Тиг (Т), Авп (М) і Сіп (С)
СІу (С), Аа (А), Ма! (М), ем (у і Пе (І
Суз (С), Ме! (М) і Рго (Р)
Рне (Є), Туг (У) і Тгр (МУ)
Альтернативні класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Таблиця З а 11116111 11111111 1 811111 214111в1 11111 к1 6 Гм 7261 ГГ мМ1мМ
Альтернативні фізичні і функціональні класифікації амінокислотних залишків
Таблиця 4
Групи більш консервативних замін включають валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін- тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін і аспарагін-глутамін.
Додаткові групи амінокислот також можуть бути складені за допомогою принципів, описаних, наприклад, в Стеідпіоп (1984) Ргоїеіп5: Зігисіиге апа Моїесшціаг Ргорегііїеєз (24 Еа. 1993), МУ. Н.
Егеетап апа Сотрапу.
Як альтернативу можна застосовувати технологію фагового дисплея для підвищення (або зниження) афінності СОК. Ця технологія, яка називається дозріванням афінності, передбачає використання мутагенезу або "прогулянки по СОМ", а повторний відбір передбачає застосування цільового антигену або його антигенного антигензв'язувального фрагмента для ідентифікації антитіл, що мають СОК, які зв'язуються з вищою (або нижчою) афінністю з антигеном в порівнянні з первинним або початковим антитілом (див., наприклад, Сіазег еї аї. (1992) У. ІттипоЇоду 149:3903). Мутагенез цілих кодонів, а не окремих нуклеотидів, приводить до отримання напіввипадкового набору амінокислотних мутацій. Можна конструювати бібліотеки, що складаються з пулу варіантів клонів, кожен з яких відрізняється однією зміною амінокислоти в одній СОЖК і який містить варіанти, що представляють кожну можливу амінокислотну заміну для кожного залишку СОК. Мутанти з підвищеною (або зниженою) афінністю зв'язування з антигеном можна піддати скринінгу шляхом приведення в контакт іммобілізованих мутантів з міченим антигеном. Для ідентифікації антитіл мутантів з підвищеною або зниженою афінністю до антигену можна застосовувати будь-який відомий з рівня техніки спосіб скринінгу (наприклад, ЕГІ5А) (див. УМи єї аЇ. 1998, Ргос. Май. Асай. 5сі. (0О.5.А.) 95:6037;
Уепоп еї аї., 1995, 9. Іттипоїоду 155:1994). Можливе застосування методики "прогулянки по
СО", за допомогою якої рандомізують легкий ланцюг (див. Зспієег еї а!І., 1996, У. Мої. Віо. 263:551).
Способи здійснення такого дозрівання афінності описані, наприклад, в Кгаизе, .).С. еї аї. (2011) "Ап Іпзепйіоп Миїайоп Тнаї Оівіопв5 Апіїроду Віпаїпд 5йе Агспіесіиге Еппапсев ЕРипсійп ОЇ
А Нитап Апііїроду", МВіо. 2(1) рії: е00345-10. дої: 10.1128/тВіо.00345-10; Киап, С.Т. еї аї. (2010) "Аніпіку-Маїигейд Апіі-Сіусоргоївїп ММВ Ресотрбіпапі Іттипоїохіп5 Тагдеїпа Маїїдпапі Спіотав5
Ап Меїапотав", Іпі. У. Сапсег 10.1002/|с.25645; НаскКеї, В.). еї ах. (2010) "Ззарійу Апа СОВ
Сотровійоп Віазев Епгісп Віпдег Рипсііопаїйу І апазсарев", У. Мої. Віої. 401(1):84-96; Мопідотегу,
О.К. еї аї. (2009) "Аніппу Маїигайоп Апа Спагасієгігайноп ОА Нитап Мопосіопа! Апіїроду Адаїпві
НІМ-1 др41", МАБб5 1(5):462-474; Саяивісніпа, Е. єї аі. (2009) "АНіпйу Майшгайоп Ву Таговївй
Оімегвіїїсайоп ОЇ Те СОВ-НЕ2 Іоор ОЇ А Мопосіопа! Раб Оеєгімед Рот А Зупіпеїїс Маїме Нитап
Апіїрбоду І Інгагу Апа бігесієйд Адаїпві Те Іпіетпа! Титетіс Сойеа-Сої ОЇ Сір41 Мівідв А 5еї ОЇ Рарз
ММ Ітргомей НІМ-1 Мешгаїїгайоп Роїепсу Апа Вгєайін", Мігоіїоду 393(1):112-119; Ріпіау, МУ... еї а. (2009) "АНіпйу Маїйгайоп ОЇ А Нитапігей АНаї Апіроду Бог АМТІ-ВАСЕ Тнегару:
СотргеНепвзіме Миїадепевзіз Немеаї5 А Нідп І еме! ОЇ Миїайопаї! Ріавіїсйу Воїй Іпвіде Апа Оцівіде
Тне Сотріетепіату-Оеєїеттіпіпу Недіопв", ). Мої. Віої. 388(3):541-558; Вовігот, «у. еї аї. (2009) "Іпргоміпуд Апіїбоду Віпаіїпд Айіпйу Апа Зресіїсну Рог Тнегарешіс ЮемеІортепі", Меїйодв Мої.
Віо!. 525:353-376; еїеїаї, 5. еї аї. (2008) "п Міго Айіпйу Майшгайоп ОЇ Нитап СМ-С5Е Апіїродієв
Ву Тагдеїва СОВ-Оімегвіїісайоп", Мої. Іттипої. 46(1):135-144; і Вагаегав, Е. еї аї. (2008) "Айіпйу
Маїсгаїйоп Ої Апііродієз Азвівієй Ву Іп 5іїїсо Моаеїїпд", Ргос. Маї!. Асад. 5сі. (ОБА) 105(26):9029- 9034.
Таким чином, послідовність варіантів СОМ охоплюваних антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів може відрізнятися від послідовності СОК початкового антитіла завдяки замінам; наприклад, заміненим 4 амінокислотним залишкам, З амінокислотним залишкам, 2 амінокислотним залишкам або 1 амінокислотному залишку. Відповідно до одного варіанта здійснення цього винаходу додатково передбачається те, що амінокислоти в СОК-ділянках можуть бути замінені шляхом консервативних замін, визначених в З таблицях нижче.
Термін "трансгенна тварина, відмінна від людини" відноситься до тварини, що відмінна від людини, що має геном, що містить один або декілька людських трансгенів або трансхромосом, що кодують важкий і/або легкий ланцюги (інтегрованих або не інтегрованих в природну геномну
ДНК тварини), яка здатна експресувати повністю людські антитіла. Наприклад, трансгенна миша може мати трансген, що кодує людський легкий ланцюг, і або трансген, що кодує людський важкий ланцюг, або трансхромосому, що кодує людський важкий ланцюг, унаслідок чого у миші виробляється людське антитіло до сортиліну при імунізації сортилінним антигеном і/або клітинами, експресуючими сортилін. Трансген, що кодує людський важкий ланцюг, може бути інтегрований в хромосомну ДНК миші, як у випадку з трансгенними мишами, наприклад, мишами НиМАБбБ, такими як миші НСо7 або НСо12, або трансген, що кодує людський важкий ланцюг, може зберігатися позахромосомно, як у випадку з трансхромосомними мишами КМ, описаними в УУМО02/43478. Такі трансгенні і трансхромосомні миші (що в сукупності називаються в даному описі "трансгенними мишами") здатні виробляти декілька ізотипів моноклональних антитіл людини до даного антигену (таких як Ідс, ІдА, ІЮДМ, дО і/або ІЗДЕ), шляхом піддавання М- р-У-рекомбінації і перемиканню ізотипу.
Трансгенну тварину, відмінну від людини, також можна використовувати для отримання антитіл до специфічного антигену шляхом введення генів, що кодують таке специфічне антитіло, наприклад, шляхом формування функціонального зв'язку генів з геном, що експресується в молоці тварини.
Використовуваний в даному описі винаходу термін "лікування" або "здійснення лікування" означає полегшення, уповільнення, ослаблення або обернення розвитку або тяжкості захворювання або порушення або полегшення, уповільнення, ослаблення або усунення одного або декількох симптомів або побічних ефектів такого захворювання або порушення. Для цілей цього винаходу термін "лікування" або "здійснення лікування" додатково означає підхід для отримання сприятливих або бажаних клінічних результатів, де термін "сприятливі або бажані клінічні результати" включає без обмеження зменшення інтенсивності прояву симптому,
Зо зниження ступеня тяжкості порушення або захворювання, стабілізацію (тобто відсутність погіршення) стану захворювання або порушення, затримку або уповільнення прогресу стану захворювання або порушення, полегшення або пом'якшення стану захворювання або порушення і ремісію захворювання або порушення, або частково, або повністю, що піддається виявленню або не піддається виявленню.
Термін "ефективна кількість", вживаний відносно антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за цим винаходом, відноситься до кількості, яка при введенні в необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу є достатньою для досягнення наміченого біологічного ефекту або бажаного терапевтичного результату, включаючи, без обмеження, досягнення клінічних результатів. Фраза "тгерапевтично ефективна кількість", вживана відносно антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за цим винаходом, призначена позначати кількість антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, яка є достатньою для полегшення, пом'якшення, стабілізації, обернення, уповільнення, ослаблення або затримки прогресу порушення або хворобливого стану або симптому порушення або захворювання. У одному варіанті здійснення спосіб за цим винаходом передбачає введення антитіла або його антигензв'язувального фрагмента в комбінаціях з іншими сполуками. У такому разі "ефективною кількістю" є кількість комбінації, достатня для того, щоб викликати намічений біологічний ефект.
Терапевтично ефективна кількість антитіла до сортиліну або його антигензв'язувального фрагмента за цим винаходом може мінятися залежно від таких чинників, як стан хвороби, вік, стать і вага індивідуума, а також здатність антитіла до сортиліну або його антигензв'язувального фрагмента викликати бажану відповідь у індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також є кількістю, при якій терапевтично сприятливі ефекти перевершують будь-які токсичні або пагубні ефекти антитіла або частини антитіла.
Антитіла переважно являють собою людське або гуманізоване антитіло.
Нумерація амінокислотних залишків в цій ділянці відповідає ІМОСТФ, міжнародній інформаційній системі ІтМипосепетіс5Ф або КаБбаї, Е. А., УМи, Т. Т., Реггу, Н. М., соНезтапп, К.
З. б БоеїІег, С. (1991). Зедиєпсе5 ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгевії, 5-е видання, Ц.5.
Рераптепі ої Неайп апа Нитап 5егмісе5, публікація МІН Мо 91-3242; Споїпіа, С. 8. І е5К, А. М. (1987). Сапопіса! вігисіиге5 Рог Те Нурегуапаріе дотаїнз ОЇ Іттиподіобиїїпв. У. Мої. Вісі. 196, 901-917. (516)
Антитіло 5Е1
Відповідно, цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО:1; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:2; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:3; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО 4; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:5; і (д СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:6, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮО МО:8 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮО МО;:7 або складатися з них.
Антитіло 1Е2
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО І МО:9; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:10; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:11; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за хЕО ІЮ МО:12; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:13; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:14, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:16 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:15 або складатися з них.
Антитіло 068
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:17; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:18;
Зо (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за хЕО ІЮ МО:19; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5Е0О ІЮ МО:20; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:21; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:22, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:24 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:23 або складатися з них.
Антитіло 1320
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:25; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:26; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО 1Ю МО:27; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:28; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:29; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:30, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:32 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:31 або складатися з них.
Антитіло 93-05
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:33; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО:34; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО:35; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:36; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:37; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:38, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за 60 ЗЕО ІЮ МО:40 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:39 або складатися з них.
Антитіло 93-01
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ1 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:41; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:42; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:43; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:44; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:45; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:46, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:48 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:47 або складатися з них.
Антитіло 924
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО:49; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:50; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:51; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО:52; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:53; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:54, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:56 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:55 або складатися з них.
Антитіло 1276
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:57; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:58;
Зо (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:59; (4) СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО:60; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:61; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:62, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:64 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:63 або складатися з них.
Антитіло 849
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:65; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:66; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:67; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:68; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:69; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:70, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:72 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:71 або складатися з них.
Антитіло 531-02
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО:73; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО:74; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:75; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5Е0О ІЮ МО:76; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:77; і (у СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:78, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за 60 ЗЕО ІЮ МО:80 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:79 або складатися з них.
Антитіло 548-01
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО І МО:81; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО:82; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:83; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:84; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО:85; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:86, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:88 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО:87 або складатися з них.
Антитіло 548-02
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:89; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:90; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:91; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:92; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:93; і ( СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:94, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:96 і варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО:95 або складатися з них.
Антитіло 1289-02
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОК!І легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:97; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:98;
Зо (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:99; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО:100; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:101; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:102, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:104 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:103 або складатися з них.
Антитіло 811-02
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:105; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:106; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за хЕО ІЮ МО:107; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:108; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:109; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:110, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:112 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:111 або складатися з них.
Антитіло 566-01
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:113; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:114; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО:115; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:116; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:117; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:118, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за 60 ЗЕО ІЮ МО:120 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:119 або складатися з них.
Антитіло 562
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:121; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:122; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:123; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:124; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО:125; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:126, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:128 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІО МО:127 або складатися з них.
Антитіло 193
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5БЕО ІЮ МО:129; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:130; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:131; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО:132; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:133; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:134, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:136 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:135 або складатися з них.
Антитіло 88
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:137; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:138;
Зо (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО:139; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО:140; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:141; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:142, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:144 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:143 або складатися з них.
Антитіло 045
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:145; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:146; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5Е0 ІЮ МО:147; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:148; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:149; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:150, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:152 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:151 або складатися з них.
Антитіло 044
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:153; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:154; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО:155; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:156; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:157; і (у СОВЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО:158, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за 60 ЗЕО ІЮ МО:160 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО:159 або складатися з них.
Антитіло 002
Відповідно до іншого варіанта здійснення цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містять (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО І МО:161; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО:162; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО:163; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО:164; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО:165; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО:166, або що складаються з них.
Переважно, моноклональне антитіло може містити варіабельний домен важкого ланцюга за
ЗЕО ІЮ МО:168 і варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІО МО:167 або складатися з них.
Відповідно до одного варіанта здійснення антитіла, згадані вище, можуть додатково містити варіант з не більше ніж 4 відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж З відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж 2 відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж 1 відмінністю в амінокислотах в порівнянні з вказаними послідовностями СОКІ, СОК2 і/або СОНКЗ (МН і/або МІ).
Крім того, антитіла можуть бути представлені в композиції разом з фармацевтично прийнятним носієм. Антитіла за цим винаходом можна застосовувати в терапії. Зокрема, антитіла за цим винаходом можна застосовувати при лікуванні ЕТО, або АЇ 5, або протеїнопатій
ТОРА, таких як хвороба Альцгеймера (АБ).
Лікування, що передбачається цим винаходом, може бути довгостроковим, і пацієнт може отримувати лікування щонайменше протягом 2 тижнів, як, наприклад, протягом щонайменше 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
Антитіла за цим винаходом можуть представляти собою, наприклад, моноклональні антитіла, що отримуються за допомогою гібридомного способу, вперше описаного в КопПіег еї аї.,
Маїшге 256, 495 (1975), або можуть представляти собою моноклональні антитіла, що отримуються за допомогою рекомбінантних ДНК або інших способів. Моноклональні антитіла також можна виділяти з фагових бібліотек антитіл за допомогою методик, описаних, наприклад, в СіІаск5оп еї аї., Майшге 352, 624-628 (1991) і Магк5 еї аї., У. МОЇ. Віої. 222, 581-597 (1991).
Моноклональні антитіла можна отримувати від будь-якого відповідного джерела. Так, наприклад, моноклональні антитіла можна отримати з гібридом, отриманих з В-лімфоцитів селезінки миші, отриманих від мишей, імунізованих антигеном, що представляє інтерес, або нуклеїновою кислотою, що кодує антиген, що представляє інтерес, наприклад, у вигляді клітин, що експресують антиген на поверхні. Моноклональні антитіла також можна отримувати з гібридом, отриманих з клітин, що експресують антитіла, від імунізованих людей або ссавців, відмінних від людини, таких як щури, кролі, собаки, вівці, кози, примати і т. д.
У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є антитілом людини.
Моноклональні антитіла людини, спрямовані проти сортиліну, можна отримувати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть частини імунної системи людини замість системи миші. Такі трансгенні і трансхромосомні миші включають мишей, що називаються в даному описі мишами НиМАБ і мишами КМ, відповідно.
Миша НиМАБ містить мінілокус гена імуноглобуліну людини, який кодує нереаранжовані послідовності варіабельних і константних доменів важких ланцюгів (н їі у) і варіабельних і константних доменів легких ланцюгів (к) імуноглобуліну людини, разом з цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси, що кодують ур- і к-ланцюги (І опрего, М. еї аї., Маїшге 368, 856- 859 (1994)). Відповідно, ці миші характеризуються пониженою експресією ІДМ або ІдК миші, ії у відповідь на імунізацію введені трансгени людського важкого і легкого ланцюга піддаються перемиканню класу і соматичній мутації, щоб утворювати високоафінні моноклональні антитіла
ІЧ людини к-ізотипу (І опрегу, М. еї аІ. (1994), вище; огляд яких наведений в Іопрего, М.,
Напароок ої Ехрегпітепіа! Рпаптасоіоду 113, 49-101 (1994), І опрегу, М. апа Низлаг, 0., Іпіет.
Кем. Іттипої. том 13, 65-93 (1995) і Нагаїпо, Р. апа Гопрего, М., Апп. М. У. Асай. зсі 764 536-546 (1995)). Отримання мишей НиМАБ детально описано в Тауїог, Ї. еї а!., Мисівїс Асід5 Кезеагсп 20, 6287-6295 (1992), Спеп, ». еї аї., Іпіегпайопа! Іттипоіоду 5, 647-656 (1993), Тиаїйноп еї аї.,».
Ітітипої. 152, 2912-2920 (1994), Тауог, Ї. еї аї., Іпїегпайопа! Іттипоіоду 6, 579-591 (1994),
ЕівПпУліа, 0. еї а!., Маїшге Віотесппоіоду 14, 845-851 (1996). Див. також 5 5545806, О5 5569825, 55625126, 005 5633425, 005 5789650, 005 5877397, 05 5661016, 005 5814318, 005 5874299, 05 5770429, 05 5545807, УМО 98/24884, МО 94/25585, МО 93/1227, МО 92/22645, МО 92/03918 і
МО 01/09187. 60 Миші НСо7, НСо12, НСо17 і НСо20 мають порушення УКО в своїх ендогенних генах легкого ланцюга (каппа) (як описано в Спеп еї аї., ЕМВО .). 12, 811-820 (1993)), порушення СМО в своїх ендогенних генах важкого ланцюга (як описано в прикладі 1 публікації М/О 01/14424) і трансген
КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг (як описано в Різпуліа еї аї., Маїиге ВіббесппоЇоду 14, 845-851 (1996)). Додатково, миші НСо7 мають трансген НСо7, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в 05 5770429), миші НСо12 мають трансген НСо12, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в прикладі 2 УМО 01/14424), миші НСо17 мають трансген НСо17, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в прикладі 2 М/О 01/09187), а миші НСо20 мають трансген НСо20, що кодує людський важкий ланцюг. Отримані в результаті миші експресують трансгени, що кодують важкий і легкий каппа-ланцюги імуноглобуліну людини в генетичному оточенні, гомозиготному стосовно руйнування ендогенних локусів мишачого важкого ланцюга і легкого каппа-ланцюга.
У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в Спеп еї а!І., ЕМВО .). 12, 811-820 (1993), і ендогенний ген мишачого важкого ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в прикладі 1 УМО 01/09187. Ця лінія мишей несе трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг, як описано в Різпм/йа еї аї., Майшге ВіотесппоЇіоду 14, 845-851 (1996). Ця лінія мишей також несе трансхромосому, що кодує людський важкий ланцюг, що складається з фрагмента пСЕ (5020) хромосоми 14, як описано в УМО 02/43478. Мишей НСо12-Ваїр/с, НСо17-Ваїр/с і НСог20-Ва!р/с можна отримати шляхом схрещування НСо12, НСо17 і НСо20 з КСо5мЮ/ку(Ваї!р), як описано в
МО 09/097006.
У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в Спеп еї аї., ЕМВО .). 12, 811-820 (1993), і ендогенний ген мишачого важкого ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню, як описано в прикладі 1 УМО 01/09187. Ця лінія мишей несе трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг, як описано в Різпм/їа еї аї., Майшге ВіотесппоЇіоду 14, 845-851 (1996). Ця лінія мишей також несе трансхромосому людського важкого ланцюга, що складається з антигензв'язувального фрагмента ПСЕ (5020) хромосоми 14, як описано в УМО 02/43478.
Спленоцити від цих трансгенних мишей можна застосовувати для отримання гібридом, які секретують моноклональні антитіла людини, відповідно до добре відомих методик.
Моноклональні або поліклональні антитіла людини за цим винаходом або антитіла за цим винаходом, що походять від інших видів, також можна отримувати трансгенним шляхом за допомогою отримання іншого ссавця, відмінного від людини, або рослини, що є трансгенними стосовно послідовностей важких і легких ланцюгів імуноглобуліну, що представляють інтерес, і отримання з нього антитіла у добувній формі. Що стосується отримання антитіл у ссавців трансгенним шляхом, антитіла можуть бути отримані в молоці кіз, корів або інших ссавців і добуті з нього. Див., наприклад, 05 5827690, 005 5756687, 05 5750172 і 05 5741957.
Антитіло за цим винаходом може відноситися до будь-якого ізотипу. Вибір ізотипу зазвичай визначатиметься бажаними ефекторними функціями, такими як індукція АОСС. Ілюстративними ізотипами є ІДС1, Ідс2, ІдоЗ і Іде4. Можна використовувати константні домени будь-якого з людських легких ланцюгів каппа- або лямбда-типу. За необхідності, клас антитіла до сортиліну за цим винаходом можна перемкнути за допомогою відомих способів. Наприклад, антитіло за цим винаходом, яке спочатку було ІДМ, можна піддати перемиканню класу на антитіло Ідс за цим винаходом. Додатково, методики перемикання класу можна застосовувати для перетворення до одного підкласу на іншій, наприклад з ІдсІ на Ідос2. Таким чином, ефекторну функцію антитіл за цим винаходом можна змінити шляхом перемикання ізотипу, наприклад, на антитіло Ідс1, Ідс2, ІдсеЗ, Ідс4, дО, ДА, (ДЕ або ІМ для різних терапевтичних шляхів застосування. У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є антитілом Ідс1, наприклад, Ідс1 к-ізотипу. Вважають, що антитіло відноситься до конкретного ізотипу, якщо його амінокислотна послідовність найбільш гомологічна такому ізотипу в порівнянні з іншими ізотипами.
У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом являє собою повнорозмірне антитіло, переважно антитіло до, зокрема антитіло Ідс1 к-ізотипу. У іншому варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є антигензв'язувальним фрагментом антитіла або одноланцюговим антитілом.
Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти можна отримувати, наприклад, шляхом фрагментації на антигензв'язувальні фрагменти із застосуванням традиційних методик, а антигензв'язувальні фрагменти піддавати скринінгу стосовно корисності таким же чином, як описано в даному описі винаходу для повних антитіл. Наприклад, антигензв'язувальні Е(аб)2- фрагменти можна отримувати шляхом обробки антитіла пепсином. Отриманий в результаті бо антигензв'язувальний Е(аб)2-фрагмент можна обробити для відновлення дисульфідних містків з отриманням антигензв'язувальних Рар'-фрагментів. Антигензв'язувальні ЕРаб-фрагменти можна отримувати шляхом обробки антитіла Ід папаїном; антигензв'язувальні РГар'-фрагменти можна отримувати шляхом розщеплювання антитіла ДС пепсином. Антигензв'язувальний
Кар)-фрагмент також можна отримувати шляхом зв'язування описаного нижче Рар' за допомогою тіоетерного зв'язку або дисульфідного зв'язку. Антигензв'язувальний Рар'-фрагмент являє собою антигензв'язувальний фрагмент антитіла, отриманий шляхом розрізання дисульфідного зв'язку в шарнірному домені К(аб')». Антигензв'язувальний Бар'-ррагмент можна отримувати шляхом обробки антигензв'язувального Е(ар')»--фрагмента відновником, таким як дитіотреїтол. Антигензв'язувальний фрагмент антитіла також можна отримати шляхом експресії нуклеїнових кислот, що кодують такі антигензв'язувальні фрагменти, в рекомбінантних клітинах (див., наприклад, Емапз еї аї.,.). Іттипої. Мей. 184, 123-38 (1995)). Наприклад, химерний ген, що кодує частину антигензв'язувального Е(ар)2-фрагмента, може включати послідовності ДНК, що кодують СНІ1-домен і шарнірний домен Н-ланцюга, за якими розташований стоп-кодон для зупинки трансляції з отриманням такої усіченої молекули антигензв'язувального фрагмента антитіла.
У одному варіанті здійснення антитіло до сортиліну є одновалентним антитілом, переважно одновалентним антитілом, як описано в УМО2007059782 (яка включена в даний опис шляхом посилання у її повному обсязі), що має делецію в шарнірній ділянці. Відповідно, в одному варіанті здійснення антитіло являє собою одновалентне антитіло, де вказане антитіло до сортиліну сконструйоване за допомогою способу, що включає ї) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, при цьому вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує Мі-ділянку вибраного антигенспецифічного антитіла до сортиліну, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну
СіІ-ділянку Ід, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує Мі-ділянку вибраного антигенспецифічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку Ід, функціонально зв'язані одна з одною, і де у випадку з підтипом Іде1 нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку, була модифікована так, щоб Сі -ділянка не містила будь-яких амінокислот, здатних утворювати дисульфідні зв'язки або ковалентні зв'язки з іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність Сі -ділянки, у присутності поліклонального ЇД людини
Зо або при введенні тварині або людині; ії) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, при цьому вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антигенспецифічного антитіла, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну СН-ділянку ІД людини, де нуклеотидна послідовність, що кодує СН-ділянку, була модифікована так, щоб ділянка, що відповідає шарнірній ділянці, і, як того вимагає підтип Ід, іншим ділянкам СН-ділянки, таким як СНЗ- ділянка, не містила будь-яких амінокислотних залишків, що беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків або ковалентних або стабільних нековалентних зв'язків між важкими ланцюгами з іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність СН-ділянки
Ід людини, у присутності поліклонального (ІД людини або при введенні тварині людині, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антиген-специфічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує СН-ділянку вказаного Ід, функціонально зв'язані одна з одною; ії) забезпечення клітинною системою експресії для отримання вказаного одновалентного антитіла; ім) отримання вказаного одновалентного антитіла шляхом сумісної експресії конструктів нуклеїнових кислот за (і) і (ії) в клітинах клітинної системи експресії за (іїї).
Так само, в одному варіанті здійснення антитіло до сортиліну за цим винаходом являє собою одновалентне антитіло, яке містить () варіабельний домен антитіла за цим винаходом, описаний в даному описі, або антигензв'язувальну частину вказаного домену, і (ї) СН-домен імуноглобуліну або його домен, що містить СН2- і СНЗ-домени, де СН-домен або його домен був модифікований так, щоб домен, відповідний шарнірному домену і, якщо імуноглобулін не відноситься до підтипу Їд4, іншим доменам СН-домену, таким як СНЗ-домен, не містив будь-яких амінокислотних залишків, здатних утворювати дисульфідні зв'язки з ідентичним СН-доменом або інші ковалентні або стабільні нековалентні зв'язки між важкими ланцюгами з ідентичним СН-доменом у присутності поліклонального ДО людини.
У додатковому варіанті здійснення важкий ланцюг одновалентного антитіла був модифікований так, щоб вся шарнірна ділянка була піддана делеції.
У іншому додатковому варіанті здійснення послідовність одновалентного антитіла була модифікована так, щоб вона не містила будь-яких акцепторних сайтів М-зв'язаного глікозилування. 60 Цей винахід також включає "біспецифічні антитіла", де ділянка зв'язування антитіла з сортиліном (наприклад, ділянка зв'язування з сортиліном моноклонального антитіла до сортиліну) є частиною двовалентного або полівалентного біспецифічного остову, націленого більш ніж на один епітоп (наприклад, другий епітоп може включати епітоп рецептора, що бере участь в активному транспорті, так що біспецифічне антитіло проявлятиме покращений трансцитоз через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр). Таким чином, в іншому додатковому варіанті здійснення одновалентний ЕРар антитіла до сортиліну може бути з'єднаний з додатковим Бар або б5сїм, які націлюються на інший білок, з отриманням біспецифічного антитіла. Біспецифічне антитіло може мати подвійну функцію, наприклад терапевтичну функцію, що додається доменом, що зв'язується з сортиліном, і транспортну функцію, завдяки якій воно може зв'язуватися з молекулою рецептора для посилення перенесення через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр.
Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом також включають одноланцюгові антитіла. Одноланцюговими антитілами є пептиди, в яких Еу-домени важкого і легкого ланцюгів з'єднані один з одним. У одному варіанті здійснення цей винахід передбачає одноланцюговий Ем (50Ем), де важкий і легкий ланцюги в Ем антитіла до сортиліну за цим винаходом з'єднані за допомогою гнучкого пептидного лінкера (зазвичай завдовжки приблизно у 10, 12, 15 або більше амінокислотних залишків) в один пептидний ланцюг. Способи отримання таких антитіл описані, наприклад, в 5 4946778, РійсКІпип в Те Ріпаппасоїоду ої Мопосіопаї!
Апііродіе5, том 113, під редакцією Козепригд і Мооге, Зргіпдег-Мепіад, Мем МогїКк, стор. 269-315 (1994), Віка еї аї., Зсієпсе 242, 423-426 (1988), Нивіоп єї аі., РМАБ ОБА 85, 5879-5883 (1988) і
МесСанепу ех а)., Маїште 348, 552-554 (1990). Одноланцюгове антитіло може бути одновалентним, якщо використовується тільки один МН і Мі, двовалентним, якщо використовуються два МН і МІ, або полівалентним, якщо використовується більше двох МН і МІ...
Описані в даному описі винаходу антитіла до сортиліну і їх антигензв'язувальні фрагменти можна модифікувати шляхом включення будь-якої відповідної кількості модифікованих амінокислот і/або асоціацій з такими кон'югованими замісниками. Придатність в даному контексті загалом визначається здатністю щонайменше в значній мірі зберігати селективність щодо сортиліну і/або специфічність щодо сортиліну, властиву недериватизованому початковому антитілу до сортиліну. Включення однієї або декількох модифікованих амінокислот
Зо може бути переважним, наприклад, для збільшення періоду напівжиття поліпептиду в сироватці крові, зменшення антигенності поліпептиду або підвищення стабільності поліпептиду при зберіганні. Амінокислота(и) піддається(ються) модифікації, наприклад, котрансляційно або посттрансляційно в ході отримання рекомбінантним шляхом (наприклад, М-зв'язане глікозилування в мотивах М-Х-5// в ході експресії в клітинах ссавців), або піддається модифікації за допомогою синтетичних способів. Необмежуючі приклади модифікованої амінокислоти включають глікозиловану амінокислоту, сульфатовану амінокислоту, преніловану (наприклад, фарнезиловану, геранілгераніловану) амінокислоту, ацетиловану амінокислоту, ациловану амінокислоту, ПЕГіловану амінокислоту, біотиніловану амінокислоту, карбоксиловану амінокислоту, фосфориловану амінокислоту і т. д. У літературі представлено безліч джерел, які можуть бути керівництвом для фахівця з модифікації амінокислот. Приклади протоколів знаходяться в УмаїКег (1998) Ргоївіп Ргоїосої5 Оп СО-Нот, Нитапа Ргезз, Тома, МУ.
Модифіковану амінокислоту можна вибрати, наприклад, з гликозилованої амінокислоти,
ПЕГілованої амінокислоти, фарнезилованої амінокислоти, ацетилованої амінокислоти, біотинілованої амінокислоти, амінокислоти, кон'югованої з ліпідним фрагментом, або амінокислоти, кон'югованої з органічним дериватизуючим засобом.
Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом також можна модифікувати хімічним шляхом за допомогою ковалентного кон'югування з полімером, наприклад, для збільшення їх періоду напівжиття в кровотоку. Ілюстративні полімери і способи приєднання їх до пептидів наведені, наприклад, в 05 4766106, 005 4179337, 05 4495285 ії 05 4609546. Додаткові ілюстративні полімери включають поліоксіетиловані поліоли і полієтиленгліколь (РЕ) (наприклад, РЕС з молекулярною масою від приблизно 1000 до приблизно 40000, наприклад, від приблизно 2000 до приблизно 20000, наприклад, приблизно 3000-12000 г/моль).
Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна додатково застосовувати в способі діагностики або як діагностичний візуалізуючий ліганд.
Згідно з одним варіантом здійснення передбачаються антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом, що містять одну або декілька мічених радіоактивними ізотопами амінокислот. Мічене радіоактивним ізотопом антитіло до сортиліну можна застосовувати як в діагностичних, так і в терапевтичних цілях (ще однією можливою ознакою є кон'югування з міченими радіоактивним ізотопом молекулами). Необмежувальні приклади таких міток 60 включають без обмеження вісмут (2ЗВі), вуглець (10, 190, 1223, хром (Сг), кобальт (27Со, 900),
мідь (Си), диспрозій (55бу), ербій (99Ег), фтор (РЕ), гадоліній (159034, 159(54), галій (98Сха, 6/Са), германій (98(зе), золото (98Аи), гольмій (196Но), водень (ЗН), індій (171, 72Іп, 119|и, 115Іп), йод (1, 129|, 125), 191), іридій (192Іг), залізо (Ре), криптон ('"Кут), лантан (І а), лютецій (77 и), марганець (Мп), молібден (Мо), азот (ЗМ, М), кисень (720), паладій (ра), фосфор (ЗР), калій (2К), празеодим ("2Рі), прометій (9Рт), реній (85Ве, "89Ке), родій (952), рубідій (В, 82), рутеній (822Ви, Ки), самарій (53517), скандій (775с), селен (75е), натрій (Ма), стронцій (8551, 895, 9251), сірку (55), технецій (Тс), талій (21ТІ), олово (З5п, 71751), ксенон (З3Хе), ітербій (99Ур, 175Ур, 1774), ітрій (294) і цинк (952п). Способи отримання амінокислот, мічених радіоактивними ізотопами, і відповідних похідних пептидів відомі з рівня техніки (див., наприклад, ЧУипупапь еї аІ., у Сапсег Спетоїпегару апа Віоїштегару 655-686 (2-е видання, під редакцією СВПаїпег і Гоподо,
Прріпсоїї Камеп (1996)) і 5 4681581; 05 4735210; 005 5101827; 005 5102990 (05 ВЕЗ35500), О05 5648471 і ШШ5 5697902. Наприклад, радіоактивний ізотоп можна кон'югувати за допомогою способу із застосуванням хлораміну Т (І іпдедгеп, 5. еї аї. (1998) "Спіогатіпе-Т Іп Нідн-5ресіїіс-
Асіїмпу Вадіоіодіпайоп ОЇ Апіїбодієє Овіпуд М-Зиссіпітіау!-3-(Тіітеїйну!втаппу!) Вепгоаіїе А5 Ап
Іпіептеаіаїе", Мисі. Мед. Віої. 25(7):659-665; Кипи, М. еї а!. (1993) "Зйе-Зресіїїс Сопіндайоп ОТА
Вадіоіїодіпатєд РіПепеїйпуїатіпе Оегімайме То А Мопосіопа! Апіїбоду Незий5 по Іпстеазей
Вадіоасіїмйу І осаїїгайоп Іп Титог", У. Мед. Спет. 36(9):1255-1261; Веєа, О.МУ. єї а!. (1990) "5йе- зресіїісаПу гадіоіодіпаїєд апіїроду ог Тагдеїїпуд шШтотгв", Сапсег Нев. 50(3 З,иррі):8575-8615).
Цей винахід також передбачає антитіла до сортиліну і їх антигензв'язувальні фрагменти, мічені за допомогою детектовної флуоресцентної мітки (такої як хелат рідкоземельного елементу (наприклад, хелат європію)), мітки флуоресцеїнового типу (наприклад, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, 5-карбоксифлуоресцеїн, б-карбоксифлуоресцеїн, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн), мітки родамінового типу (наприклад, АГЕХА Р ШООКФО 568 (Іпмігодеп), ТАМКАФ або данзилхлорид), МІМОТАС 680 ХІІ РГООКОСНЕКОМЕ" (Регкіп ЕЇІптег), фікоеритрину; умбеліферону, лісаміну; ціаніну; фікоеритрину, техаського червоного, ВОБІРУ
ЕІ -5ЕФ (Іпмігодеп) або його аналога, всі з яких підходять для оптичного виявлення. Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу, люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна здійснити шляхом зв'язування діагностичної молекули цього винаходу з придатними до виявлення речовинами, включаючи, без обмеження,
Зо різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або з комплексами з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин.
Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу, люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна здійснити шляхом зв'язування діагностичної молекули цього винаходу з придатними до виявлення речовинами, включаючи, без обмеження, різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або з комплексами з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин. Також можна використовувати парамагнітні мітки, і їх переважно виявляють за допомогою позитронно- емісійної томографії (РЕТ) або однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (ЗРЕСТ). Такі парамагнітні мітки включають, без обмеження, сполуки, що містять парамагнітні іони алюмінію (АЇ), барію (Ва), кальцію (Са), церію (Се), диспрозію (Су), ербію (Ег), європію (Би), гадолінію (са), гольмію (Но), іридію (Іг), літію (Ії), магнію (Мо), марганцю (Мп), молібдену (М), неодиму (Ма), осмію (05), кисню (0), паладію (Ра), платини (РО), родію (КП), рутенію (Ки), самарію (Зт), натрію (Ма), стронцію (Зг), тербію (ТБ), тулію (Тт), олова (Зп), титану (Ті), вольфраму (М/) і цирконію (2), ії, зокрема, Со, СА, Сі, бите, Ре, Рез, (баз, Мп-3, Мі, Тіз, Ме і Ми, позитронно-активні метали з використанням різних видів позитронно-емісійної томографії і нерадіоактивних парамагнітних іонів металів.
Таким чином, згідно з одним варіантом здійснення антитіло до сортиліну або його фрагмент, що зв'язується з сортиліном, за цим винаходом можуть бути мічені флуоресцентною міткою, хемілюмінесцентною міткою, парамагнітною міткою, радіоїзотопною міткою або ферментною міткою. Мічене антитіло його фрагмент можна застосовувати для виявлення наявності або вимірювання кількості вказаного сортиліну в головному мозку суб'єкта. Цей спосіб може включати виявлення або вимірювання кількості антитіла до сортиліну або фрагмента, зв'язаного з вказаним сортиліном, за допомогою візуалізації іп мімо і може включати візуалізацію ех мімо вказаного антитіла до сортиліну або фрагмента, зв'язаного з вказаним сортиліном.
Згідно з додатковим аспектом цей винахід відноситься до вектора експресії, що кодує одну або декілька поліпептидних ланцюгів антитіла за цим винаходом або його антигензв'язувального домену. Такі вектори експресії можна застосовувати для отримання бо антитіл і антигензв'язувальних фрагментів за цим винаходом рекомбінантним шляхом.
Вектор експресії в контексті цього винаходу може являти собою будь-який відповідний ДНК- або РНК-вектор, включаючи хромосомні, нехромосомні вектори і вектори на основі синтетичної нуклеїнової кислоти (послідовність нуклеїнової кислоти, що містить відповідний набір елементів контролю експресії). Приклади таких векторів включають похідні 5М40, бактеріальні плазміди, фагову ДНК, бакуловірус, дріжджові плазміди, вектори, отримані в результаті об'єднання плазмід і фагової ДНК, і вектори на основі вірусної нуклеїнової кислоти (РНК або ДНК). У одному варіанті здійснення нуклеїнова кислота, що кодує антитіло до сортиліну, міститься у векторі на основі "голої" ДНК або РНК, що включає, наприклад, лінійний елемент експресії (описаний, наприклад, в ЗуКез5 апа допп5іоп, Маї Віоїесп 12, 355-59 (1997)), векторі на основі щільно укладеної нуклеїнової кислоти (описаний, наприклад, в 5 6077835 і/або УМО 00/70087), плазмідному векторі, такому як рВК322, рис 19/18 або рос 118/119, векторі мінімального розміру "тідде" на основі нуклеїнової кислоти (описаний, наприклад, в 5спакомузкі еї аї., Мої
ТНег 3, 793-800 (2001)), або представлена у вигляді векторного конструкту, що осаджується, на основі нуклеїнової кислоти, такого як конструкт, що осаджується СаРох (описана, наприклад, в
МО 00/46147, Вепмепівіу апа Везпеї, РМАБ ОБА 83, 9551-55 (1986), М/ідіег єї а!., Сеї! 14, 725 (1978), ії Согаго апа Реагхоп, Зотаїйіс Се! Сепеїісз 2, 603 (1981)). Такі вектори на основі нуклеїнових кислот і їх застосування добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, 5 5589466 і 55973972).
У одному варіанті здійснення вектор придатний для експресії антитіл до сортиліну або їх антигензв'язувальних фрагментів за цим винаходом в бактеріальній клітині. Приклади таких векторів включають вектори експресії, такі як Вісезсгірі (Зігаїадепе), вектори ріМ (Мап НеекКе 8 зЗеспизвіег, У Віої Снет 264, 5503-5509 (1989), вектори рЕТ (Момадеп, Мадісон, Вісконсін) і т. п.).
Вектор експресії може також, або як альтернатива, бути вектором, відповідним для експресії в дріжджовій системі. Можна використовувати будь-який вектор, відповідний для експресії в дріжджовій системі. Відповідні вектори включають, наприклад, вектори, що містять конститутивні або індуковані промотори, такі як промотор гена фактора альфа, алкогольоксидази і РОН (огляд яких наданий в Сигепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесціаг Віоіоду, під редакцією Е. А!зибеї еї аї., сгеепе Рибіїхєпіпд апа Уміеу ІпіТегосіепсе Мем ХогкК (1987), Сгапі еї аї.,
Меїнодз іп Епгутої 153, 516-544 (1987), Манапоміси, 0. еї аіІ. Меїтйоа5 Мої. Вісі. 824, 329-358
Зо (2012), СеїїкК, Е. еї аї. Віоїесппої. Адм. 30(5), 1108-1118 (2012), Ії, Р. еї аї. Аррі. Віоспет.
Віоїесппої. 142(2), 105-124 (2007), Воег, Е. єї а. Аррі. Містобіої!. Віотеснпої. 77(3), 513-523 (2007), мап дег Мааїй, 9У.М. Меїподз Мої. Віої. 178, 359-366 (2002), і Ноїдег, Р. МеїШйодз Мої. Віої. 178, 349-357 (2002)).
У векторі експресії за цим винаходом нуклеїнові кислоти, що кодують антитіло до сортиліну, можуть містити будь-який відповідний промотор, енхансер і інші елементи, що сприяють експресії, або бути пов'язаними з ними. Приклади таких елементів включають сильні промотори експресії (наприклад, ІЕ промотор/(енхансер СММ людини, а також ГТК промотори КМ, 5М40,
ЗІ 3-3, ММТМУ ії НІМ), ефективні полі-(А)-послідовності термінації, точку початку реплікації для продукту плазміди в Е. сої, ген стійкості до антибіотика як селектовний маркер і/або відповідний сайт клонування (наприклад, полілінкер). Нуклеїнові кислоти також можуть містити індукований промотор, а не конститутивний промотор, такий як ІЕ СММ (фахівець в даній галузі техніки зрозуміє, що такі терміни фактично описують ступінь експресії гена в певних умовах).
Згідно з ще одним додатковим аспектом цей винахід відноситься до рекомбінантної еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, такої як трансфектома, яка продукує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом, визначені в даному описі винаходу, або біспецифічну молекулу за цим винаходом, визначену в даному описі винаходу. Приклади клітин-хазяїнів включають клітини дріжджів, бактерій і ссавців, такі як клітини СНО або НЕК.
Наприклад, в одному варіанті здійснення цей винахід передбачає клітину, яка містить нуклеїнову кислоту, стабільно інтегровану в клітинний геном, що містить послідовність, що кодує антитіло до сортиліну за цим винаходом або його антигензв'язувальний фрагмент, які експресуються. У іншому варіанті здійснення цей винахід передбачає клітину, яка містить неінтегровану нуклеїнову кислоту, таку як плазміда, косміда, фагміда або лінійний елемент експресії що містить послідовність, що кодує антитіло до сортиліну або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом, які експресуються.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до способу отримання антитіла до сортиліну за цим винаходом, при цьому вказаний спосіб включає стадії: а) культивування гібридоми або клітини-хазяїна за цим винаходом, описаних в даному описі вище, і Б) очищення антитіла за цим винаходом від культурального середовища.
У одному варіанті здійснення цей винахід відноситься до препарату в тому сенсі, в якому бо цей термін використовується в даному описі винаходу, який містить антитіло до сортиліну,
визначене в даному описі, і який практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах, які або не здатні зв'язуватися з сортиліном, або істотним чином не змінюють антисортилінові функціональні характеристики препарату. Таким чином, такий препарат не охоплює сироватку крові, що утворюється в природних умовах, або очищений похідний продукт такої сироватки крові, що містить суміш антитіла до сортиліну і іншого антитіла, яке не змінює функціональні характеристики антитіла до сортиліну в препараті, де такі функціональні характеристики являють собою: (і) афінність зв'язування (Ко) з сортиліном; (і) здатність знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном; (ії) здатність знижувати і/або пригнічувати виведення РОКМ клітинами, що експресують сортилін; (ім) здатність знижувати і/або пригнічувати ендоцитоз РОКМ клітинами, що експресують сортилін; (м) здатність підвищувати кількість і/або концентрацію РОКМ в плазмі крові у мишей з нокіном, за рахунок якого у них експресується сортилін людини; здатність підвищувати кількість і/або концентрацію РОЕМ в головному мозку і/або (м) здатність забезпечувати лікування лобно-скроневої деменції (ЕТО) і/або бічного аміотрофічного склерозу (АГ 5) при його тривалому введенні.
Цей винахід, зокрема, відноситься до препаратів такого антитіла до сортиліну, що має структурну зміну в своїй амінокислотній послідовності (у будь-яких своїх СОК, варіабельних доменах, залишках каркасної ділянки і/або константних доменах) в порівнянні із структурою антитіла до сортиліну, що зустрічається в природі, де вказана структурна зміна обумовлює прояв антитілом до сортиліну значно змінених функціональних характеристик (тобто більш ніж з 2095 різницею, більш ніж з 40 95 різницею, більш ніж з 60 95 різницею, більш ніж з 80 95 різницею, більш ніж з 100 95 різницею, більш ніж з 150 95 різницею, більш ніж з 2-кратною різницею, більш ніж з 4-кратною різницею, більш ніж з 5-кратною різницею або більш ніж з 10- кратною різницею у функціональних характеристиках) в порівнянні з функціональними характеристиками, що проявляються вказаним антитілом до сортиліну, що зустрічається в природі; де вказані функціональні характеристики являють собою:
Зо (і) афінність зв'язування (Ко) з сортиліном; (і) здатність знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном; (ії) здатність знижувати і/або пригнічувати виведення РОКМ клітинами, що експресують сортилін; (ім) здатність знижувати і/або пригнічувати ендоцитоз РОКМ клітинами, що експресують сортилін; (м) здатність підвищувати кількість і/або концентрацію РОМКМ в плазмі крові у мишей з нокіном, за рахунок якого у них експресується сортилін людини; (мії) здатність підвищувати кількість і/або концентрацію РОЕМ в головному мозку і/або (м) здатність забезпечувати лікування лобно-скроневої деменції (ЕТО), бічного аміотрофічного склерозу (АЇ 5) і/або хвороби Альцгеймера (АБ) при його тривалому введенні особливо в тих випадках, де такі змінені функціональні характеристики є результатом структурної зміни і, отже, невіддільні від неї.
Термін "практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах" відноситься до повної відсутності таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в таких препаратах або до включення таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в такі препарати в концентрації, в якій вони істотним чином не впливають на властивості зв'язування з сортиліном даних препаратів. Говорять, що антитіло є "виділеним", якщо воно не має еквівалента, що утворюється в природних умовах, або було відокремлене або очищене від компонентів, які в природних умовах супроводжують його.
Термін "антитіла, що утворюються в природних умовах", використовуваний щодо таких препаратів, відноситься до антитіл (включаючи аутоантитіла, що утворюються в природних умовах), утворення яких викликається в організмі людей або інших тварин як природний наслідок функціонування їх імунних систем.
Таким чином, препарати за цим винаходом не виключають, а насправді явним чином охоплюють такі препарати, які містять антитіло до сортиліну і спеціально додане додаткове антитіло, здатне зв'язуватися з епітопом, що не міститься в сортиліні. Такі препарати, зокрема, включають варіанти їх здійснення, де даний препарат проявляє підвищену ефективність при лікуванні лобно-скроневої деменції (ЕТО) і/або бічного аміотрофічного склерозу (АГ 5).
Антитіла їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна отримати в різних 60 лініях клітин, таких як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, і клітинна лінія комахи, наприклад клітинна лінія СНО, клітинна лінія НЕК, клітинна лінія ВНК-21, клітинна лінія миші (така як клітинна лінія мієломи), клітинна лінія фібросаркоми, клітинна лінія
РЕК.Сб, клітинна лінія НКВ-11, клітинна лінія САР і клітинна лінія НинН-7 людини (Юитогпі еї аї, 2015, Стії Вем ВіоїеєсНнпої. Зер 18:1-13, зміст якої включено в даний опис шляхом посилання).
У ще одному додатковому аспекті цей винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить (ї) антитіло до сортиліну або його антигензв'язувальний фрагмент, обидва з яких визначені в даному описі винаходу, або препарат, в тому сенсі, в якому цей термін визначений в даному описі винаходу, який містить таке антитіло до сортиліну або його антигензв'язувальний фрагмент; і (ії) фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтичні композиції можна складати з фармацевтично прийнятними носіями або розріджувачами, а також з будь-якими іншими відомими допоміжними засобами і наповнювачами згідно з традиційними методиками, такими як розкриті в Ветіпаїоп: Те бЗсіепсе апа Ргасіїсе ої Рнаптасу, 22па Еайіоп, Сеппаго, Ед., Маск Рибіївпіпу Со., Еавіоп, РА, 2013.
Фармацевтично прийнятні носії або розріджувачі, а також будь-які інші відомі допоміжні засоби і наповнювачі мають бути придатними для вибраної сполуки за цим винаходом і вибраного способу введення. Придатність носіїв і інших компонентів фармацевтичних композицій визначають на підставі відсутності значного негативного впливу на бажані біологічні властивості вибраної сполуки або фармацевтичної композиції за цим винаходом (наприклад, менш ніж істотного впливу (1095 або меншого відносного інгібування, 595 або меншого відносного інгібування і т. п.) на зв'язування з епітопом).
Фармацевтична композиція за цим винаходом також може містити розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіонний детергент, такий як Тиееп-20 або
Тмжееп-80), стабілізатори (наприклад, цукри або вільні протеїногенні амінокислоти), консерванти, фіксатори тканин, солюбілізатори і/або інші матеріали, відповідні для включення у фармацевтичну композицію. Розріджувач вибирають так, щоб він не впливав на біологічну активність комбінації. Прикладами таких розріджувачів є дистильована вода, фізіологічний фосфатно-сольовий буферний розчин, розчини Рінгера, розчин декстрози і розчин Хенка. Крім
Зо того, фармацевтична композиція або склад також можуть містити інші носії або нетоксичні нетерапевтичні неімуногенні стабілізатори і т. п. Композиції також можуть містити великі макромолекули, що поволі метаболізуються, такі як білки, полісахариди, такі як хітозан, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти і сополімери (наприклад, функціоналізована латексом сефароза, агароза, целюлоза і т. п.), полімери амінокислот, сополімери амінокислот і ліпідні агрегати (наприклад, масляні краплі або ліпосоми).
Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях за цим винаходом можна змінювати так, щоб отримати кількість активного інгредієнта, ефективну для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції і способу введення.
Вибраний рівень дози залежатиме від ряду фармакокінетичних чинників, зокрема активності конкретних використовуваних композицій за цим винаходом або їх аміду, шляху введення, часу введення, швидкості виведення конкретної використовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, вживаних в комбінації з конкретними використовуваними композиціями, віку, статі, ваги, стану, загального стану здоров'я і анамнезу пацієнта, що піддається лікуванню, а також аналогічних чинників, добре відомих в галузі медицини.
Фармацевтичну композицію можна вводити будь-яким відповідним шляхом і способом, зокрема парентеральним, місцевим, пероральним або інтраназальним шляхом, для профілактичного і/або терапевтичного лікування. У одному варіанті здійснення фармацевтичну композицію за цим винаходом вводять парентерально. Використовувані в даному описі винаходу фрази "парентеральне введення" і "що вводиться парентерально", означають способи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і включають епідермальну, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньокапсулярну, внутрішньоочноямкову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньочеревну, внутрішньосухожильну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуставну, підкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, внутрічерепну, інтраторакальну, епідуральну і внутрішньогрудинну ін'єкцію і інфузію. Додаткові відповідні шляхи введення сполуки за цим винаходом іп мімо і іп міго добре відомі з рівня техніки і можуть бути вибрані звичайними фахівцями в даній галузі техніки. Згідно з одним варіантом здійснення цю фармацевтичну композицію вводять за допомогою внутрішньовенної або підшкірної ін'єкції 60 або інфузії.
Фармацевтично прийнятні носії включають всілякі відповідні розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, засоби, що надають ізотонічність, антиоксиданти і засоби, що уповільнюють абсорбцію, і т. п., які Є фізіологічно сумісними із сполуками за цим винаходом.
Приклади відповідних водних і неводних носіїв, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях за цим винаходом, включають воду, сольовий розчин, фосфатно- сольовий буферний розчин, етанол, декстрозу, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.), а також їх придатні суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, кукурудзяна олія, арахісова олія, бавовняна олія і кунжутна олія, колоїдні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат, і/або різні буфери. Інші носії добре відомі в галузі фармацевтики.
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального отримання стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій.
Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли будь-яке традиційне середовище або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях цього винаходу.
Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування матеріалів для покриття, таких як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і шляхом застосування поверхнево-активних речовин.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад, (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію і т. п.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутилований гідроксіанізол (ВНА), бутилований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і т. п.; і (3) металохелатори, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т. п.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити засоби, що забезпечують ізотонічність, такі як цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, гліцерин, або хлорид
Зо натрію, в композиціях.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити одну або декілька допоміжних речовин, відповідних для вибраного шляху введення, такі як консерванти, зволожувальні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини, консерванти або буфери, які можуть збільшити термін зберігання або ефективність фармацевтичної композиції. Сполуки за цим винаходом можна отримувати з носіями, які захищатимуть сполуки від швидкого вивільнення, наприклад, у вигляді складу з контрольованим вивільненням, в тому числі у вигляді імплантатів, трансдермальних пластирів і мікроїнкапсульованих систем доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, полімери, які руйнуються біологічно, біосумісні полімери, такі як сополімер етилену і вінілацетату, поліангідриди, полігліколеву кислоту, колаген, поліортоестери і полімолочну кислоту, окремо або разом з воском, або інші матеріали, добре відомі з рівня техніки. Способи отримання таких складів в цілому відомі фахівцям в даній галузі техніки. Див., наприклад, Зивіаіїпей апа
Сопігоїїєй ВеІєазе Ога Овєїїмегу Зувієтв, .). В. Вобіпзоп, єд., Магсеї! Оеккег, Іпс., Мем МоїКк, 1978.
У одному варіанті здійснення сполуки за цим винаходом можна складати для забезпечення належного розподілу іп мімо. Фармацевтично прийнятні носії для парентерального введення включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли які-небудь традиційні середовища або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях цього винаходу. У композиції також можуть бути включені додаткові активні сполуки.
Фармацевтичні композиції для ін'єкцій як правило мають бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і зберігання. Композиція може бути складена у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, відповідної для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути водним або неводним розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.) і відповідні їх суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування покриття, такого як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру бо частинок у разі дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин. В багатьох випадках буде переважним включення засобів, що забезпечують ізотонічність, наприклад цукрів, багатоатомних спиртів, таких як гліцерин, маніт, сорбіт, або хлориду натрію в композицію. Тривалого всмоктування ін'єкційних композицій можна досягти шляхом включення в композицію засобу, що уповільнює всмоктування антитіла, наприклад моностеаратних солей і желатину. Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, наприклад, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією.
Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти, наприклад, з перелічених вище. У разі стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів отримання порошків є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті якої отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з їх розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією. Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти з перелічених вище. У разі стерильних порошків для отримання стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів приготування є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті якої отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з їх розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Схеми прийому у вищезгаданих способах лікування і застосуваннях, описаних в даному описі винаходу, коректують для отримання оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити одноразову болюсну дозу, можна вводити декілька розділених доз протягом деякого часу, або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, як визначається потребами терапевтичної ситуації. Композиції для парентерального введення можна складати у вигляді одиничної лікарської форми для простоти введення і рівномірності дозування. Одинична лікарська форма, використовувана в даному описі винаходу, відноситься до фізично дискретних одиниць, зручних як одиничні дози для суб'єктів, що підлягають лікуванню; при цьому кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активної сполуки, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту, спільно з необхідним фармацевтичним носієм. Технічні вимоги до одиничних лікарських форм цього винаходу продиктовані (а) унікальними характеристиками активної сполуки і конкретним терапевтичним ефектом, якого необхідно досягти, і (Б) обмеженнями, притаманними галузі складання такої активної сполуки для лікування чутливості у індивідуумів, і безпосередньо залежать від них.
Ефективні дози і схеми прийому для антитіл до сортиліну залежать від захворювання або стану, що підлягають лікуванню, і можуть бути визначені фахівцями в даній галузі техніки.
Ілюстративний необмежувальний діапазон для терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом становить приблизно 0,1-10 мг/кг ваги тіла, як, наприклад, приблизно 0,1-5 мг/кг ваги тіла, наприклад, приблизно 0,1-2 мг/кг ваги тіла, як, наприклад, приблизно 0,1-1 мг/кг ваги тіла, наприклад, приблизно 0,15, приблизно 0,2, приблизно 0,5, приблизно 1, приблизно 1,5 або приблизно 2 мг/кг ваги тіла.
Лікар або ветеринар із стандартною кваліфікацією в даній галузі легко може визначити і призначити ефективну кількість необхідної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може почати з доз антитіла до сортиліну, використовуваного у фармацевтичній композиції, нижчих рівнів, ніж потрібно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу до досягнення бажаного ефекту. В цілому, відповідною добовою дозою композиції за цим винаходом буде така кількість сполуки, яка є найнижчою дозою, ефективною для отримання терапевтичного ефекту. Така ефективна доза зазвичай залежатиме від описаних вище чинників. Введення може бути, наприклад, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньочеревним або підшкірним, і, наприклад, введення можна здійснювати в безпосередній близькості від сайта мішені. За бажанням, ефективну добову дозу фармацевтичної композиції можна вводити у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше частин дози, що вводяться окремо з відповідними інтервалами протягом доби, необов'язково у вигляді одиничних лікарських форм. Хоча сполуки цього винаходу можна вводити окремо, переважно вводити сполуки у вигляді фармацевтичної композиції, описаної вище. бо Мічені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна
Зо застосовувати в діагностичних цілях для виявлення, діагностики або моніторингу захворювань або порушень. Цей винахід передбачає виявлення або діагностику нейродегенеративного або когнітивного захворювання або порушення, включаючи, без обмеження, ЕТО, А 5 або протеїнопатій ТОР43, таких як хвороба Альцгеймера (АБ), що включають (а) проведення аналізу наявності піроглутамілованих АВ-фрагментів у клітинах або зразках тканин суб'єкта із застосуванням одного або декількох антитіл, що специфічно зв'язуються з сортиліном; і (Б) проведення порівняння рівня антигену з контрольним рівнем, наприклад, з рівнями в зразках нормальної тканини, при якому підвищення аналізованого рівня антигену в порівнянні з контрольним рівнем антигену свідчить про захворювання або порушення або свідчить про тяжкість захворювання або порушення.
Антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна застосовувати для аналізу рівня сортиліну або антигензв'язувальних фрагментів сортиліну в біологічному зразку за допомогою імуногістохімічних способів, добре відомих з рівня техніки. Інші способи з використанням антитіл, застосовні для виявлення білка, включають імунологічні аналізи, такі як твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5ЗА), радіоіїмунологічний аналіз (КІА), а також аналізи з використанням платформи Мезо ЗсаЇе Різсомегу (М5О). У таких наборах і способах можна застосовувати відповідні мітки для антитіл, і мітки, відомі з рівня техніки, включають ферментні мітки, такі як лужна фосфатаза і глюкозооксидаза; радіоізотопні мітки, такі як йод (251, 791), вуглець (77), сірка (355), тритій (ЗН), індій (п) і технецій (тп"Тс); а також люмінесцентні мітки, такі як люмінол і люцифераза; і флуоресцентні мітки, такі як рлуоресцеїн і родамін.
Наявність мічених антитіл до сортиліну або їх фрагментів, що зв'язуються з сортиліном, можна виявляти іп мімо в діагностичних цілях. Згідно з одним варіантом здійснення діагностика передбачає а) введення суб'єктові ефективної кількості такої міченої молекули; Б) очікування протягом деякого проміжку часу після введення для забезпечення концентрації міченої молекули в місцях відкладення АВ (за наявності таких) і для забезпечення очищення від незв'язаної міченої молекули до фонового рівня; с) визначення фонового рівня і 4) виявлення міченої молекули у суб'єкта, при цьому виявлення міченої молекули на рівні, що перевищує фоновий, свідчить про те, що суб'єкт має захворювання або порушення, або свідчить про
Зо тяжкість захворювання або порушення. Відповідно до такого варіанту здійснення молекулу мітять візуалізуючим фрагментом, відповідним для виявлення за допомогою конкретної системи візуалізації, відомої фахівцям в даній галузі техніки. Фонові рівні можна визначити за допомогою різних способів, відомих з рівня техніки, зокрема шляхом порівняння кількості виявленого міченого антитіла із стандартним значенням, заздалегідь визначеним для конкретної системи візуалізації. Способи і системи, які можна застосовувати в діагностичних способах цього винаходу, включають, без обмеження, комп'ютерну томографію (СТ), сканування всього тіла, таке як позитронно-емісійна томографія (РЕТ), магнітно-резонансна візуалізація (МК) і ультразвукове дослідження.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за цим винаходом для застосування в медицині.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за цим винаходом для застосування при лікуванні захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за цим винаходом при виготовленні лікарського препарату для лікування захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до способу попередження або лікування захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта, який включає введення ефективної дози антитіла за цим винаходом або його антигензв'язувального фрагмента.
Переважно, що в цих застосуваннях і способах за даними аспектами цього винаходу захворювання являють собою ЕТО; АЇ 5 або протеїнопатії ТОР43, як, наприклад, АЮ.
Переважно, в цих застосуваннях і способах за даними аспектами цього винаходу лікування є тривалим і переважно здійснюється щонайменше протягом 2 тижнів, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає набір, який містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за цим винаходом.
Таблиця 5
Послідовності антитіл
Ар БЕ зеа І Мо: 1 СОК'І легкого ланцюга 5Е1 зеа І Мо: 2 СОКЗ2 легкого ланцюга 5Е1 зеа І Мо: З СОЗ легкого ланцюга 5Е1 зеа ІО Мо: 4 СОКІ важкого ланцюга 5Е1 зеа І Мо: 5 СО2 важкого ланцюга 5Е1 зеа І Мо: (5) СОЕЗ важкого ланцюга 5Е1 зе ІО Мо: 7 МІ. 5Е1 зеа ІЮО Мо: 8 МН 5Е1
АрлЕг зеа І Мо: 9 СОН легкого ланцюга 1Е2 зеа І Мо: 10 СОКЗ2 легкого ланцюга 162 зеа І Мо: 11 СОВЗ легкого ланцюга 1Е2 зеа І Мо: 12 СОК'І важкого ланцюга 12 зеа І Мо: 13 СОКЗ2 важкого ланцюга 12 зеа І Мо: 14 СОКЗ важкого ланцюга 12 зе ІО Мо: 15 МІ/т1вг2 зеа ІЮО Мо: 16 МН 1Е2
Ар 068 зеа І Мо: 17 СОК'І легкого ланцюга 068 зеа І Мо: 18 СОКЗ2 легкого ланцюга 068 зеа І Мо: 19 СОКЗ легкого ланцюга 068 зеа І Мо: 20 СОК'І важкого ланцюга 068 зеа І Мо: 21 СОКЗ2 важкого ланцюга 068 зеа І Мо: 22 СОКЗ важкого ланцюга 068 зеа І Мо: 23 МІ 068 зеа ІЮО Мо: 24 ун 068
Ар 1320 зеа І Мо: 25 СОКТ легкого ланцюга 1320 зеа І Мо: 26 СОКа2 легкого ланцюга 1320 зеа І Мо: 27 СОКЗ легкого ланцюга 1320 зеа І Мо: 28 СОКІ важкого ланцюга 1320 зеа І Мо: 23 СОКЗО важкого ланцюга 1320 зеа І Мо: 30 СОЕЗ важкого ланцюга 1320 зе ІО Мо: 31 МІ. 1320 зеа ІЮО Мо: 32 МН 1320
Ар 93-05 зеа І Мо: З СОКТ легкого ланцюга 93-05 зе ІО Мо: 34 СОга2 легкого ланцюга 93-05 зеа І Мо: 35 СОКЗ легкого ланцюга 93-05 зе ІО Мо: 36 СОМ важкого ланцюга 93-05 зе ІО Мо: 37 СОК2 важкого ланцюга 93-05 зе ІО Мо: 38 СОКЗ важкого ланцюга 93-05 зе ІО Мо: 39 МІ. 93-05 зеа ІЮО Мо: 40 МН 93-05
Ар 93-01 зе ІО Мо: А СО легкого ланцюга 93-01 зе ІО Мо: 42 СОКа2 легкого ланцюга 93-01 зе ІО Мо: АЗ сСОмЗ легкого ланцюга 93-01 зе ІО Мо: 44 СОМ важкого ланцюга 93-01 зе ІО Мо: 45 СОК2 важкого ланцюга 93-01 зе ІО Мо: 46 СОКЗ важкого ланцюга 93-01 зе ІО Мо: 47 МІ. 93-01 зеа ІЮО Мо: 48 МН 93-01
Таблиця 5
Послідовності антитіл
Ар 924 зеа І Мо: 43 СОК'І легкого ланцюга 924 зеа І Мо: 50 СОг2 легкого ланцюга 924 зеа І Мо: 51 СОКЗ легкого ланцюга 924 зеа І Мо: 52 СОК'І важкого ланцюга 924 зеа І Мо: 53 СОР2 важкого ланцюга 924 зеа І Мо: 54 СОКЗ важкого ланцюга 924 зеа І Мо: 55 МІ 924 зеа ІЮО Мо: 56 ун 924
Ар 1276 зеа І Мо: 57 СОКТ легкого ланцюга 1276 зеа І Мо: 58 СОг2 легкого ланцюга 1276 зеа І Мо: 59 СОЗ легкого ланцюга 1276 зеа І Мо: бо СОМ важкого ланцюга 1276 зеа І Мо: 61 СОКЗО важкого ланцюга 1276 зеа І Мо: 62 СОКЗ важкого ланцюга 1276 зе ІО Мо: 63 МІ 1276 зеа ІЮО Мо: 64 МН 1276
АЬ 849 зеа І Мо: 65 СОН легкого ланцюга 849 зеа І Мо: 66 СОг2 легкого ланцюга 849 зеа І Мо: 67 СОКЗ легкого ланцюга 849 зеа І Мо: 68 СОМ важкого ланцюга 849 зеа І Мо: 69 СОР2 важкого ланцюга 849 зеа І Мо: 70 СОКЗ важкого ланцюга 849 зе ІО Мо: 71 МІ 849 зЗеа ІЮО Мо: 72 МН 849
Ар 5331-02 зеа І Мо: 73 СОКТ легкого ланцюга 531-02 зеа І Мо: 74 СОКаО легкого ланцюга 531-02 зеа І Мо: 75 СОКЗ легкого ланцюга 531-02 зеа І Мо: 76 СОКІ важкого ланцюга 531-02 зеа І Мо: 77 СОКЗО2 важкого ланцюга 531-02 зеа І Мо: 78 СОКЗ важкого ланцюга 531-02 зеа І Мо: 79 МІ. 531-02 зеа ІЮО Мо: 80 МН 531-02
Ар 548-01 зе ІО Мо: 81 СОН легкого ланцюга 548-01 зе ІО Мо: 82 СОКа2 легкого ланцюга 548-01 зе ІО Мо: 83 СОмЗ легкого ланцюга 548-01 зе ІО Мо: 84 СОМ важкого ланцюга 548-01 зе ІО Мо: 85 СОК2 важкого ланцюга 548-01 зе ІО Мо: 86 СОКЗ важкого ланцюга 548-01 зе ІО Мо: 87 МІ 548-01 зеа ІЮ Мо: 88 МН 548-01
Ар 548-02 зеа І Мо: 89 СОК легкого ланцюга 548-02 зеа І Мо: 90 СОКаО легкого ланцюга 548-02 зеа І Мо: 91 СОЕЗ легкого ланцюга 548-02 зеа І Мо: 92 СОКІ важкого ланцюга 548-02 зеа І Мо: 93 СОКЗО важкого ланцюга 548-02 зеа І Мо: 94 СОКЗ важкого ланцюга 548-002 зеа І Мо: 95 МІ 548-02 зеа ІЮО Мо: 96 ун 548-02
Таблиця 5
Послідовності антитіл
Ар1289-02 зеа І Мо: 97 СОК'І легкого ланцюга 1289-02 зеа І Мо: 98 СОКЗ2 легкого ланцюга 1289-02 зеа І Мо: 99 СОКЗ легкого ланцюга 1289-02 зеа І Мо: 100 СОКІ важкого ланцюга 1289-02 зеа І Мо: 101 СОКЗ2 важкого ланцюга 1289-02 зеа І Мо: 102 СОКЗ важкого ланцюга 1289-02 зе ІО Мо: 103 МІ 1289-02 зеа ІЮО Мо: 104 МН 1289-02
Ар 811-02 зеа І Мо: 105 СОКТ легкого ланцюга 811-02 зеа І Мо: 106 СОКа легкого ланцюга 811-02 зеа І Мо: 107 СОКЗ легкого ланцюга 811-02 зеа І Мо: 108 СОКІ важкого ланцюга 811-02 зеа І Мо: 109 СОКЗО2 важкого ланцюга 811-02 зеа І Мо: 110 СОКЗ важкого ланцюга 811-02 зе ІО Мо: 111 МІ. 811-02 зеа ІЮО Мо: 112 МН 811-02
Ар 566-01 зе ІО Мо: 113 СОН легкого ланцюга 566-01 зе ІО Мо: 114 СО легкого ланцюга 566-01 зе ІО Мо: 115 сСОмЗ легкого ланцюга 566-01 зе ІО Мо: 116 СОМ важкого ланцюга 566-01 зе ІО Мо: 117 СОК2 важкого ланцюга 566-01 зе ІО Мо: 118 СОКЗ важкого ланцюга 566-01 зеа І Мо: 119 МІ. 566-01 зеа ІЮО Мо: 120 МН 566-01
АЬ 562 зеа І Мо: 121 СОК легкого ланцюга 562 зеа І Мо: 122 СО легкого ланцюга 562 зеа І Мо: 123 СОКЗ легкого ланцюга 562 зеа І Мо: 124 СОК'І важкого ланцюга 562 зеа І Мо: 125 СОКЗ2 важкого ланцюга 562 зеа І Мо: 126 СОКЗ важкого ланцюга 562 зе ІО Мо: 127 МІ 562 зеа ІЮО Мо: 128 Ун 562
Ар 193 зе ІО Мо: 129 СОН легкого ланцюга 193 зеа І Мо: 130 СОКЗ2 легкого ланцюга 193 зеа І Мо: 131 СОКЗ легкого ланцюга 193 зеа І Мо: 132 СОК'І важкого ланцюга 193 зеа І Мо: 133 СОКЗ2 важкого ланцюга 193 зеа І Мо: 134 СОКЗ важкого ланцюга 193 зеа І Мо: 135 МІ 193 зеа ІЮО Мо: 136 МН 193
Аь 88 зеа І Мо: 137 СОКТ легкого ланцюга 88 зеа І Мо: 138 СОг2 легкого ланцюга 88 зеа І Мо: 139 сСОгЗ легкого ланцюга 88 зеа І Мо: 140 СОКІ важкого ланцюга 88 зеа І Мо: 141 СОК2 важкого ланцюга 88 зеа І Мо: 142 СОКЗ важкого ланцюга 88 зе ІО Мо: 143 МІ 88 зеа ІЮО Мо: 144 ун 88
Таблиця 5
Послідовності антитіл
Ар 045 зеа І Мо: 145 СОК легкого ланцюга 045 зеа І Мо: 146 СОКа легкого ланцюга 045 зеа І Мо: 147 СОКЗ легкого ланцюга 045 зеа І Мо: 148 СОК'І важкого ланцюга 045 зеа І Мо: 149 СОКЗО2 важкого ланцюга 045 зеа І Мо: 150 СОЕЗ важкого ланцюга 045 зе ІО Мо: 151 МІ 045 зеа ІЮО Мо: 152 ун 045
Ар 044 зеа І Мо: 153 СОН легкого ланцюга 044 зе ІО Мо: 154 СОК2 легкого ланцюга 044 зеа І Мо: 155 СОЗ легкого ланцюга 044 зеа ІО Мо: 156 СОМ важкого ланцюга 044 зеа І Мо: 157 СОКЗО2 важкого ланцюга 044 зеа І Мо: 158 СОЕЗ важкого ланцюга 044 зеа І Мо: 159 МІ 044 зеа ІЮО Мо: 160 ун 044
Ар 002 зеа І Мо: 161 СОК легкого ланцюга 002 зеа І Мо: 162 СОКа2 легкого ланцюга 002 зеа ІО Мо: 163 СОКЗ легкого ланцюга 002 зеа І Мо: 164 СОК'І важкого ланцюга 002 зеа І Мо: 165 СО2 важкого ланцюга 002 зеа І Мо: 166 СОКЗ важкого ланцюга 002 зеа І Мо: 167 МІ 002 зеа ІЮО Мо: 168 Ун ог зеа І Мо: 169 Повна людська послідовність сортиліну ізоформи 1 зеа І Мо: 170 "Ділянка 0", ідентифікована в цьому винаході зеа І Мо: 171 Сортилін "и5ОКТЕСОВАР" зеа І Мо: 172 Сортилін ЗОКТЕСОВАР ПВАСК зеа І Мо: 173 Сортилін ЗОКТЕСОВАР (Іеїга зеа І Мо: 174 Сортилін ЗОКТЕСОВАР пВО1-05 зеа І Мо: 175 Сортилін ЗОКТЕСОВАР КІМ зеа І Мо: 176 Сортилін ЗОКТЕСОВАР пВОб6-10 зеа І Мо: 177 Сортилін ЗОКТЕСОВАР пВ12390 зеа І Мо: 178 Сортилін ЗОКТЕСОВАР пВ45678 зеа І Мо: 179 Сортилін ЗОКТЕСО НІ5 зеа І Мо: 180 "Ділянка А", ідентифікована в цьому винаході зеа І Мо: 181 109-114 ділянки А зеа І Мо: 182 126-153 ділянки А зеа І Мо: 183 126-144 ділянки А зеа І Мо: 184 154-159 ділянки А зеа І Мо: 185 570-572 ділянки Ю зеа І Мо: 186 588-597 ділянки Ю зеа І Мо: 187 593-597 ділянки Ю
Зеа ІО Мо: 188 Послідовності, що застосовуються для НОХ
Перелічення або обговорення в даному описі документа, очевидно опублікованого раніше, не обов'язково повинні розглядатися як підтвердження того, що документ є частиною рівня техніки або загальнодоступними відомостями.
ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ
Як буде очевидно з тексту і прикладів, цей винахід додатково відноситься до наведених нижче варіантів здійснення. 1. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, здатні специфічно зв'язуватися з сортиліном і пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном. 2. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 1, де антитіло містить інтактне антитіло або складається з нього. 3. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 1 або 2, де антигензв'язувальний фрагмент містить антигензв'язувальний фрагмент, вибраний з групи, що складається з Ем-фрагмента (наприклад, одноланцюгового Ем або зв'язаного дисульфідним зв'язком Ем); Габ-подібного фрагмента (наприклад, РГар-фрагмента або Е(ар")»- фрагмента) і доменного антитіла (наприклад, окремого варіабельного домену Мн або варіабельного домену Мі), або складається з нього. 4. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло вибрано з групи, що складається з антитіла підтипу ЇДС1, Ідс2,
ІЧОЗ або Ідсаі. 5. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де вказані антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно зв'язуються з ділянкою О сортиліну, визначеною в 5ЕО ІЮ МО:170. 6. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де вказані антитіло або його фрагмент специфічно зв'язуються щонайменше з З послідовними амінокислотами, як, наприклад, 4, 5, б або 7 послідовними амінокислотами, ділянки О сортиліну, визначеної в ЗЕО ІЮ МО:170. 7. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент проявляють одне або декілька з наступних властивостей: () афінність зв'язування (Ко) з сортиліном, що становить 0,5-10 нМ, як, наприклад, 1-5 нм або 1-2 НМ; (ії) здатність знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОЕМ з сортиліном; (ії) здатність знижувати і/або пригнічувати виведення РОКМ клітинами, що експресують сортилін; (ім) здатність знижувати і/або пригнічувати ендоцитоз РОКМ клітинами, що експресують сортилін;
Зо (м) здатність підвищувати кількість або концентрацію РОКМ в плазмі крові у мишей з нокіном, за рахунок якого у них експресується сортилін людини. 8. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 7, де здатність антитіла або його фрагмента знижувати зв'язування РОМ з сортиліном передбачає зниження зв'язування РОКМ з сортиліном на 10 95 або більше; наприклад, на 20 95 або більше або на 30 95 або більше. 9. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 7 або 8, де здатність вказаних антитіла або його фрагмента антитіла або його фрагмента знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном передбачає зниження і/або пригнічення зв'язування РОКМ з сортиліном при ІС5О0, що становить 22 нМ або менше, як, наприклад, від 22 НМ до 1 нМ, або від 10 нМ до 1 нМ, або від 5 НМ до 1 нМ. 10. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент є людськими або гуманізованими. 11. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить одну або декілька СОК 1-3 легкого ланцюга, які перелічені для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 12. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 11, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить СОК 1-3 легкого ланцюга, які перелічені для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5. 13. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 11 або 12, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність МІ.,, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї. 14. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 11-13, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МІ, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї. 60 15. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить одну або декілька СОК 1-3 важкого ланцюга, які перелічені для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 16. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 15, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить СОК 1-3 важкого ланцюга, які перелічені для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5. 17. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 15 або 16, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність УН, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї. 18. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 15-17, що містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність Мі, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї. 19. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність МІ,, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї, і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність УН, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї. 20. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність МІ, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї, і важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність УН, вказану для кожного з антитіл, визначених в таблиці 5, або що складається з неї. 21. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де вказані антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент конкурують з антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, визначеними у варіанті здійснення 20, за
Зо зв'язування з сортиліном. 22. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містять Ес-ділянку. 23. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент додатково містять компонент для збільшення періоду напівжиття іп мімо. 24. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 22, де компонент для збільшення періоду напівжиття іп мімо вибраний з групи, що складається з поліетиленгліколю (РЕС), сироваткового альбуміну людини, глікозилуючих груп, жирних кислот і декстрану. 25. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло або антигензв'язувальний фрагмент додатково містять детектовний компонент. 26. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 25, де детектовний компонент, вибраний з групи, що складається з флуоресцентної мітки; хемілюмінесцентної мітки; парамагнітної мітки; радіоізотопної мітки або ферментної мітки. 27. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 25 або 26, де детектовний компонент містить радіоактивний ізотоп або складається з нього. 28. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 26 або 27, де радіоактивний ізотоп вибраний з групи, що складається з "Тс, 111п, 6/«За, 68(За, "2Ав, 89, 125| і 20171, 29. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 25, де детектовний компонент містить парамагнітний ізотоп або складається з нього. 30. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 29, де парамагнітний ізотоп вибраний з групи, що складається з 157434, Мп, 792Пу, 52Стк і 56Ее, 31. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 25-30, де детектовний компонент виявляється за допомогою методики візуалізації, такої як ХРЕСТ, РЕТ, МК, оптична або ультразвукова візуалізація. 32. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 25-31, де детектовний компонент опосередковано з'єднаний з антитілом або його бо антигензв'язувальним фрагментом за допомогою лінкерного компоненту.
33. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 32, де лінкерний компонент вибраний з групи, що складається 3 похідних 1,4,7,10- тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраоцтової кислоти (ОТА); дефероксаміну (ОБО); похідних діетилентриамінпентаоцтової кислоти (ОТРА); похідних 5-2-(4-ізотіоціанатобензил)-1,4,7- триазациклононан-1,4,7-триоцтової кислоти (МОТА) і похідних 1,4,8,11-тетраазациклододекан- 1,4,8,11-тетраоцтової кислоти (ТЕТА). 34. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-33. 35. Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до варіанта здійснення 34, де молекула є молекулою кКДНК. 36. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, визначену у варіантах здійснення 34 або 35. 37. Рекомбінантна клітка-хазяїн, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, визначену в будь-якому з варіантів здійснення 34-36. 38. Спосіб отримання антитіла або антигензв'язувального фрагмента, визначених в будь- якому з варіантів здійснення 1-33, при цьому спосіб включає культивування клітини-хазяїна, визначеної у варіанті здійснення 37, в умовах, що забезпечують можливість експресії закодованого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента. 39. Препарат, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де вказаний препарат практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах, які або не здатні зв'язуватися з сортиліном, або істотним чином не змінюють антисортилінові функціональні характеристики препарату, при цьому вказані функціональні характеристики вибрані з групи, що складається з (І) афінності зв'язування (Ко) з сортиліном; (і) здатності знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОЕМ з сортиліном; (ії) здатності знижувати і/або пригнічувати виведення РОКМ клітинами, що експресують сортилін; (ім) здатності знижувати і/або пригнічувати ендоцитоз РОКМ клітинами, що експресують сортилін;
Зо (м) здатності підвищувати кількість і/або концентрацію РОМ в плазмі крові у мишей з нокіном, за рахунок якого у них експресується сортилін людини; і/або (м) здатності забезпечувати лікування лобно-скроневої деменції (ЕТО) і/або бічного аміотрофічного склерозу (АГ 5) при його тривалому введенні. 40. Препарат, що містить моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де вказане моноклональне антитіло має структурну зміну в своїй амінокислотній послідовності в порівнянні із структурою антитіла до сортиліну, що зустрічається в природі, де вказана структурна зміна обумовлює прояв вказаним моноклональним антитілом змінених функціональних характеристик в порівнянні з функціональними характеристиками, що проявляються вказаним антитілом до сортиліну, що зустрічається в природі, де вказані функціональні характеристики являють собою (ї) афінність зв'язування (КО) з сортиліном; (і) здатність знижувати і/або пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном; (ії) здатність знижувати і/або пригнічувати виведення РОКМ клітинами, що експресують сортилін; (м) здатність знижувати і/або пригнічувати ендоцитоз РОМ клітинами, що експресують сортилін; (м) здатність підвищувати кількість і/або концентрацію РОКМ в плазмі крові у мишей з нокіном, за рахунок якого у них експресується сортилін людини; і/або (м) здатність забезпечувати лікування лобно-скроневої деменції (ЕТО) і/або бічного аміотрофічного склерозу (АГ 5) при його тривалому введенні. 41. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-33, або препарат відповідно до будь- якого з варіантів здійснення 39-40 і фармацевтично прийнятний носій. 42. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-33, або препарат відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 39-40 для застосування в медицині. 43. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-33, або препарат відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 39-40 для застосування при попередженні і/або лікуванні захворювання, що асоціюється із зниженими бо рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта.
44. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, визначених в будь- якому з варіантів здійснення 1-33, або препарату відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 39-40 при виготовленні лікарського препарату для попередження і/або лікування захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта. 45. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування відповідно до варіанта здійснення 43 або застосування відповідно до варіанта здійснення 44, де захворювання вибране з групи, що складається з ЕТО; АЇ 5; протеїнопатій ТОР43, як, наприклад, АЮ. 46. Спосіб попередження або лікування захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта, який включає введення ефективної дози антитіла або його фрагмента, визначених в будь-якому з варіантів здійснення 1-33, препарату відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 39-40 або фармацевтичної композиції відповідно до варіанта здійснення 41. 47. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування відповідно до варіанта здійснення 43, або застосування відповідно до варіанта здійснення 44, або спосіб відповідно до варіанта здійснення 46, де захворювання вибране з групи, що складається з ЕТО;
АЇ 5 або протеїнопатій ТОР43, як, наприклад, АЮ. 48. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування; або застосування; або спосіб відповідно до варіанта здійснення 46 або 47, де лікування є тривалим. 49. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування; або застосування; або спосіб відповідно до варіанта здійснення 48, де тривале лікування продовжується протягом щонайменше 2 тижнів, як, наприклад, протягом щонайменше 1 місяця, б місяців, 1 року або довше. 50. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-33, препарат відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 39-40 або фармацевтична композиція відповідно до варіанта здійснення 41, які здатні специфічно зв'язуватися з сортиліном і пригнічувати зв'язування РОКМ з сортиліном, але при цьому їх зв'язування не пригнічує або по суті не пригнічує зв'язування нейротензину або АЕ38469 з сортиліном.
Зо 51. Набір, який містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, визначені в будь- якому з варіантів здійснення 1-33, препарат, визначений в будь-якому з варіантів здійснення 39- 40, або фармацевтичну композицію, визначену у варіанті здійснення 41.
Переважні необмежувальні приклади, які утілюють певні аспекти цього винаходу, далі будуть описані з посиланням на фігури, що додаються.
ПРИКЛАДИ
У прикладах 1-3 описано отримання конструктів сортиліну.
У прикладі 1 розкриті конструкти, отримані перетасовуванням. У прикладі 2 розкрита експресія конструктів сортиліну. У прикладі З розкрито очищення конструктів сортиліну.
У прикладах 4-7 описано отримання антитіл до сортиліну.
У прикладі 4 розкриті імунізація і гібридоми. У прикладі 5 розкритий аналіз послідовностей. У прикладі 6 розкрито очищення антитіл. У прикладі 7 розкрито отримання антитіл миші.
У прикладах 8-17 описана характеристика антитіл до сортиліну
У прикладі 8 розкрито зв'язування сортиліну. У прикладі 9 розкрита здатність антитіл до сортиліну до перехресного блокування. У прикладі 10 розкритий НТКЕ, що проводиться відносно зв'язування РОКМ-сортилін. У прикладі 11 розкрито зв'язування МТ5. У прикладі 12 розкриті зв'язування РОКМ клітинами і ендоцитоз. У прикладі 13 розкриті рівні позаклітинного
РОМ. У прикладі 14 розкриті рівні РОКМ в ІРЗС. У прикладі 15 розкриті рівні РОКМ в плазмі крові. У прикладі 16 розкрите картування епітопів за допомогою НОХ. У прикладі 17 розкритий мікродіаліз РОКМ в головному мозку.
Приклад 1
Для застосування як в способі скринінгу гібридом, так і в розширенні панелі антитіл розробляли, конструювали і отримували так звані "конструкти, отримані перетасовуванням" з утворенням набору химерних молекул сортиліну, що містять амінокислотні послідовності, що походять як від сортиліну людини, так і сортиліну далекородинних видів (голкочеревні) із значно зниженим ступенем гомології послідовностей. Логічним обгрунтуванням для цього є те, що загальна структура сортиліну і функціональні характеристики цих химерних конструктів зберігатимуться, але при цьому втрата антитілами здатності зв'язуватися з певними химерними конструктами указуватиме на залучення до зв'язування конкретних ділянок, підданих заміні.
Конструкти розчинної позаклітинної ділянки (ЕСО, аа 1-755) мітили або ВАР-міткою (біотин- бо акцепторний пептид), що забезпечує можливість біотинілування білків "іп міго" за допомогою сумісної експресії з біотин-лігазою, або Ніб-міткою, що забезпечує можливість простого очищення. Отримували вектори експресії, що кодують наступні білки: ЗОКТ-ЕСОВАР, 5ОВТ-
ЕСОВАР-НВОЇТ-05, БОВТ-ЕСОВАР-НВОб6-10, 5ОВТ-ЕСОВАР-НВ12390, 5ОВТ-ЕСОВАР-НВ45678,
ЗОВТ-ЕСОВАР-ета, 5ОВТ, 5ОВТ-івїга.
Послідовності сортиліну можна знайти в 5ЕО ІЮ МО:169-180 і на фігурі 2, що показує схематичне представлення віднесення антитіл до ділянок на підставі зв'язування з конструктами сортиліну, отриманими перетасовуванням.
Приклад 2
У разі експресії антитіла вектори, що кодують відповідний важкий ланцюг і легкий ланцюг, описані в прикладах 4, 5 і 6, спільно експресували в клітинах НЕК-293БЕ.
Приклад 3. Очищення сортиліну, міченого Ніб
ЗОВТЕСОНІіх експресували в клітинах НЕК-293Е. Нів-мітка в білках забезпечувала можливість очищення за допомогою афінної хроматографії на іммобілізованому металі. У цьому способі картридж МІМТА Зирептшом (Оіадеп) врівноважували за допомогою 50 мМ МАНегРО», 300
ММ Масі ї 10 мМ імідазолу, рН 8,0. У колонку завантажували білок, мічений Ні, при цьому час витримування складав 1 хвилину. Колонку промивали за допомогою 50 мМ МАНегРО», 300 мМ
Масі ї 20 мМ імідазолу, рН 8,0. Білок елюювали за допомогою 50 мМ МАНегРО», 300 мМ Масі і 250 мМ імідазолу, рН 8,0. Потім білок піддавали діалізу в РВ5 із застосуванням 5іїде-А-І угег з відсіканням за молекулярною масою 10000 Да (Тпегто 5сіепійіс). Після виконання діалізу білок піддавали стерилізуючій фільтрації із застосуванням фільтру ЗЕСА з розміром пор 0,2 мікрона (Тнегто зсієпійіс).
Лінію клітин 518-НЕК отримували шляхом трансфекції клітин НЕК293 вектором експресії сортиліну людини дикого типу (М/Т). Стабільно трансфектовані клітини отримували після здійснення пасажу у присутності засобу селекції. Окремі клони відбирали за допомогою клонування методом розведень. Клони характеризували стосовно експресії мРНК сортиліну із застосуванням ОРСЕ. Клони з найбільш високими рівнями експресії потім аналізували за допомогою БАС5 ((зцама, МіПіроге) із застосуванням поліклонального антитіла до сортиліну (поліклонального козячого біотинілованого АБ до сортиліну Мо за кат.: ВАЕ2934 (К8О Зузіетв5)) для визначення рівнів поверхневої експресії сортиліну.
Приклад 4
А. Процедура імунізації трансгенних мишей
Антитіла НиМаб до сортиліну отримували шляхом імунізації мишей ліній НСо12, НСо17,
НСого, НСо12-ВАЇ В/с, НСо17-ВАЇ В/с і НСо20-ВАЇ В/с за допомогою НиМАБ (моноклонального антитіла людини; Медагех Іпс., Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Ці миші характеризуються подвійним нокаутом по сгенам важкого ланцюга і легкого каппа-ланцюга мишачого імуноглобуліну (Ід), що в значній мірі інактивує експресію антитіл, що є повністю мишачими.
Різні лінії мишей робили трансгенними шляхом вставки локусів, що кодують важкий ланцюг Ід людини, і локусів, що кодують легкий каппа-ланцюг Ід людини, і вони відрізнялися за кількістю людських генів МН (варіабельного домену важкого ланцюга) і МІ. (варіабельного домену легкого ланцюга). Мишей НСо12-ВАГВ/с отримували шляхом перехресного схрещування з мишами
КСо5-ВАЇ В/с (з трансгеном, що кодує легкий каппа-ланцюг). 48 мишей імунізували по черзі інтраперитонеально (ІР) за допомогою 20 мкг ЗОКТЕСОНІ5 (ЗЕО ІО МО: 179) і підшкірно (ЗС, в основу хвоста) тим же білком з інтервалом в 14 днів.
Здійснювали максимум вісім імунізацій: 4 ІР і 4 560.
Згідно з одним протоколом першу імунізацію проводили за допомогою 5ОКТЕСОНІв в повному ад'юванті Фрейнда (СЕА, Оіїсо І абогайшгіє5, Детройт, Мічиган, США), наступні імунізації - в неповному ад'юванті Фрейнда (ІРА). Згідно з другим протоколом застосовували ЗАЗ як ад'ювант на всіх стадіях імунізації. Після виявлення, що сироваткові титри є достатніми (розведення сироватки крові 1750 або нижче давало позитивний результат в скринінговому аналізі, специфічному стосовно антигену, щонайменше в двох послідовних подіях скринінгу, що проводяться двічі на тиждень), мишей додатково двічі стимулювали внутрівенно (ІМ) за допомогою 10 мкг білка ЗОКТЕСОНІ» в 100 мкл РВУ, за чотири і три дні до злиття.
В. Отримання НиМар-гібридоми
Мишей НиМАБбБ з виробленням достатнього антигенспецифічного титру, як визначено вище, убивали і брали селезінку і лімфатичні вузли, прилеглі до черевної аорти і порожнистої вени.
Злиття спленоцитів і клітин лімфатичних вузлів з клітинною лінією мишачої мієломи проводили шляхом електрозлиття із застосуванням системи для електрозлиття СЕЕЕ 50 (Су Риїзе
Зсієеєпсе5, Глен Берні, Меріленд, США), по суті, відповідно до інструкцій виробника. Злиті клітини висівали в середовище для культивування злитих клітин, що містить 10 95 бичачої сироватки бо ЕегаІСіопе І (Регріо) 1 мМ пірувату натрію (Сатбгех), 0,5 од./мл пеніциліну, 0,5 од./мл стрептоміцину (Сатргех), 50 мкМ 2-меркаптоетанолу (Іпмігодеп), 600 нг/мл інтерлейкіну 6 (1-6) (Зігатшттапп), 1 х НАТ (5ідта) і 0,5 мг/мл канаміцину (Іпмігодеп) в Нус тАОСсСЕ-Маб (Регбіо).
Через десять днів збирали супернатант і клітини оновлювали середовищем для збору, що містить 10 95 бичачої сироватки РеїаїІСіопе І, 0,5 од./мл пеніциліну, 0,5 од./мл стрептоміцину, 600 нг/мл ЇЇ -6 і 1 х реоНтТ (Сатьгех) в НУО тАОсСЕ-Маб. Супернатанти культур гібридоми піддавали скринінгу за допомогою первинних скринінгових аналізів і гранул стрептавідину, зв'язаного з
ЗОВТЕСОВАР (5БО 10 МО: 171) БОВТЕСОВАРИВО6-10 (5БО 10 МО: (176),
ЗОВТЕСОВАРНИВІТ2390 (5ЕО ІО МО: 177), для виявлення гібридом, що продукують людські (або химерні) антитіла до сортиліну. Клітини гібридоми з визначених в ході первинного скринінгу лунок з найкращим результатом висівали в напівтверде середовище, виготовлене з 40 95
СіІопеМеадіа (Сепеїїх, Гемпшир, Великобританія) і 60 956 повного середовища Нус 2х (Нусіопе,
Волтем, США). У разі кожної лунки з первинного скринінгу її вміст висівали в лунку б-лункового чорного планшета Сепеїїх. З кожної лунки відбирали 25 субклонів за допомогою системи
СіоперРіх (Сепвеїїх). Субклони відбирали в середовище для збору. Через сім днів супернатанти субклонів знову піддавали скринінгу відносно специфічного до сортиліну зв'язування Ід людини і вимірювали концентрацію ДдсС людини із застосуванням платформи Осієвї З384гей (Еоперіо, Менло-Парк, США). З кожної лунки первинного скринінгу вибирали найкращий субклон і розмножували його в середовищі для розмноження, що містить тільки 600 нг/мл ІІ -6, 0,5 од./мл пеніциліну, 0,5 од./мл стрептоміцину і 1 х ргоНтТ. Субклони розмножували в наступному порядку: одна лунка 9б6-лункового планшета - одна лунка 24-лункового планшета - чотири лунки 24- лункового планшета - шість лунок б-лункового планшета. Клони, отримані в результаті цього процесу, були позначені як первинні клони (РОС).
Антитіла НиМар до сортиліну за цим винаходом ідентифікували і піддавали аналізу послідовностей.
Приклад 5. Аналіз послідовностей специфічних стосовно сортиліну варіабельних доменів
НиМаб і клонування у вектори експресії 3 0,2-5 х 106 клітин гібридоми отримували загальну РНК і з 100 нг загальної РНК отримували 5-ВАСЕ-комплементарну ДНК (кКДНК) за допомогою набору для ампліфікації КДНК
ЗМАКТ КАСЕ (Сіопіесі) відповідно до інструкцій виробника. Ділянки, що кодують МН і Мі,
Зо ампліфікували за допомогою ПЛР і безпосередньо клонували, в рамці зчитування, у вектори експресії р3ззсе1ї ії рзаЗКарра (що містять послідовності, що кодують константні домени Ідс1 людини/каппа) шляхом незалежного від лігування клонування (Авіапідаі5, С. апа РУ де допо,
Мисівїс Асіда5 Нез 1990; 18 (20): 6069-74). Для кожного антитіла секвенували 16 клонів Мі і 16 клонів УН. Для додаткового вивчення і експресії відбирали клони з коректною відкритою рамкою зчитування (ОКЕ). Здійснювали сумісну транзієнтну експресію векторів всіх комбінацій важких ланцюгів і легких ланцюгів в клітинах ЕгеезіуЇеТМ 293-Е з використанням 293гесііп.
Отримані в результаті послідовності показані в даному описі в переліку послідовностей (ЗЕО ІЮ МО:1-168). Послідовності СОК визначали відповідно до виданого керівництва.
Приклад 6. Очищення антитіл
Супернатант культури фільтрували через тупикові фільтри з розміром пор 0,2 мкм, завантажували у 5 мл колонки з білком А (гРгоївіп А ЕЕ, Атегейпат Віозсіепсе) і елюювали за допомогою 0,1 М лимонної кислоти-маон, рН 3. Елюат негайно нейтралізували за допомогою 2
М Тті5-НСЇ, рН 9, ї піддавали діалізу в 12,6 мМ МанНегРоОх», 140 мм Масі, рН 7,4 (В.Вгашйп), О/М (протягом ночі). Після діалізу зразки піддавали стерилізуючій фільтрації через тупикові фільтри з розміром пор 0,2 мкм. Чистоту визначали за допомогою ЗЮО5-РАСЕ, а концентрацію вимірювали за допомогою нефелометрії і поглинання при 280 нм. Очищені антитіла розділяли на аліквоти і зберігали при -80 С. Після розморожування аліквоти очищених антитіл витримували при 4 "С. Мас-спектрометрію проводили для ідентифікації молекулярної маси важкого і легкого ланцюгів антитіла, що експресувалися гібридомами.
Приклад 7. Отримання антитіл миші (122 і 5Е1)
Імуноген
Синтетичний ген, що кодує химерний імуноген пзогпійп-ЕС, (АА сортиліну людини (78-756) з
ЗБЕО ІО МО:169 ї АА Ід61-ЕС людини (104-330) з 5БЕО ІЮ МО:169), клонували в рсОМАЗ.1 і використовували для експресії із застосуванням системи Іеевзіуїе від Іпмігодеп. Антиген очищали з супернатантів культури клітин за допомогою афінної хроматографії на білку А із застосуванням стандартних процедур очищення антитіл, описаних вище для антитіл людини.
Отримання гібридоми пБопйййп-ЕС застосовували як імуноген і ним імунізували 5 мишей ВАЇВ/с. Мишей із задовільною імунною відповіддю вибирали для злиття клітин і отримання гібридоми. бо Супернатанти гібридом піддавали скринінгу за допомогою ЕГІЗА із застосуванням п5огійп-ЕСО як покриваючого антигену. В цілому отримували вісімнадцять ліній клітин-гібридом, що походять з дев'яти початкових клонів.
Експресія
Гібридоми спочатку вирощували в повному середовищі для вирощування, ОМЕМ з 10 95
ЕВЗжантибіотики, і потім забезпечували адаптацію до середовища СОпубгідота (Іпийгодеп) для проведення експериментів з експресії.
Очищення
Моноклональні антитіла миші очищали з супернатантів культури клітин гібридоми на сефарозі з білком С відповідно до стандартних процедур, рекомендованих постачальником (СЕ
Пеайнсагє).
Приклад 8. Афінність специфічних стосовно сортиліну НиМар і антитіл миші до рекомбінантної позаклітинної ділянки сортиліну
Кінетику зв'язування антитіл НиМаб до сортиліну з сортиліном визначали із застосуванням
Осії 384КЕЮО (Роперіо, Менло-Парк, США). Розчини НиМар з концентрацією 2 мкг/мл отримували шляхом розведення в розріджувачі зразків (ГопевВіо, арт. Мо 18-5028). Чутливі до білка А сенсори (РопевВіо, арт. Мо 18-0004) заздалегідь змочували буфером для дослідження кінетики (1:10 розріджувача зразків в РВ5) протягом щонайменше 600 секунд. Потім на сенсори іммобілізували розчин НиМабр протягом 600 секунд. Відповідь на початковому рівні отримували шляхом занурення в буфер для дослідження кінетики на 120 секунд. Асоціацію з конструктами 5ОКТЕСО забезпечували шляхом інкубації протягом 1000 секунд. Після цього забезпечували дисоціацію в буфері для дослідження кінетики протягом 100 секунд. Після дисоціації сенсори відновлювали (10 мМ гліцину, рН 1,0) і нейтралізували (буфер для дослідження кінетики) З рази протягом 5 секунд. Всі НиМаб аналізували з використанням чотирьох концентрацій конструктів
ЗОКТЕСО (10, 5, 2,5 і 1,25 мкг/мл). Молекулярну масу, що становить 76,8 кДа, використовували для 5ОКТЕСОНІі5х. Дані апроксимували за допомогою програмного забезпечення РЕогіевВіо
Апаїузі5 6.4, використовуючи глобальну загальну апроксимацію. Результати показані на фігурі З і фігурі 4.
Приклад 9. Перехресне блокування НимМаБб до сортиліну антитілами
Дослідження з перехресного блокування антитілами проводили із застосуванням Осіеєї
Зо 384КЕО (Рогперіо, Менло-Парк, США). Розчини антитіл НиМар з концентрацією 2 мкг/мл отримували шляхом розведення в розріджувачі зразків (ЕопевВіо, арт. Мо 18-5028). Чутливі до аміногруп сенсори (ЕопевВіо, арт. Мо 18-0008) використовували для іммобілізації НиМабр. Перед зв'язуванням з чутливими до аміногруп сенсорами НиМаб розводили в буфері МЕ5, рН 6,0 (18- 5027). Зв'язування здійснювали при 30 "С і 1000 об./хв. таким чином. Чутливі до аміногруп 35 сенсори заздалегідь змочували в РВ5 і потім активували за допомогою розчину для активації
ЕОС/МН5З (РопевВіо, арт. Мо 18-1033/18-1034) (відповідно до інструкції виробника) протягом 300 секунд. На активовані сенсори іммобілізували НиМар протягом 600 секунд. Іммобілізовані сенсори блокували етаноламіном (БогпеВіо Мо за кат. 18-1039) для усунення залишкової реактивності стосовно аміногруп. Після блокування сенсори поміщали в РВЗ5 до застосування. 40 Аналіз перехресного блокування починали з встановлення відповіді на початковому рівні при "С ї 1000 об./хв. Відповідь на початковому рівні отримували шляхом занурення в розріджувач зразка на 120 секунд. Асоціацію з 5ОКТЕСОНІіх забезпечували протягом 300 секунд, безпосередньо після чого забезпечували асоціацію з НиМар протягом 300 секунд. Після асоціації з НимМабр сенсори відновлювали (10 мМ гліцину, рН 1,0) і нейтралізували (розріджувач зразків) З рази протягом 5 секунд. Дані обробляли із застосуванням програмного забезпечення
ЕопевВіо Апаїувзів 6.4.
Антитіла групували на підставі їх профілів зв'язування з різними конструктами сортиліну, отриманими перетасовуванням (фігура 2, фігура З і фігура 4). Для підтвердження того, що всі антитіла, відповідні ділянці Ю (і ділянці ЕР), зв'язуються з однією й тією ж ділянкою в ЕСО сортиліну людини дикого типу, їх здатність блокувати зв'язування один одного з ЕСО сортиліну людини дикого типу характеризували в дослідженні перехресного блокування із застосуванням
Осіеї384 гед. Наприклад, при тестуванні антитіл, відповідних одній і тій же ділянці, первинне антитіло блокуватиме зв'язування вторинного антитіла і навпаки. Тоді як при тестуванні антитіл, відповідних різним ділянкам, перехресне блокування не відбуватиметься, оскільки тільки одна ділянка блокується первинним антитілом, а решта ділянок доступна для зв'язування з вторинним антитілом. На фігурі 7 показано, що всі антитіла до ділянки ЮО і ЮО- перехресно блокували один одного, що підтверджує визначення антитіл в клас відповідності ділянки О і Ю- на підставі конструктів, отриманих перетасовуванням. Крім того, ці дані також підтверджують, що у химерних конструктів сортиліну зберігається схожість з ЕСО нативного сортиліну людини
Гс10) дикого типу.
Приклад 10. Характеристика зв'язування сортиліну з лігандом РОКМ у присутності антитіл до сортиліну
Значення ІС5О для антитіл визначали шляхом вимірювання зсуву зв'язування РОКМ з сортиліном за допомогою флуоресцентного аналізу з розрізненням за часом (НТЕЕ, Сів5Віо), див. фігуру 5 і фігуру 6.
Експерименти проводили в буфері для аналізу (50 мМ фосфату, рН 7,0, 0,1 95 В5А) в загальному об'ємі 20 мкл в 384-лунковому білому малооб'ємному титраційному мікропланшеті від Сгеіпег (784075, ОСгеїіпег).
Антитіла заздалегідь інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з 50 нМ НІ5- міченого ЕСО сортиліну і 4 НМ РОКМ (50(020110924) перед додаванням 7 нМ антитіла до бНІЗ-42 і 0,7 нМ антитіла до РОКМ-криптат Єи (Сіб5ріо), розведеного в буфері для кон'югату (50
ММ фосфату, рН 7,0, 0,8 мМ КЕ, 0,195 ВА). 20 мкМ нейротензину використовували як позитивний контроль, а ОМ5О в буфері використовували як негативний контроль.
Аналітичний планшет інкубували протягом 60 хвилин при кімнатній температурі і протягом ночі при 4 "С перед зчитуванням планшета на зчитувачі Епмізіоп (РегкКіп ЕІтег).
Проби неміченого нейротензину і ЮМ5О використовували відповідно як позитивний і негативний контроль для постановки аналізу. Оцінку залежності доза-відповідь для антитіл проводили з використанням десяти концентрацій в діапазоні від 1 мкМ до 50 пМ за кривою 3- кратного розведення.
Значення концентрації напівмаксимального пригнічення (ІС50) розраховували за допомогою нелінійної регресії з використанням сигмоїдальної кривої концентрація-відповідь (із змінною крутизною) в ХІ її 4 (ІОВ5, Великобританія) (фігури 5 і 6).
Приклад 11. Характеристика зв'язування сортилін - нейротензин у присутності антитіл до сортиліну
Значення ІС50 для специфічної стосовно сортиліну сполуки АЕ38469 (5спгедег еї аї, Віоогд
Мей Спет Ген 2014 Цап 1:24(1):177-80, 2014) визначали шляхом вимірювання зсуву зв'язування ЗН-нейротензину з сортиліном із застосуванням сцинтиляційного аналізу зближення (БРА).
Експерименти проводили в буфері для аналізу (50 мМ НЕРЕЗ5, рН 7,4, 100 мм Масі, 2 мМ
Зо СасСі», 0,195 ВА, 0,195 Тмееп-20) в загальному об'ємі 40 мкл в 384-лунковому білому непрозорому планшеті Оріїріаїе (6007299, РегкКкіп ЕІптег). 150 нм НізЗ-міченого сортиліну заздалегідь інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з 1 мкМ специфічного стосовно сортиліну антитіла (Ід01-6003-045 або Ідс1-6003- 068) або без нього або з ізотипічним контролем, що представляє собою ІдДС1 людини, перед додаванням розчинів білка в лунки, що містять АЕ38469 в серії концентрацій від 50 мкМ до 2,5
НМ. Суміш інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі на шейкері перед додаванням 5 нМ ЗН-нейротензину і гранул, покритих хелатом Мі, для візуалізації (ЕРМО0266,
Регкіп ЕІтег). Аналізовану суміш додатково інкубували протягом 60 хвилин за тих же умов.
Через б годин планшет зчитували на Міем/ их (час експозиції 360 с). Проби неміченого нейротензину і ОМ5О використовували, відповідно, як позитивний і негативний контроль.
Оцінку залежності доза-відповідь для АЕЗ38469 проводили з використанням десяти концентрацій в діапазоні від 50 мкМ до 2,5 нМ за кривою З-кратного розведення. Значення концентрації напівмаксимального пригнічення (ІС50) розраховували за допомогою нелінійної регресії з використанням сигмоїдальної кривої концентрація-відповідь (із змінною крутизною) в
ХМ 4 (085, Великобританія). Результати можна побачити на фігурі 8.
Приклад 12. Характеристика зв'язування сортиліну з лігандом РОКМ на поверхні клітин у присутності антитіл до сортиліну
У цьому аналізі використовували як клітини, транзієнтно трансфектовані сортиліном, так і стабільну лінію клітин 518-НЕК (клітини НЕК, що надмірно експресують сортилін людини).
Клітини трипсинізували і висівали при щільності 42000 клітин на лунку в 96-лунковий планшет. У разі транзієнтно трансфектованих клітин клітини висівали в 9б-лункові планшети через 24 години після трансфекції. Наступного дня середовище повністю замінювали і до клітин додавали розведені в середовищі випробовувані сполуки на 30 хвилин з подальшим додаванням РОКМ на 4 години. В кінці дослідження (через 4,5 години) клітини фіксували і забарвлювали для виявлення РОКМ. Всі планшети, піддані забарвлюванню, аналізували за допомогою СеїОтіс5 Аггау Зсап (Тпепто Різспег) і середню інтенсивність забарвлення за
РОКМ/клітина/лунка використовували для аналізу.
Використовуваний в аналізі РОКМ збирали з середовища після транзієнтної трансфекції клітин НЕК 293 плазмідами, що експресують РОКМ. Рівні РОКМ вимірювали із застосуванням 60 набору ЕГІЗА для РОЕКМ (КУ).
Доданий до клітин РОКМ легко зв'язувався і піддавався ендоцитозу, що приводило до підвищеного сигналу флуоресценції в лунках з клітинами, трансфектованими сортиліном.
Додаванню нейротензину запобігало зв'язування сортиліну з РОКМ і інтенсивність флуоресценції РОКМ була аналогічною контрольним рівням, указуючи на те, що РОКМ не зв'язувався і не піддавався ендоцитозу у присутності нейротензину.
Обидва НитАб до сортиліну (45 і 68) перешкоджали поглинанню РОКМ з аналогічною нейротензину ефективністю. Ізотипічне контрольне антитіло В12 не надавало ніякого ефекту стосовно ендоцитозу або зв'язування РОКМ. Результати можна побачити на фігурі 9.
Приклад 13. Вплив антитіл на рівні позаклітинного РОКМ
Було виявлено, що як клітини НЕК293, так і клітини 518-НЕК безперервно секретують РОКМ в середовище без будь-якої стимуляції.
Антитіла і контрольні засоби додавали до клітин 518-НЕК для оцінки впливу на рівень
РОМ. Додавання нейротензину, відомого пептидного ліганду сортиліну, або антитіл 45, 68 і 811 людини до клітин 518-НЕК приводило до підвищення рівня РОКМ в середовищі культури клітин. Два антитіла людини до сортиліну (45 і 68) мали подібний до нейротензину ефект з підвищенням рівнів РОКМ до 202 95 і 201 95, відповідно. Антитіло 811 підвищувало рівень РОКМ в середовищі до 14695 в порівнянні з контролями В12, при цьому ізотипічне контрольне антитіло використовували як негативний контроль у всіх дослідженнях, і воно не показало ніякого ефекту стосовно рівнів РОКМ. Ці спостереження указують, що випробовувані антитіла до сортиліну пригнічували опосередковану сортиліном інтерналізацію РОКМ, підвищуючи за рахунок цього рівень позаклітинного РЕВМ.
У 1-й день клітини 518-НЕК висівали в 96-лунковий планшет. Через 24 години середовище повністю замінювали або тільки середовищем (контроль), або середовищем, доповненим випробовуваною сполукою. Всі сполуки тестували при концентрації 10 мкМ, а антитіла при концентрації 100 нМ, якщо не вказане інше. Середовище збирали на 3-й день і аналізували за допомогою ЕГІЗА для РОКМ (КУ). Життєздатність клітин оцінювали за допомогою Сеї! Тег (Рго Меда) для оцінки цитотоксичного ефекту сполук. Рівні РОКМ в середовищі аналізували за допомогою ЕГІЗА і значення нормалізували відносно контрольних лунок. Результати можна побачити на фігурі 10.
Приклад 14. Аналіз ЕГІЗА стосовно позаклітинного РОКМ в ІРЗС
Індуковані плюрипотентні стволові клітини (ІРБС) отримували за допомогою неінтеграційного перепрограмування фібробластів людини (нормальних фібробластів шкіри людини від 18-річного чоловіка; І оп7а), як описано в іншому документі (Казтизвзеп еї аї., їет
Се! Аеропв. 2014 Бер 9;3(3):404-13.). Для цих досліджень використовували лінію МНОЕ
КІ 5пр53. РОС спочатку отримували в середовищі тТЕ5БК і потім культивували у вигляді моношару в Рішигірго (СеїЇ Сцідапсе Зубхіет). Диференціювання в нейрони ініціювали в день 0 шляхом пересівання клітин на покриті полі-І -орнітином/ламініном чашки і культивування їх в середовищі М3 (50 95 ОМЕМ/Е12--50 95 нейробазального середовища, доповненого 0,5 95 М2, 195 827 з КА, 0,5 мМ сІшамАХ, 0,5 95 МЕА, 50 мкМ 2-меркаптоетанолу і 2,5 мг/мл інсуліну) з 500 нг/мл поддіп і 10 мкм 58431542. Середовище оновлювали щодня. Через 11 днів індукції за допомогою поддіп/58431542 клітини піддавали відокремлюванню за допомогою диспази і пересівали в покриті полі-І -орнітином/ламініном чашки в середовище М3. З цієї миті середовище МЗ оновлювали кожні 2-3 дні і клітини піддавали відокремлюванню приблизно кожні 10-14 днів з використанням акутази.
Диференційовані з клітин ІР5С нейрони висівали в 9б-лунковий планшет. Через один тиждень до клітин додавали антитіла. Середовище від клітин збирали через 48 годин або 96 годин і аналізували за допомогою ЕГІЗА для РОКМ людини (Еп2о І їе 5сіепсе5), і при цьому зразки аналізували згідно з інструкціями виробника.
Випробовувані антитіла людини до сортиліну (45 і 68) підвищували рівні РОМ в середовищі на різних рівнях через 48 годин і 96 годин. Антитіло В12 і антитіло до НеІ являли собою контрольні ізотипічні антитіла (негативний контроль). Дані представлені у вигляді середнього значення х 50. Дані аналізували за допомогою однофакторного Апома з подальшим аналізом з використанням критерію Даннета "р«е0,05; ""р«0,01. Результати можна побачити на фігурі 12.
Приклад 15
Для аналізу ефекту антитіл відносно рівнів РОКМ в плазмі крові гуманізовані миші з КІ по сортиліну отримували одноразову або багатократні ін'єкції (10 мг/кг) антитіл до сортиліну або ізотипічного контролю за допомогою підшкірних ін'єкцій. Тварин анестезували і убивали в різні моменти часу після введення доз, і рівні РОКМ в плазмі крові визначали за допомогою ЕГІЗА.
А. Дослідження в динаміці. Мишей обробляли антитілами (питар до сортиліну або бо контрольним аб) і убивали в різні моменти часу. У мишей, оброблених контрольними антитілами (антитілами до Неї), не спостерігали зміни рівнів РОКМ в плазмі крові, тоді як у мишей, оброблених питаб 45 до сортиліну, спостерігали підвищення рівнів РОЕМ, які, судячи з усього, досягали свого піку в проміжку від 24 до 48 годин, а потім поступово знижувалися, починаючи приблизно з 4-го дня. Рівні РОКМ все ще були підвищеними на 7-й день.
В. Дослідження середньої тривалості. На підставі даних з дослідження в динаміці мишам з
КІ по сортиліну двічі в тиждень вводили дози, що становлять 10 мг/кг, 5.с, або антитіла 45 людини до сортиліну, або ізотипічного контрольного антитіла з метою підтримки постійного рівня антитіл для дослідження середньої тривалості (4 тижні). Зразки крові збирали на початку дослідження і кожного тижня для відстеження змін рівня РОКМ в плазмі крові. Рівні РОКМ в плазмі крові на початку дослідження були аналогічними в обох групах тварин. Вищі рівні РОКМ в плазмі крові спостерігали у мишей, оброблених антитілом 45 до сортиліну, починаючи з тижня 1, ї вони залишалися підвищеними впродовж всього дослідження. У мишей, оброблених контрольним ар, не спостерігали будь-якого підвищення рівня РОМБМ в плазмі крові, і він залишався на початкових рівнях (тиждень 0).
С. Дослідження залежності доза-відповідь. Різні дози (4 дози: 10, 2, 0,4 і 0,1 мг/кг) антитіла до сортиліну (45) і контрольного антитіла (антитіла до Неї) вводили за допомогою ін'єкції і мишей убивали на 2-й день. Рівень РОКМ в плазмі крові підвищувався у мишей, оброблених
Ппитаб до сортиліну в дозі 10 мг/кг і 2 мг/кг, а нижчі дози не надавали ефекту стосовно рівня
РОКМ в плазмі крові, що чітко указує на дозозалежний ефект антитіла до сортиліну стосовно рівнів РОМ в плазмі крові. У мишей, оброблених контрольним антитілом, не спостерігали ніякої зміни стосовно рівнів РОКМ.
Мишей анестезували за допомогою ІР введення 0,4 мл авертину і кров з серця збирали і переносили у флакон з 500 мкл КЕЮОТА. Зразки витримували на льоду до проведення центрифугування при 3600 с протягом 15 хвилин при 4 "С. Плазму крові переносили піпеткою у флакон тісгопіс і заморожували при -20"С. Рівень РОКМ в зразках вимірювали із застосуванням набору ЕГІЗА для РОЕМ (Адіродеп) згідно з інструкціями виробника. Результати можна побачити на фігурі 13.
Приклад 16. Картування епітопів антитіл, спрямованих на взаємодію програнулін-сортилін, за допомогою водень-дейтерієвого обміну з подальшою мас-спектрометрією
Зо При проведенні водень-дейтерієвого обміну з подальшою мас-спектрометрією (НОХ-М5) вимірювали швидкість обміну атомів водню амідної групи остову білка. Таким чином можна вивчати конформаційну динаміку всього остову білка, за винятком залишків проліну. Швидкість реакції обміну визначали за станом амідної групи остову утворювати водневі зв'язки і у меншій мірі за доступністю для розчинника. Незначні зміни цих двох параметрів, наприклад, обумовлені присутністю ліганду, можуть спостерігатися у вигляді зміни рівня включення дейтерію.
Для визначення сублокалізації змін включення дейтерію білок обробляли кислототривкою протеазою (наприклад, пепсином), яка забезпечує утворення локальних ділянок звичайно з десяти - п'ятнадцяти амінокислот. Ділянки, в яких спостерігається зсув у присутності ліганду, або безпосередньо залучені в зв'язування граничної поверхні, або алостерично впливають на процес зв'язування.
Картування епітопів антитіл
Включення дейтерію в позаклітинну ділянку сортиліну (ЗЕО ІЮ МО:188) вимірювали у відсутності і присутності тАб45, тАбБб8, тАБа11 і антитіла, названого тАбБЗО, яке не зв'язується з ділянкою Ю. Для гарантії того, що вимірювання будуть проводиться в незмінних умовах, забезпечували урівноваження комплексів протягом 15 хвилин при 25 "С перед ініціацією реакції обміну. Реакцію обміну ініцювали шляхом розведення зразків білка 1:9 (о06б./06.) в дейтерованому буфері (99 95 020, 20 мМ Ттгі5, 150 мМ Масі, рОзчит. - 7,6). Через різні моменти часу (15 с, 1 хв., 10 хв., 1 год. і 8 год.) реакцію обміну гасили шляхом розведення 1:1 (об./об.) крижаним буфером для гасіння (2 М гліцину, 0,8 М Ттгі5-(2-карбоксіетил)уфосфіну (ТСЕР), рн-г,3), із зниженням за рахунок цього рН до 2,46. Піддані гасінню зразки негайно поміщали в морозильну установку, що підтримує -80", і зберігали в ній до проведення аналізу. Повністю дейтеровані контрольні зразки отримували шляхом розведення зразків сортиліну в співвідношенні 1:9 (06./06.) в дейтерованому денатуруючому буфері (6 М гуанідинію хлориду, 99 95 020, 20 мМ Тті5, 150 мМ Масі, рОзчит. - 7,6) з подальшою інкубацією при 25 "С протягом 16 годин перед їх гасінням і проведенням маніпуляцій, як описано вище.
Піддані гасінню зразки розморожували і вводили в охолоджену (0 "С) систему на основі обернено-фазової ОРІ С-НОХ (Магег»5 Іпс., США), обладнану заздалегідь заповненою пепсином колонкою (внутрішній об'єм 60 мкл, гранули пепсину отримували у Тпегто Зсіепійіс Іпс.). У даному випадку дейтеровані зразки білка піддавали розщеплюванню пепсином при 20 "С, що бо відстежували в режимі реального часу, і отримані в результаті дії пепсину пептиди розділяли за допомогою обернено-фазової ОРІ С. Пептиди іонізували за допомогою електророзпилювальної іонізації в мас-спектрометрі (мас-спектрометр бБупарі 2, МУМагеге Іпс, Великобританія), при цьому пептиди додатково розділяли за рухливістю іонів перед остаточним визначенням їх маси.
Ідентифікацію пептидів проводили з використанням повністю відновлених і недейтерованих зразків за допомогою тандемної мас-спектрометрії, в якій використовується комбінація принципів збору даних, не залежних від отриманої раніше інформації (М5е) і залежних від неї.
Аналіз даних
Ідентифікація пептидів
Отримані мас-спектри являли собою фіксовану масу, скоректовану відносно СЕР, і були проаналізовані в РІ 5 3.0, що здійснює підбір відповідності батьківських і фрагментованих іонів до локальної бази даних білків. Всі ідентифікації пептидів уважно оцінювали уручну.
Визначення рівня включення дейтерію. Отримані мас-спектри являли собою фіксовану масу, скоректовану відносно СЕР, і програмне забезпечення ЮОупатхХ 3.0 (Умаїегє Іпс., США) застосовували для визначення рівня включення дейтерію для всіх пептидів сортиліну в присутності або відсутності антитіл.
Вважалося, що пептид є частиною зв'язуючого епітопу, якщо спостерігали захист від обміну більш 0,50 у присутності антитіла.
Таблиця 1
Таблиця з ідентифікованими за допомогою НОХ-М5 конформаційними епітопами 45 | 709-414 | 126-153 | -(х | 570-572 | 588-597.ЙД.К 68 | 709-114 | 126-144 | 154-159 | 570-572 | 593-597 щ (81102 | 709-414 | 126-144 | -: | -(/«К/ 17777 593-597.ЙЖКЖЖ(
Приклад 17. Мікродіаліз для оцінки рівнів програнуліну в головному мозку тварин, що не сплять та вільно рухаються
Двотактний спосіб мікродіалізу застосовували для оцінки рівня програнуліну (РЕСМ) в ІЗЕ головного мозку у мишей, що не сплять і вільно рухаються. Мишей містили поодинці в регульованих умовах температури (225-1,5 С) і вологості (55-65 90) і підтримували 12:12- годинний цикл світла/темряви (включення світла о 06:00 год.). Їжа і вода були доступні без обмежень. Дане дослідження проводили на гіпокампі мишей з нокіном по людському сортиліну (Н5ОКТІ) (віком 22 тижні). Для забезпечення можливості здійснення мікродіалізу в гіпокампі мишей анестезували ізофлураном і в головний мозок стереотаксично імплантували внутрішньоцеребральну направляючу канюлю (СМА), розташовуючи мікродіалізний зонд в гіпокампі (координати наконечника зонда: на 3,1 мм назад і на 2,8 мм латерально від брегми і на 1,3 мм щодо твердої мозкової оболонки) відповідно до атласу Рахіпо5 апа ЕгапкКіїп 2001.
Акриловий цемент застосовували для фіксації направляючих канюль. Після імплантації канюлі забезпечували відновлення мишей після операції протягом 7 днів перед здійсненням діалізу.
Протягом перших 5 днів, включаючи день проведення хірургічного втручання, тварини отримували знеболюючі засоби і антибіотики (римадил і Моготох Ргоіопдаїшт). За 24 години до початку мікродіалізних експериментів насос також з'єднували з випускною трубкою з метою запобігання втраті перфузійної рідини із зонда при пропусканні рідини через трубку. Як перфузійний буфер 25 95 фракцію М бичачого альбуміну (бідта) розводили до 0,2 96 штучною
СЕ (асзЕ; у мМ: 147 Масі, 2,7 КС, 1,2 Сасі», 085 МоСіг) в день його застосування і фільтрували через мембрану з розміром пор 0,1 мкм. Фактичну витрату потоку насоса визначали без приєднаного зонда. Пробірки для зразків зважували до і після забору зразків протягом заданого періоду часу і розраховували витрату потоку. Потім насос встановлювали на постійний потік у 1 мкл/хв. Впродовж всього періоду експериментів використовували 120- хвилинний режим забору зразків і збирали 12 зразків (12 год. збору) (фігура 17, що стосується процедури). В кінці експериментів у тварин брали кров, тварин піддавали перфузії і збирали зразки головного мозку. Діалізати, плазму крові і зразки головного мозку зберігали при -80 "С до визначення рівня РКОМ за допомогою ЕГІЗА.
Вимірювання рівнів РЕСМ кожні 2 години протягом 24 годин зображено на фігурі 17. У кожен період часу, за винятком 24 годин після початку збору ді діалізатів, рівні РЕОМ значущо підвищувалися у тварин, оброблених за допомогою тар Ме45, підвищувалися в порівнянні з рівнями у тварин, оброблених за допомогою РВЗ (фігура 18а). Рівні РКОМ залишалися постійними за часом від 4 годин до 16 годин після введення зонда в гіпокамп. Рівень РКОМ в першому діалізаті був підвищений, ймовірно, унаслідок введення зонда в гіпокамп.
Передбачається, що рівні РКОМ знижуються через 2 18 годин/20 годин після введення зонда, ймовірно, унаслідок закупорювання мембрани зонда, оскільки це відбувалося в обох групах (їі раніше спостерігалося в інших двотактних дослідженнях).
За початковий рівень приймали середнє значення ж 5ЕМ від 12 зразків діалізу через 24 години після обробки антитілом або середовищем-носієм для кожної тварини і потім дані від всіх тварин об'єднували (фігура 185). Різницю між даними від тварин, оброблених за допомогою тар Мо45 і РВ5, аналізували за допомогою двовибіркового І-критерію для незалежних вибірок.
Початкові рівні РЕСМ у тварин, оброблених за допомогою тар Ме45, були значно вищими в порівнянні з початковими рівнями у тварин, оброблених за допомогою РВ5 (р«0,001, 210,0, ОРп, 9 Ога 7; 3,320,3 нг/мл, п-10 в порівнянні з 1,1:520,1 нг/мл, п--8) (фігура 185).

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, здатні специфічно зв'язуватися з сортиліном і пригнічувати або знижувати зв'язування РОКМ з сортиліном, вибрані з групи, що складається з антитіл (1)-(21); антитіло (1) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 1; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮО МО: 2; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 3; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 4; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 5; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 6; антитіло (2) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 9; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 10; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 11; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 12; Зо е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 13; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 14; антитіло (3) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 17; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 18; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 19; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 20; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 21; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 22; антитіло (4) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 25; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 26; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 27; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 28; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 29; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 30; антитіло (5) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 33; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 34; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 35; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 36; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 37; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 38; антитіло (6) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 41; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК2, що містить ЗЕО І МО: 42; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 43; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 44; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 45; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 46; бо антитіло (7) містить:
    а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 49; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 50; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 51; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 52;
    е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 53; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОК 3, що містить 5ЕО ІЮ МО: 54; антитіло (8) містить:
    а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 57; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 58;
    с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 59; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 60; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 61; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 62; антитіло (9) містить:
    а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 65;
    р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 66;
    с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 67;
    а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 68;
    е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 69; та
    І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 70; антитіло (10) містить:
    а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 73; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 74; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 75; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 76; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 77; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 78; антитіло (11) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 81; Зо р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 82; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 83; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 84; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 85; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 86; антитіло (12) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 89; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 90; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 91; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКТ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 92;
    е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМК2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 93; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮО МО: 94; антитіло (13) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 97; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 98;
    с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить ЗЕО ІЮО МО: 99; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 100; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 101; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 102; антитіло (14) містить:
    БО а) змінний домен легкого ланцюга І -СОК1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 105;
    р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 106;
    с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 107;
    а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 108;
    е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 109; та
    І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 110; антитіло (15) містить:
    а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 113; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 114; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 115; 60 а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 116;
    е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 117; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 118; антитіло (16) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 121; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 122; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 123; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 124; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОК2, що містить 5ЕО ІО МО: 125; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 126; антитіло (17) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 129; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 130; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 131; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 132; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮО МО: 133; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 134; антитіло (18) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 137; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 138; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить БЕО ІЮ МО: 139; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 140; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 141; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОНВЗ, що містить ЗЕО ІЮ МО: 142; антитіло (19) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 145; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 146; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІО МО: 147; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 148; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 149; та Зо І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 150; антитіло (20) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 153; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 154; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить БЕО ІЮ МО: 155; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 156; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 157; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 158; антитіло (21) містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОМ1, що містить ЗЕО ІЮ МО: 161; р) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОК2, що містить 5ЕО ІЮ МО: 162; с) варіабельний домен легкого ланцюга І -СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 163; а) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМКІ1, що містить 5ЕО ІЮ МО: 164; е) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОМ2, що містить ЗЕО ІЮ МО: 165; та І) варіабельний домен важкого ланцюга Н-СОКЗ, що містить 5ЕО ІЮ МО: 166.
    2. Антитіло за п. 1, де зазначене антитіло додатково містить: антитіло (1) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО МО: 8, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 7; антитіло (2) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 16, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 15; антитіло (3) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 24, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 23; антитіло (4) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 32, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 31; антитіло (5) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 40, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 39; антитіло (6) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 48, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 47; антитіло (7) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 56, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 55;
    антитіло (8) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 64, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 63; антитіло (9) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 72, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 71; антитіло (10) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 80, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 79; антитіло (11) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 88, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 87; антитіло (12) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 96, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 95; антитіло (13) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 104, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 103; антитіло (14) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 112, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 111; антитіло (15) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 120, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 119; антитіло (16) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 128, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 127; антитіло (17) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 136, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 135; антитіло (18) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 144, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 143; антитіло (19) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 152, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 151; антитіло (20) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 160, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 159; антитіло (21) додатково містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 168, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 167.
    З. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за пп. 1-2, де антигензв'язувальний Зо фрагмент вибраний з групи, що складається з Ем-фрагмента (наприклад одноланцюгового Ем або зв'язаного дисульфідним зв'язком Ем); Еабр-подібного фрагмента (наприклад Еар- фрагмента, Бар'-фрагмента або Е(ар)2-фрагмента) і доменного антитіла (наприклад окремого варіабельного домену МН або варіабельного домену МІ).
    4. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло складається з інтактного антитіла.
    5. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло вибрано з групи, що складається з антитіла підтипу Їдс1, Ідс2, дез або Ідссаі.
    6. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент належить до людського, гуманізованого, рекомбінантного або химерного антитіла.
    7. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-6 і фармацевтично прийнятний носій.
    8. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-6 або фармацевтичної композиції за п. 7 в медицині.
    9. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-6 або фармацевтичної композиції за п. 7 при лікуванні захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта.
    10. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-6 або фармацевтичної композиції за п. 7 при виготовленні лікарського препарату для лікування захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОКМ в головному мозку пацієнта.
    11. Спосіб попередження або лікування захворювання, що асоціюється із зниженими рівнями РОРКМ в головному мозку пацієнта, який включає введення ефективної дози антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-6 або фармацевтичної композиції за п. 7.
    12. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за п. 9 або 10 або спосіб за п. 11, де захворювання являє собою лобно-скроневу деменцію (ЕТО); бічний аміотрофічний склероз (АЇ 5) або протеїнопатії ТОР43, як, наприклад, хвороба Альцгеймера (АБ).
    13. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за пп. 9, 10 або 11, де лікування є тривалим і переважно проводиться протягом щонайменше 2 тижнів, як, наприклад, протягом щонайменше 1 місяця або протягом щонайменше б місяців, або протягом щонайменше 1 року.
    14. Набір, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-6 або фармацевтичну композицію за п. 7.
    15. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-6, які були отримані або вироблені в клітинній лінії, такій як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, клітинна лінія комахи, дріжджів або бактерії.
    16. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 15, отримані в клітинній лінії СНО, клітинній лінії НЕК, клітинній лінії ВНК-21, клітинній лінії миші (такій як клітинна лінія мієломи), клітинній лінії фібросаркоми, клітинній лінії РЕК.Сб, клітинній лінії НКВ-11, клітинній лінії САР і клітинній лінії НинН-7 людини. Е ЗБ враанвяуя зклоєзнянатяк. 15. вооовитктльеття КЕ екю «В Зкухувння спдензоуу є німе я хека ї ЗУ нега, БРКЕНУ КЕ НЕ ВКАЄТІКНЯЕ ЗК ХНН С УВА і : ЕК ВЕ, КК ЕМ ВОК. КН Ті 2). кан !
    «В. ВУТКЕ зиххування РОК оренді З веууну арекакк УвК ЯКвав Кадр новвВ Н З укескерікачьима КХ нене паху ях, : Н З візавевінанах мае ЖЕ» : «М Зивжях аедукрановтя Се утниа І 13 дерекрєєва Блек ум ни : Хр жвсрнкях 5 КТ знаю а АЖ: «кока аа оКя Ї ЯУ АБ НЕЕВНувЯл фінк прхкктнння я РОМ Е: З АЖ жест щу Ве В Був нке; хх ВАВ : і нудить півев ПРКТВК В вони КВ : Фіг з. я шк. й ї К 5 в В ОВО ЕЕ їв с й о ХМ вх купу ки шк кинь во ПАК кеВ х. УК КВ КВК КУ ЕЗ х. ЗК МХ М Х Б - НЕБО кет: в вв о вн Кт ннених хх Ка У Я КЕ ох ВИ кн с Же й.
    що . Ки иКу ОО АКА Вк ВЕ і. КУ - Кортні взкенкевнях и: ккдвкови вени лен пе о ЗП З М о пе но о Моя с КОНЕМ сосен яке ннннкн то МНН Ж Ж росу Ку З хх Мих од Як я х. код дно Н КЗ, ку ох Ян УПАК. Кеш се ще жу МК ОН ЕЕВКА КАК яко КО кі Олж ККВ КУКИ Жди ОХ УВООДНи ях ВЗ шо ІМ ох В НК С НК ВК поч ОХ В МЕ о КК В М Му 0 ВУ Ор КО ЕЖХ ЖК МОЮ БО пік. лук др кв. ше хв я ПЕ КОХ я ЕВ КК, хи Хо пи ОК, а пил ех Одко пт ТІК ах п Кен о ви Р ККУ я В С 5 ВЕК; МКК ТЕ. Ж ОКА КК УКХ ху ОО ох ОН М : ЕЕ У ЖК. ЖЕ Б ще ки ОВ Ж ВН ж о Ве С БОЖЕ жо МЕМ Її они и А о нн в НН ши З ВК с ні ним нання, ен нин АК сни ПО СК Вон ми нн НН а нн нн НН, ти пакт х х ій т ра І у МИ 7 шо СЕ ие М НН А НН З НА МНН : лик ля : ї - с 5 й Я у се У ОЗ і; ; ково о сном ЗІ в в вв НД НЕ НИЕЯНЕ НЕ НН ДК НН ЩЕ Но М ВИН : у гі : хх їжа 5 сер и нн они мон нн ЯИ и о ява Демеж і В ПА» ! НЕОБ Б'ЄЗОЮ БОБ оте : Її : ї (Е Н а Ії ї Н і ж шин ше НИК НН ЩЕ ох нин лнннк Но як НАШИ ШИ гомо р ми зво пов мо и о й а а и и Іов о и ово ле и ЗИ ри зу ІН а; МИ АК Аа ни Ме: НИКА НН МИ ке НН НН НИ М МІ і МИ 1 В. звюні І За її МА см КН.
    МИНА кх НИ ЯН - ши нн шин пи нини нин миши ни не ни у ми п чи ума ми чи ши з ш ши ши ши шко ин я й панни НИХ НК ІНН НН НН СН й ши ащши: ши ши шли шо миши жи ни. ши ин ЯН ши й ШИ шишки и шк ШИ: овен вин мана мин нак: ес ов м м иа п вн ма нах КО ЕК ях НИХ ХК М У В З Й ки и ши ши ши Ше НИ ШИ не нн он нн не нн нин и а ни нн у зни нн нн нн Кк шк ши ж я шик ши ЯН о акне: и НИ: НН НН НН МИ пк ЛЕСВО ів вм ! їх Ж БСШЕ о вна ї ІОВ кет. в'язня Н Ффіг.З о жАВ і Дююю | Во | ББОТ НВО БЕ ВН зе пекан нн ЛеНи НЕ КНИЖН ИН ЖИ.
    Я.
    кн о ин: НИ ЕН ЛИН АННА
    ОАЕ свкормуунють ля узуханнні сріг.4 їх і ! і пшенння що Ши шк ж ! й Е Ва г Ї й ї ко Щи х Ж КЕ шк Ї ї й: з . КЕ зо У Е Не Я ї Б ї Кох Ї, І р ї; К Ж ; ! я й й Ї і Еф ран й : ее к Є сн В Р Ж жов : Н : во є З А ї -Щ Хутори тео о тет сях ОКУ і каьньньннтн у лях ї : м В БИ Я : Ковка вен СМ ї рн в КИ і тео вам ак Ада Бовичену НЕК ПАБ ех УМНИЖКВ З дірок заукнтта ЦИВ. Вик пом еВка Кк УЗ кученния зисжеваюхтя пані ВМ Коб рен унехоВНя ВІ мк Я оудежу ВОЗ УК КЗ о ВЗН КТУЮ: ДКУБе ква ктка ЛНВ ЕКЗ УК рен ЯЕ зграя кно захована дню зикиюка». З меч моченов др МКМ фіг. : ве патч : то нрненіч, І : в Найвникх вафбие. ОБ Е А ванн. канж. В. Жозе ово ко ни ИН ІІ ИН БСК хо хо А з и НИ Б сан 0 МЕ ИЙ Как о ши Ин Шк НА он ах шик ши ни НН ж пе скік ни: ДИН НИ ИН НН сн он НН: НН НН НН НН тів ОТ ВИ ТО0О В 1 ШК і т ів В) те З це ' ка ни З нн но Ку нн о ні он нин вн савани ОО ОюЬНВи НЕ ЕЕ за (В : во 1-03 О ТК ло В 0 "во М-ВОВаЯ Р ча не 4 ДИ: он и у нн нн нн с нн тн ні ГО ЩО за Ж 0 Е ОН няя КО 1 За 0 : їі ЩО-ТО НІ зпВ 8,5 ЕМ ' я нн нн нн нн ин і о ДОМ тене ЖщюЮ ща БК Га і кенеє Тс ситно тт
    Фіг.б кине хх ххккіжукюююх ВЕ сенси синте сестенанн дея ї в еВ сквжкя ї Я СУ Алли 3 й ї гне ех ДН Кум дмхх но З сек ї ІЗ ї поту ще й і дання 1 М ї они : Ся з - ши нн ще ІН ре Ве В НК оововВно х : во ї пеня ї ї о ММ НЕ ма їж т ня г БК ОВ: їх ї пове ЩЕ Там св -й ; ке оон вові УЖ товщ Її С т хх : анти ї ї З ххх ОЗ яна В. Коса : МЕМ кн дж ох шини 1 ЯМБ ДИВ ши ши що Бу ен щої сили із ЖЕ ї пен єн ге ї СУ кухжднюких и КОосФкк се ТЕТУ Енюя шо ХО МИ зі шої що т іонннфеннен дк неннн нн ХВ В кода З ЗВ М. ШЕ НН ОХ, ше т. ши ВЕБ сво ЗАХК осврею Х ЕК юки хе знання ОКО ЖК сяк то нн в щк ої оц конк У ОЗ я ХУ он т КВ дом х сн нов вк вової вдо п ки 5 я Ек й шк. Св -й ше сені ч Том п ше он ї ї с . З ідоацек т АК ля. сх ден ож КО ВеНННЯ пок «НЕ вен ек е а В | їв Е | ке | В ї ; х ох сан с сиве ї СЕ СН і : : ; о | то т в ЕЕ о і КОМ З 1 Ж КЛ хненеи що В ЗЕ ЕИЕт ен денн ЯКЕ нини Пот й. М Е | . «В пе щи хв КОД. я ср ВУ, ЗЕМ флиних ої ок пиши ОЖНОЇ їз ще Н кое г. дина т ОВ ОКО КОД Кс НАБУ а Он е кави пої ЗК - їх ко: ЗТ ї ШО ОМ Мф тож Он м " Е ї во ке її ї Б еф ОВО ЗЛИМИ му 5 деки ї ПЕК СКК 7 ва З 7. зе і Кухня що ди кн Ко ДМЕ Кол Я вве: М: появ тик - | са дв ЗІ лини Ковао ВН г М ОКХ ЗЕ у ЕНН Я НЕ ше нн й: й М ПТК У ех нео он ща ОО 5 х ВЕ З | й ну ще я о МК со ВК: вн ее ЖЕ о | п ї Е ї сват в: ЗК Хр Кня ІОВ тя ДЕК М Ї Доном В 1 БАК В Ше М дням во Зк Са а оо я і Денне ІЗ Кк Де К нити как КОКО. сгсиктнн В ЗУ оєкюфнююте ОБОВ ся паї ах в ай х й В ХЕ Сх ї СОНЯ ПТКТЕТотс її Ба Ж ї сх КИ й то Н ОЗ ше --й ше я Її Зх кож ИН ОК «ВКХЕрно АНЯ с тору вве 3 З сени і щи ее кВ по я АН я Бо ОА шу ве то | г х : ї м НЕ я А шо ї Ко ІЗ Зх Я: Я ї ТК / й : Ме СУК нн КО ї нд й вих в ше ак на. ши ше а ге ; вх, : БИК КАМ й їі Піх од їх А НН з ї ке й Шон З УКХ о ПОВ х Е св о дв ше ї ВЕК: не Ї ще шо БУ ВО не : В ; ; і І СЕ З ТЕС Мк МАЕКНе Ж ГО У ін ква їв ДАТЕЕКА кн ї ггегодене 1 що ЗШ мік БУ пеки кВ ЖУ ПА июня р шо м об . її я ї і | Ен ЕВ ща тА том І ОМ СВ дення й рек нов в | то я о ее х ВЕК СА Я ОА КЕ ККТ Кн хв її ОКХ ня НН У З ух Ж м жо І ПТУ с ОКО ше ВІ ї - ве о 3 5 Кс тя т жу МОЖ й ВОІВ Лех дя м ЕЕ ї я її її зі пе два ї ЗА дес Кок ПК з де мих з ВА хни ПОТ Во ; еще Я Х с НК хх КО п ЛК, Її ожоух БОС дж і ем ХХ тр х с 8 ши ї щ. із в ОН Я сх Її ха ЕК З З ке дк мн М паї А : - в Сл ї т С ї ЕК Я вони нин х ї Ка но 3 о їм ях ї. ше К. вх фени ОДН ие Її шах в ста а Но т о т у ХК ЗЕ КОЗУ ом нем МОМ кий кг ук Кт ДБК 1 о пон ная С 3 у пк Койдкої ГОМ ; їж З «КККня УНН У я Го їі ху що ОН НМКнення пениння НИК УМ І ЛЕК ху ЗД НН Аа З олкех НК нн КО Вс ня денних ї ж сек ня тр ї ОБОВ Хо со МЖК ОКХ коню СН ЛКК кіна ке, її зх: уки ПЕ Її хлка вх МН иа хо ОЇ ення а їв днини т тв в Б пед ОМ ДОВ их ЩЕ опе лет М: СУХЕЕК ЕВ їй АК ВАХ, їж МЕ лох ВН мон ОО СК лк ОК НЄ кни: що 1. ще КУКИ дах ЖЖ ов ї жа 3 Холл «ЗДА ос У ване п ОХ сени п МАК сеї ЖЖ сс НИ: ва і Ж ння " НИК КАК с КОН Ен ЗО СЕК хе Не М тння ще А - ша | т Св ша пет ОЗ У Кн ій ї вх ща АКА КАн деко МЕЖА ек ож СКЗ тк комина, толк ЗЕЖТн ний от С ИНОНИНН ОВОожжу ДЕК кни я ОМ ; БВ. Її в оф К КоЯцВ о Ан щит ке Кр НН ОН мк Іа: Кк о ї рт дико ДА Ето паж до Кк ща 1 що ин З вах БАК ї ЩО ДЕК ТЕ Е 1 сжх ор зн ОХ ше їх ща се й Е ще в ВЕ их / и пе Б жей од їв ЗМ діння оЩщО З Ощ ЗНУ де Я ОСИ ї жк 1 МО ХТО ек дн одуу З ЖИ пове в | п. -Яе її її її ї Хееннндннн й хм «ККУ їду СКрееєдетию и ОККО: ЗЕ ко хОЖУ зно ще жи ше ШЕ їх п. тв митну щої ВЖК 5 Уж чі пе т 7 в 1 дах Канон зи: Пеня МОМ нія ВО КО й яки ЕЕ ї (У 3 меня лож ЗМ В хост 3 СЕ кої ох дух ї ам ЗУ зн е М я кос: ге о ЕК подо МОЯ т 5 КУ ІС МАХ ОВУ: СМ це і тав й вне -й ї ки ще Лине й ВОЗ: ТЕЖ хін ше 5 ! з Бяй ше: її Шоу 1 жу Ди сеи З 3 КВ Вова ММК МАЕ ОВ. з шк ІМ пом : ей МОЗКО Кун й В ї ЕОМ оо ННе ув ян Мн МОВА: СОЮ Х ге і манна АЖ з І.О Оп й В ГИ ех з ше : її ак Се с не Та ї се ЕХ нн хосердасї МКМ як уже ВХ КАМ і пе я як ЕВ, Е о С ОМА, шо й. я: ЕЕ ї із жк 3 ЯК нн ОО Ва пе пЯЖК мон в ВЗЯВ НААУ Сн СВ т її шо ши Я ОВО їощва. ов ше ние их а ОК З пт ї ВХ УА нн Кох У Мних 5. І МК нен ХА ЛЖ ї В МОМ й ї в : шн ї І Її ХК нн 1 М: «ММ КК ОН їди її ЛУ ня Іще Е. і я вія ЩЕ КОХ они а і ЩО: «КАЖАН вци с дце ДНЕМ Кос врах ї З ре НІ ЦО: Ме: За я о не Но век ЧИ ОД а Ух ПУЛ ОВЕН | Но жи її ау ООН ПМЖний ши. її Е в вне ВЕ товщ ЗК родждО ви ні: З ОЕМ, ш В в ої ЗХ ї ща: ЗК Ж НО В во вв шин по: ване ї МА ОС о Не - Б НЕ БК ен Мене Я ВЖК ОО ОМ ОВ ен я Я 3 Б: тої СОМЕХенн нен ГЛ ЗОМ вою я в ОА ЕЕ шо сен ЗК КОЖ па ВМ о ших : в Ме КО мив ПВ їосвуда В ос ооавосюнся швш ОО: СКК офннн тя Божа о Коб Енн не вий феоттютння я я й ї В ; В ов п в п Ох,
    ФГ. оесррсреєтктк кві : соестесткскдвоксюєнох ? : пеікеєютіх : й ! і ен що шо м вно ! нщ- не І ши ше ІЕЕ ЗКокя ов ення п ІМЯ ї КЕ їх ВЕ 7 ї- Я ЕК долин Кн Ї В пиекекткююююх ї ї я х Ь 1 КУ їЯ «Ж Кннкнжни х ї ла іо У З ше шк ни . ще ие зм ев» вв сво : В тн енд - ше й | | і є й У Е сво 1 Гоодмюєюєнусє 1 ї ЗАЙ х ВЕД і В ІЗ - ше Е : ще Дикун ІЗ 1 кої МОМ. ск ккккк ї ядек и сша ши я що док пекокасючечндннннсн ння ї їз Доткххаа З ЗВ Е І як го 2 | я ВИН т ї ХХууккнжнякі тн КО З КН ХМК ОКУ кю шо в ї. секкукукюккуккикх ї і: КЗ 3 Зо ся ч 1 У Кут З ж ! зе Б Деу еокжнєткх т ї с. ї З М І: ї5 г І пучки йоія А ві о : пек юви : ще ши ше ШИ 7 їв . мона косе фея ї ї х ї ? сжжюі ї ту г Кук, їх Я ї КИ ники і т у : З яна НО: пед же З Енн век Ж ої шо ши ш . ши
    Кан. ТНЕУ: мое вн 0 ВІ виш Б ши а Б ши Ефектно 3. І ЗХ секкжЖуюк і А фін КІ З шо ! г: ЩІ 1 дя х ГАЛЮ КН ДАК їв тон Ж ння я ащ ЗБЕ і у : и ше з з Ме Її сис до ОО УК 7 ї Зах нічо Фо із ПЕ екрит М т т ва. м с---ве ей : он їв КН ше ви и х з и ж: Іте ї АЕН ї пон ктАтнжнн ї це ї СА ення У 1 в ЩЕ ше її ий о Ва ши еВ в ши по Ти я ще 1 З ско Адкк : вах ня УКХ сивих ДАВЕХ, кожно ок С Кук» дк : я дека кн 11 ОС ее Ко врЕу де й їО0ОщА пере няно в ї пфрккек З КОХ Я ух і СКУ ху ї « Я ЛКК. х а ї Ве ІЗ Уже ю у Ки Че ва ї ке х МОХ ху х ї ХХ ой у пу ок Е їі ся х оо ї У З кун, яку се ІЗ Кк х ХХТКЕЕХКН. ї се ку Ії Сехжнини ї ще 4 | що Хоееюе 1 ВІ фани ї ее х УЖ ккхнкдк Я ї Зх ее х шоп т ВАК ; склкднк я : е в їх | ВЕ В ї ІРІКЕ ї ЕХ и ям во | м во он р тер ТТ Н За я що щ ; ня» | зе ТЕ о : ож еко Е 5 ї ум УК кккн Кк На х Же НН в) щі ІЗ Зоо ї ї у Ц тер щу Я ЯК сн не я ої пе лтннех пе г ОБО ПК М З ї В Сто ОЗ нн ЕН ЖЖ осн ши й зв а ше СН пен ЗУ СОН Її ща поши шкі ЩІ Б Я в ; ке З і ЯК поко хосвюему: Е СІК дна ко хдокк Косова ї / пеш ш КОВКА Ко |З пев З А пекдкчннкнх ї ге вена сх КО шенй р-в- | зе | «й щЕ Е Бе ЩЕ сдехек о ІЗ « ГИ З м одкснвня од, : еК сеефес В. ї ї Її 1 М в ен: ЕеКЕКУ 3 КК дюсюоюсек пак І о я з ад ав в Ж з оо В ЯК: УК укуіния що 1 ОХ нки КК х м . ща. за х печу й х їж со щоь і З у МЕЖ 5 НІ МЕЖ и ІЗ се М От -в ши ши ше ши ше ши ши жу 3 Я: урни в ва МКК кни її печін ої ТАК сс пово ї : З Ви мине ща одннл КК ї ва їі КАК оеднся ше ш- ся ї їЗ Ходлххчлян ї Кук Я "УМ й ї ПК ВЯ сади 5 їй Ще в. ї | бі фунт я: ЖК юних і ад З я йще дів ОВО С Яяхх й 1 їх сх ї Уж 1 СК ї о : жо за -шВ ї ЕЕ Н нання Ж : "Клум пофденну кв Е ще : М. шо й | і ЗЕ й Х : ЗЕД ЗІ Ми: СЯ 3 ЖЕ. доня пд 1 зх МА х З Е МЕ ше ши З ШО ЗШ шо Що Я Я гу Ії скін сх : ЗАКО ккн мк ВАШ Я ї ПАМ З ко летіли нак я ! ї суху ікек ще т ВК нах ї ХНУ УМ ач ік І Дехто з на ! а що Жунхумтучтум 7 ЕХ зо В. Що гу Н З ОВ ОМ: ЩО А окон то щої З КУ і і г Вінн я ї ше То свррех ї ТЕОЕстянтнндтню г ія М пло ах і Я ї ї й ни КО КК кір КК кож ЩО ж но Н Ж ДЕМО КТтя т в Вк Кен ї з 1 ККУ Б Е КУ Не ї дюфиа З лих, не ТЯ т в ! в я піша щі Ї ТМ і, Коов КА ше : ши пи отв ОВ Мк х ІАЕ 3 МА ові нене нини о ЖАН я ЗХоекед ех ї З то А ення ще ОЇ КАН В пиши ОВ «ЖК усе мк ЖК дн ех ШЕ: ВН в | а тов : ЕВ. ща ї МАХ Хоесююкекикя й Ії ак із нн сум їх 5 я ОМ ХолхкАхікхккнн ї х З ї ТОМ ен Я : КЕ Думу к ких ї я ї Коня ЖЖ ук В ? я ще я І Ноя х ККУ ї Вино ї у осв у а : ЯН. аа ще ее ЯКЕ п. Ва ше: тн ше че я . щі : Е х 3 сечею : ра ; г СЕ ; | | | Е ї Дуочечу ММ ї уч ї УМ ою щи : ЕЕ Кене х т в зда зві. : ня: о о Не КО ав ЯК вне Тен кт вилов вн ро і. ШЕ ВЕ Сен ТУЯ ЖЖ сонце У її ва Н кю КО. Б ОСЗОВ зн. ї | М два: жан т ТЕО ї о х : . : е я СЕ ве сви св ек: І ве НЕ ни ши: я у нії ЗУ ДЕ Я одне ї о вуврю 1.2 ши о СКЯКВ есе ання СУА в. | | З т ' шо т ї МОХ ден ? ще З її й но ши Во 0 вн. ну ЩО. шо ВЕ Вр 40 ВО Ох ве що З ї. ЖК КХ ЕЕ у ї ХК кхнчн " : Де ЖЕК м - ї рення ї дих КОМ ЕР тож ІЗ уки ут З с ЗМК АНЯ ов ї комин КО ОКХ нн с ї Доккчееч кі 7 ї Пл Ї : МОВ г нн сок ВЕЖ своя ОО оз в коні З ої Жди шви а ше шшЕ пед ша В ЩО ОМ я ши ешш пе нн ОГО ще БО М.О Ин " Зк 5-х в : З . сь КЗ 5 ї мс НН Й ї З М 3 ХК рлалаААКАААХААНКК КАЖАНИ КАК АЖААКК КАК ЖАХКАЖКИ МАК
    Є. ШІ З НЕОН їде З ХК деУмУ УК ї Я р. АЖ ! ща і пи КО ї «Я У яки ях їх є с. хо М оееииюея й ї БА покрите ї дк | т; с : В і КАХААКААМН КАК ОПО ин екс вон» А я ща. й ВВС Я сні ж ніж ні нн п дк
    Фіг." (продовж.)
    ду у ж или юю кю кю уч их, : УЗ в, М Вк ОО ож ї- дек х УК і ях ї кер: ї ж Ї ши нин ше ин я ОБ Док що іден : : ге ї- ї кг ї зе їх і з: Ж: зо В Б є я ИН: КУ ї 3 ї ї З х За Е її ху В їх ї ї є не і скла Я пнкрвннкю шини ди вуепу ї екихх Ж шк шк шк ес ж ее ж Коен аміни: ВЗ нео ВН два АБЕЕ дае ! дви о ав? З вна (ст пшшок аег я НК ою ШК АБ БЕ АН ов АББУ аБАХ кеВ о: ЗІ НЕ ХВУ п вав і дя Во свв СН: шо Я Тов : СУДИ ї 5 реко ХЕ се о ОЗНА хо арх др о сжеЕх ха шо шив в ню не БЕН НН же Не дн Зх ї ще ї ск жк сх ви у ї тихе ІЗ ке ї кін ї дя : На шк ї з и Еш кое ж я НН а о Е т но т іона і. яй й У тека ТУТ К КМИН ЕЕ и в В НО СВ ел КУ В ї ск мож ко ЗЗОК НН вик З пом НН КЗ ще : шо Ж ж до ЕЗ ; ї Бек у ї су х 3 я Х у ї пр і ЯКО Е ке: гу Я ї ко жіжк т Я у шо ши ші ши ши ї ща хе З маг ВЕ То отюдоух Її УЧИ Х УНН Іа 1 шин ши ши ши шен ЕВ ее КН Я : ; їв Її ва вл зак ог яя о жо жу во: ще СУ ши ши шен шо ши ши а я Її вав її йо вве 0 йде ка о ква вш їо ще їо хаї шо ши ша нших ХЕ ї 3 я ї Хе : ох до Божої мод сх: : док ї я В нн не нн нн Не Ше НН и НН НН Й, а Ї я ї пон ї Ма ї тк як ух ці кни но он п т яку і сх : ї : ОО ї о ї ок, їх У ї кож як есе ЕН НЕ сн о НИ НН МН | СЕКС, Е в Ї де ї а сту В код ї дрож : : пк В о ни й М ке зни ок Мн М ; з а В Не ов ехо зе а І КЗ о я а і : шин ж ши ши ши ши ше ши З З ї Зх ї 3 су А І ж ї МОХ ї Клим ї м ї че їх ї Ж Н ек і о ех не не НН кН ше с їх ї У їх ж ї жк ІЗ су ак х я КЗ ї я : ж ї ж : о ВО пк нн и НН М НН а ВИН о НИ с з ЯН КО в мини І нн нн нн я а ЕК дшждиі Е ї ах і. фу : їх ТоОоожоерх : ж ТКУ ї код : ща КО ск Її те Х ши ше ши ши шини и ши Ь КЕ: ї ХУ ІЗ ЖЖ є УК. ї ТУ. ї Коня ї ОМ з і як, Аж ї и лщк ШУ нн ие нн А НН НН Не НН ЛИ НК К 7 ел с яку т З З а В в КН в в ка у т ДЕК зх х мя : якщо ожих по тари ї шнКк З дво, ї Ся х ї ше ее ж нн: Ме ши: НИ Не о о НН НИ НК у " ї но ну кн оо неза а Я вам проза ча зн а я : ї що ї й наш їх шик шо ВВ КВ Ко ек НМА НИ о В Й НИ НЕ Е : хз НВК о НИ Ко о НВ о и НН СНО ше сф Ко ви о ЧУ КЕ шен в НН ШИ НН НН НИ НО СЕ їх ї чЕ2 вику т Ку ке ї о ни нн и нн оон ОМ ЗНУ
    Ж. : ЗЕВЕЖК Її Ба З пав Її вв вв її вади г ваше Б о дах оз НЕ Е шен нн ше ши ши я 3 А НЕ НЕ ї УЗ ї з кож 3 А Її ДНЕЙ йо нс У ВН НЕ и НН о НН ги ши ж ше а, жк нн шу ОХ у У : х КЗ ї у у Ж х що х В Бе Н ех ї Я ї сх х грот їх пе у - : їн 0 Я ОХ З 5 ї КК ОККО З ЗНИК З З ЯК ЇЇ М Ї З ї о с и ан нн в НН Ко НН НН НН АЛ НН НА НИК АН Фіг (продовж. зе З : і! Н Кк ІЗ : іш ї ! Е : Е : ї сей хе ї Я ї ни ТУ З : за и ї ї т ой : ї ЕЕ КО : вх Б ї М а КО я тож 5 ; дя Ко КО ще є ОВ ї г НУ Ї жа КОЖ щі ик тож в виде ї Ге ка дя ов : и Ов же кож - я ! зве рий н а Код З і НИ Яся й у Б Ще ОК ; ВОК ИН НИЙ і пн а ! нн й і й один ї «ДВ Бокань т К н т АК АА АК КАК ке КИ Кк кн Аикних ке бдв- ке Конекнтвація св зеееептгоооо ооо гот ОТТО РТВ РК АТ УТРАТ садАКюю і ОНА ; Зони тину ВО чно х ОВЕН 5. ЗНАВ ів З і Зав : поминки я Кия се нккі і. 5 У 5 : ТКАНІ Я Зрев чн КОХ : тео скц ПН ун еня ви схожа жк у - : ТОК ж ВКОЗННЯНИЄ КОМЕТ ев ква не ЩІ
    Фіг. 8 пжо ж ша й |: ї ЕХ МН себя ! ЖЕ й ПЕЛЕООООО ВХ я. ТуУВЯ ВХ ЕЕ ОО М: ПППИИНИ ПИТ Е З 5 Ж 158 Я А ж ВО се 5: ВЕ - В їж а оо ВОД 5 вишень щЕ КЗ : ж СНЕННЯ опдооожовосях. БИ ВВ За Нами нн а шою В ННЯ я-- щи ЩІ І ворл/Л ур р ВІ Щ ПН 535 МІН ри НТ В, КЕ ха ЩЕ ши що с бах Мина. ши з м Ж "схо овен НН МНН я З ШЕ «ВН Б ще БОЮ: Бе Бе 8 КЕ в нЄІЇ
    Фіг.а я Кс Ук ЩО ї пово» НК пис; шН ск 3. ОХ Кит КУ зм КД ї: МІК ПИКИТИИИ ІЙ ї Ж. 4 щі ван М: ВО ЕВ ї БО Вони ВХ в 1 1 й кози жи ОО Ви ВН оон їх 5 М ООН В ВОМ осо ннох - - ОБ Ж ПИЛИП КЛІПИ КОЛИ ПИШИ ІВ КВК ва Ж ИН НКИ ВЕЛИ ВВ
    М. - В "В ДИТИ ПИТНЕ поневннвння ен 5 дних ж ня шин Ве еААННОЯ соски Ко аа ПИПИПИПИИИИ ТА ІТИ ИИИ и. КОП ии ППП те Ка В З ІН шевннии Мне Мн ВН Вени ВН З ї тає а нє на З ОО хе зви Б В ьо ЛВ ше її. 5 вк ув ее ше НН НН БО ще ЕК 5 в й ж є як яе є КЗ ни ще Фіг ло : ти і 165 іще що : Депо ооо рок лиж жжжж ж жи ж жи ЖЖ ж жи жк ЖЖ ЖКККАЖ КК КАКККАААККАККК КК КККААККАКККККККККК КККККККААКККККАККККААККККК КК КККККККККККК Фіг їР5С ака ОВ шк -- 2 тв г. дан вн в-во» Каєцроезь о ОБ'Ї щік ТБ нт певне Ка ія зооч ній пенні нн нН ЖКонтцель СБ мак й Автвтіче Ева зви На
    Фіг.12
    Жеерание Ток зе юу СО беж ж 4 о сортах Звваміка З жк зв кг нОвою ше ян в : ме хз Ї зах Ех я - НН Еш: ж КЗ З я і | ; : | З ЕЕ т вки ї шк Еш:
    по. | | І шк що ва, Ї в ж ЕН Ж НО Я ДОВ: жо КНУ Я ень ж ві В в фіг. 1За Король зані чне те ЄС Нива МБ 45 зо сортезліне ДЛоеслішнення єсренньої Її тривалості я -З ак ще т т БК, ї ЕВ я | Б З Е ВЕ З те В соня З В. г З в ся М я ЕЕ Еї Бе а ЩО ї г. р. і Бе з и щі: ВЕЖ І я шин ЧЖежовви: Тржаень фвжоев Твою. Кен: й Н ї з З Фіг з
    ЩО Коврельне зовні зе ГО нив 45 зо сортеіне - Залежність лоза-вівновісь - ТК яке зе Ж | ще 2 а У Як: че ше І в. У Е Ї Е: З і МО їз Ж й я Я «й - В зве о ; лях. В ве ШИ В: І ' и Зб г о бан'же ба жмеже Бізе Фіг 1Зе б Ж дк я з і Ей В ке а з ЕТ Є -- НН І і ак в М ко жов ПК М ОК я с Її М йо ООН я о М МН о: бу ОМ УПЮ КК ОХ. 8 зх МОМ В: ЕЕ ПЕВНО ВВ ОК ВН: А Кожна в че
    Фіг. 14
    Ме КОСУ, р ї з КУ зх й - й щей р дн шк Кк ї а ж- сн, нн ВИНИ сис ших, чех о ще ай се і ж щкощх щи Що я ши ск , ж По ща Ки ща ТУ КУ М ТК УК МУ УМ У УТ ва із що 108, їв ЧЗасіхва хе ТВЕНА я КОВЕКЛІНЯИВЙ СОрТНЖННСА КОДИМА «В кун твезВНий Бі: ее яз Занаюх
    Фіг.15а(1) ТЕМ БАЛА, Зак Ка З ся. Я ЗЕ ї о ї М сне Оу ка Зх ВА 1 На КЕ ЕВ «Час їха ФК не Секвіенеке се КДЕЯКЖНМОН о. КоренвМенАЮ ХР контрольне як що Бе зва
    Фіг.15а (2)
    КИТ ТЕМУ ВТ Ва ни х я С ще нки Ше КО ї гей Вон даючи В А єв, пе ша шен Б ши Еш ї ї МК зак щі їй ЕЕ НЕ НВ Маск «ж боюавів «СОВА у СОХКНННЯЙ СОБІ. « ВН коніопоцнй я ще КЕ, Зваще
    Фіг. ба (3 ее
    Ж І. х й Я лк їй дей Бу я й ї й Ж. вк В ний Щ дконнннниВ г ї Кох я ря чех Б яд о: в ЕК тка з лен Час їхні се оденини я: СОННА У БЕДНННККНХ С. Каренафтвех- «МО кекухьнх БО жи Зрашх
    Фіг. 15а (4 м. ї М За о що : слйдх Кошку : се З : К. іа а Ж Б а з ; - що Зк Є
    ОО. ще : і о ва їз Ка ННЯ НИ . хе й нн Б Часіжя зе Кожні я ЗОРНОМН ВХ у ДоНеЕНННИА роках «ЖЕК кнольних с ще СН Вежа Фіг ба (51 З М х сдж зх ХВ Емо пет ж : й й : я сш 7 Ж и я ВЕ ов ау Най я й с Ох Зк. екс ен їх В нн КУ й Б вої се їв ща Мб вв ае Ба се перех СЗБНАНИЯЬ у СОННИХ . КОреНаВнВАЮ «БВ ветовНЕНей « вк ян жа ї я р
    Фіг.бБа (61
    ББО-5УЗ ЕТКОРІУЄТОЇ ШЕ к - де : п во ТЖо фо, ї з : кв й б ви" з ще Ах 5 : ки є: Не Шк й о й а Ж ЕЕЖЯ ІЗ ЕЕ че ва не Пуднидак ях СУДЕН ох СОДННИЮННИ , СОДЕНЕНЕНЯ «КУ похееренй Фіг15Ь й : Х : УК Шов Ку : ши фр ї ще ш :
    ьх. пе ї КІ Щя і. що Ге Е ВЕ Ей чай НЕ Ж хр екв ан и НН я Фіг156 (21
    В я одесі в : ря я дк в ий й я : ще ї : а Ше жк з - «Й а і: шк й ж" В ї ше нев шк й. до В ЩЕ ШЕ я | фен о нн КК ві іа зва і отоов Звеїхв ЗБЕ КОНУЕВИНУ об КВЧ ех ККД ВА ВАН ою КрТНЕВ МК Фіг 56 (3 ВОЗ ТВОРУ, Яка хх : х З ящо КІ Кох й Б ОО. ш МАКОХ 3 са ї У З я ШЕ Як НІ ДК шо ї- Е ко го че ай я ее | ее З тв зни : І ЕІ : де сш м: ШИ Мак боже М и ях тоди жд МИ ЖЖ, ро ання ві за І Я Ки те аск зафе: борти зе Сорти тав
    Фіг.16ба (1)
    ВТО ТИЛ АНЯ ТОРКО х БЖ | соді і | нн З : дей в: Оса ей Е хо як У ще Ше
    В. Бо
    16. в ЩЯК солити го юкрівт стю о уж нм конт ві їв ії 190 ниві Че вв) зафе» пОрТИНІН еф СОоДТИЛН Кк ТАВІВ
    Фіг.1ба (2)
    БИ УЕОСИ о ше Ко й: ше с т : се я За ит й : Мн ж ї й х. Х ДК як Би не ан З : вся : МК ! го Я м КЗ Ол й ! жи и на з 1 І нНке ВИНО: Часенві зд Бортилін зефе СОртТИпі Є ТАН
    Фіг.1ба (3)
    ВІЧНО ОКО ш й А в, т шк ГУ в : й х пе я-а Її що І я Я ї їх : р х З ПК. Ї ше Ж : во М І я зу: ї Ме а НН о ин . ше кн аа вх а ГЕ НВК ВІКНІ: Часіхва зер СОртипін «ефе Сортилін купа віЮ
    Фіг. 1ба (41 МБО НАЗВУСОВМОКО де ек в Е я ! ш ЗВ ж Я еВ х ре т і дв ї ЗВ. й т : ши ю Щ і Кекс т ЗВ ве: Н ! В і ва їв тва їн-е іа Увеїхва чефне Сортилін ефе Мертипін є таБОВ
    Фіг. ба (5)
    ввт-яа? УУУТКОРоЮ., о ке 4 Є й | ден іш ювт ние : Ше М Кая и ней В Ї й ше Бе ха що й Ж ! що Ех - ГУ в : ах ї жещх ї що та па не їв зе» Сертинів ефе Бортинін кА
    Фіг.16а2 (6)
    ув ДК Рхрка ех НО СЕ я В | щи їх : дане щш рю, понфуннаннннн В Ка 5 их і с Е
    5. : : БУ й Е ке : Е ро с в їй тво Нв: ен чає їх яефек Сорти хафен ДОТИ Кк ЗАВІВ
    Фіг.16бБ С
    Я а Со еувне і РВК ТМ Є УОВЕВНЬТТНО Я К Є | Бе ен ко щ Зоя ге КУ : ї Я ї У з Ж й Іо во Ж : С НК З що ї за : 5 з ж : Я Її : а предме шин в їЕ ва ЗВ ІВ Часїхві шин и нн В
    Фіг.1вЬ (2)
    о а З ут уки : ПО КАК ОХ ж Е о ще : з» дей ї тМх ї ве є Бе ї Кс ЩО с не З : Й Ше: Е | ж п Е Б ех й Шен ге : Коня - кн - ї - ї й са ОО ї : о і г зж Вл шен КЕТІ ТАУ МУ у МУ КУ Кит нккитя Б їя ще ке зве ас ва зе ПОЗИТИВ піде СрОКУВНКНІ Ж ННЯ
    Фіг.1вь (3) Нвсленн, ів че Басженвя ние заоюнантанія навравлинині ши рани как На Ї КАЖУ ФК» ЖЖ ЖК ЖЖ У КУ ЖЖ ХК КИ Ж ТАЛОНИ МКК ЯКА ки ЖК ЖЖ КА Ж ЖЖ жи дю ЖЖ ох пен окттюнн ВИ Я що Ї Знебозювачьні ЖНр зназкії На И ВН ВК ЕВ Нротаєви са кої зн а
    Фіг.17 й. бе Я з Чостікцінтяй віх Во й 1 Щ о явах Ор он не ЖЖ ВК й і ие нене НД ие їв з ОО іх ак ен Ше г і Ва ех соде: -ЗВеЕ я ві шо ва о ОНИ п 2 4 6 а НЕ мч о 0 в часі мо ІОВ ВАВ ХО митну, За ог ВИНИ зеке ГУ СІ ак ВК дев середня ання МК век, хро охрВЯЕН зах В Зорі, деефактоваВи АКА т кастувине аногстерювивх тег ах Ви рерранЕ Фіг ба в. мк ще хх у ря 0 шк Як т ММ 0000 щи І 1 Добен» нення зиениннни остео дини здана сн зах ТНЕ зн Уке Зв жкалка: ібяужвх хк Б же Я год вели нВежени вже середа. вечерею ваБля є поря БЕХ, їх крнкерій Ффіг18Б5
    Еш
    Часбеа З ав гак й хе КУ В Я ПДК Х ї зла поем ІВ БІВ Енн Ж ях | БО ВАВ Ку КВН поз х Не | Іа Пе в ДЕК аХе ПЕВНЕ Е м ВАВ Звях Мк жжо пере х НЕ ЗНІ От Ів понад Б х І | ЗІЗ БАНІ ее ББАЗІВ ПІІ й ТЕ ЗБЯЗВ КН їй КК ТІК х В щі : ЗУБІВ ее та ПЕЖРАЕ піна х Ще | ЗОЗ че 18 ТА пада х За ! УМ Км і ЗБЕ Мас х
    Фіг1ос
UAA201800574A 2015-07-13 2016-07-12 Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну UA125136C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1512215.3A GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-07-13 Agents,uses and methods
PCT/EP2016/066516 WO2017009327A1 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Antibodies that bind to sortilin and inhibit the binding of progranulin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125136C2 true UA125136C2 (uk) 2022-01-19

Family

ID=54013862

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201800574A UA125136C2 (uk) 2015-07-13 2016-07-12 Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну

Country Status (31)

Country Link
US (5) US10428147B2 (uk)
EP (1) EP3322726A1 (uk)
JP (2) JP6979397B2 (uk)
KR (1) KR20180030045A (uk)
CN (3) CN114478774A (uk)
AR (1) AR105335A1 (uk)
AU (1) AU2016292980B2 (uk)
BR (1) BR112018000771A2 (uk)
CA (1) CA2989739A1 (uk)
CL (2) CL2018000092A1 (uk)
CO (1) CO2017012988A2 (uk)
CR (1) CR20180002A (uk)
DO (1) DOP2018000014A (uk)
EA (1) EA201890038A1 (uk)
EC (1) ECSP18002725A (uk)
GB (1) GB201512215D0 (uk)
HK (1) HK1254356A1 (uk)
IL (1) IL256503B (uk)
JO (1) JO3710B1 (uk)
MA (1) MA42440A (uk)
MX (1) MX2018000506A (uk)
NI (1) NI201800007A (uk)
PE (1) PE20181014A1 (uk)
PH (1) PH12018500100A1 (uk)
RU (1) RU2735639C2 (uk)
SV (1) SV2018005613A (uk)
TN (1) TN2017000534A1 (uk)
TW (1) TWI760305B (uk)
UA (1) UA125136C2 (uk)
WO (1) WO2017009327A1 (uk)
ZA (1) ZA201708613B (uk)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3991748A3 (en) 2015-04-07 2022-08-24 Alector LLC Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
WO2016164608A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Alector Llc Methods of screening for sortilin binding antagonists
GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US10894833B2 (en) * 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
LT3618928T (lt) * 2018-07-13 2023-04-11 Alector Llc Anti-sortilino antikūnai ir jų panaudojimo būdai
WO2023247754A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Draupnir Bio Aps Bifunctional molecules that selectively induce degradation of extracellular targets in lysosomes

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5102990A (en) 1989-08-09 1992-04-07 Rhomed Incorporated Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5101990A (en) 1990-03-23 1992-04-07 Continental Pet Technologies, Inc. Stretch blow molded oblong or oval container
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
ATE193301T1 (de) 1993-03-09 2000-06-15 Genzyme Corp Verfahren zur isolierung von proteinen aus milch
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
ES2228467T3 (es) 1999-02-03 2005-04-16 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Particulas terapeuticas de fosfato calcico y metodos de fabricacion y su uso.
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
EP1210372B1 (en) 1999-07-29 2008-01-23 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
TWI313299B (en) 2000-11-30 2009-08-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
IL166244A0 (en) 2001-07-12 2006-01-15 Jefferson Foote Super humanized antibodies
AU2003287930A1 (en) 2002-12-20 2004-07-14 Neuronicon Aps Modulation of activity of neurotrophins
JP5525729B2 (ja) 2005-11-28 2014-06-18 ゲンマブ エー／エス 組換え一価抗体およびその作製方法
WO2008076262A2 (en) 2006-12-15 2008-06-26 Merck & Co., Inc. Receptor for amyloid beta and uses thereof
HUE031611T2 (en) 2006-12-21 2017-07-28 H Lundbeck As Modulation of Pronurotrophin Activity
WO2009097006A2 (en) 2007-08-10 2009-08-06 Medarex, Inc. Hco32 and hco27 and related examples
ES2730972T3 (es) 2008-04-27 2019-11-13 H Lundbeck As Estructura cristalina de sortilina humana y sus usos para identificar ligandos de sortilina
JP2011524741A (ja) 2008-05-27 2011-09-08 協和発酵キリン株式会社 インターロイキン１０受容体（ｉｌ−１０ｒ）抗体及び使用方法
US20120039865A1 (en) 2008-08-19 2012-02-16 Yale University Identification of sortilin as a neuronal receptor for the frontotemporal dementia protein, progranulin
CN102439041B (zh) * 2008-12-19 2016-05-04 H.隆德贝克有限公司 用于治疗精神和行为障碍的对Vps10p-结构域受体家族的调节
RU2536232C2 (ru) * 2011-07-01 2014-12-20 Олег Ильич Эпштейн Лекарственное средство для лечения болезни альцгеймера и способ лечения болезни альцгеймера
JP6239635B2 (ja) 2012-11-02 2017-11-29 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． 血管石灰化の誘導因子であるソルチリン１
EP3991748A3 (en) 2015-04-07 2022-08-24 Alector LLC Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US10894833B2 (en) 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
LT3618928T (lt) 2018-07-13 2023-04-11 Alector Llc Anti-sortilino antikūnai ir jų panaudojimo būdai

Also Published As

Publication number Publication date
IL256503A (en) 2018-02-28
CA2989739A1 (en) 2017-01-19
US20170267761A1 (en) 2017-09-21
RU2018100824A3 (uk) 2020-01-17
WO2017009327A1 (en) 2017-01-19
RU2018100824A (ru) 2019-08-13
RU2735639C2 (ru) 2020-11-05
US20200190188A1 (en) 2020-06-18
CO2017012988A2 (es) 2018-05-21
AR105335A1 (es) 2017-09-27
JP6979397B2 (ja) 2021-12-15
CN114478775A (zh) 2022-05-13
EP3322726A1 (en) 2018-05-23
KR20180030045A (ko) 2018-03-21
TWI760305B (zh) 2022-04-11
US20230159643A1 (en) 2023-05-25
US20210269524A1 (en) 2021-09-02
AU2016292980B2 (en) 2022-10-06
TN2017000534A1 (en) 2019-04-12
CL2020002468A1 (es) 2021-01-29
US10479835B2 (en) 2019-11-19
PH12018500100A1 (en) 2018-07-30
CN114478774A (zh) 2022-05-13
ZA201708613B (en) 2021-03-31
PE20181014A1 (es) 2018-06-26
JP2022003058A (ja) 2022-01-11
HK1254356A1 (zh) 2019-07-19
CR20180002A (es) 2018-04-09
CL2018000092A1 (es) 2018-07-06
JP2018529635A (ja) 2018-10-11
AU2016292980A1 (en) 2018-01-18
JO3710B1 (ar) 2021-01-31
GB201512215D0 (en) 2015-08-19
US11548950B2 (en) 2023-01-10
ECSP18002725A (es) 2018-03-31
US10428147B2 (en) 2019-10-01
CN107849135A (zh) 2018-03-27
US20180305455A1 (en) 2018-10-25
MA42440A (fr) 2018-05-23
SV2018005613A (es) 2018-02-23
NI201800007A (es) 2018-10-18
MX2018000506A (es) 2018-05-11
EA201890038A1 (ru) 2018-06-29
IL256503B (en) 2022-02-01
BR112018000771A2 (pt) 2018-09-25
DOP2018000014A (es) 2018-04-15
US10889650B2 (en) 2021-01-12
TW201702273A (zh) 2017-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102596852B1 (ko) 항-프로/잠재성-미오스타틴 항체 및 그의 용도
UA125136C2 (uk) Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну
RU2693430C2 (ru) Антитела к компоненту комплемента с5
JP6518199B2 (ja) Ｍｉｃａおよびｍｉｃｂタンパク質に対する抗体
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
UA126657C2 (uk) ОДНОЛАНЦЮГОВА КОНСТРУКЦІЯ АНТИТІЛА ДО BCMA І CD3<font face="Symbol">e</font>
UA123862C2 (uk) Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування
US9663586B2 (en) Anti-SOD1 antibodies and uses thereof
TW200936160A (en) Monoclonal antibodies that bind to anexelekto and uses thereof
CN105121468A (zh) 用于cdh19和cd3的抗体构建体
EA010726B1 (ru) Агенты, специфически связывающие ангиопоэтин-2
KR20130028050A (ko) 유방암을 치료하는 방법
CN106459210A (zh) 用于治疗糖尿病黄斑性水肿的组合物和方法
WO2018073648A1 (en) Antibodies to mica and micb proteins
KR20190085935A (ko) 항-dkk-1 항체를 사용하여 암을 치료하기 위한 바이오마커로서의 베타-카테닌의 용도
BR112013012858B1 (pt) Anticorpo monoclonal que se liga a pectinacetilesterase de notum, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira e método para produzir o dito anticorpo
WO2018109058A9 (en) Agents, uses and methods
KR20200031610A (ko) 치료를 위한 제제, 용도 및 방법
CN107207585B (zh) 补体组分c5抗体
CN103930128A (zh) 组成型活性uPAR变体及其在抑制性抗体的生成与分离中的应用
AU2015201676A1 (en) Anti-C5a antibodies and methods for using the antibodies
EP4249509A1 (en) Anti-netrin-1 antibody against arthritis-associated pain
KR20190001538A (ko) Mic-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
UA113308C2 (uk) St2-антигензв'язувальний білок
UA105397C2 (uk) Терапевтичний dll4-зв'язувальний білок