JPWO2009063965A1 - Ａｎｅｘｅｌｅｋｔｏに結合するモノクローナル抗体、およびその利用 - Google Patents

Abstract

本発明者は、特定の機能を有する抗AXL抗体を取得することに成功した。さらに該抗体が血管新生抑制作用および抗癌作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の抗AXL抗体は、血管新生阻害剤、および、リン酸化活性を誘導もしくは阻害するための薬剤として有用である。

Description

Anexelektoに結合するモノクローナル抗体、および該抗体を有効成分とする薬剤、並びに該抗体を利用する方法に関する。

Anexelekto（AXL、UFO、ARKまたはTYRO7とも称される。以下、AXLという。）は、その高発現によってマウスNIH3T3細胞を形質転換しうる慢性骨髄性白血病患者由来のオンコジーンとしてクローン化された（非特許文献１・２）。AXLタンパクは140 kDaの受容体チロシンキナーゼであり（非特許文献３）、リガンドであるGas6（growth arrest specific gene 6）の結合後生じる自身のリン酸化を通じて、下流分子へのシグナル伝達を担っているといわれている（非特許文献４）。Gas6をリガンドとする受容体チロシンキナーゼには、AXLの他SkyならびにMerといった受容体チロシンキナーゼが知られている（非特許文献５）。

AXLの分子機能としては、細胞増殖促進・アポトーシス抑制・細胞遊走・細胞接着への寄与が示唆されている。これら機能推定の根拠となった実験事実は、Gas6タンパク処理を施した細胞に生じる現象である。現在までに、ラット血管平滑筋の細胞死抑制ならびに増殖亢進（非特許文献６・７）、マウスNIH3T3細胞の血清飢餓後の細胞増殖亢進ならびに細胞死抑制（非特許文献８・９）、マウス心臓繊維芽細胞の増殖促進（非特許文献１０）、ヒト前立腺癌由来細胞の増殖促進（非特許文献１１）、ヒト胃癌由来細胞の増殖促進・細胞浸潤促進・細胞死抑制（非特許文献１２）、ヒトおよびラット血管平滑筋細胞の細胞遊走能亢進（非特許文献１３）、マウス神経細胞の細胞遊走能亢進（非特許文献１４）、マウスAXL高発現細胞の細胞凝集（非特許文献１５）といった実験結果が報告されている。

同様にGas6処理後の細胞内シグナル分子解析によって、PI3K-AktパスウェイならびにMAPKパスウェイがAXLを介したシグナル伝達の下流パスウェイとして機能しているといわれている（非特許文献５）。これら下流パスウェイに対する直接的分子間相互作用の存在を確認する実験として、AXLの細胞内領域をbaitとしたYeast two-hybrid法を用いた解析が行われ、GrbB2/PI3K/p55γ/SOCS-1/NcK2/RanBP2/C1-TENといった分子群が同定されている（非特許文献１６）。これらタンパクとの相互作用は、AXLシグナル下流における上記細胞内シグナル伝達パスウェイの存在を示唆するとともに、AXLの想定分子機能である細胞増殖促進・アポトーシス抑制・細胞遊走・細胞接着への関与を支持している。加えて、AXLはIL-15によるマウス繊維芽細胞のTNFα誘導細胞死抑制時に高発現している遺伝子としても同定されており、AXLの発現抑制によるTNFα誘導細胞死抑制の解除、IL-15処理によるIL-15受容体およびAXLのリン酸化亢進といった実験事実から、IL-15受容体との共役を介したシグナル伝達の存在も示唆されている（非特許文献１７）。

AXLのdominant negative体を過剰発現したヒトグリオーマ株では、Gas6によるAXLのリン酸化が抑制され、ヌードマウスでの造腫瘍性が消失するとの報告がある（非特許文献１８）。しかし、抗AXL抗体でリン酸化を阻害するものが存在するか否かについては、報告も示唆もされておらず不明であった。

AXLは１回膜貫通型の受容体チロシンキナーゼであり、細胞外領域は、N末側から、２つのImmunogrobulin like domain（それぞれIgD1、IgD2という）と2つのFibronectin type III domain(それぞれFND1、FND2という)で構成されている（非特許文献１９）。FNDは、細胞間接着に関与するNeural cell adhesion molecule やnephrin等の分子で発現していることが知られているが、AXL におけるFND の機能に関する詳細は不明である(非特許文献２０)。

本来の細胞形質転換能を保持するオンコジーンとして同定されたAXLについては、癌化関連分子としての解析対象となっており、多くの発現解析がタンパク・mRNA量レベルで報告されている。ヒト癌組織もしくはヒト癌細胞における発現確認事例として、肺癌（非特許文献２１）・乳癌（非特許文献２２）卵巣癌（非特許文献２３）・甲状腺癌（非特許文献２４）・メラノーマ（非特許文献２４）・腎癌（非特許文献２５）・胃癌（非特許文献１２）・グリオーマ（非特許文献２６）といった癌種において、AXLタンパクの高発現が確認されており、食道癌（非特許文献２７）・大腸癌（非特許文献２８）・急性骨髄性白血病（非特許文献２９）における高レベルのAXL mRNAの存在から、AXLタンパクの高発現が示唆されている。上記事実に加えて、HUVEC細胞におけるRNAi によるAXL発現抑制を介した管腔形成阻害（非特許文献３０）、恒常的AXL発現抑制によるヒト乳癌由来細胞のマウス内腫瘍形成能低下（非特許文献３０）、恒常的ドミナントネガティブ変異体高発現によるヒトグリオーマ細胞のマウス内腫瘍形成能低下（非特許文献２６）が報告されており、腫瘍増殖におけるAXLの分子機能関与が強く示唆されている。

AXLの細胞外領域に対するポリクローナル抗体が高浸潤性乳癌細胞系の遊走抑制作用を有することが報告されている（特許文献１）。しかし、非臨床試験で癌細胞遊走抑制作用を示す薬物が必ずしも抗腫瘍活性を示すとは限らないことが知られている。例えば、Matrix metalloproteinase (以下、MMPという)は、腫瘍の浸潤、遊走を促進することが知られていることから、MMPの酵素活性を阻害する種々のMatrix metalloproteinase inhibitorが、抗癌剤の候補として注目され、Batimastat, Marimastat, Prinomastatなど様々な薬剤が治験入りした。しかし、臨床で抗腫瘍効果は認められなかった（非特許文献３１）。

したがって、特にin vivoで抗AXL抗体が抗腫瘍効果を有するか否か、あるいは抗AXL抗体が血管新生抑制作用を有するか否か、又、抗AXL抗体が癌抑制作用を有するか否かについては、報告も示唆もされておらず不明であった。

WO2004/008147 Liuら Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:1952-6. Janssenら Oncogene 1991; 6:2113-20. O'Bryanら Mol Cell Biol 1991;11:5016-31. Varnumら Nature 1995; 373:623-626. Hafiziら FEBS J 2006; 273:5231-5244 Nakanoら FEBS Lett 1996;387:78-80. Nakanoら J Biol Chem 1995;270:5702-5. Goruppiら Mol Cell Biol 1997;17:4442-53. Bellostaら Oncogene 1997;15:2387-97. Stenhoffら Biochem Biophys Res Commun 2004;319:871-8. Sainaghiら J Cell Physiol 2005;204:36-44. Sawabuら Mol Carcinog 2007;46:155-164 Fridellら J Biol Chem 1998;273:7123-6 Allenら Mol Cell Biol 2002;22:599-613. McCloskeyら J Biol Chem 1997; 272:23285-91. Hafiziら Biochem Biophys Res Commun 2002;299:793-800. Budagianら Embo J 2005;24:4260-70. VajkoczyPら Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 5799-804. O’Bryanら Mol Cell Biol 1991;11:5016-31. Yamagataら Curr. Opin. Cell Biol 2003; 15:621-632. Shiehら Neoplasia 2005;7:1058-1064 Mericら Clin Cancer Res 2002;8:361-367 Sunら Oncology 2004;66:450-457 Itoら Thyroid 2002;12:971-975 Chungら DNA Cell Biol 2003;22:533-540 Vajkoczyら Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:5799-804 Nemotoら Pathobiology 1997;65:195-203 Cravenら Int J Cancer 1995; 60:791-797 Neubauerら Blood 1994;84:1931-1941 Hollandら Cancer Res 2005;65:9294-9303 Pavlakiら Cancer Metastasis Rev. 2003;22:177-203

本発明は抗AXL抗体とその用途を提供することを課題とする。より詳細には、抗AXL抗体を用いて血管新生を阻害する方法、細胞の増殖を抑制する方法、AXLの機能を阻害する方法、AXLの機能を亢進する方法およびAXLの発現量を低下させる方法を提供することを目的とする。さらに新規な作用を有する抗AXL抗体を提供することを目的とする。

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、特定の機能を有する抗AXL抗体を取得することに成功し、さらに該抗体が血管新生抑制作用および抗癌作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下の（１）から（５６）の発明を包含する。

（１） AXLに結合するモノクローナル抗体。
（２） 細胞増殖抑制活性を有することを特徴とする（１）に記載の抗体。
（３） 癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする（１）に記載の抗体。
（４） FND1に結合する（１）から（３）いずれかに記載の抗体。
（５） FND1全部または少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として作製した抗体。
（６） AXLに対してアゴニスト活性を有することを特徴とする（１）から（５）いずれかに記載の抗体。
（７） AXLに対してアンタゴニスト活性を有することを特徴とする（１）から（５）いずれかに記載の抗体。
（８） AXLを発現する細胞にAXLリガンドと共に接触させると、AXL内にリン酸化チロシンが検出されない抗体を選抜することによって得られる、（７）に記載の抗体。
（９） AXLの発現量を低下させる活性を有することを特徴とする（１）から（８）いずれかに記載の抗体。
（１０） 血管新生阻害活性を有することを特徴とする（１）から（９）いずれかに記載の抗体。
（１１） 以下の(a)〜(j)いずれかに記載の抗体；
(a)受託番号FERM BP-10858として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax285)、
(b)受託番号FERM BP-10859として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax292)、
(c)受託番号FERM BP-10853として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax223)、
(d)受託番号FERM BP-10852として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax96)、
(e)受託番号FERM BP-10856として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax258)、
(f)受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax284)、
(g)受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax7)、
(h)受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax51)、
(i)受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax225)、
(j)受託番号FERM BP-10855として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax232)。
（１２） （１１）に記載のいずれかの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
（１３） （１１）に記載のいずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体。
（１４） 重鎖CDR１，２，３の配列が配列番号４，５，６である抗体。
（１５） （１４）の抗体の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲを有する抗体であって、（１４）に記載の抗体と機能的に同等な抗体。
（１６） 軽鎖CDR１，２，３の配列が配列番号８，９，１０である抗体。
（１７） （１６）の抗体の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲを有する抗体であって、（１６）に記載の抗体と機能的に同等な抗体。
（１８） キメラ抗体である（１３）〜（１７）いずれかに記載の抗体。
（１９） ヒト化抗体である（１３）〜（１７）いずれかに記載の抗体。
（２０） 以下の(a)〜(j)いずれかに記載のハイブリドーマ；
(a)受託番号FERM BP-10858として寄託されたハイブリドーマ (Ax285)、
(b)受託番号FERM BP-10859として寄託されたハイブリドーマ (Ax292)、
(c)受託番号FERM BP-10853として寄託されたハイブリドーマ (Ax223)、
(d)受託番号FERM BP-10852として寄託されたハイブリドーマ (Ax96)、
(e)受託番号FERM BP-10856として寄託されたハイブリドーマ (Ax258)、
(f)受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマ (Ax284)、
(g)受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマ (Ax7)、
(h)受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマ (Ax51)、
(i)受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマ (Ax225)、
(j)受託番号FERM BP-10855として寄託されたハイブリドーマ (Ax232)。
（２１） 抗AXL抗体を有効成分とする血管新生阻害剤。
（２２） 抗体が（１）〜（１９）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする（２１）記載の血管新生阻害剤。
（２３） 抗AXL抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
（２４） 細胞が癌細胞である（２３）に記載の抑制剤。
（２５） 抗体が（１）〜（１９）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする（２３）に記載の抑制剤。
（２６） 抗AXL抗体がFND1に結合する抗体である（２３）に記載の抑制剤。
（２７） IgD2に結合しリン酸化活性阻害作用を有する抗体を有効成分とする（２３）に記載の抑制剤。
（２８） 抗AXL抗体を有効成分とするAXLのリン酸化活性誘導剤。
（２９） 抗AXL抗体がIgDに結合する抗体である（２８）に記載の誘導剤。
（３０） 抗体が（６）に記載の抗体であることを特徴とする（２８）に記載の誘導剤。
（３１） 抗AXL抗体を有効成分とするAXLのリン酸化活性阻害剤。
（３２） 抗AXL抗体がIgD2に結合する抗体である（３１）に記載の阻害剤。
（３３） 抗体が（７）又は（８）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする（３１）に記載の阻害剤。
（３４） 抗AXL抗体を有効成分とするAXL発現量低下剤。
（３５） 抗AXL抗体がFND1に結合する抗体である（３４）に記載の発現量低下剤。
（３６） 抗体が（９）に記載の抗体であることを特徴とする（３４）に記載の発現量低下剤。
（３７） 抗AXL抗体を用いてAXLのリン酸化を誘導する方法。
（３８） 抗AXL抗体を用いてAXLの発現量を低下させる方法。
（３９） 抗AXL抗体を用いてAXLのリン酸化を阻害する方法。
（４０） 抗AXL抗体を有効成分とする抗癌剤。
（４１） 抗体が（１）〜（１９）いずれかに記載の抗体であることを特徴とする（４０）に記載の抗癌剤。
（４２） IgD2に結合しリン酸化活性阻害作用を有する抗体を有効成分とする（４０）に記載の抗癌剤。
（４３） 癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である（４０）の抗癌剤。
（４４） 癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である（４２）の抗癌剤。
（４５） 癌が膵臓腺癌または乳癌である（４３）の抗癌剤。
（４６） AXLのリン酸化阻害作用を有することを特徴とする（１）に記載の抗体。
（４７） 抗AXL抗体を用いて血管新生を阻害する方法。
（４８） 血管新生阻害剤を製造するための抗AXL抗体の使用方法。
（４９） 抗AXL抗体を用いて細胞の増殖を抑制する方法。
（５０） 抗AXL抗体を用いて癌の治療及び／又は予防をする方法。
（５１） 細胞増殖抑制剤を製造する為の抗AXL抗体の使用方法。
（５２） 抗癌剤の製造の為の抗AXL抗体の使用方法。
（５３） リン酸化誘導剤を製造する為の抗AXL抗体の使用方法。
（５４） リン酸化阻害剤の製造の為の抗AXL抗体の使用方法。
（５５） AXL発現量低下剤の製造の為の抗AXL抗体の使用方法。
（５６） 次の工程を含む抗ＡＸＬ特異抗体の製造方法；
（ａ）FND1全部または少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを非ヒト動物に免疫する工程、および
（ｂ）（ａ）の非ヒト動物から抗体を回収するか、または抗体産生細胞を回収して該抗体産生細胞が産生する抗体を回収する工程。

本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax292)による癌細胞内AXLリン酸化誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLのキナーゼドメインのリン酸化を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax258) による癌細胞内AXLリン酸化誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLのキナーゼドメインのリン酸化を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax285) による癌細胞内AXLリン酸化誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLのキナーゼドメインのリン酸化を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax223) による癌細胞内AXLリン酸化誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLのキナーゼドメインのリン酸化を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax96) による癌細胞内AXLリン酸化誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLのキナーゼドメインのリン酸化を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax51) による細胞内のリガンド依存的リン酸化阻害活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLのキナーゼドメインのリガンド依存的なリン酸化を阻害することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax7) による細胞内のリガンド依存的リン酸化阻害活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLのキナーゼドメインのリガンド依存的なリン酸化を阻害することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax292) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax284) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax285) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax223) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax7) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax225) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax96) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax258) による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体(Ax232, Ax292, Ax285, Ax284) によるin vitro血管新生阻害活性の評価実験の結果を示す図および写真である。該抗体は、in vitro血管新生阻害活性を有することが示された。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体（Ax223, Ax285, Ax96, Ax292, Ax258, Ax7, Ax51, Ax284, Ax225）のヒト膵臓腺癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定結果を示す図である。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体（Ax223, Ax285, Ax96, Ax292, Ax258, Ax7, Ax51, Ax284, Ax225）のヒト膵臓腺癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定結果（2）と、各抗体の結合ドメイン、各抗体のリン酸化阻害活性をまとめた表である。 本発明の抗AXLモノクローナル抗体（Ax225）のヒト乳癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定結果を示す図である。

[発明を実施するための最良の形態]
本発明によって、新規な抗AXL抗体が提供される。さらに、本発明によって抗AXL抗体の新規な用途が提供される。

本発明の抗AXL抗体はAXLに結合する限り特に限定されず、その由来（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、等）、種類(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体)、形状（改変抗体、修飾抗体、抗体断片、低分子化抗体、等）等を問わない。本発明の抗AXL抗体は特に限定されないが、Anexelektoに特異的に結合することが好ましく、又、モノクローナル抗体であることが好ましい。

又、本発明の抗AXL抗体は細胞増殖抑制活性を有していることが好ましい。

本発明の抗AXL抗体の好ましい態様の一つとして、FND1に結合する抗AXL抗体を挙げることができる。
後述の実施例で明らかなように、特にFND1に結合する抗体は他の抗体に比べて、in vivoにおいて顕著に高い抗腫瘍活性を有することが明らかになった。
抗AXL抗体とFND1の結合活性は、当業者に公知の方法で評価することができ、例えば、以下の方法により行うことが可能である。FND1を電気泳動し抗AXL抗体とウェスタンブロットすることにより、抗AXL抗体とFND1の結合活性を確認する。

又、本発明の抗AXL抗体の好ましい態様の一つとして、AXLに対してアゴニスト活性を有する抗AXL抗体を挙げることができる。AXLに対してアゴニスト活性を有する抗AXL抗体とは、抗AXL抗体がAXLに結合した際に、AXLを介したリン酸化、特にチロシンのリン酸化反応が誘導されることをいう。アゴニスト活性を有する抗AXL抗体によってリン酸化反応が誘導される対象は特に限定されないが、例としてAXLの自己リン酸化を挙げることができる。

抗AXL抗体がアゴニスト活性を有するか否かは当業者に公知の方法により行なうことができ、例えば、以下の方法により行なうことが可能である。AXLを発現する細胞（例えば、Calu-1、MDA-MB-231、DU-145など）に被検抗AXL抗体を接触させ、その後細胞からAXLを抽出する。抗リン酸化チロシン抗体を用いて抽出されたAXL内のチロシンがリン酸化されていることを確認する。より具体的には実施例に記載の方法で抗AXL抗体がアゴニスト活性を有するか否かを確認することが可能である。

アゴニスト活性を有する抗AXL抗体の例として、例えば、以下の(a)から(g)の抗体を挙げることができる。
(a) 受託番号FERM BP-10858として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax285)
(b) 受託番号FERM BP-10852として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax96)
(c) 受託番号FERM BP-10856として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax258)
(d) 受託番号FERM BP-10859として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax292)
(e) 受託番号FERM BP-10853として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax223)
(f) (a)から(e)いずれかの抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体
(g) (a)から(e)いずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体

上述の抗体と同じエピトープを認識する抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。

被検抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたAXLタンパク質を、候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、上述の抗AXL抗体が添加される。ウェル中のAXLタンパク質に結合した上述の抗AXL抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被検抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被検抗体の親和性が大きくなればなる程、上述の抗AXL抗体のAXLタンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、被検抗体のAXLタンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。

ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。

更に被検抗体が上述の抗AXL抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合した抗体の量を、その抗体の定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体の量を測定することができる。

候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも20-50％、さらに好ましくは少なくとも50％、抗AXL抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は上述の抗AXL抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。

ある抗体と同一のCDR配列を有する抗体を得るためのCDR配列の決定は当業者に公知の方法により行なうことができる。例えば、抗体の全長アミノ酸配列または可変領域のアミノ酸配列を決定し、決定されたアミノ酸配列をKabatらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983）にあてはめて、相同性を調べることによりCDR配列を決定することが可能である。フレームワーク中の番号およびCDR配列中の番号はKabatの規定（Kabat, E. A.ら、US Dept. Health and Human Services, US Goverment Printing Offices, 1991)により決定することが可能である。

抗体の全長アミノ酸配列または可変領域のアミノ酸配列は当業者に公知の方法により決定することが可能である。

ある抗体と同一のCDR配列を有する抗体は、抗体中に６つ存在するCDRのうち少なくとも１つのCDRにおいて同一の配列を有していればよいが、好ましくは重鎖に存在する３つのCDR全てにおいて同一の配列を有する抗体または軽鎖に存在する３つのCDR全てにおいて同一の配列を有する抗体であり、さらに好ましくは抗体中に存在する６つのCDR全てにおいて同一の配列を有する抗体である。

ある抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体には、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。キメラ抗体およびヒト化抗体については後述のとおりである。

本発明の抗AXL抗体の好ましい他の態様として、AXLに対してアンタゴニスト活性を有する抗AXL抗体を挙げることができる。AXLに対してアンタゴニスト活性を有する抗AXL抗体とは、AXLリガンド（例えば、Gas6など）のAXLへの結合により誘導されるAXLを介したリン酸化反応、特にチロシンリン酸化反応を阻害する活性を有する抗体である。リン酸化反応の阻害は、AXLリガンドとAXLの結合を阻害することにより行われてもよいし、他の方法により行われてもよい。アンタゴニスト活性を有する抗AXL抗体によってリン酸化反応が阻害される対象は特に限定されないが、例としてAXLの自己リン酸化を挙げることができる。

抗AXL抗体がアンタゴニスト活性を有するか否かは当業者に公知の方法により行なうことができ、例えば、以下の方法により行なうことが可能である。AXLを発現する細胞（例えば、Calu-1、MDA-MB-231、DU-145など）にAXLリガンドと伴に被検抗体を接触させ、その後細胞からAXLを抽出する。抗リン酸化チロシン抗体を用いて抽出されたAXL内にリン酸化チロシンが検出されないことを確認する。より具体的には実施例に記載の方法で抗AXL抗体がアンタゴニスト活性を有するか否かを確認することが可能である。

アンタゴニスト活性を有する抗AXL抗体の例として、例えば、以下の(a)から(d)の抗体を挙げることができる。
(a) 受託番号FERM BP-10850として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax7)
(b) 受託番号FERM BP-10851として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax51)
(c) (a)から(b)の抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体
(d) (a)から(c)いずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体

同じエピトープを認識する抗体の取得および同一のCDR配列を有する抗体の取得は上述の方法により行なうことができる。
アンタゴニスト活性を有する抗体は血管新生阻害や細胞増殖抑制などに有用である。

本発明の抗体の好ましい他の態様として、AXLの発現量を低下させる活性を有する抗体を挙げることができる。本発明においてAXLの発現量を低下させるとは、AXLの分解などにより既に存在しているAXLの量を減少させてもよいし、AXLの発現を抑制することにより新たに発現するAXLの量を減少させてもよい。AXLの発現量が低下したか否かは当業者に公知の方法により確認することが可能であり、例えば、以下の方法により行なうことが可能である。AXLを発現する細胞（例えば、Calu-1、MDA-MB-231、DU-145など）に被検抗AXL抗体を接触させ、その後、細胞内に存在するAXLの量を免疫ブロッティングなどにより検出する。被検抗体を接触させた場合に検出されたAXLの量と被検抗体を接触させない場合に検出されたAXLの量を比較する。より具体的には実施例記載の方法により確認することが可能である。

AXLの発現量を低下させる活性を有する抗AXL抗体の例として、例えば、以下の(a)から(ｊ)の抗体を挙げることができる。
(a) 受託番号FERM BP-10858として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax285)
(b) 受託番号FERM BP-10852として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax96)
(c) 受託番号FERM BP-10856として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax258)
(d) 受託番号FERM BP-10850として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax 7)
(e) 受託番号FERM BP-10859として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax292)
(f) 受託番号FERM BP-10853として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax 223)
(g) 受託番号FERM BP-10854として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax225)
(h) 受託番号FERM BP-10857として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax284)
(i) (a)から(h)の抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体
(j) (a)から(i)いずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体

同じエピトープを認識する抗体の取得および同一のCDR配列を有する抗体の取得は上述の方法により行なうことができる。
AXLの発現量を低下させる活性を有する抗体は血管新生阻害や細胞増殖抑制などに有用である。

本発明の抗体の好ましい他の態様の一つとして、血管新生阻害作用を有する抗体を挙げることができる。本発明において血管新生阻害作用は血管の新生が阻害される限り特に限定されないが、例えば、血管内皮細胞の遊走活性の阻害作用、血管内皮細胞のアポトーシス誘導作用、血管内皮細胞の血管形態形成の阻害作用などを挙げることができる。血管新生阻害作用を有する抗体の好ましい例として、腫瘍組織において血管新生阻害作用を有する抗体を挙げることができる。腫瘍組織は特に限定されないが、例えば、膵臓癌組織（膵臓腺癌組織など）、胃癌組織、肺癌組織（小細胞肺癌、非小細胞肺癌組織など）、骨肉腫組織、大腸癌組織、前立腺癌組織、メラノーマ組織、子宮内膜癌組織、卵巣癌組織、子宮平滑筋腫組織、甲状腺癌組織、幹細胞癌組織、乳癌組織、膀胱癌組織、腎臓癌組織、グリオーマ組織、神経芽腫組織、食道癌組織などを挙げることができる。さらに好ましくは、グリオーマ組織、胃癌組織、子宮内膜癌組織、非小細胞肺癌組織、膵臓腺癌組織、乳癌組織を挙げることができる。特に好ましくは、膵臓腺癌組織、乳癌組織を挙げることができる。

抗体が血管新生阻害作用を有するか否かは当業者に公知の方法により確認することが可能であり、例えば、市販の血管新生キットを用いて確認することが可能である。より具体的には実施例に記載の方法などにより確認することが可能である。
血管新生阻害作用を有する抗体の具体的な例としては、例えば上述の抗体を挙げることができる。

本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、細胞増殖抑制活性を有する抗体を挙げることができる。
抗AXL抗体により増殖が抑制される細胞は特に限定されないが、好ましくは疾患に関連した細胞であり、特に好ましくは癌細胞である。細胞が癌細胞の場合、癌種は特に限定されず、例えば、膵臓癌（膵臓腺癌など）、胃癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌など）、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、食道癌などを挙げることができる。さらに好ましくは、グリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、乳癌を挙げることができる。特に好ましくは、膵臓腺癌、乳癌を挙げることができる。

本発明の抗体により細胞増殖が抑制される際のメカニズムは特に限定されず、血管新生阻害、リン酸化阻害、リン酸化誘導、AXLの発現量の低下、など如何なるメカニズムにより細胞増殖が抑制されてもよい。

抗AXL抗体に基づく細胞増殖抑制効果を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。
試験管内において該細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、培地中に添加した[³H]ラベルしたチミジンの生細胞による取り込みをDNA複製能力の指標として測定する方法が用いられる。より簡便な方法としてトリパンブルー等の色素を細胞外に排除する能力を顕微鏡下で計測する色素排除法や、MTT法が用いられる。後者は、生細胞がテトラゾリウム塩であるMTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)を青色のホルマザン産物へ転換する能力を有することを利用している。より具体的には、被検細胞の培養液にリガンドと共に被検抗体を添加して一定時間を経過した後に、MTT溶液を培養液に加えて一定時間静置することによりMTTを細胞に取り込ませる。その結果、黄色の化合物であるMTTが細胞内のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により青色の化合物に変換される。この青色生成物を溶解し呈色させた後にその吸光度を測定することにより生細胞数の指標とするものである。MTT以外に、MTS、XTT、WST-1、WST-8等の試薬も市販されており（nacalai tesqueなど）好適に使用することができる。活性の測定に際しては、対照抗体を用いることも可能である。

また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、腫瘍担持マウスモデルを用いることができる。例えば、AXLを発現する癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被検抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞増殖抑制活性を評価することができる。試験管内での評価と同様に対照抗体を投与し、抗AXL抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことにより細胞増殖抑制活性を判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞増殖抑制活性の評価・測定に当たって被検動物中のＴリンパ球の関与を除くことが可能となる。
細胞増殖抑制作用を有する抗AXL抗体の例として、上述の抗体を挙げることができる。

本発明の抗AXLモノクローナル抗体は、公知の手段を用いて取得することが可能である。本発明の抗AXL抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは公知技術を使用して、例えば、以下のようにして作製できる。まず、AXLタンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させて、ハイブリドーマを得る。更に、このハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗AXL抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。

より具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、AXL遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるAXLタンパク質が取得できる。ヒトAXL遺伝子の塩基配列は既に公知である（GenBank Accession No. M76125）。すなわち、AXLをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトAXLタンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のAXLタンパク質も同様に使用できる。精製は通常のイオンクロマトグラフィやアフィニティクロマトグラフィなどの複数のクロマトグラフィを単数回又は複数回、組み合わせて又は単独で使用することにより生成することができる。また、AXLタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば抗体のFc断片やペプチドタグ等を利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を前記の様に発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed. (Sambrook,J. et al., Molecular Cloning 2^nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.Press, 1989)に記載されている。このようにして精製されたAXLタンパク質を哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。

また、AXLの部分ペプチドも感作抗原として使用できる。AXLの部分ペプチドとしては、例えば、ヒトAXLのアミノ酸配列より化学合成によって取得されたペプチド、ヒトAXL遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド、ヒトAXLタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチドなどを挙げることができる。部分ペプチドとして用いられる領域は特に限定されないが、AXLの細胞外領域などを用いることが可能である。

さらに、部分ペプチドとして、好ましくは、AXLのFND1全部または少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列とは、好ましくは６個以上、さらに好ましくは８個以上の連続するアミノ酸配列である。また、少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列とは、抗原性を有するアミノ酸配列である。

該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。

公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。更に、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。

このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。

前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。

HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等のようなミエローマ細胞を利用することができる。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. andMilstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行なうことが可能である。

より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。

このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、AXLを認識する抗体を国際公開WO03/104453に記載された方法によって作成することもできる。

目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実施的に同質なAXLタンパク質が好適に使用できる。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をAXLタンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久***能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。この方法によって得られる抗AXL抗体は、AXLタンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。

さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるAXLタンパク質を投与することによって、抗AXLヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞からAXLタンパク質に対するヒト抗体を単離することによってもできる（国際公開WO 94/25585、WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602参照）。更に不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトAXLを異物と認識する。したがって、ヒトAXLに対するヒト抗体を容易に得ることができる。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。

当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。

本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775参照）。

たとえば、抗AXL抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗AXL抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）などを用いることができる。
抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）を利用することができる。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。

得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認できる。

可変領域をコードする遺伝子を得るために、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使ったPCR法を利用することもできる。まず抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。

得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文(J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597)などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法を行う。

具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ1〜γ5、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。

重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、AXLに対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。

目的とする抗AXL抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素が好ましい。上記のように消化された抗AXL抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターを得ることができる。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させることによって、キメラ抗体を得ることができる。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来の生物が異なることを言う。したがって、マウス−ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト−ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入して、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。

具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5'側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列を配置しておくことができる。両者を同じ組み合わせの制限酵素で消化し、インフレームで融合させることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。

本発明の抗AXL抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗AXL抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。

抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。H鎖とL鎖を組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換(co-transfect)することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO 94/11523参照）。

抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、例えば、哺乳類細胞（CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Veroなど）、両生類細胞（アフリカツメガエル卵母細胞など）、昆虫細胞（sf9、sf21、Tn5など）などを用いることが可能である。

あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。

更に真菌細胞としては、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属）、糸状菌（アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属）などを用いることができる。

あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。

哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３'側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させた発現ベクターを構築することができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。

また、その他に本発明の抗体の発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。

SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。

大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6,2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。

抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。

発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカー挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等の選択マーカーを利用することができる。

これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。

前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。

また、組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。本発明の組み換え抗体のC領域として、動物抗体由来のＣ領域を使用できる。例えばマウス抗体のH鎖C領域としては、Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεが、L鎖C領域としてはCκ、Cλが使用できる。また、マウス抗体以外の動物抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物抗体が使用できる。これらの配列は公知である。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、C領域を修飾することができる。本発明において、抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。

これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体を言う。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。例えばH鎖においては、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、およびCεをC領域として利用することができる。またL鎖においてはCκ、およびCλをC領域として使用できる。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾することができる。

一般にキメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成される。これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity determining region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework region）およびヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。

抗体の可変領域は、通常、４つのフレーム(FR)にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。

ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。

また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。特異的なプライマーセットによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。

最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5'末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400、国際公開WO 96/02576参照）。

上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。

また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作する。次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞融合させることによって、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体が取得できる（特公平1-59878参照）。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。

また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することにより所望のヒト抗体が取得できる（国際公開WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製できる。該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより該ヒト抗体が取得できる。これらの方法は既に公知である（国際公開WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388）。

本発明の抗体には、AXLタンパク質に結合する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、AXLタンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。

低分子化抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含む。AXL抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにAXL抗原への結合能を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、ディアボディー（Diabody）、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。

抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S.et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。

消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる：
パパイン消化：F(ab)2またはFab；
ペプシン消化：F(ab’)2またはFab’；
プラスミン消化：Facb。

ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。

scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883.)。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。V領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず前記抗体のH鎖またはH鎖Ｖ領域をコードするDNA配列、および前記抗体のL鎖またはL鎖Ｖ領域をコードするDNA配列の全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。

増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。

sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。

抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照に開示されるリンカー）等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、更に好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。

あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してV領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などを用いることが可能である。

4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明において好ましい低分子化抗体はDiabody又はsc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。

さらに、本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性物質等の各種分子と結合させた抗体修飾物として使用することもできる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。

さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。すなわち本発明において、二重特異性抗体はAXL分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することもできる。又、一方の認識部位がAXLを認識し、他方の認識部位が細胞障害性物質を認識する二重特性抗体とすることも可能である。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。

また本発明においては、AXL以外の抗原を認識する二重特異性抗体を組み合わせることもできる。たとえば、AXLと同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、AXLとは異なる抗原を認識するような二重特異性抗体を組み合わせることができる。

二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。

抗体の結合活性
抗体の抗原結合活性の測定には公知の手段を使用することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。更に、細胞に発現する抗原に対する抗体の結合活性を測定する手法としては、例えば、前記Antibodies A Laboratory Manual中の359 - 420ページに記載されている方法が挙げられる。

また、緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原と当該抗原に対する抗体との結合を測定する方法として、特にフローサイトメーターを使用した方法を好適に用いることが出来る。使用するフローサイトメーターとしては例えば、FACSCanto^TM II, FACSAria^TM, FACSArray^TM, FACSVantage^TM SE, FACSCalibur^TM （以上、BD Biosciences社）や、EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC, Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC（以上、Beckman Coulter社）などを挙げることができる。

被検AXL抗体の抗原に対する結合活性の好適な測定方法の一例として、AXLを発現する細胞と反応させた被検抗体を認識するFITC標識した二次抗体で染色後、FACSCalibur (BD社) により測定を行い、その蛍光強度をCELL QUEST Software (BD社) を用いて解析する方法を挙げることができる。

ハイブリドーマ
本発明はさらに、受託番号FERM BP-10858（AX285）、FERM BP-10859（AX292）FERM BP-10853（AX223）、FERM BP-10852（AX96）、FERM BP-10856（AX258）、FERM BP-10857（AX284）、FERM BP-10850（Ax7）、FERM BP-10851（Ax51）、FERM BP-10854（Ax225）、FERM BP-10855（Ax232）として寄託されているハイブリドーマを提供する。該ハイブリドーマはアゴニスト活性を有する抗AXL抗体、アンタゴニスト活性を有する抗AXL抗体、AXLの発現量を低下させる活性を有する抗AXL抗体、血管新生阻害活性を有する抗AXL抗体および／または細胞増殖抑制活性を有する抗AXL抗体を産生する。

血管新生阻害剤
本発明はさらに抗AXL抗体を含む血管新生阻害剤を提供する。血管新生が阻害されるメカニズムは特に限定されず、例えば、血管内皮細胞の遊走活性の阻害作用、血管内皮細胞のアポトーシス誘導作用、血管内皮細胞の血管形態形成の阻害作用などを挙げることができる。本発明の血管新生阻害剤は腫瘍組織において血管新生を阻害するものであることが好ましい。腫瘍組織は特に限定されないが、例えば、膵臓癌組織（膵臓腺癌組織など）、胃癌組織、肺癌組織（小細胞肺癌、非小細胞肺癌組織など）、骨肉腫組織、大腸癌組織、前立腺癌組織、メラノーマ組織、子宮内膜癌組織、卵巣癌組織、子宮平滑筋腫組織、甲状腺癌組織、幹細胞癌組織、乳癌組織、膀胱癌組織、腎臓癌組織、グリオーマ組織、神経芽腫組織、食道癌組織などを挙げることができる。さらに好ましくは、グリオーマ組織、胃癌組織、子宮内膜癌組織、非小細胞肺癌組織、膵臓腺癌組織、乳癌組織を挙げることができる。特に好ましくは、膵臓腺癌組織、乳癌組織を挙げることができる。

本発明の血管新生阻害剤に用いられる抗体は血管新生阻害作用を有するものであれば特に限定されず、例えば上述の抗体（アゴニスト活性を有する抗体、アンタゴニスト活性を有する抗体、AXLの発現量を低下させる活性を有する抗体、など）を用いることが可能である。

本発明の抗AXL抗体を含む血管新生阻害剤は、抗AXL抗体を用いて血管新生を阻害する方法とも表現できる。又、本発明の抗AXL抗体を含む血管新生阻害剤は、血管新生阻害剤を製造するための抗AXL抗体の使用とも表現できる。

細胞増殖抑制剤
本発明はさらに抗AXL抗体を含む細胞増殖抑制剤を提供する。細胞の増殖が抑制されるメカニズムは特に限定されず、例えば、血管新生阻害作用によるもの、抗体の細胞障害活性によるもの、抗体に結合した細胞障害性物質によるものなどを挙げることができるが、好ましくは血管新生阻害作用によるものである。

抗AXL抗体により増殖が抑制される細胞は特に限定されないが、好ましくは疾患に関連した細胞であり、より好ましくは癌細胞である。従って、本発明の細胞増殖抑制剤の好ましい態様として、抗AXL抗体を含む抗癌剤を挙げることができる。細胞が癌細胞の場合、癌種は特に限定されず、例えば、膵臓癌（膵臓腺癌など）、胃癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌など）、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、食道癌などを挙げることができる。さらに好ましくは、グリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、乳癌を挙げることができる。特に好ましくは、膵臓腺癌、乳癌を挙げることができる。

本発明の細胞増殖抑制剤に用いられる抗体は細胞増殖抑制活性を有するものであれば特に限定されず、例えば上述の抗体（アゴニスト活性を有する抗体、アンタゴニスト活性を有する抗体、AXLの発現量を低下させる活性を有する抗体、など）を用いることが可能である。

本発明の抗AXL抗体を含む細胞増殖抑制剤は、抗AXL抗体を用いて細胞の増殖を抑制する方法とも表現できる。増殖が抑制される細胞が癌細胞の場合、本発明の抗AXL抗体を含む抗癌剤は、抗AXL抗体を用いて癌の治療及び／又は予防をする方法とも表現できる。又、本発明の抗AXL抗体を含む細胞増殖抑制剤は、細胞増殖抑制剤を製造する為の抗AXL抗体の使用とも表現できる。増殖が抑制される細胞が癌細胞である場合、抗癌剤の製造の為の抗AXL抗体の使用とも表現できる。

リン酸化誘導剤
本発明はさらに抗AXL抗体を含むリン酸化誘導剤を提供する。本発明のリン酸化誘導剤は通常、AXLを発現している細胞内でのリン酸化を誘導する。リン酸化が誘導される対象は特に限定されないが、通常、チロシンを有するポリペプチドであり、好ましくはAXLである。

本発明のリン酸化誘導剤に用いられる抗体は特に限定されず、例えば、上述のアゴニスト活性を有する抗体を用いることが可能である。

本発明の抗AXL抗体を含むリン酸化誘導剤は、抗AXL抗体を用いてリン酸化を誘導する方法とも表現できる。又、本発明の抗AXL抗体を含むリン酸化誘導剤は、リン酸化誘導剤を製造する為の抗AXL抗体の使用とも表現できる。

リン酸化阻害剤
本発明はさらに抗AXL抗体を含むリン酸化阻害剤を提供する。本発明のリン酸化阻害剤は通常、AXLリガンド（例えばGas6など）がAXLに結合することにより誘導されるリン酸化を阻害する。リン酸化が阻害される対象は特に限定されないが、通常、チロシンを有するポリペプチドであり、好ましくはAXLである。

本発明のリン酸化阻害剤に用いられる抗体は特に限定されず、例えば、上述のアンタゴニスト活性を有する抗体を用いることが可能である。

本発明の抗AXL抗体を含むリン酸化阻害剤は、抗AXL抗体を用いてリン酸化を阻害する方法とも表現できる。また、本発明の抗AXL抗体を含むリン酸化阻害剤は、リン酸化阻害剤の製造の為の抗AXL抗体の使用とも表現できる。

AXL発現量低下剤
本発明はさらに抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤を提供する。AXL発現量低下剤は、AXLを発現する細胞内のAXL発現量を減少させるものである。AXLを発現する細胞は特に限定されないが、例えば癌細胞（Calu-1、MDA-MB-231、DU-145など）などを挙げることができる。

AXLの発現量の減少は、AXLの分解などにより既に存在しているAXLの量を減少させてもよいし、AXLの発現を抑制することにより新たに発現するAXLの量を減少させてもよい。

本発明の抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤は、抗AXL抗体を用いてAXLの発現量を低下させる方法とも表現できる。さらに、本発明の抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤は、AXL発現量低下剤の製造の為の抗AXL抗体の使用とも表現できる。

医薬組成物
本発明の血管新生阻害剤、細胞増殖抑制剤、リン酸化誘導剤、リン酸化阻害剤またはAXL発現量低下剤の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の血管新生阻害剤、細胞増殖抑制剤、リン酸化誘導剤、リン酸化阻害剤またはAXL発現量低下剤は常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

〔実施例１〕
１−１ 抗原の調製
ハムスター卵巣細胞（CHO(dhfr-) cells）にヒトAXL細胞外領域とマウスIgG2aのFc領域を融合したFusion protein(hAXL-ECD-mIgG2aFc)発現ベクターを遺伝子導入し、G418 selection法により、hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質産生CHO細胞株をクローニングした。無血清培地（CHO-S-SFM II, GIBCO）を用いて回収したhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白産生CHO細胞株の培養上清を、結合緩衝液（20 mM リン酸緩衝液, pH 7.0）で平衡化したProtein Gカラム（HiTrap Protein G HP, GE Healthcare）に添加した。結合緩衝液で非結合蛋白を洗浄した後、溶出緩衝液（100 mM Glycine-HCl, pH 2.7）を用いて、中和緩衝液(1 M Tris-HCl, pH 9.0)を分注したチューブにhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質の画分を回収し、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット（Centricon（登録商標）, Millipore）を用いて、精製蛋白質の緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.35-7.65, タカラバイオ）に緩衝液置換し、精製蛋白質を濃縮した。C.N. Pace et al., Prof. Sci. 4:2411-2423, (1995)の計算式に従い算出したモル吸光係数を用いて、280 nmの吸光度から精製蛋白質の濃度を算出した。

１−２ 抗AXL抗体産生ハイブリドーマの作製
BALB/cマウス（雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー）4匹およびMRL/lprマウス（雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー）2匹に、前項で作製した抗原（hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質）を以下の通り免疫した。初回免疫としてFCA（フロイント完全アジュバントH37 Ra（Difco laboratories））でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。2週間後にFIA（フロイント不完全アジュバント（Difco laboratories））でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3回行った。抗原に対する血清抗体価の上昇を、次項に示したELISA（Enzyme linked immunosorbent assay）で確認後、最終免疫としてリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まないphosphate buffered saline（PBS(-)）、日水製薬）に希釈した抗原を10μg/head静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3X63Ag8U.1（P3U1と称す、ATCC CRL-1597）を、PEG1500（Roche Diagnostics）を用いた常法に従い細胞融合した。10%FBS(Invitrogen)を含むRPMI1640培地（Invitrogen）(以下、10%FBS/RPMI1640と称す)にて融合細胞を培養した。融合の翌日に、融合細胞を半流動培地（StemCells）に懸濁し、ハイブリドーマの選択培養を行うと共に、ハイブリドーマのコロニー化を実施した。融合後9日目または10日目にハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地（10%FBS/RPMI1640, 2 vol% HAT 50x concentrate（大日本製薬）, 5 vol% BM-Condimed H1（Roche Diagnostics））の入った96-ウェルプレートに、1ウェル当り1コロニーを播種した。3〜4日培養後、各ウェルの培養上清を回収し、次項に示したELISAにより、上記抗原、及びマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白に対する結合活性を測定することにより、ヒトAXL細胞外領域に結合活性を有するハイブリドーマを選択した。
選択したハイブリドーマ上清の結合活性を表１に示す。

本発明者によって選択されたハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。

(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１ 中央第６（郵便番号305-8566）
(b)受託日（寄託日）：２００７年７月５日
(c)受託番号：
AXL No.7 #070402 (Ax7)（受託番号 FERM BP-10850）
AXL No.51 #070406 (Ax51)（受託番号 FERM BP-10851）
AXL No.232 #070406 (Ax232)（受託番号 FERM BP-10855）
AXL No.96 #070402 (Ax96)（受託番号 FERM BP-10852）
AXL No.223 #070402 (Ax223)（受託番号 FERM BP-10853）
AXL No.225 #070402 (Ax225)（受託番号 FERM BP-10854）
AXL No.258 #070402 (Ax258)（受託番号 FERM BP-10856）
AXL No.284 #070402 (Ax284)（受託番号 FERM BP-10857）
AXL No.285 #070402 (Ax285)（受託番号 FERM BP-10858）
AXL No.292 #070411 (Ax292)（受託番号 FERM BP-10859）

１−３ ヒトAXLへの結合活性
Coating Buffer（100 mM sodium bicarbonate, pH9.6, 0.02% sodium azide）で1μg/mLに希釈した抗原（hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質）、またはマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白を、96-ウェルプレート（Nunc-Immuno^TM 96 MicroWell^TM plates MaxiSorp^TM（Nalge Nunc International））に、80μL/wellで分注後、4℃で一晩以上インキュベーションした。0.05 vol%のTween（登録商標）20を含むリン酸緩衝生理食塩水（tPBS(-)）で3回洗浄後、Diluent Buffer (BlockingOne, ナカライテスク)の1/5希釈液)にて、該プレートを、4℃で一晩以上ブロッキングした。緩衝液を除去後、該プレートに、Diluent Bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて3回洗浄後、Diluent Bufferで1/5000に希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体（Stressgen）を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて5回洗浄後、発色基質Peroxidase Substrate（Kirkegaad & Perry Laboratories）を80μL/well添加し、室温で20分インキュベーションした。Peroxidase Stop Solution（Kirkegaad & Perry Laboratories）を80μL/well添加した後、405 nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550（Bio-Rad Laboratories）で測定した。

１−４ ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製
上記で得られたハイブリドーマを、FBSとしてlow IgG FBS（Invitrogen）を用いた HAT選択培地で培養した。該培養上清20 - 50 mLに、溶媒をWash Buffer (20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0) に置換したProtein Gビーズ（Pharmacia）を、該培養上清10 mL当り50μL加え、4℃で一晩転倒混和した。Protein Gビーズを回収した後、Wash Bufferで洗浄後、溶出 Buffer (50 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH3.3)にて抗体を溶出し、直ちに中和Buffer (トリス塩酸緩衝液、pH7.8)で中和した。精製抗体は、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット（Amicon（登録商標）, Millipore）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（pH7.35-7.65, 日水製薬）への緩衝液置換及び濃縮を行い、0.22μmの滅菌フィルター（MilliporeGV Millipore）にて滅菌した。

〔実施例２〕 抗体によるリン酸化誘導アッセイ
実施例１で得られた抗AXLモノクローナル抗体の癌細胞内AXLのリン酸化を誘導する能力を試験した。細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231、ヒト前立腺癌細胞株DU-145）を6-ウェルプレートに4 × 10⁵ cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し（serum starved）、さらに一晩培養した。ついで、2μg/mLとなるように、上記で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、一方では陽性コントロールとして200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6（R&D）を添加し、37℃で30分間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、30分間氷上で細胞溶解バッファー（137 mM NaCl /20 mM Tris-HCl, pH8.0, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 1 mMバナジン酸ナトリウム，1 vol% NP-40, 1 mMフッ化フェニルメチルスルフォニル（PMSF）, 10μg/mLアプロチニン, 10μg/mL ロイペプチン，10μg/mL ペプスタチン）で溶解した。細胞・溶液混合物を超音波破砕機（トミー精工）で破砕後、4℃で10分間遠心した（20,000 × g）。細胞・溶液混合物の上清を0.05容量のプロテインG-アガロース（Roche Diagnostics）と30分間混合した。4℃で1分遠心後（2,300 × g）、上清に1.2μgの抗AXLモノクローナル抗体（R&G）を添加し、4℃で1時間振盪し、ついで10μLのプロテインG-アガロースを添加し、該溶液をさらに4℃で1時間振盪した。4℃で1分遠心後（2,300 × g）、免疫沈澱物を洗浄し、NuPAGE-LDSサンプルバッファー（Invitrogen）に懸濁し、70℃で10分加熱した。免疫沈降物を7% NuPAGE（Invitrogen）を用いて150 Vで1時間電気泳動した。

免疫沈降し7% NuPAGEにて電気泳動したタンパク質を、NuPAGE-トランスファーバッファー（Invitrogen）および20 vol%メタノールを含む該バッファーにて、30 mAで1時間かけて、0.45μmのポリビニリデンジフルオライドフィルター（Immobilon-FL, Millipore）に電気泳動的にトランスファーした。フィルターをTBS（50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl）で洗浄し、ODYSSEYブロッキングバッファー（Li-COR）で一晩インキュベーションすることによって遮断した。フィルターをTBST（0.05 vol% Tween（登録商標）20を含むTBS）で5分間4回洗浄し、ビオチン化した4G10抗リン酸化チロシン抗体（TBSTにて1:1,000希釈、Upstate）と抗AXL抗体（TBSTにて1:15,000希釈、SantaCruz^TM）で室温にて2時間インキュベーションした。フィルターをTBSTにて5分間4回洗浄し、TBSTにて1:10,000希釈したAlexa680標識ストレプトアビジン（Invitrogen）と、TBSTにて1:10,000希釈したIRDye800標識抗ヤギ第二抗体（Rockland）で1時間インキュベーションした。TBSTで5分間3回洗浄、さらにTBSで5分間1回洗浄後、フィルターを赤外線イメージングシステムODYSSEY（Li-COR）を用いてスキャンした。

この免疫沈降した細胞内AXLに対して抗AXL抗体で免疫ブロットしたバンドと、抗リン酸化チロシン抗体で免疫ブロットしたバンドが重なり、AXLチロシンリン酸化バンドの増強が観察されたのはAx285、Ax292、Ax223、Ax96、Ax258の抗AXLモノクローナル抗体を添加した後と、陽性コントロールのリコンビナントGAS6を添加した後であった（図1a、b、c、d、e）。従って、増強したAXLのチロシンリン酸化が、本発明者の取得した抗AXLモノクローナル抗体の添加により、増強したAXLのチロシンリン酸化が観察された。これら抗AXLモノクローナル抗体は、AXLのキナーゼドメインのリン酸化を誘導することができる。

〔実施例３〕 抗体によるリガンド依存的リン酸化阻害アッセイ
抗AXLモノクローナル抗体による、癌細胞内のリガンド依存的リン酸化阻害能力を試験した。細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1またはヒト乳癌細胞株MDA-MB-231またはヒト前立腺癌細胞株DU-145）を6-ウェルプレートに4 × 10⁵ cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し（serum starved）、一晩培養した。2μg/mLとなるように、実施例１で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、同時に200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6（R&D）を添加し、37℃で30分間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、上記細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。市販の抗AXL抗体（SantaCruz^TM）で免疫沈降した細胞溶解産物を7% NuPAGE（Invitrogen）を介して分離し、上記のウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイで免疫ブロットした。この免疫沈降した細胞内AXLは、リガンドであるGAS6処理により抗リン酸化チロシン抗体でブロットされたが、Ax7、Ax51の抗AXLモノクローナル抗体により抗リン酸化チロシン抗体のブロットが減弱した（図2a、b）。従って、リガンド依存的なAXLのチロシンリン酸化は、本発明者の取得した抗AXLモノクローナル抗体をさらしたことで阻害されることが確認された。これら抗AXLモノクローナル抗体はAXLのキナーゼドメインのリガンド依存的なリン酸化を阻害することができる。

〔実施例４〕 抗体によるAXLタンパク質分解誘導アッセイ
抗AXLモノクローナル抗体の癌細胞内AXLの分解を誘導する能力を試験した。細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1またはヒト乳癌細胞株MDA-MB-231またはヒト前立腺癌細胞株DU-145）を6-ウェルプレートに4 × 10⁵ cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し（serum starved）、一晩培養した。ついで、2μg/mLとなるように、上記で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、一方では陽性コントロールとして200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6（R&D）を添加し、37℃で24時間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、上記細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。市販の抗AXL抗体（SantaCruz^TM）で免疫沈降した細胞溶解産物を7% NuPAGE（Invitrogen）を介して分離し、上記のウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイで免疫ブロットした。

25μgの各タンパク質溶液をNuPAGE-LDSサンプルバッファー（Invitrogen）に懸濁し、70℃で10分加熱し、7% NuPAGE（Invitrogen）を用いて150 Vで1時間電気泳動した。電気泳動したゲルをNuPAGE-トランスファーバッファー（インビトロジェン（Invitrogen）および20 vol%メタノールを含む該バッファーにて30 mAで１時間かけて、0.45μmのポリビニリデンジフルオライドフィルター（Immobilon-FL, Millipore）に電気泳動的にトランスファーした。フィルターをTBS（50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl）で洗浄し、ODYSSEYブロッキングバッファー（Li-COR）で一晩インキュベーションすることによって遮断した。フィルターをTBSTで5分間4回洗浄し、抗AXL抗体（TBSTにて1:15,000希釈、SantaCruz）と抗アクチン抗体（TBSTにて1:5,000希釈）で室温にて2時間インキュベーションした。フィルターをTBSTにて5分間4回洗浄し、TBSTにて1:10,000希釈したAlexa680標識抗ウサギ第二抗体（Invitrogen）と、TBSTにて1:10,000希釈したIRDye800標識抗ヤギ第二抗体（Rockland）で1時間インキュベーションした。TBSTで5分間3回洗浄、さらにTBSで5分間1回洗浄後、フィルターを赤外線イメージングシステムODYSSEY（Li-COR）を用いてスキャンした。

AXLのブロットが、Ax285、Ax292、Ax223、Ax96、Ax258、Ax284、Ax7、Ax225の抗AXLモノクローナル抗体をさらした後に減弱することが観察された（図3a、b、c、d、e、f、g、h）。すなわち、これら抗AXLモノクローナル抗体はAXLタンパク質の分解を誘導することができる。

〔実施例５〕 抗AXL抗体のin vitro 血管新生阻害活性
クラボウが販売している血管新生キットを用いて抗AXL抗体のヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC）の管腔形成阻害活性を測定した。実験手順は、キット添付のプロトコールに従った。以下に概略を示す。HUVECおよび線維芽細胞を共培養し、管腔形成初期段階の増殖状態とした細胞を含む24-ウェルプレート（キット添付）を37℃、5%-CO₂、加湿空気のインキュベーターに3時間入れた。25 mL入り専用培地（キット添付）3本のキャップを緩めて、37℃、5%-CO₂、加湿空気のインキュベーターに約30分入れた。プレートをインキュベーターから出し、ウェルキャップシートを剥がした。プレートの蓋を新しいもの（キット添付）に交換した。細胞を顕微鏡で観察し異常がないか確認した。37℃に温めた培地（>12 mL/plate）をファルコンチューブに分注し、VEGF-A (2 μg/mL)を200倍希釈で最終濃度10 ng/mLになるよう培地に添加した。チューブに分注した培地に最終濃度10μg/mLとなるように上記で作製した抗AXL抗体を添加した。ネガティブコントロールには、抗体の代わりにPBS(-)を加えた。24-ウェルプレートのウェルの培地を静かに吸引除去し、薬物の入った培地を500μL静かに添加した。細胞の様子を顕微鏡で観察し、インキュベーターに戻した。抗体を添加した日を１日目として、4, 7, 9日目の培地交換も同様の手順で行った。

抗体添加11日目に、管腔染色キット（クラボウ）を用いて、細胞層の固定および染色操作を行った。手順はキット添付のプロトコールに従った。以下にその概要を示す。細胞を顕微鏡で観察した後、培地を吸引除去し、各ウェルに1 mLの洗浄緩衝液（PBS(-), pH7.4, SIGMA）を加えウェルを洗浄し、その後洗浄緩衝液を吸引除去した。氷冷した固定液(70%エタノール)を各ウェルに1 mLずつ添加し、30分間室温で静置した。固定液を除去し、各ウェルに1 mLのブロッキング液を加え、洗浄し吸引除去した。プロトコールにしたがって希釈したキット添付の一次抗体を各ウェルに0.5 mLずつ添加し、1時間37℃でインキュベートした。一次抗体を吸引除去し、各ウェルを1 mLのブロッキング液（1%BSA含有PBS(-), pH7.4, SIGMA）で3回洗浄した。プロトコールにしたがって希釈したキット添付の二次抗体を各ウェルに0.5 mLずつ添加し、1時間37℃でインキュベーションした。二次抗体を吸引除去し、各ウェルを1 mLの蒸留水で3回洗浄した。キット添付の基質溶液を各ウェルに0.5 mLずつ添加し、管腔が深紫色になるまで、10〜30分間37℃でインキュベーションした。基質溶液を吸引除去し、各ウェルを1 mLの蒸留水で3回洗浄し、自然乾燥させた。固定化した各ウェルの顕微鏡の画像をCCDカメラ(NIKON DIGITAL CAMERA dxm1200)で5箇所撮影し、血管新生定量ソフトウエア(Ver1.0 KURABO)により、血管の面積を算出した。

陰性対照のPBS(-)を添加したウェルでの管腔形成血管の面積に対して、抗AXL抗体を添加したウェルの管腔形成血管の面積の減少率を抗体の阻害活性の指標として評価を行なったところ、Ax232、Ax292、Ax285、Ax284は阻害活性を示した（図4）。

〔実施例６〕 抗AXL抗体のマウスAXLへの結合活性
マウスAXLの細胞外領域（R&D社、以下mAXL-ECD）をCoating Buffer（100 mM Sodium bicarbonate buffer, pH9.6）で2μg/mLに希釈後、96-ウェルプレート（Nunc-Immuno^TM 96 MicroWell^TM plates MaxiSorp^TM（Nalge Nunc International））に100μLずつ分注した。冷蔵庫で一晩放置した後、プレート内の抗体溶液を除去し、Diluent Buffer (BlockingOne, ナカライテスク)を200μL/wellずつ分注し、室温で2時間ブロッキングした。Diluent Bufferを除去した後に、Diluent Bufferで3μg/mLに希釈した上記で作製した抗AXL抗体を100μL/wellずつ分注し、室温で1.5時間放置した。抗体溶液を除去した後に、tPBS(-)で３回洗浄した。アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG1抗体、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG2a抗体、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG2b抗体(Southern Biotech)を各抗体の最終希釈が1/2250：1/4000：1/4000となるように調製した標識抗体カクテルを100μL/wellずつ分注し、室温で１時間放置した。抗体溶液を除去した後に、tPBS(-)で3回洗浄した。アルカリホスファターゼ用発色基質溶液（BluePhos Microwell Phosphatase Substrate System, Kirkegaad & Perry Laboratories）を100μL/wellずつ分注し、室温で発色させた。マイクロプレートリーダー（Emax、Molecular Devices社製）にて650 nmの吸光度を測定した。
Ax96、Ax119、Ax223、Ax225、Ax284でマウスAXLへの結合が確認された。

〔実施例７〕 抗AXL抗体のin vitro腫瘍細胞増殖阻害活性
ATCCより購入したHCT-116 (CCL-247)、Calu-1(HTB-54)、DU 145 (HTB-81)、T-47D（HTB-133）および大日本住友製薬より購入したAsPC-1、MDA-MB-231、PANC-1を用いて評価を行った。細胞の維持は、各細胞の供給元の推奨条件にて行った。上記で作製した抗AXL抗体を10%FBS/RPMI1640にて希釈系列を作成し、その20μLを96-ウェルプレート（平底）に分注した。HCT-116、Calu-1、DU 145、T-47D、AsPC-1、MDA-MB-231、PANC-1の各細胞懸濁液を1ウェルあたり2000、3000、2000、5000、3000、5000、3000個となるよう調製し、各ウェルに細胞懸濁液の180μLを加え、37℃、5% CO₂ インキュベーターにて培養した。4日後、WST-8（Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所社製）を各ウェルに10μL加え、キット添付のプロトコールに準じて、マイクロプレートリーダー（Model 3550-UV、BIO-RAD社製）にて450 nmの吸光度を測定した。被験物質を含まない場合の測定値を0%阻害、被験物質および細胞を含まない場合の測定値を100%阻害として、抗AXL抗体の細胞阻害活性(%)を算出した。
Ax51がHCT116細胞に対して30%以上のCGI活性を示した。

〔実施例８〕抗AXL抗体のヒト膵臓腺癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定
１．ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社（現 大日本住友製薬株式会社）より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×10⁷個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu（BALB-nu/nu）マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL（1×10⁷個/マウス）を移植した。腫瘍体積の平均値がおよそ210 mm³になった時点でマウスを当該実験に供した。

２．抗体調製および投与
表１の抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール（日本イーライリリー株式会社）は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。

３．抗腫瘍効果の評価
ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より４日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した（図５）。
腫瘍増殖抑制効果（％）＝（１−抗体処理群の腫瘍増殖量／対照群の腫瘍増殖量）×100

４．統計処理
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95％の信頼度（＊；ｐ<0.05）をもって有意とした。

５．結果
いずれの抗体も腫瘍の増殖を抑制し、抗腫瘍効果を有していた（図５）。

〔実施例９〕抗AXL抗体のヒト膵臓腺癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定（２）
１．ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社（現 大日本住友製薬株式会社）より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×10⁷個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu（BALB-nu/nu）マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL（1×10⁷個/マウス）を移植した。腫瘍体積の平均値がおよそ270 mm³になった時点でマウスを当該実験に供した。

２．抗体調製および投与
抗AXL抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール（日本イーライリリー株式会社）は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。

３．抗腫瘍効果の評価
ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より４日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。
腫瘍増殖抑制効果（％）＝（１−抗体処理群の腫瘍増殖量／対照群の腫瘍増殖量）×100

４．結果
腫瘍増殖抑制効果を図６に示した。腫瘍増殖抑制効果（％）が30%より低い場合を"−"、30%以上を"＋"、60%以上を"＋＋"とした。図６には、〔実施例３〕 抗体によるリガンド依存的リン酸化阻害アッセイの結果も併せて表示した。
FND-1に結合する抗体は、腫瘍体積の平均値がおよそ270mm³となった時点で投与を開始しても、60%以上のTGI活性を示した。FND-1に結合する抗AXL抗体が、in vivoでこのような顕著な抗腫瘍効果を有することは、本願で新たに発見されたものであり、全く予想外であった。
また、IgD2に結合する抗AXL抗体で、実施例３、実施例８および実施例９のようなリン酸化阻害効果を有し、かつin vivoで抗腫瘍効果を示すものが存在することは、本願で新たに発見されたものであり、全く予想外であった。

〔実施例１０〕 ヒトAXL-FND1、ヒトAXL-IgD2への結合活性
１． ヒトAXL-FND1、ヒトAXL-IgD2への結合活性
抗AXLモノクローナル抗体のAXL-Fibronectin type 3 domain 1（AXL-FND1）、AXL Immunoglobulin family domain 2 (AXL-IgD2)への結合能力を試験した。

２．ヒト組み換えAXL-FND1、ヒト組み換えAXL-IgD2の発現ベクターの調製
ヒト組み換えAXL-FND1は全長ヒトAXL cDNA（O'Bryanら，Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 5016-5031）（GenBank#NM_021913）から、225番から331番目のアミノ酸に相当する領域をPCRにて増幅し、GST-tagとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)（Novagen）にクローニングし、pET-AXL-FND1を構した。その他のドメインについては、137番から224番目のアミノ酸に相当する領域AXL-IgD2をPCRにて増幅し、GSTタグとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)にクローニングした。
作製した各ベクター（5μL）をDH5α（東洋紡，Cat# DNA-903）にヒートショック法により形質転換し、SOC培地で培養後、カナマイシンを含むLBプレート上37度で終夜培養後、コロニーを選抜した。

３．ヒト組み換えAXL-FND1、ヒト組み換えAXL-IgD2の精製
作製した各コロニーを、カナマイシンを含む20 mLのLB培地に終夜37度で前培養し、500 mLの培地に移し、A₆₀₀=0.5±0.05まで培養しIPTGを0.5 mMとなるように添加した。37度で1時間培養後集菌し、Buffer A（50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT）にて懸濁後、液体窒素を用いて凍結融解を2回繰り返した。NP-40を0.5%となるように加え、超音波破砕機で破砕（30秒x5）後、204,000xG、30分遠心し、上清を回収した。
得られた上清を用いて、以下のようにヒト組み換えAXL-FND1を精製した。可溶化した大腸菌上清とグルタチオンセファロース^TM 4 Fast Flow（GEヘルスケア）を混合し、ローテーターで4度1時間攪拌した。500xG、5分遠心分離し、上清を捨てBuffer Aを加えてグルタチオンセファロース^TM 4Bを洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。洗浄したグルタチオンセファロース^TM 4 Fast Flowからミニカラムに移し、ヒト組み換えAXL-FND1は、50 mM Tris-HCl, pH7.5, 25 mM グルタチオンでグルタチオンセファロース^TM 4 Fast Flowから分離・溶出した。その他のAXLの各ドメインも同様の方法で発現・分離・溶出した。

４．ウエスタンブロッティング法による抗AXL抗体のAXL-FND1への結合活性の評価
グルタチオンセファロース^TM4 Fast Flowから分離・溶出したヒト組み換えAXL-FND1をはじめ、AXL-IgD1、AXL-IgD2、AXL-FND2、AXL-IgD1+IgD2、AXL-IgD2+FND1、AXL-FND1+FND2はBIO-RAD Dc Protein Assayでタンパク定量し、1μgをNuPAGE(登録商標) Sample buffer（Invitrogen）と混合し、NuPAGE(登録商標) 10% Bis-Tris Gelで電気泳動を行った。電気泳動したGelはImmobilon^TM-FL（Millipore）PVDF膜に転写した。転写したタンパク質を含むPVDF膜は、Odyssey(登録商標) Blocking Buffer（LI-COR）でブロッキング後、抗AXL抗体を5μg/mLとなるように希釈した一次抗体溶液に浸し、終夜4度でインキュベートした。一次抗体溶液に浸した転写したタンパク質を含むPVDF膜は、0.1% TBS-T [0.1% Tween-20を含むTBS（Tris-buffered Saline, TaKaRa)]で5分4回洗浄した。抗AXL抗体に浸したPVDF膜は、80 ng/mLに希釈したAlexa Fluor(登録商標) 680 goat anti-mouse IgG（H+L）（Invitrogen）二次抗体溶液に浸し、室温で1時間インキュベートした。二次抗体溶液に浸したPVDF膜は0.1% TBS-Tで5分3回洗浄後、0.01% SDSを含むTBS-Tで5分洗浄後、TBSで5分洗浄した。洗浄したPVDF膜は遠赤外線イメージングシステムOdyssey(登録商標)でスキャンして結合性を評価した。

５．結果
評価結果を図６に記載した。
受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗ＡＸＬ抗体 (Ax225)は、AXLのFND1を認識することが明らかとなった（図６）。受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗ＡＸＬ抗体 (Ax284)は、AXLのFND1およびIgD2を認識すると考えられた（図６）。受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗ＡＸＬ抗体 (Ax7)、および受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗ＡＸＬ抗体 (Ax51) は、AXLのIgD2を認識することが明らかとなった（図６）。

〔実施例１１〕抗AXL抗体のヒト乳癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定
１．ヒト乳癌移植マウスモデルの作製
ATCCより入手したヒト乳癌細胞株MDA-MB-435Sは、HBSSにて5×10⁷個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu（BALB-nu/nu）マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL（1×10⁷個/マウス）を移植した。腫瘍体積がおよそ200 mm³になった時点でマウスを当該実験に供した。

２．抗体調製および投与
抗AXL抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、20 mg/kgにてヒト乳癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。

３．抗腫瘍効果の評価
ヒト乳癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より４日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。
腫瘍増殖抑制効果（％）＝（１−抗体処理群の腫瘍増殖量／対照群の腫瘍増殖量）×100

４．統計処理
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95％の信頼度（＊；ｐ<0.05）をもって有意とした。

５．結果
使用した抗AXL抗体は、腫瘍の増殖を抑制し、抗腫瘍効果を有していた（図７）。よって、FND1に結合する抗AXL抗体は種々の腫瘍に対して抗腫瘍効果が期待できる。

〔実施例１２〕抗体cDNAの配列解析
１．キメラ抗体発現ベクターの作製
受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマ細胞(Ax225)から、RNeasy Mini Kits（QIAGEN）を用いてトータルRNAを抽出し、SMART RACE cDNA Amplification Kit（BD Biosciences）によりcDNAを合成した。SMART RACE cDNA Amplification Kit（BD Biosciences）に添付の10X Universal Primer A Mixと抗体のそれぞれの定常領域に設定した、以下のプライマー（H鎖：MHCg1、L鎖MLCk）を用い、PrimeSTAR HS DNA polymerase（TaKaRa）によってPCRを行い、抗体の可変領域遺伝子を単離した。
MHCg1：5’-GGGCCAGTGGATAGACAGATG-3’ （配列番号：１）
MLCk：5’-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG-3’ （配列番号：２）
単離した各DNA断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3730xL DNA SequencerまたはABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。

２．結果
得られたAXL225のマウス抗体のアミノ酸配列の、重鎖可変領域を配列番号：３、該領域のＣＤＲ１を配列番号：４、ＣＤＲ２を配列番号：５、ＣＤＲ３を配列番号：６に示す。得られたAXL225のマウス抗体のアミノ酸配列の、軽鎖可変領域を配列番号：７、該領域のＣＤＲ１を配列番号：８、ＣＤＲ２を配列番号：９、ＣＤＲ３を配列番号：１０に示した。

本発明者は、抗AXL抗体が血管新生抑制作用および癌抑制作用を有することを初めて見出した。本発明の抗AXL抗体は、血管新生阻害剤、細胞増殖抑制剤として有用である。また、本発明の抗体を利用することにより、AXLのリン酸化を誘導もしくは阻害することが可能である。さらに、本発明の抗体を利用することにより、AXLの発現量を低下させることが可能である。

Claims (46)

1. AXLに結合するモノクローナル抗体。
2. 細胞増殖抑制活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
3. 癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
4. FND1に結合する請求項１から３いずれかに記載の抗体。
5. FND1全部または少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として作製した抗体。
6. AXLに対してアゴニスト活性を有することを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の抗体。
7. AXLに対してアンタゴニスト活性を有することを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の抗体。
8. AXLを発現する細胞にAXLリガンドと共に接触させると、AXL内にリン酸化チロシンが検出されない抗体を選抜することによって得られる、請求項７に記載の抗体。
9. AXLの発現量を低下させる活性を有することを特徴とする請求項１から８いずれかに記載の抗体。
10. 血管新生阻害活性を有することを特徴とする請求項１から９いずれかに記載の抗体。
11. 以下の(a)〜(j)いずれかに記載の抗体；
    (a)受託番号FERM BP-10858として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax285)、
    (b)受託番号FERM BP-10859として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax292)、
    (c)受託番号FERM BP-10853として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax223)、
    (d)受託番号FERM BP-10852として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax96)、
    (e)受託番号FERM BP-10856として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax258)、
    (f)受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax284)、
    (g)受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax7)、
    (h)受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax51)、
    (i)受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax225)、
    (j)受託番号FERM BP-10855として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax232)。
12. 請求項１１に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
13. 請求項１１に記載のいずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体。
14. 重鎖CDR１，２，３の配列が配列番号４，５，６である抗体。
15. 請求項１４の抗体の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲを有する抗体であって、請求項１４に記載の抗体と機能的に同等な抗体。
16. 軽鎖CDR１，２，３の配列が配列番号８，９，１０である抗体。
17. 請求項１６の抗体の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲを有する抗体であって、請求項１６に記載の抗体と機能的に同等な抗体。
18. キメラ抗体である請求項１３〜１７いずれかに記載の抗体。
19. ヒト化抗体である請求項１３〜１７いずれかに記載の抗体。
20. 以下の(a)〜(j)いずれかに記載のハイブリドーマ；
    (a)受託番号FERM BP-10858として寄託されたハイブリドーマ (Ax285)、
    (b)受託番号FERM BP-10859として寄託されたハイブリドーマ (Ax292)、
    (c)受託番号FERM BP-10853として寄託されたハイブリドーマ (Ax223)、
    (d)受託番号FERM BP-10852として寄託されたハイブリドーマ (Ax96)、
    (e)受託番号FERM BP-10856として寄託されたハイブリドーマ (Ax258)、
    (f)受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマ (Ax284)、
    (g)受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマ (Ax7)、
    (h)受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマ (Ax51)、
    (i)受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマ (Ax225)、
    (j)受託番号FERM BP-10855として寄託されたハイブリドーマ (Ax232)。
21. 抗AXL抗体を有効成分とする血管新生阻害剤。
22. 抗体が請求項１〜１９いずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項２１記載の血管新生阻害剤。
23. 抗AXL抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
24. 細胞が癌細胞である請求項２３に記載の抑制剤。
25. 抗体が請求項１〜１９いずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項２３に記載の抑制剤。
26. 抗AXL抗体がFND1に結合する抗体である請求項２３に記載の抑制剤。
27. IgD2に結合しリン酸化活性阻害作用を有する抗体を有効成分とする請求項２３に記載の抑制剤。
28. 抗AXL抗体を有効成分とするAXLのリン酸化活性誘導剤。
29. 抗AXL抗体がIgDに結合する抗体である請求項２８に記載の誘導剤。
30. 抗体が請求項６に記載の抗体であることを特徴とする請求項２８に記載の誘導剤。
31. 抗AXL抗体を有効成分とするAXLのリン酸化活性阻害剤。
32. 抗AXL抗体がIgD2に結合する抗体である請求項３１に記載の阻害剤。
33. 抗体が請求項７又は８いずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項３１に記載の阻害剤。
34. 抗AXL抗体を有効成分とするAXL発現量低下剤。
35. 抗AXL抗体がFND1に結合する抗体である請求項３４に記載の発現量低下剤。
36. 抗体が請求項９に記載の抗体であることを特徴とする請求項３４に記載の発現量低下剤。
37. 抗AXL抗体を用いてAXLのリン酸化を誘導する方法。
38. 抗AXL抗体を用いてAXLの発現量を低下させる方法。
39. 抗AXL抗体を用いてAXLのリン酸化を阻害する方法。
40. 抗AXL抗体を有効成分とする抗癌剤。
41. 抗体が請求項１〜１９いずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項４０に記載の抗癌剤。
42. IgD2に結合しリン酸化活性阻害作用を有する抗体を有効成分とする請求項４０に記載の抗癌剤。
43. 癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である請求項４０の抗癌剤。
44. 癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である請求項４２の抗癌剤。
45. 癌が膵臓腺癌または乳癌である請求項４３の抗癌剤。
46. AXLのリン酸化阻害作用を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。

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