TW200902548A

TW200902548A - Method for manufacturing a recombinant polyclonal protein

Info

Publication number: TW200902548A
Application number: TW097119118A
Authority: TW
Inventors: Lars Soegaard Nielsen; Dietmar Weilguny; Anne Bondgaard Tolstrup; Finn C Wiberg; Christian Muller
Original assignee: Symphogen As
Priority date: 2007-05-25
Filing date: 2008-05-23
Publication date: 2009-01-16
Also published as: KR20100017923A; AU2008255383A1; PT2152872E; DE602008002593D1; BRPI0812091A2; HRP20100640T1; US7910332B2; CN101688204B; MX2009012526A; PL2152872T3; IL201395A0; CN101688204A; WO2008145133A2; JP2011504721A; WO2008145133A3; US20090111142A1; IL201395A; JP5941616B2; EP2152872B1; ZA200908021B

Description

200902548 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於使用不依賴位點特異性整合之產生系統產生重組多株蛋白冑，諸如來自免疫球蛋白超家族之蛋白貝例如可洛形式或膜結合形式之B細胞受體或τ細胞受體。【先前技術】諸如傳染病及癌症之許多疾病缺乏有效療法。單株抗體般尚未成功對抗所有此等靶標，此部分歸因於複雜靶祆之&異性及引起自單株抗體識別免疫逃脫之靶蛋白質適應性突^。另一方面，多株抗體能靶向複數個動態靶標，例如病毒、細菌或癌細胞。χ ’多株抗體在抗原突變情況下具有保留活性之最高可能性。存在不同市售多株抗體治療劑，包括：〇自正常人類供體之血液分離之正常人類免疫球蛋白；2)纟源於帶有針對特定疾病靶標（例如病毒）之抗冑（先前已經由感染或接種而遇到）的個別人類供體之血液的人類高免疫性免疫球蛋白；及3)來源於經免疫動物之血液之動物高免疫性免疫球蛋白。火=人類血液純化之免疫球蛋白已證實有效對抗Β型肝 =病毒、兮吸道融合性病#、細胞巨大病#及其他疮療病毒、狂犬病病毒、肉毒桿菌毒素等錢，以及有效預防新生恆河猴D (nec)natalrhesusD)。自用人類了細胞免疫之純化之免疫球蛋白被用於在治療或預防移植排斥反 200902548 應中提供τ細胞免疫抑制（例如抗胸腺細胞球蛋白 (Thymoglobulin))。正常人類免疫球蛋白已被用於加強免疫缺陷患者之免疫系統以及用在各種自體免疫病症之療法中。然而，廣泛使用免疫球蛋白因供體血液原料之供應受限、批次間變化之問題及安全性不穩定而已受限制。動物源性免疫球蛋白尤其面臨20世紀80年代及9〇年代對於動物源性單株抗體所觀測相同之免疫原性問題。最後，如同其他血液產品一樣，諸如HIV、疱疹或肝炎病毒或病毒性蛋白顆粒之感染劑傳播之危險仍存在。因此，儘管臨床醫師承認多株抗體在一些情況下為較佳治療劑，但其使用已極受限制。產生人類免疫球蛋白之新方法隨轉殖基因動物技術而出現。已產生帶有人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因小鼠 (美國專利第6，111，166號）。此等小鼠產生完全人類免疫球蛋白，且針對特定靶標之抗體可藉由常用免疫技術產生。然而，較大抗體產量因相對小體型之小鼠而受限。亦已將較大型動物製成人類免疫球蛋白基因轉殖動物，例如牛（Kuroiwa，Υ.等人⑽則价以⑽⑽少；2〇〇2; 2〇: 889_ 893 )。然而，自該等動物之血液產生供治療用之多株抗體並非無併發症問題。首先，動物及人類之免疫生理學可能顯不相當大的差異，引起所得免疫庫、功能重排及抗體反應多樣性之差異。第二，所引入之免疫球蛋白基因座之有絲***不穩定性可能影響抗體的長期產生。第三，刪除 200902548 動物自身免疫球蛋白基因座使得（例如）冑物抗體產生將。第四’諸如病毒、傳播之危險伴隨動不超過人類抗體產生在技術上具挑戰,! 生病毒性蛋白顆粒或其他病原體之感染齊I 物中所產生之人類抗體的投藥。最近’已開發出在產生時不依賴供體可用性之一種新型多株抗體。此等多株抗體係藉由自具有針對所要乾標之免疫反應的供體分離編碼抗體之核酸疼列、垃 ^ 较者師選出特異性結合所要起標之抗體而產生。多株抗體可藉由經修改之哺乳動物表現技術來製造’該技術係基於如w〇 2004/061 1 04中所述一個抗體表現質體位點特異性整合至各細胞之同一基因組位點中。此新型多株抗體之一實=為針對恆河猴D之重組多株抗體（W〇 2〇〇6/〇〇785〇)。使用位點特異性整合產生細胞群體，其中各細胞含有單一複本且其中表現量及生長速率據預期為相對均一的。【發明内容】發明概要本發明提供用於產生重組多株蛋白質之替代方法，該等方法不依賴位點特異性整合且由此關於產生細胞系之選擇提供增加之靈活性，同時維持蛋白質之多株性。另外，表現量可高於使用位點特異性整合之可能表現量。本發明之方法係基於所關注之個別基因隨機整合至宿主細胞中，較佳接著選殖具有所要特徵之單細胞。接著將各自產生多株蛋白質之個別成員的個別細胞純系混合以產生用於產生多株蛋白質之多株製造細胞系。 200902548 多株抗體一般為最熟知之多株蛋白質。τ細胞受體 (TcR)同樣如此，其於重組表現系統申產生時可以可溶 Φ式獲仔’可具有如同多株抗體之治療潛力。然而，就本毛明之重組表現系統而言，亦有可能將未必同源之蛋白質 (例如，在特定缺陷或疾病中具有已知相關性之不同蛋白、）'且5本發明將藉由多株抗體例示，但其意欲涵蓋可旎需要一起製造之多株TcR及其他多株蛋白質。必要時，該等蛋白質亦可為融合蛋白質。本發明允許在一容器中商業性生產重組多株蛋白質，用於醫藥組合物中。本發明之—重要特徵在於在製造製=間’構成多株蛋白質之個別分子的偏向表現保持於 -里使不合需要之批次間變化降至最低且避免製造期間消除多株抗體之成員。在一態樣中，本發明係關於一種產生能表現包含2個至n個獨特成員之多株蛋白質之多株細胞系的方法，該方法包含：提供一組表現載體，其中該等載體中之每一者包含士馬4夕株蛋白質之獨特成員的獨特核酸之至少-個複本； )在避免表現載體位點特異性整合至宿主細胞之基因 ::之條件下用該等表現載體中之每一者各別地轉染該等、、田胞’從而獲得細胞之2個至η也办夕主η個組合物’各組合物表現 n個、纟且合物混合以獲得多株細胞夕株蛋白質之一個獨特成員； c )將細胞之該2個至 200902548 系0 在較佳具體實例中，多株細胞系被用作多株製造細胞糸’且經冷;東及儲存並用作多株主細胞庫（p〇lycl〇nal Master Cell Bank，pMCB )，自其可將樣本（例如安瓿）解凍且直接用於製造重組多株蛋白質或產生多株工作細胞庫 (polyclonal Working Cell Bank, pWCB ) 〇肢在一具體實例中’表現載體為游離基因型載 (episomal vector)。在另一較佳具體實例中，表現載體穩定且隨機地整合至宿主細胞之基因組中。表現載體可在隨機位置處穩定整合至宿主細胞之一或多個染色體中。較佳地，選殖步驟b)中所獲得之經轉染細胞。在一 ”體實例中，選殖係使用如本文所述之螢光活化細胞分選 (FACS)選殖來進行。純系可針對至少一個選自由以下各項組成之群的標準來選擇長速率、倍增時間、表現量、產生量、隨時間生c生存力、耐性、穩固性、形態及複本數。 :佳地’純系係針對關於該至少一個標準之均一性來選來.|^佳地純系係針對關於倍增時間及表現量之均一性采選擇。員來選擇’、。因此一固Γ上純系可針對各獨特多株蛋白質成來選擇，或可_/㈣可針對各獨❹株蛋白質成員個、i。；、"個二、4個、5個、6個、7個、8個、9 個、個、19個：20固：13個、14個、15個、16個、17 固、25個、30個、35個、40個、45 11 200902548 個、50個、6〇個、7〇個、8〇個、9〇個或_個純系。表現不同獨特成員之細胞之組合物可以ι:ι比率或以不同於1 · 1比率之比率混合。較佳地’表現载體除多株蛋白質之編碼序列的變化以外皆相同。 °亥方法可應用於單體（monomeric )多株蛋白質與多聚體（multimeric )多株蛋白質。在多聚體蛋白質之狀況下，一個表現載體可編碼一個獨特多株蛋白質成員之所有次單元。或者，步驟中之表現載體組由兩個或兩個以上表現載體亞組構成，其中第一亞組包含編碼蛋白質之—個次單元的變異核酸序列，且第二亞組包含編碼蛋白質之另一個次單元的變異核酸序列，使得各轉染以來自第一亞組之成員及第二亞組表現載體之成員進行。此轉染可同時或依序進行。特定言之，步驟a)中之表現載體組可由兩個表現載體亞組構成，其中第一亞組包含編碼抗體重鏈之變異核酸序列，且第二亞組包含編碼抗體輕鏈之變異核酸序列，使得各轉染以來自第 —亞組之成員及第二亞組表現載體之成員進行。 »亥表現載體或又一表現載體較佳編碼可選標記。此外，在有利於表現可選標記之細胞生長之條件下連續培養細胞。藉由使用包含宿主細胞所缺乏之基因產物的可選標記來最大地確保此目H具體實例中，可選標記由:編石馬多肽成^該多肽成貝之次單元的轉錄物編碼，較佳地，其中該可選標記由編碼最大次單元之轉錄物編碼。 12 200902548 本發明之一態樣係關於一種製造多株蛋白質之方法，其中該多株蛋白質包含2-n個獨特成員，該方法包含： a) 提供使用本發明之方法所獲得之多株細胞系； b) 在允許表現多株蛋白質之條件下培養該多株細系；及〇自細胞或培養基回收及視情況純化該多株蛋白質。本發明者已確定，令人驚舒地，在模擬生產週期期間維持個別純系之分布，其代表工業上製造重組藥品之條件。由於多株抗體之個別成員的表現載體在不同位置處整合且由於複本數不m上述現象非常令人㈣。其可產生表現量與生長速率方面的差異。人與預期相反’製造未引起多株抗體之—或多個成卜全或部分損失。即使不同細胞季 70 g , i系惑間生長速率具有微小差 '、’乃預期多株組合物隨時間將引起多株組合物之至小— 部分損失。因此’在本發明之具體實例；， ▲工作細胞庫解;東之後1G次以上細胞㈣上=***’諸如2。次以上細胞***，例如二：胞刀衣’諸如30次以上細胞***，例如、田衣老如50次以上細胞***，例如75次諸如1 00次以上细朐八到# 上、，，田胞为裂，胞刀裂期間維持組成穩定性。 ::附Λ施例顯不在25次以上細胞分被維持於可接受之限度内。 1、、·且成穩及性 “各別轉染在絕大多數狀況下較佳下有可能在轉染前*集表現载继。若多株蛋白件 13 200902548 則此確實為一種選擇，此係由蛋白質之若干不同成員之問題則轉染前彙集表現載體僅在採入一個複本時方為可能的。否要之混雜（scrambling)。於不存在-個細胞表現多株。若多株蛋白質為多聚體，用手段確保每個乡田胞中僅插則，可能發生次單元不合需儘管彙集表現載體有-定可能性，但其與各別轉染相比較為不# ’此係由於預期其產生關於維持組成穩定性之較不穩固製造系統。在本發明之兩種方法中，應瞭解，多株蛋白質通常為與實現表現之細胞並不天然相關之多株蛋白質。本發明描述將變異核酸序列之文庫引入宿主細胞系中以產生適合作為多株製造細胞系之細胞集合的若干方法。此等方法包括用文庫整體式轉染（bulk的㈣灿⑽）細胞集合’·用文庫之部分半整體式轉染細胞等分試樣；或較佳地個別轉染，《中用文庫之個別成M轉染宿主細胞，接著彙集選擇後即產生之純系。較佳地’本發明利用哺乳動物細胞（細胞系或細胞型）作為宿主細胞系。在本發明之一態樣中，由獨立基因片段對編碼多株蛋白貝之個別成員。個別成員包含兩個或兩個以上多肽鏈之多株蛋白質包括可溶形式或膜結合形式之抗體及T細胞受體。在本發明之其他具體實例中，一對基因片段編碼抗體重鏈及輕鏈可變區，或τ細胞受體α鏈及p鏈可變區，或 Τ細胞受體γ鏈及δ鏈可變區。本發明進一步提供包含2個至η個細胞群體之多株細 14 200902548 胞系，各群體表現重組多株蛋白質之獨特成員，該等細胞包含至少一個隨機整合至基因組中之表現構築體。在一具體實例中’至少一個表現構築體隨機整合至染色體外元件中。在另一具體實例中，該至少一個表現構築體在隨機位置處整合至宿主細胞之一或多個染色體中。細胞系車义佳源於哺乳動物細胞系’諸如中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髓瘤細胞（例如 SP2/0細胞、NS0、YB2/0 ) 、NIH 3T3、纖維母細胞或永生化人類細胞（5者如海拉細胞（HeLa cell) 、HEK 293細胞或PER_C6 )。然而’亦可使用非哺乳動物真核或原核細胞，諸如植物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、細菌、真菌等。在又一態樣中，本發明係關於包含編碼與組成性啟動子以可操作方式連接之5型腺病毒反式活化子E1A之穩定整合核酸的DHFR陰性CHO細胞。構築該經修飾之CH0細胞系用於產生本發明之其他態樣之貫驗。如併入本文中之實施例中所示，該細胞系已證貫關於生長速率及表現量之均一性及兩者隨時間之穩定性異常穩定且由此尤其適於在本發明之方法中使用。稍後實驗顯示El A mRNA在經兩次次選殖之細胞中不可偵測。此意謂顯示顯著組成穩定性之結果不可僅歸於El A表現。甚至還預期，穩定表現ElA之DHFR陰性CH0細胞系將產生極穩定及高表現細胞系。

在一較佳具體實例中，細胞系來源於DG44細胞系，其為同型合子DHFR基因剔除的。若細胞包含重組DHFR 15 200902548 表現構築體’則此細胞系可僅在胸*缺乏培養基中存活。在車又佳具體實例中，本發明之細胞系進一步包含編碼所關主多肽之穩定整合表現構築體之至少一個複本。所關庄多肽可為多聚體蛋白質，該多聚體蛋白質較佳為抗體。為允許在胸苷缺乏培養基中選擇，編碼所關注多肽之表現構築體另外編碼dhfr。車又佳地，dhfr及所關注多肽之至少一個次單元係由同一轉錄物編碼’更佳地，dhfr係由編碼最大次單元之轉錄物編碼。由此在所要產物（所關注多肽）與選擇標記（dhf〇之間產生強連接，且確保存活細胞表現所關注多肽。為進一步增強所關注多肽之表現，可由一或多個可由轉錄活化j E 1A &式活化之啟動子控制所關注多肽之表

現’較佳地，其中該啟動子為CMV啟動子或來源於CMV 啟動子。定義「蛋白質」或「多肽」意謂胺基酸之任何鏈，無論長度或翻譯後修飾如何。丨白質可以單體或包含兩個或兩個以上經裝配多肽鏈、蛋白質片段、多肽、寡肽或肽之形式存在之多聚體。如本文所用之術語「多株蛋白質」或「多株性 (polyclonahty )」係指包含不同但同源之蛋白質分子的蛋白質組合物，該等蛋白質分子較佳係選自免疫球蛋白超家族。因此，各蛋白質分子與組合物之其他分子同源，但亦含有一或多段可變多肽序列，該一或多段之特徵在於多 16 200902548 株蛋白質之個別成員之間存在胺基酸序列差異。該等多株蛋白貝之已知貝例包括抗體或免疫球蛋白分子或其衍生物 (諸如Fab、Fab2、單鏈Fvs等）、了細胞受體及B細胞受體。多株蛋白質可由經定義之蛋白質分子亞組組成，該亞組已藉由常見特徵^義，諸如對所要㈣之共有結合活性，例如在針對所要靶抗原之多株抗體的狀況下。術-所關庄之多株蛋白質」涵蓋共有常見特徵之所 ^義多株蛋白質亞組’該常見特徵為諸如對所要乾標之社合活性，例如在藉由針對乾抗原之結合活性或特異性描：之多株抗體的狀況下，該抗原例如為各別蛋白f、微生物、寄生蟲、細胞型、過敏原或碳水化合物分子或任何其他可為特異性抗體結合之靶標的結構、分子或物質中之一或多者或該等抗原之混合物。阴从Μ」或1重多株蛋白質之-個成員」表示包含不同但同源之蛋白質子之蛋白t、组合物的一個蛋白質分子，其中各蛋白質八與組合物之其他分子同源、，但亦含有—或多段可變多二列，該-或多段之特徵在於多株蛋白質之個別成在胺基酸序列差異。 a 」」艾眭」可互換使月術語「重組多株蛋白質之獨特成員只」衣不包含同源之蛋白質分子之蛋白質組合物的—钿 J 個蛋白質分中各蛋白質分子與組合物之其他分子回，、s ' 刀卞问源，但亦含多段可變多肽序列’該一或多段之特徵在於多株蛋 17 200902548 個別成員之間存在胺基酸序列差異。術语「抗體」描述也、、主乩 π之功能組份且通常稱作分子集合（抗體或免疫球I白彳—、/ 耸白）或—個分子（抗體分子或免疫球蛋白刀子）&體分子能與特異性抗原決定子（抗原或抗原决定基）',。口或與之反應、繼而可誘導免疫效應機制。個別抗體分子通常視作單特異性，且抗體分子之組合物可為單株（亦即，由相同抗體分子組成）或多株（亦即，由 .、同抗原上或甚至獨特、不同抗原上之相同或不同抗原決定基反應之不同抗體分子組成）。各抗體分子具有使其能與其相應抗原特異性結合之獨特結構，且所有天然抗體分子具有兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈之相同整體基本結構。抗體亦統稱為免疫球蛋白。如本文所用之術語抗體亦思欲包括嵌合抗體及單鏈抗體；以及抗體之結合片段，諸如Fab、Fv片段或scFv片段；以及多聚體形式，諸如二聚

IgA分子或五價igM。術語「多株抗體」描述能與同一抗原上或不同抗原上之若干不同特異性抗原決定子結合或與之反應之不同抗體分子的組合物。通常認為多株抗體之變異性位於該多株抗體之所謂可變區中。然而，在本發明之情形中，多株性亦可理解為描述存在於所謂恆定區中之個別抗體分子之間的差異’例如，如在含有兩個或兩個以上抗體同型之抗體混合物的狀況下，該等抗體同型為諸如人類同型IgG卜IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl、IgA2'IgM、IgD 及 IgE 或鼠類同型 IgGl、 IgG2a ' IgG2b、IgG3 及 IgA。 200902548 「所關注之重組多株抗體」描述所定義之重組多株抗體亞組’其特徵在於與所要靶標或所要靶標組結合之能力，該等靶標例如為各別蛋白質、微生物、寄生蟲、細胞、過敏原或碳水化合物公；―、甘π a ^ 初刀子或其他可為特異性抗體結合之靶標的結構、分子或物質或其混合物。術語「免疫球蛋白」通常用作血液或灰清中所發現之抗體混合物之統稱，但,亦·^ -方了用於命名其他來源之抗體混合物。術-s疫球蛋白分子」表示個別抗體分子，例如，為免疫求蛋白之部分，或任何多株或單株抗體組合物之一部分。當陳述多株蛋白暫> + g β ,, 成員/、抗原、，'σ合時，其此處意謂具有低於1 mM、較佳依於〗ΛΛ A/r ^

平又佳低於100 nM、甚至更佳低於10 nM 之結合常數的結合。術語「所關注之變異核田认# + 八 U敗刀于之文犀」用於描述核酸集& ’其共同編碼「所關注之重組多株蛋白質」。當用於轉染時，所關4 、異核酸分子之文庫含於表現載體之文庫中。該文庫典型地具有至少2個、3個、4個載 5 固6個、10個、20個、50個、1000個、104個、1〇5個或1〇6個獨特成員。 W個如本文所用之術語「獨特核酸序列」應一起構成所關注蛋白皮曰貝之不同多肽鏈的核酸序去核酸序列包含一個以上縊m+ ^ 田獨特子轉錄單元之形式戋其芒^ 雙順反飞次其右與合適啟動子以可 19 200902548 接，則可以兩個各別轉錄單元之形式操作。同樣地，關注蛋白質由3個或4個次單元組成，或若選擇標記碼所關注蛋白質或其次單元之核酸一起包括於轉錄單元中’則可設想使用三順反子及四順反子轉錄單元。較佳地，本發明之獨特核酸序列為核酸分子（諸如載體）之一部分。一些需要一個以上編碼序列以產生所關注蛋白質之二二分子之實例包括B細胞受體、抗體及抗體片段（諸如可變域）A T細胞受體。當引入細胞中時，一起編碼所關注之經完全裝配蛋白質的基因存在於同一載體中，由此在一個核酸序列中連接於一起。如本文所用之術語「所關注基因」係指包含—或多個編碼所關注蛋白質之一個成員的基因片段（基因組或 _A) <核酸序列。複數形式之「所關注基因」係指編碼所關注多株蛋白質之核酸序列之文庫。術語「⑽」用作所關注基因（包括單數與複數形式）之縮寫。如本文所用之術語「載體」係指核酸序列可***其中用於在不同it傳環境之間輸送及/或用於在宿主細胞中表現之核酸分子。若載體帶有供***載體中之核酸序列轉錄用 ^調郎70件（至少—合適啟動子），則該載體於此處稱為「表現載體」。若***上文所鏗別之載體中之核酸序列編碼如本文所定義之所關注蛋白質，則使用以下術語：「所關注載1及「所關注表現載體」。術語「同型編碼載體

Un lsotype_enc〇ding概⑽）」係指帶有編碼抗體同型之核酸序列之載體。在本說明書中，「嗟菌體载體（0W 20 200902548 vector)」及「噬菌體裁體r …「趙规戟體（Phage而〇r)」可互換使用。術語負體」及「載體」可互換# _ 比L ^ 立換使用。本發明意欲包括起 4效功庇之其他形式载體』如質體、噬菌體及病毒基因組或此引導所要蛋白質在適去、田伤主中產生之任何核酸分子0 術語「所關注載體之文庫之每個成員」用於描述來源於所關注載體之文庫之具有獨特核酸序列的個別載體分 f 子，其中該核酸序列編碼所關注之重組多株之一個成員。術語f量轉移（mass transfe〇」帛於描述所關注之核酸序列自一個載體群體轉移至另一個載體群體且對各 DNA同時如此進行，而不重新分選以分離所關注之個別 DNA。該等載體群體可為含有（例如）所關注之可變區、啟動子、前導序列或強化元件之文庫。接著可在無預先分離之情況下將此等序列自（例如）噬菌體載體移至哺乳動物表現載體。尤其對於抗體序列而言’此技術確保在文庫自（例如）選擇載體（例如噬菌體呈現載體）移至哺乳動物表現載體時VH與VL多樣性之間的聯繫不會喪失。藉此保留VH與VL之原始配對。術語「轉染」於本文中用作將外來DNa引入細胞中之廣義術語。該術語亦意欲涵蓋將外來DNA引入細胞中之其他功能等效方法’諸如供體細胞及受體細胞之轉型、感染、轉導或融合。術語「選擇」用於描述細胞已獲得能與尚未獲得某特 21 200902548 徵之細胞分離之彼特徵的方法。劑+ 該專特徵可為對細胞毒性 y八机性或產生必需營養素、酵素或顏色。術語「可選標記基因「選擇標記基因「選土因」及Μ票記基因」用於描 ,^ Α 疋、、扁碼可選標記之基因（例如，賦予針對某細胞毒性藥物（的美闲” * 辨物（啫如某些抗生素）之抗性的基因、忐產生可自生長培養某 ^ ^ . I基耗盡之必需營養素的基因、編碼產生可分析代謝物 n Γ A 畔素的基因或編碼（例如） / 可由FACS分選之有色蛋白質、iAm 為的基因），可將其連同所關 /主基因一起共同引入細胞中。術語「重組蛋白質」用於描述 ^ + k目經包含蛋白質之編碼序列之表現載體轉染的細胞系表現之蛋白質。如本文所用之術語「以可操 ’、乍方式連接（operably hnked)」係指一片段被置於 ^ 月奴之功能關係時， /、該另一片段連接。舉例而

右觸瑪# 5虎序列之DNA 被表現為參與多肽轉移至内質絪負網之刖導序列，則該編碼信號序^之職與編碼該多肽之_A以可操作方式連接。又，若啟動子或強化子刺激編碼序列轉錄，則該啟動子或強化子與该編碼序列以可操作方式連接。術語「大多數個別細胞」係指一定百分率之細胞，諸如大於80%、較佳大於85%、更佳人丨王yu/。、95%或甚至99〇/〇或更高。如本文所用之術語「基因組」並非照文字上理解為存在於細胞中之染色體之正常補體，而亦為可引入細胞中或維持於細胞中之染色體外元件。料染色體外元件可包括 22 200902548 但不限於）.迷你染色體（mini_chr〇inosoine)、酵母人工染色體（yeast artificial chrom〇s〇mes , YAC )、小鼠人工染色體（mouse artificial chr〇m〇s〇mes，MAC)或人類人工染色體（human artificial chromosomes，HAC ) 〇術語「啟動子」係指結合RNA聚合酶以起始轉錄之過程中所涉及之DNA區。術口。頭對頭啟動子（head-to-head promoters )」係扣靠近置放使得由啟動子驅動之兩個基因片段轉錄反向發生之啟動子對。頭對頭啟動子亦可構築有包含兩個啟動子之間的不相關核酸之填充片段。該填充片段可易於含有5〇〇個以上核普酸。「抗生素抗性基因（antibiotic resistance gene)」為編碼能克制抗生素對細胞之抑制作用或毒性作用以確保該細胞在該抗生素存在下存活且繼續增殖之蛋白質的基因。術語「内部核糖體進入位點（internal rib〇s〇me entry site)」或「ires」描述不同於mRNA上之正常5'端帽子結構之結構。兩種結構均可由核糖體識別以起始對AUQ 密碼子掃描來起始翻譯。藉由使用一個啟動子序列及兩個起始AUG，可自單一 mRNA翻譯第一多肽序列及第二多肽序列。因此’為能自單一雙順反子mRNA共同翻譯第一聚核苦酸序列與第二聚核苷酸序列，該第一聚核苷酸序列及該第二聚核苷酸序列可經由連接子序列（包括能使IRES 序列下游之聚核苷酸序列翻譯之IRES序列）以轉錄方式融合。在此狀況下，經轉錄之雙順反子RNA分子將自加 23 200902548 帽5’端且自雙順反子RNA分子之内部IRES序列翻譯，從而產生第一多肽與第二多肽。術語「可誘導性表現（inducible expression)」用於描述需要誘導分子相互作用或輔佐抑制分子及供表現之調節蛋白質釋放發生之表現。術語「組成性表現（constitutive expressi〇n)」係指並非通常為可誘導性之表現。術語「混雜（scrambling )」描述自個別細胞表現多株蛋白質之兩個或兩個以上獨特成員（各自包含兩個或兩個以上不同多肽鏈（例如來自免疫球蛋白超家族之情形。此情形在個別細胞已整合至基因組（一對以上基因片 k )中時可發生，其中各對基因片段編碼多株蛋白質之獨特成員。在該等情形下，可形成自基因片段表現之多肽鏈的非所欲組合。多肽鏈之此等非所欲組合可能不具有任何治療作用。術語「vH-vL 鏈混雜（vH_vL chain scrambling)」為上文所^義之混雜之-實例。在此實射，VH及VL編碼基因片段構成一對基因片段。混雜在自細胞產生及、多肽之非所欲組合時發生，其令兩個不同\及VL編碼基因片段對被整合至同一細胞中。該混雜之抗體分子不太可能保留原始特異性，以此可能不具有任何治療作用或甚至非所欲之治療作用。術語「重組多株製造細胞系（recombinant p0lyclonal manufacturing cell llne )」係指經所關注之變異核酸序列 24 200902548 f \ 之文庫轉染使得一起構成重組多株製造細胞系之個別細胞 π有所關注之獨特核酸序列之一或多個複本的蛋白質表現細胞之群體’其中該獨特核酸序列編碼所關注之重組多株蛋白貝之一個成員，且各複本被整合至各細胞之基因組中。針對保留所關注之獨特核酸序列之經整合複本的能力來選擇構成重組多株製造細胞系之細胞，例如藉由抗生素選擇。可構成該製造細胞系之細胞可例如為細菌；真菌；真核細胞，諸如酵母；昆蟲細胞；或哺乳動物細胞，尤其水生哺乳動物細胞系，諸如CHO細胞、c〇s、細胞、細胞、骨髓瘤細胞（例如Sp2/0細胞、NS〇、γΒ2/〇)、νιη 3Τ3及永生化人類細胞（諸如海拉細胞、2们細胞或 PER.C6)。術語「偏差（bias)」用於表示重組多株蛋白質產生期間之現象中多株載體、多株細胞系或多株蛋白質之組合物因隨機遺傳突變、個別細胞之間的增殖動力學差異、不同表現構築體序列之間的表現量差異《DNA之選殖效率差異而隨時間改變。術語「RFU>」係指「限制片段長度多型性UeStriction 咏福1邮^。1，_叫」，其為—種在用限制酵素裂解後分析核酸分子片段之遷移凝膠圖案之方法。術語「5, UTR」係指邮财之5|非翻譯區。術語「避免位點特異性整人么正0 之條件（c〇nditions avoidi sit"«㈣。„)」係指不包括獲得位點特異合之任何可能方式的轉染過程。位點特異性整合可（例如） 25 200902548 使用重組酶及重組酶於宿主細胞染色體中之識別位點之組合來達成。重組酶亦可與識別染色體中之特定位點之核苦酸段共價連接。位點特異性整合亦可使用同源重組達成-但效率較低。若使用整合載體，則避免位點特異性整合通常將使得在宿主細胞整個基因組的隨機位置處整合。術語「隨機整合（random integration)」係指表現載體在隨機位置處整合至宿主細胞之基因組中。隨機之辭典含義為對各個項目（在此狀況下為整合位點）存在同等機會。當轉染細胞時，所有整合位點並不表示絕對同等機會之整合，此係由於染色體之一些部分比其他部分更傾向於整合事件。當未做任何事情以將表現載體引導至特定整合位點時，其將在可能整合位點之組内隨機的位置處整合。因此，在本發明之情形中’ 「隨機整合」應理解為未做任何事情以將表現構築體引導至預定位置之轉染程序。不存在將表現載體引導至預定位置之手段足以確保「隨機整合」。因而，整合位點在經轉染群體中的細胞之間會有所不同’且準確整合位點可視為不可預測。術S吾「穩定整合（stably integrated )」係指表現載體整合至佰主細胞之基因組中，其中該整合經至少2 〇代、更佳30代、更佳40代、更佳5〇代（諸如75代，例如1〇〇代）或更多代而保持穩定。縮寫：「CMV」=(人類）細胞巨大病毒。「AdMLP」 =腺病毒主要晚期啟動子。SV4〇多聚A =猿猴病毒4〇多聚A信號序列。GFP =綠色螢光蛋白質。TcR = τ細胞 26 200902548 文體。ELISA =酵素聯結免疫吸附檢定。LTR=長末端重複序列。【實施方式】發明詳細描述重組多株蛋白質表現系統本I明k供可罪地製造較佳選自免疫球蛋白超家族（具有類免疫球蛋白域之蛋白質家族）之重組多株蛋白質的方法。大多數成員與細胞表面識別事件有關。序列分析表明抗體、T細胞受體、MHC分子、一些細胞黏附分子及細胞激素（cytokines )受體高度同源。含有可變區之此家族成員尤其適合於產生本發明之重組多株蛋白質。該等成員包括抗體、膜結合抗體（B細胞受體）、Fab片段、Fv片段、單鏈Fv ( scFv)片段、T細胞受體（TcR)、可溶性TcR、 TcR可變域片段、藉由多肽連接子連接之TcR可變域片段或其他抗體或TcR源性片段。詳言之，預期本發明可用於重組治療性多株抗體及TcR之大規模製造及生產。本發明之製造方法之主要優勢之一在於構成重組多株蛋白質之所有成員可於一個或數個生物反應器或其等效物中產生。另外，重組多株蛋白質組合物可自反應器以單一製劑形式純化，而無須在製程期間分離構成重組多株蛋白質之個別成員。相比之下，若欲藉由混合經純化之單株抗體模擬重組多株抗體組合物（例如，如W 〇 91 /16 0 7 4中所提出），則將需要在生物反應器中各別製造待包括於組合物中之各抗體且亦將個別地純化抗體。此單株混合物之產 27 200902548 生與如本文所述產生重組多株抗體或其他多株蛋白質之方法相比，成本高昂、耗時且佔用面積大。因此，如w〇 91/16074中所述之方法對於可包括於該混合物中之單株抗體數目當然存在實際限制，而如本文所述之技術—般可產生具有許多個別成員（原則上無上限）之多株抗體。所使用之宿主細胞系較佳為哺乳動物細胞系，包含典型地用於生物醫藥蛋白質表現之彼等哺乳動物細胞系例如CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髓瘤細胞（例如 SP2/0細胞、NSO、YB2/0) 、NIH 3T3及永生化人類細胞 (諸如海拉細胞、HEK 293細胞或PER.C6)。在本發明中，使用CHO細胞，更特別為經修飾之DG44純系。選擇此特殊細胞系的原因在於，CHO細胞被廣泛用於重組製造抗體且DG44純系可與另外允許所編碼之基因擴增的代謝選擇標記DHFR組合使用。 DG44細胞系已藉由經編碼El A反式活化子之表現載體轉染而加以修飾。當所關注基因與CMV啟動子以可操作方式連接時’進行此修飾以增加總產量。CMV啟動子係由E1A反式活化。修飾已提供異常穩定之細胞系，從而提供針對不同抗體具有均一生長速率及均—且較高表現量之細胞純系。由此認為修飾改良了隨時間之組成穩定性。偵測經修飾細胞系中之El A表現的嘗試已失敗。因而，均一生長速率及均一且較高表現量不太可能僅歸於E1A表現。儘管在目前狀況下’ El A表現不可偵測，但仍咸信利用E1A 表現使CMV啟動子反式活化可產生更高且穩定之表現量。 28 200902548 較佳將BHK-21細胞或CHO細胞用於表現。合適之cH〇胞匕括（但不限於）CH〇_K1及CH〇 s細胞。之缺乏突變體（諸如CH〇_DUKX_BU或DG44)為用於實施本發月之較佳哺乳動物細胞。此等細胞在此項技術中已為熟知且廣泛可得，例如可得自美國菌種保存中心(二：

Type Culture Collection, A.T.C.C., Rockville, Md.) (BHK-21)或 Dr. Lawrence Chasin, Columbia University， New Y〇rk(CHO DUKX_BU或DG44)。此等細胞良好適應$懸洋培養物中（亦於無血清條件下）生長及/或可在低血清浪度下生長且可與DHFR選擇標記一起使用。較it對、'’田胞系進行次選殖且選擇顯示較高且穩定表現多株蛋白質之成員的純系。因此’ 一般熟習此項技術者將能用其他純系取代DG44 純系且用如所述之其他哺乳動物細胞取代CHO細胞，或甚至利用其他類型之細胞，包括植物細胞、酵母細胞、昆蛛細胞、真菌及細菌。因此，細胞類型的選擇並不意欲限制本發明。使用本發明之方法可獲得之產量視許多參數而定，該等茶數包括（但不限於）培養條件及所使用之宿主細胞種類。在本發明之具體實例中，產量較佳超過50 mg/L·蛋白貝諸如大於mg/L，例如大於75 mg/L ’諸如大於1〇〇叫/L ’例如大於125 mg/L，諸如大於15〇 mg/L，例如大於200 mg/L ’諸如大於250 mg/L，例如大於300 mg/L，者如大於400 mg/L，例如大於500 mg/L ’諸如大於600 29 200902548 mg/L，例如大於7〇〇 mg/L，諸如大於75〇 mg/L，例如大於_ mg/L，諸如大於9〇〇 mg/L，例如大於1〇〇〇叫化，諸如大於2 g/L，例如大於3 g/L，諸如大於4 g/L，例如大於 5 g/L 〇本發明之重組多株蛋白質意欲涵蓋包含不同但同源之蛋貝刀子的蛋白負組合物，該等蛋白質分子天然可變，意謂在較佳具體實例中，變異核酸之文庫包含天然產生之多樣性。因此，各蛋白質分子與組合物之其他分子同源，但亦含有-或多段可變多肽序歹，卜該—或多段之特徵在於多株蛋白質之個別成員之間存在胺基酸序列差異。構成可變多肽序狀胺基㈣列差異可能小至—㈣基酸。較佳地，胺基酸序列之差異構成一個以上胺基酸。通常，認為多株抗體或TcR之天然變異性位於多肽鏈之所謂可變區或V區中。在本發明之一態樣中，多株蛋白質中之個別成員包含長度大致介於80個與120個胺基酸之間的可變區。可變區可包含高變域，例如互補決定區（CDR )。在天然產生之TcR中，各可變區中有四個CDR。在天然產生之抗體中，重鏈中有三個CDR且輕鏈中有三個 CDR。在本發明之又一態樣中，多株蛋白質之個別成員之可變區包含至少一個長度介於i個與26個胺基酸之間、較佳長度介於4個與16個胺基酸之間的高變域。此高變域可對應於CDR3區。對於抗體而言，各可變區較佳構成三 30 200902548 個同變域。此等高變域可對應於Cdri、CDR2及CDR3。對於TcR而言’各可變區較佳構成四個高變域。此等高變域可對應於CDR1、CDR2、CDR3及CDR4。高變域可單獨構成本發明之重組多株蛋白質之可變區内的可變序列。在本發明之情形中，多肽序列之變異性（多株性）亦可理解為描述存在於抗體多肽鏈之所謂恆定區或C區中之個別抗體分子之間的差異，例如，如在含有兩個或兩個以上不同抗體同型之抗體混合物的狀況下，該等抗體同型為諸如人類同型 IgG卜 IgG2、IgG3、IgG4、IgA卜 IgA2、IgM、 IgD 及 lgE 或鼠類同型 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、工⑽ 及IgA。因此’重組多株抗體可包含特徵在於可變區（v 區）中或恆定區（C區）中或二者中個別抗體分子之間的序列差異之抗體分子。較佳地’抗體具有相同同型，此係由於此種情形會使後續純化相當容易。亦可設想將（例如）同型IgGl、IgG2及IgG4之抗體組合，此係由於此等同型可使用蛋白質A親和層析法一起純化。在一較佳具體實例中’構成多株抗體之所有抗體具有相同恆定區以進一步有利於純化。更佳地，抗體具有重鏈之相同恆定區。輕鏈之恆定區在獨特抗體之間亦可相同。為提供編碼結合特定抗原之蛋白質的變異核酸序列，可利用此項技術中已知之許多方法。典型地，本發明將得放於使用能鑑別及/或分離編碼結合特定抗原之蛋白質之核酸的筛選程序。若干此等方法包括自以下技術已知之富集步驟或所謂生物淘選步驟（biopanning step ):諸如 31 200902548

Symplex™ ( Mejier % A, 2006, J. Mol. Biol, 358:764-772 ； WO 2005/042774 )、噬菌體呈現（Kang，A_S.等人 1991. Proc Natl Acad Sci U S A 88，4363-4366 )、核糖體呈現 (Schaffitzel，C.等人 1999.J.Immunol.Methods231，119-135)、DNA 呈現（Cull, M.G.等人 1992. Proc Natl Acad Sci U S A 89，1865-1869 ) 、RNA-肽呈現（Roberts,R.W.，

Szostak，J.W.，1997_ Proc Natl Acad Sci U S A 94，12297-12302 )、共價呈現（covalent display) (WO 98/37186)、細函表面呈現（Fuchs，P_ 等人 1991 · Biotechnology 9， 1369-1372)、酵母表面呈現（Boder，E.T., Wittrup，K.D.，1997. Nat Biotechnol 15,553-557)及真核病毒呈現（Grabherr，R.，

Ernst,W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 1 8 5 -1 9 2 ) ，s亥等技術皆為此項技術中已知之方法，且皆為

實施本發明之受關注辅助法。FACS及磁性珠粒分選亦適用於使用經標記抗原達成富集（淘選）目的。亦可繼生物淘選步驟之後或單獨使用免疫偵測檢定，諸如EUSA (Dreher，M.L.等人 1991. J. Immunol. Methods 139, 197-205 )及 ELISPOT (Czerkinsky，C.C.等人 i983. j Im_〇1

Methods. 65，109-21)。所關注之重組多株蛋白質之組合物包含已藉由常見特徵定義之所定義蛋白質亞組，該常見特徵為諸如對所要靶標之共有結合活性，例如在針對所要靶抗原之多株抗體的狀況下。典型地，多株蛋白質組合物具有至少2個、3個、 100 個、1〇〇〇個、1〇4 4個、5個、10個、20個、50個 32 200902548 個、1〇5個或1〇”固獨特變異成員。多株蛋白質組合物中所需之獨特成員之數目將視粗標之複雜性而定。在抗體之狀 2下，所靶向之抗原的複雜性將影響多株抗體組合物中所需之獨特變異成員之數目。就較小或不太複雜之靶標（例 J蛋白貝）而5 ，包含2或3個與1〇〇個之間的獨特變異成員之多株抗體組合物可能足夠，且變異體之數目較佳磁超過90個或甚至80個或70個。在許多情形中，獨特 ::體之數目將不超過60個或50個，且變異體之數目較 ;個與40個之間’諸如5個與3〇個之間。而對於 I 靶標而曰，包含20個至500個之間的獨特變異貝之多株抗體組合物可能足夠。對抗原包含許多不同分間雜靶標而言，可能需要包含5。個至1()，°°〇個之 S 寺變異成員之多株抗體組合物。 =哺乳動物中’存在天然產生之多株蛋白質之若干已子其在血液中自由循環，諸如抗體或免疫球蛋白分在一二表面上’諸如T細胞受體及B細胞受體。係藉由編碼4天然產生之多株蛋白質之多樣性成：另外已：等 '白質之可變區之基因的遺傳重組來達發明可萨由：抗體藉由體細胞突變而使其多樣性增加。本 ::二可變域或⑽區)且自其產生文庫來利用此：鏈與τ對於自例如抗體可變重鏈與可變輕鏈、TcRa 白質而言：文鏈之兩個獨立基因片段編碼之蛋之載體將構成一對此等可變區編碼序 33 200902548 列了是區編碼序列對之文座的其止a 知。文庫的產生在此項技術中已為熟包含天然產生之乡魏變區編碼序列之隨機配對源 ^文庫（可細胞:可變區編碼序列對，例…。❹二入適當構架（諸如抗體或丁化可變區 _ 开

基因片段產生之其他文庫f D〇之經分離CDR 文庫（例如S〇derlind，E箄人_λλλ Nat. Biotechnol. 18 852 ， 000· 佐设 6)適用於本發明。較佳篩潠女庫以獲得具有所要特異較佳^文二入辱（所關注文庫）。蛋白質之多樣性亦可以人工方由突變。突變可為編碼單一蛋之=成歹'°口成或藉或點突變，從而產生單_蛋白拼&酸序列的隨機突變诚^ 早蛋白質之多株群體。產生人工浐 =庫：另-實例描述於…9 841中，其為一種基：另一⑽文庫組合之可變區構架文庫之方法。在本發明之-較佳具體實例中，重組組多株抗體或抗體片段。蛋質為重 “發明之另一較佳具體實例中，重重組多株TcR或TcR片段。貢馬口此本心明之重組多株蛋白質亦可由不或更佳由不同亞類構成。免籌成蛋白分子之恒定部分中㈣株性可在免疫球者中出現。 -中或恆疋部分與可變域二抗體之所„月艮疋區、尤其重鍵中之多株性在抗體之治療應用方面受關注。各種免疫球蛋白同型具有不同生物功 34 200902548 能（概述於表1中）’當利用抗體進行治療時可能需要將其組合，此係由於免疫球蛋白之不同同型可能牽涉於天然免疫反應之不同方面（Canfield 及]VIorri son 199 1. J. Exp Med 173，1483-91 ; Kumpel 等人 2002. Transfus.Clin.Biol. 9, 45.-53，Stirnadel 等人 2000. Epidemiol. Infect.124, 153-162)。表1 :人類免疫球蛋白同型之生物功能人類免疫球安白 IgG, IgG, I叫 IgA, IgA, IgM IgD IgE 傳統補體活化 +++ ++ ++++ + ++++ 替代補體活化 + + + +++ + — 一 + — 胎盤轉移 + ++ + ++ — — 一一細菌溶解 + + + + +++ +++ + ? ? 巨噬細胞/其他吞 °里細胞結合 + — + + + + — — — 肥大細胞/嗜鹼細胞結合 — — — — 一 — — 一 — 葡萄球菌蛋白質 _Α反應性 — + + — + 一 — — — — 本發明之又一態樣為包含含有2-n個細胞群體之多株細胞系的重組多株製造細胞系，其中各群體表現重組多株蛋白質之獨特成員，該等細胞包含隨機整合至基因組中之表現構築體。該等表現構築體較佳穩定整合至基因組中。在一具體實例中，構築體被整合至一或多個染色體中。多株細胞系中細胞群體之數目η可為3個或3個以上， 4如4個或4個以上，例如5個或5個以上，諸如6個或 6個以上’例如7個或7個以上，諸如8個或8個以上， 35 200902548 例如9個或9個以上’諸如1〇個或ι〇個以個或11個以上’諸如12個或12個以上，例如i 13 個以上，諸如14個或14個以上’例如15個或i二諸如個或16個以上，例如17個或17個以上，’ 個或18個以上，例如19個或19個以上，諸如20 個以上，例如21個或21個以上，諸如22個或、例如23個或23個以上’諸如24個或24個以上，例如2’5 個或25個以上，諸如26個或％個以上，例如2 η 個以上，諸如28個或28個以上，例如29個或29個以上省如3〇個或30個以上，例如35㈣35個以個或，上，例如45個或45個以上，諸如5。= 個以上’例如60個或60個以上，諸如7〇個或7 :列如個或80個以上’諸如9〇個或9〇個以 ’ 個或100個以上。！如100 :多數情況下，η可小於W個’諸如小於45個，例如小於40個，諸如小於35個，例如小於3〇個。二本發明之一重要具體實例為在最終混合多株細胞系之則所進行之細胞選殖步驟。此步驟藉由使純系偏差⑺^ 二)之出現降至最低而使所獲得之多株細胞庫之產量及心疋性侍以改良。表現重組多株蛋白質之一個獨特成員之細胞可來源於1個或1個以上經選殖之細胞，諸如2個或 2個以上，例如3個* 3個以上，諸如4個< 4個以上，例如5個或5個以上，諸如6個“個以上，例如7個或 7個以上’諸# 8個或8個以上，例如9個或9個以上， 36 200902548 諸如10個或10個以上，例如η個或η個以上，諸如12 或個以上’例如13個或丨3個以上，諸如1 4個或i 4 们乂上你j如1 5個或i 5個以上，諸如工6個或丄6個以上，例如17個或17個以上，諸如18個或18個以上，例如19 個或19個以上，諸如2〇個或2〇個以上，例如21個或2ι ^ 個或22個以上，例如23個或23個以上，諸如24個或24個以I* 7 , 乂上’例如25個或25個以上，諸如26 或26個以上，例如27個或27個以上，諸如28個或28 乂上例如29個或29個以上，諸如3〇個或3〇個以上，例如h個或35個以上，諸如4〇個或4〇個以上，例如Μ 個或45個以上，諸如5〇個或50個以上，例如60個或6〇個以上，諸如7 0個忐7 iWn 1口成70個以上，例如80個或80個以上，諸如9〇個或90個以上，例如ι〇〇個或ι〇〇個以上。在多清况下經選殖細胞之數目小於50個，例如小於20個，諸如小於1”固，例如小於1〇個。在上述具體實例之又—具體實例中，編碼多株蛋白質 (車又佳來自免疫球蛋白超家族）之變異核酸序列皆來源於天然產生之序列’例如自供體分離之序列。純系多樣性夕株蛋白質之特徵之一在於其由許多個別蛋白質分子構成’其中各蛋白質分子與多株蛋白質之其他分子同源， ===於多株蛋白f之個別成員之間的胺基酸序差異之老異性。較佳祕，兮笙M w m Λ 較佳地5亥荨差異限於多株蛋白質之整、、，。構的獨特區域。該等區域例如仇歷及丁CR之可變區 37 200902548 且可能進一步限於述為多樣性… 域中之CDR區。此變異性亦可描別八σ在核酸層面上與蛋白質功能層面上鑑別，例如對靶標 <特異性及親和力差異。細胞系之純系& 多樣性可藉由對自表現重組多株蛋白質之、，、田胞池分離之紬备 _

、。進仃RFLP來分析。（RT)-PCR產物之疋序係分析純车容样liL ^樣性之另一可能方式。亦可藉由對由細月匕糸產生之重紐客址，，夕株蛋白質進行功能測試（例如ELISA) 枝it樣性。WQ 2GG6/G(m53揭示表徵多株細胞系及多之方法。此等方法可用於分析細胞系及所得多株蛋白質之純系多樣性。旦、〖在屯系偏差（亦即，構成多株抗體之個別抗體含里逐漸變化），則其可藉由將用於轉染之初始文庫之純系樣U現重組多株蛋白質之細胞（細胞系）池中所發見之夕樣性相比較來進行評估。併胞系表現之多株蛋白質之純系多樣性可以多株蛋貝所引起之覆蓋（target eGv⑽ge )來評估。在此狀況下’當約25-1〇〇%之所要乾分子被多株蛋白質結合時，視為獲得足夠多樣性。舉例而言，&多株抗體之狀況下，抗 ”靶抗原表面上至少25%之非相同抗原決定基結合提供組合物巾之足夠多樣性。乾覆蓋所引起之純系多樣性較佳為至少50%’且甚至更佳為至少、75%。對於抗體而言，該靶覆蓋可（例如）藉由抗原決定基定位來評估。或者，純系多樣性可以多株組合物個別成員之分布來評估。此分布可以與轉染期間最初引入細胞系中之不同編 38 200902548 碼序列之數目相比’农終多株蛋白質組合物中之不同個別成員之總數來評估。在此狀況下，當轉染中最初使用之編碼序列之至少50%、較佳至少75%、更佳至少8〇%、更佳至少90。/。（諸如至少95%、97%、98%或99%)可被鐘別為最終多株蛋白質之不同個別成員時，視為獲得足夠多樣性。以另一方式表示，若製造期間多株蛋白質中僅丨個成員喪失，或若2個、3個、4個或5個成員喪失，則純系多樣性可視為足夠。多株組合物個別成員之分布亦可關於個別成員之間的相互分布來評估。在此狀況下，若組合物中無單一成員構成最終多株蛋白質組合物中之蛋白質總量的75%以上，則 ^為獲得足夠純系多樣性。較佳地，無個別成員超過最終夕株組合物中之個別成員總數的5 〇%以上，甚至更佳為2 $ % f取佳為10%。基於多株組合物中個別成員之分布的純系多樣性評估可藉由RFLp分析、序列分析及蛋白質分析來進行，諸如稍後對於多株組合物表徵所述之方法。純系多樣性可因純系偏差而降低，該純系偏差可因a) 表現里之差異，b)細胞增殖之變化而出現。若該等偏差出現，則易於藉由對如本文所述之方法進行微小修改來補救純系多樣性喪失之此等來源中之每一者。有可能細胞系中個別細胞之細胞增殖速率的變化可經 ^長之時段將偏差引人重組多株蛋白質表現中，使由細胞由表現之重組多株蛋白質之一些成員的存在增加或減少。於本發明方法可能基於隨機整合至宿主細胞之基因組 39 200902548 中’因此位置與複本數在多株細胞系之同。此可能引扭妯金員之間有所不 ^引起“之間增殖料及表選擇具有類彻掸結、古士 J左異。藉由有類似增殖速率之細胞純系，使此一可能性為使用多株蛋白質之各成員之—個以化^ ::說3明與多株蛋白質之各成員僅一個純系相比純:使： "於3個肖5個之間的表現使用系，則組成穩定性增加。質之早-成員之純處理此問題之另—方式為使用一或多個選保細胞在某些預設限度内關於一或多個標準為均—的节 -f多個標準係選自由生長速率、倍增時間、表現量、產/ 生量、隨時間之產生穩定性、生存力、耐性、穩固性、形態及複本數組成之群。增殖速率變化之一原因可能為構成用於初始轉染之開始細胞系之細胞群體為異質的。已知細胞系中之個別細胞經延長之時段不同地發育。為確保更均質之開始物質，在用所關注之表現載體轉染之前’可使用將細胞系限制稀釋 (limiting dilution)直至單細胞層面且使各單細胞生長成新細胞群體來進行細胞系之次選殖或重複次選殖（所謂藉由限制稀釋進行細胞次選殖）。用於單細胞選殖以確保明確定義之細胞群體之一替代較佳方法為繼轉染之後使用螢光活化細胞分選（FACS)。此可在選擇程序之前完成。經螢光標記之抗體可用於富集來源於經IgG構築體轉染之細胞池之高產細胞（Brezinsky

等人 J_ 2003. Immunol Methods 277, 141-155 )。使用 FACS 40 200902548 分選之優勢在於該方法組合單細胞選殖（藉由將單細胞分選至孔中），而同時提供關於各單細胞之表現量的資訊。為進一步改進分選程序，可將生存力染色（viabUity stain) 〇括在内以摒棄死亡細胞或顏臨死亡細胞。FACS程序使細胞經叉相當嚴格的條件，包括剪應力。此意謂間接選擇對4等條件具抗性之細胞。此外，自動化操作facs程序以允許分選大量單細胞。 FACS方法亦可用於分選表現類似量之免疫球蛋白之、、田胞從而產生關於生產力之均質細胞群體。同樣地，藉由使用以螢光純5,6-羧基螢光素二乙酸鹽丁二醯亞胺酯 (CFSE)標記，可藉由FACS方法選擇顯示類似增殖速率之細胞。本發明之一重要具體實例為產生多株抗體之各成員之一或多個選殖細胞系。單細胞純系的產生可使用許多標準技，中之S者進行。然而’結果為，針對生存力及量選擇細胞且將其個別分選至孔中之FACS細胞分選法已始終如一地顯示提供適合於製備多株主細胞庫及後續多株作細胞庫之穩定純系。可I FACS分選之前或期間移除來自（例如）Mtx之選擇壓力，但較佳維持持續選擇壓力，例如’藉由於無核苦培養基中生長。較佳在繼細胞分選之後在選擇壓力下於培養物中一定天數後選擇個別純系。由於在分選之後同-天選擇純系，因此該等純系之生長速率將：對均一。除此之外’亦視覺檢查群落以摒棄與原始未轉染之細胞系相比形態明顯變化且生長速率較低之純^。 41 200902548 最後，可使用（例如）ELISA或其他分析技術檢定抗體表現量且可選擇具有較高及相對均一表現量之純系。即使確實發生增殖速率所誘導之偏差，個別成員之喪失或過度呈現亦可能未必關鍵，此視最終重組多株蛋白質產品之多樣性需求及多樣性隨時間之穩定性而定。宿主細胞宿主細胞可自可將DNA整合至其染色體中或保留染色體外元件之任何細胞產生，該等染色體外元件為諸如迷你染色體、酵母人工染色體（YAC )、小鼠人工染色體 (MAC )或人類人工染色體（HAC ) 。MAC及HAC詳細描述於WO 97/40183中’其以引用的方式併入本文。較佳地，使用哺乳動物細胞，諸如CHO細胞、COS細胞、BHK 細胞、骨髓瘤細胞（例如Sp2/0、YB2/0或NS0細胞）、纖維母細胞（諸如NIH 3T3)及永生化人類細胞（諸如海拉細胞、HEK 293細胞或PER.C6 )。然而，亦可使用非哺乳動物真核或原核細胞，諸如植物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、真菌、大腸桿菌（E. coli)等。在本發明之一具體實例中，藉由在用所關注載體之文庫轉染之前對細胞系進行所謂限制稀釋直至單細胞層面、接著使各單細胞生長成新細胞群體來次選殖待用作開始物質之細胞系。必要時，亦可在選擇正確細胞系之過程中稍後進行該次選殖。單細胞選殖之其他方法包括：FACS選殖（Brezinsky 等人 J. 2003. Immunol Methods 277，141-155)、LEAPTM 技術（來自 Cyntellect，San Diego, California, 42 200902548 USA)及 cionePix (來自 Genetix，UK)。整合用載體以下描述集中於使用哺乳動物表現系統。然而，同樣可能使用具有合適修改之用於在細菌中表現之本發明方法。合適之載體包含合適之選擇基因。用於哺乳動物細胞表現之合適選擇基因包括（但不限於）能用於營養選擇之基因’諸如胸苷激酶基因（τκ)、麵胺醯胺合成酶基因 (GS)、色胺酸合成酶基因（trpB)或組胺醇脫氫酶基因 (h〗sD )。另外，選擇標記為賦予抗藥性之抗代謝物抗性基因，諸如二氫葉酸還原酶基因（dhfr ),其可用次黃嘌呤及胸苷缺乏培養基選擇且用甲胺喋呤（meth〇trexate)進一步選擇；黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因（gpt)，其可用黴酚酸（mycophenolic acid)選擇；新黴素磷酸轉移酶基因（neo)，其可用真核細胞中之G418選擇且用原核、、’田月已中之新嫉素（ne〇myCin )或康黴素（kanamycin )選擇；潮黴素B磷酸轉移酶（hyg、hph、hpt)基因，其可用潮徽素（hygromycin)選擇；嘌呤黴素N_乙醯基_轉移酶基因（pac ) ’其可用嘌吟黴素（puromycin )選擇；或殺稻 4 囷素 S 脫胺酶基因（Blasticidin S deaminase gene， Bsd )，其可用殺稻瘦菌素（blasticidin )選擇；紮辛抗性基因（Zeocin resistance gene，Sh ble )，其介導對紮辛 (Zeocin)及博萊黴素（Bleomycin)之抗性。最後，編碼能（例如）藉由流式細胞術分選之蛋白質的基因亦可用作 43 200902548 選擇標記，諸如綠色螢光蛋白質（GFp)、神經生長因子受體⑽或其他膜蛋白質，或β•半乳糖苦酶（㈣）。選擇才丁己可位於各別表現載體i，由此用編碼選擇標 L己之表!^體及—或多個編碼所關注蛋白質或所關注蛋白貝之-人早7L的表現載體進行共同轉染。選擇標記亦可位於

編碼所關注蛋白質之矣目哉M 負之表現載體中。在此後者狀況下，選擇 f記較佳位於亦編碼利注蛋白質或其次單元之-的轉錄 =此可^例如）使用1RES構築體完成。在多聚體蛋 „ 礎擇軚s己較佳位於編碼最大二人早元（諸如抗體重鏈）之轉錄物上。整合所關注基因之載體進— 戰進步包含編碼所關注之重組夕株蛋白質之一個成員的dna，仕再之刖為引導蛋白皙类現之自身哺乳動物啟動子。若、 .§ ^ ^ 勒于右所關注之重組多株蛋白質t 成貝包含一個以上蛋白質鏈的A^ J戈右該成員為抗體或T細胞文體，則在編碼該等蛋白質鏈 ^ ^ ^ θ Μ之DNA之前可為引導各鏈較咼1表現（雙向或單向）之各 ¥ ^ , 自身哺乳動物啟動子。在雙向表現中，可使用表現載體中之牡

JtL ^ 〇D , 員對頭啟動子組態’而對於早向表現而言，可將與（例如鲂為2」ires序列組合之兩個啟動子或一個啟動子用於表現。亦 M i4- AL· ύ£, °又t具有兩個由同_ 轉錄物編碼且由IRES序列分開表現載體。不同-人早凡之雙順反子合適之頭對頭啟動子組態為f 兩個方位之AdMLP啟動子連同小& A，但不限於）處於處於兩個方位之AdMLp啟動子屬^蛋白_ 1啟動子’ 同延長因子-1啟動子， 44 200902548 或處於兩個方位之CMV啟動子連同MPSV啟動子，或以兩個方位使用之CMV啟動子。在抗體之狀況下，經驗已表明細胞所表現之重鏈量應不超過輕鏈量。因此，引導輕鏈表現之啟動子較佳至少與引導重鏈表現之啟動子一樣強。編碼功能前導序列或轉位信號之核酸序列可包括於表現載體中以將基因產物引導至内質網或細胞内之特定位置 (諸如細胞器（organeUe))。強多聚腺嘌呤信號可處於蛋白質編碼DNA序列之3,端。多聚腺嘌呤信號確保初生 RNA轉錄物終止及多聚腺嘌呤化且與訊息穩定性相關。編碼所關注之重組多株蛋白質之成員的DNA可（例如）編碼抗體或抗體片段之重鏈與輕鏈，在各基因序列之前視情況為引導兩條鏈中之每—者較高量表現之自身哺乳動物啟動子元件及/或接著強多聚A信號。整合用之表現載體可帶有其他轉錄調節元件，諸如用於增加整合位點處之表現及表現穩定性的強化+、抗抑制元件（anti-repressor)或常染色質開放元件（ubiquitous chrmatin opening elements’ uc〇E)。強化子為與轉錄中所涉及之核蛋白質特異性相互作用之核酸序列。開放染色質或將染色質維持於開放狀態且有利於重現性表現以可插作方式連接之基因（更詳細描述於w〇〇〇/〇5393及

Benton 等人，Cytotechnology 38:43-46, 2002 中）。其他強化子或強化元件包括如 (「Chapter 10: Use 〇f (例如）Girod & Mermod 2003 scaffold/matrix-attachment regions 45 200902548 for protein production」，第 359-379 頁，Gene Transfer and

Expression in Mammalian Cells，SC Makrides (編），2003

Elsevier Science BV)中所述之基質附著區（MAR)。抗抑制元件包括（但不限於）STAR元件（Kwaks等人Nat

Biotechnol. 2003 年 5 月，21(5):553-8 )。當上文所述之調節元件中之一或多者被整合至宿主細胞之染色體中時，將其稱為異源調節元件。多株工作細胞庫及主細胞庫在本發明之較佳具體實例中，利用多株默金細胞庫 (polyclonal Morking Cell Banks，pMCB)及多株衛斯特細胞庫（polyclonal Waster Cell Banks，pWCB )。可用於藉由解凍及擴展單一安瓿之内含物來建立多株製造細胞系之pMCB可自包含個別細胞系之冷凍原料產生。用於產生該pMCB之個別細胞系係獲自丨）單一純系 (如實施例2中所述），Η )單一純系之混合物（如實施例2中所述），或Hi )純系池（選擇後所獲得之單一群落池。純系已自經個別轉染且經選擇用於穩定表現多株蛋白質之個別成員的宿主細胞獲得。針對穩定表現之選擇係藉由此項技術中已知之程序進行，例如使用選擇標記基因。在本發明之一杈佳具體實例中，個別細胞系係獲自經選殖或次選殖之細胞，例如藉由使源於i ) 、ii )或iii )之細胞系經受限制稀釋或單細胞FACS分析及選擇，或藉由選擇咼表現純系，例如使用自動儀器，如ClonePix FL(見下文）。可將用於產生如上文所述之pMCB之個別細胞系預儲存於 46 200902548 個别，.田ι系之冷;東文庫原料巾，在產生之前自該冷東文庫原、料解;東及擴展各個別細胞系之安親。較佳地，個别、i系表現特性與由pMCB之其他成員產生之抗體不同的全長抗體，例如不同抗原特異性、$同親和力、不同可變區或CDR區及/或不同恆定區。用於產生pMCB之各細胞系產生多株蛋白質之不同成員。較佳地’多株蛋白質之各獨特成員結合特定抗原。另外，較佳地，各獨特成員係自位於各宿主細胞基因組中之隨機位點處的多個整合冑（integrant)纟生。pMCB係藉由將預定數目之來自各個別細胞系之細胞混合而產生。該等細胞較佳以相等數目（1:1比率）混合，但亦可能需要其他比率（見後文）。將細胞之混合物以等分試樣冷凍，在此將其分配至許多小瓶中’ |小瓶具有規定數目之細也將此等小瓶冷凍且儲存作為供稍後製造目的用之 pMCB。較佳地，構成pMCB之小瓶的數目超過丨〇個、25 個、50個、75個、100個、200個、5〇〇個或1〇〇〇個小瓶。可在產生多株製造細胞系之不同批次之不同時間點處將 pMCB中之個別小瓶解凍，該等批次能產生批次間具有基本上相同組成之多株蛋白質。在本發明之一替代方法中，可自來源於pMCB之p WCB 擴展多株製造細胞系。pWCB係藉由將來自pMcB之單一小瓶解;東且將細胞擴展為足以產生可以新一系列等分々式樣 (pWCB )冷;柬之細胞總數的許多代而產生，其中各pwcB 等分試樣中之細胞數與最初用於產生p WCB之pMCB小瓶 47 200902548 中之細胞數大致相同。當pWCB已耗盡時，可能自pMcB 之等分試樣產生新PWCB。因此，與擴展來自冷凍文庫原料之個別細胞系且混合新pMCB所需之工作量相比，此方法將需要顯著較低之工作量。另外，在pWCB耗盡之情況下’產生多株製造細胞系之更多批次的機會增加，該等批次能產生批次間具有基本上相同組成之多株蛋白質。 / 藉由混合已藉由個別轉染而獲得之個別細胞系來產生 PMCB的優勢在於有可能在產生pMCB之前進行經個別轉染之細胞系的額外分析及選擇。由此可確保實現已描述之多樣性需求的更穩定多株製造細胞系。另外，多株蛋白質可以更具重現性方式製造。以下關於pMCB所述之内容亦適用於pWCB。在本發明之又一具體實例中，已如上文所述經選擇用於穩定表現多株蛋白質之個別成員的個別細胞系在產生 PMCB之前關於其增殖速率及/或生長力來進—步表徵。在 &佳具體實例中’選擇具有類似增殖速率或生產力之細胞系用於產生pMCB。甚至更佳地’選擇具有類似生產力，類似增殖速率之細胞系用於產生pMCB。較佳地，在徵增殖速率及/或生產力之前使細胞系適應無血清懸浮培縣、Λ或者’在轉染之前使用於轉染之親本細胞適應無血清

怨序培養D ::殖速率可藉由此項技術中已知之方法評估。哺乳動佳介於、18小時與100小時之間，較、時與40小時之間且最佳介於24小時與32小 48 200902548 時之間。生產力應超過0.5皮克蛋白質/細胞/天（皮克/(細胞 x天））’較佳應超過 1、1.5、3、5、8、1〇、15、20、、 30、40、50、75或100皮克/(細胞X天卜另外，當藉由細胞内染色法評估時，細胞系應顯示關於表現之均質細胞群體。必要時，可藉由選殖，例如藉由本文所述之facs分選法，獲得各個別細胞系之更均質細胞群體。在本發明之其他具體實例中，繼如本文所述之轉染及選擇程序之後，對個別細胞系進行FACS分選以鑑別具有均質表現量之細胞。可使用經螢光標記之抗體分選表現較高量之所要蛋白負（例如抗體或TcR )之細胞’從而產生關於生產力之均質細胞群體。此技術係基於以下觀測：所分泌之蛋白質可在分泌其之細胞表面上偵測到，且表面蛋白質之量顯然對應於個別細胞之表現量。因此，高產細胞可為用經標記之抗體染色後、接著藉由facs分析分選出之單細胞。該技術已由 Brezinsky ( Brezinsky 等人 J. 2003· immun〇1 Methods 277, 141-155 )描述。替代分選技術係基於對自細胞表現之蛋白質具特異性之配位體與細胞表面偶合。舉例而言，抗F c抗體或抗獨特型抗體可經由生物素（biotin )與分泌蛋白質之細胞群體表面偶合。接著由個別細胞表面上之抗Fc抗體捕捉彼細胞所分泌之抗體。其後，可在用經標記之抗體染色後即藉由FACS分選高產細胞。此技術已描述於ep 667 896中。為獲得具有均質高表現量之細胞系，基於藉由所述技 49 200902548 術中之一者所獲得之FACS概況來分析具有高表現量之單細胞。接著如上文所述擴展個別細胞純系且關於增殖速率

及生產力潛在地分析。或者，藉由分選收集如藉由FACS 概況所鑑別之具有最高表現量之細胞子池。必要時，來自個別細胞系之細胞子池亦可關於增殖速率及生產力加以分析。刀

在本發明之—替代具體實例中，使用諸如clGnePixFL 自動儀器（Genetix，υκ)之自動儀器選擇展示高表現量及 /或類似生長特性之純系。其可如下完成：使轉染及選擇之後所獲得之群落在半固體培養基中生長，該半固體谇養美允：藉由捕捉緊鄰群落處所分泌之蛋白質產物來伯測高：群洛。各群落之產生量係藉助於免疫螢光標記由細胞表現之蛋白質、接著基於諸如表現量及生長特性之預定選擇標準由成像軟體選擇最佳純系來確定。料，可藉由自動儀 =使用幻貞測成像來評估各群落之以、（反映細胞增殖速。㈣藉由自動儀器分離具有所要生產及/或生長特性之群洛且將其轉移至96孔盤進行進-步繁殖。較佳地，選擇具有類似生產力之個別細胞系用於產生 :广在-較佳具體實例中，構成pMCB之個別細胞系係自（例如）藉由單細胞分選限制稀釋或自動儀器採集 :獲传之具有高表現量之經選殖細胞產生或自具有高表現里之細胞池產生。在本發明中，將獲自轉染及選擇之後所分離之細胞之早-群落的個別細胞系與獲自（例如）藉由單細胞FA。 50 200902548 刀選所獲得之純系的個別細胞系稱為經選殖之細胞系。在車父佳具體實例中’該等經選殖之細胞系用於產生pMCB。在本發明之其他具體實例中，在產生pMCB時以不同比率混合個別細胞系。可基於個別細胞系及/或由該細胞系表現之個別蛋白質成員的特性（例如比生產率或結合親和力）’根據預定標準來混合該等個別細胞系。舉例而言，表現尤其結合關鍵抗原或抗原決定基之某些抗體的個別細胞系可以超過pMCB之其餘成員細胞系之量供給，例如高 ^ 3倍、5倍或1 〇倍。一個成員細胞系可（例如）超出所有其他成員以2:1比率添加，例如成員i為4χ丨〇6個細胞且其餘成員細胞系中之每一者為2χ1〇6個細胞。、亦可採用PMCB中之個別細胞系為差別比率之此方法以避免個別細胞系之間增殖速率及生產力的差異，尤其當此等個別細胞系尚未針對此等特性之類似性加以選擇時。因此：若個別細胞系中之一或多者與特徵在於較快增殖速 ^之多株工作細胞庫其他成員相比具有較慢增殖速率，亦即，較長倍增時間’但此較慢增殖速率與特定高生產力益關時、，則可將此（此等）特定成員以增加之量添加至中以補償其緩慢生長^舉例而言’若構成_Β之其餘細胞系具有介於22小時與3G小時之間的增殖速率，則可以 2:1比率添加具有％小時增殖速率之細胞系。同樣地，可 =具有短倍增時間之細胞系之比率以確保此等細胞系在 ^期間將不會過剩（takeGVer)。另外，可根據對由產 PMCB之多株製造細胞系所產生之多株蛋白質產物之 51 200902548

且反之’若特定成員以較低量產生，則可產生具

分析調整PMCR Φ徊a丨“ ΠΑ 4 i ., +. 況或等效特定蛋白生新pMC 率降低。有乓加比率之產生此成員之細胞系的pMCB。培養系統止本發明之重組多株蛋白質可使用任何合適之培養模式製造’該培養模式包括（但*限於）批次（bateh)、饋料寺人（fed-batch)及灌流（perfusi〇n)製程。建立高量表現蛋白質之表現系統將核酸序列引入細胞中之方法在此項技術中已知。此等方法典型地包括使用DNA載體以將所關注序列引入細胞、基因組或染色體外元件中。細胞轉染可藉由熟習此項技術者已知之許多方法實現，該等方法包括脂質體轉染 (hpofection)、化學介導之轉染、磷酸鈣沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、RBC ghost融合、原生質體融合、病毒轉導及類似方法。對於宿主細胞系轉染而言，使用所關注載體之文庫，其中各載體包含編碼所關注之重組多株蛋白質之一個成員的核酸序列之僅—個複本。所關注表現載體之此文庫共同編碼所關注之重組多株蛋白質。合適之整合用載體描述於先前部分中。產生重組多株製造細胞系及自該細胞系產生重組多株 52 200902548 蛋白質可藉由若干不同轉染及製造策略獲得。圖1中所說明之較佳轉染方式為一種高產量方法，其中使用構成所關注文庫之個別載體各別地轉染宿主細胞。將此方法稱為個別轉染。較佳各別地選擇經個別轉染之宿主細胞。然而，亦可在選擇之前將其彙集。選擇後即產生之個別細胞純系可關於表現量、增殖速率及整合模式加以分析，且較佳地，具有類似生長速率、類似複本數、類似表現量及/或類似穩固程度之彼等純系可用於產生多株G 〇工文庫原料。可在產生原料之前、在已自原料擷取後即刻或在短增殖及適應時間之後混合個別細胞純系以獲得所要多株細胞系。此方法可進一步改進組成穩定性。在允許一個以上複本整合至各細胞中之轉染環境下，若夕株蛋白質為單體，則可使用表現載體之混合物進行整體式轉染。對於多聚體蛋白質而言，允許多重整合至宿主、-、月l基因組中之§亥整體式轉染將引起次單元混雜。在許多狀況下’諸如製造醫藥用途之重組多株抗體時，應避免混雜對於多聚體蛋白質而言，若混雜為可接受的或若轉染係於確保僅一個複本整合至各宿主細胞之基因組中之條件下進行，則可進行整體式轉染。該等方法之實例包括反轉錄病毒轉導（retroviral transduction )及原生質球體融合 (sphaer〇blast fusi〇n )。可將構成所關注之變異核酸序列之文庫的個別載體一起混合成單一組合物，或較佳地，可將編碼各文庫成員之個別載體保持於各別組合物中或保持於組合物中文庫之約5個至50個個別載體之混合物中。 53 200902548 弋為使用刀成於組合物中含有文庫之約s /η 5 0個個別載體f 、、、 5個至之數。卩分的載體文庫進行轉染。較庫之—部分由10他e 也，文個至20個個別載體構成。接著將物轉染$诠士， w香將各組合 ^以細胞之等分試樣中。將此方法轉染。經韓絍夕楚八4 1卞正體式個別載體之數目而定。各4刀中成疋右文庫（例如）由100個獨特變里成貝構成，該刚個獨特變異成貝被分成於組合物有 2 〇個獨特戀展出g 士有異成員之數部分，則宿主細胞之5個將需要用構成原始文庫之一獨# J^八& $ ’ 轉染播、㈣m蜀特^刀的文庫組合物轉染。、伯細胞之等分試樣。較佳各別地選擇獨特等分試樣°然而’亦可在選擇之前將其彙集。等分試樣可針 =其純系多樣性加以分析’且僅將具有足夠多樣性之彼等等分試樣用於產生多株G0I文庫原料。可在重組多株蛋白質製造開始之前產生多株細胞系之冷細。為獲得製造所要之多株細胞系，可在產生冷康原料之前、在e自料糾後即刻或在短增殖及適應時間之後混合純系。上文概述之製造策略之共有特徵為構成重組多株蛋白質之所有個別成員可在一個纟器或有紐目之纟# (諸如生物反應器）中產生’最多約10個容器。若需增加表現量，則可使用針對DHFR基因或麩胺醯胺合成酶（glutamine synthetase，GS)基因、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（hyP〇xanthin phosph〇rib〇syUransferase， hprt )或色胺酸合成酶基因之選擇進行基因擴增。其需要 54 200902548 使用包含該選擇標記之載體。本發明之一特殊特徵在於保持複本數相對較低以保持細胞穩定性較高。因此，較值僅使細胞在相對適度選擇壓力下在具有低濃度MTX (例如卜 1 0 nM )之無核苷培養基中針對實施例中所使用之構築體類型經受一輪選擇。咸信該適度選擇壓力產生相對較低的複本數。咸信適度選擇壓力產生帶來高表現量同時避免異有極高複本數之細胞不穩定的平衡複本數。為達成較高表現量，用於表現之細胞系較佳包括能增強控制多株蛋白質表現之啟動子的異源反式活化子。反式活化子與啟動子之合適組合之實例於下表（表2 )中提及。表2.反式活化子/啟動子對之實例反式活化子致動子實例註釋一慢病毒Tat 長末端重複序列（LTR) ___—-— 腺病毒El A HCMV主要IE強化子/啟動子單純疱疹病毒VP16 单純疱療病毒基因啟動子為 IE175 US 6,635,478_ B型肝炎病毒X蛋白質 (HBx) "SV40 合成鋅指蛋白（Synthetic Zn-finger protein ) 合成 Sangamo 公司 SV40大T抗原 SV40晚期啟動子四環素控制之反式活化子 (tTA) 合成合成融合人類細胞巨大病毒IE2p86 強化子/啟動子人類細胞巨大病毒ΙΕ1ρ72 HCMV主要IE強彳卜子/啟動子 ------- 愛-巴病毒R反式活化子 ( Epstein-Barr virus R transactivator, Rta) EBV啟動子 _ 甲狀腺激素受體生長激素啟動子糖皮質激素受體乳腺腫瘤病毒（MMTV)啟動子 55 200902548 較佳地，用編碼反式活化子之表現構築體轉染細胞系且使用限制稀釋或用於單細胞選瘦之其他方法選擇純系。該表現載體可包含如本文對於表現载體所述之元件，諸如啟動子、選擇標記等。較佳地，控制反式活化子表現之啟動子為組成性啟動子’諸如延長因子1啟動子、CMV啟動子金屬硫蛋白-1啟動子或類似啟動子。在一較佳具體實例中，啟動子為CMV啟動子。尤其較佳為使用腺病毒E1A反式活化子，其似乎除反弋化控制所關〆主基因表現之CMv啟動子以外亦自身穩定細胞。如其他地方所提及，E1A表現在首先產生之細胞系巾不可侦測。因此，E1A與細胞穩定之間的聯繫尚未由本發明實驗證實。斜對於製坆各蛋白質成員包含兩個以上多肽鏈之多株蛋貝而口鏈之組合對其所形成之蛋白質之親和力、特異性及=性可具重要性。例如，此對於抗體及TcR可見。舉例而言’已知抗體可變番細& 1k 曼室鏈與可變輕鏈之組合影響由該等鍵所开v成之抗體之親和力及特異性。因此，當抗體編碼序列之文庫已針對其產生對某免標具親和力之抗體的能力加以選擇時’需要確保最終產物中可變重鏈與可變輕鏈之組合與之對應。出於此原因’較佳將構成多株蛋白質之個別成貝的多肽鏈置於用於整合之同一載體中，從而確保該等多肽鏈在整個過程中將保持於一起。或者，可用編碼重鏈與輕鏈之同源對的表現㈣龍染宿主細胞。以下描述為如何獲得重組多株抗體表現細胞系之一實 56 200902548 例。可構築用於組成性表現之具有兩 (諸如由可變重鏈及整個“戈λ輕 "目反轉錄方向之啟動子的通用啟動子盒，以允許整鍵個圍頭對頭構造） ;，及重鍵值定區之載體中。預期亦可使用用於誘; 現之啟動子盒。此外，啟動子可尾對尾置放，丄 =錄，或尾對頭置放，用於單向轉錄。誘導性啟動子亦以現。轉染後，較佳於選擇性條件下培養細胞以選擇穩疋轉型體。可隨後使此等條件下存活之細胞在不同培養系統中生長’该專培養系統為諸如習知小型培養瓶、Nunc多層έ田胞工廠、小型高產量生物反應_ (Miniperm, INTEGRA_ LLlne)、震盈器及旋轉瓶至中空纖維及生物反應器衣（Wave Biotech，Tagelswangen’ Switzerland)或 f他抛棄式器皿/容器。可使用針對抗體產生來測 :式。亥等細胞。多株細胞系較佳係針對在選擇壓力下於無丘月。養基中懸浮生長延長之時段的生存力來選擇。系、先申多株性之保存（⑽）評估據本^明’確保表現系統中之多株性在生產期間不會嚴重改變使彳專古1 At , f有了此在多株性確實改變時停止生產通常很重要孝艮據本發明此目的藉由監測變異核酸序列之相對表見量來凡成。表現量可（例如）在mRNA層面上使用（例如）RFLP 八士a 刀祈 '陣列或即時PCR來監測，或在蛋白質層面上使用（例如、 )二維聚丙烯醯胺凝膠電泳、質譜分析或 57 200902548 各種層析技術來監測。使用此等技術，將可能建立一定數目之所有個別表現量之基線值且接著在生產期間自培養物才木集樣本以判斷表現量是否已變化（整體上與相對地）。在本發明之正常實施中，可建立一定範圍之圍繞基線值之值，且右發現相對表現量在該等範圍以外，則終止生產。培養細胞及產生重組多株抗聽可使如上文所述產生之多株細胞系在適用於表現由插入、.·田i基因組中之變異核酸序列編碼之所關注多株蛋白質的條件下於合適培養基中生《。細胞培養可以若干步驟進行。當使用哺乳動物細胞時，所選細胞較佳適應在懸浮液中以及無血清條件下生長。適應在無血清培養基中生長亦可有利地在將針對多株細胞系所選殖之細胞系混合之前完成。適應可在一或兩個步驟中在有或無選擇壓力下進行。較佳地’ u允許在整個製造時段中在不損害所製造藥品之純度的’清況下達成選擇之選擇***。—般而[對於製造醫藥用途之重組蛋白質而言，較佳不使用（例如）抗生素或其他低分子量藥物以提供選擇壓力，此係由於將需要確認最終產物不含有任何痕量之抗生素。當多株細胞系適應適當條件時，可開始擴大規模。此時，可將多株工作細胞原料（多株工作細胞庫，pWCB) 及/或多株主細胞庫（pMCB)冷凍。較佳地，使用介於3〇公升與1〇〇公升之間的生物反應器，但亦可使用更小（'5_1〇公升）或更大（高達UU00、10，_、15，_公升，或甚至更大）之生物反應器。合適之生產時間及生物反應 58 200902548 器尺寸選擇視來自批料之蛋白質之坏要產置及來自細胎系之表現量而定。時間可在數目、’田胞系隹数天至二個月之間變化。可自細胞或上清液回收經表現之重组多、夕株蛋白質。可根據孰習此項技術者已知之程序純化及*料舌A h 电化及表徵重組蛋白質。純化程序之貫例於下文列出。表徵裎床夕昝/，衣傻私序之實例可見於（例如 2006/007853 中。自培養物上清液純化重組多株蛋白質自培養物上清液分離特異性蛋自質可能❹各種層析技術，該等層析技術利用蛋白質之物理化學特性的差異，例如分子ϊ、淨電荷、疏水性或對特異性配位體或蛋白質之親和力的差異。由此，可棍播八工A m J根據刀子量使用凝膠過濾層析或根據淨電荷使用離子交換（陽離子/陰離子）層析或替代地使用層析聚焦來分離蛋白質。類似地，可根據疏水性使用疏水相互作用或疏水電荷料層析或使用親和層析利用，特異性固定配位體或蛋白f之親和力的差異來分離蛋白質。因此，可藉由各種層析原理之依序組合達成蛋白質之设雜混合物的分離。由此，最初可根據（例如）淨電荷使用離子交換層析來分離蛋白質之混合物，且隨後可根據分子$使用凝膠過濾層析或在高濃度之所選鹽存在下使用疏水相互作用層析進行疏水性分離之後分離具有類似淨電荷之蛋白質。與諸如離子交換層析、疏水相互作用及凝膠過濾之後續純化步驟組合之親和層析已常常用於自不同來源（例如腹水、細胞培養物上清液及血清）純化IgG (多株以及單 59 200902548 株）。分離係基於蛋白質盥偶合至思 ^ /、偶β至層析基質之特異性配位體之間的可逆相互作用之鉬知奸儿法用之親和純化為-種簡便快速之方法，其提供高選擇性、通常$ & 4 m *间今量且濃縮至較小體積。蛋白質A與蛋白質G兩種細菌表面蛋白質對抗體之f區旦有高親和力且已以固㈣式被用於許多常規㈣，包㈣自各種物種之多株IgG及J：亞類的妯儿八亞頰的純化及免疫複合物的吸收及純化。繼親和層析之後，可進行下游層析步驟（例如離子交換及/或疏水相互作用層析）以移除宿主細胞蛋白質、洩漏蛋白質 A ( leaked Protein Α)及 DNA。作為最終純化步驟之凝膠過濾可用於移除諸如二聚體及其他聚集體之污染分子，且將樣本轉移至儲存緩衝液中。視來源及表現條件而定，可能有必要包括額外純化步驟以達成所需抗體純度。由此常常與蛋白質A層析及凝膠過濾層析組合使用疏水相互作用層析或離子交換層析以純化治療用途之抗體。為使純化簡便，較佳地，多株抗體之所有成員共用重鏈及/或輕鏈之相同怪定區。為純化其他種類之抗體，須使用替代親和層析介質，此係由於蛋白質A及G不結合IgA及IgM。可使用免疫親和純化（與固相偶合之抗IgA或抗IgM單株抗體），或替代地’可採用包括離子交換及疏水相互作用之多步純化策略。結構表徵^ 60 200902548 諸如抗體及TcR之多株蛋白質的結構表徵因混合物之複雜性（純系多樣性及糖基化）而需要高解析度。諸如凝膠過濾、離子交換層析或電泳之傳統方法可能不具有足夠解析度以區分個別抗體。二維聚丙烯醯胺凝膠電泳（ PAGE )已被用於圖譜分析（pr〇fiiing )複雜蛋白質混合物，繼之以質譜分析（MS)或液相層析（LC) _MS (例如蛋白質組研究（prote〇mics ))。組合以蛋白質電荷及質量為基礎之分離的2D-PAGE已證實適用於區分血清樣本中之多株、寡株及單株免疫球蛋白。《而，此方法具有—些限制。層析技術、尤其毛細管及與電噴霧電離MS偶合之[c 正日益應用於分析複雜肽混合物。LC_MS已用於表徵單株，體。極複雜樣本的分析需要更高解析力之層析系統，此可猎由二、维（或更多維）分離獲得。該方法可基於第一維之離子交換及第二維中視情況與Ms偶合之逆相層析（或疏水相互作用）。 1力能表征夕例如可經由與對同一靶標具有特異性或具有類似活性 =株蛋白質的可比性研究（eQmparabinty)來對 :多株蛋白質進行功能表征。該等研究可於試管内以及活體内進行。其為株抗體之武管内功能表彺可為（例如）免疫沈澱法，性枯二種Ϊ粗細胞溶解產物分析性分離乾抗原之高度特異組人衧藉由將免疫沈澱法與諸如SDS-PAGE之其他技術、·且…繼之以蛋白質染色（庫馬斯藍（c。。顧仏版）、 61 200902548 銀染色或生物音炉4、化抗原，二==或免疫墨點法，有可㈣測並量給出抗體分子數以及：二些功此特性。儘管此方法未 ,^ ^ ^ 及其D合親和力之評估，但其提供靶茶貝由此特異性之觀測。此方期間㈣龍原之潛在差異（,㈣多雜之現過程夕株抗體之活體内< ^ ^ m 體内功^表征可為（例如）感染研究。實Γ對其已開發出多株抗體之特異性病毒感染諸如功：：貫驗動物。感染可被抑制之程度將指示多株抗體之治療址合物在本發明之一具體實例中，包含作為活性成份之選自免疫球蛋白超家族之重組多株蛋白質的醫藥組合物意欲治療或預防哺乳動物之疾病。在本發明之一較佳具體實例中，w藥組合物包含作為

活性成份之重組多株抗體或抗體片段及醫藥學上可接受之賦形劑。 X 在本發明之另一較佳具體實例中，醫藥組合物包含作為活性成份之重組多株τ細胞受體或T細胞受體片段及醫藥學上可接受之賦形劑。本發明之醫藥組合物係以本身已知之方式製備，例如藉助於習知溶解、凍乾、混合、粒化或調製製程。醫藥組合物可根據習知醫藥規範來調配（參見，例如RemingtQn;

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Marcel Dekker, New York, NY)= 較佳使用活性成份之溶液，亦及懸浮液，及尤其等滲水溶液或懸浮液，該等溶液或懸浮液有可能於使用前產生，例如在包含單獨或連同載劑（例如甘露糖醇）一起之活性成份之凍乾組合物的狀況下。醫藥組合物可為無菌的及/或可包含賦形劑，例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑及/或礼化刎私'合劑、調節滲透壓之鹽及/或緩衝劑，且以本身已知之方式製備’例如藉助於習知溶解或;東乾製程。該等溶液或料液可包切㈣質，諸如羧Μ纖維素鈉、叛曱基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮或明膠。式亦係於無菌條件下以常規方式製備；上述方 > ’、、；：組合物引人安瓶或小瓶中且將醫藥組合物可包含約1%至約95%、較佳:封 90。/。之活性成份。太说 3 幸乂佳 '約20%至約 h 本發明之醫藥組合物可（例如）S昆办劑型’諸如呈安瓿.. ! 士）呈早位之形式。瓶、小叙、栓劑、糖衣藥丸、鍵劑或膠囊本發明之組合物之治療用途本發明之醫蠤4 A , 诸樂組合物可用於治療、改呈七 . 物之疾病。可用士找、。或預防哺乳動 J用本發明醫藥組合物治療之傳染病、發炎疾，t ’、、病包括癌症、人疾病、過敏、哮喘及其他呼免疫疾病、心血技— 次道疾病、自體 &疾病、中樞神經系統疾病泌疾病、移植姐匕佚届、代謝及内分植排斥反應及非期待懷 V undesired 63 200902548 pregnancy)。本發明之一態樣為動物疾病治療、改善或預防之方法，其中投予有效量之重組多株抗體或抗體片段。在又一態樣中，投予有效量之重組多株T細胞受體或τ細胞受體片段。本發明之又一態樣為重組多株抗體或重組多株τ細胞受體或抗體或Τ細胞受體之片段之用途，其用於製備治療選自由以下疾病組成之群之疾病的組合物：癌症、傳染病’、、發炎疾病、過敏、哮喘或其他呼吸道疾病、免疫失調、自體免疫疾病、心血管疾病、中樞神經系統疾病、代謝疾病、内分泌疾病、移植排斥反應及非期待懷孕。診斷用途及環境偵測用途 …月之另-具體實例係針對診斷套組及環境债測用 2:組以及使用此等套組之方法。本發明之套組包含根據本杳明所製備之重組多株蛋 ^, Α 休蛋白f該蛋白質可經可偵測標經標記用於非標記福測。若經標記，則可將本才株蛋白f添加至懷疑含“分子之樣本中，且二本子J否指不靶分子存在與否。待測試之樣本可為體液樣本’諸如血液、血清n 巧體或非哺乳動物樣本，諸如來自懷疑藏有：：液，尿液，樣本。非哺乳動物樣本可為水；境源之 ^己谓測涵蓋對結合後壤非中重㈣株蛋白質料捕絲分/之折射變㈣量測’其貫施例但不應視為限制本發明以下實施例用於說明本發明 64 200902548 之範疇。實施例1 表現抗體之CHO細胞純系衍生表現載體所使用之IgG表現載體如圖2a中所示。 E1A表現載體如圖2b中所示。細胞系所使用之細胞系為獲自 Lawrence Chasin，Columbia University (亦可購自 Gibco，目錄號 12613-014)之 DHFR-陰性CHO細胞系DG44之衍生物。在載體pcDNA3.1+ (目錄號V790-20, Invitrogen)中用5型腺病毒反式活化子E1A (NCBI 寄存編號 AY339865 ， cDNA 序列： atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtctttt ggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaa ccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaac gaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaaggga ttgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccgg cagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgta ccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgag gatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgc aggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttg ctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagc ccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgct atcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagct 65 200902548 gtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccc cattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcga ggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggcc ataa)之13S型式之cDNA轉染DG44細胞。用500 pg/ml 濃度之遺傳黴素（Geneticin) (Invitrogen)選擇轉染物。選擇後，藉由限制稀釋對細胞進行單細胞選殖。藉由用抗體質體（上文所示）瞬間轉染針對CMV啟動子之反式活化（表現改良）來測試純系。單一純系顯示瞬間檢定中之表現量與未經轉染之DG44細胞系相比改良達3倍。表現量增加並非實際反式活化之證據，且可能藉由選擇尤其高度表現之次純系而引起。在以穩定轉染進行之比較中，所選池與野生型DG44細胞系相比，顯示表現量增加4-5倍。對此純系（稱為ECHO )進行兩次次選殖且其似乎關於CMV 啟動子之反式活化（表現改良）為穩定的。未量測CMV 啟動子之實際反式活化，但純系仍顯示在CMV啟動子控制下抗體之穩定高表現。抗體表現質體

如上文所示構築所使用之抗體表現質體。出於此目的，選擇6個針對不同牛痘病毒表面蛋白質之不同抗體。選自該等抗體之原因在於，其每一者在離子交換層析中都具有極具特徵性圖譜，使得在不同抗體之混合物中鑑別及量化成為可能。該等抗體（揭示於2006年12月4曰申請之同在申請中之 PCT/DK2006/000686中，題為「Antiorthopoxvirus recombinant polyclonal antibody」，以 WO 66 200902548 2007/065433 公開）為： • Sym002-037(純系 002-037) • Sym002-186 (純系 002-186) • Sym002-235 (純系 002-235 ) • Sym002-286 (純系 002-286 ) • Sym002-303 (純系 002-303 ) • Sym002-482 (純系 002-482 )

IgG ELISA 由夾心ELISA量測IgG。簡言之，用山羊抗人Fc( Ser()tee， STAR106)塗佈 96 孔盤（Maxisorp，NUNC)，接著與樣本及標樣（經純化之人類單株IgGl κ抗體）一起培育。用與辣根過氧化酶（Serotec STAR100P)結合之山羊抗人κ 輕鍵進行偵測。 echo細胞轉染將ECHO細胞以含核苷（invitrogen，目錄號32571 ) 與10%胎牛血清（FCS) (lnvitr〇gen)之μεμ α培養基以〇·3〇χΐ〇6個細胞/瓶之密度接種於Τ8〇瓶中。自接種起一小時内，用Fugene6 ( R0che )轉染細胞： •將10 μΐ Fugene6與490 μΐ杜貝卡氏改良依格氏培養基（Dulbecco’s modified Eagle's medium)混合且在室溫下培育5分鐘 •添加5 pg表現質體且將混合物在室溫下再培育15 分鐘 •將混合物添加至細胞培養瓶中 67 200902548 第二天’抽出含轉染試劑之培養基，將各瓶用5 ml含 10%經透析FCS ( Invitrogen)之MEM α培養基（無核芽） (ΜΕΜα-)洗滌一次，且添加1 0 ml相同培養基以及2 ηΜ 濃度之甲胺喋呤。其後，每週兩次更換培養基。 15天後’使細胞騰蛋白酶化且將所有細胞轉移至新瓶。再培養2天後’更換培養基且第二天抽出培養基，對細胞計數且在IgG ELISA中量測生產力。結果如表3中所示。生產力係以皮克/細胞/天為單位使用收集時之細胞數來計算。抗體 IgG 漢度，pg/ml 總IgG 細胞數，xlO6 生產力，皮克/細胞/ 天 Sym002-037 3.65 36.5 3.0 12.2 Sym002-186 8.15 81.5 6.0 13.6 Sym002-235 5.71 57.1 3.3 17.3 Sym002-286 1.39 13.9 0.8 17.4 Sym002-303 11.4 114 9.4 12.1 Sym002-482 17.0 170 12.5 13.6 表3 細胞計數、培養基之IgG含量及經轉染池之特異性細胞生產力對於產生單細胞純系而言，將池中之細胞用表面相關抗體染色且單細胞分選至含有5〇%經ECH〇細胞調節之培養基（ΜΕΜα·)及50%未經調節之相同培養基的％孔盤中。簡言之，染色方案如下： 1.使細胞胰蛋白酶化且對其計數 68 200902548 2.將1-5χ 106個細胞吸入無菌FACS管中 3 ·在4 °C下以2 5 0 g將細胞向下旋轉1分鐘且移除上清液 4. 在 2 ml 無菌 FACS PBS ( PBS + 2% FCS )中洗滌細胞（5 ml ) 5. 以100 μΐ經稀釋抗體（Ab) /1〇6個細胞以i:2〇稀釋之山羊 F(ab)2 片段抗人 IgG H+L-PE ( Beckman-Coulter， IM1 626 )將細胞染色且培育20 min ( 4°C下於黑暗中） 6. 在2 ml FACS PBS中將細胞洗滌兩次（5 ml) 7. 再懸浮於 FACS PBS 中達 l-5xl06/ml ( 2 ml) 8. 添加填化丙唆，10 pg/ml 1 :1〇〇〇又疋適 S 門且使用 FACS-Aria ( Beckton-Dickinson ) 將細胞單細胞分選至96孔盤中（5個盤/抗體）。約1週後，由顯微鏡檢查孔中是否存在單一純系。約2週後’各自於單一稀釋液中由elisA檢定來自具有單一純系之孔中的上清液’且基於ELISA值及對孔之視覺檢查，選擇24個呈現各抗體之純系用於繼續培養。利用對細胞數及形態之視覺觀察結合針對抗體表現量之選擇來選擇純系。進一步在耗盡檢定中測試所選純系：簡言之，將細胞接種至24孔盤中且使其生長直至多數細胞死亡為止。由ELISA檢定上清液且選擇前1〇個針對各抗體之純系以適應無血清懸浮培養。適Μ無叙清懸浮培養使細胞胰蛋白酶化且對其計數。將5χ106個細胞離心 69 200902548 竽於1 〇 ml pr〇CH〇4無血清培養基（Cambrex )中。將、田胞轉移至50 ml細胞培養管（TRP, Switzerland)且在 37 C下於震盪器上培育。每週兩次對細胞密度計數且每次將。養物稀釋至〇5χ1〇6個細胞/毫升（頭兩週）或稀釋至〇·3Χΐ()6個細胞/毫升（其餘時段）。4-5週後，多數純系之 u時間接近3G小時’屆時將其視為適應無血清培養。適應時段結束時’由ELISA檢定細胞，冷凍於含1〇% DMS〇之培養基中且用於表現實驗（參見下文實施例2)。實施例2 表現實驗為測試混合培養物經長時間之組成穩定性，製備許多純系混合物。基於適應時段期間所進行之計數，儘可能將倍增時間考慮在内。小Μ配具有類似倍增時間之純系。總共製備9個混合物： •混合物1-5:在每一混合物中使用針對各抗體之單 *混合物6 :各抗體使用2個純系 •混合物7 :各抗體使用5個純系 •混合物8 :各抗體使用3個純系 •混合物9:使用所有可用純系—各抗體5_7個 /將純系混合使得呈現各抗體之細胞數（對於Μ個純系之各抗體）構成混合物中細胞總數之丨/6。如實施例1中所述在50 ml培養管中田+ 货& Y進仃實驗。所使培養基為Pr。⑽4且總培養體積為iq W。實驗以 200902548 0.3X106個細胞/毫升之濃度開始。每週兩次以3及4天時間間隔將培養物稀釋至g.3x1q6個細胞/毫升。每週一次採集樣本用於ELISA及離子交換層析分析。第4天採集第一樣本且第3 5天採集最終樣本。 9個混合物之EUSA值如圖3中所示。 ☆自開始至結束所計算之細胞***數在混合物中自約Μ ㈣27 ^。其意謂若如所述每週兩次稀釋培養物但每次保持完整體積，則最後總體積將在43,〇〇〇公升與152，⑻〇 :升之間不等。工業上大規模哺乳動物細胞培養物典型地间達15’_公升’其意謂此處關於培養時間及代數所述之此&貫驗為工業規模中培養物的合理模擬。似乎細胞生產力經5週之時段相對恆定，其中一些混合物中有下降之趨勢。 kG組成分析將5-10m丨〇_22μπ^^過濾之培養基上清液加載至 MabSelect Sure管柱（GE細灿咖）上。如製造商所述用1〇 ml PBS (pH 7.4)洗滌且用〇] M甘胺酸（pH 2 7) 溶離管柱。將所彙集之蛋白質物質針對4〇 mM NaU、5〇乙酸鈉（pH 5.0)透析兩次且藉由在28〇 nm下量測吸光度來測定總IgG濃度。將60叫IgG混合物加載至來自p〇lyLC之弱陽離子交換官柱 PolyCat A ( 100x4 ’ 6 mm，3 μηι，1500 A)上。藉由以1 ml/min之流速經72分鐘施加於乙酸鈉（ρΗ 5 〇) 緩衝液中之150至500 mM NaCl之梯度來溶離蛋白質。監 71 200902548

測溶離液之2 1 5 nm吸光度且藉由信號整合測定個別IgG 之相對量。圖3顯示MabS elect純化後來自混合物8之第一及最終收集物之IgG組成之陽離子交換分析的層析圖。如可見，個別Ab被良好分離，其中四者具有基線分離。因此，UV 信號整合給出樣本中相對IgG濃度之極準確測定。如上文所述分析所有混合物且計算各混合物中各抗體之含量。於開始樣本中見到6個不同抗體之間相當均一之分布。所見之差異可反映混合物中所使用之純系之間的不同表現量。各樣本之抗體含量如圖5中所圖示。令人驚訝地，所有抗體皆可在所有最終樣本中被明確鑑別。亦可見在具有一個以上呈現各抗體之單一純系之混合物（混合物6-9 ) 中，在最終樣本中存在抗體更均一分布之趨勢。實施例3 : ECHO中E1A之表現為研究ECHO中E1A之表現，藉由用SYBR綠色（SYBR green)進行定量反轉錄即時PCR ( qRT-PCR)來測定E1A mRNA之含量。qRT-PCR方法係基於靶序列之PCR擴增。在DNA結合染料SYBR綠色存在下進行PCR，其中SYBR 綠色在與雙股DNA結合時發射綠光。由此允許在每一輪擴增後即時量化雙股DNA。

當雙股DNA之量較低時，在PCR之初，不能將來自經結合SYBR綠色之信號與背景雜訊作出區分。然而，在擴增過程期間，信號增加超過雜訊，且可追蹤雙股DNA 72 200902548 之產生。以此方式，可基於SYBR綠色信號跨越特定臨限值所需之週期來測定最初存在於樣本中之靶標的相對量。達到臨限值之準確點為Ct值，其可用於初始靶標量之相對比較。材料及方法如製造商所推薦，使用來自Qiagen之RNeasy Mini套組目錄號74104自3.0E + 06 ECHO及Hek293細胞提取總 RNA。使用來自Agilent之2100 Bioanalyzer系統以真核細胞總RNA奈米系列II檢定液（Eukaryote Total RNA Nano Series II assay)來測定RNA樣本之濃度及完整性。將完整性測定為介於1 -1 0之間的RNA完整值（RIN )，其中1 表示已降解而10表示完整RNA。ECHO RNA具有9.5之 RIN且HEK293具有8.9之RIN。使用來自Qiagen之 QuantiTect反轉錄套組目錄號2053 1 1、使用800 ng RNA 作為開始物質製得各樣本之cDNA。將Hek293 cDNA稀釋 25倍，而將ECHO cDNA稀釋兩倍。使用來自Stratagene 之 SYBR 亮綠色 QPCR 主混合物（Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix)目錄號 600548 在 Stratagene Mx3005P 上進行qRT-PCR。熱循環條件：在95°C下保持10 min ; 40 個週期，在95°C下15 s變性，在60°C下1 min黏接，且在 72°C下30 s延長；在55-95°C下解鏈曲線分析。所使用之引子（ElA-696bpF: 5，-TGACTCCGGTCCTTCTAACACA-，3， ElA-772bpR: 5'-TCACGGCAACTGGTTTAATGG-，3)靶向 E1A基因之3·端之77bp片段。 73 200902548 結果使用qRT-PCR檢定分析ECHO細胞中ElA之表現且顯示El A mRNA在此檢定中不可擴增及偵測，強有力地說明ECHO細胞系不表現ElA蛋白質。使用人類293細胞系作為陽性對照，其係由腺病毒DNA之片段轉型且已知、相對高量表現E 1A。 qRT-PCR在Hek293樣本中顯示擴增，陽性對照^ 18.74，但在無模板對照（NTC)中及在ECH〇樣本中^ 見到擴增。 ~未樣本 Ct Hek293 18.74 ECHO 無Ct NTC 無Ct 實施例4 :製備供生物反應器實驗用之細胞庫為能進行組成穩定性研究之生物反應器實驗，製備細胞庫及工作細胞庫。對於實驗而言，使用如實施例1主所述之表現6個不同抗體之ECHO細胞之純系。所使純系已適應在培養基Pr〇CH〇4中無企清懸浮培養。之主細胞庫將純系解凍且於懸浮培養物中恢復一定時段。下說明自指數生長中之細胞製備4個混合之主細胞庫：U •當細胞處於對數生長中時將其冷凍 •使所有6個抗體呈現於各細胞庫中 74 200902548 •將呈現各抗體之同等細胞數混合 •此合物1A _ 3A含有單一純系/抗體 •混合物4A含有3個純系/抗體每種屋*合物冷凍1 〇個各含有20X 1 〇6個細胞之安瓶 •冷凍培養基：含1〇%DMS〇之培養基（Pr〇CH〇4) 工作細胞庫每種混合物解凍—個冷凍安瓿。將混合物於培養物中保持8-10天，隨後製備工作細胞庫： •當細胞處於對數生長中時將其冷凍 •每種混合物冷凍10個各含有20X106個細胞之安瓿 •冷凍培養基：含1〇%DMS〇之培養基（pr〇CH〇4) 實施例5 :生物反應器中之組成穩定性工作細胞庫之每種混合物解凍一個冷凍安瓿且將細胞作為菌種（seed train)於培養物中保持14天，屆時開始生物反應器培養：

使用各菌種以250 ml開始培養基（proCH〇4 + 5 mM 糙胺醯胺+ 1/100非必需胺基酸）以〇.6χ1〇6個細胞/毫升接種兩個生物反應器。

在以饋料培養基（feed medium) (ProCH04 + 6 g/L 葡萄糖+ 5 mM麩胺醯胺+ i/ioo非必需胺基酸）接種後自第2天至第14天進行饋料培養，在第16天收集時體積為約585 ml。在DASGIP生物反應器（單元ι_8)中控制以下參數：表4·一般生物反應器製程參數 75 200902548 體積 ~~~ 溫度設定,ιΐ!~~~ jgOml > 第 2 天起直至第 pH值設走 3〇.8 C，在120小時棘拖$ 。厂 ρίί值控制1 — 6.95 ----~~——__ 攪動： — 使用無菌經過濾^5725 MNaXO, --- 80 rpm ------_ Ρ〇2 設定 ΪΓΙ~ ~~ 氣體流量-— 30。/。（經由氣體之〇7含量調筘） --— 0.1 sl/h. -—-—-_ C〇2含量： ~~ —--— 由DASGIP系統調整以保持pH值-- 每天採集5 mi樣本用於生存力、活細胞數、邮產生及代謝物刀析。所有培養皆如關於生存力及活細胞數所預期以相同方式進行。再採集1G ml用於藉由離子交換層析分析自菌種（帛9天及第14天）且自各生物反應器（單凡1-8)在將安瓶解束後第2〇天、第μ天、第μ天及第 3〇天分析IgG組成。如上文實施例2所述進行IgG組成分析。如上文所述分析所有混合物且計算4個混合物之各樣本中各抗體之含量。來自培養物之IgG之總產量處於約"Ο 至250 mg/L之範圍内。各樣本之抗體含量如圖5中所圖示。令人驚訝地，所有抗體皆可在所有樣本中被明確鑑別。組成看似穩固，經 Μ天菌種培養、接著16天生物反應器運作期間，純系中無—者喪失或過剩。組成視輸入純系而不同。藉由選擇混合物之特異純系以確定最終產物中個別抗體之相對分布亦似乎為可能的。【圖式簡單說明] 76 200902548 圈1為產生多株細胞庫之製程的示意圖。該圖示意性說明為獲得多株細胞雇、抓+ G年、例如多株主細胞 )“之步驟。a)說明各編碼多株士、g — _ 口貝夂不同及獨特用表現Γ表現載體NU.Am.3等。b)說明待冑體轉染之宿主細胞。c)說明表現載體在不同位置同複本數整合至個別細胞中。d)說明選擇針對夕株蛋白質之成員中之每一者 ^ J、脲砘系。在此特定狀況卜’為便於說明，多株蛋白晳在站金彳体贪白質之母一獨特成員僅顯示一個 2。步驟0說明將步驟d)中所選擇之純系混合以產生夕株細胞庫。圖2a為編瑪重鏈及輕鏈之原型載鼉。元件如下：動子其間具有間隔元件之兩個相同頭對頭人類cMV啟重鏈（VH + γΐ恆定區）及輕鏈（κ 〇2_286 )之編碼區 • bGH=牛生長激素多聚腺嘌呤序列 • SV40 PA = SV40多聚腺嘌呤序列 •重鏈及輕鏈之基因組前導序列

• IHES + DHFR = ECMV内部核糖體進入位點及小鼠二氫葉酸還原酶cDNA • pUC ori = pUC複製起點 bla amp -女比西林抗性基因（⑴n resistance gene ) 77 200902548 圖2b為E1A表現載Λ pML29。元件如下：該載體係基於 pCDNA3.1 + ( Invitrogen ) CMV =人類CMV啟動子

Ela = 5型腺病毒13S反式活化子之cdNA bGH=牛生長激素多聚腺嘌呤區 SV40EP = SV40早期啟動子

Neo = neo抗性基因 SV40多聚a = SV4〇多聚腺嘌呤區 AMP =編碼安比西林抗性之卜内醯胺酶基因圈3為進行實驗之5週時段期間混合物丨_9之IgG含量。詳情參見實施例1。圈4為顯示5週培養時段開始（黑色）及結束（藍色）時混合物8之組成的離子交換層析圖。圈5顯不藉由離子交換層析法分析來自全部9個混合物之第一（灰色）及最終（黑色）樣本且計算並圖示各個別抗體之含量。圖ό顯不藉由離子交換層析法分析菌種及生物反應器運作期間來自4個混合物（實施例5)之樣本且計算並圖示各個別抗體之含量。混合物1 A - 3 Α含有單一純系/抗體。表現6個抗體中之每一者之細胞純系在混合物1A (圖6a )、混合物2A (圖 6b )及混合物3 A (圖6c )中不同。混合物4Λ (圖6d)含有3個純系/抗體。 78 200902548 【主要元件符號說明】益 * »»> 79 200902548 序列表 <I10>賽門弗鎭公司拉爾斯索格德尼爾森戴爾瑪威爾格尼安邦格德透斯徹分C.威伯格克利斯穆勒 <u〇>用於製造重組多株蛋白質的方法 <130> P108US02 <150> DK PA 2007 00764 <15]> 2007-05-25 <150> DK PA 2007 01292 <351> 2007Ό9-07 <150> US 60/924,708 <151> 2007-05-29 <150> US 60/960,002 <151> 2007-09-11 <160> 3 <170> patentln 3.5 版本 <210> 1 <211> S70 <2I2> DNA <213>腺病毒 <400> 1 atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg gacca忌ctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgag^ag gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag cagccggagc agagascctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatgd agagggtgag gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattaccac cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatsag gacctgtggc atgtttgtct acagtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga accggagcct gcaagaccta cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc gacatcacct gtgtctagag aatgcaatag tagtacggat agclgtgact ccggtccttc taacacacct cctgagatac acccggtggt cccgctgtgc cccattaaac cagttgccgt gagagttggt gggcgtcgcc aggctgtgga atgtatcgag gapttgctta acgagcctgg gcaacctttg gacttgagct gtaaacgccc caggccataa <2】0> 2 <211> 22 <212> mk <213>人工序列 <220> <223> PCR 引子 <400> 2 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 870 1 200902548 tgactccggt ccttctaaca ca <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> PCR 引子 <400> 3 tcacggcaac tggtttaatg g

Claims

200902548 十、申請專利範困： 1.-種產生能表現包含2個至n個獨特成員白夤之多株細胞糸的方法，該方法包含· a)提供一組表現載體，其中該等載體中之每—A 編碼該多株蛋白質之獨特成員的獨特核酸之至少一本； ( Μ在避免該等表現載體位點特異性整合至宿主細胞之基因組中之條件下用該等表現載體中之每一者各別地轉半該等細胞，從而獲得細胞之2個至 n個組合物，各組合物表現該多株蛋白質之一個獨特成員； c)將細胞之該2個至n個組合物混合以獲得多株系。、 2.如申請專利讓！項之方法，其中該等表現載體為游離基因型載體（episomal vector )。 3·如申請專利刪i項之方法，其中該等表現載體係穩定且隨機地整合至該等宿主細胞之一或多個染色體中。 4.如申請專利範圍第丨項之方法，其中步驟b) _所獲得之§亥等經轉染細胞經選殖。 5 ·如申4專利範圍第4項之方法，其中該等細胞係使用FACS選殖經選殖。 6.如申請專利範圍第4項之方法，其中純系係針對至少一個選自由以下各項組成之群之標準來選擇：生長速率、倍增時間、表現量、產生量、隨時間之產生穩定性、 200902548 生存力、耐性、穩固性、形態及複本數。 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中純系係針對關於該至少一個標準之均一性來選擇。 8·如申請專利範圍第7項之方法，其包含針對關於倍增時間及表現量之均一性來選擇。 9.如申請專利範圍第*項之方兵τ 一個以上純系係針對各獨特多株蛋白質成員來選擇 10.如申請專利範圍第9項之方法，其中2個純系對各獨特夕株蛋白質成M來選擇，或其中選擇3個、4'個、 5個、6個、7個、8個、9個、1〇個、η個、^個、η 個、Μ個、15個、16個、17個、18個、19個、2〇個、25 ，30 個 35 個、40 個、45 個、5() 4固、6Q 個、^ n % 個、90個或1〇〇個純系。 11. 如申請專利範圍第成員之細胞之該等組合物 12. 如申請專利範圍第合物以不同於1:1比率之 1項之方法，其中表現不同獨特以1:1比率混合。 1項之方法，其中細胞之該等組比率混合。 * 項之方法，其中該等表現栽體的變化以《外皆相同。項之方法，其中轉染前該等宿 1 3 .如申請專利範圍第i 除該多株蛋白質之編碼序歹,J 14.如申請專利範圍第i 主細胞來源於一個純系。 1 5 _如申請專利範圍第丨為多聚體蛋白質。方法，其中該多株蛋白質 16.如申請專利範圍第丨員之方法，其中一個表現栽 200902548 體編碼一個猶牲獨特多株蛋白質成員之所有次單元。 • D申凊專利範圍第之該組表現载員之方法，其中步驟a) _ 中第-亞纽!：=或兩個以上表現載體亞組構成，其列，且第二亞r蛋白質之—個次單元的變異核酸序亞、及包含編碼該蛋白質, 核酸序列，使得m蛋質之另一個次早元的變異 -亞组表現巷辦 *係以來自該第-亞組之成員及該第〆亞、表現载體之成員進行。 18. 如申請專利範圍第！項之方法，其中又一轰Ji哉脚<66 表現載體或又衣現载體編碼可選標記。 19. 如申凊專利範圍第18 利於表現該可選標m +細胞係於有選棕记之細胞生長之條件下連續培養。 20. 如申請專利範圍第々会兮总& 項万法其中该可選標記包3 6亥佰主細胞所缺乏之基因產物。 / 21如中請專利範圍帛18項之方法，其中該可選標記係由亦編碼多肽成員或該多 / ” 瑪，較佳地，…可選二Λ二…的轉錄物編選標。己係由編碼隶大次單元物編碼。〜锝罈其中該多株蛋白質其中該多株蛋白質 22.如申請專利範圍第1項之方法，與該等宿主細胞並不天然相關。 23.如申請專利範圍第1項之方法為多株抗體或多株抗體片段。 24.如申請專利範圍第16項之方法，其中步驟y中之忒組表現載體由兩個表現載體亞組構成，其中第— 包含編碼抗體重鏈之變異核酸序列，且第二亞組勺匕含纟扁碼 200902548 抗體輕鏈之變異核酸序列，使得各轉染係以來自該第—亞組之成員及該第二亞組表現載體之成員進行。 A如申請專利範圍第23項之方法，其中該等多株抗體具有重鏈或輕鏈之相同以區，較佳具有重鏈之相同怪 26·如巾請專利範圍第丨項之方法，其中該多株蛋白質為多株T細胞受體或多株τ細胞受體片段。 27.如中請專利範圍第μ之方法，其中該等宿主細胞為原核的。 Μ.如申請專利範圍第μ之方法，其中該等宿為真核的。肥 29.如申請專利範μ 28項之方法，其中該等真核细胞係選自由植物、酵母、真菌、脊椎動物或無脊椎動物組成之群。 3〇·如中請專利範圍帛28項之方法，其中該等真核細胞係選自由中國倉鼠印巢（CH〇)細胞、c〇s、細胞、卵κ 細胞、骨髓瘤細胞（例如卟別細胞、Ns〇、γΒ2/〇 )、細 3Τ3、纖維母細胞或包括海拉細胞（HeLa ceU)、ΗΕΚ293 細胞或PER.C6之永生化人類細胞組成之群。 31. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該宿主細胞表現能使編碼該多株蛋自質表現之啟動子反式活化之重組反式活化子。 32. -種製造多株蛋白質之方法，該方法包含： )提权使用如申凊專利範圍第j項之方法所獲得之多 200902548 株細胞系； b) 系；及在允許表現該多株蛋白質之條件下培養該多株細胞 c)自該等細胞或培

養基回收及視情況純化該多株蛋白 33.如申請專利範圍第32項之方法，其中該等經混合 ’ 口物係於諸如辰盪瓶、拋棄式生物反應器、生物反應器之容器中培養。夕3 4 ·如申n月專利範圍第3 3項之方法，其中一個表現該 f株蛋自質之獨特成員之一個群體的多株細胞系係於一容為中培養’且表現該多株蛋白質之獨特成員之第二群體的至夕第―多株細胞系係於第二容器中培養，且來自各容器之該多株蛋白質於純化之前或之後混合。 3 5.如申請專利範圍第32項之方法，其進一步包含驗祖在該經回收及視情況經純化之多株蛋白質中獨特成員中之每一者是否存在之步驟。 3 6. —種包含2個至^個細胞群體之多株細胞系’各群體表現重組多株蛋白質之獨特成員，該等細胞包含至少一個隨機整合至基因組中之表現構築體。 37. 如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中該至少—個表現構築體被整合至一或多個染色體中。 38. 如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中η為 3個或3個以上，諸如4個或4個以上，例如5個或5個以上’諸如6個或6個以上，例如7個或7個以上’諸如 200902548 8個或8個以上，例如9個或9個以上，諸如10個或10 個以上，例如1 1個或11個以上，諸如1 2個或1 2個以上，例如13個或13個以上，諸如14個或14個以上，例如15 個或15個以上，諸如16個或16個以上，例如17個或17 個以上，諸如1 8個或18個以上，例如19個或19個以上，諸如20個或20個以上，例如21個或21個以上，諸如22 個或22個以上，例如23個或23個以上，諸如24個或24 個以上，例如25個或25個以上，諸如26個或26個以上，例如27個或27個以上，諸如28個或28個以上，例如29 個或29個以上，諸如30個或30個以上，例如35個或35 個以上，諸如40個或40個以上，例如45個或45個以上，諸如50個或50個以上，例如60個或60個以上，諸如70 個或70個以上，例如80個或80個以上，諸如90個或90 個以上，例如100個或100個以上。 39. 如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中η小於5 0，諸如小於4 5，例如小於4 0，諸如小於3 5，例如小於30。 40. 如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中表現該重組多株蛋白質之一個獨特成員之細胞來源於1個或1 個以上經選殖之細胞，諸如2個或2個以上，例如3個或 3個以上，諸如4個或4個以上，例如5個或5個以上，諸如6個或6個以上，例如7個或7個以上，諸如8個或 8個以上，例如9個或9個以上，諸如1 0個或1 0個以上，例如1 1個或1 1個以上，諸如12個或12個以上，例如13 200902548 個或15 ϋ以上，諸如20 個或22 3以上，例如27 個或29 ]以上，諸如50 個或70 丨以上，中該多中各表中該等中該等中該可的轉錄個或13個以上’諸如14個或14個以上，例如i5 個以上’諸如16個或16個以上，例如Η個或Μ 諸如18個或18個以上，例如19個或_以上，個或20個以上，例如21個或21個以上，諸如22 個以上’例如23個或23個以上，諸如24個或則例如25個或25個以上，諸如％個或⑷固以上，個或27個以上’諸如28個或28個以上，例如29 個以上’諸如30個或30個以上，例如35個或35布諸如40個或40個以上，例如45個或^個以上，個或5〇個以上，例如6〇個或60個以上，諸如7〇個以上，例如80個或80個以上，諸如9〇個或㈣例如100個或100個以上。 41. 如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其株蛋白質為多聚體蛋白質。 42. 如申請專利範圍第41項之多株細胞系，其現構築體編碼多聚體蛋白質之次單_ 如申請專利範圍第41項之:株細胞系其 :人早元之表現係於相同或相似啟動子之控制之下。 44. 如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其表現構築體編碼可選標記。 45. 如申請專利範圍第44項之多株細胞系，其選標記係由亦編碼多肽成員或該多肽成員之次單元物編碼。 46·如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中該多 200902548 <* 株蛋白質與該專宿主細胞並不天然相關。 47. 如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中該多株蛋白質為多株抗體或多株抗體片段。 48. 如申請專利範圍第47項之多株細胞系，其中該組表現載體由兩個表現載體亞組構成，其中第一亞組包含編碼抗體重鏈之變異核酸序列，且第二亞組包含編碼抗體輕鏈之變異核酸序列，使得各轉染係以來自該第—亞組之成員及該第二亞組表現載體之成員進行。 49. 如申請專利範圍第47項之多株細胞系，其中該等多株抗體之所有成員皆具有相同同型（is〇type )。 5〇_如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中該多株蛋白質為多株T細胞受體或多株τ細胞受體片段。 5 1.如申請專利範圍第36項之多株細胞系，其中該等宿主細胞為原核的。 52. 如申請專利範圍第刊項之多株細胞系，其中該等宿主細胞為真核的。 53. 如申請專利範圍第％項之多株細胞系，其中該等、’田月U 3穩定整合表現構築體’該表現構築體編碼能使編碼β亥夕株蛋白質之該等成員之啟動子反式活化之反式活化子。種DHFR陰性CH〇細胞，其包含編碼與組成性啟動子以可操作方式連接之5型腺病毒反式活化子Ε1Α的穩定整合核酸β 55.如申請專利範圍第54項之細胞系，其中該細胞系 200902548 來源於DG44細胞系。 5 6 _如申請專利範圍第5 4項夕細胞李，甘山> 唄之細肥系，其中該細胞系進一步包含編碼所關注多肽之穩定整合表現構築體之至= 一個複本。 57.如申請專利範圍f 56項之細胞系，其中該所關连多肽為多聚體蛋白質，較佳地，其中該多聚體蛋白質為抗體。〜 / 、 —τ m 6¾ μή· 關注多肽之表現構築體另外編碼dhfr。 59.如申請專利範圍第58項之細胞系’其中及該所關注多肽之至少-個次單元係由同—轉錄物編碼，較= 地，其中dhfr係由編碼最大次單元之轉錄物編碼。 60‘如申請專利範圍第％項之細胞车， ^ ^ φ . I糸，其中該所關注 ^狀之表現係由一或多個可由Ε丨Α反，制久式活化之啟動子控較佳地，其中該啟動子為CMV啟動；$ 啟動子。敬動子或來源於CMV 十一、圈式：如次頁。