CN116284389A - 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种抗AFP/HLA02 TCR样抗体及其用途，所述抗体能以约3.1E‑09M或以下的KD值与人AFP158‑166/HLA‑A02*01*复合物特异性结合。本申请还涉及包含所述抗体的嵌合抗原受体、免疫缀合物以及包含所述嵌合抗原受体的细胞。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种抗AFP/HLA02 TCR样抗体及其用途。
背景技术
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是一种糖蛋白，在成人中，AFP可以在大约80％的肝癌患者血清中升高，生殖细胞肿瘤出现AFP阳性率为50％，在胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者中亦可出现不同程度的升高。所以，AFP有望成为治疗多种实体瘤的靶点。
细胞内的肿瘤特异性抗原可以被加工成肽并通过I类主要组织相容性复合物(MHC)呈递到肿瘤细胞表面，TCR样抗体可以与多肽/MHC复合物结合，从而诱导肿瘤细胞死亡。TCR样抗体可以转化为CAR结构，通过T细胞介导特异性的肿瘤溶解。
目前，CART技术在血液肿瘤中取得了巨大成功，但在实体瘤的应用领域尚未出现重大改变。CART治疗面临的问题包括：1)实体瘤发生的部位不像白血病散布全身，CART细胞需要抵达实体瘤的病灶，并且浸润到肿瘤内部才能发挥作用，这是实体瘤组织结构形成的CART治疗的空间阻碍作用；2)肿瘤内部免疫微环境的抑制作用会导致CART细胞无法正常发挥作用，并且会产生T细胞耗竭；3)实体瘤内部微环境存在缺氧、营养物质缺乏等情况，也不利于CART细胞大量增殖和产生靶向细胞毒作用。
因此，亟需开发新的抗体及CAR结构来治疗实体瘤。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其具有以下性质的一种或多种：1)以约3.1E-09M或以下的KD值与人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物特异性结合；和2)能与小鼠AFP158//HLA-A02*01*复合物结合。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述的任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
b)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
c)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
d)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:34，和HCDR3：SEQ ID NO:35；
e)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
g)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
h)HCDR1：SEQ ID NO:44，HCDR2：SEQ ID NO:45，和HCDR3：SEQ ID NO:46；
i)HCDR1：SEQ ID NO:50，HCDR2：SEQ ID NO:51，和HCDR3：SEQ ID NO:52；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:55，和HCDR3：SEQ ID NO:56；
和
k)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ IDNO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述的任意一组氨基酸序列：
a)H-FR1：SEQ ID NO:58，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
b)H-FR1：SEQ ID NO:59，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
c)H-FR1：SEQ ID NO:60，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
d)H-FR1：SEQ ID NO:61，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
e)H-FR1：SEQ ID NO:62，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
f)H-FR1：SEQ ID NO:63，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
g)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
h)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:68和H-FR4：SEQID NO:71；和
i)H-FR1：SEQ ID NO:65，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:69和H-FR4：SEQID NO:70。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ IDNO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包括VHH或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含靶向部分，所述靶向部分包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ IDNO:55中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含SEQ ID NO:72至SEQID NO:84中任一项所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述的任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
b)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
c)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
d)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:34，和HCDR3：SEQ ID NO:35；
e)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
g)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
h)HCDR1：SEQ ID NO:44，HCDR2：SEQ ID NO:45，和HCDR3：SEQ ID NO:46；
i)HCDR1：SEQ ID NO:50，HCDR2：SEQ ID NO:51，和HCDR3：SEQ ID NO:52；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:55，和HCDR3：SEQ ID NO:56；
和
k)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQ IDNO:65中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQ IDNO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述的任意一组氨基酸序列：
a)H-FR1：SEQ ID NO:58，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
b)H-FR1：SEQ ID NO:59，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
c)H-FR1：SEQ ID NO:60，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
d)H-FR1：SEQ ID NO:61，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
e)H-FR1：SEQ ID NO:62，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
f)H-FR1：SEQ ID NO:63，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
g)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
h)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:68和H-FR4：SEQID NO:71；和
i)H-FR1：SEQ ID NO:65，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:69和H-FR4：SEQID NO:70。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包括抗体或抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包括VHH。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述VHH靶向人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述靶向部分包含SEQ ID NO:72至SEQID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含铰链区。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述铰链区包含源自下述蛋白的铰链区：IgG4、IgG1和CD8。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述铰链区包含SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含跨膜结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、CD24、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD154和SLAM。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述跨膜结构域包括源自CD8的跨膜结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述跨膜结构域的N端与所述铰链区的C端连接。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、4-1BB、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域包括源自CD28的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域包含如SEQID NO:132或SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述共刺激信号传导结构域的N端与所述跨膜结构域的C端连接。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下述蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述胞内信号传导结构域包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:134所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体中所述胞内信号传导结构域的N端与所述共刺激信号传导结构域的C端连接。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:112至SEQ ID NO:124中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种多肽，其包含所述分离的抗原结合蛋白和/或所述的嵌合抗原受体。
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码所述分离的抗原结合蛋白，所述的嵌合抗原受体，或者所述的多肽。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含所述分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种或多种经修饰的细胞，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述的嵌合抗原受体，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子和/或所述的载体。
在某些实施方式中，所述修饰包括使所述细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的表达量上调。
在某些实施方式中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段包含选自下组的一种或多种：低密度脂蛋白受体相关蛋白1-12和其功能性片段。
在某些实施方式中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段来源于人。
在某些实施方式中，所述功能性片段包含具备所述低密度脂蛋白受体相关蛋白活性的所述低密度脂蛋白受体相关蛋白的片段或截短体。
在某些实施方式中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白包含低密度脂蛋白受体相关蛋白6和其截短体，和/或低密度脂蛋白受体相关蛋白5和其截短体。
在某些实施方式中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的胞内区；和/或，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的胞内区。
在某些实施方式中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的跨膜区和所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的LDLR区；和/或，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的跨膜区和所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的LDLR区。
在某些实施方式中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段包含SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:144中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述修饰包括向所述经修饰的细胞中引入使得所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的表达量上调的载体。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞包括免疫细胞。
在某些实施方式中，所述免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞包括T细胞。
另一方面，本申请提供了一种制备所述分离的抗原结合蛋白，所述的嵌合抗原受体，和/或所述的多肽的方法，所述方法包括在使得所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述的多肽表达的条件下，培养所述的经修饰的细胞。
另一方面，本申请提供了一种或多种药物组合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述的嵌合抗原受体，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
另一方面，本申请提供了一种用于检测AFP蛋白的方法，其包括：
施用所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽或所述的免疫缀合物。
另一方面，本申请提供了一种AFP蛋白的检测试剂盒，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽或所述的免疫缀合物。
另一方面，本申请提供了所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽或所述的免疫缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测AFP蛋白的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供了一种所述分离的抗原结合蛋白，所述的嵌合抗原受体，所述的多肽、所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述经修饰的细胞在制备预防和/或***的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括非实体瘤。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括与AFP的表达相关的肿瘤。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括肝癌。
另一方面，本申请提供了所述分离的抗原结合蛋白，所述的嵌合抗原受体，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的经修饰的细胞，其用于预防和/或***。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括非实体瘤。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括与AFP的表达相关的肿瘤。
在某些实施方式中，所述的用途中所述肿瘤包括肝癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述分离的抗原结合蛋白，所述的嵌合抗原受体，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的经修饰的细胞。
在某些实施方式中，所述的方法中所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述的方法中所述肿瘤包括非实体瘤。
在某些实施方式中，所述的方法中所述肿瘤包括与AFP的表达相关的肿瘤。
在某些实施方式中，所述的方法中所述肿瘤包括肝癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述5轮淘选ELISA鉴定结果。
图2显示的是本申请所述淘选后挑取的单克隆的序列重复性。
图3显示的是本申请所述候选VHH抗体核苷酸序列PCR扩增结果。
图4显示的是本申请所述表达纯化后的VHH抗体SDS-PAGE结果。
图5显示的是本申请所述候选VHH-Fc抗体真核表达载体(以1C11为例)。
图6显示的是本申请所述候选VHH-Fc抗体的亲和力。
图7A显示的是本申请所述候选VHH-Fc抗体与人TERT540/T2细胞的流式检测结果。
图7B显示的是本申请所述候选VHH-Fc抗体与多肽/T2细胞的流式检测结果。
图7C显示的是本申请所述候选VHH-Fc抗体与小鼠AFP158/T2细胞的流式检测结果。
图8显示的是本申请所述核心质粒载体图谱。
图9显示的是本申请所述CAR核心质粒结构图。
图10A显示的是本申请所述人AFP158-166核苷酸序列扩增PCR结果。
图10B显示的是本申请所述载体酶切结果。
图11显示的是本申请所述流式筛选检测单克隆结果。
图12显示的是本申请所述流式检测筛选HEPG2-MiniG和SK-HEP-1-MiniG阳性率结果。
图13A-13B显示的是本申请所述CAR-T细胞反复刺激扩增实验结果。
图13C和图13F显示的是本申请所述效靶比1：1CAR-T细胞体外细胞杀伤实验结果。
图13D和图13G显示的是本申请所述效靶比1：1IFN-γ细胞因子分泌结果。
图13E和图13H显示的是本申请所述效靶比1：1IL-2细胞因子分泌结果。
图14显示的是本申请所述动物实验流程图。
图15A显示的是本申请所述肿瘤生长曲线图。
图15B显示的是本申请所述动物体重曲线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常是指能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽聚合体。例如，分离的抗原结合蛋白可以包括重链的一部分。例如，分离的抗原结合蛋白可以包括重链可变区。术语“分离的抗原结合蛋白”可以包括单域抗体。例如，分离的抗原结合蛋白可以包括但不限于人单域抗体。
在本申请中，术语“单域抗体”或“sdAb”或“VHH”通常是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。在某些情形中，单域抗体可以来自双峰驼、单峰驼、羊驼、美洲驼、护士鲨、大星鲨或鳐鱼(例如，可参见康晓圳等，生物工程学报,2018,34(12):1974-1984)。例如，单域抗体可以来自羊驼。单域抗体可由重链可变区(VH)构成。术语“重链可变区”通常是指抗原结合片段的重链的氨基末端结构域。重链可变区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在成为框架区(FR)的更保守的区域中。每个重链可变区可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链可变区含有与抗原(例如，AFP)相互作用的结合结构域。
在本申请中，术语“TCR样抗体”通常是指能够识别肿瘤细胞表面的肽/MHC复合物的抗体。这些TCR样抗体在靶标识别方面与TCR共享功能上的同一性。技术上可以通过常规的杂交瘤技术或者通过本领域技术人员已知的体外抗体文库技术产生TCR样抗体。在本申请中，所述“TCR样抗体”可以识别AFP/HLA02。例如，所述TCR样抗体可以识别人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物。
在本申请中，术语“跨膜结构域”通常是指细胞表面蛋白中一段跨越细胞膜的序列，其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜结构域可以与细胞内信号传导结构域相连接，起着传递信号的作用。在本申请中，跨膜结构域可以源自任意的I型、II型或III型跨膜蛋白。在本申请中，跨膜结构域可以包含源自选自下组蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、CD24、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12、CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD154和SLAM。例如，跨膜结构域可以包括源自所述CD8的跨膜结构域。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”通常是指包含能够结合抗原的靶向部分和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括靶向部分(例如，靶向肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)、信号肽、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。在本申请中，所述CAR可以基于抗体的抗原(例如，AFP158-166/HLA-A02*01*复合物)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。关于CAR和CAR-T细胞的描述，可参见例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi`ereI.The basicprinciples of chimeric antigen receptor design.Cancer Discov.2013；3(4):388-398；Turtle CJ,Hudecek M,Jensen MC,Riddell SR.Engineered T cells foranti-cancer therapy.Curr Opin Immunol.2012；24(5):633-639；Dotti G,GottschalkS,Savoldo B,Brenner MK.Design and development of therapies using chimericantigen receptor-expressing T cells.Immunol Rev.2014；257(1):107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。
在本申请中，术语“共刺激信号传导结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。在某些情形中，共刺激信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、4-1BB、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。例如，共刺激信号传导结构域可以包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在本申请中，术语“胞内信号传导结构域”通常是指位于细胞内部能够转导信号的结构域。在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以将信号传导至细胞内。通常，胞内信号传导结构域为用于指导蛋白质寻靶的任何一段连续的氨基酸序列。在某些情形中，胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组的蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10，DAP-12，和至少包含一个ITAM的结构域。例如，胞内信号传导结构域可以包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一成分(Clq)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下来实现：包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重链，或者，包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的轻链。(1)Fab片段，通常由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(2)F(ab’)2片段，可包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的CDR的组合。此外，还可包括由VL和VH配对形成的一价单链分子Fv(scFv)(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。所述“抗原结合片段”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；和(3)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。例如，所述的抗原结合片段还可以包括单域抗体。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指一群基本同源的抗体，即包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。例如，所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生。单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述的技术进行。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321:522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988Science 239:1534-1536；Riechmann,et al.,1988Nature 332:323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol 19919:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989Proc Natl AcadSci USA 86:10029-10033；Co,et al.,1991Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co,et al.,1992J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion:moleculardefinition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)、表面重建(美国专利US5639641)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“核糖体跳跃位点”又叫内部核糖体进入位点(Internalribosome entry site，IRES)，通常是指位于mRNA序列中部为转译起始而备用的一段核苷酸序列。所述核糖体跳跃位点可以允许以不依赖于帽子的方式起始翻译。IRES通常位于5’UTR中。在本申请中，所述核糖体跳跃位点可包括SEQ ID NO:145中的第1位至第578位序列。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指局部组织细胞增生所形成的赘生物。例如，所述肿瘤可以包括实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与AFP的表达相关的肿瘤。术语“与AFP的表达相关的肿瘤”通常是指与正常细胞相比，所述肿瘤微环境中或肿瘤中AFP的表达改变。例如，所述“与AFP的表达相关的肿瘤”可以是与正常细胞相比，肿瘤微环境中或肿瘤中AFP的表达量上调的肿瘤。所述与AFP的蛋白表达相关的肿瘤可以是AFP阳性的肿瘤。在AFP阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞中或肿瘤微环境中的AFP的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指所述其他治疗剂与所述分离的抗原结合蛋白缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述分离的抗原结合蛋白与靶细胞上的抗原的特异性结合，将所述其他治疗剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。此外，所述抗原也可以由所述靶细胞分泌，并位于所述靶细胞外的间隙。
在本申请中，术语“KD”(同样地，“KD”或“KD”)通常指“亲和常数”或“平衡解离常数”，并指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(kd)除以结合速率常数(ka)所获得的值。使用结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)表示结合蛋白(例如本申请所述的分离的抗原结合蛋白)对抗原(例如，AFP蛋白)的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。例如，可以通过Biacore(生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcoreInternationalAB，aGEHealthcarecompany，Uppsala，瑞典获得的仪器)所述KD值，也可以使用其他实验途径和仪器例如Octet检测。另外，也可以使用可以从SapidyneInstruments(Boise，Idaho)获得的KinExA(动态排阻测定(KineticExclusionAssay))测定所述KD值，或者使用表面等离子共振仪(SPR)测定所述KD值。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子。所述载体可将***的核酸分子转移到细胞中和/或细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体可以是当引入合适的细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体可包含慢病毒载体。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的嵌合抗原受体或本申请所述的抗原结合蛋白的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的嵌合抗原受体或抗原结合蛋白即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方式中，所述细胞可以是免疫细胞。例如，所述免疫细胞可以选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
在本申请中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。
通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。
用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、***或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“AFP抗原”通常是指一种糖蛋白，它属于白蛋白家族。人AFP的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P02771。
在本申请中，术语“T细胞”又称T淋巴细胞，是白细胞的一种亚型，其在细胞介导的免疫中发挥中心作用。T细胞可以通过细胞表面存在的T细胞受体与其他淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞区分开来。在本申请中，所述T细胞可以包括记忆性干细胞样T细胞(TSCM)和中央记忆性T细胞(TCM)。
在本申请中，术语“T细胞受体”通常又称“TCR”，通常是指T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构。所述T细胞受体可以与CD3分子呈复合物形式存在于T细胞表面。所述TCR可以是一个固定在细胞膜上的异源二聚体，多数由高度易变的α亚基和β亚基通过二硫键连接组成；少数由γ和δ肽链组成。所述TCR可以包含可变区和恒定区，其中所述恒定区可以靠近细胞膜，连接着跨膜区和胞内的末端，而所述可变区负责识别多肽/MHC复合体。
在本申请中，术语“低密度脂蛋白受体相关蛋白”(Low density lipoproteinreceptor-related protein,LRP)通常是指一种包含839个氨基酸(除去21个氨基酸信号肽后)的镶嵌蛋白。嵌入在LDL(Low density lipoprotein)颗粒的外部磷脂层中属于一种内吞性受体，可以介导富含胆固醇的LDL的内吞作用，是低密度脂蛋白受体(Low densitylipoprotein receptor,LDLR)基因家族中的一员。所述LRP在支气管上皮细胞和肾上腺和皮质组织中表达最显著。在本申请中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白可以包括选自下组的一种或多种：低密度脂蛋白受体相关蛋白1-12或截短体。
在本申请中，术语“低密度脂蛋白受体相关蛋白6”(LRP-6)和“低密度蛋白受体相关蛋白5”(LRP-5)通常是指低密度脂蛋白受体(LDLR)家族中独特的亚群。人LRP-6在UniProt中的登录号为O75581。人LRP-5在UniProt中的登录号为O75197。
在本申请中，术语“截短体”(Truncated protein)通常是指截短的蛋白质。所述截短体可以通过蛋白质水解或操作结构基因消除蛋白质的N-或C-末端部分而得到。或者，所述截短体可以通过无义突变而导致结构基因中存在终止密码子而提前终止翻译而得到。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
发明详述
本申请所述分离的抗原结合蛋白
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其在ForteBio AHC传感器的测定中，可以以3.1E-09M或以下的KD值(例如，所述KD不高于约3.1E-09M、不高于约3.0E-09M、不高于约2.9E-09M、不高于约2.8E-09M、不高于约2.7E-09M、不高于约2.6E-09M、不高于约2.7E-09M、不高于约2.6E-09M、不高于约2.3E-09M、不高于约2.0E-09M、不高于约1.5E-09M、不高于约1E-09M或不高于5E-10M或以下)与人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物特异性结合。
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可以包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR可以通过任何形式划分，只要VH与SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的HCDR都可落入本申请的保护范围内。
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码***来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、North’s、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码***为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码***确定出CDR区。使用不同的编码***，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或***；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区VH，所述VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR3序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR3序列可根据Kabat编号***定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR2序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR2序列可根据Kabat编号***定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1序列可根据Kabat编号***定义。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2、HCDR3序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQID NO:56中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列可根据Kabat编号***定义。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1B3或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1C4或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1D12或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体2F9或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体3号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体4号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体7号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体8号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体15号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体17号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体24号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体29号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的VH可包含框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR3可包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR4可包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1B3或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1C4或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1C11或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1D12或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体2F9或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体3号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体4号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体7号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体8号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体15号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体17号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体24号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体29号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:72所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1B3或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:73所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1C4或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:74所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1C11或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:75所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体1D12或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:76所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体2F9或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:77所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体3号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:78所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体4号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:79所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体7号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:80所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体8号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:81所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体15号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:82所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体17号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:83所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体24号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ IDNO:84所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体29号或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以与参比抗体竞争结合人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区VH，所述VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR3序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR3序列可根据Kabat编号***定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR2序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR2序列可根据Kabat编号***定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR1序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR1序列可根据Kabat编号***定义。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述参比抗体包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ IDNO:56中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列可根据Kabat编号***定义。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体1B3或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体1C4或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体1C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体1D12或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体2F9或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体3号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体4号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体7号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体8号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体15号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体17号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体24号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体29号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
嵌合抗原受体和经修饰的细胞
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区VH，所述VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR3可包含SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR3序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR3可包含SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR3序列可根据Kabat编号***定义。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR2可包含SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR2序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR2可包含SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR2序列可根据Kabat编号***定义。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1序列可根据Kabat编号***定义。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:53中任一项所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1、HCDR2、HCDR3序列可根据IMGT编号***定义。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列可根据Kabat编号***定义。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1B3或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1C4或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1D12或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体2F9或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体3号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体4号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体7号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体8号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体15号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体17号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体24号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体29号或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的VH可包含框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:58至SEQID NO:65中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR3可包含SEQ ID NO:67至SEQID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR4可包含SEQ ID NO:70至SEQID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQID NO:65中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1B3或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1C4或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1C11或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1D12或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体2F9或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体3号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体4号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体7号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体8号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体15号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:68所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体17号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体24号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的H-FR1可包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ IDNO:69所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体29号或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1B3或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1C4或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1C11或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体1D12或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体2F9或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体3号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体4号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体7号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体8号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体15号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体17号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体24号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包含重链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分的重链可变区可包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的靶向部分可包括抗体29号或与其具有相同重链可变区的嵌合抗原受体的靶向部分。
在本申请中，所述的嵌合抗原受体可包含铰链区。例如，所述铰链区可包含源自下述蛋白的铰链区：IgG4、IgG1和CD8。例如，所述铰链区可包含SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列。例如，所述铰链区可包含与SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。例如，所述编码铰链区的核苷酸序列可包含SEQ ID NO:148所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含跨膜结构域。例如，所述跨膜结构域可以包含但不限于源自选自下述蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、CD24、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12、CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD154和SLAM。例如，所述跨膜结构域可包括源自CD8的跨膜结构域。例如，所述跨膜结构域可包含SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列。例如，所述跨膜结构域可包含与SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。例如，所述编码跨膜结构域的核苷酸序列可包含SEQ ID NO:150所示的核苷酸序列。
例如，所述铰链区和跨膜区可包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列。例如，所述铰链区和跨膜区可包含与SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。例如，所述铰链区和跨膜区可包含SEQ ID NO:127所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述的嵌合抗原受体可包含共刺激信号传导结构域。例如，所述共刺激信号传导结构域可包含但不限于源自选自下述蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、4-1BB、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。例如，所述共刺激信号传导结构域可包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。例如，所述共刺激信号传导结构域可包含如SEQID NO:132所示的氨基酸序列。例如，所述共刺激信号传导结构域可包含与SEQ ID NO:132所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。例如，所述编码共刺激信号传导结构域可包含SEQ ID NO:131的核苷酸序列。
例如，所述共刺激信号传导结构域可包括源自CD28的共刺激信号传导结构域。例如，所述共刺激信号传导结构域可包含如SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列。例如，所述共刺激信号传导结构域可包含与SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。例如，所述编码共刺激信号传导结构域可包含SEQ ID NO:129的核苷酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含胞内信号传导结构域。例如，所述胞内信号传导结构域可包含源自选自下述蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。例如，所述胞内信号传导结构域可包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。例如，所述胞内信号传导结构域可包含如SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列。例如，所述胞内信号传导结构域可包含与SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。例如，所述编码胞内信号传导结构域可包含SEQ ID NO:133的核苷酸序列。
例如，所述跨膜结构域的N端可以与所述靶向部分的C端连接。例如，所述跨膜结构域的C端可以与所述共刺激信号传导结构域的N端连接。例如，所述共刺激信号传导结构域的C端可以与所述胞内信号传导结构域的N端连接。
例如，所述嵌合抗原受体从N端到C端可以依次包含下述结构域：靶向部分、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。
例如，所述嵌合抗原受体从N端到C端可以依次包含下述结构域：本申请的抗原结合蛋白(例如，VHH)、源自CD8的跨膜结构域、源自CD137的共刺激信号传导结构域和源自CD3zeta的胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含SEQ ID NO:112至SEQ ID NO:124中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体可包含与SEQ ID NO:112至SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种经修饰的细胞，所述经修饰的细胞可包含前述的嵌合抗原受体。在本申请中，所述修饰可包括使所述细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的表达量上调。
低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段
在本申请中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白可包括选自下组的一种或多种：低密度脂蛋白受体相关蛋白1-12和其功能性片段。
在本申请中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段可以来源于哺乳动物。例如，可以来源于人、猕猴、大鼠和小鼠。例如，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段可以来源于人。
在本申请中，所述功能性片段可包含具备所述低密度脂蛋白受体相关蛋白活性的所述低密度脂蛋白受体相关蛋白的片段或截短体。例如，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白可以包含低密度脂蛋白受体相关蛋白6和其截短体，和/或，低密度脂蛋白受体相关蛋白5和其截短体。
在本申请中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的截短体可以包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的胞内区；和/或，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的截短体可以包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的胞内区。在本申请中，术语“胞内区”通常是指蛋白质位于细胞膜内的结构域。在本申请中，所述胞内域可以指所述低密度脂蛋白受体相关蛋白细胞膜内的结构域。在本申请中，所述胞内区可包括SEQ ID NO:140中的第24位至第243位的序列或与其具备至少80％同源性的氨基酸序列，或者，包括SEQ ID NO:144中的第24位至第231位的序列或与其具备至少80％同源性的氨基酸序列。又例如，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的截短体可以包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的跨膜区和所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的LDLR区；和/或，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的截短体可以包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的跨膜区和所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的LDLR区。在本申请中，术语“LDLR区”通常是指所述低密度脂蛋白受体相关蛋白在跨膜区以外靠近N段的结构域。该结构域该结构域可以具有增强Wnt信号的功能。在本申请中，所述LDLR区可包括SEQ ID NO:138中的第5位至第119位或与其具备至少80％同源性的氨基酸序列，或SEQID NO:142中的第4位至第119位的序列或与其具备至少80％同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段包含下述任一项所示的氨基酸序列或与其具备至少80％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQID NO:142和SEQ ID NO:144。
在本申请中，编码所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的核酸分子包含下述任一项所示的核酸序列或与其具备至少80％同源性的核酸序列：SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:139、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:143。
在本申请中，所述经修饰的细胞可以包含免疫细胞(例如，淋巴细胞)。在本申请中，所述经修饰的细胞可包括经修饰的T细胞。在本申请中，所述经修饰的细胞可包含经修饰的记忆性干细胞样T细胞(TSCM)和/或经遗传修饰的中央记忆性T细胞(TCM)。在本申请中，所述TSCM可包含为CCR7+和/或CD62L+。在本申请中，所述TSCM还包含具有选自下组的一种或多种性质：CD45RA+或CD45RA-、CD45RO+或CD45RO-、CD27+、CD28+、CD127+、CD122+、CD3+、CD4+和CD8+。
在本申请中，所述经修饰的细胞可以表达所述嵌合抗原受体(CAR)。例如，所述经修饰的细胞可以包含能够表达所述嵌合抗原受体(CAR)的载体。所述载体中可包含编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸分子。又例如，所述载体可以选自下组：逆转录病毒载体、慢病毒载体和/或转座子质粒。
在本申请中，所述能够表达所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的载体与所述能够表达所述嵌合抗原受体(CAR)的载体可以为同一个载体，也可以为不同的载体，只要这一个或多个载体可以表达所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段和所述嵌合抗原受体(CAR)，从而使所述经遗传修饰的免疫细胞同时具备所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段和所述嵌合抗原受体(CAR)即可。
例如，所述能够表达所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的载体与所述能够表达所述嵌合抗原受体(CAR)的载体可以为同一个载体。在该载体中，所述编码所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的核苷酸分子和所述编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸分子可以位于同一个表达框中。例如，所述编码所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的核苷酸分子可以位于所述编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸分子的3’端。
在本申请中，所述编码所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的核苷酸分子可以与所述编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸分子直接或间接连接。例如，所述的间接连接可以通过连接序列进行连接。所述连接序列的5’端可以与所述编码所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的核苷酸分子的3’端连接，且所述连接序列的3’端可以与所述编码所述嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸分子的5’端连接。
在本申请中，所述经修饰的免疫细胞所表达得到的所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段和所述嵌合抗原受体(CAR)可以是两个独立的蛋白。即，两者没有任何的相互连接关系而形成任何形式的二(多)聚体或蛋白质复合物。然而，所述经遗传修饰的免疫细胞所表达得到的所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段和所述嵌合抗原受体(CAR)也可以是相互连接的。例如，在某些情况下，翻译形成的这两种蛋白没有被切割完全，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段和所述嵌合抗原受体形成了复合体。
所述嵌合抗原受体可包含2A序列。术语“2A序列”通常是指一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列。所述2A序列可以有助于转录产生两种蛋白。在本申请中，所述2A序列可以包括SEQ ID NO:136中的第1位至第54位的序列。例如，所述编码2A序列的核苷酸序列可包含SEQ ID NO:135的核苷酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含前导序列。例如，所述编码前导序列的核苷酸序列可包含SEQ ID NO:146的核苷酸序列。
多肽和免疫缀合物
另一方面，本申请提供了一种或多种多肽，其可包含本申请的分离的抗原结合蛋白。例如，所述多肽可包括融合蛋白。例如，所述多肽可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
另一方面，本申请提供了一种或多种免疫缀合物，所述免疫缀合物可包含本申请的分离的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，所述免疫缀合物还可包含药学上可接受的治疗剂、标记物和/或检测剂。
核酸、载体和细胞
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述分离的抗原结合蛋白或多肽。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、重链可变区中的一种或多种)。
例如，当核酸分子分别编码所述抗原结合蛋白或多肽的一部分时，核酸分子编码的产物合在一起可以形成有功能的(例如，可结合AFP)的本申请的分离的抗原结合蛋白。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。例如，所述分离的核酸可以是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述分离的抗原结合蛋白的核酸，这些方法包括但不限于，采用逆转录PCR和PCR获得本申请所述分离的抗原结合蛋白或多肽的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体可为表达载体。例如，所述载体可为病毒载体。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。病毒载体技术在本领域中是公知的，并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。常规的基于病毒的***可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使***的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非***细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。本申请所述的载体可以被引入细胞。
另一方面，本申请提供了一种细胞。所述细胞可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。例如，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。例如，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞、293F细胞或HEK293A细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述细胞可以包括酵母细胞。例如，所述细胞可以包括大肠杆菌细胞。例如，所述细胞可以包括哺乳动物细胞。例如，所述细胞可以包括免疫细胞。
所述细胞可以包括免疫细胞。在某些情形中，所述细胞可以包括免疫细胞。例如，所述细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述细胞可包括T细胞。
药物组合物
另一方面，本申请提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。在本申请中，所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂。除非与本申请所述的细胞不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。在本申请中，所述药学上可接受的赋形剂可以包括在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。例如，所述赋形剂可以包括片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂。例如，所述赋形剂可以包括中药丸剂中的酒、醋、药汁等。例如，所述赋形剂可以包括半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分。例如，所述赋形剂可以包括液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。
试剂盒、用途和方法
另一方面，本申请提供了一种用于检测或测定AFP的方法，所述方法可包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
在本申请中，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
例如，所述方法可包括用于非诊断目的的检测AFP的存在和/或含量的方法，其可包括下述步骤：
1)使样品与本申请的抗原结合蛋白接触；以及
2)检测样品结合的所述抗原结合蛋白的存在和/或含量来确定获自受试者的样品中AFP的存在和/或表达水平。
另一方面，本申请提供了一种AFP的试剂盒，其可包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
在本申请中，所述试剂盒还可包含使用说明，所述使用说明记载用于检测AFP的存在和/或含量的方法。例如，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白或所述的多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒可用于检测AFP的存在和/或含量的方法。例如，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的药物组合物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
另一方面，在本申请中，所述的试剂盒和/或所述的药物组合用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
例如，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括与AFP的表达相关的肿瘤。术语“与AFP的表达相关的肿瘤”通常是指与正常细胞相比，所述肿瘤微环境中或肿瘤细胞中AFP的表达改变。例如，所述“与AFP的表达相关的肿瘤”可以是与正常细胞相比，肿瘤微环境中或肿瘤细胞中AFP的表达量上调的肿瘤。所述与AFP的蛋白表达相关的肿瘤可以是AFP阳性的肿瘤。在AFP阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞中或肿瘤微环境中的AFP的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。例如，所述肿瘤可以包括实体瘤。例如，所述肿瘤可以包括肝癌。
另一方面，本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述的分离的核酸分子、所述的载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
另一方面，本申请提供了一种药物组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
例如，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括与AFP的表达相关的肿瘤。术语“与AFP的表达相关的肿瘤”通常是指与正常细胞相比，所述肿瘤微环境中或肿瘤细胞中AFP的表达改变。例如，所述“与AFP的表达相关的肿瘤”可以是与正常细胞相比，肿瘤微环境中或肿瘤细胞中AFP的表达量上调的肿瘤。所述与AFP蛋白表达相关的肿瘤可以是AFP阳性的肿瘤。在AFP阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞中或肿瘤微环境中的AFP的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
例如，所述肿瘤可以包括实体瘤。例如，所述肿瘤可以包括肝癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用所述的分离的抗原结合蛋白、所述的分离的核酸分子、所述的载体，所述的细胞、所述的药物组合物。
例如，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括与AFP的表达相关的肿瘤。术语“与AFP的表达相关的肿瘤”通常是指与正常细胞相比，所述肿瘤微环境中或肿瘤细胞中AFP的表达改变。例如，所述“与AFP的表达相关的肿瘤”可以是与正常细胞相比，肿瘤微环境中或肿瘤细胞中AFP的表达量上调的肿瘤。所述与AFP蛋白表达相关的肿瘤可以是AFP阳性的肿瘤。在AFP阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞中或肿瘤微环境中的AFP的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
例如，所述肿瘤可以包括实体瘤。例如，所述肿瘤可以包括肝癌。
本申请所述药物组合物及方法可与其他类型的癌症疗法结合使用，诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等。本申请中所描述的药物组合物及方法可用于其他依赖于免疫反应的疾病病状，诸如炎症、免疫疾病及感染性疾病。
在本申请中，所述受试者可以包括人或非人动物。例如，所述非人动物可以选自下组：猴、鸡、鹅、猫、狗、小鼠和大鼠。此外，非人动物也可以包括任何除人以外的动物物种，例如家畜动物，或啮齿类动物，或灵长类动物，或家养动物，或家禽动物。所述人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或各种种族的杂合体。又例如，所述人可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
可以根据在实验动物中的有效量推测在人类中的有效量。例如，Freireich等人描述了动物和人的剂量的相互关系(基于每平方米身体表面的毫克数)(Freireich et al.，Cancer Chemother.Rep.50，219(1966))。身体表面积可以从患者的身高和体重近似确定。参见例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardsley，N.Y.，537(1970)。
本申请还提供了以下实施方案：
1.分离的抗原结合蛋白，其具有以下性质的一种或多种：
1)以约3.1E-09M或以下的KD值与人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物特异性结合；
2)能与小鼠AFP158//HLA-A02*01*复合物结合。
2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
7.根据实施方案6所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述的任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
b)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
c)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
d)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:34，和HCDR3：SEQ ID NO:35；
e)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
g)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
h)HCDR1：SEQ ID NO:44，HCDR2：SEQ ID NO:45，和HCDR3：SEQ ID NO:46；
i)HCDR1：SEQ ID NO:50，HCDR2：SEQ ID NO:51，和HCDR3：SEQ ID NO:52；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:55，和HCDR3：SEQ ID NO:56；
和
k)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQID NO:65中任一项所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQID NO:69中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
13.根据实施方案12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述的任意一组氨基酸序列：
a)H-FR1：SEQ ID NO:58，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
b)H-FR1：SEQ ID NO:59，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
c)H-FR1：SEQ ID NO:60，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
d)H-FR1：SEQ ID NO:61，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
e)H-FR1：SEQ ID NO:62，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
f)H-FR1：SEQ ID NO:63，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
g)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
h)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:68和H-FR4：SEQID NO:71；和
i)H-FR1：SEQ ID NO:65，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:69和H-FR4：SEQID NO:70。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
16.根据实施方案15所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括VHH或其抗原结合片段。
18.根据实施方案15-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和全人源抗体。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
20.嵌合抗原受体，其包含靶向部分，所述靶向部分包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案20所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案20-21中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案20-22中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
24.根据实施方案20-23中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
25.根据实施方案24所述的嵌合抗原受体，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述的任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
b)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
c)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
d)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:34，和HCDR3：SEQ ID NO:35；
e)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
g)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
h)HCDR1：SEQ ID NO:44，HCDR2：SEQ ID NO:45，和HCDR3：SEQ ID NO:46；
i)HCDR1：SEQ ID NO:50，HCDR2：SEQ ID NO:51，和HCDR3：SEQ ID NO:52；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:55，和HCDR3：SEQ ID NO:56；
和
k)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30。
26.根据实施方案20-25中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ IDNO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案20-26中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案20-27中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ IDNO:69中任一项所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案20-28中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ IDNO:70至SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案20-29中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:65中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:69中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:70至SEQID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
31.根据实施方案30所述的嵌合抗原受体，其中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述的任意一组氨基酸序列：
a)H-FR1：SEQ ID NO:58，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
b)H-FR1：SEQ ID NO:59，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
c)H-FR1：SEQ ID NO:60，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
d)H-FR1：SEQ ID NO:61，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
e)H-FR1：SEQ ID NO:62，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
f)H-FR1：SEQ ID NO:63，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
g)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:67和H-FR4：SEQID NO:70；
h)H-FR1：SEQ ID NO:64，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:68和H-FR4：SEQID NO:71；和
i)H-FR1：SEQ ID NO:65，H-FR2：SEQ ID NO:66，H-FR3：SEQ ID NO:69和H-FR4：SEQID NO:70。
32.根据实施方案20-31中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包括抗体或抗原结合片段。
33.根据实施方案32所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
34.根据实施方案20-33中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包括VHH。
35.根据实施方案34所述的嵌合抗原受体，其中所述VHH靶向人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物。
36.根据实施方案20-35中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案20-36中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含铰链区。
38.根据实施方案37所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区包含源自下述蛋白的铰链区：IgG4、IgG1和CD8。
39.根据实施方案37-38中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区包含SEQID NO:147所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案20-39中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含跨膜结构域。
41.根据实施方案40所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、CD24、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12、CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD154和SLAM。
42.根据实施方案40-41中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包括源自CD8的跨膜结构域。
43.根据实施方案40-42中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列。
44.根据实施方案40-43中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域的N端与所述铰链区的C端连接。
45.根据实施方案20-44中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含共刺激信号传导结构域。
46.根据实施方案45所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、4-1BB、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
47.根据实施方案45-46中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
48.根据实施方案45-47中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域包括源自CD28的共刺激信号传导结构域。
49.根据实施方案45-48中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列。
50.根据实施方案45-49中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域的N端与所述跨膜结构域的C端连接。
51.根据实施方案20-50中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含胞内信号传导结构域。
52.根据实施方案51所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下述蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。
53.根据实施方案51-52中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。
54.根据实施方案51-53中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列。
55.根据实施方案51-54中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域的N端与所述共刺激信号传导结构域的C端连接。
56.根据实施方案20-55中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含SEQ ID NO:112至SEQ ID NO:124中任一项所示的氨基酸序列。
57.多肽，其包含实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白和/或实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体。
58.免疫缀合物，其包含实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
59.分离的核酸分子，其编码实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体，或者实施方案57所述的多肽。
60.载体，其包含实施方案59所述的分离的核酸分子。
61.经修饰的细胞，其包含实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体，实施方案57所述的多肽，实施方案58所述的免疫缀合物，实施方案59所述的分离的核酸分子和/或实施方案60所述的载体。
62.根据实施方案61中所述的经修饰的细胞，其中所述修饰包括使所述细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的表达量上调。
63.根据实施方案62所述的经修饰的细胞，其中所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段包含选自下组的一种或多种：低密度脂蛋白受体相关蛋白1-12和其功能性片段。
64.根据实施方案62-63中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段来源于人。
65.根据实施方案63-64中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述功能性片段包含具备所述低密度脂蛋白受体相关蛋白活性的所述低密度脂蛋白受体相关蛋白的片段或截短体。
66.根据实施方案62-65中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述低密度脂蛋白受体相关蛋白包含低密度脂蛋白受体相关蛋白6和其截短体，和/或低密度脂蛋白受体相关蛋白5和其截短体。
67.根据实施方案62-66中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的胞内区；和/或，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的胞内区。
68.根据实施方案62-67中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的跨膜区和所述低密度脂蛋白受体相关蛋白6的LDLR区；和/或，所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的截短体包含所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的跨膜区和所述低密度脂蛋白受体相关蛋白5的LDLR区。
69.根据实施方案62-68中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段包含SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:144中任一项所示的氨基酸序列。
70.根据实施方案61-69中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述修饰包括向所述经修饰的细胞中引入使得所述低密度脂蛋白受体相关蛋白或其片段的表达量上调的载体。
71.根据实施方案61-70中任一项所述的经修饰的细胞，其包括免疫细胞。
72.根据实施方案71所述的经修饰的细胞，其中所述免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
73.根据实施方案61-72中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞包括T细胞。
74.制备实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体，和/或实施方案57所述的多肽的方法，所述方法包括在使得所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述的多肽表达的条件下，培养实施方案61-73中任一项所述的经修饰的细胞。
75.药物组合物，其包含实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体，实施方案57所述的多肽，实施方案58所述的免疫缀合物，实施方案59所述的分离的核酸分子，实施方案60所述的载体，实施方案61-73中任一项所述的经修饰的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
76.一种用于检测AFP蛋白的方法，其包括：
施用实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案57所述的多肽或实施方案58所述的免疫缀合物。
77.一种AFP蛋白的检测试剂盒，其包含实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案57所述的多肽或实施方案58所述的免疫缀合物。
78.实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案57所述的多肽或实施方案58所述的免疫缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测AFP蛋白的存在和/或含量。
79.实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体，实施方案57所述的多肽，实施方案58项所述的免疫缀合物，实施方案59所述的分离的核酸分子，实施方案60所述的载体，和/或实施方案61-73中任一项所述的经修饰的细胞在制备预防和/或***的药物中的用途。
80.根据实施方案79所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
81.根据实施方案79-80中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括非实体瘤。
82.根据实施方案79-81中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括与AFP的表达相关的肿瘤。
83.根据实施方案79-82中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括肝癌。
84.实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体，实施方案57所述的多肽，实施方案58所述的免疫缀合物，实施方案59所述的分离的核酸分子，实施方案60所述的载体，和/或实施方案61-73中任一项所述的经修饰的细胞，其用于预防和/或***。
85.根据实施方案84所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
86.根据实施方案84-85中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括非实体瘤。
87.根据实施方案84-86中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括与AFP的表达相关的肿瘤。
88.根据实施方案84-87中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括肝癌。
89.一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案20-56中任一项所述的嵌合抗原受体，实施方案57所述的多肽，实施方案58所述的免疫缀合物，实施方案59所述的分离的核酸分子，实施方案60所述的载体，和/或实施方案61-73中任一项所述的经修饰的细胞。
90.根据实施方案89所述的方法，其中所述肿瘤包括实体瘤。
91.根据实施方案89-90中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括非实体瘤。
92.根据实施方案89-91中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括与AFP的表达相关的肿瘤。
93.根据实施方案89-92中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括肝癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、嵌合抗原受体、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1构建人工合成纳米抗体(VHH抗体)库并筛选抗AFP/HLA02 TCR样抗体
1.1人工合成纳米抗体(VHH抗体)库的构建
通过比对PDB(Protein Data Bank)数据库中296条无重复序列的纳米抗体(VHH抗体)核苷酸序列及其蛋白结构，确定人工合成纳米抗体库CDRs的突变策略，其中CDR3的长度为三种：14、17和21个氨基酸。选取已经上市的纳米抗体Caplacizumab(公开号：NL300966I2)为骨架，合成纳米抗体Caplacizumab全核苷酸序列。将人工合成的Caplacizumab全核苷酸序列克隆至HP153噬菌体载体后，提取HP153噬菌体载体的单链DNA，以提取得的单链DNA为模板，利用Kunkel Mutagenesis的方法突变纳米抗体Caplacizumab的CDRs区的核苷酸，并获得突变后的纳米抗体的双链DNA库。将双链DNA电转至M13KO7预感染的感受态大肠杆菌SS320，过夜培养后收集噬菌体上清，最终构建出多样性为1.44×1010的人工合成纳米抗体库NanoOri_1.0(原启生物科技(上海)有限责任公司)，作为种子库进行抗体序列筛选。
1.2人工合成纳米抗体库的液相淘选
在无抗生素的细菌培养平板中涂布TG1大肠杆菌感受态细胞，第二天取15ml无抗2×YT培养基接种TG1单菌落，37℃过夜培养。取新的无抗2×YT培养基接种过夜培养的TG1菌液200μl，在37℃，250rpm转速下，将TG1菌液培养至OD600＝0.8左右备用。取带有链霉亲和素的磁珠900μl，平均加入3个1.5ml EP管中，每管300μl，置于磁力架上，PBS洗涤3次；其中两管EP管中分别加入30μg生物素标记的人TERT540多肽，记为540-1、540-2，第三管中加入30μg生物素标记的人AFP多肽，记为hAFP，3个1.5ml EP管于室温孵育1h，置于磁力架上，PBS洗涤3次；取700μl噬菌体库加入540-1的管中，室温孵育1h，置于磁力架上，取上清；将上清加入hAFP的管中，室温孵育1h，置于磁力架上，PBST(吐温0.05％)洗涤10次；加入500μl的Gly-HCl(pH2.2)洗脱噬菌体，室温下静置15min，置于磁力架上，取上清，然后向上清中加入250μl的Tris-HCl(pH8.0)进行中和；将中和后的上清加入540-2的管中，室温孵育1h，置于磁力架上，取上清；获得次级库；在次级库中加入20ml上述提前制备的TG1菌液(OD600＝0.8)，于37℃静置30min，取1ml，计数；加入40μl的辅助噬菌体M13K07，于37℃静置30min；加入抗生素氨苄青霉素、卡那霉素，补加20ml的2×YT培养基，在37℃，220rpm转速下过夜培养；将过夜生长的菌液8000rpm离心，取上清，加入上清的1/5体积的PEG-NaCl沉淀，冰浴1h，8000rpm离心30min，去除上清，沉淀用1ml的PBS重悬，即为第一轮淘选结果，然后用此噬菌体进行第二轮淘选。后面的每一轮淘选过程中可以通过调节筛选压力达到预期目标，具体条件见表1，共计完成5轮淘选。淘选结果如表1所示，在第三轮开始出现明显富集，5轮淘选ELISA结果如图1所示。二抗选用M13噬菌体抗体(HRP)(厂家：Sino Biological)。
表1纳米抗体淘选条件及结果
挑选单克隆进行测序鉴定分析；用软件BioEdit进行序列比对分析，统计结果如图2所示，在挑取的单克隆中共计有13条重复的VHH抗体1B3核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示)，11条重复的VHH抗体1C4核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，5条重复的VHH抗体1C11核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，4条重复的VHH抗体1D12核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)和4条重复的VHH抗体2F9核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)，未重复的VHH抗体单一核苷酸序列有8条。
实施例2候选VHH-Fc抗体的表达及特性鉴定
2.1候选VHH-Fc抗体的真核表达载体构建及抗体纯化
设计引物对实施例1中得到的候选VHH抗体核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中任一项所示)进行PCR扩增，分别通过同源重组克隆至经限制性核苷酸内切酶SfiI和NotI双酶切的带有氨苄青霉素抗性的pcDNA3.4载体中，VHH抗体核苷酸序列的3’端与抗体Fc部分(SEQ ID NO:125)的5’端连接，从而构建了候选VHH-Fc抗体真核表达载体，构建的载体图谱如图5所示。将测序正确的重组质粒转染Expi293F细胞进行瞬时表达，并通过ProteinA柱纯化，获得不同的候选VHH-Fc抗体，PCR结果如图3，从左往右，依次为100bp marker，1B3(VHH抗体1B3核苷酸)、1C4(VHH抗体1C4核苷酸)、1C11(VHH抗体1C11核苷酸)、1D12(VHH抗体1D12核苷酸)、2F9(VHH抗体2F9核苷酸)(约400bp)条带；纯化后蛋白电泳图如图4，从左往右依次为Marker，还原性的1B3(含有VHH抗体1B3核苷酸序列的VHH-Fc抗体)、非还原的1B3，纯化后的1B3分子量大小正确(还原后41kDa左右)。
2.2鉴定候选VHH-Fc抗体的亲和力
采用ForteBio AHC传感器，先结合100nM候选VHH-Fc抗体，再分别结合人AFP158-166/HLA-A02*01*或人TERT540/HLA-A02*01*复合物，150nM起始，2倍比稀释，7个浓度梯度，结合5分钟，解离10分钟，采用Data Analysis 9.0分析亲和力数据，数据结果见表2，亲和力结果如图6，其中17号(含有VHH抗体17号核苷酸序列的VHH-Fc抗体，抗体核苷酸序列如SEQID NO：11所示)、24号(含有VHH抗体24号核苷酸序列的VHH-Fc抗体，抗体核苷酸序列如SEQID NO：12所示)2个抗体基本不解离，3号(含有VHH抗体3号核苷酸序列的VHH-Fc抗体，抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)亲和力比优瑞科阳性对照抗体Ab61(氨基酸序列为SEQ IDNO：86，核苷酸序列为SEQ ID NO:85，Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：88所示，Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：87所示)高9倍左右，4号(含有VHH抗体4核苷酸序列的VHH-Fc抗体，抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)、29号(含有VHH抗体29号核苷酸序列的VHH-Fc抗体，抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示)、1B3(含有VHH抗体1B3核苷酸序列的VHH-Fc抗体，抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和1C4(含有VHH抗体1C4核苷酸序列的VHH-Fc抗体，抗体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)亲和力也优于优瑞科阳性对照抗体Ab61。
表2纳米抗体亲和力检测结果
2.3鉴定候选VHH-Fc抗体与人类不同内源性多肽的非特异结合活性
使用iQue Screener流式细胞仪检测抗体的结合活性,具体如下，T2细胞为HLA-A02*01*阳性细胞，分别负载人AFP158多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示，核酸序列如SEQ ID NO：89所示)、人NY-Eso-1 157多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:91所示)以及IFI30(氨基酸序列如SEQ ID NO:92-95中任一项所示)、BTG2(氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示)、BCR(氨基酸序列如SEQ ID NO:97所示)、SSR1(氨基酸序列如SEQ ID NO:98-99中任一项所示)、PPP2R1B(氨基酸序列如SEQ ID NO:100所示)、DDX5(氨基酸序列如SEQ ID NO:101所示)、CTSG(氨基酸序列如SEQ ID NO:102所示)、CD247(氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示)、DMTN(氨基酸序列如SEQ ID NO:104所示)、CALR(氨基酸序列如SEQ ID NO:105所示)、PIM1(氨基酸序列如SEQ ID NO:106所示)、HLA-E(氨基酸序列如SEQ ID NO:107所示)、RPS6KB1(氨基酸序列如SEQ ID NO:108所示)、CSF2RA(氨基酸序列如SEQ ID NO:109所示)、IL7(氨基酸序列如SEQ ID NO:110所示)、人TERT540多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:111所示)等20种人类内源性多肽，这些内源性多肽通常表达于多种类型的成核人类细胞的蛋白质，如血球蛋白α链、β链、核蛋白p68及其类似物。人AFP158/T2为阳性结合细胞，人TERT540/T2、人NY-Eso-1 157/T2和其余上述19种人类内源性混合多肽/T2为非特异性对照细胞，使用缓冲液配置浓度为1×106个细胞/ml的细胞，加入96孔尖底板，每孔30μl至每孔3×104的细胞数；使用缓冲液配置检测抗体，10μg/ml起始，3倍比稀释抗体，设置7个浓度梯度，用流式仪器检测，进一步鉴定候选VHH抗体特异性结合活性。结果如图7A所示，1D12(含有VHH抗体1D12核苷酸序列的VHH-Fc抗体)、2F9(含有VHH抗体2F9核苷酸序列的VHH-Fc抗体)、1B3(含有VHH抗体1B3核苷酸序列的VHH-Fc抗体)与人TERT540/T2细胞无非特异性结合活性，而10μg/ml的高浓度下，1C11(含有VHH抗体1C11核苷酸序列的VHH-Fc抗体)、1C4(含有VHH抗体1C4核苷酸序列的VHH-Fc抗体)及优瑞科阳性对照抗体Ab61均与人TERT540/T2细胞有非特异性结合活性。如图7B所示，1C11、1C4、2F9、1D12、1B3均能与人AFP158/T2细胞结合，且所有5个候选VHH-Fc抗体与人NY-Eso-1 157/T2对照多肽和人类内源性混合多肽/T2均没有非特异性结合活性。
2.4鉴定候选VHH-Fc抗体与小鼠AFP158肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:126所示)的交叉反应性
针对活细胞表面上的小鼠AFP158肽/HLA-A*02:01复合物交叉反应性的进一步鉴定。小鼠AFP158肽在两个氨基酸位置4及位置9不同于人类AFP158肽。与人类及小鼠AFP158肽/MHC复合体均交叉反应的抗体适用于评估HLA-A02*01*转基因小鼠中的抗体药物毒性。结果如图7C所示，5个候选VHH-Fc抗体(含有VHH抗体1C11、1C4、2F9、1B3、1D12核苷酸序列的VHH-Fc抗体)均结合小鼠AFP158/T2细胞，而优瑞科阳性对照抗体Ab61为较弱结合活性。
实施例3含有候选VHH抗体核苷酸序列的CAR核心质粒的构建、慢病毒包装及CAR-T细胞制备
3.1含有VHH抗体核苷酸序列的CAR核心质粒的构建
使用限制性核酸内切酶SphI和NotI对核心质粒进行双酶切，分别与候选VHH抗体核苷酸序列按1:3的比例混合(摩尔比例)同源重组，测序验证同源重组的核心质粒核苷酸序列，扩增质粒保存备用，核心质粒图谱如图8所示，CAR核心质粒核苷酸序列的结构如图9所示，选用41BB和CD3ζ作为共刺激域。
3.2慢病毒包装及滴度测定
用于构建本发明的慢病毒质粒的载体***属于第三代慢病毒载体***，该***共有三个质粒，即1：编码Gag-Pol蛋白和Rev蛋白的包装质粒psPAX2；2：编码包膜蛋白VSV-G的PMD2.G质粒；3：3.1构建的含有编码VHH抗体核苷酸序列的CAR核心质粒。基于BBz平台质粒的核心质粒中，编码CAR的基因由延长因子-1α(EF-1α)启动子调控表达。慢病毒的包装过程如下：1×106的293T细胞悬于2ml 10％FBS的DMEM培养基中铺于6孔板的单个孔中，过夜培养；吸去144ul培养基(质粒质量的50倍)，混入144ul Opti-MEM培养基，其中含有2.88μg包装质粒(psPAX2：PMD2.G：核心质粒＝3:2:4)和8.64μl FuGENEHD转染试剂，，轻轻混匀后在CO2培养箱中37℃培养12小时；去除含质粒的培养基，PBS洗涤一次后更换为2ml含5％FBS的DMEM培养基，培养48小时；收集2.5ml病毒上清，该上清3000rpm离心5分钟，分装冻存-80℃待用，并检测其滴度。
3.3含有VHH抗体的CAR-T细胞的制备
含有VHH抗体的CAR-T细胞的产生方法如下：通过密度梯度离心法获得人外周血单核细胞；用含有200U/ml白介素2的培养基重悬外周血单核细胞至细胞密度为2×106/ml，按1:3的比例(细胞:磁珠)加入CD3/CD28磁珠对T细胞进行激活；激活的外周血单核细胞静置在37℃CO2培养箱中培养24小时；按病毒感染复数(MOI)为3的比例加入以上所得慢病毒上清，加Polybrene至终浓度为5μg/ml，将细胞悬液置于孔板中用水平离心机1200rpm离心1小时；将孔板放回37℃CO2培养箱中培养24小时；300g离心5分钟，去上清，并用新鲜的含500U/ml白介素2的X-VIVO培养基(厂家:LONZA)重悬细胞至细胞密度为0.6×106/ml，置于37℃CO2培养箱中培养；每2天对细胞进行计数，并补加新鲜的含500U/ml白介素2的X-VIVO培养基(厂家:LONZA)将细胞密度调回0.6×106/ml；培养9-14天的CAR-T细胞检测细胞阳性率：用于感染细胞的慢病毒携带GFP，慢病毒感染细胞后通过流式细胞仪检测GFP阳性率从而得到CAR表达阳性率，阳性率>20％的细胞可以用于进行肿瘤杀伤实验。
实施例4过表达细胞株HepG2-MiniG细胞和SK-HEP-1-MiniG细胞的构建及检测
采用慢病毒包装、慢病毒感染的方式，将人AFP158-166基因(SEQ ID NO:89)分别导入HepG2-MiniG和SK-HEP-1细胞中，制备HepG2-MiniG和SK-HEP-1-MiniG细胞。以构建SK-HEP-1-MiniG细胞为例，选用pLV-C-GFPS为载体，***人AFP158-166核苷酸序列，构建重组质粒pLV-C-GFPS-AFP-short(SEQ ID NO:)，PCR及酶切结果如图10所示，人AFP158-166核苷酸序列扩增PCR结果如下(A)：从左往右，依次为100bp Marker，人AFP158-166条带(约150bp)；载体酶切结果如下(B)：依次为Marker IV，载体酶切后条带(约7500bp)；通过慢病毒感染后，将重组质粒pLV-C-GFPS-AFP-short转入SK-HEP-1细胞，挑选单克隆SK-HEP-1-MiniG细胞进行流式结合活性检测，具体结果如图11；单克隆SK-HEP-1-MiniG-7(SK-HEP-1-MiniG细胞单克隆7号)平均荧光强度最高，扩大培养作为靶细胞，HepG2-MiniG细胞构建方法同SK-HEP-1-MiniG细胞。流式检测HepG2-MiniG细胞和SK-HEP-1-MiniG细胞的单克隆细胞扩大培养后的阳性率，结果如图12，HepG2-MiniG细胞阳性率达到87.5％，SK-HEP-1-MiniG细胞阳性率达到93.9％。
实施例5含有候选VHH抗体的CAR-T细胞体外杀伤及因子检测
5.1含有候选VHH抗体的CAR-T细胞体外反复刺激实验
根据实施例3制备CAR-T细胞，在扩增到第9-12天时，检测阳性率，取CAR-T细胞用无血清的X-VIVO培养基(厂家:LONZA)重悬至4×105/ml的密度，作为效应细胞；将实施例4制备的HepG2-MiniG细胞用无血清X-VIVO培养基(厂家:LONZA)重悬至4×105/ml的密度，作为靶细胞；效靶比1:1混合后，在37℃，5％CO2培养箱中静置培养，每2天观察一次培养基颜色，培养基由橙色转黄色时补1倍体积的培养基。第4至5天时进行细胞计数，计数扩增倍数。计数后取5×105CAR-T细胞，再次进行第二、三、四轮扩增，方法同前描述的，将第一轮扩增倍数乘以第二轮、第三轮和第四轮，计算总的累积扩增倍数。
反复刺激结果如图13A，CAR-T细胞1B3经过三轮反复刺激后，累积扩增倍数与CAR-T细胞Ab61相当，如图13B，含有候选VHH抗体的CAR-T细胞3号、4号、7号、8号、17号、29号经过四轮反复刺激后，累积扩增倍数均超过CAR-T细胞Ab61。
5.2含有候选VHH抗体的CAR-T细胞体外杀伤实验
将实施例4制备的SK-HEP-1-MiniG细胞作为靶细胞，实施例3制备的含有候选VHH抗体的CAR-T细胞作为效应细胞，未感染慢病毒的T细胞可作为对照效应细胞。具体实验过程如下，检测实施例3制备的包装好的CAR核心质粒慢病毒的感染效率，用未感染慢病毒的T细胞调整感染比例至每组一致；按效应细胞：靶细胞(效靶比)＝1:1加入200μl X-VIVO培养基中，靶细胞数量为1×104/孔，作为实验组；只含有与实验组等量的效应细胞的孔作为效应细胞自释放背景组；只含有与实验组等量的靶细胞的孔作为靶细胞自释放背景组；将得到的细胞在37℃CO2培养箱中培养18小时；在部分仅含靶细胞的孔中加入20μl 10×的裂解液，反应45分钟，作为靶细胞最大释放。将所得细胞培养孔板分别300g离心5分钟，收集50μl上清用于检测乳酸脱氢酶LDH的释放量，检测方法参照CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒的说明书(厂家：Promega)。释放的LDH在培养基上清中，可通过偶联的酶反应来检测。细胞杀伤活性计算公式为：
杀伤毒性％＝100×(实验组-效应细胞自释放-靶细胞自释放+培养基本底值)/(靶细胞最大释放-靶细胞自释放)。
根据细胞杀伤公式，分析各含有候选VHH抗体的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用，选择具有明显杀伤作用的候选VHH抗体进入体内功能学评价。
杀伤结果如图13C，结果显示5个候选VHH抗体对于HLA-A02*01*+/AFP+阳性细胞SK-HEP-1-MiniG细胞杀伤作用区别不大，在HepG2-MiniG为靶细胞的细胞杀伤结果中，含有候选VHH抗体1C11的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用优于含有阳性对照抗体Ab61的CAR-T细胞，而含有候选VHH抗体2F9的CAR-T细胞对低表达水平的HLA-A02*01*+/AFP+阳性细胞HepG2的细胞杀伤作用优于含有阳性对照抗体Ab61的CAR-T细胞。如图13F，结果显示含有候选VHH抗体3、4、7、8、15、17、24、29的CAR-T细胞对于HLA-A02*01*+/AFP+阳性细胞SK-HEP-1-MiniG细胞杀伤作用均与含有阳性对照抗体Ab61的CAR-T细胞相当，而在HepG2-MiniG为靶细胞的细胞杀伤结果中，含有候选VHH抗体3、4的CAR-T细胞的细胞杀伤作用明显优于含有阳性对照抗体Ab61的CAR-T细胞。
5.3含有候选VHH抗体的CAR-T细胞体外细胞因子分泌实验
实施例4制备的HepG2-MiniG或SK-HEP-1-MiniG细胞作为靶细胞，实施例3制备的含有候选VHH抗体的CAR-T细胞作为效应细胞，未感染慢病毒的T细胞可作为对照效应细胞。具体实验过程如下，检测实施例3制备的包装好的CAR核心质粒慢病毒的感染效率，用未感染病毒的T细胞调整比例至每组一致；按效应细胞：靶细胞(效靶比)＝1:1加入200μlX-VIVO培养基中，靶细胞数量为2×104/孔，作为实验组；只含有与实验组等量的效应细胞的孔作为背景组；将得到的细胞在37℃CO2培养箱中培养18小时；将所得细胞培养孔板分别300g离心5分钟，收集50μl上清用于检测IL2、IFN-γ表达水平，检测方法参考R&D DuoSet ELISA试剂盒(厂家：R&D SYSTEM)说明书。
检测结果如图13D，当靶细胞为HepG2-MiniG或SK-HEP-1-MiniG时，含有候选VHH抗体1B3、1C4、1C11的CAR-T细胞的IFN-γ因子分泌多；如图13E，所有含有候选VHH抗体的CAR-T细胞对HepG2-MiniG细胞和未感染病毒的T细胞的IL2细胞因子的背景都较低。如图13G，当靶细胞为SK-HEP-1-MiniG时，含有候选VHH抗体3、4、7、8、15、17、1B3的CAR-T细胞的IFN-γ因子释放较好。如图13H，当靶细胞为HepG2-MiniG细胞或SK-HEP-1-MiniG细胞时，含有候选VHH抗体15、17、1B3的CAR-T细胞的IL2细胞因子分泌较好，且所有候选VHH抗体的CAR-T细胞对HepG2-MiniG细胞和未感染病毒的T细胞的IL2背景都较低。
实施例6 VHH抗体CAR-T细胞体内药效验证
任意选取含有候选VHH抗体17的CAR-T细胞和含有候选VHH抗体1B3的CAR-T细胞进行体内药效评价。分别向6只小鼠注射6×106K-HEP-1-MiniG细胞，右上肢背中皮下荷瘤，待肿瘤至100mm3时，将NDG小鼠各分为7组，每组给药途径为瘤内注射或尾静脉：1组未感染病毒的T细胞组(对照组I.V)、2组注射含有阳性对照抗体Ab61的CAR-T细胞组(Ab61-I.T为瘤内注射组、Ab61-I.V为尾静脉注射组)、2组注射含有候选VHH抗体1B3的CAR-T细胞组(1B3-I.T为瘤内注射组、1B3-I.V为尾静脉注射组)、2组注射含有候选VHH抗体17的CAR-T细胞组(17-I.T为瘤内注射组、17-I.V为尾静脉注射组)，每组5只，分别回输1×107各自的CAR-T细胞。2周重复一次回输各自的CAR-T细胞，记录给药后各组小鼠的体重，肿瘤大小变化，观察其各种生物学反应情况。
PG(D52)时，各组的肿瘤体积及肿瘤抑制率见表3，未感染病毒的T细胞组平均肿瘤体积为973.98±136.05mm3；与未感染病毒的T细胞组(对照组I.V)相比较，含有阳性对照抗体Ab61的CAR-T细胞瘤内注射组(Ab61-I.T)、含有候选VHH抗体1B3的CAR-T细胞瘤内注射组(1B3-I.T)、含有候选VHH抗体17的CAR-T细胞瘤内注射组(17-I.T)、含有阳性对照抗体Ab61的CAR-T细胞尾静脉注射组(Ab61-I.V)、含有候选VHH抗体1B3的CAR-T细胞尾静脉注射组(1B3-I.V)、含有候选VHH抗体17的CAR-T细胞尾静脉注射组(17-I.V)小鼠平均肿瘤体积分别为2.73±1.71mm3、3.38±2.11mm3、9.58±1.12mm3、19.72±2.08mm3、24.8±1.08mm3、38.32±1.33mm3；与未感染病毒的T细胞组(对照组I.V)相比较，均存在显著性差异(P<0.0001)；肿瘤体积抑制率分别为109.68％、109.57％、108.88％、107.75％、107.19％、105.67％。
表3 PG(D52)小鼠动物实验肿瘤体积及抑制率统计表
动物实验流程如图14，图15A肿瘤生长曲线图结果显示，每组小鼠的肿瘤在第一剂回输各自的CAR-T细胞后第14天开始持续性的消退，各实验组的小鼠平均肿瘤体积与对照组相比较，均存在显著性差异(0.0001<P<0.001)，肿瘤体积抑制率(TGI)均超过100％，瘤内注射回输组的抑瘤作用明显优于尾静脉注射回输组，但无统计学差异，且含有候选VHH抗体1B3、17的CAR-T细胞组与阳性对照组的抑瘤作用不相上下，无统计学差异。图15B动物体重曲线图显示，除对比阳性对照组，Ab61-I.T、1B3-I.T组各有一只小鼠的体重下降超过20％，按动物福利，给予安乐死后解剖观察重要脏器，未发现异常。其余实验组的小鼠体重均较为稳定。实验结果表明，本申请的CAR-T细胞对于SK-HEP-1-MiniG细胞荷瘤的动物模型是安全、有效的。
Claims (10)
1.分离的抗原结合蛋白，其具有以下性质的一种或多种：
1)以约3.1E-09M或以下的KD值与人AFP158-166/HLA-A02*01*复合物特异性结合；
2)能与小鼠AFP158//HLA-A02*01*复合物结合。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述的任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
b)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
c)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
d)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:34，和HCDR3：SEQ ID NO:35；
e)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
g)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
h)HCDR1：SEQ ID NO:44，HCDR2：SEQ ID NO:45，和HCDR3：SEQ ID NO:46；
i)HCDR1：SEQ ID NO:50，HCDR2：SEQ ID NO:51，和HCDR3：SEQ ID NO:52；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:55，和HCDR3：SEQ ID NO:56；
和
k)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:84中任一项所示的氨基酸序列。
4.嵌合抗原受体，其包含靶向部分，所述靶向部分包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述的任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
b)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
c)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
d)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:34，和HCDR3：SEQ ID NO:35；
e)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
g)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30；
h)HCDR1：SEQ ID NO:44，HCDR2：SEQ ID NO:45，和HCDR3：SEQ ID NO:46；
i)HCDR1：SEQ ID NO:50，HCDR2：SEQ ID NO:51，和HCDR3：SEQ ID NO:52；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:55，和HCDR3：SEQ ID NO:56；
和
k)HCDR1：SEQ ID NO:37，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:30。
5.免疫缀合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
6.分离的核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，或者权利要求4所述的嵌合抗原受体。
7.载体，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子。
8.经修饰的细胞，其包含权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求4所述的嵌合抗原受体，权利要求5所述的免疫缀合物，权利要求6所述的分离的核酸分子和/或权利要求7所述的载体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求4中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求5所述的免疫缀合物，权利要求6所述的分离的核酸分子，权利要求7所述的载体，权利要求8所述的经修饰的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
10.权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求4所述的嵌合抗原受体，权利要求5所述的免疫缀合物，权利要求6所述的分离的核酸分子，权利要求7所述的载体，和/或权利要求8所述的经修饰的细胞在制备预防和/或***的药物中的用途。
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