PT2152872E - Método para o fabrico de uma proteína policlonal recombinante - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA O FABRICO DE UMA PROTEÍNA POLICLONAL RECOMBINANTE"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à produção de proteínas policlonais recombinantes, tal como proteínas a partir da superfamília da imunoglobulina, por exemplo, formas solúveis ou ligadas a membrana de receptores de células B ou T, usando sistemas de produção que são independentes de integração especifica.

Antecedentes da Invenção

Diversas doenças tais como doenças infecciosas e cancros carecem de terapias eficazes. Os anticorpos monoclonais geralmente não foram bem sucedidos contra todos esses alvos, parcialmente devido à variabilidade dos alvos complexos e mutações adaptativas de proteínas-alvo causando uma fuga imune do reconhecimento pelo anticorpo monoclonal. Os anticorpos policlonais, por outro lado, são capazes de ter como alvo uma variedade de alvos dinâmicos, por exemplo, em virus, bactérias, ou células de cancro. Também, os anticorpos policlonais têm a mais alta probabilidade de reter actividade no evento de mutação antigénica.

Existem diferentes terapêuticas de anticorpo policlonal comercialmente disponíveis incluindo: (1) imunoglobulina humana normal isolada do sangue de doadores humanos normais; (2) imunoglobulina hiperimune humana derivada do sangue de doares humanos individuais com anticorpos contra uma alvo de doença particular, por exemplo, um virus, que previamente encontraram através de infecção ou vacinação; e 2 (3) imunoglobulina hiperimune animal derivada do sangue de animais imunizados. A imunoglobulina purificada de sangue humano provou ser eficaz contra infecções com virus da hepatite B, virus sincicial respiratório, citomegalovirus e outros virus do herpes, virus da raiva, toxina botulinica, etc., bem como na profilaxia de rhesus-D neonatal. A imunoglobulina purificada do sangue de coelhos imunizados com células T humanas é usada para fornecer imunossupressão de célula T no tratamento ou prevenção de rejeição de transplante (por exemplo, timoglobulina). A imunoglobulina humana normal foi utilizada para estimular o sistema imune de pacientes imunodeficientes, bem como na terapia de vários distúrbios autoimunes.

No entanto, o amplo uso da imunoglobulina foi limitado devido ao fornecimento restrito de matéria-prima de sangue do doador, problemas com variações entre lotes, e segurança variável. As imunoglobulinas derivadas de animais, em particular, têm os mesmos problemas da imunogenicidade como as observadas por anticorpos monoclonais derivados de animais nos anos 80 e 90. Finalmente, como com outros produtos do sangue, o risco de transmissão de agentes infecciosos, tal como o virus do VIH, herpes ou hepatite ou priões, permanece. Consequentemente, enquanto os médicos reconhecem que os anticorpos policlonais são um terapêutico preferencial em algumas situações, a sua utilização foi muito limitada.

Surgiram novas abordagens para gerar imunoglobulinas humanas com as técnicas de animais transgénicos. Criaram-se ratinhos transgénicos carregando loci de imunoglobulina (Patente U.S. N° 6,111,166). Esses ratinhos produzem imunoglobulinas completamente humanas, e podem ser obtidos 3 anticorpos contra um alvo específico por técnicas de imunização convencionais. No entanto, rendimentos mais elevados de anticorpos são limitados por causa do tamanho relativamente pequeno dos ratinhos. Animais maiores também foram feitos transgénicos para os genes de imunoglobulina humana, por exemplo, vacas (Kurolwa, Y. et al, Nature Biotechnology; 2002; 20: 889-893). No entanto, a produção de anticorpos policlonais para aplicações terapêuticas a partir do sangue de tais animais não está isenta de complicações. Primeiro, a imunofisiologia do animal e humanos pode apresentar diferenças consideráveis, causando uma diferença no repertório imune resultante, rearranjo funcional e diversidade da resposta do anticorpo. Segundo, a instabilidade mitótica dos loci de imunoglobulina introduzido poderá influenciar a produção a longo prazo de anticorpos. Terceiro, é tecnicamente difícil deletar os próprios loci de imunoglobulina do animal tal que, por exemplo, a produção de anticorpo animal não exceda a produção de anticorpo humano. Quarto, o risco de transmissão de agentes infecciosos tais como vírus, priões ou outros patogénios, acompanha a administração de anticorpos humanos produzidos em animais.

Recentemente, desenvolveu-se um novo tipo de anticorpos policlonais que é independente da disponibilidade do doador na altura da produção. Esses anticorpos policlonais são gerados isolando-se sequências de ácido nucleico que codificam para o anticorpo de doadores com uma resposta imune contra o alvo desejado, seguido por um rastreio de anticorpos que se ligam especificamente ao alvo desejado. O anticorpo policlonal pode ser fabricado por uma tecnologia de expressão de mamífero adaptada, que é baseada na integração específica de um plasmídeo de expressão de anticorpo no mesmo local genómico de cada célula como descrito em WO 2004/061104. Um exemplo deste novo tipo de 4 anticorpos policlonais é um anticorpo policlonal recombinante contra Rhesus D (WO 2006/007850) . O uso de integração especifica resulta numa população celular na qual cada célula contém uma única cópia e em que se esperam níveis de expressão e taxas de crescimento relativamente uniformes. WO 2004/029284 apresenta um sistema de expressão celular específico capaz de permutar pelo menos um gene alvo, em que o sistema compreende uma primeira cassete de integração, uma primeira cassete do alvo, e pelo menos um elemento rec que codifica para pelo menos uma actividade de recombinase que reconhece os locais de reconhecimento de recombinase das cassetes. WO 2006/007853 apresenta métodos para a caracterização estrutural de um anticorpo policlonal recombinante ou outra proteína policlonal recombinante ou uma linha celular policlonal que produz tal proteína, de modo a verificar a consistência entre lotes dos produtos finais assim como a estabilidade da composição durante lotes de produção únicos .

Wiberg et al. (Biotechn. Bioeng. (2006) 94(2):396-405) descrevem a expressão e a produção de um anticorpo policlonal recombinante anti-Rhesus D compreendendo 25 anticorpos humanos IgGl baseados na integração específica de genes de anticorpo em células CHO.

Huang et al. (J. Immunol. Methods (April 2007) 322(1-2):28-39) descrevem um sistema de integração de genes vector-célula alvo para uma elevada expressão de anticorpos utilizando uma estratégia FRT/FLP para ultrapassar os efeitos da posição. 5

Haurum et al. (iDrugs (2005) 8(5):404-9) revêem o desenvolvimento de terapêuticas com anticorpos desde a primeira geração de imunoglobulina humana à segunda geração de anticorpos monoclonais recombinantes até anticorpos policlonais recombinantes.

Resumo da Invenção A presente invenção fornece métodos alternativos para a produção de uma proteína policlonal recombinante, que são independentes de integração específica e, portanto, fornecem uma flexibilidade acrescida em relação à escolha da linha celular de produção, mantendo a policlonalidade da proteína. Além disso, os níveis de expressão podem ser mais elevados do que possibilitado com a integração específica. A abordagem da presente invenção é baseada na integração aleatória dos genes individuais de interesse em células hospedeiras, preferencialmente seguida pela clonagem de células isoladas com as características desejadas. Os clones de células individuais, dos quais cada um produz um membro individual da proteína policlonal, são então misturados de modo a gerar uma linha celular policlonal de fabrico para a produção de uma proteína policlonal.

Os anticorpos policlonais são geralmente as proteinas policlonais mais bem conhecidas. O mesmo é válido para os receptores de célula τ (TcRs), os quais quando produzidos num sistema de expressão recombinante, podem ser obtidos numa forma solúvel que pode ter potencial para tratamento tal como os anticorpos policlonais. Com os sistemas de expressão recombinante da presente invenção, é, no entanto, também possível combinar proteinas que não são necessariamente homólogas, por exemplo, proteinas diferentes com relevância conhecida numa deficiência ou doença particular. A presente invenção será exemplificada 6 por anticorpos policlonais, mas é destinada a cobrir TcRs policlonais e outras proteínas policlonais que se pode desejar que sejam fabricadas em conjunto. Tais proteínas podem também ser proteínas de fusão se desejado. A presente invenção permite a produção comercial de uma proteína policlonal recombinante num recipiente, por exemplo, para uso em composições farmacêuticas. Uma característica importante da invenção é que durante o processo de fabrico, a expressão preferencial das moléculas individuais constituindo a proteína policlonal é mantida num nível baixo, minimizando a variação entre lotes indesejada e evitando a eliminação de membros do anticorpo policlonal durante o fabrico.

Num aspecto, a presente invenção refere-se a um método para geração de uma linha celular policlonal capaz de expressar uma proteína policlonal compreendendo 2 a n membros distintos, compreendendo o referido método: a) Fornecer um conjunto de vectores de expressão, em que cada um dos referidos vectores compreende pelo menos uma cópia de um ácido nucleico que codifica para um membro distinto da referida proteína policlonal; b) Transfectar separadamente células hospedeiras com cada um dos referidos vectores de expressão sob condições que evitem a integração específica dos vectores de expressão no genoma das células, obtendo desse modo 2 a n composições de células, cada composição expressando um membro distinto da proteína policlonal; c) Misturar as referidas 2 a n composições de células para obter uma linha celular policlonal. 7

Em implementações preferenciais, a linha celular policlonal é usada como uma linha celular de produção policlonal e congelada e armazenada e usada como um Banco de Células Primário policlonal (pMCB), a partir do qual amostras (por exemplo, ampolas) podem ser descongeladas e usadas directamente para fabrico de proteina policlonal recombinante ou geração de um Banco de Células de Trabalho policlonal (pWCB).

Numa implementação, os vectores de expressão são vectores epissomais. Noutra implementação preferencial, os vectores de expressão são integrados de forma estável e aleatória no genoma das células hospedeiras. Os vectores de expressão podem ser integrados de forma estável em posições aleatórias num ou mais cromossomas de uma célula hospedeira.

Preferencialmente, as células transfectadas obtidas na etapa b) são clonadas. Numa implementação, a clonagem é executada usando clonagem FACS como aqui descrito.

Os clones podem ser seleccionados por pelo menos um critério seleccionado a partir do grupo que consiste em: taxa de crescimento, tempo de duplicação, nível de expressão, nível de produção, estabilidade de produção ao longo do tempo, viabilidade, dureza, vigor, morfologia, e número de cópias. Preferencialmente, os clones são seleccionados quanto à uniformidade relativamente a pelo menos um critério. Mais preferencialmente, os clones são seleccionados quanto à uniformidade em relação ao tempo de duplicação e ao nível de expressão.

Um clone ou mais do que um clone podem ser seleccionados para cada membro de proteína policlonal distinto. Assim, podem ser seleccionados 2 clones para cada membro de proteína policlonal distinto, ou podem ser seleccionados 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 clones. As composições de células expressando diferentes membros distintos podem ser misturadas numa razão de 1:1 ou numa razão diferente de uma razão de 1:1.

Preferencialmente, os vectores de expressão são idênticos, excepto variações na sequência que codifica para a proteína policlonal. 0 método pode ser aplicado tanto a proteínas policlonais monoméricas e como multiméricas.

No caso de proteínas multiméricas, um vector de expressão pode codificar para todas as subunidades de um membro de proteína policlonal distinto. Alternativamente, o conjunto de vectores de expressão na etapa (a) é constituído por dois ou mais subconjuntos de vectores de expressão, em que um primeiro subconjunto compreende sequências de ácido nucleico variantes que codificam para uma subunidade da proteína, e um segundo subconjunto compreende sequências de ácido nucleico variantes que codificam para outra subunidade da proteína, de tal modo que cada transfecção é executada com um membro do primeiro subconjunto e um membro para o segundo subconjunto de vectores de expressão. Essa transfecção pode ser simultânea ou sequencial.

Especificamente, o conjunto de vectores de expressão na etapa (a) pode ser constituído por dois subconjuntos de vectores de expressão, onde o primeiro subconjunto compreende sequências de ácido nucleico variantes que codificam para uma cadeia pesada de anticorpo, e o segundo subconjunto compreende sequências de ácido nucleico variantes que codificam para uma cadeia leve de anticorpo, 9 de tal modo que cada transfecção é executada com um membro a partir do primeiro subconjunto e um membro para o segundo subconjunto de vectores de expressão. 0 vector de expressão ou um vector de expressão adicional codifica preferencialmente um marcador seleccionável. Ainda, as células são continuamente cultivadas sob condições que favorecem o crescimento de células que expressam o marcador seleccionável. Isto é melhor assegurado usando um marcador seleccionável compreendendo um produto de gene, do qual a célula hospedeira é deficiente. 0 marcador seleccionável numa implementação é codificado por um transcrito que também codifica para um membro polipeptidico ou uma subunidade do referido membro polipeptidico, preferencialmente em que o marcador seleccionável é codificado pelo transcrito que codifica para a maior subunidade.

Um aspecto da presente invenção refere-se a um método para fabrico de uma proteína policlonal, em que a dita proteína policlonal compreende 2-n membros distintos, compreendendo o referido método: a) fornecer uma linha celular policlonal obtida usando o método da invenção; b) cultivar a linha celular policlonal sob condições que permitem a expressão da proteína policlonal; c) recuperar e opcionalmente purificar a proteína policlonal a partir das células ou do meio de cultura; e opcionalmente d) verificar a presença de cada um dos membros distintos na proteína policlonal recuperada e opcionalmente purificada.

Os presentes inventores determinaram que, surpreendentemente, a distribuição dos clones individuais é 10 mantida durante o estímulo de um ciclo de produção, que é representativo de condições para fabrico industrial de um produto de fármaco recombinante. Isto é muito surpreendente, uma vez que os vectores de expressão para os membros individuais do anticorpo policlonal integram em diferentes posições e porque o número de cópias difere. Isso poderia levar a diferenças tanto no nível de expressão como na taxa de crescimento.

Ao contrário do esperado, o fabrico não resultou na perda completa ou parcial de um ou mais membros do anticorpo policlonal. Mesmo com diferenças mínimas na taxa de crescimento entre diferentes linhas celulares, espera-se que uma composição policlonal ao longo do tempo resulte na perda completa ou parcial de pelo menos um membro da composição policlonal. Assim, em implementações da invenção, a estabilidade composicional é mantida durante mais de 10 divisões celulares após a descongelação do Banco de Célula de Trabalho, preferencialmente durante mais de 15 divisões celulares, tal como mais de 20 divisões celulares, por exemplo, mais de 25 divisões celulares, tal como mais de 30 divisões celulares, por exemplo, mais de 40 divisões celulares, tal como mais de 50 divisões celulares, por exemplo, mais de 75 divisões celulares, tal como mais de 100 divisões celulares.

Os exemplos em anexo mostram que a estabilidade composicional é mantida dentro de limites aceitáveis durante mais de 25 divisões celulares.

Enquanto a transfecção separada é preferida na vasta maioria dos casos, a junção de vectores de expressão antes da transfecção é possível sob certas condições. Se a proteína policlonal for um monómero tal é de facto uma opção, uma vez que não é um problema que uma célula 11 expresse vários membros diferentes da proteína policlonal. Se a proteína policlonal é um multímero, a junção de vectores de expressão antes da transfecção é apenas possível se foram usados meios para assegurar que apenas uma cópia é inserida em cada célula. De outra forma, pode ocorrer o baralhar indesejado das subunidades.

Enquanto a junção de vectores de expressão é uma possibilidade definida, ela é menos preferida que a transfecção separada uma vez que se espera que resulte num sistema de fabrico menos robusto em relação à manutenção da estabilidade composicional.

Em ambos os métodos da invenção, entende-se que a proteína policlonal normalmente é uma que não é naturalmente associada às células em que a expressão é efectuada. A presente invenção descreve vários métodos pelos quais uma biblioteca de sequências de ácido nucleico variantes pode ser introduzida numa linha celular hospedeira de modo a gerar uma colecção de células adequada como linha celular de produção policlonal. Esses métodos incluem transfecção em massa de uma colecção de células com a biblioteca, transfecção em quantidade de alíquotas de células com fracções da biblioteca ou, preferencialmente, transfecção individual onde as células hospedeiras são transfectadas com os membros individuais da biblioteca seguida pela junção de clones gerados mediante selecção. Preferencialmente, a presente invenção utiliza células de mamíferos (linhas celulares ou tipos de células) como linha celular hospedeira.

Num aspecto da invenção, os membros individuais de uma proteína policlonal são codificados a partir de pares de segmentos de gene independentes. As proteínas policlonais, 12 onde os membros individuais são compreendidos por duas ou mais cadeias de polipéptidos, incluem formas de anticorpos ligadas à membrana ou solúveis e receptores de célula T. Em implementações adicionais da presente invenção, um par de segmentos de gene codifica para uma região variável de cadeia pesada de anticorpo e de cadeia leve de anticorpo, ou uma região variável de cadeia beta e de cadeia alfa de receptor de célula T ou uma região variável de cadeia delta ou de cadeia gama de receptor de célula T. A presente invenção adicionalmente fornece uma linha celular policlonal compreendendo 2 a n populações de células, cada população expressando um membro distinto de uma proteína policlonal recombinante, compreendendo as células pelo menos uma construção de expressão aleatoriamente integrada no genoma. Numa implementação, pelo menos uma construção de expressão é aleatoriamente integrada num elemento extracromossómico. Noutra implementação, pelo menos uma construção de expressão é integrada em posições aleatórias num ou mais cromossomas de uma célula hospedeira. A linha celular é preferencialmente originada de uma linha celular de mamíferos, tal como de células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3, fibroblastos ou células humanas imortalizadas tais como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. No entanto, podem também ser utilizadas células eucarióticas ou procarióticas não-mamíferas, tais como células de plantas, células de insectos, células de levedura, bactérias, fungos, etc.

Também se apresenta aqui uma célula CHO DHFR-negativa compreendendo um ácido nucleico integrado de forma estável que codifica para um transactivador de EIA de adenovírus 13 tipo 5 ligado de maneira funcional a um promotor constitutivo.

Tal linha celular CHO modificada foi construída para as experiências aqui descritas. Verificou-se que a linha celular era excepcionalmente estável em relação à uniformidade de taxas de crescimento e niveis de expressão e estabilidade ao longo do tempo tal como é mostrado nos exemplos aqui incorporados e é portanto especialmente adaptada para uso nos métodos da invenção. Experiências posteriores mostraram que mRNA de EIA não era detectável na célula subclonada duas vezes. Isto significa que os resultados mostrando uma estabilidade composicional notável não são apenas devidos à expressão EIA. Ainda, espera-se que uma linha celular CHO DHFR-negativa que expresse EIA de forma estável resulte numa linhagem de expressão de elevada expressão e muito estável.

Numa implementação preferencial, a linha celular é derivada de uma linha celular DG44, que é um "knock-out" DHFR homozigótico. Essa linha celular pode sobreviver apenas num meio deficiente em timidina se as células compreendem uma construção de expressão de DHFR recombinante.

Em implementações preferenciais, a linha celular da invenção adicionalmente compreende pelo menos uma cópia de uma construção de expressão estavelmente integrada que codifica para um polipéptido de interesse. 0 polipéptido de interesse pode ser uma proteina multimérica, preferencialmente a proteína multimérica é um anticorpo.

De modo a permitir a selecção em meio deficiente em timidina, a construção de expressão que codifica para o polipéptido de interesse adicionalmente codifica para dhfr. 14

Preferencialmente, dhfr e pelo menos uma subunidade do polipéptido de interesse é codificada pelo mesmo transcrito, mais preferencialmente dhfr é codificado pelo transcrito que codifica para a maior subunidade. Isto conduz a uma forte ligação entre o produto desejado, o polipéptido de interesse, e o marcador de selecção, dhfr, e assegura que as células sobreviventes expressem o polipéptido de interesse.

Para intensificar adicionalmente a expressão do polipéptido de interesse, a expressão do polipéptido de interesse pode ser controlada por um ou mais promotores transactivável pelo activador transcricional ElA, preferencialmente em que o promotor é um promotor CMV ou derivado de um promotor CMV.

Definições

Por "proteína" ou "polipéptido" entende-se qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou de modificação pós-translacional. As proteínas podem existir como monómeros ou multímeros, compreendendo duas ou mais cadeias de polipéptidos montadas, fragmentos de proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, ou péptidos.

Como usado aqui, o termo "proteína policlonal" ou "policlonalidade" refere-se a uma composição de proteína compreendendo moléculas de proteína diferentes, mas homólogas, preferencialmente seleccionadas da superfamília de imunoglobulina. Assim, cada molécula de proteína é homóloga às outras moléculas da composição, mas também contém uma ou mais porções de sequência de polipéptido variável, que são caracterizados por diferenças na sequência de aminoácidos entre os membros individuais da proteína policlonal. Exemplos conhecidos de tais proteínas policlonais incluem moléculas de anticorpo ou 15 imunoglobulina ou derivados dessas (tal como Fab Fab2; Fvs de cadeia simples, etc.), receptores de célula T e receptores de célula B. Uma proteína policlonal pode consistir num subconjunto definido de moléculas de proteina, que foi definido por uma caracteristica comum tal como a actividade de ligação partilhada relativamente a um alvo desejado, por exemplo, no caso de um anticorpo policlonal contra o antigénio-alvo desejado. 0 termo "proteina policlonal de interesse" cobre um subconjunto de proteina policlonal definido, que partilha uma caracteristica comum, tal como actividade de ligação em relação a um alvo desejado, por exemplo, no caso de anticorpos policlonais descritos pela actividade de ligação ou especificidade para o antigénio-alvo, sendo o referido antigénio um ou mais de, por exemplo, proteínas separadas, microrganismos, parasitas, tipos de células, alergénios, ou moléculas de hidratos de carbono, ou quaisquer outras estruturas, moléculas, ou substâncias, que podem ser o alvo de ligação especifica de anticorpos, ou misturas dos referidos antigénios.

Os termos "um membro de uma composição de proteina policlonal recombinante" ou "um membro de uma proteina policlonal recombinante" denota uma molécula de proteina de uma composição de proteina compreendendo moléculas de proteina diferentes, mas homólogas, onde cada molécula de proteina é homóloga às outras moléculas da composição, mas também contém uma ou mais porções de sequência de polipéptido variável, que é/são caracterizados por diferenças na sequência de aminoácidos entre os membros individuais da proteina policlonal.

Os termos "sequência de polipéptido variável" e "região variável" são usados indistintamente. 16 0 termo "um membro distinto de uma proteína policlonal recombinante" denota uma molécula de proteína de uma composição de proteína compreendendo moléculas de proteína diferentes, mas homólogas, onde cada molécula de proteína é homóloga às outras moléculas da composição, mas também contém uma ou mais porções da sequência de polipéptido variável, que é/são caracterizados por diferenças na sequência de aminoácidos entre os membros individuais da proteína policlonal. 0 termo "anticorpo" descreve um componente funcional de soro e é frequentemente referido ou como uma colecção de moléculas (anticorpos ou imunoglobulina) ou como uma molécula (a molécula de anticorpo ou molécula de imunoglobulina). Uma molécula de anticorpo é capaz de se ligar ou reagir com um determinante antigénico específico (o antigénio ou o epitopo antigénico), que, por sua vez, pode levar à indução de mecanismos efectores imunológicos. Uma molécula de anticorpo individual é geralmente considerada como monoespecífica, e uma composição de moléculas de anticorpo pode ser monoclonal (isto é, consistindo em moléculas idênticas de anticorpo) ou policlonal (isto é, consistindo em diferentes moléculas de anticorpo reagindo com os mesmos epitopos ou epitopos diferentes no mesmo antigénio ou até em antigénios diferentes, distintos). Cada molécula de anticorpo tem uma estrutura única que a permite ligar-se especificamente ao seu antigénio correspondente, e todas as moléculas de anticorpo naturais têm a mesma estrutura básica global de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Os anticorpos são também conhecidos colectivamente como imunoglobulinas. 0 termos anticorpo ou anticorpos como aqui utilizados também pretendem incluir anticorpos de cadeia simples e de cadeia quimérica, bem como fragmentos de ligação de anticorpos, tais como 17 fragmentos Fab, Fv ou scFv, assim como formas multiméricas tais como moléculas igA diméricas ou IgM pentavalente. O termo "anticorpo policlonal" descreve uma composição de diferentes moléculas de anticorpo que é capaz de se ligar ou reagir com vários determinantes antigénicos específicos diferentes nos mesmos antigénios ou em antigénios diferentes. Geralmente, pensa-se que a variabilidade de um anticorpo policlonal está localizada nas regiões assim denominadas de variáveis do anticorpo policlonal. No entanto, no contexto da presente invenção, a policlonalidade pode também ser entendida como descrevendo diferenças entre as moléculas de anticorpo individuais residindo nas assim denominadas regiões constantes, por exemplo, como no caso de misturas de anticorpos contendo dois ou mais isotipos de anticorpo tais como os isotipos humanos igGl, lgG2, lgG3, lgG4, igAl, igA2, IgM, igD, e igE, ou os isotipos murinos igGl, lgG2a, IgG2b, lgG3, e IgA.

Um "anticorpo policlonal recombinante de interesse" descreve um subconjunto de anticorpo policlonal recombinante definido, que é caracterizado pela capacidade de se ligar a um alvo desejado ou conjunto de alvos desejados, sendo os referidos alvos, por exemplo, uma proteína separada, um microrganismo, um parasita, uma célula, um alergénio, ou uma molécula de hidrato de carbono, ou outra estrutura, molécula, ou substância que possa ser o alvo da ligação específico do anticorpo, ou misturas dessas. 0 termo "imunoglobulina" é geralmente usado como uma designação colectiva da mistura de anticorpos encontrados no sangue ou soro, mas pode também ser usado para designar uma mistura de anticorpos derivados de outras fontes. 18 0 termo "molécula de imunoglobulina" denota uma molécula de anticorpo individual, por exemplo, como sendo uma parte da imunoglobulina, ou parte de qualquer composição de anticorpo policlonal ou monoclonal.

Quando se determina que um membro de uma proteína policlonal se liga a um antigénio, considera-se aqui uma ligação com uma constante de ligação que está abaixo de 1 mM, preferencialmente abaixo de 100 nM, ainda mais preferencialmente abaixo de 10 nM. O termo "uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico variantes de interesse" é usado para descrever a colecção de moléculas de ácido nucleico, que colectivamente codificam para uma "proteína policlonal recombinante de interesse". Quando usada para transfecção, a biblioteca de moléculas de ácido nucleico variantes de interesse está contida numa biblioteca de vectores de expressão. Tal biblioteca tipicamente tem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 1000, ΙΟ4, 105 ou 106 membros distintos.

Como usado aqui, pelo termo "sequência de ácido nucleico distinta" entende-se uma sequência de ácido nucleico que pode codificar para cadeias de polipéptido diferentes que em conjunto constituem a proteína de interesse. Quando a sequência de ácido nucleico distinta é compreendida por mais de uma sequência codificante, essas sequências podem estar na forma de uma unidade de transcrição dicistrónica ou elas podem ser operadas como duas unidades transcricionais separadas se ligadas de maneira funcional a promotores adequados. Igualmente, o uso de unidades de transcrição tri- e quatrocistrónica é concebível se a proteína de interesse consiste em 3 ou 4 subunidades, ou se um marcador de selecção está incluído numa unidade 19 transcricional em conjunto com um ácido nucleico que codifica para uma proteína de interesse ou uma sua subunidade. Preferencialmente, uma sequência de ácido nucleico distinta da presente invenção é parte de uma molécula de ácido nucleico tal como, por exemplo, um vector. Alguns exemplos, onde mais de uma sequência codificante é exigida para originar uma molécula completa de uma proteína de interesse, incluem receptores de célula B, anticorpos e fragmentos de anticorpos tais como Fabs e domínios variáveis, ou receptores de célula T. Quando introduzidos na célula, os genes, que em conjunto codificam para a proteína de interesse completamente montada, residem no mesmo vector, sendo assim ligados numa única sequência de ácido nucleico. 0 termo "um gene de interesse" como usado aqui, refere-se a uma sequência de ácido nucleico composta por um ou mais segmentos de gene (genómico ou cDNA) que codificam para um membro de uma proteína de interesse. A forma plural "genes de interesse" refere-se a uma biblioteca de sequências de ácido nucleico que codificam para uma proteína policlonal de interesse. 0 termo "GOI" é usado como uma abreviação de um ou mais genes de interesse.

Como usado aqui, o termo "vector" refere-se a uma molécula de ácido nucleico na qual uma sequência de ácido nucleico pode ser inserida para transporte entre diferentes ambientes genéticos e/ou para expressão numa célula hospedeira. Se o vector contém elementos reguladores para transcrição da sequência de ácido nucleico inserida no vector (pelo menos um promotor adequado), o vector é aqui denominado "um vector de expressão". Se a sequência de ácido nucleico inserida nos vectores identificados acima codifica para uma proteína de interesse como aqui definido, os seguintes termos são usados "vector de interesse" e 20 "vector de expressão de interesse". O termo "um vector que codifica para um isotipo" refere-se a um vector com sequências de ácido nucleico que codifica para um isotipo de anticorpo. Na presente especificação, "vector fagemídeo" e "vector de fagos" são usados de forma indistinta. Os termos "plasmideo" e "vector" são usados de forma indistinta. A invenção pretende incluir tais outras formas de vectores, que servem para funções equivalentes, por exemplo, plasmideos, fagemideos e genomas de virus ou quaisquer moléculas de ácido nucleico capazes de direccionar a produção de uma proteína desejada num hospedeiro apropriado. O termo "cada membro da biblioteca de vectores de interesse" é usado para descrever moléculas individuais de vector com uma sequência de ácido nucleico distinta derivada de uma biblioteca de vectores de interesse, onde a sequência de ácido nucleico codifica um membro da proteína policlonal recombinante de interesse. O termo "transferência de massa" é usado para descrever a transferência de sequências de ácido nucleico de interesse a partir de uma população de vectores para outra população de vectores e fazendo isso para cada adn simultaneamente sem recorrer ao isolamento dos ADNs individuais de interesse. Tais populações de vectores podem ser bibliotecas contendo, por exemplo, regiões variáveis, promotores, elementos líderes ou intensificadores de interesse. Essas sequências podem ser então movidas sem isolamento prévio a partir de, por exemplo, um vector de fago para um vector de expressão de mamíferos. Especialmente para sequências de anticorpos, essa técnica assegura que a ligação entre a diversidade de VH e VL não é perdida enquanto se movem as bibliotecas, por exemplo, de um vector de selecção (por exemplo, um vector de "phage 21 display") para um vector de expressão de mamífero. Aqui, o emparelhamento original de VH e VL é retido. 0 termo "transfecção" é aqui usado como um termo amplo para a introdução de ADN estranho numa célula. 0 termo também visa cobrir outros métodos equivalentes funcionais para introduzir adn estranho numa célula, tal como, por exemplo, transformação, infecção, transdução ou fusão de uma célula doadora e uma célula receptora. 0 termo "selecção" é usado para descrever um método onde as células adquiriram uma certa característica que permite o isolamento de células que não adquiriram essa característica. Tais características podem ser resistência a um agente citotóxico ou produção de um nutriente essencial, enzima, ou cor. 0 termos "gene marcador seleccionável", "gene marcador de selecção", "gene de selecção" ou "gene marcador" são usados para descrever um gene que codifica para um marcador seleccionável, por exemplo, um gene que confere resistência contra algum fármaco citotóxico tal como certos antibióticos, um gene capaz de produzir um nutriente essencial que se pode esgotar do meio de crescimento, um gene que codifica para uma enzima que produz metabolitos analisáveis ou um gene que codifica para uma proteína colorida que, por exemplo, pode ser classificada por FACS, que é co-introduzida nas células em conjunto com o (s) gene(s) de interesse. 0 termo "proteína recombinante" é usado para descrever uma proteína que é expressa a partir de uma linha celular transfectada com um vector de expressão compreendendo a sequência de codificação da proteína. 22

Como aqui usado, o termo "ligado de maneira funcional" refere-se a um segmento ligado a outro segmento quando localizado numa relação funcional com o outro segmento. Por exemplo, o ADN que codifica para uma sequência de sinal é ligado de modo funcional ao ADN que codifica para um polipéptido se ele for expresso como um lider que participa na transferência do polipéptido para o retículo endoplsmático. Também, um promotor ou intensificador é ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação se ele estimula a transcrição da sequência. 0 termo "uma maioria das células individuais" refere-se a uma percentagem das células, tal como mais de 80%, preferencialmente mais de 85%, mais preferencialmente 90%, 95%, ou até 99% ou mais.

Como usado aqui, o termo "genoma" não é usado literalmente como o complemento normal de cromossomas presentes numa célula, mas também elementos extracromossómicos que podem ser introduzidos e mantidos numa célula. Tais elementos extracromossómicos podem incluir, mas não estão limitados a, minicromossomas, YACs (cromossomas artificiais de levedura), MACs (cromossomas artificiais de ratinho), ou HACs (cromossomas artificiais humanos). 0 termo "promotor" refere-se a uma região de ADN envolvida na ligação da ARN polimerase para iniciar a transcrição. 0 termo "promotores cabeça a cabeça" refere-se a um par de promotores colocado localizado em íntima proximidade de tal modo que a transcrição de dois fragmentos de gene accionada pelos promotores ocorre em direcções opostas. Um promotor cabeça a cabeça pode também ser construído como um fragmento central composto de ácidos nucleicos irrelevantes 23 entre os dois promotores. Tal fragmento central pode facilmente conter mais de 500 nucleótidos.

Um "gene de resistência a antibiótico" é um gene que codifica para uma proteína que pode sobrepor o efeito inibidor ou tóxico que um antibiótico tem numa célula assegurando a sobrevivência e proliferação continuada de células na presença do antibiótico. 0 termo "sítio interno de entrada do ribossoma" ou "IRES" descreve uma estrutura diferente da estrutura cap 5' normal num mARN. Ambas as estruturas podem ser reconhecidas por um ribossoma para iniciar o rastreio de um codão AUG para iniciar a tradução. Usando uma sequência promotora e dois AUGs de iniciação, uma primeira e uma segunda sequência de polipéptido podem ser traduzidas a partir de um único mARN. Assim, para permitir a co-tradução de uma primeira e uma segunda sequência de polinucleótido a partir de um único mARN bicistrónico, a primeira e a segunda sequência de polinucleótido podem ser transcricionalmente fundidas através de uma sequência ligadora incluindo uma sequência IRES que permite a tradução da sequência de polinucleótido a jusante da sequência de IRES. Nesse caso, uma molécula de ARN bicistrónica transcrita será traduzida tanto a partir da extremidade 5' terminada como da sequência IRES interna da molécula de ARN bicistrónica para, desse modo, produzir tanto o primeiro como o segundo polipéptido. 0 termo "expressão indutível" é utilizado para descrever a expressão que requer a interacção de uma molécula indutora ou a libertação de uma molécula co-repressora e uma proteína reguladora para que a expressão ocorra. O termo "expressão constitutiva" refere-se à expressão que não é geralmente induzida. 24 0 termo "baralhamento" descreve situações onde dois ou mais membros distintos de uma proteína policlonal, cada um compreendido por duas ou mais cadeias de polipéptido diferentes, por exemplo, da superfamília de imunoglobulinas, são expressos a partir de uma célula individual. Essa situação pode surgir quando a célula individual integrou, no genoma, mais de um par de segmentos de gene, onde cada par de segmentos de gene codifica para um membro distinto da proteína policlonal. Em tais situações, podem porduzir-se combinações involuntárias das cadeias de polipéptido expressas a partir dos segmentos de gene. Essas combinações não pretendidas de cadeias de polipéptidos podem não ter qualquer efeito terapêutico. 0 termo "baralhamento de cadeia VH-VL" é um exemplo do baralhamento definido acima. Neste exemplo, os segmentos de gene que codifica para VH e VL constituem um par de segmentos de gene. 0 baralhamento ocorre quando são produzidas combinações involuntárias de polipéptidos VH e VL a partir de uma célula onde dois pares de segmento de gene que codificam para VH e VL são integrados na mesma célula. Não é provável que tal molécula de anticorpo baralhada retenha a especificidade original, e assim poderá não ter qualquer efeito terapêutico ou até pode ter um efeito terapêutico indesejado. 0 termo "linha celular de produção policlonal recombinante" refere-se a uma população de células que expressa proteína que são transfectadas com uma biblioteca de sequências de ácido nucleico variantes de interesse, tais como as células individuais, as quais em conjunto constituem a linha celular de produção policlonal recombinante, contêm uma ou mais cópias de uma sequência de ácido nucleico distinta de interesse, que codifica um membro da proteína policlonal 25 recombinante de interesse, e que cada cópia é integrada no genoma de cada célula. As células que constituem a linha celular de produção policlonal recombinante são seleccionadas quanto à sua capacidade de reter a cópia integrada da sequência de ácido nucleico distinta de interesse, por exemplo, por selecção com antibiótico. As células que constituem tal linha celular de produção podem ser, por exemplo, bactérias, fungos, células eucarióticas, tal como levedura, células de insectos ou células de mamíferos, especialmente linhas celulares imortais de mamíferos tais como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3, e células humanas imortalizadas, tais como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. 0 termo "tendência" é usado para denotar o fenómeno durante a produção de proteína policlonal recombinante, onde a composição de um vector policlonal, linha celular policlonal, ou proteína policlonal se altera ao longo do tempo devido a mutações genéticas aleatórias, diferenças na cinética de proliferação entre células individuais, diferenças nos níveis de expressão entre diferentes sequências de uma construção de expressão, ou diferenças na eficiência da clonagem de ADN. 0 termo "RFLP" refere-se a "polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição", um método onde o padrão de migração em gel de fragmentos de molécula de ácido nucleico é analisado após clivagem com enzimas de restrição. 0 termo "UTR 5'" refere-se a uma região não traduzida 5' do mRNA. 0 termo "condições que evitam a integração específica" refere-se a um processo de transfecção que não inclui 26 qualquer uma das formas possíveis de obter a integração específica. A integração específica pode ser alcançada, por exemplo, usando uma combinação de uma recombinase e um local de reconhecimento para a recombinase num cromossoma da célula hospedeira. A recombinase pode também ser ligada de forma covalente a uma porção de nucleótido que reconhece um local particular num cromossoma. A integração específica pode também ser alcançada, apesar de com uma menor eficácia, usando recombinação homóloga. Evitar a integração específica frequentemente resultará na integração em posições aleatórias por todo o genoma da célula hospedeira, se forem usados vectores de integração. 0 termo "integração aleatória" refere-se à integração de um vector de expressão no genoma de uma célula hospedeira em posições que são aleatórias. 0 significado no dicionário de aleatório é que existem hipóteses idênticas para cada item, nesse caso, local de integração. Quando se transfectam células, nem todos os locais de integração representam hipóteses de integração absolutamente iguais na medida em que algumas partes dos cromossomas são mais propensas a eventos de integração do que outras. Quando nada é feito para guiar o vector de expressão para um local de integração particular, ele integrará em posições que são aleatórias dentro do grupo de locais de integração possíveis. Portanto, "integração aleatória" no contexto da presente invenção deve ser entendido como um procedimento de transfecção onde nada é feito para guiar a construção de expressão para uma posição predeterminada. A ausência de meios de guiar o vector de expressão para uma posição predeterminada basta para assegurar a "integração aleatória". Deste modo, o ou os sítios de integração irão variar de célula para célula numa população transfectada, e os locais exactos de integração podem ser considerados imprevisíveis. 27 0 termo "estavelmente integrado" refere-se à integração de um vector de expressão no genoma de uma célula hospedeira, em que a integração permanece estável ao longo de pelo menos 20, mais preferencialmente 30, mais preferencialmente 40, mais preferencialmente 50, tal como 75, por exemplo, 100 gerações ou mais.

Abreviaturas: "CMV" = Citomegalo Vírus (humano). "AdMLP" = Promotor Tardio Principal do Adenovírus. SV40 poli A = sequência sinal poli A do vírus símio 40. GFP = Proteínas Verdes Fluorescentes. TcR = receptor de célula T. ELISA = Ensaio de Imunossorção Enzimática. LTR = Repetição Terminal Longa.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Apresentação esquemática geral do processo para gerar um banco de células policlonais. A Figura ilustra esquematicamente as etapas necessárias para se obter um banco de células policlonais, por exemplo, um banco primário de células policlonais. (a) ilustra diferentes vectores de expressão N.A.i, N.A.2, N.A.3, etc., cada um que codifica para um membro diferente e distinto da proteína policlonal. (b) ilustra as células hospedeiras a serem transfectadas com os vectores de expressão. (c) ilustra a integração dos vectores de expressão em diferentes posições e em diferentes números de cópias em células individuais. (d) ilustra a selecção de clones celulares para cada um dos membros da proteína policlonal. Neste caso particular, para facilidade de ilustração, é apenas mostrado um clone por membro distinto da proteína policlonal. Etapa (e) ilustra a mistura dos clones seleccionados na etapa (d) para gerar um banco de células policlonais. 28

Figura 2a. Vector protótipo que codifica para a cadeia pesada e a cadeia leve.

Os elementos são como segue: dois promotores CMV humanos cabeça a cabeça idênticos com um elemento espaçador de permeio regiões de codificação para cadeia pesada (VH + região constante gama 1) e cadeia leve (kapa 02-286) bGH = sequência de poliadenilação da hormona do crescimento bovino SV40 pA = sequência de poliadenilação SV40 lideres genómicos para cadeia pesada e cadeia leve IRES + DHFR = ECMV local de entrada interno do ribossoma e o cDNA de di-hidrofolato redutase de ratinho

pUC ori = origem de replicação pUC bla, amp = gene para resistência à ampicilina

Figura 2b. Vector de expressão de EIA pML29.

Os elementos são como segue: O vector é baseado em pcDNA3.1 + (Invitrogen) CMV = promotor de CMV humano EIA = cDNA para transactivador 13S de adenovirus tipo 5 bGH = região de poliadenilação da hormona do crescimento bovino SV40EP = promotor precoce SV40

Neo = o gene para resistência neo SV40 poli A = região de poliadenilação SV40 AMP = gene da β-lactamase que codifica para resistência à ampicilina

Figura 3. Conteúdo de IgG de misturas 1-9 durante o período de 5 semanas em que a experiência foi executada. 29

Figura 4. Cromatogramas de troca iónica mostrando a composição de Mistura 8 no inicio (preto) e fim (azul) do período de cultura de 5 semanas.

Figura 5. Primeira (cinza) e última (preta) amostra de todas as 9 misturas que foram analisadas por cromatografia de troca iónica e o conteúdo de cada anticorpo individual foi calculado e apresentado graficamente.

Figura 6. Amostras das 4 misturas (Exemplo 5) durante a preparação de inoculo e processo em biorreactor foram analisadas por cromatografia de troca iónica e o conteúdo de cada anticorpo individual foi calculado e apresentado graficamente.

Mistura IA - 3A continha um único clone por anticorpo. Os clones celulares que expressavam cada um dos 6 anticorpos foram diferentes na mistura IA (Figura 6a), mistura 2A (Figura 6b) e mistura 3A (Figura 6c).

Mistura 4A (Figura 6d) continha 3 clones por anticorpo. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 sistema de expressão de proteína policlonal recombinante A presente invenção fornece métodos para o fabrico consistente de proteínas policlonais recombinantes que são preferencialmente seleccionadas a partir da superfamília de imunoglobulinas, uma família de proteínas com domínios similares à imunoglobulina. A maioria dos membros está envolvida em eventos de reconhecimento de superfície celular. A análise de sequência sugere que os anticorpos, receptores de célula T, moléculas MHC, algumas moléculas de adesão celular e receptores de citocinas são altamente homólogos. Especialmente, os membros dessa família que contêm regiões variáveis são adequados para a geração de proteínas policlonais recombinantes de acordo com a 30 presente invenção. Tais membros incluem anticorpos, anticorpos ligados à membrana (receptores de célula B), fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadeia simples (scFv), receptores de célula T (TcRs), TcRs solúveis, fragmentos de domínio variável TcR, fragmentos de domínio variável TcR ligados por um polipéptido ligante ou outro anticorpo ou fragmentos derivados de TcR. Em particular, contempla-se que a presente invenção pode ser usada para fabrico em larga escala e produção de anticorpos policlonais terapêuticos recombinantes e TcRs.

Uma das maiores vantagens do método de fabrico da presente invenção é que todos os membros constituindo a proteína policlonal recombinante podem ser produzidos num ou alguns biorreactores ou seus equivalentes. Além disso, a composição de proteína policlonal recombinante pode ser purificada a partir do reactor como uma única preparação sem ter que separar os membros individuais constituindo a proteína policlonal recombinante durante o processo. Pelo contrário, se fosse desejado mimetizar uma composição de anticorpo policlonal recombinante misturando anticorpos monoclonais purificados (como, por exemplo, proposto em WO 91/16074), isso exigiria o fabrico separado num biorreactor de cada anticorpo a ser incluído na composição e os anticorpos seriam purificados individualmente também. Tal produção de uma mistura monoclonal seria muito dispendiosa, e onerosa em tempo e espaço comparada com o método de produção de anticorpo policlonal recombinante ou outras proteínas policlonais como descrito aqui. Assim, o método descrito em WO 91/16074 naturalmente resultaria num limite prático para o número de anticorpos monoclonais que poderia ser incluído em tal mistura, enquanto que a tecnologia descrita aqui geralmente pode produzir um anticorpo policlonal com vários membros individuais, em princípio, sem um limite superior. 31 A linha celular hospedeira usada é preferencialmente uma linha celular de mamífero compreendendo aquelas tipicamente usadas para expressão de proteínas biofarmacêuticas, por exemplo, células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3, e células humanas imortalizadas, tal como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. Na presente invenção, células foram usadas CHO, mais particularmente, um clone DG44 modificado. A escolha dessa linha celular particular foi feita porque as células CHO são amplamente usadas para produção recombinante de anticorpos e porque o clone DG44 pode ser usado em combinação com o marcador de selecção metabólico DHFR, que adicionalmente permite a amplificação do gene codificado. A linha celular DG44 foi modificada por transfecção com um vector de expressão que codifica para o transactivador EIA. Isso foi feito para aumentar o rendimento total, quando o gene de interesse é ligado de maneira funcional a um promotor de CMV. 0 promotor de CMV é transactivado por EIA. A modificação proporcionou uma linha celular excepcionalmente estável fornecendo clones celulares com taxas de crescimento uniformes e níveis de expressão elevados e uniformes para diferentes anticorpos. Crê-se que a modificação, portanto, optimiza a estabilidade composicional ao longo do tempo. Tentativas de detectar a expressão de EIA na linha celular modificada falharam. Não é portanto provável que as taxas de crescimento uniformes e os níveis de expressão altos e uniformes possam estar relacionados unicamente com a expressão de EIA. Enquanto no presente caso, a expressão de ElA não foi detectável, crê-se ainda que a transactivação do promotor de CMV usando a expressão de ElA poderia levar a níveis de expressão ainda mais estáveis e elevados. 32

As células BHK-21 ou células CHO são preferencialmente usadas para expressão. As células CHO adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células CH0-K1 e CHO-S. Mutantes DHFR-menos de CHO tais como CH0-DUKX-B11 ou DG44, são células de mamífero preferidas para a prática desta invenção. Essas células são bem conhecidas na técnica e amplamente disponíveis, por exemplo, a partir da American Type Culture Collection (A.T.C.C) Rockville, Md, (BHK-21) ou através do Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, Nova Iorque (CHO DUKX-B11 ou DG44). Essas células adaptam-se bem ao crescimento em culturas em suspensão (também sob condições sem soro) e/ou podem crescer sob baixas concentrações de soro e podem ser usadas em conjunto com o marcador de selecção de DHFR. A linha celular é preferencialmente subclonada e seleccionada para clones que mostram uma alta e estável expressão de membro(s) da proteína policlonal.

Consequentemente, uma pessoa versada na técnica seria capaz de substituir o clone DG44 por outros clones e substituir células CHO por outras células de mamífero como descrito, ou até utilizar outros tipos de células, incluindo células de plantas, células de levedura, células de insecto, fungos e bactérias. Assim, não se pretende que a escolha do tipo de célula seja limitativa da invenção.

Os rendimentos que podem ser obtidos usando os métodos da presente invenção dependem de um número de parâmetros incluindo, mas sem limitação limitados, as condições de cultura e as espécies de células hospedeiras usadas. Em implementações da presente invenção, o rendimento preferencialmente excede 50 mg/L de proteína, tal como mais de 60 mg/L, por exemplo, mais de 75 mg/L, tal como mais de 100 mg/L, por exemplo, mais de 125 mg/L, tal como mais de 33 150 mg/L, por exemplo, mais de 200 mg/L, tal como mais de 250 mg/L, por exemplo, mais de 300 mg/L, tal como mais de 400 mg/L, por exemplo, mais de 500 mg/L, tal como mais de 600 mg/L, por exemplo, mais de 700 mg/L, tal como mais de 750 mg/L, por exemplo, mais de 800 mg/L, tal como mais de 900 mg/L, por exemplo, mais de 1000 mg/L, tal como mais de 2 g/L, por exemplo, mais de 3 g/L, tal como mais de 4 g/L, por exemplo, mais de 5 g/L.

Pretende-se que a proteína policlonal recombinante da presente invenção abranja uma composição de proteína compreendendo moléculas de proteína diferentes, mas homólogas, que são naturalmente variáveis, significando que, nas implementações preferenciais, a biblioteca de ácidos nucleicos compreende uma diversidade que ocorre naturalmente. Assim, cada molécula de proteína é homóloga a outras moléculas da composição, mas também contém uma ou mais porções de sequência de polipéptido variável, que é/são caracterizados por diferenças na sequência de aminoácido entre os membros individuais da proteína policlonal. As diferenças na(s) sequência(s) de aminoácido que constituem a sequência de polipéptido variável podem ser de apenas um aminoácido. Preferivelmente, as diferenças nas sequências de aminoácido constituem mais do que um aminoácido.

Geralmente, a variabilidade natural de um anticorpo policlonal ou TcR é considerada como estando localizada nas denominadas regiões variáveis ou regiões-V das cadeias de polipéptido.

Os membros individuais numa proteína policlonal podem compreender regiões variáveis que têm um comprimento entre aproximadamente 80 e 120 aminoácidos. As regiões variáveis 34 podem compreender domínios hipervariáveis, por exemplo, regiões de determinação de complementaridade (CDR).

Em TcRs que ocorrem naturalmente existem quatro CDRs em cada região variável. Em anticorpos que ocorrem naturalmente, há três CDRs na cadeia pesada e três CDRs na cadeia leve.

Além disso, as regiões variáveis dos membros individuais de uma proteína policlonal podem compreender pelo menos um domínio hipervariável que tem um comprimento entre 1 e 26 aminoácidos, preferencialmente entre 4 e 16 aminoácidos. Esse domínio hipervariável pode corresponder a uma região CDR3. Para anticorpos, cada região variável preferencialmente constitui três domínios hipervariáveis. Estes correspondem a CDRl, CDR2 e CDR3. Para TcRs, cada região variável preferencialmente constitui quatro domínios hipervariáveis. Esses correspondem a CDRl, CDR2, CDR3 e CDR4. Os domínios hipervariáveis podem isoladamente constituir as sequências variáveis dentro de uma região variável de uma proteína policlonal recombinante da presente invenção.

No contexto da presente invenção, a variabilidade na sequência de polipéptido (a policlonalidade) pode também ser entendida para descrever diferenças entre as moléculas de anticorpo individual residindo nas denominadas regiões constantes ou regiões C das cadeias de polipéptidos de anticorpos, por exemplo, como no caso de misturas de anticorpos contendo dois ou mais isotipos de anticorpos diferentes, tais como os isotipos humanos igGl, lgG2, lgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD, e IgE, ou os isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM e IgA. Assim, um anticorpo policlonal recombinante pode compreender moléculas de anticorpo que são caracterizadas por diferenças de 35 sequência entre as moléculas de anticorpo individual na região variável (região V) ou na região constante (região C), ou em ambas. Preferencialmente, os anticorpos são do mesmo isotipo, na medida em que isso facilita consideravelmente a subsequente purificação. É também concebível combinar anticorpos, por exemplo, de isotipo igGl, igG2 e lgG4, uma vez que esses podem ser todos purificados em conjunto usando cromatografia de afinidade com a Proteína A. Numa implementação preferencial, todos os anticorpos constituindo o anticorpo policlonal têm a mesma região constante para facilitar adicionalmente a purificação. Mais preferencialmente, os anticorpos têm a mesma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia leve pode também ser a mesma entre anticorpos distintos.

De modo a fornecer sequências variantes de ácido nucleico que codificam proteínas que se ligam a um antigénio particular, pode-se utilizar um número de métodos conhecidos na técnica. Tipicamente, a invenção beneficiará do uso de um procedimento de rastreio que permite a identificação e/ou isolamento de ácidos nucleicos que codificam para a proteína que se liga a um antigénio particular, vários desses métodos incluem uma etapa de enriquecimento ou uma denominada etapa de "biopanning", conhecida de tecnologias tais como Symplex (Mejier et al, 2006, J. Mol. Biol, 358:764 a 772; WO 2005/042774), apresentação de fagos (Kang, A.S. et al, 1991. Proc Natl Acad Sei USA 88, 4363 a 4366), apresentação de ribossoma (Schaffitzel, C. et al, 1999. J. Immunol. Methods 231, 119 a 135), apresentação de ADN (Cull, M.G. et al, 1992. Proc Natl Acad Sei USA 89, 1865 a 1869), apresentação de ARN-péptido (Roberts, R.W., Szostak, J.W., 1997. Proc Natl Acad Sei USA 94, 12297 a 12302), apresentação covalente (WO 98/37186), apresentação de superfície bacteriana (Fuchs, P. 36 et al, 1991. Biotechnology 9, 1369 a 1372), apresentação de superfície de levedura (Boder, E.T. ., Wittrup, K.D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553 a 557) e apresentação de vírus eucariótico (Grabherr, R., Ernst, W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen . 4, 185 a 192), métodos que são todos conhecidos na técnica e são auxílios interessantes na prática da presente invenção. FACS e classificação de esferas magnética são também aplicáveis para propósitos de enriquecimento (panning) usando antigénio marcado. Os ensaios de imunodetecção, tal como ELISA (Dreher, M.L. et al, 1991. J. Immunol. Methods 139, 197 a 205) e ELISPOT (Czerkinsky, C.C. et al, 1983. J Immunol Methods. 65, 109 a 121) podem também ser usados após uma etapa de "biopanning" ou isoladamente.

Uma composição de uma proteína policlonal recombinante de interesse compreende um subconjunto definido de proteínas, que foram definidas por uma característica comum tal como a actividade de ligação partilhada em relação a um alvo desejado, por exemplo, no caso de anticorpos policlonais contra o antigénio-alvo desejado. Tipicamente, uma composição de proteína policlonal tem pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, ΙΟ4, 105 ou 106 membros variantes distintos. O número de membros distintos necessários na composição de proteína policlonal dependerá da complexidade do alvo. No caso de anticorpos, a complexidade do(s) antigénio(s)-alvo influenciará no número de membros variantes distintos necessários na composição de anticorpo policlonal. Com alvos pequenos ou não muito complexos, por exemplo, uma pequena proteína, uma composição de anticorpo policlonal que compreenda entre 2 ou 3 e 100 membros variantes distintos pode ser suficiente, e é preferível que o número de variantes não exceda 90, ou até 80 ou 70. Em muitos casos, o número de variantes distintas não excederá 60 ou 50, e é preferível que o número de variantes esteja 37 na faixa entre 5 e 40, tal como entre 5 e 30. Dado que para alvos mais complexos, uma composição de anticorpo policlonal que compreende entre 20 e 500 membros variantes distintos pode ser suficiente. Alvos muito complexos, onde o antigénio compreende muitas moléculas diferentes, uma composição de anticorpo policlonal compreendendo entre 50 a 10000 membros variantes distintos pode ser necessária.

Em mamíferos, há vários exemplos conhecidos de proteínas policlonais que ocorrem naturalmente que ou circulam livremente no sangue, tal como moléculas de anticorpos ou imunoglobulinas, ou estão presentes em superfícies celulares, tais como receptores de célula T e receptores de célula B. A diversidade dessas proteínas policlonais que ocorrem naturalmente é, nalguns mamíferos, alcançada por recombinação genética de genes que codificam para regiões variáveis dessas proteínas. Os anticorpos são adicionalmente conhecidos por aumentar sua diversidade por mutação somática. A presente invenção pode utilizar essas diversidades naturais isolando as sequências responsáveis pela diversidade (por exemplo, os domínios variáveis ou regiões CDR de moléculas de imunoglobulina ou TcRs) e gerando uma biblioteca a partir delas. Para proteínas codificadas a partir de dois segmentos de gene independentes, por exemplo, cadeia pesada variável e cadeia leve variável de anticorpo, cadeia TcRa e cadeia β ou cadeia TcRõ e cadeia γ, cada vector na biblioteca constituirá um par dessas sequências que codificam para regiões variáveis. A geração de bibliotecas de pares de sequências de codificação de região variável é bem conhecida na técnica.

As bibliotecas compreendendo diversidades que ocorrem naturalmente são, por exemplo, bibliotecas combinatoriais (emparelhamento aleatório das sequências de codificação de 38 região variável) bem como bibliotecas de par cognato (pares de sequências de codificação de região variável derivadas da mesma célula, por exemplo, WO 2005/042774) . Bibliotecas adicionais geradas a partir de fragmentos de gene CDR isolados, que são incorporados numa estrutura apropriada (por exemplo, Soderlind, E. et al, 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852 a 856), tal como um anticorpo ou região variável TcR, são aplicáveis com a presente invenção. As bibliotecas são preferencialmente rastreadas para obter as sub-bibliotecas (bibliotecas de interesse) com uma especificidade desejada.

As diversidades de proteínas podem também ser produzidas de uma forma artificial, por exemplo, sintética ou por mutação. As mutações podem ou ser mutações aleatórias ou pontuais de uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma única proteina, gerando desse modo uma população policlonal da única proteina. Outro exemplo de geração de bibliotecas de anticorpo artificial é descrito em EP 0 859 841, um método que é baseado na geração de uma biblioteca de estruturas de região variável que pode ser combinada com outra biblioteca de CDRs.

Numa implementação preferencial da invenção, a proteína policlonal recombinante é um anticorpo ou fragmento de anticorpo policlonal recombinante.

Noutra implementação preferencial da invenção, a proteína policlonal recombinante é um TcR policlonal recombinante ou fragmento de TcR.

Uma proteina policlonal recombinante da presente invenção pode, portanto, também ser constituída pelos diferentes isotipos ou mais preferencialmente de subclasses diferentes. A policlonalidade das imunoglobulinas pode ocorrer na parte constante ou no domínio variável da 39 molécula de imunoglobulina ou em ambos a parte constante e o domínio variável. A policlonalidade na denominada região constante, particularmente a cadeia pesada dos anticorpos, é de interesse com relação à aplicação terapêutica dos anticorpos. Os vários isotipos de imunoglobulina têm diferentes funções biológicas (resumidas na Tabela 1), que devem ser desejáveis de combinar quando se utilizam anticorpos para o tratamento porque diferentes isotipos de imunoglobulina podem estar implicados em diferentes aspectos de respostas imunes naturais (Canfield e Morrison 1991. J. Exp.Med. 173, 1483 a 1491; Kumpel et al, 2002. Transfus. Clin. Biol. 9, 45 a 53; Stirnadel et al, 2000. Epidemiol. Infect. 124, 153 a 162).

Tabela 1: Funções biológicas dos isotipos de imunoglobulina humana

Imunoglobulina Humana IgGi IgG2 IgG3 IgG4 igAi IgA2 IgM IgD IgE Activação do complemento clássica +++ ++ ++++ + - - ++++ - - Activação do complemento alternativa + + + + + + + - - + - Transferência placentária + + + + + + - - - - - Lise bacteriana + + + + +++ +++ + 7 7 Ligação a macrófagos/ou tros fagócitos + - + + + + - - - Ligação a mastócitos/ba sóf ilos - - - - - - - - - Reactividade à Proteína A de estafilococo + + - + - - - - - 40

Um aspecto adicional da presente invenção é uma linha celular de produção policlonal recombinante, compreendendo uma linha celular policlonal com 2-n populações de células, cada população expressando um membro distinto de uma proteína policlonal recombinante, as células compreendendo construções de expressão aleatoriamente integrados no genoma. As construções de expressão são preferencialmente estavelmente integradas no genoma. As construções numa implementação são integradas num ou mais cromossomas. O número de populações de células na linha celular policlonal, n, pode ser 3 ou mais, tal como 4 ou mais, por exemplo, 5 ou mais, tal como, 6 ou mais, por exemplo, 7 ou mais, tal como 8 ou mais, por exemplo, 9 ou mais, tal como 10 ou mais, por exemplo, 11 ou mais, tal como 12 ou mais, por exemplo, 13 ou mais, tal como 14 ou mais, por exemplo, 15 ou mais, tal como 16 ou mais, por exemplo, 17 ou mais, tal como 18 ou mais, por exemplo, 19 ou mais, tal como 20 ou mais, por exemplo, 21 ou mais, tal como 22 ou mais, por exemplo, 23 ou mais, tal como 24 ou mais, por exemplo, 25 ou mais, tal como 26 ou mais, por exemplo, 27 ou mais, tal como 28 ou mais, por exemplo, 29 ou mais, tal como 30 ou mais, por exemplo, 35 ou mais, tal como 40 ou mais, por exemplo, 45 ou mais, tal como 50 ou mais, por exemplo, 60 ou mais, tal como 70 ou mais, por exemplo, 80 ou mais, tal como 90 ou mais, por exemplo, 100 ou mais.

Para a maioria dos objectivos, n pode ser menor que 50, tal como menos de 45, por exemplo, menos de 40, tal como menos de 35, por exemplo, menos de 30.

Uma implementação importante da presente invenção é a etapa de clonagem de célula executada antes de finalmente misturar a linha celular policlonal. Essa etapa resulta num rendimento e estabilidade optimizados dos bancos de células 41 policlonais obtidos minimizando a ocorrência de prevalência clonal. As células expressando um membro distinto da proteína policlonal recombinante podem ser derivadas de 1 ou mais células clonadas, tal como a partir de 2 ou mais, por exemplo, 3 ou mais, tal como 4 ou mais, por exemplo 5 ou mais, tal como 6 ou mais, por exemplo, 7 ou mais, tal como 8 ou mais, por exemplo, 9 ou mais, tal como 10 ou mais, por exemplo, 11 ou mais, tal como 12 ou mais, por exemplo, 13 ou mais, tal como 14 ou mais, por exemplo, 15 ou mais, tal como 16 ou mais, por exemplo, 17 ou mais, tal como 18 ou mais, por exemplo, 19 ou mais, tal como 20 ou mais, por exemplo, 21 ou mais, tal como 22 ou mais, por exemplo, 23 ou mais, tal como 24 ou mais, por exemplo, 25 ou mais, tal como 26 ou mais, por exemplo, 27 ou mais, tal como 28 ou mais, por exemplo, 29 ou mais, tal como 30 ou mais, por exemplo, 35 ou mais, tal como 40 ou mais, por exemplo, 45 ou mais, tal como 50 ou mais, por exemplo, 60 ou mais, tal como 70 ou mais, por exemplo, 80 ou mais, tal como 90 ou mais, por exemplo, 100 ou mais . Para a maioria dos objectivos, o número de células clonadas é menor que 50, por exemplo, menor que 20, tal como menor que 15, por exemplo, menor que 10.

Numa implementação adicional da implementação acima, as sequências de ácido nucleico variantes que codificam para a proteína policlonal (preferencialmente da superfamília de imunoglobulina) são todas derivadas de sequências que ocorrem naturalmente, por exemplo, isoladas de um doador.

Diversidade Clonal

Uma das características de uma proteína policlonal é que ela é constituída por um número de moléculas de proteína individuais onde cada molécula de proteína é homóloga às outras moléculas da proteína policlonal, mas também tem uma variabilidade que é caracterizada por diferenças na 42 sequência de aminoácido entre os membros individuais da proteína policlonal. Preferencialmente, as diferenças são confinadas a áreas distintas da estrutura global da proteína policlonal. Tais áreas são, por exemplo, a região variável de um anticorpo ou TcR e possivelmente ainda confinadas às regiões CDR nessas áreas. Esta variabilidade pode também ser descrita como uma diversidade, a qual pode ser identificada tanto ao nivel do ácido nucleico bem como ao nivel funcional da proteína, por exemplo, diferenças de especificidade e afinidade em relação a um alvo. A diversidade clonal da linha celular pode ser analisada por RFLP em clones isolados a partir de um grupo de células que expressam uma proteína policlonal recombinante. A sequenciação de produtos de (RT)-PCR representa outra possibilidade de analisar a diversidade clonal. A diversidade pode também ser analisada por testes funcionais (por exemplo, ELISA) na proteína policlonal recombinante produzida pela linha celular. WO 2006/007853 apresenta métodos para a caracterização de uma linha celular policlonal e uma proteina policlonal. Esses métodos podem ser usados para analisar a diversidade clonal da linha celular e da proteína policlonal resultante. A prevalência clonal (ou seja, uma alteração gradual no conteúdo dos anticorpos individuais que constituem o anticorpo policlonal), se existir, pode ser estimada através da comparação da diversidade clonal da biblioteca inicial, utilizada para transfecção, com a diversidade encontrada no conjunto de células (linha celular) que expressam a proteina policlonal recombinante. A diversidade clonal de uma proteina policlonal expressa a partir de uma linha celular pode ser avaliada como a cobertura do alvo pela proteína policlonal. Neste caso 43 considera-se que se adquire uma diversidade suficiente quando aproximadamente 25 a 100% das moléculas-alvo desejadas estão ligadas pela proteína policlonal. Por exemplo, no caso de um anticorpo policlonal, a ligação do anticorpo a pelo menos 25% dos epitopos não-idênticos na superfície de um antigénio-alvo fornece uma diversidade suficiente na composição. Preferencialmente, a diversidade clonal por cobertura do alvo é pelo menos 50%, e ainda mais preferencial pelo menos 75%. Para anticorpos, tal cobertura do alvo poderia, por exemplo, ser avaliada por mapeamento de epitopo.

Alternativamente, a diversidade clonal pode ser avaliada como a distribuição de membros individuais da composição policlonal. Essa distribuição pode ser avaliada como o número total de diferentes membros individuais na composição de proteína policlonal final comparada com o número de diferentes sequências codificantes originalmente introduzidas na linha celular durante a transfecção. Nesse caso, a diversidade suficiente é considerada como sendo adquirida quando pelo menos 50% das sequências de codificação originalmente usadas na transfecção podem ser identificadas como diferentes membros individuais das proteínas policlonais finais, preferencialmente, pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, 97%, 98%, ou 99%. Expressa de outra forma, a diversidade clonal pode ser considerada suficiente se apenas 1 membro da proteína policlonal for perdido durante a produção, ou se 2, 3, 4 ou 5 membros são perdidos. A distribuição de membros individuais da composição policlonal pode também ser avaliada com relação à distribuição mútua entre os membros individuais. Nesse caso, a diversidade clonal suficiente é considerada como 44 sendo adquirida se nenhum único membro da composição constitui mais de 75% da quantidade total de proteína na composição de proteína policlonal final. Preferencialmente, nenhum membro individual excede mais de 50%, ainda mais preferencialmente, 25% e preferivelmente 10% do número total de membros individuais na composição policlonal final. A avaliação da diversidade clonal baseada na distribuição dos membros individuais na composição policlonal pode ser executada por análise RFLP, análise de sequência e análise de proteína tal como as abordagens descritas posteriormente para caracterização de uma composição policlonal. A diversidade clonal pode ser reduzida como um resultado de prevalência clonal que pode aparecer (a) como um resultado de diferenças no nível de expressão, (b) como um resultado de variações na proliferação celular. Se tais prevalências aparecem, cada uma dessas fontes de uma perda de diversidade clonal é facilmente remediada por pequenas modificações aos métodos descritos aqui. É possível que variações nas taxas de proliferação celular nas células individuais na linha celular pudessem, ao longo de um período de tempo prolongado, introduzir uma prevalência na expressão de proteína policlonal recombinante, aumentando ou reduzindo a presença de alguns membros da proteína policlonal recombinante expressa pela linha celular. Como os presentes métodos podem ser baseados na integração aleatória no genoma da célula hospedeira, tanto a posição e o número de cópias variam entre os membros da linha celular policlonal. Isso provavelmente dar origem a diferenças na taxa de proliferação e no nível de expressão entre os clones. Seleccionando-se os clones celulares com taxas de proliferação similares, esse problema é minimizado. Uma possibilidade adicional é usar 45 mais do que um clone para cada membro da proteína policlonal. Os exemplos ilustram que a estabilidade composicional é aumentada se entre 3 e 5 clones expressando um único membro da proteína policlonal forem usados em comparação com apenas um clone para cada membro da proteína policlonal.

Outra forma de abordar esta questão é usar um ou mais critérios de selecção para assegurar que as células são uniformes dentro de certos limites predeterminados em relação a um ou mais critérios seleccionados a partir do grupo que consiste em taxa de crescimento, tempo de duplicação, nível de expressão, nível de produção, estabilidade de produção ao longo do tempo, viabilidade, vigor, robustez, morfologia, e número de cópia.

Uma razão para variações nas taxas de proliferação poderia ser que a população de células constituindo a linha celular de partida para a transfecção inicial é heterogénea. Sabe-se que as células individuais numa linha celular desenvolvem-se diferentemente ao longo de um período de tempo prolongado. Para assegurar um material de partida mais homogéneo, a subclonagem ou subclonagem repetida da linha celular antes da transfecção com os vectores de expressão de interesse pode ser executada usando uma diluição limitante da linha celular até ao nível de uma célula única e cultivando cada célula única numa nova população de células (denominada subclonagem celular por diluição limitante).

Um método alternativo e preferencial para clonagem de uma única célula para assegurar uma população celular bem definida é usar a classificação de célula activada por fluorescência (FACS) após a transfecção. Isto pode ser feito antes do procedimento de selecção. Os anticorpos 46 marcados com fluorescência podem ser usados para enriquecer relativamente a células altamente produtivas derivadas de um grupo de células transfectadas com construções de IgG (Brezinsky et al, J. 2003. Immunol Methods 277, 141 a 155). A vantagem de usar classificação FACS é que o método combina clonagem de única célula (classificando as células isoladas em poços), enquanto simultaneamente fornece informação sobre o nivel de expressão de cada célula isolada. Para optimizar ainda o procedimento de classificação, uma coloração de viabilidade pode ser incluida tal que as células mortas ou que estão a morrer são descartadas. O procedimento FACS submete as células a condições de bastante severas incluindo tensões de corte. Isso significa que indirectamente as células são seleccionadas quanto à resistência a tais condições. Além disso, o procedimento FACS é automatizado permitindo a classificação de um elevado número de células isoladas. O método FACS pode também ser usado para classificar células que expressem niveis similares de imunoglobulina, criando desse modo uma população de células homogénea em relação à produtividade. Igualmente, usando marcação com o corante fluorescente éster succinimidilico do diacetato de 5, β-carboxifluoresceina (CFSE) células que apresentem taxas de proliferação similares podem ser seleccionadas por métodos FACS.

Uma implementação importante da presente invenção é a geração de uma ou mais linhas celulares clonadas para cada membro do anticorpo policlonal. A geração de clones de célula isolada pode ser executada usando qualquer uma de um número de técnicas padrão. Entretanto, verificou-se que a classificação de células FACS, onde as células são seleccionadas quanto à viabilidade e niveis de IgG e são classificadas individualmente em poços, consistentemente 47 forneceu clones estáveis adequados para preparar um banco primário de células policlonais e um subsequente banco de trabalho de células policlonais. A pressão de selecção, por exemplo, de Mtx pode ser removida antes ou durante a classificação FACS, mas uma pressão de selecção continuada, por exemplo, crescendo num meio isento de nucleósidos é preferencialmente mantida. Os clones individuais são preferencialmente seleccionados após um certo número de dias em cultura sob pressão de selecção após a classificação de células. Uma vez que os clones são seleccionados no mesmo dia após a classificação, a taxa de crescimento dos clones será relativamente uniforme. Além disso, as colónias são inspeccionadas visualmente para descartar os clones com mudanças graves em morfologia e baixas taxas de crescimento em comparação com a linha celular não transfectada original. Finalmente, o nível de expressão de anticorpos pode ser avaliado usando, por exemplo, ELISA ou outras técnicas analíticas e clones com níveis de expressão altos e relativamente uniformes podem ser seleccionados.

Até se uma prevalência induzida pela taxa de proliferação se desenvolve, a perda ou sobre-representação de membros individuais pode não ser necessariamente crítica, dependendo das exigências de diversidade do produto de proteína policlonal recombinante final e da estabilidade da diversidade ao longo do tempo. A célula hospedeira

As células hospedeiras podem ser geradas a partir de qualquer célula que pode integrar o ADN nos seus cromossomas ou reter elementos extracromossómicos tais como minicromossomas, YACs (cromossomas artificiais de levedura), MACs (cromossomas artificiais de ratinho), ou HACs (cromossomas artificiais humanos). Os MACs e HACs são 48 descritos em detalhe em WO 97/40183. Preferentemente, são utilizadas células de mamífero tais como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, YB2/0, ou NSO), fibroblastos tais como NIH 3T3 e células humanas imortalizadas, tais como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. No entanto, podem também ser empregues células eucarióticas ou procarióticas não-mamíferas, tais como células de plantas, células de insectos, células de levedura, fungos, E. coli, etc.

Numa implementação da presente invenção, a linha celular que é para ser usada como material de partida é subclonada executando uma denominada diluição limitante da linha celular até um nível de célula isolada, seguida pelo crescimento de cada célula isolada numa nova população de células antes da transfecção com a biblioteca de vectores de interesse. Tal subclonagem pode também ser executada posteriormente no processo de selecção de linha celular correcta, se desejado. Outros métodos para clonagem de uma célula isolada incluem: clonagem FACS (Brezinsky et al, J. 2003. Immunol Methods 277, 141 a 155), tecnologia LEAP™ (da Cyntellect, San Diego, Califórnia, USA), e ClonePix (da Genetix, UK). O vector para integração A seguinte descrição foca o uso de sistemas de expressão de mamíferos. Entretanto, é igualmente possível usar os métodos da invenção para expressão em bactérias com modificações adequadas.

Um vector adequado compreende um gene de selecção adequado. Os genes de selecção adequados para uso em expressão em células de mamíferos incluem, mas não estão limitados a, genes permitindo a selecção nutricional, tais como o gene timidina cinase (TK), o gene da glutamina sintetase (GS), o 49 gene da triptofano sintase (trpB) ou o gene da histidinol desidrogenase (hisD). Além disso, os marcadores de selecção são genes com resistência antimetabolito que conferem resistência a fármacos, tal como o gene da di-hidrofolato redutase (dhfr) que pode ser seleccionado com meio deficiente em hipoxantina e timidina e ainda seleccionado com metotrexato, o gene da guanina-xantina fosforribosiltransferase (gpt), que pode ser seleccionado com ácido micofenólico, o gene da neomicina fosfotransferase (neo) que pode ser seleccionado com G418 em célula eucariótica e neomicina ou canamicina em células procarióticas, o gene da higromicina B fosfotransferase (hyg, hph, hpt) que pode ser seleccionado com higromicina, o gene da puromicina N-acetil-transferase (pac) que pode ser seleccionado com puromicina ou o gene da Blasticidina S deaminase (Bsd) que pode ser seleccionado com blasticidina, o gene da resistência a Zeocina (Sh ble) que medeia a resistência à Zeocina e à Bleomicina. Finalmente, os genes que codificam para as proteínas que permitem a classificação, por exemplo, por citometria de fluxo, podem também ser usados como marcadores de selecção, tais como proteína verde fluorescente (GFP), o receptor de factor de crescimento do nervo (NGFR) ou outras proteínas de membrana, ou beta-galactosidase (LacZ). 0 marcador de selecção pode estar localizado num vector de expressão separado, assim executando cotransfecção com um vector de expressão que codifica para o marcador de selecção e um ou mais vectores de expressão que codificam para a proteína de interesse ou subunidades da proteína de interesse. 0 marcador de selecção pode também estar localizado no vector de expressão que codifica para a proteína de interesse. Neste último caso, o marcador de selecção está preferencialmente localizado num transcrito que também codifica para a proteína de interesse ou uma das 50 suas subunidades. Isto pode ser feito, por exemplo, usando uma construção IRES. No caso de uma proteína multimérica, tal como um anticorpo, o marcador de selecção está preferencialmente localizado no transcrito que codifica para a subunidade maior, tal como, por exemplo, a cadeia pesada de um anticorpo. O vector para integração do gene de interesse adicionalmente compreende ADN que codifica para um membro da proteína policlonal recombinante de interesse, precedido por seu próprio promotor de mamífero direccionando a expressão da proteína. Se um membro da proteína policlonal recombinante de interesse compreende mais de uma cadeia de proteína, por exemplo, se o membro é um anticorpo ou receptor de célula T, o ADN que codifica para as cadeias da proteína pode ser precedido pelo seu próprio promotor de mamífero direccionando elevados níveis de expressão (bidirecional ou unidirecional) de cada uma das cadeias. Numa expressão bidirecional, uma configuração de promotor cabeça a cabeça no vector de expressão pode ser usada e para uma expressão unidirecional dois promotores ou um promotor combinado com, por exemplo, sequência IRES pode ser usado para a expressão. Um vector de expressão bicistrônico com duas subunidades diferentes codificadas pelo mesmo transcrito e separadas por uma sequência IRES é igualmente concebível.

As configurações de promotor cabeça a cabeça adequadas são, por exemplo, mas não-limitadas a, o promotor AdMLP em conjunto com o promotor metalotioneína-1 de ratinho em ambas as orientações, o promotor AdMLP em conjunto com o promotor de factor-1 de alongamento em ambas as orientações ou o promotor de CMV em conjunto com o promotor MPSV em ambas as orientações, ou o promotor de CMV usado em ambas as orientações. 51

No caso de anticorpos, a experiência mostrou que a quantidade de cadeia pesada expressa por uma célula não deveria exceder a quantidade de cadeia leve. Então, o promotor que dirige a expressão da cadeia leve é preferencialmente pelo menos tão forte quando o promotor que dirige a expressão da cadeia pesada.

Uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma sequência lider funcional ou sinal de translocação pode ser incluída no vector de expressão para direccionar o produto de gene para o retículo endoplásmico ou uma localização específica dentro da célula, tal como um organelo. Um forte sinal de poliadenilação pode ser situado num posição 3' da sequência de ADN que codifica para a proteína. 0 sinal de poliadenilação assegura a terminação e a poliadenilação do transcrito de ARN nascente e está correlacionado com a estabilidade da mensagem. 0 ADN que codifica para um membro da proteína policlonal recombinante de interesse pode, por exemplo, codificar para ambas as cadeias pesada e leve de um anticorpo ou fragmentos de anticorpo, cada sequência de gene sendo opcionalmente precedida pelos seus elementos de promotor de mamífero e/ou seguida por fortes sinais poli A dirigindo um elevado nível de expressão de cada uma das duas cadeias. 0 vector de expressão para integração pode ter elementos de regulação transcricionais adicionais, tal como intensificadores, antirrepressores, ou UCOE (elementos de abertura de cromatina ubíquos) para aumento da expressão e estabilidade da expressão no local de integração. Os intensificadores são sequências de ácido nucleico que interagem especificamente com proteínas nucleares envolvidas na transcrição. 0 UCOE abre a cromatina ou mantém a cromatina num estado aberto e facilita a expressão reprodutível de um gene ligado de maneira funcional 52 (descrito em mais detalhe em WO 00/05393 e Benton et al, Cytotechnology 38:43-46, 2002). Intensificadores adicionais ou elementos intensificadores incluem Regiões de Ligação a Matriz (MARs) como descrito, por exemplo, em Girod & Mermod 2003 ("Capitulo 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production", pág. 359-379 em Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed), 2003, Elsevier Science BV). Os elementos antirrepressores incluem, mas não estão limitados a, elementos STAR (Kwaks et al, Nat Biotechnol., Maio de 2003;21 (5) :553-558). Quando um ou mais dos elementos reguladores descritos acima são integrados no cromossoma de uma célula hospedeira são denominados elementos reguladores heterólogos.

Bancos de Trabalho de Células Policlonais e Bancos Primários de Células

Em implementações preferidas da invenção, utilizam-se Bancos de Células Primários policlonais (pMCB) e Bancos de Células de Trabalho policlonais (pWCB).

Um pMCB que pode ser usado para o estabelecimento da linha celular de produção policlonal pela descongelação e expansão dos conteúdos de uma única ampola, pode ser gerado a partir de uma matéria-prima congelada composta de linhas celulares individuais. As linhas celulares individuais usadas para gerar tal pMCB são ou obtidas a partir de (i) um único clone (como descrito no Exemplo 2), (ii) uma mistura de clones únicos (como descrito no Exemplo 2), ou (iii) um grupo de clones (um grupo de colónias isoladas obtidas após selecção). Os clones foram obtidos a partir de células hospedeiras transfectadas individualmente, e seleccionadas para expressão estável de um membro individual de uma proteína policlonal. A selecção para 53 expressão estável é executada por procedimentos conhecidos na técnica, por exemplo, usando genes marcadores de selecção. Numa implementação preferencial da presente invenção, as linhas celulares individuais são obtidas a partir de células clonadas ou subclonadas, por exemplo, submetendo a uma linha celular originando de (i), (ii) ou (iii) para diluição limitante ou análise e selecção de células isoladas por FACS, ou seleccionando clones de elevada expressão, por exemplo, usando um robô como o ClonePix FL (ver abaixo). As linhas celulares individuais usadas para gerar o pMCB como descrito acima podem ser pré-armazenadas num stock de biblioteca congelado de linhas celulares individuais, a partir do qual uma ampola de cada linha celular individual é descongelada e expandida antes da geração de um pMCB. Preferencialmente, as linhas celulares individuais expressam anticorpos de comprimento total com propriedades que diferem das propriedades dos anticorpos produzidos pelos outros membros do pMCB, por exemplo, diferente especificidade de antigénio, diferente afinidade, diferentes regiões variáveis ou CDR e/ou diferentes regiões constantes.

Cada linha celular usada para gerar o pMCB produz um membro diferente de uma proteína policlonal. Preferencialmente, cada membro distinto da proteína policlonal liga-se a um antigénio particular. Adicionalmente, prefere-se que cada membro distinto seja produzido a partir de múltiplos integrantes localizados em locais aleatórios no genoma de cada célula hospedeira. Um pMCB é gerado misturando um número predefinido de células a partir de cada linha celular individual. Preferencialmente, as células são misturadas em números iguais (uma razão 1:1), embora outras razões também possam ser desejadas (ver posteriormente). A mistura de células é congelada em alíquotas, já que elas são distribuídas por um número de frascos com um número 54 definido de células em cada frasco. Esses frascos são congelados e armazenados como o pMCB para efeitos de produção posterior. Preferencialmente, o número de frascos constituindo o pMCB excede 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500 ou 1000 frascos. Os frascos individuais num pMCB podem ser descongelados em diferentes pontos no tempo gerando diferentes lotes da linha celular de produção policlonal que são capazes de produzir uma proteína policlonal com essencialmente a mesma composição de lote a lote.

Numa abordagem alternativa da presente invenção, a linha celular de produção policlonal pode ser expandida a partir de um pWCB, que é derivado de um pMCB. O pWCB é gerado descongelando um único frasco de um pMCB e expandindo as células durante um número de gerações suficiente para produzir um número total de células que podem ser congeladas numa nova série de alíquotas (o pWCB), com aproximadamente o mesmo número de células em cada alíquota pWCB que no frasco pMCB originalmente usado para gerar o pWCB. Quando o pWCB se esgotar, é possível gerar um novo pWCB a partir de uma alíquota do pMCB. Essa abordagem exigirá, portanto, uma quantidade significativamente mais baixa de trabalho do que exigiria para expandir as linhas celulares individuais a partir da matéria-prima de biblioteca congelada e misturando um novo pMCB. Além disso, caso o pWCB se esgote, a possibilidade de se produzirem lotes adicionais da linha celular de produção policlonal, que sejam capazes de produzir uma proteína policlonal com essencialmente a mesma composição de lote a lote, é aumentada.

Uma vantagem de produzir um pMCB misturando as linhas celulares individuais que foram obtidas por transfecção individual é que é possível executar análise e selecção adicional das linhas celulares individualmente 55 transfectadas antes da geração do pMCB. Isso pode assegurar uma linha celular de produção policlonal mais estável que preenche as exigências de diversidade já descritas. Além disso, a proteína policlonal pode ser fabricada de uma forma mais reproduzível. 0 que é dito de seguida relativamente ao pMCB também se aplica ao pWCB.

Numa implementação adicional da presente invenção, as linhas celulares individuais que foram seleccionadas para expressão estável de um membro individual de uma proteína policlonal como descrito acima, são adicionalmente caracterizadas em relação à suas taxas de proliferação e/ou produtividade antes da geração de um pMCB. Numa implementação preferencial, as linhas celulares com taxas de proliferação ou produtividade similares são seleccionadas para a geração de um pMCB. Ainda mais preferido, as linhas celulares com produtividade similar bem como taxas de proliferação similares são seleccionadas para a geração do pMCB. Preferencialmente, as linhas celulares são adaptadas a cultura em suspensão isenta de soro antes da caracterização de taxas de proliferação e/ou produtividade. Alternativamente, as células parentais usadas para transfecção são adaptadas a cultura em suspensão isenta de soro antes da transfecção.

As taxas de proliferação podem ser avaliadas por métodos conhecidos na técnica. As taxas de proliferação para linhas de células de mamífero deveriam estar entre as 18 e as 100 horas, preferencialmente entre as 22 e as 40 horas e mais preferencialmente entre as 24 e as 32 horas. A produtividade deveria exceder 0,5 pg de proteína por célula por dia (pg/(célula*dia)), preferencialmente deveria exceder 1, 1,5, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, ou 100 56 pg/ (célula*dia). Além disso, a linha celular deveria apresentar uma população celular homogénea em relação à expressão quando avaliada por um método de coloração intracelular. Se desejado, uma população celular mais homogénea para cada linha celular individual pode ser obtida clonando, por exemplo, por métodos de classificação FACS aqui descritos.

Em implementações adicionais da presente invenção, as linhas celulares individuais são classificadas por FACS para identificar células com um nível de expressão homogéneo, após os procedimentos de transfecção e selecção tal como aqui descritos.

Os anticorpos marcados com fluorescência podem ser usados para classificar células que expressam altos níveis da proteína desejada, por exemplo, anticorpo ou TcR, criando desse modo uma população celular homogénea relativamente à produtividade. Esta técnica é baseada na observação de que as proteínas secretadas podem ser detectadas na superfície da célula secretando-as, e a quantidade de proteína na superfície aparentemente corresponde aos níveis de expressão da célula individual. As células de elevada produção podem, portanto, ser classificadas célula a célula mediante coloração com um anticorpo marcado, seguidas da análise por FACS. A técnica foi descrita por Brezinsky (Brezinsky et al, J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155).

Uma técnica de classificação alternativa é baseada no acoplamento de um ligando, com especificidade para a proteína expressa a partir das células, à superfície das células. Por exemplo, um anticorpo anti-Fc ou um anticorpo anti-idiotipo pode ser acoplado à superfície da população celular que secretam proteína através de biotina. Os anticorpos secretados por uma célula individual são então 57 capturados pelos anticorpos anti-Fc na superfície dessa célula. Posteriormente, as células de elevada produção podem ser classificadas por FACS mediante coloração com um anticorpo marcado. Esta técnica foi descrita em EP 667 896.

Para obter linhas celulares com elevados níveis de expressão homogéneos, células isoladas com um nível elevados de expressão são analisadas com base no perfil FACS obtido por uma das técnicas descritas. Os clones celulares individuais são então expandidos e potencialmente analisados em relação às taxas de proliferação e produtividade como descrito acima. Alternativamente, um subgrupo de células tendo o mais elevado nível de expressão como identificado pelo perfil FACS é recolhido por classificação. 0 subgrupo de células da linha celular individual pode igualmente ser analisado em relação às taxas de proliferação e produtividade se desejado.

Numa implementação alternativa desta invenção, um robô tal como robô ClonePixFL (Genetix, UK) é usado para seleccionar clones que apresentem elevados níveis de expressão e/ou propriedades de crescimento similares. Isso é feito como segue: As colónias obtidas após transfecção e selecção são cultivadas num meio semissólido que permite a detecção de colónias de alta produção capturando o produto de proteína secretado na proximidade imediata da colónia. 0 nível de produção de cada colónia é determinado por meio de marcação por imunofluorescência da proteína expressa pelas células seguida por selecção com um programa informático de análise de imagem dos melhores clones baseados nos critérios de selecção predeterminados tais o como nível de expressão e propriedades de crescimento. Além disso, o tamanho (reflectindo a taxa de proliferação celular) de cada colónia pode ser avaliado pelo robô usando imagiologia de detecção de luz. As colónias com a produção e/ou 58 propriedades de crescimento desejadas são então isoladas pelo robô e transferidas para placas de 96 poços para propagação adicional.

Preferencialmente, as linhas celulares individuais com produtividade similar são seleccionadas para a geração do pMCB. Numa implementação preferencial, as linhas celulares individuais constituindo o pMCB são geradas a partir de células clonadas, por exemplo, obtidas por classificação de células isoladas, diluição limitante ou selecção por robô, com um elevado nível de expressão ou a partir de um grupo de células com elevado nível de expressão.

Na presente invenção, ambas as linhas celulares individuais obtidas a partir de uma única colónia de células isoladas após transfecção e selecção bem como linhas celulares individuais obtidas a partir de um clone obtido, por exemplo, por classificação FACS de células isoladas, são denominadas linhas celulares clonadas. Numa implementação preferencial, tais linhas celulares clonadas são usadas para gerar o pMCB.

Em implementações adicionais da presente invenção, as linhas celulares individuais são misturadas em diferentes razões mediante a geração de um pMCB. As linhas celulares individuais podem ser misturadas de acordo com critérios predeterminados baseados nas propriedades das linhas celulares individuais e/ou o membro de proteína individual expresso pela referida linha celular, por exemplo, produtividade específica ou afinidade de ligação. Por exemplo, as linhas celulares individuais que expressam certos anticorpos ligando-se particularmente a antigénios ou epitopos críticos podem ser fornecidas em excesso das linhas celulares dos membros restantes do pMCB, por exemplo, em quantidades 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes superiores. Uma linha celular de membro pode, por 59 exemplo, ser adicionada numa relação 2:1 relativamente a todos os outros membros, por exemplo, 4 x 106 células do membro 1 e 2 x 106 células de cada uma das linhas celulares dos membros restantes.

Essa abordagem de relações diferenciadas das linhas celulares individuais no pMCB pode também ser adoptada para contornar diferenças nas taxas de proliferação e produtividade entre as linhas celulares individuais, em particular, se essas não foram seleccionadas quanto à similaridade nessas características. Portanto, se uma ou mais linhas celulares individuais têm uma taxa de proliferação mais lenta, isto é, tempos de duplicação maiores, comparados com outros membros do banco de células de trabalho policlonais que são caracterizados por uma taxa de proliferação mais rápida, mas essa taxa de proliferação mais lenta não está associada com uma produtividade particularmente elevada, esse ou esses membros particulares podem ser adicionados ao pMCB numa quantidade aumentada para compensar seu crescimento lento. Por exemplo, pode ser adicionada uma linha celular com uma taxa de proliferação de 50 horas numa relação 2:1 se as linhas celulares restantes constituindo o pMCB têm taxas de proliferação entre 22 e 30 horas. Igualmente, a relação de linhas celulares com curtos tempos de duplicação pode ser reduzida para assegurar que elas não assumirão o controlo durante a produção. Além disso, as relações das linhas celulares individuais num pMCB podem ser ajustadas mediante análise dos produtos de proteína policlonal produzidos a partir das linhas celulares de fabrico policlonal geradas a partir do pMCB. Tais ajustamentos podem, por exemplo, ser feitos com base em perfis IEX ou ferramentas de caracterização equivalentes. Se tal análise mostrar que um ou mais membros de proteína particulares são produzidos numa quantidade aumentada em comparação com os membros restantes, pode ser 60 gerado um novo pMCB, onde a relação das linhas celulares produzindo esses membros de proteína particulares são reduzidos. E vice-versa, se um membro particular é produzido numa baixa quantidade, um pMCB com uma relação aumentada da linha celular produzindo esse membro pode ser gerado.

Sistemas de Cultura A proteína policlonal recombinante da invenção pode ser fabricada usando qualquer modo de cultivo adequado incluindo, mas não limitado a processos em descontínuo, semi-contínuo e perfusão.

Estabelecimento de um sistema de expressão para expressão elevada de proteínas

Os métodos para introduzir uma sequência de ácido nucleico numa célula são conhecidos na técnica. Esses métodos tipicamente incluem o uso de um vector de ADN para introduzir a sequência de interesse na célula, no genoma ou num elemento extracromossómico. A transfecção das células pode ser executada por um número de métodos conhecidos pelos versados na técnica, incluindo lipofecção, transfecção quimicamente mediada, precipitação de fosfato de cálcio, electroporação, microinjecção, fusão de lipossomas, fusão fantasma de RBC, fusão de protoplasto, transdução de vírus e semelhantes.

Para a transfecção de uma linhagem de células hospedeiras, é usada uma biblioteca de vectores de interesse, em que cada vector compreende apenas uma cópia de uma sequência de ácido nucleico que codifica para um membro de uma proteína policlonal recombinante de interesse. Essa biblioteca de vectores de expressão de interesse codifica colectivamente 61 a proteína policlonal recombinante de interesse. Os vectores adequados para integração foram descritos na sessão anterior. A geração de uma linha celular de produção policlonal recombinante e a produção de uma proteína policlonal recombinante a partir de uma linha celular podem ser obtidas por várias estratégias diferentes de fabrico e transfecção.

Uma forma preferencial de transfecção ilustrada na Figura 1 é um método de elevado débito no qual as células hospedeiras são transfectadas separadamente usando os vectores individuais constituindo a biblioteca de interesse. Este método é denominado de transfecção individual. As células hospedeiras individualmente transfectadas são preferencialmente seleccionadas separadamente. No entanto, elas podem também ser agrupadas antes da selecção. Os clones de células individuais gerados mediante a selecção podem ser analisados com relação ao nível de expressão, taxa de proliferação e padrão de integração e, preferencialmente, aquelas com taxas de crescimento similares, número de cópias similar, níveis de expressão similares e/ou níveis de vigor similares podem ser usados para gerar uma matéria-prima de biblioteca GOI policlonal. Os clones de células individuais podem ser misturados para obter a linha celular policlonal desejada antes de gerar o stock, imediatamente após elas serem restauradas a partir do stock, ou após um curto tempo de proliferação e adaptação. Essa abordagem pode adicionalmente melhorar a estabilidade composicional.

Sob circunstâncias de transfecção permitindo a integração de mais de uma cópia em cada célula, a transfecção em volume usando misturas de vectores de expressão pode ser 62 executada se a proteína policlonal é um monómero. Para proteínas multiméricas, tal transfecção em massa permitindo integração múltipla no genoma de uma célula hospedeira, resultaria no baralhamento das subunidades. Em muitos casos, tal como o fabrico de anticorpo policlonal recombinante para uso farmacêutico, o baralhamento deve ser evitado. Para proteínas multiméricas, a transfecção em massa pode ser feita se o baralhamento é aceitável ou se a transfecção é executada sob condições assegurando a integração de apenas uma cópia no genoma de cada célula hospedeira. Exemplos de tais métodos incluem a transdução retroviral e fusão de esferoblasto. Os vectores individuais constituindo a biblioteca de sequências de ácido nucleico variantes de interesse podem ou ser misturados em conjunto numa única composição, ou preferencialmente os vectores individuais que codificam para cada membro da biblioteca podem ser mantidos em composições separadas ou em misturas de aproximadamente 5 a 50 vectores individuais da biblioteca numa composição.

Outra forma é usar uma biblioteca de vectores divididos em fracções, contendo aproximadamente 5 a 50 vectores individuais da biblioteca numa composição, para transfecção. Preferencialmente, uma fracção da biblioteca constitui 10 a 20 vectores individuais. Cada composição é então transfectada numa alíquota de células hospedeiras. Esse método é denominado transfecção em quantidade. O número de alíquotas transfectadas dependerá do tamanho da biblioteca e do número de vectores individuais em cada fracção. Se a biblioteca, por exemplo, constitui 100 membros variantes distintos, que são divididos em fracções contendo 20 membros variantes distintos numa composição, 5 alíquotas de células hospedeiras necessitariam ser transfectadas com uma composição de biblioteca constituindo uma fracção distinta da biblioteca original. As alíquotas 63 de células hospedeiras são seleccionadas após a transfecção. Preferencialmente, as aliquotas distintas são seleccionadas separadamente. Entretanto, elas podem também ser agrupadas antes da selecção. As aliquotas podem ser analisadas relativamente à sua diversidade clonal e somente aquelas com suficiente diversidade serão usadas para gerar um stock de biblioteca GOI policlonal.

Um stock congelado da linha celular policlonal pode ser gerada antes do inicio da produção de proteína policlonal recombinante. Para obter a linha celular desejada para produção, os clones podem ser misturados antes de gerar o stock congelado, imediatamente após eles serem recuperados a partir do stock ou após um curto tempo de proliferação e de adaptação.

Uma característica partilhada nas estratégias de fabrico traçadas acima é que todos os membros individuais constituindo a proteína policlonal recombinante podem ser produzidos num, ou um número limitado de recipientes, tais como biorreactores, com aproximadamente 10 como máximo.

Se os níveis de expressão necessitam ser aumentados, a amplificação de gene pode ser executada usando a selecção para um gene DHFR ou um gene da glutamina sintetase (GS), um gene hprt (hipoxantina fosforribosiltransferase) ou um gene da triptofano sintetase. Isto exige o uso de vectores compreendendo tal marcador de selecção. Uma característica particular da presente invenção é manter o número de cópias relativamente baixo de modo a manter a estabilidade das células elevada. Portanto, as células são preferencialmente apenas submetidas a uma ronda de selecção sob pressão de selecção relativamente modesta em meio isento de nucleósido com uma baixa concentração de MTX (por exemplo, 1-10 nM) para o tipo de construção usado nos exemplos. Crê-se que tal pressão modesta conduza a um número de cópias relativamente baixo. Crê-se que a pressão de selecção modesta conduza a um número de cópias equilibrado resultando numa expressão elevada enquanto evitando a instabilidade de células com número de cópias muito alto.

De modo a alcançar níveis de expressão mais elevados, a linha celular usada para expressão preferencialmente inclui um transactivador heterólogo capaz de intensificar o promotor que controla a expressão da proteína policlonal. Exemplos de combinações adequadas de transactivador e promotor são mencionados na seguinte tabela (Tabela 2).

Tabela 2. Exemplos de pares transactivador/promotor

Transactivador Exemplos de Promotor Comentários Tat de lentivírus repetições terminais longas (LTR) EIA de adenovírus intensificador/promotor principal IE de HCMV VP16 do vírus do herpes simplex o gene promotor do vírus do herpes simplex é IE175 US 6,635,478 proteína X do vírus da hepatite B (HBx) SV40 precoce Proteínas dedo de zinco sintéticas Sintético Sangamo inc antigénio T do SV40 Promotor tardio de SV40 Transactivadores controlados por tetraciclina (tTA) Sintético Fusões sintéticas Citomegalovírus humano IE2p86 intensificador/promotor principal IE de HCMV citomegalovírus humano IElp72 intensificador/promotor principal IE de HCMV Transactivador do vírus R de Epstein-Barr (Rta) Promotor de EBV Receptores de hormona da tiróide Promotor da hormona do crescimento Receptores de hormonas glicocorticóides Promotor do vírus do tumor mamário (MMTV) 65

Preferivelmente, a linha celular é transfectada com uma construção de expressão que codifica para o transactivador e clones são seleccionados usando diluição limitante ou outros métodos para clonagem de célula isolada. 0 vector de expressão pode compreender elementos tal como promotor, marcador de selecção, etc., tal como descrito para os vectores de expressão aqui citados. Preferencialmente, o promotor que controla a expressão do transactivador é um promotor constitutivo tal como o promotor do factor 1 de alongamento, promotor de CMV, promotor de metalotioneína-1 ou similar. Numa implementação preferencial, o promotor é o promotor de CMV.

Particularmente preferencial é o uso do transactivador de EIA de adenovirus, que aparece para estabilizar as células em adição à transactivação de um promotor de CMV controlando a expressão do gene de interesse. Como mencionado aqui, a expressão de EIA não foi detectável na primeira linha celular produzida, ECHO. Portanto, a ligação entre EIA e a estabilização das células não foi provada pelas experiências presentes.

Para o fabrico de uma proteína policlonal, em que cada membro de proteína é compreendido de mais de duas cadeias de polipéptido, a combinação das cadeias pode ser de importância para a afinidade, especificidade e actividade da proteína que elas formam. Isso é, por exemplo, visto para anticorpos e TcRs. Por exemplo, é a combinação de cadeia leve variável e cadeia pesada variável de anticorpo conhecida por afectar a afinidade e especificidade de um anticorpo formado a partir das cadeias. Assim, quando uma biblioteca de sequências que codificam para um anticorpo foi seleccionada pela sua capacidade de produzir anticorpos com afinidade por um certo alvo, é desejável assegurar que a combinação da cadeia pesada variável e da cadeia leve 66 variável no produto final corresponde a isso. Por essa razão, as cadeias de polipéptido constituindo um membro individual da proteína policlonal são preferencialmente localizadas no mesmo vector usado para integração, assegurando desse modo que elas sejam mantidas juntas por todo o processo. Alternativamente, as células hospedeiras podem ser transfectadas com pares de vectores de expressão que codifica para pares cognatos de cadeia pesada e cadeia leve. A seguinte descrição é um exemplo de como obter uma linha celular que expressa um anticorpo policlonal recombinante.

Um cassete de promotor universal para a expressão constitutiva tendo dois promotores localizados em direcção transcricional oposta, tal como uma construção cabeça a cabeça circundada pela cadeia pesada variável e toda a cadeia leve kapa ou lambda pode ser construída, permitindo a transferência da construção inteira num vector compreendendo um marcador de selecção e a região constante de cadeia pesada. Observa-se que uma cassete de promotor para expressão indutível pode também ser usado. Além disso, os promotores podem ser localizados cauda a cauda que resultará na transcrição em direcção oposta ou cauda a cabeça para transcrição unidirecional. Um promotor indutível pode também ser usado para controlo da expressão. Após transfecção, as células são preferencialmente cultivadas sob condições selectivas para seleccionar transformantes estáveis.

As células que sobrevivem sob essas condições podem subsequentemente ser cultivadas em diferentes sistemas de cultura, tal como pequenos frascos de cultura convencionais, fábricas de células em multicamadas Nuns, pequenos biorreactores de alto rendimento (Munirem, 67 iNTEGRA-CELLine), agitador, e "spinner flasks" a fibras ocas e biorreactores em saco WAVE (Wave Biotech, Tagelswagen, Suíça) ou outros vasos/recipientes descartáveis. As células podem ser testadas quanto à produção de anticorpos usando ELISA. As linhas celulares policlonais são preferencialmente seleccionadas quanto à viabilidade em culturas em suspensão em meio isento de soro sob pressão de selecção por períodos prolongados.

Avaliação da preservação de policlonalidade no sistema de expressão

De acordo com a presente invenção, é frequentemente importante assegurar que a policlonalidade no sistema de expressão não seja alterada seriamente durante a produção de tal modo que seja possível parar a produção quando a policlonalidade é de facto alterada. Isto, de acordo com a invenção, é realizado monitorizando os níveis de expressão relativos das sequências de ácido nucleico variantes. Os níveis de expressão podem, por exemplo, ser monitorizados ao nível do mARN usando, por exemplo, análise RFLP, chips ou PCR em tempo real, ou ao nível de proteína usando, por exemplo, electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional, espectrometria de massa ou várias técnicas cromatográficas. Com essas técnicas, será possível estabelecer um valor de base para um número de todos os níveis de expressão individuais e então recolher amostras da cultura durante a produção de modo a medir se os níveis de expressão mudaram (tanto no total e relativamente). Na prática normal da invenção, uma gama de valores à volta dos valores base pode ser estabelecida, e se os níveis de expressão relativos são considerados fora da gama, então a produção é terminada. 68

Cultivo de células e produção de um anticorpo policlonal recombinante A linha celular policlonal produzida como descrito acima pode ser crescida em meios adequados sob condições adequadas para expressar a proteína policlonal de interesse codificada pelas sequências de ácido nucleico variantes inseridas no genoma das células. 0 cultivo de células pode ser executado em várias etapas. Quando usando células de mamífero, as células seleccionadas são preferencialmente adaptadas para crescer em suspensão bem como em condições isentas de soro. A adaptação para crescer em meio isento de soro pode também ser feita vantajosamente antes de misturar as linhas celulares clonadas para a linha celular policlonal. A adaptação pode ser executada numa ou duas etapas e com ou sem pressão de selecção. Preferencialmente, um sistema de selecção é usado, o qual permite selecção por todo o período de fabrico sem comprometer a pureza do produto de fármaco fabricado. Em geral, para o fabrico de proteínas recombinantes para uso farmacêutico, é preferível não usar, por exemplo, antibióticos ou outros fármacos de baixo peso molecular para fornecer pressão de selecção, como ela será necessária para validar que o produto final não contém quaisquer traços do antibiótico.

Quando a linha celular policlonal é adaptada às condições apropriadas, o aumento de escala pode ser iniciado. Neste ponto, um stock de célula de trabalho policlonal (banco de células de trabalho policlonais, pWCB) e/ou banco primário de células policlonais (pMCB) pode ser congelada. Preferencialmente, são usados biorreactores de entre 30 e 100 litros, mas biorreactores menores (5 a 10 litros) ou maiores (até 1000, 5000, 10000, 15000 litros, ou até maiores) podem ser empregados. O tempo de produção adequado e a escolha do tamanho do biorreactor são dependentes do 69 rendimento desejado de proteína do lote e dos níveis de expressão da linha celular. Os tempos podem variar desde alguns dias até três meses. A proteína policlonal recombinante expressa pode ser recuperada a partir das células ou do sobrenadante. A proteína recombinante pode ser purificada e caracterizada de acordo com os procedimentos conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Exemplos de procedimentos de purificação são listados abaixo. Exemplos de procedimentos de caracterização podem ser encontrados, por exemplo, em WO 2006/007853.

Purificação de uma proteína policlonal recombinante a partir do sobrenadante de cultura O isolamento de proteínas específicas de sobrenadantes de cultura é possível usando várias técnicas cromatográficas que utilizam diferenças nas propriedades físico-químicas de proteínas, por exemplo, diferenças no peso molecular, carga líquida, hidrofobicidade, ou afinidade por um ligando ou proteína específica. As proteínas podem, assim, ser separadas de acordo com o peso molecular usando cromatografia por filtração em gel ou de acordo com a carga líquida usando cromatografia por troca iónica (catião/anião) ou alternativamente usando cromatofocalização. Similarmente, as proteínas podem ser separadas de acordo com a hidrofobicidade usando interacção hidrofóbica ou cromatografia de indução de carga ou cromatografia de afinidade utilizando diferenças em afinidade por um ligando ou proteína imobilizada específicos. A separação de misturas complexas de proteínas pode assim ser alcançada por combinação sequencial de vários princípios cromatográficos. Uma mistura de proteínas pode assim inicialmente ser separada de acordo com, por exemplo, carga líquida usando cromatografia por troca iónica e proteínas de carga líquida similar podem 70 subsequentemente ser separadas de acordo com o peso molecular usando cromatografia por filtração em gel ou após hidrofobicidade usando cromatografia por interacções hidrofóbicas na presença de uma elevada concentração de um sal seleccionado. A cromatografia por afinidade combinada com etapas de purificação subsequentes tais como cromatografia por troca iónica, interacções hidrofóbicas e filtração em gel tem sido frequentemente usada para a purificação de IgG (policlonal bem como monoclonal) e TcR de diferentes fontes, por exemplo, fluido de ascites, sobrenadantes de cultura celular e soro. A purificação por afinidade, em que a separação é baseada numa interacção reversível entre a ou as proteínas e um ligando específico acoplado a uma matriz cromatográfica, é um método fácil e rápido, que oferece elevada selectividade, usualmente elevada capacidade e concentração num menor volume. A proteína A e a proteína G, duas proteínas de superfície celular bacteriana, têm elevada afinidade pela região Fc de anticorpos, e foram usadas, numa forma imobilizada, para muitas aplicações de rotina, incluindo purificação de IgG policlonal e suas subclasses a partir de várias espécies e absorção e purificação de complexos imunes.

Após a cromatografia por afinidade, as etapas de cromatografia a jusante, por exemplo, cromatografia de troca iónica e/ou cromatografia por interacção hidrofóbica, podem ser executadas para remover proteínas de célula hospedeira, Proteína A extravasada, e ADN. A filtração em gel, como uma etapa de purificação final, pode ser usada para remover moléculas contaminantes tais como dímeros e outros agregados, e transferir a amostra para tampão de armazenamento. Dependendo da fonte e 71 condições de expressão, pode ser necessário incluir uma etapa de purificação adicional para alcançar o nivel exigido de pureza de anticorpo. A cromatografia de interacção hidrofóbica ou cromatografia por troca iónica são assim frequentemente usadas, em combinação com a cromatografia de afinidade com a Proteína A e a cromatografia de filtração em gel, para purificar anticorpos para uso terapêutico.

De modo a facilitar a purificação, é preferível que todos os membros do anticorpo policlonal partilhem a mesma região constante da cadeia pesada e/ou cadeia leve.

De modo a purificar outras classes de anticorpos, os meios de cromatografia de afinidade alternativos têm que ser usados uma vez que as proteínas A e G não se ligam a IgA e igM. Uma purificação de imunoafinidade pode ser usada (anticorpos monoclonais anti-IgA ou anti-IgM acoplados à fase sólida) ou, alternativamente, estratégias de purificação em várias etapas, incluindo interacção de troca iónica e hidrofóbica, podem ser empregues.

Caracterização Estrutural A caracterização estrutural de proteínas policlonais, tais como anticorpos e TcRs, exige elevada resolução devido à complexidade da mistura (diversidade clonal e glicosilação) . Abordagens tradicionais, tais como filtração em gel, cromatografia de troca iónica ou electroforese, podem não ter suficiente resolução para diferenciar entre os anticorpos individuais. A electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) foi usada para traçar o perfil de misturas de proteínas complexas seguida por espectrometria de massa (MS) ou cromatografia líquida (LC)-MS (por exemplo, proteómica). 2D-PAGE, que combina separação com base na carga e massa da proteína, provou-se 72 útil para diferenciar entre imunoglobulina policlonal, oligoclonal e monoclonal em amostras de soro. No entanto, este método tem algumas limitações. As técnicas de cromatografia, em particular electroforese capilar ou LC acoplado a MS de ionização por spray de electrões estão a ser cada vez mais aplicadas para a análise de misturas de péptidos complexos. LC-MS foi usada para a caracterização de anticorpos monoclonais. A análise de amostras muito complexas exige mais poder de resolução do sistema cromatográfico, que pode ser obtida por separação em duas dimensões (ou mais). Tal abordagem poderia ser baseada em troca iónica na primeira dimensão e cromatografia de fase reversa (ou interacção hidrofóbica) na segunda dimensão opcionalmente acoplada a MS.

Caracterização Funcional

Uma proteína policlonal pode, por exemplo, ser caracterizada funcionalmente através de estudos de comparabilidade com proteinas policlonais com especificidade em direcção ao mesmo alvo ou uma actividade similar. Tais estudos podem ser executados in vitro bem como in vivo.

Uma caracterização funcional in vitro de um anticorpo policlonal poderia, por exemplo, ser imunoprecipitação que é uma técnica altamente especifica para a separação analítica de antigénios alvo a partir de lisados celulares em bruto. Combinando-se imunoprecipitação com outras técnicas, tal como SDS-PAGE seguida por coloração de proteína (Azul de Coomassie, coloração com prata ou marcação com biotina) e/ou immunoblotting, é possível detectar e quantificar antigénios, por exemplo, e assim avaliar algumas das propriedades funcionais dos anticorpos. Embora este método não forneça uma estimativa do número de moléculas de anticorpos nem as suas afinidades de ligação, 73 fornece uma visualização das proteinas-alvo e assim a especificidade. Este método pode igualmente ser usado para monitorizar potenciais diferenças dos anticorpos relativamente aos antigénios (a integridade da diversidade clonal) durante o processo de expressão.

Uma caracterização funcional in vivo de um anticorpo policlonal poderia, por exemplo, ser estudos de infecção. Um animal experimental, tal como um ratinho, pode, por exemplo, ser infectado com um virus especifico, em relativamente ao qual um anticorpo policlonal foi desenvolvido. 0 grau para o qual a infecção pode ser inibida indicará a funcionalidade do anticorpo policlonal.

Composições terapêuticas

Uma composição farmacêutica preparada de acordo com a invenção compreendendo uma proteína policlonal recombinante seleccionada a partir da superfamília de imunoglobulina como seu ingrediente activo é destinada para o tratamento ou prevenção de uma doença num mamífero. A composição farmacêutica compreende preferencialmente um anticorpo policlonal recombinante ou fragmento de anticorpo como o ingrediente activo e um excipiente farmaceuticamente aceitável. É também preferida uma composição farmacêutica compreendendo um receptor de célula T policlonal recombinante ou fragmento de receptor de célula T como o ingrediente activo e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo, por meio de processos de 74 dissolução, liofilização, mistura, granulação ou confecção convencionais. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (ver, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988 a 1999, Mareei Dekker, Nova Iorque, NY).

As soluções do ingrediente activo, e também suspensões, e especialmente soluções ou suspensões aquosas isotónicas, são preferencialmente usadas, sendo isso possível, por exemplo, no caso de composições liofilizadas que compreendem o ingrediente activo isolado ou em conjunto com um veículo, por exemplo, manitol, para tais soluções ou suspensões a serem produzidas antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes e/ou emulsionantes, solubilizantes, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões, e são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo, por meio de processos convencionais de dissolução ou liofilização. As referidas soluções ou suspensões podem compreender substâncias de aumento da viscosidade, tal como carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatina.

As composições para injecção são preparadas de maneira convencional sob condições estéreis; o mesmo se aplica também à introdução das composições em ampolas ou frascos e vedação dos recipientes. 75

As composições farmacêuticas podem compreender de aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, preferencialmente de aproximadamente 20% a aproximadamente 90% de ingrediente activo. As composições farmacêuticas podem estar, por exemplo, na forma de doses unitárias, tal como na forma de ampolas, frascos, supositórios, drageias, comprimidos ou cápsulas.

Utilizações terapêuticas das composições

As composições farmacêuticas preparadas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para o tratamento, melhoria ou prevenção de uma doença num mamífero. As doenças que podem ser tratadas com as presentes composições farmacêuticas incluem cancro, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, alergia, asma e outras doenças respiratórias, doenças autoimunes, doenças cardiovasculares, doenças no sistema nervoso central, doenças metabólicas e endócrinas, rejeições a transplantes e gravidez indesejada.

As composições podem ser usadas num método para o tratamento, melhoria ou profilaxia da doença num animal, onde uma quantidade eficaz do anticorpo policlonal recombinante ou fragmento de anticorpo é administrado, ou em que uma quantidade eficaz do receptor de célula T policlonal recombinante ou fragmento de receptor de célula T é administrada.

Um aspecto adicional da presente invenção é o uso de um anticorpo policlonal recombinante ou receptor de célula T policlonal recombinante ou fragmentos de anticorpos ou receptores de célula T para a preparação de uma composição para o tratamento de doenças seleccionadas a partir de um grupo consistindo num cancro, uma infecção, uma doença inflamatória, uma alergia, asma ou outra doença 76 respiratória, mau funcionamento imunológico, uma doença auto-imune, uma doença cardiovascular, uma doença no sistema nervoso central, uma doença metabólica, uma doença endócrina, rejeição a transplante e gravidez indesejada.

Uso diagnóstico e uso em detecção ambiental

Kits de diagnóstico e kits para uso em detecção ambiental podem compreender uma proteina policlonal recombinante preparada de acordo com a invenção, proteina que pode ser marcada com uma marcação detectável ou não-marcada para detecção sem marcação. Se marcada, a proteina policlonal recombinante presente pode ser adicionada a uma amostra suspeita de conter a molécula -alvo e na presença ou ausência da marcação indica a presença ou ausência da molécula-alvo. A amostra a ser testada pode ser uma amostra de fluido corporal tal como sangue, soro, plasma, fluido espinhal, fluido linfático ou urina ou uma amostra de não mamífero tal como uma amostra de uma fonte ambiental suspeita de abrigar um contaminante. As amostras não provenientes de mamífero podem ser água, ar ou terra contaminada. A detecção não-marcada abrange a medição de alteração refractiva em BlAcore mediante ligação, onde a proteína policlonal recombinante é usada para capturar a molécula-alvo. EXEMPLOS EXEMPLO 1

Derivação de clones de célula CHO expressando anticorpos Vector de expressão 0 vector de expressão de igG usado é mostrado na Figura 2a. 0 vector de expressão de ElA é mostrado na Figura 2b.

Linha celular 77 A linha celular usada é um derivado da linha celular CHO DG44 negativa em DHFR obtido a partir de Lawrence Chasin, Columbia University (também disponível a partir de Gibco cat N° 12613-014) . As células DG44 foram transfectadas com um cADN para a versão 13S do transactivador de EIA de adenovirus tipo 5 (No. de acesso NCBI AY339865, sequência de cADN: atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtctttt ggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaac cacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgag gaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattga cttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagc ccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggag gtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaaga gggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtc attatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgagg acctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccaga accggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcc cgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtcct tctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgc cgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagc ctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataa) no vector pcDNA3.1+ (Cat N° V790-20, Invitrogen). Os transfectantes foram seleccionados com Geneticina (Invitrogen) numa concentração de 500 pg/ml. Após a selecção, as células foram clonadas em células isoladas por diluição limitante. Os clones foram testados quanto à transactivação do promotor de CMV (expressão optimizada) por transfecção transiente com um plasmideo de anticorpo (mostrado acima). Um único clone mostrou um nível de expressão no ensaio transiente que foi optimizado por um factor de 3 em comparação com a linha celular DG44 não transfectada. O nível de expressão aumentado não é evidência de transactivação real e poderia ser causado por selecção de um subclone de expressão particularmente alta. 78

Em comparações executadas com transfecção estável, grupos seleccionados mostraram um nível de expressão 4-5 vezes aumentado comparado com linha celular DG44 que. Este clone (chamado ECHO) foi subclonado duas vezes e pareceu ser estável em relação à transactivação do promotor de CMV (expressão optimizada). A transactivação real do promotor de CMV não foi medida, mas o clone, no entanto, mostrou uma elevada expressão estável de anticorpo sob o controlo do promotor de CMV.

Plasmídeos de expressão de anticorpo

Os plasmídeos de expressão em anticorpo usados foram construídos como mostrado acima. Para esse propósito, 6 diferentes anticorpos direccionados contra diferentes proteínas de superfície do vírus Vaccinia foram escolhidos. Eles foram escolhidos porque cada um deles tem um perfil muito característico em cromatografia de troca iónica tornando possível uma identificação e quantificação em misturas de diferentes anticorpos. Os anticorpos (descritos em PCT/DK2006/000686 copendente depositado em 4 de Dezembro de 2006, intitulado "Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody", publicado como WO 2007/065433) foram: • Sym002-037 (clone 002-037) • Sym002-186 (clone 002-186) • Sym002-235 (clone 002-235) • Sym002-286 (clone 002-286) • Sym002-303 (clone 002-303) • Sym002-482 (clone 002-482)

ELISA de IgG

IgG foi medida por ELISA em sanduíche. Brevemente, placas com 96 poços (Maxisorp, NUNC) foram revestidas com Fc de cabra anti-humano (Serotec, STAR106) seguido por incubação com amostras e padrão (anticorpo kapa IgGl monoclonal 79 humano purificado). A detecção foi executada com cadeias leves kapa anti-humanas de cabra conjugadas com peroxidase do rábano (Serotec STAR100P).

Transfecção de células ECHO

As células ECHO foram inoculadas em frascos T80 numa densidade de 0,30*106 células/frasco em meio MEM alfa com nucleósidos (Invitrogen cat. No. 32571) com soro bovino fetal a 10% (FCS) (Invitrogen). Na hora seguinte à inoculação, as células foram transfectadas com Fugeneô (Roche) : 10 μΐ de Fugeneô são misturados com 490 μΐ de meio de Eagle modificado por Dulbecco e permitiu-se incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente, adiciona-se 5 pg de plasmideo de expressão e a mistura é incubada por mais 15 minutos à temperatura ambiente. A mistura é adicionada ao frasco de cultura celular.

No dia seguinte, o meio com reagentes de transfecção foi aspirado, cada frasco foi lavado uma vez com 5 ml de meio MEM alfa (sem nucleósidos) com FCS dialisado a 10% (Invitrogen) (MEMalfa) e 10 ml do mesmo meio foram adicionados em conjunto com metotrexato numa concentração de 2 nM. Depois disso, o meio foi mudado das vezes por semana.

Após 15 dias, as células foram tripsinizadas e todas as células foram transferidas para novos frascos. Após mais 2 dias de cultura, o meio foi alterado e no dia seguinte, o meio foi aspirado, as células foram contadas e as produtividades foram medidas com ELISA de igG. Os resultados são mostrados na Tabela 3. As produtividades 80 foram calculadas como picogramas por célula por dia usando o número de células na altura da colheita.

Tabela 3

Anticorpo conc. De IgG, pg/ml IgG Total Número de Células, *106 Produtividade, picogramas por célula por dia Sym002-037 3, 65 36,5 3,0 12,2 Sym002-186 8, 15 81,5 6,0 13,6 Sym002-235 5, 71 57,1 3,3 17, 3 Sym002-286 1, 39 13,9 0,8 17, 4 Sym002-303 11,4 114 9,4 12,1 Sym002-482 17, 0 170 12,5 13,6

Contagens de células, conteúdo de IgG de meio e produtividades celulares especificas de grupos transfectados

Para a produção de clones de única célula, as células nos grupos foram coradas para anticorpos associados à superfície e submetidas a classificação de células isoladas para placas com 96 poços contendo meio condicionado com célula ECHO a 50% (MEMalfa) e 50% do mesmo meio sem condicionamento. Resumidamente, o protocolo de coloração foi como se segue: 1. As células são tripsinizadas e contadas 2. Pipetar 1-5 x 106 células para tubo FACS estéril 3. Centrifugar as células durante 1 minuto a 250 g e 4°C e remover sobrenadante 4. Lavar células em 2 ml de PBS FACS estéril (PBS + FCS a 2%) (5 ml) 5. Corar as células com fragmento F(ab)2 de cabra IgG H+L-PE anti-humano (Beckman-Coulter, IM1626) diluído 1:20 em 100 μΐ de células Ab/106 diluídas e incubar durante 20 minutos (4°C no escuro) 6. Lavar as células duas vezes em 2 ml de PBS FACS (5 ml) 81 7. Ressuspender para 1-5 x 106/ml em PBS FACS (2 ml) 8. Adicionar iodeto de propídio, 10 pg/ml 1:100

Uma porta apropriada foi ajustada e as células isoladas foram para placas de 96 poços (5 placas por anticorpo) usando um FACS-Aria (Beckton-Dickinson).

Após aproximadamente 1 semana, os poços foram inspeccionados por microscópio relativamente à presença de clones isolados.

Após aproximadamente 2 semanas, os sobrenadantes dos poços com um único clone foram testados, cada um numa única diluição por ELISA e com baseado no valor do ELISA e na inspecção visual dos poços, seleccionaram-se 24 clones representando cada anticorpo para continuar a cultura. Os clones foram seleccionados usando inspecção visual do número de células e morfologia combinados com uma selecção para o nivel de expressão de anticorpo. Os clones seleccionados foram adicionalmente testados num ensaio de exaustão: resumidamente, as células foram inoculada em placas de 24 poços e permitiu-se crescer até que a maioria das células estivesse morta. Os sobrenadantes foram analisados por ELISA e os 10 melhores clones para cada anticorpo foram seleccionados para adaptação à cultura em suspensão isenta de soro.

Adaptação à cultura em suspensão isenta de soro

As células foram tripsinizadas e contadas. 5*106 células foram centrifugadas e ressuspensas em 10 ml de meio isento de soro ProCH04 (Cambrex). As células foram transferidas para tubos de cultura celular de 50 ml (TRP, Suíça) e incubadas num agitador a 37°C. As densidades das células foram contadas duas vezes por semana e de cada vez, as culturas foram diluídas para 0,5*106 células por ml 82 (durante as primeiras 2 semanas) ou para 0,3*106 células por ml (durante o período restante). Após 4-5 semanas, o tempo de duplicação para a maioria dos clones foi aproximadamente 30 horas, tempo no qual se considerou que estavam adaptados à cultura isenta de soro.

No fim do período de adaptação, as células foram testadas por ELISA, congeladas em meio de cultura com DMSO a 10% e usadas para experiências de expressão (ver Exemplo 2 abaixo) .

Exemplo 2

Experiências de Expressão

Para testar a estabilidade composicional de culturas mistas por longo prazo, preparou-se um número de misturas de clones. Com base nas contagens realizadas durante o período de adaptação, o tempo de duplicação foi levado em consideração tanto quanto possível. Foi tomado cuidado para juntar clones com um tempo de duplicação semelhante. No total, foram preparadas 9 misturas: - Misturas 1 a 5: em cada uma dessas foi usado um único clone para cada anticorpo - Mistura 6: dois clones foram usados para cada anticorpo - Mistura 7: cinco clones foram usados para cada anticorpo - Mistura 8: 3 clones foram usados para cada anticorpo - Mistura 9: todos os clones disponíveis foram usados, 5-7 para cada anticorpo

Os clones foram misturados de tal modo que o número de células representando cada anticorpo (para cada anticorpo de 1-7 clones) constituiu 1/6 do número total de células na mistura. 83 A experiência foi executada em tubos de cultura de 50 ml tal como descrito no exemplo 1. O meio usado foi ProCH04 e os volumes totais de cultura foram 10 ml. A experiência foi iniciada com uma concentração de 0,3*106 células por ml. As culturas foram diluídas a 0,3*106 células por ml duas vezes por semana com intervalos de 3 e 4 dias. Uma vez por semana foram recolhidas amostras para análise por ELISA e cromatografia por troca iónica. As primeiras amostras foram obtidas no dia 4 e as últimas no dia 35.

Os valores de ELISA para as 9 misturas são apresentados na Figura 3. O número calculado de divisões celulares do início ao fim diferiu nas misturas de aproximadamente 25 a aproximadamente 27. Isso significa que se as culturas foram diluídas como descrito, duas vezes por semana, mas mantendo o volume total em cada ponto, os volumes totais no fim teriam variado entre 43000 e 152000 litros. As culturas de células de mamíferos em grande escala na indústria são tipicamente até 15000 litros, o que significa que as experiências de mistura descritas aqui relativamente à duração da cultura e ao número de gerações são uma simulação fiel da cultura à escala industrial.

Parece que a produtividade celular é relativamente constante ao longo do período de 5 semanas com uma tendência declinar nalgumas misturas.

Análise de Composição de igG

Carregou-se 5-10 ml de sobrenadante de meio filtrado a 0,22 pm numa coluna MabSelect Sure de 1 ml (GE Healthcare) . A coluna foi lavada com 10 ml de pbs pH 7,4 e eluída com glicina a 0,1 M pH 2,7 como descrito pelo fabricante. O material de proteína recolhido foi dialisado duas vezes 84 contra NaCl a 40 mM, acetato de sódio a 50 mM pH 5,0 e a concentração de IgG total foi determinada medindo-se a absorvância em 280 nm. A mistura de IgG a 60 gg foi carregada na coluna de troca catiónica fraca PolyCat A (100x4, 6 mm, 3 gm, 1500 Ã) da PolyLC. A proteína foi eluída aplicando-se um gradiente de NaCl a 150 a 500 mM num tampão de acetato de sódio a pH 5,0 com um caudal de 1 ml/min ao longo de 72 minutos. A absorvância a 215 nm do eluato foi monitorizada e as quantidades relativas de IgGs individuais foram determinadas por integração do sinal.

Na Figura 3 apresentam-se os cromatogramas da análise de troca catiónica da composição de IgG da primeira e última recolha da Mistura 8 após purificação com MabSelect. Como se pode observar, os Abs individuais são bem separados, com separação até à linha de base de quatro deles. Portanto, a integração do sinal UV fornece uma determinação muito precisa das concentrações relativas de IgG na amostra.

Todas as misturas foram analisadas como descrito acima e o conteúdo de cada anticorpo em cada mistura foi calculado.

Observa-se uma distribuição de particularmente uniforme entre os 6 diferentes anticorpos nas amostras de início. As diferenças observadas podem reflectir diferentes níveis de expressão entre os clones usados nas misturas. O conteúdo em anticorpo de cada amostra é apresentado graficamente na Figura 5. Surpreendentemente, todos os anticorpos podem ser claramente identificados em todas as últimas amostras. Pode-se também observar que nas misturas com mais de um único clone representando cada anticorpo (misturas 6-9), existe uma tendência de uma distribuição mais uniforme dos anticorpos nas últimas amostras. 85

EXEMPLO 3, expressão de ElA em ECHO

Para investigar a expressão de ElA em ECHO, o nivel de mARN de ElA foi determinado por PCR em tempo real de transcrição reversa quantitativo (qRT-PCR) com verde de SYBR. 0 método de qRT-PCR é baseado na amplificação por PCR de uma sequência alvo. 0 PCR é executado na presença do corante de ligação ao ADN, verde de SYBR, que emite luz verde quando ligado a ADN de cadeia dupla. Isso permite a quantificação em tempo real do ADN de cadeia dupla após cada ciclo de amplificação.

Quando a quantidade de ADN de cadeia dupla é baixa, no inicio do PCR, o sinal do corante verde de SYBR ligado não pode ser distinguido do ruído de fundo. No entanto, durante o processo de amplificação, o sinal aumenta acima do ruído e a produção de ADN de cadeia dupla pode ser seguida. Dessa maneira, a quantidade relativa de alvo inicialmente presente nas amostras pode ser determinada com base nos ciclos necessários para o sinal do verde de SYBR cruzar o limite especifico. 0 ponto exacto no qual o limite é alcançado é o valor ct, que pode ser usado para comparações relativas da quantidade inicial do alvo.

Materiais e Métodos 0 ARN total foi extraído de células ECHO 3.06+06 e Hek293 usando o Mini Kit RNeasy cat. No. 74104 da Qiagen como recomendado pelo fabricante. As concentrações e a integridade das amostras de ARN foram determinadas usando o equipamento Bioanalyzer 2100 da Agilent com o ensaio Eukaryote Total ARN Nano Series II. A integridade é determinada como um número de integridade de ARN (RIN) entre 1-10 com 1 correspondente a ARN degradado e 10 a ARN intacto. O ARN ECHO tem um RIN de 9,5 e HEK293 tem um RIN de 8,9. cDNA de cada amostra foi preparado usando o 86

QuantiTect Reverse Transcription Kit cat. No. 205311 da Qiagen usando 800 ng de ARN como o material de partida. O cDNA de Hek293 foi diluído 25 vezes, enquanto o cDNA ECHO foi diluído duas vezes. O qRT-PCR foi levado a cabo num Stratagene Mx3005P usando a Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix cat. no. 600548 da Stratagene. Condições de ciclagem térmica: 10 minutos manutenção a 95°C, 40 ciclos com 15 segundos de desnaturação a 95°C, 1 minuto de emparelhamento a 60°C e 30 segundos de extensão a 72°C; análise de curva de fusão de 55 a 95°C. Os iniciadores usados (ElA-696bpF: 5 ' -TGACTCCGGTCCTTCTAACACA-'3, ElA-772bpR: 5'- TCACGGCAACTGGTTTAATGG-' 3) têm como alvo um fragmento de 77bp na extremidade 3'do gene ElA.

Resultados A expressão de ElA em células ECHO foi analisada usando qRT-PCR e mostrou que mARN de ElA não pode ser amplificado e detectado nesse ensaio, indicando fortemente que a linha celular ECHO não expressa a proteína EIA. Como um controlo positivo foi usada a linha celular 293 humana que é transformada por um fragmento de ADN de adenovírus e conhecida por expressar ElA a um nível relativamente alto. O qRT-PCR apresenta amplificação na amostra Hek293, o controlo positivo Ct = 18,74, mas nenhuma amplificação foi observada nem no NTC (controlo sem molde) nem na amostra ECHO.

Amostra ct Hek293 18, 74 ECHO Sem Ct NTC Sem Ct

Exemplo 4. Preparação de bancos de células para experiências em biorreactor 87

Para se conseguir executar experiências em biorreactores para o estudo de estabilidade composicional, prepararam-se bancos de células primários e de trabalho. Para a experiência, clones de célula ECHO expressando 6 anticorpos diferentes como descrito no Exemplo 1 foram usados. Os clones usados foram adaptados para cultura em suspensão isenta de soro no meio de cultura ProCH04.

Banco de Células Primário

Os clones foram descongelados e permitidos recuperar em cultura de suspensão durante um período de tempo. Prepararam-se 4 Bancos de Células Primários misturados a partir de células em crescimento exponencial de acordo com as seguintes especificações: - As células foram congeladas quando estavam em crescimento logarítmico - Todos os 6 anticorpos estavam representados em cada banco de células - Misturaram-se números de células iguais representando cada anticorpo - Mistura 1 A - 3 A continha um único clone por anticorpo - Mistura 4 A continha 3 clones por anticorpo - 10 ampolas, cada uma contendo 20*106 células, foram congeladas por mistura - Meio de Congelamento: meio de cultura (ProCH04) com DMSO a 10%

Banco de Células de Trabalho

Uma ampola congelada por mistura foi descongelada. As misturas foram mantidas em cultura por 8-10 dias antes da preparação do banco de células de trabalho: - As células foram congeladas quando elas estavam em crescimento logarítmico 88 - 10 ampolas, cada uma contendo 20*106 células, foram congeladas por mistura - Meio de congelamento: meio de cultura (ProCH04) com DMSO a 10%

Exemplo 5: Estabilidade composicional em biorreactor

Uma ampola congelada por mistura do banco de células de trabalho foi descongelada e as células foram mantidas em cultura como preparação de inoculo por 14 dias, altura em que a cultura no biorreactor foi iniciada:

Cada cultura de inoculo foi usada para inocular dois biorreactores com 0,6* 106 células/ml em 250 ml de meio inicial (ProCH04 + glutamina a 5 mM + aminoácidos não essenciais 1/100) .

As culturas foram alimentadas do dia 2 ao dia 14 após a inoculação com meio de alimentação (ProCH04 + 6 g/L de glucose + glutamina a 5 mM + aminoácidos não essenciais 1/100) resultando num volume de ~ 585 ml no dia 16 da recolha.

Os seguintes parâmetros foram controlados nos biorreactores DASGIP (unidade 1-8):

Tabela 4. Parâmetros gerais do processo de biorreactor

Volume 250 ml alimentados continuamente, início dia 2 até dia 14 Ponto de controlo de temperatura: 36,8°C, deslocado para 32,0°C em 120 horas Ponto de controlo de pH: 6,95 Controle de pH: Na2C03 a 0,25 M esterilizado por filtração é usado. Agitação: 80 rpm. Ponto de controlo de pC>2: 30 % (regulado via conteúdo de 02 no gás) Caudal de gás: 0,1 sl/h Nível de C02: Ajustado pelo sistema DASGIP de modo a manter o pH 89

Todos os dias foram recolhidas amostras de 5 ml para análise de viabilidade, número de células viável, produção de IgG e metabolitos. Todas as culturas correram como esperado com viabilidades e números de células viáveis, que foram parecidos. Além disso, 10 ml foram recolhidos para análise da composição de IgG por análise de cromatografia por troca iónica das culturas de inoculo (no dia 9 e no dia 14) e de cada biorreactor (unidade 1-8) no dia 20, dia 24, dia 28, e no dia 30 após a descongelação das ampolas. A análise da composição de IgG foi executada como descrito no exemplo 2 acima.

Todas as misturas foram analisadas como descrito acima e o conteúdo de cada anticorpo em cada amostra das 4 misturas foi calculado. O rendimento total de IgG das culturas está na gama de aproximadamente 150 a 250 mg/L. O conteúdo de anticorpo de cada amostra é apresentado graficamente em 5. Surpreendentemente, todos os anticorpos podem claramente ser identificados em todas as amostras. A composição parece robusta, nenhum dos clones é perdido ou removido durante a cultura de inóculos de 14 dias seguida de cultura em biorreactor durante 16 dias. As composições são diferentes dependendo dos clones de entrada.

Parece também possível, através da selecção de clones específicos para uma mistura, determinar a distribuição dos anticorpos individuais no produto final.

Lisboa, 10 de Novembro de 2010

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para produção de uma linha celular policlonal capaz de expressar uma proteína policlonal com 2 a n membros distintos, compreendendo o referido método: (a) fornecer um conjunto de vectores de expressão, em que cada um dos referidos vectores compreende pelo menos uma cópia de um ácido nucleico distinto que codifica para um membro distinto da referida proteína policlonal; (b) transfectar separadamente células hospedeiras com cada um dos vectores de expressão sob condições que evitem a integração específica dos vectores de expressão no genoma das células, obtendo desse modo 2 a n composições de células, cada composição expressando um membro distinto da proteína policlonal; (c) misturar as referidas 2 a n composições de células para obter uma linha celular policlonal. 2. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que os vectores de expressão são integrados de forma estável e aleatória num ou mais cromossomas das células hospedeiras. 3. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que as células transfectadas obtidas na etapa (b) são clonadas, por exemplo, usando clonagem por FACS, e preferivelmente em que os clones são seleccionados por pelo menos um critério seleccionado a partir do grupo que consiste em: taxa de crescimento, tempo de duplicação, nível de expressão, nível de produção, estabilidade de produção ao longo do tempo, viabilidade, vigor, morfologia, e número de cópias. 4. 0 método da reivindicação 3, em que os clones são seleccionados quanto à uniformidade com relação a pelo menos um critério, por exemplo, em que os clones são 2 seleccionados quanto à uniformidade em relação ao tempo de duplicação e/ou ao nível de expressão, opcionalmente em que mais do que um clone é seleccionado para cada membro de proteína policlonal distinto. 5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as referidas composições de células expressando diferentes membros distintos são misturadas numa relação 1:1, ou em que as referidas composições de células são misturadas numa relação diferente da relação 1:1. 6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os vectores de expressão são idênticos excepto variações na sequência que codifica para a proteína policlonal. 7. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as células hospedeiras são derivadas de um clone antes da transfecção. 8. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proteína policlonal é uma proteína multimérica, por exemplo, em que um vector de expressão codifica para todas as subunidades de um membro de proteína policlonal distinto, ou em que o conjunto de vectores de expressão na etapa (a) é constituído por dois ou mais subconjuntos de vectores de expressão, onde um primeiro subconjunto compreende sequências de ácido nucleico variantes que codificam para uma subunidade da proteína, por exemplo uma cadeia pesada do anticorpo, e o segundo subconjunto compreende sequências de ácido nucleico variantes que codificam para outra subunidade da proteína, por exemplo uma cadeia leve do anticorpo, tal que cada transfecção é executada com um membro do primeiro 3 subconjunto e um membro do segundo subconjunto dos vectores de expressão. 9. 0 método de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o vector de expressão ou um vector de expressão adicional codifica para um marcador seleccionável, por exemplo, em que as células são continuamente cultivadas sob condições que favorecem o crescimento de células que expressam o marcador seleccionável, em que o marcador seleccionável compreende um produto de gene do qual a célula hospedeira é deficiente, por exemplo, em que o marcador seleccionável é codificado por um transcrito que também codifica para um membro de polipéptido ou uma subunidade do referido membro de polipéptido, preferencialmente, em que o marcador seleccionável é codificado pelo transcrito que codifica para a maior subunidade.

10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a proteína policlonal é um anticorpo policlonal ou fragmento de anticorpo policlonal; preferentemente em que todos os membros do anticorpo policlonal têm a mesma região constante da cadeia pesada e/ou da cadeia leve, preferencialmente da cadeia pesada.

11. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as células hospedeiras são eucarióticas, preferencialmente células de mamifero, por exemplo células de mamifero seleccionadas a partir do grupo que consiste em células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3, fibroblasto ou células humanas imortalizadas incluindo células HeLa, células HEK293, ou PER.C6. 4 12. 0 método da reivindicação 11, em que a célula hospedeira expressa um transactivador recombinante, capaz de transactivar o promotor que codifica para a expressão da proteína policlonal.

13. Um método para a produção de uma proteina policlonal, compreendendo o referido método: (a) fornecer uma linha celular policlonal obtida usando o método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12; (b) cultivar a linha celular policlonal sob condições que permitem a expressão da proteina policlonal; (c) recuperar e opcionalmente purificar a proteina policlonal a partir das células ou meio; e, opcionalmente, (d) verificar a presença de cada um dos membros distintos na proteina policlonal recuperada e opcionalmente purificada.

14. Uma linha celular policlonal, compreendendo 2 a n populações de células, cada população expressando um membro distinto de uma proteina policlonal recombinante, em que a proteina policlonal recombinante compreende moléculas de proteínas diferentes mas homólogas, compreendendo as células pelo menos uma construção de expressão aleatoriamente integrada no genoma, de tal modo que os locais de integração variam entre os membros da linha celular policlonal.

15. A linha celular policlonal da reivindicação 14, em que pelo menos uma construção de expressão é integrada num ou mais cromossomas.

16. A linha celular policlonal da reivindicação 14 ou 15, em que n é menor que 50, tal como menos de 45, por exemplo, menos de 40, tal como menos de 35, por exemplo, menos de 30. 5

17. A linha celular policlonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, em que as células expressando um membro distinto da proteína policlonal recombinante são derivadas de 2 ou mais células clonadas, e em que o número de células clonadas é inferior a 50, por exemplo inferior a 20, tal como inferior a 15, por exemplo inferior a 10.

18. A linha celular policlonal de qualquer uma das reivindicações 14-17, em que a proteína policlonal é uma proteína multimérica, por exemplo em que cada construção de expressão codifica para as subunidades de uma proteína multimérica, por exemplo, em que a expressão das subunidades está sob o controlo dos mesmos promotores ou promotores idênticos.

19. A linha celular policlonal de qualquer uma das reivindicações 14-18, em que as construções de expressão codificam para um marcador seleccionável, opcionalmente em que o marcador seleccionável é codificado por um transcrito que também codifica para um membro de polipéptido ou uma subunidade do referido membro de polipéptido.

20. A linha celular policlonal de qualquer uma das reivindicações 14-19, em que a proteína policlonal é um anticorpo policlonal ou um fragmento de anticorpo policlonal, preferentemente em que todos os membros do anticorpo policlonal são do mesmo isotipo.

21. A linha celular policlonal de qualquer uma das reivindicações 14-20, em que as células hospedeiras são eucarióticas, preferencialmente em que as células hospedeiras são células de mamífero. 6

22. A linha celular policlonal de qualquer uma das reivindicações 14-21, em que as células compreendem uma construção de expressão estavelmente integrada que codifica para um transactivador capaz de transactivar o promotor que codifica os membros da proteína policlonal. Lisboa, 10 de Novembro de 2010