PT1583830E - Método para produzir proteínas policlonais recombinantes - Google Patents

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA PRODUZIR PROTEÍNAS POLICLONAIS RECOMBINANTES"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção forma a base de uma plataforma de tecnologia para produzir proteínas policlonais recombinantes, como as proteínas da superfamília de imunoglobulinas, por exemplo, formas ligadas a membrana ou solúveis de receptores de células B ou T, a serem usadas como uma nova classe de terapêuticos no tratamento, melhora ou prevenção de várias infecções, doenças inflamatórias, rejeição a transplantes, cancro e alergias.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Várias doenças infecciosas e cancros não têm ainda terapias eficazes. Os anticorpos monoclonais não obtiveram geralmente sucesso contra estes marcadores, parcialmente devido à variabilidade dos marcadores complexos e mutações adaptativas de proteínas alvo levando ao escape imune de reconhecimento de anticorpo monoclonal. Os anticorpos policlonais, por outro lado, são capazes de marcar uma pluralidade de alvos dinâmicos, por exemplo, em vírus ou células de cancro. Igualmente, anticorpos policlonais têm a maior probabilidade de reter actividade no evento de mutação antigénica.

Existem diferentes terapêuticas de anticorpos policlonais comercialmente disponíveis incluindo: 1) imunoglobulina humana normal isolada do sangue de doadores humanos normais; 2) imunoglobulina hiperimune humana, derivada do 2 sangue de doadores humanos individuais transportando os anticorpos contra uma marcação de doença particular, por exemplo, um virus, que eles previamente encontraram ou através da infecção ou vacinação, e 3) imunoglobulina hiperimune animal derivada de sangue de animais imunizados. A imunoglobulina purificada de sangue humano demonstrou ser eficaz contra as infecções com virus de hepatite B, virus sincicial respiratório, citomegalovirus e outros virus da herpes, virus da raiva, toxina botulinica, etc., assim como na profilaxia rhesus D neonatal. A imunoglobulina purificada do sangue de coelhos imunizados com células T humanas é usada para dar imunossupressão de células T no tratamento ou prevenção de rejeição a transplantes (por exemplo, Timoglobulina). A imunoglobulina humana normal foi utilizada para reforçar o sistema imune de pacientes imunodeficientes, assim como na terapia de vários distúrbios auto-imunes.

Mesmo assim, o uso difundido de imunoglobulinas foi limitado devido ao suprimento limitado de matéria-prima de sangue do doador, problemas com variações lote-a-lote, e segurança variável. As imunoglobulinas derivadas de animais são, particularmente, defrontadas com os mesmos problemas de imunogenicidade, como foi observado para anticorpos monoclonais derivados de animais nos anos 80 e 90. Finalmente, como com outros produtos de sangue, o risco de transmissão de agentes infecciosos como HIV, virus do herpes ou hepatite ou priões permanece. Consequentemente, enquanto os clínicos sabem que os anticorpos policlonais são uma terapia preferida em algumas situações, seu uso foi muito limitado. 3

Novas abordagens para gerar imunoglobulinas humanas surgiram com as técnicas de animais transgénicos. Foram criados ratos transgénicos transportando loci de imunoglobulina humana (patente U.S. número 6.111.166). Estes ratos produzem imunoglobulinas completamente humanas, e anticorpos contra uma marcação especifica podem ser criados por técnicas de imunização comuns. No entanto, maiores rendimentos de anticorpos são limitados devido ao tamanho relativamente pequeno dos ratos. Animais maiores também foram tornados transgénicos para os genes de imunoglobulina humana, por exemplo, vacas, ovelha, coelhos, e galinhas (Kuroiwa, Y. et al. Nature Biotechnology; 2002/ 20: 889 - 893) . No entanto, a produção de anticorpos policlonais para terapia do sangue destes animais não ocorre sem complicações. Primeiro, a imunofisiologia do animal e seres humanos pode demonstrar diferenças consideráveis, causando uma diferença no repertório imune resultante, rearranjo funcional, e diversidade da resposta do anticorpo. Segundo, a instabilidade mitótica dos loci de imunoglobulina introduzida pode influenciar a produção a longo prazo de anticorpos. Terceiro, é tecnicamente um desafio apagar os próprios loci de imunoglobulina do animal de modo que, por exemplo, a produção de anticorpo do animal não exceda a produção de anticorpo humano. Quarto, o risco de transmissão de agentes infecciosos como virus, priões, ou outros patogenos, acompanha a administração de anticorpos humanos produzidos nos animais.

Consequentemente, existe a necessidade para a produção de tecnologias para a produção de proteinas policlonais recombinantes, como anticorpos, em quantidades suficientemente grandes e com variações de lote-a-lote minimas para uso clinicos seguros. Os métodos eficazes para 4 a produção de proteínas recombinantes homogéneas usando linhas celulares de expressão eucariótica (particularmente mamíferos) foram desenvolvidos para a produção de várias proteínas incluindo anticorpos monoclonais, interleucinas, interferons, factor de necrose de tumor, factores de coagulação VII, VIII e IX. Muitas destas técnicas são baseadas na transfecção e integração aleatória do gene de interesse no genoma da linha celular de expressão seguido por selecção, amplificação, e caracterização de um clone de expressão altamente produtor e propagação deste clone como uma linha celular de expressão mestre. A expressão de um gene estranho inserido pode ser influenciada por "efeitos de posição" do DNA genómico circundante. Em muitos casos, o gene é inserido em locais onde os efeitos de posição são suficientemente fortes para inibir a síntese do produto do gene introduzido. Além disso, a expressão é com frequência instável devido aos mecanismos de silenciamento (isto é, metilação) impostos pelo DNA hospedeiro cromossómico circundante.

Os sistemas permitindo a integração e expressão de um gene de interesse em células de mamíferos num local genómico específico foram desenvolvidos para a expressão de uma composição de proteína recombinante homogénea (patente U.S. números 4.959.317 e 5.654.182; WO 98/41645; WO 01/07572). A WO 98/41645 descreve a integração num locus específico para a produção de uma linha celular de mamíferos que segrega, por exemplo, anticorpo. No entanto, esta expressão é monoclonal e não se tem indicação de que transfecções podem ser feitas com um banco de vectores. Nem existem quaisquer sugestões de como manter a diversidade original gerada por combinações VH-VL específicas num banco. 5

DESCRIÇÃO DA CONTRIBUIÇÃO A presente invenção proporciona soluções para gerar uma linha celular produtoras para a expressão e a produção de uma proteina policlonal recombinante, evitando um desvio significante entre os membros individuais que constituem a proteina policlonal.

Além disso, a presente invenção não utiliza animais na produção de proteina policlonal, assim eliminando as dificuldades éticas e clinicas associadas com estas abordagens.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona métodos para produzir uma linha celular produzindo policlonal recombinante para a produção de uma proteina policlonal recombinante, com frequência seleccionada de entre a superfamilia de imunoglobulinas. Especialmente, a produção de anticorpos policlonais, receptores de células T policlonais, ou fragmentos policlonais dos mesmos, é interessante. A presente invenção permite a produção comercial de uma proteina policlonal recombinante para uso nas composições farmacêuticas. Um aspecto importante da invenção é que, durante o processo de produção, a expressão desviada das moléculas individuais que constituem a proteina policlonal é mantida a um nivel não significante, minimizando a variação indesejada lote-a-lote.

Um aspecto da presente invenção refere-se a um método para a produção de uma proteina policlonal recombinante de interesse, em que a referida proteina policlonal compreende 6 (ou consiste em) membros distintos que ligam um antigeno particular, o referido método compreendendo: a) proporcionar uma colecção de células compreendendo um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes, onde cada uma das referidas sequências de ácido nucleico codifica um membro distinto da referida proteina policlonal e onde cada uma das referidas sequências de ácido nucleico são integradas no mesmo local único do genoma de cada célula individual na referida colecção de células, b) cultivo da referida colecção de células sob condições que facilitam a expressão da referida proteina policlonal; e c) recuperar a referida proteína policlonal expressada da cultura de células, fracção de células ou meio de cultura de células.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para gerar uma colecção de células apropriada como uma linha celular produzindo policlonal recombinante, o referido método compreendendo: a) proporcionar um banco de vectores compreendendo uma população de sequências de ácidos nucleicos variantes, em que cada um dos referidos vectores compreende 1) uma cópia única de uma sequência de ácido nucleico distinta codificando um número distinto de uma proteína policlonal compreendendo (ou consistindo em) membros distintos que ligam a um antigeno particular e 2) uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinase, b) introduzir referido banco de vectores numa linha celular hospedeira, em que o genoma de cada célula individual da referida linha celular hospedeira compreende sequências de reconhecimento de recombinase, equiparando as do vector, num local específico único no seu genoma; c) assegurar a presença, nas referidas células, de uma ou mais recombinases de modo a que as sequências de ácidos nucleicos variantes da etapa (a) são integradas 7 especificamente no local nas células da linha celular hospedeira, em que referidas uma ou mais recombinases é/ são i) expressada(s) pelas referidas células em que a referida sequência de ácido nucleico é introduzida; ou ii) codificada(s) de modo operativo pelos vectores da etapa a); ou iii) proporcionada(s) através da expressão de um segundo vector; ou iv) proporcionada(s) à célula como uma proteína; e d) seleccionar células compreendendo uma cópia integrada do referido banco de sequências de ácidos nucleicos variantes.

Em ambos os métodos da invenção, será entendido que a proteina policlonal é normalmente uma que não é naturalmente associada com as células em que a expressão é efectuada. A presente invenção descreve vários métodos em que um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes pode ser introduzido numa linha celular hospedeira a fim de gerar uma colecção de células apropriada como uma linha celular produzindo policlonal. Estes métodos incluem a transfecção em massa de uma colecção de células com o banco, transfecção em semi-massa de aliquotas de células com fracções do banco ou transfecção individual onde as células hospedeiras são transfectadas com membros individuais do banco seguido por reunião dos clones gerados aquando da selecção. Preferivelmente, a presente invenção utiliza células de mamíferos (linhas celulares ou tipos de células) como linha celular hospedeira.

Num aspecto da invenção, os membros individuais de uma proteína policlonal são codificados a partir de pares de segmentos de genes independentes. As proteínas policlonais, onde os membros individuais são compostos de duas cadeias de polipeptideos, incluem formas ligadas a membrana ou solúveis de anticorpos e receptores de células T. Em outras formas de realização da presente invenção, um par de segmentos de genes codificam uma região variável de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos, ou uma região variável de cadeia alfa e cadeia beta de receptores de células T, ou uma cadeia gama de receptores de células T e região variável de cadeia delta. A presente invenção proporciona ainda uma linha celular produzindo policlonal recombinante compreendendo uma colecção de células transfectadas com um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes, em que cada célula na colecção é transfectada com e capaz de expressão de um membro do banco, que codifica um membro distinto de uma proteína policlonal que liga um antígeno particular e que está localizada no mesmo local único no genoma de células individuais na referida colecção, em que a referida sequência de ácido nucleico não é naturalmente associada com a referida célula na colecção. Preferivelmente, a linha celular ter origem numa linha celular de mamíferos como células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO), YB2/0, NIH 3T3, fibroblastos ou células humanas imortalizadas tais como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. No entanto, as células eucarióticas ou procarióticas não-mamíferas, tais como células de planta, células de insecto, células de levedura, bactéria, fungos etc., também podem ser utilizadas.

Também é englobado pela presente invenção um banco de vectores para integração num locus específico compreendendo 9 uma população de sequências de ácidos nucleicos variantes de ocorrência natural, em que cada um dos referidos vectores, compreende 1) uma cópia de uma sequência de ácido nucleico distinta codificando um membro distinto de uma proteína policlonal que liga a um antígeno particular e 2) uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinases.

Num outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo, como um ingrediente activo, um anticorpo policlonal recombinante (ou fragmento do mesmo) ou receptor policlonal de célula T (ou fragmento do mesmo), preferivelmente obtido pelos métodos da invenção. A proteína policlonal recombinante da composição é específica para ou reactiva contra um alvo de doença predeterminada. Tais composições farmacêuticas podem ser usadas para o tratamento, melhora ou prevenção de doenças tais como cancro, infecções, doenças inflamatórias, alergia, asma e outras doenças respiratórias, doenças auto-imunes, funcionamento imunológico deficiente, doenças cardiovasculares, doenças no sistema nervoso central, doenças metabólicas e endócrinas, rejeição a transplantes, ou gravidez indesejada, num mamífero tal como um ser humano, um animal doméstico, ou um animal de estimação.

Definições "Proteína" ou "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia de aminoácidos, sem considerar o comprimento ou modificação pós translacional. Proteínas podem existir como monómeros ou multímeros, compreendendo duas ou mais cadeias de polipeptídeos montadas, fragmentos de proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos, ou peptídeos. 10

Como usado aqui, o termo "proteína policlonal" ou "policlonalidade" refere-se a uma composição de proteínas compreendendo moléculas de proteínas diferentes, mas homólogas, preferivelmente seleccionadas de entre a superfamília de imunoglobulinas. Assim, cada molécula de proteína é homóloga para as outras moléculas da composição, mas também contém um ou mais pedaços da sequência de polipeptídeos variáveis, que é/são caracterizados por diferenças na sequência de aminoácidos entre os membros individuais da proteína policlonal. Exemplos conhecidos de tais proteínas policlonais incluem anticorpos ou moléculas de imunoglobulina, receptores de células T e receptores de células B. Uma proteína policlonal pode consistir dum subconjunto definido de moléculas de proteína, que foi definido por um aspecto comum, como a actividade de ligação compartilhada para um alvo desejado, por exemplo, no caso de um anticorpo policlonal contra o antígeno desejado. O termo "proteína policlonal de interesse" cobre um subconjunto de proteína policlonal definido, que compartilha um aspecto comum, como actividade de ligação para uma marcação desejada, por exemplo, no caso de anticorpos policlonais descritos pela actividade de ligação ou especificidade contra o antígeno alvo, o referido antígeno sendo um ou mais de entre, por exemplo, proteínas separadas, microrganismos, parasitas, tipos de células, alergénios, ou moléculas de hidrato de carbono, ou quaisquer outras estruturas, moléculas, ou substâncias, que podem ser o alvo de ligação de anticorpo específica, ou misturas de referidos antígenos.

Os termos "um membro de uma composição de proteína policlonal recombinante" ou "um membro de uma proteína 11 policlonal recombinante" denotam uma molécula de proteína de uma composição de proteína compreendendo moléculas de proteína diferentes, mas homólogas, onde cada molécula de proteína é homóloga para as outras moléculas da composição, mas também contém um ou mais pedaços de sequência de polipeptídeo variável, que é/são caracterizados por diferenças na sequência de aminoácido entre os membros individuais da proteína policlonal.

Os termos "sequência de polipeptídeo variável" e "região variável" são usados de modo alternado.

Os termos "um membro distinto de uma proteína policlonal recombinante" denota uma molécula de proteína de uma composição de proteína compreendendo moléculas de proteína diferentes, mas homólogas, onde cada molécula de proteína é homóloga para as outras moléculas da composição, mas também contém um ou mais pedaços de sequência de polipeptídeo variável, que é/são caracterizados por diferenças na sequência de aminoácidos entre os membros individuais da proteína policlonal. 0 termo "anticorpo" descreve um componente funcional de soro e é com frequência referido como uma colecção de moléculas (anticorpos ou imunoglobulina) ou como uma molécula (a molécula de anticorpo ou molécula de imunoglobulina). Uma molécula de anticorpo é capaz de ligar a ou reagir com um determinante antigénio específico (o antígeno ou o epítopo antigénico), que pode levar, por sua vez, à indução de mecanismos efectores imunológicos. Uma molécula de anticorpo individual é geralmente considerada como monoespecífica, e uma composição de moléculas de anticorpo pode ser monoclonal (isto é, consistindo em 12 moléculas de anticorpo idênticas) ou policlonal (isto é, consistindo em diferentes moléculas de anticorpo reagindo com o mesmo ou diferentes epitopos no mesmo antigeno ou mesmo em antigenos distintos, diferentes). Cada molécula de anticorpo tem uma estrutura única que permite que ela se ligue especificamente ao seu antigeno correspondente, e todas as moléculas de anticorpo naturais têm a mesma estrutura básica global de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Os anticorpos são também conhecidos colectivamente como imunoglobulinas. Os termos anticorpo ou anticorpos como usados aqui são também pretendidos para incluir anticorpos de cadeia única e quimérica, assim como fragmentos de ligação de anticorpos, como Fab, fragmentos Fv ou fragmentos scFv, assim como formas multiméricas tais como moléculas diméricas IgA ou pentavalentes IgM. O termo "anticorpo policlonal" descreve uma composição de moléculas de anticorpo diferentes que é capaz de ligação ou reacção com vários determinantes antigénicos específicos diferentes no mesmo ou em diferentes antigenos. Geralmente, a variabilidade de um anticorpo policlonal está localizada, como se pensa, nas chamadas regiões variáveis do anticorpo policlonal. No entanto, no contexto da presente invenção, a policlonalidade também pode ser entendida como descrevendo diferenças entre as moléculas de anticorpo individuais residindo nas assim chamadas regiões constantes, por exemplo, como no caso de misturas de anticorpos contendo dois ou mais isotipos de anticorpos tais como isotipos humanos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2, ou os isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, e IgA.

Um "anticorpo policlonal recombinante de interesse" 13 descreve um definido subconjunto de anticorpo policlonal recombinante, que é caracterizado pela capacidade de ligar a um alvo desejado ou conjunto desejado de alvos, referidos alvos sendo, por exemplo, uma proteina separada, um microrganismo, um parasita, uma célula, um alérgeno, ou uma molécula de hidrato de carbono, ou outra estrutura, molécula, ou substância que pode ser o alvo de ligação de anticorpo especifica, ou misturas dos mesmos. 0 termo "imunoglobulina" é comummente usado como uma designação colectiva da mistura de anticorpos encontrados no sangue ou soro, mas também pode ser usado para designar uma mistura de anticorpos derivados de outras fontes. 0 termo "molécula de imunoglobulina" designa uma molécula de anticorpo individual, por exemplo, como sendo uma parte de imunoglobulina, ou parte de qualquer composição de anticorpo monoclonal ou policlonal.

Quando se afirma que um membro de uma proteina policlonal se liga a um antigeno, isto significa aqui uma ligação tendo uma constante de ligação que está abaixo de 1 mM, preferivelmente abaixo de 100 nM, ainda mais preferivelmente abaixo de 10 nM. O termo "um banco de moléculas de ácido nucleico variantes de interesse" é usado para descrever a colecção de moléculas de ácido nucleico, que colectivamente codifica uma "proteina policlonal recombinante de interesse". Quando usado para transfecção, o banco de moléculas de ácido nucleico variante de interesse está contido num banco de vectores de expressão. Este banco tipicamente tem pelo menos 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 ou 106 membros distintos. 14

Como usado aqui os termos "uma cópia de uma sequência de ácido nucleico distinta de interesse" não devem ser tomados literalmente como um pedaço único de ácidos nucleicos correspondendo a um seqmento de gene único, mas ao contrário como uma cópia de todos os segmentos de genes requeridos para produzir todas as subunidades de uma molécula da proteína de interesse, e montados numa molécula de ácido nucleico como, por exemplo, um vector. Alguns exemplos, onde não mais do que um segmento de gene geralmente é requerido para dar surgimento a uma molécula completa de uma proteína de interesse incluem receptores de células B, anticorpos e fragmentos de anticorpos, como Fabs e domínios variáveis, ou receptores de células T. Quando introduzidos na célula, os segmentos de genes, que juntos codificam a proteína de interesse completamente montada, residem no mesmo vector, assim sendo ligados juntos numa sequência de ácido nucleico, possivelmente como elementos transcripcionais separados sob o controlo de diferentes promotores. 0 termo "um gene de interesse" como usado aqui, refere-se a uma sequência de ácido nucleico composta de um ou mais segmentos de genes (genómico ou cDNA) que codifica um membro de uma proteína de interesse. A forma plural "genes de interesse" refere-se a um banco de sequências de ácido nucleico codificando uma proteína policlonal de interesse. 0 termo "GOI" é usado como uma abreviatura de (um) gene(s) de interesse.

Como usado aqui, o termo "vector" refere-se a uma molécula de ácido nucleico em que uma sequência de ácido nucleico pode ser inserida para transporte entre diferentes meios genéticos e/ou para a expressão numa célula hospedeira. Um 15 vector capaz de integrar no genoma de uma célula hospedeira como um locus especifico, predeterminado no genoma é aqui chamado "um vector para integração num locus especifico". Se o vector transporta elementos reguladores para transcrição de sequência de ácido nucleico inserida no vector (pelo menos um promotor apropriado), o vector é aqui chamado um "vector de expressão". Se o vector de expressão é capaz de integrar num locus especifico, predeterminado no genoma da célula hospedeira, a expressão vector pode ser chamada "um vector de expressão para a integração num locus especifico". Se a sequência de ácido nucleico inserida nos vectores acima identificados codifica uma proteina de interesse como aqui definido, os seguintes termos são usados "vector de interesse", "vector de interesse para integração num locus especifico", "vector de expressão de interesse" e "vector de expressão de interesse para integração num locus especifico". 0 termo "um vector codificando isotipo" refere-se a um vector transportando sequências de ácido nucleico codificando um isotipo de anticorpo. No presente relatório descritivo, "vector de fagomídeo" e "vector de fago" são usados de modo alternado. Os termos "plasmideo" e "vector" são usados de modo alternado. A invenção destina-se a incluir estas outras formas de vectores, que servem a funções equivalentes, por exemplo, plasmideos, fagomideos e genomas de virus ou quaisquer moléculas de ácido nucleico capazes de dirigir a produção de uma proteina desejada num hospedeiro apropriado. 0 termo "cada membro do banco de vectores de interesse" é usado para descrever moléculas de vector individuais como uma sequência de ácido nucleico distinta derivada de um banco de vectores de interesse, onde a sequência de ácido 16 nucleico codifica para um membro da proteina policlonal recombinante de interesse. O termo "transferência em massa" é usado para descrever a transferência de sequências de ácido nucleico de interesse de uma população de vectores para outra população de vectores e assim fazendo para cada DNA simultaneamente sem recorrer ao isolamento dos DNAs individuais de interesse. Estas populações de vectores podem ser bancos contendo, por exemplo, regiões variáveis, promotores, lideres ou elementos melhoradores de interesse. Estas sequências podem ser então movimentadas sem anterior isolamento de, por exemplo, um vector de fago para um vector de expressão de mamíferos. Especialmente para sequências de anticorpos, esta técnica assegura que a ligação entre a diversidade de VH e VL não é perdida enquanto se movimentando bancos de, por exemplo, um vector de selecção (por exemplo, um vector de exibição de fagos) para um vector de expressão de mamíferos. Assim, a formação de pares originais de VH e VL é retida. 0 termo "transfecção" é aqui usado como um termo amplo para introduzir DNA estranho numa célula. O termo também significa cobrir outros métodos equivalentes funcionais para a introdução de um DNA estranho numa célula, como, por exemplo, transformação, infecção, transdução ou fusão de uma célula doadora para uma célula receptora. 0 termo "selecção" é usado para descrever um método onde as células adquiriram uma certa característica que permite o isolamento das células que não adquiriram esta característica. Estas características podem ser resistência a um agente citotóxico ou produção de um nutriente essencial, enzima ou cor. 17

Os termos "gene marcador seleccionável", "gene marcador de selecção", "gene de selecção" e "gene marcador" são usados para descrever um gene codificando um marcador seleccionável (por exemplo, um gene conferindo resistência contra alguma droga citotóxica como alguns antibióticos, um gene capaz de produzir um nutriente essencial que pode ser reduzido do meio de crescimento, um gene codificando uma enzima produzindo metabolitos analisáveis ou um gene codificando uma proteina colorida que, por exemplo, pode ser classificada por FACS), que é co-introduzida nas células junto com o(s) gene(s) de interesse. 0 termo "proteina recombinante" é usado para descrevem uma proteina que é expressada de uma linha celular transfectada com um vector de expressão compreendendo a sequência de codificação da proteina.

Como usado aqui, o termo "ligado de modo operativo" refere-se a um segmento sendo ligado a outro segmento quando colocado numa relação funcional com o outro segmento. Por exemplo, DNA codificando uma sequência de sinal é ligado de modo operativo a DNA codificando um polipeptídeo se ele for expressado como um lider que participa na transferência do polipeptídeo para o retículo endoplásmico. Também, um promotor ou melhorador é ligado de modo operativo a uma sequência de codificação se estimular a transcrição da sequência. 0 termo "a maior parte das células individuais" refere-se a uma percentagem das células como mais do que 80%, preferivelmente mais do que 85%, mais preferivelmente 90%, 95%, ou ainda 99% ou maior. 18

Como usado aqui, o termo "genoma" não deve ser tomado literalmente como o complemento normal de cromossomas presentes numa célula, mas também elementos extra-cromossómicos que podem ser introduzidos em e mantidos numa célula. Estes elementos extra-cromossómicos podem incluir, mas não são limitados a mini-cromossomas, YACs (cromossomas artificiais de levedura), MACs (cromossomas artificiais de ratos) ou HACs (cromossomas artificiais humanos). 0 termo "promotor" refere-se a uma região de DNA envolvida na ligação da polimerase de RNA para iniciar a transcrição. 0 termo "promotores cabeça-a-cabeça" refere-se a um par de promotores sendo colocado em proximidade estreita de modo a que a transcrição de dois fragmentos de genes accionados pelos promotores ocorra em direcções opostas. Um promotor cabeça-a-cabeça também pode ser construído com um recheio composto de ácidos nucleicos irrelevantes entre os dois promotores. Este fragmento de recheio pode facilmente conter mais do que 500 nucleótidos.

Um "gene de resistência a antibiótico" é um gene codificando uma proteína que pode superar o efeito inibitório ou tóxico que um antibiótico tem sobre uma célula assegurando a sobrevivência e proliferação continuada de células na presença do antibiótico. O termo "local de entrada de ribossoma interno" ou "IRES" descreve uma estrutura diferente da estrutura de terminação 5' normal num mRNA. Ambas as estruturas podem ser reconhecidas por um ribossoma para iniciar a varredura para um codão AUG para iniciar a tradução. Ao usar uma sequência de promotor e dois AUGs de iniciação, uma primeira e uma 19 segunda sequência de polipeptídeos podem ser traduzidas num único mRNA. Assim, para permitir a co-tradução de uma primeira e uma segunda sequência de polinucleótidos de um único mRNA bi-cistrónico, a primeira e a segunda sequência de polinucleótidos podem ser fundidas de modo transcripcional via uma sequência de ligador incluindo uma sequência IRES que permite a tradução da sequência de polinucleótido a jusante da sequência IRES. Neste caso, uma molécula de RNA bi-cistrónica transcrita será traduzida tanto da extremidade 5' terminal como da sequência IRES interna da molécula de RNA bi-cistrónica para assim produzir tanto o primeiro como o segundo polipeptideo. 0 termo "expressão induzida" é usado para descrever a expressão que requer a interacção de uma molécula indutora ou a liberação de uma molécula co-repressora e uma proteina reguladora para a expressão ocorrer. O termo "expressão constitutiva" refere-se a uma expressão que não é geralmente induzida. 0 termo "recombinase" refere-se a uma enzima que catalisa a recombinação entre dois ou mais locais de recombinação. As recombinases utilizáveis na presente invenção catalisam a recombinação em locais de recombinação específicos que são sequências de ácido nucleico específicas, reconhecidas por uma recombinase particular. 0 termo "atabalhoamento" descreve situações onde dois ou mais membros distintos de uma proteína policlonal compreendida de duas cadeias de polipeptídeos diferentes, por exemplo, de superfamília de imunoglobulinas, são expressados de uma célula individual. Esta situação pode 20 surgir quando a célula individual tem integrado, no genoma, mais do que um par de segmentos de genes, onde cada par de segmentos de genes codifica um membro distinto da proteína policlonal. Em tais situações, as combinações não pretendidas das cadeias de polipeptídeos expressadas dos segmentos dos genes podem ser realizadas. Estas combinações não pretendidas de cadeias de polipeptídeos podem não ter qualquer efeito terapêutico. O termo "atabalhoamento de cadeia VH-VL" é um exemplo do atabalhoamento definido acima. Neste exemplo, os segmentos de genes codificando VH e VL constituem um par de segmentos de genes. O atabalhoamento ocorre quando combinações não pretendidas de polipeptídeos VH e VL são produzidos a partir de uma célula onde dois diferentes pares de segmentos de genes codificando VH e VL são integrados na mesma célula. Esta molécula de anticorpo embaralhada não irá provavelmente reter a especificidade original, e assim pode não ter qualquer efeito terapêutico. O termo "linha celular produzindo policlonal recombinante" refere-se a uma população de células expressando proteínas que são transfectadas com um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes de interesse, como que as células individuais, que juntas constituem a linha celular produzindo policlonal recombinante, transportam somente uma cópia de uma sequência de ácido nucleico distinta de interesse, que codifica um membro da proteína policlonal recombinante de interesse, e que cada cópia é integrada no mesmo local do genoma de cada célula. As células constituindo a linha celular produzindo policlonal recombinante são seleccionadas por sua capacidade de reter a cópia integrada da sequência de ácido nucleico distinta 21 de interesse, por exemplo, por selecção de antibióticos. As células que podem constituir esta linha celular de produção podem ser por exemplo bactérias, fungos, células eucarióticas, como leveduras, células de insectos ou células de mamiferos, especialmente linhagens de célula de mamíferos imortais, tais como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO), NIH 3T3, YB2/0 e células humanas imortalizadas, tais como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. O termo "ponto activo" como em "linha celular de ponto activo" refere-se a um locus preestabelecido do genoma da célula que foi seleccionado ou gerado e caracterizado para uma transcrição altamente eficaz de uma sequência de ácido nucleico integrada de interesse aquando da integração do vector de expressão neste local. 0 termo "desvio" é usado para designar o fenómeno durante a produção de proteina policlonal recombinante, em que a composição por um vector policlonal, linha celular policlonal, ou proteina policlonal altera com o tempo devido a mutações genéticas aleatórias, diferenças na cinética de proliferação entre células individuais, diferenças em niveis de expressão entre diferentes sequências de construção de expressão, ou diferenças na eficácia de clonagem de DNA. 0 termo "RFLP" refere-se a "polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição", um método em que o padrão de gel migratório de fragmentos de molécula de ácido nucleico é analisado após clivagem com enzimas de restrição. 22 0 termo "HDS" refere-se a um método de triagem de alta densidade onde muitas moléculas discretas são testadas em paralelo em membranas de modo que números elevados de compostos de teste são triados para uma dada actividade simultaneamente.

Como usado aqui, "TaqMan PCR" refere-se a um teste PCR baseado no sistema TaqMan descrito por Holland, P. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 7276 - 7280 (1991). O termo "5' UTR" refere-se a uma região não traduzida 5' do mRNA. O termo "Pfu PCR" refere-se a uma reacção PCR realizada usando uma Pfu DNA polimerase (isolado de Pyrococcus furiosus), que é utilizada porque tem a maior fidelidade de entre as polimerases termo-estáveis conhecidas.

Abreviações: "CMV" = Citomegalovirus (humano). "MSPSV" = virus de sarcoma mieloproliferativo, "AdMLP" = Promotor tardio principal de adenovirus. SV40 poli A = sequência de sinal poli A de virus de simio 40. GFP = proteínas fluorescentes verdes. PVDF = difluoreto de polivinilideno. TcR = receptor de células T. ELISA = ensaio de imunoabsorção enzimática. LTR = repetição terminal longa.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: representação esquemática de um vector de expressão "promotor cabeça-a-cabeça" compreendendo os seguintes elementos: Amp pro = um promotor permitindo a expressão do gene de resistência à ampicilina. Amp = gene de resistência à ampicilina. Origem pUC = uma origem pUC de 23 replicação. Locais de enzima de restrição: Not I e EcoRI. Promotor A / promotor B = cassete de promotor cabeça-a-cabeça incluindo sequências de lider (por exemplo, CMV/ MPSV) . V pesado = sequência codificando para a cadeia pesada variável de um GOI. Cadeia pesada C = sequências codificando para a cadeia pesada constante (por exemplo, as sequências para cadeia pesada constante IgG2B ou IgGl de rato) . R-B-globina pA = sequência poli A de β-globina de coelho. bGH poli A = sequência poli A de hormona de crescimento bovino. V Kappa = sequência codificando para kappa variável de um GOI. Cadeia Kappa C = sequência codificando para a cadeia kappa constante. Local FRT = um local de recombinação FRT. Higromicina = gene para resistência à higromicina. Poli A SV40 = sequência de sinal poli A.

Figura 2: Representação esquemática de um vector de expressão para expressão unidireccional compreendendo os seguintes elementos: Amp pro = um promotor permitindo a expressão do gene de resistência à ampicilina. Amp = gene de resistência à ampicilina. Ori pUC = uma origem pUC de replicação. Promotor A = um promotor de mamifero incluindo sequências lider (por exemplo, AdMLP). V pesado = sequência codificando para a cadeia pesada variável de um GOI. Cadeia pesada C = sequências codificando para a cadeia pesada constante (por exemplo, as sequências para cadeia pesada constante IgGl de rato) . hGH poli A = sequência poli A de hormona de crescimento humano. bGH poli A = sequência poli A de hormona de crescimento bovino. V Kappa = sequência codificando para cadeia leve de kappa variável de um GOI. Kappa C = sequência codificando para a cadeia kappa constante. FRT = um local de recombinação FRT. Higromicina = gene para resistência à higromicina. Poli A SV40 = 24 sequência de sinal poli A. As sequências de hGH poli A e promotor A podem ser substituídas por uma estrutura IRES.

Figura 3: Diagrama de fluxos descrevendo a geração de uma linha celular produzindo policlonal recombinante e a produção de uma proteina policlonal recombinante. 1) ilustra uma estratégia de transfecção em massa; 2) ilustram uma estratégia de transfecção em semi-massa, e 3) ilustra uma estratégia de transfecção individual. A) ilustra o banco de vectores (linhas horizontais), as cabeças de seta ilustram o agrupamento dos vectores. Na estratégia 1, os vectores são agrupados em massa, na estratégia 2, eles são agrupados em menores fracções (semi-massa), enquanto na estratégia 3, eles são mantidos separados uns dos outros (indivíduo). B) ilustra a transfecção, onde o número de tubos depende do agrupamento de vectores que constituem o banco. C) ilustra a selecção de células que tem especificamente no local integrado um GOI no genoma da célula hospedeira, D) ilustra a geração de uma carga de banco GOI policlonal, onde as células seleccionadas constituindo o banco integrado são armazenadas num congelador. É opcional depositar no banco clones individuais ou reunir os clones. E) ilustra o começo da fase de produção, onde os clones da carga são descongelados (ou individualmente, a partir de fracções menores ou de uma poça), e adaptados para crescer em suspensão. A adaptação do meio isento de soro pode ser realizada após a etapa de selecção ou nesta etapa. F) ilustra a etapa na produção onde a linha celular policlonal é propagada para semeaura de um maior bio-reactor (etapas de semeadura intermediária são uma opção, apesar de não ilustrada). Na estratégia 2, e 3, esta é a etapa onde a carga de clone de células policlonais não mais é mantida como clones individuais ou 25 fracções de semi-massas, mas reunida numa colecção de células, formando uma linha celular produzindo policlonal recombinante. G) ilustra a produção final obtida da produção do bio-reactor. Após a fase de produção, a composição de proteína policlonal é colhida para purificação e caracterização do produto.

Figura 4: Diagrama de fluxos ilustrando a geração de um vector de expressão de mamíferos. (A) Uma representação esquemática de um vector de fagomídeo, pSymvClO, que transporta uma sequência codificando um membro do GOI. P tac e p lacZ = cassete de promotor cabeça-a-cabeça bacteriano. V kappa = sequência codificando uma cadeia leve kappa variável de um GOI. Cadeia Kappa C = sequência codificando para a cadeia leve kappa constante de rato. V pesada = uma sequência codificação uma cadeia pesada variável de um GOI. Cadeia pesada C = sequência codificando para o domínio CHI de cadeia pesada constante. Locais de enzima de restrição: EcoRI, Notl, Saci e Xhol. cpIII = proteína de fago III. Amp pro = um promotor permitindo a expressão do gene de resistência à ampicilina. Amp = um gene de resistência à ampicilina. pUC Ori = uma origem pUC de replicação.

Etapa 1: por digestão de restrição com Saci e Xhol, a cassete de promotor bacteriano pode ser excisado de pSymvclO e por ligação, substituído com uma cassete de promotor de mamíferos (B) que também foi preparado por digestão de restrição com Saci e Xhol. (c) Representação esquemática de um vector de fagomídeo, pSymvC12, que transporta sequências do GOI, após a troca de 26 promotor com um cassete de promotor cabeça-a-cabeça bacteriano. Promotor A / Promotor B = cassete de promotor cabeça-a-cabeça de escolha (por exemplo, CMV/ MPSV). V kappa = sequência codificando uma cadeia leve kappa variável de um GOI. Cadeia Kappa C = sequência codificando para a cadeia leve kappa constante de rato. V pesada = uma sequência codificação uma cadeia pesada variável de um GOI. Cadeia pesada C = sequência codificando para o domínio CHI de cadeia pesada constante. Locais de enzima de restrição: Notl, Saci, Xhol e EcoRI. cpIII = proteína de fago III. Amp pro = um promotor permitindo a expressão do gene de resistência à ampicilina. Amp = um gene de resistência à ampicilina. pUC Ori = uma origem pUC de replicação.

Etapa 2: por digestão de restrição com pSymvcl2 com EcoRI e Notl, um fragmento de ácido nucleico contendo o todo do cassete de promotor, kappa, e pesada V, podem ser excisados de pSymvcl2 e ligados num vector codificando isotipo, por exemplo, pSymvc20, que foi preparado também por digestão de restrição com EcoRI e Notl, assim gerando o vector de expressão de mamífero pSymvc21 (E). (E) Representação esquemática de um vector de expressão de mamíferos, pSymvc21, com as regiões kappa e pesada variável de GOI, para a expressão de anticorpo. Este vector de expressão de mamíferos compreende os seguintes elementos: Amp pro = um promotor permitindo a expressão do gene de resistência à ampicilina. Amp = gene de resistência à ampicilina. Origem pUC = uma origem pUC de replicação. Locais de enzima de restrição: Notl e EcoRI. Promotor A / promotor B = cassete de promotor cabeça-a-cabeça de escolha, (por exemplo, CMV/MPSV). V kappa = sequência de kappa V codificando para a cadeia leve kappa variável de um 27 GOI. Cadeia kappa C = sequência codificando para a cadeia leve kappa constante de mamífero (por exemplo, uma cadeia kappa constante de rato). Pesada V = sequência pesada V codificando para uma cadeia pesada variável de um GOI. Cadeia pesada C = sequências codificando para uma cadeia pesada constante de mamíferos (por exemplo as sequências para cadeia pesada constante IgGl ou IgG2B de rato) . R-B-globina pA = sequência poli A de β-globina de coelho. bGH poli A = sequência poli A de hormona de crescimento bovino. Local FRT = um local de recombinação FRT. Higromicina = gene para resistência a higromicina. Poli A SV40 sequência de sinal poli A.

Naturalmente, a ordem das etapas 1 e 2 pode ser revertida de modo a que um fragmento de pSymvclO contendo a totalidade da cassete de promotor bacteriano kappa e pesada V podem ser excisadas de pSymvclO usando digestão de restrição EcoRI e NotI, que podem ser então ligados num vector codificando isotipo, por exemplo, pSymvc20. A troca de promotor pode ser então realizada em pSymvc20 por digesto de restrição usando Saci e Xhol e ligação com um fragmento de cassete de promotor de mamífero digerido com Saci + Xhol, por exemplo, como na figura 4B.

Figura 5: Histograma mostrando a distribuição de genótipos em células TG1 transformadas com preparação de plasmideo 1. Em 223-228, fazer referência aos vectores com promotores bacterianos codificando anti32-microglobulina (antiB2M), fosfato antialcalino (antiAP), antiovalbumina (antiOVA), antifactor VIII (antiFVIII), antilisozima (antiLYS), antihaptoglobina (antiHAP), respectivamente. Em 223-228 são vectores do tipo pSymvclO. 0 número de genótipos individuais parecendo-se pelo padrão de fragmento 28 determinado por RFLP corresponde ao número de colónias individuais de entre o número total de colónias tomadas.

Figura 6: Histograma mostrando a distribuição de genótipos em células TG1 transformadas com preparação de plasmideo 2. Em 229-234 fazem referência a vectores com promotores de mamíferos (CMV/MPSV) codificando antiP2-microglobulina (antiB2M), fosfato antialcalino (antiAP), antiovalbumina (antiOVA), antifactor VIII (antiFVIII), antilisozima (antiLYS), antihaptoglobina (antiHAP), respectivamente. Em 229-234 são vectores do tipo pSymvcl2. O número de clones representa o número de clones observados que se parecem com o padrão de sequência determinado por RFLP deste tipo Em (uma análise de sequência completa não foi realizada).

Figura 7: Histograma mostrando a distribuição de genótipos em células TG1 transformadas com preparação de plasmideo 3. Em 235-240 fazem referência a um vector de expressão de mamífero IgGl de rato (incluindo um sinal poli A de β-globina de coelho) e codificando antiP2-microglobulina (antiB2M), fosfato antialcalino (antiAP), antiovalbumina (antiOVA), antifactor VIII (antiFVIII), antilisozima (antiLYS), antihaptoglobina (antiHAP), respectivamente. Em 235-240 são vectores do tipo pSymvc21. O número de clones representa o número de clones observados que se parecem com o padrão de sequência determinado por RFLP deste tipo Em (uma análise de sequência completa não foi realizada).

Figura 8: Histograma mostrando a distribuição de genótipos em células TG1 transformadas com preparação de plasmideo de dupla digestão /ligação (transferência em massa no vector de expressão de mamíferos sem amplificação de DNA em E. coli após a etapa 1 da preparação de plasmídeos). 29

Figura 9: Histogramas mostrando a distribuição de genótipos em células CHO-Flp-In transfectadas com uma mistura de vectores de expressão de mamíferos codificando os seis genes de interesse de A) dia 16 e B) dia 34 após a transfecção.

Figura 10: ELISA específico para antígeno de sobrenadantes derivados de CHO-Flp-In células 34 dias após a transfecção em massa com uma mistura de vectores de expressão codificando os seis genes de interesse.

Figura 11: ELISA de revestimento anti-kappa de sobrenadantes derivados de poças de células CHO-Flp-In 34 dias após a transfecção ou com um vector de expressão único codificando um gene de interesse ou uma mistura de vectores de expressão codificando os seis genes de interesse.

Figura 12: ELISA específico para antígeno quantitativo de sobrenadantes derivados de clone 019 Flp-In de CHO em dia 17, 31, 45, 59 e 73 após a transfecção em massa com uma mistura de vectores de expressão codificando os seis genes de interesse. A, B e C representam três experiências de transfecção diferentes.

Figura 13: ELISA antígeno específico de sobrenadantes derivados de culturas de células Flp-In de CHO em dia 8, 17, 30, 45, 57, 72 e 85 após misturar as linhas celulares CHO Flp-In expressando membros individuais do banco "mini-seis". Os resultados são mostrados como desvio padrão + médio de três experiências independentes. 30

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O sistema de expressão de proteína policlonal recombinante A presente invenção proporciona métodos para a produção consistente de proteinas policlonais recombinantes que são preferivelmente seleccionadas de entre a superfamilia de imunoglobulinas, uma familia de proteinas com dominios semelhantes a imunoglobulina. A maior parte dos membros está envolvida em eventos de reconhecimento de superfície celular. A homologia da sequência sugere que anticorpos, receptores de células T, moléculas MHC, algumas moléculas de adesão celular e receptores de citocinas compartilham uma homologia próxima. Especialmente membros desta familia que contém regiões variáveis são apropriados para a geração de proteinas policlonais recombinantes de acordo com a presente invenção. Estes membros incluem anticorpos, anticorpos ligados à membrana (receptores de células B) , fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos de cadeia única Fv (scFv), receptores de células T (TcRs), TcRs solúveis, fragmentos de domínio de TcR variáveis, fragmentos de domínio de TcR variáveis ligados por um ligador de polipeptídeos ou outro anticorpo ou fragmentos derivados de TR. Em particular, é contemplado que a presente invenção irá abrir a possibilidade de uma produção em larga escala e a produção de uma nova classe de agentes terapêuticos compreendendo anticorpos policlonais terapêuticos recombinantes ou TcRs.

Uma das vantagens principais do método de produção da presente invenção é que todos os membros constituindo a proteína policlonal recombinante podem ser produzidos entre um e aproximadamente 10 bio-reactores ou equivalentes dos 31 mesmos. Além disso, a composição de proteína policlonal recombinante pode ser purificada do reactor como uma preparação única sem precisar separar os membros individuais constituindo a proteína policlonal recombinante durante o processo. Em contraste, caso se deseje imitar uma composição de anticorpo policlonal recombinante por mistura de anticorpos monoclonais purificados (como, por exemplo, proposto em WO 91/16074), isto iria requerer separar a produção num bio-reactor, de cada anticorpo a ser incluído na composição e mais provavelmente os anticorpos podem ser também purificados individualmente. Tal produção de uma mistura monoclonal seria muita onerosa, e consumidora de tempo e espaço em comparação com o método de produção de um anticorpo policlonal recombinante ou outras proteínas policlonais como aqui descrito. Assim, o método como descrito no documento WO 91/16074 iria resultar naturalmente num limite prático ao número de anticorpos monoclonais que seriam incluídos em tal mistura, mais provavelmente abaixo de 10, enquanto a tecnologia, como descrita no presente, geralmente pode produzir um anticorpo policlonal com tantos membros individuais como desejado. A fim de obter uma expressão previsível de uma proteína policlonal recombinante a partir de uma linha celular produzindo policlonal recombinante, as propriedades reguladoras do local de integração genómica seria razoavelmente bem entendidos.

As técnicas de transfecção convencional e as de expressão de proteína recombinante usando integração aleatória são indesejáveis para a produção de uma proteína policlonal recombinante, porque a natureza aleatória do processo irá levar o número e posições das sequências de ácido nucleico 32 integradas a variar de célula a célula. Assim, se a proteína policlonal recombinante for produzida por tais protocolos tradicionais, é provável resultar numa cultura de células heterogénea com variáveis taxas de expressão de membros individuais da proteina policlonal, e uma instabilidade genética devido a efeitos posicionais do DNA integrado. Isto irá resultar mais provavelmente numa expressão desviada dos membros constituindo a proteina policlonal. A introdução num local genómico predefinido é assim desejável, e isto pode em principio ser obtido por recombinação homóloga. No entanto, devido à dominância de eventos de recombinação ilegítimos, a recombinação homóloga é muito ineficaz.

Além disso, quando a proteina policlonal é um anticorpo ou receptor de células (TcR), outro problema surge com o uso de protocolos de transfecção convencionais resultando em integração aleatória. Os anticorpos e TcRs são codificados de pares de segmentos de genes independentes, as sequências codificando cadeia leve e pesada para anticorpos e as sequências codificando cadeias alfa e beta ou delta e gama para TcRs. Os produtos de polipeptideos destes segmentos de gene tornam-se covalentemente ligados durante o processamento intracelular da molécula de anticorpo ou TcR. A tecnologia de transfecção convencional resultando em integração aleatória leva à introdução de várias cópias de diferentes cadeias pesada e leve ou cadeias alfa e beta na mesma célula, que resulta em combinações aleatórias de cadeias pesadas e leves, assim chamado atabalhoamento de cadeia VH-VL ou atabalhoamento de cadeia alfa-beta. Consequentemente, isto deteriora o desempenho dos 33 anticorpos expressados ou TcRs causando perda de afinidade e/ou especificidade, a possivel ocorrência de novas especificidades e/ou reduzida actividade especifica.

Para superar estes problemas, o sistema de expressão da presente invenção usa integração num locus especifico no genoma das células hospedeiras individuais. 0 sistema da presente invenção assegura que um banco de vectores de interesse compreendendo as sequências de ácidos nucleicos variantes de interesse pode ser inserida numa localização cromossómica pré-caracterizada por um procedimento de troca de cassete mediado por recombinases, assim gerando uma linha celular, em que as células individuais expressam um membro distinto único da proteina policlonal recombinante de interesse. Como descrito abaixo, as integrações múltiplas podem ocorrer em algumas das células constituindo a linha celular produzindo policlonal recombinante. Isto, no entanto, não é considerado como colocando um problema desde que a maior parte das células individuais expresse um membro distinto único da proteina policlonal recombinante.

Recombinases tais como Cre, Flp, beta-recombinase, Gin, Pin, PinB, PinD, R/RS, lambda integrase, ou fago <I>C31 integrase podem ser usados. As recombinases apropriadas para integração no local cromossómico podem ser proporcionadas (i) por expressão do próprio genoma da célula em que a referida sequência de ácido nucleico é introduzida, (ii) ao ser codificado de modo operativo pela sequência de ácido nucleico inserida na célula, (iii) através da expressão de uma segunda molécula de ácido nucleico, ou (iv) como uma proteina. Numa forma de realização preferida, a sequência de ácido nucleico variante contida no vector de interesse é integrada num locus que medeia a transcrição de alto nivel e 34 expressão da sequência de ácido nucleico de interesse, um assim chamado "ponto activo". A linha celular hospedeira é preferivelmente uma linha celular de mamiferos compreendendo aqueles tipicamente usados para expressão de proteína bio-farmacêutica, por exemplo, células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO), YB2/0, NIH 3T3, e células humanas imortalizadas, como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. Na presente invenção foram usadas as células CHO. No entanto, um versado na técnica seria facilmente capaz de substituir as células CHO por outras células de mamíferos, como descrito, ou mesmo utilizar outros tipos de células, incluindo células de plantas, células de leveduras, células de insectos, fungos e bactérias. Assim, a escolha do tipo de células não é destinada a ser limitativa à invenção. Numa forma de realização preferida, as células de mamíferos contendo um ponto activo pré-caracterizado, mediando níveis de expressão elevados da proteína policlonal recombinante de interesse, são usadas para a produção.

Numa outra forma de realização da presente invenção, as sequências de ácidos nucleicos variantes de interesse são integradas num modo específico para o local, usando o mesmo local de integração de cromossoma nas células hospedeiras. Esta incorporação num único local específico minimiza os efeitos posicionais de outra forma vistos com a integração aleatória ou integração em locais múltiplos num genoma. Especialmente, quando expressando proteínas policlonais compostas de mais do que uma cadeia de polipeptídeo, é ainda relevante ter um local único, em que a integração num locus específico ocorre no genoma. Isto é devido ao facto de que 35 uma única célula expressa mais do que um integrante, assim provavelmente ocorrendo o atabalhoamento entre as subunidades.

Num sistema locus de integração especifico, as células hospedeiras individuais estão expressando a mesma estrutura de proteína global além das diferenças observadas na região variável da proteína policlonal recombinante de interesse, por exemplo, a região de ligação a antígeno de anticorpos ou TcRs. Assim, a maior parte das células dentro desta reunião de células deve demonstrar características similares com relação à produtividade e estabilidade genética e, assim, esta tecnologia oferece a possibilidade de uma produção controlada de uma proteína policlonal recombinante, por exemplo, um anticorpo policlonal recombinante ou TcRs . A proteína policlonal recombinante da presente invenção destina-se a cobrir uma composição de proteína compreendendo moléculas de proteína diferentes, porém homólogas, que são naturalmente variáveis, significando que, em forma de realizações preferidas, o banco de ácidos nucleicos variantes compreende uma diversidade de ocorrência natural. Assim, cada molécula de proteína é homóloga as outras moléculas da composição, mas também contém um ou mais pedaços de sequência de polipeptídeo variável, que é/são caracterizado/s por diferenças na sequência de aminoácidos entre os membros individuais da proteína policlonal. As diferenças na(s) sequência (s) de aminoácido que constituem a sequência de polipeptídeo variável podem ser pequenas como de um aminoácido. Preferivelmente, as diferenças na sequência de aminoácidos constituem mais de um aminoácido. 36

Geralmente, a variabilidade natural de um anticorpo policlonal ou TcR é considerada como estando localizada nas assim chamadas regiões ou regiões V variáveis das cadeias de polipeptideos.

Num aspecto da presente invenção os membros individuais numa proteína policlonal compreendem as regiões variáveis gue são de aproximadamente 80 a 12 0 aminoácidos de comprimento. As regiões variáveis podem conter domínios hipervariáveis, por exemplo, regiões de determinação da complementaridade (CDR).

Em TcRs de ocorrência natural, existem guatro CDRs em cada região variável. Em anticorpos de ocorrência natural, existem três CDRs na cadeia pesada e três CDRs na cadeia leve.

Num aspecto adicional da presente invenção, as regiões variáveis dos membros individuais de uma proteína policlonal contêm pelo menos um domínio hipervariável gue tem entre 1 e 26 aminoácidos de comprimento, preferivelmente entre 4 e 16 aminoácidos de comprimento. Este domínio hipervariável pode corresponder a uma região CDR3. Para anticorpos, cada região variável constitui preferivelmente três domínios hipervariáveis. Estes podem corresponder a CDR1, CDR2 e CDR3. Para TcRs, cada região variável constitui preferivelmente guatro domínios hipervariáveis. Estes podem corresponder a CDR1, CDR2, CDR3 e CDR4. Os domínios hipervariáveis podem sozinhos constituir as seguências variáveis dentro de uma região variável de uma proteína policlonal recombinante da presente invenção. 37

No contexto da presente invenção, a variabilidade na sequência de polipeptideos (a policlonalidade) também pode ser entendida para descrever diferenças entre as moléculas de anticorpo individuais residindo em assim chamadas regiões constantes ou regiões C das cadeias de polipeptideo de anticorpo, por exemplo, como no caso de misturas de anticorpos contendo dois ou mais diferentes isotipos de anticorpo, como os isotipos humanos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2, ou os isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, e IgA. Assim, um anticorpo policlonal recombinante pode compreender moléculas de anticorpo que são caracterizadas por sequências diferentes entre as moléculas de anticorpo individuais na região variável (região V) ou na região constante (região C) ou ambas. A fim de proporcionar sequências de ácidos nucleicos variantes que codificam proteínas que ligam um antigeno particular, vários métodos conhecidos na técnica podem ser usados. Tipicamente, a invenção irá beneficiar do uso de um procedimento de triagem que permite a identificação e/ou isolamento dos ácidos nucleicos que codificam proteína que liga a um antigeno particular. Vários destes métodos incluem a chamada etapa de biopanning, conhecida a partir de tecnologias como exibição de fagos (Kang, A. S. et al. 1991. Proc Natl Acad Sei USA 88, 4363 - 4366), exibição de ribossomas (Schaffitzel, C. et al. 1999. J. Immunol. Methods 231, 119 - 135), exibição de DNA (Cull, M. G. et al. 1992. Proc Natl Acad Sei USA 89, 1865 - 1869), exibição de peptídeo-RNA (Roberts, R. W., Szostak, J. W., 1997. Proc Natl Acad Sei USA 94, 12297 - 12302), exibição de covalentes (WO 98/37186), exibição de superfície bacteriana (Fuchs, P. et al. 1991. Biotechnology 9, 1369 -1372), exibição de superfície de levedura (Boder, E. T., 38

Wittrup, K. D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553 - 557) e exibição de virus eucarióticos (Grabherr, R., Ernst, W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185 - 192), métodos que são todos conhecidos na técnica e são todos auxiliares interessantes na prática da presente invenção. FACS e classificação de contas magnéticas também são aplicáveis para fins de enriquecimento (panning) usando antigeno rotulado. Os testes de imunodetecção como ELISA (Dreher, M. L. et al. 1991. J. Immunol. Methods 139, 197 - 205) e ELISPOT (Czerkinsky, C. C. et. al. 1983. J Immunol

Methods. 65, 109 - 21) também podem ser usados, após uma etapa de biopanning ou sozinhos.

Uma composição de uma proteína policlonal recombinante de interesse compreende um subconjunto definido de proteínas, que foram definidas por um aspecto comum, como a actividade de ligação compartilhada para uma marcação desejada, por exemplo, no caso de anticorpos policlonais contra o antigeno de marcação desejado. Tipicamente, uma composição de proteína policlonal tem pelo menos 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 ou 106 membros variantes distintos. O número de membros distintos necessários na composição de proteína policlonal irá depender da complexidade da marcação. No caso de anticorpos, a complexidade do(s) antigeno (s) marcado irá influenciar o número de membros variantes distintos necessários na composição de anticorpo policlonal. Com marcações pequenas ou não muito complexas, por exemplo, uma proteína pequena, uma composição de anticorpo policlonal que compreende entre 3 a 100 membros variantes distintos será suficiente, e é preferido que o número de variantes não exceda 90, ou mesmo 80 ou 70. Em muitos casos, o número de variantes distintas não irá exceder 60 ou 50, e prefere-se que o número de variantes se 39 encontre na faixa entre 5 e 40, tal como entre 5 e 30. Enquanto para marcações mais complexas, por exemplo, vírus com proteínas de superfície complexas ou intercambiáveis, ou englobando vários subtipos de vírus, uma composição de anticorpo policlonal que compreende entre 20 a 500 membros variantes distintos será suficiente. As marcações muito complexas, onde o antígeno compreende muitas moléculas diferentes, uma composição de anticorpo policlonal compreendendo entre 50 a 10.000 membros variantes distintos pode ser requerida.

Em mamíferos, existem vários exemplos conhecidos de proteínas policlonais de ocorrência natural ou circulando livremente no sangue, como anticorpos ou moléculas de imunoglobulina, ou presentes sobre as superfícies das células como receptores de células T e receptores de células B. A diversidade destas proteínas policlonais de ocorrência natural é, em alguns mamíferos, obtida por recombinação genética de genes codificando regiões variáveis destas proteínas. Os anticorpos são ainda conhecidos como aumentando a sua diversidade por mutação somática. A presente invenção pode usar estas diversidades naturais por isolamento das sequências responsáveis pela diversidade (por exemplo dos domínios variáveis ou regiões de CDR de moléculas de imunoglobulinas ou TcRs) e gerando um banco a partir dos mesmos. Para proteínas codificadas de dois segmentos de genes independentes, por exemplo, cadeia pesada variável de anticorpo e cadeia leve variável, cadeia TcRa e cadeia β ou cadeia TcRõ e cadeia γ, cada vector no banco irá constituir um par destas sequências de codificação de região variável. A geração de bancos de pares de sequências codificando região variável é bem conhecida dos versados na técnica. 40

Os bancos compreendendo diversidades de ocorrência natural são, por exemplo, bancos combinatórios (formação de pares aleatórios das sequências codificando região variável) assim como bancos de pares cognatos (pares de sequências codificando região variável derivadas da mesma célula). Além disso, os bancos gerados a partir de fragmentos de genes CDR isolados, que são incorporados numa estrutura apropriada (por exemplo Soderlind, E. et al., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852 - 856), tal como um anticorpo ou região variável TcR, são aplicáveis com a presente invenção. Os bancos são preferivelmente triados para obter sub-bancos (bancos de interesse) com uma especificidade desejada.

As diversidades de proteínas também podem ser feitas num modo artificial, por exemplo, sintético ou por mutação. As mutações podem ser aleatórias ou mutações por pontos de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína única, assim gerando uma população policlonal da proteína única. Outro exemplo de geração de bancos de anticorpo artificial é descrito em EP 0 859 841, um método que é baseado na geração de um banco de estruturas de região variável, que podem ser combinadas com outro banco de CDRs.

Numa forma de realização preferida da invenção, a proteína policlonal recombinante é um anticorpo policlonal ou fragmento de anticorpo recombinante.

Numa outra forma de realização preferida da invenção, a proteína policlonal recombinante é um fragmento TcR ou TcR policlonal recombinante.

Além da diversidade obtida pela recombinação somática e genética nas chamadas regiões variáveis, existem diferentes 41 isotipos das imunoglobulinas, que são definidas pela cadeia pesada. Os isotipos principais são IgM, IgG, IgA, IgD, e IgE.

Uma proteína policlonal recombinante da presente invenção pode assim também ser constituída de isotipos diferentes ou, mais preferido, de subclasses diferentes. A policlonalidade das imunoglobulinas pode ocorrer na parte constante ou no domínio variável da molécula de imunoglobulina ou em ambos, na parte constante e no domínio variável. A policlonalidade da chamada região constante, particularmente a cadeia pesada dos anticorpos, é de interesse relativamente à aplicação terapêutica de anticorpos. Os vários isotipos de imunoglobulina têm diferentes funções biológicas (resumidas na tabela 1), que podem ser desejáveis para combinar quando usando anticorpos para tratamento devido a diferentes isotipos de imunoglobulina poderem estar implicados em diferentes aspectos de respostas imunes naturais (Canfield e Morrison 1991. J. Exp. Med. 173, 1483 - 91; Kumpel et al. 2002. Transfus. Clin. Biol. 9, 45. - 53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect. 124, 153 - 162).

Tabela 1: Funções biológicas dos isotipos de imunoglobulina humana 42

Imunoglobulina Humana IgGi igG2 igG3 igG4 IgAi IgA2 IgM IgD IgE Activação de complemento clássica +++ ++ ++++ + - - +++ + - - Activação de complemento alternada + + + +++ + - - + - Transferência placental + ++ + ++ - - - - - Lise bacteriana + + + + +++ +++ + 9 7 Ligação de macrófagos /outros fagócitos + - + + + + - - - Ligação de células tronco / basófilos - - - - - - - - - Reactividade de proteína A estafilococo + + - + - - - - -

Uma outra forma de realização da presente invenção é uma linha celular produzindo policlonal recombinante, compreendendo uma colecção de células transfectadas com um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes, em que cada célula na colecção é transfectada com e capaz de expressão de um membro do banco, que codifica um membro distinto de uma proteína policlonal que liga a um antígeno particular e que está localizada no mesmo local único no genoma de células individuais na referida colecção, em que referida sequência de ácido nucleico não é naturalmente associada com a referida célula na colecção.

Numa forma de realização adicional da acima referida forma de realização, as sequências de ácidos nucleicos variantes codificando a proteína policlonal (preferivelmente da superfamília de imunoglobulinas) são todas derivadas de sequências de ocorrência natural, por exemplo, isoladas de um doador. 43

As composições de células que contêm os ácidos nucleicos variantes localizados num único local especifico no genoma dentro de cada célula foram descritas no documento WO 02/44361. Este documento descreve o uso de células para identificar moléculas tendo propriedades desejáveis, mas a referência não trata da provisão de um sistema de produção ou da provisão de proteína policlonal caracterizada por uma ligação específica a um antígeno.

Diversidade Clonal

Uma das características duma proteína policlonal é que ela é constituída por um número de moléculas de proteína individuais em que cada molécula de proteína é homóloga às outras moléculas da proteína policlonal mas também tem uma variabilidade que é caracterizada por diferenças na sequência de aminoácido entre os membros individuais da proteína policlonal. Preferivelmente, as diferenças são confinadas a áreas distintas da estrutura global da proteína policlonal. Estas áreas são, por exemplo, a região variável de um anticorpo ou TcR e possivelmente ainda confinadas às regiões CDR nestas áreas. Esta variabilidade também pode ser descrita como uma diversidade, que pode ser identificada tanto ao nível do ácido nucleico como ao nível funcional da proteína, por exemplo, especificidade e diferenças de afinidade para um marcador. A diversidade clonal da linha celular pode ser analisada por RFLP (ou sequenciamento de produtos (RT) - PCR) em clones isolados de uma poça de células expressando uma proteína policlonal recombinante. A diversidade também pode ser analisada por testes funcionais (por exemplo, ELISA), 44 na proteína policlonal produzida pela linha celular. 0 desvio clonal (isto é, uma mudança gradual no teor dos anticorpos individuais constituindo o anticorpo policlonal), se existente, pode ser estimado por comparação da diversidade clonal do banco inicial, usado para transfecção, com a diversidade encontrada na poça de células (linha celular) expressando a proteína policlonal recombinante. A diversidade clonal de uma proteína policlonal expressada de uma linha celular pode ser avaliada como a cobertura de marcador pela proteína policlonal. Neste caso, suficiente diversidade é considerada como sendo adquirida quando aproximadamente 25-100% das moléculas alvo desejadas são ligadas pela proteína policlonal. Por exemplo no caso de um anticorpo policlonal, a ligação de anticorpo a pelo menos 25% dos epítopos não-idênticos sobre a superfície de um antígeno alvo proporciona uma diversidade suficiente na composição. Preferivelmente, a diversidade clonal pela cobertura alvo é pelo menos 50%, e ainda mais preferível pelo menos 75%. Para anticorpos, esta cobertura alvo pode ser avaliada, por exemplo, por mapeamento de epítopo.

Alternativamente, a diversidade clonal pode ser avaliada como a distribuição de membros individuais da composição policlonal. Esta distribuição pode ser avaliada como o número total de diferentes membros individuais na composição de proteína policlonal final comparado com o número de diferentes sequências de codificação originalmente introduzidas na linha celular durante a transfecção. Neste caso, uma diversidade suficiente é considerada como sendo adquirida quando pelo menos 50% das 45 sequências de codificação originalmente usadas na transfecção podem ser identificadas como diferentes membros individuais das proteínas policlonais finais e preferivelmente pelo menos 75%. A distribuição de membros individuais da composição policlonal também pode ser avaliada com relação à distribuição mútua de entre os membros individuais. Neste caso, uma diversidade clonal suficiente é considerada como sendo adquirida se nenhum membro único da composição constituir mais do que 75% do número total de membros individuais na composição de proteína policlonal final. Preferivelmente, nenhum membro individual excede mais do que 50%, ainda mais preferido 25% e mais preferido 10% do número total de membros individuais na composição policlonal final. A avaliação da diversidade clonal, com base na distribuição dos membros individuais na composição policlonal, pode ser realizada por análise RFLP, análise de sequência e análise de proteína, como as abordagens descritas abaixo para a caracterização de uma composição policlonal. A diversidade clonal pode ser reduzida como um resultado do desvio clonal que pode surgir a) durante o processo de clonagem, b) como um resultado de variações em proliferação celular, ou c) através do atabalhoamento de integrantes múltiplos. Se tais desvios surgirem, cada uma destas fontes de uma perda de diversidade clonal é facilmente remediada por modificações pequenas aos métodos aqui descritos. A fim de limitar o desvio introduzido por clonagem dos domínios variáveis nos vectores apropriados, a transferência dos genes de interesse de um vector para outro pode ser projectada de modo que o desvio de clonagem 46 é limitado. As técnicas de transferência em massa e uma selecçao cuidadosa da estirpe de E. coli usada para a amplificação podem reduzir o desvio de clonagem. Outra possibilidade consiste em realizar uma transferência individual de cada polinucleótido codificando um membro individual da proteína policlonal, entre vectores da invenção. É possível que variações nas taxas de proliferação celular das células individuais na linha celular podem, durante um período de tempo prolongado, introduzir um desvio na expressão da proteína policlonal recombinante, aumentando ou reduzindo a presença de alguns membros da proteína policlonal recombinante expressada pela linha celular. Uma razão para estas variações nas taxas de proliferação pode ser que a população de células constituindo a linha celular de partida usada para a transfecção inicial seja heterogénea. Sabe-se que células individuais numa linha celular se desenvolvem de modo diferente durante um período de tempo prolongado. Para assegurar um material de partida mais homogéneo, a sub-clonagem da linha celular antes da transfecção com o banco de interesse pode ser realizada usando uma diluição limitativa da linha celular descendo para o nível de célula única e cultivando cada célula única para uma nova população de células (assim chamada sub-clonagem celular por diluição limitativa) . Uma ou mais destas populações de células são então seleccionadas como o material de partida com base em sua proliferação e propriedades de expressão.

Além disso, a pressão de selecção usada para assegurar que somente células que receberam integrantes específicos para o local irão sobreviver, pode afectar as taxas de 47 proliferação de células individuais dentro de uma linha celular policlonal. Isto pode ser devido ao favorecimento de células que sofrem algumas mudanças genéticas a fim de adaptar à pressão de selecção. Assim, a escolha do marcador de selecção também pode influenciar o desvio induzido por taxa de proliferação. Se isto ocorrer, diferentes marcadores de selecção podem ser testados. Em casos onde a selecção é baseada numa substância que é tóxica para as células, a concentração óptima deve ser testada com cuidado, assim como se a selecção for necessária em todo o período de produção ou somente na fase inicial.

Uma abordagem adicional para assegurar uma população de células bem definida consiste em usar classificação de células activada por fluorescência (FACS) após a transfecção e procedimentos de selecção. Os anticorpos rotulados por fluorescência podem ser usados para enriquecer células altamente produtivas derivadas de uma poça de células transfectadas com construções de IgG (Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141 - 155). Este método também pode ser usado para classificar células expressando níveis similares de imunoglobulina, assim criando uma população de células homogénea com relação à produtividade. Do mesmo modo, por uso de rotulação com o corante fluorescente de células éster succinimidílico de diacetato de 5,6-carboxifluoresceína (CFSE) mostrando taxas de proliferação similares podem ser seleccionados por métodos FACS.

Mesmo que se desenvolva um desvio induzido por taxa de proliferação, a perda ou super-representação de membros individuais pode não ser necessariamente crítica, dependendo das exigências de diversidade do produto de 48 proteína policlonal recombinante final e a estabilidade da diversidade com o tempo.

Em integrantes únicos específicos para o local, as células irão somente diferir na sequência das regiões variáveis dos anticorpos a serem expressados. Assim, os efeitos celulares diferentes impostos por variação no local de integração e elementos reguladores de genes são eliminados e têm efeitos mínimos sobre a taxa de proliferação celular. Nem o atabalhoamento nem as integrações múltiplas são prováveis de causar problemas na taxa de proliferação da linha celular produtora, porque estes são eventos raros. As integrações aleatórias geralmente ocorrem com uma eficiência de aproximadamente IO”5, enquanto a integração num locus específico ocorre com uma eficiência de aproximadamente 10”3. Se integrações múltiplas devem colocar inesperadamente um problema, uma alternativa é repetir a transfecção com o banco de vectores de interesse, devido à possibilidade que o evento ocorrerá novamente é muito pequena, como descrito acima. As alternativas adicionais são descritas no exemplo 3 abaixo.

Outro método de controlo de desvio clonal indesejado é realizar a transfecção com o banco completo de vectores de interesse em várias sub-poças ou dividir a poça de células num ponto de tempo anterior após transfecção em sub-poças. Neste ponto, o desvio não deveria tornar-se significante e poderia ser estatisticamente possível adquirir sub-poças que faltam clones com uma vantagem de proliferação indesejada. A exclusão resultante de clones indesejados precisa estar de acordo com as exigências de diversidade no produto de proteína policlonal recombinante final. Considerando as estatísticas, a transfecção em massa de um 49 grande número de células também constitui um modo para superar um desvio clonal indesejado. Nesta abordagem, uma linha celular hospedeira é transfectada em massa com o banco de sequências de ácidos nucleicos variantes. Este banco constitui muitas cópias de cada membro distinto do banco. Estas cópias devem ser preferivelmente integradas num grande número de células hospedeiras. Preferivelmente, pelo menos 100, 1.000, 10.000 ou 100.000 células individuais são transfectadas com cópias de membros distintos do banco de sequências de ácidos nucleicos variantes. Assim, se um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes é composto de 1.000 membros distintos que são, cada, integrados em 1.000 células individuais, 106 clones contendo um GOI integrado especificamente no local deve surgir da transfecção. Deste modo, a curva gaussiana de taxas de duplicação de células individuais deve influenciar a população geral somente em graus muito pequenos. Isto irá aumentar a probabilidade de manter a composição clonal constante com o tempo, se uma baixa percentagem das células produtoras demonstrar um crescimento anómalo e/ou propriedades de expressão.

Alternativamente, o banco de vectores de interesse pode ser dividido em fracções contendo aproximadamente 5 a 50 vectores individuais do banco. Preferivelmente, uma fracção do banco constitui 10 a 15 vectores individuais. Cada fracção é então transfectada numa aliquota de células. As aliquotas individuais de células podem então ser seguidas durante um período de tempo para ver se o desvio clonal se desenvolve em qualquer uma das mesmas. Se isto acontecer, estas aliquotas de células podem ser omitidas antes da colecção de células ser reconstituída por reunião das aliquotas restantes de células. Opcionalmente, as aliquotas 50 de células são mantidas separadas em toda a produção, e a composição de anticorpo policlonal é montada por combinação dos produtos de cada alíquota em vez das alíquotas de células antes da produção. O número de poças que podem ser então manipuladas é esperado como estando entre cinco a dez (ver a descrição anterior de anticorpos monoclonais).

Alternativamente, um método de alta produção pode ser implementado em que as células são transfectadas separadamente usando vectores e células com base em clones únicos do banco inicial de vectores de interesse. Isto pode eliminar qualquer desvio de sequência possivel durante a transfecção e integração. Opcionalmente, os transfectantes únicos podem ser genotipados e uma poça completamente diversa de células montada logo antes da produção ou antes, se apropriado. Alternativamente, a transfecção individual de um grande número de células, gerando muitos clones com o mesmo membro distinto do banco de sequências de ácidos nucleicos variantes pode produzir as mesmas vantagens estatísticas descritas para transfecção em massa, quando as células individualmente transfectadas são reunidas antes da produção de proteina policlonal. A célula hospedeira

Uma célula hospedeira apropriada compreende, numa região de seu genoma, um ou mais locais de recombinação apropriados, isto é, sequências de ácido nucleico reconhecíveis por uma ou mais enzimas recombinases. Para ser capaz de seleccionar os integrantes, (isto é, células tendo uma cópia integrada da sequência de ácido nucleico de interesse num local de integração), o local de recombinação é ligado de modo operativo a um primeiro gene de selecção (por exemplo um gene 51 de resistência a antibiótico) situado 3' ao local de recombinação. Além disso, um promotor fraco (por exemplo um promotor prematuro SV40 truncado) e um codão de inicio de transcrição podem estar situados 5' ao local de recombinação que constitui uma parte integrante da região de codificação de marcador de resistência. Assim, o codão de inicio de transcrição inicia a partida da transcrição do gene de selecção na célula hospedeira antes da transfecção com o banco de vectores de expressão codificando a proteína policlonal.

As células hospedeiras para integração num locus específico, como descrito acima, podem ser geradas de qualquer célula que pode integrar DNA em seus cromossomas ou reter elementos extracromossómicos como minicromossomas, YACs (cromossomas artificiais de levedura), MACs (cromossomas artificiais de rato), ou HACs (cromossomas artificiais humanos). MACs e HACs são descritos em detalhes na WO 97/40183, aqui incorporada por referência. As células preferivelmente de mamíferos tal como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0 ou NSO) , fibroblastos tal como NIH 3T3, e células humanas imortalizadas, como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6 são usadas. No entanto, as células eucarióticas ou procarióticas não-mamíferas, como células de plantas, células de insectos, células hospedeiras, fungos, E. coli etc., também podem ser empregadas.

Numa forma de realização da presente invenção, a linha celular que deve ser usada como material de partida é sub-clonada por realização de uma chamada diluição limitadora da linha celular descendo a um nível de célula único, seguido por cultivo de cada célula única a uma nova população de células antes da transfecção com o banco de 52 vectores de interesse. Esta sub-clonagem também pode ser realizada depois no processo de selecção da linha celular correcta, se desejado.

As células hospedeiras para integração num locus especifico podem ser obtidas por transfecção com um plasmídeo de integração aleatória compreendendo um promotor fraco (por exemplo, um promotor prematuro SV40 truncado), um codão de partida de transcrição, um local de recombinação situado 3' ao codão de partida. Preferivelmente, o plasmideo de integração também compreende um gene marcador copulado num primeiro gene de selecção. Um exemplo deste plasmideo de integração é o pFRT/LacZeo2 de Invitrogen (Carlsbad, CA) . 0 gene marcador pode ser usado para avaliar a resistência relativa de expressão no local genómico usado para a inserção de uma sequência de ácido nucleico de interesse. Um gene marcador (por exemplo beta-galactosidase (lacZ) , proteina de fluorescência verde (GFP) ou um marcador de superfície de célula) pode ser ligado ao primeiro gene de selecção numa fusão de genes ou ligado de modo transcripcional por um IRES (local de entrada de ribossoma interno), de modo que ocorre a co-expressão do primeiro gene de selecção e gene marcador. 0 uso de um gene de selecção que estabelece uma pressão de sobrevivência sobre as células (por exemplo, resistência a drogas ou depleção nutricional) combinado com um marcador permitindo a avaliação dos níveis de expressão relativos da linha celular para a linha celular é um método eficaz para assegurar células de elevada produção que mantêm o plasmídeo integrado no interior do genoma. As células com a sequência de recombinação inserida num ponto com uma transcrição particularmente activa irão levar a uma expressão elevada do gene marcador, por exemplo, GFP ou LacZ. Os expressores elevados podem ser seleccionados 53 por classificação de células activadas por fluorescência (FACS) e clonados. Neste ponto, também deve ser analisado se o integrante é um integrante único. Isto pode ser realizado por PCR em tempo real e Southern blotting.

Outro método de avaliação de niveis de expressão relativos das células transfectadas com um plasmideo integrante consiste em realizar uma etapa de integração - excisão adicional sobre as células geradas como descrito acima. Esta poça de células seleccionadas é transfectada novamente, com um plasmideo codificando uma recombinase correspondendo ao local de recombinação de plasmideo de integração e um segundo plasmideo contendo um segundo marcador de selecção sem um codão de partida, cuja região de codificação é precedida por uma sequência de recombinação do mesmo modo correspondendo ao primeiro plasmideo de integração. Este segundo plasmideo também contém a sequência de codificação para uma proteina de marcador de fluorescência (por exemplo, GFP (ou proteínas fluorescentes equivalentes) accionado por um promotor mamífero. A recombinase medeia a integração deste plasmideo no genoma da célula hospedeira onde uma sequência de recombinação similar foi previamente inserida pelo plasmideo de integração. As células com a sequência de recombinação inseridas num ponto com transcrição particularmente activa irão levar a alta expressão da proteína fluorescente. Os expressores elevados são seleccionados por classificação de células activadas por fluorescência (FACS) e clonados. Os clones com expressão consistentemente elevada e contendo uma cópia do plasmideo inserido são transfectados com a recombinase e seleccionados pelo primeiro marcador de selecção, identificando as células onde a segunda sequência de 54 plasmídeo foi removida pela recombinase, levando o primeiro marcador de selecção a trabalhar novamente. Estas células ainda contém a primeira sequência de recombinação inserida num ponto activo transcripcional e podem ser agora usados para a expressão de genes de interesse.

As linhas celulares, que obtêm alta expressão do gene marcador quando da integração de uma cópia única do plasmideo, são usadas para a transfecção com o gene de interesse. 0 local de recombinação na célula hospedeira está preferivelmente localizado num gene ou região de expressão particularmente activa, isto é, numa assim chamado ponto activo. 0 vector para a integração num locus específico

Um vector apropriado compreende um local de recombinação apropriado ligado a um gene de selecção apropriado diferente do gene de selecção usado para a construção da célula hospedeira. Os genes de selecção apropriados para uso em expressão de células de mamíferos incluem, mas não são limitados aos genes permitindo a selecção nutricional, como o gene timidina quinase (TK) , gene glutamina sintetase (GS), gene triptofano sintase (trpB), ou gene histidinol desidrogenese (hisD). Além disso, os marcadores de selecção são genes de resistência antimetabólitos conferindo resistência à droga, como o gene dihidrofolato reductase (dhfr), que podem ser seleccionados com meio deficiente em hipoxantina e timidina e ainda seleccionados com metotrexato, o gene xantina- guanina fosforibosil transferase (gpt), que podem ser seleccionados com ácido micofenólico, o gene neomicina fosfotransferase (neo) que pode ser seleccionado com G418 em células eucarióticas e 55 neomicina ou canamicina em células procarióticas, o gene higromicina B fosfotransferase (hyg, hph, hpt) que pode ser seleccionado para com higromicina, o gene puromicina N-acetil-transferase (pac), que pode ser seleccionado com puromicina ou o gene blasticidina S deaminase (Bsd) que pode ser seleccionado com blasticidina. Finalmente, os genes codificando proteínas que permitem a classificação, por exemplo, por citometria de fluxo também podem ser usados como marcadores de selecção, como proteína de fluorescência verde (GFP) , o receptor de factor de crescimento de nervos (NGFR), ou outras proteínas de membrana ou beta-galactosidase (LacZ).

Em um aspecto da presente invenção, o gene seleccionável não é nem precedido por um promotor nem equipado com um codão de iniciação de tradução. 0 promotor e o codão ATG são proporcionados no local de recombinação específico para local seleccionado. Se este vector for integrado num local diferente do local de recombinação seleccionado no genoma da célula hospedeira, nenhuma expressão deste segundo gene de selecção pode ocorrer devido à falta de promotor e codão de iniciação. Se a integração ocorrer no local de recombinação seleccionado no genoma da célula hospedeira, o segundo gene de selecção é expressado e a expressão do primeiro gene de selecção é perdida. A integração pode, por exemplo, ser realizada usando um assim chamado local FRT (5'-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3' (SEQ ID NO 1) e variantes do mesmo) no genoma e no vector para uma integração num locus específico junto com a recombinase Flp ou mutantes da mesma de Saccharomyces cerevisiae. No entanto, outros sistemas de recombinase podem ser 56 igualmente bem usados, incluindo os de Cre recombinases e uma variedade de locais Iox como IoxP de bacteriófago PI ou variantes ou mutantes do mesmo, por exemplo, lox66, lox71, lox76, lox75, lox43, lox44 e lox511 (C. Gorman e C. Bullock, Curr. Opinion in Biotechnology 2000, 11: 455 -460) ou por uso de integrase de fago Φ C31 ou lambda integrase, que transporta recombinação entre o local attP e o local attB (A. C. Groth et al. PNAS 2000, 97: 5995 -6000). Outros sistemas de recombinase que podem ser usados na presente invenção são, mas não são limitados ao sistema de β-recombinase-six de plasmideo bacteriano pSM19035, o sistema Gin-gix de bacteriófago Mu ou o sistema R-RS de Zygosaccharomyces rouxii.

Uma outra variante para o sistema de recombinação especifico para o local é usar locais de recombinação não-homólogos. Em tal sistema, dois locais de recombinação não-idênticos são introduzidos no genoma do hospedeiro para a geração de locais de marcação específicos. Os locais de recombinação correspondendo aos flanqueando o local alvo também flanqueiam a construção contendo o gene de interesse. Este sistema foi descrito em WO 99/25854, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade. O uso de locais de recombinação não-homólogos foi mostrado como suprimindo a excisão do GOI do cromossoma. Os locais de recombinação não-idênticos podem ser compostos de qualquer um dos locais de recombinação descritos acima desde que as recombinases correspondentes sejam proporcionadas. Por exemplo, locais de recombinação não-idênticos podem consistir de um local FRT e um local FRT mutante utilizando uma recombinase para Flp para integração ou um local FRT e um local IoxP usando Flp e Cre recombinases para a integração. 57

Além disso, um sistema usando dois locais FRT diferentes foi descrito em Verhoeyen et al., Hum. Gene Ther. 2001 12, 933 - 44. Nesta abordagem, o plasmídeo de integração é transferido para as células hospedeiras por infecção retroviral. O plasmideo consiste numa combinação de um gene repórter e um primeiro gene marcador de selecção, assim como os elementos retrovirais requeridos para a infecção. O 3'LTR retroviral contém dois diferentes locais FRT. Um segundo gene marcador de selecção, não-funcional, que falta um promotor e um codão de iniciação de tradução estão localizados 3' a estes locais. Durante o processo de infecção retroviral, a sequência 3' LTR é copiada para o 5' LTR. Isto resulta no flanco do gene repórter e do primeiro gene marcador de selecção por dois diferentes locais de FRT em cada lado. A sequência entre os locais FRT externos pode ser mudada contra um GOI sob o controlo de um promotor forte. A cassete contendo o GOI é flanqueada pelo mesmo conjunto de locais FRT. A reacção é catalisada pela Flp recombinase. No plasmideo de troca transfectado, um elemento IRES e um codão de iniciação de tradução estão localizados ainda a jusante do GOI. Após substituição da cassete integrado, o gene marcador de selecção não-funcional localizado na sequência LTR 3' fora dos locais FRT é activado pelo codão de iniciação de tradução proporcionado pela cassete constituindo o GOI. O estado de troca pode ser ainda enriquecido se um marcador de selecção negativo (por exemplo timidina quinase) estiver presente no vector de integração. O vector de integração também pode ser transferido para as células hospedeiras por transfecção padrão. Neste caso, a cassete de integração é flanqueado por um FRT na extremidade 5' e um local FRT' diferente na extremidade 3'. 58 0 segundo gene marcador de resistência deficiente em ATG está posicionado ainda a jusante do local 3' FRT'. A troca para um GOI prossegue como descrito para o sistema retroviral.

Outro sistema que evita a excisão do GOI após sua integração num locus específico no cromossoma é a Φ C31 integrase, também mencionada acima. Este sistema foi descrito totalmente nos pedidos de patente WO 01/07572 e WO 02/08409, que se incorporam aqui por referência em sua totalidade.

Em um outro aspecto da invenção, o vector para a integração num locus específico do gene de interesse ainda compreende DNA codificando um membro da proteína policlonal recombinante de interesse, opcionalmente precedido por seu próprio promotor de mamífero dirigindo a expressão da proteína. Se um membro da proteína policlonal recombinante de interesse compreender mais do que uma cadeia de proteína, por exemplo, se o membro for um anticorpo ou receptor de células T, o DNA codificando as cadeias da proteína pode ser precedido por seu próprio promotor de mamífero dirigindo altos níveis de expressão (bidireccional ou unidireccional, ver figuras 1 e 2, respectivamente) de cada uma das cadeias. Numa expressão bidireccional, uma configuração de promotor cabeça-a-cabeça no vector de expressão pode ser usada e, para uma expressão unidireccional, dois promotores ou um promotor combinado com, por exemplo, uma sequência IRES, pode ser usado para expressão. As configurações de promotor cabeça-a-cabeça apropriadas são, por exemplo, mas não são limitados a, promotor AdMLP junto com o promotor de metalotioneína-1 de rato em ambas as orientações, o promotor AdMLP junto com o 59 promotor do factor 1 de alongamento em ambas as orientações ou o promotor CMV junto com o promotor MPSV em ambas as orientações.

Uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência lider funcional pode ser incluida no vector de expressão para dirigir o produto de gene ao retículo endoplásmico ou uma localização específica dentro da célula, como uma organela. Um sinal de poliadenilação forte pode estar situado 3' da sequência de DNA codificando proteína. 0 sinal de poliadenilação assegura a terminação e a poliadenilação do transcrito de RNA nascente e está correlacionado com a estabilidade da mensagem. 0 DNA codificando um membro da proteína policlonal recombinante de interesse pode, por exemplo, codificar tanto as cadeias pesadas como leves de um anticorpo ou fragmentos de anticorpo, cada sequência de genes opcionalmente sendo precedida por seus próprios elementos de promotor de mamíferos e/ou seguido por fortes sinais poli A dirigindo uma expressão de alto nível de cada uma das duas cadeias. 0 vector de expressão para a integração num locus específico pode transportar elementos reguladores transcripcionais adicionais, como melhoradores ou UCOE (elementos de abertura de cromatina ubíquos) para aumentada expressão no local de integração. Os intensificadores são sequências de ácido nucleico que interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas em transcrição. 0 UCOE abre cromatina ou mantém cromatina num estado aberto e facilita a expressão reprodutível de um gene ligado de modo operativo (descrito em mais detalhes em WO 00/05393, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade). Quando um ou mais dos elementos reguladores descritos acima são 60 integrados no cromossoma de uma célula hospedeira, eles são chamados elementos reguladores heterólogos.

Estabelecimento de um sistema de expressão para expressão de nível elevado de proteínas

Os métodos para introduzir uma sequência de ácido nucleico numa célula são bem conhecidos dos versados na técnica. Estes métodos tipicamente incluem o uso de um DNA vector para introduzir a sequência de interesse na célula, o genoma ou um elemento extracromossómico. A transfecção de células pode ser obtida por vários métodos bem conhecidos dos versados na técnica, incluindo precipitação de fosfato de cálcio, electroporação, micro-injecção, fusão de lipossomas, fusão de "ghost" RBC, fusão de protoplastos, e outros.

Para a transfecção de uma linha celular hospedeira, um banco de vectores de interesse, em que cada vector compreende somente uma cópia de uma sequência de ácido nucleico codificando um membro de uma proteína policlonal recombinante de interesse, é usado. Este banco de vectores de expressão de interesse codifica colectivamente a proteína policlonal recombinante de interesse. Os vectores apropriados para a integração num locus específico foram descritos na secção anterior. Os vectores individuais constituindo o banco de sequências de ácido nucleico variantes de interesse podem ou ser misturados juntos numa composição única, ou os vectores individuais codificando cada membro do banco podem ser mantidos em composições separadas ou em misturas de aproximadamente 5 a 50 vectores individuais do banco numa composição. 61 A geração de uma linha celular produzindo policlonal recombinante e a produção de uma proteína policlonal recombinante a partir desta linha celular podem ser obtidas por várias estratégias de transfecção e produção diferentes. Estas estratégias são descritas na figura 3.

Um modo consiste em usar um banco de vectores misturados juntos numa única composição para a transfecção de uma linha celular hospedeiras. Este método é chamado transfecção bruta ou transfecção em massa. Geralmente, o projecto do vector e célula hospedeira previamente descrito irá assegurar que uma linha celular policlonal será obtida quando da selecção apropriada. Em tal linha celular, a maior parte das células individuais tem integrado uma cópia de uma molécula de ácido nucleico, codificando um membro distinto de uma proteína policlonal recombinante, a partir de um banco de sequências de ácido nucleico de interesse no genoma. A cópia única da sequência de ácido nucleico é integrada num local específico único do genoma de cada célula na colecção de células, assim gerando uma linha celular policlonal composta de células individuais expressando membros individuais da proteína policlonal de interesse. Uma carga congelada da linha celular policlonal será gerada antes da iniciação da produção de proteína policlonal recombinante.

Outro modo consiste em usar um banco de vectores dividido em fracções, contendo aproximadamente 5 a 50 vectores individuais do banco numa composição, para transfecção. Preferivelmente, uma fracção do banco constitui 10 a 20 vectores individuais. Cada composição é então transfectada numa alíquota de células hospedeiras. Este método é chamado transfecção em semi-massa. O número de alíquotas 62 transfectadas irá depender do tamanho do banco e o número de vectores individuais em cada fracção. Se o banco constituir, por exemplo, 100 membros variantes distintos, que são divididos em fracções contendo 20 membros variantes distintos numa composição, 5 aliquotas de células hospedeiras devem precisar de serem transfectados com uma composição de banco constituindo uma fracção distinta do banco original. As aliquotas de células hospedeiras são seleccionadas para integração num locus especifico. Preferivelmente, as aliquotas distintas são seleccionadas separadamente. No entanto, elas podem ser reunidas antes da selecção. As aliquotas podem ser analisadas para sua diversidade clonal e somente as com uma diversidade suficiente serão usadas para gerar uma carga de banco GOI policlonal. Para obter a linha celular policlonal desejada para produção, as aliquotas podem ser misturadas antes de gerarem a carga de congelamento, imediatamente após terem sido recuperadas da carga ou após um curto tempo de proliferação e adaptação. Opcionalmente, as aliquotas de células são mantidas separadas em toda a produção, e a composição de proteina policlonal é montada por combinação dos produtos de cada alíquota em vez das aliquotas de células antes da produção.

Um terceiro modo, é um método de elevada produção em que as células hospedeiras são transfectadas separadamente usando os vectores individuais constituindo o banco de interesse. Este método é chamado transfecção individual. As células hospedeiras individualmente transfectadas são preferivelmente seleccionadas para integração num locus especifico separadamente. No entanto, elas também podem ser reunidas antes da selecção. Os clones de células individuais gerados quando da selecção podem ser analisados 63 com relação ao tempo de proliferação e padrão de integração e preferivelmente os com taxas de crescimento similares e uma única integração num locus especifico são usados para gerar uma carga de banco GOI policlonal. Os clones de células individuais podem ser misturados para obter a linha celular policlonal desejada antes de gerar a carga, imediatamente após terem sido recuperadas da carga, ou após um curto tempo de proliferação e adaptação. Esta abordagem pode eliminar qualquer desvio de sequência residual possivel durante a transfecção, integração e selecção. Alternativamente, as células hospedeiras individualmente transfectadas são misturadas antes da selecção ser realizada, isto irá permitir o controlo de desvio de sequência devido à transfecção.

Um aspecto compartilhado nas estratégias de produção descritas acima é que todos os membros individuais constituindo a proteína policlonal recombinante podem ser produzidos em um, ou um número limitado de bio-reactores, com aproximadamente 10, como um máximo. A única diferença é a etapa em que se escolhe gerar a colecção de células que constitui a linha celular produzindo policlonal recombinante. A linha celular hospedeiras a ser usada para a expressão e a produção de uma proteína policlonal recombinante de interesse tem uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico reconhecíveis por enzima(s) recombinase (por exemplo, células preparadas antes tendo um local FRT numa localização predeterminada no genoma, como descrito em por exemplo, US 5.677.177). O vector para integração num locus específico é 64 preferivelmente integrado num locus genómico predefinido que media a expressão em nivel elevado, um assim denominado ponto activo.

Se os niveis de expressão necessitarem ser aumentados, a amplificação de genes pode ser realizada usando selecção para um gene DHFR ou um gene glutamina sintetase (GS). Isto requer o uso de vectores compreendendo um marcador de selecção.

Para a produção de uma proteína policlonal, em que cada membro da proteína é composto de mais do que duas cadeias de polipeptídeo, a combinação destas cadeias pode ser importante para a afinidade, especificidade e actividade da proteína que elas formam. Isto é observado, por exemplo, para anticorpos e TcRs. Por exemplo, sabe-se que é a combinação de cadeia leve variável e cadeia pesada variável de anticorpos que afecta a afinidade e a especificidade de um anticorpo formado a partir destas cadeias. Assim, quando um banco de sequências codificando anticorpos foi seleccionado por sua capacidade para produzir anticorpos com afinidade num determinado alvo, é desejável assegurar que a combinação da cadeia pesada variável e cadeia leve pesada no produto final corresponda a este facto. Por esta razão, as cadeias de polipeptídeo constituindo um membro individual da proteína policlonal são colocadas no mesmo vector usado para integração, assegurando, assim, que elas serão mantidas juntas durante todo o processo. A seguinte descrição é um exemplo de como obter uma linha celular expressando anticorpo policlonal recombinante, em que o atabalhoamento das cadeias é mínimo, se existente de todo. 65

Um cassete de promotor universal para expressão constitutiva tendo dois promotores colocados na direcção transcripcional oposta, como uma construção cabeça-a-cabeça circundada pela cadeia leve variável e o total da cadeia leve kappa, foi construído, permitindo a transferência do construção total num vector para integração num locus especifico, referido vector compreendendo um local FRT e um gene de resistência a higromicina e a região constante de cadeia pesada. É contemplado que uma cassete de promotor para expressão induzida também pode ser usado. Além disso, os promotores podem ser colocados cauda-a-cauda, o que resultará em transcrição na direcção oposta ou cauda-a-cabeça para transcrição unidireccional. Células CHO-Flp-In (Invitrogen, Carisbad, CA), que expressam estavelmente o gene de fusão lacZ-Zeocin, foram usadas para a experiência, tornando as células resistentes ao antibiótico Zeocin. As células foram mantidas num meio contendo Zeocin. As células foram transfectadas em massa com o banco de vectores para integração num locus especifico codificando o anticorpo policlonal e um marcador de selecção diferente (higromicina fosfotransferase) junto com um plasmideo expressando a Flp recombinase. Um promotor induzido também pode ser usado para o controlo da expressão. Após a transfecção, as células foram cultivadas na presença de higromicina. Células que foram resistentes à higromicina foram subsequentemente cultivadas em diferentes sistemas de cultura, como frascos de cultura pequenos convencionais, produção de células em múltiplas camadas Nunc, bio-reactores pequenos de rendimento elevado (MiniPerm, INTEGRA-CELLine) e frascos giratórios de fibras ocas e bio-reactores e fibras. As células foram testadas para produção de anticorpos usando ELISA. Linhas celulares policlonais foram seleccionadas para viabilidade em cultura em 66 suspensão em meio isento de soro sem pressão de selecção durante periodos prolongados. Cargas de linhas celulares foram cultivadas na presença de higromicina.

Avaliação da conservação de policlonalidade no sistema de expressão

De acordo com a presente invenção, é frequentemente importante assegurar que a policlonalidade no sistema de expressão não é seriamente alterada durante a produção, de modo que é possível interromper a produção quando a policlonalidade é realmente alterada. Isto está de acordo com a invenção feita monitorizando-se os níveis de expressão relativos das sequências de ácido nucleico variantes. Os níveis de expressão podem, por exemplo, ser monitorizados a nível de mRNA usando, por exemplo, análise RFLP, arranjos ou PCR em tempo real, ou a nível de proteína usando, por exemplo, electroforese de gel poliacrilamida bidimensional, espectrometria de massa ou várias técnicas cromatográficas. Com estas técnicas, será possível estabelecer um valor de linha de base para um número de todos os níveis de expressão individuais e, então, extrair as amostras da cultura durante a produção a fim de avaliar se os níveis de expressão foram trocados (tanto no total como relativamente). Na prática normal da invenção, uma faixa de valores circundando os valores de linha de base pode ser estabelecida, e caso os níveis de expressão relativos estejam fora das faixas, como verificado, então a produção é terminada.

Para ser capaz de avaliar a estabilidade e a reprodutibilidade do sistema de expressão, vectores codificando seis fragmentos de Fab distintos (o banco mini- 67 seis) com reactividade contra ovalbumina de frango (OVA), fosfatase alcalina bovina (AP), microglobulina β2 humana (P2m), haptoglobina humana (HAP), factor humano VIII (FVIII) e lisozima de clara de ovo de galinha (LYS) foram preparados. As diferentes sequências codificando fragmentos de Fab não são idênticas e, assim, demonstram padrões de RFLP diferentes, em que RFLP pode ser usado para analisar a composição de genótipo. 0 banco mini-seis foi introduzido em células CHO-Flp-In por transfecção usando um vector de expressão com um cassete de promotor cabeça-a-cabeça. As células CHO-Flp-In foram tanto transfectadas em massa com uma mistura de vectores de expressão de interesse codificando os seis anticorpos distintos resultando numa linha celular policlonal expressando os seis anticorpos em combinação conhecida, como as células foram transfectadas individualmente com um membro do banco de expressão de interesse seguido por misturar as células transfectadas, gerando uma linha celular expressando anticorpo policlonal recombinante expressando os seis anticorpos em combinação conhecida.

Deste modo, foi possível testar se a transfecção das células de mamífero ocorre sem gerar um desvio num ou vários clones individuais da linha celular expressando anticorpo policlonal. Além disso, foi possível verificar os desvios de proliferação e desvios causados pela purificação da composição policlonal de anticorpos.

Estabelecimento de uma linha celular produzindo um anticorpo policlonal recombinante antiovalbumina

Clones de fagos de ligação a ovalbumina foram seleccionados usando exibição de fagos e ELISA para identificar os clones 68 relevantes. Duas configurações foram usadas para identificar os anticorpos dos clones de ligação a ovalbumina, isto é, placas de ELISA revestidas com ovalbumina ou um método de triagem de alta densidade (HDS), com base na imobilização de ovalbumina sobre membranas de PVDF. Deste modo, um painel de anticorpos foi obtido, dos quais alguns reconhecem ovalbumina imobilizada na placa de ELISA e outros reconhecem ovalbumina imobilizada sobre a membrana de PVDF.

Os clones de fagos de ligação a ovalbumina seleccionados podem ter suas sequências de DNA de cadeias kappa e pesadas variáveis ligadas a promotores mamiferos e transferidos para um vector do tipo pSymvc20 (figura 4D) para expressão de anticorpo, gerando uma colecção de clones do tipo pSymvc21 (figura 4E). As células CHO-Flp-In são tanto transfectadas em massa com uma mistura dos clones pSymvc21 como as células são transfectadas individualmente com um plasmídeo expressando o anticorpo pSymvc21 seguido por misturar as células transfectadas expressando os outros anticorpos de ligação a ovalbumina. 0 procedimento para criar uma linha celular produzindo anticorpo policlonal antiovalbumina pode ser monitorizado por sequenciamento de DNA, análises TaqMan PCR e RFLP de células expressando anticorpo individual, bem como ELISA, cromatografia líquida (Lc) bidimensional (2D) e espectrometria de massa (MS) da mistura de anticorpos produzida.

Cultivo de células e produção de um anticorpo policlonal recombinante A linha celular policlonal, como descrito acima, é cultivada em meios apropriados em condições apropriadas 69 para expressar a proteina policlonal de interesse codificada pelas sequências de ácido nucleico variantes inseridas no genoma das células. A cultura de células pode ser realizada em várias etapas. Uma primeira etapa é onde a linha celular policlonal é seleccionada para integrantes especificos do local. Quando se usam células de mamifero, as células seleccionadas são então preferivelmente adaptadas para cultura em suspensão bem como a condições isentas de soro. Isto pode ser realizado numa ou duas etapas e com ou sem pressão de selecção. Quando a linha celular policlonal é adaptada às condições apropriadas, a classificação pode ser iniciada. Neste ponto, uma carga de células de trabalho pode ser congelada. Preferivelmente, bio-reactores de entre 30 e 100 litros são usados, mas bio-reactores menores ou maiores podem ser empregados. O tempo de produção apropriado e escolha de tamanho do bio-reactor dependem do rendimento de proteina desejado a partir dos niveis de expressão e batelada da linha celular. Os tempos podem variar de alguns dias até três meses. A proteina policlonal recombinante expressada é isolada das células ou dos sobrenadantes. A proteina recombinante é purificada e caracterizada de acordo com procedimentos conhecidos por um versado na técnica. Exemplos de procedimentos de purificação e caracterização são listados abaixo.

Purificação de uma proteína policlonal recombinante do sobrenadante de cultura

Isolamento das proteínas específicas dos sobrenadantes de cultura é possível usando-se várias técnicas cromatográficas que utilizam diferenças nas propriedades físico-químicas de proteínas, por exemplo, diferenças em peso molecular, carga líquida, hidrofobicidade, ou afinidade para uma proteína ou 70 ligando específico. As proteínas podem, assim, ser separadas de acordo com o peso molecular usando cromatografia de filtração de gel ou de acordo com a carga líquida usando cromatografia de troca de iões (catião/ anião) ou, alternativamente, usando cromatofocalização. Similarmente, as proteínas podem ser separadas após hidrofobicidade usando cromatografia de interacção hidrofóbica ou cromatografia de afinidade utilizando diferenças em afinidade para uma proteína ou ligando imobilizado específico. A separação das misturas complexas de proteínas, pode, assim, ser obtida por combinação sequencial de vários princípios cromatográficos. Uma mistura de proteínas pode, assim, ser inicialmente separada de acordo, por exemplo, com a carga líquida, usando cromatografia de troca de iões, e proteínas de carga líquida similar podem subsequentemente ser separadas de acordo com o peso molecular usando cromatografia de filtração de gel ou após hidrofobicidade usando cromatografia de interacções hidrofóbicas na presença de uma alta concentração de um sal seleccionado.

Cromatografia de afinidade combinada com etapas de purificação subsequentes, como cromatografia de troca de iões, interacções hidrofóbicas e filtração de gel, é frequentemente usada para a purificação de IgG (policlonal bem como monoclonal) e fontes diferentes de TcRfrom, por exemplo, fluido de ascite, sobrenadantes de cultura de células e soro. Purificação de afinidade, onde a separação é baseada numa interacção reversível entre a(s) proteína(s) e um ligando específico copulado a uma matriz cromatográfica, é um método fácil e rápido, que oferece alta selectividade, geralmente alta capacidade e concentração num volume menor. Proteína A e proteína G, duas proteínas de superfície de célula bacteriana, têm alta 71 afinidade para a região Fc, e são, numa forma imobilizada, usadas para muitas aplicações de rotina, incluindo purificação de IgG policlonal e suas subclasses de várias espécies e absorção e purificação de complexos imunes.

Após cromatografia de afinidade, etapas de cromatografia a jusante, por exemplo, cromatografia de troca de iões e/ou de interacção hidrofóbica, podem ser realizadas para remover proteínas de células hospedeiras, proteína A escoada, e DNA.

Filtração de gel, como uma etapa de purificação final, pode ser usada para remover as moléculas contaminantes como dímeros e outros agregados, e transferir a amostra em tampão de armazenagem. Dependendo das condições da fonte e expressão pode ser necessário incluir uma etapa de purificação adicional para obter o nível requerido de pureza de anticorpo. Cromatografia de interacção hidrofóbica ou cromatografia de troca de iões é, assim, frequentemente usada, em combinação com proteína A e cromatografia de filtração de gel, para purificar anticorpos para uso terapêutico. A fim de purificar outras classes de anticorpos, meios de cromatografia de afinidade alternativos devem ser usados uma vez que as proteínas A e G não ligam IgA e IgM. Uma purificação por imunoafinidade pode ser usada (anticorpos monoclonais antilgA e antilgM copulados em fase sólida) ou, alternativamente, estratégias de purificação em múltiplas etapas incluindo troca de iões e interacção hidrofóbica podem ser empregadas. 72

Caracterizaçao Estrutural

Caracterização estrutural de proteínas policlonais como anticorpos e TcRs requer uma alta resolução devido à complexidade da mistura (diversidade clonal e glicosilação). Experiências tradicionais como filtração de gel, cromatografia de troca de iões ou electroforese podem não ter resolução suficiente para diferenciar de entre os anticorpos individuais. Electroforese de gel poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) é usada para traçar um perfil de misturas de proteína complexas seguido por espectrometria de massa (MS) ou cromatografia líquida (LC)-MS (por exemplo, proteómicos). 2D-PAGE, que compreende a separação na base de uma massa e carga de proteína, prova-se utilizável para diferenciar entre imunoglobulina policlonal, oligoclonal e monoclonal em amostras de soro. No entanto, estes métodos têm algumas limitações. Técnicas cromatográficas, em particular, capilares e LC copulado a MS de ionização de electropulverização estão sendo crescentemente aplicadas para a análise de misturas de peptídeo complexas. LC-MS é usado para a caracterização de anticorpos monoclonais e, recentemente, também para traçar o perfil de cadeias leves de anticorpos policlonais. A análise de muitas amostras complexas requer um maior poder de resolução do sistema cromatográfico, que pode ser obtido por separação em duas dimensões (ou mais). Uma experiência pode ser baseada em troca de iões na primeira dimensão e cromatografia de fase reversa (ou interacção hidrofóbica) na segunda dimensão opcionalmente copulada a MS.

Caracterização Funcional

Uma proteína policlonal pode, por exemplo, ser 73 caracterizada funcionalmente através de estudos de comparação com proteínas policlonais com especificidade para o mesmo alvo ou uma actividade similar. Estes estudos podem ser realizados tanto in vitro como in vivo.

Uma caracterização funcional in vitro de um anticorpo policlonal pode, por exemplo, ser por imunoprecipitação, que é uma técnica altamente específica para a separação analítica de antígenos alvo de lisados de células brutas. Combinando-se imunoprecipitação com outras técnicas, como SDS-PAGE seguido por coloração de proteína (Coomassie Blue, coloração com prata ou rótulo de biotina) e/ou imunoblotting, é possível detectar e quantificar antígenos, por exemplo, e assim avaliar algumas das propriedades funcionais dos anticorpos. Apesar deste método não fornecer nem uma estimativa do número de moléculas de anticorpos nem suas afinidades de ligação, ele proporciona uma visualização das proteínas alvo e, assim, a especificidade. Este método pode do mesmo modo ser usado para monitorar as diferenças potenciais dos anticorpos para antígenos (a integridade da diversidade clonal) durante o processo de expressão.

Uma caracterização funcional in vivo de um anticorpo policlonal pode, por exemplo, ocorrer em estudos de infecção. Um animal experimental como um rato pode, por exemplo, ser infectado com um vírus específico, para o qual o anticorpo policlonal foi desenvolvido. 0 grau no qual a infecção pode ser inibida indicará a funcionalidade do anticorpo policlonal. 74

Composições terapêuticas

Em uma forma de realização da invenção, uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína policlonal recombinante, seleccionada da super família de imunoglobulinas como seu ingrediente activo, é destinada para o tratamento ou prevenção de uma doença num mamífero como uma doença seleccionada de cancro, infecções, doenças inflamatórias, alergia, asma e outros doenças respiratórias, doenças auto-imunes, funcionamento imunológico deficiente, doenças cardiovasculares, doenças no sistema nervoso central, doenças metabólicas e endócrinas, rejeições de transplantes e gravidez indesejada. 0 mamífero é preferivelmente um ser humano, um animal doméstico ou um animal de estimação.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo policlonal recombinante ou fragmento de anticorpo como o ingrediente activo e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em outra forma de realização preferida da presente invenção, a composição farmacêutica compreende um receptor de célula T policlonal recombinante ou fragmento de receptor de célula T como o ingrediente activo e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Para o tratamento ou prevenção de infecções, a composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende uma proteína policlonal recombinante de interesse, capaz de reagir com ou de se ligar a um microrganismo infeccioso como um microrganismo seleccionado de entre bactérias, 75 micobactérias, virus, micoplasmas, rickettsias, espiroquetas, protozoários, fungos, helmintos e ectoparasitas.

As proteínas policlonais humanas recombinantes podem ser administradas num diluente farmaceuticamente aceitável, veiculo ou excipiente, na forma de dosagem unitária. Prática farmacêutica convencional pode ser empregada para proporcionar formulações apropriadas ou composições para administrar os compostos a pacientes sofrendo de uma doença, por exemplo, causada por proliferação de células excessiva. A administração pode começar antes do paciente ser sintomático. Qualquer via de administração apropriada pode ser empregada, por exemplo, a administração pode ser parenteral, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intramuscular, intracraniana, intra-orbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intra-espinal, intracistermal, intraperitoneal, intranasal, aerossol, supositório ou administração oral. Por exemplo, formulações terapêuticas podem estar na forma de soluções liquidas ou suspensões; para administração oral, as formulações podem estar na forma de comprimidos ou cápsulas, goma de marcar, pasta, composições apropriadas para a aplicação na pele podem estar na forma de cremes, unguentos, loções, géis, curativos ou outros, composições apropriadas para aplicação na mucosa vaginal ou urogenital podem estar na forma de supositórios vaginais, géis ou outras e para formulações intranasais, na forma de pós, gotas nasais, ou aerossóis.

As composições farmacêuticas da presente invenção são preparadas de um modo conhecido per se, por exemplo, por meio de processos de dissolução, liofilização, mistura, granulação ou confecção convencionais. As composições 76 farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (ver por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J.C. Boylan, 1988-1999, Mareei Dekker, New York (NY) .

Soluções do ingrediente activo, e também suspensões, e especialmente soluções aquosas isotónicas ou suspensões, são preferivelmente usadas, sendo possível, por exemplo, no caso de composições liofilizadas que compreendem o ingrediente activo sozinho ou junto com um veículo, por exemplo, manitol, para estas soluções ou suspensões serem produzidas antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo, conservantes, estabilizadores, agentes humidificação e/ou emulsão, solubilizadores, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões, e são preparadas de um modo conhecido per se, por exemplo, por meio de processos de liofilização ou dissolução convencionais. As referidas soluções ou suspensões podem compreender substâncias que aumentam a viscosidade, como carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatina.

As composições de injecção são preparadas do modo comum em condições estéreis; o mesmo aplica-se também para introduzir as composições em ampolas ou frascos e vedar os recipientes.

Composições farmacêuticas para administração oral podem ser obtidas combinando o ingrediente activo com veículos 77 sólidos, se desejado granulando uma mistura resultante, e processando a mistura, se desejado ou necessário, após a adição de excipientes apropriados, em comprimidos, núcleos de drageias ou cápsulas. Também é possível para as mesmas serem incorporadas em veículos plásticos que permitem que os ingredientes activos difundam ou sejam liberados em quantidades medidas.

As composições farmacêuticas compreendem de aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, preferivelmente de aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, de ingrediente activo. Composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem, por exemplo, estar na forma de dose unitária, como na forma de ampolas, frascos, supositórios, drágeas, comprimidos ou cápsulas.

As formulações podem ser administradas a pacientes humanos em quantidades terapeuticamente eficazes (por exemplo, quantidades que previnem, eliminam ou reduzem uma condição patológica) para proporcionar terapia para uma doença ou condição. A dosagem preferida de agente terapêutico a ser administrado provavelmente depende de variáveis como o tipo e extensão do distúrbio, o estado de saúde total do paciente particular, a formulação dos excipientes do composto, e sua via de administração.

Se desejado, o tratamento com anticorpos policlonais humanos recombinantes pode ser combinado com terapias mais tradicionais. Por exemplo, no tratamento de cancro estas terapias combinatórias podem tomar a forma de cirurgia ou administração de quimioterapêuticos ou outros agentes anticancerígenos. 78

Numa outra forma de realização da invenção, a composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende uma proteína policlonal recombinante de interesse capaz de reagir com ou ligar-se a um microrganismo como um microrganismo seleccionado de bactérias, micobactérias, vírus, micoplasmas, rickéttsias, espiroquetes, protezoários fungos, helmintos e ectoparasitas.

Usos terapêuticos das composições de acordo com a invenção

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para o tratamento, melhora ou prevenção de uma doença num mamífero. Doenças que podem ser tratadas com as presentes composições farmacêuticas incluem cancro, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, alergia, asma e outras doenças respiratórias, doenças auto-imunes, doenças cardiovasculares, doenças no sistema nervoso central, doenças metabólicas e endócrinas, rejeições de transplantes e gravidez indesejada.

Um outro aspecto da presente invenção é um método para tratamento de doenças, melhoria ou profilaxia num animal, em que uma quantidade eficaz do anticorpo policlonal recombinante ou fragmento de anticorpos é administrada. Em outro aspecto, uma quantidade eficaz do receptor de célula T policlonal recombinante ou fragmento do receptor de célula T é administrada.

Um aspecto adicional da presente invenção é o uso de um anticorpo policlonal recombinante ou receptor de célula T policlonal recombinante ou fragmentos de anticorpos ou receptores de células T para a preparação de uma composição para o tratamento de doenças seleccionadas de entre um 79 grupo consistindo num cancro, uma infecção, uma doença inflamatória, uma alergia, asma ou outra doença respiratória, função imunológica deficiente, uma doença auto-imune, uma doença cardiovascular, uma doença no sistema nervoso central, uma doença metabólica, uma doença endócrina, rejeição de transplantes e gravidez indesejada.

Uso em diagnóstico e uso de detecção ambiental Outra forma de realização da invenção é dirigida a kits diagnósticos e kits para uso de detecção ambiental bem como métodos para usar estes kits. Kits de acordo com a presente invenção compreendem uma proteina policlonal recombinante de acordo com a invenção, cuja proteina pode ser rotulada com um rótulo detectável ou não rotulada para detecção sem rótulo. Se rotulada, a presente proteina policlonal recombinante pode ser adicionada a uma amostra que se suspeita contenha a molécula de alvo e a presença ou ausência do rótulo indica a presença ou ausência da molécula de alvo. A amostra a ser testada pode ser uma amostra de fluido corporal como sangue, soro, plasma, fluido espinal, linfa ou urina ou uma amostra não de mamífero como uma amostra de uma fonte ambiental que se suspeita abrigue um contaminante. Amostras de não mamíferos podem incluir água, ar ou terra contaminada. Detecção sem rótulo engloba a medição de mudança refractiva em BIAcore quando da ligação, em que uma proteína policlonal recombinante é usada para capturar a molécula de alvo.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos descrevem como anticorpos policlonais recombinantes são expressados e produzidos numa linha celular de alta produção, onde o(s) gene(s) / vector(es) de 80 interesse é (são) inserido (s) por integração num locus especifico num local de "ponto activo" cromossómico pré-caracterizado.

Nos exemplos, as células CHO foram utilizadas como célula hospedeira. As vantagens das mesmas incluem a disponibilidade de meio de cultura apropriado, sua capacidade de crescer eficientemente numa densidade elevada em cultura, e sua capacidade de expressar proteínas de mamífero, como anticorpos, numa forma biologicamente activa.

Em geral, a transformação de E. coli e a transfecção de células de mamíferos de acordo com a presente invenção serão realizadas de acordo com métodos convencionais. Para melhorar o entendimento da invenção, a construção de vectores exemplares e seu uso na produção de uma linhagem de célula produzindo policlonal recombinante para expressão de proteína policlonal recombinante são descritos nos exemplos abaixo.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção, mas não devem ser considerados como limitando o escopo da invenção. EXEMPLO 1

Integração num locus específico versus integração aleatória

Para a seguinte experiência de transfecção, as células CHO Flo-In (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram usadas. A eficácia do sistema foi testada usando fosfatase alcalina segregada humana (SEAP) como um gene repórter. Foram preparadas duas construções de plasmídeo: 81 1. SEAP inserido em pcDNA3.lhigro+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) (para integração aleatória no local); 2. SEAP inserido em pcDNA5/FRT (Invitrogen, Carlsbad, CA) (para integração num locus especifico);

As duas construções de plasmídeo foram muito similares com respeito a elementos reguladores, isto é, promotor, poliadenilação, etc. que tornam possível usar os plasmídeos para comparar integração aleatória com integração num locus específico. Células CHO Flp-In foram transfectadas com a construção de plasmídeo 1 sozinha ou construção de plasmídeo 2 junto com o plasmídeo pOG44 codificando recombinase de acordo com o procedimento descrito por Invitrogen. Os transfectantes foram seleccionados usando higromicina e a produção de SEAP de poças de transfectantes foi medida. Células transfectadas por integração num locus específico produziram aproximadamente 6 vezes mais SEAP do que células transfectadas por integração aleatória provendo a eficácia do sistema e da linhagem de célula. EXEMPLO 2

Projecto e preparaçao de um vector de expressão para integração num locus específico numa célula hospedeira

Um vector de expressão apropriado para integração num locus específico numa região cromossómica de ponto activo de uma 82 célula hospedeira pode ser reunido, compreendendo os seguintes elementos de DNA: a) um local de recombinação FRT ligado ao gene de resistência à higromicina; b) uma origem PUC de replicação; c) um gene de resistência à ampicilina (bla); d) um promotor de bla permitindo expressão do gene de resistência à ampicilina (bla); e) gene(s), codificando uma proteína de interesse (GOIs); f) promotor(es) permitindo expressão de GOI; e g) opcionalmente, elementos reguladores translacionais ou transcripcionais adicionais, como melhoradores ou UCOEs, para expressão aumentada do local de integração ou um IRES.

Para proporcionar um melhor entendimento da construção do vector de expressão, cada um dos elementos é descrito em mais detalhes: a) foi usado um local de recombinação FRT ligado ao gene de resistência à higromicina para integração mediada por Flp recombinase e selecção de uma linhagem de célula com uma maioria de integrantes únicos. 0 gene de higromicina nem foi precedido por um promotor nem equipado com um codão de início de transcrição, mas um sinal de poliadenilação foi adicionado em 3' do gene. 0 local FRT usado foi 5'-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3' (SEQ ID NO: 1)/ 83 b) uma origem PUC de replicação foi incluída para permitir replicação de número com elevado número de cópias numa célula hospedeira de E.coli; c) Um gene de resistência à ampicilina (bla) (β-lactamase) permitindo selecção de transformantes de E. coli foi incluído; d) Um promotor de bla permitiu expressão do gene de resistência à ampicilina (bla) em E. coli; e) GOI codificando uma proteína de interesse, por exemplo, uma proteína policlonal recombinante, anticorpo, as cadeias pesadas e leves de um anticorpo, bem como sequências de nucleótidos que codificam toda ou uma porção tanto da região constante como da região variável de uma molécula de anticorpo, e opcionalmente toda ou uma porção de uma sequência de nucleótidos reguladora que controla a expressão de uma molécula de anticorpo foram incluídos.

Loci de imunoglobulina para cadeias pesadas podem incluir, mas não estão limitados a todas ou a uma porção da região V, D, J e de troca (incluindo sequências intervenientes, também conhecidas como intrões) e sequências de flanco associadas com ou adjacentes ao gene de região constante de cadeia pesada particular e podem incluir regiões localizadas dentro ou a jusante da região constante (incluindo intrões) .

Loci de imunoglobulina para as cadeias leves podem incluir, mas não estão limitados às regiões V e J, suas sequências de flanco a montante e sequências intervenientes (intrões) 84 associadas com ou adjacentes ao gene de região constante de cadeia leve, e podem incluir regiões localizadas dentro ou a jusante da região constante (incluindo intrões).

Para a modificação de toda ou uma porção de uma região constante de um anticorpo, sequências modificadoras da invenção podem incluir, mas não estão limitadas a uma região constante de anticorpo tendo uma função efectadora particular, classe e/ou origem (por exemplo, regiões constantes de IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE de imunoglobulinas humanas ou qualquer outra espécie) ou uma porção de uma região constante que modifica a actividade ou propriedades da região constante do anticorpo; bem como genes que codificam outras moléculas que conferem alguma nova função a uma molécula de anticorpo modificada, por exemplo, uma enzima, toxina e similares. 0(s) gene(s) codificando uma proteína de interesse pode(m) ser ligado(s) de modo operativo a sequências de nucleótidos codificando sequências líderes funcionais dirigindo o produto de gene à via secretória.

Além disso, 3' no GOI codificando a proteína de interesse, por exemplo, como um anticorpo policlonal compreendendo cadeias pesadas e leves, pode ser sinais de poliadenilação fortes. 0 uso de IgGl de isotipo de ratos nos seguintes exemplos é para fins ilustrativos e não pretende limitar o escopo da invenção; f) Promotores permitindo a expressão do GOI são proporcionados. Assim, é descrito uma cassete compreendendo elementos promotores e melhoradores para expressão. No vector de expressão, cada um dos genes de anticorpos pode ser precedido por seus próprios elementos promotores de 85 mamífero dirigindo expressão de alto nível de cada uma das duas cadeias, se for usada orientação unidireccional, bidireccional ou cauda-a-cauda de cassetes de transcrição. Em uma orientação bidireccional de expressão, uma configuração de promotor cabeça-a-cabeça pode ser usada (a construção deste sistema é descrita em detalhes na patente US 5.789.208, que se incorpora por referência em sua totalidade). Num sistema de expressão unidireccional, dois promotores ou um promotor combinado, por exemplo, uma sequência IRES, também pode ser usado para expressão.

Para construção de promotores cabeça-a-cabeça, uma amplificação Pfu PCR dos promotores é realizada individualmente. O iniciador 5' iniciará na base a montante 5' do promotor, o iniciador da extremidade 3' incluirá um local de restrição único, como um local Xbal. Após amplificação PCR, os fragmentos podem ser separados num gel agarose, e isolados do gel usando colunas QiaQuick (Qiagen). Isto é seguido por uma digestão de restrição Xbal, inactivação com calor a 65 °C durante 20 minutos, e purificação em coluna dos fragmentos usando QiaQuick. Os fragmentos são então misturados e ligados juntos usando ligase E. coli (New England Biolabs (NEB)), uma enzima que liga preferencialmente extremidades aderentes. A mistura de ligação é amplificada por PCR com os iniciadores 5' de cada promotor para dar o fragmento de promotor cabeça-a-cabeça completo (promotor A / promotor B) . Este fragmento é submetido com quinase de polinucleótido T4 (PNK) (NEB), a enzima é inactivada com calor a 65 °C durante 20 minutos, e o fragmento é ligado (extremidade obtusa) no vector de interesse (fragmento pSymvclO amplificado com PCR) (ver figura 4), onde os iniciadores usados para amplificação recombinam em cada lado da região de promotor amplificando 86 tudo excepto o promotor) usando T4 ligase (NEB).

As figuras 1 e 2 mostram vectores de expressão compreendendo promotores para bidireccional e unidireccional, respectivamente. Estes promotores se destinam a ser ilustrativos e não limitar a escolha de promotor na invenção; g) 0 vector de expressão pode transportar elementos reguladores transcripcionais e/ou translacionais adicionais, como melhoradores e/ou UCOEs, para expressão aumentada no local de integração e/ou IRES. EXEMPLO 3

Avaliação de conservação de policlonalidade no sistema de produção desenvolvido A fim de conseguir avaliar a estabilidade e a reprodutibilidade do sistema de produção, uma linhagem de célula expressando uma composição policlonal de anticorpos distintos em combinação conhecida foi preparada. A composição de anticorpo policlonal foi chamada como a composição mini-seis. 0 banco de sequências de ácido nucleico codificando a composição mini-seis foi denominado como o banco mini-seis. (a) Origem do clone

As seguintes sequências codificando os fragmentos de Fab (os genes de interesse) com reactividade contra 1-6 antigenos foram usadas neste exemplo: 87 1. Ovalbumina (OVA). Os fragmentos codificando Fab foram seleccionados de um banco de exibição de fagos antiOVA de murino; 2. Fosfatase alcalina (AP). Os fragmentos codificando Fab foram seleccionados de um banco de exibição de fago antiAP de murino; 3. P2-microglobulina (β2ΐη) . Os fragmentos codificando Fab foram clonados do hibridoma BBM.l (um presente do Dr. L.0. Pedersen, Dinamarca) , que foi gerado contra β2Γη; 4. Haptoglobina humana (HAP). Os fragmentos codificando Fab foram seleccionados de um banco de exibição de fagos de haptoglobina antihumana de murino; 5. Factor VIII (FVIII). 0 anticorpo monoclonal parental deste fragmento de Fab foi um anticorpo monoclonal FVIII F25 (oferta de Novo Nordisk, Dinamarca). 0 DNA codificando o VH e cadeias Kappa completas deste fragmento de fab foi sub-clonado num fagomideo, seguido por inserção do cassete de promotor procariótico na construção. 6. Lisozima de ovo de galinha (LYS) . Esta construção foi gerada do clone Dl.3 scFv (Boulot, G. et al., J. Mol. Biol. 213 (4) (1990) 617-619), por amplificação PCR de VH e fragmentos Vk e clonado num fagomideo.

Os clones de fagomideo existem tanto em cargas de glicerol da estirpe TGl de Escherichia coli transformada (mantidas a -80 °C) ou como de preparações de DNA de fagomideos. (b) Análise RFLP e sequenciamento de DNA do banco mini-seis.

As sequências de nucleótidos codificando as cadeias pesadas dos fragmentos de Fab foram analisadas por RFLP como a seguir: Os padrões da banda obtidos após digesto dos fragmentos gerados de PCR com a enzima Nla III e Hinf I foram examinados. As sequências codificando fragmentos de Fab diferentes demonstraram padrões muito diferentes e facilmente distinguíveis. As sequências de nucleótidos codificando os fragmentos VH e VL foram sequenciadas e sequências correspondentes ao padrão RFLP foram encontradas. Além disso, as sequências de nucleótidos codificaram matrizes de leitura aberta e traduziram em polipeptideos bem definidos. (c) Análise ELISA da composição mini-seis

Os fragmentos de Fab expressados dos clones foram analisados usando ELISA, em que todos os fragmentos de Fab foram analisados para reactividade com todos os antigenos. Expressão de Fab foi monitorizada usando um ELISA antikappa. Todos os fragmentos de Fab foram testados em duplicata em ELISA. Todos os clones expressaram fragmentos de Fab, e os fragmentos de Fab reagiram especificamente com seu antigeno relevante. Nenhum problema background foi encontrado nas análises ELISA.

Os seis clones de fagomideo existem em cargas de glicerol de estirpe TG1 de Escherichia coli transformada, que foram usadas no sistema modelo para inoculação como descrito abaixo. (d) Projecto de um sistema modelo policlonal com seis anticorpos distintos em combinação conhecida. 89

Os seis clones expressando Fab (clones expressando fragmentos de Fab de antiOVA, antiAP, antip2m, antiHAP, antiFVIII e antiLYS) foram caracterizados testando a reactividade dos fragmentos de Fab expressados contra os antígenos relevantes. Estes clones formaram parte de um sistema modelo policlonal para testar a expressão e produção de seis anticorpos distintos numa combinação conhecida (a composição mini-seis). Todos os fragmentos de Fab codificando sequências de nucleótidos (o banco mini-seis) foram transferidos num vector de fagomideo (ilustrado por pSymvclO, figura 4A). (d.l) Transferência individual dos GOIs do vector de fagomideos num vector para expressão de mamíferos A transferência dos genes de interesse (o banco mini-seis) de um vector de fagomideo para um vector para expressão de mamifero foi, neste exemplo, realizada por um procedimento em duas etapas. A primeira etapa foi substituir os promotores procarióticos com uma cassete de promotor de mamifero numa orientação cabeça-a-cabeça. Esta etapa foi seguida por transferência de uma região variável dos GOIs, a cassete de promotor e o kappa constante para o vector de expressão, como descrito em detalhes em baixo, e ilustrado na figura 4. A cassete de promotor cabeça-a-cabeça (promotor A / promotor B) foi inserido no vector de fagomideo para cada clone usando uma digestão Saci/Xhol seguido por uma ligação resultando numa troca de promotores de bacteriano em mamifero. Um digesto de BcoRI e NotI foi então usado para mover a cadeia pesada variável, o cassete de promotor 90 cabeça-a-cabeça (promotor A / promotor B) e a cadeia kappa total (fragmento EcoRI/Not I) do vector de fagomídeo no vector de expressão.

Um exemplo da transferência individual de cada clone é dado com o diagrama de fluxos na figura 4. Esta figura mostra o plasmideo pSymvclO onde as sequências codificando kappa e pesada de interesse (por exemplo, gc032 OVA) estão presentes no vector de fagomideo no qual a construção da cassete de promotor de mamífero cabeça-a-cabeça foi ligada para substituir os promotores bacterianos usando um pSymvcl2 gerando a transferência do fragmento Sacl/Xhol.

Desta construção, a sequência codificando a cadeia pesada variável incluindo a cassete de promotor e o total da sequência codificando a cadeia kappa foi transferida no vector codificando o isotipo de mamífero (pSymvc20) por uma transferência de NotI/EcóRI. O vector resultante (pSymvc21) expressou o anticorpo de rato de interesse (por exemplo, anticorpo IgGl antiOVA). A sequência codificando a cadeia pesada variável, o cassete de promotor de mamífero e a sequência codificando a cadeia kappa total de cada um dos seis clones foram transferidos individualmente por uma transferência Notl/EcoRI resultando no vector de expressão de mamífero pSymvc21, que expressa cada uma das sequências de anticorpo codificadas por GOI como anticorpos IgGl de rato.

Os seis clones de pSymvc21 individuais contendo os seis GOIs foram mantidos como cargas de glicerol de TG1.

Para a transfecção em células CHO Flp-In, as cargas de TG1 foram propagadas individualmente, e após normalização de 91 Οϋβοο para o número de células de E. coli, as seis culturas foram misturadas e usadas para preparação de plasmideo. Esta preparação de plasmideo compreendendo os seis GOIs (o banco mini-seis) foi usada para transfecção em massa de células de mamifero para expressão de proteina policlonal recombinante. (d.2) Transferência em massa dos GOIs de vectores de fagomideo em vectores para expressão de mamifero

Os GOIs (o banco "mini-seis") (aqui os fragmentos EcoRI/Notl) , que estavam localizados em vectores de fagomideo e codificando seis fragmentos de Fab distintos (antiOVA, antiAP, antiP2m, antiHAP, antiFVIII e antiLYS), foram transferidos em massa como uma mistura das seis construções de vector em vectores para expressão de mamifero resultando numa mistura de seis vectores de expressão distintos. O procedimento experimental relativo à transferência em massa segue o procedimento descrito em (d.l) com a excepção de que ele foi realizado em massa, isto é, todos os seis GOIs (codificando as cadeias pesadas variáveis, incluindo o cassete de promotor cabeça-a-cabeça e cadeias kappa completas) foram transferidos simultaneamente como uma mistura dos seis vectores de fagomideo.

Preparações de plasmideos do banco mini-seis A preparação de plasmideo 1 refere-se a uma preparação de plasmideo de uma mistura dos seis vectores de plasmideo (com as sequências codificando anticorpos contidas no vector pSymvclO). 92 A preparação de plasmídeo 2 refere-se a uma preparação de plasmídeo de seis vectores de fagomídeo com as sequências de codificação contidas no vector pSymvcl2 após a etapa 1 de transferência em massa (ver figura 4C) , que resulta na troca dos promotores procarióticos com as construções de cassete de promotor de mamifero. A preparação de plasmídeo 3 refere-se a uma preparação de plasmideo após a etapa 2 de transferência em massa (ver figura 4D) , que dá a troca da cadeia pesada variável, o cassete de promotor cabeça-a-cabeça e a cadeia kappa total de pSymvcl2 para o vector de expressão de mamifero (pSymvc21), permitindo assim expressão dos seis anticorpos seleccionados como anticorpos IgGl de rato de comprimento completo.

Genotipagem de células de TG1 transformadas com preparações de plasmídeo usadas em transferência em massa Células de TG1 foram transformadas em massa com o banco mini-seis, por electroporação e após uma incubação nocturna em placas 2xYT (Sigma Y 2627), colónias individuais foram seleccionadas. Em cada experiência, 180 colónias foram seleccionadas e incubadas em formatos de 96 cavidades em meio liquido 2xYT, durante 4 horas. Aliquotas das culturas foram diluidas com água, desnaturadas e usadas como gabarito em PCR. Em todas as experiências, a cadeia pesada variável foi amplificada. Sequências de iniciadores para os vectores de fagomideo (tipo pSymvclO) foram: 5'-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3' (SEQ ID NO: 2) e 93 5'-GCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTC-3' (SEQ ID NO: 3)

Iniciadores para vectores com cassete de promotor de mamífero foram (tipo pSymvcl2): 5'-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3' (SEQ ID NO: 4) e 5' -GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3' (SEQ ID NO: 5)

Iniciadores para construções de pSymvc21 foram: 5'-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3' (SEQ ID NO: 6) e 5'-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3' (SEQ ID NO: 7)

Todos os produtos PCR foram digeridos com ambos NlalII e Hinfl para assegurar genotipagem não ambígua. Os fragmentos de digestão foram analisados por electroforese de gel agarose e as bandas foram visualizadas por coloração EtBr. O número de genótipos individuais parecidos pelo padrão de fragmento determinado por RFLP corresponde ao número de colónias individuais representando cada um dos seis anticorpos de entre o número total de colónias seleccionadas. (d.2a) Transferência em massa do vector de fagomídeo num vector de mamífero após amplificação de DNA em células de E. coli (método de amplificação em duas etapas) A preparação de plasmídeo 1 foi preparada de cada uma das seis cargas de glicerol de TG1 de E. coli contendo um dos seis vectores de fagomídeo constituindo o banco mini-seis. As cargas foram propagadas individualmente, e após normalização de ODeoo para o número de E. coli, as seis 94 culturas foram misturadas em quantidades iguais e usadas para preparação de plasmídeo resultando na preparação de plasmídeo 1. A distribuição de genótipo dos seis vectores de fagomideo na preparação de plasmideo 1 foi testada por transformação em células de TG1 electrocompetentes e subsequente análise RFLP. A distribuição dos diferentes genótipos em células de TG1 é mostrada na figura 5. A preparação de plasmideo 1 compreendendo o vector de fagomideo policlonal expressando uma mistura igual dos seis genótipos de fragmentos de Fab seleccionados foi digerida com Sacl/Xhol. Então, a cassete de promotor cabeça-a-cabeça (promotor CMV / promotor MPSV) foi inserido por ligação. A distribuição de genótipos dos vectores após a troca de promotor no vector foi testada em células de TG1 após transformação com DNA da etapa de ligação (figura 6).

As células foram depositadas em placa e cultivadas em placas de agar grandes (245 mm x 245 mm) e a preparação de plasmideo 2 foi preparada para gerar o vector de fagomideo agora contendo a cassete de promotor cabeça-a-cabeça (pSymvcl2).

Da preparação de plasmideo 2, a sequência de codificação da cadeia pesada variável incluindo o cassete de promotor e a sequência da cadeia kappa total foi cortada do vector de fagomideo por um digesto NotI/EcoRI e transferida num vector (pSymvc20) já contendo os domínios de regiões constantes de IgGl de rato. Isto resultou numa colecção de vectores pSymvc21, que expressa a região variável dos seis clones de anticorpos seleccionados como anticorpos IgGl de rato de comprimento completo. 95 A transferência de promotor pode, alternativamente, ser realizada no vector de mamífero expressando um isotipo, revertendo a ordem do digesto de restrição iniciando com Notl/EcoRI para transferência do DNA de interesse para o vector de mamífero e, então, fragmento do digesto de restrição Saci/Xhol para inserção da região de promotor. A distribuição de genótipos após transferir a sequência codificando a cadeia pesada variável, o cassete de promotor e a sequência codificando a cadeia kappa total no vector de expressão foi testada transformando células de TG1 com DNA da segunda etapa de ligação (figura 7) . As células foram depositadas em placa de agar 2x YT grandes (245 mm x 245 mm) e a preparação de plasmídeo 3 foi preparada (pSymvc21), em que a região variável dos seis clones é expressada no contexto de uma estrutura de anticorpo IgGl de rato. A preparação de plasmídeo 3 pode ser usada para transfecção em massa de células de mamífero para gerar uma linha celular produzindo policlonal recombinante para expressão de anticorpo policlonal recombinante.

Os resultados da transferência em massa do vector de fagomídeo para um vector de mamífero codificando isotipo após amplificação de DNA em células de E. coli mostrou que foi possível obter uma distribuição equilibrada das seis construções de vector após eles terem se propagado individualmente e misturados (preparação de plasmídeo 1, figura 5) . As seis construções, após troca de cassete de promotor (preparação de plasmídeo 2, figura 6) bem como após inserção num vector codificando isotipo de IgGl de rato (preparação de plasmídeo 3, figura 7), foram todos detectáveis em níveis comparáveis. 96 (d.2b) Transferência em massa de um vector de fagomídeo num vector para expressão de mamífero sem amplificação de DNA em E. coli após a etapa de preparação de plasmídeo 1 (método de amplificação numa etapa) DNA da preparação de plasmídeo 1 (aqui foram usados 25 μρ) compreendendo o vector de fagomídeo policlonal (pSymvclO) expressando uma mistura igual dos seis genótipos de fragmento de Fab seleccionados foi digerido com Saci/Xhol para troca de promotores. 0 fragmento de vector Saci/Xhol foi purificado e ligado com o cassete de promotor cabeça-a-cabeça (promotor CMV/ promotor MPSV). Após a troca de promotores sem realizar qualquer amplificação, o vector com cassete de promotor CMV/ MPSV foi digerido com Notl/EcoRI para cortar a região total com a sequência codificando a cadeia pesada variável, incluindo o cassete de promotor e a sequência codificando a cadeia kappa total do vector de fagomídeo para transferência em massa num vector para expressão de mamífero. Após ligar o fragmento Notl/EcoRI codificando a cadeia pesada variável, o cassete de promotor e a cadeia kappa num vector codificando IgGl de rato (pSymvc20), um vector de expressão, que expressa a região variável dos seis clones seleccionados no contexto de anticorpos de comprimento completo IgGl de rato foi obtido. A composição deste vector de expressão é ilustrada na figura 1.

Após a transferência em massa resultando na troca de promotor no vector e transferência das sequências de nucleótido codificando a cadeia pesada variável, o cassete de promotor e a cadeia kappa total num vector para expressão de mamífero, a distribuição de genótipos foi 97 testada por transformação de células de TG1 com plasmídeo da segunda etapa de ligação. As células foram depositadas em placa de agar 2xYT grandes (245 mm x 245 mm) e uma preparação de plasmideo desta preparação de plasmideo de digestão/ ligação dupla foi preparada (vector pSymvc21, em que a região variável dos seis clones é expressada no contexto de anticorpos IgGl de rato, correspondente à preparação de plasmideo 3 de d.2a). A distribuição de genótipo em células de TG1 após transformação com a preparação de plasmídeo do método de amplificação de uma etapa é mostrada na figura 8. O método de amplificação de uma etapa pode introduzir algum atabalhoamento de entre as cadeias leves e pesadas das seis sequências codificando Fab resultantes da geração de produtos de ligação indesejados que são normalmente omitidos durante amplificação em E. coli. No entanto, se este atabalhoamento ocorrer, uma etapa de triagem pode ser introduzida para assegurar que diversidade clonal suficiente é mantida. (d.2c) Transfecção directa de células de mamifero após a troca de promotor 0 produto das preparações de plasmídeo do banco mini-seis tanto do método de amplificação em duas etapas como método de amplificação numa etapa pode ser usado directamente para transfectar células de mamífero em massa para expressão de anticorpos policlonais recombinantes. (d.3) Teste das células de mamífero transfectadas A combinação de anticorpos conhecida do sistema de modelo 98 policlonal mini-seis pode ser usada para testar e assegurar que a transfecção e transferência em massa em células de mamífero ocorrem de um modo que mantém a diversidade clonal e sem introduzir desvios na composição dos genótipos da sequência variável de anticorpos durante transfecção e subsequente cultura. Os métodos pelos quais a composição genotípica será monitorizada por todo o processo de transferência em massa, transfecção em massa e expressão de mamífero, podem compreender os seguintes: - sequenciamento de DNA de clones isolados - análise RFLP de clones individuais - ELISA da mistura de anticorpos produzida - espectrometria de massa da mistura de anticorpos produzida - PCR Taqman da composição relativa das sequências genômicas e mRNA expressando as diferentes cadeias leve e pesada.

Desvios na composição genotípica introduzidos durante o processo de transfecção devem ocorrer, podem ser causados por integração aleatória ou integrantes múltiplos. Como descrito na descrição detalhada, isto provavelmente não causa problemas quando usando uma linha celular hospedeira preprojectada para integração num locus específico. No entanto, pode ser controlado em vários de modos. A selecção contra integração num local genómico aleatório (um local diferente do local específico do local) pode ser feita usando quantidades muito baixas de DNA, por exemplo, 1 99 μg/107 células quando realizando transfecção com Lipofectamina ou 0,2 μρ/107 células quando realizando transfecção por electroporação. Também, o DNA a ser integrado pode ser fornecido na forma superespiralada; como se sabe, esta forma é desfavorável para a integração aleatória.

Integrações únicas ou múltiplas fora do local de marcação preprojectado serão eliminadas por selecção negativa, porque o marcador seleccionável estará presente no genoma sem um promotor ou um codão de partida. Assim, os recipientes destes eventos de integração aleatória não sobrevivem ao processo de selecção.

Transformantes tendo integrações múltiplas onde um dos eventos de recombinação ocorre no local de marcação sobreviverão ao processo de selecção; no entanto, a probabilidade deste tipo de integrações múltiplas é extremamente baixa. Este evento pode, Consequentemente, levar a atabalhoamento mínimo da proteína policlonal. Além disso, devido a poder ter 100 a 1000 outros clones codificando a mesma proteína policlonal recombinante, mesmo se a expressão ectópica é alta, o efeito de atabalhoamento pode ser menor do que cerca de 1% se ocorrerem integrações múltiplas. Como mencionado anteriormente, a probabilidade de integração ectópica pode ser reduzida reduzindo a quantidade de DNA usada no método. O evento menos provável é uma integração em tandem múltipla no local de marcação. Usando o sistema Flp recombinase aqui descrito, este tipo de evento será raro porque a actividade de excisão do cromossoma é significativamente maior do que a actividade de integração. No entanto, a integração em 100 tandem deve ocorrer numa frequência inaceitavelmente alta, o sistema Flp pode ser trocado por um em que somente um inserto de cópia única é possível (ver, por exemplo, WO 99/25854; incorporado por referência). (e) Expressão dos seis anticorpos distintos em combinação conhecida em células de mamíferos

Geralmente, a fim de minimizar as taxas de proliferação variável, é preferível integrar cada GOI específico (neste caso, cada membro individual do banco mini-seis) em pelo menos 100, preferivelmente 1000 e mais preferido em 10.000 células. Uma linha celular policlonal contendo um grande número de células individuais expressando o mesmo GOI (para todos os GOIs) é estatisticamente esperada ser menos influenciada por diferenças em taxas de proliferação de células individuais e tem possibilidade reduzida de desvios na composição de proteína policlonal final.

Além disso, pode ser uma vantagem assegurar uma linha celular hospedeiras homogénea para a expressão. Isto pode ser obtido ao sub-clonar a linha celular hospedeiras antes da transfecção. Este processo é descrito no parágrafo com respeito à diversidade clonal.

Para bancos policlonais em que outro controlo de desvio é desejável, a composição final do produto de proteína policlonal pode ser controlada introduzindo um elemento de controlo transcripcional induzido na plataforma do vector de expressão. Elementos de controlo indutíveis apropriados incluem, por exemplo, BD Tet ligado/desligado (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) e GeneSwitch (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Estas comutações transcripcionais podem ser 101 induzidas num ponto de tempo apropriado (por exemplo, quando a poça de células é totalmente expandida) para minimizar qualquer desvio de proliferação devido à variação em expressão de gene ou do produto de proteína. A presente experiência não foi realizada com estes elementos de controlo.

Após transferir os seis GOIs seleccionados do vector de fagomídeo para os vectores de expressão de mamífero, tanto individualmente como descritos em (d.l) como por transferência em massa, como descrito em (d.2), os vectores de expressão de mamífero foram usados para transfecção num ponto activo numa linha celular CHO-Flp-In usando integração num locus específico para expressar os seis anticorpos distintos como descrito abaixo.

Para o GOI transferido individualmente (d.l), DNAs de plasmídeo foram propagados individualmente e usados para transfecção individual em células CHO Flp-In ou as cargas de TG1 foram propagadas individualmente, e após normalização de Οϋεοο para números de células de E. coli, as seis culturas foram misturadas e usadas para preparação de plasmídeo. Esta preparação de plasmídeo contendo os seis genes de interesse foi usada para transfecção em massa de células de mamífero para expressão de anticorpos policlonais recombinantes.

Para o GOI transferido em massa (d.2a ou d.2b), DNAs de plasmídeo tanto são transferidos em células CHO-Flp-In como amplificados e purificados (preparação de plasmídeo 3) de acordo com o procedimento descrito (d.2a ou d2.b) e, então, usados para transfecção em massa. 102 (e.l) Cultura de células A linha celular hospedeira CHO Flp-In (Invitrogen,

Carlsbad, CA) foi mantida em meio Hams F-12, com a adição de glutamina (2 mM) e FCS (10%) e 100 μρ/ιηΐ de Zeocin (Invitrogen, Carlsbad , CA). Para subcultura, as células foram destacadas por tripsina e divisão de acordo com instruções do fabricante. As células foram cultivadas a 5% de CO2, 37°C. Meio e aditivos do meio foram de Gibco.

Esta linha celular estável expressa o gene de fusão lacZ-Zeocin, tornando as células resistentes ao antibiótico Zeocin, uma resistência gue, guando da integração num locus especifico de um gene estranho, será perdida. As células contêm uma cópia única do local de marcação de recombinação de Flp (FRT) , e assim, são prontas para serem usadas como linha celular hospedeiras para integração dirigida ao local por uso do sistema Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA).

(e.2) Transfecção de células CHO

Placas de cultura de tecidos com 6 cavidades foram inoculadas com 4,0 x 105 células CHO-Flp-In/ cavidade, e incubadas durante a noite a 37°C/ 5% de CO2. A transfecção destas células foi realizada testando métodos de transfecção diferentes usando FuGENE 6 (Roche),

Lipofectine®, LipofectAmine® ou LipofectAMINE 2000® (Gibco), de acordo com as instruções do fabricante. Neste exemplo, LipofectAMINE 2000® foi usado como reagente de transfecção. Resumidamente, no dia antes da transfecção, células CHO-Flp-In cultivando espontaneamente foram semeadas como descrito acima e incubadas durante a noite a 103 37°C/ 5% de CO2. Cavidades com uma confluência de células de 85-95% foram usadas para a co-transfecção.

Dois tubos com os seguintes conteúdos foram preparados:

Tubo 1: 0,5 μρ de um vector de expressão individual com GOI descrito em (d.l) (por exemplo, pSymvc21 com OVA) + 4,5 μρ de mp040 (uma maxipreparação de pOG44) (uma Flp recombinase expressando plasmideo) foram adicionados a 250 μΐ de Optimem (tubos Eppendorf de 1,5 ml).

Tubo 2: 7,5 μΐ de LipofectAMINE 2000® foram adicionados a 250 μΐ de Optimem (tubos Eppendorf de 1,5 ml) e incubados em temperatura ambiente (TA) durante 5 min. O conteúdo do tubo 2 foi transferido para o tubo 1 seguido por incubação em TA durante 20 min.

Os complexos DNA-Lipofectamina foram transferidos às cavidades com células, de acordo com as instruções do fabricante.

Após 24 h, as células foram destacadas por tripsina, divisão (1:3) e distribuídas num frasco T-25 e em pratos petri de 100 mm e cultivadas em meio nutriente novo de mistura F-12 Ham + 10% de FCS + L-Glutamina 2 mM com 900 μρ de higromicina B/ml como pressão de selecção. (e.3) Selecção de integrantes específicos do local e subcultivo de células transfectadas

As células foram cultivadas sob pressão de selecção de 104 higromicina B durante duas a três semanas, neste período as células foram renovadas a cada 2 a 4 dias com meio novo contendo a mesma concentração de agente de selecção. A poça de células sobreviventes no frasco T-25 e em pratos Petri foram destacadas por tripsina, divididas (1:6) e distribuídas em frascos T para outra propagação sob a pressão de selecção mencionada acima. Alguns clones únicos foram seleccionados (usando os assim chamados cilindros de clonagem) dos pratos Petri contendo os transfectantes gerados de acordo com o método descrito em (d.l), e transferidos para cavidades novas para propagação e uso em estudos de níveis de expressão.

Cada poça de células ou clones únicos, que foi resistente à concentração de higromicina B limite, foi subsequentemente cultivada em confluência em placas de 6 cavidades, recolocadas em placa em pratos Petri, frascos T-25, T-80 e T-175 em seu meio respectivo mais higromicina B. Quando células cultivando exponencialmente alcançaram 80% de confluência em frascos de cultura T80, frascos de cada linha celular foram congelados e armazenados em congelador com nitrogénio líquido N2 (L) .

Para transfecção com uma mistura de plasmídeos contendo os seis genes de interesse (o banco mini-seis), as seis culturas individuais foram normalizadas em ODeoo para números de E. coli, misturadas e usadas para uma preparação de plasmídeo policlonal contendo os seis genes de interesse. Um procedimento de transfecção usando 7,5 vezes a quantidade dos reagentes e células descritos acima foi realizado, produzindo uma linha celular policlonal recombinantes expressando uma mistura dos seis anticorpos distintos. 105

As seis linhas celulares expressando membros individuais dos anticorpos seleccionados e a linha celular expressando a mistura dos seis anticorpos distintos foram, durante cultivo e propagação, testadas para produção de anticorpos por ELISA especifico de antigeno. (f) Monitorar a composição de uma linha celular policlonal expressando seis anticorpos distintos de combinação conhecida

Gerando uma mistura dos seis genes seleccionados de interesse, situados nos vectores de expressão seguidos por transfecção em massa e integração num locus especifico em células CHO-Flp-In, uma linha celular policlonal expressando seis anticorpos distintos foi gerada. A linha celular foi seguida durante 34 dias em que distribuição de genótipos, expressão de anticorpos e taxas de proliferação foram seguidas. Os resultados são descritos abaixo. (f.l) Distribuição de genótipos dos seis genes seleccionados de interesse em células CHO-Flp-In transfectadas com a preparação de plasmídeo da mistura normalizada de Οϋ6οο de células. A linha celular CHO-Flp-In policlonais foi tripsinizada e a suspensão de células diluída em 10 células/ml. Depois, 200 μΐ foram transferidos para cada cavidade de um total de dez placas de 96 cavidades. Aproximadamente 10 dias depois, as cavidades com colónias únicas foram identificadas por microscopia. Cavidades com colónias únicas foram lavadas lx em PBS e 50 μΐ de água foram adicionados. As placas foram 106 incubadas a 80 °C durante 10 min e lisados foram transferidos para outra placa de 96 cavidades. Dez μΐ dos lisados foram usados em 25 μΐ de OneStep RT-PCR (Qiagen) com os seguintes iniciadores: 5'-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3' (SEQ ID NO: 6) e 5'-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3'(SEQ ID NO: 7) RFLP foi realizado usando Hinfl e IVlalII em 10 μΐ de misturas RT-PCR em reacções de 15 μΐ que foram incubadas a 37 °C durante 2 horas. Os fragmentos de digestão foram visualizados usando electroforese de gel agarose seguido por coloração EtBr do gel. A distribuição de genótipo de células produzindo antiOVA, antiAP, antiP2m, antiHAP, antiFVIII e antiLYS foi seguido com o passar do tempo (16 e 34 dias após transfecção), ver figura 9. (f.2) ELISA de amostras de células CHO-Flp-In transfectadas com a preparação de plasmideo da mistura normalizada de OD6oo de E. coli (d.l) A linha celular CHO-Flp-In policlonal (e.3) foi tripnizada e 3 x 106 células foram depositadas em placa em frascos T-75 em F-12 HAM + 10% de FCS + L-glutamina 2 mM e 900 μρ de higromicina. O meio foi trocado todos os dias e, no dia 3, sobrenadantes foram seleccionados para ELISA. Antigenos, (P2-microglobulina (uma oferta da Universidade de Copenhagen), fosfatase alcalina (Sigma), ovalbumina (Sigma), factor VIII (uma oferta de Novo Nordisk, Dinamarca), lisozima de clara de ovo de galinha (Sigma) e haptoglobina (Sigma)) foram diluídos em tampão de carbonato 107 50 mM em 10 μg/ml. Placas de ELISA foram revestidas com antígeno (50 μΐ em cada cavidade) e incubadas durante a noite a 4°C. As cavidades foram lavadas 4 vezes com tampão de lavagem (lx PBS/0,05% de Tween 20) e bloqueadas durante 1 hora com 2% de leite desnatado em pó em tampão de lavagem (100 μΐ em cada cavidade). Amostras de 50 μΐ foram adicionadas às cavidades e as placas incubadas durante 1 hora em TA. As placas foram lavadas 4x e anticorpos secundários (conjugado IgG/HPR antirato de cabra (Sigma)) foram adicionadas durante 1 hora, seguido por 4x lavagem. O ELISA foi desenvolvido com substrato TMB (50 μΐ em cada cavidade, DAKO S1600) durante 5 min e as reacções interrompidas adicionando 50 μΐ de H2SO4 1 M. As placas foram lidas imediatamente a 450 nm. Dados demonstrando expressão de todos os seis anticorpos de interesse em lisados derivados no dia 34 após transfecção com a mistura de vectores de expressão codificando os seis genes de interesse são mostrados na figura 10. Deve ser observado que uma vez que os dados apresentados na figura 10 são derivados de seis ensaios ELISA específicos de antígenos diferentes, as leituras de OD450 não são directamente comparáveis em termos de quantidade de anticorpos. Níveis de expressão de anticorpos foram ainda analisados por ELISA de cabra antikappa em poças de células CHO-Flp-In transfectadas com cada GOI individual ou a mistura dos seis GOIs. O resultado é mostrado nas figuras 11. Isto mostra que os níveis de expressão de anticorpos são comparáveis entre as linhas celulares individualmente transfectadas (por exemplo, uma linha celular transfectadas com um vector codificando antiP2m expressa uma quantidade comparável de anticorpo comparada a uma linha celular transfectadas com um vector 108 codificando anticorpo antiAP). O termo poças de células CHO-Flp-In transfectadas com GOI individual, é usado aqui porque as linhas celulares individuais não são derivadas de clones únicos, mas de poças de clones, como descrito em e.3. (g) Conclusões da experiência

Em primeiro lugar, estas avaliações (testes) de conservação da policlonalidade no sistema de produção mostraram que transferência em massa dos seis genes colhidos de interesse dos bancos mini-seis (codificando antiOVA, antiAP, antiP2in, antiHAP, antiFVIII e antiLYS) de vectores de fagomideo em vectores de expressão de mamífero foi possível sem introdução de desvios de selecção ou proliferação (figura 7), terminando, assim, com frequências comparáveis dos seis genes de interesse seleccionados.

Em segundo lugar, a transfecção em massa de células CHO-Flp-In em células com uma mistura das construções contendo os seis genes seleccionados também resultou em distribuição comparável das construções em células de mamífero isoladas. As distribuições de genótipo dos seis genes de interesse seleccionados com o passar do tempo (16 e 34 dias após transfecção) também foram similares (figura 9), indicando que o sistema de expressão até o dia 34 manteve a distribuição igual, original dos seis genótipos, sem introduzir desvios de proliferação.

Em terceiro lugar, as células transfectadas em massa com a mistura dos seis genes de interesse mostraram expressão de todos os seis anticorpos, como examinado por ELISA específico de antígeno em sobrenadantes de células 34 dias após transfecção (figura 10). Os resultados de ELISA para 109 os diferentes antígenos não são directamente comparáveis em termos de quantidades de anticorpo, devido a afinidades de ligação diferentes. No entanto, um ELISA de captura baseado em revestimento com anticorpo de cadeia kappa antirato de cabra realizado em sobrenadantes de a) das seis linhas celulares CHO-Flp-In individualmente transfectadas gerados usando a preparação de vector, como descrito em (d.l) e b) em sobrenadantes da linha celular policlonal expressando uma mistura dos seis genes de interesse seleccionados mostraram niveis de expressão de anticorpos comparáveis dos seis genótipos.

Em resumo, foi demonstrado que é viável transferir um GOI policlonal em massa de um vector de fagomideo num vector de expressão de mamífero. Isto foi descrito previamente por Sharon (US 5.789.208). Além disso, uma mistura de construção de expressão de mamífero pode ser transfectada em células de mamífero em massa e mantida numa frequência comparável pelo menos até o dia 34 após transfecção. EXEMPLO 3a

Avaliação de conservação de policlonalidade em culturas de células geradas por transfecção em massa de um sub-clone da linha celular CHO-Flp-In com o banco mini-seis. (a) Sub-clonagem de uma linha celular CHO-Flp-In "original" A linha celular CHO-Flp-In original (Invitrogen) foi cultivada como descrito (exemplo 3, secção e.l). Após tripsinação, as células foram contadas e colocadas em 1 célula por cavidade numa placa de cultura de 96 cavidades. Aproximadamente 14 dias depois, 20 cavidades com colónias 110 únicas foram identificadas e as células foram tripsinizadas e transferidas para placas de 24 cavidades. Um dos sub-clones, clone 019 de CHO-Flp-In, foi seleccionado para estudos futuros após caracterização de comportamento da cultura bem como niveis de expressão. (b) Selecção e transfecção em massa de células do clone 019 de CHO-Flp-In A transfecção foi realizada em triplicata, e selecção das células do clone 019 de CHO-Flp-In foi essencialmente realizada como descrito (exemplo 3, secção e.2 e e.3), com excepção de que um marcador de selecção de neomicina substituiu o marcador de higromicina em pSymvc21 (figura 4.e). Consequentemente, geniticina (450 μg/ml) foi usada em vez de higromicina B durante selecção e cultura das células. (c) ELISA de amostras obtidas de células do clone 019 de CHO-Flp-In transfectadas em massa com o banco mini-seis

As células foram cultivadas durante 73 dias após transfecção e amostras para ELISA foram tomadas nos dias 17, 31, 45, 59 e 73. Um ELISA quantitativo (usando anticorpos mini-seis individualmente purificados como padrão) foi realizado como descrito (exemplo 3, secção f.2). Os resultados de três transfecções independentes são mostrados na figura 12. Perfis de expressão diferentes entre transfecções diferentes foram observados. No entanto, todos os seis anticorpos foram detectáveis em todas as experiências até o dia 59. (d) Conclusão da experiência 111

Experiências com sistema de selecção de neomicina em células do clone 019 de CHO-Flp-In mostraram perfis de expressão relativamente preservados de bateladas individuais, durante dois meses após transfecção em massa (figura 12). Este periodo de estabilidade é suficiente para fins de produção. A variação de batelada para batelada observada pode ser tratada com a geração e a formação de bancos de uma grande carga de congelamento do lote individual antes da produção.

EXEMPLO 3B

Avaliação de conservação da policlonalidade em culturas de células geradas misturando células CHO-Flp-In individualmente transfectadas após selecção. (a) Selecção e transfecção individual de células CHO-Flp-In

Os procedimentos experimentais para geração das seis linhas celulares expressando os membros individuais do banco mini-seis foram descritos anteriormente (exemplo 3, secção e.3). As seis linhas celulares expressando membros individuais do banco mini-seis foram misturadas imediatamente após selecção em números iguais (5xl05 de cada linhagem de célula) e a população de célula misturada foi cultivada durante 85 dias. Três misturas separadas foram feitas das linhas celulares individuais. (b) ELISA de amostras obtidas de culturas de células policlonais geradas em (a)

Amostras foram tomadas a cada quinzena e a composição dos 112 anticorpos expressados do banco mini-seis foi determinada por ELISA como descrito (exemplo 3, secção f.2). ELISA foi realizado nos dias 8, 17, 30, 45, 57, 72 e 85 após a mistura. Os resultados (média ± desvio padrão de experiência em triplicata) são mostrados na figura 13. Todos os seis anticorpos foram detectáveis 85 dias após mistura. Como anteriormente mencionado (exemplo 3, secção f.2), as leituras para anticorpos diferentes não foram directamente comparáveis, mas os dados apresentados na figura 13 mostram perfis de expressão relativamente estáveis pelo menos até 45 dias após mistura, após o que uma queda geral na produtividade foi observada. Além disso, a comparação de resultados obtidos de três misturas independentes mostrou perfis de expressão similares com o passar do tempo dos anticorpos mini-seis, indicando que os resultados foram reprodutíveis. (c) Conclusão das experiências

Culturas de células policlonais compostas de misturas de células individualmente transfectadas com membros distintos do banco mini-seis mostraram conservação composicional pelo menos até o dia 45 após a mistura. Uma conservação composicional durante 45 dias será, na maioria dos casos, tempo suficiente para fins de produção. Além disso, experiências em triplicata deram resultados similares, indicando assim que a mistura de células individualmente transfectadas com diferentes construções resulta em culturas de células misturadas com baixa variação de batelada para batelada. EXEMPLO 4 113

Estabelecimento de uma linha celular produzindo anticorpo policlonal recombinante antiovalbumina (a) Expressão de uma composição de anticorpo policlonal antiovalbumina

Uma colecção de clones de fago com ligação a ovalbumina totalmente caracterizados foi identificada como a seguir. Quatro ratos BALB/c do sexo feminino de oito semanas de idade foram imunizados i.p. e s.c. com 50 μg de OVA em adjuvante de Freunds total e reforçados com OVA em adjuvante de Freunds incompleto nos dias 21 e 42 após o dia 0 de imunização, e confirmou-se que todos os animais tinham convertido soro contra OVA, como medido por um ELISA especifico de antigeno. Os baços foram colhidos do rato com melhor resposta nos dias 31 e 52. Bancos de fagomideo exibindo Fab foram gerados de RNA esplénico, usando o vector de fagomideo (SymvclO) como anteriormente descrito. Os bancos resultantes continham aproximadamente 106 clones independentes. A selecção destes bancos foi realizada reagindo 5 x 1011 fagomideos exibindo Fab com OVA revestido em imunotubos NUNC, seguido por lavagem e eluição de ácido de fagos de ligação. Como os eluidos do primeiro ciclo de panning continham uma proporção significativa de aglutinantes de OVA, os eluidos dos primeiro e segundo ciclos de panning foram triados para clones de fago de ligação a OVA.

Inicialmente, clones de fago reactivos com OVA foram identificados por ELISA. Em resumo, placas de ELISA foram revestidas com OVA e feitas reagir com os Fabs exibidos nos fagos, seguido por um anticorpo secundário conjugado HRP. Para controlos negativos, antigenos irrelevantes (BSA) ou 114

Fabs exibidos nos fagos irrelevantes (antiAP) foram usados.

Além disso, um método HDS, baseado na imobilização de OVA em membranas PVDF, foi estabelecido. Estes dois métodos resultaram na identificação de subconjuntos separados de clones, isto é, alguns clones que reconheceram OVA numa configuração e não na outra e vice-versa. Para clones de fago exibindo Fab que reagiram com OVA tanto com ELISA como HDS, a sequência de nucleótido codificando o dominio variável de VH foi determinada por sequenciamento de DNA, e a diversidade genética foi estimada por análise filogenética, usando o software Vector NTI. 0 painel resultante inclui 127 clones de ligação a OVA, para todos os quais as sequências de nucleótido s da parte variável do VH foi estabelecida.

Fragmentos de Fab expressados pelos 127 clones de ligação a OVA têm todos a capacidade de ligar-se à ovalbumina tanto na forma nativa como desnaturada. Deste aspecto, os requerentes identificaram aproximadamente 30 clones diferentes contidos num vector de fagomideo, por exemplo, pSymvclO, a serem usados para transferência em massa e expressão de mamifero. Estes anticorpos são expressados tanto na forma de anticorpos IgA, IgG2A como IgG2B de rato. Devidos as requerentes terem caracterizado totalmente as sequências de DNA destes clones produzindo anticorpos, as requerentes são capazes de monitorar a distribuição dos genótipos por todo o procedimento de transferência em massa e expressão de mamifero usando os mesmos métodos como usados para o sistema modelo com os seis anticorpos distintos descritos no exemplo 3. (b) Transferência em massa das sequências de anticorpos 115 específicas de OVA num vector para expressão de mamífero A transferência de genes de interesse de um vector de fagomídeo para um vector de expressão é um procedimento em duas etapas (ilustrado na figura 4), onde a primeira etapa é a troca de promotores com o cassete de promotor com orientação cabeça-a-cabeça dos promotores de mamífero seleccionados, isto é seguido transferindo a região variável dos genes de interesse e o cassete de expressão para um vector de expressão. A cassete de promotor cabeça-a-cabeça (promotor A/ promotor B) pode ser inserido no vector de fagomídeo de cada clone usando um digesto Saci/Xhol seguido por uma ligação resultando em troca de promotores de promotor bacteriano em mamífero (pSymvcl2).

Um digesto .EcoRI e Not I irá movimentar, então, as sequências codificando a cadeia pesada variável, a cassete de promotor cabeça-a-cabeça (promotor A/ promotor B) e a cadeia kappa completa do vector de fagomídeo (pSymvcl2) num vector codificando isotipo, pSymvc20. 0 vector pSymvc20 pode aceitar qualquer fragmento Notl/EcoRI do vector de fagomídeo. Este fragmento pode transferir a sequência codificando a cadeia pesada variável para conectar com as sequências de cadeia pesada constantes em pSymvc20, bem como a sequência total codificando a cadeia kappa a ser conectada com a sequência bGH PolyA. Esta transferência em massa resultará em vectores de expressão, como mostrado na figura 1, que expressam as regiões pesadas variáveis e as cadeias kappa totais como anticorpos IgG2B de rato após a transferência em massa. 0 vector, pSymvc20, pode conter as regiões constantes de rato da cadeia pesada dos genes IgA, IgG2A, IgG2B, IgE ou 116

IgGl, e é assim capaz de expressar quaisquer isotipos de imunoglobulina de rato relevantes de escolha. (c) Expressão de um anticorpo policlonal recombinante antiovalbumina

Por transferência em massa, as sequências codificando a região variável da cadeia pesada, os promotores e a cadeia kappa total são movidos de um banco de vector de fago para vectores codificando isotipo resultando numa composição de vector de expressão de mamífero policlonal. Isto é seguido por transfecção e integração num locus especifico numa linha celular CHO-Flp-In, gerando uma linha celular produzindo anticorpos policlonais recombinantes. Esta última linha celular é gerada marcando o gene de interesse codificando cada membro da proteina policlonal recombinante na mesma localização especifica no genoma de cada célula transfectada, e ao mesmo tempo integrando somente uma cópia da construção de expressão contendo a referida sequência de ácido nucleico em cada célula transfectada.

As culturas de célula e o procedimento de transfecção e selecção são as mesmas como descrito no exemplo 3 (e.l-e. 3) . (d) Monitorização da estabilidade da composição

Para assegurar que a transfecção e transferência em massa em células de mamífero ocorrem sem introdução de desvios consideráveis com relação à clonagem, expressão e diversidade entre os clones individuais, o processo de transferência em massa e a expressão de mamífero podem ser monitorizados com os seguintes métodos: 117 1) Análise de tempo de geração das poças de células de cada construção transfectada 2) Análise de nivel de expressão das poças de células de cada construção transfectada, 3) Análise por RFLP em células únicas, 4) ELISA da mistura de anticorpos produzida, 5) Espectrometria de massa da mistura de anticorpos produzida, 6) Análise por Taqman PCR (PCR em tempo real) numa medida de batelada definida usando iniciadores específicos da região V para identificar relações de cada clone diferente, ou 7) Análise da batelada com o passar de tempo cultivada com e sem pressão de selecção (higromicina) pode ser realizada pelos seguintes parâmetros: a) distribuição clonal b) níveis de expressão de proteína (quantidade e distribuição) c) estabilidade genómica d) efeitos de adaptação em meio isento de soro. (e) Produção de uma composição de anticorpos policlonais recombinantes antiovalbumina 118 A linha celular CHO-Flp-In produzindo anticorpos policlonais recombinantes é cultivada em sistemas de cultura diferentes, incluindo frascos de cultura pequenos convencionais, produção de células de múltiplas camadas Nunc e bio-reactores pequenos de alto rendimento (MiniPerm, INTEGRA-CELLine). Além disso, as linhas celulares são adaptadas em suspensão isenta de soro para cultura subsequente em frascos giratórios, fibras ocas e bio-reactores .

Os meios usados para cultivar as linhas celulares seleccionadas são isentos de soro, isentos de proteínas ou meios quimicamente definidos, como recomendado pelo fabricante (Invitrogen, B&D, Hyclone).

Os sobrenadantes de células fixadas ou em suspensão que são cultivados sem selecção (higromicina) foram colhidos. Os sobrenadantes colhidos são analisados e caracterizados como descrito (3f). Os rendimentos de produção, funcionalidade e qualidade dos anticorpos produzidos são verificados durante e após o cultivo das células em condições de batelada alimentada ou perfusão. As células em suspensão são usadas para inoculação em frascos giratórios grandes ou bio-reactores . O anticorpo policlonal dos sobrenadantes colhidos é purificado para uso posterior no estudo dos animais.

Lisboa,28 de Setembro de 2006 119

LISTAGEM DE SEQUENCIA A o \—1 \—1 V Symphogen A/S <12 0> MÉTODO PARA PRODUZIR PROTEÍNAS POLICLONAIS

RECOMBINANTES <130> 15685PCT00 <160> 7 <17 0> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <4 0 0> 1 gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttc 48 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador de PCR sintético <4 0 0> 2 gcattgacag gaggttgagg c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador de PCR sintético <4 0 0> 3 gctgccgacc gctgctgctg gct 23 <210> 4 <211> 21

<212> DNA 120 <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador de PCR sintético <4 0 0> 4 gcattgacag gaggttgagg c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador de PCR sintético <4 0 0> 5 gtgtccactc tgaggttcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador de PCR sintético <4 0 0> 6 caaatagccc ttgaccaggc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador de PCR sintético <4 0 0> 7 gtgtccactg tgaggttcag 20

Claims (45)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para gerar uma colecção de células apropriada como uma linha celular produzindo policlonal recombinante, o referido método compreendendo: a) proporcionar um banco de vectores compreendendo uma população de sequências de ácidos nucleicos variantes, em que cada um dos referidos vectores compreende 1) uma cópia única de uma sequência de ácido nucleico distinta codificando um número distinto de uma proteína policlonal compreendendo membros distintos que ligam a um antígeno particular e 2) uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinase; b) introduzir o referido banco de vectores numa linha celular hospedeira, em que o genoma de cada célula individual da referida linha celular hospedeira compreende sequências de reconhecimento de recombinase, igualando as do vector, num local especifico único no seu genoma; c) assegurar a presença nas referidas células de uma ou mais recombinases de modo a que as sequências de ácidos nucleicos variantes da etapa (a) são integradas especificamente no local nas células da linha celular hospedeira, em que as referidas uma ou mais recombinases é/são i) expressadas pelas referidas células em que a referida sequência de ácido nucleico é introduzida; ou ii) codificada de modo operativo pelos vectores da etapa a) ; ou iii) 2 proporcionada através da expressão de um segundo vector; ou iv) proporcionada para a célula como uma proteína; e d) seleccionar células compreendendo uma cópia integrada do referido banco de sequências de ácidos nucleicos variantes.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína policlonal não é naturalmente associada com a referida colecção de células.

3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida proteína policlonal é um anticorpo policlonal ou fragmento de anticorpo.

4. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida proteina policlonal é um receptor de célula T policlonal ou fragmento de receptor de célula T.

5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o referido banco de vectores é introduzido na referida linha celular hospedeira por transfecção em massa de uma colecção das referidas células hospedeiras com o referido banco de vectores.

6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido banco de vectores é introduzido na referida linha celular hospedeira por transfecção de semi-massa das alíquotas das referidas células hospedeiras com fracções compreendendo 5 a 50 vectores individuais do referido banco de vectores, e as referidas células são reunidas para formar uma 3 colecção de células apropriadas como uma linha celular de produção de policlonal recombinante anterior ou subsequente à selecção da etapa (d).

7. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido banco de vectores para inteqração especifica no local é introduzido na referida linha celular hospedeira por transfecção das referidas células hospedeiras separadamente com membros individuais da referida biblioteca de vectores, e as referidas células são reunidas para formar uma colecção de células apropriadas como uma linha celular de produção de policlonal recombinante anterior ou subsequente à selecção da etapa (d).

8. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a população de ácidos nucleicos variantes na etapa (a) é isolada ou identificada com a ajuda de um procedimento de triagem que permite a identificação e/ou isolamento de ácidos nucleicos que codificam proteina a qual liga o referido antigeno particular.

9. 0 método de acordo com a reivindicação 8, em que o procedimento de triagem inclui uma etapa de biopanning e/ou um teste de imunodetecção.

10. O método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o referido procedimento de triagem é seleccionado de entre o grupo consistindo em exibição de fagos, exibição de ribossomas, exibição de DNA, exibição de peptideo RNA, exibição covalente, exibição de superficie bacteriana, exibição de superficie de 4 levedura, exibição de virus eucariótico, ELISA e ELISPOT.

11. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida biblioteca de sequências de ácido nucleico variante compreende pelo menos 3 sequências de ácidos nucleicos variantes.

12. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que os membros individuais da referida biblioteca de sequências de ácidos nucleicos variantes são integrados em um locus genómico predefinido único de células individuais na referida colecção de células, o referido locus sendo capaz de mediar a expressão em alto nivel de cada membro da referida proteína policlonal recombinante.

13. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que cada sequência de ácido nucleico distinta compreende um par de segmentos de genes que codificam um membro de uma proteína policlonal composta de duas cadeias de polipeptídeos diferentes.

14. O método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido par de segmentos de genes compreende uma sequência codificando uma região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma sequência codificando uma região variável de cadeia leve de anticorpo.

15. 0 método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido par de segmentos de genes compreende uma sequência codificando uma região variável de cadeia alfa de receptor de células T e uma sequência 5 codificando uma região variável de cadeia beta de receptor de células T.

16. 0 método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido par de segmentos de genes compreende uma sequência codificando uma região variável de cadeia gama de receptor de células T e uma sequência codificando uma região variável de cadeia delta de receptor de células T.

17. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o referido banco de sequências de ácido nucleico variante compreende uma diversidade de ocorrência natural localizada dentro das sequências de ácidos nucleicos variantes.

18. 0 método de acordo com a reivindicação 17, em que a diversidade de ocorrência natural está localizada nas regiões CDR presentes nas referidas sequências de ácidos nucleicos variantes.

19. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida colecção de células é derivada de uma linha celular de mamíferos ou tipo de células.

20. O método de acordo com a reivindicação 19, em que a referida linha celular de mamíferos é seleccionada de entre o grupo consistindo em células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS, células ΒΗΚ, YB2/0, NIH 3T3, células de mieloma, fibroblastos, HeLa, HEK 293, PER.C6, e linhas celulares derivadas das mesmas. 6

21. Um método para a produção de uma proteína policlonal, em que a referida proteína policlonal compreende membros distintos que ligam um antígeno particular, o referido método compreendendo: a) proporcionar uma colecção de células compreendendo um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes, onde cada uma das referidas sequências de ácido nucleico codifica um membro distinto da referida proteína policlonal e onde cada uma das referidas sequências de ácido nucleico são integradas no mesmo e único local do genoma de cada célula individual na referida colecção de células; b) cultivar a referida colecção de células sob condições que facilitam a expressão da referida proteína policlonal; e c) recuperar a referida proteína policlonal expressada das células de cultura de células ou sobrenadante de cultura de células.

22. 0 método de acordo com a reivindicação 21, em que a colecção de células na etapa (a) é gerada de acordo com 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

23. O método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que a proteína policlonal não é naturalmente associada com a referida colecção de células.

24. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, em que o banco de ácidos nucleicos variantes 7 na etapa (a) é isolado ou identificado numa etapa anterior pela ajuda de um procedimento de triagem que permite a identificação e/ou isolamento de ácidos nucleicos que codificam a proteina que liga o referido antigeno particular.

25. 0 método de acordo com a reivindicação 24, em que o procedimento de triagem inclui uma etapa de biopanning e/ou um teste de imunodetecção.

26. 0 método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que o referido procedimento de triagem é seleccionado de entre o grupo consistindo em exibição de fagos, exibição de ribossomas, exibição de DNA, exibição de peptideo RNA, exibição covalente, exibição de superfície bacteriana, exibição de superfície de levedura, exibição de vírus eucariótico, ELISA e ELISPOT.

27. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, em que a referida proteína policlonal é um anticorpo policlonal ou fragmento de anticorpo.

28. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, em que a referida proteína policlonal é um receptor de células T policlonal ou um fragmento de receptor de células T.

29. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, em que os níveis de expressão relativos das sequências de ácidos nucleicos variantes são monitorizados.

30. O método de acordo com a reivindicação 29, em que os referidos niveis de expressão são monitorizados em nivel de mRNA e/ou nivel de proteína.

31. O método de acordo com a reivindicação 29 ou 30, em que o cultivo na etapa (b) é terminado no último, quando os níveis de expressão relativos estão fora de uma faixa predeterminada.

32. Uma linha celular produzindo policlonal recombinante, compreendendo uma colecção de células transfectadas com um banco de sequências de ácidos nucleicos variantes, em que cada célula na colecção é transfectada com e capaz de expressar um membro do banco, que codifica um membro distinto de uma proteína policlonal que liga um antígeno particular e que está localizada no mesmo local único no genoma de células individuais na referida colecção, em que a referida sequência de ácido nucleico não é naturalmente associada com a referida célula na colecção.

33. A linha celular produzindo policlonal recombinante de acordo com a reivindicação 32, em que o referido banco de sequências de ácidos nucleicos variantes codifica um anticorpo policlonal ou um fragmento de anticorpo tendo uma diversidade de ocorrência natural entre os membros individuais do referido anticorpo policlonal ou fragmentos de anticorpo.

34. A linha celular produzindo policlonal recombinante de acordo com a reivindicação 32, em que o referido banco de sequências de ácidos nucleicos variantes codifica um receptor de células T policlonais ou fragmento de 9 receptor de células T tendo uma diversidade de ocorrência natural entre os membros individuais do referido receptor de células T policlonais ou fragmento de receptor de células T.

35. A linha celular produzindo policlonal recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, em que a referida colecção de células é derivada de uma linha celular de mamíferos ou tipo de células.

36. A linha celular produzindo policlonal recombinante de acordo com a reivindicação 35, em que a referida linha celular de mamíferos é seleccionada de entre o grupo consistindo em células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS, células BHK, YB2/0, NIH 3T3, células de mieloma, fibroblastos, HeLa, HEK 293, PER.C6, e linhas celulares derivadas das mesmas.

37. Um banco de vectores para integração específica de local, compreendendo uma população de sequências de ácidos nucleicos variantes de ocorrência natural em que cada um dos referidos vectores compreende 1) uma cópia de uma sequência de ácido nucleico distinta codificando um membro distinto de uma proteína policlonal que liga um antígeno particular e 2) uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinases.

38. 0 banco de acordo com a reivindicação 37, em que a referida população de sequências de ácido nucleico variante de ocorrência natural codifica um anticorpo policlonal ou fragmento de anticorpo.

39. 0 banco de acordo com a reivindicação 37, em que a 10 referida população de sequências de ácido nucleico variante de ocorrência natural codifica um receptor de células T policlonais ou fragmento de receptor de células T.

40. O banco de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, em que cada membro do referido banco de vectores compreende ainda uma sequência de ácido nucleico codificando recombinase.

41. Uma colecção de células compreendendo um banco de sequências de ácido nucleico variantes, em que cada uma das referidas sequências de ácido nucleico codifica um membro distinto de uma proteína policlonal compreendendo membros distintos que ligam um antígeno particular, em que cada uma das referidas sequências de ácido nucleico é integrada no mesmo local único do genoma de cada célula individual na referida colecção de células, e em que a referida sequência de ácido nucleico não é naturalmente associada com referida célula na colecção.

42. A colecção de células de acordo com a reivindicação 41, em que o banco de sequências de ácido nucleico variantes é um banco como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 40.

43. A colecção de células de acordo com a reivindicação 41 ou 42, em que pelo menos 50% das sequências de codificação originalmente presentes no banco podem ser identificadas como membros individuais diferentes da proteína policlonal final expressada da referida colecção de células. 11

44. Uma linha celular expressando um anticorpo policlonal transfectada com um banco de pares de segmentos de genes VH e VL, em que cada célula na linha celular é transfectada com e capaz de expressar um par de genes VH e VL do banco, que codifica um membro distinto de um anticorpo policlonal que liga um antigeno particular e que está localizado no mesmo local único no genoma das células individuais na referida linha celular, em que referida sequência de ácido nucleico não é naturalmente associada com referida célula na colecção.

45. A linha celular de acordo com a reivindicação 44, em que o banco de pares de segmentos de genes VH e VL é um banco de acordo com a reivindicação 38. Lisboa,28 de Setembro de 2006