JP2011504721A - 組み換えポリクローナルタンパク質を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)発現ベクターの1セットであって、前記ベクターの各々が前記ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーをコードする別個の核酸の少なくとも1コピーを含むものを提供し;
b)発現ベクターの細胞ゲノムへの部位特異的な組み込みを回避する条件下において、宿主細胞を前記発現ベクターの各々で別々にトランスフェクトし、それにより2からn個の細胞の組成物であって、各組成物がポリクローナルタンパク質の1つの別個のメンバーを発現するものを得て;
c)前記2からn個の細胞の組成物を混合してポリクローナル細胞株を得ること
を含む方法を関する。
a)本発明の方法を用いて得られたポリクローナル細胞株を提供し;
b)ポリクローナルタンパク質の発現を可能にする条件において、ポリクローナル細胞株を培養し;次いで
c)細胞または培地からポリクローナルタンパク質を回収し、任意選択的に精製すること
を含む方法に関する。
「タンパク質」または「ポリペプチド」によると、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸鎖のいずれかが意味される。タンパク質は、2つまたはそれ以上の組み立てられたポリペプチド、タンパク質のフラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含む、単量体または多量体として存在することができる。
本発明は、好ましくは、免疫グロブリン様ドメインを有するタンパク質の1つのファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される組み換えポリクローナルタンパク質の安定した製造方法を提供する。このメンバーのほとんどは、細胞表面認識イベントに関与する。配列解析は、抗体、T細胞受容体、MHC分子、いくつかの細胞接着分子およびサイトカイン受容体が高い相同性であることを示唆する。特に、可変領域を含むこのファミリーのメンバーは、本発明による組み換えポリクローナルタンパク質の作成に適当である。かかるメンバーは、抗体、膜結合抗体(B細胞受容体)、Fabフラグメント、Fvフラグメント、単一鎖Fv(scFv)フラグメント、T細胞受容体(TcR)、可溶性TcR、TcR可溶性ドメインフラグメント、ポリペプチドリンカーまたはその他の抗体により連結されたTcR可溶性ドメインフラグメントあるいはTcR由来のフラグメントを含む。特に、本発明は、組み換え治療用ポリクローナル抗体とTcRの大規模な製造および産生に用いることができることが意図される。
ポリクローナルタンパク質の1つの特徴は、多くの各々のタンパク質により構成されており、各タンパク質分子が、ポリクローナルタンパク質のその他の分子に相同であるだけでなく、ポリクローナルタンパク質の別個のメンバー間のアミノ酸配列における相違により特徴付けられる可変性を有することである。好ましくは、相違は、ポリクローナル抗体の全体構造の異なる領域に限定される。かかる領域は、例えば、抗体の可変領域またはTcRであり、可能な限り、これらの領域におけるCDR領域に限定される。この可変性はまた、核酸レベルならびにタンパク質機能レベルの両方、例えば、標的に対する特異性および親和性の相違において同定されうる、多様性として記載することができる。
宿主細胞は、DNAを染色体に組み込むことができるか、あるいは、ミニ染色体、YAC(酵母人工染色体)、MAC(マウス人工染色体)、またはHAC(ヒト人工染色体)のごとき染色体外エレメントを保持することができるいずれかの細胞から作成することができる。MACおよびHACは、出典明示により援用されるWO 97/40183に詳細に記載される。好ましくは、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髄腫細胞(例えば、Sp2/0、YB2/0またはNS0細胞)、NIH3T3のごとき線維芽細胞、ならびに、HeLa細胞、HEK293細胞、またはPER.C6のごとき不死化細胞のごとき哺乳動物細胞が用いられる。しかしながら、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、大腸菌などのごとき非哺乳動物の真核または原核細胞もまた用いられうる。
以下の記載は、哺乳動物発現系の使用に関する。適切な改変を伴って細菌の発現用に本発明の方法を使用することも同様に可能である。
本発明の好ましい具体例において、使用はポリクローナルワーキング細胞バンク(pMCB)およびポリクローナルマスター細胞バンク(pWCB)から構成される。
本発明の組み換えポリクローナルタンパク質は、バッチ、流加培養および灌流プロセスを含むが、これらだけに限定されない適切な培養様式を用いて製造されてもよい。
核酸配列を細胞に導入する方法は、当該技術分野で知られている。これらの方法は、典型的に、目的の配列を細胞、ゲノム、染色体外エレメントに導入するDNAベクターの使用を含む。細胞のトランスフェクションは、リポフェクション、化学的に介在されたトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、RBCゴースト融合、プロトプラスト融合、ウイルス形質導入、およびこれらに類似する方法を含む、当業者に知られる多くの方法により達成されてもよい。
表2.トランスアクチベーター/プロモーターペアの例
本発明によると、多クローン性が実際に変化した時に産生を中止できるため、発現系における多クローン性が産生中に重大に変化していないことを確認することが大抵の場合に重要である。これは、本発明では変異核酸配列の相対的な発現レベルをモニターすることにより行われうる。発現レベルは、例えば、RFLP解析、アレイまたはリアルタイムPCRを用いるmRNAレベル、あるいは例えば、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析または様々なクロマトグラフィー技術を用いるタンパク質レベルでモニターすることができる。これらの技術を用いて、発現レベルが(全体または相対の両方で)変化したかどうかを測定するために、多くの全ての別個の発現レベルに関する基準値を確立し、次いで産生中の培養物からサンプルを取り出することができる。本発明の通常の実施において、基準値付近の値の範囲が設定され、相対的な発現レベルが範囲外に見出される場合に産生が終結される。
上述のごとく産生されるポリクローナル細胞株は、細胞のゲノムに挿入される変異核酸配列によりコードされる目的のポリクローナルタンパク質を発現するために適当な条件下で適当な培地で増殖されてもよい。細胞培養は、いくつかの工程で実施されてもよい。哺乳動物細胞を用いる場合、選択される細胞は、好ましくは、懸濁ならびに血清を含まない条件における増殖に適応される。血清を含まない培地における増殖への適応はまた、ポリクローナル細胞株についてクローン化された細胞株を混合する前に有利に行われてもよい。適応は、1または2つの工程および選択圧の有無で行われうる。好ましくは、製造された薬剤の純度を落とすことなく製造中に選択できる選択系が用いられる。一般的に、医薬用途のための組み換えタンパク質の製造においては、最終産物が一切の抗生物質の痕跡を含まないことを実証することが必要となるため、例えば、抗生物質またはその他の低分子量薬物を使用することなく選択圧を供することが好ましい。
培養上澄み液からの特定のタンパク質の単離は、タンパク質の物理−化学的特性における相違、例えば、分子量、正味荷電、疎水性、または特定のリガンドもしくはタンパク質に対する親和性における相違を利用する様々なクロマトグラフ技術を用いることが可能である。それゆえ、タンパク質は、分子量を用いるゲルろ過クロマトグラフィーによるか、あるいは正味荷電を用いるイオン交換(陽イオン/陰イオン)クロマトグラフィー、代わりにクロマト分画により分離されてもよい。同様に、タンパク質は、疎水性を用いる疎水性相互作用または電荷誘導クロマトグラフィー、あるいは特定の固定化リガンドまたはタンパク質に対する親和性の相違を利用するアフィニティークロマトグラフィーにより分離されてもよい。それゆえ、タンパク質の複合混合物の分離は、様々なクロマトグラフ原理の連続的な組み合わせにより行われてもよい。したがって、タンパク質の混合物は、例えば、正味荷電を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより最初に分離されてもよく、同様の正味荷電のタンパク質は、後に、高濃度の選択された塩の存在下において、分子量を用いるゲルろ過クロマトグラフィーまたは疎水性を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー後に分離されてもよい。
抗体およびTcRのごときポリクローナルタンパク質の構造の特徴付けは、混合物の複雑性(クローン多様性およびグリコシル化)のために高い分解能を必要とする。ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたは電気泳動のごとき従来のアプローチは、別個の抗体間を区別するのに十分な分解能を有さないかもしれない。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D−PAGE)は、複合タンパク質混合物のプロファイリング、次いで質量分析(MS)または液体クロマトグラフィー(LC)−MS(例えば、プロテオミクス)に用いられる。2D−PAGEは、タンパク質の荷電と質量に基づいた分離を組み合わせ、血清サンプル中のポリクローナル、オリゴクローナルおよびモノクローナル間を区別するのに有用であることが証明されている。しかし、この方法はいくつかの制約を有する。クロマトグラフ技術、特に、エレクトロスプレーイオン化MSにカップルされたキャピラリーおよびLCは、複合体ペプチド混合物の解析にますます適用されている。LC−MSは、モノクローナル抗体の特徴付けに用いられる。極めて複雑なサンプルの解析は、クロマトグラフ系のより分解する力を必要とし、それは二次元(またはそれ以上)の分離により得られうる。かかるアプローチは、一次元におけるイオン交換、および任意選択的にMSにカップルされた二次元における逆相クロマトグラフィー(または疎水性相互作用)に基づきうる。
ポリクローナルタンパク質は、例えば、同一の標的に対する特異性または同様の活性を有するポリクローナルタンパク質との比較研究を通して機能的に特徴付けられうる。かかる研究は、インビトロならびにインビボで実施されうる。
本発明の具体例において、有効成分として免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される組み換えポリクローナルタンパク質を含む治療用組成物は、哺乳動物における疾患の治療または予防が意図される。
本発明による医薬組成物は、哺乳動物における疾患の処置、軽減または予防に用いられてもよい。本医薬組成物で処置されうる疾患は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、アレルギー、喘息およびその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、中枢神経系の疾患、代謝性および内分泌性疾患、移植拒絶および所望されない妊娠を含む。
本発明の別の具体例は、診断キットおよび環境検出用途のためのキットならびにこれらのキットを使用する方法を対象とする。本発明によるキットは、本発明により調製された組み換えポリクローナルタンパク質を含み、このタンパク質は、検出可能な標識で標識されてもよく、あるいは非標識用に標識されなくてもよい。標識された場合、本組み換えポリクローナルタンパク質は、標的分子を含むとされるサンプルに添加されてもよく、標識の存在または不在が標的分子の存在または不在を示す。テストされるサンプルは、血液、血清、血漿、髄液、リンパ液または尿のごとき体液サンプルあるいは混入物を有する疑いのある環境供給源からのサンプルのごとき非哺乳動物サンプルであってもよい。非哺乳動物サンプルは、水、空気または混入された土であってもよい。非標識検出は、結合によるBIAcoreにおける屈折率変化の測定を包含し、組み換えポリクローナルタンパク質は標的分子を捕捉するのに用いられる。
以下の実施例は本発明を例示するが、発明の範囲を限定するものとして考慮されるべきではない。
用いたIgG発現ベクターを図2aに示す。
用いた細胞株は、コロンビア大学のローレンスチェイスンから譲渡された(Gibcoカタログ番号12613−014からも利用可能である)DHFR陰性CHO細胞株DG44の誘導物である。DG44細胞を、ベクターpcDNA3.1+(カタログ番号V790−20、Invitrogen)中におけるアデノウイルスタイプ5トランスアクチベーターE1Aの13SバージョンのcDNA(NCBI受入番号AY339865、cDNA配列:atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataa)でトランスフェクトした。形質転換体を500μg/ml濃度のジェネテシン(Invitrogen)で選択した。選択後、細胞を限定希釈により単一細胞にクローン化した。クローンを、(上に示される)抗体プラスミドによる一過性トランスフェクションによりCMVプロモーターのトランス活性化(発現の改善)についてテストした。単一クローンは、トランスフェクトされていないDG44細胞株と比較して、3倍改善した一過性アッセイの発現レベルを示した。上昇した発現レベルは、実際のトランスアクチベーションの証拠ではなく、特に高い発現のサブクローンの選択により引き起こされうる。安定なトランスフェクションを用いて行った比較において、選択したプールは、野生型DG44細胞株と比較して、4〜5倍の増加した発現レベルを示した。このクローン(ECHOと呼ぶ)を、2回サブクローン化し、このクローンはCMVプロモーターのトランスアクチベーター(発現の改善)に関して安定であるように見えた。CMVプロモーターの実際のトランスアクチベーションを測定しなかったが、それにもかかわらず、クローンはCMVプロモーターの制御下で抗体の安定で高い発現を示した。
用いた抗体発現プラスミドを上述のごとく構築した。このために、異なるワクシニアウイルス表面タンパク質に対して指向される異なる抗体を選択した。それらの各々が、異なる抗体の混合物において同定と定量を可能にするイオン交換クロマトグラフィーの極めて特徴的なプロファイルを有するため、それらを選択した。(WO 2007/065433として公表された名称「Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody」の2006年12月4日付提出の同時係属中のPCT/DK2006/000686で開示される)抗体は:
・Sym002-037(クローン002-037)
・Sym002-186(クローン002-186)
・Sym002-235(クローン002-235)
・Sym002-286(クローン002-286)
・Sym002-303(クローン002-303)
・Sym002-482(クローン002-482)
であった。
IgGをサンドイッチELISAにより測定した。簡単に説明すると、96−ウェルプレート(Maxisorp、NUNC)をヤギ抗ヒトFc(Serotec、STAR106)でコートし、次いでサンプルおよび標準物質(精製したヒトモノクローナルIgG1カッパ抗体)とインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼと抱合したヤギ抗ヒトカッパ軽鎖(Serotec、STAR100P)で検出を行った。
ECHO細胞を、10%ウシ胎児血清(FCS)(Invitrogen)含有のヌクレオシド(Invitrogenカタログ番号32571)を含むMEMアルファ培地中に1フラスコあたり0.30×106個の細胞密度でT80フラスコに播種した。播種から1時間以内に、Fugene6(Roche)を用いてトランスフェクトした:
・10μlのFugene6を490μlのダルベッコ改変イーグル培地と混ぜ、室温で5分間インキュベートする
・5μgの発現プラスミドを添加し、混合物を室温でさらに15分間インキュベートする
・混合物を細胞培養フラスコに添加する
翌日、トランスフェクション試薬を含む培地を吸引し、各フラスコを、10%の透析FCS(Invitrogen)を含む5mlの(ヌクレオシドを含まない)MEMアルファ培地(MEMアルファ−)で1回洗浄し、10mlの同一培地を2nMの濃度のメトトレキサートと一緒に添加した。この後、培地を1週間に1回交換した。
トランスフェクトされたプールの細胞カウント、培地のIgG含有量および特定の細胞生産性
簡単に説明すると、染色プロトコルは以下のとおりであった:
1.細胞をトリプシン処理し、カウントする
2.1〜5×106個の細胞を滅菌FACSにピペットする
3.250gで4℃にて1分間スピンして落とし、上澄み液を取り除く
4.2mlの滅菌FACS PBS(PBS+2% FCS)(5ml)中の細胞を洗浄する
5.細胞を、Ab/106個の細胞の割合で希釈した100μl中に1:20で希釈した(ヤギF(ab)2 フラグメント抗ヒトIgG H+L−PE(Beckman−Coulter、IM1626)で染色し、(暗中4℃で)20分間インキュベートする
6.細胞を2mlのFACS PBS(5ml)で2回洗浄する
7.FACS PBS(2ml)中に1〜5×106/mlに再懸濁する
8.ヨウ化プロピジウムを10μg/ml 1:100で添加する
細胞をトリプシン処理し、カウントした。5×106個の細胞を遠心分離し、10ml ProCHO4血清を含まない培養(Cambrex)に再懸濁した。細胞を50mlの細胞培養チューブ(スイスのTRP)に移し、37℃で振蘯機においてインキュベートした。細胞密度を1週間に2回カウントし、毎回、細胞を、1mlあたり0.5×106個の細胞(最初の2週間について)または1mlあたり0.3×106個の細胞(残りの期間について)に希釈した。4〜5週間後、ほとんどの細胞の倍加時間が30時間に近づき、この時点でそれらが血清を含まない培養に適応したと考えた。
長期間にわたる混合培養の組成物の安定性をテストするために、クローンの多くの混合物を調製した。適応期間中になされた計数に基づいて、倍加時間を可能な限り考慮に入れた。同様の倍加時間を有するクローンを合わせるように注意した。全部で9個の混合物を調製した:
・混合物1〜5:各々において、各抗体に関する単一クローンを用いた
・混合物6:各抗体に関して2つのクローンを用いた
・混合物7:各抗体に関して5つのクローンを用いた
・混合物8:各抗体に関して3つのクローンを用いた
・混合物9:各抗体に関して5〜7個の全て利用可能なクローンを用いた
5〜10mlの0.22μmでろ過した培地上澄み液を、1mlのMabSelect Sureカラム(GE Healthcare)上にロードした。製造業者により説明されるごとく、カラムを10ml PBSでpH7.4にて洗浄し、0.1M グリシンでpH2.7にて溶出した。プールしたタンパク質素材を、40mM NaCl、50mM 酢酸Na、pHに対して2回透析し、合計のIgG濃度を、280nMの吸光度を測定することにより調べた。
ECHOにおけるE1Aの発現を調べるために、E1A mRNAレベルを、SYBRグリーンを用いる定量逆転写リアルタイムPCR(qRT−PCR)により決定した。qRT−PCR法は、標的配列のPCR増幅に基づく。二本鎖DNAに結合した時に緑色の光を励起するDNA結合色素、SYBRグリーンの存在下でPCRを実施する。このことは、各増幅ラウンド後における二本鎖DNAのリアルタイム定量を可能にする。
総RNAを、Qiagenから提供されるRNeasy Mini Kitカタログ番号74104を用いて、製造業者により推奨されるごとく、3.0E+06のECHOおよびHek293細胞から抽出した。RNAサンプルの濃度と品質を、Eukaryote Total RNA Nano Series II assayと一緒に、Agilentから提供される2100 Bioanalyzerを用いて決定した。品質を、1が分解されているRNA、10が無傷のRNAを示す1〜10の間のRNA品質ナンバー(RIN)として調べた。ECHO RNAは9.5のRINを示し、HEK293は8.9のRINを示した。各サンプルのcDNAを、開始物質として800ng RNAを用いて、Qiagenから提供されるQuantiTect Reverse Transcription Kit カタログ番号205311により作成した。Hek293 cDNAを25×に希釈し、一方でECHO cDNAを2倍に希釈した。qRT−PCRを、Stratageneから提供されるBrilliant SYBR Green QPCR Master Mix カタログ番号600548を用いてStratagne Mx3005Pにおいて行った。熱サイクリング条件:95℃で10分の保温;95℃で15秒の変性、60℃で1分のアニーリングおよび72℃で30秒の伸長の40サイクル;55〜95℃からの融解曲線分析。用いたプライマー(E1A−696bpF:5’−TGACTCCGGTCCTTCTAACACA−‘3、E1A−772bpR:5’−TCACGGCAACTGGTTTAATGG−‘3)は、E1A遺伝子の3’末端における77bpフラグメントを標的とする。
ECHO細胞におけるE1Aの発現を、qRT−PCRアッセイを用いて解析し、それは、E1A mRNAをこのアッセイで増幅し、検出できないことを示し、ECHO細胞株がE1Aタンパク質を発現しないことを強く示した。陽性コントロールとして、アデノウイルスDNAのフラグメントにより形質転換され、比較的高いレベルでE1Aを発現することが知られるヒト293細胞株を用いた。
組成物の安定性の研究のためのバイオリアクター実験を行うことができるために、マスターおよびワーキング細胞バンクを調製した。この実験においては、実施例1に記載されるごとく6個の異なる抗体を発現するECHO細胞のクローンを使用した。用いたクローンを、培地ProCHO4における血清を含まない懸濁培養に適応した。
クローンを溶解し、しばらく懸濁培養で回復させた。4個の混同したマスター細胞バンクを、以下の明細書による指数増殖における細胞から調製した:
・細胞を対数増殖期に凍結した
・6個の抗体全てを各細胞バンクで示した
・各抗体を示す等量の細胞数を混合した
・混合物1A〜3Aは1抗体あたり単一クローンを含んだ
・混合物4Aは1抗体あたり3個のクローンを含んだ
・20×106個の細胞をそれぞれ含む10個のアンプルを1つの混合物あたり凍結した
・凍結培地:10%DMSOを含有する培地(ProCHO4)
1つの混合物あたり1つの凍結アンプルを溶解した。混合物を、ワーキング細胞バンクの調製前に8〜10日間培養を続けた:
・細胞を対数増殖期に凍結した
・20×106個の細胞をそれぞれ含む10個のアンプルを1つの混合物あたり凍結した
・凍結培地:10%DMSOを含有する培地(ProCHO4)
ワーキング細胞バンクの1つの混合物あたり1つの凍結アンプルを溶解し、細胞を、バイオリアクター培養を開始した時点から14日間シードトレイン(seed train)として培養を続けた:
各シードトレインを、250mlの開始培地中に0.6×106個の細胞/mlで2つのバイオリアクターに播種するのに用いた(ProCHO4+5mM グルタミン+1/100非必須アミノ酸)。
表4.一般的なバイオリアクター工程パラメーター
Claims (60)
- 2個からn個までの別個のメンバーを含むポリクローナルタンパク質を発現することができるポリクローナル細胞株の作成のための方法であって、前記方法が:
a)発現ベクターの1セットであって、前記ベクターの各々が前記ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーをコードする別個の核酸の少なくとも1コピーを含むものを提供し;
b)発現ベクターの細胞ゲノムへの部位特異的な組み込みを回避する条件下で、前記発現ベクターの各々で宿主細胞を別々にトランスフェクトし、それにより2からn個の細胞の組成物であって、各々の組成物がポリクローナルタンパク質の1つの別個のメンバーを発現するものを得て;
c)前記2からn個の細胞の組成物を混合してポリクローナル細胞株を得ること
を含む、方法。 - 発現ベクターがエピソームベクターである、請求項1記載の方法。
- 発現ベクターが、宿主細胞の1つまたはそれ以上の染色体に安定的かつ無作為に組み込まれる、請求項1記載の方法。
- 工程b)で得られたトランスフェクトされた細胞がクローン化される、請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- 細胞が、FACSクローニングを用いてクローン化される、請求項4記載の方法。
- クローンが、増殖率、倍加時間、発現レベル、産生レベル、長期間にわたる産生の安定性、生存率、耐性、構造安定性、形態、およびコピー数:からなる群から選択される少なくとも1つの判断基準について選択される、請求項4または5記載の方法。
- クローンが、少なくとも1つの判断基準に関する均一性について選択される、請求項6記載の方法。
- 倍加時間および発現レベルに関する均一性について選択することを含む、請求項7記載の方法。
- 1個より多くのクローンが、各々別個のポリクローナルタンパク質のメンバーについて選択される、請求項4〜8のいずれか記載の方法。
- 2個のクローンが、各々別個のポリクローナルタンパク質のメンバーについて選択されるか、あるいは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、または100個のクローンが選択される、請求項9記載の方法。
- 異なる別個のメンバーを発現する前記細胞の組成物が、1:1の比率で混合される、請求項1〜10のいずれか記載の方法。
- 前記細胞の組成物が、1:1の比率とは異なる比率で混合される、請求項1〜10のいずれか記載の方法。
- 発現ベクターが、ポリクローナルタンパク質をコードする配列における変動を除いて同一である、請求項1〜12のいずれか記載の方法。
- 宿主細胞が、トランスフェクション前の1つのクローンに由来するものである、請求項1〜13のいずれか記載の方法。
- ポリクローナル抗体が多量体タンパク質である、請求項1〜14のいずれか記載の方法。
- 1つの発現ベクターが、1つの別個のポリクローナルタンパク質のメンバーの全てのサブユニットをコードする、請求項15記載の方法。
- 工程a)における発現ベクターのセットが発現ベクターの2つまたはそれ以上のサブセットからなり、第1のサブセットが、タンパク質の1つのサブユニットをコードする変異核酸配列を含み、第2のサブユニットが、タンパク質の別のサブユニットをコードする変異核酸配列を含むものであって、各トランスフェクションが、第1のサブユニットに由来するメンバーおよび第2のサブユニットに由来するメンバーの発現ベクターを用いて実施されるものである、請求項15記載の方法。
- 発現ベクターまたはさらなる発現ベクターが選択可能なマーカーをコードする、請求項1〜17のいずれか記載の方法。
- 細胞が、選別可能なマーカーを発現する細胞の増殖に適当な条件下で継続的に培養される、請求項18記載の方法。
- 選択可能なマーカーが、宿主細胞が欠失する遺伝子産物を含む、請求項18記載の方法。
- 選択可能なマーカーが、ポリペプチドメンバーまたは前記ポリペプチドメンバーのサブユニットをコードする転写物によりコードされるものであって、好ましくは、選択可能なマーカーが、最も大きなサブユニットをコードする転写物によりコードされるものである、請求項18記載の方法。
- ポリクローナルタンパク質が宿主細胞に本来的に関連するものではない、請求項1〜21のいずれか記載の方法。
- ポリクローナルタンパク質が、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体フラグメントである、請求項1〜22のいずれか記載の方法。
- 工程a)における発現ベクターのセットが発現ベクターの2つのサブセットからなり、第1のサブセットが、抗体重鎖をコードする変異核酸配列を含み、第2のサブセットが、抗体軽鎖をコードする変異核酸配列を含むものであって、各トランスフェクションが、発現ベクターの第1のサブセットに由来するメンバーおよび第2のサブユニットのためのメンバーを用いて実施されるものである、請求項16記載の方法。
- ポリクローナル抗体が、重鎖または軽鎖、好ましくは重鎖の同一の定常領域を有する、請求項23記載の方法。
- ポリクローナルタンパク質が、ポリクローナルT細胞受容体またはポリクローナルT細胞受容体のフラグメントである、請求項1〜22のいずれか記載の方法。
- 宿主細胞が原核生物のものである、請求項1〜26のいずれか記載の方法。
- 宿主細胞が真核生物のものである、請求項1〜26のいずれか記載の方法。
- 真核生物の細胞が、植物、酵母、真菌、脊椎動物または無脊椎動物からなる群から選択されるものである、請求項28記載の方法。
- 真核生物の細胞が、チャイニーズハムスター卵母(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髄腫細胞(例えば、Sp2/0細胞、NS0、YB2/0)、NIH3T3、線維芽細胞、あるいはHela細胞、HEK293細胞、またはPER.C6を含む不死化ヒト細胞からなる群から選択されるものである、請求項28記載の方法。
- 宿主細胞が、ポリクローナルタンパク質の発現のためにコードするプロモーターをトランス活性化することができる組み換えトランスアクチベーターを発現する、請求項28記載の方法。
- ポリクローナルタンパク質の製造のための方法であって、前記方法が:
a)請求項1〜31のいずれかの方法を用いて得られるポリクローナル細胞株を提供し;
b)ポリクローナルタンパク質の発現を可能にする条件下で、ポリクローナル細胞株を培養し;次いで
c)細胞または培地からポリクローナルタンパク質を回収し、任意選択的に精製すること
を含む、方法。 - 混合した組成物が、振とうフラスコ、使い捨てバイオリアクター、バイオリアクターのごとき容器中で培養される、請求項32記載の方法。
- ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーの1つの集団を発現する1つのポリクローナル細胞株が、1つの容器中で培養され、ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーの第2の集団を発現する少なくとも第2のポリクローナル細胞株が、第2の容器中で培養され、次いで各容器に由来するポリクローナルタンパク質が精製前または後に混合される、請求項33記載の方法。
- 回収され、任意選択的に精製されるポリクローナルタンパク質における別個のメンバーの各々の存在を確認する工程をさらに含む、請求項32〜34のいずれか記載の方法。
- 2からn個の細胞集団を含むポリクローナル細胞株であって、各集団が組み換えポリクローナルタンパク質の別個のメンバーを発現するものであって、細胞がゲノムに無作為に組み込まれる少なくとも1つの発現構築物を含むものである、細胞株。
- 少なくとも1つの発現構築物が、1つまたはそれ以上の染色体に組み込まれる、請求項36のポリクローナル細胞株。
- nが、3またはそれ以上、例えば、4またはそれ以上であり、例えば、5またはそれ以上であり、例えば、6またはそれ以上であり、例えば、7またはそれ以上であり、例えば、8またはそれ以上であり、例えば、9またはそれ以上であり、例えば、10またはそれ以上であり、例えば、11またはそれ以上であり、例えば、12またはそれ以上であり、例えば、13またはそれ以上であり、例えば、14またはそれ以上であり、例えば、15またはそれ以上であり、例えば、16またはそれ以上であり、例えば、17またはそれ以上であり、例えば、18またはそれ以上であり、例えば、19またはそれ以上であり、例えば、20またはそれ以上であり、例えば、21またはそれ以上であり、例えば、22またはそれ以上であり、例えば、23またはそれ以上であり、例えば、24またはそれ以上であり、例えば、25またはそれ以上であり、例えば、26またはそれ以上であり、例えば、27またはそれ以上であり、例えば、28またはそれ以上であり、例えば、29またはそれ以上であり、例えば、30またはそれ以上であり、例えば、35またはそれ以上であり、例えば、40またはそれ以上であり、例えば、45またはそれ以上であり、例えば、50またはそれ以上であり、例えば、60またはそれ以上であり、例えば、70またはそれ以上であり、例えば、80またはそれ以上であり、例えば、90またはそれ以上であり、例えば、100またはそれ以上である、請求項36または37記載のポリクローナル細胞株。
- nが、50より小さく、例えば、45より小さく、例えば、40より小さく、例えば、35より小さく、例えば、30より小さい、請求項36〜38のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 組み換えポリクローナルタンパク質の1つの別個のメンバーを発現する細胞が、1個またはそれ以上のクローン化された細胞であって、例えば、2個またはそれ以上に由来し、例えば、3個またはそれ以上であり、例えば、4個またはそれ以上であり、例えば、5個またはそれ以上であり、例えば、6個またはそれ以上であり、例えば、7個またはそれ以上であり、例えば、8個またはそれ以上であり、例えば、9個またはそれ以上であり、例えば、10個またはそれ以上であり、例えば、11個またはそれ以上であり、例えば、12個またはそれ以上であり、例えば、13個またはそれ以上であり、例えば、14個またはそれ以上であり、例えば、15個またはそれ以上であり、例えば、16個またはそれ以上であり、例えば、17個またはそれ以上であり、例えば、18個またはそれ以上であり、例えば、19個またはそれ以上であり、例えば、20個またはそれ以上であり、例えば、21個またはそれ以上であり、例えば、22個またはそれ以上であり、例えば、23個またはそれ以上であり、例えば、24個またはそれ以上であり、例えば、25個またはそれ以上であり、例えば、26個またはそれ以上であり、例えば、27個またはそれ以上であり、例えば、28個またはそれ以上であり、例えば、29個またはそれ以上であり、例えば、30個またはそれ以上であり、例えば、35個またはそれ以上であり、例えば、40個またはそれ以上であり、例えば、45個またはそれ以上であり、例えば、50個またはそれ以上であり、例えば、60個またはそれ以上であり、例えば、70個またはそれ以上であり、例えば、80個またはそれ以上であり、例えば、90個またはそれ以上であり、例えば、100個またはそれ以上である、請求項36〜39のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- ポリクローナルタンパク質が多量体タンパク質である、請求項36〜40のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 各発現構築物が多量体タンパク質のサブユニットをコードする、請求項41記載のポリクローナル細胞株。
- サブユニットの発現が、同一または同質のプロモーターの制御下にある、請求項41または42記載のポリクローナル細胞株。
- 発現構築物が選択可能なマーカーをコードする、請求項36〜43のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 選択可能なマーカーが、ポリペプチドメンバーまたは前記ポリペプチドメンバーのサブユニットをコードする転写物によりコードされる、請求項44記載のポリクローナル細胞株。
- ポリクローナルタンパク質が、宿主細胞に本来的に関連するものではない、請求項36〜45のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- ポリクローナルタンパク質が、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体フラグメントである、請求項36〜46のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 発現ベクターのセットが、発現ベクターの2つのサブセットからなり、第1のサブセットが、抗体重鎖をコードする変異核酸配列を含み、第2のサブセットが、抗体軽鎖をコードする変異核酸配列を含むものであり、各トランスフェクションが、発現ベクターの第1のサブセットに由来するメンバーおよび第2のサブセットに由来するメンバーを用いて実施されるものである、請求項47記載のポリクローナル細胞株。
- ポリクローナル抗体の全てのメンバーが同一のアイソタイプのものである、請求項47または48のポリクローナル細胞株。
- ポリクローナルタンパク質が、ポリクローナルT細胞受容体またはポリクローナルT細胞受容体フラグメントである、請求項36〜46のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 宿主細胞が原核細胞のものである、請求項36〜50のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 宿主細胞が真核細胞のものである、請求項36〜50のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 細胞が、ポリクローナルタンパク質のメンバーのためにコードするプロモーターをトランス活性化することができるトランスアクチベーターをコードする安定的に組み込まれた発現構築物を含む、請求項36〜52のいずれか記載のポリクローナル細胞株。
- 構成プロモーターに作動可能に連結されたアデノウイルスタイプ5トランスアクチベーターE1Aをコードする安定的に組み込まれた核酸を含む、DHFR陰性CHO細胞。
- 細胞株がDG44細胞株に由来する、請求項54記載の細胞株。
- 細胞株が、目的のポリペプチドをコードする安定的に組み込まれた発現構築物の少なくとも1コピーをさらに含む、請求項54または55記載の細胞株。
- 目的のポリペプチドが多量体タンパク質であり、好ましくは多量体タンパク質が抗体である、請求項56記載の細胞株。
- 目的のポリペプチドをコードする発現構築物が、dhfrをさらにコードする、請求項56または57記載の細胞株。
- dhfrおよび目的のポリペプチドの少なくとも1つのサブユニットが同一の転写物によりコードされるものであり、好ましくは、dhfrが最も大きいサブユニットをコードする転写物によりコードされるものである、請求項58記載の細胞株。
- 目的のポリペプチドの発現が、E1Aによりトランス活性化可能である1つまたはそれ以上のプロモーターにより制御されるものであり、好ましくは、プロモーターがCMVプロモーターであるか、またはCMVプロモーターに由来するものである、請求項56〜59のいずれか記載の細胞株。
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