TR201815560T4 - E.coli ve clostrıdıum perfrıngens e karşı antimikrobiyal etkiye sahip ve yüksek sporülasyon kapasitesine sahip antibiyotiğe duyarlı bacıllus suşları. - Google Patents

Abstract

Bir Bacillus suşu, (i) ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlılık; (ii) E. coli ve Clostridium perfringens'e karşı antimikrobiyal aktivite; ve (iii) inkübasyonun 2. gününden sonra ölçüldüğünde en az 80 olan bir sporülayon yüzdesi ile karakterize edilmektedir. Buluş ayrıca bu tarz suşların seçimine yönelik bir yöntemle ilgilidir. Buluşa göre tanımlanmış birçok suş, Bacillus amyloliquefaciens türlerinden gelmektedir. Bazı Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amyloliquefaciens alt türleri amyloliquefaciens olarak tanımlanırken, diğerleri, amyloliquefaciens alt türleri plantarum olarak tanımlanmıştır. Buluşun bir Bacillus suşu, probiyotik bir etkiye sahip olduğu hayvan yemine bir yem katkısı olarak kullanılabilmektedir.

Description

TEKNIK ALAN Baci'llus türleri, hayvan besini endüstrisindeki probiyotik çözeltileri için kullanilmaktadir ve üretimde Bacillus bazli probiyotiklerin pozitif etkileri ve üretim hayvanlarinin sagligi iyi bilinmektedir (Spiehs v.d., 2008; Cutting, 2011).

Kullanimlari, Bacillus`un, hayvan besini endüstrisinde büyüme promoterleri olarak kullanilan antibiyotiklerin kullanimini degistirebilme veya azaltabilme kabiliyeti ile iliskilidir.

Fakat insanlar için yaygin olarak kullanilan antibiyotiklere karsi antibiyotik direncine sahip olmayan Bacillus suslarina karsilanmamis bir ihtiyaç mevcuttur.

Mevcut bulus, ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik ile karakterize edilen ve ayrica E. 0011' ve Clostridium peifringens gibi ana patojenlerin büyümesini de inhibe eden izole Baci'llus suslarini saglamaktadir. Suslar ayrica 2. günde ölçüldügünde, en azindan yüzde 80 bir sporülasyona sahiptir, bu da hayvan besini üretimi için güvenli ve faydali Baci'llus sporlarinin üretimini etkili bir sekilde üretmeyi mümkün kilmaktadir.

Bulus ayrica hayvan besini katkilarinin, özellikle domuzlara ve kümes hayvanlarina yönelik ürünlerin üretimine yönelik bulusun Bacillus suslarinin sporlarinin kullanimi ile ilgilidir, burada suslar, probiyotik (saglik, yem kullanimi ve büyümenin arttirilmasi) bir etkiye sahiptir. 2494639 ÖNCEKI TEKNIK Domuzlar, özellikle yavru domuzlar, asinmalara, bir baska ifadeyle Escheri'chia 0011' (E 0011') ve Clostri'dium peijßingens Tip A ve C (Cpeifringens) gibi bakterilerin yol açabildigi ishalden muzdarip olmaktadir. Asinmalar, tedavi edilmemesi halinde, agirlik kaybi dâhil olmak üzere ölümle kayiplara ve siddetli üretim kayiplarina yol açabilmektedir.

E. coli, yavru domuzlarda diyarenin birincil sebebidir ve tarlalarda kullanilan antibiyotigin %50-75”i, birincil olarak E. colfnin yol açtigi sütten diyareye karsi kullanilmaktadir. Diyare, sütten kesilmislerde ve yetistiricilerde (40 kg`ye kadar) en büyük problemdir ve E. 0011', diyareye yol açan en önemli patojendir (Klose Domuzlarda enterik klostridial enfeksiyonlar baskin bir sekilde sütten kesme sürecinde olusmaktadir, fakat sonlandirma sürecinde domuzlari etkileyen hemorajik bagirsak sendromu ile iliskilidir. C. perfringens tip C°ye kadar immünizasyon, sütten kesim öncesi mortaliteyi önemli ölçüde azaltmasina ragmen, C. perfringens tip A için mevcut olarak herhangi bir ticari asi bulunmamaktadir. C. per/ringens tip A enfeksiyonlari, domuzlarin sütten kesim öncesinde artan siklikla taninmaktadir ve teshise ve profilaksiye yönelik yaklasimlar, tip C enfeksiyonu için olanlardan hem farkli hem de daha komplekstir.

Kümes hayvanlarinda siddetli enfeksiyonlar ve hastaliklara, E. call' e Clostri'dz'um perfringens dâhil olmak üzere patojenik bakteriler yol açmaktadir. Patojenlerin yol açtigi enfeksiyonlar ve hastaliklar, artan mortaliteye, azalan performansa ve artan üretim maliyetlerine neden olmaktadir. Ek olarak, bu patojenlerin birçogu, insanlara iletilebilmektedir. Kus kolibasiloz, E. colfnin yol açtigi bir sistemik enfeksiyondur ve en yaygin olarak, genç piliçlerde ve palazlarda olusmaktadir. 2494639 Probiyotlar, Clostri'dz'a ve E. 0011' gibi zararli bakterilerdeki bir azalma ve Lactobaci'llus türleri ve Bijîdobacterium gibi faydali bakterilerdeki bir artis dâhil olmak üzere saglikli bagirsak mikroflorasini sürdürmek için hayvan sagligi uygulamalarinda kullanilmaktadir. Probiyotikler, antibiyotiklerin aksine, ne bakterileri ayrim göstermeksizin yok etmedigi ne de patojenik bakterilerin antibiyotige dirençli suslarina yol açmadiklari için, patojenik ve faydali bakteriler arasindaki bir saglik dengesini sürdürmek üzere uyumlu hale getirilmektedir.

Probiyotiklerin, saglikli bagirsak mikroflorasini sürdürdügü birçok mekanizma mevcuttur: patojenik bakterilerin rekabetçi dislanmasi, antimikrobiyal maddelerin üretimi vasitasiyla patoj enik bakterilerin azaltimi, faydali bagirsak mikroflorasinin büyümesinin ve eanliliginin arttirilmasi ve hayvanda bir sistemik immün yanitinin uyarilmasi.

Yukarida bahsi geçenler açisindan, domuzlarda ve kümes hayvanlarinda E. 6011' ve/Veya Clostri'di'um ile enfeksiyonlardan dolayi hastaliklari tedavi etmek veya Önlemek üzere bir veya birden fazla Baci'llus susa sahip olmasi arzu edilmektedir.

Guo v.d., 2006, potansiyel probiyotikleri olarak Bacillus suslarinin taranmasini ve domuzlarda Baci'llus subti'li's MAl39 testini açiklamaktadir. Piliçlerden, domuzlardan, topraktan, ferrnente gidalardan ve Çin otlarindan 124 numune toplanmistir. 750 aerobik spor olusturan sus, bu numunelerden izole edilmistir. E. 0011' K88 ve K99, Salmonella ve Staphylococcus aureus°a karsi inhibitör aktivitesi, bir disk plakasi difüzyon deneyi kullanilarak test edilmistir. En iyi aktiviteye sahip 6 Baci'lli', uyarilmis GIT kosullari (pH 2 ve %0.3 safra tuzu) içerisinde sagkalimlari için test edilmistir. B. subtilis MA139, en iyi aday olmustur ve 90 yavru domuzla 28 günlük bir besleme çalismasinda yavru domuzlarda canli içi test edilmistir. ADG ve yem kullanimi arttirilmistir. Laktik asit bakterileri arttirilmistir, diskilardaki Ecoli azaltilmistir. Fakat Clostri'di'um perfringenfe karsi antimikrobiyal aktivite ve antibiyotiklere duyarlilik test edilmemistir. 2494639 Barbosa v.d., 2005, organik olarak (toprakla temas ederek) yetistirilmis piliçlerden gelen dislilardan 237 Bacillus izolasyonunu açiklamaktadir. 31 izolat karakterize edilmistir. Bunlar arasinda B. subtili's ve B. li'cheni'formi's mevcuttur. Çesitli B. subtili's suslai'i, C. perfringens ve S. aureus°a inhibisyon sergilemistir. B. licheni'formis ayrica C. peiylri'ngensie karsi etki sergilemistir. Fakat seçilen Bacillus izolatlarindan hiç birisi, mevcut basvuruda belirlenen Ecolfye karsi antimikrobiyal aktivite sergilememistir. Seçilen bir Baci'llus izolati, büyüm yogunlugunda azaltim sergilemektedir, fakat E. coli susu O78:K80”e karsi herhangi bir tam inhibisyon ve test edilen diger E coli' susuna karsi herhangi bir etkiye sergilememektedir (bakiniz Tablo 5). 2 günlük inkübasyondan sonra sporülasyon yüzdesine veya vankomisin, kanamisin, streptomisin ve klindamisine duyarliliga dair herhangi bir veri saglanmamaktadir.

Chaiyawan V.d., 2010, tibbi tedavide genis oranda kullanilan antibiyotiklere duyarli olan ve C. peijfringens ATCC 151917e karsi antimikrobiyal aktivite sergileyen bir T3-1 Baci'llus sus türünü tarif etmektedir. Sus, E. call` 0157iye karsi herhangi bir antimikrobiyal aktiviteye sahip degildir. 2 günlük inkübasyondan sonra sporülasyon yüzdesinde herhangi bir veri saglanmamaktadir.

Benitez v.d., 2011, bozulmamis veya aktif halde olmayan Ecoli mevcudiyetinin, Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006 susu ile antimikrobiyal peptitlerinin sentezini gelistirdigini gücen bir sekilde açiklamistir.

US 7,754,469 sayili patent dokümani, kümes hayvanlarinin tedavi edilmesine yönelik mikroorganizmalar ve yöntemlerle ilgilidir ve US 8,021,654 sayili patent dokümani, Baci'llus suslari ile domuzlarin tedavi edilmesine yönelik yöntemlerle Fakat bu makalelerin veya patentlerin hiçbirisinde, yaygin olarak insanlar için kullanilan antibiyotiklere duyarli olan Bacillus suslarini seçmek, Clostri'di'um peijß'ingens ve E. coli°nin büyümesini inhibe etmek ve etkili sporülasyon için 2494639 kullanisli sus ve bu sekilde Bacillus probiyotik üretimini olusturmak için 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde en azindan yüzde 80 olan bir sporülasyona sahip olmak üzere herhangi bir açiklama veya öneri mevcuttur. teknigin dokümanlarinin hiç birisi, insanlar için yaygin olarak kullanilan antibiyotiklere duyarliliga sahip olan, Clostri'dium perfüngens ve E. coli',nin büyümesini inhibe eden ve 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde, en azindan yüzde 80 sporülasyon yüzdesine sahip olan suslari tarif etmektedir. Özet olarak, Baci'llus suslarinin taranmasi ile iliskili önceki teknik, mevcut bulusun ayirt edici üç özelligini saglamamaktadir, bir baska ifadeyle insanlar için yaygin olarak kullanilan antibiyotiklere duyarliligi, E. 0011' ve Clostri'di'um perfringens büyümesinin inhibisyonunu ve 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde, en azindan yüzde 80 bir sporülasyon yüzdesini saglamamaktadir. Önceki teknik, bu üç kriteri yerine getiren Bacillus suslarini da saglamamaktadir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus ile çözülecek olan problem, ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisiii, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik; E. 0011' ve Clostri'di'um peijfringensîn büyüme inhibisyonu; ve 2. günde ölçüldügünde, en az yüzde 80 bir sporülasyon yüzdesi ile karakterize edilen bir Bacillus susunu saglamaktir. Çözüm, bu gelismis özelliklere sahip gelismis Baci'llus suslarinin tanimlanmasi için mucitler tarafindan gelistirilen bir seçim yöntemine dayaninaktadir.

Seçim yönteminin birinci temel adimi, insanlar için yaygin olarak kullanilan antibiyotiklere karsi duyarli olan Bacillus suslarini belirgin olarak görüntülemektir. Daha belirgin olarak, suslar, ampisilin, vankomisin, gentamisin, 2494639 kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenitona duyarlilik için görüntülenmektedir.

Dahasi, suslar, E. coli' ve Clostri'di'um perfringenfe karsi antimikrobiyal aktivite ve 2. günde ölçüldügünde, en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi için görüntülenmektedir.

Mucitler tarafindan incelenen topraktan ve diskilardan ve gida kaynaklarindan gelen 261 izolattan 161 izolat, örneklerde açiklanan ön tarama testinde antibiyotige dirençli olmustur. Antibiyotige duyarli 100 izolattan 56”si, Clostri'di'um perfringenýe karsi antimikrobiyal etkiye sahip olmustur ve sadece 22asi, E. 0011' ve Clostridium perfringenfe karsi etkiye sahip olmustur. Bunlardan, 12 izolat B. amyloliquefaciens türünden gelmistir. Diger temsili suslar, B. subtilis ve B. mojavensis türelerinden gelmistir. Tablolar 2 ve 3, Chr. Hansen sirketinin suslarinin (ikincil tarama için seçilmis 32 sustan 22,si) sonuçlarini özetlemektedir.

Seçim süreci, üretim için uygun ortamda (i) güvenlige, (ii) etkiye ve (iii) yüksek sporülasyona odaklanmistir. Güvenlik yönü ana olarak insanda dirençli bakterilerin artan vakalarindan dolayi önemli olan antibiyotige direncin yoksunluguna baglidir. Bu bakteriler, patojen bakterileri dirençli hale geldikçe, artik antibiyotiklerle tedavi edilemeyen, iyi bilinen hastaliklara neden olmustur.

Baci'lluýun, antimikrobiyal aktiviteye sahip olabilen maddeleri, bir baska ifadeyle bakteriosinler, bakteriolitik enzimler veya sürfaktinleri üretebilmektedir. Ikinci seçim kriteri, E. coli ve Clostridium perfringenfe karsi etki, her iki patojen domuzlarda ve çiftlik hayvanlarinda diyarenin ana sebebi oldugu için önemlidir.

Etki, E. coli`°nin üç suluna karsi ve Clostri'dium perfißingens tip A'ya karsi test edilmektedir, fakat sonuçlarin, E.coli”ye karsi genel bir etkinin ve Clostri'dium perfringens tip C gibi diger Clostri'di'a tiplerine karsi bir etkinin göstergesi olmasi tasarlanmaktadir. 2494639 Üçüncü seçim kriteri, probiyotik üretimi için Önemlidir. Üretim süreci, Bacillus°u büyüten fermentörde yer almaktadir ve sürecin sonunda, bir yüksek sporülasyon orani, bir yüksek üretim verimliligi için gereklidir. Baci'llus”un sporülasyon süreci, bir kaç yil boyunca incelenmistir, fakat hala akilda birçok soru kalmaktadir. Bu sekilde, bazi Bacz'llus suslarinin oldukça düsük bir sporülayon oranina sahip oldugu Bacillus üretim ve süreç gelisimi ile çalisma, teknikte tecrübe sahibi kisiler arasinda iyi bilinmektedir. Baci'llufun, özellestirilmis hücrelerin alt popülasyonlarina, bir baska ifadeyle sporlanan topluluklara, kompleks besinlerinin degradasyonu için enzimleri üreten topluluklar ve ölen (Lopez ve Kolter, 2010) topluluklara ayrildigi gösterilmistir. Bu farklilasimin, bunlardan çogunun Baci'llus'un kendisi tarafindan üretildigi hücre disi sinyallerle düzenlendigi görülmektedir, Bu sekilde, enzimlerin veya antimikrobiyal maddelerin yüksek bir üretiminin, düsük bir sporülasyon verimliligine neden olabildigi hipotezine varilmistir. Teknikte tecrübe sahibi kisi için, bir Bacillus susu için, bir antimikrobiyal aktiviteye ve bir yüksek sporülasyon yüzdesine sahip olmasi olagandisi ve sasirticidir.

SEKILLER Sekil 1, 261 Baci'lli susunun antimikrobiyal aktivitesini sematik olarak göstermektedir. Birçok Baci'llus amyloliquefaci'ens susunun, antimikrobiyal etkiye sahip olmasi sasirticidir.

BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI 2006 yilinda Avrupa Birliginde antibiyotik büyüme promoterlerinin asamali olarak bitmesi, yüksek veriinlilige sahip uygun maliyetli besin katkilarina olan artan bir ihtiyaca ve bu sekilde yeni probiyotiklere bir ihtiyaca neden olmaktadir.

Bacillus-bazli probiyotik besin katkilari, doinuzlarda ve kümes hayvanlarinda sagliga ve üretime dair pozitif etkileri için bilinmektedir. Bu ürünler, Sporlarin isisinin stabil olmasindan ve 90-95°C`ye kadar sicakliklarda topaklama 2494639 sürecinden sag kalabilmesinden dolayi yem endüstrisine yöneliktir.

Domuzlarin probiyotiklerinin, hayvanlar, insanlar ve çevre için güvenli olmasi gerekmektedir ve hayvanin büyümesini ve yem kullanimini arttirmalidir. Mevcut bulusun amaci, üç adimda domuzlarda probiyotik etkileri için farkli kaynaklardan gelen genis aralikta aerobik endospor olusturan bakterileri (AEB) görüntülemek olmustur. AEB, fermente yemden (Kantong, ve Gergoush priiner baslaticilar), domuz diskilari ve farkli kültür koleksiyonlarindan izole edilmistir. 26] AEB izolati, l6S rDNA geninin siralanmasi ile tanimlanmistir ve çesitli ilgili antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonunun (MIC) saptanmasi ile ilgili antibiyotik direnci için incelenmistir.

Diger analizler, safta ve asit toleransini, patojen inhibisyonunu, farkli ortamlarda büyümeyi, sporülasyonu, ayrica bagirsak sisteminde siki baglanti yerlerinde pozitif etkilerin olasiligini degerlendirmek üzere hayvan hücre dizileri ile etkilesimleri içermistir. Sonuçlar, hem türler hem de suslar arasindaki yüksek bir farki göstermektedir. lzole türler birincil olarak gida kaynaklarindan B. amyloliquefaciens, B. subtili's ve B. safénsis, diskilardan B. subtilis) B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B.1ichenif0rmi's, B. megaterium ve topraktan B. licheniformis ve B. simplex dâhil olmak üzere Baci'llus geninden olusmustur.

Birçok izolat, EFSA ile belirlenen yukaridaki kirilma noktalarinin üzerinde arzu edilmeyen antibiyotik direnç sergilemistir ve güvenlik endiselerinden dolayi atilmistir. Dana eti infüzyon suyunda gece boyunca büyütüldügünde, çogu sus için iyi bir büyüme gözlemlenirken, %lö'si, fermentasyon için uygun bir ortamda tatmin edici olmayan büyümeye sahip olmustur. Tarama sürecinin 2. adiminda, herhangi bir antibiyotik direnç içermeyen 32 seçilmis sus, gyrB geni ve PFGE parmak izi siralanarak tanimlanmistir. Ek olarak, seçilmis patojenlerde antimikrobiyal etkileri test edilmistir ve izolatlar arasinda önemli ölçüde varyasyon gözlemlenmistir. Çesitli izolatlar, Clostri'di'um perfringens inhibisyonunu sergilerken, sadece bir kaç izolat, E.coli"yi inhibe etmistir. Mevcut 2494639 bulusun sonuçlari bu sekilde, Closzridium perfringens ve E. coli`°nin büyüme inhibisyonunun sadece nadiren birlestirildigini onaylamaktadir. Tarama sürecinin 3. adimi, yüksek patojen inhibisyonuna sahip 10 susu içermistir ve Sporlarin isi stabilitesinin saptanmasini, genom siralamasini ve ayrica, siki baglanti yerlerindeki etkilerini sergileyen in vitro çalismalari içermistir.

Mevcut bulus, (i) ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik ile karakterize edilen Bacillus susu saglamaktadir. klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik” terimi, özel bir antibiyotige duyarlilik olarak düsünülen bir susun, Tablo lide çizilen EFSA (EFSA, 2008) ile verilen kopma noktasi seviyesinde büyümemesi gerektigi kast edilmektedir.

Tablo lide çizilen MIC degerleri, insan ve veteriner önemine sahip antibiyotiklere bakteriyel direncin degerlendirilmesinde kullanilan kriterin güncellemesinde EFSA tarafindan yayinlanan kilavuzlara (Hayvan Yeminde Kullanilan Katkilara ve Ürünlere veya Maddelere dair Panel (FEEDAP) tarafindan hazirlanan teknik antibiyotiklerinin ve kabul edilebilir kesim degerlerinin bir listesini saglamaktadir.

Bacillusia yönelik ampisilin için EFSA tarafindan verilen herhangi bir kopma noktasi mevcut degildir, fakat bir kopma noktasi, çesitli diger bakteriler, bir baska ifadeyle Lactobacillus türü için mevcuttur. Bu sekilde, Baci'llus suslarinin, ampisiline karsi duyarliligi, mevcut bulusun bir kopma noktasi olarak seçilmistir.

Tablo 1. Insanlar için yaygin olarak kullanilan çesitli antibiyotiklerin EFSA kirilma noktalari Antibiyotik tipi Antibiyotik EFSA Kopma noktasi mg/L B-laktam Ampisilin 4 Glikopeptit Vankomisin 4 Gentamisin 4 Aininoglikosidler Kanamisin 8 Streptomisin 8 2494639 Makrolid Eritromisin 4 Linkosamid Klindamisin 4 Tetrasiklin Tetrasiklin 8 Kloramfenikol Kloramfenikol 8 Mevcut bulusun kapsami içerisinde olacak sekilde, susun, tüm yukarida bahsi geçen antibiyotige karsi duyarli olmasi gerekecektir. Uygulamada, bu, bir mikroseyrelti yönteini (minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC)) ile test edildiginde kopma noktasi seviyesinde herhangi bir sulun gözlemlenmedigi anlamina gelmektedir.

Mevcut bulusa göre, MIC, asagidaki gibi uygulanan CLSI standardi (Klinik ve Laboratuvar Standartlari Enstitüsü M07-A8 ve M45-A2) tarafindan çizilen bir et suyu mikroseyrelti yöntemi ile ölçülmektedirz Test edilecek olan susun bir gece boyu büyümesinin bir süspansiyonu, test edilecek olan iki kat antibiyotik seyreltisinde (toplam hacim 100 pl/çukurcuk) 105 cüi/ml uygun bir konsantrasyonda (koloni olusturan birim/ml) mikrotitre plakalarinda ISO-SENSITEST Suyunda (Oxoid CM0473) asilanmaktadir ve 37°C7de 20-24 saatligine aerobik olarak inkübe edilmistir. Ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikol antibiyotiklerini içeren önceden üretilmis paneller VetMIC Lact-l düsük antibiyotik konsantrasyonu olarak 24 saat sonra kaydedilmistir.

Bulusun yönünün (ii) birinci bölümü, E.colz”ye karsi antimikrobiyal aktivitesi sergileyen bir Baci'llus susla ilgilidir. Mevcut bulusa göre, bu, asagidaki gibi uygulanan E. 0011' agar spot testi ile ölçülmektedirz 9 ml Dana Infüzyon Suyu (VIB), test edilecek olan Bacillus kültürü ile asilanmaktadir ve gece boyunca 37°C ve 175 rpm'de inkübe edilmistir. ES zamanli olarak, 9 ml Beyin Kalp Intîizyon (BHI) suyu, E. coli seçilen bir Ecoli' susu ile asilanmaktadir ve 37°C1de gece boyunca inkübe 2494639 edilmektedir.

E.coli'”nin gece boyu kültürleri, 2 m1 bir hacimde, 200 m1 sivi VIB agarina 50°C7de eklenmekte ve her bir biyo deney çanagina dökülmektedir. Kaplar, steril bir sehpada kurutulmaktadir. Test edilecek olan gece boyunca Bacz'llus kültürü, Ecoli' ile karistirilan VIB agarinin yüzeyine tespit edilmektedir ve 2 günlügüne 37°C3de inkübe edilmektedir. Noktalarin etrafindaki inhibisyon bölgelerinin yariçaplari ve noktalarin yariçaplari kaydedilmektedir.

Bir Bacillus susu, inhibisyon bölgesinin en az 1.5 mm olmasi halinde Ecolfye karsi bir antimikrobiyal aktivite sergiledigi düsünülmektedir. Tercihen, inhibisyon bölgesi en az 2.0 mm, örnegin en az 2.5 mm, daha çok tercih edilecek sekilde en az 3 mm, en çok tercih edilecek sekilde en az 3.5 mm ve hatta daha çok tercih edilecek sekilde en az 4 mm7dir. Inhibisyon bölgesi, çesitli Ecoli' suslari için farkli olabilmektedir. Mevcut bulusa göre E.coli”ye karsi bir antimikrobiyal aktivite sergiledigi düsünülecek olan bir sus için, test edilen tüm Ecoli suslari için en az 1.5 mm bir inhibisyon bölgesi sergilemelidir. Tercihen, iki Ecoli' susunun inhibisyon bölgesi veya hatta daha çok tercih edilecek sekilde tüm üç Ecoli susunun inhibisyon bölgesi, en az 2 mm olmaktadir. Bulusun bir Bacillus susu, E.coli”nin büyüme inhibisyonu, özellikle test edilen türün büyüme inhibisyonu ile karakterize edilmektedir. Önceki teknik ile görülecegi ve mucitler tarafindan onaylandigi üzere, bir E. coli' türünün herhangi bir büyüme inhibisyonu, bir diger E.coli' türünün (Tablo 5, Barbosa v.d., 2005) herhangi bir büyüme inhibisyonu ile birlestirilmektedir ve tam tersi olmaktadir, bir baska ifadeyle bir Ecoli' türünün inhibitör aktivitesi genel olarak diger Ecolz' türlerinin inhibitör aktivitesi ile birlestirilmektedir (Tablo 1, Guo V.d., 2006).

Bulusun yönünün (ii) ikinci bölümü, Clostri'dium peijringens”e karsi antimikrobiyal aktivite sergileyen bir Bacillus susu ile ilgilidir. Mevcut bulusa göre, bu, asagidaki gibi uygulanan Clostri'di'um per/ringens agar spot testi ile ölçülmektedir: 2494639 9 ml VIB, test edilecek olan Bacillus kültürü ile asilanmaktadir ve gece boyunca 37°C ve 175 rpm`de inkübe edilmektedir. Es zamanli olarak, 9 ml BHI suyu, Clostridium perfringens Tip A, DSM 756 ile asilanmaktadir ve bir anaerobik kavanozda 37°C'de gece boyunca inkübe edilmektedir.

Bacillus kültürleri, petri kaplarinda VIB agarin yüzeyine tespit edilmektedir ve gece boyunca 37°C”de inkübe edilmektedir. Bir 2 ml haciinde gece boyunca C. perjfingens kültürü, 200 m1 sivi BHl agari ile karistirilmaktadir ve büyütülmüs Baci'llus noktalari ile VIB agarina dökülmektedir. Kaplar, 1 günlügüne 37°C,de anaerobik olarak inkübe edilmektedir. Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin, noktalar etrafindaki yariçapi ölçülmektedir.

Bir Baci'llus susunun, inhibisyon bölgesinin en az 5 mm olmasi halinde Clostridium perfrz'ngenfe karsi bir antimikrobiyal aktivitesi sergiledigi düsünülmektedir. Tercihen, inhibisyon bölgesi, en az 6 mm, daha çok tercih edilecek sekilde en az 7 mmidir. Bulusun bir Baci'llus susu, Clostridium perfringensîn büyüme inhibisyonu, özellikle test edilen türlerin büyüme inhibisyonu ile karakterize edilmektedir. Teknikte tecrübe sahibi bir kisi tarafindan bilindigi üzere, bir türün herhangi bir büyüme inhibisyonu genel olarak, diger Clostridium perfi'i'ngens türlerinin herhangi bir büyüme inhibisyonu ile birlestirilmemektedir ve tam ters geçerlidir, bir baska ifadeyle bir Clostridium perfringens türlerinin büyüme inhibisyonu genel olarak diger Clostridium perfringens türlerinin büyüme inhibisyonu ile birlestirilmektedir.

Baci'llus hücreleri, bacillus Spor hücreleri ve bacillus bitkisel hücreler olarak mevcuttur. Burada Baci'llus hücrelerine referans verildiginde, bu, her ikisi ile Bir Baci'llus spor hücresi ile iliskili “Baci'llus spor” terimi burada, teknige göre, Baci'llus bakteriler ile üretilen, bir pasif, sert, üretken olmayan yapi olarak karakterize edilebilen bir spor ile ilgilidir. Sporlarin birincil islevi, genel olarak 2494639 çevresel gerilim süreçler vasitasiyla bir bakterinin sag kalimini temin etmektir. Bu sekilde, ultraviyole ve gama radyasyonu, kurutulmasi, lizozim, sicaklik, açlik ve kimyasal dezenfektanlara dirençlidir. Sporlar yaygin olarak toprakta ve suda bulunmaktadir, burada bunlar uzun bir süre zarfinda sag kalabilmektedir. Spor kaplama, birçok toksik moleküle geçirimsizdir ve ayrica emzirmede dâhil olan enzimleri içerebilmektedir. Çekirdek, DNA ve ribozoinlar gibi normal hücre yapilarina sahiptir, fakat metabolik olarak inaktiftir. Bir bakteri, çevresel kosullarin elverissiz hale geldigini tespit ettiginde, yaklasik sekiz saat alan bir sporülasyon sürecini baslatabilmektedir. bitki Baci'llus hücreleri ile ilgilidir.

Yönünde (iii), bulus, 2. günde ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesini sergileyen bir Bacillus susu ile ilgilidir. Mevcut bulusa göre, sporülasyon yüzdesi, asagidaki gibi degerlendirilmektedir: Test edilecek olan bir Bacillus susu, bir 50 pl hacminde, bir Derin çukurcuklu (DW) plakada 700 aL VlB”ye eklenmektedir ve gece boyunca 37 °C°de ve 175 rpm,de inkübe edilmektedir. 50 uL bir hacimde gece boyunca Bacillus kültürü, DW plakalarinda (agirlik cinsinden) %95 suyu; %l.5 nitrojen kaynagi (bir baska ifadeyle, maya); %3 sakaroz; %0.06 mikromineralleri; %0.l dipotasyumhidrojen fosfati içeren 700 aL bir sporülasyon ortamina aktarilmaktadir. Plaka, 3 günlügüne 37°C ve 175 rpm,de inkübe edilmektedir.

Sporülasyon mikroskobik olarak takip edilmektedir ve spor yüzdesi (toplam Bacillus hücre sayisina kiyasla spor sayisi), inkübasyonun 1. gününden (24 saat), 2. gününde (48 saat) ve 3. gününden (72 saat) sonra görsel inceleme ile belirlenmektedir. terimi ile, hücrelerin en az %80”inin, inkübasyonun 2. gününden sonra sporlandigi kast edilmektedir. Sporülasyon yüzdesi tercihen en az %85, en az %90, en az 2494639 amaci, susu, hayvan yemi üretimi için kullanisli hale getirmek için yüksek bir sporülasyon yüzdesini içeren hücrelere sahip Bacillus suslari seçmektir. Ayrica yüksek bir sporülasyon orani olarak adlandirilabilen bir yüksek sporülasyon yüzdesine, yukarida açiklandigi gibi bir yüksek üretim verimliligi için ihtiyaç duyulmaktadir.

Yukarida açiklandigi gibi, önceki teknik, Bacillus suslarinin seçimine yönelik yöntemleri açiklamistir, fakat önceki teknigin tarama yöntemleri, sporülasyon yüzdesine odaklanmamistir. Dolayisiyla, önceki teknigin seçilmis Bacillus susunun, burada açiklandigi gibi sporülasyon yüzdesine uyum saglamak üzere yeterli bir derecede sporlanmasi mümkün degildir.

Yüksek büyüme özelliklerinin ve sporülasyonunun birlesik kabiliyetine sahip, herhangi bir antibiyotik direnci olmayan ve yüksek antimikrobiyal aktiviteye sahip üç sus seçilmis ve biriktirilmistir. Ayrica diger suslar, özellikler Bacillus amyloli'quefâci'ens türlerinin suslari (bkz. Tablolar 2 ve 3°te bulunan suslar (D-J)), istemlere göre çizilen kriterleri yerine getirmektedir ve bu sekilde, mevcut bulusun kapsami içerisine dâhil edilmektedir.

Sekil l,den görüldügü üzere, Baci'llus amylolz'quefaciens türlerinin özellikle birçok susu, mevcut bulusun kapsami içerisinde kalmaktadir. Birçok Baci'llus amyloli'quejâciens susunun, Bacillus geninin antimikrobiyal etkisinin susa özgü oldugu ve türlerle iliskili olmadigi güne kadar varsayildigi için, antimikrobiyal etkiye sahip olmasi sasirticidir.

Kapsamli deney açiklamalarina bagli olarak, teknikte tecrübe sahibi bir kisi, bir spesifik Baci'llus susunun, mevcut bulusun çesitli yönlerinin (i) maddenin duyarliligi, (ii) maddenin antimikrobiyal aktivitesi ve maddenin (iii) sporülasyon yüzdesi ile uyumlu olup olmadigini belirlemek için bu deneyleri tekrar edebilmektedir. Bu sekilde, teknikte tecrübe sahibi bir kisi, belirtilen özelliklere 2494639 sahip suslari tutarli bir sekilde üretebilecektir. Tercihen, seçim yöntemi ayrica (iv) pH 4”te bitkisel hücrelerin duyarliliginin degerlendirilmesini ve (v) suslarin, gastrointestinal yolda yeterli bir derecede sag kalabilmesini temin etmek için safra direncinin degerlendirilmesini içerecektir. Görünür bir sekilde, bu deneyler herhangi bir sirada uygulanabilmektedir ve bazi suslar, kriterleri doldurmamalari halinde, süreç esnasinda çikarilabilmektedir.

Safranin, sag kalimda ve emzirmede ve hayvanlarin GlT°sinde bitkisel hücrelere bacillus spor hücrelerinin asiri büyüinesinde bazi negatif etkilere sahip oldugu, literatürde bilinmektedir.

Bu sekilde, probiyotik bakteriler genel olarak hayvan yemine ek olarak probiyotik bacillus bilesimler olarak kullanisli olmasi için bir düsük pH°1 ve safra tuzuna direnci tolere edebilerek, hayvanin bagirsaginda sag kalabilecek ve prolifere olabilecektir. Örnekler, bu hususta kullanisli in vitro testler saglamaktadir. Düsük pH,a (gastrik kosullari uyarmaktadir) duyarliligin testi, bitkisel hücrelerin, pH 4,e direncine odaklaninaktadir. Sporlarin, 2-3 pH degerine dirençli oldugu ve bitkisel hücrelerin pH 2ide ölecegi iyi bilinmektedir. Fakat, gastrik pH, özellikle besleme kosullarinda 4°e kadar pH degerlerine sahip olabilmektedir. Bu, Sporlarin yesillendirilmesini saglayabilmektedir ve bu sekilde, pH 4”te bitkisel hücrelerin duyarliliginin testi için uygundur. Seçilmis suslar tercihen 4 olan pH”a dirençli olmalidir. Seçilmis suslarin sonuçlari, Tablo 2”de temsil edilmektedir.

Bacillus geni, Bacillus amyloli'quefaciens alt türü, amyloliquefâciens veya Baci'llus amyloli'quefêiciens alt türleri, plantarum, Bacillus simplex, Baci'llus licheng'formz's, Baci'llus megaterium, Bacillus mojavensis, Baci'llus pumi'lus, Baci'llus safensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Baci'llus atrophaeus, Baci'lliis methylotrophicus, Bacillus siamensi's, Bacillus valli'smorti's or Bacillus tequilensi's gibi Bacillus amyloliquefaciens türlerini içermektedir. 261 susun taniminin ilk yöntemi, 16S,ye dayali olmaktadir. Bu yöntem, 2494639 Baci'llufun bazi yakindan iliskili türleri arasinda ayrim yapamamaktadir. Bu sebepten ötürü, bir sus, Baci'llus amyloliquejâcienS/atrophaeus/methylotmphi'cus/si'amensis/vallz'smorris türlerinden olusan grupla veya Bacillus mQ/'avensiS/subti'liS/tequi'lensis türlerinden olusan grupla iliskili olarak tanimlanabilmektedir. Her iki grup, bulusun kriterlerini yerine getiren birçok susu içermektedir ve bu gruplar, bulusun öneinli yapilandirmalarini temsil etmektedir.

Uygun olarak görüldügü yerde, suslar daha kapsamli bir yöntem (gyr B)) ile tanimlanmistir. Tablolar 2 ve 3,te gösterilen veriler birincil olarak Baci'llus anzyloliquefaciens°e (gyr B ile tanimlanmistir) baglidir. Seçilen Baci'llus amyloliquefaci'ens izolatlari ayrica RNA polimeraz beta alt birim (rpo B) gen sekans analizi ile tanimlanmistir ve alt türler tanimlanmis ve Tablolar 4, 5 ve 67da sunulmustur.

Susun, isi stabilitesi sergilemesi arzu edilmektedir. Seçilen suslarin sonuçlari, Tablo 4Ste sunulmaktadir. 99.5°C,de isi stabilitesi, 0 süresi (log/log) ile iliskili olarak 2, 5 ve 10 dakika sonra azaltim olarak cfu cinsinden ölçülmektedir. 2,nin altina bir azaltima, yaygin ticari Baci'lllus spor formülasyonlari ile ulasilmaktadir.

Mevcut bulusun kapsami içerisindeki suslar için, azaltim tercihen 2 dakika sonra 05 veya daha az, daha çok tercih edilecek sekilde 0.25 veya daha az, en çok tercih edilecek sekilde 005 veya daha az olmalidir. Tercih edilen yapilandirmalarda, 5 dakika sonraki azaltim tercihen 2.5 veya daha az, daha çok tercih edilecek sekilde 1 veya daha az, en çok tercih edilecek sekilde 0.5 veya daha az olmalidir ve 10 dakika sonra, azaltim ayrica tercihen 2.5 veya daha az, daha çok tercih edilecek sekilde 1 veya daha az en çok tercih edilecek sekilde 05 veya daha az olmalidir.

Tabloda bulunan tüm suslar, uygun bir isi stabilitesi sergilemektedir. Tablodan göründügü üzere, suslar (B, D ve F), her 10 dakika sonra bile oldukça yüksek bir isi stabilitesine sahiptir. B ve F”nin, Bacillus amyloliqiiefaciens°nin alt türü amyloliquefizciens oldugunu belirtmek gerekmektedir, suslar, bu alt türleri, mevcut bulusun tercih edilen bir yapilandirmasi haline getirmektedir. 2494639 Enzim üretimi, Örnek 4°te incelenmistir. Mevcut bulgular, tüm incelenmis suslar için, 50 mU/ml veya daha fazla bir selülaz aktivitesi sergilemektedir. Bu tarz bir aktivitenin, bulusun bir Baccillus susu için faydali bir özellik olmasi tasarlanmaktadir. Belirli yapilandirma için, susun, B. amylolz'quefaciens alt türü plantarum için bulundugu üzer e 100 mU/ml veya daha fazlasi gibi daha yüksek bir selülaz aktivitesine sahip olmasi tercih edilebilmektedir, suslar, bu alt türleri, mevcut bulusun tercih edilen bir yapilandirmasi haline getirmektedir. Mevcut bulusun kapsami içerisindeki suslar için, selülaz aktivitesi tercihen 50 mU/ml veya daha fazla, daha çok tercih edilecek sekilde 100 mU/ml veya daha fazla, en çok tercih edilecek sekilde 250 mU/ml veya daha fazla, hatta daha çok tercih edilecek sekilde 400 mU/ml veya daha fazla olmalidir.

Bazi suslari, 70 mU/ml veya daha fazla olan bir yüksek ksilanaz aktivitesi sergilemektedir. Tablo 5, incelenmis suslar için, yüksek selülaz aktivitesinin yüksek ksilanaz veya 40000 RFU/OD veya daha fazlasi olarak belirlenen yüksek proteaz aktivitesi ile birlesik olmasinin gerek olmadigini göstermektedir. Tüm B. amyloliquefaciens alt türü plantarum olan suslar (G, I ve J), tüm üç enzim için yüksek aktivite sergileyen suslarin örnekleridir.

Bulusun bir Bacillus susu, (a) erisim numarasi DSM 25839`a sahip Bacillus mojavensis sulundan; (b) erisim numarasi DSM 25840, erisim numarasi DSM susundan ve (c) erisim numarasi DSM 25841,e sahip olan Bacillus subti'li's susundan olusan gruptan seçilmektedir.

Bulusun bir diger yönü, asagidakilerden olusan bir mutant susun elde edilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir 2494639 (a) erisim numarasi DSM 25 839`a sahip Bacillus mojavensis susu; numarasi DSM 27033°e sahip Baci'llus amyloli'quefacz'ens suslari; veya (0) erisim numarasi DSM 25841 'e sahip Baci'llus subtili's susu; yöntem, istege bagli olarak (a), (b) veya (c),nin susunun mutajenizasyoii tedavisine tabi tutulmasini ve asagidaki özelliklere sahip olan (a), (b) veya (c)”nin mutant suslarinin seçilmesini içermektedir (i) ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik; (ii) E. 0011' ve Clostri'di'um peifringenfin büyüme inhibisyonu ve (iii) 2. günde ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi.

Sus, mutant suslarini elde etmek üzere asagida daha kapsamli bir sekilde açiklandigi üzere bir mutajenizasyon tedavisine tabi tutulabilmektedir ve bundan sonra, bir seçim süreci uygulanmaktadir. Alternatif olarak, spontane bir sekilde olusan mutantlar için bir seçim uygulanmaktadir.

Bir mutant susunun elde edilmesine yönelik yöntem ayrica (iv) pH 4ate bitkisel hücrelerin duyarliliginin degerlendirilmesini ve (v) suslarin, gastrointestinal yolda yeterli bir derecede sag kalabilmesini temin etmek için safra direncinin degerlendirilmesini içerebilmektedir. Açikçasi, bu deneyler, herhangi bir sirada uygulanabilmektedir ve bazi suslar, kriterleri yerine getirememeleri halinde süreç esnasinda hariç tutulabilmektedir.

Burada kullanilan bir bakteriyel “sus” büyütüldügünde veya çogaldiginda genetik olarak degismemis kalan bir bakteriyi ifade etmektedir. Özdes bakteri çoklugu da dâhil edilmektedir. 2494639 ugramamis bir formunu ifade etmektedir.

Bir “mutant bakteri” veya bir “mutant sus”, bir dogal (spontane, dogal yolarla olusan) inutant bakteriyi veya sokak türü DNA'da mevcut olmayan genomundaki (DNA) bir veya birden fazla mutasyonu içeren bir indüklenmis mutant bakterisini ifade etmektedir. Bir “indüklenmis mutant”, mutasyonun, (i) örnegin 2- aminopürin benzeri bir baz analog veya ICR-191 gibi bir interselatlayici madde gibi DNA ile birlesik olan veya dâhil edilmis bir hale gelen bir mutajen, (ii) nitrozoguanidin veya hidroksilamin veya etan metil sülfonat (EMS) veya N-metil- N'-nitro-N-nitr0guanidin (NTG), UV- veya gama radyasyonu ve benzeri gibi alkilleyici maddeleri içeren DNA ile reaksiyona giren bir mutajenden seçilen bir kimyasal mutajen gibi kimyasal mutajenlerle islem dâhil olmak üzere, herhangi bir geleneksel olarak kullanilan mutajenizasyon islemi ile olan islem gibi insan tedavisi ile indüklendigi bir bakteridir. Buna karsin, bir “spontane mutant” veya Bir mutant, çesitli mutajenizasyon islemlerine tabi tutulabilmistir (tek bir islem, bir mutajenizasyon adimini, bundan sonra bir tarama/seçim adimini anlainalidir), fakat mevcut olarak 203den daha fazla olmayan veya 10idan daha fazla olmayan veya 57ten daha fazla olmayan islemin (veya tarama/seçim adiminin) uygulanmasi tercih edilmektedir. Mevcut olarak tercih edilen bir mutantta, bakteriyel az veya hatta %0.0001”den daha az nükleotid, ana susa kiyasla bir diger nükleotid ile degistirilmis veya silinmistir.

Yukarida açiklanan mutant bakterileri, GMO degildir, bir baska ifadeyle rekombinant DNA teknolojisi ile modifiye edilmemektedir. Rastgele mutagenez ile mutatin saglanmasina yönelik olarak yukarida tercih edilen yönteme bir alternatif olarak, ayrica alana yönelik mutagenez vasitasiyla, örnegin uygun bir 2494639 sekilde tasarlanmis PCR teknikleri kullanilarak veya bakteriyel replikonlara entegre edilebilen bir degistirilebilir eleman kullanilarak bu tarz bir mutantin saglanmasi da mümkündür.

Mutant, spontane bir sekilde olusan bir mutant olarak saglandiginda, yukaridaki sokak türü sus, herhangi bir önceki mutajenizasyon islemi olmadan seçim adimina tabi tutulmaktadir. Çesitli Bacillus türleri, GRAS durumuna sahiptir, bir baska ifadeyle genel olarak güvenli olarak taninmaktadirlar. Tüm B. subti'li's suslari, GRAS”dir. Burada açiklanan Bacillus suslari, aerobik ve fakültatif spor Olusturucularidir. Baci'llus türleri, sadece GRAS olarak görülen spor olusturuculardir. GRAS durumuna sahip mikroorganizmalarin çiftlik hayvanlarina beslenmesi, üreticiler, veterinerler ve çiftlik hayvani endüstrisindeki digerleri arasinda kabul edilebilir bir uygulamadir.

Dolayisiyla, bir diger yönünde, bulus, bulusun bir Baci'llus susunun hücrelerini içeren bir Baci'llus bilesimi ile ilgilidir. Bilesim, bulusun en az bir susundan seçilen en az bir, en az iki, en az üç, en az dört veya daha fazla Baci'llus susunun hücrelerini içerebilmektedir. Tercihen, Baci'llus bilesiminin hücreleri, spor hücreleridir.

Bilesimin ilgili Bacillus suslari, teknikte tecrübe sahibi bir kisi tarafindan bilinen ticari olarak ilgili bir formda mevcut olabilmektedir. Dolayisiyla, bir yapilandirmada, bilesimin Baci'llus suslari, kurutulmus (örn. Sprey ile kurutulmus) hücreler veya donmus hücreler olarak mevcuttur. Bilesim, bir sivi, bir bulamaç, bir toz veya bir topak formunda oldugu gibi herhangi bir uygun formda saglanabilinektedir.

Tercih edilen bir yapilandirrnada, Bacillus bilesimi, 105 ila 1012 CFU/g, daha çok '2 CFU/ g içermektedir. 2494639 bilesiinin gram agirligi ile ilgilidir. Teknikte tecrübe sahibi bir kisi tarafindan bilindigi üzere, ticari olarak ilgili bir bakteriyel bilesim genel olarak, diger ilgili katki maddelerini de, Örnegin peynir alti suyu, peynir alti suyu süzüntüsüne, kalsiyum karbonat/kireçtasina ve alüminyum silikatlar ve kieselgur (silisli toprak) gibi topaklanmayi önleyici maddelere ait olan grubun bir tasiyicisi/içerigi gibi diger ilgili katki maddelerini içermektedir. Bacillus bilesimini paketlemek için kullanilan uygun bir kabin agirligini içerrnemektedir. Bir yapilandirma, uygun bir kaba paketlenen bir bilesim ile ilgilidir.

Mevcut bulusun bilesimleri, bulusun bir Baci'llus susunu ve bu bilesimleri, hayvanlara besleme için bir yem katkisi olarak veya içme suyu için bir katki olarak uygun hale getiren tasiyicilari içerebilmektedir. Alternatif olarak, bulusun Baci'llus susu, yem proteini ve/veya yem karbonhidratlari dâhil olmak üzere, hayvan yem içerikleri ile formüle edilebilmektedir. Bu tarz kombinasyonlar, standart topaklanma süreçleri vasitasiyla esktrüde edilen topaklarin formunda olabilmektedir.

Burada açiklanan Baci'llus bilesimi, hayvan yemine bir probiyotik katki olarak kullanilabilmektedir. Bulus ayrica, bir hayvan yeminin veya ön karisimin üretilmesine yönelik olan, bulusun bir Bacillus bilesiminin bir hayvan yemine eklenmesini içeren bir yöntemi saglamaktadir.

Burada kullanildigi üzere, “ön karisim” terimi, daha sonrasinda arzu edilen bir inklüzyon oraninda yeme eklenen ve hayvana verilen bir ön karisimi olusturacak sekilde bir tasiyiciya eklenen bir Bacillus susunu ifade etmektedir.

Bulusun bir diger yönü, bir hayvanin beslenmesine yönelik olan, bulusun bir Baci'llus bilesiminin veya bulusa göre üretilen bir hayvan yeminin veya ön karisiminin bir hayvana uygulanmasini içeren bir yöntem ile ilgilidir. 2494639 Örnek 5, suslarla (B ve C) besleme çalismalarini açiklamaktadir ve bakimevi diyetlerine takviye edilen her iki Baci'llus susu probiyotik ürünlerinin, bir negatif kontrol grubuna kiyasla üretken performansi sayisal olarak arttirdigini göstermektedir. Üretim parametrelerine dair etki, çalisma esnasinda gözlemlenebilmektedir. Mortalite yüzdesi, her iki Baci'llus grubunda ve her iki çalismada azaltilmistir.

Bölgelerden birisi, siddetli bir diyarenin üstesinden gelmek için kafes basina EnroIloksasin ile tedavi edilinis hayvan sayisi, kontrol diyeti ile beslenen hayvanlarda olanlarda Baci'llus ile beslenenlerden önemli ölçüde daha yüksek (P>0.05) çikmistir.

Bu örnek bu sekilde bulusun Baci'llus bilesiminin uygulanmasinin, patojenler inhibe edilerek, örnegin hayVanda E. call' ve Clostridz'um gibi hastaliklarin tedavi edilmesi ve önlenmesi için kullanilabilmektedir. Baci'llus bilesimi, dogrudan beslenen bir mikrobiyal veya hayvan yemine bir besin katkisi olarak beslenebilmektedir. Mevcut bulusun bilesimleri, hayvana, hayvanin bagirsaginda Clostridia ve Escherichia coli' gibi patojenik bakterilerin büyümesini azaltmasi için etkili bir miktarda uygulaninakta veya beslenmektedir.

Hayvan, çiftlik hayvanlar, gevisgetirenler, buzagilar, domuzlar, tavsanlar, atlar, baliklar ve evcil hayvanlardan olusan gruptan seçilebilmektedir. Tercih edilen bir yapilandirmada, hayvan, tüketim için büyütülen, domuz gibi bir tarim hayvanidir veya piliçler ve yumurta üreten tavuklar gibi gida üreten hayvanlardir.

Bulusun bir veya birden fazla Bacillus susunun, küçük bir domuza uygulanmasina yönelik yöntemler de saglanmaktadir. Bu tarz yöntemler, bulusun bir veya birden fazla Bacillus susunun bir yavru domuzun annesine beslenmesini içerebilmektedir. Suslar, gebelik, emzirme veya her ikisi esnasinda beslenebilmektedir. Bir veya birden fazla Bacillus susu, bakimevi domuzlarina ve 2494639 büyümesi bitmis domuzlara beslenebilmektedir.

Bu sekilde, bulusu tarif eden (özellikle de asagidaki isteinlerin baglaminda) baglamin içerisindeki örnegin “bir” gibi terimler ve benzer göndergeler, aksi burada tarif edilmedikçe veya baglam içerisinde açikça karsi çikilmadikça tekil veya çogul terimleri kapsamasi için yapilandirilmaktadir. “Içeren”, “sahip olan”, olusturulacaktir (öm. “kisitlayici olmayacak sekilde dâhil” anlamina gelmektedir).

Burada bulunan deger araliklarinin anlatimi ile, aksi burada belirtilmedikçe her bir ayri degerin aralik içerisinde kaldigi sekilde ve her bir ayri degerin, sanki bireysel olarak burada anlatildigi gibi tarifname içine dâhil edildigi sekilde sadece bireysel olarak stenograf bir yöntem olarak hareket edilmesi amaçlanmaktadir. Burada tarif edilen tüm yöntemler, burada aksi belirtilmedikçe veya baglam tarafindan açikça karsi çikilmadikça herhangi bir uygun sirada uygulanabilmektedir.

Herhangi bir veya tüm örneklerin veya burada saglanan örnek teskil eden dilin (ör. aydinlatilmasi ve bulusun baglami içerisinde bir kisitlama koyulmamasi amaçlanmistir. Tarifnamede hiçbir dil, bulusun uygulamasi için esas olmayan herhangi bir talep edilmemis elemani gösterdigi sekilde yorumlanmalidir.

Biriktirilmis suslar Baci'llus mojavensi's susu CHCC 15510, Chr. Hansen A/S, Danimarka tarafindan 3 Nisan 2012 birikim tarihi ile erisim numarasi DSM 25839 altinda DSMZlde (Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH, Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.

Baci'llus amyloliquefâciens susu CHCC 15516, Chr. Hansen A/S, Danimarka 2494639 DSMZ°de (Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH, Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslararasi Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.

Bacillus amyloliquefaciens susu CHCC 15536, Chr. Hansen A/S, Danimarka DSMZide (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.

Baci'llus amyloliquefaciens susu CHCC 15539, Chr. Hansen A/S, Danimarka DSMZde (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.

Baci'llus subri'li's susu CHCC 15541, Chr. Hansen A/S, Danimarka tarafindan 3 Nisan 2012 birikim tarihi ile erisim numarasi DSM 25841 altinda DSMZSde (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.

Yukarida taniinlanan tüm biriktirilmis mikroorganizmalar için, asagidaki ek göstergeler geçerlidir: Ilgili devletlerin ilgili Patent Ofisleri ile ilgili olarak, basvuranlar, yukarida belirtilen biriktirilinis mikroorganizmalarinin bir numunesinin, patentin garanti edildigi tarihe veya basvurunun reddedildigi veya geri çekildigi veya geri çekilmis olarak addedildigi tarihe kadar, sadece basvuran 2494639 tarafindan aday gösterilen bir uzman tarafindan erisilebilmesini talep etmektedir.

Mevcut bulusun yapilandirmalari, kisitlayici olmayan örneklerin yoluyla asagida açiklanmaktadir. ÖRNEKLER Malzemeler: Dana Infiizyon Suyu (VIB) (Difco, 234420) Dana Inü'izyon Suyu (VIB) agar (VIB + %l.5 Agar bakteriyolojik, (Agar no. 1), Oxoid LP0011) TS agar plakalari (litre basina: 3 g tripton, 2 g triptoz, 1.5 g maya ekstrakti, Laura-Bertani (LB) suyu (g/L: Bakto tripton 10 (Difco 0123), Maya ekstrakti 5 Beyin Kalp Infîizyon (BHI) Suyu (Oxoid CM225) Beyin Kalp Infîizyon (BHI) agar (Oxoid CM375) Safra tuzlari (safra ekstrakti, domuz; Sigma B863 l) Biyo deney kaplari (Nunc 240845) Petri kaplari (Procudan 140096, nervürlere sahip petri kabi) Sporülasyon ortami: %(agirlik cinsinden) %95 su; %l.5 nitrojen kaynagi (bir baska ifadeyle, maya); %3 sakkarit; %006 mikromineraller; %0.1 dipotasyumhidrojenfosfat Pepton (%09 sodyum klorür, %1 pepton) FKP VetMIC Lact-l & Lact-2 (SVA,Uppsa1a, Isveç) içeren fizyolojik salin çözeltisi Kültürler: Bacillus suslari, diskilardan, topraktan, gida kaynaklarindan izole edilmis ve sus 2494639 bankasi koleksiyonlarindan toplanmistir ve -80°C`de MTP ana plakalarda %20 gliserol ile VIB°de sürdürülmüstür.

Antibiyotikler: Ampisilin (Sigma, A9518-SG) Vankomisin (Sigma, V1764-250MG) Kanamisin (Sigma, Kl377-IG) Eritromisin (Sigma E-53 89) Klindamisin (Sigma, C2569-10MG) Tetrasiklin (Sigma T-7660) Kloramfenikol (Sigma, C0378-5G) Patoj enler: E. coli 0101 F5 (Devlet Serum Enstitüsü, Copenhagen, Danimarka) E. Ulusal Tip Kültür Koleksiyonu E. 0011' suslari, -80°C°de MTP ana plakalarmda %20 gliserol ile LB°de sürdürülmüstür Clostri'di'um perßingens Tip A, DSM 756, -80°C,de %20 gliserol ile BHISda sürdürülmüstür. ÖRNEK 1: Ön tarama Topraktan ve diskidan 261 izolat ve gida kaynaklari, antibiyotik uyarliligi, patojen inhibisyonu, safra direnci ve düsük pH°a duyarlilik için bir ön tarama islemine tabi tutulmustur. 2494639 1.] Antibiyotik duyarliligi Baci'llus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 aL hacminde, DW plakalarinda 700 ”L VIB7ye eklenmistir ve gece boyunca 37 °C7de ve 175 rpmjde inkübe edilmistir. 2 konsantrasyonda Tablo 1,de listelenen antibiyotikler ile takviye edilen ISO test numuneleri ve antibiyotikleri içermeyen ISO kontrolleri, 180 aL bir hacimde MTP plakalarina eklenmistir. Gece boyunca Baci'llus kültürleri, 100 kat seyreltilmis ve plakalari, 37°Cade inkübe edilmistir. 620 nm°de optik yogunluk (0D), inokulümde ve inkübasyondan 24 ve 48 saat sonra MTP test plakalarinda ölçülmüstür. Bakterilerin antibiyotik duyarliligi, ISO kontrollerinde OD'ye ISO test numunelerinde OD°nin bir yüzdesi olarak öngörülmüstür. 1.2 Patoien inhibisyonunun Bacillus suslarinin taranmasi Bacillus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 u] hacminde, DW plakalarinda 700 ul V1B°ye eklenmistir ve gece boyunca 37 °C9de ve 175 rpmjde inkübe edilmistir.

Deneyden önce, E.coli' suslari, 30°Cide gece boyunca LB1de büyütülmüstür. C. perfringens CHCC143 72, 37°C”de anaerobik bir kavanozda gece boyunca BHI7da büyütülmüstür. 1.2.1 Agar spot testi ile Ecoli inhibisyonu Gece boyunca 2 m1 Ecoli kültürü, 50°C7de 200 m1 sivi VIB agari ile karistirilmis ve her bir biyo deney çanagina dökülmüstür. Kaplar, steril bir sehpada kurutulmustur. Gece boyunca 2 ul her bir Bacillus kültürü, Ecoli' ile karistirilan VIB agarinin yüzeyine tespit edilmistir ve 2 günlügüne 37°C,de inkübe edilmistir.

Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin, noktalar etrafindaki yariçapi, “yüksek” - 2 mm,den daha fazla yariçap, “orta” - 0.5 - 2 mm arasinda yariçap ve “düsük” 0.5 mm,den daha az yariçap olarak ölçülmüs ve kaydedilmistir. 2494639 1.2.2 Agar spot testi ile C. perfringens inhibisyonu VIB agari, biyo deney kaplara (kap basina 200 ml) dökülmüs ve bir steril sehpada boylu boyunca kurutulmustur. Gece boyunca 2 al her bir Bacz'llus kültürü, VIB agar kaplarinin yüzeyine tespit edilmistir ve gece boyunca 37°C'de inkübe edilmistir. C. perfringens Tip A CHCC14372, 2 ml ila 200 ml hacminde sivi BHl agarina eklenmis, karistirilmis ve Baci'llus noktalari ile biyo deney kaplarina nazikçe kaplanmistir. Kaplar, 1 günlügüne 37 °C,de anaerobik olarak inkübe edilmistir. Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin, noktalar etrafindaki yariçapi, 1.2.3 Çukurcuk diûizvon testi ile C. perfringens inhibisyonu karistirilmis ve her bir biyo deney çanagina dökülmüstür. Solidifikayondan sonra, bir steril delgi ile BHl agarinda 10 mm çukurcuklar olusturulmustur ve 80 ul gece boyunca Bacillus kültürü, her bir çukurcuga aktarilmistir. Kaplar, 1 günlügüne 37°C,de anaerobik olarak inkübe edilmistir. Netlestirilinis inhibisyon bölgelerinin, çukurcuklar etrafindaki yariçapi, “yüksek” - 2 mm°den daha fazla yariçap, “orta” - 0.5 - 2 mm arasinda yariçap ve “düsük” 0.5 mm,den daha az yariçap olarak ölçülmüs ve kaydedilmistir. 1.3 Safra direnç deneyi Baci'llus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 ul hacminde, DW plakalarinda 700 ul VlB,ye ekleninistir ve gece boyunca 37°C”de ve 175 rpm”de inkübe edilmistir. 50 ;41 bir hacimde gece boyunca Bacillus kültürleri, %03 safra tuzlari (test numuneleri) ile takviye edilen 800 pl VIBîye ve DW plakalarinda safra (kontroller) içermeyen VIB,ye aktarilmistir. Plakalar, 37°C ve 175 rpm”de inkübe 2494639 sürelerde ölçülmüstür ve VIB kontrollerinde ilgili OD620 degerlerinden çikarilmistir. Kültürler, OD620 degerlerindeki farklara göre, A (OD < 0.1), B (0D: 0.1-0.4) ve C (0D > 0.4) gruplarina siralanmistir. A grubunda bulunan suslar, safra tuzlarina en dirençli olarak düsünülmüstür. Seçilmis suslar, A veya B grubunda olmalidir. Seçilen suslarin sonuçlari, Tablo 2`de sunulmaktadir. 1.4 Düsük pH”a duyarlilik (uyarici gastrik kosullari) 1.0 M hidroklorik asitle pH4°e düzenlenen 800 ul VIB tambölenleri ve VIB kontrolleri (pH7), DW plakalarinda dagitilmistir. Bacillus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 nl hacminde, DW plakalarina eklenmistir ve gece boyunca 24 sürede ve inkübasyondan 24 saat sonra 200 141 hücre süspansiyonlarinda ölçülmüstür. pH4,te bakteriyel büyüme, inkübasyondan önce OD620 degerlerinin, inkübasyon sonrasi ilgili degerlerden çikarilmasi ile belirlenmistir. 0.1,den daha fazla ODssze artis gösteren kültürler, pH4”e dirençli (Tablo 2°de bir R ile gösterilmektedir) olarak görülürken, 0.1”den daha az OD620 degerlerine sahip kültürler (herhangi bir büyüme veya negatif deger yok), pH4'e duyarlilik (Tablo 2,de bir S ile gösterilmektedir) olarak görülmüstür. 1.5 Ön tarama sonuçlari: Ön tarama testine bagli olarak, ikincil tarama için 32 sus seçilmistir. Seçilmis suslar, açiklanan antibiyotikler için duyarli olmalidir ve Ecoli ve Clostridium perfringens”e karsi antimikrobiyal etkiyi göstermektedir ve diger uygulanan testlerde makul seklide uygulanmaktadir.

Topraktan ve diskilardan ve gida kaynaklarindan gelen 261 izolattan 161 izolat, ön tarama testinde antibiyotige dirençli olmustur. Antibiyotige duyarli 100 izolattan 56,s1, Clostridiiim perfringens`e karsi antimikrobiyal etkiye sahip 2494639 olmustur ve sadece 22°si, E. coli ve Clostri'di'um perfringensie karsi etkiye sahip olmustur. Bunlardan, 12 izolat B. amyloliquefaciens türünden gelmistir. Diger temsili suslar, B.3ubti`li's ve Bmojavensis türelerinden gelmistir. Tablolar 2 ve 3, Chr. Hansen sirketinin suslarinin (ikincil tarama için seçilmis 32 sustan 22”si) sonuçlarini özetlemektedir. ÖRNEK 2: Ikinci] tarama Birincil taramanin sonuçlarina bagli olarak, 40 seçilmis izolat ve referans suslari, agar spot testlerinin tekrari ile patojenlerin inhibisyonu için ve sporülasyon için test edilmistir. 32 sus ayrica MIC testi ile antibiyotik duyarliligi için test edilmistir. 2.1 Patoien inhibisyonunun Baci'llus suslarinin taranmasi Deneyden önce, 9 m1 VIB, Bacillus kültürü ile asilanmistir ve gece boyunca 37°C ve 175 rpmade inkübe edilmistir. Es zamanli olarak, 9 m1 BHI suyu, E. coli suslari ile asilanmistir ve gece boyunca 37°C”de inkübe edilmistir. Clostridium perfringens, bir anaerobik kavanozda ayni kosullarda büyütülmüstür. 2.1.1 Agar spot testi ile Ecolz' inhibisyonu: Patojenlerin gece boyu kültürleri, 2 ml bir hacimde, 200 m1 sivi VIB agarina 50°C”de eklenmis ve her bir biyo deney çanagina dökülmüstür. Kaplar, steril bir sehpada kurutulmustur. Gece boyunca Bacillus kültürleri, patojenler ile karistirilan VIB agarinin yüzeyine tespit edilmistir ve 2 günlügüne 37°C°de inkübe edilmistir. Noktalarin etrafindaki inhibisyon bölgelerinin yariçaplari ve noktalarin yariçaplari kaydedilmistir. 2.1.2 Agar spot testi ile C. per/ringens inhibisyonu: 2494639 Bacillus kültürleri, petri kaplarinda VIB agarin yüzeyine tespit edilmistir ve gece boyunca 37 OC,de inkübe edilmistir. Bir 2 m1 hacimde gece boyunca C. perfringens kültürü, 200 ml sivi BHI agari ile karistirilmistir ve büyütülmüs Bacillus noktalari ile VIB agarina dökülmüstür. Kaplar, 1 günlügüne 37°C,de anaerobik olarak inkübe edilmistir. Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin, noktalar etrafindaki yariçapi ölçülmüstür. 2.2 VIB,de ve sporülasyon ortaminda büy_u"me Baci'llus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 nl hacminde, DW plakalarinda 700 ul VIB,ye veya sporülasyon ortamina eklenmistir ve 24 saatligine 37°C,de ve 175 rpm,de inkübe edilmistir. Bakteriyel büyüme, 200 ul süspansiyonlarda 620 nm (OD620) optik yogunlukla belirlenmistir. Sporülasyon ortaminin bir yüksek türbiditesinden ve çukurcuklar arasindaki varyasyonlarindan dolayi, inkübasyondan önce OD620 degerleri, inkübasyondan sonra ilgili çukurcuklarda OD620 degerlerinden çikarilmistir. OD620,yi 0.4,ten daha fazla gösteren kültürler, A grubuna (yüksek büyüme) siralanmistir ve ODszoiyi 0.4,ten daha az gösteren kültürler, B grubuna (düsük büyüme) siniflandirilmistir. 2.3 Sporülasyon ortaminda sporülasyon Bacillus suslari, MTP ana plakalarmdan bir 50 ul hacminde, DW plakalarinda 700 ul VIB°ye eklenmistir ve gece boyunca 37°C”de ve 175 rpm'de inkübe edilmistir. 50 u.] bir hacimde gece boyunca Bacillus kültürleri, DW plakalarinda 700 ul bir sporülasyon ortamina (SM) aktarilmistir. Plakalar, 3 günlügüne 37°C ve 175 rpmide inkübe edilmistir. Sporülasyon mikroskopik olarak takip edilmistir ve spor yüzdesi (toplam hücre sayisi ile iliskili spor sayisi), inkübasyonun 1. gününden (24 saat), 2. gününde (48 saat) ve 3. gününden (72 saat) sonra görsel inceleme ile belirlenmistir. 2.4 MIC ile ölçülen antibiyotik duyarlilik 2494639 Suslar, bir antibiyotik sayisi için minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) ölçülerek antibiyotik duyarlilik için analiz edilmistir. Kullanilan yöntem, CLSI standardi (Klinik ve Laboratuvar Standartlari Enstitüsü M07-A8 ve M45-A2) tarafindan çizilen bir et suyu mikroseyrelti yöntemi ile ölçülmüstür.

Test edilecek olan susun bir gece boyu büyümesinin bir süspansiyonu, test edilecek olan iki kat antibiyotik seyreltisinde (toplam hacim 100 ul/çukurcuk) 105 cfu/ml uygun bir konsantrasyonda (koloni olusturan birim/ml) mikrotitre plakalarinda ISO-SENSITEST Suyunda (Oxoid CM0473) asilanmaktadir ve 37°C°de 20-24 saatligine aerobik olarak inkübe edilmistir. Ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikol antibiyotiklerini içeren önceden üretilmis paneller VetMIC Lact-l antibiyotigin en düsük konsantrasyonu olarak 24 saatten sonra kaydedilmektedir.

Test, iki bagimsiz biyolojik kopya olarak iki defa uygulanmistir. 2494639 Sonuçlar 32 seçilmis sustan sonuçlar, Baci'llus amyloli'quefaci'ensîn, antibiyotik duyarliligin, antimikrobiyal etkinin ve sporülasyonun en iyi birlesik özelliklerine sahip oldugunu göstermistir, bkz. Tablo 2. Sadece Chr. Hansen firmasinin suslari (32 sustan 22,si) ile iliskili veriler dâhil edilmektedir.

Seçilmis Bac'illus suslarina yönelik temel veriler Kaynak, gyrB'ye göre türler. VIB'de ve sporülasyon ortaminda büyüme, ayrica sporülasyon yüzdesi Büyüme Sporülasyon, % Suslar Kaynak Türler Antibiyotik VlB SM Gün 1 Gün 2 Gün 3 Direnç A Diskilar B.mojavensis Duyarli A B 5 95 90 B Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli A A 10 99 99 C Diskilar B.subtilis Duyarli B A 0 80 95 D Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 40 99 99 E Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 20 99 99 F Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 50 99 99 G Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 95 95 95 H Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli A A 99 99 99 l Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 80 99 99 J Diskilar B. amyloliquetîici'ens Duyarli B A 50 99 99 K LMG B. amyloliquefaciens Duyarli A A 2 99 99 L Diskilar Blicheniformis Duyarli B A 90 99 Yok M Toprak B. licheniformis Dirençli B A 0 1 80 N Toprak B. megaterium Dirençli B A 0 0 0 O Diskilar B.subtilis Duyarli A B 0 60 10 P Diskilar B. pumilus Dirençli A A 0 10 99 Q Diskilar B. licheniformis Dirençli A A 0 1 5 R Diskilar B. licheniformis Dirençli A A 0 çok az 40 S Diskilar B. pumilus Duyarli A A 0 10 95 T Toprak B. megaterium Dirençli B A 0 0 0 U Toprak B. licheniformis Dirençli A A 0 çok az 70 V Diskilar B.5ubtilis Direncli A B 95 99 90 E. 0011' ve Closiridium peifi'ingens`iii (mm) inhibisyonu, ayrica seçilmis Baci'llus suslari ile safraya ve aside karsi direnç 2494639 geçen üç E. coli domuz patojenidir peifri'ngens, A B. mojavensis C A S 1.5 1.7 2.3 7 B amyloliquefaciens A A S 25 2.3 3.5 8 C B. subtilis A B R 1.8 1.5 2.7 7 D aiiiyloliquefaciens A A R 2 I .7 2.5 6 B amyloliquefaciens B A S 3 3 3.5 6 F amyloliquefaciens B A S 2.5 2.5 3.3 7 G amyloliquefaciens B B R 2 1.7 2 7 1-1 amyloliquefaciens A A R 3.5 3 4.5 7 I amyloliquefaciens B A R 2 2 2 8 J amyloliquefaciens B A S 2 2.5 2.5 8 K B. amyloliquefaciens B A S 0.3 <1 1 4 L B. licheniformis A B S < 1 <1 1.3 8 M B. Iicheniformis B A S 0 0 O 4 N B. megaterium B A S 0 0 0 P B. pumilus A A R 1 0 1.7 8 Q B. licheniformis B B S 0 0 0 2 R B. licheniformis B B S 0 0 O 2 S B. pumilus A A R <1 0 <1 6 T B. megaterium A A S 0 0 O 0 U B. Iicheniformis B B S 0 0 0 3 V B. subtilis C A S 2.5 1 2.5 10 ÖRNEK 3: Isi Stabilitesi 3.1 181 stabilite testinin yöntemi Baci'llus suslan, 37 0C ve 220 rpmsde VIBîde gece boyunca büyütülmüstür. Gece 2494639 sporülasyon tamamlanana kadar 1-2 günlügüne 37°C°de inkübe edilmistir.

Sporlar, plakalardan kazinmis, FKP çözeltisinde süspanse edilmis ve bitkisel hücreleri etkisiz hale getirmek için 15 dakikaligina 80°C9de inkübe edilmistir.

Spor süspansiyonlari, isitma isleminden hemen sonra buza yerlestirilmistir.

Sporlarin preparasyonlari, FKPSde iki defa yikanmis, %20 gliserol ile FKP,de yeniden süspanse edilmis ve kullanim öncesi 80°C`de tutulmustur. Bakteriyel Sporlarin isi direncine, 2, 5 ve 10 dakikaligina 99.5°C,de FKP,de (ml basina yaklasik olarak 500 ul spor süspansiyonlari ile eppendorf tüplerini tutarak erisilmistir. CFU sayilari, gece boyunca 37°C,de inkübasyondan sonra VIB agarina plakalanan isitilmis süspansiyonlarin seyreltilerinde belirlenmistir. 3.2 Isi stabilitesinin test sonuçlari lsi stabilitesi verileri, Tablo 4°te gösterilmektedir.

Tablo 4 seçilmis Bacillus suslarinm 99.5°C'de isi stabilitesi; 0 süresi (log/log) ile iliskili olarak 2, 5 ve 10 dakika sonra azaltim olarak da cinsinden ölçülmüstür Suslar Türler Sonra cfu cinsinden azaltim 2 dakika 5 dakika 10 dakika B B. amyloliquefaciens alt türü 0.05 0 0 amyloliquefaciens C B. subtilis 0.25 2.5 3.8 D B. amyloliquefaciens /iliskili siamensis 0 0 0.05 E B. amyloliquefaciens alt türü plantarum 0.34 3.8 5.3 F E. amyloliquefaciens alt türü 0 0 0 amyloliquefaciens H B. amyloliqucfacicns alt türü plantarum 0.19 2.5 5 Genel olarak 0 süresi ile iliskili olarak 2 dakika sonra 2 (log/log) cfuadan daha az bir azaltim, topaklanma için yemde dâhil edilecek olan sporlar için uygundur ve 2,nin altinda olan sonuçlara, yaygin ticari Bacillus sporlarinin preparasyonlari ile ulasilmaktadir. Bu sekilde, test edilen ve Tablo 4% gösterilen tüm suslar, iyi isi stabilitesine sahiptir. Bazi suslar ayrica 5 ve 10 dakika sonra iyi isi stabilitesi 2494639 sergilemistir, bir baska ifadeyle sus (B) ve Sus (F), B. amyloli'quefaciens alt türü amyloli'quefaci'ens, herhangi bir cfu azaltimi sergilememistir. ÖRNEK 4; Enzim üretimi 4.1 Selülaz deneyinin yöntemi Baci'llus suslari, 24 saatligine 37°C9de ve kuvvetli manyetik ajitasyonda karboksimetil selüloz (CMC) ortaminda (Abou-Taleb v.d. 2009) (I basina: 10.0 g üreticinin talimatlarina göre EnZChek Selülaz Sübstrat kiti (kat. E33953, Life Technologies) kullanilarak belirlenmistir. Kisacasi, kültür süpernatantlari, santriiîijleme ile toplanmistir seri seyreltiler halinde MTP”1erde (çukurcuk basina 200 ul) dagitilmistir. Standart egriler, 2 U ml`hden baslayarak Aspergillus nigefden (C1184) selülaz kullanilarak olusturulmustur. EnzChek sübstrat çözeltisi, Nunc 96 çukurcuklu Black FluoroNunc plakalarinda (kat. 237105, Therrno Fisher Scientific, NUNC Inc.) kültür süpernatantlarina eklenmistir.

Floresan, 30 dakikalik inkübasyondan sonra 360 nm uyarim/42 nm emisyonda kaydedilmistir (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc). Selülaz aktivitesi, iki bagimsiz deneyde standart egrilerden hesaplanmistir ve ortalama (U m1") olarak ifade edilmistir.

Baci'llus suslari, 24 saatligine 37°C ve kuvvetli manyetik ajitasyonda kayin agaci (kat. 288620, Becton Dickinson A/S, Danimarka), 5.0 g Bakto Pepton (kat. 2494639 üreticinin talimatlarina göre EnzChek Ultra Ksilanaz Deney Kitinin (kat. E33650, Life Technologies) kullanimi ile uygulanmistir. Kisacasi, kültür süpematantlari, santriûîjleme ile toplanmistir, sen' seyreltiler halinde MTP“lerde (çukurcuk basina 200 nl) dagitilmistir ve ksilanaz sübstrat çalisma çözeltisi eklenmistir. Kültür süpernatantlarinda floresan, 30 dakikaligina inkübasyondan sonra 360 nm uyarimda/420 nm emisyonda ölçülmüstür (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Eliner lnc.). Thermomyces lanugi'nosis (X2753), standart enzim olarak kullanilmis ve seri seyriler olarak, 25 mU ml'l”den baslayarak MTPslere yüklenmistir. Bacillus suslarinin ksilanaz aktivitesi, standart egrilerden hesaplanmistir ve iki bagimsiz deneyin ortalamalari (mU ml'l) olarak ifade edilmistir. 4.3 Proteaz deneyinin yöntemi Gece boyunca Baci'llus kültürleri (37 °C5de VlB*de büyütülmüstür), sübstrat (Sigma C3777) olarak Fluoresin izotiyosiyanat-kazein (FlTC-C) ile bir reaksiyon karisimina aktarilmis ve 3 saatligine 37 °C,de inkübe edilmistir. Çökeltiden sonra, çözülebilir peptit miktari, 497 nm uyarimda, 515 nm emisyonda floresan ile ölçülmüstür. Bu deney, genis proteaz araligini (serin, aspartik, sistein ve metalloproteazlar) tespit etmektedir. 4.4 Bivofilm üretiminin yöntemleri Bacillus suslari, VIB,ye (yaklasik MTP31erine (96 Well Conical Btm PP Plt Natural; NUNC lnc., Danimarka) dagitilmis ve çalkalamadan 24 saatligine 37°C°de inkübe edilmistir. Büyüme, 620 nm optik yogunlugunun (0D) Ölçümleri ile kontrol edilmistir. Biyofilm formasyonu, öncesinde açiklandigi gibi kristal mor leke ile degerlendirilmistir (Auger v.d. 2009). Kisacasi, çukurcuklarin distile suyla yikanmasindan sonra, agirlik hacim'l cinsinden %0.l kristal mor çözelti, PP-MTP,lere eklenmistir ve plakalar, 30 dakikaligina inkübe edilmistir. Daha sonrasinda, yikama prosedürü 2494639 tekrar edilmistir ve hacim hacim'l cinsinden %96 etanol , plakalara eklenmistir. 570 nm sogurum, 15 dakikalik inkübasyon sonrasi ölçülmüstür (Wallac Vict0r2 spectrophotometer, Perkin Elmer Inc.). Bacillus türlerinin suslari, yüksek (Ab5570 üreticileri olarak siniflandirilmistir. Deney, kopyalar halinde iki defa uygulanmistir. 4.5 Enzim deneylerinin sonuçlari Tablo 5 Enzim üretimi ve Biyofîlm (RFU= göreli floresan birimi) Selülaz Ksîlanaz, Proteaz, Suslarin Türleri mU/ml mU/ml RFU/OD Biyof'ilm Bamyloliqucfacicns alt türleri B. amyloliquefaciens alt türü F amyloliqucfacicns yüksek selülaz aktivitesine sahip olurken, B. amyloliquejâciens alt türü amyloliquefaciens olan suslarin (B ve F), düsük selülaz aktiviteye sahip oldugunu göstermektedir. ÖRNEK 5: Yavru domuz çalismalari Iki seçilmis Baci'llus suslari (Sus B veya C), büyüme performansinda ve yavru 2494639 domuzlarin sütten kesilmesinden sonraki mortalitelerindeki etkilerini degerlendirmek üzere bakimevi diyetlerine takviye edilmistir. Ecoli', üretim parametrelerinde ve mortalitede önemli bir etkiye sahip, bakim sürecinde ana patojenlerden birisi oldugu için, bu çalismalar, hayvanlarda Ecoli' inhibisyonundaki etki hakkindaki bilgiyi verebilmektedir. Çalismalar, 2 farkli alanda uygulanmistir, alan 1, bir arastirma çiftligi olmus ve alan 2, bir üniversite olmustur. Bu çalisma kurulumu, her iki alanda benzer olmustur.

Yavru domuz çalismalarinda kullanilan alanlarin genel incelemesi Toplam domuz sayisi Kopya sayisi Agirliklar Çalisma günleri .1.1 Alan lide deneysel kurulum Sütten kesim gününde, deney çiftliginden ortaya çikan, iki ardisik sütte kesilmis yigindan (288 yavru domuz) 576 yavru domuz (28 günlük), deneyde kullanilmistir. Yavru domuzlar, melezlestirilmis domuzlardir (ACMC x Pietrain).

Seçilmis yavru domuzlar, genel olarak sagliklilardir ve bakim asamasinda herhangi bir asi almamislardir. Deney çiftligi, kontrol altinda Domuz Üreme & Solunum Sendromuna (PRRS) pozitif olmustur ve sütten kesme asamasindan sonra bazi kolibasillozis problemlerine sahip olmustur. Yavru domuzlar, vücut agirligina göre siniflandirilmistir ve daha sonrasinda, her iki tedavide vücut agirligina benzer olarak, her bir kafes blogunun, 6 yavru domuzu, 3 tam erkek ve 3 disiyi içerdigi sekilde her iki sütten kesilmis yiginda (toplamda 96 kafes) 48 kafese ayrilmistir. Tedaviler, blok vasitasiyla hafif ve agir yavru domuzlarin kafeslerine ayrilmistir, böylelikle her bir tedavi, 6 yavru domuz için 24 kafese (tedavi ve oda basina 6 kafes; tedavi ve sütten kesilmis yigin basina 12 kafes) uygulanmistir. Bacillus ürünleri, 400 g/ton yemde veya 1.28 *10 7 CF U g/yeme eklenmistir. 2494639 Domuzlarin, ortalama günlük agirlik kazancini (ADWG) hesaplamak için 28, (0. gün; sütten kesilme günü), 35, 42 ve 63. günde bireysel olarak agirligi alinmistir.

Ortalama günlük yem alimi (ADFI) ve yem dönüsüm orani (FCR), ayni 28-42 günlük; baslatici: 42-63 günlük; ve toplam bakim süreci) ölçülmüstür.

Uygulanan bireysel antibiyotik tedavilerinin kaydi dâhil olmak üzere, günlük olarak motalite ve patoloji sikligi kontrol edilmistir.

Kontrole kiyasla P-degerleri (A: P=< 0.1; a =<0.05) Sus B: [5516; Sus C=1554l SE = Standart Hata Vücut agirligi, 28-42 günlük (çalismada 14 gün) 42-63 günlük Toplam (28-63 gün) 28. gün 63.gün ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR 5.1.2 Sonuçlar Bakiin diyetlerine takviye edilen her iki Baci'llus susu probiyotik ürünü, bunlar arasindaki farklari göstermeden negatif bir kontrol grubu ile kiyasla üretim performansini sayisal olarak arttirmistir. ADG ve FU,ya dair önemli etki, ön baslatici asamada (28-42 günlük) gözlemlenebilmektedir. Mortalite yüzdesi, her iki Baci'llus grubunda azaltilmistir (Mortalite %7si: Kontrol (3.47), Sus, B (%139), Sus C (208)) .2.1 Alan 2”de deneysel kurulum Sütten kesimden hemen sonra, seçilmis tüm yavru domuzlar, kafes basina otuz üç hayvanla 24 çukurcukli bir sütten kesim odasina alinmistir. Oda, merkezi isitma 2494639 ve sogutma sistemine sahip basinçli havalandirma ile ve tamamen çitali zeminle ile donatilmaktadir. Her bir kafes, istenildigi kadar beslemeyi ve ayni zamanda üç hayvanin beslenmesine yönelik bir kapasite ile serbest suya erisimi temin etmek için bir ticari çift tarafli islak-kuru besleyici ile donatilmaktadir. Yem, tüm deney asamasi boyunca istenildigi kadar dagitilmistir.

Toplam yedi yüz ve yirmi ticari çapraz yeni sütten kesilmis yavru domuz [Pietrain x (Land-race x Large White)] kullanilmistir. Hayvanlar, sütten kesim gününde ayni çiftligin disi domuzlarindan elde edilmistir ve deney tesisine (tasinmadan) gönderilmistir. Erkek ve disi 26 günlük yavru domuz 7.0 kg SD=l.64 kg BW kullanilmistir. Hayvan numarasini içeren plastik kulak etiketi kimligi kullanilmistir. Hayvanlar, ilk vücut agirligi ile üç bloga dagitilmistir. Her bir blok içerisinde, yavru domuzlar, bir dengeli vücut agirligi dagilimina yönelik kafeslere dagitilmistir. Bu sekilde, her bir blok, deney diyetlerinin rastgele bir sekilde atandigi 30 hayvanlik 8 kafesten olusmustur. Çalisma, 28. gün sütten kesimde baslamistir. Hayvanlarin agirligi, bireysel olarak 0. ve 7. günde agirligi alinmistir ve grubun agirligi, çalismada 21. ve 35. günlerde alinmistir. Her bir besleme hunisinde biten yem, deney boyunca ölçülmüstür.

Toplam yem aliinina göre ortalama günlük yem alimi (ADFI), ortalama günlük kilo kazanç (ADG) ve yemzkazanç orani (PCR) bu sekilde hesaplanmistir. Yavru domuzlarin saglik durumu düzenli olarak degerlendirilmistir ve verilen herhangi bir anormal belirti veya ilaç kaydedilmistir. Mortalite orani ve ayirma yüzdesi de hesaplanmistir. en az kare ortalamasi, kontrolle kiyaslanan P degerleri (A: P=< 0.1) 2494639 .2.2 Sonuçlar Bakim diyetlerine takviye edilen her iki Bacillus susu, bunlar arasindaki farklari göstermeden negatif bir kontrol grubu ile kiyasla üretim performansini sayisal olarak arttirmistir. ADG ve FU”ya dair önemli etki, çalisma süreçlerinde gözlemlenebilmektedir.

Siddetli bir diyarenin üstesinden gelmek için kafes basina Enrofloksasin ile tedavi edilmis hayvan sayisi, sütten kesim sonrasi birinci hafta esnasinda kontrol diyeti ile beslenen hayvanlarda olanlarda, Bacillus ile beslenenlerden önemli ölçüde daha yüksek (P>0.05) çikmistir. Ayni sonular (P<0.05), tüm deney süreci (sütten kesimden sonra 0 ila 35. gün) için gözlemlenmistir. Mortalite yüzdesi, her iki Bacillus grubunda azaltilmistir (Mortalite %'siz Kontrol (4.17), Sus B (%004), REFERANSLAR Barbosa v.d., 2005, Screening for Bacillus Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract, Applied and Environmental Microbiology, 968-978 Benitez V.d., 2011, Antimicrobial Activity of Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006 is enhanced in the Presence of Escherichia Coli, Curr Microbiol 62, 1017-1022 Chaiyawan v.d., 2010, Characterization and probiotic properties of Bacillus strains isolated from broiler, The Thai Journal of Veterinary Medicine, 40, 2, 207-214 EFSA 2008. Technical Guidance. Update of antibiotic resistance criteria. The 2494639 EFSA Journal 732, 9-15 Guo v.d, 2006, Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis Klose v.d., 2010. In vitro antagonistic activities of` animal intestinal strains against swine-associated pathogens. Vet. Microbiology 144: 515-521.

Lopez, D., ve R. Kolter. 2010. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in bacillus subtllis. FEMS Microbiol. Rev. 34(2): 134- Spiehs, M. J ., G. C. Shurson, and L. J. Johnston. 2008. Effects of two direct- fed microbial on the ability of pigs to resist an infection with salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Swine Health and Production. 16(1): 27-36.

B.Iicheniformis Büamyloliquefaciens Yüksek Yok __T- - B.purrilus / B.5afensis B.subtilis/B.mojavensis i ' r. Düsük ° 0 Düsük i' Yüksek -' ::Yüksek

Claims (6)

ISTEMLER

1. Asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir Bacillus susu (a) erisim numarasi DSM 25839? sahip Bacillus mojavensi's susu; erisiin numarasi DSM 270339e sahip Bacillus amyloli'quefaci'ens suslari; (c) erisim numarasi DSM 25841 ”e sahip Bacillus subtili's susu.

Asagidakilere sahip bir Bacillus susunun seçimine yönelik bir yöntem (i): ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik; (ii) E. 0011` ve Clostri'di'um perfi/i'ngensîn büyümesinin inhibisyonu; ve (iii) 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi, yöntem asagidaki adimlari içermektedir: (i): ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarli olan bir Bacillus susunun, bir Bacillus susu havuzundan seçilmesi ve izole edilmesi, (ii) E. 0011' ve Clostridium peijfißingensîn büyümesini inhibe eden bir Bacillus susunun bir Bacillus susu havuzundan seçilmesi ve izole edilmesi, (iii) 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesine sahip olan bir Bacillus susunun bir Bacillus susu havuzundan seçilmesi ve izole edilmesi, (iv) pH 4`te bitkisel hücrelerin duyarliligi için bir Bacillus susu havuzunun degerlendirilmesi, ve (v) safra direnci için bir Bacillus susu havuzunun degerlendirilmesi.

3. Asagidakilerin bir mutant susunun elde edilmesine yönelik bir yöntem (a) erisim numarasi DSM 25839321 sahip Baci'llus mojavensi's susu; erisim numarasi DSM 27033,e sahip Bacillus amyloliquefâciens suslari; (0) erisim numarasi DSM 25841 ”e sahip Baci'llus subtilis susu. yöntem asagidakileri içermektedir istege bagli olarak (a), (b) veya (0) susunun, mutajenizasyon islemine tabi tutulmasi, ve asagidaki özelliklere sahip olan bir (a), (b) veya (0) mutant susunun seçilmesi (i): ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik; (ii) E. (3011' ve Clostridium peigfringensîn büyümesinin inhibisyonu, ve (iii) 2 günlük inkübasyonundan sonra Ölçüldügünde, en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi.

4. Istem 1°e göre en az bir Bacillus susunun hücrelerini içeren bir Baci'llus bilesimi.

5. Istem 1,e göre en az iki susun hücrelerini içeren, Istem 4”e göre Bacz'llus bilesimi.

6. Istem l°e göre en az üç susun hücrelerini içeren, Istem 4 veya Sie göre Bacillus bilesimi. Bacillus susunun veya suslarinin hücrelerinin sporlar oldugu, Istemler 4 ila 6°dan herhangi birine göre Bacillus bilesimi. Istemler 4 ila 7`den herhangi birine göre bir Baci'llus bilesiminin bir hayvan yemine eklenmesini içeren bir hayvan yeminin veya ön karisiminin üretimine yönelik bir yöntem. Istemler 4 ila 7°den herhangi birine göre bir Baci'llus bilesiminin veya Istem 8”in yöntemine göre üretilen bir hayvan yeminin veya ön karisiminin bir hayvana uygulanmasini içeren bir hayvanin beslenmesine yönelik bir yöntem. Hayvanin, kümes hayvanlari, gevisgetirenler, buzagilar, domuzlar, tavsanlar, atlar, balik ve evcil hayvanlardan olusan gruptan seçilen bir hayvan oldugu, Istem 9”a göre bir hayvanin beslenmesine yönelik yöntem.