TR201815560T4 - E.coli ve clostrıdıum perfrıngens e karşı antimikrobiyal etkiye sahip ve yüksek sporülasyon kapasitesine sahip antibiyotiğe duyarlı bacıllus suşları. - Google Patents
E.coli ve clostrıdıum perfrıngens e karşı antimikrobiyal etkiye sahip ve yüksek sporülasyon kapasitesine sahip antibiyotiğe duyarlı bacıllus suşları. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201815560T4 TR201815560T4 TR2018/15560T TR201815560T TR201815560T4 TR 201815560 T4 TR201815560 T4 TR 201815560T4 TR 2018/15560 T TR2018/15560 T TR 2018/15560T TR 201815560 T TR201815560 T TR 201815560T TR 201815560 T4 TR201815560 T4 TR 201815560T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- bacillus
- strains
- strain
- animal
- sporulation
- Prior art date
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 152
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 title abstract description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title abstract description 25
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 title abstract description 13
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 64
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 53
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims abstract description 26
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims abstract description 15
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims abstract description 14
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 12
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 claims abstract 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 15
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 241001249117 Bacillus mojavensis Species 0.000 claims description 8
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 claims description 7
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 claims description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 claims description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 2
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 claims 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 abstract description 25
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 abstract description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 28
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 27
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 27
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 25
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 description 19
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 18
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 18
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 16
- 241000894007 species Species 0.000 description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 101710122864 Major tegument protein Proteins 0.000 description 13
- 101710148592 PTS system fructose-like EIIA component Proteins 0.000 description 13
- 101710169713 PTS system fructose-specific EIIA component Proteins 0.000 description 13
- 101710199973 Tail tube protein Proteins 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 11
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 11
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 11
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 11
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 9
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 6
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 5
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 241000282890 Sus Species 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 4
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 4
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 4
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 3
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 3
- 241000193400 Bacillus simplex Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- -1 Tetracycline Tetracycline Chemical class 0.000 description 3
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 235000021052 average daily weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 235000020940 control diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 2
- 235000020939 nutritional additive Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ULLQXGARUROVCU-UHFFFAOYSA-N 1,2-dinitroguanidine Chemical compound [O-][N+](=O)NC(N)=N[N+]([O-])=O ULLQXGARUROVCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 241000208327 Apocynaceae Species 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000278457 Bacillus siamensis Species 0.000 description 1
- 241000315694 Bacillus tequilensis Species 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008564 Boehmeria nivea Species 0.000 description 1
- 101100004287 Caenorhabditis elegans best-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100454314 Caenorhabditis elegans lact-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 206010061043 Clostridial infection Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000124209 Crocus sativus Species 0.000 description 1
- 235000015655 Crocus sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000001692 EU approved anti-caking agent Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019738 Limestone Nutrition 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 108010064250 RNA polymerase beta subunit Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 244000292604 Salvia columbariae Species 0.000 description 1
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 description 1
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000223257 Thermomyces Species 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- LMEMIKWTNPWYMI-UHFFFAOYSA-N acridine half-mustard dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1=C(Cl)C=CC2=C(NCCCNCCCl)C3=CC(OC)=CC=C3N=C21 LMEMIKWTNPWYMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006030 antibiotic growth promoter Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000740 enrofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- RIUKRCNLZYDWHS-UHFFFAOYSA-N ethane;methanesulfonic acid Chemical compound CC.CS(O)(=O)=O RIUKRCNLZYDWHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000006028 limestone Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- ZJQHPWUVQPJPQT-UHFFFAOYSA-N muscimol Chemical compound NCC1=CC(=O)NO1 ZJQHPWUVQPJPQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 1
- 235000013974 saffron Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000037974 severe injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000007201 ts agar Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Bir Bacillus suşu, (i) ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlılık; (ii) E. coli ve Clostridium perfringens'e karşı antimikrobiyal aktivite; ve (iii) inkübasyonun 2. gününden sonra ölçüldüğünde en az 80 olan bir sporülayon yüzdesi ile karakterize edilmektedir. Buluş ayrıca bu tarz suşların seçimine yönelik bir yöntemle ilgilidir. Buluşa göre tanımlanmış birçok suş, Bacillus amyloliquefaciens türlerinden gelmektedir. Bazı Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amyloliquefaciens alt türleri amyloliquefaciens olarak tanımlanırken, diğerleri, amyloliquefaciens alt türleri plantarum olarak tanımlanmıştır. Buluşun bir Bacillus suşu, probiyotik bir etkiye sahip olduğu hayvan yemine bir yem katkısı olarak kullanılabilmektedir.
Description
TEKNIK ALAN
Baci'llus türleri, hayvan besini endüstrisindeki probiyotik çözeltileri için
kullanilmaktadir ve üretimde Bacillus bazli probiyotiklerin pozitif etkileri ve
üretim hayvanlarinin sagligi iyi bilinmektedir (Spiehs v.d., 2008; Cutting, 2011).
Kullanimlari, Bacillus`un, hayvan besini endüstrisinde büyüme promoterleri
olarak kullanilan antibiyotiklerin kullanimini degistirebilme veya azaltabilme
kabiliyeti ile iliskilidir.
Fakat insanlar için yaygin olarak kullanilan antibiyotiklere karsi antibiyotik
direncine sahip olmayan Bacillus suslarina karsilanmamis bir ihtiyaç mevcuttur.
Mevcut bulus, ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin,
eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik ile karakterize
edilen ve ayrica E. 0011' ve Clostridium peifringens gibi ana patojenlerin
büyümesini de inhibe eden izole Baci'llus suslarini saglamaktadir. Suslar ayrica 2.
günde ölçüldügünde, en azindan yüzde 80 bir sporülasyona sahiptir, bu da hayvan
besini üretimi için güvenli ve faydali Baci'llus sporlarinin üretimini etkili bir
sekilde üretmeyi mümkün kilmaktadir.
Bulus ayrica hayvan besini katkilarinin, özellikle domuzlara ve kümes
hayvanlarina yönelik ürünlerin üretimine yönelik bulusun Bacillus suslarinin
sporlarinin kullanimi ile ilgilidir, burada suslar, probiyotik (saglik, yem kullanimi
ve büyümenin arttirilmasi) bir etkiye sahiptir.
2494639
ÖNCEKI TEKNIK
Domuzlar, özellikle yavru domuzlar, asinmalara, bir baska ifadeyle Escheri'chia
0011' (E 0011') ve Clostri'dium peijßingens Tip A ve C (Cpeifringens) gibi
bakterilerin yol açabildigi ishalden muzdarip olmaktadir. Asinmalar, tedavi
edilmemesi halinde, agirlik kaybi dâhil olmak üzere ölümle kayiplara ve siddetli
üretim kayiplarina yol açabilmektedir.
E. coli, yavru domuzlarda diyarenin birincil sebebidir ve tarlalarda kullanilan
antibiyotigin %50-75”i, birincil olarak E. colfnin yol açtigi sütten diyareye karsi
kullanilmaktadir. Diyare, sütten kesilmislerde ve yetistiricilerde (40 kg`ye kadar)
en büyük problemdir ve E. 0011', diyareye yol açan en önemli patojendir (Klose
Domuzlarda enterik klostridial enfeksiyonlar baskin bir sekilde sütten kesme
sürecinde olusmaktadir, fakat sonlandirma sürecinde domuzlari etkileyen
hemorajik bagirsak sendromu ile iliskilidir. C. perfringens tip C°ye kadar
immünizasyon, sütten kesim öncesi mortaliteyi önemli ölçüde azaltmasina
ragmen, C. perfringens tip A için mevcut olarak herhangi bir ticari asi
bulunmamaktadir. C. per/ringens tip A enfeksiyonlari, domuzlarin sütten kesim
öncesinde artan siklikla taninmaktadir ve teshise ve profilaksiye yönelik
yaklasimlar, tip C enfeksiyonu için olanlardan hem farkli hem de daha
komplekstir.
Kümes hayvanlarinda siddetli enfeksiyonlar ve hastaliklara, E. call' e Clostri'dz'um
perfringens dâhil olmak üzere patojenik bakteriler yol açmaktadir. Patojenlerin
yol açtigi enfeksiyonlar ve hastaliklar, artan mortaliteye, azalan performansa ve
artan üretim maliyetlerine neden olmaktadir. Ek olarak, bu patojenlerin birçogu,
insanlara iletilebilmektedir. Kus kolibasiloz, E. colfnin yol açtigi bir sistemik
enfeksiyondur ve en yaygin olarak, genç piliçlerde ve palazlarda olusmaktadir.
2494639
Probiyotlar, Clostri'dz'a ve E. 0011' gibi zararli bakterilerdeki bir azalma ve
Lactobaci'llus türleri ve Bijîdobacterium gibi faydali bakterilerdeki bir artis dâhil
olmak üzere saglikli bagirsak mikroflorasini sürdürmek için hayvan sagligi
uygulamalarinda kullanilmaktadir. Probiyotikler, antibiyotiklerin aksine, ne
bakterileri ayrim göstermeksizin yok etmedigi ne de patojenik bakterilerin
antibiyotige dirençli suslarina yol açmadiklari için, patojenik ve faydali bakteriler
arasindaki bir saglik dengesini sürdürmek üzere uyumlu hale getirilmektedir.
Probiyotiklerin, saglikli bagirsak mikroflorasini sürdürdügü birçok mekanizma
mevcuttur: patojenik bakterilerin rekabetçi dislanmasi, antimikrobiyal maddelerin
üretimi vasitasiyla patoj enik bakterilerin azaltimi, faydali bagirsak mikroflorasinin
büyümesinin ve eanliliginin arttirilmasi ve hayvanda bir sistemik immün yanitinin
uyarilmasi.
Yukarida bahsi geçenler açisindan, domuzlarda ve kümes hayvanlarinda E. 6011'
ve/Veya Clostri'di'um ile enfeksiyonlardan dolayi hastaliklari tedavi etmek veya
Önlemek üzere bir veya birden fazla Baci'llus susa sahip olmasi arzu edilmektedir.
Guo v.d., 2006, potansiyel probiyotikleri olarak Bacillus suslarinin taranmasini ve
domuzlarda Baci'llus subti'li's MAl39 testini açiklamaktadir. Piliçlerden,
domuzlardan, topraktan, ferrnente gidalardan ve Çin otlarindan 124 numune
toplanmistir. 750 aerobik spor olusturan sus, bu numunelerden izole edilmistir. E.
0011' K88 ve K99, Salmonella ve Staphylococcus aureus°a karsi inhibitör
aktivitesi, bir disk plakasi difüzyon deneyi kullanilarak test edilmistir. En iyi
aktiviteye sahip 6 Baci'lli', uyarilmis GIT kosullari (pH 2 ve %0.3 safra tuzu)
içerisinde sagkalimlari için test edilmistir. B. subtilis MA139, en iyi aday
olmustur ve 90 yavru domuzla 28 günlük bir besleme çalismasinda yavru
domuzlarda canli içi test edilmistir. ADG ve yem kullanimi arttirilmistir. Laktik
asit bakterileri arttirilmistir, diskilardaki Ecoli azaltilmistir. Fakat Clostri'di'um
perfringenfe karsi antimikrobiyal aktivite ve antibiyotiklere duyarlilik test
edilmemistir.
2494639
Barbosa v.d., 2005, organik olarak (toprakla temas ederek) yetistirilmis piliçlerden
gelen dislilardan 237 Bacillus izolasyonunu açiklamaktadir. 31 izolat karakterize
edilmistir. Bunlar arasinda B. subtili's ve B. li'cheni'formi's mevcuttur. Çesitli B.
subtili's suslai'i, C. perfringens ve S. aureus°a inhibisyon sergilemistir. B.
licheni'formis ayrica C. peiylri'ngensie karsi etki sergilemistir. Fakat seçilen
Bacillus izolatlarindan hiç birisi, mevcut basvuruda belirlenen Ecolfye karsi
antimikrobiyal aktivite sergilememistir. Seçilen bir Baci'llus izolati, büyüm
yogunlugunda azaltim sergilemektedir, fakat E. coli susu O78:K80”e karsi
herhangi bir tam inhibisyon ve test edilen diger E coli' susuna karsi herhangi bir
etkiye sergilememektedir (bakiniz Tablo 5). 2 günlük inkübasyondan sonra
sporülasyon yüzdesine veya vankomisin, kanamisin, streptomisin ve klindamisine
duyarliliga dair herhangi bir veri saglanmamaktadir.
Chaiyawan V.d., 2010, tibbi tedavide genis oranda kullanilan antibiyotiklere
duyarli olan ve C. peijfringens ATCC 151917e karsi antimikrobiyal aktivite
sergileyen bir T3-1 Baci'llus sus türünü tarif etmektedir. Sus, E. call` 0157iye karsi
herhangi bir antimikrobiyal aktiviteye sahip degildir. 2 günlük inkübasyondan
sonra sporülasyon yüzdesinde herhangi bir veri saglanmamaktadir.
Benitez v.d., 2011, bozulmamis veya aktif halde olmayan Ecoli mevcudiyetinin,
Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006 susu ile antimikrobiyal peptitlerinin
sentezini gelistirdigini gücen bir sekilde açiklamistir.
US 7,754,469 sayili patent dokümani, kümes hayvanlarinin tedavi edilmesine
yönelik mikroorganizmalar ve yöntemlerle ilgilidir ve US 8,021,654 sayili patent
dokümani, Baci'llus suslari ile domuzlarin tedavi edilmesine yönelik yöntemlerle
Fakat bu makalelerin veya patentlerin hiçbirisinde, yaygin olarak insanlar için
kullanilan antibiyotiklere duyarli olan Bacillus suslarini seçmek, Clostri'di'um
peijß'ingens ve E. coli°nin büyümesini inhibe etmek ve etkili sporülasyon için
2494639
kullanisli sus ve bu sekilde Bacillus probiyotik üretimini olusturmak için 2 günlük
inkübasyondan sonra ölçüldügünde en azindan yüzde 80 olan bir sporülasyona
sahip olmak üzere herhangi bir açiklama veya öneri mevcuttur.
teknigin dokümanlarinin hiç birisi, insanlar için yaygin olarak kullanilan
antibiyotiklere duyarliliga sahip olan, Clostri'dium perfüngens ve E. coli',nin
büyümesini inhibe eden ve 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde, en
azindan yüzde 80 sporülasyon yüzdesine sahip olan suslari tarif etmektedir.
Özet olarak, Baci'llus suslarinin taranmasi ile iliskili önceki teknik, mevcut
bulusun ayirt edici üç özelligini saglamamaktadir, bir baska ifadeyle insanlar için
yaygin olarak kullanilan antibiyotiklere duyarliligi, E. 0011' ve Clostri'di'um
perfringens büyümesinin inhibisyonunu ve 2 günlük inkübasyondan sonra
ölçüldügünde, en azindan yüzde 80 bir sporülasyon yüzdesini saglamamaktadir.
Önceki teknik, bu üç kriteri yerine getiren Bacillus suslarini da saglamamaktadir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI
Mevcut bulus ile çözülecek olan problem, ampisilin, vankomisin, gentamisin,
kanamisin, streptomisin, eritromisiii, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole
duyarlilik; E. 0011' ve Clostri'di'um peijfringensîn büyüme inhibisyonu; ve 2. günde
ölçüldügünde, en az yüzde 80 bir sporülasyon yüzdesi ile karakterize edilen bir
Bacillus susunu saglamaktir.
Çözüm, bu gelismis özelliklere sahip gelismis Baci'llus suslarinin tanimlanmasi
için mucitler tarafindan gelistirilen bir seçim yöntemine dayaninaktadir.
Seçim yönteminin birinci temel adimi, insanlar için yaygin olarak kullanilan
antibiyotiklere karsi duyarli olan Bacillus suslarini belirgin olarak
görüntülemektir. Daha belirgin olarak, suslar, ampisilin, vankomisin, gentamisin,
2494639
kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenitona
duyarlilik için görüntülenmektedir.
Dahasi, suslar, E. coli' ve Clostri'di'um perfringenfe karsi antimikrobiyal aktivite
ve 2. günde ölçüldügünde, en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi için
görüntülenmektedir.
Mucitler tarafindan incelenen topraktan ve diskilardan ve gida kaynaklarindan
gelen 261 izolattan 161 izolat, örneklerde açiklanan ön tarama testinde
antibiyotige dirençli olmustur. Antibiyotige duyarli 100 izolattan 56”si,
Clostri'di'um perfringenýe karsi antimikrobiyal etkiye sahip olmustur ve sadece
22asi, E. 0011' ve Clostridium perfringenfe karsi etkiye sahip olmustur. Bunlardan,
12 izolat B. amyloliquefaciens türünden gelmistir. Diger temsili suslar, B. subtilis
ve B. mojavensis türelerinden gelmistir. Tablolar 2 ve 3, Chr. Hansen sirketinin
suslarinin (ikincil tarama için seçilmis 32 sustan 22,si) sonuçlarini özetlemektedir.
Seçim süreci, üretim için uygun ortamda (i) güvenlige, (ii) etkiye ve (iii) yüksek
sporülasyona odaklanmistir. Güvenlik yönü ana olarak insanda dirençli
bakterilerin artan vakalarindan dolayi önemli olan antibiyotige direncin
yoksunluguna baglidir. Bu bakteriler, patojen bakterileri dirençli hale geldikçe,
artik antibiyotiklerle tedavi edilemeyen, iyi bilinen hastaliklara neden olmustur.
Baci'lluýun, antimikrobiyal aktiviteye sahip olabilen maddeleri, bir baska ifadeyle
bakteriosinler, bakteriolitik enzimler veya sürfaktinleri üretebilmektedir. Ikinci
seçim kriteri, E. coli ve Clostridium perfringenfe karsi etki, her iki patojen
domuzlarda ve çiftlik hayvanlarinda diyarenin ana sebebi oldugu için önemlidir.
Etki, E. coli`°nin üç suluna karsi ve Clostri'dium perfißingens tip A'ya karsi test
edilmektedir, fakat sonuçlarin, E.coli”ye karsi genel bir etkinin ve Clostri'dium
perfringens tip C gibi diger Clostri'di'a tiplerine karsi bir etkinin göstergesi olmasi
tasarlanmaktadir.
2494639
Üçüncü seçim kriteri, probiyotik üretimi için Önemlidir. Üretim süreci, Bacillus°u
büyüten fermentörde yer almaktadir ve sürecin sonunda, bir yüksek sporülasyon
orani, bir yüksek üretim verimliligi için gereklidir. Baci'llus”un sporülasyon süreci,
bir kaç yil boyunca incelenmistir, fakat hala akilda birçok soru kalmaktadir. Bu
sekilde, bazi Bacz'llus suslarinin oldukça düsük bir sporülayon oranina sahip
oldugu Bacillus üretim ve süreç gelisimi ile çalisma, teknikte tecrübe sahibi kisiler
arasinda iyi bilinmektedir. Baci'llufun, özellestirilmis hücrelerin alt
popülasyonlarina, bir baska ifadeyle sporlanan topluluklara, kompleks
besinlerinin degradasyonu için enzimleri üreten topluluklar ve ölen (Lopez ve
Kolter, 2010) topluluklara ayrildigi gösterilmistir. Bu farklilasimin, bunlardan
çogunun Baci'llus'un kendisi tarafindan üretildigi hücre disi sinyallerle
düzenlendigi görülmektedir, Bu sekilde, enzimlerin veya antimikrobiyal
maddelerin yüksek bir üretiminin, düsük bir sporülasyon verimliligine neden
olabildigi hipotezine varilmistir. Teknikte tecrübe sahibi kisi için, bir Bacillus
susu için, bir antimikrobiyal aktiviteye ve bir yüksek sporülasyon yüzdesine sahip
olmasi olagandisi ve sasirticidir.
SEKILLER
Sekil 1, 261 Baci'lli susunun antimikrobiyal aktivitesini sematik olarak
göstermektedir. Birçok Baci'llus amyloliquefaci'ens susunun, antimikrobiyal
etkiye sahip olmasi sasirticidir.
BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI
2006 yilinda Avrupa Birliginde antibiyotik büyüme promoterlerinin asamali
olarak bitmesi, yüksek veriinlilige sahip uygun maliyetli besin katkilarina olan
artan bir ihtiyaca ve bu sekilde yeni probiyotiklere bir ihtiyaca neden olmaktadir.
Bacillus-bazli probiyotik besin katkilari, doinuzlarda ve kümes hayvanlarinda
sagliga ve üretime dair pozitif etkileri için bilinmektedir. Bu ürünler, Sporlarin
isisinin stabil olmasindan ve 90-95°C`ye kadar sicakliklarda topaklama
2494639
sürecinden sag kalabilmesinden dolayi yem endüstrisine yöneliktir.
Domuzlarin probiyotiklerinin, hayvanlar, insanlar ve çevre için güvenli olmasi
gerekmektedir ve hayvanin büyümesini ve yem kullanimini arttirmalidir. Mevcut
bulusun amaci, üç adimda domuzlarda probiyotik etkileri için farkli kaynaklardan
gelen genis aralikta aerobik endospor olusturan bakterileri (AEB) görüntülemek
olmustur. AEB, fermente yemden (Kantong, ve Gergoush priiner baslaticilar),
domuz diskilari ve farkli kültür koleksiyonlarindan izole edilmistir. 26] AEB
izolati, l6S rDNA geninin siralanmasi ile tanimlanmistir ve çesitli ilgili
antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonunun (MIC) saptanmasi ile ilgili
antibiyotik direnci için incelenmistir.
Diger analizler, safta ve asit toleransini, patojen inhibisyonunu, farkli ortamlarda
büyümeyi, sporülasyonu, ayrica bagirsak sisteminde siki baglanti yerlerinde
pozitif etkilerin olasiligini degerlendirmek üzere hayvan hücre dizileri ile
etkilesimleri içermistir. Sonuçlar, hem türler hem de suslar arasindaki yüksek bir
farki göstermektedir. lzole türler birincil olarak gida kaynaklarindan B.
amyloliquefaciens, B. subtili's ve B. safénsis, diskilardan B. subtilis) B. pumilus, B.
amyloliquefaciens, B.1ichenif0rmi's, B. megaterium ve topraktan B. licheniformis
ve B. simplex dâhil olmak üzere Baci'llus geninden olusmustur.
Birçok izolat, EFSA ile belirlenen yukaridaki kirilma noktalarinin üzerinde arzu
edilmeyen antibiyotik direnç sergilemistir ve güvenlik endiselerinden dolayi
atilmistir. Dana eti infüzyon suyunda gece boyunca büyütüldügünde, çogu sus için
iyi bir büyüme gözlemlenirken, %lö'si, fermentasyon için uygun bir ortamda
tatmin edici olmayan büyümeye sahip olmustur. Tarama sürecinin 2. adiminda,
herhangi bir antibiyotik direnç içermeyen 32 seçilmis sus, gyrB geni ve PFGE
parmak izi siralanarak tanimlanmistir. Ek olarak, seçilmis patojenlerde
antimikrobiyal etkileri test edilmistir ve izolatlar arasinda önemli ölçüde
varyasyon gözlemlenmistir. Çesitli izolatlar, Clostri'di'um perfringens
inhibisyonunu sergilerken, sadece bir kaç izolat, E.coli"yi inhibe etmistir. Mevcut
2494639
bulusun sonuçlari bu sekilde, Closzridium perfringens ve E. coli`°nin büyüme
inhibisyonunun sadece nadiren birlestirildigini onaylamaktadir. Tarama sürecinin
3. adimi, yüksek patojen inhibisyonuna sahip 10 susu içermistir ve Sporlarin isi
stabilitesinin saptanmasini, genom siralamasini ve ayrica, siki baglanti
yerlerindeki etkilerini sergileyen in vitro çalismalari içermistir.
Mevcut bulus, (i) ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin,
eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik ile karakterize
edilen Bacillus susu saglamaktadir.
klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik” terimi, özel bir antibiyotige
duyarlilik olarak düsünülen bir susun, Tablo lide çizilen EFSA (EFSA, 2008) ile
verilen kopma noktasi seviyesinde büyümemesi gerektigi kast edilmektedir.
Tablo lide çizilen MIC degerleri, insan ve veteriner önemine sahip antibiyotiklere
bakteriyel direncin degerlendirilmesinde kullanilan kriterin güncellemesinde
EFSA tarafindan yayinlanan kilavuzlara (Hayvan Yeminde Kullanilan Katkilara
ve Ürünlere veya Maddelere dair Panel (FEEDAP) tarafindan hazirlanan teknik
antibiyotiklerinin ve kabul edilebilir kesim degerlerinin bir listesini saglamaktadir.
Bacillusia yönelik ampisilin için EFSA tarafindan verilen herhangi bir kopma
noktasi mevcut degildir, fakat bir kopma noktasi, çesitli diger bakteriler, bir baska
ifadeyle Lactobacillus türü için mevcuttur. Bu sekilde, Baci'llus suslarinin,
ampisiline karsi duyarliligi, mevcut bulusun bir kopma noktasi olarak seçilmistir.
Tablo 1. Insanlar için yaygin olarak kullanilan çesitli antibiyotiklerin EFSA kirilma noktalari
Antibiyotik tipi Antibiyotik EFSA Kopma noktasi mg/L
B-laktam Ampisilin 4
Glikopeptit Vankomisin 4
Gentamisin 4
Aininoglikosidler Kanamisin 8
Streptomisin 8
2494639
Makrolid Eritromisin 4
Linkosamid Klindamisin 4
Tetrasiklin Tetrasiklin 8
Kloramfenikol Kloramfenikol 8
Mevcut bulusun kapsami içerisinde olacak sekilde, susun, tüm yukarida bahsi
geçen antibiyotige karsi duyarli olmasi gerekecektir. Uygulamada, bu, bir
mikroseyrelti yönteini (minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC)) ile test
edildiginde kopma noktasi seviyesinde herhangi bir sulun gözlemlenmedigi
anlamina gelmektedir.
Mevcut bulusa göre, MIC, asagidaki gibi uygulanan CLSI standardi (Klinik ve
Laboratuvar Standartlari Enstitüsü M07-A8 ve M45-A2) tarafindan çizilen bir et
suyu mikroseyrelti yöntemi ile ölçülmektedirz
Test edilecek olan susun bir gece boyu büyümesinin bir süspansiyonu, test
edilecek olan iki kat antibiyotik seyreltisinde (toplam hacim 100 pl/çukurcuk) 105
cüi/ml uygun bir konsantrasyonda (koloni olusturan birim/ml) mikrotitre
plakalarinda ISO-SENSITEST Suyunda (Oxoid CM0473) asilanmaktadir ve
37°C7de 20-24 saatligine aerobik olarak inkübe edilmistir. Ampisilin, vankomisin,
gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve
kloramfenikol antibiyotiklerini içeren önceden üretilmis paneller VetMIC Lact-l
düsük antibiyotik konsantrasyonu olarak 24 saat sonra kaydedilmistir.
Bulusun yönünün (ii) birinci bölümü, E.colz”ye karsi antimikrobiyal aktivitesi
sergileyen bir Baci'llus susla ilgilidir. Mevcut bulusa göre, bu, asagidaki gibi
uygulanan E. 0011' agar spot testi ile ölçülmektedirz
9 ml Dana Infüzyon Suyu (VIB), test edilecek olan Bacillus kültürü ile
asilanmaktadir ve gece boyunca 37°C ve 175 rpm'de inkübe edilmistir. ES
zamanli olarak, 9 ml Beyin Kalp Intîizyon (BHI) suyu, E. coli
seçilen bir Ecoli' susu ile asilanmaktadir ve 37°C1de gece boyunca inkübe
2494639
edilmektedir.
E.coli'”nin gece boyu kültürleri, 2 m1 bir hacimde, 200 m1 sivi VIB agarina
50°C7de eklenmekte ve her bir biyo deney çanagina dökülmektedir. Kaplar, steril
bir sehpada kurutulmaktadir. Test edilecek olan gece boyunca Bacz'llus kültürü,
Ecoli' ile karistirilan VIB agarinin yüzeyine tespit edilmektedir ve 2 günlügüne
37°C3de inkübe edilmektedir. Noktalarin etrafindaki inhibisyon bölgelerinin
yariçaplari ve noktalarin yariçaplari kaydedilmektedir.
Bir Bacillus susu, inhibisyon bölgesinin en az 1.5 mm olmasi halinde Ecolfye
karsi bir antimikrobiyal aktivite sergiledigi düsünülmektedir. Tercihen, inhibisyon
bölgesi en az 2.0 mm, örnegin en az 2.5 mm, daha çok tercih edilecek sekilde en
az 3 mm, en çok tercih edilecek sekilde en az 3.5 mm ve hatta daha çok tercih
edilecek sekilde en az 4 mm7dir. Inhibisyon bölgesi, çesitli Ecoli' suslari için
farkli olabilmektedir. Mevcut bulusa göre E.coli”ye karsi bir antimikrobiyal
aktivite sergiledigi düsünülecek olan bir sus için, test edilen tüm Ecoli suslari için
en az 1.5 mm bir inhibisyon bölgesi sergilemelidir. Tercihen, iki Ecoli' susunun
inhibisyon bölgesi veya hatta daha çok tercih edilecek sekilde tüm üç Ecoli
susunun inhibisyon bölgesi, en az 2 mm olmaktadir. Bulusun bir Bacillus susu,
E.coli”nin büyüme inhibisyonu, özellikle test edilen türün büyüme inhibisyonu ile
karakterize edilmektedir. Önceki teknik ile görülecegi ve mucitler tarafindan
onaylandigi üzere, bir E. coli' türünün herhangi bir büyüme inhibisyonu, bir diger
E.coli' türünün (Tablo 5, Barbosa v.d., 2005) herhangi bir büyüme inhibisyonu ile
birlestirilmektedir ve tam tersi olmaktadir, bir baska ifadeyle bir Ecoli' türünün
inhibitör aktivitesi genel olarak diger Ecolz' türlerinin inhibitör aktivitesi ile
birlestirilmektedir (Tablo 1, Guo V.d., 2006).
Bulusun yönünün (ii) ikinci bölümü, Clostri'dium peijringens”e karsi
antimikrobiyal aktivite sergileyen bir Bacillus susu ile ilgilidir. Mevcut bulusa
göre, bu, asagidaki gibi uygulanan Clostri'di'um per/ringens agar spot testi ile
ölçülmektedir:
2494639
9 ml VIB, test edilecek olan Bacillus kültürü ile asilanmaktadir ve gece boyunca
37°C ve 175 rpm`de inkübe edilmektedir. Es zamanli olarak, 9 ml BHI suyu,
Clostridium perfringens Tip A, DSM 756 ile asilanmaktadir ve bir anaerobik
kavanozda 37°C'de gece boyunca inkübe edilmektedir.
Bacillus kültürleri, petri kaplarinda VIB agarin yüzeyine tespit edilmektedir ve
gece boyunca 37°C”de inkübe edilmektedir. Bir 2 ml haciinde gece boyunca C.
perjfingens kültürü, 200 m1 sivi BHl agari ile karistirilmaktadir ve büyütülmüs
Baci'llus noktalari ile VIB agarina dökülmektedir. Kaplar, 1 günlügüne 37°C,de
anaerobik olarak inkübe edilmektedir. Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin,
noktalar etrafindaki yariçapi ölçülmektedir.
Bir Baci'llus susunun, inhibisyon bölgesinin en az 5 mm olmasi halinde
Clostridium perfrz'ngenfe karsi bir antimikrobiyal aktivitesi sergiledigi
düsünülmektedir. Tercihen, inhibisyon bölgesi, en az 6 mm, daha çok tercih
edilecek sekilde en az 7 mmidir. Bulusun bir Baci'llus susu, Clostridium
perfringensîn büyüme inhibisyonu, özellikle test edilen türlerin büyüme
inhibisyonu ile karakterize edilmektedir. Teknikte tecrübe sahibi bir kisi
tarafindan bilindigi üzere, bir türün herhangi bir büyüme inhibisyonu genel olarak,
diger Clostridium perfi'i'ngens türlerinin herhangi bir büyüme inhibisyonu ile
birlestirilmemektedir ve tam ters geçerlidir, bir baska ifadeyle bir Clostridium
perfringens türlerinin büyüme inhibisyonu genel olarak diger Clostridium
perfringens türlerinin büyüme inhibisyonu ile birlestirilmektedir.
Baci'llus hücreleri, bacillus Spor hücreleri ve bacillus bitkisel hücreler olarak
mevcuttur. Burada Baci'llus hücrelerine referans verildiginde, bu, her ikisi ile
Bir Baci'llus spor hücresi ile iliskili “Baci'llus spor” terimi burada, teknige göre,
Baci'llus bakteriler ile üretilen, bir pasif, sert, üretken olmayan yapi olarak
karakterize edilebilen bir spor ile ilgilidir. Sporlarin birincil islevi, genel olarak
2494639
çevresel gerilim süreçler vasitasiyla bir bakterinin sag kalimini temin etmektir. Bu
sekilde, ultraviyole ve gama radyasyonu, kurutulmasi, lizozim, sicaklik, açlik ve
kimyasal dezenfektanlara dirençlidir. Sporlar yaygin olarak toprakta ve suda
bulunmaktadir, burada bunlar uzun bir süre zarfinda sag kalabilmektedir. Spor
kaplama, birçok toksik moleküle geçirimsizdir ve ayrica emzirmede dâhil olan
enzimleri içerebilmektedir. Çekirdek, DNA ve ribozoinlar gibi normal hücre
yapilarina sahiptir, fakat metabolik olarak inaktiftir. Bir bakteri, çevresel
kosullarin elverissiz hale geldigini tespit ettiginde, yaklasik sekiz saat alan bir
sporülasyon sürecini baslatabilmektedir.
bitki Baci'llus hücreleri ile ilgilidir.
Yönünde (iii), bulus, 2. günde ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon
yüzdesini sergileyen bir Bacillus susu ile ilgilidir. Mevcut bulusa göre,
sporülasyon yüzdesi, asagidaki gibi degerlendirilmektedir:
Test edilecek olan bir Bacillus susu, bir 50 pl hacminde, bir Derin çukurcuklu
(DW) plakada 700 aL VlB”ye eklenmektedir ve gece boyunca 37 °C°de ve 175
rpm,de inkübe edilmektedir. 50 uL bir hacimde gece boyunca Bacillus kültürü,
DW plakalarinda (agirlik cinsinden) %95 suyu; %l.5 nitrojen kaynagi (bir baska
ifadeyle, maya); %3 sakaroz; %0.06 mikromineralleri; %0.l dipotasyumhidrojen
fosfati içeren 700 aL bir sporülasyon ortamina aktarilmaktadir. Plaka, 3 günlügüne
37°C ve 175 rpm,de inkübe edilmektedir.
Sporülasyon mikroskobik olarak takip edilmektedir ve spor yüzdesi (toplam
Bacillus hücre sayisina kiyasla spor sayisi), inkübasyonun 1. gününden (24 saat),
2. gününde (48 saat) ve 3. gününden (72 saat) sonra görsel inceleme ile
belirlenmektedir.
terimi ile, hücrelerin en az %80”inin, inkübasyonun 2. gününden sonra sporlandigi
kast edilmektedir. Sporülasyon yüzdesi tercihen en az %85, en az %90, en az
2494639
amaci, susu, hayvan yemi üretimi için kullanisli hale getirmek için yüksek bir
sporülasyon yüzdesini içeren hücrelere sahip Bacillus suslari seçmektir. Ayrica
yüksek bir sporülasyon orani olarak adlandirilabilen bir yüksek sporülasyon
yüzdesine, yukarida açiklandigi gibi bir yüksek üretim verimliligi için ihtiyaç
duyulmaktadir.
Yukarida açiklandigi gibi, önceki teknik, Bacillus suslarinin seçimine yönelik
yöntemleri açiklamistir, fakat önceki teknigin tarama yöntemleri, sporülasyon
yüzdesine odaklanmamistir. Dolayisiyla, önceki teknigin seçilmis Bacillus
susunun, burada açiklandigi gibi sporülasyon yüzdesine uyum saglamak üzere
yeterli bir derecede sporlanmasi mümkün degildir.
Yüksek büyüme özelliklerinin ve sporülasyonunun birlesik kabiliyetine sahip,
herhangi bir antibiyotik direnci olmayan ve yüksek antimikrobiyal aktiviteye
sahip üç sus seçilmis ve biriktirilmistir. Ayrica diger suslar, özellikler Bacillus
amyloli'quefâci'ens türlerinin suslari (bkz. Tablolar 2 ve 3°te bulunan suslar (D-J)),
istemlere göre çizilen kriterleri yerine getirmektedir ve bu sekilde, mevcut
bulusun kapsami içerisine dâhil edilmektedir.
Sekil l,den görüldügü üzere, Baci'llus amylolz'quefaciens türlerinin özellikle
birçok susu, mevcut bulusun kapsami içerisinde kalmaktadir. Birçok Baci'llus
amyloli'quejâciens susunun, Bacillus geninin antimikrobiyal etkisinin susa özgü
oldugu ve türlerle iliskili olmadigi güne kadar varsayildigi için, antimikrobiyal
etkiye sahip olmasi sasirticidir.
Kapsamli deney açiklamalarina bagli olarak, teknikte tecrübe sahibi bir kisi, bir
spesifik Baci'llus susunun, mevcut bulusun çesitli yönlerinin (i) maddenin
duyarliligi, (ii) maddenin antimikrobiyal aktivitesi ve maddenin (iii) sporülasyon
yüzdesi ile uyumlu olup olmadigini belirlemek için bu deneyleri tekrar
edebilmektedir. Bu sekilde, teknikte tecrübe sahibi bir kisi, belirtilen özelliklere
2494639
sahip suslari tutarli bir sekilde üretebilecektir. Tercihen, seçim yöntemi ayrica (iv)
pH 4”te bitkisel hücrelerin duyarliliginin degerlendirilmesini ve (v) suslarin,
gastrointestinal yolda yeterli bir derecede sag kalabilmesini temin etmek için safra
direncinin degerlendirilmesini içerecektir. Görünür bir sekilde, bu deneyler
herhangi bir sirada uygulanabilmektedir ve bazi suslar, kriterleri doldurmamalari
halinde, süreç esnasinda çikarilabilmektedir.
Safranin, sag kalimda ve emzirmede ve hayvanlarin GlT°sinde bitkisel hücrelere
bacillus spor hücrelerinin asiri büyüinesinde bazi negatif etkilere sahip oldugu,
literatürde bilinmektedir.
Bu sekilde, probiyotik bakteriler genel olarak hayvan yemine ek olarak probiyotik
bacillus bilesimler olarak kullanisli olmasi için bir düsük pH°1 ve safra tuzuna
direnci tolere edebilerek, hayvanin bagirsaginda sag kalabilecek ve prolifere
olabilecektir. Örnekler, bu hususta kullanisli in vitro testler saglamaktadir. Düsük
pH,a (gastrik kosullari uyarmaktadir) duyarliligin testi, bitkisel hücrelerin, pH 4,e
direncine odaklaninaktadir. Sporlarin, 2-3 pH degerine dirençli oldugu ve bitkisel
hücrelerin pH 2ide ölecegi iyi bilinmektedir. Fakat, gastrik pH, özellikle besleme
kosullarinda 4°e kadar pH degerlerine sahip olabilmektedir. Bu, Sporlarin
yesillendirilmesini saglayabilmektedir ve bu sekilde, pH 4”te bitkisel hücrelerin
duyarliliginin testi için uygundur. Seçilmis suslar tercihen 4 olan pH”a dirençli
olmalidir. Seçilmis suslarin sonuçlari, Tablo 2”de temsil edilmektedir.
Bacillus geni, Bacillus amyloli'quefaciens alt türü, amyloliquefâciens veya
Baci'llus amyloli'quefêiciens alt türleri, plantarum, Bacillus simplex, Baci'llus
licheng'formz's, Baci'llus megaterium, Bacillus mojavensis, Baci'llus pumi'lus,
Baci'llus safensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Baci'llus atrophaeus, Baci'lliis
methylotrophicus, Bacillus siamensi's, Bacillus valli'smorti's or Bacillus tequilensi's
gibi Bacillus amyloliquefaciens türlerini içermektedir.
261 susun taniminin ilk yöntemi, 16S,ye dayali olmaktadir. Bu yöntem,
2494639
Baci'llufun bazi yakindan iliskili türleri arasinda ayrim yapamamaktadir. Bu
sebepten ötürü, bir sus, Baci'llus
amyloliquejâcienS/atrophaeus/methylotmphi'cus/si'amensis/vallz'smorris türlerinden
olusan grupla veya Bacillus mQ/'avensiS/subti'liS/tequi'lensis türlerinden olusan
grupla iliskili olarak tanimlanabilmektedir. Her iki grup, bulusun kriterlerini
yerine getiren birçok susu içermektedir ve bu gruplar, bulusun öneinli
yapilandirmalarini temsil etmektedir.
Uygun olarak görüldügü yerde, suslar daha kapsamli bir yöntem (gyr B)) ile
tanimlanmistir. Tablolar 2 ve 3,te gösterilen veriler birincil olarak Baci'llus
anzyloliquefaciens°e (gyr B ile tanimlanmistir) baglidir. Seçilen Baci'llus
amyloliquefaci'ens izolatlari ayrica RNA polimeraz beta alt birim (rpo B) gen
sekans analizi ile tanimlanmistir ve alt türler tanimlanmis ve Tablolar 4, 5 ve 67da
sunulmustur.
Susun, isi stabilitesi sergilemesi arzu edilmektedir. Seçilen suslarin sonuçlari,
Tablo 4Ste sunulmaktadir. 99.5°C,de isi stabilitesi, 0 süresi (log/log) ile iliskili
olarak 2, 5 ve 10 dakika sonra azaltim olarak cfu cinsinden ölçülmektedir. 2,nin
altina bir azaltima, yaygin ticari Baci'lllus spor formülasyonlari ile ulasilmaktadir.
Mevcut bulusun kapsami içerisindeki suslar için, azaltim tercihen 2 dakika sonra
05 veya daha az, daha çok tercih edilecek sekilde 0.25 veya daha az, en çok tercih
edilecek sekilde 005 veya daha az olmalidir. Tercih edilen yapilandirmalarda, 5
dakika sonraki azaltim tercihen 2.5 veya daha az, daha çok tercih edilecek sekilde
1 veya daha az, en çok tercih edilecek sekilde 0.5 veya daha az olmalidir ve 10
dakika sonra, azaltim ayrica tercihen 2.5 veya daha az, daha çok tercih edilecek
sekilde 1 veya daha az en çok tercih edilecek sekilde 05 veya daha az olmalidir.
Tabloda bulunan tüm suslar, uygun bir isi stabilitesi sergilemektedir. Tablodan
göründügü üzere, suslar (B, D ve F), her 10 dakika sonra bile oldukça yüksek bir
isi stabilitesine sahiptir. B ve F”nin, Bacillus amyloliqiiefaciens°nin alt türü
amyloliquefizciens oldugunu belirtmek gerekmektedir, suslar, bu alt türleri,
mevcut bulusun tercih edilen bir yapilandirmasi haline getirmektedir.
2494639
Enzim üretimi, Örnek 4°te incelenmistir. Mevcut bulgular, tüm incelenmis suslar
için, 50 mU/ml veya daha fazla bir selülaz aktivitesi sergilemektedir. Bu tarz bir
aktivitenin, bulusun bir Baccillus susu için faydali bir özellik olmasi
tasarlanmaktadir. Belirli yapilandirma için, susun, B. amylolz'quefaciens alt türü
plantarum için bulundugu üzer e 100 mU/ml veya daha fazlasi gibi daha yüksek
bir selülaz aktivitesine sahip olmasi tercih edilebilmektedir, suslar, bu alt türleri,
mevcut bulusun tercih edilen bir yapilandirmasi haline getirmektedir. Mevcut
bulusun kapsami içerisindeki suslar için, selülaz aktivitesi tercihen 50 mU/ml
veya daha fazla, daha çok tercih edilecek sekilde 100 mU/ml veya daha fazla, en
çok tercih edilecek sekilde 250 mU/ml veya daha fazla, hatta daha çok tercih
edilecek sekilde
400 mU/ml veya daha fazla olmalidir.
Bazi suslari, 70 mU/ml veya daha fazla olan bir yüksek ksilanaz aktivitesi
sergilemektedir. Tablo 5, incelenmis suslar için, yüksek selülaz aktivitesinin
yüksek ksilanaz veya 40000 RFU/OD veya daha fazlasi olarak belirlenen yüksek
proteaz aktivitesi ile birlesik olmasinin gerek olmadigini göstermektedir. Tüm B.
amyloliquefaciens alt türü plantarum olan suslar (G, I ve J), tüm üç enzim için
yüksek aktivite sergileyen
suslarin örnekleridir.
Bulusun bir Bacillus susu, (a) erisim numarasi DSM 25839`a sahip Bacillus
mojavensis sulundan; (b) erisim numarasi DSM 25840, erisim numarasi DSM
susundan ve (c) erisim numarasi DSM 25841,e sahip olan Bacillus subti'li's
susundan olusan gruptan seçilmektedir.
Bulusun bir diger yönü, asagidakilerden olusan bir mutant susun elde edilmesine
yönelik bir yöntem ile ilgilidir
2494639
(a) erisim numarasi DSM 25 839`a sahip Bacillus mojavensis susu;
numarasi DSM 27033°e sahip Baci'llus amyloli'quefacz'ens suslari; veya
(0) erisim numarasi DSM 25841 'e sahip Baci'llus subtili's susu;
yöntem, istege bagli olarak (a), (b) veya (c),nin susunun mutajenizasyoii
tedavisine tabi tutulmasini ve asagidaki özelliklere sahip olan (a), (b) veya (c)”nin
mutant suslarinin seçilmesini içermektedir
(i) ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin,
klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik;
(ii) E. 0011' ve Clostri'di'um peifringenfin büyüme inhibisyonu ve
(iii) 2. günde ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi.
Sus, mutant suslarini elde etmek üzere asagida daha kapsamli bir sekilde
açiklandigi üzere bir mutajenizasyon tedavisine tabi tutulabilmektedir ve bundan
sonra, bir seçim süreci uygulanmaktadir. Alternatif olarak, spontane bir sekilde
olusan mutantlar için bir seçim uygulanmaktadir.
Bir mutant susunun elde edilmesine yönelik yöntem ayrica (iv) pH 4ate bitkisel
hücrelerin duyarliliginin degerlendirilmesini ve (v) suslarin, gastrointestinal yolda
yeterli bir derecede sag kalabilmesini temin etmek için safra direncinin
degerlendirilmesini içerebilmektedir. Açikçasi, bu deneyler, herhangi bir sirada
uygulanabilmektedir ve bazi suslar, kriterleri yerine getirememeleri halinde süreç
esnasinda hariç tutulabilmektedir.
Burada kullanilan bir bakteriyel “sus” büyütüldügünde veya çogaldiginda genetik
olarak degismemis kalan bir bakteriyi ifade etmektedir. Özdes bakteri çoklugu da
dâhil edilmektedir.
2494639
ugramamis bir formunu ifade etmektedir.
Bir “mutant bakteri” veya bir “mutant sus”, bir dogal (spontane, dogal yolarla
olusan) inutant bakteriyi veya sokak türü DNA'da mevcut olmayan genomundaki
(DNA) bir veya birden fazla mutasyonu içeren bir indüklenmis mutant bakterisini
ifade etmektedir. Bir “indüklenmis mutant”, mutasyonun, (i) örnegin 2-
aminopürin benzeri bir baz analog veya ICR-191 gibi bir interselatlayici madde
gibi DNA ile birlesik olan veya dâhil edilmis bir hale gelen bir mutajen, (ii)
nitrozoguanidin veya hidroksilamin veya etan metil sülfonat (EMS) veya N-metil-
N'-nitro-N-nitr0guanidin (NTG), UV- veya gama radyasyonu ve benzeri gibi
alkilleyici maddeleri içeren DNA ile reaksiyona giren bir mutajenden seçilen bir
kimyasal mutajen gibi kimyasal mutajenlerle islem dâhil olmak üzere, herhangi
bir geleneksel olarak kullanilan mutajenizasyon islemi ile olan islem gibi insan
tedavisi ile indüklendigi bir bakteridir. Buna karsin, bir “spontane mutant” veya
Bir mutant, çesitli mutajenizasyon islemlerine tabi tutulabilmistir (tek bir islem,
bir mutajenizasyon adimini, bundan sonra bir tarama/seçim adimini anlainalidir),
fakat mevcut olarak 203den daha fazla olmayan veya 10idan daha fazla olmayan
veya 57ten daha fazla olmayan islemin (veya tarama/seçim adiminin) uygulanmasi
tercih edilmektedir. Mevcut olarak tercih edilen bir mutantta, bakteriyel
az veya hatta %0.0001”den daha az nükleotid, ana susa kiyasla bir diger nükleotid
ile degistirilmis veya silinmistir.
Yukarida açiklanan mutant bakterileri, GMO degildir, bir baska ifadeyle
rekombinant DNA teknolojisi ile modifiye edilmemektedir. Rastgele mutagenez
ile mutatin saglanmasina yönelik olarak yukarida tercih edilen yönteme bir
alternatif olarak, ayrica alana yönelik mutagenez vasitasiyla, örnegin uygun bir
2494639
sekilde tasarlanmis PCR teknikleri kullanilarak veya bakteriyel replikonlara
entegre edilebilen bir degistirilebilir eleman kullanilarak bu tarz bir mutantin
saglanmasi da mümkündür.
Mutant, spontane bir sekilde olusan bir mutant olarak saglandiginda, yukaridaki
sokak türü sus, herhangi bir önceki mutajenizasyon islemi olmadan seçim adimina
tabi tutulmaktadir.
Çesitli Bacillus türleri, GRAS durumuna sahiptir, bir baska ifadeyle genel olarak
güvenli olarak taninmaktadirlar. Tüm B. subti'li's suslari, GRAS”dir. Burada
açiklanan Bacillus suslari, aerobik ve fakültatif spor Olusturucularidir. Baci'llus
türleri, sadece GRAS olarak görülen spor olusturuculardir. GRAS durumuna sahip
mikroorganizmalarin çiftlik hayvanlarina beslenmesi, üreticiler, veterinerler ve
çiftlik hayvani endüstrisindeki digerleri arasinda kabul edilebilir bir uygulamadir.
Dolayisiyla, bir diger yönünde, bulus, bulusun bir Baci'llus susunun hücrelerini
içeren bir Baci'llus bilesimi ile ilgilidir. Bilesim, bulusun en az bir susundan
seçilen en az bir, en az iki, en az üç, en az dört veya daha fazla Baci'llus susunun
hücrelerini içerebilmektedir. Tercihen, Baci'llus bilesiminin hücreleri, spor
hücreleridir.
Bilesimin ilgili Bacillus suslari, teknikte tecrübe sahibi bir kisi tarafindan bilinen
ticari olarak ilgili bir formda mevcut olabilmektedir. Dolayisiyla, bir
yapilandirmada, bilesimin Baci'llus suslari, kurutulmus (örn. Sprey ile kurutulmus)
hücreler veya donmus hücreler olarak mevcuttur. Bilesim, bir sivi, bir bulamaç,
bir toz veya bir topak formunda oldugu gibi herhangi bir uygun formda
saglanabilinektedir.
Tercih edilen bir yapilandirrnada, Bacillus bilesimi, 105 ila 1012 CFU/g, daha çok
'2 CFU/ g içermektedir.
2494639
bilesiinin gram agirligi ile ilgilidir. Teknikte tecrübe sahibi bir kisi tarafindan
bilindigi üzere, ticari olarak ilgili bir bakteriyel bilesim genel olarak, diger ilgili
katki maddelerini de, Örnegin peynir alti suyu, peynir alti suyu süzüntüsüne,
kalsiyum karbonat/kireçtasina ve alüminyum silikatlar ve kieselgur (silisli toprak)
gibi topaklanmayi önleyici maddelere ait olan grubun bir tasiyicisi/içerigi gibi
diger ilgili katki maddelerini içermektedir. Bacillus bilesimini paketlemek için
kullanilan uygun bir kabin agirligini içerrnemektedir. Bir yapilandirma, uygun bir
kaba paketlenen bir bilesim ile ilgilidir.
Mevcut bulusun bilesimleri, bulusun bir Baci'llus susunu ve bu bilesimleri,
hayvanlara besleme için bir yem katkisi olarak veya içme suyu için bir katki
olarak uygun hale getiren tasiyicilari içerebilmektedir. Alternatif olarak, bulusun
Baci'llus susu, yem proteini ve/veya yem karbonhidratlari dâhil olmak üzere,
hayvan yem içerikleri ile formüle edilebilmektedir. Bu tarz kombinasyonlar,
standart topaklanma süreçleri vasitasiyla esktrüde edilen topaklarin formunda
olabilmektedir.
Burada açiklanan Baci'llus bilesimi, hayvan yemine bir probiyotik katki olarak
kullanilabilmektedir. Bulus ayrica, bir hayvan yeminin veya ön karisimin
üretilmesine yönelik olan, bulusun bir Bacillus bilesiminin bir hayvan yemine
eklenmesini içeren bir yöntemi saglamaktadir.
Burada kullanildigi üzere, “ön karisim” terimi, daha sonrasinda arzu edilen bir
inklüzyon oraninda yeme eklenen ve hayvana verilen bir ön karisimi olusturacak
sekilde bir tasiyiciya eklenen bir Bacillus susunu ifade etmektedir.
Bulusun bir diger yönü, bir hayvanin beslenmesine yönelik olan, bulusun bir
Baci'llus bilesiminin veya bulusa göre üretilen bir hayvan yeminin veya ön
karisiminin bir hayvana uygulanmasini içeren bir yöntem ile ilgilidir.
2494639
Örnek 5, suslarla (B ve C) besleme çalismalarini açiklamaktadir ve bakimevi
diyetlerine takviye edilen her iki Baci'llus susu probiyotik ürünlerinin, bir negatif
kontrol grubuna kiyasla üretken performansi sayisal olarak arttirdigini
göstermektedir. Üretim parametrelerine dair etki, çalisma esnasinda
gözlemlenebilmektedir. Mortalite yüzdesi, her iki Baci'llus grubunda ve her iki
çalismada azaltilmistir.
Bölgelerden birisi, siddetli bir diyarenin üstesinden gelmek için kafes basina
EnroIloksasin ile tedavi edilinis hayvan sayisi, kontrol diyeti ile beslenen
hayvanlarda olanlarda Baci'llus ile beslenenlerden önemli ölçüde daha yüksek
(P>0.05) çikmistir.
Bu örnek bu sekilde bulusun Baci'llus bilesiminin uygulanmasinin, patojenler
inhibe edilerek, örnegin hayVanda E. call' ve Clostridz'um gibi hastaliklarin tedavi
edilmesi ve önlenmesi için kullanilabilmektedir. Baci'llus bilesimi, dogrudan
beslenen bir mikrobiyal veya hayvan yemine bir besin katkisi olarak
beslenebilmektedir. Mevcut bulusun bilesimleri, hayvana, hayvanin bagirsaginda
Clostridia ve Escherichia coli' gibi patojenik bakterilerin büyümesini azaltmasi
için etkili bir miktarda uygulaninakta veya beslenmektedir.
Hayvan, çiftlik hayvanlar, gevisgetirenler, buzagilar, domuzlar, tavsanlar, atlar,
baliklar ve evcil hayvanlardan olusan gruptan seçilebilmektedir. Tercih edilen bir
yapilandirmada, hayvan, tüketim için büyütülen, domuz gibi bir tarim hayvanidir
veya piliçler ve yumurta üreten tavuklar gibi gida üreten hayvanlardir.
Bulusun bir veya birden fazla Bacillus susunun, küçük bir domuza uygulanmasina
yönelik yöntemler de saglanmaktadir. Bu tarz yöntemler, bulusun bir veya birden
fazla Bacillus susunun bir yavru domuzun annesine beslenmesini
içerebilmektedir. Suslar, gebelik, emzirme veya her ikisi esnasinda
beslenebilmektedir. Bir veya birden fazla Bacillus susu, bakimevi domuzlarina ve
2494639
büyümesi bitmis domuzlara beslenebilmektedir.
Bu sekilde, bulusu tarif eden (özellikle de asagidaki isteinlerin baglaminda)
baglamin içerisindeki örnegin “bir” gibi terimler ve benzer göndergeler, aksi
burada tarif edilmedikçe veya baglam içerisinde açikça karsi çikilmadikça tekil
veya çogul terimleri kapsamasi için yapilandirilmaktadir. “Içeren”, “sahip olan”,
olusturulacaktir (öm. “kisitlayici olmayacak sekilde dâhil” anlamina gelmektedir).
Burada bulunan deger araliklarinin anlatimi ile, aksi burada belirtilmedikçe her bir
ayri degerin aralik içerisinde kaldigi sekilde ve her bir ayri degerin, sanki bireysel
olarak burada anlatildigi gibi tarifname içine dâhil edildigi sekilde sadece bireysel
olarak stenograf bir yöntem olarak hareket edilmesi amaçlanmaktadir. Burada
tarif edilen tüm yöntemler, burada aksi belirtilmedikçe veya baglam tarafindan
açikça karsi çikilmadikça herhangi bir uygun sirada uygulanabilmektedir.
Herhangi bir veya tüm örneklerin veya burada saglanan örnek teskil eden dilin (ör.
aydinlatilmasi ve bulusun baglami içerisinde bir kisitlama koyulmamasi
amaçlanmistir. Tarifnamede hiçbir dil, bulusun uygulamasi için esas olmayan
herhangi bir talep edilmemis elemani gösterdigi sekilde yorumlanmalidir.
Biriktirilmis suslar
Baci'llus mojavensi's susu CHCC 15510, Chr. Hansen A/S, Danimarka tarafindan 3
Nisan 2012 birikim tarihi ile erisim numarasi DSM 25839 altinda DSMZlde
(Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH,
Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi
Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.
Baci'llus amyloliquefâciens susu CHCC 15516, Chr. Hansen A/S, Danimarka
2494639
DSMZ°de (Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH,
Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslararasi
Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.
Bacillus amyloliquefaciens susu CHCC 15536, Chr. Hansen A/S, Danimarka
DSMZide (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi
Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.
Baci'llus amyloliquefaciens susu CHCC 15539, Chr. Hansen A/S, Danimarka
DSMZde (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi
Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.
Baci'llus subri'li's susu CHCC 15541, Chr. Hansen A/S, Danimarka tarafindan 3
Nisan 2012 birikim tarihi ile erisim numarasi DSM 25841 altinda DSMZSde
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Prosedürünün Amaçlarina yönelik Mikroorganizmalarin Birikiminin Uluslar Arasi
Taniminda Budapeste Antlasmasinin kosullari altinda olusturulmustur.
Yukarida taniinlanan tüm biriktirilmis mikroorganizmalar için, asagidaki ek
göstergeler geçerlidir: Ilgili devletlerin ilgili Patent Ofisleri ile ilgili olarak,
basvuranlar, yukarida belirtilen biriktirilinis mikroorganizmalarinin bir
numunesinin, patentin garanti edildigi tarihe veya basvurunun reddedildigi veya
geri çekildigi veya geri çekilmis olarak addedildigi tarihe kadar, sadece basvuran
2494639
tarafindan aday gösterilen bir uzman tarafindan erisilebilmesini talep etmektedir.
Mevcut bulusun yapilandirmalari, kisitlayici olmayan örneklerin yoluyla asagida
açiklanmaktadir.
ÖRNEKLER
Malzemeler:
Dana Infiizyon Suyu (VIB) (Difco, 234420)
Dana Inü'izyon Suyu (VIB) agar (VIB + %l.5 Agar bakteriyolojik, (Agar no.
1), Oxoid LP0011)
TS agar plakalari (litre basina: 3 g tripton, 2 g triptoz, 1.5 g maya ekstrakti,
Laura-Bertani (LB) suyu (g/L: Bakto tripton 10 (Difco 0123), Maya ekstrakti 5
Beyin Kalp Infîizyon (BHI) Suyu (Oxoid CM225)
Beyin Kalp Infîizyon (BHI) agar (Oxoid CM375)
Safra tuzlari (safra ekstrakti, domuz; Sigma B863 l)
Biyo deney kaplari (Nunc 240845)
Petri kaplari (Procudan 140096, nervürlere sahip petri kabi)
Sporülasyon ortami: %(agirlik cinsinden) %95 su; %l.5 nitrojen kaynagi (bir
baska ifadeyle, maya); %3 sakkarit; %006 mikromineraller; %0.1
dipotasyumhidrojenfosfat
Pepton (%09 sodyum klorür, %1 pepton) FKP VetMIC Lact-l & Lact-2
(SVA,Uppsa1a, Isveç) içeren fizyolojik salin çözeltisi
Kültürler:
Bacillus suslari, diskilardan, topraktan, gida kaynaklarindan izole edilmis ve sus
2494639
bankasi koleksiyonlarindan toplanmistir ve -80°C`de MTP ana plakalarda %20
gliserol ile VIB°de
sürdürülmüstür.
Antibiyotikler:
Ampisilin (Sigma, A9518-SG)
Vankomisin (Sigma, V1764-250MG)
Kanamisin (Sigma, Kl377-IG)
Eritromisin (Sigma E-53 89)
Klindamisin (Sigma, C2569-10MG)
Tetrasiklin (Sigma T-7660)
Kloramfenikol (Sigma, C0378-5G)
Patoj enler:
E. coli 0101 F5 (Devlet Serum Enstitüsü, Copenhagen, Danimarka)
E. Ulusal Tip Kültür Koleksiyonu
E. 0011' suslari, -80°C°de MTP ana plakalarmda %20 gliserol ile LB°de
sürdürülmüstür Clostri'di'um perßingens Tip A, DSM 756, -80°C,de %20
gliserol ile BHISda sürdürülmüstür.
ÖRNEK 1: Ön tarama
Topraktan ve diskidan 261 izolat ve gida kaynaklari, antibiyotik uyarliligi, patojen
inhibisyonu, safra direnci ve düsük pH°a duyarlilik için bir ön tarama islemine
tabi tutulmustur.
2494639
1.] Antibiyotik duyarliligi
Baci'llus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 aL hacminde, DW plakalarinda 700
”L VIB7ye eklenmistir ve gece boyunca 37 °C7de ve 175 rpmjde inkübe edilmistir.
2 konsantrasyonda Tablo 1,de listelenen antibiyotikler ile takviye edilen ISO test
numuneleri ve antibiyotikleri içermeyen ISO kontrolleri, 180 aL bir hacimde MTP
plakalarina eklenmistir. Gece boyunca Baci'llus kültürleri, 100 kat seyreltilmis ve
plakalari, 37°Cade inkübe edilmistir. 620 nm°de optik yogunluk (0D),
inokulümde ve inkübasyondan 24 ve 48 saat sonra MTP test plakalarinda
ölçülmüstür. Bakterilerin antibiyotik duyarliligi, ISO kontrollerinde OD'ye ISO
test numunelerinde OD°nin bir yüzdesi olarak öngörülmüstür.
1.2 Patoien inhibisyonunun Bacillus suslarinin taranmasi
Bacillus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 u] hacminde, DW plakalarinda 700
ul V1B°ye eklenmistir ve gece boyunca 37 °C9de ve 175 rpmjde inkübe edilmistir.
Deneyden önce, E.coli' suslari, 30°Cide gece boyunca LB1de büyütülmüstür. C.
perfringens CHCC143 72, 37°C”de anaerobik bir kavanozda gece boyunca BHI7da
büyütülmüstür.
1.2.1 Agar spot testi ile Ecoli inhibisyonu
Gece boyunca 2 m1 Ecoli kültürü, 50°C7de 200 m1 sivi VIB agari ile karistirilmis
ve her bir biyo deney çanagina dökülmüstür. Kaplar, steril bir sehpada
kurutulmustur. Gece boyunca 2 ul her bir Bacillus kültürü, Ecoli' ile karistirilan
VIB agarinin yüzeyine tespit edilmistir ve 2 günlügüne 37°C,de inkübe edilmistir.
Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin, noktalar etrafindaki yariçapi, “yüksek” - 2
mm,den daha fazla yariçap, “orta” - 0.5 - 2 mm arasinda yariçap ve “düsük” 0.5
mm,den daha az yariçap olarak ölçülmüs ve kaydedilmistir.
2494639
1.2.2 Agar spot testi ile C. perfringens inhibisyonu
VIB agari, biyo deney kaplara (kap basina 200 ml) dökülmüs ve bir steril sehpada
boylu boyunca kurutulmustur. Gece boyunca 2 al her bir Bacz'llus kültürü, VIB
agar kaplarinin yüzeyine tespit edilmistir ve gece boyunca 37°C'de inkübe
edilmistir. C. perfringens Tip A CHCC14372, 2 ml ila 200 ml hacminde sivi BHl
agarina eklenmis, karistirilmis ve Baci'llus noktalari ile biyo deney kaplarina
nazikçe kaplanmistir. Kaplar, 1 günlügüne 37 °C,de anaerobik olarak inkübe
edilmistir. Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin, noktalar etrafindaki yariçapi,
1.2.3 Çukurcuk diûizvon testi ile C. perfringens inhibisyonu
karistirilmis ve her bir biyo deney çanagina dökülmüstür. Solidifikayondan sonra,
bir steril delgi ile BHl agarinda 10 mm çukurcuklar olusturulmustur ve 80 ul gece
boyunca Bacillus kültürü, her bir çukurcuga aktarilmistir. Kaplar, 1 günlügüne
37°C,de anaerobik olarak inkübe edilmistir. Netlestirilinis inhibisyon
bölgelerinin, çukurcuklar etrafindaki yariçapi, “yüksek” - 2 mm°den daha fazla
yariçap, “orta” - 0.5 - 2 mm arasinda yariçap ve “düsük” 0.5 mm,den daha az
yariçap olarak ölçülmüs ve kaydedilmistir.
1.3 Safra direnç deneyi
Baci'llus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 ul hacminde, DW plakalarinda 700
ul VlB,ye ekleninistir ve gece boyunca 37°C”de ve 175 rpm”de inkübe edilmistir.
50 ;41 bir hacimde gece boyunca Bacillus kültürleri, %03 safra tuzlari (test
numuneleri) ile takviye edilen 800 pl VIBîye ve DW plakalarinda safra
(kontroller) içermeyen VIB,ye aktarilmistir. Plakalar, 37°C ve 175 rpm”de inkübe
2494639
sürelerde ölçülmüstür ve VIB kontrollerinde ilgili OD620 degerlerinden
çikarilmistir. Kültürler, OD620 degerlerindeki farklara göre, A (OD < 0.1), B
(0D: 0.1-0.4) ve C (0D > 0.4) gruplarina siralanmistir. A grubunda bulunan
suslar, safra tuzlarina en dirençli olarak düsünülmüstür. Seçilmis suslar, A veya B
grubunda olmalidir. Seçilen suslarin sonuçlari, Tablo 2`de sunulmaktadir.
1.4 Düsük pH”a duyarlilik (uyarici gastrik kosullari)
1.0 M hidroklorik asitle pH4°e düzenlenen 800 ul VIB tambölenleri ve VIB
kontrolleri (pH7), DW plakalarinda dagitilmistir. Bacillus suslari, MTP ana
plakalarindan bir 50 nl hacminde, DW plakalarina eklenmistir ve gece boyunca 24
sürede ve inkübasyondan 24 saat sonra 200 141 hücre süspansiyonlarinda
ölçülmüstür. pH4,te bakteriyel büyüme, inkübasyondan önce OD620 degerlerinin,
inkübasyon sonrasi ilgili degerlerden çikarilmasi ile belirlenmistir. 0.1,den daha
fazla ODssze artis gösteren kültürler, pH4”e dirençli (Tablo 2°de bir R ile
gösterilmektedir) olarak görülürken, 0.1”den daha az OD620 degerlerine sahip
kültürler (herhangi bir büyüme veya negatif deger yok), pH4'e duyarlilik (Tablo
2,de bir S ile gösterilmektedir) olarak görülmüstür.
1.5 Ön tarama sonuçlari:
Ön tarama testine bagli olarak, ikincil tarama için 32 sus seçilmistir. Seçilmis
suslar, açiklanan antibiyotikler için duyarli olmalidir ve Ecoli ve Clostridium
perfringens”e karsi antimikrobiyal etkiyi göstermektedir ve diger uygulanan
testlerde makul seklide uygulanmaktadir.
Topraktan ve diskilardan ve gida kaynaklarindan gelen 261 izolattan 161 izolat,
ön tarama testinde antibiyotige dirençli olmustur. Antibiyotige duyarli 100
izolattan 56,s1, Clostridiiim perfringens`e karsi antimikrobiyal etkiye sahip
2494639
olmustur ve sadece 22°si, E. coli ve Clostri'di'um perfringensie karsi etkiye sahip
olmustur. Bunlardan, 12 izolat B. amyloliquefaciens türünden gelmistir. Diger
temsili suslar, B.3ubti`li's ve Bmojavensis türelerinden gelmistir. Tablolar 2 ve 3,
Chr. Hansen sirketinin suslarinin (ikincil tarama için seçilmis 32 sustan 22”si)
sonuçlarini özetlemektedir.
ÖRNEK 2: Ikinci] tarama
Birincil taramanin sonuçlarina bagli olarak, 40 seçilmis izolat ve referans suslari,
agar spot testlerinin tekrari ile patojenlerin inhibisyonu için ve sporülasyon için
test edilmistir. 32 sus ayrica MIC testi ile antibiyotik duyarliligi için test
edilmistir.
2.1 Patoien inhibisyonunun Baci'llus suslarinin taranmasi
Deneyden önce, 9 m1 VIB, Bacillus kültürü ile asilanmistir ve gece boyunca 37°C
ve 175 rpmade inkübe edilmistir. Es zamanli olarak, 9 m1 BHI suyu, E. coli suslari
ile asilanmistir ve gece boyunca 37°C”de inkübe edilmistir. Clostridium
perfringens, bir anaerobik kavanozda ayni kosullarda büyütülmüstür.
2.1.1 Agar spot testi ile Ecolz' inhibisyonu:
Patojenlerin gece boyu kültürleri, 2 ml bir hacimde, 200 m1 sivi VIB agarina
50°C”de eklenmis ve her bir biyo deney çanagina dökülmüstür. Kaplar, steril bir
sehpada kurutulmustur. Gece boyunca Bacillus kültürleri, patojenler ile
karistirilan VIB agarinin yüzeyine tespit edilmistir ve 2 günlügüne 37°C°de
inkübe edilmistir. Noktalarin etrafindaki inhibisyon bölgelerinin yariçaplari ve
noktalarin yariçaplari kaydedilmistir.
2.1.2 Agar spot testi ile C. per/ringens inhibisyonu:
2494639
Bacillus kültürleri, petri kaplarinda VIB agarin yüzeyine tespit edilmistir ve gece
boyunca 37 OC,de inkübe edilmistir. Bir 2 m1 hacimde gece boyunca C.
perfringens kültürü, 200 ml sivi BHI agari ile karistirilmistir ve büyütülmüs
Bacillus noktalari ile VIB agarina dökülmüstür. Kaplar, 1 günlügüne 37°C,de
anaerobik olarak inkübe edilmistir. Netlestirilmis inhibisyon bölgelerinin, noktalar
etrafindaki yariçapi ölçülmüstür.
2.2 VIB,de ve sporülasyon ortaminda büy_u"me
Baci'llus suslari, MTP ana plakalarindan bir 50 nl hacminde, DW plakalarinda 700
ul VIB,ye veya sporülasyon ortamina eklenmistir ve 24 saatligine 37°C,de ve 175
rpm,de inkübe edilmistir. Bakteriyel büyüme, 200 ul süspansiyonlarda 620 nm
(OD620) optik yogunlukla belirlenmistir. Sporülasyon ortaminin bir yüksek
türbiditesinden ve çukurcuklar arasindaki varyasyonlarindan dolayi,
inkübasyondan önce OD620 degerleri, inkübasyondan sonra ilgili çukurcuklarda
OD620 degerlerinden çikarilmistir. OD620,yi 0.4,ten daha fazla gösteren kültürler,
A grubuna (yüksek büyüme) siralanmistir ve ODszoiyi 0.4,ten daha az gösteren
kültürler, B grubuna (düsük büyüme) siniflandirilmistir.
2.3 Sporülasyon ortaminda sporülasyon
Bacillus suslari, MTP ana plakalarmdan bir 50 ul hacminde, DW plakalarinda 700
ul VIB°ye eklenmistir ve gece boyunca 37°C”de ve 175 rpm'de inkübe edilmistir.
50 u.] bir hacimde gece boyunca Bacillus kültürleri, DW plakalarinda 700 ul bir
sporülasyon ortamina (SM) aktarilmistir. Plakalar, 3 günlügüne 37°C ve 175
rpmide inkübe edilmistir. Sporülasyon mikroskopik olarak takip edilmistir ve spor
yüzdesi (toplam hücre sayisi ile iliskili spor sayisi), inkübasyonun 1. gününden
(24 saat), 2. gününde (48 saat) ve 3. gününden (72 saat) sonra görsel inceleme ile
belirlenmistir.
2.4 MIC ile ölçülen antibiyotik duyarlilik
2494639
Suslar, bir antibiyotik sayisi için minimum inhibitör konsantrasyon (MIC)
ölçülerek antibiyotik duyarlilik için analiz edilmistir. Kullanilan yöntem, CLSI
standardi (Klinik ve Laboratuvar Standartlari Enstitüsü M07-A8 ve M45-A2)
tarafindan çizilen bir et suyu mikroseyrelti yöntemi ile ölçülmüstür.
Test edilecek olan susun bir gece boyu büyümesinin bir süspansiyonu, test
edilecek olan iki kat antibiyotik seyreltisinde (toplam hacim 100 ul/çukurcuk) 105
cfu/ml uygun bir konsantrasyonda (koloni olusturan birim/ml) mikrotitre
plakalarinda ISO-SENSITEST Suyunda (Oxoid CM0473) asilanmaktadir ve
37°C°de 20-24 saatligine aerobik olarak inkübe edilmistir. Ampisilin, vankomisin,
gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve
kloramfenikol antibiyotiklerini içeren önceden üretilmis paneller VetMIC Lact-l
antibiyotigin en düsük konsantrasyonu olarak 24 saatten sonra kaydedilmektedir.
Test, iki bagimsiz biyolojik kopya olarak iki defa uygulanmistir.
2494639
Sonuçlar
32 seçilmis sustan sonuçlar, Baci'llus amyloli'quefaci'ensîn, antibiyotik
duyarliligin, antimikrobiyal etkinin ve sporülasyonun en iyi birlesik özelliklerine
sahip oldugunu göstermistir, bkz. Tablo 2. Sadece Chr. Hansen firmasinin suslari
(32 sustan 22,si) ile iliskili veriler dâhil edilmektedir.
Seçilmis Bac'illus suslarina yönelik temel veriler
Kaynak, gyrB'ye göre türler. VIB'de ve sporülasyon ortaminda büyüme, ayrica sporülasyon yüzdesi
Büyüme Sporülasyon, %
Suslar Kaynak Türler Antibiyotik VlB SM Gün 1 Gün 2 Gün 3
Direnç
A Diskilar B.mojavensis Duyarli A B 5 95 90
B Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli A A 10 99 99
C Diskilar B.subtilis Duyarli B A 0 80 95
D Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 40 99 99
E Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 20 99 99
F Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 50 99 99
G Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 95 95 95
H Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli A A 99 99 99
l Diskilar B. amyloliquefaciens Duyarli B A 80 99 99
J Diskilar B. amyloliquetîici'ens Duyarli B A 50 99 99
K LMG B. amyloliquefaciens Duyarli A A 2 99 99
L Diskilar Blicheniformis Duyarli B A 90 99 Yok
M Toprak B. licheniformis Dirençli B A 0 1 80
N Toprak B. megaterium Dirençli B A 0 0 0
O Diskilar B.subtilis Duyarli A B 0 60 10
P Diskilar B. pumilus Dirençli A A 0 10 99
Q Diskilar B. licheniformis Dirençli A A 0 1 5
R Diskilar B. licheniformis Dirençli A A 0 çok az 40
S Diskilar B. pumilus Duyarli A A 0 10 95
T Toprak B. megaterium Dirençli B A 0 0 0
U Toprak B. licheniformis Dirençli A A 0 çok az 70
V Diskilar B.5ubtilis Direncli A B 95 99 90
E. 0011' ve Closiridium peifi'ingens`iii (mm) inhibisyonu, ayrica seçilmis Baci'llus suslari ile safraya ve aside karsi direnç
2494639
geçen üç E. coli domuz patojenidir
peifri'ngens,
A B. mojavensis C A S 1.5 1.7 2.3 7
B amyloliquefaciens A A S 25 2.3 3.5 8
C B. subtilis A B R 1.8 1.5 2.7 7
D aiiiyloliquefaciens A A R 2 I .7 2.5 6
B amyloliquefaciens B A S 3 3 3.5 6
F amyloliquefaciens B A S 2.5 2.5 3.3 7
G amyloliquefaciens B B R 2 1.7 2 7
1-1 amyloliquefaciens A A R 3.5 3 4.5 7
I amyloliquefaciens B A R 2 2 2 8
J amyloliquefaciens B A S 2 2.5 2.5 8
K B. amyloliquefaciens B A S 0.3 <1 1 4
L B. licheniformis A B S < 1 <1 1.3 8
M B. Iicheniformis B A S 0 0 O 4
N B. megaterium B A S 0 0 0
P B. pumilus A A R 1 0 1.7 8
Q B. licheniformis B B S 0 0 0 2
R B. licheniformis B B S 0 0 O 2
S B. pumilus A A R <1 0 <1 6
T B. megaterium A A S 0 0 O 0
U B. Iicheniformis B B S 0 0 0 3
V B. subtilis C A S 2.5 1 2.5 10
ÖRNEK 3: Isi Stabilitesi
3.1 181 stabilite testinin yöntemi
Baci'llus suslan, 37 0C ve 220 rpmsde VIBîde gece boyunca büyütülmüstür. Gece
2494639
sporülasyon tamamlanana kadar 1-2 günlügüne 37°C°de inkübe edilmistir.
Sporlar, plakalardan kazinmis, FKP çözeltisinde süspanse edilmis ve bitkisel
hücreleri etkisiz hale getirmek için 15 dakikaligina 80°C9de inkübe edilmistir.
Spor süspansiyonlari, isitma isleminden hemen sonra buza yerlestirilmistir.
Sporlarin preparasyonlari, FKPSde iki defa yikanmis, %20 gliserol ile FKP,de
yeniden süspanse edilmis ve kullanim öncesi 80°C`de tutulmustur. Bakteriyel
Sporlarin isi direncine, 2, 5 ve 10 dakikaligina 99.5°C,de FKP,de (ml basina
yaklasik olarak 500 ul spor süspansiyonlari ile
eppendorf tüplerini tutarak erisilmistir. CFU sayilari, gece boyunca 37°C,de
inkübasyondan sonra VIB agarina plakalanan isitilmis süspansiyonlarin
seyreltilerinde belirlenmistir.
3.2 Isi stabilitesinin test sonuçlari
lsi stabilitesi verileri, Tablo 4°te gösterilmektedir.
Tablo 4 seçilmis Bacillus suslarinm 99.5°C'de isi stabilitesi; 0 süresi (log/log) ile iliskili olarak 2, 5 ve 10 dakika sonra azaltim
olarak da cinsinden ölçülmüstür
Suslar Türler Sonra cfu cinsinden azaltim
2 dakika 5 dakika 10 dakika
B B. amyloliquefaciens alt türü 0.05 0 0
amyloliquefaciens
C B. subtilis 0.25 2.5 3.8
D B. amyloliquefaciens /iliskili siamensis 0 0 0.05
E B. amyloliquefaciens alt türü plantarum 0.34 3.8 5.3
F E. amyloliquefaciens alt türü 0 0 0
amyloliquefaciens
H B. amyloliqucfacicns alt türü plantarum 0.19 2.5 5
Genel olarak 0 süresi ile iliskili olarak 2 dakika sonra 2 (log/log) cfuadan daha az
bir azaltim, topaklanma için yemde dâhil edilecek olan sporlar için uygundur ve
2,nin altinda olan sonuçlara, yaygin ticari Bacillus sporlarinin preparasyonlari ile
ulasilmaktadir. Bu sekilde, test edilen ve Tablo 4% gösterilen tüm suslar, iyi isi
stabilitesine sahiptir. Bazi suslar ayrica 5 ve 10 dakika sonra iyi isi stabilitesi
2494639
sergilemistir, bir baska ifadeyle sus (B) ve Sus (F), B. amyloli'quefaciens alt türü
amyloli'quefaci'ens, herhangi bir cfu azaltimi sergilememistir.
ÖRNEK 4; Enzim üretimi
4.1 Selülaz deneyinin yöntemi
Baci'llus suslari, 24 saatligine 37°C9de ve kuvvetli manyetik ajitasyonda
karboksimetil selüloz (CMC) ortaminda (Abou-Taleb v.d. 2009) (I basina: 10.0 g
üreticinin talimatlarina göre EnZChek Selülaz Sübstrat kiti (kat. E33953, Life
Technologies) kullanilarak belirlenmistir. Kisacasi, kültür süpernatantlari,
santriiîijleme ile toplanmistir seri seyreltiler halinde MTP”1erde (çukurcuk basina
200 ul) dagitilmistir. Standart egriler, 2 U ml`hden baslayarak Aspergillus
nigefden (C1184) selülaz kullanilarak olusturulmustur. EnzChek sübstrat
çözeltisi, Nunc 96 çukurcuklu Black FluoroNunc plakalarinda (kat. 237105,
Therrno Fisher Scientific, NUNC Inc.) kültür süpernatantlarina eklenmistir.
Floresan, 30 dakikalik inkübasyondan sonra 360 nm uyarim/42 nm emisyonda
kaydedilmistir (Enspire 2300 Multilabel Reader, Perkin Elmer Inc). Selülaz
aktivitesi, iki bagimsiz deneyde standart egrilerden hesaplanmistir ve ortalama (U
m1") olarak ifade edilmistir.
Baci'llus suslari, 24 saatligine 37°C ve kuvvetli manyetik ajitasyonda kayin agaci
(kat. 288620, Becton Dickinson A/S, Danimarka), 5.0 g Bakto Pepton (kat.
2494639
üreticinin talimatlarina göre EnzChek Ultra Ksilanaz Deney Kitinin (kat. E33650,
Life Technologies) kullanimi ile uygulanmistir. Kisacasi, kültür süpematantlari,
santriûîjleme ile toplanmistir, sen' seyreltiler halinde MTP“lerde (çukurcuk basina
200 nl) dagitilmistir ve ksilanaz sübstrat çalisma çözeltisi eklenmistir. Kültür
süpernatantlarinda floresan, 30 dakikaligina inkübasyondan sonra 360 nm
uyarimda/420 nm emisyonda ölçülmüstür (Enspire 2300 Multilabel Reader,
Perkin Eliner lnc.). Thermomyces lanugi'nosis (X2753), standart enzim olarak
kullanilmis ve seri seyriler olarak, 25 mU ml'l”den baslayarak MTPslere
yüklenmistir. Bacillus suslarinin ksilanaz aktivitesi, standart egrilerden
hesaplanmistir ve iki bagimsiz deneyin ortalamalari (mU ml'l) olarak ifade
edilmistir.
4.3 Proteaz deneyinin yöntemi
Gece boyunca Baci'llus kültürleri (37 °C5de VlB*de büyütülmüstür), sübstrat
(Sigma C3777) olarak Fluoresin izotiyosiyanat-kazein (FlTC-C) ile bir reaksiyon
karisimina aktarilmis ve 3 saatligine 37 °C,de inkübe edilmistir. Çökeltiden sonra,
çözülebilir peptit miktari, 497 nm uyarimda, 515 nm emisyonda floresan ile
ölçülmüstür. Bu deney, genis proteaz araligini (serin, aspartik, sistein ve
metalloproteazlar) tespit etmektedir.
4.4 Bivofilm üretiminin yöntemleri
Bacillus suslari, VIB,ye (yaklasik
MTP31erine (96 Well Conical Btm PP Plt Natural; NUNC lnc., Danimarka)
dagitilmis ve çalkalamadan 24 saatligine 37°C°de inkübe edilmistir. Büyüme, 620
nm optik yogunlugunun (0D) Ölçümleri ile kontrol edilmistir. Biyofilm
formasyonu, öncesinde açiklandigi gibi kristal mor leke ile degerlendirilmistir
(Auger v.d. 2009). Kisacasi, çukurcuklarin distile suyla yikanmasindan sonra,
agirlik hacim'l cinsinden %0.l kristal mor çözelti, PP-MTP,lere eklenmistir ve
plakalar, 30 dakikaligina inkübe edilmistir. Daha sonrasinda, yikama prosedürü
2494639
tekrar edilmistir ve hacim hacim'l cinsinden %96 etanol , plakalara eklenmistir.
570 nm sogurum, 15 dakikalik inkübasyon sonrasi ölçülmüstür (Wallac Vict0r2
spectrophotometer, Perkin Elmer Inc.). Bacillus türlerinin suslari, yüksek (Ab5570
üreticileri olarak siniflandirilmistir. Deney, kopyalar halinde iki defa
uygulanmistir.
4.5 Enzim deneylerinin sonuçlari
Tablo 5 Enzim üretimi ve Biyofîlm
(RFU= göreli floresan birimi)
Selülaz Ksîlanaz, Proteaz,
Suslarin Türleri mU/ml mU/ml RFU/OD Biyof'ilm
Bamyloliqucfacicns alt türleri
B. amyloliquefaciens alt türü
F amyloliqucfacicns
yüksek selülaz aktivitesine sahip olurken, B. amyloliquejâciens alt türü
amyloliquefaciens olan suslarin (B ve F), düsük selülaz aktiviteye sahip oldugunu
göstermektedir.
ÖRNEK 5: Yavru domuz çalismalari
Iki seçilmis Baci'llus suslari (Sus B veya C), büyüme performansinda ve yavru
2494639
domuzlarin sütten kesilmesinden sonraki mortalitelerindeki etkilerini
degerlendirmek üzere bakimevi diyetlerine takviye edilmistir. Ecoli', üretim
parametrelerinde ve mortalitede önemli bir etkiye sahip, bakim sürecinde ana
patojenlerden birisi oldugu için, bu çalismalar, hayvanlarda Ecoli'
inhibisyonundaki etki hakkindaki bilgiyi verebilmektedir. Çalismalar, 2 farkli
alanda uygulanmistir, alan 1, bir arastirma çiftligi olmus ve alan 2, bir üniversite
olmustur. Bu çalisma kurulumu, her iki alanda benzer olmustur.
Yavru domuz çalismalarinda kullanilan alanlarin genel incelemesi
Toplam domuz sayisi Kopya sayisi Agirliklar Çalisma günleri
.1.1 Alan lide deneysel kurulum
Sütten kesim gününde, deney çiftliginden ortaya çikan, iki ardisik sütte kesilmis
yigindan (288 yavru domuz) 576 yavru domuz (28 günlük), deneyde
kullanilmistir. Yavru domuzlar, melezlestirilmis domuzlardir (ACMC x Pietrain).
Seçilmis yavru domuzlar, genel olarak sagliklilardir ve bakim asamasinda
herhangi bir asi almamislardir. Deney çiftligi, kontrol altinda Domuz Üreme &
Solunum Sendromuna (PRRS) pozitif olmustur ve sütten kesme asamasindan
sonra bazi kolibasillozis problemlerine sahip olmustur. Yavru domuzlar, vücut
agirligina göre siniflandirilmistir ve daha sonrasinda, her iki tedavide vücut
agirligina benzer olarak, her bir kafes blogunun, 6 yavru domuzu, 3 tam erkek ve
3 disiyi içerdigi sekilde her iki sütten kesilmis yiginda (toplamda 96 kafes) 48
kafese ayrilmistir. Tedaviler, blok vasitasiyla hafif ve agir yavru domuzlarin
kafeslerine ayrilmistir, böylelikle her bir tedavi, 6 yavru domuz için 24 kafese
(tedavi ve oda basina 6 kafes; tedavi ve sütten kesilmis yigin basina 12 kafes)
uygulanmistir. Bacillus ürünleri, 400 g/ton yemde veya 1.28 *10 7 CF U g/yeme
eklenmistir.
2494639
Domuzlarin, ortalama günlük agirlik kazancini (ADWG) hesaplamak için 28, (0.
gün; sütten kesilme günü), 35, 42 ve 63. günde bireysel olarak agirligi alinmistir.
Ortalama günlük yem alimi (ADFI) ve yem dönüsüm orani (FCR), ayni
28-42 günlük; baslatici: 42-63 günlük; ve toplam bakim süreci) ölçülmüstür.
Uygulanan bireysel antibiyotik tedavilerinin kaydi dâhil olmak üzere, günlük
olarak motalite ve patoloji sikligi kontrol edilmistir.
Kontrole kiyasla P-degerleri (A: P=< 0.1; a =<0.05)
Sus B: [5516; Sus C=1554l
SE = Standart Hata
Vücut agirligi, 28-42 günlük (çalismada 14 gün)
42-63 günlük
Toplam (28-63 gün)
28. gün 63.gün ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR
5.1.2 Sonuçlar
Bakiin diyetlerine takviye edilen her iki Baci'llus susu probiyotik ürünü, bunlar
arasindaki farklari göstermeden negatif bir kontrol grubu ile kiyasla üretim
performansini sayisal olarak arttirmistir. ADG ve FU,ya dair önemli etki, ön
baslatici asamada (28-42 günlük) gözlemlenebilmektedir. Mortalite yüzdesi, her
iki Baci'llus grubunda azaltilmistir (Mortalite %7si: Kontrol (3.47), Sus, B
(%139), Sus C (208))
.2.1 Alan 2”de deneysel kurulum
Sütten kesimden hemen sonra, seçilmis tüm yavru domuzlar, kafes basina otuz üç
hayvanla 24 çukurcukli bir sütten kesim odasina alinmistir. Oda, merkezi isitma
2494639
ve sogutma sistemine sahip basinçli havalandirma ile ve tamamen çitali zeminle
ile donatilmaktadir. Her bir kafes, istenildigi kadar beslemeyi ve ayni zamanda üç
hayvanin beslenmesine yönelik bir kapasite ile serbest suya erisimi temin etmek
için bir ticari çift tarafli islak-kuru besleyici ile donatilmaktadir. Yem, tüm deney
asamasi boyunca istenildigi kadar dagitilmistir.
Toplam yedi yüz ve yirmi ticari çapraz yeni sütten kesilmis yavru domuz [Pietrain
x (Land-race x Large White)] kullanilmistir. Hayvanlar, sütten kesim gününde
ayni çiftligin disi domuzlarindan elde edilmistir ve deney tesisine (tasinmadan)
gönderilmistir. Erkek ve disi 26 günlük yavru domuz 7.0 kg SD=l.64 kg BW
kullanilmistir. Hayvan numarasini içeren plastik kulak etiketi kimligi
kullanilmistir. Hayvanlar, ilk vücut agirligi ile üç bloga dagitilmistir. Her bir blok
içerisinde, yavru domuzlar, bir dengeli vücut agirligi dagilimina yönelik kafeslere
dagitilmistir. Bu sekilde, her bir blok, deney diyetlerinin rastgele bir sekilde
atandigi 30 hayvanlik 8 kafesten olusmustur.
Çalisma, 28. gün sütten kesimde baslamistir. Hayvanlarin agirligi, bireysel olarak
0. ve 7. günde agirligi alinmistir ve grubun agirligi, çalismada 21. ve 35. günlerde
alinmistir. Her bir besleme hunisinde biten yem, deney boyunca ölçülmüstür.
Toplam yem aliinina göre ortalama günlük yem alimi (ADFI), ortalama günlük
kilo kazanç (ADG) ve yemzkazanç orani (PCR) bu sekilde hesaplanmistir. Yavru
domuzlarin saglik durumu düzenli olarak degerlendirilmistir ve verilen herhangi
bir anormal belirti veya ilaç kaydedilmistir. Mortalite orani ve ayirma yüzdesi de
hesaplanmistir.
en az kare ortalamasi, kontrolle kiyaslanan P degerleri (A: P=< 0.1)
2494639
.2.2 Sonuçlar
Bakim diyetlerine takviye edilen her iki Bacillus susu, bunlar arasindaki farklari
göstermeden negatif bir kontrol grubu ile kiyasla üretim performansini sayisal
olarak arttirmistir. ADG ve FU”ya dair önemli etki, çalisma süreçlerinde
gözlemlenebilmektedir.
Siddetli bir diyarenin üstesinden gelmek için kafes basina Enrofloksasin ile tedavi
edilmis hayvan sayisi, sütten kesim sonrasi birinci hafta esnasinda kontrol diyeti
ile beslenen hayvanlarda olanlarda, Bacillus ile beslenenlerden önemli ölçüde
daha yüksek (P>0.05) çikmistir. Ayni sonular (P<0.05), tüm deney süreci (sütten
kesimden sonra 0 ila 35. gün) için gözlemlenmistir. Mortalite yüzdesi, her iki
Bacillus grubunda azaltilmistir (Mortalite %'siz Kontrol (4.17), Sus B (%004),
REFERANSLAR
Barbosa v.d., 2005, Screening for Bacillus Isolates in the Broiler
Gastrointestinal Tract, Applied and Environmental Microbiology, 968-978
Benitez V.d., 2011, Antimicrobial Activity of Bacillus amyloliquefaciens LBM
5006 is enhanced in the Presence of Escherichia Coli, Curr Microbiol 62,
1017-1022
Chaiyawan v.d., 2010, Characterization and probiotic properties of Bacillus
strains isolated from broiler, The Thai Journal of Veterinary Medicine, 40, 2,
207-214
EFSA 2008. Technical Guidance. Update of antibiotic resistance criteria. The
2494639
EFSA Journal 732, 9-15
Guo v.d, 2006, Screening of Bacillus strains as potential probiotics and
subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis
Klose v.d., 2010. In vitro antagonistic activities of` animal intestinal strains
against swine-associated pathogens. Vet. Microbiology 144: 515-521.
Lopez, D., ve R. Kolter. 2010. Extracellular signals that define distinct and
coexisting cell fates in bacillus subtllis. FEMS Microbiol. Rev. 34(2): 134-
Spiehs, M. J ., G. C. Shurson, and L. J. Johnston. 2008. Effects of two direct-
fed microbial on the ability of pigs to resist an infection with salmonella
enterica serovar typhimurium. Journal of Swine Health and Production. 16(1):
27-36.
B.Iicheniformis
Büamyloliquefaciens
Yüksek Yok __T- -
B.purrilus / B.5afensis B.subtilis/B.mojavensis
i ' r. Düsük ° 0 Düsük
i' Yüksek -' ::Yüksek
Claims (6)
1. Asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir Bacillus susu (a) erisim numarasi DSM 25839? sahip Bacillus mojavensi's susu; erisiin numarasi DSM 270339e sahip Bacillus amyloli'quefaci'ens suslari; (c) erisim numarasi DSM 25841 ”e sahip Bacillus subtili's susu.
Asagidakilere sahip bir Bacillus susunun seçimine yönelik bir yöntem (i): ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik; (ii) E. 0011` ve Clostri'di'um perfi/i'ngensîn büyümesinin inhibisyonu; ve (iii) 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi, yöntem asagidaki adimlari içermektedir: (i): ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarli olan bir Bacillus susunun, bir Bacillus susu havuzundan seçilmesi ve izole edilmesi, (ii) E. 0011' ve Clostridium peijfißingensîn büyümesini inhibe eden bir Bacillus susunun bir Bacillus susu havuzundan seçilmesi ve izole edilmesi, (iii) 2 günlük inkübasyondan sonra ölçüldügünde en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesine sahip olan bir Bacillus susunun bir Bacillus susu havuzundan seçilmesi ve izole edilmesi, (iv) pH 4`te bitkisel hücrelerin duyarliligi için bir Bacillus susu havuzunun degerlendirilmesi, ve (v) safra direnci için bir Bacillus susu havuzunun degerlendirilmesi.
3. Asagidakilerin bir mutant susunun elde edilmesine yönelik bir yöntem (a) erisim numarasi DSM 25839321 sahip Baci'llus mojavensi's susu; erisim numarasi DSM 27033,e sahip Bacillus amyloliquefâciens suslari; (0) erisim numarasi DSM 25841 ”e sahip Baci'llus subtilis susu. yöntem asagidakileri içermektedir istege bagli olarak (a), (b) veya (0) susunun, mutajenizasyon islemine tabi tutulmasi, ve asagidaki özelliklere sahip olan bir (a), (b) veya (0) mutant susunun seçilmesi (i): ampisilin, vankomisin, gentamisin, kanamisin, streptomisin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlilik; (ii) E. (3011' ve Clostridium peigfringensîn büyümesinin inhibisyonu, ve (iii) 2 günlük inkübasyonundan sonra Ölçüldügünde, en az 80 olan bir sporülasyon yüzdesi.
4. Istem 1°e göre en az bir Bacillus susunun hücrelerini içeren bir Baci'llus bilesimi.
5. Istem 1,e göre en az iki susun hücrelerini içeren, Istem 4”e göre Bacz'llus bilesimi.
6. Istem l°e göre en az üç susun hücrelerini içeren, Istem 4 veya Sie göre Bacillus bilesimi. Bacillus susunun veya suslarinin hücrelerinin sporlar oldugu, Istemler 4 ila 6°dan herhangi birine göre Bacillus bilesimi. Istemler 4 ila 7`den herhangi birine göre bir Baci'llus bilesiminin bir hayvan yemine eklenmesini içeren bir hayvan yeminin veya ön karisiminin üretimine yönelik bir yöntem. Istemler 4 ila 7°den herhangi birine göre bir Baci'llus bilesiminin veya Istem 8”in yöntemine göre üretilen bir hayvan yeminin veya ön karisiminin bir hayvana uygulanmasini içeren bir hayvanin beslenmesine yönelik bir yöntem. Hayvanin, kümes hayvanlari, gevisgetirenler, buzagilar, domuzlar, tavsanlar, atlar, balik ve evcil hayvanlardan olusan gruptan seçilen bir hayvan oldugu, Istem 9”a göre bir hayvanin beslenmesine yönelik yöntem.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12164087 | 2012-04-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TR201815560T4 true TR201815560T4 (tr) | 2018-11-21 |
Family
ID=48142761
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TR2018/15560T TR201815560T4 (tr) | 2012-04-13 | 2013-04-11 | E.coli ve clostrıdıum perfrıngens e karşı antimikrobiyal etkiye sahip ve yüksek sporülasyon kapasitesine sahip antibiyotiğe duyarlı bacıllus suşları. |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9844573B2 (tr) |
EP (2) | EP2836589B1 (tr) |
JP (1) | JP6212108B2 (tr) |
KR (1) | KR102128560B1 (tr) |
CN (1) | CN104487566B (tr) |
AU (1) | AU2013246850B2 (tr) |
BR (1) | BR112014025119B1 (tr) |
CA (1) | CA2869036C (tr) |
DK (1) | DK2836589T3 (tr) |
EA (1) | EA028359B1 (tr) |
ES (1) | ES2695149T3 (tr) |
HK (1) | HK1201558A1 (tr) |
MX (1) | MX357230B (tr) |
PH (1) | PH12014502283B1 (tr) |
PL (1) | PL2836589T3 (tr) |
TR (1) | TR201815560T4 (tr) |
WO (1) | WO2013153159A1 (tr) |
Families Citing this family (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103571811B (zh) * | 2013-10-19 | 2015-04-22 | 沅江浣溪沙酶技术有限公司 | 一种木聚糖酶及生产方法 |
JP6440463B2 (ja) * | 2013-11-15 | 2018-12-19 | プリマハム株式会社 | 抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカス |
CN103740607B (zh) * | 2013-11-28 | 2015-10-14 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一种摩加夫芽胞杆菌及微生物菌剂和它们的应用 |
CN103865839B (zh) * | 2014-01-03 | 2017-12-26 | 青岛东海药业有限公司 | 一种应用于水产养殖的微生态制剂 |
US10357046B2 (en) | 2014-05-13 | 2019-07-23 | Microbial Discovery Group, Llc | Direct-fed microbials and methods of their use |
WO2016011511A1 (en) * | 2014-07-25 | 2016-01-28 | The University Of Queensland | Bacillus amyloliquefaciens probiotic compositions, methods of production, and methods of use |
EP3200590B1 (en) * | 2014-09-30 | 2020-09-02 | Auburn University | Use of pectin or pectin-related saccharides to enhance efficacy of plant growth-promoting rhizobacteria (pgpr) strains for promoting growth and health in plants |
JP6595761B2 (ja) * | 2014-12-19 | 2019-10-23 | 東亜薬品工業株式会社 | バチルスアミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物 |
ES2759300T3 (es) | 2015-01-23 | 2020-05-08 | Novozymes As | Subespecies de Bacillus subtilis |
BR112017015623B1 (pt) | 2015-01-23 | 2022-05-31 | Novozymes A/S | Ração animal ou aditivo de ração animal ou pré-mistura de ração, método para melhora de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal e para alimentação de um animal, e, uso de uma cepa de bacillus |
CN107567493B (zh) | 2015-01-23 | 2021-11-16 | 诺维信公司 | 改进生产动物的健康和性能的芽孢杆菌属菌株 |
WO2017181203A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Ascus Biosciences, Inc. | Methods for improving agricultural production of fowl by administration of microbial consortia or purified strains thereof |
US10201574B1 (en) | 2015-09-16 | 2019-02-12 | Church & Dwight Co., Inc. | Methods of microbial treatment of poultry |
CA3016203C (en) * | 2016-02-29 | 2024-06-11 | Microbial Discovery Group, Llc | Direct-fed microbials |
US11298383B2 (en) | 2016-05-20 | 2022-04-12 | Church & Dwight Co., Inc. | Lactobacillus and bacillus based direct fed microbial treatment for poultry and method of use |
CN117004520A (zh) | 2016-05-25 | 2023-11-07 | 丘奇和德怀特有限公司 | 芽孢杆菌属组合物及用于反刍动物的方法 |
US11173184B2 (en) | 2016-05-31 | 2021-11-16 | Evonik Operations Gmbh | Bacillus subtilis strain with probiotic activity |
CN106957805B (zh) * | 2017-01-21 | 2020-10-23 | 南京钱塘洪泰生物科技有限公司 | 一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9菌株及其分离方法和应用 |
WO2018165252A1 (en) * | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Bioresource International, Inc. | Feed additive formulation and methods of making and using the same |
PE20200178A1 (es) * | 2017-03-14 | 2020-01-24 | Chr Hansen As | Cepas de bacillus subtilis que mejoran los parametros de rendimiento en animales |
CN107058182B (zh) * | 2017-04-19 | 2018-10-23 | 刘冰冰 | 一种解淀粉芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌复配微生物菌剂及其制备方法和应用 |
EP3645751A1 (en) * | 2017-06-30 | 2020-05-06 | Evonik Operations GmbH | Bacillus subtilis |
US11622569B2 (en) | 2017-07-24 | 2023-04-11 | Church & Dwight Co., Inc. | Bacillus microbial terroir for pathogen control in swine |
EP3447122A1 (en) * | 2017-08-24 | 2019-02-27 | Evonik Degussa GmbH | Bacillus subtilis strain with probiotic activity |
WO2019038153A1 (en) * | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Evonik Degussa Gmbh | DEBACILLUS SUBTILIS STRAIN HAVING PROBIOTIC ACTIVITY |
US11825862B2 (en) | 2017-10-18 | 2023-11-28 | Native Microbials, Inc. | Fowl production by administration of a synthetic bioensemble of microbes or purified strains thereof |
CN108004145B (zh) * | 2018-01-24 | 2021-03-02 | 吉林省农业科学院 | 一种黑木耳破壁方法 |
CN108208316B (zh) * | 2018-01-24 | 2021-02-02 | 吉林省农业科学院 | 含有暹罗芽孢杆菌的饲料 |
WO2019175783A1 (en) * | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Better Air International Limited | Compositions comprising bacterial strains and use thereof in controlling pathogenic microorganisms |
WO2019175782A1 (en) | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Better Air International Limited | Compositions comprising bacterial strains and use thereof in controlling pathogenic microorganisms |
WO2019175780A1 (en) * | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Better Air International Limited | Compositions comprising bacterial strains and use thereof in controlling pathogenic microorganisms |
WO2019175777A1 (en) | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Better Air International Limited | Compositions comprising bacterial strains and use thereof in controlling pathogenic microorganisms |
US12016513B2 (en) | 2018-05-21 | 2024-06-25 | Ecological Balancing Technologies Corporation | Automated device and method for spreading environmental friendly microbes on a surface |
BR122023002250B1 (pt) * | 2018-06-07 | 2024-01-09 | Artugen Therapeutics Ltd | Composição para o tratamento de c. difficile |
KR102178350B1 (ko) * | 2018-07-11 | 2020-11-11 | 대한민국 | 항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스 균주 및 이의 항균 용도 |
CA3114626A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Microbial Discovery Group, Llc | Microorganisms for plant pathogen inhibition |
KR102173953B1 (ko) | 2018-10-19 | 2020-11-04 | 중앙대학교 산학협력단 | 된장에서 분리한 단백질 분해능 및 항균활성이 우수한 신규 바실러스 벨레젠시스 kd1 균주 |
CN109619283B (zh) * | 2019-01-04 | 2022-10-04 | 大连民族大学 | 一种提高豆粕发酵效率的方法 |
CN109730198B (zh) * | 2019-01-04 | 2022-10-04 | 大连民族大学 | 一种利用响应面实验提高豆粕发酵效率的方法 |
EP3923737A1 (en) * | 2019-02-11 | 2021-12-22 | Evonik Operations GmbH | Compositions containing bacillaene producing bacteria or preparations thereof |
CN113825407A (zh) * | 2019-03-19 | 2021-12-21 | 微生物发现集团有限责任公司 | 用于病毒抑制的微生物菌株 |
WO2020243676A1 (en) * | 2019-05-31 | 2020-12-03 | South Dakota Board Of Regents Technology Transfer Office | Probiotics to inhibit enteric pathogens |
CN110368394B (zh) * | 2019-06-25 | 2022-10-11 | 华中农业大学 | 一种阿维拉霉素在猪产气荚膜梭菌抑制药物中的应用 |
BR112022003209A8 (pt) * | 2019-08-22 | 2024-02-06 | Microbial Discovery Group Llc | Método de alimentação de um animal, embalagem comercial, aditivo alimentar para uma ração animal, aditivo para a água potável de um animal, composição alimentar para animal, e uso de um aditivo compreendendo uma cepa de bacillus isolada |
CN110791450B (zh) * | 2019-11-22 | 2021-01-19 | 北京理工大学 | 一株能够降解多种β-内酰胺类抗生素的菌株Am101及其应用 |
CN111690578B (zh) * | 2020-07-31 | 2021-11-23 | 山东佐田氏生物科技有限公司 | 一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用 |
BR112023002974A2 (pt) * | 2020-08-21 | 2023-04-04 | Microbial Discovery Group Llc | Cepas microbianas e antibióticos |
CN112760251A (zh) * | 2021-01-05 | 2021-05-07 | 安徽农业大学 | 一种复合型芽孢杆菌益生菌及其制备与应用 |
CN113151069B (zh) * | 2021-04-01 | 2022-07-26 | 安杰利(重庆)生物科技有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备抗菌肽、饲料中的应用 |
CN113308397B (zh) * | 2021-05-19 | 2022-05-13 | 浙江大学 | 抑制产气荚膜梭菌的益生菌及其筛选方法与应用 |
CN113234631A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-08-10 | 广东海纳川生物科技股份有限公司 | 一种地衣芽孢杆菌及其发酵方法与应用 |
CN114836335B (zh) * | 2021-11-11 | 2023-09-05 | 施可丰化工股份有限公司 | 一株沙福芽孢杆菌t1-5及其应用 |
CN115449491A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-12-09 | 唐人神集团股份有限公司 | 一种具有高效抑菌功能的地衣芽孢杆菌及其应用 |
CN115428925B (zh) * | 2022-11-08 | 2023-03-24 | 四川大学 | 萝卜干的制备方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100287825B1 (ko) * | 1999-05-15 | 2001-04-16 | 이태일 | 가축용 복합 미생물 제제 |
BRPI0412978A (pt) * | 2003-08-14 | 2006-10-03 | Bio Balance Corp | cultura biologicamente pura de grupo bacteriano, co-cultura bacteriana, composição terapêutica, aditivo ou suplemento alimentar, gênero alimentìcio, método para tratar ou prevenir desordem e artigo de manufatura |
US7754469B2 (en) | 2005-11-30 | 2010-07-13 | Agtech Products, Inc | Microorganisms and methods for treating poultry |
US8021654B2 (en) | 2008-03-14 | 2011-09-20 | Danisco A/S | Methods of treating pigs with Bacillus strains |
PE20120074A1 (es) | 2008-09-17 | 2012-02-26 | Agraquest Inc | Composicion que comprende cepa de bacillus subtilis para alimentar animales |
EP2379705B2 (en) * | 2008-12-19 | 2019-10-02 | Chr. Hansen A/S | A bile resistant bacillus composition |
KR101370941B1 (ko) * | 2012-04-05 | 2014-03-12 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 바실러스 서브틸리스 |
KR101370942B1 (ko) * | 2012-04-05 | 2014-03-12 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 바실러스 서브틸리스 |
KR101658046B1 (ko) * | 2013-01-14 | 2016-09-20 | 한국생명공학연구원 | 항균활성을 갖는 신규한 바실러스 속 kr-of1 균주 및 이의 용도 |
KR101618220B1 (ko) * | 2014-02-21 | 2016-05-18 | 대한민국 | 신규 바실러스 속 균주 및 그의 용도 |
-
2013
- 2013-04-11 EP EP13717479.3A patent/EP2836589B1/en active Active
- 2013-04-11 JP JP2015504955A patent/JP6212108B2/ja active Active
- 2013-04-11 EA EA201491838A patent/EA028359B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-04-11 WO PCT/EP2013/057590 patent/WO2013153159A1/en active Application Filing
- 2013-04-11 KR KR1020147031931A patent/KR102128560B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-11 EP EP18188517.9A patent/EP3486313A1/en not_active Withdrawn
- 2013-04-11 ES ES13717479T patent/ES2695149T3/es active Active
- 2013-04-11 AU AU2013246850A patent/AU2013246850B2/en active Active
- 2013-04-11 TR TR2018/15560T patent/TR201815560T4/tr unknown
- 2013-04-11 CA CA2869036A patent/CA2869036C/en active Active
- 2013-04-11 MX MX2014012098A patent/MX357230B/es active IP Right Grant
- 2013-04-11 CN CN201380019655.7A patent/CN104487566B/zh active Active
- 2013-04-11 DK DK13717479.3T patent/DK2836589T3/en active
- 2013-04-11 BR BR112014025119-3A patent/BR112014025119B1/pt active IP Right Grant
- 2013-04-11 PL PL13717479T patent/PL2836589T3/pl unknown
- 2013-04-11 US US14/391,564 patent/US9844573B2/en active Active
-
2014
- 2014-10-10 PH PH12014502283A patent/PH12014502283B1/en unknown
-
2015
- 2015-03-02 HK HK15102077.5A patent/HK1201558A1/xx unknown
-
2017
- 2017-12-08 US US15/836,346 patent/US10702560B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2695149T3 (es) | 2019-01-02 |
HK1201558A1 (en) | 2015-09-04 |
CN104487566B (zh) | 2018-04-10 |
PH12014502283A1 (en) | 2014-12-15 |
PH12014502283B1 (en) | 2014-12-15 |
JP6212108B2 (ja) | 2017-10-11 |
DK2836589T3 (en) | 2018-10-29 |
MX2014012098A (es) | 2014-11-21 |
KR20140148488A (ko) | 2014-12-31 |
AU2013246850B2 (en) | 2018-03-29 |
CA2869036A1 (en) | 2013-10-17 |
EA201491838A1 (ru) | 2015-01-30 |
US20180200309A1 (en) | 2018-07-19 |
BR112014025119B1 (pt) | 2022-04-19 |
US10702560B2 (en) | 2020-07-07 |
US9844573B2 (en) | 2017-12-19 |
MX357230B (es) | 2018-07-02 |
EA028359B1 (ru) | 2017-11-30 |
JP2015517809A (ja) | 2015-06-25 |
AU2013246850A1 (en) | 2014-10-02 |
WO2013153159A1 (en) | 2013-10-17 |
EP2836589B1 (en) | 2018-08-15 |
BR112014025119A2 (pt) | 2021-06-01 |
KR102128560B1 (ko) | 2020-07-01 |
CA2869036C (en) | 2021-06-08 |
EP2836589A1 (en) | 2015-02-18 |
CN104487566A (zh) | 2015-04-01 |
PL2836589T3 (pl) | 2019-02-28 |
US20150079058A1 (en) | 2015-03-19 |
EP3486313A1 (en) | 2019-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10702560B2 (en) | Antibiotic sensitive Bacillus strains having antimicrobial effect against E. coli and Clostridium perfringens and having high sporulation capacity | |
AU736681B2 (en) | Competitive exclusion culture for swine | |
US7247299B2 (en) | Antimicrobial compounds from Bacillus subtilis for use against animal and human pathogens | |
Afrilasari et al. | Effect of probiotic Bacillus megaterium PTB 1.4 on the population of intestinal microflora, digestive enzyme activity and the growth of catfish (Clarias sp.) | |
Vijayabaskar et al. | Isolation of bacteriocin producing lactic acid bacteria from fish gut and probiotic activity against common fresh water fish pathogen Aeromonas hydrophila | |
KR101242821B1 (ko) | 비브리오 속 미생물에 대한 생물학적 방제용 프로바이오틱스 | |
KR101370941B1 (ko) | 신규 바실러스 서브틸리스 | |
KR100825129B1 (ko) | 신규 유산균 | |
Abbas et al. | Isolation of Lactobacillus strains with probiotic potential from camel’s milk | |
KR101370942B1 (ko) | 신규 바실러스 서브틸리스 | |
AU1402095A (en) | Probiotic for control of (salmonella) | |
KR101230813B1 (ko) | 사프로레그니아 속 미생물에 대한 생물학적 방제용 프로바이오틱스 | |
US20110104134A1 (en) | Novel lactic acid bacterium having high immunoglobulin-a-inducing ability | |
US20140349331A1 (en) | Use of bacillus composition for increasing the amount of available sugars in animal feed | |
Al-Faragi et al. | Isolation and identification of Bacillus subtilus as (probiotic) from intestinal microflora of common carp Cyprinus carpio L | |
Lestari et al. | Isolation and identification of bacteria in gastrointestinal of eel (Anguilla bicolor) that has potential as probiotic | |
Hatha et al. | Diversity and antimicrobial activity of lactic acid bacteria from the gut of marine fish Rastrelliger kanagurta against fish, shrimp and human pathogens | |
Chandra et al. | Development and assessment of a fish feed to assist in aquaculture nutrition management | |
KR20040065065A (ko) | 가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸 및 유해 병원성미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스훼시움 Probio-048 및 이를 함유한 생균활성제 | |
PL233898B1 (pl) | Nowe szczepy bakterii fermentacji mlekowej do zwalczania Escherichia coli i Clostridium perfringens u zwierząt, zwłaszcza u przeżuwaczy, ich kompozycje i zastosowania | |
Ahmady et al. | EFFECT OF DIETARY MANNAN OLIGOSACCHARIDE AND LIGNIN ON POPULATION AND CHARACTERISTICS OF PROBIOTIC BACTERIA ISOLATED FROM JAPANES QUAILS | |
PL233897B1 (pl) | Nowe szczepy bakterii probiotycznych do zwalczania Escherichia coli i Clostridium perfringens u zwierząt, zwłaszcza u świń i dzików, kompozycje szczepów bakterii probiotycznych i ich zastosowania |