CN106957805B - 一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9菌株及其分离方法和应用 - Google Patents
一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9菌株及其分离方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物制药工程技术领域，主要是提供一种从条纹斑竹鲨肠道内分离得到的一株具有抑菌效果的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus‑9，其分离自条纹斑竹鲨，并于2016年11月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.13337。本发明还提供该芽孢杆菌GBacillus‑9菌株在制备抗菌药物中的应用，以及包括该芽孢杆菌GBacillus‑9菌株的微生物菌剂及其制备方法。该菌株具有明显抑制枯草芽孢杆菌生长的作用，为研制新一代的海洋抗菌药物打下了基础，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制药工程技术领域，具体涉及一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株、及其分离方法和应用。
背景技术
条纹斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）属于软骨鱼纲(Chondrichthyes)、须鲨目（Orectolformes）须鲨科(Orectolebidea)、斑竹鲨属(Chiloscyllium)，是一种小型底栖种类，卵生，主要生活在浅海层多藻类生长的岩礁环境中，在我国的东海、南海均有分布。鲨鱼机体的免疫功能令人瞩目，目前的研究主要集中在肝脏功能、养殖生物学、核型染色体研究等方面。鲨鱼胃肠道内是一个精彩的微生物世界，但是目前未见有与其胃肠道微生物相关的基础研究报道。
发明内容
本发明主要是提供一种从条纹斑竹鲨肠道内分离得到一株具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）的技术，该技术包括对条纹斑竹鲨肠道的处理、原菌液的获取、菌群的分离固体培养基。经抑菌实验及重复抑菌实验证明该菌株具有明显抑制枯草芽孢杆菌生长的作用，其有望应用于抗菌药物的制备中，能为海洋抗菌药物制备提供新的良好的材料来源。
本发明所采用的技术方案为：
一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株，其特征在于，分离自条纹斑竹鲨，并于2016年11月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 13337。
所述芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株的单菌落形态如图1所示。
所述芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株的分离过程如下：
条纹斑竹鲨，来自广东海域，购回后放于遮光水箱内暂养数日后，对其进行手术取其肠道，75%的酒精擦拭外表面后于紫外超净台内解剖其肠道，取出肠道内容物及粘膜液，使用生理盐水稀释，得到原菌液。以稀释涂布的方法涂布于海水LB固体培养基内，置于37℃培养箱培养，海水LB固体培养基成分：酵母提取物 5g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂13g，1000 mL人工海水，摇动容器直至溶质溶解，在121℃下灭菌20 min，每个玻璃平板内倒入约20 mL培养基。人工海水为本实验室自配，由蒸馏水加适量海盐溶解的母液配制而成，pH约为7.0。
所述芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株的遗传学特征：用细菌基因组试剂盒提取细菌基因DNA后，利用通用引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，连接质粒载体，然后将连接产物转化到感受态细胞中，进行阳性克隆的筛选，培养后测序。该菌株的16S rDNA基因序列为：GACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTA（如图2所示）。将该序列与GenBank中已登录的部分菌株的16S rDNA基因序列进行相似性比较，结果表明该菌株属于甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。
本发明还提供芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株在制备抗菌药物中的应用；所述抗菌药物是海洋抗菌药物。
本发明还提供芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株在抑制枯草芽孢杆菌的生长中的应用。
本发明还提供一种具有抑菌效果的微生物菌剂，其活性成分包括芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株。
本发明还提供上述微生物菌剂的制备方法，包括芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌株的扩大培养和发酵步骤。
本发明具有以下显著创新点和有益效果：
（1）材料来源选自浅海层的条纹斑竹鲨，近年来，对于条纹斑竹鲨肝脏功能、机体免疫功能的研究有了初步的进展，鲨鱼肠道内微生物世界丰富多彩，功能也将会呈现多样化的趋势，探索鲨鱼机体免疫功能与肠道微生物的关联性是本发明的目的，我们也将此作为探索海洋微生物资源的起点；
（2）得到的可抑制枯草芽孢杆菌的芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus），具有应用于抗菌药物制备中的潜力，这为研制新一代的海洋抗菌药物打下了基础，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1 所示的是本发明的单菌落形态图。
图2 所示的是本发明GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）的16S rDNA序列图。
图3 所示的是本发明GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）的PCR鉴定电泳图。
图4 所示的是本发明GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）的抑菌实验结果，其中左上为空白培养基，右下为GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌液，中间为稀释100倍的氨苄抗生素。
具体实施方式
以下是对实验材料的具体描述。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例一
材料和试剂：
1. 材料、菌种：
条纹斑竹鲨来自广东海域，枯草芽孢杆菌WB800N购自德国MoBiTec GmbH公司。
2. 主要试剂：
海盐购自仟湖鱼业集团；琼脂粉（Agar）购自日本BIOSHARP公司；蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）购自英国Oxoid公司；其余试剂为国产分析纯。
LB固体培养基：5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，10g氯化钠，15g琼脂粉，1L 去离子水。
LB液体培养基：5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，10g氯化钠，1L 去离子水。
1%琼脂：10g琼脂，1L去离子水。
牛津杯法测抑菌活性的具体方法和步骤：
1. 分别接种50 μL枯草芽孢杆菌WB800N和芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌液至5mL LB液体培养基培养，置于220 rpm，37℃摇床培养12h；
2. 倾倒1%琼脂至凝固，待到灭菌过后的LB固体培养基冷却至40-50℃时加入1/100 WB800N菌液，混匀后倒板，凝固待用；
3. 将无菌牛津杯烧热后固定于WB800N平板上，冷却后，根据牛津杯容积加满芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌液（实验组），阴性对照加满的普通LB液体培养基，阳性对照加满稀释100倍的氨苄抗生素，于37℃正置培养箱中培养12-18h，观察抑菌生长情况（平皿上方需覆盖滤纸）。
结论：根据表1的抑菌圈直径大小，可知芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）具有明显的抑菌作用。
表1 芽孢杆菌GBacillus-9的抑菌试验结果（n=4）
| 阴性对照组 | 实验组 | 阳性对照组 | |
| 平均抑菌圈直径/mm | 无明显抑菌圈 | 10.4±2.7 | 15.8±1.1 |
实施例二
材料与方法：
1. 样品的制备：
接种5mL芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）菌液至500mL LB液体培养基中培养，得到GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）种子液；再接种500mL种子液至加有10L LB液体培养基的发酵罐中扩大培养，得到GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）发酵液。
2. 动物：
试验组江南某生猪养殖场保育猪120头，其中僵猪30头；对照组为保育猪122头，其中僵猪29头；试验起始前者为35-38日龄，后者为36-38日龄。
3. 方法：
试验组日粮中芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）培养液各1升/吨，试验组不添加。
4. 判定标准
观察各组整齐度、毛色、粪便量，统计各组死淘率、日增重、日耗料。
实验结果：
1. 整齐度：试验组原来两栏30头僵猪，已与正常猪没有区别；对照组的僵猪仍处于僵猪状态。
2. 毛色：试验组自从饲喂第4天开始，毛色开始发亮，比对照组明显有精神。
3. 粪便量：试验组粪便减少，氨味减轻。
4. 死淘率：试验组死亡2头（由于急性链球菌致死），对照组死亡13头（包括僵猪5头）。
5. 日增重：结果见附表2，各数值为平均值。从表2可以看出，饲喂芽孢杆菌GBacillus-9（甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus）的试验组猪的体重增加量显著高于对照组；料肉比结果明显降低，说明养殖所用饲料成本可明显降低。
表2 芽孢杆菌GBacillus-9动物实验的日增重结果
| 起始重/kg | 结束重/kg | 增重/kg | 料肉比 | |
| 实验组 | 14.5 | 36.2 | 21.7 | 1.99 |
| 对照组 | 15.3 | 30.2 | 14.9 | 2.78 |
<110>南京钱塘洪泰生物科技有限公司
<120>一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9菌株及其分离方法和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1364
<212> DNA
<213>
<220>
<223>
<400> 1
SEQ ID No.1
1 GACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAAC
61 CTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAA
121 CCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGC
181 ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG
241 GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG
301 AATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC
361 GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTG
421 ACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG
481 TGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTG
541 ATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAG
601 AAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCA
661 GTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGA
721 ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGT
781 TTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCA
841 AGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT
901 TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGG
961 ACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
1021 GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTT
1081 GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCA
1141 TCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGA
1201 AACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACT
1261 CGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTT
1321 CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTA
Claims (7)
1.一种具有抑菌效果的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株，其特征在于，分离自条纹斑竹鲨，并于2016年11月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 13337。
2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如下：
GACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTA。
3.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株，其特征在于，所述菌株的分离过程如下：取条纹斑竹鲨肠道的内容物及粘膜液，使用生理盐水稀释，得到原菌液；
以稀释涂布的方法涂布于海水LB固体培养基内，置于37℃培养箱培养；摇动容器直至溶质溶解，在121℃下灭菌20 min，每个玻璃平板内倒入15-30 mL培养基；
所述海水LB固体培养基成分为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂13 g，1000 mL人工海水；
所述人工海水由蒸馏水加适量海盐溶解的母液配制而成，pH为6.8-7.2。
4.根据权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株，其特征在于，所述pH为7.0。
5.权利要求1-4任意一项权利要求所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株在制备抑制枯草芽孢杆菌药物中的应用。
6.一种具有抑菌效果的微生物菌剂，其活性成分包括权利要求1-4任意一项权利要求所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）GBacillus-9菌株。
7.权利要求6所述的微生物菌剂的制备方法，包括所述甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）GBacillus-9菌株的扩大培养和发酵步骤。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 大蒜汁对枯草芽孢杆菌抑制作用的研究;张宝善等;《西北植物学报》;20091231;第29卷(第6期);1269- 1275 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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