CN113234631A - 一种地衣芽孢杆菌及其发酵方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌为地衣杆菌B‑1126，保藏号为GDMCC NO：61564；本发明将地衣芽孢杆菌B‑1126进行筛选发酵，得到发酵液。本发明筛选的地衣芽孢杆菌简单，无毒副作用、无残留、绿色安全，该地衣芽孢杆菌经过发酵后获得的发酵液中含有较高的分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶，还能分泌抑菌物质，使其具有显著的金黄色葡萄球菌以及产气荚膜梭菌的抑制作用，且无免疫应激。另外，本发明能解决地衣芽孢杆菌发酵液中芽孢含量与产孢率低的问题，具有更高的发酵活力与应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵与微生物转化技术领域，具体而言，涉及一种地衣芽孢杆菌及其发酵方法与应用。
背景技术
抗生素替代是目前饲料添加剂产业研究的热点问题。无残留、无污染的益生菌作为抗生素的替代品之一，潜力巨大。其中地衣芽孢杆菌作为益生菌的一种，在调节肠道微生态功能、促进有益菌群增值、提高机体免疫功能等方面具有重要作用。地衣芽孢杆菌是一种属于芽孢杆菌属的***，研究表明其对多种植物土传病原菌有很强的抑制作用，如对植物疫霉病菌、结核病病菌、核盘菌、稻瘟病病菌等具有较强的抑菌活性，也有研究将地衣芽孢杆菌应用于畜牧业，由于地衣芽孢杆菌的发酵培养成分以及发酵工艺会影响地衣芽孢杆菌发酵液中的芽孢产量，目前现有技术中普遍存在地衣芽孢杆菌发酵液中芽孢含量与产孢率低的问题，从而导致制备的地衣芽孢杆菌发酵液对金黄色葡萄球菌以及产气荚膜梭菌的抑制效果不佳。
综上，在微生物发酵与微生物转化技术领域，仍然存在亟待解决的技术问题。
发明内容
基于此，为了解决现有技术中地衣芽孢杆菌发酵液中芽孢含量与产孢率低的问题，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，具体技术方案如下：
一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌为地衣杆菌B-1126，其保藏号为GDMCC NO：61564。
本发明还提供一种地衣芽孢杆菌的发酵方法，所述发酵方法包括以下步骤：
将地衣芽孢杆菌接种于LB培养基上进行活化培养；
将活化后的地衣芽孢杆菌接种于摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；
将所述一级种子液涂布于筛选平板上培养24h，然后挑取平板上透明圈较大的单菌落；
将所述单菌落接种于二级种子罐中搅拌培养，得到二级种子液；
将所述二级种子液接种于发酵罐中进行发酵培养，得到发酵液；
其中，所述发酵培养的培养基为：玉米淀粉25g/L-35g/L、糖蜜8g/L-12g/L、豆粕粉3g/L-6g/L、蛋白胨3g/L-6g/L、氯化钠1g/L-3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L-0.8g/L、磷酸氢二钾1g/L-3g/L、硫酸镁0.3g/L-0.8g/L、消泡剂1g/L-3g/L。
进一步地，所述筛选平板的培养温度为36℃。
进一步地，所述二级种子液的接种量为1％-5％。
进一步地，所述发酵罐内的培养温度为30℃-38℃；所述发酵罐内的培养时间为24h-26h。
进一步地，所述发酵罐内的压力为0.02Mpa-0.08Mpa，所述发酵罐内通入的空气流量为0.5vvm-2.0vvm。
进一步地，所述活化培养为将挑取的单菌落划线转接于LB培养基中，在30℃-36℃的温度条件下培养10h-16h。
进一步地，所述二级种子罐内的温度为33℃-36℃、搅拌速度为100r/min-150r/min、通气量为0.3vvm-0.6vvm、压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养时间为24h-26h。
进一步地，所述发酵液总菌数达80亿CFU/mL以上，芽孢数达76亿CFU/mL以上，产孢率达93％以上。
另外，本发明还提供所述的发酵液在抑制产气荚膜梭菌以及金黄色葡萄球菌中的应用。
上述方案中筛选的地衣芽孢杆菌简单，无毒副作用、无残留、绿色安全，该地衣芽孢杆菌经过发酵后获得的发酵液中含有较高的分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶，还能分泌抑菌物质，使其具有显著的金黄色葡萄球菌以及产气荚膜梭菌的抑制作用，且无免疫应激。另外，本发明能解决地衣芽孢杆菌发酵液中芽孢含量与产孢率低的问题，具有更高的发酵活力与应用价值。
附图说明
图1是实施例1中地衣杆菌B-1126的生长曲线示意图；
图2是应用试验例中产气荚膜梭菌感染率的示意图；
图3是实施例8制备的发酵液、那西肽、恩拉、杆菌肽锌对产气荚膜梭菌CVCC2027的抑菌示意图；
图4是实施例8制备的发酵液、那西肽、恩拉、杆菌肽锌对产气荚膜梭菌CVCC2038的抑菌示意图；
图5是实施例8制备的发酵液、那西肽、恩拉、杆菌肽锌对鸡源临床梭菌的抑菌示意图；
图6是实施例8制备的发酵液、那西肽、恩拉、杆菌肽锌对猪源临床梭菌的抑菌示意图。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例中的一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌为地衣杆菌B-1126(Bacillus licheniformis B-1126)，其保藏号为GDMCC NO：61564；于2021年3月17号保藏在广东省微生物菌种保藏中心保藏，地址为：广州市先烈中路100号广东省微生物研究所实验楼五楼；分类命名为：Bacillus licheniformis。
在其中一个实施例中，提供一种地衣芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤：
将地衣芽孢杆菌接种于LB培养基上进行活化培养；
将活化后的地衣芽孢杆菌接种于摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；
将所述一级种子液涂布于筛选平板上培养24h，然后挑取平板上透明圈较大的单菌落；
将所述单菌落接种于二级种子罐中搅拌培养，得到二级种子液；
将所述二级种子液接种于发酵罐中进行发酵培养，得到发酵液；
其中，所述发酵培养的培养基为：玉米淀粉25g/L-35g/L、糖蜜8g/L-12g/L、豆粕粉3g/L-6g/L、蛋白胨3g/L-6g/L、氯化钠1g/L-3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L-0.8g/L、磷酸氢二钾1g/L-3g/L、硫酸镁0.3g/L-0.8g/L、消泡剂1g/L-3g/L。
在其中一个实施例中，所述筛选平板的培养温度为36℃。
在其中一个实施例中，所述二级种子液的接种量为1％-5％。
在其中一个实施例中，所述发酵罐内的培养温度为30℃-38℃；所述发酵罐内的培养时间为24h-26h。
在其中一个实施例中，所述发酵罐内的压力为0.02Mpa-0.08Mpa，所述发酵罐内通入的空气流量为0.5vvm-2.0vvm。
在其中一个实施例中，所述活化培养为将挑取的单菌落划线转接于LB培养基中，在30℃-36℃的温度条件下培养10h-16h。
在其中一个实施例中，所述二级种子罐内的温度为33℃-36℃、搅拌速度为100r/min-150r/min、通气量为0.3vvm-0.6vvm、压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养时间为24h-26h。
在其中一个实施例中，所述发酵液总菌数达80亿CFU/mL以上，芽孢数达76亿CFU/mL以上，产孢率达93％以上。
在其中一个实施例中，所述的发酵液在抑制产气荚膜梭菌以及金黄色葡萄球菌中的应用。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1：
地衣芽孢杆菌B-1126是从母猪的肠道中分离得到。具体是解剖母猪后取出肠道，挤压肠道，排出其肠道内容物后，将肠道剪开，用无菌刀片刮肠道内壁，获得肠道内壁样品。用10倍量的磷酸盐缓冲液将肠道内壁样品进行稀释，利用移液枪吸取稀释液100μL到BHI固体平板上，用涂布棒涂匀、编号，并做3个重复。涂布均匀后在超净工作台中放置5-10min，使培养基表面菌液被充分吸收。将平板倒置后，置于30℃恒温培养箱中培养48h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化，并且对不同的菌进行抗病毒功能的测定，获得了一株可抗淡水养殖动物病毒的菌株，命名为B-116。取经过BHI固体培养基纯化培养的B-116，单菌落划线接种于BUG鉴定平板上，36℃培养16h-24h，待菌落大小适宜时取细菌鉴定试剂盒IF-A接种液，将管外壁擦拭干净，置入浊度仪中调整其读数为100％T；用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在92％T-98％T之间，用8孔移液枪将混合液以每孔100μL体积转移至GENⅢ鉴定板中。将鉴定板装载于Biolog***中培养，***自动读数并最终输出鉴定结果为地衣芽孢杆菌，即获得地衣芽孢杆菌B-116；
将地衣芽孢杆菌B-1126接种于LB培养基上在36℃的温度条件下摇瓶培养28h，并绘制地衣芽孢杆菌的生长曲线，如图1所示。
实施例2：
将地衣芽孢杆菌B-1126接种于LB培养基上在30℃的温度条件下培养16h，然后收集活化后的地衣芽孢杆菌，用生理盐水洗涤活化后的地衣芽孢杆菌，然后于摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；将所述一级种子液涂布于筛选平板上于36℃的条件下培养24h，然后挑取平板上透明圈较大的单菌落；将所述单菌落接种于温度为33℃、搅拌速度为150r/min、通气量为0.3vvm、压力为0.03Mpa的二级种子罐中搅拌培养22h，得到二级种子液。
实施例3：
将地衣芽孢杆菌B-1126接种于LB培养基上在36℃的温度条件下培养16h，然后收集活化后的地衣芽孢杆菌，用生理盐水洗涤活化后的地衣芽孢杆菌，然后于摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；将所述一级种子液涂布于筛选平板上于36℃的条件下培养24h，然后挑取平板上透明圈较大的单菌落；将所述单菌落接种于温度为36℃、搅拌速度为150r/min、通气量为0.6vvm、压力为0.05Mpa的二级种子罐中搅拌培养24h，得到二级种子液。
实施例4：
将地衣芽孢杆菌接B-1126种于LB培养基上在36℃的温度条件下培养16h，然后收集活化后的地衣芽孢杆菌，用生理盐水洗涤活化后的地衣芽孢杆菌，然后于摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；将所述一级种子液涂布于筛选平板上于36℃的条件下培养24h，然后挑取平板上透明圈较大的单菌落；将所述单菌落接种于温度为36℃、搅拌速度为150r/min、通气量为0.6vvm、压力为0.05Mpa的二级种子罐中搅拌培养26h，得到二级种子液。
按照实施例2-4中的条件，每组实施例进行了5组试验，得到地衣芽孢杆菌B-1126摇瓶活菌数和芽孢数试验汇总，结果如下表1所示。
表1：
由表1中的数据分析可知：地衣芽孢杆菌B-1126培养24h-26h具有较高的活菌数以及孢芽率，其中活菌数最高的为培养24h时，达到60亿/mL以上，芽孢数达59％以上，芽孢率达95％以上，当培养至26h，虽然也具有较高的活菌数和芽孢率，但活菌数和芽孢率开始下降，因此，本发明地衣芽孢杆菌B-1126的培养时间优选24h。
实施例5：
将接种量为5％的所述二级种子液接种于培养温度为36℃、压力为0.08Mpa、空气流量为2.0vvm、体积为50L的发酵罐中进行发酵培养26h，得到发酵液，且所述发酵培养的培养基为：玉米淀粉10g/L、糖蜜2g/L、蛋白胨1g/L、氯化钠0.1g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.3g/L、消泡剂1g/L。
实施例6：
将接种量为5％的所述二级种子液接种于培养温度为36℃、压力为0.08Mpa、空气流量为2.0vvm、体积为50L的发酵罐中进行发酵培养26h，得到发酵液，且所述发酵培养的培养基为：玉米淀粉25g/L、糖蜜8g/L、豆粕粉3g/L、蛋白胨3g/L、氯化钠1g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.3g/L、消泡剂1g/L。
实施例:7：
将接种量为5％的所述二级种子液接种于培养温度为36℃、压力为0.08Mpa、空气流量为2.0vvm、体积为50L的发酵罐中进行发酵培养26h，得到发酵液，且所述发酵培养的培养基为：玉米淀35g/L、糖蜜12g/L、豆粕粉6g/L、蛋白胨6g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢0.8g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.8g/L、消泡剂3g/L。
实施例8：
将接种量为5％的所述二级种子液接种于培养温度为36℃、压力为0.08Mpa、空气流量为2.0vvm、体积为50L的发酵罐中进行发酵培养26h，得到发酵液，且所述发酵培养的培养基为：玉米淀粉30g/L、糖蜜10g/L、豆粕粉5g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、消泡剂2g/L。
检测实施例5-8中的发酵液的总菌数、芽孢数以及产孢率来判断地衣芽孢杆菌B-1126的发酵能力，结果如下表2所示。
表2：
由表2中的数据分析可知，在本申请的培养基中进行发酵培养，50L发酵罐能够达到发酵液的总菌数为80亿CFU/mL以上，芽孢数76亿CFU/mL以上，产孢率达94％以上，而实施例5中改变了培养基中的配方成分，导致总菌数、芽孢数以及产孢率均比实施例6-8中的总菌数、芽孢数以及产孢率的低，因此，说明本发明的地衣芽孢杆菌B-1126在优化的培养基的配方下具有优异的发酵能力，且获得的发酵液具有显著的总菌数、芽孢数以及产孢率。
体外抑菌试验：
测定试液：取实施例8中制备的发酵液1ml(100g/T)。
测定方法：采用滤纸片测定法进行抑菌活性测定，将产气荚膜梭菌CVCC2027的菌悬液0.5ml，利用涂布法接种于NA平板(制备方法：取蒸馏水1000ml煮沸后，加入葡萄糖10g，琼脂20g，牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，pH＝7)上，用灭菌镊子取分别浸泡过的测定试液的滤纸片平放于含有测试菌的培养皿中，每组3次重复，并以清水为空白对照。制备好后的培养皿置于30℃恒温培养箱中，于48h后观察，用十字交叉法测量抑菌圈的直径，记录为试验1。同样的方法，检测实施例8中制备的发酵液对产气荚膜梭菌CVCC2038(记录为试验2)、鸡源临床梭菌(记录为试验3)、猪源临床梭菌(记录为试验4)、金黄色葡萄球菌ATCC25923(记录为试验5)以及金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003(记录为试验6)的抑菌情况，经过测试，5次重复抑菌圈直径测量结果如下表3所示。
表3：
由表3中的体外抑菌试验数据分析可知，本发明中份发酵液对产气荚膜梭菌具有显著的抑制作用，且对金黄色葡萄球菌也具有优异的抑制作用。
另外，在体外试验中，还做了相关的对比试验，试验的试剂以及试验的结果如下表4以及结果如图3-6所示。其中，所述发酵液为实施例8制备的发酵液，所述那西肽、恩拉、杆菌肽锌为市面上购买的产品，在试验条件一致的情况下，具体的成分不做详细赘述。
表4：
由表4中的数据以及图3-6分析可知，本发明的发酵液对梭菌具有显著的抑制效果。
应用试验例：
将实施例8得到的发酵液添加至母猪基础饲粮中，得到拌料，无抗生素添加；
在广西一猪场选择50头怀孕的母猪，先在没有使用所述发酵液的情况下检测怀孕母猪粪便中梭菌的含量，检测结束后将含有所述发酵液的拌料饲喂试验母猪，添加量为200g/t。在饲喂含有所述发酵液的拌料15天后分别采集所有试验母猪的分别检测产气荚膜梭菌的含量。
其中，产气荚膜梭菌含量检测按照现场快速检测产气荚膜梭菌试剂盒说明书进行操作，在第4小时读一次结果，第5小时读一次结果用于判定母猪产气荚膜梭菌感染情况。如果粪便中产气荚膜梭菌含量越高，在培养的过程中相同时间繁殖出的产气荚膜梭菌就越多，代谢产生的硫化氢也更多，因此生成的硫化亚铁也会相应增加，同理产生相同量黑色沉淀菌含量越高所需的时间也就越短。因此可以根据培养过程中开始产生黑色的时间以及量来判定粪便中产气荚膜梭菌的含量。产气荚膜梭菌与颜色反应的关系如下表5所示，试验母猪使用含有所述发酵液的拌料的结果如表6所示，试验母猪的产气荚膜梭菌感染率如图2所示。
表5：
表6：
由表6分析可知，试验例中50头怀孕母猪中，重度感染产气荚膜梭菌18头，轻度感染24头，机体肠道内产气荚膜梭菌数正常有8头，并结合图2分析可知：感染率占比分别为36％、48％、16％。本试验所有试验猪使用含有所述发酵液200g/t的拌料进行饲喂，饲喂期15天。15天后采集试验猪的粪便检查产气荚膜梭菌含量。在使用含有所述发酵液的拌料的15天后再次检测结果是，重度感染产气荚膜梭菌3头，轻度感染5头，机体肠道内产气荚膜梭菌数正常有42头，并结合图2分析可知感染率占比分别为6％、10％、84％，具体为：试验例中50头怀孕母猪进行产气荚膜梭菌含量的检测，严重感染和轻度感染的怀孕母猪分别达36％和48％，产气荚膜梭菌量正常仅为16％。在使用含有所述发酵液15天后再次检测可以看出严重感染的母猪从18头减少至3头，总计减少15头，改善率达83.33％；轻度感染母猪由24头减少到5头，总计减少19头，改善率达79.17％；机体内产气荚膜梭菌量正常的母猪由8头增加至42头，有34头母猪恢复正常，治疗率达到80.95％。说明本发明中所述发酵液可以有效减少猪肠道中的产气荚膜梭菌，改善动物健康状态，能明显降低产气荚膜梭菌感染率的作用，具有显著的进步。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌为地衣杆菌B-1126，其保藏号为GDMCC NO：61564。
2.一种地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括以下步骤：
将地衣芽孢杆菌接种于LB培养基上进行活化培养；
将活化后的地衣芽孢杆菌接种于摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；
将所述一级种子液涂布于筛选平板上培养24h，然后挑取平板上透明圈较大的单菌落；
将所述单菌落接种于二级种子罐中搅拌培养，得到二级种子液；
将所述二级种子液接种于发酵罐中进行发酵培养，得到发酵液；
其中，所述发酵培养的培养基为：玉米淀粉25g/L-35g/L、糖蜜8g/L-12g/L、豆粕粉3g/L-6g/L、蛋白胨3g/L-6g/L、氯化钠1g/L-3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L-0.8g/L、磷酸氢二钾1g/L-3g/L、硫酸镁0.3g/L-0.8g/L、消泡剂1g/L-3g/L。
3.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述筛选平板的培养温度为36℃。
4.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述二级种子液的接种量为1％-5％。
5.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵罐内的培养温度为30℃-38℃；所述发酵罐内的培养时间为24h-26h。
6.根据权利要求5所述的地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵罐内的压力为0.02Mpa-0.08Mpa，所述发酵罐内通入的空气流量为0.5vvm-2.0vvm。
7.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述活化培养为将挑取的单菌落划线转接于LB培养基中，在30℃-36℃的温度条件下培养10h-16h。
8.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述二级种子罐内的温度为33℃-36℃、搅拌速度为100r/min-150r/min、通气量为0.3vvm-0.6vvm、压力为0.03Mpa-0.05Mpa，培养时间为24h-26h。
9.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵液总菌数达80亿CFU/mL以上，芽孢数达76亿CFU/mL以上，产孢率达93％以上。
10.权利要求2所述的发酵液在抑制产气荚膜梭菌以及金黄色葡萄球菌中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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