SK281946B6 - Spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov - Google Patents
Spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov Download PDFInfo
- Publication number
- SK281946B6 SK281946B6 SK106-96A SK10696A SK281946B6 SK 281946 B6 SK281946 B6 SK 281946B6 SK 10696 A SK10696 A SK 10696A SK 281946 B6 SK281946 B6 SK 281946B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- arginine
- extraction
- protein
- liter
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 20
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 title claims description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title description 52
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 64
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 57
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 14
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000008505 β-D-glucopyranosides Chemical class 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XPIVOYOQXKNYHA-RGDJUOJXSA-N [(2r,3s,4s,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methoxyoxan-2-yl]methyl n-heptylcarbamate Chemical compound CCCCCCCNC(=O)OC[C@H]1O[C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O XPIVOYOQXKNYHA-RGDJUOJXSA-N 0.000 description 2
- -1 alkyl glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- JVDHWXLTNDKLIZ-WCCKRBBISA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N JVDHWXLTNDKLIZ-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- YEIPDMVCOQKQHV-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-diphenyltetrazol-1-ium-1-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=C(C=2C=CC=CC=2)N=NN1C1=CC=CC=C1 YEIPDMVCOQKQHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000031266 Microcystic stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001599630 Stelis <bee> Species 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 108700003606 glycosylated interleukin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000030751 ovarian microcystic stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000013055 pulp slurry Substances 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5437—IL-13
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Postup spočíva v tom, že sa usadenina buniek alebo bunkovej drviny z buniek, pochádzajúcich z kultivácie prokaryotických mikroorganizmov, transformovaných pomocou vektora expresie, ktorý obsahuje gén kódujúci dotyčný proteín a prostriedky na jeho expresiu v periplazme, suspenduje v roztoku pufra, obsahujúcom arginín. Príslušný proteín sa ďalej izoluje zo supernatantu takto získanej bakteriálnej suspenzie.ŕ
Description
Vynález sa týka extrakcie rekombinovaných proteínov produkovaných prokaryotickými mikroorganizmami, najmä Escherichia coli. Extrakcia sa vykonáva v prítomnosti arginínu.
Doterajší stav techniky
Od genetického inžinierstva sa stále viac žiada, aby sa zameralo na výrobu zaujímavých proteínov ako je napr. inzulín, interleukíny, rastový hormón a pod.
Všeobecne je mikroorganizmus transformovaný vektorom expresie, obsahujúcim gén kódujúci predmetný proteín a prostriedky nutné na jeho expresiu, ako napr. regulačné znaky. Potom sa mikroorganizmus pestuje na vhodnej živnej pôde, a keď sa vytvorí dostatočné množstvo buniek organizmu, začne sa prídavkom induktora fáza nazývaná expresia, v ktorej priebehu je produkovaný žiadaný proteín vo vysokom množstve a hromadí sa. Na konci kultivácie sa suspendované bunky zo živnej pôdy oddelia, napr. odstredením alebo mikrofiltráciou. Potom sa podrobia extrakcii, ktorá sa často začína drvením stien mikroorganizmov.
Expresia génu kódujúceho žiadaný proteín v prokaryotickom mikroorganizme môže byť cytoplazmatická, periplazmatická alebo sekretorická, podľa druhu prostriedkov expresie uplatnených s uvedeným génom (promótor, terminátor, fixačné miesto ribozómov, peptidové znaky a pod.).
Cytoplazmatická expresia dovoľuje získať významné množstvo proteínov. Ale je nevyhnutné pred extrakciou žiadaných proteínov, pokiaľ obsahujú jeden či viac sírnych mostíkov, pristúpiť k etape denaturácia/renaturácia, čo predstavuje etapu obzvlášť ťažkopádnu a chúlostivú v priemyselnom meradle výroby. Etapa denaturácia - renaturácia sa vykonáva klasickými spôsobmi, dobre známymi pracovníkom z odboru, pričom sa používa denaturačné činidlo za prítomnosti redukovadla a potom podmienky denaturácie zahŕňajú kontrolu najmä čo do redox charakteru roztoku; medzi používanými denaturačnými činidlami je nutné obzvlášť uviesť guanidínhydrochlorid, ktorý bol navrhnutý v postupe získavania ľudského interleukínu-2. O tejto problematike pojednáva napr. patentový spis č. EP-A2-0 145 390.
Sekretorické systémy expresie, v ktorých sa nachádza žiadaný proteín v kultivačnom médiu aktívne, sú používané len zriedka alebo vôbec nie, ak ide o baktérie gramnegatívne pre ich malú produktivitu. Tu je nutné poznamenať, že prostredie bakteriálnej kultúry s veľkou hustotou v bioreaktore nie je ideálne prostredie pre rekombinované proteíny, citlivé vzhľadom na nebezpečenstv fázovej interfaciálnej denaturácie.
Periplazmatická expresia dovoľuje získať priamo rekombinované proteíny v podstate správne replikované, a to v priestore chránenom pred okolím, a preto predstavuje rozumnú možnosť pre získavanie týchto proteínov, hlavne proteínov neglykozylovaných. V tomto prípade potom nie je nutné podrobovať proteín etape denaturačnej.
Metódy drvenia buniek, všeobecne v tejto oblasti používané, sú napr. lýza buniek ultrazvukom alebo mechanickým tlakom (French Pressure Celí, guľový mlyn), chemická lýza alebo lýza enzymatická, osmotický šok a spracovanie pomocou činidiel chaotropických alebo detergentov. Tieto metódy rozdrvia väčšinu bunkových membrán vrátane membrán plazmatických a membrán endoplazmatického retikula a vytvoria homogénnu suspenziu bunkových zlomkov. Charakter usadeniny bunkovej drviny, ktorá môže byť získaná centrifúgáciou (jadrá, bunkový skelet, mitochondrie, lyzozómy, ribozómy, makromolekuly atď.) závisia hlavne od dĺžky a rýchlosti centrifúgácie (10 minút na 1000 g až 3 hodiny na 150 000 g).
Problémy, s ktorými sa môžeme stretnúť v priebehu extrakčnej operácie, sa menia podľa typu expresie a podľa použitých extrakčných metód. Sú to najmä;
- strata na výťažku rekombinovaného proteínu,
- strata biologickej aktivity rekombinovaného proteínu,
- proteolytická degradácia rekombinovaného proteínu,
- toxicita extrakčných činidiel a kontrola jej odstránenia,
- neľahký prevod do priemyselného meradla,
- zmes proteínov periplazmatických a cytoplazmatických.
Navyše, ak ide o žiadané proteíny, ktoré sú hydrofóbne alebo nesú náboj, môžu sa viazať na bunkové zložky, ktoré sú samé hydrofóbne alebo nabité, čo urobí extrakciu extrémne ťažkou.
Priemyselná výroba žiaducich rekombinovaných proteínov pomocou genetického inžinierstva je veľmi sľubná, ale vyžaduje použitie takých extrakčných metód, ktoré umožnia vyhnúť sa uvedeným nevýhodám alebo ich aspoň minimalizovať.
Je však dôležité žiadané proteíny nielen produkovať v značných množstvách, ale ešte tiež ich produkovať nekontaminované extrakčnými činidlami a uchovať im všetku biologickú aktivitu.
Na tento účel sú navrhované rôzne postupy, najmä pre prípad extrakcia - separácia intcrleukínu-2.
Patentový spis EP-A2-0 145 390 opisuje spôsob získania ľudského neglykozylovaného interleukínu-2 (IL-2) s vysokou špecifickou aktivitou, a to pomocou chromatografie na kolóne pre extrakciu IL-2. Tento postup dovoľuje tiež vykonanie denaturácie pomocou guanidinhydrochloridu.
Patentový spis EP-A2-0 147 819 navrhuje postup na získanie homogénneho a čistého ľudského rekombinovaného interleukínu-2. Tento postup spočíva v kultivácii mikroorganizmu transformovaného pomocou vektora expresie, ktorý obsahuje gén kódujúci interleukín-2, ďalej vo vyvolaní lýzy buniek, izolácii bunkovej drviny, v extrakcii IL-2 premývaním bunkovej usadeniny vhodným premývacím roztokom, potom v chromatografickom vyčistení premývacieho roztoku. Použité premývacie roztoky môžu obsahovať soľ, ako napr. chlorid sodný alebo guanidínhydrochlorid alebo detergent, ako napr. produkt známy pod obchodným názvom „Triton X-100“.
Podľa uprednostňovaného postupu sa odporúča použiť postupne tri premývacie roztoky: premývací roztok obsahujúci chlorid sodný, premývací roztok obsahujúci detergent a premývací roztok obsahujúci guanidínhydrochlorid.
Patentový spis EP-A1-0 337 243 opisuje postup na čistenie ľudského interleukinu-2, používajúci dve kolóny na kvapalinovú chromatografiu v obrátenej fáze. Pred etapou chromatografického čistenia sa nerozpustná fáza lyzátu bakteriálnych buniek extrahuje roztokom obsahujúcim guanidínhydrochlorid, aby bol získaný bakteriálny extrakt, ktorý sa potom zriedi pomocou pufra bez guanidínhydrochloridu, potom sa chromatografúje, pričom sa elúcia vykoná s acetonitrilovým gradientom.
Podstata vynálezu
V súčasnosti bolo prekvapujúco zistené, že extrakcia žiadaného proteínu produkovaného prokaryotickým mikroorganizmom, ktorý bol pozmenený pôsobením vektora expresie obsahujúceho gén kódujúci žiadaný proteín a pros2 triedky na jeho expresiu, ako napr. regulačné znaky nevyhnutné na periplazmatickú expresiu, môže byť uskutočnená tak, že sa bunková usadenina alebo bunková drvina mikroorganizmov, pochádzajúca z kultivácie uvedeného organizmu, suspenduje v roztoku pufra, pričom tento roztok obsahuje výhodne arginín, ktorý môže byť vo forme L a/alebo D.
Predmetom tohto vynálezu je spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov, ktorý spočíva v tom, že sa:
1. bunková usadenina, pochádzajúca z kultúry mikroorganizmu transformovaného pôsobením vektora expresie, ktorý obsahuje gén kódujúci dotyčný proteín a všetky regulačné znaky nevyhnutné na jeho periplazmatickú expresiu, suspenduje v roztoku pufra, obsahujúceho arginín a že sa počas kontaktu za zodpovedajúcich podmienok pH, teploty, bakteriálnej koncentrácie atď.,
2. rekuperuje žiadaný proteín z takto získanej suspenzie.
Predmetom vynálezu je zároveň použitie arginínu ako extrakčného činidla pre periplazmatické rekombinované proteíny.
Podľa jedného z variantov nového postupu spočíva extrakcia príslušného periplazmatického proteínu v tom, že sa usadenina bunkovej drviny, získaná po lýzy buniek pochádzajúcich z kultivácie, suspenduje v roztoku pufra, obsahujúcom arginín.
Extrakcia periplazmatických proteínov je obzvlášť účinná, keď je extrakčný pufor tvorený vodným roztokom, obsahujúcim arginín s koncentráciou rovnajúcou sa prinajmenšom 0,4 M arginínu v medziach rozpustnosti arginínu vo vode pri teplote miestnosti (blízko 0,8 M v čistej vode a ďalej za prítomnosti solí), a keď je jeho pH mierne alkalické, výhodne rovnajúce sa 8.
Arginín je prírodná α-aminokyselina, ktorá bola navrhnutá ako pomocný prostriedok pri denaturácii/renaturácii/substitúcii dvoch reťazcov Abbokinázy (urinámy aktivátor plazminogénu), v ktorých je pôvodný peptid nahradený v priebehu tejto operácie peptidom syntetickým. Tu je možné odkázať na článok G. A. Homandberga, R. Waia v Biochimica and Biophysica Acta, 1990, 1038,209 - 215.
V postupe podľa vynálezu a v jeho výhodných vyhotoveniach sa nepristupuje k denaturácii - renaturácii proteínu, ale arginín pôsobí výlučne na úrovni extrakcie proteínu z bunkovej usadeniny alebo z bunkovej drviny mikroorganizmu.
Arginín má značné účinky pri extrakcii proteínu tak na úroveň výťažkov, ako na biologickú aktivitu proteínu. Bolo totiž zistené, že napr. dospelá forma IL-13 sa rekuperuje s použitím postupu podľa vynálezu s výsledkami vyššími ako 95 %, pričom zostane zachovaná jej biologická aktivita. Je nutné uviesť, že pokusy s extrakciou osmotickým šokom pri tom istom systéme expresie nevedú k porovnateľným výsledkom.
Porovnávacie pokusy ukázali, že guanidínhydrochlorid použitý za tých istých podmienok dovoľuje získať proteín IL-13 s výťažkom vyšším ako 95 %. Na druhej strane jc však biologická aktivita proteínu takto získaného zmenená viac ako arginínovou metódou.
Bez toho, aby išlo o pokus viazať sa na nejakú teóriu, možno predpokladať, že arginín pôsobí ako činidlo slabo chaotropické a biologické, na rozdiel od činidiel silne chaotropických a denaturačných, akým je pri potrebných vysokých koncentráciách rovnajúcich sa či vyšších ako 5 M, nevyhnutný na zaistenie extrakcie, napr. guanidínhydrochlorid.
Postup podľa vynálezu, prípadne v niektorom z možných výhodných vyhotovení, môže byť aplikovaný po a komkoľvek procese kultivácie mikroorganizmu, transformovaného vektorom expresie, obsahujúcom gén kódujúci žiadaný proteín a činiteľa pre periplazmatickú expresiu dotyčného proteínu, ako napr. potrebné regulačné znaky.
Odborníkom je zrejmé, že táto metóda je použiteľná pre baktérie blízke E. coli, t. j. pre baktérie gramnegatívne, pripadne anaeróbne zo skupiny Enterobaktérií. V tejto skupine Enterobaktérií sa nachádzajú hlavne druhy: Escherichia, Salmonella a Erwinia, ale tiež Shigella, Klebsiella, Serratia, Protens a Enterobacter.
Vzhľadom na chaotropický charakter arginínu sa rovnako ukazuje, že arginín možno prípadne výhodne nahradiť inými chaotropickými činidlami. Pretože je nemožné podať príklady týkajúce sa všetkých rodov baktérií vzhľadom na diverzitu dotyčných živých systémov, odborníci si poradia s aplikáciou i adaptáciou arginínovej extrakčnej metódy na svoje zvláštne prípady.
V rámci odboru sú takéto procesy kultivácie dobre známe. Postupy opisujúce kultiváciu baktérií gramnegatívnych vo fermentore sú opísané napr. v patentových spisoch EP 360 641 a EP 356 335 a vzťahujú sa na získanie a využívanie kmeňov Escherichia coli označených SEBR 1250 a TP 2339.
Len čo je dosiahnutý žiaduci počet buniek, kultúra sa podrobí centrifiigácii (spravidla) alebo mikrofiltrácii a na usadeninu biomasy takto získanú sa pôsobí roztokom pufra obsahujúcim arginín - postupom podľa vynálezu.
Podľa všeobecného predpisu sa pracuje pri teplote medzi izbovou teplotou 25 °C a teplotou 2 °C, výhodne pri 4°C.
Čas kontaktu bunkovej usadeniny s roztokom pufra obsahujúcim arginín musí byť dostatočný na to, aby mohol nastať prestup príslušného proteínu do pufrového roztoku. Pokiaľ sa pracuje pri teplote 4 °C, je zvyčajne dĺžka kontaktu výhodne blízka 1 hodine.
Extrakcia, t. j. prechod periplazmatického proteínu do prostredia, prebieha v priebehu kontaktu biomasy s extrakčným prostriedkom - arginínovým pufrom. Čas kontaktu, ktorý zruší úplnú alebo už nepokračujúcu extrakciu, je medzi 30 minútami a 16 hodinami. Pokusy ukazujú, že uspokojivé výťažky môžu byť dosiahnuté v priebehu niekoľko hodín pri teplote 4 °C. Bolo rovnako zaznamenané, že ľahké premiešavame biomasy v extrakčnom pufre vedené tak, aby sa zabránilo sedimentácii mikroorganizmu, poskytuje vyššie výťažky, t. j. vyššiu mieru extrakcie ako funkcie času.
Postup extrakcie podľa vynálezu je rovnako vhodný pre extrakcie hydrofóbnych proteínov, ako sú napr. interleukíny, hlavne IL-13, opísaný v patentovom spise EP-A1-0 506 574, ako pre extrakciu proteínov hydrofilných, ako je napr. rastový hormón (hGH). Postup podľa vynálezu zjednodušuje získavanie hGH, ktoré normálne vyžaduje pre extrakciu uplatnenie osmotického šoku.
Aby bolo možné uskutočniť extrakciu proteínu priamo zo suspenzie bunkovej usadeniny, použije sa výhodne roztok pufra obsahujúceho arginín v koncentrácii medzi 0,4 M a 0,8 M.
Pokiaľ sa chce uskutočniť extrakcia žiaduceho periplazmatického proteínu z usadeniny bunkovej drviny podľa jedného z výhodných vyhotovení postupu podľa tohto vynálezu, postupuje sa rovnakým spôsobom ako pri základnom vyhotovení až do etapy získania bunkovej usadeniny po centrifugácii alebo mikrofiltrácii, potom sa ale uskutoční drvenie buniek metódami známymi odborníkom. Metódy drvenia buniek sú opísané napr. v týchto publikáciách: C. T. Choma a H. Yamazaki, Can. J. Microbiol., 1981, 27, 547 - 550, L. O. Ingram, Joumal of Bacteriology, 1981,
SK 281946 Β6
146, 1, 331 - 336, N. G. Nossal a L. A. Heppel, Joumal of Biological Chemistry, 1966, 241, 13, 3065 - 3072, R. Bennet, D. R. Taylor a A. Hunt, Biochem. Biophys. Acta 18 (3), 512 - 521 a v kolektívnej práci Fermentation and Enzýme Technology, kap. 12, 239 - 309, vyd. J. Willey and Sons(1979).
Usadenina bunkovej drviny získaná zvyčajným spôsobom sa centrifuguje a znova suspenduje, potom sa na ňu pôsobí roztokom pu&a s obsahom arginínu. Čas styku suspenzie bunkovej drviny s roztokom pufra obsahujúcim arginín musí byť dostatočne dlhý, aby umožnil prestup príslušného proteínu do roztoku pufra. Zvyčajne sa pri teplote 4 °C čas styku, zaručujúci prakticky úplnú extrakciu, rovná 48 hodinám. Bolo pozorované, že podobne i tu mierne premiešavame biomasy v extrakčnom pufre, ktoré zabráni sedimentácii bunkovej drviny, dáva vyššie extrakčné hodnoty v závislosti od času.
Tento variant cxtrakčného postupu podľa vynálezu vyhovuje hlavne k extrakciám žiaducich periplazmatických proteínov, ktoré sú silne asociované na bunkových membránach, ako napr. interleukíny.
Odborníkom je dobre známe, že extrakčný pufor obsahujúci arginín podľa vynálezu môže rovnako obsahovať vhodný detergent, ktorý má zlepšiť výťažok a/alebo rýchlosť extrakcie príslušného proteínu. Medzi detergentmi vhodnými na použitie si odborník vie zvoliť také, ktoré umožnia zachovať výhody použitia arginínu ako extrakčného činidla, hlavne to, že zostáva zachovaná biologická účinnosť dotyčného proteínu. Ako vhodné mierne detergenty je možné uviesť napr. alkylglykozidy ako alkylmaltozidy, nonyl-α alebo β-D-glukopyranozidy, oktyl-α alebo β-D-glukopyranozidy alebo alkyl-karbamoyl-metyl-α alebo β-D-glukopyranozidy, ako napr. produkt značky Hecameg, ktorého veľmi slabá toxicita núti mať na mysli, že môže byť nájdený v stopách vo finálnom produkte.
Aby bola uskutočnená extrakcia žiaduceho proteínu zo suspenzie usadeniny bunkovej drviny, použije sa prednostne roztok pufra obsahujúceho arginín v koncentrácii vymedzenej hodnotami 0,4 M a 2,5 M, pričom koncentrácia v hodnote 2,5 M môže byť získaná hlavne za prítomnosti solí.
Ďalej bolo zistené, že arginín má značný blahodarný účinok na výťažky vylučovaného rekombinovaného periplazmatického proteínu, ak je pridaný v nezvyčajných a veľmi vysokých koncentráciách, oveľa vyšších ako sú tie, s ktorými sa môžeme stretnúť v prostrediach kultúry, vyrábané z hydrolyzátov obchodných proteínov a ktoré dovoľujú pokryť potrebu arginínu z použitého kmeňa.
Okrem toho bolo zistené, že blahodarný účinok arginínu je zvlášť výrazný, pokiaľ koncentrácie arginínu pridaného do kultivačného prostredia sa pohybujú na úrovni medzi 2 g/liter a 10 g/liter.
Odborník bude vedieť optimalizovať túto koncentráciu z prípadu na prípad.
Tento postup je zvlášť vhodný na výrobu proteínov s aktivitou cytokínového typu, hlavne IL-13, ako je opísané v patentovom spise EP-A1-0 506 574.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález je teraz bližšie osvetlený pomocou príkladov, ktoré rozsah vynálezu nijako neobmedzujú.
Príklad 1
Extrakcia periplazmatického IL-13 z E. coli z bunkovej usadeniny za prítomnosti arginínu
1. Kultivácia v banke:
V tomto príklade bol použitý kmeň E. coli RB791 (Roger Brent, PNAS 78 (1981), str. 4204 - 4208) transformovaný plazmidom p922 získaným podľa analogických postupov, ako sú postupy opísané v patentových spisoch EP 360 641 a 356 335, ktorého sekvencia ADN je sekvenciou SEQID No. 1.
Rozličné sekvencie, ktoré definujú plazmid p922, sú uvedené.
Sekvencia promótora
Hcxanukleotidy TTGCTT a TATAAT sú vytlačené hrubo.
| 1 | XboX TCQMTGGGT | TTGAGGCGXJ | CACACTTCTG | TTAACGCAGA ACCTAAACGC | |
| 51 | ATCTCGACTG | CACGGTGCAC | cAATGcrrcr | GGCGTCAGGC | ACCCATCGGA |
| 101 | AGCTGTGCTA | TGGCTGTCCA | GGTCGTAAAT | CACTGCATAA | TTCCTGTCGC |
| 151 | TCAAGCCGCA | CTCCCGtTCŤ | GGATAATCTT TTTTGC6CCG | ACATCATAAC | |
| -35 |
| 201 | GGTTCTGCCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA CTGACTGTT6 | ||
| •10 | |||
| 251 | CnATATTAC | ASCGATMCG | υαλλΚΤΟΤ GG |
Sekvencia oblasti 5' neodovzdávaná mRNA
Fixačné miesto ribozómu je tlačené hrubo. Sekvencia CAT umiestnená na konci 3' tejto sekvencie je časťou hexanukleotidu rozpoznávaného reštrikčným enzýmom Ndel
RBS
283 AATTGTOAGC GGATAACAAT TTCACACAGT TTTTCCCCAA OAAOGAOATA 333 TACAT
Sekvencia kódujúca prekurzor IL-13
Sekvencia písaná kurzívou zodpovedá sekvencii IL-13 maturovaného. Sekvencia, ktorá nie je tlačená hrubo, je sekvenciou väzobnou spájajúcou koniec sekvencie kódujúcej IL-13 s hexanukleotidom, poznávaným reštrikčným enzýmom BAmHI
33í uauAAMA naoocon Mcncocia actaccotto tattctctcc
388 aicaxxne toaxccn iecatxctc ncreaxre AGGGiccrcA 20 Ají nusatsa eaautrn tauauux tóuoscrec armcur
488 CCUCC41W Z1NSMOU* CMCCTSÍU «ZWOKa 4CTGTSC4CC
538 ccTCfiurcc cmucucí reracccrs ucícccae «suexccc
588 auscuter eaumxze wosceua isstckkc rsaxwirr <38 rewecnw jnmia acauurc amaagxc tsrmttM 25 (88 cuccnac inanxu mucnn· raKUGGM ccsiraucr
738 euAcrrcoA ueaxai tam sekvucl* tarainační
7(3 OMTCCOKT OCXMCMW CCCauAOCA AKTOACITC OCICCTCCCA Taxuicítor j«au xo Iíju 77 30 813 CC0CKMCA ATAACTAOCA IAACCCCT70 OCOCCTCTAA ACCCCTCTTO mnaiii
363 Adacomri ncisaamm momctata tccuiatota ccaaccttcc
913 CCOCATCAAA UľUUKOt CmCCAGAC arľAGTAAAT GAATITTCTa 9(3 takiaohtt itcuiACAA ctticaacm τπολοοοοα gtcacaatag 35 TaxaitUctír figu M
1013 AAAOOMCM CZUMCMT TOOMTAAT ΛΛΤΓΓΤΤΓΟΛ ΚΠΟΑΑΑΑΤ 1063 CTCCAAAAU AMOOCtCOA AMOCACCCT ΓΓΛΑΤΤΙΓΓΑΤ C0CTTTA7CA
SK 281946 Β6
1113 ccrrGCrrrc cagskmatt tcttaaacac cttcataccg atacttccgc 1163 CGACAATCAC AACAACCATC CCCCACaCAT aaCCCaTATA TTCCCTCCCT 1213 GAffiCTTtCA OOOACTCAAA CTOCCnil' CCCCGATCGA T
Gén Kódujúci repxesor operónu laktózy StelI
125* CCOCCOAACC ATAAACTOTA MOXtaaa TOCCTAATCA GrCAQCTAAC 1304 mcsTT/M ηαπτοακ ταααχχα cnraaaic «kaaacctc 1354 tcctcccaoc taxnuso uaceaxM axxcaaxu oaaxsanr i4o4 αοατΑττοοα coccAOoara οπτππττ tcaccactoa oacccocaac 1454 mctoatioc ccrtCACcac ciooccctc* oacaottoca ocaaccogic 1504 CACOCTCOTT TOCCCCAOCA OOWAAAATC CTGnTGCTG OTGTTAACG 1554 KOCGATATA ACATÚACCTC TCTTCCCTAT OTCOTATCC CACTACCCAG 1604 ATATCC6CAC CAACSCOCAQ CCCOMCICC atUOOOOK OCATTOCOCC 1654 caococcatc mnccnca caaccaocai cocaoiwca acoatoccct 1704 CATTCAGCAT TTOCATOOTT TOITOAAAAC COQACATOCC ACTCCACTCG 1754 ccrrcccsn «xoctatcog ποαλτγτοα τπκομπολ satatttaks 1804 CCACCCAGCC ABACXACAC GCCCCCAOAC AGAACITAAT OOKCCOCTA 1854 ACAflOKGAT TTOCTOGroA OCCAATOCGA CCAGATOCTC CAOOCCCAGT 1904 COCCTACCOT CTTCATOOCA GAAAATAATA CTOTTOATOC OTOTCTCCIC 1954 AOACACATCA ACAAATAACO CCOGAACAT7 ASTOCAOKA OCTtCCACAO 2004 CAATOOCATC CianCATCC AOCCOATAOT TAATCATCAC CCCACTOACG 2054 CGrreCGCCA GAACATTOro CACCOCCOCT TTACAOOCTT CGACOCCGCT 2104 TCOTTCTACC ATCGACACCA CCACOCTOCC ACCCAGTTGA TOCCGCGAG 2154 ATTTAATCGC CtSCCACAAlT TOCGACaOCO CCtOCAOGOC CAGACTOOAG 2204 GTCCCAACGC CAAICAGCAA CCACTCTTTC CCCGCCAGIT OTTCTGCCAC 2254 GCGCTTOGCA ATCTAATTCA GCTCCCCCAT CGtXGCTTtX ACTm-ľGCC 2304 ccormcoc aoaaaotoi ctotcctost tcaccacoco ogaaacgctc 2354 TCATAAOACA CACCO3CATA CICTCCGACA TCOTATAACO ΤΓΑΟΤΟΟΤΤΤ 2404 CACATTCACC ACCCTGAATT OACTCTCTTC COGOCCCTAT CATOCCATAC 2434 CGCCAAAOCT TTTOCaCCAT TCOATCTACC CCGCACOCAT CCTCGCCGCA 2504 AA
Sekvenciu pBR 327 rn>i
2506 CCAACCCrra CCAGAACATA TCCATCCCGT CCCCCATCTC CAGCAOCCCC 2556 ACGKOCWA TOCaSOCCO CCTTtSCTOOC OllinCCAT ACOCTCCOCC 2606 CCCCTCACCA 02ATCACAAA AA7CQACGCT CAAOTCACAC CTGGCGAAAC 2656 CCGACACCAC TATAAAGATA CCAOCCtOTT CCCCCTOOAA CCTCCC7CCT
2706 OCCCICTCCT OTTCCQACCC TCCCOCTTAC COGATACCTO TCCOCCTTTC 2756 leeoncoca aagccigocc ctttctcaat octcaccctc tacctatctc 2806 Acnooaror AOGTCorrcc ctccaaoctc cucionnac acoaaccccc 2856 ccttcaoccc caccoctocc ccttatccoi taactatcot cttoactcca 2906 ACCCOCTAAC ACACCACTTA ICOCCACTCO CAOCAGCCAC TOGTAACAGC 2356 ATIACCAOAO CGACGIATOT ADOCCOTOCT ACAGAGTtCT TOAAOTSCTO 3006 GCCTAACTAC aCTACACTA GAAOGACACT ATITOCTATC TCCCKTCTOC 3056 TOAAOXACT TACCTTOBA AAAACAGTTC STACCTCT7C ATCCQGCAAA 3106 CAAACCACCO CltSTMCGO ΤΟΟΠΠΤΠ CTTTCCAACC ACCACA7TAC 3156 OCOCAOAAAA AAAOOATCTC AAGAAflAItX TTTCATCTTT TCTACCGOGT 3206 CTOACOCTCA ffTOOAACOAA MCKKOft /ΜΟΧΠΤΤ CCTCATOAOA 3256 ITATCAAAAA OCATCTTCAC CTAGATCCTT ΤΤΑΛΑΤΓΑΛΛ AATCAACTTT 3306 TAAATCAATC ΤΛΑΛΟΤΑΤΑΤ ATGAOTAAAC TrGGTCTGAC ACTTACCAAT 3356 αοπΑΛταα tcagjcacct atctcaecga totoictatt tcottcatcc 3406 atacitocct OACTCCCCor cotctacata actaccatac aocAacocrr 3456 ACCATCTCOC CCCAOTOCTC CAATOATACC OCOACACCCA COCTCACCCC 3506 CTCAGATrr ATCAOCAATA AACCAOCCAO CCGCAAOCGC CCACCQCACA 3536 AGTOCrcCTC CAACTTTATC COCCTCCATC CACTCTATTA ΛΠΟΤΤΟΟΟΟ 3606 OCAACCTACA GTAAOTAOTT CCCCAOTTAA TAGTTTGCGC AACGnOITC 3656 CCATTOCTCC AOOCATCOTO ararCACOCT CGTCG'l 1'166 TATOOCTTCA
3706 TTCACCTCCG OTTCCCAACG ATCAAOOCGA CTTACATSAT CCCCCATOTT 3756 GTOCAAAAAA OCOGITAGCT CCTTCOCTCC TCCGATCOTT GTCACAAGTA 3806 Msmsaxc κκπκκΛ ctcatcctu tcgcaccact gcataattct 3856 CTTACTCTCA TOCCATCCCT AACATOCITT TCTOTOACTC CTOACTACTC 3906 AACCAACTCA TTC1GAGAAT AOTOTATOCO OCGACCCAGT 7OCTCT7CCC 3956 COTCGTCAAC ACOOGATAAT ACCCCOCCAC ATAGCA6AAC ΤΠΑΑΑΑΠΤύ 4006 CTCATCATKS GAAAACCTTC TTCCOGOCGA AAACTCTCAA CCATCTTACC 4056 ccrorrcAGA tccagttcoa tgtaacccac tctccaccc aactgatctt 4106 CACCATCITT TACTHCACC ACCCTTTCTC GCTCAOCAAA MCAOCAACO 4156 CAAAATCCCC CAAAAMCCC AATAAOOOCO ACACOOAAAT CTttMATACT 4206 CATACTCTTC CmTTCAAT ATTATTOAAC ΟΛΤΙΤΑΤΟΑΟ GGTTATTOTC 4256 TCATOAOCOG ΑΤΑΟΑΤΛΤΠ ΟΑΑΤΟΤΑΤΓΤ Α6ΑΑΑΛΑΤΑΑ ACAAATAGG6 4306 onCCOCCCA CATrrcCCCC AAAACTtXXA CCTCACCTCT AACAAACCAT 4356 TATTA7CAT0 ACATTAACCT ATAAAAATAC OCCTATCACC AOCCCCTTTC 4406 CTCCC
Plazmid pBR 327 je opísaný v Gene, 9, 287 - 305 (1980).
Tento kmeň E. coli RB 791/p922 bol daný do predkultivácie, a to cez noc pri teplote 30 °C pri miešaní 200 otáíok/minútu a na pôde L (Luria broth) opísané v Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sambrook, Fritsch, Manitas, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2. vydanie (1989)) so 100 mg/liter ampicilínu. Z tejto predkultivácie bola naočkovaná nová bunka s kultivačnou pôdou L tak, aby počiatočná optická hustota (označovanie optickej hustoty: optická hustota D.O. pri 600 m. D.O. = 1 zodpovedá 400 - 450 mg biomasy na liter) D.O. bola 0,6. Po hodinovom zotrvaní bola kultivácia indukovaná 1 mM IPG (izopropyl-P-D-l-tiogalaktopyranozid) a pokračovala ešte 3 hodiny. Vzorky bakteriálnej suspenzie boli centrifugované a bakteriálne usadeniny takto získané boli suspendované ďalej v extrakčnom pufre tak, aby konečná optická hustota D.O. (pozri vyššie) bola 10, čo zodpovedá 4,5 g biomasy v litre v okamihu extrakcie.
Boli použité nasledujúce pufre:
A: Arginín 0,8 M pH 8,0, nastavený pomocou HC1 vo vode Milli-Q (Millipore)
B: Guanidínhydrochlorid 5 M vo vode Milli-Q bez úpravy pH.
Aby bolo možné merať účinnosť extrakcie, boli odoberané vzorky po 1 ml suspenzie kultúry do dosiahnutia D.O. 0,2 zodpovedajúcej usadeniny baktérií, získané odstredením pri 5000 g počas 10 minút uložené na polyakrylamidový gél do 16,5 % po denaturácii v SDS. Tiež bakteriálne suspenzie boli odstredené a ich supematanty boli odsolené ultrafiltráciou (filtračné zariadenie Ultra-free-MC s prahom rezu 5000 Da Millipore) pred umiestnením na gél. Vlastný gél bol potom vyvolaný metódou Westem Blot s použitím protilátok anti-IL-13-CHO a vyhodnotený kvantitatívne na Phosphorimager (Molecular Dynamics). Protilátka anti-IL-13-CGHO (Chinese Hamster Ovaiy) použitá v tomto príklade bola získaná imunizáciou králikov.
V tomto príklade bolo zistené, že extrakcia za prítomnosti guanidínhydrochloridu a prípadne arginínu je pri maturovanej forme prakticky kompletná, pričom sú výťažky extrakcie v týchto dvoch prípadoch vyššie ako 99 %. Bolo rovnako zaznamenané, že nie sú rozdiely v obsahu prekurzora IL-13 medzi extraktom získaným za prítomnosti arginínu a extraktom získaným za prítomnosti guanidínhydrochloridu.
2. Kultivácia vo fermentore
Kmeň E. coli RB 791/p922 bol vnesený do živnej pôdy L s ampicilínom 100 mg/liter a inkubovaný pri 30 °C za miešania, aby sa získala predkultúra. Objem 100 ml tejto predkultúry poslúžil na naočkovanie do fermentora s obsahom 2,5 litra značky MBR. Kultivácia sa uskutočnila v objeme 1,2 litra v prostredí, ktorého zloženie je uvedené a za rovnako definovaných podmienok.
Živné prostredie pre fermentor - kmeň E. coli RB 791/p922
Údaje platia pre 1 konečný liter, objem inokula je potrebné odpočítať.
1. Rozpustí sa v 700 ml vody Milli-Q:
Zložka:
Hmotnosť/liter
EDTA1 g
FeSO4,7 H2O 45mg
MgSO4,7H2O1,5 g
K2SO4 0,75 g
CaCl2,2 H2O 32mg
NaCl 1,45 g
KC15 g
HY-SOY75 g
L-metionín1,4 g
Tryptofán1 g stopové prvky 2ml výťažok z kvasníc10 g
Doplní sa na 800 ml vodou Milli-Q a autoklávuje sa 30 minút pri teplote 120 “C.
2. Filtruje sa na 0,2 pm v 100 ml vody Milli-Q:
Glycerín15 g
K2HPO47,1 g
Koncentrácia glycerínu počas kultivácie má byť udržiavaná na hodnotách medzi 10 a 15 g/1.
3. V okamihu indukcie sa pridá:
IPTG1 g kyselina
6-aminokaprónová 0,65 g
HY-SOY40 g
L-cysteín0,3 g
Objem tohto prídavku nie je zahrnutý do následných výpočtov.
Roztoky mikroelementov
Používajú sa v množstve 1 ml/liter.
Na 1 liter sa doplní vodou Milli-Q, na rozpustenie sa
| berie 800 ml. | Hmotnosť/liter |
| H3BO3 | 3 mg |
| NaMoO4,2 H2O | 4,8 mg |
| MnSO4, H2O | 59 mg |
| CoCl2,6 H2O | 23,8 mg |
| CuSO4,5 H2O | 8,7 mg |
| ZnSO4, 7 H2O | 13 mg |
| AlClj, 6 H2O | 60 mg |
| KCr(SO4)2, 12H2O | 6 mg |
| KJ (zvlášť) | 60 mg |
| NiSO4,6 H2O | 2,6 mg |
Pridá sa 100 ml kone. HC1 a doplní sa na 1000 ml vodou Milli-Q.
V jednom prípade pri D.O. 58 začala expresia IL-13 prídavkom IPTG v množstve 1 g/liter. Prebiehala 5 hodin.
Parametre kultivácie vo fermentore boli nasledujúce: pH = 7,4 T = 30°C pO2 = 40 mm Hg, regulované miešaním, s prietokom vzduchu v rozmedzí 1-3 litre/minúta.
Použité metódy extrakcie a merania biologickej aktivity boli rovnaké ako v časti 1 uvedené vyššie.
Bolo zistené, že extrakcia bakteriálnej usadeniny získanej vo fermentore a nie už v banke, vykonaná za prítomnosti guanidínhydrochloridu i za prítomnosti arginínu, je v maturovanej forme IL-13 takmer úplná a že v obidvoch prípadoch sú výťažky extrakcie vyššie ako 97 %.
Príklad 2
Biologická aktivita IL-13 takto extrahovaného
Extrakty, získané za prítomnosti guanidínhydrochloridu alebo arginínu v príklade 1 boli odsolené ultrafiltráciou, ako bolo opísané. Boli po zriedení vnesené do zostavy za prítomnosti podklonu bunkovej populácie B9 závislého od IL-13. Aktivita IL-13 pri zriedených vzorkách vedie k rastu buniek B9 a bola určená koncentrácia za polčas zdvojenia. Bunkový rast bol zastavený po 3 dňoch kontaktu prídavkom MTT [3-(4,5-dímetyltiazol-2-yl-2,5-difenyltet-razolium)bromid] a zmeraný na spektrofotometri pomocou absorpcie vyvolaného modrého sfarbenia pri 565 nm. Biologická aktivita IL-13 bola vyjadrená v ng/ml v porovnaní so štandardom IL-13, ktorý bol kalibrovaný na medzinárodný štandard pochádzajúci z kultúry IL-13 CHO, získanej imunizáciou králikov podľa N. Vitá, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983,225,2,436 - 445.
Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke:
Tabuľka:
| Páku* s bunkovou | IL-13 | Biol. aktivita | Biol. aktivita |
| líniou B9 | ng/el | ng/«l | špecifická |
| kontrola | 500 | 500 | 100 |
| arginin | 3 200 | 1 376 | 43 |
| guán i d í n | 4 300 | 1 098 | 25 |
Uvedené výsledky ukazujú, že špecifická biologická aktivita arginínového extraktu je už pred akoukoľvek inou následnou čistiacou operáciou vyššia ako aktivita guanidínhydrochloridového extraktu.
Príklad 3
Extrakcia periplazmatického hGH baktérie E. coli z bunkovej usadeniny za prítomnosti arginínu
Kmeň SEBR 1250 (EP 360 641 a EP 356 335) bol predpestovaný cez noc pri teplote 37 °C za miešania 200 ot./minútu v kultivačnom médiu L (Luria broth) so 100 mg/1 ampicilínu. Touto predpestovanou kultúrou bola naočkovaná iná banka so živným roztokom L tak, aby počiatočná D.O. sa rovnala 0,2. Po hodinovom zotrvaní bola kultivácia indukovaná pomocou 1 mM IPTG a pokračovala ešte 3 hodiny. Vzorky bakteriálnej suspenzie boli odstredené a usadeniny baktérií takto získané boli suspendované v extrakčnom pufre tak, aby sa konečná D.C. rovnala 10, čo zodpovedá 4,5 g biomasy/liter vo chvíli extrakcie.
Extrakčné podmienky boli nasledovné:
| Chaotropické činidlo | pH | T | ČM |
| Argínín 0,8 N | 8.0 | 22 *C | 20 hodín |
| Arginín 0.8 N | 8.0 | 4 *C | 20 hodín |
Kvôli zmeraniu účinnosti extrakcie boli odobrané vzorky zodpovedajúce 1 ml kultivačnej suspenzie s D.O. 0,2 a príslušné bakteriálne usadeniny po odstredení pri 5000 g počas 10 minút. Boli nanesené na polyakrylamidový gél 16,5 % po denaturácii v SDS. Bakteriálne suspenzie boli rovnako centrifogované a ich supematant bol nanesený na gél. Samotný gél bol vyvolaný pomocou „Westem Blot“ s použitím protilátky anti-hGH a kvantifikovaný na Phosphorimager (Molecular Dynamics). Protilátky anti-hGH, ktoré boli použité, boli získané imunizáciou králikov.
SK 281946 Β6
Rozbor pásiem získaných pomocou Phosphorimager dovoľuje záver, že extrakcia ľudského periplazmatického hGH produkovaného Escherichia coli za prítomnosti arginínu, je účinná. V tomto príklade bol dosiahnutý výťažok extrakcie prinajmenšom 60 %, a to za prítomnosti arginínu v množstve 0,8 M pri pH 8,0 a teplote 22 °C pri čakacom čase 20 hodín. Vyšší výťažok extrakcie okolo 80 % môže byť dosiahnutý za prítomnosti arginínu v množstve 0,8 M, pH 8,0, teplote 4 °C a čase 20 hodín.
Pretože hGH je proteín hydrofilný, je možné vysloviť záver, že prírodné rekombinantné proteíny, ktoré sú veľmi rôznorodé a sú kumulované v periplazmate E. coli, môžu byť jednoducho extrahované za prítomnosti arginínu.
Príklad 4
Extrakcia periplazmatického IL-13 z E. coli z bunkovej drviny za prítomnosti arginínu
1. Kultivácia vo fermentore
V tomto príklade bol použitý kmeň E. coli TP2339 (EP 360 641 a EP 356 335), transformovaný plazmidom p922, získaným podľa postupov, analogickým tým, ktoré sú uvedené v príklade 1.
Kmeň E. coli TP2339/p922 bol vnesený do živného prostredia L s ampicilínom 100 mg/liter a ponechaný pri 30 °C za miešania, aby sa vytvorila predkultúra. Z tejto predkultúry bolo odobraných 100 ml a použitých na naočkovanie fermentora s celkovým objemom 2,5 litra so živným prostredím i definovanými podmienkami.
Fermentačné prostredie - kmeň E. coli TP2339/p922
Pre predbežný finálny objem 1,2 litra bolo živné prostredie vytvorené prídavkom jedného litra fázy autoklávovanej a 0,1 litra fázy filtrovanej, ktorých zloženie je opísané a 0,1 litra definovanej predkultúry.
1. Autoklávovaná fáza
Rozpustiť v 900 ml vody Milli-Q
Hmotnosť/liter
| tricín | 360 mg |
| FeSO4,7 H2O | 280 mg |
| CaCl2,2 H2O | 6,7 mg |
| MgCl2,6 H2O | 1,27 g |
| K2SO4 | 8,71 g |
| NaCl | 500 mg |
| KC1 | 5g |
| Hy-Case(SF) | 25 g |
| výťažok z kvasníc | 18 g |
| stopové prvky | 1 ml |
| L-arginín | 1,5 g |
Roztokom KOH sa upraví pH na hodnotu 7,4, a potom sa doplní na objem 1000 ml vodou Milli-Q. Autoklávuje sa 30 minút pri 120 °C.
2. Fáza filtrovaná
Sterilná filtrácia na membráne 0,2 pm: glukóza20 g glycerín50 g
K2HPO45 g
V priebehu kultivácie má byť koncentrácia glukózy udržiavaná na hodnote medzi 5 a 15 g/liter.
Keď bola dosiahnutá hodnota D.O. = 40 (cca 16 g suchej látky/liter), sa začala expresia prídavkom IPTG (1 g/1) a bola vykonávaná 5 hodín. Parametre kultivácie boli nasledovné:
pH = 7,4
T = 37°C pO2 = 50 mbarov bol regulovaný miešaním prúdom vzduchu v rozmedzí množstve 1 až 3 litre/minúta.
2. Získanie a mletie bakteriálnych tiel
Jeden liter kultivačnej suspenzie bol centriíúgovaný 20 minút na cca 6400 g. Usadenina bola vnesená za miešania vrtuľovým miešadlom do rovnakého objemu pufra Tris 10 mM s EDTA 1 mM, pepstatínu 1 mg/liter a pri pH 8.
Drvenie bolo uskutočnené v lise Manton - Gaulin pri tlaku 700 barov dvoma pasážami. Drvina sama osebe môže byť v prípade podľa tohto príkladu uchovávaná pri -80 °C.
3. Extrakcia
Po rozmrazení bolo odobraných 5 ml drviny s optickou denzitou D.O. = 75 (30 g suchej látky/liter) a centrifúgované 50 minút na 23 300 g.
Takto získaná usadenina bola vybraná do jednej tretiny počiatočného objemu pufrom Tris 0,1 mM, pH 7,0, potom bolo doplnené na pôvodný objem roztokom obsahujúcim arginín a to tak, aby výsledná koncentrácia arginínu bola 2,5 M a pH 8,0.
Pre tento príklad bol k arginínu pripojený pomocný detergent (Hecameg na finálnu koncentráciu 20 g/liter).
Suspenzia bunkovej drviny takto vzniknutej bola umiestnená do rotačnej trepačky (300 otáčok/minúta) na dva dni pri 4 °C.
Potom bola suspenzia centrifiigovaná naposledy 50 minút pri 23 300 g a supematant tvoril očakávaný extrakt.
4. Biochemické analýzy a biochemická aktivita
a) Stanovenie úhrnu všetkých proteínov bolo uskutočnené metódou „Protein Assay“ Biorad.
b) Metóda stanovenia IL-13 rekombinovaného je rovnaká ako v príklade L
Výťažok IL-13 takto získaného extrakciou
Získané výsledky sú zhrnuté do nasledujúcej tabuľky:
V tomto príklade bolo konštatované, že uskutočnená extrakcia bunkovej drviny za prítomnosti 2,5 M arginínu a pomocného detergentu umožňuje získať extrakčný výťažok okolo 70 %.
Príklad 5
Expresia IL-13 za prítomnosti arginínu v kultivačnom prostredí
Kmeň E. coli RB 791/p922 bol kultivovaný v živnom prostredí L obsahujúcom ampicilín v množstve 100 mg/liter za prítomnosti rôznych koncentrácií arginínu.
SK 281946 Β6
Indukcia sa začala 1 hodinu po naočkovaní prídavkom 1 mM IPGT a kultivácia pokračovala ešte 3 hodiny.
Vzorky bakteriálnych usadenín ekvivalentné 1 ml kultivačnej suspenzie s optickou denzitou D.O. - 0,2 a vzorky zodpovedajúcich supematantov boli nanesené na gel, vyvolané a kvantifikované opísanými postupmi. Výsledky predstavuje nasledujúca tabuľka.
| Vzorka | D.O. Koniec kultivácie | TL-13 v ng/1. D.O. 1 |
| purovnávucia vzorka | 1.17 | 388 |
| Arginin 2 g/1 | 1.24 | 455 |
| ArginJn 4 g/1 | 1.24 | 600 |
| Arginin β g/1 | 1 | 720 |
Je zrejmé, že za pokusných podmienok a pri uvažovanom systéme expresie:
- arginin badateľne zvyšuje expresiu periplazmatického IL-13 a to z 2 g/liter na 4 g/liter,
- rast baktérii sa spomaľuje pri koncentrácii 8 g/liter,
- pri týchto koncentráciách arginin nespôsobuje prestup IL-13 do supematantu.
Dôležitosť arginínu v extrakčnom procese podľa vynálezu spočíva v schopnosti využiť proteínové extrakty samé osebe alebo po minimálnej úprave pri testovaní biologickej aktivity.
Toto zjednodušenie extrakčnej metódy prináša výhodu tak pre priemyselnú výrobu rekombinovaných plazmatických proteínov, ako pre triedenie tým, že sa stanoví biologická aktivita v laboratórnom meradle. To sa týka napr. mutovaných proteínov.
Na rozdiel od guanidínhydrochloridu, ktorý je často používaný ako extrakčné činidlo, arginin nepôsobí agresívne na materiály používané v priemysle, hlavne na oceľ. Arginín nie je ani znečisťovadlo, takže jeho použitie nevyžaduje nákladnú úpravu odpadu.
Výhodný spôsob expresie periplazmatického proteínu za prítomnosti arginínu pri koncentráciách rovnajúcich sa najmenej 2 g/liter a hlavne pri koncentráciách v rozmedzí 2 g/liter až 10 g/liter púta na seba pozornosť vzrastom výťažku vylučovaného rekombinovaného proteínu získaného in vivo.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecná informácia:
(1) Ukladateľ (A) meno: SANOFI (B) Ulica: 32-34 Rue Marboeuf (C) Mesto: Paríž (E) Zem: Francúzsko (F) PSČ: 57008 (G) Telefón: 53 77 41 31 (H) Fax: 53 77 42 16 (ii) Názov vynálezu: Spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov (iii) Počet sekvencií: 1 (iv) Čítací spôsob pre počítač:
(A) Typ nosiča: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Systém prevádzky: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, Verzia # 1.25 (OEB) (2) Informácia o sekvencií ID č. 1 (i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 4410 základných párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jednoduché (D) Konfigurácia: lineárna (ii) Typ molekuly: ADN (genomická) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 1:
TCGACTGQCT TTGAOOCGAT CACACTTCTQ TTAACGCAGA ACCTAAACGC ATCTCGACTG60
CACOCTGCAC CAATCCTTCT GOCCTCAGGC AGCCATCCGA ACCTCTGGTA TMCTCTGCA120
GGTCGTAAAT CACTOCATAA TTCOTGTCOC TC/AGOCGCA CTCCCGŤTCT GCATAATGTT180 rrrrccoccc acatcataac cgttctoxa aatattctoa aatcagctgt ttccagctgazío
CTCACTGITC CTTATATTAC ATCOATAGCO TATAATGTOT GGAATTGTCA CCGGATAACA}0G
ATTTCACACA GTTTTTCGCG AASAAQGAGA TATACATATG AAAAAGATCC TGGCGTTAGC}6O
TGCGCTCACT ACCGTTGTAT TCTCTOCGTC CGCCTTCCCT QOCCCTOTOC CTCCCAGTAC420
TGCCCTCAÚG GAGCTCATTG ACCAGľTGCT CAACATCACC CACAACCAGA AGGCTCCCCT480
CTGCAATOGC AOCATCCTAT GGACCATCAA CCTGACACCT GGCATOTACT GTOCAGCCCT540
GCAATCCCTG ATCAACGTúT CAGCCTCCAG TGCCATCGAG AAGACCCAGA GGATCCTGAG600
CGCATTCTOC CCGCACAACG TCTCAGCTGC GCACTTTTCC AGCTKCATC TCCGACACAC660
CAAAATCGAG GKJ3CCCACT TTGTAAAGQA CCTQCTCTTA CATTTAAAGA AACTTTT7CG720
CGAGCGACGC TTCAACTGAA ACTTCGAAAC CATCATTATT TCCCATCCGC CTGCTAACAA780
AOCCCGAAAG GAAGCTGAOT TOGCTOCTCC CACCGCTGAG CAATAACTAG CATAACCCCTWO
TGCCCCCTCT AAACGCGTCT TGACCQC1TT TTTGCTCAM GGACGAACTA TATCCGGAT3900
TACCAAOCTT OOCCOGATCA AAGTmOTC OTCTľTCCAG ACGTTAGTAA ATGAATTTTC960
TCTATGAGOT TTTGCTAAAC AACTTTCAAC AOTCTCAGCG GACTGAGAAT ACAAAGGAAC1020
AACTAAAGGA ATTGCGAATA ΑΤΑΑΤΓΤΤΤΤ CACOTTCAAA ATCTCCAAAA AAAAAG3CTC1030
CAAAAOQAOC CTTTAATTCT ATOGTTTAT CAGCTTGCTT TCGAGOTGAA TJ'IVITAAAC1140
AGCTTOATAC CGATAGTTQC GCCGACAATO ACAACAACCA TCGCCCACGC ATAACCGATA1200
TATTCGOTCG CTGAGCCTTG CAGGGAGTCA AAGGCCGCTT TTGCGGGATC GATCCQCGGA1260
AOCATAAAffľ (TAAAOCCTO OOOTCCCTAA TQAGTpAGCT AACTCACATŤ AATTGCGTTO1320
CGCTCACTĎC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTOTCGTGCC AGCTOCATTA ATOAATOjCC1330
CäACGCCCGG GGAGACGCGG TTTGCGTATT CGCCCCCACC ΟΤΟΟΤΠΤΓύ ITITCACCAG144Q
TÚAGACOGGC AACAGCTOAT ľGCCCTTCAC COCCT0GCCC TOAGAGACTT OCAGCAAGCGI5OO
GTCCACGCTC CTTTCCCCCA CCAGCCCAAA ATCCTCTTTC CTOCTCOTA ACCCCOGGAT1560
ATAACATGAG CTtľTCTTCGG TATCOTCOTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG1620
CAGCCCGGAC TCGCTAATGG COČGCATTCC CCCCACCCCC ATCTCATCCT TGCCAACCAG1680
CATCCCACTG QGAACOATGC CCTCATTCAC CATTTGCATG Cll.GlfGAA AACCGGACAT1740
OGCACTCCAG TCOCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTCAATT 7GA1TGCGAG TGAGATATTT1800
ATGCCAGCCA GCCAGACGCA GACGCCCCGA GACAGAACTT AATGCGCCCG CTAACAGCGC1860
GATrroCTGO toacccaato cgaccagatg ctccacgccc agtcgcotac cgtcttcatg1920
GCAGAAAATA atactcttga TCCCTGTCTG GTCAGAGACA TCAACAAATA ACGCCCGUC19ΘΟ
ATTAGTOCAG QCAGCTTCCA CAOCAATGOC ATCCTCGTCA TCCACCGGAT AGTTAATCAT2040
CAGCCCACTG ACXGTTOCC CGAGAAGATT GTOCACCGCC CCTHACAGG CTTCQACGCC2100
GCTTCGTTCT ACCATCGACA CCACCACCCT GGGACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT2160
CGCCGCGACA AHTOCGACC GCOCCTGCAC GGCCACACTC GAGCTGGCAA COCCAATCAO2220
CAACQACTGT TTOCCCOCCA GTTGTTCTGC CACGCCCTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC2280
CATCOCCOCT TCCACTTm CCCGCGTTTT COCAQAAACO TQGCTOGCCT GGTTCACCAC2340
GCGCGAAACG CTCTGATAAG ACACACCGGC ATACTCTOCG ACATCGTATA ACGTTACTÚC2400
TTTCACATTÚ ACCACCCTCA ATTOACTCTC TTCCGGGCGC TäTCATGCCA TACCGCCAAAJ46O
Gb'ľľľľGCGC CATTCGATCT ACGCCGGACG CäTCGTGGCC GCAAACCAAC CCTTOGCAGA2520
ACATATCCAT CGCGTCCGCC ATCTCCAGCA CCCCCACGCG GCKATCTCO COCCGCCTTC2580
CTGOCGTTTT TCCATAOGCT CCCCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT2640
CAGAOGTCOC GAAACCCGAC AOGACTATAA AGATACCAGG CCTHCCCCC TGGAAGCTCC2700
CTCGTQCGCT CTCCTGTTCC GACCCT5CCO CTľACCOCAT ACCTCTCCCC CTTTCTCCCT2760
TCGGGAACCG TGOCGCTITC TCAATGCTCA CGCTGTAOOT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC2820
CTTCGCTCCA AGCTCGCCrc TGTGCACGAA CCCCCCCTTC AGCCCCACCG CTGCGCCTTA2880
TCCCGTAACT ATCGTCTTGA GľCCAACCCG GTAAGACACC ACTTATCGCC ACTGCCAGCA2$4O
GCCACTCGTA ACAGGATTAG CAGACCGAOC TATGTAGGCG GTQCTACAGA VnVJTUAAC3000
TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAACG ACACTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTQAAGJ060
CCACTTACCT TCGGAAAAAG AGTTOCTAGC TCTTGATCCG OCAAACAAAC CACCGCTGGT3120
AGCGGTCCTr TlTITCrrre CAAGCAGCAG attacgcgca CAAAAAAACG ATCTCAAGAA3180
GATĽtľťTGA TCHTTCTAC OOOGTCTGAC GCTCAOTOGA ACGAAAACTC ACCTTAAGGC3240
ATmGGTCA TCACATTATC AAAAAOGATC TTCACCTAGA ΤΟΟΓΠΤΛΑΑ TTAAAAATSA3300
ΑσΠΤΓΑΑΑΤ CAATCTAAAG TATATATCAG TAAACrTGCT CTCACAGTTA CCAATOCTTA3360
ATCAGT3ACG CACCSKTCTC AGCGATCTST CTATTTCGrr CATCCATWJT TOCCTGACTC34» cccgtcgtgt agataactac oataccggag gocttaccat ctogccocag tgctgcaatc3M0 ataccgcgag acccacgctc acccgctcca GATTTATCAG caataaacca GCCAGCCGGA3540
ACGGCCGACC GCAGAAGTGG tcctgcaact ttatccgcct CCATCCAGTC TATTAATTGT3600
TGCCGOGAAG CTAGACT/AG TACTTCGCCA GTTAATACTT TGCGCAACOT TOTTOCCATT3660
GCTGCAGGCA TCGTGOTCTC ACCCTCCTCC TlľGUťATCC CTTCATTCAG CTCCOGTTCC3720
CAACGATCAA GOCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA AAAAAOEGT TAGCTCCTTC3780
GGTCCTCCGA TCOTTGTCAG AAGTAAGTrC QCCGCAGTGT TATCAC1CAT GOTTATCGCA3840
GCACTGCATA ATTCTCTTAC TOTCATGCCA TCCGTAAGAT GCmTCTGT GACTGGTCAG3900
TACTCAACCA ACTCATTCTG AGAATAGTGT ATCCGGCGAC CGAGrTOCTC TTGCCCOOCG3?60
TCAACACG6G ATAATACCOC CCCACATACC ACAACTTTAA AAGTGCTCA? CATTCGAAAA4020
CCTTCTtCGC CeCCAAAACT CTCAAGCATC ITACCGCtCT TGAGATCCAC TfeOATffTAA4080
CCCACTCCTC CACCCAACTG ATCITCAGCA ΊΧΤΠΤΑΟΤΓ TCACCAGCGT TTCTGGGTGA4140
GCAAAAACAC GAAGGCAAAA TOXGCAAAA AAGGGAATAA OOGCGACACG GAAATGTTGA4200 atactcatac TCTTccnrr tcaatattat tgaagcattt atcaggctta rroTcrcATC4260
AGCGGATACA TATHGAATG ΤΑΤΤΓΑΟΛΑΑ AATAAACAAA TAGGGGIľCC GCQCACAITTA 320
CCCCGAAAAG TCCCACCTCA CGTCTAAGAA ACCATTATTA TCA7GACATT AACCTATAAA«380
AATAGGCGTA TCACGAGGCC CTTTCGTCCC4410
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (6)
1. Spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov, vyznačujúci sa t ý m , že bunková usadenina, pochádzajúca z kultivácie prokaryotických mikroorganizmov, transformovaných pomocou vektora expresie, ktorý obsahuje gén kódujúci príslušný proteín a prostriedky na jeho expresiu v periplazme, sa suspenduje v roztoku pufta, obsahujúcom arginín a príslušný proteín sa izoluje zo supematantu takto získanej bakteriálnej suspenzie.
2. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa v roztoku pufra, obsahujúcom arginin, suspenduje usadenina bunkovej drviny z buniek pochádzajúcich z kultivácie prokaryotických mikroorganizmov, trans8 formovaných pomocou vektora expresie, ktorý obsahuje gén kódujúci príslušný proteín a prostriedky na jeho expresiu v periplazme.
3. Spôsob podľa nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým,že sa bunková usadenina suspenduje vo vodnom alkalickom roztoku s koncentráciou arginínu najmenej rovnajúcou sa 0,4 M.
4. Použitie arginínu ako činidla na extrakciu periplazmatických rekombinantných proteínov.
5. Spôsob kultivácie prokaryotických mikroorganizmov, transformovaných pomocou vektora expresie, ktorý obsahuje gén kódujúci príslušný proteín, vyznačujúci sa tým, že sa kultivácia vykonáva za prítomnosti arginínu s koncentráciou najmenej rovnajúcou sa 2 g/liter.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m , že sa kultivácia vykonáva v prítomnosti arginínu s koncentráciou v rozmedzí 2 g/liter až 10 g/liter.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501083A FR2729972B1 (fr) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10696A3 SK10696A3 (en) | 1996-09-04 |
| SK281946B6 true SK281946B6 (sk) | 2001-09-11 |
Family
ID=9475667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK106-96A SK281946B6 (sk) | 1995-01-31 | 1996-01-25 | Spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5700665A (sk) |
| EP (1) | EP0725140B1 (sk) |
| JP (1) | JP3005464B2 (sk) |
| KR (1) | KR100401028B1 (sk) |
| CN (1) | CN1132842C (sk) |
| AR (1) | AR000831A1 (sk) |
| AT (1) | ATE250132T1 (sk) |
| AU (1) | AU700509B2 (sk) |
| BR (1) | BR9600270A (sk) |
| CA (1) | CA2168382C (sk) |
| CZ (1) | CZ286509B6 (sk) |
| DE (1) | DE69629965D1 (sk) |
| EA (1) | EA000017B1 (sk) |
| FI (1) | FI960427A (sk) |
| FR (1) | FR2729972B1 (sk) |
| HU (1) | HU222598B1 (sk) |
| IL (1) | IL116973A0 (sk) |
| MX (1) | MX9600380A (sk) |
| NO (1) | NO316519B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ280919A (sk) |
| PL (1) | PL183598B1 (sk) |
| SK (1) | SK281946B6 (sk) |
| TW (1) | TW403760B (sk) |
| UA (1) | UA27997C2 (sk) |
| ZA (1) | ZA96734B (sk) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1048732A1 (de) | 1999-04-26 | 2000-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen |
| KR20010056451A (ko) * | 1999-12-15 | 2001-07-04 | 윤재승 | 아르기닌이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물 |
| EP1585574A4 (en) * | 2002-12-20 | 2006-04-26 | Cardiac Inv S Unltd Inc | DEVICE AND METHOD FOR IMPLANTING LEFT-VATRICULAR PIPE MACHINE IN KORONARSINUS |
| DE602007012412D1 (de) * | 2005-12-22 | 2011-03-24 | Genentech Inc | Rekombinante produktion heparinbindender proteine |
| WO2008008975A2 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Genentech, Inc. | Refolding of recombinant proteins |
| GB201107737D0 (en) | 2011-05-09 | 2011-06-22 | Univ Birmingham | Extraction from cells |
| JPWO2022191223A1 (sk) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 | ||
| WO2022201917A1 (ja) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | 株式会社カネカ | 大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 |
| CN113249391A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-13 | 江苏坤力生物制药有限责任公司 | 一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6244198A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-02-26 | Toray Ind Inc | 有用タンパク質の生産方法 |
| JPS6251983A (ja) * | 1985-09-02 | 1987-03-06 | Hagiwara Yoshihide | ヒト／ヒト・ハイブリド−マ培養用無血清培地 |
| JPH0672105B2 (ja) * | 1985-10-02 | 1994-09-14 | 持田製薬株式会社 | 血栓溶解剤及びその製法 |
| DE3537708A1 (de) * | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
| JP2769541B2 (ja) * | 1987-06-24 | 1998-06-25 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 平衡型構成誘導性転写系 |
| FR2636644B1 (fr) * | 1988-08-24 | 1990-12-28 | Sanofi Sa | Sequence d'adn participant a la regulation de l'expression d'une sequence d'adn codant pour un precurseur d'un polypeptide, vecteurs d'expression et procede de production periplasmique du polypeptide |
| PT100580A (pt) * | 1991-06-12 | 1993-09-30 | Regeneron Pharma | Producao e recuperacao de neurotrofinas recombinantes |
-
1995
- 1995-01-31 FR FR9501083A patent/FR2729972B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-01-25 SK SK106-96A patent/SK281946B6/sk unknown
- 1996-01-26 EA EA199600001A patent/EA000017B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 MX MX9600380A patent/MX9600380A/es unknown
- 1996-01-29 DE DE69629965T patent/DE69629965D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-29 UA UA96010341A patent/UA27997C2/uk unknown
- 1996-01-29 AT AT96400201T patent/ATE250132T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-29 EP EP96400201A patent/EP0725140B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 CA CA002168382A patent/CA2168382C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-30 AR ARP960101196A patent/AR000831A1/es unknown
- 1996-01-30 HU HU9600209A patent/HU222598B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 PL PL96312543A patent/PL183598B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 NO NO960396A patent/NO316519B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 KR KR1019960002120A patent/KR100401028B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 BR BR9600270A patent/BR9600270A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-30 FI FI960427A patent/FI960427A/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 JP JP8015273A patent/JP3005464B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 AU AU42244/96A patent/AU700509B2/en not_active Ceased
- 1996-01-31 IL IL11697396A patent/IL116973A0/xx unknown
- 1996-01-31 TW TW085101206A patent/TW403760B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 CZ CZ1996290A patent/CZ286509B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 US US08/594,469 patent/US5700665A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 ZA ZA96734A patent/ZA96734B/xx unknown
- 1996-01-31 CN CN96105578A patent/CN1132842C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 NZ NZ280919A patent/NZ280919A/en unknown
-
1997
- 1997-08-06 US US08/906,957 patent/US5856142A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2651747C (en) | Production of isoprenoids | |
| CA1341361C (en) | Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells | |
| US5922583A (en) | Methods for production of recombinant plasmids | |
| KR960016560B1 (ko) | 인체 과립구 콜로니 자극인자 폴리펩타이드 유도체, 이를 코드화하는 dna, dna를 함유하는 재조합 플라스미드, 플라스미드를 함유하는 미생물 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법 | |
| EP1828239B1 (en) | Fgf18 production in prokaryotic hosts | |
| US20040191865A1 (en) | Direct expression of peptides into culture media | |
| JPH0665305B2 (ja) | 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法 | |
| KR950001992B1 (ko) | 배양된 세포내에서 바쿨로바이러스 벡터를 이용한 펩타이드의 제조방법 | |
| JPH0659218B2 (ja) | Ｄｎａ導入ベクタ− | |
| CN109996874A (zh) | 10-甲基硬脂酸的异源性产生 | |
| NZ581702A (en) | Follicle stimulating hormone producing cell clone | |
| SK281946B6 (sk) | Spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov | |
| JPH0787788B2 (ja) | イソペニシリンｎ合成酵素をコ−ドしているｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクタ− | |
| RU2354702C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS11, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК-ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS11, ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS11 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| CN113025599A (zh) | 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用 | |
| CN1346407A (zh) | 胰羧肽酶原b、其同工型和突变蛋白的制备及应用 | |
| EP0405858B1 (en) | Control of aberrant expression vector accumulation during fermentation procedures | |
| RU2376368C2 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS21 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| SU1703690A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека | |
| NO864206L (no) | Derivat av interleukin-2, dets fremstilling og anvendelse. | |
| FI65447C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en bakterie som innehaolleren foer tillvaexthormon kodande nukleotidsekvens | |
| JP2632680B2 (ja) | ブリ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミド | |
| FI74732C (fi) | Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en nukleotidsekvens som kodar foer tillvaexthormon. | |
| CA2224777A1 (en) | New immunoregulatory protein lst-1 |