NO316519B1 - Fremgangsmåte for ekstraksjon av periplasmatiske proteiner fra prokaryote mikroorganismer og anvendelse av arginin som middel for ekstraksjon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for ekstraksjon av periplasmatiske proteiner fra prokaryote mikroorganismer og anvendelse av arginin som middel for ekstraksjon

Det skjer en økende bruk av genetisk manipulenngsteknikk for fremstilling av aktuelle proteiner, som for eksempel insulin, lnterleukiner, veksthormoner og lignende

Generelt transformeres mikroorganismer ved hjelp av en ekspresjonsvektor inneholdende et gen som koder for det aktuelle protein og for nødvendige anordninger for dets ekspresjon, så som regulatorsignalene Mikroorganismen dyrkes deretter under passende dyrkningsparametere i et passende dyrkmngsmedium, og når et tilstrekkelig antall mikroorganisme-celler er oppnådd, utløser tilsetning av en inducer den såkalte ekspresjonsfase, hvorunder det ønskede protein dannes i høyt utbytte og akkumuleres Etter fullført dyrkning separeres cellene i suspensjonen fra dyrkmngsmediet, for eksempel ved sentnfugenng eller mikrofiltrenng, og underkastes deretter en ekstraksjon som ofte begynner med en operasjon hvor mikroorganismenes vegger sprenges

Ekspresjonen av et gen som koder for et aktuelt protein i en prokaryot mikroorganisme kan være cytoplasmatisk, periplasmatisk eller sekretorisk, avhengig av de ekspresjons-anordningers natur som er knyttet til det nevnte gen (promoter, terminator, nbosom-bindingssete, signalpeptid og lignende)

Cytoplasmatisk ekspresjon gjør det mulig å oppnå store mengder proteiner Før ekstraksjonen av det aktuelle protein, er det for proteiner som omfatter en eller flere disulfid-broer, imidlertid nødvendig å foreta et denaturenngs/renaturenngs-tnnn, noe som under produksjon i industriell skala representerer et spesielt tungvint og omstendelig tnnn Denaturenngs/renaturenngs-tnnnet foretas tradisjonelt i henhold til metoder som er velkjent for fagmannen, ved å benytte et denaturenngsmiddel i nærvær av et reduksjonsmiddel, og som etterfølges av renaturenngsbetingelser som særlig innebærer en overvåkning av løsningens redoks-tilstand Blant anvendte denaturenngsmidler skal særlig nevnes guanidinhydroklorid, som har vært foreslått i en fremgangsmåte for å oppnå humant interleukin-2 I denne sammenheng henvises for eksempel til dokumentet EP-A2-0 145 390

Med gramnegative bakterier er det som følge av deres lave produktivitet, gjort liten eller ingen bruk av sekretoriske ekspresjonssystemer, hvor det aktuelle protein finnes aktivt i dyrkningsmediet Det skal i denne forbindelse bemerkes at et tett baktenekulturmedium i en bioreaktor ikke er noe ideelt oppholdssted for følsomme rekombinante proteiner, for eksempel på grunn av risikoen for lnterfase-denaturenng

Penplasmatisk ekspresjon gjør det mulig å oppnå rekombinante proteiner som, i prinsippet, er korrekt rephkert, i et rom som er beskyttet mot miljøet og som derfor representerer et riktig valg for å oppnå proteiner, spesielt ikke-glykosylerte proteiner Det er i så fall ikke nødvendig å utsette proteinene for et denarurenngs/reriaturenngs-tnnn

De metoder som generelt benyttes på dette felt for å sprenge celler, er for eksempel cellelyse ved ultralydbehandling eller ved mekanisk trykk (French Pressure Cell, kulemøUe), kjemisk lyse eller enzymatisk lyse, osmotisk sjokk og behandling ved bruk av "chaotropic" nudler eller overflateaktive midler Disse metodene sprenger de fleste cellemembraner inklusivt plasmamembraner og membraner i det endoplasmatiske retikulum under dannelse av en homogen suspensjon av cellebrokker Hvilken natur den oppnådde pellet av celle-brokker som i alminnelighet kan høstes etter senrnfugenng (kjerner, celleskjelett, mitokondrier, lysosomer, ribosomer, makromolekyler og lignende) er avhengig spesielt av tiden og hastigheten av sentnfugenngen (10 minutter ved 1000 g til 3 timer ved 150 000 g)

De vansker som opptrer under ekstraksjonstnnnene varierer med typen av ekspresjon og anvendte ekstraksjonsmetoder, og er særlig

- tap av utbytte av det rekombinante protein

- tap av biologisk aktivitet av det rekombinante protein

- proteolytisk nedbrytning av det rekombinante protein

- ekstraksjonsmidlenes giftighet og dermed forbundne

nødvendige overvåking med henblikk på fjerning

- vanskelighet ved industriell gjennomføring

- blanding av de periplasmatiske proteiner med cyto-

plasmatiske proteiner

Når de produserte aktuelle proteiner er hydrofobe eller ladede, kan de dessuten forbinde seg med cellekomponenter som selv er hydrofobe eller ladede og dermed gjøre ekstraksjon spesielt vanskelig

Det kan oppnås betydelige fordeler ved å foreta den industrielle fremstilling av aktuelle rekombinante proteiner ved genetisk manipulering, men dette nødvendiggjør utvikling av ekstraksjonsmetoder som omgår eller minimaliserer ovennevnte ulemper

I realiteten er det ikke bare viktig å fremstille store mengder av det aktuelle protein, men proteinene må heller ikke være forurenset med ekstraksjonsmidlene og de må bibeholde deres fullstendige biologiske aktivitet

Det har vært foreslått forskjellige metoder for dette formål, spesielt for ekstraksjonen/separasjonen av interleukin-2

Dokumentet EP-A2-0 145 390 beskriver en fremgangsmåte for å oppnå ikke-glykosylert humant interleukin-2 (IL-2) som har en spesifikk aktivitet på mer enn 104 U/mg, som benytter et kolonne-kromatografisk separasjonstnnn for å ekstrahere IL-2 Denne metode innebærer også et denaturenngstrinn ved å benytte guamdinhydroklond

I dokument EP-A2-0 147 819 foreslås en fremgangsmåte for oppnå homogent og rent rekombinant interleukin-2 Fremgangsmåten består i å dyrke en mikroorganisme transformert ved hjelp av en ekspresjonsvektor inneholdende genet som koder for interleukin-2, bevirke at cellene går i lyse, gjenvinne celle-brokkene, ekstrahere IL-2 ved å vaske cellebrokkene med en passende vaskeløsning og deretter rense vaskeløsmngen ved kromatografi De anvendte vaskeløsmnger kan inneholde et salt, som f eks natnumklond eller guamdinhydroklond, eller et overflateaktivt middel, som for eksempel produktet kjent under handelsnavnet "TntonX®-100"

I henhold til en foretrukket variant anbefales suksessiv bruk av tre vaskeløsmnger, nemlig en vaskeløsning inneholdende natnumklond, en vaskeløsning inneholdende et overflateaktivt middel og en vaskeløsning inneholdende guamdinhydroklond

I dokument EP-Al-0 337 243 besknves en fremgangsmåte for å rense humant mterleukm-2 og som gjør bruk av et system av to omvendt-fase væskekromatograflkolonner Før rensetnnnet ved kromatografi ekstraheres den uløselige fraksjon av baktenecelle-lysatet med en løsning inneholdende guamdinhydroklond, for å oppnå et baktene-ekstrakt som så fortynnes ved å benytte guandidinhydroklond-fh buffer og deretter kromatograferes, idet eluenng foretas med en acetonitnl-gradient

Det har nå overraskende vist seg at ekstraksjonen av et aktuelt protein produsert av en prokaryot mikroorganisme, transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende et gen som koder for det aktuelle protein og anordninger for ekspresjon av dette, så som de regulatorsignaler som trengs for dets penplasmatiske ekspresjon, kan foretas ved å suspendere den oppnådde pellet av celler, eller av cellebrokker fra mikroorganismen som sknver seg fra dyrkningen av nevnte mikroorganisme, i en bufferløsmng, hvor nevnte løsning helst inneholder arginin, hvor argimnet kan ha L- og/eller D-form I henhold til et første aspekt vedrører oppfinnelsen anvendelsen av arginin som et middel for ekstraksjonen av periplasmatiske proteiner

I henhold til et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for ekstraksjon av et aktuelt periplasmatisk protein, som består i 1) suspendering av pelleten av celler eller av celle-debns av cellersom skriver seg fra dyrkningen av en prokaryot mikroorganisme som er transformert ved hjelp av en ekspresjonsvektor inneholdende et gen som koder for nevnte protein og anordninger for ekspresjon av dette i nevnte mikroorganismes penplasma, i en bufferløsmng som inneholder arginin, og 2) gjenvinning av det aktuelle protein fra supernatanten av den derved oppnådde baktenesuspensjon

En variant av nevnte metode for ekstraksjonen av et aktuelt periplasmatisk protein består i å suspendere pelleten av cellebrokker oppnådd etter lyse av de cellene som skriver seg fra kulturen, i den arginin-holdige bufferløsmng

Ekstraksjonen av de periplasmatiske proteinene er spesielt effektiv når ekstraksjonsbufferen består av en vandig løsning inneholdende arginin i en konsentrasjon på minst 0,4 M arginin, innenfor løselighetsgrensen av arginin i vann ved romtemperatur (i området 0,8 M i rent vann og høyere i nærvær av salter), og ved svakt alkalisk pH, fortrinnsvis 8

Arginin er en nøytral a-aminosyre som har vært foreslått som et hjelpestoff for denaturenng/renaturenng/substitusjon av to kjeder av Abbokinase®

(unnplasminogenaktivator), hvor en kjede av native peptider under denne prosess delvis erstattes av et syntetisk peptid I denne sammenheng henvises til publikasjonen av G A Homandberg og T Wai i Biochimica et Biophysica Acta, 1990,1038, 209-215

Etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen eller varianten av denne, foretas ingen denaturenng/renaturenng av proteinet, og argimnet deltar kun når det gjelder ekstraksjon av et protein fra en pellet av celler eller cellebrokker fra mikroorganismer

Arginin forårsaker bemerkelsesverdige virkninger på ekstraksjonen av proteinet både med hensyn til utbyttet og den biologiske aktivitet av proteinet Det har faktisk vist seg at for eksempel den modne form av IL-13 gjenvinnes ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, i utbytter høyere enn 95% samtidig som molekylets biologiske aktivitet bibeholdes Det skal bemerkes at forsøk på ekstraksjon ved osmotisk sjokk på det samme ekspresjonssystem, ikke fører til sammenlignbare utbytter

Sammenhgningsforsøk viste at guamdin*HCl benyttet under de samme betingelsene, også gjorde det mulig å gjenvinne IL-13-protein i høyere utbytte enn 95%, men den biologiske aktivitet av det derved gj en vundne protein hadde tatt mer skade enn ved argininmetoden

Selv om det ikke er ønskelig å begrense forståelsen til en eller annen bestemt teori, antas arginin å virke som et mildt og biologisk kaotropisk middel i motsetning til de kraftige kaotropiske midler som virker denaturerende ved de høye konsentrasjoner på 5 M eller mer som trengs for å bevirke ekstraksjon, så som guamdinhydroklond

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, eller van anten av denne, kan gjennomføres ved å følge en hvilken som helst metode for dyrkning av en mikroorganisme transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende et gen som koder for det aktuelle protein og anordninger for penplasmatisk ekspresjon av nevnte protein, så som alle nødvendige regulatorsignaler

For fagmannen vil det være klart at metoden kan anvendes for baktener som er nær beslektet med E coh, hvilket vil si såkalte fakultativt anerobe gramnegative baktener som utgjør Enterobactenaceae-gruppen Innen familien Enterobactenaceae finner man spesielt følgende arter Eschenchia, Salmonella, Erwima og også Shigella, Klebsiella, Serratia, Proteus og Enterobacter

I betraktning av argimns kaotrope karakter er det også klart at arginin, alt etter forholdene, med fordel kan erstatte andre kaotrope midler Selv om det på grunn av diversiteten av de i levende systemer det her er tale om, ikke kan angis eksempler på alle baktenefamilier, vil fagmannen for sitt bestemte formål kjenne til hvorledes argimn-ekstraksjonsmetoden kan anvendes og tilpasses

Slike dyrkmngsmetoder er velkjente for fagmannen Metoder som besknver fermentenng av gramnegative baktener er beskrevet, for eksempel i patentene EP-360 641 og EP-356 335 som omtaler hvorledes E coli-stammene kjent som SEBR 1250 og TP 2339 oppnås og benyttes

Når det ønskede celleantall er nådd, underkastes kulturen en sentnfugenng (i alminnelighet) eller en mikrofiltrenng, og den oppnådde biomasse-pellet bnnges i kontakt med en bufferløsmng som i henhold ul foreliggende fremgangsmåte, inneholder arginin

I alminnelighet foretas prosessen ved en temperatur mellom romtemperatur på ca 25°C og 2°C, fortrinnsvis ved 4°C Kontakttiden mellom cellepelleten og bufferløsmngen som inneholder arginm, må være tilstrekkelig til at det aktuelle protein kan gå over i bufferløsmngen

I alminnelighet er det når prosessen foretas ved 4°C, fordelaktig at kontakttiden er ca 1 time

Ekstraksjonen, hvilket vil si det periplasmatiske proteins passasje over i mediet, fortsetter under det tidsrom hvor biomassen er i kontakt med den argimn-holdige

ekstraksjonsbuffer Den kontakttid som fører til fullstendig ekstraksjon eller til en ekstraksjon som ikke viser noen ytterligere nivåendring, er mellom 30 minutter og 16 tuner Forsøk viser at tilfredsstillende ekstraksjonsutbytter kan oppnås i løpet av noen få timer ved en temperatur på 4°C Det har også vært registrert at forsiktig omrøring av biomassen i ekstraksjonsbufferen for å unngå sedimentering av mikroorgamsme-pelleten, gir bedre resultater, hvilket vil si høyere ekstraksjon som funksjon av tiden

Ekstraksjonsmetoden i henhold til oppfinnelsen er egnet for å ekstrahere både hydrofobe proteiner, som for eksempel interlevkiner, spesielt IL-13, beskrevet i dokumentet EP-A1-0 506 574 og hydrofile proteiner som for eksempel veksthormon (hGH) Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det enklere å oppnå hGH som for ekstraksjon vanligvis fordrer bruk av osmotisk sjokk

For å foreta ekstraksjonen av det aktuelle protein direkte på suspensjonen av cellepelleten, foretrekkes en bufferløsmng som inneholder argmin i en konsentrasjon på mellom 0,4 M og 0,8 M

Når det er ønskelig å foreta ekstraksjonen av det aktuelle periplasmatiske protein på den oppnådde pellet av cellebrokker, i henhold til varianten av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er fremgangsmåten den samme som den som benyttes for metoden ifølge oppfinnelsen opp til det trinn hvor cellepelleten oppnås etter sentnfugermg eller mikrofiltrenng, hvoretter sprengning av cellene foretas etter fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen Metoder for å sprenge celler er beskrevet, for eksempel av C T Choma og H Yamazaki, Can J Microbiol, 1981,27,547-550, L O Ingram, Journal of Bactenology, 1981,146,1,331-336, N G Nossal og L A Heppel, Journal of Biological Chemistry, 1966, 241,13, 3065-3072, R Bennett, DR Taylor og A Hurst, Biochem Biophys, Acta, 18(3), 512-521 (1966), og i oversikten Fermentation and enzyme technology, Kap 12, 239-309, J Wiley & Sons pubhshers (1979)

Den høstede pellet av cellebrokker resuspenderes i alminnelighet etter sentnfugenng og bnnges deretter i kontakt med en bufferløsmng inneholdende arginin Kontakttiden mellom suspensjonen av cellebrokker og bufferløsmng inneholdende arginin, må være tilstrekkelig til at det aktuelle protein går over i bufferløsmngen Ved en temperatur på 4°C utgjør i alminnelighet den kontakttid som bevirker nesten fullstendig ekstraksjon, 48 timer Det ble likeledes registrert at forsiktig omrøring av biomassen i ekstraksjonsbufferen, hvorved sedimentenng av cellematenalet unngås, gir høyere grad av ekstraksjon som funksjon av tiden

Denne variant av ekstraksjonsmetoden ifølge oppfinnelsen, er spesielt egnet for å ekstrahere aktuelle periplasmatiske proteiner som er sterkt assosiert med cellemembranene, som for eksempel interlevkiner

Det vil for fagmannen også være vel kjent at den argimn-holdige ekstraksjonsbuffer i henhold til oppfinnelsen, også kan inneholde et ekstra overflateaktivt middel som vil ha den virkning at det forbedrer utbyttet og/eller ekstraksjonshastigheten av det aktuelle protein Blant de ekstra overflateaktive midler som kan benyttes, vil fagmannen være i stand til å velge slike som gjør det mulig å bibeholde fordelene ved å benytte arginin som ekstraksjonsmiddel, spesielt opprettholdelsen av den biologiske aktivitet av det aktuelle protein Blant disse svake overflateaktive midlene kan nevnes for eksempel alkylglykosider, så som alkylmaltosider, nonyl-a- eller p-D-glykopyranosider, oktyl-o- eller -P-D-glykopyranosider eller alkylkarbamoylmetyl-a- eller -P-D-glykopyranosider som for eksempel Hecameg®, som på grunn av sin lave toksisitet eventuelt kan tillates å forekomme i spor-mengder som formulenngsmiddel i det endelige produkt

For å foreta ekstraksjonen av det aktuelle protein fra suspensjonen av pelleten av cellebrokker, foretrekkes bruk av en bufferløsmng som inneholder argimn i en konsentrasjon på mellom 0,4 M og 2,5 M, hvorved en konsentrasjon på 2,5 M arginin kan oppnås, spesielt i nærvær av salter

Det ble dessuten funnet at argimn bevirker en meget fordelaktig virkning på utbyttet av utskilt, rekombinant periplasmatisk protein dersom det tilsettes ved uvanlige konsentrasjoner, som er betydelig høyere enn de som forekommer i dyrkmngsmedier fremstillet av kommersielle proteinhydrolysater, og som gjør det mulig å dekke argimnbehovene for den anvendte stamme

Dessuten viste det seg at argimnets gunstige virkninger er spesielt betydelige dersom argmmkonsentrasj onene som tilsettes til dyrkmngsmediet, ligger mellom 2 g/L og 10 g/L

Oppfinnelsen vil i det følgende bh beskrevet mer detaljert ved hjelp av de etterfølgende eksempler

EKSEMPEL 1

Ekstraksjon av periplasmatisk IL-13 fra E coli, i nærvær av argimn, på cellepellet 1) Kolbekultur

I dette eksempel ble det benyttet E coli stamme RB 791 (Roger Brent, PNAS 78

(1981) s 4204-4208), transformert med plasmidet p922 oppnådd etter lignende fremgangsmåter som angitt i patentene EP 360 641 og 356 335, hvis DNA-sekvens er sekvens SEKV ID Nr 1

De forskjellige sekvenser som utgjør plasmidet p922, er vist nedenfor

(Plasmid pBR327 er beskrevet i Gene, 9,287-305 (1980))

Denne E coli stamme RB 791/p922 ble etablert i forkultur over natten ved 30°C under omrøring ved 200 rpm på L-medium (Luna-buljong beskrevet i Molecular Clomng, A Laboratory Manual Sambrook, Fntsch, Maniatis, Cold Spnng Harbor Laboratory Press, 2 utg 1989) inneholdende 100 mg/L ampicillin Fra denne forkultur ble en ytterligere kolbe med L-medium inokulert slik at den initiale OD (OD = optisk tetthet ved 600 nm, OD = 1 tilsvarer 400-450 mg biomasse/liter) var 0,6 Etter en ventetid på 1 time ble kulturen indusert med 1 mM IPTG (isopropyl-p-D-1-itogalaktopyranosid) og dyrkingen fortsatt 13 timer Prøvene av baktenesuspensjonen ble sentrifugert og de oppnådde baktenepellets suspendert i de nedenfor angitte ekstraksjonsbuffere, slik at den endelige OD var 10, hvilket tilsvarer 4,5 g biomasse/liter ved ekstraksj onsndspunktet

Ekstraksjonsbufferne benyttet i dette eksempel er følgende

A 0,8 M argimn pH 8,0 korrigert med HC11 milli-Q® vann

(Millipore)

B 5 M guamdin*HCl i Milli-Q® vann uten pH-korngenng

Ekstraksjonen ble foretatt 11 time ved 4°C under forsiktig magnetomrønng

For å måle ekstraksj onse ffekti vi teten ble det uttatt prøver tilsvarende 1 mL kultursuspensjon med en OD på 0,2, og de tilsvarende baktenepellets som ble oppnådd ved sentnfugenng ved 5 000 g 110 minutter, ble avsatt på 16,5% polyakrylamidgel etter denaturenng med SDS Baktenesuspensjonene ble også sentrifugert og de respektive supematanter avsaltet ved ultrafiltrenng (Millipore Ultrafree-MC filtrenngsapparat med en cut-off-terskel på 5 000 Da) før påsetting på gelen Selve gelen ble gjort synlig ved western-blotting ved å benytte et anti-CHO IL-13 antistoff og den kvantitative bestemmelse foretatt med en Phosphorlmager® (Molecular Dynamics) Anti-CHO- (Chinese hamster ovary)IL-13 antistoffet benyttet i dette eksempel, ble oppnådd ved å immunisere kaniner

Det ble i dette eksempel fastslått at ekstraksjon i nærvær av guamdin*HCl eller alternativt i nærvær av argimn, praktisk talt er fullstendig for den modne form, i begge tilfeller med ekstraksj onsutbytter høyere enn 99% Det ble også registrert at forløperformene av IL-13 ikke forekom i supernatanten ekstrahert i nærvær av argimn, i motsetning til ekstraktet oppnådd i nærvær av guanidin*HCl

2) Fermentorkultur

E coh-stammen RB 791/p922 ble etablert på L-medium med 100 mg/L ampicilhn og inkubert ved 30°C under omrønng for å danne en forkultur Et 100 mL volum av denne forkultur ble benyttet som lnokulum for en fermentor av merke MBR med et totalvolum på 2,5 liter Dyrkingen ble foretatt i et volum på 1,2 liter på et medium med nedenfor angitte sammensetning og under betingelsene angitt nedenfor

Medium for fermentor - E coli stamme RB 791/p922

Angivelsene gjelder 1 liter sluttvolum, idet lnokulum-volumet må trekkes fra

1 O ppløs i 700 mL Milli- 0®- vann

Fyll opp til 800 mL med Milh-Q®-vann, autoklaver i 30 min ved 120°C

2 Filtrer gjennom 0. 2 om 1100 mL Milh- Q®- vann

Glycerolkonsentrasjonen opprettholdes mellom 10 og 15 g/L under dyrkningen

3 Tilsett ved tidspunktet for induksjon

Volumet av denne tilsetning er ikke inkludert i de øvrige beregningene

<*> Løsning av sporelementer

Denne benyttes i forholdet 1 mL/hter

For et sluttvolum på 1 liter av Milh-Q®-vann, løs opp 1800 mL

Tilsett 100 mL konsentrert HC1 Fyll opp til 1000 mL med Milh-Q®-vann

Etter at OD nar nådd 58, utløses ekspresjonen av IL-13 ved tilsetning av 1PTG i en konsentrasjon på 1 g/L og fortsettes 15 timer

Fermentorkultur-parameterne var som følger

pH = 7,4

T = 30°C

p02 = 40 mm Hg regulert under omrøring, med en luftstrøms-

hastighet på mellom 1 og 3 liter/min

Metodene som benyttes for ekstraksjon og måling av den biologiske aktivitet er som beskrevet ovenfor under avsnitt 1

Det ble fastslått at ekstraksjon foretatt på en baktenepellet oppnådd i en fermentor, og ikke i en kolbe, i nærvær av guanidinsHCl, eller alternativt i nærvær av argimn, praktisk talt er fullstendig for den modne form av IL-13, i begge tilfeller med ekstraksjonsutbytter på mer enn 97%

EKSEMPEL 2

Biologisk aktivitet av det således ekstraherte IL-13

Ekstraktene oppnådd i nærvær av guamdin*HCl eller arginin i Eksempel 1, ble avsaltet ved ultrafiltrenng som ovenfor beskrevet Etter senefortynmng ble de bragt i kontakt med en IL-13-avhengig subklon av B9-cellehnjen IL-13-akbviteten av de fortynnede prøvene induserer veksten av B9-celler, og halv-prohferasjonskonsentrasjonen ble bestemt Celleveksten ble stanset etter 3 dagers kontakt ved tilsetning av MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazohumbromid) og absorpsjonen av blåfarven målt ved 565 nm i et spektrofotometer Den biologiske IL-13-aktivitet ble uttrykt i nanogram/mL i forhold til en IL-13-standard som selv ble kalibrert mot den internasjonale standardkandidat oppnådd fra en CHO-IL-13-kultur oppnådd ved unmunisenng av kaniner i henhold til N Vita, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983, 225.2,436-445

De oppnådde resultater fremgår av Tabell II nedenfor

Resultatene ovenfor viser at den spesifikke biologiske aktivitet av argininekstraktet før eventuell påfølgende rensing, er større enn for guamdirihydroklondekstraktet

EKSEMPEL 3

Ekstraksjon av periplasmatisk hGH fra E coli, i nærvær av arginin, på cellepellet

Stammen SEBR 1250 (EP-360 641 og EP-356 335) ble etablert i forkultur overnatten ved 37°C under omrøring ved 200 rpm på L-medium (Luna-buljong) inneholdende 100 mg/L ampicilhn Fra denne forkultur ble en ytterligere kolbe med L-medium inokulert slik at den initiale OD var 0,2 Etter 1 times henstand ble kulturen indusert med 1 raM IPTG og dyrkingen fortsatt 13 timer Prøvene av baktenesuspensjonen ble sentrifugert og de derved gjenvundne baktenepellets suspendert i ekstraksjonsbufferne slik at den endelige OD var 10, hvilket tilsvarer ~4,5 g biomasse/liter ved ekstraksjonstidspunktet

Ekstraksjonsbetingelsene var som følger

For å måle ekstraksj onseffektiviteten ble det uttatt prøver tilsvarende 1 mL kultursuspensjon med en OD på 0,2, og de tilsvarende baktenepellets som ble oppnådd ved sentnfugenng ved 5 000 g 110 minutter, ble avsatt på 16,5% polyakrylamidgel etter denaturenng med SDS Baktenesuspensjonene ble også sentnfugert og de respektive supematanter anbragt på gelen Gelen ble fremkalt gjennom westem-blotting ved å benytte et anti-hGH antistoff og den kvantitative bestemmelse foretatt med en Phosphorlmager®

(Molecular Dynamics) Det anvendte anti-hGH antistoff benyttet i dette eksempel, ble oppnådd ved å immunisere kaniner

Analyse av de bånd som ble oppnådd med Phosphorlmager® gjør det mulig å trekke den slutning at ekstraksjonen av humant penplasmatisk hGH produsert i E coli i nærvær av arginin, er effektiv I dette eksempel kan det oppnås et utbytte på minst 60% i nærvær av 0,8 M argimn, pH 8,0, T 22°C i løpet av 20 timer, og et ekstraksjonsutbytte på mer enn 80% kan oppnås i nærvær av 0,8 M argimn, pH 8,0, T 4°C i løpet av 20 timer

Siden hGH er et hydrofilt protein, kan det herav sluttes at rekombinante proteiner som varierer sterkt i sin natur, akkumulert i penplasmaet til E coli, lett kan ekstraheres i nærvær av arginin

EKSEMPEL 4

Ekstraksjon av periplasmatisk IL-13 fra E coli på cellebrokker i nærvær av argimn

1) Fermentor-kultur

I dette eksempel ble det benyttet E Coli stamme TP2339 (EP 360 641 og

EP 356 335), transformert med plasmid p922 oppnådd etter tilsvarende metoder som i Eksempel 1

E coli stammen TP 2339/p922 ble etablert på L-medium med 100 mg/L ampicillin og inkubert ved 30°C under omrøring for å danne en forkultur Et 100 mL volum av denne forkultur ble benyttet som inokulum for en fermentor av merke MBR® med et totalvolum på 2,5 liter Dyrkingen ble foretatt i et volum på 1,2 liter i et medium hvis sammensetning og betingelser er angitt nedenfor

Medium for fermentor- E coli- stamme TP2339/ p922

Beregnet for et sluttvolum på 1,2 liter oppnås dyrkmngsmediet ved tilsetning av én liter autoklavert fase og 0,1 liter filtrert fase med nedenfor angitte sammensetning og 0,1 liter av ovennevnte forkultur

1) Autoklavert fase fl000 mLl

Løs opp 1900 mL Milli-Q®-vann

Juster pH Ul 7,4 med KOH-løsmng og fyll deretter opp til 1000 mL med Milh-Q®-vann Autoklaver 30 minutter ved 120°C

2) Filtrert fase f 100 mD

Filtrer under sterile betingelser gjennom en 0,2 um membran

Glukosekonsentrasjonen opprettholdes under dyrkningen i en konsentrasjon på mellom 5 og IS g/L

Etter at OD har nådd 40 (ca 16 g tørrstoff/liter) utløses ekspresjonen av IL-13 ved tilsetning av IPTG i en konsentrasjon på 1 g/L og fortsettes 15 timer Dyrkmngsparameterne var som følger

pH = 7,4 regulert med 3N HC1 og KOH

T = 37°C

pC>2 = 50 mbar regulert under omrønng, med en luftstrøm

på mellom 1 og 3 liter/min

2) Gjenvinning og oppmaling av baktenematenalet

En liter kultursuspensjon sentrifugeres i 20 minutter ved -6400 g Pelleten tas opp i det samme volum 10 raM Tns-buffer , 1 mM EDTA, 1 mg/L pepstatm, pH 8, under mekanisk omrønng ved bruk av en rører av propelltype

Oppmaling skjer i en Manton-Gauhn-presse under et trykk på 700 bar i to omganger Det oppmalte preparat kan i dette eksempel oppbevares som sådant ved -80°C

3) Ekstraksion

Etter opptining uttas 5 mL av det oppmalte preparat med OD lik 75 (30 g tørrstoflyiiter) som deretter sentnfugeres i 50 minutter ved 23 300 g

Den derved oppnådde pellet tas opp i én tredjedel av det opprinnelige volum med 0,1 mM Tns-buffer, pH 7,0, og fylles deretter opp til det opprinnelige volum med en løsning inneholdende argimn slik at sluttkonsentrasjonen av argimn er 2,5 M og pH 8,0

For dette eksempel ble et ytterligere overflateaktivt middel (Hecameg® i en sluttkonsentrasjon på 20 g/L) kombinert med argimnet

Suspensjonen av cellebrokker fremstillet på denne måte, anbnnges ved 4°C over en roterende omrører ved 300 rpm i 2 dager

Suspensjonen sentnfugeres avslutningsvis 150 minutter ved 23 300 g, og supernatanten utgjør det forventede ekstrakt

4) Biokjemisk analyse og analyse av biologisk aktivitet

a) Bestemmelse av de totale proteiner ble foretatt etter Biorad® "Protein Assay" metoden b) Metoden for bestemmelse av rekombinant IL-13 er som den benyttet i Eksempel 1 Utbytte av det således ekstraherte IL-13 de oppnådde resultater fremgår av den følgende tabell

Det ble i dette eksempel funnet at ekstraksjonen utført på cellebrokker i nærvær av 2,5 M argimn og med et ytterligere overflateaktivt middel, gjorde det mulig å oppnå et ekstraksjonsutbytte på ca 70%

EKSEMPEL 5

Ekspresjon av IL-131 nærvær av argimn i dyrkningsmediet

E coli stamme RB791/p922 ble dyrket på L-medium med 100 mg/L ampicilhn i nærvær av forskjellige konsentrasjoner argimn Induksjon ble utløst 1 time etter inokulering ved tilsetning av 1 mM IPTG, og dyrkningen ble fortsatt i 3 timer

Prøvene av baktenepellets - tilsvarende 1 mL av kultursuspensj onen med en OD på 0,2, og de tilsvarende prøver av supematant, ble avsatt på gel, fremkalt og kvantifisert som beskrevet ovenfor Resultatene er angitt i tabellen nedenfor

Det fremgår under forsøksbetingelsene for det aktuelle ekspresjonssystem at

- argimn øker ekspresjonen av penplasmatisk IL-13 fra

2 g/L og vesentlig fra 4 g/L,

- bakteneveksten bremses ved en konsentrasjon på 8 g/L,

- ved disse konsentrasjoner forårsaker ikke argimn

lekkasje av IL-13 over i supernatanten

Fordelen ved arginin-ekstraksjonsmetoden i henhold til oppfinnelsen består i muligheten av å benytte proteinekstrakter som de er, eller med et minimum av behandling, i tester på biologisk aktivitet

Denne forenkling av ekstraksj onsmetoden medfører en fordel både for den industrielle produksjon av rekombinante periplasmatiske proteiner og for screening ved bestemmelse av den biologiske aktivitet i forhold til for eksempel muterte proteiner, i laboratoneskala

Til forskjell fra guamdin*HCl som ofte benyttes som ekstraksjonsmiddel, angriper ikke argimn de matenaler som benyttes i industrien, særlig stål Dessuten er argimn et ikke-forurensende middel som ikke fordrer en kostbar prosess for avløpsbehandling

Fordelen ved å uttrykke et periplasmatisk protein i nærvær av argimn i konsentrasjoner som tilsvarer minst 2 g/L og spesielt i konsentrasjoner på mellom 2 g/L og 10 g/L, i dyrkningsmediet, fremgår av økningen i utbyttet av sekretert rekombinant protein oppnådd in vivo

Claims (5)

1 Anvendelse av arginin som middel for ekstraksjon av rekombinante periplasmatiske protemer

2 Fremgangsmåte for ekstraksjon av et periplasmatisk aktuelt protein, som består i

(1) suspendering av pelleten av celler eller av celledebns av celler som skriver seg fra dyrkningen av en prokaryot mikroorganisme som er transformert ved hjelp av en ekspresjonsvektor inneholdende et gen som koder for nevnte protein og anordninger for ekspresjon av dette i nevnte mikroorganismes penplasma, i en bufferløsmng som inneholder arginin, og

(2) gjenvinning av det aktuelle protein fra supematanten av den derved oppnådde baktenesuspensjon

3 Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bufferløsmngen som inneholder argimn, er en alkalisk vandig løsning som har en argininkonsentrasjon på minst 0,4 M

4 Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at en pellet av celler med opprinnelse fra kulturen av en prokaryot mikroorganisme blir anvendt i trinn (1) og ved at den alkaliske vandige løsningen har en argininkonsentrasjon på mellom 0,4 og 0,8 M

5 Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at en pellet av celledebns fra celler med opprinnelse fra kulturen av en prokaryot mikroorganisme blir anvendt i rn nn (1) og ved at den alkaliske vandige løsningen har en argininkonsentrasjon på mellom 0,4 og 2,5 M