CZ286509B6 - Extraction process of periplasmatic protein - Google Patents
Extraction process of periplasmatic protein Download PDFInfo
- Publication number
- CZ286509B6 CZ286509B6 CZ1996290A CZ29096A CZ286509B6 CZ 286509 B6 CZ286509 B6 CZ 286509B6 CZ 1996290 A CZ1996290 A CZ 1996290A CZ 29096 A CZ29096 A CZ 29096A CZ 286509 B6 CZ286509 B6 CZ 286509B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- arginine
- extraction
- buffer solution
- cell
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title description 49
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 63
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 28
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 abstract 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 14
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 150000008505 β-D-glucopyranosides Chemical class 0.000 description 3
- 102100035436 Complement factor D Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XPIVOYOQXKNYHA-RGDJUOJXSA-N [(2r,3s,4s,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methoxyoxan-2-yl]methyl n-heptylcarbamate Chemical compound CCCCCCCNC(=O)OC[C@H]1O[C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O XPIVOYOQXKNYHA-RGDJUOJXSA-N 0.000 description 2
- -1 alkyl glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101000829958 Homo sapiens N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 108700003606 glycosylated interleukin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5437—IL-13
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu extrakce periplasmatického proteinu, zahrnujícího i) kultivaci prokaryontního mikroorganismu, transformovaného pomocí vektoru exprese obsahujícího gen kódující uvedený protein a prostředky pro jeho expresi do periplasmy uvedeného mikroorganismu, ii) odstředění nebo mikrofiltraci získané kultivační směsi k získání buněčného podílu a případně lyži buněk získaného buněčného podílu a odstředění získaného lyzátu k získání rozrušeného buněčného podílu, iii) suspendování získaného buněčného podílu nebo rozrušeného buněčného podílu v roztoku pufru, iv) odstředění získané suspenze k získání supematantu a v) izolaci uvedeného proteinu z tohoto supematantu.
Dosavadní stav techniky
Na genetickém inženýrství se stále více požaduje, aby se zaměřilo na výrobu aplikačně zajímavých proteinů, jakými jsou například inzulín, interleukiny a růstový hormon.
Obecně je mikroorganismus transformován vektorem exprese, obsahujícím gen kódující požadovaný protein a prostředky nutné kjeho expresi, jakými jsou například regulační znaky. Potom se mikroorganismus kultivuje na vhodné živné půdě a když se vytvoří dostatečné množství buněk organismu, zahájí se přídavkem induktoru exprese, během které se produkuje a akumuluje ve velkém množství požadovaný protein. Po ukončení kultivace se suspendované buňky oddělí od živné půdy, například odstředěním nebo mikrofiltraci. Získané buňky se potom podrobí extrakci, a to po případné desintegraci stěn buněk mikroorganismu.
Exprese genu kódujícího požadovaný protein v prokaryotním mikroorganismu může být cytoplasmatická, periplasmatická nebo sekretorická podle druhu prostředku exprese uplatněných společně s uvedeným genem (promotor, terminátor, fixační místo ribosomů, peptidové znaky a pod.).
Cytoplasmatická exprese umožňuje získat významné množství proteinů. Nicméně je nezbytné před extrakcí požadovaných proteinů v případě, že obsahují jeden nebo více simých můstků, přistoupit k etapě denaturace/renaturace, což představuje obzvláště těžkopádnou a choulostivou etapu při realizaci extrakce v průmyslovém měřítku. Etapa denaturace-renaturace se provádí klasickými způsoby, dobře známými pracovníkům z oboru, přičemž se používá denaturační činidlo za přítomnosti redukovadla a pak podmínky denaturace zahrnují kontrolu zvláště co do redox charakteru roztoku; mezi používanými denaturačními činidly je nutno zvláště uvést guanidinhydrochlorid, který byl navržen v postupu získávání lidského interleukinu-2. O této problematice pojednává např. patentový spis EP-A2-0 145 390.
Sekretorické systémy exprese, v nichž se nachází žádaný protein v kultivačním médiu aktivně, jsou užívány jen zřídka nebo vůbec ne, jde-li o bakterie Gram-negativní pro jejich malou produktivitu. Zde je nutno poznamenat, že prostředí bakteriální kultury o velké hustotě v bioreaktoru není ideálním prostředím pro rekombinované proteiny, citlivé vzhledem k nebezpečí fázové interfaciální denaturace.
Periplasmatická exprese dovoluje získat přímo rekombinované proteiny v podstatě správně replikované a to v prostoru chráněném před okolím, a proto představuje rozumnou možnost pro získávání těchto proteinů, zejména proteinů neglykosylovaných. V tomto případě pak není nutno podrobovat proteiny etapě denaturační.
- 1 CZ 286509 B6
Metody drcení buněk obecně v této oblasti užívané jsou např. lyse buněk ultrazvukem nebo mechanickým tlakem /French Pressure Cell, kulový mlýn/, chemická lyse nebo lyse enzymatická, osmotický šok a zpracování pomocí činidel chaotropních nebo detergentů. Tyto metody rozdrtí většinu buněčných membrán včetně membrán plasmatických a membrán endoplasmatického retikula a vytvoří homogenní suspenzi buněčných zlomků. Charakter sedliny buněčné drtě, která může být získána centrifugací /jádra, buněčný skelet, mitochondrie, lysosomy, ribosomy, makromolekuly atd./, závisí hlavně na délce a rychlosti centrifugace/10 minut na 1000 g až 3 hodiny na 150 000 g/.
Obtíže, s nimiž se můžeme setkat v průběhu extrakční operace, se mění podle typu exprese a podle užitých extrakčních metod. Jsou to zejména:
- ztráta na výtěžku rekombinovaného proteinu
- ztráta biologické aktivity rekombinovaného proteinu
- proteolytická degradace rekombinovaného proteinu
- Toxicita extrakčních činidel a kontrola jejího odstranění
- nesnadný převod do průmyslového měřítka
- směs proteinů periplasmatických a cytoplasmatických.
Navíc, jde-li o žádané proteiny, které jsou hydrofobní nebo nesou náboj, mohou se vázat na buněčné složky, které jsou samy hydrofobní nebo nabité, což učiní extrakci extrémně nesnadnou.
Průmyslová výroba žádoucích rekombinovaných proteinů pomocí genetického inženýrství je velmi slibná, ale vyžaduje použití takových extrakčních metod, které umožní vyhnout se uvedeným nevýhodám neboje alespoň minimalizovat.
Je ovšem důležité žádané proteiny nejen produkovat ve značných množstvích, ale ještě také je produkovat nekontaminované extrakčními činidly a uchovat jim všechnu biologickou aktivitu.
Za tímto účelem jsou navrhovány různé postupy, zejména pro případ extrakce-separace interleukinu-2.
Patentový spis EP-A2-0 145 390 popisuje způsob získání lidského neglykosilovaného interleukinu-2 /IL—2/ s vysokou specifickou aktivitou a to pomocí chromatografie na koloně pro extrakci IL-2. Tento postup dovoluje také provedení denaturace pomocí guanidinhydrochloridu.
Patentový spis EP-A2-0 147 819 navrhuje postup pro získání homogenního a čistého lidského rekombinovaného interleukinu-2. Tento postup spočívá v kultivaci mikroorganismu transformovaného za pomoci vektoru exprese, který obsahuje gen kódující interleukin-2, dále ve vyvolání lyse buněk, izolaci buněčné drtě, v extrakci IL-2 promýváním buněčné sedliny vhodným promývacím roztokem, potom v chromatografickém vyčištění promývacího roztoku. Použité promývací roztoky mohou obsahovat sůl, jako například chlorid sodný nebo guanidinhydrochlorid, nebo detergent, jako například produkt známým pod obchodním označením Triton X100.
Podle výhodného postupu se doporučuje použít postupně tři promývací roztoky: promývací roztok obsahující chlorid sodný, promývací roztok obsahující detergent a promývací roztok obsahující guanidinhydrochlorid.
Patentový dokument EP-A1-0 337 243 popisuje postup používaný pro čistění lidského interleukinu-2, využívající dvě kolony pro kapalinovou chromatografii v reverzní fázi. Před etapou chromatografického čistění se nerozpustný podíl lyzátu bakteriálních buněk extrahuje roztokem obsahujícím guanidinhydrochlorid, aby byl získán bakteriální extrakt, který se potom
-2CZ 286509 B6 zředí pomocí pufru bez guanidinhydrochloridu, načež se provede chromatografie, při které se použije eluce s acetonitrilovým gradientem.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob extrakce periplasmatického proteinu, zahrnující i) kultivaci prokaryotního mikroorganismu, transformovaného pomocí vektoru exprese obsahujícího gen kódující uvedený protein a prostředky pro jeho expresi do periplasmy uvedeného mikroorganismu, ii) odstředění nebo mikrofiltraci získané kultivační směsi k získání buněčného podílu a případně lysi buněk získaného buněčného podílu a odstředění získaného lysátu k získání rozrušeného buněčného podílu, iii) suspendování získaného buněčného podílu nebo rozrušeného buněčného podílu v roztoku pufru, iv) odstředění získané suspenze k získání supematantu a v) izolaci uvedeného proteinu z tohoto supematantu, jehož podstata spočívá v tom, že roztok pufru obsahuje arginin.
Výhodně se jako roztok pufru obsahující arginin použije alkalický vodný roztok mající koncentraci argininu alespoň rovnou 0,4 M, výhodněji rovnou 0,4 až 0,8 M v případě, kdy se v roztoku pufru ve stupni iii) suspenduje buněčný podíl, nebo rovnou 0,4 až 2,5 M v případě, kdy se v roztoku pufru ve stupni iii) suspenduje rozrušený buněčný podíl. Extrahovaným proteinem je výhodně protein IL-13 nebo protein hGH.
Arginin je přírodní alfa-aminokyselinou, která byla navržena jako pomocný prostředek při denaturaci/renaturaci/substituci dvou řetězců Abbokinasy (urinámí aktivátor plasminogenu), ve kterých je původní peptid nahrazen v průběhu této operace syntetickým peptidem. V této souvislosti je možné odkázat na článek G. A. Homandberga a T. Wai-e, zveřejněný v Biochimica and Biophysica Acta, 1990, 1038, 209-215.
Při způsobu podle vynálezu a při provádění jeho výhodných provedení se nepřistupuje k denaturaci-renaturaci proteinů, nýbrž zde arginin působí výlučně v úrovni extrakce proteinu z buněčného podílu (buněčné sedliny) nebo z rozrušeného buněčného podílu (buněčné drtě) mikroorganismu.
Arginin vykazuje výrazné účinky při extrakci proteinu a to jak pokud jde o výtěžek proteinu, tak také pokud jde o biologickou aktivitu získaného proteinu. Bylo totiž zjištěno, že například dospělá forma IL-13 se izoluje při použití způsobu podle vynálezu ve výtěžcích vyšších než 95 %, přičemž zůstane zachována její biologická aktivita. Je nutno uvést, že pokusy s extrakcí osmotickým šokem u téhož systému exprese nevedou ke srovnatelným výsledkům.
Srovnávací pokusy ukázaly, že guanidinhydrochlorid použitý za týchž podmínek dovoluje získat rotein IL—13 s výtěžkem vyšším než 95 %. Na druhé straně je však biologická aktivita proteinu takto získaného změněna více než metodou argininovou.
Aniž by šlo o pokus vázat se na nějakou teorii, lze předpokládat, že arginin působí jako činidlo slabě chaotropické a biologické, na rozdíl od činidel silně chaotropických a denaturačních, jakým je při potřebných vysokých koncentracích rovných či vyšších než 5 M, nutných pro zajištění extrakce, např. guanidinhydrochlorid.
Postup dle vynálezu, případně v některém z možných výhodných provedení, může být aplikován po jakémkoliv procesu kultivace mikroorganismu, transformovaného vektorem exprese, obsahujícím gen kódující žádaný protein a činitele pro periplasmatickou expresi dotyčného proteinu, jako např. potřebné znaky regulační.
-3 CZ 286509 B6
Odborníkům je zřejmé, že tato metoda je použitelná pro bakterie blízké E.coli, tj. pro bakterie Gram-negativní, případně anaerobní ze skupiny Enterobacterií. V této skupině Enterobacterií se nalézají zejména druhy: Escherichia, Salmonella a Erwinia, ale také Shigella, Klebsiella, Serratia, Próteus a Enterobacter.
Vzhledem k chaotropnímu charakteru argininu se rovněž ukazuje, že arginin lze případně s výhodou nahradit jinými chaotropními činidly. Jelikož je nemožné podat příklady týkající se všech rodů bakterií vzhledem k diversitě dotyčných živých systémů, odborníci si poradí s aplikací i adaptací argininové extrakční metody pro své zvláštní případy.
V rámci oboru jsou takové procesy kultivace dobře známy. Postupy popisující kultivaci bakterií Gram-negativních ve fermentoru jsou popsány např. v patentových spisech EP 360 641 a EP 356 335 a vztahují se k získání a využívání kmenů Escherichia coli zvaných SEBR 1250 aTP 2339.
Jakmile je dosažen žádoucí počet buněk, kultura se podrobí centrifugaci /zpravidla/ nebo mikrofiltraci a na sedlinu biomasy takto získané se působí roztokem pufru obsahujícím arginin postupem podle vynálezu.
Podle obecného předpisu se pracuje při teplotě mezi pokojovou teplotou 25 °C a teplotou 2 °C, s výhodou při 4 °C.
Doba kontaktu buněčné sedliny s roztokem pufru obsahujícím arginin musí být dostačující k tomu, aby mohl nastat přestup příslušného proteinu do pufrového roztoku. Pokud se pracuje při teplotě 4 °C je obvykle délka kontaktu s výhodou blízká 1 hodině.
Extrakce, tj. přechod periplasmatického proteinu do prostředí, probíhá v průběhu kontaktu biomasy s extrakčním prostředkem - argininovým pufrem. Doba kontaktu, která zaručí úplnou nebo už nepokračující extrakci, leží mezi 30 minutami a 16 hodinami. Pokusy ukazují, že uspokojivých výtěžků může být dosaženo v průběhu několika hodin při teplotě 4 °C. Bylo rovněž zaznamenáno, že lehké promíchávání biomasy v extrakčním pufru vedené tak, aby se zabránilo sedimentaci mikroorganismů, poskytuje vyšší výtěžky, tj. vyšší míru extrakce jako funkce času.
Postup extrakce podle vynálezu je stejně vhodný pro extrakce hydrofobních proteinů, jako jsou např. interleukiny, zejména IL—13, popsaný v patentovém spise EP-A1-0 506 574, jako pro extrakci proteinů hydrofilních, jako je např. růstový hormon /hGH/. Postup podle vynálezu zjednodušuje získávání hGH, které normálně vyžaduje pro extrakci uplatnění osmotického šoku.
Aby bylo možno uskutečnit extrakci proteinu přímo ze suspenze buněčné sedliny, použije se s výhodou roztok pufru obsahujícího arginin v koncentraci mezi 0,4 M a 0,8 M.
Pokud se chce uskutečnit extrakce žádoucího periplasmatického proteinu ze sedliny buněčné drtě podle jednoho z výhodných provedení postupu dle tohoto vynálezu, postupuje se stejným způsobem jako u základního provedení až do etapy získání buněčné sedliny po centrifugaci nebo mikrofiltraci, pak se ale uskuteční drcení buněk metodami známými odborníkům. Metody drcení buněk jsou popsány např. v těchto publikacích: C. T. Choma a H. Yamazaki, Can. J. Microbiol., 1981, 27, 547-550, L. O. Ingram, Joumal of Bacteriology, 1981, 146,1,331-336, N. G. Nossal aL. A. Heppel, Joumal of Biological Chemistry, 1966, 241,13,3065-3072, R. Bennet, D. R. Taylor a A. Hunt, Biochem. Biophys. Acta 18(3),512-521, a v kolektivní práci Fermentation and enzyme technology, kap. 12,239-309, vyd. J. Willey and Sons (1979).
Sedlina buněčné drtě získaná obvyklým způsobem se centrifuguje a znovu suspenduje, pak se na ni působí roztokem pufru s obsahem argininu. Doba styku suspenze buněčné drtě s roztokem pufru obsahujícím arginin musí být dostatečně dlouhá, aby umožnila přestup příslušného
-4CZ 286509 B6 proteinu do roztoku pufru, obvykle se při teplotě 4 °C doba styku, zaručující prakticky úplnou extrakci, rovná 48 hodinám. Bylo pozorováno, že obdobně i zde mírné promíchávání biomasy v extrakčním pufru, které zabrání sedimentaci buněčné drtě, dává vyšší extrakční hodnoty v závislosti na čase.
Tato varianta extrakčního postupu podle vynálezu vyhovuje zejména k extrakcím žádoucích periplasmatických proteinů, které jsou silně asociovány na buněčných membránách, jako např. interleukiny.
Odborníkům je dobře známo, že extrakční pufr obsahující arginin podle vynálezu může rovněž obsahovat vhodný detergent který má zlepšit výtěžek nebo/a rychlost extrakce příslušného proteinu. Mezi detergenty vhodnými k použití si odborník dovede zvolit takové, jež umožní zachovat výhody použití argininu jako extrakčního činidla, zejména to, že zůstává zachována biologická účinnost dotyčného proteinu. Jako vhodné mírné detergenty je možno uvést např. alkylglykosidy jako alkylmaltosidy, nonyl-α nebo β-D-glukopyranosidy, oktyl-α nebo β-Dglukopyranosidy nebo alkyl-karbamoyl-methyl-α nebo β-D-glukopyranosidy, jako např. produkt značky Hecameg, jehož velmi slabá toxicita nutí mít na mysli, že může být nalezen ve stopách ve finálním produktu.
Aby byla uskutečněna extrakce žádoucího proteinu ze suspenze sedliny buněčné drtě, použije se přednostně roztok pufru obsahujícího arginin v koncentraci vymezené hodnotami 0,4M a 2,5M přičemž koncentrace v hodnotě 2,5M může být získána zejména za přítomnosti solí.
Dále bylo zjištěno, že arginin vykazuje značný blahodárný účinek na výtěžky vylučovaného rekombinovaného periplasmatického proteinu, je-li přidán v neobvyklých a velmi vysokých koncentracích, mnohem vyšších, než jsou ty, s nimiž se můžeme setkat v prostředích kultury, vyráběné z hydrolyzátů obchodních proteinů a které dovolují pokrýt potřebu argininu z použitého kmene.
Kromě toho bylo nalezeno, že blahodárný účinek argininu je zvlášť výrazný, pokud koncentrace argininu přidaného do kultivačního prostředí se pohybují na úrovni mezi 2 g/litr a 10 g/litr.
Odborník bude umět optimisovat tuto koncentraci případ od případu.
Tento postup je zvláště vhodný pro výrobu proteinů s aktivitou cytokinového typu, zejména IL13, jak je popsáno v patentovém spise EP-A1-0 506 574.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je nyní blíže osvětlen pomocí příkladů, které rozsah vynálezu nikterak neomezují.
Příklad 1
Extrakce periplasmatického IL-13 z E. coli z buněčné sedliny za přítomnosti argininu.
1. Kultivace v baňce:
V tomto příkladu byl použit kmen E. coli RB 791 (Roger Brent, PNAS 78 (1981), str. 42044208) transformovaný plasmidem p922 získaným podle analogických postupů, jako jsou postupy popsané v patentových spisech EP 360 641 a 356 335, jehož sekvence ADN je sekvencí SEQ ID No.l.
-5CZ 286509 B6
Rozličné sekvence, které definují plasmid p922 jsou uvedeny níže.
Sekvence promotoru ilexanukleotidy TTGCTT a TATAAT jsou vytištěny tučně
Xhol
| 1 | TCGAGTGGGT | TTGAGGCGíAT | CACACTTCTG | TTAACGCAGA ACCTAAACGC |
| 51 | ATCTCGACTG | CACGGTGCAC | CAATGCTTCT | GGCGTCAGGC AGCCATCGGA |
| 1C1 | AGCTGTGGTA | TGGCTGTGCA | GGTCGTAAAT | CACTGCATAA TTCGTGTCGC |
| 151 | TCAAGGCGCA | CTCCCGTTCT | GGATAATGTT | TTTTGCGCCG ACATCATAAC |
| -35 | ||||
| 2C1 | GGTTCTGGCA | AATATTCTGA | AATGAGCTGT | TTCGAGCTGA CTGACTGTTG |
| -1C | ||||
| 251 | CTTATATTAC | ATCGATAGCG | TATAATGTGT | GG |
Sekvence oblasti 5'nepředávaná mRNA
Fixační místo ribosomu je tištěno tučně. Sekvence CAT umístěná na konci 3'této sekvence je částí hexanukleotidu rozpoznávaného restrikčním enzymem Ndel
RES
2tí 3 AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGT TTTTCGCGAA GAAGGAGATA
333 TACAT
Sekvence kódující prekurzor IL-13
Sekvence psaná kursivou odpovídá sekvenci IL-13 maturovaného. Sekvence, která není tištěna tučně, je sekvencí vazebnou spojující konec sekvence kódující IL-13 s hexanukleotidem, poznávaným restrikčním enzymem BAmHI
-6CZ 286509 B6
338 ATGAAAAAGA TCCTGGCGTT AGCTGCGCTG ACTACCGTTG TATTCTCTGC
388 GTCCGCCTTC GCTGGCCCTG TGCCTCCCAG TACTGCCCTC AGGGAGCTCA
438 TTGAGGAGCT GGTCAACATC ACCCAGAACC AGAAGGCTCC GCTCTGCAAT 988 GGCAGCATGG TATGGAGCAT CAACCTGACA GCTGGCATGT ACTGTGCAGC 538 CCTGGAATCC CTGATCAACG TGTCAGGCTG CAGTGCCATC GAGAAGACCC 588 AGAGGATGCT GAGCGGATTC TGCCCGCACA AGGTCTCAGC TGGGCAGTTT 638 TCCAGCTTGC ATGTCCGAGA CACCAAAA1C GAGGTGGCCC AGTTTGTAAA 688 GGACCTGCTC TTACATTTAA AGAAACTTTT TCGCGAGGGA CGGTTCAACT 738 GAAACTTCGA AAGCATCATT ATTTG
Sekvance terniinační
763 GGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA Terminátor genu 1C fágu T7
813 CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCTCTAA ACGGGTCTTG
HindiII
863 AGGGGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TCCGGATGTA CCAAGCTTGG
913 CCGGATCAAA GTTTTGTCGT CTTTCCAGAC GTTAGTAAAT GAATTTTCTG
963 TATGAGGTTT TGCTAAACAA CTTTCAACAG TTTCAGCGGA GTGAGAATAG Terminátor fágu fd
1013 AAAGGAACAA CTAAAGGAAT TGCGAATAAT AATTTTTTCA CGTTGAAAAT 1063 CTCCAAAAAA AAAGGCTCCA AAAGGAGCCT TTAATTGTAT CGGTTTATCA
1113 GCTTGCTTTC GAGGTGAATT TCTTAAACAG CTTGATACCG ATAGTTGCGC 1163 CGACAATGAC AACAACCATC GCCCACGCAT AACCGATATA TTCGGTCGCT 1213 GAGGCTTGCA GGGAGTCAAA GGCCGCTTTT GCGGGATCGA T
Gen kódující represor ooeronu laktosy SacII
1259 CCGCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC 1309 TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG 1359 TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT 1409 GCGTATTGGG CGCCAGGGTG GITITTCITr TCACCAGTGA GACGGGCAAC 1954 AGCTGATTGC CCTTCACCGC CTGGCCCTGA GAGAGTTGCA GCAAGCGGTC 1504 CACGCTGGTT TGCCCCAGCA GGCGAAAATC CTGTTTGCTG GTGGTTAACG 1554 GCGGGATATA ACATGAGCTG TCTTCGGTAT CGTCGTATCC CACTACCGAG 1604 ATATCCGCAC CAACGCGCAG CCCGGACTCG GTAATGGCGC GCATTGCGCC 1654 CAGCGCCATC TGATCGTTGG CAACCAGCAT CGCAGTGGGA ACGATGCCCT
1704 CATTCAGCAT TTGCATGGTT TGTTGAAAAC CGGACATGGC ACTCCAGTCG 1754 CCTTCCCGTT CCGCTATCGG CTGAATTTGA TTGCGAGTGA GATATTTATG 1804 CCAGCCAGCC AGACGCAGAC GCGCCGAGAC AGAACTTAAT GGGCCCGCTA 1854 ACAGCGCGAT TTGCTGGTGA CCCAATGCGA CCAGATGCTC CACGCCCAGT 1904 CGCGTACCGT CTTCATGGGA GAAAATAATA CTGTTGATGG GTGTCTGGTC 1954 AGAGACATCA AGAAATAACG CCGGAACATT AGTGCAGGCA GCTTCCACAG 2004 CAATGGCATC CTGGTCATCC AGCGGATAGT TAATGATCAG CCCACTGACG 2054 CGTTGCGCGA GAAGATTGTG CACCGCCGCT TTACAGGCTT CGACGCCGCT 2104 TCGTTCTACC ATCGACACCA CCACGCTGGC ACCCAGTTGA TCGGCGCGAG 2154 ATTTAATCGC CGCGACAATT TGCGACGGCG CGTGCAGGGC CAGACTGGAG 2204 GTGGCAACGC CAATCAGCAA CGACTCTTTG CCCGCCAGTT GTTGTGCCAC 2254 GCGGTTGGGA ATGTAATTCA GCTCCGCCAT CGCCGCTTCC ACTTTTTCCC 2304 GCGTTTTCGC AGAAACGTGG CTGGCCTGGT TCACCACGCG GGAAACGGTC 2354 TGATAAGAGA CACCGGCATA CTCTGCGACA TCGTATAACG TTACTGGTTT 2404 CACATTCACC ACCCTGAATT GACTCTCTTC CGGGCGCTAT CATGCCATAC 2454 CGCGAAAGGT TTTGCGCCAT TCGATCTACG CCGGACGCAT CGTGGCCGCA 2504 AA
Sekvence pBR 327
Pflml
2506 CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC CAGCAGCCGC 2556 ACGCGGCGCA TCTCGGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC 2606 CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC 2656 CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT 2706 GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC 2756 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC 2806 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC 2856 CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA 2906 ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG 2956 ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG 3006 GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC 3056 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA 3106 CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC 3156 GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTCATCTTT TCTACGGGGT 3206 CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA 3256 TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT 3306 TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT 3356 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC
-8CZ 286509 B6
3406 ATAGTTGCCT GACTCCCCGT 3456 ACCATCTGGC CCCAGTGCTG 3506 CTCCAGATTT ATCAGCAATA 3556 AGTGGTCCTG CAACTTTATC 3606 GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT 3656 CCATTGCTGC AGGCATCGTG 3706 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG 3756 GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT 3806 AGTTGGCCGC AGTGTTATCA 3856 CTTACTGTCA TGCCATCCGT 3906 AACCAAGTCA TTCTGAGAAT 3956 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT 4006 CTCATCATTG GAAAACGTTC 4056 GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA 4106 CAGCATCTTT TACTTTCACC 4156 CAAAATGCCG CAAAAAAGGG 4206 CATACTCTTC CTTTTTCAAT 4256 TCATGAGCGG ATACATAT1T 4306 GTTCCGCGCA CATTTCCCCG 4356 TATTATCATG ACATTAACCT 4406 GTCCC
CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC
Plasmin pER 327 je popsán v Gene, S,287-3C5 (1980).
Tento kmen E.coli RB 791/p922 byl dán do předkultivace a to přes noc při teplotě 30 °C při míchání 200 otáček/minutu a na půdě L/Luria broth - popsáno v Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sambrook, Fritsch, Manitas, Cold Spring Harbor, Laboratory Press,
2. vydání (1989)/ s lOOmg/litr ampicilinu. Z této předkultivace byla naočkována nová buňka s kultivační půdou L tak, aby počáteční optická hustota /označování optické hustoty: optická hustota D.O. při 600 nm. D.O. = 1 odpovídá 400 až 450 mg biomasy na litr/ D.O. byla 0,6. Po hodinové prodlevě byla kultivace indukována 1 mM IPG /isopropyl-|3-D-l-thiogalaktopyranosid/ a pokračovala ještě 3 hodiny. Vzorky bakteriální suspenze byly centrifugovány a bakteriální sedliny takto získané byly suspendovány dále v extrakčním pufru tak, aby konečná optická hustota D.O. /viz výše/ činila 10, což odpovídá 4,5 g biomasy v litru v okamžiku extrakce.
Byly použity následující pufry:
A: Arginin 0,8 M pH 8,0, nastavený pomocí HC1 ve vodě Milli-Q /Millipore/
B: Guanidinhydrochlorid 5 M ve vodě Milli-Q bez úpravy pH.
Aby bylo možno měřit účinnost extrakce, byly odebírány vzorky po 1 ml suspenze kultury do dosažení D.O. 0,2 odpovídající sedliny bakterií získané odstředěním při 5000 g po dobu 10 minut byly uloženy na polyakrylamidový gel do 16,5% po denaturaci v SDS. Také bakteriální suspenze byly odstředěny a jejich supematanty byly odsoleny ultrafiltrací /filtrační zařízení Ultra-free-MC s prahem řezu 5000 Da Millipore/ před umístěním na gel. Vlastní gel byl pak
-9CZ 286509 B6 vyvolán metodou Western blot za použití protilátek anti-IL-13-CHO a vyhodnocen kvantitativně na Phosphorimager /Molecular Dynamics/. Protilátka anti-IL-13 CHO /Chinese Hamster Ovary/ použitá v tomto příkladu byla získána imunizací králíků.
V tomto příkladě bylo zjištěno, že extrakce za přítomnosti guanidinhydrochloridu a případně argininu je u maturované formy prakticky kompletní, přičemž jsou výtěžky extrakce v těchto dvou případech vyšší než 99 %. Bylo rovněž zaznamenáno, že nejsou rozdíly v obsahu prekurzoru IL-13 mezi extraktem získaným za přítomnosti argininu a extraktem získaným za přítomnosti guanidinhydrochloridu.
2. Kultivace ve fermentoru
Kmen E. coli RB 791/p922 byl vnesen do živné půdy L s ampicilinem 100 mg/litr a inkubován pri 30 °C za míchání, aby se získala předkultura. Objem 100 ml této předkultury posloužil k naočkování do fermentoru o obsahu 2,5 litru značky MBR. Kultivace se uskutečnila v objemu 1,2 litru v prostředí, jehož složení je uvedeno níže a za podmínek rovněž definovaných níže.
Živné prostředí pro fermentor - kmen E.coli RB 791/p922
Údaje platí pro 1 konečný litr, objem inokula je třeba odečíst.
1. Rozpustí se v 700 ml vody Milli-Q:
Složka
EDTA
FeSO4.7H2O
MgSO4.7H2O
K2SO4
CaCl2.2HO
NaCl
KC1
HY-SOY
L-methion Tryptofan stopové prvky výtažek z kvasnic hmotnost/litr g
mg
1,5 g
0,75 g mg
1,45 g 5g g
1,4 g g
ml
10g
Doplní se na 800 ml vodou Milli-Q a autoklávuje se 30 minut při teplotě 120 °C.
2. Filtruje se na 0,2 pm ve 100 ml vody Milli-Q:
| Glycerin K2HPO4 | 15 g 7,1 g |
Koncentrace glycerinu během kultivace má být udržována na hodnotách mezi 10 a 15 g/1.
3. V okamžiku indukce se přidá:
| IPTG kyselina 6-aminokapronová H-SOY L-cystein | 1 g 0,65 g 40 g 0,3 g |
-10CZ 286509 B6
Objem tohoto přídavku není zahrnut do následných výpočtů
Roztoky mikroelementů
Užívá se v množství 1 ml/litr.
Na 1 litr se doplní vodou Mílii-Q, k rozpouštění se bere 800 ml hmotnost/litr
H3BO3
NaMoO4.2H2O
MnSO4.H2O
CoC12.6H2O
CuSO4.5H2O
ZnSO4.7H2O
A1C13.6H2O
KCr(SO4)2.12H2O
KJ /zvlášť/
NiSO4.6H2O mg
4,8 mg mg
23,8 mg
8,7 mg mg mg mg mg
2,6 mg
Přidá se 100 ml konc. HC1 a doplní se na 1000 ml vodou Mílii—Q.
V jednom případě byla při D.O. 58 zahájena exprese IL-13 přídavkem IPTG v množství 1 g/litr. Probíhala 5 hodin.
Parametry kultivace ve fermentoru byly následující:
pH = 7,4
T = 30 °C pO2 = 40 mm Hg, regulováno mícháním, s průtokem vzduchu v rozmezí 1 až 3 litry/minutu.
Použité metody extrakce a měření biologické aktivity byly stejné jako v části 1 uvedené výše.
Bylo zjištěno, že extrakce bakteriální sedliny získané ve fermentoru a ne už v baňce, provedená za přítomnosti guanidinhydrochloridu i za přítomnosti argininu, je co do maturované formy IL13 téměř úplná a že v obou případech jsou výtěžky extrakce vyšší než 97 %.
Příklad 2
Biologická aktivita IL-13 takto extrahovaného
Extrakty, získané za přítomnosti guanidinhydrochloridu nebo argininu v příkladu 1 byly odsoleny ultrafiltrací, jak bylo popsáno výše. Bylo po zředění vneseny do sestavy za přítomnosti podklonu buněčné populace B9 závislého na IL-13. Aktivita IL-13 u zředěných vzorků vede k růstu buněk B9 a byla určena koncentrace za poločas zdvojení. Buněčný růst byl zastaven po 3 dnech kontaktu přídavkem MTT /3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-difenyltetrazolium)bromid/ a změřen na spektrofotometru pomocí absorpce vyvolaného modrého zabarvení při 565 nm. Biologická aktivita IL-13 byla vyjádřena vng/ml v porovnání se standardem IL-13, který kalibrován na mezinárodní standard pocházející z kultury IL-13 CHO, získané imunizací králíků podle N. Vita, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983,225,2,436-445.
Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:
-11CZ 286509 B6
Tabulka
| Pokus s buněč. linií B9 | IL-13, ng/ml | Biol. aktivita ng/ml | biol. aktivita specifická |
| kontrola | 500 | 500 | 100 |
| arginin | 3200 | 1376 | 43 |
| Guanidin | 4300 | 1098 | 25 |
Shora uvedené výsledky ukazují, že specifická biologická aktivita argininového extraktu je už před jakoukoliv jinou následnou čisticí operací vyšší než aktivita extraktu guanidinhydrochloridového.
Příklad 3
Extrakce periplasmatického hGH bakterie E.coli z buněčné sedliny za přítomnosti argininu.
Kmen SEBR 1250 /EP 360 641 a EP 356 335/ byl předpěstován přes noc při teplotě 37 °C za míchání 200 ot./minutu v kultivačním médiu L /Luria broth/ se 100mg/l ampicilinu. Touto předpěstovanou kulturou byla naočkována jiná buňka s živným roztokem L tak, aby počáteční D.O. byla rovna 0,2. Po hodinové prodlevě byla kultivace indukována pomocí 1 mM IPTG a pokračovala ještě 3 hodiny. Vzorky bakteriální suspenze byly odstředěny a sedliny bakterií takto získané byly suspendovány v extrakčním pufru tak, aby konečná D.C. byla rovna 10, což odpovídá 4,5 g biomasy/litr ve chvíli extrakce.
Extrakční podmínky byly následující:
Chaotropní činidlo____________pH___________________T___________________doba________
Arginin 0,8M 8,0 22 °C 20 hodin
Arginin 0,8M 8,0 4 °C 20 hodin
Pro změření účinnosti extrakce byly odebrány vzorky odpovídající 1 ml kultivační suspenze o D.O. 0,2 a příslušné bakteriální sedliny po odstředění při 5000 g po dobu 10 minut. Byly naneseny na polyakrylamidový gel 16,5% po denaturaci v SDS. Bakteriální suspenze byly rovněž centrifugovány a jejich supematant byl nanesen na gel. Samotný gel byl vyvolán pomocí „Western Blot“ za užití protilátky anti-hGH a kvantifikován na Phosphorimager /Molecular Dynamics/. Protilátky anti-hGH, které byly použity, byly získány imunizací králíků.
Rozbor pásem získaných pomocí Phosphorimager dovoluje závěr, že extrakce lidského periplasmatického hGH produkovaného Escherichia coli za přítomnosti argininu je účinná. V tomto příkladu byl dosažen výtěžek extrakce přinejmenším 60 % a to za přítomnosti argininu v množství 0,8 M při pH 8,0 a teplotě 22 °C při čekací době 20 hodin. Vyšší výtěžek extrakce okolo 80 % může být dosažen za přítomnosti argininu v množství 0,8 M, pH 8,0, teplotě 4 °C a době 20 hodin.
Jelikož hGH je protein hydrofílní, je možno vyslovit závěr, že přírodní rekombinantní proteiny, které jsou velmi různorodé a jsou kumulovány v periplasmatu E.coli, mohou být jednoduše extrahovány za přítomnosti argininu.
-12CZ 286509 B6
Příklad 4
Extrakce periplasmatického IL-13 z E.coli buněčné drtě za přítomnosti argininu.
1. Kultivace ve fermentoru
V tomto příkladu byl použit kmen E.coli TP2339/EP 360 641 a EP 356 335/, transformovaný plasmidem p922, získaným podle postupů, analogických těm, jež jsou uvedeny v příkladu 1.
Kmen E.coli TP2339/p922 byl vnese do živného prostředí L sampicilinem lOOmg/litr a ponechán při 30 °C za míchání, aby se vytvořila předkultura. Z této předkultury bylo odebráno 100 ml a použito k naočkování fermentoru o celkovém objemu 2,5 litru s živným prostředím i podmínkami definovanými níže.
Fermentační prostředí-kmen E.coli TP2339/p922
Pro předběžný finální objem 1,2 litru bylo živné prostředí vytvořeno přídavkem jednoho litru fáze autoklávované a 0,1 litru fáze filtrované, jejíž složení je popsáno níže, a 0,1 litru předkultury, definované výše.
1/ autoklávovaná fáze
Rozpustit v 900 ml vody Milli-Q hmotnost/litr tricin 360mg
FeSO3.72O 280mg
CaCl2.2H2O 6,7mg
MgCl2.6H2O 1,27 g
K2SO4 8,71 g
NaCl 500 mg
KC15g
Hy-Case (SF)25 g výtažek z kvasnic18 g stopové prvky1 ml
L-arginin1,5 g
Roztokem KOH se upraví pH na hodnotu 7,4 a pak se doplní na objem 1000 ml vodou Milli-Q. Autoklávuje se 30 minut při 120 °C.
2/ fáze filtrovaná
Sterilní filtrace na membráně 0,2 pm:
Glukosa 20g
Glycerin 50g
K2HPO4 5g
V průběhu kultivace má být koncentrace glukosy udržována na hodnotě mezi 5 a 15 g/litr.
Když bylo dosaženo hodnoty D.O. = 40,/cca 16 g suché látky/litr/, byla zahájena exprese přídavkem IPTG /1 g/1/ a prováděna 5 hodin. Parametry kultivace byly následující:
-13CZ 286509 B6 pH = 7,4
T = 37 °C pO2 - 50 mbarů byl regulován mícháním proudem vzduchu v rozmezí množství 1 až 3 litry/minutu.
2. Získání a mletí bakteriálních těl
Jeden litr kultivační suspenze byl centrifugován 20 minut na cca 6 400 g. Sedlina byla vnesena za míchání vrtulových míchadlem do stejného objemu pufru Tris lOmM s EDTA 1 mM, pepstatinu Img/litr a při pH 8.
Drcení bylo uskutečněno v lisu Manton-Gaulin při tlaku 700 barů dvěma pasážemi. Drť jako taková může být v případě podle tohoto příkladu uchovávána při -80 °C.
3. Extrakce
Po rozmražení bylo odebráno 5 ml drtě o optické densitě D.O. = 75 /30 g suché látky /litr/ a centrifugováno 50 minut na 23 300 g.
Takto získaná sedlina byla vyjmuta do jedné třetiny počátečního objemu pufrem Tris 0,1 mM, pH 7,0, pak bylo doplněno na původní objem roztokem obsahujícím arginin a to tak, aby výsledná koncentrace argininu byla 2,5 M a pH 8,0.
Pro tento příklad byl k argininu připojen pomocný detergent /Hecameg na finální koncentraci 20 g/litr.
Suspenze buněčné drtě takto vzniklé byla umístěna do rotační třepačky /300 otáček/minutu/ na dva dny při 4 °C.
Pak byla suspenze centrifugována naposled 50 minut při 23 300 g a supematant tvořil očekávaný extrakt.
4. Biochemické analýzy a biochemická aktivita.
a/ Stanovení úhrnu všech proteinů bylo uskutečněno metodou „Proteuin Assay“ Biorad.
b/ Metoda stanovení IL-13 rekombinovaného je stejná jako u příkladu 1.
Výtěžek IL-13 takto získaného extrakcí.
Získané výsledky jsou shrnuty do následující tabulky:
V suspenzi buněčné V supematantů _______________________________________drtě před extrakcí__________________po extrakci__________ úhrn všech proteinů 324g/ml 108g/ml
IL-13 rekombinovaný 575 ng/ml 390 ng/ml
V tomto příkladu bylo konstatováno, že uskutečněná extrakce buněčné drtě za přítomnosti 2,5 M argininu a pomocného detergentu umožňuje získat extrakční výtěžek okolo 70 %.
-14CZ 286509 B6
Příklad 5
Exprese IL-13 za přítomnosti argininu v kultivačním prostředí
Kmen E.coli RB 791/p922 byl kultivován v živném prostředí L obsahujícím ampicilin v množství lOOmg/litr za přítomnosti různých koncentrací argininu. Indukce byla zahájena 1 hodinu po naočkování přídavkem 1 mM IPGT a kultivace pokračovala ještě 3 hodiny.
Vzorky bakteriálních sedlin ekvivalentní 1 ml kultivační suspenze o optické densitě D.O=0,2 a vzorky odpovídajících supematantů byly naneseny na gel, vyvolány a kvantifikovány postupy popsanými výše. Výsledky představuje následující tabulka:
| Vzorek | D.O. konec kultivace | IL-13 vng/l,D.O. 1 |
| srovnávací vzorek | L17 | 388 |
| Arginin 2 g/1 | 1,24 | 455 |
| Arginin 4 g/1 | 1,24 | 600 |
| Arginin 8 g/1 | 1 | 720 |
Je zřejmé, že za pokusných podmínek a při uvažovaném systému exprese:
- arginin znatelně zvyšuje expresi periplasmatického IL-13 a to z 2g/litr na 4 g /litr.
- růst bakterie se zpomaluje při koncentraci 8 g/litr
- při těchto koncentracích arginin nezpůsobuje přestup IL-13 do supematantu.
Důležitost argininu v extrakčním procesu podle vynálezu spočívá ve schopnosti využít proteinové extrakty jako takové nebo po minimální úpravě při testování biologické aktivity.
Toto zjednodušení extrakční metody přináší výhodu jak pro průmyslovou výrobu rekombinovaných plasmatických proteinů, tak pro třídění tím, že se stanoví biologická aktivita v laboratorním měřítku. To se týká např. mutovaných proteinů.
Na rozdíl od guanidinhydrochloridu, kteiý je často používán jako extrakční činidlo, arginin nepůsobí agresivně na materiály používané v průmyslu, zejména na ocel. Arginin není ani znečisťovadlo, takže jeho použití nevyžaduje nákladnou úpravu odpadu.
Výhodný způsob exprese periplasmatického proteinu za přítomnosti argininu při koncentracích rovných nejméně 2 g/litr a zejména při koncentracích v rozmezí 2 g/litr až 10 g/litr upoutává na sebe pozornost vzrůstem výtěžku vylučovaného rekombinovaného proteinu získaného in vivo.
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Ukladatel (A) Jméno: SANOFI (B) Ulice: 32-34 rue Marboeuf (C) Město: Paříž (E) Země: Francie (F) PSČ: 57008 (G) Telefon: 53 77 41 31 (H) Fax: 53 77 42 16 (i i) Název vynálezu: Způsob extrakce periplasmatických proteinů z prokaryotních mikroorganismů (iii) Počet sekvencí: 1
-15CZ 286509 B6 (iv) Čtecí způsob pro počítač:
(A) Typ nosiče: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Systém provozu: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, Verse # 1.25 (OEB)
Informace o sekvenci ID č: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 4410 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduché (D) konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: ADN (geonomická) (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 1:
TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG CACGGTGCAC CAATGCTTCT GGCGTCAGGC GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC TTTTGCGCCG ACATCATAAC GGTTCTGGCA CTGACTGTTG CTTATAÍTAC ATCGATAGCG ATTTCACACA GTTTTTCGCG AAGAAGGAGA TGCGCTGACT ACCGTTGTAT TCTCTGCGTC
TTAACGCAGA ACCTAAACGC ATCTCGACTG AGCCATCCGA AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGTT AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA TAT.AATGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA TATACATATG AAAAAGATCC TGGCGTTAGC CGCCTTCGCT GGCCCTGTGC CTCCCAGTAC
120
180
240
300
360
420
TGCCCTCAGG CTGCAATGGC GGAATCCCTG CGGATTCTGC CAAAATCGAG CGAGGGACGG AGCCCGAAAG TGGGGCCTCT TACCAAGCTT TGTATGAGGT AACTAAAGGA CAAAAGGAGC AGCTTGATAC TATTCGGTCG AGCATAAAGT CGCTCACTGC CAACGCGCGG TGAGACGGGC GTCCACGCTG ATAACATGAG CAGCCCGGAC
GAGCTCATTG AGCATGGTAT ATCAACGTGT CCGCACAAGG GTGGCCCAGT TTCAACTGAA GAAGCTGAGT AAACGGGTCT GGCCGGATCA TTTGCTAAAC ATTGCGAATA CTTTAATTGT CGATAGTTGC CTGAGGCTTG CTAAAGCCTG CCGCTTTCCA GGAGAGGCGG AACAGCTGAT GTTTGCCCCA CTGTCTTCGG TCGGTAATGG
AGGAGCTGGT GGAGCATCAA CAGGCTGCAG TCTCAGCTGG TTGTAAAGGA ACTTCGAAAG TGGCTGCTGC TGAGGGGTTT AAGTTTTGTC AACTTTCAAC ΑΤΑΑΤΤΤΤΤΓ ATCGGTTTAT GCCGACAATG CAGGGAGTCA GGGTGCCTAA GTCGGGAAAC TTTGCGTATT TGCCCTTCAC GCAGGCGAAA TATCGTCGTA CGCGCATTGC
CAACATCACC CCTGACAGCT TGCCATCGAG GCAGTTTTCC CCTGCTCTTA CATCATTATT CACCGCTGAG TTTGCTGAAA GTCTTTCCAG AGITrCAGCG CACGTTGAAA CAGCTTGCTT ACAACAACCA AAGGCCGCTT TGAGTGAGCT CTGTCGTGCC GGGCGCCAGG CGCCTGGCCC ATCCTGTTTG TCCCACTACC GCCCAGCGCC
CAGAACCAGA GGCATGTACT AAGACCCAGA AGCTTGCATG CATTTAAAGA TGGGATCCGG CAATAACTAG GGAGGAACTA ACGTTAGTAA GAGTGAGAAT ATCTCCAAAA TCGAGGTGAA TCGCCCACGC TTGCGGGATC AACTCACATT AGCTGCATTA GTGGTTTTTC TGAGAGAGTT CTGGTGGTTA GAGATATCCG ATCTGATCGT
AGGCTCCGCT GTGCAGCCCT GGATGCTGAG TCCGAGACAC AACTTTTTCG CTGCTAACAA CATAACCCCT TATCCGGATG ATGAATTTTC AGAAAGGAAC AAAAAGGCTC TTTCTTAAAC ATAACCGATA GATCCGCGGA AATTGCGTTG ATGAATCGGC TTTTCACCAG GCAGCAAGCG ACGGCGGGAT CACCAACGCG TGGCAACCAG
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680
-16CZ 286509 B6
CATCGCAGTG GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG GTTTGTTGAA AACCGGACAT 1740 GGCACTCCAG TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT 1800 ATGCCAGCCA GCCAGACGCA GACGCGCCGA GACAGAACTT AATGGGCCCG CTAACAGCGC 1860 GATTTGCTGG TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG 1920 GGAGAAAATA ATACTGTTGA TGGGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC 1980 ATTAGTGCAG GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTAATGAT 2040 CAGCCCACTG ACGCGTTGCG CGAGAAGATT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC 2100 GCTTCGTTCT ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT 2160 CGCCGCGACA ATTTGCGACG GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG 2220 CAACGACTGT TTGCCCGCCA GTTGTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC 2280 CATCGCCGCT TCCACTTTTT CCCGCGTTTT CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GGTTCACCAC 2340 GCGGGAAACG GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG 2400 TTTCACATTC ACCACCCTGA ATTGACTCTC TTCCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA 2460 GGTTTTGCGC CATTCGATCT ACGCCGGACG CATCGTGGCC GCAAACCAAC CCTTGGCAGA 2520 ACATATCCAT CGCGTCCGCC ATCTCCAGCA GCCGCACGCG GCGCATCTCG GGCCGCGTTG 2580 CTGGCG1TTT TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT 2640 CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC 2700 CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT 2?60 TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC 2820 GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA 2880 TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA 2°4θ GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG 3000 TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG 3060 CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3120 AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACCCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA 3180
GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG 3240 ATTTTGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA 3300 AGTTTTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA 3360 ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC 3420 CCCGTČGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG 3480 ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA 3540 AGGGCCGAGC GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT 3600 TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT 3660 GCTGCAGGCA TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC 3720 CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC 3780 GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA 3840 GCACTGCATA ATTCTCTTAC TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG 3900 TACTCAACCA AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC TTGCCCGGCG 3960 TCAACACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA AAGTGCTCAT CATTGGAAAA 4020 CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA 4θ8θ CCCACTCGTG CACCCAACTG ATCTTCAGCA TCITTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA 4140 GCAAAAACAG GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA 4200 ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG 4260 AGCGGATACA TATITGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT 4320 CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCTAAGAA ACCATTATTA TCATGACATT AACCTATAAA 4380 AATAGGCGTA TCACGAGGCC CTTTCGTCCC 4410
Claims (6)
1. Způsob extrakce periplasmatického proteinu, zahrnující i) kultivaci prokaiyontního mikroorganismu, transformovaného pomocí vektoru exprese obsahujícího gen kódující uvedený protein a prostředky pro jeho expresi do periplasmy uvedeného mikroorganismu, ii) odstředění nebo mikrofiltraci získané kultivační směsi k získání buněčného podílu a případně lysi buněk získaného buněčného podílu a odstředění získaného lysátu k získání rozrušeného buněčného podílu, iii) suspendování získaného buněčného podílu nebo rozrušeného buněčného podílu v roztoku pufru, iv) odstředění získané suspenze k získání supematantu a v) izolaci uvedeného proteinu z tohoto supematantu, vyznačený tím, že roztok pufru obsahuje arginin.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se jako roztok pufru obsahující arginin použije alkalický vodný roztok mající koncentraci argininu alespoň rovnou 0,4 M.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že v případě, kdy se v roztoku pufru ve stupni iii) suspenduje buněčný podíl, použije se jako roztok pufru obsahující arginin alkalický vodný roztok mající koncentraci argininu 0,4 až 0,8 M.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že v případě, kdy se v roztoku pufru ve stupni iii) suspenduje rozrušený buněčný podíl, použije se jako roztok pufru obsahující arginin alkalický vodný roztok mající koncentraci argininu 0,4 až 2,5 M.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že extrahovaným proteinem je protein IL-13.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že extrahovaným proteinem je protein hGH.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501083A FR2729972B1 (fr) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ29096A3 CZ29096A3 (en) | 1996-08-14 |
| CZ286509B6 true CZ286509B6 (en) | 2000-04-12 |
Family
ID=9475667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1996290A CZ286509B6 (en) | 1995-01-31 | 1996-01-31 | Extraction process of periplasmatic protein |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5700665A (cs) |
| EP (1) | EP0725140B1 (cs) |
| JP (1) | JP3005464B2 (cs) |
| KR (1) | KR100401028B1 (cs) |
| CN (1) | CN1132842C (cs) |
| AR (1) | AR000831A1 (cs) |
| AT (1) | ATE250132T1 (cs) |
| AU (1) | AU700509B2 (cs) |
| BR (1) | BR9600270A (cs) |
| CA (1) | CA2168382C (cs) |
| CZ (1) | CZ286509B6 (cs) |
| DE (1) | DE69629965D1 (cs) |
| EA (1) | EA000017B1 (cs) |
| FI (1) | FI960427A (cs) |
| FR (1) | FR2729972B1 (cs) |
| HU (1) | HU222598B1 (cs) |
| IL (1) | IL116973A0 (cs) |
| MX (1) | MX9600380A (cs) |
| NO (1) | NO316519B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ280919A (cs) |
| PL (1) | PL183598B1 (cs) |
| SK (1) | SK281946B6 (cs) |
| TW (1) | TW403760B (cs) |
| UA (1) | UA27997C2 (cs) |
| ZA (1) | ZA96734B (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1048732A1 (de) | 1999-04-26 | 2000-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen |
| KR20010056451A (ko) * | 1999-12-15 | 2001-07-04 | 윤재승 | 아르기닌이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물 |
| EP1585574A4 (en) * | 2002-12-20 | 2006-04-26 | Cardiac Inv S Unltd Inc | DEVICE AND METHOD FOR IMPLANTING LEFT-VATRICULAR PIPE MACHINE IN KORONARSINUS |
| MY143274A (en) * | 2005-12-22 | 2011-04-15 | Genentech Inc | Recombinant production of heparin binding proteins |
| US20080125580A1 (en) | 2006-07-14 | 2008-05-29 | Genentech, Inc. | Refolding of Recombinant Proteins |
| GB201107737D0 (en) | 2011-05-09 | 2011-06-22 | Univ Birmingham | Extraction from cells |
| WO2022191223A1 (ja) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 | 株式会社カネカ | 原核生物細胞から標的タンパク質を抽出する方法 |
| JPWO2022201917A1 (cs) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | ||
| CN113249391A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-13 | 江苏坤力生物制药有限责任公司 | 一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6244198A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-02-26 | Toray Ind Inc | 有用タンパク質の生産方法 |
| JPS6251983A (ja) * | 1985-09-02 | 1987-03-06 | Hagiwara Yoshihide | ヒト／ヒト・ハイブリド−マ培養用無血清培地 |
| JPH0672105B2 (ja) * | 1985-10-02 | 1994-09-14 | 持田製薬株式会社 | 血栓溶解剤及びその製法 |
| DE3537708A1 (de) * | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
| DE3853479T2 (de) * | 1987-06-24 | 1995-09-28 | Genentech Inc | Ausgeglichenes, konstitutives, induzierbares transkriptionssystem. |
| FR2636644B1 (fr) * | 1988-08-24 | 1990-12-28 | Sanofi Sa | Sequence d'adn participant a la regulation de l'expression d'une sequence d'adn codant pour un precurseur d'un polypeptide, vecteurs d'expression et procede de production periplasmique du polypeptide |
| NZ243084A (en) * | 1991-06-12 | 1995-08-28 | Regeneron Pharma | Production and recovery of recombinant neurotrophins, genes for a modified lamb signal sequence, fusion genes and plasmids |
-
1995
- 1995-01-31 FR FR9501083A patent/FR2729972B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-01-25 SK SK106-96A patent/SK281946B6/sk unknown
- 1996-01-26 EA EA199600001A patent/EA000017B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 MX MX9600380A patent/MX9600380A/es unknown
- 1996-01-29 DE DE69629965T patent/DE69629965D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-29 UA UA96010341A patent/UA27997C2/uk unknown
- 1996-01-29 EP EP96400201A patent/EP0725140B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-29 AT AT96400201T patent/ATE250132T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 FI FI960427A patent/FI960427A/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 AR ARP960101196A patent/AR000831A1/es unknown
- 1996-01-30 KR KR1019960002120A patent/KR100401028B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 HU HU9600209A patent/HU222598B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 BR BR9600270A patent/BR9600270A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-30 CA CA002168382A patent/CA2168382C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-30 PL PL96312543A patent/PL183598B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 NO NO960396A patent/NO316519B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 CZ CZ1996290A patent/CZ286509B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 IL IL11697396A patent/IL116973A0/xx unknown
- 1996-01-31 ZA ZA96734A patent/ZA96734B/xx unknown
- 1996-01-31 AU AU42244/96A patent/AU700509B2/en not_active Ceased
- 1996-01-31 TW TW085101206A patent/TW403760B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-01-31 NZ NZ280919A patent/NZ280919A/en unknown
- 1996-01-31 CN CN96105578A patent/CN1132842C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 JP JP8015273A patent/JP3005464B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-31 US US08/594,469 patent/US5700665A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-08-06 US US08/906,957 patent/US5856142A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021200988A1 (en) | Gene therapy for retinitis pigmentosa | |
| US6187991B1 (en) | Transgenic animal models for type II diabetes mellitus | |
| KR20090013814A (ko) | 이소프레노이드의 생산 방법 | |
| CN108949825A (zh) | 一种靶向her2的car-t细胞的制备方法及应用 | |
| CN101802183A (zh) | 高保真度限制性内切核酸酶 | |
| TW403760B (en) | Method for the extraction of periplasmic proteins from prokaryotic microorganisms in the presence of arginine | |
| KR101616572B1 (ko) | 홍역-말라리아 조합 백신 | |
| CN108718529B (zh) | 用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法 | |
| WO1992017581A1 (en) | Mammalian expression vector | |
| CN114032217A (zh) | 基于dna载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗 | |
| CN114480385A (zh) | 基于来自耐酸酵母的基因的合成启动子 | |
| CN113186140B (zh) | 用于预防和/或治疗宿醉和肝病的基因工程细菌 | |
| CN113846071B (zh) | 一种酶活提高的丙氨酸-乙醛酸转氨酶突变体及应用 | |
| CN115707779A (zh) | 重组柯萨奇病毒a16病毒样颗粒及其用途 | |
| CN114250239A (zh) | 甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用 | |
| CN111492059A (zh) | 在宿主细胞中进行基因组编辑的方法 | |
| KR102454110B1 (ko) | ppGpp 생합성 관련 유전자 발현의 저해물질 탐색용 재조합 플라스미드 및 돌연변이 균주 | |
| CN114990163A (zh) | 用于干细胞基因修饰的慢病毒载体及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050131 |