CN1142502A - 在精氨酸存在下从原核微生物中提取周质蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及将精氨酸用作为提取重组周质蛋白质的一种试剂。本发明进一步涉及提取所需周质蛋白质的方法，该方法包括：(i)将原核微生物培养物的细胞或细胞碎片的沉淀悬浮于含有精氨酸的缓冲溶液中，所述微生物由含有编码所述蛋白质的基因以及在所述微生物周质中表达该基因所需工具的表达载体进行转化；以及(ii)在由此获得的细菌悬液的上清液中回收所需蛋白质。
Description
本发明涉及由原核微生物尤其是大肠杆菌生产的重组蛋白的提取方法。
将遗传工程技术用于生产所需蛋白质例如，胰岛素，白细胞介素，生长激素等等的现象与日俱增正越来越受到重视。
总的来说，用含有编码所需蛋白质的基因以及该基因表达所必需的工具例如调节信号的一种表达载体转化微生物。然后将该微生物培养于合适的培养基中并且根据合适的培养参数，以及当微生物细胞达到足够量时，加入一种诱导剂引发所谓的表达期，在该阶段，产生并积累高水平的所需蛋白质。在培养结束后，采用例如离心或微过滤方法将悬浮的细胞与培养基分离开，并且然后利用一种提取方法进行提取，所述提取方法的起始步骤常常是破碎该微生物的细胞壁。
根据所述基因使用的表达工具(启动子，终止子，核糖体结合位点，信号肽等等)的性质，编码所需蛋白质的基因在原核微生物中的表达可以是在胞质中，周质中或者是分泌性的。
胞质中表达可以获得大量的蛋白质。但是，在提取所需蛋白质之前，对于含有一个或多个二硫桥键的蛋白质，实施一个变性/复性步骤是必要的，但在以工业规模生产时该步骤特别麻烦和复杂。根据本领域内技术人员熟知的传统方法，在还原剂存在的条件下利用变性剂，接着利用包括尤其是监控溶液的氧化还原状态的复性条件，完成变性/复性步骤。在所使用的变性剂中，特别值得一提的是盐酸胍，在获得人白细胞介素-2的方法中已经建议使用这种物质。为此，可参见例如文献EP-A2-0,145,390。
对于革兰氏阴性细菌，因为这类细菌的生产能力低，所以极少或不使用分泌性表达***，在所述分泌性表达***中所需蛋白质以活性形式存在于培养基中。在这里应该注意到由于存在例如界面变性作用的危险，生物反应器中高密度细菌培养物的培养基对于敏感性重组蛋白质并不是理想的停留场所。
在周质中进行表达可在保护其免于环境损害的空间中直接获得原理上进行了正确折叠的重组蛋白质，因此，这种表达方式是获得蛋白质的明智的选择种类。因此，对于这种情况，将蛋白质进行变性/复性不是必要的。
在该领域内通常使用的细胞破碎方法是例如采用超声波或机械压力(French Pressue Cell，球丸研磨机)使细胞溶解，化学溶解或酶促溶解，利用离液序列高的试剂或去污剂进行渗透压休克和处理。这些方法可使大多数细胞膜包括质膜以及内质网膜破碎形成均质的细胞碎片悬液。通常在离心之后收集到的细胞碎片沉淀(核，细胞骨架，线粒体，溶酶体，核糖体，大分子等等)的性质特别依赖于离心的时间和速度(在1000g10分钟至150,000g3小时)而定。
在提取操作中遇到的困难是根据表达类型和所使用的提取方法而变化的，特别包括：
—重组蛋白质的产率受损
—重组蛋白质的生物活性丧失
—重组蛋白质的蛋白水解降解
—提取用试剂的毒性以及强性监测试剂的去除
—工业上实施的困难
—周质蛋白质和胞质蛋白质相混合。
此外，当产生的所需蛋白质是疏水或带电荷时，它们可能与本身也是疏水或带电荷的细胞成分相结合，从而使提取特别困难。
采用遗传工程技术进行工业化生产所需重组蛋白质具有越来越大的优势，但这使研制能避免上述弊端或使之降至最低程度的提取方法成为必需的。
实际上，不仅生产大量所需蛋白质是重要的，而且这些蛋白质必须不被提取试剂污染，并且必须保留其全部生物活性。
为了达到该目的，尤其是对于白细胞介素-2的提取/分离已建议了各种各样方法。
文献EP-A2-0,145,390描述了获得未糖基化的人白细胞介素-2(IL-2)的方法，该IL-2的比活性大于104U/mg，该方法使用了柱层析分离步骤用于提取IL-2。该方法还包括利用盐酸胍进行的变性步骤。
文献EP-A2-0,147,819提出了一种获得均质的以及纯的重组白细胞介素-2的方法。该方法包括培养由含有编码白细胞介素-2的基因的表达载体转化的微生物，促使细胞溶解，回收细胞碎片，通过用合适的洗液洗涤细胞碎片，然后采用层析方法从洗液中纯化而提取IL-2。所使用的洗液含有一种盐例如氯化钠或盐酸胍，或者一种去污剂例如已知商品名为“Triton X-100”的产品。
根据一种优选的方法，介绍了连续使用三种洗涤溶液，即含有氯化钠的洗液，含有一种去污剂的洗液以及含有盐酸胍的洗液。
文献EP-A1-0,337,243描述了一种纯化人白细胞介素-2的方法，该方法使用了两种反相液体层析柱的***。在层析纯化步骤之前，用含有盐酸胍的溶液对细菌细胞溶解产物的不溶部分进行提取，得到一种细菌提取物，然后用不含盐酸胍的缓冲液稀释该提取物，此后，进行层析，用乙腈梯度进行洗脱。
令人惊奇的是目前已发现，通过将源于所说微生物培养物的细胞或细胞碎片沉淀悬浮于一种缓冲溶液中，可以提取由原核微生物产生的所需蛋白质，所述原核微生物是用含有编码所需蛋白质的基因以及该基因表达所需的工具例如在周质中表达所需的调节信号的表达载体转化的，所述缓冲溶液最好含有精氨酸，这种精氨酸可以是L和/或D型。
根据第一方面，本发明的主题是精氨酸作为周质蛋白质提取试剂的应用。
根据另一方面，本发明的主题是提取所需周质蛋白质的方法，该方法包括：
1)将源于用表达载体转化的微生物培养物的细胞沉淀悬浮于一种含有精氨酸的缓冲溶液中(所述表达载体含有编码所述蛋白质的基因以及其在周质中表达必需的所有调节信号)，并且在合适pH，温度，细菌浓度等等条件下接触一个时期之后。
2)在由此获得的细菌悬液的上清液中回收所需蛋白质。
所述用于提取所需周质蛋白质的方法的一种变体形式包括将从源于培养物的细胞溶解之后获得的细胞碎片的沉淀悬浮于含有精氨酸的缓冲溶液中。
当提取缓冲液由含有精氨酸的水溶液组成并且当其pH是微碱性，优选等于8时，周质蛋白质的提取特别有效，其中溶液中精氨酸浓度至少为0.4M，于室温下在水中精氨酸的溶解度极限值范围内(在纯水中极限值在0.8M左右，并且上面溶液有盐存在)。
精氨酸是一种天然α-氨基酸，已有人建议将该氨基酸用作为Abbokinase(尿的纤维蛋白溶酶原激活因子)的双链的变性/复性/取代的辅助剂，在这一操作过程中天然肽链的一部分由合成肽链取代。为此，可参照论文：GA.Homandberg and T.wai inBiochimica etBiophysica Acta，1990，1038，209-215。
在本发明方法或变体方法中，没有实施蛋白质的变性/复性步骤并且精氨酸仅参与到从微生物的细胞或细胞碎片沉淀中提取蛋白质的步骤。
就蛋白质的产率和生物活性而言，精氨酸给蛋白质的提取带来显著效果。事实上发现例如用本发明方法回收到产率大于95％的成熟形式的IL-13，而且保留了该分子的生物活性。应该注意到在同样表达***中采用渗透压休克进行提取的试验并没有产生可与之相比的产率。
比较实验显示在同样条件下使用盐酸胍也能使回收到的IL-13蛋白质的产率大于95％以上。结果，与之相反，用此回收到的蛋白质的生物活性比采用精氨酸方法要大大地降低。
由于不希望局限于某些特定理论的解释，因而相对于为了实现提取需要在等于或大于5M的高浓度发挥变性作用的强有力的离液序列高的试剂例如盐酸胍而言，认为精氨酸起着温和的和生物学的离液序列高的试剂的作用。
可以在任何微生物培养方法之后实施本发明方法或其变体形式，所述微生物已用含有编码所需蛋白质的基因以及所述蛋白质在周质中表达需要的工具例如所有的必要调节信号的表达载体进行转化。
该方法可以应用到与大肠杆菌密切相关的细菌即所谓的组成肠杆菌科的兼性厌氧革兰氏阴性细菌，这对本领域内专业人员而言是显而易见的。在该肠杆菌科中，发现下列属内菌种特别适用：埃希氏杆菌，沙门氏菌，欧文氏菌，还有志贺氏菌，克雷氏菌，沙雷氏菌，变形菌和肠杆菌。
了解了精氨酸的离液序列高的特性，根据本发明，可优先用精氨酸替代其他离液序列高的试剂也是明显的。由于所谈论的活***之间存在差异因而不可能在所有细菌科中举证，但本领域技术人员知道怎样将精氨酸提取方法应用或适用于其特定的情况。
所述培养方法也是本领域内技术人员熟知的。涉及革兰氏阴性细菌的发酵培养方法已有描述，例如在EP-360,641和EP-356,335专利中报道了已知名为SEBR1250和TP2339的大肠杆菌菌株的获得和使用。
当达到所需的细胞量时，将培养物进行离心(一般情况)或微过滤，并且根据本发明的方法将获得的生物量沉淀与含有精氨酸的缓冲液相接触。
作为一般规则，该操作步骤是在室温约为25℃至2℃，优选为4℃的温度条件下进行的。
细胞沉淀与含有精氨酸的缓冲液的接触时间必须保证足以使所需蛋白质传递到缓冲液中。
总的来说，在4℃完成该步骤时，优选的接触时间约为1小时。
在生物量与含有精氨酸的提取缓冲液接触期间提取过程，也就是周质蛋白质传递到培养基中的过程连续进行。完全提取或者含量不再进一步变化的提取所用的接触时间为30分钟至16小时。试验证明在温度为4℃，几小时之内就可获得满意的提取产率。还要注意应将提取缓冲液中的生物量缓慢地搅拌以避免微生物团粒沉积从而获得优良结果，也就是说较高水平的提取是时间的函数。
本发明所述的提取方法既适用于提取疏水蛋白质例如白细胞介素，尤其是在文献EP-A1-0,506,574中描述的IL-13，也适用于提取亲水蛋白质例如生长激素(hGH)。本发明方法简化了获得hGH的步骤，而常规的hGH方法需要使用渗透压休克进行提取。
为了实现直接从悬浮的细胞沉淀中提取所需的蛋白质，优选使用含有浓度为0.4M至0.8M的精氨酸的缓冲液。
当希望采用本发明方法的变体从细胞碎片沉淀中提取所需的周质蛋白质时，可采用类似于在本发明中使用的方法直到在离心或微过滤之后获得细胞沉淀的步骤，然后根据本领域内熟知的方法完成细胞的破碎。细胞破碎方法描述于例如C.T.Choma和H.Yamazaki，Can.J.Microbiol.，1981，27，547-550；L.O.Ingram，Journal of Bacteriology，1981，146，1，331-336；N.G.Nossal和L.A.Heppel.Journal of Biological Chemistry，1966，241，13，3065-3072；R.Bennett，D.R.Taylo和A.Huret，Biochem.Biophys.Acta，118，512-521(1966)以及描述于论文集Fermentation and enzymetechnology，Chap，12，239-309，J.Wiley and Sons publishers(1979)。
作为一般规则，将通过离心收集到的细胞碎片沉淀悬浮后与含有精氨酸的缓冲液接触。细胞碎片悬液与含有精氨酸的缓冲液的接触时间必须保证足以使所需蛋白质传递到缓冲溶液中。一般来说，在4℃温度时，几乎完全提取所需的接触时间是48小时。同样，注意到缓慢地搅拌提取缓冲液中的生物量，从而避免细胞碎片沉积，可以得到与时间呈函数关系的高水平的提取量。
本发明的提取方法的一种变体方法尤其适用于提取所需的周质蛋白质，这种蛋白质与细胞膜紧密结合，例如白细胞介素。
本领域内的技术人员熟知本发明所述含有精氨酸的提取缓冲液还可以含有一种辅助去污剂，该去污剂具有提高产率和/或提取所需蛋白质的提取速率的作用。在所使用的辅助去污剂中，本领域内的技术人员能够选择那些能维持使用精氨酸作为提取试剂的优点，尤其是所需蛋白质的生物活性的保留的去污剂。在这些温和的辅助去污剂中，可提及的有，例如烷基糖苷如烷基麦芽糖苷，壬基α-或者β-D-吡喃葡糖苷，辛基α-或者β-D-吡喃葡糖苷或烷基氨基甲酰基甲基α-或者β-D-吡喃葡糖苷例如，Hecameg。其毒性非常低，意味着其可在最终产品中以微量存在作为配方试剂。
为了实施从细胞碎片沉淀的悬液中提取所需蛋白质，优选使用含有浓度为0.4M至2.5M的精氨酸的缓冲溶液，特别是在盐存在下获得2.5M精氨酸浓度是可能的。
而且，发现如果将精氨酸以比从商品蛋白质水解液制造的培养基中含有的精氨酸浓度高得多并且能满足所使用菌株对精氨酸的需求的非常规浓度加入时，对分泌的重组周质蛋白质的产率带来非常有利的影响。
此外，发现如果加到培养基中的精氨酸浓度为2克/升到10克/升之间时，由精氨酸发挥的有利影响尤其可观。
因此，根据另一方面，本发明的主题是培养一种原核微生物的方法，该微生物已用含有编码所需蛋白质的基因的表达载体进行转化，该培养方法包括在浓度相等于或至少为2克/升，尤其是浓度为2克/升到10克/升之间的精氨酸存在时培养所述微生物。
本领域内的技术人员对于各个特定的情况将会找到最佳的精氨酸浓度。
该方法特别适用于生产具有细胞因子类型活性的蛋白质特别是IL-13，如文献EP-A1-0.506，574描述的。
下文中借助实施例对本发明进行更详细的描述，所给出的实施例仅是为了描述本发明。
实施例1
在精氨酸存在下从大肠杆菌细胞沉淀中提取周质IL-13。
1/培养瓶培养：
在本实施例中，使用了根据本发明方法获得的P922质粒转化的大肠杆菌RB791菌株(Roger Brent，PNAS78(1981)pp.4204-4208)，该p922质粒类似于欧洲专利EP360,641和356,335中定义的质粒，并且其DNA序列是SEQ ID No.1的序列。
下文中显示了组成该p922质粒的不同序列。
启动子序列
粗体字显示了大肠杆菌中的启动子所特有的六个核苷酸TTGCTT和TATAAT
XhoI
1 TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG TTAACGCAGA ACCTAAACGC
51 ATCTCGACTG CACGGTGCAC CAATGCTTCT GGCGTCAGGC AGCCATCGGA
101 AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC
151 TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGTT TTTTGCGCCG ACATCATAAC
-35
201 GGTTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA CTGACTGTTG
-10
251 CTTATATTAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GG
信使的未转译5′-引物区的序列
粗体字显示了核糖体结合位点。在该序列的3-引物端定位的CAT序列是由NdeI限制性酶识别的六个核苷酸的一部分。
RBS
283 AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGT TTTCGCGAA GAAGGAGATA
333 TACAT
编码IL-13前体的序列
用斜体描述的序列对应于成熟IL-13的序列。未用粗体字书写的序列是，将编码IL-13的序列的末端与由限制性酶BamHI识别的六个核苷酸相连接的接头序列。338 ATGAAAAAGA TCCTGGCGTT AGCTGCGCTG ACTACCGTTG TATTCTCTGC388 GTCCGCCTTC GCTGGCCCTG TGCCTCCCAG TACTGCCCTC AGCGAGCTCA438 TTGAGGAGCT GGTCAACATC ACCCAGAACC AGAAGHCTCC GCTCTHCAAT488 GGCAGCATGG TATGGAGCAT CAACCTGACA GCTGGCATGT ACTGTGCAGC538 CCTGGAATCC CTGATCAACG TGTCAGGCTG CAGTGCCATC GAGAAGACCC588 AGAGGATGCT GAGCGGATTC TGCCCGCACA AGGTCTCAGC TGGGCAGTTT638 TCCAGCTTGC ATGTCCGAGA CACCAAAATC GAGGTGGCCC AGTTTGTAAA688 GGACCTGCTC TTACATTTAA AGAAACTTTT TCGCGAGGGA CGGTTCAACT738 GAAACTTCGA AAGCATCATT ATTTG
终止序列763 GGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA
噬菌体T7基因10终止子813 CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCTCTAA ACGGGTCTTG
HindIII863 AGGGGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TCCGGATGTA CCAAGCTTGG913 CCGGATCAAA GTTTTGTCGT CTTTCCAGAC GTTAGTAAAT GAATTTTCTG963 TATGAGGTTT TGCTAAACAA CTTTCAACAG TTTCAGCGGA GTGAGAATAG
噬菌体fd终止子1013 AAAGGAACAA CTAAAGGAAT TGCGAATAAT AATITYFYCA CGTTGAAAAT1063 CTCCAAAAAA AAAGGCTCCA AAAGGAGCCT TTAATTGTAT CGGTTTATCA1113 GCTTGCTITC GAGGTGAATT TCTTAAACAG CTTGATACCG ATAGTTGCGC1163 CGACAATGAC AACAACCATC GCCCACGCAT AACCGATATA TTCGGTCGCT1213 GAGGCTFGCA GGGAGTCAAA GGCCGCTTTT GCGGGATCGA T
编码乳糖操纵子阻遏物的基因1254 CCGCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC1304 TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG1354 TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT1404 GCGTATTGGG CGCCAGGGTG GTTTTTCTTT TCACCAGTGA GACGGGCAAC1454 AGCTGATTGC CCTTCACCGC CTGGCCCTGA GAGAGTTGCA GCAAGCGGTC1504 CACGCTGGTT TGCCCCAGCA GGCGAAAATC CTGTTTGCTG GTGGTTAACG1554 GCGGGATATA ACATGAGCTG TCTTCGGTAT CGTCGTATCC CACTACCGAG1604 ATATCCGCAC CAACGCGCAG CCCGGACTCG GTAATGGCGC GCATTGCGCC1654 CAGCGCCATC TGATCGTTGG CAACCAGCAT CGCAGTGGGA ACGATGCCCT1704 CATTCAGCAT TTGCATGGTT TGTTGAAAAC CGGACATGGC ACTCCAGTCG1754 CCTTCCCGTT CCGCTATCGG CTGAATTTGA TTGCGAGTGA GATATTTATG1804 CCAGCCAGCC AGACGCAGAC GCGCCGAGAC AGAACTTAAT GGGCCCGCTA1854 ACAGCGCGAT TTGCTGGTGA CCCAATGCGA CCAGATGCTC CACGCCCAGT1904 CGCGTACCGT CTTCATGGGA GAAAATAATA CTGTTGATGG GTGTCTGGTC1954 AGAGACATCA AGAAATAACG CCGGAACATT AGTGCAGGCA GCTTCCACAG2004 CAATGGCATC CTGGTCATCC AGCGGATAGT TAATGATCAG CCCACTGACG2054 CGTTGCGCGA GAAGATTGTG CACCGCCGCT TTACAGGCTT CGACGCCGCT2104 TCGTTCTACC ATCGACACCA CCACGCTGGC ACCCAGTTGA TCGGCGCGAG2154 ATTTAATCGC CGCGACAATT TGCGACGGCG CGTGCAGGGC CAGACTGGAG2204 GTGGCAACGC CAATCAGCAA CGACTGTTTG CCCGCCAGTT GTTGTGCCAC2254 GCGGTTGGGA ATGTAATTCA GCTCCGCCAT CGCCGCTTCC ACTTTTTCCC2304 GCGTTTTCGC AGAAACGTGG CTGGCCTGGT TCACCACGCG GGAAACGGTC2354 TGATAAGAGA CACCGGCATA CTCTGCGACA TCGTATAACG TTACTGGTTT2404 CACATTCACC ACCCTGAATT GACTCTCTTC CGGGCGCTAT CATGCCATAC2454 CGCGAAAGGT TTTGCGCCAT TCGATCTACG CCGGACGCAT CGTGGCCGCA2504 AA
pBR 327的序列
PflmI2506 CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC CAGCAGCCGC2556 ACGCGGCGCA TCTCGGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC2606 CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC2656 CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT2706 GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC2756 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC2806 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC2856 CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA2906 ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG2956 ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG3006 GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC3056 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA3106 CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC3156 GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT3206 CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA3256 TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT3306 TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT3356 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC3406 ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT3456 ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG3506 CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA3556 AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG3606 GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG3656 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA3706 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT3756 GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA3806 AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT3856 CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC3906 AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC3956 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG4006 CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC4056 GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT4106 CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG4156 CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT4206 CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC4256 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG4306 GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT4356 TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC4406 GTCCC
质粒pBR327描述于Gene，9,287～305(1980)。
在含有100mg/升氨苄青霉素的L培养基(Luria肉汤培养基，描述于Molecular Cloning，A Laboratory ManualSambrook，Fritsch，Maniatis；Cold Spring Harbor Laboratroy Press，2nd edition 1989)上，以200rpm的转速在30℃将大肠杆菌RB791/p922菌株预培养过夜。将该预培养物进一步接种到含L培养基的培养瓶中，使起始OD值(OD＝在600nm处测得的光密度值，OD＝1时对应于每升中含有400-450mg的生物量)为0.6。在接种一小时之后，用1mM IPTG(异丙基β-D-1-半乳糖呋喃糖硫苷)诱导该培养物并且连续培养3小时。将该细菌悬液的样品离心并将由此回收到的细菌沉淀悬浮于下面的提取缓冲液中，以便使提取时最后的OD值达到10，这相当于每升中含有4.5克生物量。
本实施例中使用如下所述提取缓冲液：
A：溶于Milli-Q水(Millipore)中的0.8M精氨酸，用HCl将pH校正到8.0。
B：溶于Milli-Q水中的5M盐酸胍，未进行pH校正，
提取是在4℃，温和磁搅拌条件下进行1小时。
为了检测提取效率，取出1ml光密度OD为0.2的培养物悬液样品，并且以5,000g将该样品离心10分钟获得相应的细菌沉淀，将该沉淀用SDS变性后加到16.5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。再将细菌悬液离心，通过超过滤(Millipore Ultrafree-MC过滤装置，其截留临界值为5,000Da)将上清液脱盐，然后加到凝胶上。利用抗-CHO IL-13抗体进行Western印迹分析肉眼观察凝胶本身，并且用Phosphor Imager R(Molecular Dynamics)定量分析。本实施例中使用的抗-CHO(中国仓鼠卵巢)IL-13抗体是免疫接种兔获得的。
在本实施例中发现，对于成熟形式在盐酸胍存在下或者换种方式在精氨酸存在下的提取过程事实上是圆满的，在两种情况下其提取产率均高于99％。还注意到在精氨酸存在下从上清液提取时没有看到IL-13的前体形式，这与在盐酸胍存在下获得的提取结果完全不同。
2/发酵罐培养：
在含有100mg/升氨苄青霉素的L培养基中接种大肠杆菌RB791/p922菌株，并在30℃搅拌培养到形成预培养物。取该预培养物100ml用作为总体积为2.5升的MBR牌发酵罐的接种物。培养是在1.2升体积培养基中进行的，培养基组成如下所述并且在下文中定义了培养条件。
大肠杆菌RB791/p922的发酵培养基
下面给出的是终体积为1升的配方，其中应扣除接种物的体积。
1.溶于700ml的Milli-Q水中
添加Milli-Q水至800ml，在120℃高压蒸汽灭菌30分钟。2.在100ml Milli-Q水中通过0.2μm滤膜过滤：
| 成分 | 升 |
| EDTA | 1g |
| FeSO4·7H2O | 45mg |
| MgSO4·7H2O | 1.5g |
| K2SO4 | 0.75g |
| CaCl2·2H2O | 32mg |
| NaCl | 1.45g |
| KCl | 5g |
| HY-SOY | 75g |
| L-甲硫氨酸 | 1.4g |
| 色氨酸 | 1g |
| 微量元素* | 2ml |
| 酵母提取物 | 10g |
| 甘 油 | 15克 |
| K2HPO4 | 7.1克 |
在培养期间甘油浓度保持在10到15克/升之间。
3.在诱导时加入：
在其他计算方法中并不包括这次加入的体积。*微量元素溶液按照1ml/升的比例使用该溶液。对于终体积为1升的Milli-Q水，下列物质溶于800ml水中：
| IPTG | 1g |
| 6-氨基己酸 | 0.65g |
| HY-SOY | 40g |
| L-半胱氨酸 | 0.3g |
| 质量/l | |
| H3BO3 | 3mg |
| NaMoO4·2H2O | 4.8mg |
| MnSO4·H2O | 59mg |
| CoCl2·6H2O | 23.8mg |
| CuSO4·5H2O | 8.7mg |
| ZnSO4·7H2O | 13mg |
| AlCl3·6H2O | 60mg |
| KCr(SO4)2·12H2O | 6mg |
| KI(在使用时加入) | 60mg |
| NiSO4·6H2O | 2.6mg |
加入100ml浓HCl。用Milli-Q水将体积调至1000ml。
当OD值达到58时，通过加入浓度为1克/升的IPTG激发IL-13的表达，并继续培养5小时。
发酵罐培养参数如下：
pH＝7.4
T＝30℃
pO2＝40mmHg，通过搅拌调节，空气流速在1到3升/分钟之间。
所使用的提取方法和检测生物活性的方法相同于上文第一节中描述的方法。
发现在盐酸胍或另一种方式在精氨酸存在下，对从发酵罐而不是培养瓶获得的细菌沉淀进行提取时，对IL-13成熟形式而言事实上是圆满的，在两种情况下提取产率均大于97％。
实施例2
由此方法提取到的IL-13的生物活性
按照上文描述的超过滤方法将实施例1中盐酸胍或精氨酸存在下获得的提取物进行脱盐处理。在经过系列稀释之后，将提取物与依赖于IL-13的B9细胞系的亚克隆接触。经过稀释的样品的IL-13活性诱导了B9细胞的生长并测定半增殖的浓度。在接触3天之后通过加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)终止细胞生长并且通过吸收在565nm处产生的蓝颜色而用分光光度计检测。以相对于IL-13标准物的ng/ml值表示IL-13生物活性，该IL-13标准物本身已用待选的国际标准物进行校正，该标准是从根据N.Vita，Archieves of Biochemistry and Biophysics，1983，225，2，436-445免疫接种兔而获得的CHO IL-13培养物得到的。
下文表II中显示了得到的结果。
表II
| 在B9细胞系中进行试验 | IL-13的量ng/ml | 生物活性ng/ml | 比生物活性 |
| 对照 | 500 | 500 | 100 |
| 精氨酸 | 3,200 | 1,376 | 43 |
| 胍 | 4,300 | 1,098 | 25 |
上述结果证明在进行其他后继的纯化操作之前精氨酸提取物的比生物活性大于盐酸胍提取物中的比生物活性。
实施例3
在精氨酸存在下从大肠杆菌细胞沉淀中提取周质hGH
在含有100mg/升氨苄青霉素的L培养基(Luria肉汤)中将SEBR1250菌株(EP-360，641和EP-356，335)以200rpm速率搅拌，于37℃预培养过夜。将该培养物再接种于含L培养基的培养瓶中，以便使起始OD值达0.2。在等待一小时之后，用1mM IPTG诱导培养物，并继续培养3小时。将细菌悬液的样品进行离心，将由此获得的细菌沉淀悬浮于提取缓冲液中，使在提取时的最终OD＝10，这相当于～4.5克生物量/升。
提取条件如下：
| 离液序列高试剂 | pH | T | 时间 |
| 0.8M精氨酸 | 8.0 | 22℃ | 20小时 |
| 0.8M精氨酸 | 8.0 | 4℃ | 20小时 |
为了检测提取效率，取出OD值为0.2，相当于1ml培养悬液样品，将样品以5,000g离心10分钟获得相应的细菌沉淀，在用SDS变性之后加样品到16.5％聚丙烯酰胺凝胶上。将细菌悬液离心，将其上清加到凝胶上。利用抗-hGH抗体进行Western印迹法肉眼观察凝胶本身，并用Phosphor Imager(Molecular Dynamics)进行定量分析，所使用的抗-hGH抗体是免疫接种兔获得的。
对用Pohosphor Imager获得的谱带进行分析得出下列结论，在精氨酸存在下提取大肠杆菌中产生的人周质hGH是有效的。在本实施例中，在0.8M精氨酸存在下，pH8.0，T22℃以及在20小时时期内可以获得至少60％产率，而在0.8M精氨酸存在下，pH8.0，T4℃以及在20小时时期内可以获得大于80％的提取产率。
由于hGH是一种疏水蛋白，可以总结出在精氨酸存在下可方便地提取到在大肠杆菌周质中积累的其性质有很大变化的重组蛋白质。
实施例4
在精氨酸存在下从大肠杆菌细胞碎片中提取周质IL-13
1/发酵罐培养
在本实施例中，使用了与实施例1中定义的菌株相类似的大肠杆菌TP2339(EP360，641和EP356，335)菌株，该菌株已用根据本发明方法获得的p922质拉转化。
在含有100mg/升氨苄青霉素的L培养基中接种大肠杆菌TP229/p922菌株并在30℃搅拌条件下培养直到形成预培养物。取预培养物100ml用于接种到总体积为2.5升的MBR发酵罐中。培养是在1.2升体积培养基以及下文定义的条件下完成的。
大肠杆菌TP2339/p922的发酵培养基
以终体积为1.2升计算，培养基由1升经过高温蒸汽消毒的相和0.1升其组成描述于下文中的过滤相，以及0.1升上文中定义的预培养物加入组成的。
1/经过高温蒸汽消毒的相(1000ml)：
溶解于900ml的Milli-Q水中：
| 质量/l | |
| 麦黄酮 | 360g |
| FeSO4·7H2O | 280g |
| CaCl2·2H2O | 6.7g |
| MgCl2·6H2O | 1.27g |
| K2SO4 | 8.71g |
| NaCl | 500g |
| KCl | 5g |
| Hy-Case(SF) | 25g |
| 酵母抽提物 | 18g |
| 微量元素* | 1ml |
| L-精氨酸 | 1.5g |
用KOH溶液将pH调至7.4，然后用Milli-Q水加至1000ml。在120℃高压蒸汽灭菌30分钟。
2/过滤相(100ml)
在无菌条件下通过一个0.2μm膜过滤：
| 葡萄糖 | 20克 |
| 甘油 | 50克 |
| K2HPO4 | 5克 |
在培养期间将葡萄糖浓度维持于5到15克/升之间。
当OD值达到40(每升干物质量约16克)时，通过加入浓度为1克/升的IPTG而引发IL-13的表达，并继续进行5小时。培养参数如下所述：
用3NHCl和KOH将pH调节到7.4
T＝37℃
pO2由搅拌调节为50mbar，空气流速为1到3升/分钟
2/细菌胞体的回收和研磨
以～6400g将1升培养物悬浮液离心20分钟。将沉淀溶解于相同体积的10mM Tris缓冲液，1mM EDTA，1mg/升胃蛋白酶抑制剂，pH8中，并且用一个螺旋浆形搅拌器进行机械搅拌。
在Manton-Gaulin挤压器中以700巴的压力进行2个周期完成研磨。在本实施例中经过研磨的制剂可在-80℃贮存。
3/提取
在解冻之后，取出5ml OD值相当于75(每升干物质为30克)的经过研磨的制剂，然后以23,300g离心50分钟。
将由此得到的沉淀溶于体积为上面起始时使用体积的1/3的0.1mM Tris缓冲液pH7.0中，并且然后用含有精氨酸的溶液将体积调节到相等于初始体积，以便使最后精氨酸浓度达到2.5M并且pH为8.0。
对于该实施例，将辅助去污剂(终浓度为20克/升的Hecameg)与精氨酸结合使用。
以这种方式制备的细胞碎片悬液置于转速为300rpm，4℃的旋转搅拌器中2天。
以23,300g将悬液离心，总共时间为50分钟，上清液中含有预期的提取物。
4/生化分析以及生物活性分析
a)采用Biorad＂Protein Assay＂方法对总蛋白质进行分析。
b)使用实施例1中方法分析重组IL-13。
由此方法提取到的IL-13的产率：所获得的结果描述于下列表中：
| 在提取之前细胞碎片悬液中 | 提取后的上清液中 | |
| 总蛋白质 | 324μg/ml | 108μg/ml |
| 重组IL-13 | 575ng/ml | 390ng/ml |
在该实施例中发现在2.5M精氨酸和一种辅助去污剂存在下对细胞碎片进行提取可使提取产率达到约70％。
实施例5
在精氨酸存在下IL-13在培养基中的表达
在不同浓度的精氨酸存在下在含有100mg/升氨苄青霉素的L培养基中培养大肠杆菌RB791/p922。接种1小时之后，加入1mMIPTG激发诱导作用，并且继续培养3小时。
将相当于OD为0.2的1ml培养悬液的细菌沉淀样品以及相应的上清液样品加到凝胶上电泳，肉眼观察并按上文描述定量分析。结果显示于下面表中：
| 样品 | 培养结束时OD值 | OD为1时IL-13的ng/升数 |
| 对照 | 1.17 | 388 |
| 精氨酸2克/升 | 1.24 | 455 |
| 精氨酸4克/升 | 1.24 | 600 |
| 精氨酸8克/升 | 1 | 720 |
显然，在实验条件以及所用的表达***中：
-精氨酸浓度为2克/升时周质IL-13表达提高，浓度为4克/升时基本上也能提高表达，
-在浓度为8克/升时细菌生长速率减慢，
-在所述浓度时，精氨酸并不会使IL-13渗泄到上清中。
本发明所述精氨酸提取方法的价值在于可将蛋白质提取物直接用于或经过最低程度的处理后用于生物活性检测试验。
提取方法的这种简化作用对重组周质蛋白质的工业生产以及对通过以实验室规模分析与例如突变蛋白质相关的生物活性而进行筛选都有益处。
与常常用作提取试剂的盐酸胍截然不同，精氨酸不会侵蚀工业上使用材料尤其是钢。再者，精氨酸是非污染性试剂，因而不需要代价昂贵的污水处理过程。
由体内获得的分泌重组蛋白质的产率提高的事实证明在浓度相当于至少2克/升，尤其是浓度为2克/升至10克/升的精氨酸存在下在培养基中表达周质蛋白质的价值。
序列表(1)综合资料(i)申请人：(A)姓名：SANOFI(B)街道：32-34 rue Marbeuf(C)城市：巴黎(E)国家：法国(F)邮编(EIP)：75008(G)电话：53.77.41.31(H)传真：53.77.42.16(ii)发明名称：在精氨酸存在下从原核微生物中提取周质蛋白质的方法(iii)序列数：1(iv)计算机可读形式：
(A)媒体类型：Floppy软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID No：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：4400个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)几何结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：(A)名称/关键词：启动子(B)位置：1..282(ix)特征：(A)名称/关键词.5′UTR(B)位置：283..337(D)其他资料：/注释＝＂信使RNA的未转译5’区序列＂(ix)特征：(A)名称/关键词：misc-RNA(B)位置：338..762(D)其他资料：/注释＝＂IL-13前体的编码序列＂(ix)特征：(A)名称/关键词：终止子(B)位置：763..812(D)其他资料：注释＝＂终止序列＂(ix)特征：(A)名称/关键词：终止子(B)位置：813..1012(D)其他资料：/注释＝＂噬菌体T7基因10终止子＂(ix)特征：(A)名称/关键词：终止子(B)位置：1013..1253(D)其他资料＂/注释＝＂噬菌体fd终止子＂(ix)特征：(A)名称/关键词：misc-RNA(B)位置：1254..2505(D)其他资料：/注释＝＂编码乳糖操纵子阻遏物的基因＂(ix)特征：(A)名称/关键词：misc-RNA(B)位置：2506..4410(D)其他资料：/注释＝＂pBR327的序列＂(xi)序列描述：SEQ ID No：1TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG TTAACGCAGA ACCTAAACGC ATCTCGACTG 60CACGGTGCAC CAATGCTTCT GGCGTCAGGC AGCCATCGGA AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA 120GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGTT 180TTTTGCGCCG ACATCATAAC GGTTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA 240CTGACTGTTG CTTATATTAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA 300ATTTCACACA GTTTTTCGCG AAGAAGGAGA TATACATATG AAAAAGATCC TGGCGTTAGC 360TGCGCTGACT ACCGTTGTAT TCTCTGCGTC CGCCTTCGCT GGCCCTGTGC CTCCCAGTAC 420TGCCCTCAGG GAGCTCATTG AGGAGCTGGT CAACATCACC CAGAACCAGA AGGCTCCGCT 480CTGCAATGGC AGCATGGTAT GGAGCATCAA CCTGACAGCT GGCATGTACT GTGCAGCCCT 540GGAATCCCTG ATCAACGTGT CAGGCTGCAG TGCCATCGAG AAGACCCAGA GGATGCTGAG 600CGGATTCTGC CCGCACAAGG TCTCAGCTGG GCAGTTTTCC AGCTTGCATG TCCGAGACAC 660CAAAATCGAG GTGGCCCAGT TTGTAAAGGA CCTGCTCTTA CATTTAAAGA AACTTTTTCG 720CGAGGGACGG TTCAACTGAA ACTTCGAAAG CATCATTATT TGGGATCCGG CTGCTAACAA 780AGCCCGAAAG GAAGCTGAGT TGGCTGCTGC CACCGCTGAG CAATAACTAG CATAACCCCT 840TGGGGCCTCT AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTGCTGAAA GGAGGAACTA TATCCGGATG 900TACCAAGCTT GGCCGGATCA AAGTTTTGTC GTCTTTCCAG ACGTTAGTAA ATGAATTTTC 960TGTATGAGGT TTTGCTAAAC AACTTTCAAC AGTTTCAGCG GAGTGAGAAT AGAAAGGAAC 1020AACTAAAGGA ATTGCGAATA ATAATTTTTT CACGTTGAAA ATCTCCAAAA AAAAAGGCTC 1080CAAAAGGAGC CTTTAATTGT ATCGGTTTAT CAGCTTGCTT TCGAGGTGAA TTTCTTAAAC 1140AGCTTGATAC CGATAGTTGC GCCGACAATG ACAACAACCA TCGCCCACGC ATAACCGATA 1200TATTCGGTCG CTGGAGCTTG CAGGGAGTCA AAGGCCGCTT TTGCGGGATC GATCCGCGGA 1260ACCATAAAGT GTAAAGCCTG 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Claims (6)
1.精氨酸的应用，用作为提取重组周质蛋白质的试剂。
2.提取所需周质蛋白质的方法，该方法包括：
1/将来自于原核微生物培养物细胞沉淀悬浮于含有精氨酸的缓冲液中，所述微生物已由含有编码所述蛋白质的基因和该基因在所述微生物的周质中表达所需工具的表达载体进行转化；并且
2/在由此获得的细菌悬液的上清液中回收所需蛋白质。
3.提取所需周质蛋白质的方法，该方法包括：
1/将原核微生物培养物的细胞碎片沉淀悬浮于含有精氨酸的缓冲液中，所述微生物已由含有编码所述蛋白质的基因以及该基因在所述微生物周质中表达所需工具的表达载体进行转化；并且
2/在由此获得的细菌悬液上清中回收所需蛋白质。
4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于含有精氨酸的缓冲溶液是一种碱性水溶液，该溶液含有浓度至少为0.4M的精氨酸。
5.培养原核微生物的方法，所述微生物已由含有编码所需蛋白质的基因的表达载体进行转化，其特征在于该方法包括在浓度至少为2克/升的精氨酸存在下完成培养。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于培养是在浓度为2克/升到10克/升之间的精氨酸存在下完成的。
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|---|---|---|---|---|
| CN113249391A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-13 | 江苏坤力生物制药有限责任公司 | 一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途 |
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