SK278333B6

SK278333B6 - Nucleic acid coding lymphotoxin

Info

Publication number: SK278333B6
Application number: SK3930-85A
Authority: SK
Inventors: Bharat B Aggarwal; Timothy S Bringman; Patrick W Gray; Glenn E Nedwin
Original assignee: Aggarwal Bharat B.; Bringman Timothy S.; Gray Patrick W.; Nedwin Glenn E.
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-31
Publication date: 1996-11-06
Also published as: EP0509553A1; JP2804237B2; FI852143A0; DK171531B1; ES8802182A1; NO852173L; YU91985A; CA1340641C; EP0164965A2; JP2521703B2; JPH07291995A; EP0164965B1; FI93025B; DK241385A; IE930589L; AU4320385A; BG60256B1; DE3587597D1; HU204085B; RO100383B1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nukleovej kyseliny kódujúcej lymfotoxín.

Doterajší stav techniky

Lymfotoxín bol prvýkrát identifikovaný ako biologický faktor s protibunkovou účinnosťou na neoplastické (novotvarové) bunkové línie. Účinnosť, ktorá sa opisuje ako lymfotoxínová, získava sa z lymfocytov stimulovaných mitogénom, je spojená so spektrom cytotoxických účinností od cytostázy určitých nádorových bunkových línií do význačnej cytolýzy iných transformovaných buniek. Lymfotoxínová účinnosť je však charakterizovaná malou alebo žiadnou protibunkovou účinnosťou na primáme bunkové kultúry a na testované normálne bunkové línie. Táto údajná diskriminačná vlastnosť lymfotoxínu viedla k in vivo štúdiám, z ktorých vyplýva, že lymfotoxín môže mať potenciálnu protinádorovú účinnosť.

Lymfotoxín je termín, ktorý sa používa na opis celej skupiny molekúl. Lymfotoxínové molekuly boli identifikované ako glykoproteíny, ktoré sa delia na päť tried podľa molekulových hmotností, z ktorých každá je ešte ďalej heterogénna, pokiaľ ide o náboj. Zdá sa, že vo väčšine lymfocytových supematantov prevláda ľudská alfa (molekulová hmotnosť 70 000 až 90 000) a ľudská beta trieda (molekulová hmotnosť 25 000 až 50 000). Alfa triedy (podľa molekulovej hmotnosti) sa delia podľa náboja aspoň do siedmich podtried, zatiaľ čo beta triedy sa delia na dve rôzne podtriedy (G. Gragner a spol.: v Cellular Responses to Molecular Modulators str. 287 až 310, ed. Mozes a spol., 1981). Identifikované boli tiež komplexné (s molekulovou hmotnosťou väčšou ako 200 000) a gama (molekulová hmotnosť 10 000 až 20 000) formy lymfotoxínu. Rôzne formy a triedy lymfotoxínu sa medzi sebou odlišujú stabilitou a kinetikou ich vzniku v kultúre. Pri nízkej iónovej sile sa môžu agregovať spolu s komplexnou triedou. Triedy lymfotoxínov s nižšou molekulovou hmotnosťou boli opísané ako relatívne nestále a slabo bunkovo lytické pri porovnávaní s triedami vyššej molekulovej hmotnosti. [Hiserodt a spol.: Celí. Immun. 26, 211 (1976), Granger a spol.: v Biochemical Characterisation of Lymphokines, 279 až 283, ed. De Weck a spol., 1980], Aktivita gama triedy nebola pre svoju nestabilitu extenzívne študovaná [G. Granger a spol.: Cellular Immunology 38, 388 až 402 (1978)]. Tiež aj beta trieda je v literatúre opísaná ako nestabilná [Walker a spol.: J. Inununol. 116 (3), 807 až 815 (marec 1976)].

Je potrebné si uvedomiť, že lymfotoxínová terminológia nie je jednotná. V súčasnosti názvy, ktoré sú dávané produktom bunkových kultúr, sú zväčša funkciou buniek, o ktorých sa predpokladá, že vyrábajú produkt a vytvárajú produkty v biologických skúškach. Tieto produkty sú však vo veľkom meradle len nedostatočne charakterizované. Príčin je niekoľko: mnohé štúdie boli vykonané s čiastočne čistými preparátmi, testy, ktoré sa použili na charakterizovanie produktov, nie sú molekulárne špecifické a v niektorých prípadoch prebiehajú v rôznych obmenách. Skutočná identita rôznych cytotoxických faktorov zostane neznáma, pokiaľ nebude existovať štandardná terminológia, založená na zreteľne testovateľných rozlišujúcich vlastnostiach, ako sú napríklad sekvencie aminokyselín alebo imunitné epitopy. Príkla dy ďalších názvov, ktoré sú dávané produktom cytotoxickej bunkovej kultúry sú: nádorový nekrózový faktor, NK. bunkový' cytotoxický faktor, hemoragický nekrózový faktor a makrofágový cytotoxínový alebo cytotoxický' faktor.

Patentová prihláška USA č. 608 316 (podaná 7. mája 1984) a európsky patent 100 641 A (publikovaný

15. februára 1984) opisujú aminokyselinové sekvencie ľudského lymfotoxínu, ktorý bol izolovaný z ľudskej lymfoblastoidnej bunkovej línie RPMI-1788. Hayashi a spol. v európskom patente 132 125 A (publikovanom

23. januára 1985) opisujú izoláciu proteínu z králika po stimulácii jeho retikuloendoteliálneho systému. Bolo opísané, že proteín má protinádorovú účinnosť a jeho N-terminálna aminokyselinová sekvencia je Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Ser-Gln-Trp-Leu. Sprievodná patentová prihláška USA 628 059 (podaná 5. júla 1984) opisuje čistenie a rekombinantú syntézu cytotoxického ľudského polypeptidu, ktorý bol identifikovaný ako nádorový nekrózový faktor s N-terminálnou aminokyselinovou sekvenciou: Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro. Ohnishi a spol.: (patent USA 4 481 137) opisujú získanie látky molekulovej hmotnosti 7 000 až 9 000, ktorú nazvali CB^, z kultúry buniek BALL-1. Táto látka potlačuje rast nádorových buniek a má N-terminus Ala-Ala.

Podľa Totha a Grangera [Mol. Immun. 16, 671 až 679 (1979)] ani odstránenie sialovej kyseliny z lymfocytových supematantov obsahujúcich, lymfotoxín neuramidázovým spracovaním, ani pridanie N-acetyl-glukozamímu, galaktózy, laktózy, manózy, a-metylmanozidu alebo fukózy k supematantom nemá žiadny vplyv na in vitro lyrickú aktivitu. Toth a spol. preto z toho vyvodili, že jednoduché cukry nemajú vplyv na účinnosť ich lymfotoxínu. Toth sa spol. tiež však pozorovali, že sacharidy majú dôležitú úlohu pri pôsobení na iné lymfokíny. Vyvodzujú z toho, že nemožno vylúčiť participáciu zložitejších foriem oligosacharidov v cytotoxickej aktivite lymfotoxínov.

Proctor, Klostergaard a Granger [Clinical Research 30(1), 55A (1982)] uvádzajú, že keď sú ľudské lymfocyty aktivované PHA za prítomnosti tunikamycínu (na inhibiciu adície N-naviazaných cukrových zvyškov na lymfotoxínové molekuly) uvoľňujú biologicky inertný lymfotoxín. Podľa týchto autorov, imunochemické štúdie odhalili, že zatiaľ čo cukrový zvyšok lymfotoxínu nebol potrebný na jeho transport alebo na uvoľnenie aktivovaného lymfocytu v supematante, cukor bol potrebný na efektívnu deštrukciu cieľových buniek, pretože cukor bol zodpovedný za príslušnú konformáciu molekúl (molekuly) lymfotoxínu.

Ďalšou literatúrou, ktorú by bolo možné preštudovať v súvislosti s touto prihláškou je Evans: Cancer Immunol. Immunother 12, 181 až 190 (1982), Lee a spol.: Celí Immun. 48, 166 až 181 (1979), De Weck a spol.: (ed.): Biochemical Characterization of Lymphokines, str. 279 až 312 (1980), Khan a spol. (ed.): Human Lymphokines, str. 459 až 477 (30. júna 1982), Aggarwal a spol.: príspevok na 3rd Intemation 1 Lymphokine workshop in Haverford, Pa., L až 5. septembra 1982, Ranson a spol.: Cancer Research 43, 5 222 až 5 227 (november 1983), Kuli a spol.: J. of Immun. 126 (4), 1 279 až 1 283 (apríl 1981), J. Sawada a spol.: Jap. J. Exp. Med. 46, 263 až 267 (1976), J. Granger a spol.: CelíImmun. 38, 388 až402 (1978),

J. Rundell a spol.: Immunopharmacology 3, 9 až 18 (1981), J. Granger a spol.: J. Lymphokine Res. 1, 45 až 49 (1982), N. Ruddke a spol.: Lymphokine Res. 2, 23 až 31 (1983), M. Mitsuhashi a spol.: britská patentová prihláška 2 106 117, H. Enomoto: európska patentová prihláška 87 087A, B. Williamson a spol.: P. N. A. S. USA 80, 5 397 až 5 401 (1983) a S. Wright a spol.: J. Immun. 126,1 516 až 1 521 (1981).

Lymfotoxiny (alebo látky identifikované ako lymfotoxín), tu získavané z lymfocytovej kultúry, sú prítomné v nízkych koncentráciách, rádovo 0,05 až 2 x 10⁶ jednotiek na liter supematantu buniek RPMI-1788 alebo primárnych lymfocytov. Získané množstvo je často značne rôzne a primáme lymfocyty sú drahé. Preto je potrebný ekonomický' spôsob lymfotoxinu [Yamato a spol.: J. of Biological Response Modifiers 3 (1), 76 až 87 (1984)].

Podľa predchádzajúcich spôsobov sa nepodarilo vyrobiť lymfotoxín, ktorý je homogénny v aminokyselinovej sekvencii, čo je dôležitá vlastnosť pri použití ako liečiva. Lymfotoxín, ktorý sa izoluje z kultúry bunkových línií, vykazuje heterogenitu na amínovom konci, možno vďaka proteolytickému procesu (pozri citovanú prihlášku USA 608 316). Kultúry primárnych lymfocytov, napríklad z nosných mandlí alebo z periférnej krvi, musia z ekonomických dôvodov nutne obsahovať bunky mnohých donorov. Produkty týchto buniek budú však vykazovať genetické odlišnosti medzi donormi, takže výsledný lymfotoxín môže byť v skutočnosti zmesou alelických typov. Podiely a identity takýchto alel budú navzájom zrejme neznáme. Preto je potrebný spôsob výroby lymfotoxinu, ktorý by bol jednotný, pokiaľ sa to týka aminokyselinovej sekvencie.

Predchádzajúce spôsoby sú obmedzené tiež tým, že sa podľa nich produkuje lymfotoxín, ktorý má primáme aminokyselinové sekvencie zodpovedajúce lymfotoxínom, ktoré sa nachádzajú v prírode. Substitúcia (náhrada), delécia (vynechanie) alebo inzercia (vloženie) rôznych aminokyselín do týchto sekvencii by vyžadovali rozsiahle a nákladné chemické modifikácie, pokiaľ by sa vôbec tieto modifikácie dosiahli. Preto sú potrebné spôsoby, ktorými by sa ľahko dosiahli rôzne zmeny aminokyselinových sekvencii lymfotoxinu.

Napriek tomu, že protinádorové účinky a zrejmá terapeutická hodnota lymfotoxínovej aktivity je opisovaná v literatúre od roku 1968, lymfotoxín nebol študovaný v extenzívnych klinických protokoloch alebo uvedený na trh vzhľadom na malé množstvá a heterogénnu povahu lymfotoxinu dostupnému podľa predchádzajúcich spôsobov. Preto sú potrebné spôsoby, podľa ktorých by sa ekonomicky vyrábali také množstvá lymfotoxinu, ktoré sú potrebné na klinické štúdie.

V literatúre je opísané králičie antisérum, ktoré je schopné neutralizovať cytolytickú aktivitu rôznych cytotoxínov vrátane látok, ktoré by sa identifikovali ako lymfotoxín [Yamato a spol.: Celí. Immun. 38, 403 až 416 (1978), Gately a spol.: Celí. Immun. 27, 82 až 93 (1976), Hiserodt a spol.: J. Immun. 119 (2), 274 až 380 (1977), Zacharchuk a spol.: P. N. A. S. USA 80, 6 341 až 6 345 (október 1983), Ruddle a spol.: Lymphokine Research 2 (1), 23 až 31 (1983), Mannel a spol.: Infection and Immunity 33 (1), 156 až 164 (1981), Wallach a spol.: The Biology of the Interferon Systém, ed. E. De Maeyer a spol.: str. 293 až 302 (publikované v septembri 1983) a Stone -Wolff a spol.: J. Exp. med. 159, 828 až 843 (marec 1984)]. Pretože toto antisérum je polyklonálne, obsahuje rôzne protilátky voči imunogénu lymfotoxinu. Ktorákoľvek alebo ktorékoľvek z týchto protilátok spôsobujú neutralizáciu lymfotoxínovej účinnosti. Údaje v literatúre sú zvyčajne nejasné, čo sa týka molekulárnej identity látky zodpovednej za lymfotoxínovú účinnosť, ktorá sa použila ako imunogén. To, čo je potrebné pre diagnózu a imunoafinitné čistiace postupy, je monošpecifická protilátka voči jasne a jednoznačne identifikovanej lymfotoxínovej molekule. Pred-metom tohto vynálezu je získame takej protilátky a získanie spôsobov ekonomickej syntézy lymfotoxínovej formy v prostriedku, v ktorom primárna sekvencia aminokyselín je vo všetkých molekulách lymfotoxinu rovnaká. Ďalším predmetom tohto vynálezu je spôsob prípravy vopred stanovených zmien v aminokyselinovej sekvencii lyfotoxínovej formy, konkrétne sa to týka delécie, inzercie a substitúcie aminokyselín alebo vzájomných kombinácií týchto zmien.

Podstata vynálezu

Ciele tohto vynálezu sa dosiahli úspešnou rekombinantnou expresiou proteínu, ktorý má lymfotoxínovú účinnosť. Tento typ lymfotoxinu, ktorý je tu opísaný v zmysle jeho účinnosti a prirodzenej alebo obmenenej aminokyselinovej sekvencie, je tu ďalej označovaný ako lymfotoxín. DNK kódujúca lymfotoxín bola identifikovaná s prekvapením, napriek nepatrnej hladine lymfotoxinu expresovanej v homológnych bunkách i napriek neistote v čase, v ktorom sa messegner-RNK (mRNK) kódujúci lymfotoxín objavuje v homológnych bunkách. Prekvapujúce bolo aj to, že biologicky aktívny lymfotoxín je expresovaný v rekombinantných bunkách, ktoré neglykozylujú lymfotoxín (alebo pri ktorých sa to neočakáva, tak ako pri homológnych bunkách). Lymfotoxín, ktorý sa získa touto expresiou, má v podstate jednotnú aminokyselinovú sekvenciu, bez N-terminálnej enzymatickej hydrolýzy. V bunkovej kultúre dochádza k expresii DNK kódujúcej lymfotoxin v takom množstve, ktoré prevyšuje 0,1 až 1 x 10¹¹jednotiek na liter lyzátu kultúry.

Lymfotoxín, ktorý je rekombinantnou hostiteľskou bunkou exprimovaný, závisí od DNK, ktorá sa použila na kódovanie lymfotoxinu alebo jeho prekurzorov, a tiež od zvolenej hostiteľskej bunky. Nukleokyselinové sekvencie, ktoré sú tu použité na syntézu lymfotoxinu, sú nové. Charakterizované sú nukleotidovými sekvenciami, ktoré sa odlišujú od pôvodnej alebo prírodnej sekvencie v jednej alebo vo viacerých nasledujúcich možnostiach: DNK neobsahuje intróny, v prípade ľudského lymfotoxinu je intrón prítomný medzi nukleotidmi 284 a 285 (obrázok 2a). DNK neobsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu iné proteíny organizmu, z ktorého DNK pochádza; nukleová kyselina kódujúca lymfotoxín je ligovaná do vektora; a/alebo nukleová kyselina je schopná hybridizácie na nukleovú kyselinu kódujúcu lymfotoxín, ale len v tom prípade, že takáto hybridizovaná nukleová kyselina nemá nukleotidovú sekvenciu prírodnej DNK alebo RNK kódujúcu lymfotoxin.

Mutantné nukleové kyseliny kódujúce lymfotoxín sú produktom rekombinantných manipulácií. K tichej mutácii v 5' netranslovanej oblasti dochádza preto, aby sa zvýšila hladina expresie vo vybraných hostiteľoch, napríklad redukciou možnosti štruktúr m-RNK so spárovanými úsekmi a nespárovanými (slučkami) úsekmi [stem and loop] v 5' oblastiach nukleovej kyseliny, alebo substitúciou hostiteľom preferovaných kodónov v

SK 278333 Β6 prírodných nukleokyselinových izolátoch.

Skôr ako tichá mutácia, umožňujú mutácie v nukleových kyselinách, ktoré sú represované, prípravu lymfotoxínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu pôvodného lymfotoxínu alebo primárnu sekvenciu, jeho variantov s aminokyselinovými sekvenciami odlišujúcimi sa od pôvodného lymfotoxínu. Mutantný lymfotoxín sa izoluje sám osebe, alebo je ďalej procesovaný hostiteľskou bunkou, takže sa tým získa požadovaný typ lymfotoxínu. Tieto nukleové kyseliny alebo nukleové kyseliny, ktoré s nimi hybridizujú, alebo ich fragmenty, sa označia a použijú sa v hybridizačných testoch pri identifikácii alebo určovaní genetického materiálu kódujúceho lymfotoxín.

Pri syntéze lymfotoxínu sa DNK, ktorá kóduje lymfotoxín, liguje do vektora, vektor sa použije na transformáciu hostiteľských buniek, hostiteľské bunky sa kultivujú a lymfotoxín sa izoluje z kultúry. Tento všeobecný spôsob sa používa na syntézu lymfotoxínu s aminokyselinovou sekvenciou pôvodného lymfotoxínu alebo na konštrukciu nových lymfotoxinových variantov podľa konštrukcie vektora a podľa hostiteľskej bunky vybranej na transformáciu. Typy lymfotoxínov, ktoré sú schopné syntézy, obsahujú lymfotoxín s leucínovou skupinou na aminovom konci, lymfotoxín a s histidínovou skupinou na aminovom konci, pre-lymfotoxin a lymfotoxínové varianty, medzi ktoré patria:

a) kondenzované proteíny, v ktorých heterológny protein alebo polypeptid je viazaný peptidovou väzbou na amínový a/alebo karboxylový koniec aminokyselín lymfotoxínu;

b) lymfotoxínové fragmenty, zvlášť fragmenty pre-lymfotoxínu, v ktorom ktorákoľvek aminokyselina medzi -34 a +23 znamená aminokyselinu amínového konca fragmentu;

c) lymfotoxínové mutanty, v ktorých je jeden alebo viac aminokyselinových častí substituovaných, vložených alebo vynechaných;

d) deriváty s metionínovou skupinou alebo s modifikovanou metionínovou skupinou (ako je napríklad formylmetionínová skupina alebo iné blokované metionínové skupiny) na aminovom konci a/alebo

e) neglykozylované alebo rôzne glykozylované typy všetkých predchádzajúcich možností.

Keď je bunka cicavca transformovaná nukleovou kyselinou kódujúcou lymfotoxín, ktorá je odštiepiteľne ligovaná na eukaryotický sekrečný leader (signál) (vrátane sekrečného signálom pôvodného lymfotoxínu), alebo keď nukleová kyselina, ktorá kóduje lymfotoxín, je odštiepiteľne ligovaná vo vektore na prokaryotický alebo kvasinkový sekrečný signál (leader), ktorý je rozlišovaný hostiteľskou bunkou tak, že môže byť transformovaný (zvyčajne organizmus, z ktorého sa získala signálna sekvencia), hostiteľ sa vektorom transformuje, kultivuje a potom sa lymfotoxíny s metionínovým amínovým koncom izolujú z kultúry zvyčajným spôsobom.

Keď je DNK kódujúca lymfotoxín odštiepiteľne ligovaná do vektora bez sekrečnej signálnej sekvencie a potom je použitá na transformáciu hostiteľskej bunky, potom sú syntetizované lymfotoxíny na aminovom konci zvyčajne substituované metionínovou skupinou, alebo modifikovanou metionínovou skupinou, ako je napríklad formylmetionínová skupina.

Získali sa postupy, podľa ktorých in vitro mutagenéza nukleovej kyseliny, ktorá kóduje lymfotoxín, vedie k expresii lymfotoxinových variantov predtým nedostupných. Najprv dochádza k expresii lymfotoxínu s metio nínovou skupinou alebo s modifikovanou metionínovou skupinou na N-konci hostiteľskou bunkou transformovanou nukleovou kyselinou kódujúcou lymfotoxín, ktorý je exprimovaný priamo, t. j. ktorý nie je odštiepiteľne viazaný na sekrečnú signálnu sekvenciu. Potom sa po zavedení delécie, substitúcie a/alebo inzercie do nukleovej kyseliny, ktorá kóduje lymfotoxín, použije in vitro miestne špecifická, vopred stanovená alebo náhodná mutagenéza. Tieto lymfotoxínové deriváty získané expresiou mutantnej nukleovej kyseliny, majú modifikované vlastnosti. Konečne sa získavajú nové typy lymfotoxínu ako neglykozylované alebo rôzne glykozylované lymfotoxíny. Neglykozylovaný lymfotoxín sa vyrába prokaryotickou expresiou DNK kódujúcou lymfotoxín. Rôzne glykozylované typy lymfotoxínu sú produktom rekombinantnej kultúry v transformovaných vyšších eukaryotických, zvyčajne cicavčích bunkách.

Lymfotoxín, ktorý sa tu vyrába, vyčistí sa od kultivačných supematantov alebo lyzátov imunoafinitnou adsorpciou pomocou nesolubilizovanej lymfotoxínneutralizujúcej protilátky. Táto protilátka, ktorá sa najefektívnejšie získava v monoklonálnej bunkovej kultúre, vzniká v myšiach imunizáciou lymfotoxínu adsorbovaného na sírane hlinito-draselnom.

Na terapeutické použitie sa používa lymfotoxín podľa tohto vynálezu v kombinácii s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a cxcipientmi. Pripravuje sa v sterilných dávkových formách, ako napríklad lyofilizáciou, v dávkovacích nádobách alebo sa skladuje v stabilizovaných vodných prostriedkoch. Na implantáciu do nádoru alebo do miest, z ktorých bol nádor chirurgicky odstránený, používa sa lymfotoxín, ktorý je v polymémej matrici. Získa sa tým prostriedok, ktorý časom uvoľňuje lymfotoxín, pričom lymfotoxín je lokalizovaný v danom mieste vo vysokej gradientovej koncentrácii. Terapeutické prostriedky podľa tohto vynálezu sa podávajú implantačné v terapeuticky efektívnych dávkach, injekčné alebo infuzne živočíchom, zvlášť ľudským pacientom s malignými nádormi.

Lymfotoxín je na účely tejto prihlášky definovaný ako biologicky aktívny polypeptid, ktorý má oblasť predstavujúcu podstatnú štruktúrnu aminokyselinovú homológiu aspoň s časťou aminokyselinovej sekvencie lymfotoxínu, uvedenej na obrázku 2a. Biologická účinnosť je definovaná ako preferenčná cytotoxická účinnosť definovaná ďalej, imunologická skrížená reaktivita s cytotoxickým lymfotoxinom alebo schopnosť súťažiť s cytotoxickým lymfotoxinom o lymfotoxínové bunkové povrchové receptory. V posledných dvoch príkladoch nemusí byť lymfotoxín cytotoxický. Imunologický skrížené mutanty sú užitočné ako imunogény na zvýšenie anti-lymfotoxínu u zvierat, napríklad pri príprave činidiel na imunotesty, zatiaľ čo necytotoxické kompetitívne mutanty sa používajú ako značené reakčné činidlá v imunotestoch kompetitívneho typu pre biologicky aktívny lymfotoxín.

Preferenčná cytotoxická účinnosť je definovaná ako preferenčná deštrukcia alebo inhibícia rastu nádorových buniek in vivo alebo in vitro pri porovnaní s normálnymi bunkami za rovnakých podmienok. Deštrukcia nádorových buniek lýzou in vitro alebo nekrózou in vivo je výhodným koncovým bodom testu, i keď sa môžu uspokojivo použiť tiež cytostatické alebo antiproliferačné vlastnosti. Vhodné testy na detekciu protibunkových účinností lymfotoxínu sú opísané v nasledujúcich citáciách: B. Aggarwal a spol.: J. Biol. Chem.

SK 278333 BŔ

259 (1), 686 až 691 (1984) a E. Carswll a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 72, 3666 až 3670 (1975).

Lymfotoxínová špecifická účinnosť je tu definovaná skôr v termínoch lýzy cieľovej bunky ako cytostázy. Jedna jednotka lymfotoxínu je definovaná ako množstvo, ktoré je potrebné na lýzu 50 % buniek umiestnených v každej jamke, ako bude opísané ďalej v príklade 1. Je možné použiť aj iné spôsoby stanovovania cytotoxickej účinnosti.

Pod pojmom podstatná štruktúrna homológia sa zvyčajne myslí, že viac ako asi 60 %, zvyčajne viac ako 70 % aminokyselinových zvyškov v polypeptide je zhodných, pretože zachovávajú substitúcie zodpovedajúcemu (zodpovedajúcim) zvyšku (zvyškom) v sekvencii na obrázku 2a. Nie všetky sekvencie lymfotoxínového polypeptidu potrebujú byť homológne so sekvenciou na obrázku 2a. Je ale potrebné, aby bola s niektorou časťou sekvencie na obrázku 2a homológna len taká dlhá časť lymfotoxínového polypeptidu, aby získaný kandidát vykazoval požadovanú biologickú účinnosť. Zvyčajne by mala homológia existovať pre oblasti asi od 20 do 100 aminokyselinových zvyškov s tým, že pre maximálnu homológiu môže byť potrebné zaviesť prípadné diery. Keď homológna oblasť so sekvenciou na obrázku 2a nie je niektorou z kľúčových oblastí lymfotoxínu, t. j. oblastí dôležitých pre cytotoxickú účinnosť, potom je pre polypeptid (aby bol ešte zahrnutý do definície) požadovaná menšia homológia. Za kľúčové oblasti sekvencie na obrázku 2a sa považujú asi zvyšky 162 až 171, 52 až 83 a 127 až 148.

Lymfotoxín je definovaný ako špecifický ľudský nádorový nekrózový faktor alebo jeho prírodný zvierací analóg. [D. Pennica a spol.: Náture 312, (20 až 27) (december 1984), 724 až 729 a B. Aggarwal a spol.: J. Biol. Chem. 260 (4), 2 345 až 2 354 (1985)].

Pojem štruktúrne podobný, sa vzťahuje na dominantné vlastnosti aminokyselinových bočných reťazcov, ako sú napríklad vlastnosti bázické, neutrálne alebo kyslé, hydrofilné alebo hydrofóbne, alebo prítomnosť či neprítomnosť sférickej prekážky. Substitúcia jednej aminokyseliny za inú, štruktúrne podobnú aminokyselinu je známa odborníkom ako konzervatívna substitúcia.

Významným faktorom zaisťujúcim identitu polypeptidu ako lymfotoxínu je možnosť antiséra, ktoré je schopné v podstate zneutralizovať cytolytickú účinnosť v podstate homológneho, lymfoblastoidného (alebo prírodného) lymfotoxínu, a tiež v podstate zneuatralizovať cytolytickú účinnosť príslušného polypeptidu. Je však potrebné si uvedomiť, že imunologická identita a cytotoxická identita nie sú nutne koextenzívne. Neutralizujúca protilátka lymfotoxínu na obrázku 2a nemusí viazať príslušný proteín, pretože neutralizujúca protilátka je smerovaná k miestu na lymfotoxíne, ktoré len susedí s oblasťou, ktorá je rozhodujúca pre lymfotoxínová cytotoxickú účinnosť, ale ktorá sa zúčastňuje procesu ako neutralizujúca protilátka sférickou prekážkou aktívneho miesta lymfotoxínu. Príslušný proteín mutovaný v tejto neškodnej oblasti by sa nemusel ďalej viazať na neutralizujúcu protilátku, bol by však lymfotoxínom v termínoch podstatnej homológie a biologickej účinnosti.

Pre lymfotoxín, ktorý bol získaný kultiváciou lymfoblastoidných bunkových línií, boli stanovené nasledujúce vlastnosti:

- molekulová hmotnosť 20 000 alebo 25 000, podľa stupňa glykozylácie a N-terminálnej heterogenity,

- glykozylácia na Asn + 62 (obrázok 2a);

- tendencia k agregácii, zvlášť k organizovaniu multimérov; izoelektrický bod asi 5,8;

- labilita na pH (strata viac ako 50 percent cytolytickej aktivity po 24-hodinovom skladovaní v pufri hydrogénuhličitanu amónneho pri koncentrácii 10 pg/ml pri hladinách pH menej ako asi 5 alebo viac ako asi 10);

- podstatná strata účinnosti po inkubácii vo vodnom roztoku počas piatich minút pri 80 °C.

Podľa molekulovej hmotnosti boli identifikované dva typy lymfoblastoidného lymfotoxínu. Typ lymfoblastoidného lymfotoxínu molekulovej hmotnosti 25 000 má na amínovom konci leucínovú skupinu. Polypeptidy, ktorých aminokyselinová sekvencia má molekulovú hmotnosť 25 000 sa volajú lymfotoxín s leucínovou skupinou na amínovom konci. Typ lymfoblastoidného lymfotoxínu molekulovej hmotnosti 20 000 je charakteristický tým, že má na amínovom konci histidín. Zodpovedajúca sekvencia sa potom volá lymfotoxín s histidínovou skupinou na amínovom konci. Je dôležité, že tieto charakteristiky opisujú natívny alebo divoký typ ľudského lymfotoxínu, získaného z lymfoblastoidných bunkových kultúr. Zatiaľ čo tu definovaný lymfotoxín obsahuje pôvodný, glykozylovaný lymfotoxín, do rozsahu tejto definície môžu patriť aj iné podobné cytotoxické polypeptidy. Napríklad glykozylácia je zvyčajne spojená so zvieracím lymfotoxínom a môže byť modifikovaná pri expresii v heterológnej rekombinantnej eukaryotickej hostiteľskej bunke. Získa sa tým modifikovaný lymfotoxín, ktorého molekulová hmotnosť alebo izoelektrický bod je mimo rozmedzia daného pre ľudský lymfoblastoidný lymfotoxín. Lymfotoxín, ktorý vôbec nie je glykozylovaný, vyrába sa v rekombinantnej bakteriálnej kultúre s molekulovou hmotnosťou, izoelektrickým bodom a ďalšími vlastnosťami zodpovedajúcimi modifikovanému. Post-translačné procesy pre-lymfotoxínu z prvých zvieracích typov v bunkovej línii, ktorá je odvodená od iných zvieracích druhov, môže mať iné zvyšky na amínovom konci ako je zvyčajné pri prvých zvieracích druhov. Podobne i mutagenéza napríklad umožňuje meniť aminokyselinovú sekvenciu a N-koniec (N-terminus) lymfotoxínu, tým sa modifikuje stabilita na pH, izoelektrický bod a podobné vlastnosti.

Predkladaná aminokyselinová sekvencia ľudského lymfotoxínu je opísaná na obrázku 2a. Je potrebné si všimnúť, že táto sekvencia obsahuje presekvenciu s 34 členmi, o ktorých sa predpokladá, že sa počas procesu translatovanej transkripcie v ľudských bunkách odstraňuje (spolu so svojimi mutantmi) prelymfo-toxín, čo vedie k tomu, že sa na amínovom konci tohto typu objavuje leucínová skupina. Typ s histidínovou skupinou na amínovom konci je homológny s typom s leucínovou skupinou na amínovom konci, len s tým rozdielom, že chýba prvých 23 aminokyselín typu s leucínovou skupinou na amínovom konci. Všetky tri typy, t. j. prelymfotoxín, lymfotoxín s leucínovou skupinou na amínovom konci a lymfotoxín s histidínovou skupinou na amínovom konci, rovnako tak ako metionínové, modifikované metionínové, mutantné a neglykozylované formy sú v rozsahu pojmu lymfotoxín. Neglykozylované typy s leucínovou skupinou a s histidínovou skupinou na amínovom konci majú nižšie molekulové hmotnosti ako už opísané homológne typy z lymfoblastoidných buniek.

Pre-lymfotoxín je typ lymfotoxínu, ktorý je zahrnutý v predchádzajúcej definícii. Je charakterizovaný prítomnosťou signálneho (alebo leader) polypeptidu na

SK 278333 Β6 amínovom konci molekuly. Natívny signálny polypeptid lymfotoxínu sa zvyčajne proteolyticky odštiepi z lymfotoxínu ako časť sekrečného procesu, v ktorom sa vylučuje proteín z bunky. Signálny peptid môže byť mikrobiálny alebo cicavčí (vrátane natívneho, presekvencia s 34 zvyškami), výhodne j c však signálny peptid homológny k hostiteľskej bunke. Niektoré spojenia signál - lymfotoxín nie sú rozlišované alebo procesované” hostiteľskou bunkou do lymfotoxínu bez met na N-konci. Takéto spojenia obsahujúce mikrobiálne signály sú užitočné, napríklad ako lymfotoxínové imunogény.

Poznamenajme, že výraz schopný alebo spôsobilý cytotoxickej aktivity znamená, že lymfotoxin obsahuje polypeptidy, ktoré môžu byť prevedené, napríklad enzymatickou hydrolýzou z neaktívneho stavu analogického zymogénu na polvpeptidový fragment, ktorý vykazuje požadovanú biologickú aktivitu. Pojem schopný in vitro alebo in vivo cytotoxickej aktivity sa myslí tak, že obsahuje necytotoxické polypeptidy, ktoré môžu byť prevedené, napríklad enzymatickou hydrolýzou, z neaktívneho stavu analogického zymogénu na polypeptidový fragment, ktorý vykazuje definovanú biologickú aktivitu. Tak budú inaktívne prekurzory spojené proteínmi, v ktorých je lymfotoxin viazaný peptidovou väzbou na karboxylový koniec iného proteínu alebo polypeptidu. Sekvencia na tejto peptidovej väzbe alebo v jej blízkosti, je vybraná tak, aby bola citlivá na proteolytickú hydrolýzu, pri ktorej sa uvoľní lymfotoxin, buď in vivo, alebo ako časť výroby, in vitro. Typickými väzbovými sekvenciami sú lys-lys alebo arg-lys. Nelymfotoxínová zložka, ako je napríklad prolymfotoxín, je výhodne homológny proteín, takže minimalizuje imunogenicitu spojenia. Homológny proteín by mal byť neškodný a nemal by sa viazať na povrch buniek. Takto generovaný lymfotoxin bude mať potom cytotoxickú účinnosť, ktorá sa požaduje v definícii.

Lymfotoxin zvyčajne znamená ľudský lymfotoxin, lymfotoxin z iných zdrojov, napríklad myší, bravčový·, konský alebo hovädzí lymfotoxin, tiež patrí do definície lymfotoxínu, pokiaľ zodpovedá štandardám, ktoré sú opísané, pre homológne oblasti a biologickú účinnosť. Zistilo sa, že hovädzie a myšie lymfotoxíny sú dosť (asi na 80 percent) homológne s ľudským lymfotoxínom. Lymfotoxin nie je špecifický typ, napríklad ľudský lymfotoxin je účinný na nádory a na neoplastické bunkové línie myší. Ľudský lymfotoxin alebo lymfotoxin z jedného druhu sa môže teda použiť na terapiu iného druhu živočícha.

Lymfotoxin obsahuje aj multiméme formy. Lymfotoxín spontánne agreguje do multimérov, zvyčajne do dimérov alebo do vyšších multimérov. Multiméry sú toxické, podľa toho sú vhodné na použitie v terapii in vivo. V rekombinantných hostiteľoch dochádza k expresii lymfotoxínu vo forme monoméru. Potom má však lymfotoxin tendenciu vytvárať spontánne multiméry. Terapeuticky užitočné sú homogénne multiméry alebo zmes rôznych multimérov.

Variantné lymfotoxíny obsahujú vopred stanovené alebo cielené, t. j. miestne špecifické, mutácie molekuly z obrázku 2a alebo z iných fragmentov. Variantné lymfotoxíny sú definované ako polypeptidy zodpovedajúce definovaným vlastnostiam lymfotoxínu s tým rozdielom, že sú charakterizované aminokyselinovou sekvenciou, ktorá sa od sekvencie na obrázku 2a odlišuje buď vynechaním (deléciou), substitúciou alebo inzerciou zvyškov. Neľudské lymfotoxíny tu opísané a alely ľudského lymfotoxínu sa považujú za variantné lymfotoxíny, pretože sú to miestne riadené mutanty, ktoré nemajú žiadny prírodný ekvivalent. Cieľom mutagenézy je konštrukcia takej DNK, ktorá kóduje uvedený lymfotoxin vykazujúci vlastnosti, ktoré modifikujú biologickú účin5 nnosť prírodného lymfotoxínu alebo uľahčujú výrobu lymfotoxínu. Napríklad mutáciou lyzín + 89 kodónu dochádza k expresii histidínovej skupiny v mieste lyzínovej skupiny. Histidín + 89 sa už trypsínom (ktorý zvyčajne štiepi väzby arg-X alebo lys-X proteínov) ne10 hydrolyzuje. Očakáva sa, že proteázová rezistencia poskytne mutantnu väčší biologický polčas ako je to v prípade lymfotoxínu, ktorý má sekvenciu na obrázku 2a (alebo jej fragment). Na histidín môžu byť mutované aj iné lyzínové a arginínové skupiny lymfotoxínu, 15 napríklad lyzín + 28, lyzín + 19 alebo arginín +15.

Ako už bolo uvedené, určité oblasti molekuly lymfotoxínu vykazujú podstatnú homológiu s podobne aktívnym proteínom, označeným ako nádorový nekrózový faktor. Aminokyselinové skupiny a skupiny bez20 prostredné susediace v podstate tejto homológnej oblasti sú výhodné pre mutagenézu smerovanú k identifikácii lymfotoxínových mutantov, ktoré vykazujú variantnú biologickú alebo cytotoxickú účinnosť. Takéto mutanty sa pripravujú známymi spôsobmi a potom sa 25 testujú na požadovanú biologickú účinnosť, napríklad na zvýšenú cytotoxicitu, na novotvar, pretože - v prípade lymfotoxínových typov - sú použiteľné pre imunizáciu zvierat, možnosť získania silnejšej imunitnej odpovede. Nasledujú príklady takýchto variantných lym30 fotoxínov; ala + 168 je mutovaný na aminokyselinu s rozvetveným reťazcom (val, ile, alebo leu), medzi thr + 163 a val + 164 je vložená hydrofóbna aminokyselina (napríklad Val, ile, alebo leu), thr + 163 je substituovaný tyrozínom, ser + 82 je substituovaný lyzínom, ser 35 + 42 je substituovaný izoleucínom, leucínom, fenylalanínom, valínom alebo histidínom, lys + 84 je substituovaný glutamínom, tryptofánom, serínom alebo histidínom, ser + 82 je vynechaný, na leu + 171 je napojený hydrofóbny di- alebo tripeptid, thr + 163 je substi40 tuovaný kyselinou asparágovou alebo lyzínom, medzi glu + 127 a pro + 128 je vložený ala-lys, ser + 70 je substituovaný lyzínom alebo glycínom, thr + 69 je substituovaný tyrozínom, lys + 28 je substituovaný arginínom alebo histidínom, his + 32 je substituovaný 45 arginínom alebo lyzínom, asp + 36 je substituovaný prolínom, serínom, treonínom, tyrozínom alebo kyselinou glutamovou, ser + 38 je substituovaný tyrozínom, metionínom alebo kyselinou glutamovou, ser + 61 je substituovaný treonínom, tyrozínom, histidínom alebo 50 lyzínom, gly + 124 je substituovaný kyselinou asparágovou, serínom alebo tyrozínom, his + 135 je substituovaný arginínom, lyzínom, tyrozínom, tryptofánom alebo prolínom, thr + 142 je substituovaný kyselinou asparágovou a gin + 146 je substitovaný lyzínom alebo 55 treonínom.

Zvlášť potrebnou skupinou mutantov sú tie mutanty, v ktorých sú vynechané metionínové skupiny + 20, + 120 a+ 133 v ľudskom lymfotoxíne alebo sú výhodne substituované zodpovedajúcimi skupinami, ktoré sa 60 nachádzajú v lymfotoxínoch iných typov, ako sú napríklad tie, ktoré sú opísané na inom mieste tejto prihlášky. Napríklad met + 20, + 120 a + 133 sú substituované treonínom, serínom a valínom. Tieto aminokyseliny zodpovedajú skupinám v hovädzom lymfotoxíne. 65 Substitúcia sa vykoná spôsobom, ktorý je opísaný v príklade 9, len s tým rozdielom, že met + 133 je mutovaný na val v ďalšom stupni mutagenézy použitím fágu

SK 278333 Β6

Ml 3 Mp8 spôsobom známym per se. Táto mutantná zvieracia hybridová lymfotoxínová DNK sa používa miesto DNK s leucínovou skupinou na amínovom konci (z príkladu 7) a exprimuje sa ako napojená. Známym postupom sa štiepi brómkyanom signál STO z hybridného lymfotoxinu. Izoluje sa maturovaný variantný lymfotoxín s leucínovou skupinou na amínovom konci.

Inými vhodnými variantnými lymfotoxínmi sú také lymfotoxíny, v ktorých zodpovedajúce skupiny lymfotoxínu sú substituované skupinami z nádorového nekrózového faktora. Získajú sa tým hybridné varianty nádorového nekrózového faktora s lymfotoxínom. Reprezentatívnym príkladom je substitúcia prvých 8, 9 alebo 10 skupín maturovaného nádorového nekrózového faktora (napríklad val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp) za prvých 27 skupín lymfotoxinu s leucínovou skupinou na amínovom konci. Tento variant je pri priamej expresii v E. coli pravdepodobne demetionínovaný na N-konci.

Zatiaľ čo je miesto mutácie vopred stanovené, nie je potrebné, aby bola mutácia vopred determinovaná. Napríklad pri optimalizácii prípravy mutantného lymfotoxínu s histidínom + 89 sa vykoná náhodná mutagenéza na kodóne pre lyzín + 89. Expresiou sa získavajú lymfotoxínové mutanty, ktoré sa testujú na optimálnu kombináciu cytotoxickej účinnosti a na proleázovú rezistenciu.

Lymfotoxín môže obsahovať tiež inzercie, zvyčajne radu asi od 1 do 10 aminokyselinových skupín, alebo delécie z asi 1 až 30 skupín. Pre konštrukciu konečného plazmidu je možné kombinovať substitúcie, delécie, inzercie alebo ich akékoľvek kombinácie. Inzercie majú tiež napojenie na amínovom konci alebo na karboxylovom konci, napríklad hydrofóbne rozšírenie na karboxylovom konci. Výhodne sa však vykonáva len substitučná mutagenéza. Mutácia v kódujúcej DNK však zrejme nesmie byť umiestnená v sekvencii čítacej oblasti a výhodne nevytvára ani komplementárne oblasti, ktoré by mohli produkovať sekundárnu mRNK štruktúru. Extrakty vektorov transformovanej E. coli, ktoré obsahujú DNK kódujúcu lymfotoxínové mutanty, ktoré majú deléciu posledných 26 aminokyselín na karboxylovom konci alebo prvých asi 33 skupín na amínovom konci lymfotoxinu s leucínovou skupinou na amínovom konci, nevykazujú žiadnu cytotoxickú účinnosť. Dôvody pre chýbajúcu účinnosť však nie sú známe; môže to byť ktorýkoľvek z dôvodov, ktoré sú uvedené v príklade 1.

Nie všetky mutácie v DNK, ktorá kóduje lymfotoxín, budú exprimované v konečnom produkte rekombinácie bunkovou kultúrou. Napríklad hlavná skupina DNK so substitučnými mutáciami je taká DNK, v ktorej sekrečný leader (signál) na obrázku 2a bol substituovaný iným sekrečným signálom, buď deléciami signálu s 34 skupinami alebo substitúciou, ktorá vymení väčšinu alebo celý pôvodný signál za signál, ktorý má väčšiu pravdepodobnosť, že bude rozlišovaný plánovaným hostiteľom. Napríklad, pri konštrukcii prokaryotického expresného vektora je sekrečný signál z obrázku 2a vynechaný v prospech signálu bakteriálnej alkalickej fosfatázy alebo teplotné stabilného enterotoxínu Π, pri kvasinkách signál z obrázku 2a je substituovaný signálom kvasinkovej invertázy, alfa faktora alebo kyslej fosfatázy. Neznamená to však, že by ľudský sekrečný signál nebol rozlišovaný inými hostiteľmi ako sú ľudské bunkové línie. Ak je sekrečný signál rozlišovaný“ hostiteľom, potom je napojený proteín skladajúci sa z lymfotoxinu a signálu zvyčajne štiepený na peptidovej väzbe medzi signálom a lymfotoxínom pri tom kroku, ktorý vedie k sekrécii lymfotoxinu. I keď je mutantná DNK použitá na transformáciu hostiteľa, výsledný lymfotoxín môže byť buď napojený alebo natívny lymfotoxín, čo závisí od účinnosti hostiteľskej bunky v procese napojenia.

Inou väčšou skupinou DNK mutantov, ktoré nie sú exprimované ako lymfotoxínové varianty, sú nukleotidové substitúcie, ktoré zvyšujú expresiu, primáme vynechaním spárovaných a nespárovaných (slučkových) [stem and loop] úsekov v transkribovanej mRNK] (pozri sprievodnú patentovú prihlášku USA 303 687, ktorá je tu ako odkaz), pretože poskytujú kodóny, ktoré sú ľahšie transkribované vybraným hostiteľom, napríklad dobre známe preferenčné kodóny E. coli pre E. coli expresiu.

Mutantná nukleová kyselina sa pripravuje spôsobmi známymi per se [A. Hui. a spol.: The EMBO Joumal 3(3), 623 až 629 (1984), J. Adelman a spol.: DNK 2(3), 183 až 193 (1983) anglická patentová prihláška 2 130 219A, G. Winter a spol.: Náture 299, 756 až 758 (1982) a R. Wallace a spol.: Nucleic Acids Research 9(15), 3 647 až 3 656 (1981)]. Tieto spôsoby zahŕňajú mutagenézu fágu M13, syntézu mutantného lymfotoxínového génu ako je opísané v príklade 1 a v ďalších príkladoch alebo iné spôsoby, ktoré sú známe, alebo budú známe odborníkom.

Nukleovou kyslinou, ktorá kóduje lymfotoxín, je ktorákoľvek DNK alebo RNK sekvencia, kódujúca polypeptid, ktorý je v rámci tu uvedenej definície lymfotoxinu, či už jej nukleotidové sekvencie zodpovedajú alebo nezodpovedajú sekvenciám získaným v prírode. Navyše, nukleová kyselina patrí do rozsahu tu uvedeného, to znamená, že schopnosti hybridizácie za aspoň nízkoselektívnych podmienok na nukleovú kyselinu kódujúcu lymfotoxín, i keď hybridizujúca nukleová kyselina nekóduje proteín, ktorý ináč vyhovuje požiadavkám na lymfotoxín. Príkladom posledného by mohla byť skúška, žc (vďaka krátkej dĺžke polypeptidu, ktorý kóduje) nie je schopná expresie biologicky aktívneho lymfotoxinu. Nukleová kyselina kódujúca lymfotoxín alebo hybridizovateľná, sa vyrába organickou syntézou spôsobom, ktorý je v podstate uvedený v príklade 1, lebo sa získava z prírodných zdrojov vyskúšaním genómových alebo cDNK knižníc tak, ako je uvedené v príkladoch.

Lymfotoxín podľa tohto vynálezu sa pripravuje zvyčajne postupom, pri ktorom sa hostiteľ transformuje vektorom, ktorý nesie nukleovú kyselinu kódujúcu požadovaný lymfotoxín. Vektorom je konštrukcia replikabilnej DNK. Vektory sú používané pre amplifikáciu DNK alebo pre expresiu DNK, ktorá kóduje lymfotoxín. Expresným vektorom je konštrukcia DNK, v ktorej sekvencia DNK, kódujúca lymfotoxín, je odštiepiteľne spojená s vhodnou regulačnou sekvenciou schopnou uskutočniť expresiu lymfotoxinu vo vhodnom hostiteľovi. Medzi takéto regulačné sekvencie patrí transkripčný promótor, prípadná operátorová sekvencia na reguláciu transkripcie, sekvencia kódujúca vhodné ribozomálne väzbové miesta mRNK a sekvencie, ktoré regulujú teimináciu transkripcie a translácie.

Vektorom môže byť plazmid, vírus (vrátane fágu) alebo integrovateľný fragmet DNK, to znamená, fragment, ktorý je integrovateľný do hostiteľovho genómu rekombináciou. Keď sa už raz transformuje do hostiteľa, vektor sa replikujc a funguje nezávisle od hostiteľského genómu, alebo sa môže v niektorých prípadoch do jeho genómu integrovať. V tejto prihláške sú niekedy pojmy ''plazmid a vektor používané vzájomne zameniteľné, pretože plazmid je v súčasnosti najčas

SK 278333 Β6 tejšie používanou formou vektora. Ak všetky ďalšie formy vektorov, ktoré majú rovnakú funkciu, a ktoré sú alebo budú známe odborníkom z odbornej literatúry, sú tu vhodné a použiteľné.

Vhodné vektory obsahujú replikon a kontrolné sekvencie, ktoré sú odvodené od typov zlúčiteľných s hostiteľom požadovanej expresie. Transformované hostiteľské bunky sú také bunky, ktoré boli transformované alebo transfektované lymfotoxínovými vektormi konštruovanými pomocou techniky rekombinantnej DNK. Transformované hostiteľské bunky pravidelnej exprimujú lymfotoxín. Exprimovaný lymfotoxín sa ukladá buď intraceluláme, alebo sa sekretuje do periplazmového priestoru, alebo do kultivačného supematantu, čo závisí od vybranej hostiteľskej bunky.

Oblasti DNK sú odštiepitetľne napojené (keď existuje medzi nimi funkčný vzťah) medzi sebou. Napríklad DNK presekvencia alebo sekvenčný signál sú odštiepiteľne napojené na DNK pri polypeptide, keď je exprimovaný ako preproteín, ktorý participuje pri sekrécii polypeptidu; promótor je odštiepiteľne napojený na kódujúcu sekvenciu, keď kontroluje transkripciu sekvencie; alebo väzbové miesto ribozómu je odštiepiteľne napojené na kódujúcu sekvenciu, pokiaľ je umiestnené tak, že umožňuje transláciu. Odštiepiteľne naviazaný, zvyčajne znamená styčný a v prípade sekrečných signálov styčný a v čítacej forme.

Vhodnými hostiteľskými bunkami sú prokaryoty, kvasinky alebo vyššie eukaryotické bunky. Medzi prokaryoty patria gramnegatívne alebo grampozitívne organizmy, napríldad E. coli alebo Bacilli. Medzi vyššie eukaryotické bunky patria bunkové línie cicavcov pripravené spôsobom opísaným v ďalšom texte. Výhodnou hostiteľskou bunkou je kmeň E. coli W3110 (ATCC 27 325), ktorý je rezistentný na fágy; je opísaný v príkladoch, i keď sú vhodné aj iné prokaryoty, ako sú napríklad E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537, E. coli 294 (ATCC 31 446), typy Pseudomonas alebo Serratia Marcesens.

Výhodný na expresiu lymfotoxŕnu je systém prokaryotieký hostiteľ - vektor. Dostupných je veľa mikrobiálnych vektorov. Mikrobiálny vektor obsahuje zvyčajne začiatok replikácie, rozlišovaný požadovaným hostiteľom; promótor, ktorý bude fungovať v hostiteľovi, a fenotypický selekčný gén, napríklad gén kódujúci proteíny a prepožičiavajúci antibiotickú rezistenciu alebo dodávajúci auxotrofiiú požiadavku. Pre iných hostiteľov sa zostavujú podobné konštrukcie. E. coli sa transformuje typicky plazmidom pBR322, plazmidom odvodeným od typu E. coli [E. Bolivar a spol.: Gene 2, 95 (1977)]. Plazmid pBR322 obsahuje gény ampicilínovej a tetracyklínovej rezistencie, čím sa stáva dostupným a vhodným prostriedkom na identifikáciu transformovaných buniek.

Expresné vektory musia obsahovať promótor, ktorý je rozlišovaný hostiteľským organizmom, ale nie klonujúcimi vektormi. Promótor je zvyčajne homológny k požadovanému hostiteľovi. Medzi promótory, ktoré sa najčastejšie používajú pri konštrukcii rekombinantnej DNK, patrí β-laktamázový (penicilinázový) a laktózový promótorový systém [Chang a spol.: Náture 275, 615 (1978) a Goeddel a spol.: Náture 281, 544 (1979)] a tryptofánový promótorový systém (trp) [Goeddel a spol.: Nucleic Acids Res. 8,4 057 (1980) a prihlášková publikácia európskeho patentového úradu 36 776] a tacpromótor [H. De Boer a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 až 25 (1983)]. Ikeď sú tieto promótory naj častejšie používané, vhodné sú aj iné známe mikrobiálne promótory. Podrobnosti, týkajúce sa ich nukleotidových sekvencií, ktoré boli publikované umožňujú zručnému pracovníkovi odštiepiteľne ich ligovať na DNK kódujúcu lymfotoxín v plazmidových vektoroch [Siebenlist a spol.: Celí 20, 269 (1980)] a DNK kódujúcu lymfotoxín. V súčasnosti je výhodným vektorom derivát pBR322, ktorý obsahuje promótor E. coli alkalickej fosfatázy s trp Shine-Dalgamo sekvenciou. Promótor a Shine-Dalgamo sekvencia sú odštiepiteľne napojené na DNK kódujúcu lymfotoxín, to znamená, že sú situované tak, aby podporovali transkripciu lymfotoxinovej mRNK a DNK.

Vedľa prokaryotov sa vektormi kódujúcimi lymfotoxín transformujú tiež eukaryotické mikróby, ako sú napríklad kvasinkové kultúry. Saccharomyces cerevisiae, čiže obyčajné pekárenské kvasnice, sú najčastejšie používanými nižšími eukaryotickými hostiteľskými mikroorganizmami, napriek tomu, že sú dostupné aj mnohé iné kmene. Kvasinkové vektory zvyčajne obsahujú začiatok replikácie z dvojmikrónového kvasinkového plazmidu alebo samostatne sa replikujúcu sekvenciu (ARS), promótor, DNK kódujúcu lymfotoxín (vrátane ľudského pre-lymfotoxínu), sekvenciu pre polyadenyláciu a termináciu transkripcie a selekčný gén. Vhodným plazmidom pre expresiu lymfotoxínu v kvasinkách je plazmid YRp7 [Stinchcomb a spol.: Náture 282, 39 (1979), Kingsman a spol.: Gene 7,141 (1979) a Tschemper a spol.: Gene 10, 157 (1980)]. Tento plazmid už obsahuje trpí gén, ktorý poskytuje selekčný znak (marker) mutantnému kmeňu kvasiniek, ktorý nemá schopnosť rastu v tryptofáne, napríklad ATCC č. 44 076 alebo PEP4-1 [Jones: Genetics 85,12 (1977)]. Prítomnosť oblasti trpí v genóme kvasinkovej hostiteľskej bunky tak poskytuje účinné okolie pre detekciu transformácie rastom za neprítomnosti tryptofánu.

Medzi vhodné promótorove sekvencie v kvasinkových vektoroch patria promótory pre metalotioneín, 3-fosfoglycerátkinázu [Hitzemam a spo.: J. Biol. Chem. 255, 2 073 (1980)] a iné glykolytické enzýmy [Hess a spol.: J. Adv. Enzýme Reg. 7, 149 (1968) a Holland a spol.: Biochemistry 17, 4 900 (1978)], ako sú napríklad enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát-dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukozo-6-fosfát-izomeráza, 3-fosfoglycerát-mutáza, pyruvátkináza, triozofosfát-izomeráza, fosfoglukózoizome-ráza a glukokináza. Vhodné vektory a vhodné promótory na použitie pri expresii kvasinkami sú opísané ďalej R. Hitzemanom a spol.: Publikácia európskeho patentového úradu č. 73 657. Inými promótormi, ktoré majú ďalšiu výhodu transkripcie regulovanej podmienkami rastu, sú promótor oblasti alkoholdehydrogenázy 2, izocytochróm C, kyslá fosfatáza, degradatívne enzýmy spojené s metabolizmom dusíka, uvedený metalotionenín a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, a tiež enzýmy, ktoré sú zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy. Pri konštrukcii vhodných expresných plazmidov sa terminačné sekvencie spojené s týmito génmi tiež ligujú do expresného vektora 3' sekvencie kódujúcej lymfotoxín. Tým je zaistená polyadenylácia a terminácia mRNK.

Vedľa mikroorganizmov môžu byť ako hostitelia použité tiež kultúry buniek, ktoré sú odvodené od mnohobunkových organizmov. Tie však nie sú výhodné, lebo až doteraz boli s mikróbami, ktoré expresiou poskytujú lymfotoxín, získané vynikajúce výsledky. V

SK 278333 Β6 princípe je možné pracovať s akoukoľvek kultúrou vyšších eukaryotických buniek, či už ide o kultúru stavovcov alebo nie. Najväčší záujem sa sústreďuje na bunky stavovcov. V poslednom čase sa množenie buniek stavovcov v kultúre (tkanivová kultúra) stalo rutinnou záležitosťou [Tissue Culture, Academic Press, ed. Kruse a Patterson, (1973)]. Príkladmi užitočných hostiteľských bunkových línií sú bunky VERO a HeLa bunky, bunkové línie vaječníkov čínskeho škrečka a bunkové línie WI38, BHK, COS-7 a MDCK. Expresné vektory pre tieto bunky obsahujú zvyčajne (keď je to nutné) počiatok replikácie, promótor, ktorý je umiestnený proti smeru génu, ktorý sa má získať expresiou, spolu s ribozómovým väzbovým miestom, miesto strihu RNK (keď sa používa genómová DNK obsahujúca intrón), polyadenylačné miesto a transkripčnú sekvenciu terminácie.

Transkripčná a translačná regulačná sekvencia v expresných vektoroch, ktoré sú určené na použitie v transformovaných bunkách stavovcov, sa získavajú často z vírusových zdrojov. Tak napríklad používané promótory sú zvyčajne odvodené od Polyoma, Adenovirus 2 a najvýhodnejšie od typu Simian Vírus 40 (SV 40). Tieto promótory sú zvlášť užitočné, pretože sa ľahko získavajú z vírusu ako fragment, ktorý obsahuje tiež SV 40 vírusový začiatok replikácie [Fiers a spol.: Náture 273, 113 (1978)]. Je možné použiť tiež menšie alebo väčšie SV40 fragmenty za predpokladu, že obsahujú sekvenciu s približne 250 pármi nukleotidov (pármi báz) od miesta Hind Hl k miestu Bgl I, umiestnenou vo vírusovom začiatku replikácie. Ďalej je tiež možné, a často žiaduce, využiť ľudský genómový promótor, riadiaci a/alebo signálnu sekvenciu zvyčajne spojenú s lymfotoxínom za predpokladu, že takéto riadiace sekvencie sú zlučiteľné so systémami hostiteľských buniek.

Začiatok replikácie sa môže získať buď konštrukciou vektora, ktorý by mal exogénny začiatok, ako napríklad taký, ktorý je možné odvodiť od SV40 alebo od iného vírusového zdroja (napríklad Polyoma, Adenovirus, VSV alebo BPV), alebo sa môže získať replikačným chromozomálnym mechanizmom hostiteľskej bunky. Keď je vektor integrovaný v chromozóme hostiteľskej bunky, potom je často postačujúca druhá možnosť. Transformáciou vyšších eukaryotických buniek ľudskou pre-lymfotoxínovou DNK sa pripraví lymfotoxín s metionŕnovou skupinou na amínovom konci.

Pri výbere výhodnej hostiteľskej cicavčej bunky na transfekciu vektorov, ktoré obsahujú DNK sekvencie kódujúce nielen lymfotoxín, ale aj dihydrofolát-reduktázu (DHFR), je vhodné vybrať hostiteľa podľa toho, aký typ DHFR proteinu sa použije. Keď sa používa DHFR proteín divokého typu, potom je výhodné vybrať takú hostiteľskú bunku, ktorá je deficitná na DHFR; umožní to použiť DHFR kódujúcu sekvenciu ako markér pre úspešnú transfekciu do selektívneho média s nedostatkom hypoxantínu, glycínu a tymidínu. V tomto prípade je príslušnou hostiteľskou bunkou bunková línia vaječníkov čínskeho škrečka deficitná na DHFR aktivitu, ktorá sa pripraví a namnoží spôsobom opísanom Urlaubom a Clasinom: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4 216 (1980). Naopak, keď sa ako riadiaca sekvencia použije DNK kódujúca DHFR proteín s nízkou väzbovou afinitou k metotrexátu (MTX), potom sa nemusia používať bunky rezistentné na DHFR. Pretože mutantné DHFR je rezistentné na MTX, je možné použiť médium obsahujúce MTX ako prostriedok selekcie za predpokladu, že hostiteľské bunky sú na MTX citlivé. Väčšina eukaryotických buniek, ktoré sú schopné absorbovať MTX, sú citlivé na metotrexát. Jednou z takýchto užitočných bunkových línií je línia CHO, CHO-K1 (ATCC č. CCL 61).

Transformované hostiteľské bunky sú také bunky, ktoré boli transformované alebo transfektované lymfotoxínovými vektormi skonštruovanými technikami rekombinantnej DNK. Transformované hostiteľské bunky zvyčajne exprimujú lymfotoxín. Exprimovaný lymfotoxín sa ukladá väčšinou intraceluláme.

Lymfotoxín z rekombinantnej kultúry nesekretujúcich buniek sa izoluje lyžou buniek a odstránením čiastkového materiálu odstredením alebo podobným spôsobom. Bunky, ktoré vylučujú lymfotoxín, sa oddelia od kultivačného supematantu odstreďovaním. Kontaminovaný roztok s lymfotoxínom sa potom oddelí uvedenými spôsobmi alebo imunoafinitne podľa toho, ako je to opísané v príklade 4. Lymfotoxín sa vyčistí do stupňa, ktorý je vhodný na farmakologické použitie. Vyčistený lymfotoxín sa umiestni do konvenčných dávkovacích foriem, napríklad fiol alebo injekcií. Používa sa zmes variantných lymfotoxínov, napríklad zmes cytotoxických mutantných lymfotoxínov. Lymfotoxín dlhé skladovanie sa lyofilizuje. Môže sa skladovať vo vodných roztokoch so stabilizátormi a excipientmi, napríklad v izotonických soľných roztokoch. Pacientom sa lymfotoxín podáva spôsobom, ktorý opísal B. Aggarwal a spol.: európska patentová prihláška 100 641.

Lymfotoxínové prostriedky sa podávajú živočíchom, ktoré majú nádory. Spôsob podávania je zhodný so známymi spôsobmi podávania, napríklad intravenózne, intraperitoneálne, podkožné, intramuskuláme, vnútornou infúziou alebo podávanie sterilných roztokov lymfotoxínu injekčné, alebo je možné použiť ďalej opísaný systém s pomalým uvoľňovaním lymfotoxínu. Lymfotoxín sa podáva do miesta poškodenia, t. j. priamo injekčné do pevných nádorov. V prípade roztrúsených nádorov, ako je napríklad leukémia, je výhodné podávať lymfotoxín intravenózne alebo do lymfatického systému. Nádory orgánov v brušnej dutine, ako je napríklad rakovina vaječníkov, sa výhodne lieči intraperitoneálnou infúziou použitím prostriedkov na perionteálnu dialýzu a tomu zodpovedajúcich roztokov. Zvyčajne sa však lymfotoxín podáva kontinuálne infúziou, i keď je prípustné i podávanie bolusu injekčné. Je potrebné, aby bol lymfotoxín podávaný vo forme implantovateľných prostriedkov, ktoré ho pomaly uvoľftujú. Príklady vhodných systémov pre proteíny, ktoré majú molekulovú hmotnosť zodpovedajúcu dimérom alebo trimérom lymfotoxínu, sú kopolyméry L-glutámovej kyseliny a gama etyl-L-glutamátu [V. Sidman a spol.: Biopolymers 22 (1), 547 až 556 (1983)], poly-(2-hydroxyetyl-metakrylát) [R. Langer a spol.: J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 až 277 (1981), alebo v etylén-vinylacetáte [R. Langer a spol.: pozri vyššie, R. Langer: Tech. 12, 98 až 105 (1982)]. Prostriedky obsahujúce lymfotoxín sa implantujú do miest, z ktorých boli nádory chirurgicky odstránené. Na injekčné podanie do nádoru sa lymfotoxín tiež používa v polopriepustných mikrotobolkách alebo lipozómoch. Tento spôsob podávania je zvlášť užitočný pri chirurgicky neodstrániteľných nádoroch, napríklad pri mozgových nádoroch.

Množstvo lymfotoxínu, ktoré sa pri podávaní používa, je závislé od spôsobu podávania, od typu nádoru a od stavu pacienta. Bude potrebné, aby terapeuti stanovili dávku a modifikovali spôsob podávania tak, ako

SK 278333 Β6 to je potrebné pre získanie optimálnej cytotoxickej účinnosti na cieľový nádor; je to možné stanoviť napríklad biopsiou nádoru alebo diagnostickými testami na údajné rakovinové znaky, ako je napríklad karcinóm-embryonný antigén, z pohľadu akejkoľvek rekombinantnej toxicity vo zvýšenej dávke. Dávkovanie rekombinantného lymfotoxínu myšiam v dávkach od 50 do 200 pg/kg telesnej hmotnosti/deň pri intravenóznom podávaní je zvyčajne v podstate netoxické a účinné in vivo. Režim dávkovania sa bude zrejme líšiť u rôznych zvierat.

Podľa tejto prihlášky bol objavený spôsob získavania protilátky neutralizujúcej lymfotoxín. Neutralizujúca protilátka je definovaná ako protilátka, ktorá je schopná viazať lymfotoxín (taký lymfotoxín, ktorý je definovaný v zmysle tejto prihlášky), takým spôsobom, že v podstate zníži jeho účinnosť v testoch cytostatickej alebo cytologickej účinnosti lymfotoxínu, ako je napríklad ďalej opísaný test myšieho L929. Skutočnosť, že protilátka je schopná zneutralizovať účinnosť lymfotoxínu však neznamená, že sa protilátka musí viazať priamo na aktívny lymfotoxín alebo na receptorové väzbové miesto. Protilátka môže ešte v podstate neutralizovať účinnosť lymfotoxínu aj vtedy, keď sa stéricky naviaže na oblasť, ktorá susedí s kritickým miestom, t. j. susedí v zmysle konformačného susedstva a nie z hľadiska v aminokyselinovej sekvencii.

Pri pokusoch prípravy neutralizujúcej protilátky (monoklonálnej) voči lymfotoxínu sa zistilo, že je ťažké imunizovať myši tak, aby sa vo zvieratách vytvárala, alebo aby sa zvýšila hladina protilátky neutralizujúca lymfotoxín. Ani imunizácia lymfoblastoidným lymfotoxínom ani lymfotoxínom skrížené zviazaným s glutaraldehydom neviedla k vytvoreniu akéhokoľvek detegovateľného množstva neutralizujúcej protilátky v sére imunizovaných myší ani vtedy, keď sa nezvýšilo množstvo neneutralizujúcej anti-lymfotoxínovej protilátky detegovateľnej enzýmovým imunotestom. Ale imunizácia s adsorpčným komplexom: lymfotoxín - oxid hlinitý (AI2O3.3H2O) viedla k zvýšeniu neutralizujúcej protilátky napriek tomu, že i keď pred imunizáciou týmto komplexom bolo získanie akejkoľvek aktivity u zvierat neúspešné. Príprava oxidu hlinitého a jeho použitie pri výrobe antiséra je opísané v Methods in Immunology and Immunochemistry I, strana 197 až 229, ed. C. Williams a spol. (1967).

Bunky zo sleziny zvierat produkujúcich neutralizujúce protilátky boli spojené s bunkami myšieho myleómu. V priemere sa muselo testovať 50 až 100 klonov, aby sa získal jeden kloň, ktorý syntetizuje neutralizujúcu protilátku. Spôsob testovania klonov na požadovanú účinnosť je záležitosť rutinná, dobre známa zručným odborníkom, ktorá je dobre reprodukovateľná pri minimálnom experimentálnom úsilí.

Je tu možné použiť sérum, plazmu alebo IgG frakciu z imunizovaných zvierat, rovnako ako imunoglobulíny sekretované hybridomami generovanými zo slezinových alebo lymfatických buniek imunizovaných zvierat. Vo výhodnom usporiadaní sa neutralizujúca protilátka získa v podstate čistá, bez ďalších antilymfotoxínových protilátok z hybridómovej kultúry.

Neutralizujúca protilátka sa imobilizuje adsorpciou na povrchu, napríklad na termoplastoch, ako je polystyrén, alebo sa naviaže kovalentne na matrice, ako je napríklad Sepharosa aktivovaná brómkyanom. Potom sa použije na imunotesty alebo na imunoalinitné čistenie. Pretože protilátka je neutralizujúcou protilátkou, používa sa na adsorpciu alebo detekciu biologicky účinného lymfotoxínu alebo jeho fragmentov. Protilátka je zvlášť užitočná v imunorádiometrických (sandwich) imuno-testoch s ne-neutralizujúcou anti-lymfotoxíno5 vou monoklonálnou protilátkou alebo s polyklonálnym antisérom, ktoré obsahuje ne-neutralizujúci protilymfotoxín. Imunotest sa vykoná tak, že sa ako značená zložka používa buď neutralizujúca alebo ne-neutralizujúca protilátka. Značenie sa vykoná niektorou detegovateľ10 nou zlúčeninou, ako je napríklad fluorescenčné, chemiluminiscenčné alebo rádioizotopové označenie spôsobmi známymi z odbornej literatúry. Pre lymfotoxínové imunotesty kompetitivneho typu sa lymfotoxín označí rovnakým spôsobom. Na prípravu lymfotoxínu, 15 ale aj lymfotoxínovej protilátky so značeným atómom, je vhodná rádiojodácia chloramínom T alebo spôsob, ktorý opisuje J. Klostergaard a spol.: Mol. Immun. 18, 455 (1980).

Na zjednodušenie príkladov, budú teraz uvedené 20 odkazy na niektoré často sa vyskytujúce spôsoby, s krátkymi vysvetleniami.

Plazmidy sú označované malým p, za ktorým nasledujú veľké písmena a/alebo čísla. Východiskové plazmidy používané v tomto opise sú komerčne do25 stupné, sú verejne dostupné bez akýchkoľvek reštrikčných obmedzení, alebo sa dajú z takto dostupných plazmidov skonštruovať publikovanými spôsobmi. Okrem toho, sú v odbornej literatúre známe ekvivalentné plazmidy, čo je známe bežnému odborníkovi.

Pojem štiepenie'' DNK sa týka katalytického štiepenia DNK enzýmom, ktorý pôsobí na určitých miestach v DNK. Takéto enzýmy sa volajú reštrikčné enzýmy. Miesta, pre ktoré sú tieto enzýmy špecifické, sa volajú reštrikčné miesta. Pojem, čiastočné štiepenie znamená neúplné rozštiepenie reštrikčným enzýmom, t. j. štiepenie prebieha v takých podmienkach, že niektoré miesta (nie všetky) v DNK substráte sú štiepené danou reštrikčnou endonukleázou. Rôzne reštrikčné enzýmy, ktoré sa tu používajú, sú komerčne dostupné.

Pri ich používaní sa postupovalo podľa návodu dodávateľov enzýmov, pokiaľ sa to týka reakčných podmienok, katalyzátora a ďalších požiadaviek. Reštrikčné enzýmy sú zvyčajne označené skratkami, ktoré sa skladajú z veľkého písmena, po ktorom nasleduje ďalšie 45 písmeno (písmená) a potom zvyčajne číslo reprezentujúce mikroorganizmus, z ktorého bol reštrikčný enzým pôvodne získaný. Zvyčajne sa pracuje asi s 1 mikrogramom plazmidu alebo fragmentu DNK a asi s 1 jednotkou enzýmu v asi 20 μΐ pufru. Množstvá prísluš50 ných pufrov a substrátov pre príslušný reštrikčný enzým sú dané výrobcom. Zvyčajne sa pracuje pri inkubačnom čase 1 hodina, pri teplote 37 °C, ale obe sa môžu meniť podľa inštrukcií dodávateľov. Po inkubácii sa proteín odstráni extrakciou fenolom a chloro55 formom a štiepená nukleová kyselina sa izoluje z vodnej fázy vyzrážaním etanolom. Po štiepení reštrikčným enzýmom nasleduje niekedy hydrolýza terminálneho 5' fosfátu bakteriálnou alkalickou fosfatázou, aby sa zabránilo tomu, že by sa reštrikčné rozštiepené konce 60 fragmentu DNK scirkularizovali, alebo aby vytvorili uzavretú slučku, čo by potom bránilo inzercii iného fragmentu DNK do reštrikčného miesta. Pokiaľ nie je uvedené ináč, nenasleduje po štiepení plazmidov defosforylácia na 5' konci. Pre defosforyláciu sa používa6$ jú konvenčné postupy a činidlá [T. Maniatis a spol.: Molecular Cloning, str. 133 až 134 (1982)].

Pojem izolácia daného fragmentu DNK z reštrik10

SK 278333 Β6 čného štiepenia znamená, že rozštiepená časť sa oddelí elektroforézou na polyakrylamidovom géli, fragment, o ktorý sa zaujímame, sa identifikuje porovnávaním jeho pohyblivosti s fragmentmi označenej DNK známej molekulovej hmotnosti, odstráni sa sekcia gélu, ktorá obsahuje požadovaný fragment a gél sa sám oddelí od DNK. Tento postup je všeobecne známy. Pozri napríklad R. Lawn a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 6 103 až 6 114 (1981) a D. Goeddel a spol.: Nucleic Acids Res. 8, 4 057(1980).

Southemova analýza je spôsob, ktorým je prítomnosť sekvcncií DNK v rozštiepenej časti alebo v prostriedku obsahujúcom DNK potvrdená hybridizáciou na známy fragment značeného oligonukleotidu alebo DNK. Southemova analýza bude znamenať rozdelenie rozštiepených fragmentov na 1 % agaróze, denaturáciou a prenesením na nitrocelulózu spôsobom podľa E. Southema: J. Mol. Biol. 98, 503 až 517 (1975) a hybridizáciou tak, ako ju opísal T. Maniatis a spol.: Celí 15, 687 až 701 (1978).

Pojem transfomrácia znamená zavedenie DNK do organizmu takým spôsobom, že DNK je schopná replikácie, a to alebo ako mimochromozomálny prvok alebo ako integrálna časť chromozómu. Pokiaľ nie je uvedené ináč, potom spôsob použitý v tejto prihláške na transformáciu E. coli je spôsob s chloridom vápenatým podľa Mandela a spol.: J. Mol. Biol. 53, 154 (1970).

Pojem ligácia označuje proces tvorby fosfodiesterových väzieb medzi dvoma fragmentmi dvoj vláknovej nukleovej kyseliny [T. Maniatis a spol.: Celí 15, str. 146 (1978)]. Pokiaľ nie je uvedené ináč, vykoná sa ligácia použitím známych pufrov v známych podmienkach s desiatimi jednotkami T4 DNK ligázy (ligasa) a s 0,5 pg približne ekvimolámych množstiev fragmentov DNK, ktoré majú byť ligované.

Pod pojmom príprava DNK z transformantov sa rozumie izolácia plazmidovej DNK z mikrobiálnej kultúry. Pokiaľ nie je uvedené ináč, môže sa použiť alkalický SDS spôsob podľa Maniatisa [T. Maniatis a spol.: Celí 15, str. 90 (1978)].

Pojem oligonukleotidy znamená krátke jednovláknové alebo dvoj vláknové polydeoxynukleotidy, ktoré sa chemicky syntetizujú podľa spôsobu uvedeného v citácii, v príklade 1, potom sa vyčistia na polyakrylamidových géloch.

Všetky citácie literatúry sú tu výslovne zahrnuté ako odkazy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok la znázorňuje DNK sekvenciu a aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa všeobecne pokladá za sekvenciu kódujúcu lymfotoxínový fragment. Na obrázku lb je konštrukcia syntetickej DNK kódujúcej fragment na obrázku la. Obrázok 2a znázorňuje úplnú aminokyselinovú sekvenciu pre pre-lymfotoxín a jej kódujúcu DNK plus 5' a 3' vedľajšej netranslovanej oblasti. Obrázok 2b ilustruje spôsob konštrukcie expresného vektora lymfotoxínu s metionínovu a leucínovou skupinou na amínovom konci a jeho deriváty s metionínovou skupinou na amínovom konci. Obrázok 3 znázorňuje spôsob konštrukcie expresného vektora pre lymfotoxín s metionínovou a histidínovou skupinou na amínovom konci. Obrázok 4 opisuje aminokyselinové sekvencie ľudského, myšieho a hovädzieho lymfotoxínu a zodpovedajúce časti cicavčieho lymfotoxínu. Obrázok 5a a obrázok 5b opisujú konštrukciu plazmidu kódujúceho spojenie lymfotoxínu s bakteriálnou signálnou sekvenciou.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Čistenie a sekvenovanie lymfotoxínu

Ľudská lymfoblastoidná bunková línia RPMI-1788 (ATCC č. CCL-156) sa nechá rásť v pätnásťlitrovej vibrujúcej banke do bunkovej hustoty 4 x 10⁵ buniek/ml pri použití bezsérového kultivačného média (RPMI-1640). Lymfotoxín sa indukoval 10 až 20-krát (na 500 až 1 000 jednotiek lymfotoxínu na mililiter; stanovené ďalej opísaným spôsobom) nad základné hladiny pridaním 20 ng/ml myristan-acetátu forbolu v bezsérovom médiu RPMI-1640. Po 65 hodinách kultivácie sa bunky odfiltrujú, lymfotoxínová účinnosť vo filtráte sa absorbuje na kolóne (5 cm x 20 cm) so sklenenými guľkami s kontrolovanou veľkosťou pórov (Electronucleonics), ekvilibruje sa 5 mM fosfátovým pufrom (pH 7,4) a eluuje sa 50 % etylénglykolom v 5 mM fosfátovom pufri (pH 7,4). Pre inhibíciu mikrobiálneho rastu sa do všetkých pufrov počas čistenia pridá roztok 0,1 mM fenylmetyl-sulfonyl-fluoridu (PMSF), inhibítora proteázy a 1 mM azidu sodného. Eluát zo sklenených guliek obsahoval 84 000 jednotiek lymfotoxínu na mg proteinu. Nasledovala chromatografia na DEAE celulóze, chromatografia na Sepharose lektinu zo šošovice a preparatívna natívna PAGE, ako opisuje B. Aggarwal a spol.: J. Biol. Chem. 259 (1), 689 až 691 (1984). Homogenita proteinu zodpovedného za cytotoxickú účinnosť bola stanovená SDS-PAGE, HPLC na kolóne s Lichrosorbom RP-18 na obrátených fázach a aminoterminálnou sekvenáciou.

Tento lymfotoxínový prípravok obsahoval viac ako 95 hmotnostných percent lymfotoxínu s leucínovou skupinou na amínovom konci s molekulovou hmotnosťou približne 25 000 na SDS-PAGE. Teoretická hmotnosť (molekulová hmotnosť) proteínovej zložky s leucínovou skupinounaN-koncije 18 664. Zostávajúcich asi 6 500 sa pripisuje glykozylovanému bočnému reťazcu na Asn + 62 a asi aj ďalším cukrovým zvyškom naviazaným cez atóm kyslíka. Supematant tkanivovej kultúry obsahoval údajne multiméry tohto typu (molekulová hmotnosť 60 000 podľa TSK-HPLC alebo 64 000 podľa chromatografie na Sephadexe G-100).

Zostávajúcich 5 percent lymfotoxínovej zmesi boli typy s histidínovou skupinou na N-konci molekulovej hmotnosti asi 20 000. Obidva typy vykazovali v podstate rovnakú cytolytickú aktivitu, aspoň v rámci obmedzení ďalej opísaného textu lýzy vyšších fibroblastových buniek.

Trypsínové štiepenie pôvodných molekúl lymfotoxínu poskytlo len niekoľko fragmentov. Lymfotoxín s histidínovou skupinou na amínovom konci bol rozštiepený medzi aminokyselinami v polohe 89 a 90 na dva fragmenty. Také isté štiepenie lymfotoxínu s leucinovou skupinou na amínovom konci poskytlo štiepením medzi polohami 15 a 16, 19 a 20, 89 a 90 štyri fragmenty.

Mikrosekvenáciou Endmanovou degradačnou technikou sa získali informácie o sekvencii molekuly a tiež o produktoch získaných trypsínovým štiepením.

Ďalšie informácie o sekvencii boli získané z fragmentov lymfotoxínu pripravených štiepením karboxy

SK 278333 Β6 peptidázou P, chymotrypsínom, kyselinou octovou a brómkyánom. Týmto spôsobom bola stanovená takmer úplná sekvencia ľudského lymfotoxínu. Bolo určených 156 susediacich zvyškov na amino vom konci. Z týchto sekvenčných informácií vyplynulo, že rozdiel medzi týmito dvomia typmi je v prítomnosti 23 zvyškov na aminovom konci v typoch s leucínovou skupinou na amínovom konci, pričom sa tieto zvyšky nenašli v typoch s histidinovu skupinou na aminovom konci. Preukázať prítomnosť karboxylovej terminálnej sekvencie za prvými tromi zvyškami je ťažké, pretože v tejto oblasti sú prítomné peptidové väzby, a pretože zvyšky majú hydrofóbnu povahu.

Bol navrhnutý syntetický gén, ktorý by kódoval sekvenciu proteínu v rozsahu danom mikrosekvenovaním. Navrhnutý proteín výhodne obsahuje zvyčajne výhodné kodóny E. coli. To znamená, že vzácne používané kodóny E. coli sa v sekvencii nepoužili. Pokiaľ nebola zrejmá žiadna výhoda kodónu E. coli, potom sa použili vhodné ľudské kodóny. Touto výhodou sa dosiahla expresia v E. coli a tiež to, že syntetický gén by mohol byť užitočný ako sonda na identifikáciu prírodnej DNK sekvencie z knižníc ľudských cDNK alebo z genómových knižníc. Na konštrukciu fragmentov a pre ďalšiu manipuláciu s génom boli navrhnuté na sekvenciu reštrikčné miesta Xbal, BamHI, HindlH a BglU.

Päťdesiatosem pôvodných oligomérov, ktoré boli navrhnuté pre syntetický lymfotoxínový gén, sa syntetizovalo fosforitanovou metódou v pevnej fáze podľa M. Matteucciho a spol.: J. Amer. Chem. Soc. 103, 3 185 až 3 190 (1981) a S. Beaucageho a spol.: Tetr. Letters 22, 1 859 až 1862 (1981). Veľkosť týchto oligomérov sa pohybovala medzi 16 a 20 bázami (pozri obrázok la). Oligoméry sa prekrývali v dĺžke 6 báz. Celý zostavený gén je uvedený na obrázku lb. Gén bol skonštruovaný z troch oddelených častí. Prvá časť, segment A, mal dĺžku 117 párov nukleotidov a predstavoval 5’ kódujúcu oblasť amínového konca s leucínovou skupinou na amínovom konci. Segment B, ktorý mal dĺžku 145 párov nukleotidov, predstavuje DNK kódujúcu strednú časť lymfotoxínovej molekuly. O segmente C dĺžky 217 párov nukleotidov sa predpokladá, že kóduje až na 16 aminokyselinových zvyškov celý karbonylový koniec lymfotoxínu. Oligoméry, ktoré boli potrebné na syntézu každého segmentu, boli vyčistené elektroforézou a spojené. Aby boli chyby pri syntéze čo najmenšie, boli vybrané oligoméry relatívne malej veľkosti (t. j. 16 až 20 párov nukleotidov).

Každá skupina oligomérov bola fosforylovaná v reakcii, ktorá obsahovala 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM chloridu horečnatého, 20 mM ditiotreitolu, 0,5 mM ATP a 15 jednotiek T4 polynukleid-kinázy v objeme 50 μΐ. Reakcia obsahovala približne asi 50 pmolov každého oligoméru. Po 30 minútach pri teplote 37 °C bola aktivita kinázy zničená zahriatím na 65 °C. Zmes sa nechala počas jednej hodiny pomaly ochladiť na 20 ’C. Fosforylované oligoméry boli ligované pridaním 10 jednotiek T4 DNK ligázy. Reakcia sa nechá prebiehať dve hodiny pri 20 ’C. DNK ligáza sa zahriatím deaktivuje. Ligované oligoméry sa štiepili tri hodiny pri 37 ’C reštrikčnými endonukleázami, ktoré rozlišujú navrhnuté koncové miesta [napríklad XBal a BamHI pri segmente A], Fragmenty každého segmentu sa izolujú elektroforézou na sedempercentnom polyakrylamidovom géli. Pre každý segment sa identifikujú vyfarbením etídium-bromidom fragmenty s presnou pohyblivosťou a elektroeluujú sa z gélu. Plazmid pFfFtrp69 [D. Goeddel a spol.: Náture 287, 411 až 416 (1980) alebo Crea a spol.: európska patentová prihláška 0 048 970] sa rozštiepi pôsobením Xbal a BamHI. Elektroforézou na 6 % polyakrylamidovom géli sa izoluje veľký vektorový' fragment. Do fragmentu pFIFtrp69 sa liguje asi 50 ng segmentu A. Podobne sa segment B liguje do plazmidu pBR322 rozštiepeného BamHI a HindUI a segment C do plazmidu pLeIFA-125-1 rozštiepeného pôsobením HindUI a BglU [D. Goeddel a spol.: Nucieic Acids Research 8, 4 057 až 4 073 (1980)]. Ligačné reakčné zmesi sa transformujú do E. coli ATCC 31 446. Výsledné rekombinantné plazmidy sa charakterizujú analýzou reštrikčnými ednonukleázami a sekvenovaním DNK metódou chemickej degradácie podľa Maxama a Gilberta. Päť zo šiestich klonov segmentu A obsahovali požadovanú sekvenciu. Boli izolované štyri plazmidy zo segmentu B a štyri plazmidy zo segmentu C a všetky tieto inzerty mali správne sekvencie. Každý segment bol izolovaný rozštiepením reštrikčnými endonukleázami, ktoré rozlišovali koncové miesta a boli potom ligované do plazmidového vektora pFIFtrp69 rozštiepeného pôsobením XBal a BglII. Výsledný rekombinantný plazmid pLTXBl bol charakterizovaný sekvenovaním vloženého fragmentu Xbal-Bgin, ktorý obsahoval sekvenciu uvedenú na obrázku la

Na stanovenie toho, či syntetický gén bude skutočne produkovať biologicky účinný lymfotoxín, sa transformanty E. coli nechajú rásť v minimálnom médiu v podmienkach depresie trp promótora a expresie génu syntetického lymfotoxínu. Kultúry sa nechajú rásť do optickej hustoty 1,0 pri 550 nm a izolujú sa odstredením. Bunkové pelety sa suspendujú v jednej desatine objemu, potom sa lyžujú sonikáciou.

Aktivita lymfotoxínu sa stanoví modifikovaným testom bunkovej lýzy podľa B. Spofforda: J. Immunol. 112, 211 (1974). V stručnosti - myšie fibroblastové bunky L-929 sa nechajú rásť na mikrotitrovacich doštičkách za prítomnosti aktinomycínu D. Po 12 až 18 hodinách sa do každej jamky pridá 0,125 ml sériovo zrieďovaného roztoku, ktorý sa testuje na lymfotoxín. Po 18 hodinách sa doštičky premyjú. Lýza buniek indukovaná lymfotoxínom sa stanoví zafarbením doštičiek 1 % roztokom kryštalickej violeti v zmesi metanolu s vodou (v pomere 1 : 4, objemové diely). Intenzita zafarbenia boía pozorovaná nielen vizuálne, ale aj spektrometrickv pri 450 nm a 570 nm pomocou spektrofotometra. Dynatech. V bunkách, ktoré boli do mikrotitračnej jamky aplikované len spoločne s kultivačným médiom nastala 0 % lýza, zatiaľ čo v bunkách, ktoré boli aplikované spolu s roztokom 3 M hydrochloridu guanidínu, bola v konečnom štádiu pozorovaná 100 % lýza. Jedna jednotka lymfotoxínu je definovaná ako množstvo lymfotoxínu, ktoré je potrebné na lýzu 50 % buniek z 12 000 buniek aplikovaných do každej jamky. Poznamenajme, že je možné použiť aj iné testy cytotoxickej účinnosti. Pozri napríklad: B. Aggarwal a spol.: v Thymic Hormones and Lymphokines, ed. A. Godlstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center, 1983 (bunková línia A549, ktorá je citovaná v tomto materiáli, je dostupná z ATCC pod označením CCL185). Kultivačné lyzáty nevykazovali v opísanom teste na myších bunkách žiadnu cytotoxickú účinnosť. Kontrolné lyzáty z kultúr, ktoré poskytujú expresiou gama interferón, neobsahujú gama interferónovú aktivitu. Z tohto výsledku je možné usudzovať, že synte

SK 278333 Β6 tický gén nekóduje aktívny lymfotoxín. Existuje preto niekoľko vysvetlení. Napríklad:

1. E. coli degraduje lymfotoxín,

2. gén lymfotoxinu sa netranskribuje v E. coli,

3. lymfotoxínová informácia sa neprenáša do E. coli

4. proteín nemá patričnú sekvenciu vďaka chybe v sekvencii proteínu alebo

5. sekvencia 16 zvyškov na karboxylovom konci alebo jej časť je skutočne potrebnou podmienkou pre účinnosť príslušnej konfigurácie molekuly lymfotoxinu.

Príklad 2

Postup získania cDNK kódujúcej lymfotoxín

RNK sa izoluje z kultúry neadherentnej bunkovej frakcie lymfocytov ľudskej periférnej krvi po 48 hodinách od indukcie mvristát-acetátom forbolu (10 ng/ml), stafylokokovým enterotoxinom B (1 pg/ml) a tymozínom a-1 [S. Berger a spol.: Biochemistry 18, 5 143 až 5 149 (1979)]. Táto kultúra produkuje aktivitu 400 jednotiek lymfotoxinu na mililiter supematantu. mRNK sa skoncentruje adsorpciou na imobilizovaný oligod T, eluuje sa a cDNK sa pripraví reverznou transkripciou [P. Gray a spol.: Náture 295, 503 až 508 (1982)]. Na prípravu cDNK kópie mRNK štandardnými spôsobmi sa použije reverzná transkriptáza. Druhé vlákno sa pripraví (tiež štandardnými spôsobmi) Klenowovým spracovaním. cDNK sa spracuje s S-l nukleázou, čím sa odstráni vlásenková slučka. Po vložení tejto cDNK do vektora sa ligujú konce k adaptéru alebo k linkéru tak, že sa vytvoria 5' a 3' miesta pre reštrikčné enzýmy alebo výhodné kohezívne konce pre miesta vopred stanovených reštrikčných enzýmov. Na tento účel bol použitý oligonukleid

5' HO-AATTCATGCGTTCTTACAG GTACGCAAGAATGTC-P 5'.

Oligonukleid sa liguje k cDNK. cDNK sa reizoluje elektroforézou z polyakrylamidového gélu. Všeobecne dostupný fág gama-gtlO (alebo v podstate jeho ekvivalent, fág gama-gtl], ktorý je dostupný z ATCC) sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Izoluje sa lineárny fragment [M. Wickens a spol.: J. Biol. Chem. 253, 2 483 až 2 495 (1978)]. Napojený reverzný transkript a štep gama-gtlO sa ligujú. Ligačná zmes sa použije na transfekciu E. coli C-600 alebo iného známeho hostiteľa podliehajúceho infekcii fágu gama. Na 15 cm doštičku sa aplikuje približne 10 000 rekombinantných fágov, ktoré sa testujú nízkoselektivnou hybridizačnou metódou cez jednotlivé plaky [T. Maniatis a spol.: Celí 15, 687 až 701 (1978) a P. Grey a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 5 842 až 5 846] použitím ^MP-značenej sondy pripravenej zo segmentu A na obrázku 1 a, spôsobom podľa J. Taylora a spol.: Biochem. Biophys. Acta 442, 324 až 330 (1976), v ktorom sa používajú DNK priméry teľacieho brzlíka (PL Biochemicals). Duplikátne nitrocelulózové filtre sa hybridizujú nízkoselektivnou metódou sondou (5.10⁷impulzov za minútu) v 20 % fonnamide. Filtre sa premývajú dvakrát 0,3 M chloridom sodným, 0,03 M citranom sodným a 0,1 % roztokom dodecylsulfátu sodného (SDS)pri37 ’C.

Sondou boli hybridizované dva fágy; fágy boli prečistené cez jednotlivé plaky. Vyčistené fágy sa hybridizovali nielen sondou segmentu A, ale aj sondou pripravenou zo segmentu B. cDNK inzerty zo dvoch hybridizovaných fágov, gama-LTl a gama-LT2, boli subklono vané do M13mp8 a sekvenované dideoxy-reťazovou terminačnou metódou [A. Smith: Methods in Enzymology 65, 560 až 580 (1980)]. Inzert gama-LT2 obsahoval len asi 600 párov nukleotidov a neobsahoval celú 3' kódujúcu oblasť lymfotoxinu. Inzert v gama-LTl obsahoval úplnú kódujúcu oblasť lymfotoxinu s leucínovou skupinou na amínovom konci, spolu so 650 pármi nukleotidov 3' netranslovanej oblasti (obsahujúcej súhlasný polyadenylačný signál) a kodóny pre 18 koncových aminokyselín na leucínovom konci. Pretože to nie je kódujúca oblasť celého lymfotoxinu, bola z cDNK inzertu LT1 pripravená ďalšia sonda označená ³²P a použitá na testovanie ďalších 25 000 rekombinantných fágov gama-gtlO pri vysokej selektivite (pozri T. Huynh a spol.: v Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press, Oxford, 1984). Bolo izolovaných ďalších 12 hybridizovaných fágov. Sekvencia najdlhšieho inzertu z gama-LTl 1 je uvedená na obrázku 2a. Najdlhšia otvorená čítacia oblasť bola translatovaná, a to začínajúc prvým pozorovaným ATG. Čísla nad riadkom označujú polohu aminokyseliny, čísla pod riadkom označujú polohu nukleotidu. Leucinový zvyšok, ktorý je označený 1, znamená prvý zvyšok sekvenovaný z lymfotoxinu s leucínovou skupinou na amínovom konci (obr. la) a tiež prvý· zvyšok z amínového konca maturovaných typov lymfotoxinu. Prvých 34 zvyškov reprezentuje signálnu sekvenciu. Zvyšky 156 až 171 nebolo možné určiť sekvenáciou lymfotoxinu, boli však odvodené od sekvencie nukleotidov.

Príklad 3

Konštrukcia expresného vektora hybridného syntetického génu (prírodná cDNK pre lymfotoxín s leucínovou skupinou na amínovom konci)

Táto konštrukcia je uvedená na obrázku 2b. Plazmid pLTXBl (obsahujúci neaktívny syntetický gén) sa čiastočne rozštiepi pôsobením EcoRI a Pstl. Izoluje sa fragment so 685 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje DNK kódujúcu 125 zvyškov na N-konci lymfotoxinu. Fragment bol ďalej čiastočne rozštiepený účinkom Pstl, pretože na zvyšku 10 (obrázok la) existuje ďalšie Pstl miesto. Fragment s 301 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje DNK kódujúcu 51 aminokyselín lymfotoxinu na C-konci, bol izolovaný po rozštiepení subklonovanej cDNK z fágu gama-LTl pôsobením EcoRI a Pstl (tieto miesta sú uvedené na obrázku 2a: polohy nukleotidov 554 a 855). Tieto fragmenty sa izolujú elektroforézou na 5 % polyakrylarnide a elektroelúciou. Tieto fragmenty boli ligované do plazmidu pBR322, ktorý sa rozštiepi pôsobením EcoRI a defosforyluje bakteriálnou alkalickou fosfatázou, čím sa zníži množstvo vedľajších transformantov. Výsledný expresný plazmid bol charakterizovaný, pokiaľ ide o príslušnú orientáciu a sekvenciu štiepením reštrikčnou endonukleázou a sekvenovaním DNK. Lymfotoxín s leucínovou skupinou na amínovom konci bol cxpresovaný transformáciou E. coli 31 446 plazmidom pLTtrpl a kultiváciou transformantov v prostredí, ktoré obsahovalo tetracyklín, počas 4 až 6 hodín pri teplote 37 ’C do dosiahnutia optickej hustoty 1,0. Bunkové lyzáty obsahovali cytotoxickú účinnosť. Zistilo sa, že amínový koniec s leucínovou skupinou expresovaných lymfotoxínov je substituovaný blokovaným metionŕnovým zvyškom. Predpokladá sa, že produktom tejto syntézy je skôr formyl-metionínový ako metionínový typ.

Príklad 4

Imunoafinitné vyčistenie lymfotoxínu

Myšie monoklonálne bunkové línie sekretujúce antilymfotoxín (príklad 8) boli vyčistené od kvapaliny asci- 5 tov chromatografiou na ionomeniči. Eluát z anexu bol spracovaný s Sepharozou aktivovanou brómkyanom v koncentrácii 2 mg/ml živice. Kolóna objemu 20 ml bola ekvilibrovaná postupne TBS (obsahujúcim 0,05 M Tris-HCL, pH 7,0, 0,15 M chloridu sodného a 2 mM kyseli- 10 ny etyléndiaminotetraoctovej), potom eluovaná pufrom (obsahujúcim 0,1 M kyseliny octovej, pH - 4,5, 150 mM chloridu sodného) a konečne TBS. Zrazenina, ktorá sa získa vyzrážaním (40 % nasýteným síranom amónnym) sonikovaného lyzátu E. coli transformovanej pLTtrpl 15 (vopred vyčereného odstreďovaním), sa suspenduje v 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4 a 5 mM kyseliny etyléndiaminotetraoctovej a naplní sa do kolóny rýchlosťou jeden objem kolóny za jednu hodinu. Nasleduje intenzívne premývanie TBS, ktorý obsahuje 0,05 % Tweenu 80. 20

Elúciou pufrom sa eluoval špecificky naviazaný materiál. Okamžite bolo upravené pH na hodnotu 7,8 pridaním 0,1 objemu 1 M Tris-HCl, pH 8,5 a roztok sa skladoval pri 4 °C. Špecifická aktivita takto vyčisteného lymfotoxínu bola 2 až 10 x 10⁷ jednotiek /mg (merané 25 uvedeným testom na myších bunkách L-929).

Eluát, ktorý obsahoval najväčšiu časť aktivity, bol nanesený na kolónu. Väčšina proteínu bola eluovaná ako jediný pás ako v redukujúcich, tak i v neredukujúcich podmienkach elektroforézou na SDS-polyakrylamido- 30 vom géli. Pohyblivosť tohto pásu zodpovedá molekulovej hmotnosti približne asi 18 000, čo je v súlade s predpovedanou hodnotou 18 664 pre neglykozylovaný lymfotoxín s leucínovou skupinou na amínovom konci podľa odvodenej aminokyselinovej sekvencie. Pre ďal- 35 šie charakterizovanie jeho biologickej účinnosti bol vyčistený rekombinantný lymfotoxín testovaný in vitro na cytolytickú účinnosť a in vivo na protinádorovú účinnosť.

Príklad 5

Biologická účinnosť rekombinantného lymfotoxínu in vivo

Tabuľka 1 - pokračovanie

Nekróza sarkómu Meth(a) in vivo pôsobením rekombinantného a prírodného lymfotoxínu
podávané:	počet myší s nekrózou sarkómu
	+++	++	+	-
lymfoblastoidný lymfotoxín 25 000 jednotiek lymfoblastoidný lymfotoxín	4	-	-	-
10 000 jednotiek	4	-	-	-
rekombinantný lymfotoxín 200 000 jednotiek rekombinantný	14	2	2	-
lymfotoxín 25 000 jednotiek	3			1
rekombinantný lymfotoxín 10 000 jednotiek	3		1
kontrolný pufer 2	-	-	-	9

Rekombinantný a lymfoblastoidný lymfotoxín bol 45 testovaný testom nekrózy nádoru in vivo. Sarkómy MethA (a) boli kultivované 7 až 10 dní v precitlivelých myšiach [BLAB/c x C57B1/6Í1 alebo CD6fl]. Priamo do nádorov bol potom injekčné podaný lymfotoxín z príkladu 4, lymfoblastoidný lymfotoxín (pripravený a vyčiste- 50 ný uvedenými spôsobmi) alebo kontrolná vzorka. Po 20 až 24 hodinách boli myši usmrtené, nádory odstránené a histologický zistený rozsah nekrózy. Ako je uvedené v tabuľke 1, rekombinantný aj lymfoblastoidný lymfotoxín spôsobval značnú nekrózu sarkómu MethA(a) in vivo. 55 Kontrolné vzorky nespôsobovali nekrózu sarkómov MethA(a).

Tabuľka 1

Nekróza sarkómu Meth(a) in vivo pôsobením rekombinantného a prírodného lymfotoxínu
podávané:	počet myší s nekrózou sarkómu
	-*-++	44-	4-	-
kontrolný pufer 1	-	-	-	3

Lymfoblastoidný lymfotoxín bol podávaný injekčné rozpustený v pufri 1 (0,001 M Tris-HCl, 0,05 M uhličitanu amónneho, pH 8, 0). Rekombinantný lymfotoxín bol podávaný injekčné rozpustený v pufri 2 (0,15 M chloridu sodného, 0,1 M octanu sodného a 0,1 M Tris-HCl s pH 7,8).

Zdá sa, že neprítomnosť cukru na rekombinantnom lymfotoxíne neovplyvňuje biologickú účinnosť, pretože špecifická účinnosť lymfotoxínu, produkovaného rekombinantnou kultúrou (2 až 10 x 10⁷ jednotiek na mg), je približne rovnaká ako u lymfoblastoidného lymfotoxínu (4 x 10⁷ j ednotiek na mg).

Účinnosť rekombinantného lymfotoxínu je termolabilná, podobne ako účinnosť prírodného lymfotoxínu, t. j. po zahriatí počas 1 hodiny na 80 °C dochádza k inaktivácii vodného roztoku.

Príklad 6 Konštrukcia expresného vektora pre lymfotoxín s metionínovu a histidínovou skupinou na amínovom konci

Konštrukcia plazmidu, ktorý riadi expresiu lymfotoxínu s metionínovou a histidínovou skupinou na amínovom konci v E. coli, je znázornená na obrázku 3. Syntetický oliginukleid bol vložený do expresného plazmidu tak, aby kódoval iniciačný metionínový kodón priľahlý k histidínovému kodónu lymfotoxínu s histidínovou skupinou na amínovom konci (zvyšok 24 na obrázku 2a). Ten sa získal izoláciou vektorového fragmentu s 4 630 pármi nukleotidov z plazmidu pLTtrpl štiepením Xbal a Clal, preparatívnou elektroforézou na 1 % agarózovom géli a elektroelúciou. BamHIClal fragment s 570 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje väčšinu sekvencie kódujúcej lymfotoxín, bol izolovaný tiež z plazmidu pLTtrpl rovnakým spôsobom. Uvedenými spôsobmi boli syntetizované dva syntetické oligonukleotidy a boli zmiešané s oligonukleotidmi 6, 7, 52 a 53 z obrázku la. Približne 50 pmolov každého oligonukleotidu bolo spracované s polynukleotidkinázou, tak ako je to opísané v príklade 1. Oligonukleotidy boli anelované a potom ligované so zmesou BamHIClal fragmentu s 570 pármi nukleotidov a Xbal-Clal

SK 278333 Β6 vektorového fragmentu s 4 630 pármi nukleotidov. Ligačná zmes bola transformovaná do E. coli ATCC 32 446. Rekombinanty sa vyberali na základe rezistencie na tetracyklín. Plazmid p20KLT bol izolovaný z jedného z transformantov. Plazmid p20KLT bol charakterizovaný reštrikčným enzýmom a sekvenčnou analýzou DNK.

Príklad 7

Príprava cytotoxického lymfotoxínového napojeného variantu

Plazmid, ktorý obsahuje DNK kódujúcu napojenie lymfotoxinu na bakteriálny proteín, bol skonštruovaný klonovaním sekvencie, ktorá kóduje priľahlú bakteriálnu signálnu sekvenciu k štruktúrnemu génu lymfotoxínu. Bola charakterizovaná sekvencia génu teplotné stabilného enterotoxínu H (ST H) z E. coli [R. N. Picken a spol.: Infection and Immunity 42, 269 až 275 (1983)]. Sekvencia kóduje signálnu sekvenciu s 23 aminokyselinami, ktorá riadi sekréciu STII do periplazmového priestoru E. coli.

Plazmid pWM501 [Picken a spol.: Infection and Immunity 42 (1), 269 až 275 (1983)] obsahuje gén teplotné stabilného enterotoxínu (STU). Časť DNK, ktorá kóduje gén STU, bola izolovaná z plazmidu pWM501 nasledujúcim postupom:

Plazmid pWM501 sa rozštiepi pôsobením Rsal. Izoluje sa fragment DNK s 550 pármi nukleotidov. Tento fragment sa liguje s fágom Ml 3mp8 [J. Messing a spol.: Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNK, ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam, str. 143 až 153 (1981)], ktorý bol predtým rozštiepený pôsobením Smal. Ligovaná DNK sa použije na transformáciu E. coli JM101, komerčne dostupného kmeňa na použitie s fágom Ml 3. Izolujú sa jasné plaky. Z E. coli JM101, infektovanej týmto fágom, sa štandardnými postupmi [J. Messing a spol.: pozri citácie] izoluje dvoj vláknový M13mp8 STU Rsa derivát. Použitím práve opísaného subklonovania M13mp8 sa teraz pomocou miest rôznych reštrikčných endonukleáz naviaže fragment s asi 550 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje signálny gén STII. Derivát M13mp8 STU Rsa sa potom rozštiepi pôsobením EcoRI a Pstl. Izoluje sa tak DNK fragment nepatrne väčší ako 550 párov nukleotidov.

Fragment EcoRI-PstI bol subklonovaný do plazmidu pBR322. Bolo to vykonané takým spôsobom, že plazmid pBR322 bol rozštiepený pôsobením EcoRI a Pstl. Izoluje sa vektor. Tento izolovaný vektor bol ligovaný s EcoRI-Pstl fragmentom DNK. Táto zmes s DNK sa použije na transformáciu E. coli ATCC 31 446. Vyberú sa kolónie, ktoré sú rezistentné na tetracyklín. Plazmid bol izolovaný z rezistentnej kolónie E. coli a označený ako čiastočný pSTU.

Čiastočný pSTU sa rozštiepi účinkom Mnll a BamHI. Boli izolované: fragment so 180 pármi nukleotidov obsahujúci STU Shine-Dalgamo sekvenciu, signálnu sekvenciu STU a prvých 30 kodónov maturovaného génu STU. Fragment so 180 pármi nukleotidov sa liguje s plazmidom, ktorý obsahuje trp promótor. Jeden takýto plazmid, plazmid pHGH207-l, bol už opísaný v literatúre [H. de Boer a spol.: Promotores: Structure and Function, ed. R. Rodriguez a spol.: Chamberlin, PraegerPub., NewYork, NY, str. 462 až 481 (1982)]. V tomto prípade bol použitý derivát tohto plazmidu, plazmid pHGH207-l+, v ktorom EcoRI miesto 5' k trp promó- toru bolo prevedené na EcoRI+ doplnením DNK polymerázou I (DNK poli) a pripojením zarovnaných koncov ligáciou [S. Cabilly a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81, 3 273 až 3 277 (1984)]. Plazmid, ktorý obsahuje trp promótor, bol rozštiepený pôsobením Xbal, spracovaný s DNK poli a štyri dNTP doplnili prečnievajúcu sekvenciu. DNK preparát bol rozštiepený pôsobením BamHI. Izoluje sa fragment, ktorý obsahuje vektor. Tento vektorový fragment sa potom liguje s vyššie izolovaným DNK fragmentom, ktorý obsahuje signál STU so 180 pármi nukleotidov. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli ATCC 31 446 na ampicilínovú rezistenciu. Plazmid, ktorý je označený ako signál STU (STH-leader), sa izoluje z kolónie rezistentnej na ampicilín.

Fág M13, ktorý obsahuje sekvencie kódujúce STU, sa skonštruuje najprv ligáciou fragmentu Xbal-BamHI so 180 pármi nukleotidov zo signálu pSTU do M13mpl0 rozštiepeného pôsobením Xbal a BamHI. Výsledná fágova DNK, pSIII pre viac hostiteľov, bola charakterizovaná analýzou reštrikčnými endonukleázami a sekvenovaním nukleotidov. LT kódujúce sekvencie boli potom zavedené do tohto vektora ligáciou fragmentu Hpal-EcoRI so 700 pármi nukleotidov z pLTtrpl s replikatívnou formou (RF, dvoj vláknová) DNK pSTU pre viac hostiteľov štiepené Smal-EcoRI. Obidve miesta Smal aj Hpal majú zarovnané konce a sú spolu ligované (z toho vyplýva strata obidvoch miest). Výsledná fágová DNK, M13-STH-LT, sa charakterizuje a potom sa použije na mutagenézu nasledujúcim spôsobom:

primer 5'p CAAAIUCCTATCXľACTUCCAGCiCGTAGG sa spracuje kinázou, za prítomnosti ligázového pufra sa zmieša s templátom (M13-STH-LT) a M13mpl0 RF DNK rozštiepenou pôsobením Xbal-EcoRI [pre podporu priméru ako opisuje J. P. Adelman a spol.: DNK 2, 183 až 193 (1983)]; zmes sa zahreje na 95 °C, nechá sa 30 minút anelovať pri izbovej teplote, potom sa umiestni 30 minút na ľad. Následne sa pridajú všetky štyri deoxynukleotid-trifosfáty spolu s ΑΤΡ, T4 DNK ligázou a veľkým fragmentom (Klenowov fragment) E. coli DNK polymerázy I. Zmes sa inkubuje jednu hodinu pri teplote 14 °C. Potom sa použije na transfekciu kompetetivnej E. coli JM101, komerčne dostupného kmeňa, alebo iného hostiteľa fágu Ml 3. Správne hybridizovaný fág bol identifikovaný hybridizačným testovaním, použitím priméru označeného ³²P ako sondy. Výsledný fág ST-LT-mut bol charakterizovaný sekvenčnou analýzou DNK. Z tohto fágu sa pripraví replikatívna forma DNK, ktorá sa použije na izoláciu DNK obsahujúcej fragment Xbal-EcoRI so 761 pármi nukleotidov pre signálnu sekvenciu STO priľahlú ku kódujúcej sekvencii lymfotoxinu s leucinovou skupinou na amínovom konci. Táto DNK sa liguje s p20KLT rozštiepeným pôsobením Xbal a BamHI (veľký vektorový fragment so 4 285 pármi nukleotidov) a fragmentom plazmidu pBR322 rozštiepeným pôsobením EcoRI a BamHI (s 375 pármi nukleotidov). Výsledný plazmid pST18LT bol charakterizovaný reštrikčným zmapovaním a sekvenáciou DNK. Podobná konštrukcia sa pripraví takým spôsobom, že sa zakóduje napojenie STU signálu na amínovom konci na histidinový zvyšok lymfotoxinu s histidínovou skupinou na amínovom konci. Výsledné plazmidy sa transformujú do E. coli ATCC 31 446. Izolujú sa plazmidy pSTLT18 a pSTLTló. Analýzou reštrikčnými enzýmami a dideoxy-sekvenáciou sa potvrdilo, že kódujú napojenia STU.

SK 278333 Β6

E. coli transformovaná plazmidom pSTLT18 alebo pSTLTló syntetizuje napojenie signálnej sekvencie STII a lymfotoxínu s leucínovou skupinou na amínovom konci a s histidínovou skupinou na amínovom konci, čo súhlasí s vypočítanou molekulovou hmotnosťou (podľa gélovej elektroforézy). E. coli lyzáty, ktoré obsahujú toto napojenie peptidov, vykazujú cytotoxickú aktivitu.

Príklad 8

Spôsob prípravy monoklonálnej myšej protilátky schopnej neutralizovať lymfotoxín

Vyčistený lymfoblastoidný lymfotoxín, ktorý sa získa podľa príkladu 1, sa dialyzuje v soľnom roztoku fosfátového pufra (PBS). Dialyzát obsahoval 200 pg lymfotoxínu na ml. K dialyzátu sa pridá toľko glutaraldehydu, aby bola jeho koncentrácia 70 mM. Zmes sa inkubuje 2 hodiny pri izbovej teplote, pridá sa ďalší glutaraldehyd do koncentrácie 140 mM a v inkubácii sa pokračuje ďalších 6 hodín. Zmes sa potom dialyzuje v PBS. Zmes 50 pg lymfotoxínu skrížené naviazaného na glutaraldehyd (tu nazývaný polylymfotoxín) a 0,5 ml Freundovho úplného adjuvantu sa podá myšiam injekčné (kmeň BALB/c). Po 1 týždni boli myši imunizované druhou injekciou obsahujúcou 50 pg polylymfotoxínu a 0,5 ml Freundovho neúplného adjuvantu, prvá polovica bola podaná intramuskuláme, druhá polovica do peritoneálnej dutiny. Po siedmich dňoch bolo izolované sérum. Sérum sa testuje na antilymfotoxínovú účinnosť testom ELISA. Test ELISA sa vykoná nasledujúcim spôsobom:

Pufrovaný roztok vyčisteného lymfotoxínu sa umiestni do mikrotitračných jamiek. Každá jamka sa pokryje asi 100 ng lymfotoxínu. Roztok, ktorý sa neadsorbuje do jamiek sa odoberie. Príslušne zriedený testovaný roztok (50 pl) sa spojí so 100 pl PBS, ktorý obsahuje 5 mg/ml hovädzieho sérumalbumínu (PBS-BSA pufer), zmes sa pridá do každej jamky, inkubuje sa dve hodiny pri izbovej teplote, premyje sa PbS obsahujúcim 0,05 % Tweenu 20, do každej jamky sa pridá 100 pl chrenovou peroxidázou označeného kozieho antimyšieho IgG v PBS- -BSA pufri a inkubuje sa jednu hodinu. Každá jamka sa premyje PBS, ktorý obsahuje 0,05 % Tweenu 20, potom sa do každej jamky pridá citráto-fosforečnanový pufer (pH 5) obsahujúci 0,1 mg o-fenyléndiamínu na ml (substrátový roztok) a vodný 30 % peroxid vodíka [v dávke 4 pl 30 % peroxidu vodíka (objemové diely) na 10 ml substrátového roztoku]. Jamky sa inkubujú tridsať minút. Reakcia sa zastaví pridaním 50 pl 2,5 M kyseliny sírovej. Zmeria sa absorbancia pri 492 nm. Jamky, ktoré vykazujú absorbanciu väčšiu ako 1 (optická hustota) boli považované za účinné voči lymfotoxínu.

Testované vzorky sa testovali aj na schopnosť neutralizovať cytolytickú aktivitu lymfotoxínu v teste na myšiach L 929. Sérum, ktoré sa získa z imunizovaných zvierat alebo z hybridómových supematantov, sa zriedi (podľa potreby) médiom RPMI-1640, ktoré obsahovalo 10 % fetálneho (plodového) hovädzieho séra a asi 100 lymfotoxínových jednotiek na mililiter a aplikuje sa do mikrotitračných jamiek, ktoré obsahujú kultivované bunky L929 tak, ako to je zvyčajné v cytolytických testoch. V kontrolných vzorkách boli všetky bunky lýzované. Neutralizujúca protilátka sa dokázala tým, že nenastala lýza buniek L929 účinkom lymfotoxínu.

U zvierat, ktoré boli imunizované lymfotoxínom spolymerizovaným s glutaraldehydom, nastalo zvýšenie protilátok, ktoré boli aktívne v teste ELISA. Nezistilo sa však žiadne sérum, ktoré by malo neutralizujúcu účinnosť.

Na imunizáciu rovnakých myší bola použitá suspenzia, ktorá obsahuje 100 pg lymfotoxínu a 1 ml 1,64 % (hmotnostné diely : objemovým dielom) suspenzie hydroxidu hlinitého. Myšiam bolo injekčné podaných 100 pl suspenzie intramuskuláme a 400 pl suspenzie intraperitoneálne. Po jednom týždni bolo myšiam intravenóznou injekciou podané 10 pg nespolymerizovaného a neadsorbovaného lymfoblastoidného lymfotoxínu v 100 pl pufra PBS. Testovaním zvieracieho séra (so zriedením 1/80) bola o tri dni neskôr preukázaná prítomnosť protilátky neutralizujúcej lymfotoxín. Týmto zvieratám boli odobrané sleziny. 3 x 10⁷ buniek sleziny sa spojí s 5 x 10' bunkami myšieho myelómu a aplikujú sa do mikrotitračných jamiek, ktoré obsahujú médium HAT a asi 3 000 peritoneálnych makrofágov na mikrotitračnú jamku, podľa postupu opísaného S. Fazekasom a De St. Grothom: J. Immunol. Methods. 35, 1 až 21 (1980). Hybridómy zo supematantov jamiek, ktoré boli pozitívne v uvedenom teste ELISA, boli kultivované v 1 ml média DMEM s 20 % fetálnym teľacím sérom, 10 % médiom ΝΟΤΟΙ 35, 3 x 10'³ M β-merkaptoetanolom a HAT, rozdelené do mikrotitračných jamiek, podľa štatistického priemeru jedna bunka na jamku, a kultivované v jednom alebo v piatich mililitroch rovnakého média. Supematanty sa po kultivácii testujú na neutralizujúcu protilátku. Neutralizujúca protilátka bola syntetizovaná asi 2 % (štatisticky) hybridómami (pozitívnymi v teste ELISA) z imunizácie hydroxidom hlinitým. Z tejto skupiny hybridómov sa prípadne vyberie protilátka s vysokou afinitou na lymfotoxín.

Príklad 9

Miestne špecifická mutagenéza lymfotoxínu

V tomto príklade sa postupuje presne podľa spôsobu z príkladu 3, s tým rozdielom, že segment 6 syntetického oligonukleotidu bol modifikovaný tak, že obsahuje sekvenciu 5' CTCAACTCTGCACCCA 3' a jeho doplnkové vlákno (segment 53) bolo modifikované na sekvenciu 3' AGACGTGGGTCGTCGT 5'. Modifikované oligonukleotidy sa anelujú so zvyškovými oligonukleotidmi a potom sa ligujú do expresného vektora spôsobom opísaným v príklade 6. Tento vektor obsahuje substitúcie 2 párov nukleotidov, ktoré zmenili lyzín + 28 v kodóne na histidín. Po transformácii E. coli 31 446 dôjde k expresii histidínového mutantu.

Iné miestne riadené mutanty sa pripravujú rovnakým spôsobom, kodóny sa vyberú tak, aby sa nezaviedlo EcoRI reštrikčné miesto, ktoré by vyžadovalo pre štiepenie pLTXBl v príklade 3 čiastočné rozštiepenie pôsobením EcoRI. Mutáciou by sa tiež nemali zavádzať ďalšie Xbal alebo BamHI miesta do fragmentu A (pozri obrázok lb), BamHI alebo HindUI miesta do fragmentu B alebo Hind ΠΙ či BglĽ miesta do fragmentu C. Na náležité zostavenie mutantu pLTXBl sú potrebné iné Čiastočné štiepenia: štiepením sa získajú skôr delečné mutanty (mutanty s deléciami) ako substitučné mutanty (t. j. mutanty so substitúciami), ktoré sú v tomto prípade cieľom.

SK 278333 Β6

Príklad 10

Identifikácia genómovej DNK kódujúcej myší a hovädzí lymfotoxín. Sekvencie aminokyselín myšieho a hovädzieho lymfotoxínu.

Gény myšieho a hovädzieho lymfotoxínu boli izolované z genómových buniek gama. Fragment cDNK ľudského lymfotoxínu (PvuH-EcoRI so 600 pármi nukleotidov) sa označí ³²P zárezovou transláciou a použije sa ako sonda na hľadanie v banke myšej genómovej DNK [kmeň M 600 myšej genómovej DNK gama-Charon4A, T. Maniatis a spol.: Molecular Cloning 31 (1982)] a nezávisle v banke hovädzích genómových DNK (európsky patent 88 622A). Hybridizácia sa vykoná za nízkej selektivity v 20 % formamide [Gray a Goeddel: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 5 842 až 5 846 (1983)]. Filtre boli premyté dvakrát vodným roztokom 0,03 M chloridom sodným, 0,03 M citranom sodným a 0,1 % SDS. Cez jednotlivé plaky bolo vyčistených niekoľko fágov hybridizovaných sondou ľudského lymfotoxínu [T. Maniatis a spol.: Celí 15, 687 až 701 (1978)]. Bola pripravená fágová DNK [T. Maniatis a spol.: Celí 15, 687 až 701 (1978)], ktorá bola štiepená reštrikčnými endonukleázami a analyzovaná Southemovou hybridizáciou. EcoRI fragment myšej DNK s 3 500 pármi nukleotidov a EcoRI fragment hovädzej DNK s 2 200 pármi nukleotidov boli hybridizované sondou ľudského lymfotoxínu. Tieto fragmenty DNK sa klonujú do plazmidu pBR322 a potom sa sekvenujú podľa A. J. H. Smithe: Methods in Enzymology 65, 560 až 580 (1980). Na obrázku 4 je uvedená odvodená proteínová sekvencia myšieho a hovädzieho lymfotoxínu; na porovnanie je uvedená aj sekvencia ľudského lymfotoxínu.

Príklad 11

Expresia lymfotoxínu v kvasinkách za regulácie ADH promótorom

Plazmid pLTtrpl sa rozštiepi pôsobením Xbal. Plazmid sa tým otvorí v mieste Xbal, ktoré sa nachádza práve vedľa iniciačného kodónu lymfotoxínu. Kohezívny koniec Xbal sa zarovná Klenowovým fragmentom E. coli DNK polymerázy I so štyrmi dNTP. K zarovnanému fragmentu plazmidu sa liguje EcoRI adaptér

DH

5’ ^AATTCCCGDG 3' |-GGOCCC-P 5'

3' OH a prečnievajúci 5' hydroxylový koniec sa fosforyluje polynukleotid-kinázou. Ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli ATCC 31 446 a plazmidu pLTtrplRl, ktorý podľa reštrikčnej analýzy obsahuje ďalšie EcoRI miesto vedľa začiatočného (iniciačného) kodónu lymfotoxínu. Izoluje sa plazmid pLTtrplRl, ten sa rozštiepi pôsobením EcoRI a izoluje sa fragment SP, ktorý obsahuje DNK lymfotoxínu.

Plazmid pFRPn (európsky patent 60 057A) sa rozštiepi pôsobením EcoRI, pre zabránenie recirkulácie sa spracuje s alkalickou fosfatázou, liguje sa na fragment SP lymfotoxínu (použitím T4 DNK ligázy) a ligačná zmes sa použije na transformáciu E. coli ATCC 31 446. Kolónie, ktoré sú rezistentné na ampicilin, poskytli 2 série plazmidov s SP inzertnú opačných orientácií, ako ukazuje reštrikčná analýza elektroforézou na agarózových géloch. Plazmidy sa vyčistia od E. coli transformantov a použijú sa na transformáciu kvasiniek s trp 1 mutáciou (napríklad kvasinkový kmeň RH218) (tento kmeň je voľne uložený v ATCC č. 44 076) na fenotyp trp⁺. Zistilo sa, že plazmidy orientované tak, že iniciačný kodón segmentu SP umiestnený vedľa fragmentu promótora alkohol-dehydrogenázy, transformujú kvasinky tak, že dochádza k expresii lymfotoxínu. Lymfotoxín sa izoluje z extraktov kvasinkových transformantov. Stabilitu plazmidu pri fermentácii vo veľkom meradle je možné zlepšiť tým, že sa použije expresný plazmid, ktorý obsahuje dvojmikrónový začiatok replikácie miesto pFRPn chromozomálneho začiatku replikácie (ars 1) a zlúčiteľný hostiteľský’ kmeň [J. Beggs: Náture 275,104 až 109 (1978)].

Príklad 12

Expresia lymfotoxínu v bunkách cicavcov

Fág gama-LTll (príklad 2) sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Izoluje sa fragment DNK (reverzný transkript), ktorý obsahuje lymfotoxín. Plazmid pEHER (európsky patent 117 060A) sa rozštiepi pôsobením EcoRI, pôsobí sa na neho teľacou črevnou alkalickou fosfatázou a liguje sa reverzným transkriptom (s EcoRIjfágu gama-LTll. Výsledné plazmidy, ktoré boli ^'kultivované v E. coli ATCC 31 446 (európsky patent 117 060A) sa označia pEHERLT I a PEHERLT Π. Obsahujú DNK lymfotoxínu s opačnou orientáciou, ako ukazuje reštrikčná analýza na polyakrylamidových géloch. Tieto plazmidy sa použijú na transfekciu a selekciu buniek CHO DHFR-DUX-B11, CHO1 a Ltk'.

Bunky tkanivovej kultúry sa transfektujú zmiešaním 1 μg plazmidu pEHERLT I alebo pEHERLT H vyššie pripravených s 10 pg krysej DNK v objeme 250 μΐ, 0,25 M CaCl-2, prikvapká sa 250 μΐ pufrovaného soľného roztoku HEPES (280 nM chloridu sodného,

1,5 mM hydrogénfosforečnanu sodného, 50 ml HEPES, pH 7,1). Po tridsiatich minútach pri izbovej teplote sa tento roztok pridá k bunkám tkanivovej kultúry, ktoré rastú v 60 mm plastických miskách pre tkanivové kultúry. Používajú sa bunky CHO 1, CHO DHFR-DUX-B11 a Ltk'. Misky obsahujú 3 ml kultivačného média zodpovedajúceho hostiteľskej bunke. Pre bunky CHO1 a CHO DHFR-DUX-B11 sa ako médium používa Ham F-12 (Gibco) médium doplnené 10 percentami teľacieho séra, 100 μΐ penicilínu na mililiter, 100 pg/ml streptomycínu a 2 nM L-glutamínu. Pre bunkové línie Ltk' sa používa Dubelccom modifikované Eaglovo médium (DMEM) doplnené rovnakým spôsobom ako je uvedené vyššie. Po 3 až 16 hodinách sa médium odstráni. Bunky sa premyjú 20 % glycerolom v soľnom roztoku fosfátového pufra. Na každú doštičku sa pridá médium a bunky sa inkubujú ďalšie dva dni.

Výber (selekcia) transfektovaných buniek sa vykoná trypsináciou buniek po dvojdennej kultivácii (čo obsahuje spracovanie buniek s 0,5 mg/ml sterilného trypsínu, ktorý obsahuje 0,2 mg/ml kyseliny etyléndiaminotetraoctovej) a pridaní asi 3 x 10⁵ buniek k 10 mm doštičkám tkanivovej kultúry so selektívnym médiom. Pre bunky dhfr' sa pripraví médium (F-12 GIBCO) bez glycinu, hypoxantínu a tymidínu (GHT médium). Pre hostiteľské bunky DHFR⁺ sa pridáva k nor

SK 278333 Β6 málnemu kultivačnému médiu metotrexát (100 až 1 000 nM). Kontrolné pokusy sa vykonávajú v podmienkach transfekcie bez plazmidu a s plazmidom pFD-11 (európsky patent 117 060A) obsahujúcim normálny DHFR. Kolónie, ktoré vzniknú z buniek a ktoré expresiou poskytujú DHFR plazmid, sú zrejmé počas jedného až dvoch týždňov. Identifikujú sa transfoimanty, ktoré expresiou poskytujú maturovaný lymfotoxín.

Claims

1. Nukleová kyselina, kódujúca lymfotoxín, vybraná zo skupiny obsahujúcej (a) DNK kódujúcu lymfotoxín, ktorý je bez prenesených intervenujúcich sekvencii, (b) DNK kódujúcu lymfotoxín, ktorý je bez DNK kódujúcej iné proteíny organizmu, z ktorého DNK pochádza a (c) nukleovú kyselinu schopnú hybridizovať na nukleovú kyselinu kódujúcu lymfotoxín tak, že hybridizujúca nukleová kyselina je bez nukleotidovej sekvencie prírodnej DNK alebo RNK kódujúcej lymfotoxín.

2. Nukleová kyselina podľa nároku 1, kódujúca ľudský lymfotoxín.

3. Nukleová kyselina podľa nároku 2, v ktorej DNK je bez intrónu prítomného medzi nukleotidmi 284 a 295.

4. Nukleová kyselina podľa nároku 3, ktorou je cDNK.

5. Nukleová kyselina podľa nároku 1, ktorá je kovalentne značená detegovateľnou látkou.

6. Nukleová kyselina podľa nároku 1, ktorá kóduje variantný lymfotoxín.

7. Replikovateľný vektor, obsahujúci DNK podľa nároku 1.

8. Vektor podľa nároku 7, replikovateľný v prokaryotoch.

9. Vektor podľa nároku 7, replikovateľný v eukatyotoch.

10. Vektor podľa nároku 8, obsahujúci ďalej bakteriálny promótor, ktorý je odštiepiteľne napojený na nukleovú kyselinu kódujúcu lymfotoxín.

11. Vektor podľa nároku 8, v ktorom DNK kóduje napojenie bakteriálneho sekrečného signálu a lymfotoxínu.

12. Plazmid pLTtrpl.

13. Plazmid p20KLT.

14. Heterológna bunka transformovaná nukleovou kyselinou podľa nároku 1.

15. Bunka transformovaná vektorom podľa nároku 7.

16. Bunka podľa nároku 15, ktorou je prokaryot.

17. Spôsob kultivácie bunky podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že sa lymfotoxín nechá hromadiť v kultúre, z ktorej sa potom izoluje.

18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m , že sa kultivuje kvasinková bunka alebo cicavčia neľudská bunka, pričom nukleová kyselina kóduje ľudský prelymfotoxín, a z kultúry sa izoluje lymfotoxín, ktorý'je prípadne rôznym spôsobom glykozylovaný.

19. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako bunka kultivuje prokaryot.

20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačuj úci sa t ý m , že lymfotoxínom je variantný lymfotoxín.

21. Produkt spôsobu podľa nároku 18.

22. Rekombinantná bunková kultúra obsahujúca lymfotoxín s leucínom na amínovom konci.

23. Lymfotoxín úplne bez homológnych proteínov, ktoré sú neidentifikované alebo prítomné v neznámych množstvách.

24. Lymfotoxín podľa nároku 23, ktorý má špecifickú účinnosť od 2 do 10 x 10⁷ jednotiek na mg proteínu.

25. Lymfotoxín podľa nároku 23 vo forme prelymfotoxinu.

26. Ľudský lymfotoxín úplne bez homológnych proteínov, ktorú sú neidentifikované alebo prítomné v neznámych množstvách, a ktorý nie je glykozylovaný.

27. Variantný lymfotoxín, v ktorom aminokyselinový zvyšok v sekvencii lymfotoxínu podľa obrázku 2a je (a) vynechaný, (b) substituovaný iným zvyškom alebo (c) je do sekvencie vložený iný zvyšok podľa obrázku 2a, len za predpokladu, že z takého variantného lymfotoxínu je vylúčený lymfotoxín, ktorý' má sekvenciu podľa obrázku 2a s amínovými koncami na Leu + 1 alebo His +23.

28. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, ktorým je ľudská alela so sekvenciou podľa obrázku 2a.

29. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, ktorým je zvierací lymfotoxín.

30. Variantný lymfotoxín podľa nároku 29, v ktorom zvieracím lymfotoxínom, je lymfotoxín dobytka.

31. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, v ktorom zvyšky - 34 až - 1 sú vynechané, obsahujúci ďalej aspoň jeden vsunutý aminokyselinový zvyšok.

32. Variantný lymfotoxín podľa nároku 31, v ktorom vložený aminokyselinový zvyšok znamená spojenie polypeptidu s karboxylovým koncom lymfotoxínu.

33. Variantný lymfotoxín podľa nároku 32, v ktorom polypeptid je spojený s lymfotoxínom cez miesto hydrolýzy proteolytickým enzýmom.

34. Variantný lymfotoxín podľa nároku 33, v ktorom toto miesto obsahuje lys-lys alebo lys-arg.

35. Variantný lymfotoxín podľa nároku 33, v ktorom variantný lymfotoxín je pred proteolytickou hydrolýzou cytolyticky neaktívny.

36. Variantný lymfotoxín podľa nároku 31, v ktorom hydrofóbny di- alebo tri-peptid je napojený na leu + 17L

37. Variantný lymfotoxín podľa nároku 31, v ktorom ala-lys je vložený medzi glu + 127 a pro + 128.

38. Variantný lymfotoxín podľa nároku 31, v ktorom hydrofóbny aminokyselinový zvyšok je vložený medzi thr +163 a val +160.

39. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, v ktorom aspoň jeden aminokyselinový zvyšok lymfotoxínovej sekvencie podľa obrázku 2a je substituovaný iným zvyškom.

40. Variantný lymfotoxín podľa nároku 39, v ktorom zvyšky - 34 až -1 podľa obrázku 2a sú substituované metionínom alebo formylmetionínom.

41. Variantný lymfotoxín podľa nároku 39, v ktorom zvyšky - 34 až + 22 sú substituované metionínom alebo formylmetionínom.

42. Variantný lymfotoxín podľa nároku 39, v ktorom zvyšky - 34 až - 1 sú vynechané a (a) lyzín + 89 je substituovaný histidínom, (b) alanin + 163 je substituovaný valínom, izoleucínom alebo leucínom, (c) treonín + 163 je substituovaný tyrozínom, (d) serín + 82 je substituovaný lyzínom, (e) serín + 42 je substituovaný izoleucínom, leucinom, fenylalanínom, valínom alebo histidínom, (f) lyzín + 84 je substituovaný glutamínom, trypto18

SK 278333 Β6 fánom, sennom alebo histidínom, (g) treonín + 163 je substituovaný asparagínom alebo lyzínom, (h) serín + 70 je substituovaný lyzínom alebo glycínom, (i) treonín+ 69 je substituovaný tyrozínom, (j) lyzín + 28 je substituovaný arginínom alebo histidínom, (k) histidín + 32 je substituovaný arginínom alebo lyzínom, (l) asparagín + 36 je substituovaný prolínom, serínom, treonínom, tyrozínom alebo glutamínom, (m) serín + 38 je substituovaný tyrozínom, metionínom alebo glutamínom, (n) serín + 61 je substituovaný treonínom, tyrozínom, histidínom alebo lyzínom, (o) glycín + 124 je substituovaný asparagínom, serínom, alebo tyrozínom, (p) histidín + 135 je substituovaný arginínom, lyzínom, tyrozínom, tryptofánom alebo prolínom.

(q) treonín + 142 je substituovaný asparagínom, alebo (r) glutamín + 146 je substituovaný lyzínom alebo treonínom.

43. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, ktorý je hybridným zvieracím a ľudským lymfotoxínom.

44. Variantný lymfotoxín podľa nároku 43, v ktorom metionínové zvyšky + 20, + 120 a + 133 sú substituované jednotlivo treonínovým, serínovým a valínovým zvyškom.

45. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, obsahujúci fragment nádorového nekrózového faktora.

46. Variantný lymfotoxín podľa nároku 45, v ktorom prvý z aminokoncových zvyškov 27, 26 alebo 25 leucínového aminokoncového lymfotoxínu je substituovaný polypeptidom vybraným zo skupiny val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp, val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser alebo val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro.

47. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, obsahujúci jeden substituovaný aminokyselinový zvyšok.

48. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, v ktorom z celkového počtu až 30 aminokyselinových zvyškov je jeden odstránený.

49. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, obsahujúci jeden vložený amínový zvyšok.

50. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, v ktorom je substituovaných, odstránených alebo vložených až 30 zvyškov leucínu + 1.

51. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, obsahujúci vopred stanovenú substitúciu aminokyselinového zvyšku až 25 zvyškov aminokyseliny zakončenej karboxylom.

52. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, v ktorom substitúcia znamená substitúciu zvyšku z tried neutrálnych, kyslých alebo zásaditých aminokyselinových zvyškov zvyškom, ktorý nepatrí do triedy, do ktorej patri substituovaná aminokyselina.

53. Variantný lymfotoxín podľa nároku 27, ktorý je cytotoxický.

54. Ľudský lymfotoxín, ktorý je úplne bez homológnych neidentifikovaných proteinov prítomných v neznámych množstvách a ktorého cytolytickú účinnosť neutralizuje protilátka bez ďalších neutralizujúcich protilátok.

55. Protilátka podľa nároku 54 označená detegovateľnou látkou.

56. Protilátka podľa nároku 54, ktorá j e imobilizovaná.

57. Spôsob izolácie ľudského lymfotoxínu zo zmesi podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že zmes sa uvedie do styku s protilátkou, pričom sa na ňu adsorbuje lymfotoxín, protilátka s adsorobovaným lymfotoxínom sa oddelí od zmesi a lymfotoxín sa oddelí od protilátky.

58. Protilátka podľa nároku 54, ktorá je monoklonálna.

59. Protilátka podľa nároku 54, v ktorej lymfotoxínom je polypeptid s cytotoxickou aktivitou nádoru in vitro s oblasťou, ktorá znamená funkčnú homológiu s aminokyselinovou sekvenciou lymfotoxínu alebo s jej fragmentom.

60. Protilátka podľa nároku 55, v ktorej detegovateľnou látkou je fluorescenčná, chemiluminiscenčná alebo rádioizotopická značená látka.

61. Protilátka podľa nároku 56, ktorá je imobilizovaná adsorpciou alebo kovalcntnou väzbou na povrchu alebo na matrici.