HU204085B - Process for producing lymphotoxin and monoclonal intilymphotoxin antibody - Google Patents

Description

A találmány limfokinekre, közelebbről, límfotoxinra és származékaira vonatkozik.

A limfotoxint először olyan biológiai faktorként azonosították, amely anticelluláris hatást gyakorol a neoplasztikus sejtvonalakra. Alimfotoxinnak tulajdonított és mitogén-stimulált limfociták segítségével kapott hatás különféle citosztatikus hatásokkal van kapcsolatban, amelyek egy széles spektrumon belül bizonyos tumor sejtvonalak citosztázisától más transzformáit sejtek citolíziséig terjednek. A Iimfotoxin azonban alig vagy egyáltalán nem mutat anticelluláris hatást primer sejtkultúrákban és normál sejtvonalakon végzett kísérletekben. Alimfotoxinnak ez a feltételezett diszkrimináns anticelluláris tula jdonsága olyan in vivő kísérletekhez vezetett, melyek arra utalnak, hogy a Iimfotoxin jelentős tumor-ellenes hatással rendelkezik,

A Iimfotoxin kifejezést egy egész vegyületcsalád összefoglaló neveként használjuk. A Iimfotoxin molekulák molekulatömegük szerint öt osztályba sorolható glükoproteinek, ahol az egyes osztályok töltés szempontjából heterogének. A legtöbb Iimfocita felűlúszóban a humán alfa (m.t.: 70 000 - 90000) és béta (m.t.: 25 000 - 50 000) osztályok dominálnak. Az alfa osztály töltés alapján legalább hét alosztályba osztható, míg a béta osztályon belül két alosztály különíthető' el [Gr. Granger és mtsai.: Cellular Responses to MolecuIar Modulátora, Mózes és mtsai. kiadó, 1981, 287310]. Komplex (m.t.: 200 000) és gamma (m.:10 000 20 000) Iimfotoxin formákat ugyancsak azonosítottak. A különböző Iimfotoxin formák és osztályok stabilitásukban és sejttenyészetekben való megjelenésűk kinetikájában különböznek egymástól. Kis ionerősségű térben a komplex osztállyal együtt aggregálódhatnak. A limfotoxinok kis molekulatömegű osztályai a megjelent közlemények szerint viszonylag instabilak, és a nagy molekulatömegű osztályokhoz képest csak gyengén oldódnak a sejtekben [Híserodt és mtsai., Cell. Immun. 26:211, 1976; Granger és mtsai., Biochemical Characterizatíon of lymphokines, De Weck · és mtsai. kiadó, 1980,279-283]. Agámmá osztály aktivitását, instabilitása miatt, nem tanulmányozták behatóbban [G. Granger és mtsai., Cellular Immunology 38:388-402,1978]. A béta osztályt ugyancsak instabilnak találták [Walker és mtsai., J. of Immun. 116 [3]: ² 807-815,1976].

Meg kell említeni, hogy a limfokinek terminológiája nem egységes. Jelenleg egy sejtkultúrában kapott tennék elnevezése nagyrészt a feltehetően a terméket termelő sejtek és a tennék biológiai vizsgálatokban í mutatott tulajdonságainak függvénye. E tennék jellemzése azonban jórészt igen gyenge, mert sok vizsgálatot részlegesen tiszta készítménnyel végeztek, másrészt a termékek jellemzésére használt vizsgálatok nem molekula-specifikusak, és sok esetben végrehaj- S tásuk lényeges eltérésekkel történik. A különböző citotoxikus faktorok valódi szerkezete mindaddig ismeretlen marad, míg kinem alakítanak egy egyértelműen vizsgálható, megkülönböztető jellemzőkön alapuló standarad terminológiát. Dyen jellemző lehet például θ az aminosav szekvencia vagy az immun epitopok. A citotoxikus sejttenyészeteknek adott néhány további elnevezés a tumor nekrózis faktor, NK sej t citotoxikus faktor, haemorrhagiás és nekrózis faktor és makrofág citotoxinvagycitotoxinfaktor.

A 608 316 számú, 1984. május 7-én benyújtott

USA-beli szabadalmi bejelentés és a 100641A számú európai közrebocsátási irat (publikáció: 1984. február 15.) azRPMI-1788 humán limfoblasztoid sejtvonal10 hói izolált humán Iimfotoxin aminosav-szekvenciát ismerteti.

A 132 125 A számú európai közrebocsátási irat (publikáció: 1985. január 23.) egy protein elkülönítését ismerteti nyúlból, retikulo-endoteliális rend5 szerének stimulálása után. A bejelentés szerint a protein tumor-ellenes hatású, és N-terminális aminosavszekvenciája: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-AspLys-Pro-Leu-AIa-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-GlnVal-Glu-Gly-GIn-Seu-Gln-Trp-Leu.

O A 628 059 számú USA-beli szabadalmi bejelentés egy tumor nekrózis faktorként azonosított citotoxikus humán polipeptid tisztítását és rekombináns szintézisét ismerteti. A polipeptid N-terminális aminosavszekvenciája: Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-lhr-Pro-Ser5 Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro.

A 4 481137 számú USA-beli szabadalmi leírás egy

7-9000 molekulatömegű, CB_x3-nak nevezett anyag előállítását mutatja be BALL-1 sejtkultúrából. Az anyag visszaszorítja a tumor sejtek növekedését, és

Ala-AlaN-terminálisvéggelrendelkezik.

Tóth és Granger szerint [Mól. Immun. 16:671-679,

1979] sem a nyálsav eltávolítása a limfotoxin-tartalmú Iimfocita felülúszóból neuraminodáz kezeléssel, sem N-acetil-glükozamin, galaktóz, laktóz, mannóz, alfa-metil-mannozid vagy fruktóz hozzáadása a felűlúszóhoz nem befolyásolja a litikus aktivitást. Tóth és munkatársa arra a következtetésre jutott, hogy úgy tűnik, az egyszerű cukrok nem játszanak szerepet limfotoxinjuk aktivitásában. Tóth és munkatársa azon) bán azt is megfigyelte, hogy a szacharidok fontos szerepet töltenekhemás Iifokinekhatásában, amiből arra következtettek, hogynem zárható ki, hogy az oligoszacharidokbonyolultabb formái részt vesznek a limfotoxin citotoxikus aktivitásában.

» Ezt követően Proctor, Klostergaard és Granger [Clinical Research, 30(1); 55A, 1982] azt publikálták, hogy a PHA-val [aktivált primer lecitin, lásd Proctor és mtársai: Clinical Research 30(1); 1982], tunikamicin jelenlétében aktivált limfociták (hogy meggátol ják az N-kapcsolt szénhidrát molekulák kapcsolódását a Iimfotoxin molekulákhoz) biológiailag inért limfotoxint szabadítottak fel. Aszerzők szerint immunkémiai vizsgálatok kiderítették, hogy míg a Iimfotoxin szénhidrát molekularészére nincs szükség ahhoz, hogy transzportálódjon, és az aktivált Iimfocita a szupematánsba juttassa, a szénhidrát ahhoz szükséges, hogy hatékony target sejt roncsolást kapjunk, mert a szénhidrát molekularész felelős a Iimfotoxin molekula vagy molekulák alkalmas konformációjáért.

A következőkben megadunk néhány további, a ta2

HU 204 085 Β lálmány tárgyához kapcsolódó irodalmi hivatkozást: Evans; Cancer Immunoi. Immunother. 12, 181-190 (1982); Lee és mtsai.; Cell. Immun. 48, 166-181 (1979), De Weck és mtsai. kiadás: Biochemical Characterization of Lymphokines 279-312,1980; Khan és mtsai. kiadás: Humán Lymphokines 459-477, 1982. jun. 30; Aggarwal és mtsai.: előadás a 3. Nemzetközi Lymphokin munkabizottságában, Haverfordban, (PA.) 1982. augusztus 1-5.; Ransom és mtsai.: Cancer Research 43:5222-5227 (1983. Nov.); Kuli és mtsai.: J.of Immun. 126(4): 1279-1283 (1981. ápr.); J. Sawada és mtsai.; Jpn. J. Exp. Med. 46: 263-267 (1976): G. Granger és mtsai.: Cell. Immunoi. 38:388— :402 (1978); J. Rundell és mtsai.: Immunopharmacology 5,9-18 (1981); G. Granger és mtsai.: J.Lymophokine Rés. 1: 45-49 (1982); N. Ruddle és mtsai.: Lymophokine Rés, 2:23-31 (1983); M. Mitsuhashi és mtsai.: 2 106 117 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés; H. Enomoto: 87 087 A számú európai szabadalmi bejelentés; B. Williamson és mtsai.: P.NA.S. USA 80: 5397-5401 (1983) és S. Wright és mtsai.: J. Immunoi. 126:1516-1521 (1981).

Az eddig limfocita tenyészetekből elkülönített limfotoxin vagy limfotoxinként azonosított anyagok) alacsony, 0,05-2xl0⁶ egység/liter koncentrációban vannak jelen az RPMI-17 88 sejtek vagy primer limfociták felülúszóiban. A begyűjtött mennyiségek gyakran jelentősen változnak, és a primer limfociták drágák. Szükség van ezért egy gazdaságos módszer kidolgozására a limfotoxin előállítására [Yamamoto és mtsai.: J. of Biological Response Modifiers, 3: (1) 76-87 (1984)].

A korábbi módszerekkel ezenkívül nem lehetett az aminosav szekvencia szempontjából homogén limfotoxint előállítani, holott ez a jellemző igen fontos a gyógyszer célú felhasználás szempontjából. A sejtvonal kultúrákból kinyert limfotoxin, valószínűleg proteolitikus folyamatok következtében, az amino-terminálison heterogén (lásd a fent idézett 608 316 számú USA-beli szabadalmi bejelentést). A például adenoidból vagy perifériás vérből elkülönített primer limfociták kultúráinak gazaságossági okokból szükségképpen sok donor sejtjeit kell tartalmazniuk. E sejtek termékei azonban tükrözni fogják a donorok közötti genetikus különbségeket, így a kapott „limfotoxin” voltaképpen allelomorf egyedek elegye. Nyilvánvaló, hogy az allelomorf gének aránya és milyensége kísérletről kísérletre változni fog. Szükség van tehát egy olyan módszerre, amellyel aminosav szekvencia szempontjából egységes limfotoxint lehet előállítani.

Bár az irodalomban 1968 óta írnak a limfotoxin tumor-ellenes hatásáról és nyilvánvaló terápiás értékéről, miután azonban a korábbi módszerekkel csak kis mennyiségben és heterogén formában sikerült előállítani, részletes klinikai kipróbálására és forgalomba hozatalára mind a mai napig nem került sor. Olyan módszerekre van szükség, amellyel a limfotoxin a klinikai kísérletekhez szükséges mennyiségben állítható elő.

Az irodalomban ismertették, hogy a nyúl antiszérum semlegesíteni tudja a különböző citotoxinok, így a limfotoxinként azonosított anyagok citolitikus aktivitását [Yamamoto és mtsai.: Cell. Immun. 38: 403416 (1978); Gately és mtsai.: Cell. Immun. 27:82-93 (1976); Hiserodt és mtsai.: J. of Immun. 119(2) 274380 (1977); Zacharchuk és mtsai.: P.NA.S. USA 80: 6341 6345 (1983. október); Ruddle és mtsai.: Lymphokine Research 2(1) 23-31 (1983); Mannel és mtsai.: Infection and hnmunity 55(1): 156-164 (1981); Wallach és mtsai.: E. De. Maeyer és mtsai. kiadó: The Biology of the Interferon System 293-302 (1983. szept.) és Stone-Wolff és mtsai.: J. Exp. Med, 159: 828-843 (1984. márc.)]. Mivel ez az antiszérum poliklonális, nagyszámú, az immunogén limfotoin ellen irányuló ellenanyagot tartalmaz. Egy vagy több ilyen ellenanyag működésbe lép, hogy semlegesítse a „limfotoxin hatást. Az irodalmi közlések általában nem egyértelműek az immunogénként használt limfotoxin aktivitásáért felelős anyag anyagai minősége tekintetében. A diagnózishoz és az immunoaffinitáson alapuló tisztítási eljárásokhoz egy világosan és egyértelműen azonosított limfotoxin molekulával szemben álló monospecifikus ellenanyagra van szükség. A találmány kiterjed az üyen ellenanyag előáüítására is.

A találmány ezenkívül olyan módszerekre vonatkozik, amelyekkel olyan limfotoxin szintetizálható gazdaságosan, amelyben lényegében minden limfotoxin molekula primer aminosav szekvenciája azonos.

A találmány tárgya továbbá egy limfotoxin aktivitással rendelkező protein sikeres rekombináns előállításával oldottuk meg. Ezt a limfotoxin speciest, amelyet aktivitásával és természetes vagy variáns aminosav szekvenciájával jellemzünk, a következőkben limfotoxinnak nevezzük. Meglepő módon a limfotoxint kódoló DNS azonosítható volt, függetlenül a homológ sejtekben termelt limfotoxin pillanatnyi szintjétől és annak az időnek a bizonytalanságától, amikor a limfotoxint kódoló hírvivő RNS megjelenik a homológ sejtekben. Ugyancsak meglepő, hogy a biológiailag aktív limfotoxin olyan rekombináns sejtekben termelődik, amelyek nem glikozilezik a limfotoxint (vagy amelyektől ezt nem várnánk a homológ sejtekhez hasonló módon), és az így létrehozott limfotoxin lényegében egységes aminosav szekvenciát mutató formában izolálható, N-terminális enzimatikus hidrolízis nélkül. A limfotoxint kódoló DNS-t nagy, 0,1 lxlO¹¹ egység/liter tenyészetlizátum mennyiségben termeljük.

Arekombináns gazdasejt által kifejezett limfotoxin függ a limfotoxin kódolására alkalmazott DNS-től vagy prekurzorától és a választott gazdasejttől. A limfotoxin szintézishez a találmány szerinti eljárásban alkalmazott nuldeínsav szekvenciák újak. E nukleinsav szekvenciákat olyan nukleotid szekvenciák jeüemzik, amelyek egy vagy több, a következőkben felsorolt tulajdonságban eltérnek a natív vagy természetes szekvenciától:

A DNS intron-mentes, a humán limfotoxin pedig a 284. és 285. nukleotidok között intront tartalmaz (2a. ábra); aDNS nem tartalmaz olxan nukleinsavat, amely annak a szervezetnek más proteinjeit kódolná, amely3

I

HU 204085 Β bői a DNS származik; a limfotoxint kódoló nukleinsav vektorhoz van ligáivá; és/vagy a nukleinsav alkalmas egy limfotoxint termelőnukleinsawal tőrténó'hibridizációra, feltéve azonban, hogy a hibridizáló nukleinsav nukleotid szekvenciája eltér a limfotoxint kódoló természetes DNS vagy RNS nukleotid szekvenciájától.

A limfotoxint kódoló mutáns nukleinsavak rekombináns műveletek termékei. A límfotoxin termelésért felelős nem-transzlált vagy transziáit 5’-nuldeinsavban csendes (silent) mutációkat hozunk létre, hogy elősegítsük az expressziótkülönböző,választott gazdákban, például azáltal, hogy csökkentjük a „szár-és-hurok” (stem and loop) messenger RNS szerkezeteket a nukleinsav preparátumokban talált kodonokat olyanokkal helyettesítjük, amelyeket a gazda-szervezet eIőnyben részesít.

A nukleinsav mutációk, amelyek inkább kifejezettek, mint csendesek, lehetővé teszik olyan límfotoxin fajták előállítását, amelyek a természetes límfotoxin í aminosav szekvenciáját vagy annakprimer szekvencia variánsait tartalmazzák, a natív limfotoxintól eltérő aminosav szekvenciákkal. Amutáns limfotoxint elkülönítjük vagy a kívánt límfotoxin fajta előállítása céljából továbbalakítjukagazda sejteksegítségével. í

Ezeket a nukleinsavakat vagy ezekkel hibridizáló nukleinsavakat vagy ezek fragpienseit, jelzett formában, hibridizációs vizsgálatokban alimfotoxint kódoló genetikus anyag azonosításárahasználhatjuk.

A limfotoxint szintetizáló eljárásokban a Iimfoto- 3 xint kódoló DNS-t egy vektorhoz ligáljuk, a vektort használjuk a gazda sejtek transzformálására, a gazda sejteket tenyésztjük és a tenyészetbőlkinyerjükalimfotoxint Ezt az általános eljárást használjuk a natív límfotoxin aminosav szekvenciáját tartalmazó limfo- 3 toxin vagy új límfotoxin variánsok szintetizálására, a vektor felépítésétől és a transzformációhoz kiválasztott gazda sejttől függően. A találmány szerinti szintézisre alkalmas limfotoxinfajtákközé tartoznakpéldául a következők; leucS amino-terminálist tartalmazz 4i limf otoxin, pre-limfotoxin és olyan límfotoxin variánsok, amelyek tartalmaznak (a) fúziós proteineket, ahol egy heterológ protein vagy polipeptid peptíd-kőtéssel kapcsolódik az amino- és/vagy karboxil-terminálishoz alimfotoxintfelépítőaminosavakonbelül, (b)limfoto- 4í xin fragmenseket, különösen a pre-limfotoxin fragmenseit, amelyekben a -34 és +23 helyek közötti tetszőleges aminosav a fragmens amino-terminális aminosava, (c) límfotoxin mutánsokat, melyekben egy vagy több aminosavmaradékothelyettesítünk, inszer- 5C tálunk vagy eltávolítunk, (d) metionil vagy módosított metíonil (például formil-metionil vagy más védett metionil-származékok) amino-terminális származékokat és/vagy (e) az előzőekben felsoroltak nem-glükozilezett vagy megváltozott glükozilezett származékait. 55

Ha egy emlős sejtet alimfotoxint kódoló, az eukariotikus szekréciós vezetővel (beleértve a natív limfotoxin szekréciós vezetőt is) működőképesen Iigáltnukleinsawal transzformálunk, vagy ha egy limfotoxint kódoló aminosavat egy vektorral működőképesen egy θθ prokariotikus vagy élesztő szekréciós vezetővel ligálunk, melyet a transzformálni kívánt gazda sejt felismer (ez rendszerint az a szervezet, amelyből a vezető szekvenciát kinyertük), a gazdát transzformáljuk a vektorral és tenyésztjük, majd a nem-metionilezett amino-terminális límfotoxin formákat szokásos módon kinyerjük a tenyészetből.

Ha egy limfotoxint kódoló DNS-t működőképesen ligálunk egy vektorral, szekréciós vezető szekvencia 0 alkalmazása nélkül, majd ezt használjuk egy gazda sejt transzformálásához, a szintetizált límfotoxin molekulák általában metionil- vagy módosított metionil(például formil-metionil) csoportot tartalmaznak amino-tenninálisukon.

A találmány olyan módszert is ismertet, amellyel a limfotoxint kódoló nukleinsav in vitro mutagenezise eddignem ismert límfotoxin variánsokkialakulásához vezet. Először, az N-terminálison metionil- vagy módosított metionil-csoportot tartalmazó limfotoxint ki) fejezzük a limfotoxint kódoló nukleinsawal transzformáit gazda sejtek segítségével, és a kifejezést közvetlenül végezzük, azaz anélkül, hogy szekréciós vezető szekvenciát alkalmaznánk.

Másodszor, in vitro, hely-specifikus, előre meghai tározóit vagy random mutagenezist alkalmazunk deléciók, helyetteslítések és/vagy inszekciók létrehozása céljából a limfotoxint kódoló nukleinsavban. A limfotoxim fúziókat így állítjuk elő. A mutáns nukleinsav kifejezésével kapott Iimfotoxin-származékok módosított jellemzőkkelrendelkeznek.

Végül, új limfotoxin-származékokként nem-glükozilezett vagy eltérően glükozilezett Iimfotoxin-származékokat állítottunk elő. Anem-glükozilezett limfotoxint a limfotoxint kódoló DNS prokariotikus expressziója termeli. Az eltérően glükozilezett límfotoxin fajták a transzformált magasabb eukariotikus, általában emlős, sejtek rekombináns tenyészeteinek termékei.

A találmány szerint előállítottlimfotoxint a szupernatáns vagy lizátum tenyészetéből immuno-affinitás adszorpciós módszerrel tisztítjuk, nem-szolubilizált limfotoxin-semlegesítő ellenanyag felhasználásával. Ezt az ellenanyagot, melyet leghatékonyabban monoklonális sejt kultőrában lehet termelni, egerekben hozzuk létre, timföldön adszorbeált limfotoxinnal végzett immunizáció segítségével.

Gyógyászati célra a találmány szerinti limfotoxint fiziológiailag elfogadható stabilizálószerekkel és vívóanyagokkal kombináljuk, és steril adagolási formákban, például liofilizátumot tartalmazó ampullákban szereljük ki, vagy stabilizált vizes készítmény formájában tároljuk. Alimfotoxint tumorok vagy olyan sebekkezelésére, amelyekből a tumort kimetszették, polimer mátrixba beépítve is használhatjuk. így elérhető, hogyalimfotoxinidőzítveszabaduljonfeléslokalizáltannagy koncentrációban legyen jelen.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények terápiásán hatásos mennyiségbe nimplantációval, injekció vagy infúzió formájában alkalmazhatók daganatos megbetegedésben szenvedő állatok, de különösen hu4

HU 204 085 Β mán betegek kezelésére.

Rajzismertetés:

Az 1A ábrán egy DNS szekvenciát és ennek feltehetően a limfotoxin fragmenst kódoló aminosav szekvenciáját mutatjuk be.

Az 1.B ábra az 1A ábrán bemutatott fragmenst kódoló szintetikus DNS felépítését szemlélteti,

A 2A ábrán a pre-limfotoxin teljes aminosav szekvenciája, az ezt kódoló DNS és az 5' és 3 ’ oldalsó, nemtranszlált régiók láthatók.

A 2.B ábrán egy metionil leucil amino-terminális limfotoxin és amino-terminális metionil-származékainak felépítésére alkalmas expressziós vektor kialakítását szemléltetjük.

A 3. ábra egy metionil-hisztidil amino-terminális limfotoxin létrehozására alkalmas expressziós vektor kialakítását mutatja.

A 4. ábrán a humán, patkány és szarvasmarha limfotoxin és a konszenzus emlüó's limfotoxin maradékok aminosav szekvenciáit szemlélteti.

Az 5 A és az 5.B ábra a limfotoxin és egy bakteriális jel szekvencia fúzióját kódoló plazmid felépítését mutatja.

Találmányunk ismertetése során a limfotoxint olyan biológiailag aktív polipeptidként definiáljuk, amely rendelkezik egy, a 2A ábrán bemutatott limfotoxin aminosav szekvencia legalább egy részével aminosav felépítés szemponjából lényegében homológ tartománnyal. Biológiai aktivitáson előnyösen citotoxikus aktivitást, egy citotoxikus limfotoxinnal mutatott immunológiai „kereszt-reaktivitást” vagy azt a képességet értjük, hogy az anyag versenyezni képes a citotoxikus limfotoxinnal a sejt felületi limfotoxinnak önmagában nem kell citotoxikusnak lennie. Az immunológiailag kereszt-reakcióra képes mutánsok állatokban az anti-limfotoxin emelésére szolgáló immunogénként, például immunvizsgálatok reagenseiként hasznosíthatók, míg a nem citotoxikus kompetitív mutánsok jelzett reagensekként használhatók a biológiailag aktív limfotoxin kompetitiv-típusú immun vizsgálatai során.

Előnyös citotoxikus hatás alatt azt értjük, hogy a vizsgált anyag azonos körülmények között a daganatos sejteket nagyobb mértékben semmisíti meg vagy gátolja növekedésükben, mint a normál sejteket, akár in vivő, akár in vitro vizsgálatokban. A vizsgálat végpontja előnyösen a tumor sejtek megsemmisítése lízissel in vitro vagy nekrózissal in vivő, bár a citosztázis vagy antiproliferatív aktivitás szintén kielégítően használható.

A limfotoxin anticelluláris aktivitásának kimutatására szolgáló módszereket ismertetnek például a következő irodalmak: B. Aggarwal és mtsai., J. Bioi. Chem. 259 (1) 686-691,1984; E. Carswell és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 3666-3670,1975.

A limfotoxin fajlagos aktivitását inkább a célzott sejtlízissel, mint a citosztázissal fejezzük ki. Egy egység limfotoxin az a mennyiség, amely a target sejtek 50%-os liziséhez szükséges, a részletesebben az 1. példában bemutatott körülmények között. Más módszerek is elfogadhatók azonban a citotoxikus aktivitás meghatározására.

A „lényegében szerkezetileg” homológ” kifejezés alatt általában azt értjük, hogy a polipeptid aminosavmaradékainak legalább 90%-a azonos vagy konzervatív behelyettesítése a 2 A ábrán bemutatott megfelelő maradék(ok)nak.

A limfotoxin polipeptid nem minden szekvenciájának kell a 2A ábrán bemutatott szekvenciával homológnak lennie. A követelmény csak az, hogy legalább egy szakasza legyen homológ a 2A ábrán bemutatott szekvencia tetszőleges részével, feltéve, hogy az anyag rendelkezik a kívánt biológiai aktivitással. Általában a homologitásnak körülbelül20-100 aminosavmaradékot tartalmazó tartományokra kell érvényesnek lennie, felismerve, hogy esetenként hézagokat kell beiktatni a homologitás maximalizálása érdekében.

Kisebb homologitást kívánunk meg a polipeptidektől ahhoz, a találmány szerinti definíció alá essenek, ha a 2A ábra szerinti szekvenciával homológ tartomány nem a limfotoxin kulcs-régióinak, azaz a citotoxikus aktivitás szempontjából fontos régióknak egyike. A 2 A ábrán bemutatott szekvenciában kulcs-tartományoknak tartjuk a 162-171, 52-83 és 127-148 tartományokat.

A limfotoxin találmány szerinti definíciójából egyértelműen kizárjuk a humán tumor nekrózis faktort vagy természetes állati analógjait [D. Pennica és mtsai., Natúré, 312:20/27,724-729,1984, december) és B. Aggarwal és mtsai., Natúré, 312:20/27,724-729, 1984. december) és B. Aggarwal és mtsai. J, Bioi. Chem. 260(4): 2345-2354,1985].

A szerkezetileg hasonló kifejezést az aminosav oldalláncok domináns jellemzőire, így a bázisos, semleges vagy savas karakterre, a hidrofil vagy hidrofób jellegre vagy egy nagy térkitöltésű csoport hiányára vagy jelenlétére értjük. Egy szerkezetileg hasonló aminosav helyettesítését egy másikkal a szakirodalom általában konzervatív helyettesítésként említi.

Ahhoz, hogy egy polipeptidet limfotoxinként azonosítsunk jelentős segítséget nyújtanak azok az antiszérumok, amelyek egy lényegében homogén, limfoblasztoid (vagy természetes) limfotoxin citolitikus aktivitását semlegesítik. Ha ezek az antiszérumok a kérdéses polipeptid citolitikus aktivitását is semlegesítik, limfotoxinról van szó. Meg kell azonban jegyezni, hogy az immunológiai azonosság és a citotoxikus azonosság nem szükségképpen jár együtt. Lehetséges, hogy egy, a 2A ábrán bemutatott limfotoxint semlegesítő antitest azért nem köt meg egy vizsgált proteint, mert a semlegesítő antitest történetesen a limfotoxin olyan helyére irányul, amely csupán szomszédos a limfotoxin citotoxikus hatása szempontjából kritikus tartománnyal, de amely a limfotoxin aktív helyének sztérikus gátlásán keresztül semlegesítő antitestként hat. Lehet, hogy a protein, amely ebben a tartományban mutációt tartalmaz, nem köti meg többé a semlegesítő antitestet, de a lényegében homológ felépítés és a biológiai aktivitás alapján limfotoxinnak minősül.

Vizsgálataink szerint a limfoblasztoid sejtvonalak

HU 204085 Β tenyésztésével kapott limfotoxin a következő jellemzőkkel rendelkezik molekulatömege 20 000 és 25 000 között van, a gliikozilezés fokától és az N-terminális heterogenitástól függően, az Asn⁺62 helyen glükozüezést tartalmaz (2A ábra), hajlamos az aggregációra, különösen multimerekké szerveződésre, izoelektromos pontja körülbelül 5,8 pHIabűitást mutat (a citolitikus aktivitás több, mint 50%-a elvész, ha 24 órán át ammónium-karbonát oldatban, 10 ^g/ml koncentrációban tároljuk, a pH-t 5 alatt vagy 10 felett tartva), vizes oldatban 5 percen át 80 ’C-on végzett inkubálás hatására aktivitása lényegesen csökken. Két eltérő molekulatömegű limfoblasztoíd limfotoxin terméket azonosítottunk. A 25 000 molekulatömegű tennék az amino-terminálison leuein maradékot tartalmaz. A 25 000 limfoblasztoíd limfotoxin elsődleges aminosav szekvenciáját tartalmazó polipeptideketleucil aminoterminális limfotoxinnaknevezzük. A20 000-es molekulatömegű limfoblasztoíd limfotoxint az jellemzi, hogy amino-terminálisán hisztidin maradékot tartalmaz, ezért az ennek megfelelő szekvenciájú polipeptidekethisztidil amino-terminális limfotoxinnaknevezzük. Fontos megfigyelni, hogy ezek a jellemzők a természetekből kinyert humán limfotoxinra vonatkoznak. Míg az itt megadott módon definiált limfotoxin magába foglalja a natív, glükozilezett limfotoxint, más rokon citotoxücus polipeptidek is a találmány szerinti defníció alá eshetnek. Például az általában az állati eredetű Iimfotoxinnal kapcsolatos gliikozilezés módosítható úgy, hogy az expressziót egy heterológ rekombínáns eukariotíkus gazda sejtben hajtjuk végre, és az így kapott limfotoxin molekulatömege vagy izoelektromos pontja kívül eshet a fent megadott értékeken. Rekombináns baktériumtenyészetben teljesen glükozilezés nélküli limfotoxin is előállítható, amelynek molekulasúlya, izoelektromos pontja és egyéb jellemzői megfelelően módosulni fognak. Ezenkívül a prelimfotoxin transzláció utáni átvitele egy adott, első állati sejtvonalból egy másik állatból származó sejtvonalba más amino-terminális maradékot eredményez- ‘ hét, mint amit az első állati sejtvonal esetében kapnánk. Ezenkívül például a mutagenezisre itt leírt módszerek lehetővé teszik a limfotoxin N-terminális aminosav szekvenciájának megváltoztatását, és ezáltal a pH stabilitás, izoelektromos pont és más hasonló jel- ² lemzőkmódosítását.

Humán limfotoxin esetében a transziáit aminosav szekvenciát a 2A ábrán mutatjuk be. Ez a szekvencia egy 34-tagú „pre-szekvenciát” tartalmaz, amely a transziáit transzkriptumnak a humán sejtekben törté- í nő feldolgozása során feltehetően eltávolításra kerül (a továbbiakban a mutánsokat is beleértve „pre-limfotoxin”-nak nevezzük), leucil amino-terminális érmékét eredményezve. A hísztidil ammo-termínális variáns homológ a leucil amíno-terminálissal, azzal az el- 5 téréssel, hogy hiányzik belőle a leucil amino-termináIist tartalmazó termék első 23 aminosava. Mindhárom species, azaz a pre-limfotoxin, a leucil amino-terminális limfotoxin és a hisztídií amino-terminális limfotoxin, valamint ezek metionií-, módosított metionil-, 6 mutáns- és nem glükozüezett formái aláesnek a limfotoxin találmány szerinti definíciójának. Anem-glükozilezett leucil és hisztidil amino-terminális species molekulatömege alacsonyabb a korábban a limfob5 lasztoid sejtekből elkülőnítetthomológspeciesre megadottmolekulatömegénél.

Apre-limfotoxin olyan limfotoxin variáns, amely a fenti definíció alá esik Jellemzője egy szignál (vagy vezető) polipeptíd jelenléte a molekula amino-tenni10 nálisán. Általában a limfotoxin natív szignál polipeptidja proteolitikusan lehasad a limfotoxinról annak a folyamatban a részeként, amelyneksorán aproteinkiválasztódik a sej tből. A szignál pepiid lehet mikrobiális vagy emlős (beleértve a 34-tagú natív maradék pre15 szekvenciát), de előnyösenhomológ agazda sejtteLBizonyos szignál-limfotoxm-funkciókat nem ismer fel, és nem dolgoz fel a gazda sejt. Az ilyen mikrobiális szignál szekvenciákat tartalmazó fúziók például limfotoxin immunogénként hasznosíthatók ’0 Megjegyezzük, hogy a citotoxikus aktivitásra „képes” kifejezés alatt azt értjük, hogy alimfotoxin fogalmába beletartoznak az olyan polipeptidek is, amelyek például enzimatikus hidrolízissel, egy zimogénnel analóg inaktív állapotból olyan polipeptíd fragmenssé !5 alakíthatók amely már mutatja a kívánt biológiai aktivitást. Az in vitro vagy in vivő citotoxikus aktivitásra „alkalmas” kifejezéssel az olyan nem-citotoxikus polipeptideket szándékoztunk felölelni, amelyek, például enzimatikus hidrolízissel, átalakíthatok egy zimo0 génnel analóg inaktív állapotból egy a kívánt biológiai hatást mutató polipeptíd fragmentté. Tipikus inaktív prekurzorok az olyan főziós proteinek, amelyekben a limfotoxin karboxil-terminálisán peptid-kötéssel kapcsolódik egy másik proteinhez vagy polipeptidhez. A peptid-kötésnél vagy annak közelében a szekvenciát úgy választjuk meg, hogy proteolitikus hidrolízisével limfotoxin szabadulhasson fel, akár in vivő, akár a feldolgozási folyamat részeként in vivő, akár a feldolgozási folyamat részeként in vitro. Jellegzetes kapcsolás szekvencia például a lys-lys vagy arg-lys kapcsolat. Az ilyen pre-limfotoxin nem-limfotoxin komponense előnyösen egy homológ protein, annak érdekében, hogy minimalizáljuk a fúzió immunogenitását. A homológ proteinnek ártalmatlannak kell lennie, és nem szabad kötődnie a sejt felszínéhez. Az így kapott limfotoxin azután már mutatni ogja a definíció szerint megkívánt citotoxikus aktivitást.

Bár limfotoxin alatt általában a humán limfotoxint értik, a limfotoxin találmány szerinti definíciója ma) gábanfoglalja amás forrásokból, így egérfélékből, sertésből, lófélékből vagy szarvasmarhákból származó limfotoxint is, amennyiben az megfelel a homológ régiókkal és a biológiai aktivitással kapcsolatban korábban ismertetett normáknak. így például a szarvasmar' ha és az egér-eredetű Kmfotoxinok igen nagymérték.ben (körülbelül 80%) homológok a humán limfotoxinnal. Alimfotoxin nem species specifikus, például a humán limfotoxin hatásos egéren kifejlődött tumorokra és neoplasztíkus sejtvonalakra is. így egy adott speciesből származó limfotoxin felhasználható egy másik

HU 204085 Β species terápiájában.

A limfotoxin fogalma a multimer formákra is kiterjed. Spontán módon a limf otoxin multimerekké aggregálódik, amelyek rendszerint dimerek vagy magasabb multimerek. A multimerek citotoxikusak, és így alkalmasak az in vivő terápiában történő felhasználásra. A limfotoxin a rekombináns gazdaszervezetekben monomerként fejeződik ki. Ezt követően azonban a limfotoxin nagy hajlamot mutat arra, hogy spontán módon multimereket képezzen. A terápiában mind a homogén multimerek, mind különböző multimerek elegyeifelhasználhatók.

A különböző limfotoxinok felölelik a 2 A ábra szerinti molekula vagy fragmensei előre meghatározott vagy célzott, azaz helyspecifikus mutánsait is. A limfotoxin variánsok olyan polipeptidek, amelyek megfelelnek a limfotoxin korábban megadott jellemzőinek,· de amelyek egy a 2 A ábrán megadottól eltérő amínosav szekvenciát tartalmaznak, akár ilyen szakaszok elhagyása, helyettesítése vagy beépítése következtében. A találmányban ismertetett nem-humán limfotoxinok és a humán limfotoxin allelomorf módosulatai egyaránt limfotoxinoknak minősülnek, mint olyan helyi mutációkat tartalmazó variánsok, amelyeknek nincs természetes megfelelője. A mutagenezis célja olyan DNS létrehozása, amely a fent definiált limfotoxint kódolja, de amely olyan jellemzőkkel rendelkezik, amelyek módosítják a természetes limfotoxin biológiai aktivitását vagy megkönnyítik a limfotoxin előállítását, így például a lizin +89 kodontannak érdekében mutáljuk, hogy a lizin-maradék helyett hisztidin-maradékot hozzon létre. Ahisztidin +89-et a tripszin már nem hidrolízálja (amely általában az arg-X vagy lys-X kötésnél hasítja a peptideket). A proteáz rezisztenciától nagy biológiai felezési idő várható, a 2 A ábra szerinti szekvenciának megfelelő limfoxinnal vagy mutánsával összehasonlítva. A limfotoxin más lizin vagy arginin maradékai is hisztidinné alakíthatók mutáció útján. Ilyen például a lizin +28, lizin +19 és az arginin +15.

Mint már említettük, a limfotoxin molekula bizonyos tartományai lényegében homológnak tekinthetők egy hasonlóan aktív, nekrózis faktornak nevezett proteinnel. A különböző biológiai és citotoxikus hatásokat mutató limfotoxin mutánsok azonosítására szolgáló mutagenezis céljára különösen előnyösek az ezekben a lényegében homológ tartományokban található vagy közvetlenül szomszédos aminosav maradékok. Az ilyen mutánsok önmagukban ismert módszerekkel készülnek, majd a kívánt biológiai hatás, így például a kezelni kívánt adott neoplazmával szembeni citotoxicitás megnövekedése, vagy — állatok immunzálására használandó limfotoxin származékok esetében — a kifejezettebb immun válasz kifejlesztésének képessége, vizsgálata következik, Hyen limfotoxin változatok például a következők: Az Ala+168-at egy elágazó szénláncú aminosawal (val, ile vagy leu) helyettesítjük; a thr+163 helyére tirozint helyettesítünk, a ser+82-t lizinnel helyettesítjük; a ser+42-t izoleucinnal, leucinnal, fenü-alaninnal, valínnal vagy hisztidinnel helyettesítjük; a lys+84 helyére glutamint, triptofánt, szerint vagy hisztidint építünk be; a ser+82-t eltávolítjuk; a leu+171 -hez egy hidrofób di- vagy tripeptidet kapcsolunk; a thr+163-at aszpartámsawal vagy lizinnel helyettesítjük; as glu+127 és a pro+128 közé egy ala-lys szakaszt illesztünk; a ser+70-et lizinnel vagy glicinnel helyettesítjük; a thr+69-et tirozinnal helyettesítjük; a lys+28-at argininnel vagy hisztidinnel helyettesítjük; a his+32-t argininnel vagy lizinnel helyettesítjük; az asp+36 helyére prolint, szerint, treonint, tirozint vagy glutaminsavat ültetünk be; a ser+61-et treoninnal, tirozinnal, hisztidinnel vagy lizinnel helyettesítjük; a gly+124-et aszpartámsawal, szerinnel vagy tirozinnal helyettesítjük; a his+135-öt argininnel, lizinnel, tirozinnal, triptofánnal vagy prolinnal helyettesítjük; a thr+142-t aszpartámsawal helyettesítjük; és a gln+146-ot lizinnel vagy treoninnel helyettesítjük.

A mutánsok egy különösen előnyös tulajdonságú csoportjában a +20, +120 és +133 humán limfotoxin maradékok metionin maradékai hiányoznak, vagy előnyösen helyükön más limfotoxin származékok megfelelő helyem található szakaszok találhatók. így például a met+20, +120 és +133 maradékokat treonin, szerin illetve valin helyettesítheti. Ezek a szarvasmarha limfotoxinjában található megfelelő maradékok. A helyettesítést a 9. példában leírt módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a metil+133-at egy további mutagenezis lépéssel a val-hoz kapcsoljuk, ismert módszereket követve, Ml 3 Mp8 fág felhasználásával. Ezt a mutáns állati species-hibrid limfotoxin DNS-t használjuk a 7. példában szereplő leucil amino-terminális DNS helyett, és fúziós formában kifejezzük. Ismert eljárást használva cianogén-bromidot alkalmazunk az STII jel lehasítására a hibrid limfotoxinról, majd kinyerjük a kész leucil amino-terminálist tartalmazó limfotoxin variánst.

Más hasznos limfotoxin variánsokban a megfelelő limfotoxin variánsokat a tumor nekrózis faktor egyes részeivel helyettesítjük, ilymódon hibrid tumor nekrózis faktor-limfotoxin variánsokat hozva létre. így például az érett tumor nekrózis faktor első 8,9 vagy 10 maradékával (például val-arg-ser-ser-ser-arg-thrpro-ser-asp-) helyettesíthető a leucil amino-terminálist tartalmazó limfotoxin első 27 aminosav-maradéka. Ennél a variánsnál nagyobb valószínűséggel jön létre N-terminális demetionilezés E. coli-val végzett közvetlen expresszió során.

Míg a mutáció helye előre meghatározott, nem szükségszerű, hogy a mutáció per se is előre meghatározott legyen. Például annak érdekében, hogy a mutáns hisztidin +89 limfotoxin tulajdonságait optimalizáljuk, random mutagenezist hajtunk végre a lizin +89-nek megfelelő kondonon, és a kifejezett limfotoxim mutánsokat vizsgálatnak vetjük alá, hogy megtaláljuk a citotoxikus aktivitás és a proteáz rezisztencia legmegfelelőbb kombinációját.

A limfotoxin inszertált, általában 1-10 aminosav maradékból álló, szakaszokat tartalmazhat, vagy általában 1-30 aminosav maradék eltávolítható belőle. A

HU 204085 Β helyettesítéseket, kihasításokat, inszertálásokat vagy ezek tetszőleges szubkombmációxt kombinálhatjuk egymással a végső szerkezet kialakítása érdekében. Az inszertálások az ainino-vagy karboxil-terminális fúziókra is kiterjednek, például ide tartozik a karboxil-terminális megtoldása egy hidrofób résszel. Előnyösen azonban csak helyettesítéses mutagenezist végzünk. Nyilvánvaló, hogy a kódoló DNS-ben nem helyettesíthetik a leolvasó szekvenciát, és előnyösen nem hoznak létre olyan komplementer tartományokat, amelyek másodlagos mRNA szerkezeteket hozhatnának létre. Az E. colinak limfotoxin mutánsokat kódoló DNS-t tartalmazó vektorokkal transzformált extraktumai, amelyekből az utolsó 16 karboxi terminális aminosavat vagy a leucií amino-tenninális limfotoxin első 33 amino terminális maradékát eltávolítottuk nem mutattak citotoxikus hatást. A hatás hiányának okai azonban mégnem tisztázottak, és az 1. példában megadott okok bármelyike jelentheti a magyarázatot.

A DNS-nek nem minden a limfotoxint kódoló mutációja kerül kifejezésre a rekombináns sejttenyészet végtermékében. így például a DNS-t helyettesítő mutánsok nagy csoportját alkotják azok a DNS molekulák, amelyekben a 2 A ábrán bemutatott kiválasztást biztosító szignál szekvenciát (secretory leader) más szignál szekvencia helyettesíti, akár a34 vezetőn belüli deléciók, akár helyettesítések következtében, amelyek anatív vezetőle többségét vagy mindegyikét olyan vezetővel helyettesítik, amelyet az alkalmazni kívánt gazda szervezet nagyobb valószínűséggel felismer. így például egy prokariota eredetű expressziós vektor létrehozásához a 2 A ábra szerinti szignál szekvenciát eltávolítjuk a bakteriális alkáli foszfatáz vagy hőstabil enterotoxin Π vezető beültetése céljából, míg élesztő céljára a 2 A ábra szerinti szignál helyett élesztő invertázt, alfa-faktort vagy sav foszfatáz vezetőket alkalmazunk. Ez nem jelenti azonban azt, hogy a humán, kiválasztást biztosító szignál szekvenciát a humán sejtvonalakon kívül más gazda nem ismeri fel. Amikor a szignál szekvenciát a gazda „felismeri”, a ^z limf o toxinból és a szignálból álló fúziós protein a szignál limfotoxin pepiid kötésnél általában ugyanabban a lépésben felhasad, ami a limfotoxin szekréciójához vezet. így bár mutáns DNS-t használunk a gazda transzformálásához, a kapott limfotoxin tennék fűzi- ^z onált vagy natív limfotoxin lesz, attól függően, hogy a gazda sejt milyen hatékonyan működik afúzió során.

ADNS mutánsoknak egy másiknagy olyan csoportja, amely nem vezet limfotoxin variánsokhoz az expresszió során olyan nukleotid helyettesítéseket tártál- 6 máz, amelyek célja az expresszió elősegítése, elsősorban azáltal, hogy megakadályozza szár-hurok (stemIoop) szerkezetek létrejöttét az átírtmRNS-hen (lásd a 303 687 számú USA-beli szabadalmi bejelentést), vagy olyan kodonok létrehozása, amelyeket a válasz- 55 tott gazda könnyebben átír, így például E. coli-val végzett expresszióhoz jól ismert, az E. coli által preferált kodonokalkalmazhatók.

A mutáns nukleinsavat önmagukban ismert módszerekkel készítjük, amelyeket például a következő 60 irodalmihelyekenismertetnek:

A Hűi és mtsai., 1984 „The EMBO Journal” 5(3):

263-629;

J.Adelman és mtsai. 1983, ,,DNA2(3): 183-193; a 5 2130 219 számon közrebocsátott nagy-britanniai szabadalmi bejelentés; G. Winter és mtsai, 1982 .Natúré” 299: 756-758; és R. Wallace és mtsai, 1981 „Nucleic Acid Research” 9(15): 3647-3656. Ezek a módszerek felölelik az M13 fág mutagenezist, a mu10 táns limfotoxin gén 1. példában ismertetett szintézisét és más, az irodalomból ismert módszereket.

Limfotoxint kódoló nuldeinsavalatt bármely DNSt vagy RNS-t értünk, amely a limfotoxin találmány szerinti definíciója alá eső polipeptidet kódol, függet5 lenül attól, hogy nukleotid szekvenciái megfelelnek-e a természetben előforduló szekvenciáknak. Ezen felül olyan nukleinsavak is ide tartoznak, amelyek legalább adott körülményekközött Iimfotoxintkódoló nukleinsawá képesekhibridizálódni, még akkor is, ha a hibriO dizáló nukleinsav nem kódol olyan proteint, amely egyébként megfelel a limfotoxinnal szemben támasztott követelményeknek. Ilyen például egy olyan próba, amely az általa kódoltpolipeptid rövidsége miatt, nem alkalmas biológiailag aktív limfotoxin kifejezésére. A limfotoxint kódoló vagy azzal hibridizációra képes aminosavat szerves kémiai szintézissel, lényegében az

1. példában ismertetett körülmények között állítjuk elő, vagy természetes forrásokból nyerjük, a példában mutatott módon genom vagy cDN könyvtárakat ki7 próbálva.

A találmány szerinti limfotoxint általában olyan eljárással állítjuk elő, amely szerint egy gazdát egy a kívánt limfotoxint kódoló nukleinsavat tartalmazó vektorral transzformálunk. A vektor egy replikálható 5 DNS szerkezet. A találmány szerinti vektorokat használjuk a DNS amplifikálására vagy a limfotoxint kódoló DNS expressziójára. Egy expressziós vektor olyan DNS szerkezet, amelyben a limfotoxint kódoló DNS szekvencia működőképesen egy alkalmas kont) roll szekvenciák egy transzkripciós promotert, egy a transzkripció kontrollálására szolgáló tetszőleges operátor szekvenciát, az alkalmas mRNSriboszomális kötőhelyeket kódoló szekvenciát és a transzkripció és a transzláció terminációját kontrolláló szekvenciákat ’ tartalmaznak.

A vektor lehet egy plazmid, egy vírus (beleértve a fágokat) vagyegyintegrálhatóDNSfragmentum (azaz olyan DNS fragmentum, amely rekombinációval a gazda genomba integrálható). Egy alkalmas gazdába transzformálva a vektor replikálódik, és a gazda genomtól függetlenül funkcionál, vagy bizonyos esetekben magában a genomban integrálódhat. A jelen bejelentésben a „plazmid” és „vektor kifejezéseket néha egymással felcserélhető módon alkalmazzuk, mivel jelenleg a plazmídok a vektorok leggyakrabban használható formái. Azonban bármely más vektor, amely ekvivalens célra szolgál, és az irodalomból ismert vagy a jövőben ismertté válik, felhasználható a találmány céljára.

Az alkalmas vektorok replikációs és kontroll szek8

HU 204085 Β venciákat tartalmaznak, amelyek az expresszió céljára kiválasztott gazdával kompatibilisek. A transzformáit gazda sejtek olyan sejtek, amelyeket limfotoxin vektorokkal transzformáltunk vagy transzfektáltunk, ahol az utóbbiakat rekombináns DNS technikákkal állítottuk elő. A transzformált gazdasejtek rendszerint limfotoxint fejeznek ki. A kifejezett limfotoxin intracellulárisan felgyűlik vagy a periplazmás térbe vagy a szupematánsba ürül, a választott gazdasejttől függően.

ADNS tartományok akkor kapcsolódnak operábilisen, ha funkcionálisan kapcsolódnak egymáshoz. így például a preszekvenciához vagy a szekréciós vezetőhöz szükséges DNS operábilisen kapcsolódik egy polipeptidet kódoló DNS-hez, ha olyan preproteinként fejeződik ki, amely részt vesz a polipeptid szekréciójában; egy promoter operábilisen kapcsolódik egy kódoló szekvenciához, ha a szekvencia transzkripcióját kontrollálja; vagy egy riboszóma kötőhely operábilisen kapcsolódik egy kódoló szekvenciához, ha úgy helyezkedik el, hogy megengedi a transzlációt. Az operabilis kapcsolódás általában egymásmellettiséget jelent és szekréciós vezetők esetében, egymásmellettiséget és leolvasási fázist.

Alkalmas gazdasejtek a prokarioták, az élesztő vagy magasabbrendű eukarióta eredetű sejtek. A prokarióták közé tartoznak a Gram negatív és Gram pozitív mikroorganizmusok, például az E. coli vagy Bacillus. A magasabbrendű eukarióta eredetű sejtek közé tartoznak az emlős eredetű kialakult sejtvonalak, mint a későbbiekben majd ismertetni fogjuk. Előnyösen alkalmazható gazda sejt a fág-rezisztens E. coli W3110 (ATCC 27 325) törzs, amelyet a példákban ismertetünk, bár más prokarioták, így például az E. coli, Β, E. coli X1776 (ATCC 31 537), E. Coli 294 (ATCC 31 446) törzsek, Pseudomonas speciesek, vagy Serratia marcescens is alkalmas erre a célra.

A limfotoxin expressziójához a prokarióta gazdavektor rendszereket találtuk előnyösnek. Alkalmas mikrobiális vektorok nagy bőségben állnak rendelkezésre. A mikrobiális vektorok általában a választott gazda által felismert replikációs origót, egy a gazdában funkcionáló promotert és egy fenotípusos szelekciós gént, például egy antibiotikum rezisztenciát mutató vagy a zauxotróf követelményeket kielégítő proteineket kódoló gént tartalmaz. Hasonló szerkezetek hozhatók létre más gazdákban történő alkalmazásra is. Az E. coli-t általában pBR322 felhasználásával transzformálják, amely egy E. coli speciesből nyert plazmid (Bolivár és mtsai., 1977, „Gene” 2:95). A obr322 ampicillin és tetracildin rezisztencia géneket tartalmaz, így könnyűvé teszi a transzformált sejtek azonosítását.

Az expressziós vektoroknak olyan promotert kell tartalmazniuk, amelyet a gazda szervezet felismer, ami nem áll a klónozó vektorokkal kapcsolatban. A promoter általában homológ a kiválasztott gazdával. A rekombináns DNS szerkezetekben legáltalánosabban használt promoterek közé tartozik a béta-laktamáz (penicillináz) és a laktóz promoter rendszer (Chang és mtsai., 1978. „Natúré” 275:615; és Goeddel és mtsai.,

1979, „Natúré” 281:544), a triptofán promoter rendszer (Goeddel és mtsai., 1980, „Nucleic Acid Rés.” 8: 4057 és a 36776 számon közrebocsátott Európai szabadalmi bejelentés) és a tac promoter (H. De Boer és mtsai., „Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA,” 80: 21-25 /1983/). Bár ezek a leggyakrabban használatosak, más ismert mikrobiális promoterek is alkalmazhatók. Nukleotid szekvenciájuk részletes ismertetése megtalálható az irodalomban, ezáltal lehetővé téve, hogy a területen jártas szakember operábilisen a limfotoxint kódoló DNS-hez kapcsolja ezeket egy alkalmas plazmid vektoron belül (Seibenlist és mtsai., 1980 „Cell” 20: 269). Jelenleg a legelőnyösebbnek tartott vektor egy olyan pBR322 származék, amely az E. coli alkáli foszfatáz promotert és a trp Shine-Dalgamo szekvenciát tartalmazza. A promoter és a Shine-Dalgamo szekvencia operábilisen kapcsolódik a limfotoxint kódoló DNS-hez, azaz úgy helyezkednek el, hogy elősegítsék a limfotoxin mRNS transzkripcióját a DNS-ből.

A prokariotákon kívül eukariotikus mikrobák, így például élesztő kultúrák is transzformálhatok limfotoxint kódoló vektorokkal. Az alacsonyabbrendű eukariotikus gazda mikroorganizmusok közül a Saccharomyces cerevisiae, azaz a közönséges sütőélesztő alkalmazása a legelterjedtebb, bár számos egyéb törzs is könnyen hozzáférhető és alkalmazható. Az élesztő vektorok általában a 2 mikronos élesztő plazmidból vagy egy autonóm módon replikálódó szekvenciából (ARS) származó replikációs origót, promotert, limfotoxint kódoló DNS-t (beleértve a humán pre-limfotoxint), poliadenilező és transzkripciót termináló szekvenciákat és egy szelekciós gént tartalmaznak. A limfotoxin expressziójához alkalmazható plazmidok közül élesztőben használható az YRp7 (Stinchcomb és mtsai., 1979, „Natúré”, 282: 39; Kingsman és mtsai., 1979, „Gene”, 7: 141; Tschemper és mtsai., 1980, „Gene”, 10:157). Ez a plazmid már tartalmazza a trpl gént, amely szelekciós markerként szolgál az élesztő olyan mutáns törzseihez, amelyek triptofánon nem képesek növekedni. Ilyenek például az ATCC 44076 számon deponált vagy a PEP4-1 (Jones, 1977, „Genetics” 85 : 12) jelű törzsek. A trpl lézió jelenléte az élesztő gazda sejt genomjában hatékony környezetet teremt a transzformáció detektálására a triptofán távollétében történő növekedés útján.

Az élesztő vektorokban alkalmazható promoter szekvenciák közé tartoznak a metallotionein, a 3-foszfoglicerát kináz (Hitzeman és mtsai., 1980, „J. Bioi. Chem.”, 255: 2073) vagy más glikolitikus enzimek (Hess és mtsai., 1968, „J. Adv. Enzyme Reg.’’, 7:149; ésHolland és mtsai., 1978, „Biochemistry”, 17:4900), például enolázok, glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piroszőlősav dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glukóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piroszőlősav kináz, trióz-foszfát izomeráz, foszfoglukóz izomeráz és glikokináz promoterei. Az élesztővel végzett expresszióhoz használható további vektorok és promoterek felsorolása található például a 73 657 számon közrebocsátott európai szabadalmi be9

HU 204085 Β jelentésben.

Mas promoterek, amelyek járulékos előnye a növekedési körülményekkel kontrollált transzkripció, az alkohol dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savas foszfaíáz, a nitrogén metabolizmussal kapcsolatos degradációs enzimek és a fent említett metallotionein és gliceraldehid-3-foszfatáz dehidrogenáz, valamint a maltóz és galaktóz hasznosításáért felelős enzimek promoterei. Alkalmas expressziósplazmidokkialakítása során az ezekkel a génekkel asszociált terminációs szekvenciákat is az expressziós vektorba Egáljuk, az mRNS poliadenilezése és atermináció biztosítása céljából.

A mikroorganizmusokon kívül soksejtű szervezetekből származó sejttenyészetek is felhasználhatók gazda szervezetként. Ez azonban nem tekinthető előnyösnek, tekintettel a limfotoxin expressziójához eddig használt mikroorganizmusokkal kapott nagyszerű eredményekre. Elméletileg bármely magasabbrendű eukariotikus sejttenyészet felhasználható, akár gerincesekből, akár nem gerincesekből származik. Az érdeklődés azonban nagyobb agerinces sejtekiránt, és a gerincesek sejtjeinek (szövettenyészeteknek) szaporítása az utóbbi években rutin eljárássá vált (Tissue culture, Academic Press, Kruse és Patterson, Ed. 1973.). Alkalmas gazda sejtvonalak például a VERŐ és a HeLa sejtek, a kínai hörcsög ovariumából kapott sejtvonalak (CHO) és a W138, BHK, COS-7 és MDCK jelű sejtvonalak. Az ilyen sejtekhezhasználható expressziós vektorokáltalában (ba szükséges) tartalmaznak egy replikációs origót a kifejezni kívánt géntől felfelé elhelyezkedő promotert, egy riboszóma kötőhelyet, egy RNS kapcsolódó helyet (ba intront-tartalmazó genommal rendelkező DNS-t használunk), egy poliadenüezett helyet és egy transzkripció terminációs szekvenciát.

A transzkripciós és a transzlációs kontroll szekvenciák a gerincesekből származó sejtek transzformálására használt expressziós vektorokban gyakran vírus forrásokból származnak. így például széles körben alkalmazott promoterek származnak a polyoma-ból, Adenovírus 2-ből és legelőnyösebben a Simian Vírus 40-ből (SV40). Akorai és későipromoíerekkülönösen azért hasznosak, mert mindkettő könnyen kinyerhető a vírusból olyan fragmens formájában, amely az SV40 vírus replikációs origóját is tartalmazzák (Fiers és ² mtsai., 1978, „Natúré”, 273: 113). Kisebb vagy nagyobb SV40 fragmensek is alkalmazhatók, feltéve, hogy tartalmazzák a Hind H helytől a Bgl I hely felé eső, mintegy 250 bp hosszúságú szekvenciát, mely utóbbi hely a vírus replikációs origójában helyezkedik í el. Ezenkívül lehetséges és gyakran kívánatos is az olyan humán genom promoter, kontroll és/vagy szignál szekvenciák felhasználása, amelyek a limfotoxinnal vannak kapcsolatban, feltéve, hogy ezek a kontroll szekvenciák kompatibilisek a gazda sejt rend- 55 szerekkel·

A replikációs origó létrejöhet úgy, hogy a vektort úgy konstruáljuk, hogy tartalmazzon egy exogén őrigint, amely például az SV40-ből vagy más vírusból származhat (például Polyoma, Adenovírus, VSV vagy 60

BPV), vagy a gazda sejt kromoszomális replikációs mechanizmusából eredhet. Ha a vektort a gazdasejt kromoszómájába integráljuk, gyakran elegendő az utóbbi. A limfotoxint aminoterminális metíonil nél5 kül, a magasabb eukariota sejtek humán pre-Iimfotoxin DNS-sel végzett transzformálása útján állítjuk elő. Amikor a limfotoxint és a dihidrofolát reduktáz (DHRF) egyaránt kódoló DNA szekvenciákat tartalmazó vektorokkal végrehajtott transzfekcióhoz vá10 lasztunk előnyösen alkalmazható emlős gazdasejteket, alkalmasan a sejtek kiválasztása az alkalmazott DHRF protein típusánakmegfelelően történik Ha vad típusú DHRF proteint alkalmazunk, előnyösen olyan gazdasejtet választunk, amelyből hiányzik a DHRF, ilymódon megengedve a DHRF kódoló szekvencia markerként való felhasználását, a sikeres transzfekció kimutatására olyan szelektív közegben, amelyből hiányzik a hipoxantin, glicin és timidin. Ebben az esetben alkalmas gazdasejt a kínai hörcsög ováriumából (CHO) kinyert sejtvonal, amely nem mutat DHRF aktivitást, és amelynek előállítása Urlaub és Chasink módszerével (1980., ,Proc. Nat. Acad. Sci.” (USA) 77: 4216) történik.

Másrészt, ha a metotrexáttal szemben kis kötési af5 finitást mutató DHRF proteint kódoló DNS-t használunk kontroll szekvenciaként, nincs szükség DHRF rezisztens sejtek alkalmazására. Miután a mutáns DHRF rezisztens azMTX-re, az MTX tartalmú tápközeg felhasználható a szelekció eszközeként, feltéve, hogy maguk a gazda sejtek MTX érzékenyek. A legtöbb MTXabszorbeálásán alkalmas eukariota sejt metotrexát érzékeny. Egy ilyen hasznos sejtvonal a CHO vonal, CHO-Kl (ATCCNo. CCL61).

A transzformált gazdasejtek olyan sejtek, amelye5 két rekombináns DNS technika alkalmazásával konstruált limfotoxin vektorokkal transzformáltunk vagy transzfektáltunk. A transzformált gazdasejtek rendszerint limfotoxint fejeznek ki. A kifejezett limfotoxin általában intracellulárisan gyűlik össze.

) Alimfotoxint a nem-szekretáló sejtekrekombináns tenyészetéből általában a sejtek lizisével, majd a darabos anyag centrifugálásával vagymás alkalmas módon történő eltávolításával különítjük el. A limfotoxint szekretáló sejteket a szupematánsból centrifugálással i különítjük el. Aszennyezettlimfotoxin oldatot ezután a fent ismertetett módon, az immunaffinitás alapján tisztítjuk, Alimfotoxint olyan tisztaság eléréséig tisztítjuk, amely megfelel a gyógyászati felhasználás követelményeinek, majd szokásos dózis-formákban, pél¹ dául ampullák vagy fecskendők formájában szereljük ki.

A limfotoxin variánsok elegeit, azaz citotoxikus mutáns limfotoxin speciesek elegyeit alkalmazzuk. A limfotoxint hosszú időtartamú tároláshoz előnyösen liofilizáljuk, vagy stabilizátorok és vivóanyagok felhasználásával vizes oldatba, például izotóniás sóoldatba visszük, és az Aggarwal és munkatársai által a 100641 számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetettmódon adagoljuk a betegeknek.

A limfotoxin készítményeket daganatos megbete10

HU 204085 Β gedésben szenvedő állatoknak adagoljuk. Az adagolás módja a szokásosan alkalmazott eljárásokat követve, lehet például intravénás, intraperitoneális, szubkután, intramuszkuláris, intraléziós infúzió vagy szeril limfotoxin injekciós oldatok alkalmazása, vagy a későbbiekben ismertetendő, késleltetett hatóanyagleadást biztosító készítmények adagolása. Mint említettük, a limfotoxin intralezionálisan, azaz közvetlenül a szilárd daganatba juttatott injekció formájában is alkalmazható. Disszeminált tumorok, így például leukémia esetében előnyösen intravénás adagolási módot választunk vagy a nyirokrendszerbe juttatjuk a készítményt. A hasi szervek daganatait, így például a petefészek rákos megbetegedését előnyösen intraperitoneális infúzió alkalmazásával kezeljük, a peritoneális dialízis eszközeit és a peritoneummal összeférhető oldatokat alkalmazva. Rendszerint azonban a limfotoxint folyamatosan, infúzió formájában alkalmazzuk, bár nagy egyszeri adag beadására alkalmas injekciós készítmények is rendelkezésre állnak,

A limfotoxint legkedvezőbben egy implantálható, késleltetett hatóanyagleadást biztosító gyógyászati eszköz közvetítésével juttatjuk a beteg szervezetébe. A limfotoxin dimerek és trimerek molekulatömegének megfelelő méretű proteinek esetében alkalmas rendszerekpéldául azL-glutaminsav és gamma etil-Lglutamát kopolimerjei [U. Sidman és mtsai., 1983, „Biopolymers” 22(1): 547-556], a poli(2-hidroxi-etilmetakrilát) [R. Langer és mtsai., 1981 „ J. Biomed. Mater. Rés. 15:167-277 és Langer, 1982, „Chem. Techn. „ 12, 98-105] vagy az etilén-vinil-acetát (R. Langer és mtsai., inhid.). A limfotoxint tartalmazó eszközöket azokra a sebészeti helyekre implantáljuk, amelyekről a tumort kimetszették. Alternatív megoldás, hogy a limfotoxint félig áteresztő mikrokapszulákba vagy liposzomákba zárva injektáljuk a tumorba. Ez az adagolási mód különösen előnyös sebészetüeg el nem távolítható tumorok, például agydaganatok esetében.

A limfotoxin dózisa függ például az adgolás módjától, a kérdéses daganattól és a beteg állapotától. A kezelőorvos feladata, hogy úgy állítsa be a dózist és válassza meg az adagolási módot, hogy a kezelni kívánt tumorral szemben a maximális citotoxikus aktivitás mutatkozzék. Ehhez segítséget nyújthat a tumorból próbakimetszéssel vett minta vizsgálata vagy a rák markereknek ismert diagnosztikus eszközök, így a karcinoembrionikus antigén alkalmazása. A dózis megállapításánál figyelembe kell venni, hogy magas dózisoknál toxicitás léphet fel. Egereken a rekombináns limfotoxin dózisa általában 50-200 μg/testsúly kg/nap intravénás adagolás esetében. Ez a dózis lényegében nem volt toxikus, ugyanakkor in vivő hatásosnakmutatkozott. Természetesen a dózis különböző állatok esetében eltérő lesz.

Limfotoxint semlegesítő antitest létrehozására is módszert adunk. A semlegesítő ellenanyag olyan ellenanyag, amely olyan módon képes a találmány szerint definiált limfotoxin immunológiai megkötésére, hogy a citosztatikus vagy citolitikus limfotoxin aktivitás tesztekben lényegesen csökkent hatást mutató anyaghoz vezet. Ilyen teszt például az L929 patkányteszt. Az a tény, hogy az ellenanyag képes a limfotoxin aktivitás semlegesítésére, nem jelenti, hogy az ellenanyagnakközvetlenül a limfotoxin aktív vagy receptor kötési helyeihez kell kapcsolódnia. Az ellenanyag akkor is jelentősen lecsökkentheti a limfotoxin aktivitását, ha sztérikusan egy olyan tartományhoz kötődik, amely a kritikus hellyel szomszédos, azaz konformációsán szomszédos, ami nem jelent feltétlenül az aminosav szekvencia szempontjából szomszédos helyzetet.

A limfotoxin hatását közömbösíteni képes monoklonális ellenanyag keresése közben úgy találtuk, hogy nehéz úgy immunizálni egereket, hogy a limfotoxint semlegesítő ellenanyag az állatokban keletkezzék vagy fejlődjék. Sem a limfoblasztoid limfotoxinnal, sem a glutáraldehiddel térhálósított limfotoxinnal végzett immunizáció nem eredményezett kimutatható semlegesítő ellenanyagot az immunizált egerek szérimában, jóllehet az egerek az enzim immunovizsgálattal kimutathatóan nem-semlegesítő anti-limfotoxin ellenanyagot kifejlesztettek. A limfotoxin-alum (alumínium-hidroxid vagy alumínium-oxid, A1₂O₃.3H₂O) adszorpciós komplexszel végzett immunizáció azonban semlegesítő ellenanyag keletkezéséhez vezet még olyan állatok esetében is, amelyek az alum komplexszel végzett immunizáció előtt nem generálták az aktivitást. Az alum készítése és felhasználása az ellenanyag termelésében a következő helyen szerepel: C. Williams, és mtsai., eds., 1967, Methods in Immunologyandlmmunochemistryl. 197-229.

Egerek mieloma sejtjeivel semlegesítő ellenanyagot termelő állati eredetű lépsejteket fuzionálunk. Átlagosan 50-100 kiónt kell megvizsgálni, míg egy olyant találunk, amelyben semlegesítő ellenanyag szintetizálódik. A vizsgálati eljárás rutin módszer és minimális kísérletezéssel reprodukálható.

Immunizált állatok szérumát, plazmáját vagy IgG funkciót, valamint immunizált állatok lép- vagy nyiroksejtjeiből származó hibridomák által kiválasztott immunoglobulinok egyaránt felhasználhatók a találmány céljára. Egy előnyös megoldás szerint a semlegesítő ellenanyagot lényegében más anti-limfotoxin ellenanyagtól mentesen, hibridoma tenyészetben kapjuk.

A semlegesítő ellenanyagot nagy felületű anyagokon történt felületi adszorpcióval immobilizáljuk, Ilyen anyagok lehetnek például hőre lágyuló műanyagok, mint a polisztirol.Másik lehetőség az immobilizálásra, hogy az ellenanyagot kovalens kötéssel kötjük meg olyan mátrixokon, mint például a ciano-bromiddal aktivált Sepharose. Miután az ellenanyag semlegesítő ellenanyag, valószínűleg cssak a biológiailag aktív limfotoxint vagy fragmenseit fogja abszorbeálni vagy detektálni. Az ellenanyag különösen hasznos immunoradiometrikus (szendvics”) immunvizsgálatoknál, egy nem-semlegesítő anti-limfotoxin monoklonális ellenanyaggal vagy egy olyan poliklonális antiszérummal kombinálva, amely nem-semlegesítő anti-limfotoxínt tartalmaz. Az immunvizsgálat során vagy a

HU 204085 Β semlegesítő vagy a nem-semlegesítő ellenanyagot használjuk jelzett komponensként, és a jelzés történhet egy detektálható anyag, például egy fluorescens, keminumíneszcens vagy radioizotóp anyag segítségével, a technika állása szerint ismert módon eljárva. Kompeptitív típusú Iimfotoxin immunvizsgálatoknál ugyanígy történik a jelzés. A Chloramin-T radíojódozás mind a Iimfotoxin, mid a Iimfotoxin ellenanyag preparátumokban felhasználható, de eljárhatunk KJ. Klostergaard és munkatársai (”MoI. Immun.” 18:455 /1980/)módszereszerintis.

A példák egyszerűsítése érdekében bizonyos gyakran előforduló módszereket rövidítéssel fogunk jelölni.

A plazmidok jelölése mindig tartalmaz egy kis „p” betűt, amelyet nagybetűk és/vagy számok előznek meg és/vagy követnekÁkiinduIásipIazmidokakereskedelemben kaphatók, minden megszorítás nélkül, vagy ilyen, hozzáférhető plazmidokból kiindulva publikált módszerek szerint könnyen előállíthatók. Ezen felül más, ekvivalens plazmidok is ismertek, és szakember számára nyilvánvalóan felhasználhatók a találmány céljára.

Az „emésztés kifejezést aDNS-selkapcsolatban a DNS-nek egy olyan enzim segítségével történő katalitikus hasítása jelölésére használjuk, amely enzim a DNS-t csak bizonyos, adott helyeken hasítja. Az ilyen enziméketresírikciós enzúnekneknevezik, és azokat a helyeket, amelyekre az egyes enzimek specifikusan hatnak, restrikciós helyeknek A „részleges” emésztés restrikciós enzimmel végzett, nem teljes emésztést jelöl, azaz olyan esetet, amikor a körülményeketúgy választjuk meg, hogy a DNSszerkezet nemminden olyan helyen hasad fel, amelyre az adott restrikciós endonukleáz specifikus. A különböző, a találmány szerinti eljárásban használt eljárásban használt restrikciós enzimekkereskedelmiforgalomban kaphatók, és reakciókörülményeik, ko-faktoraik és más, a felhasználással kapcsolatos útmutatások a gyártók által adott használati utasításokból bárkinek rendelkezésre állnak A ² restrikciós enzimeket rendszerint egy nagybetűvel kezdődő jellel látják el, hogy a nagybetűt más betűk, majd általában egy számköveti, mely utóbbi azt amikroorganizmust képviseli, amelyből a restrikciós enzimet eredetileg kinyerték Általában 1 pg plazmidot ^z vagyDNSfragmentumothasználunkkörülbelül 1 egység enzimmel és körülbelül 20 pliter puffer oldattal együtt. Az egyes restrikciós endonukleázokhoz alkalmas puffer és szubsztrát mennyiségeket szintén a gyártó specifikálja. Azinkubáció általában 37 °C-on 1 £ órán át történik, de a szállító instrukcióinak megfelelően változhat. Inkubáció után a proteint fenollal és kloroformmal végzett extrakcióval eltávolítjuk, és az emésztett nukleinsavat etanollal kicsapjuk a vizes frakcióból. Esetenként a restrikciós enzimmel végzett 5 emésztést a terminális 5’-foszfátok lúgos foszfatáz hidrolízise követi, hogy ezzel megakadályozzuk a DNS fragmentum két restrikciós enzimmel hasított végének cirkularizációját vagy azt, hogy a két vég olyan zártburkotképezzen, amely megakadályozná egy má- 6 sikDNS beépítését a restrikciós helynél. Ha csak másként nem említjük, a plazmidok emésztését nem követi az 5’-termináIis defoszforilezés. A defoszforilezéshez használt eljárások és reagensek szokásosak (Γ.

Maniatis és mtsai., 1982, Molecular CIoning, 133134).

Egy adott DNS fragmentum .kinyerése” vagy „izolálása” egy restrikciós emésztésselkapottrendszerből az emésztéssel kapott anyagpoli(akril-amid) gél elekt10 roforézissel végzett elkülönítését, a kívánt fragmentum azonosítását mozgékonyságának összevetése útján ismert molekulatömeg marker DNS fragmentumokéval. A kívánt fragmentumot tartalmazó gél rész eltávolítását, és a gél és a DNS elkülönítését jelenti. Ez 5 az eljárás széles körben ismert. Például a következő helyen kerül ismertetésre: R. Latra és mtsai., 1981, „Nuceleic Acids Rés.” 9:6103-6114 és D. Goeddel és mtsai., 1980, „Nucleic Acids Rés.” 8:4057.

A „Southern analízis” olyan módszer, melynél egy ;0 emésztéssel kapott elegyben vagy DNS-tartalmú készítményben a DNS szekvenciák jelenlétét egy ismert, jelzett oligonukleotiddal vagy DNS fragmentummal végzett hibridizáció útján igazoljuk. A találmány esetében, hacsak másként nem említjük, a Southern ana5 lízis az emésztéssel kapott elegy 1%-os agarózon végzett elkülönítését, denaturálását és nitrocellulózra történő átvitelét jelenti, E. Southern, 1975,, J. Mól. Bioi.” 98:503-517módszerével, amit a T.Maniatis és mtsai., 1978. „Cell” 15: 687-701 eljárásával végre0 hajtott hibridizáció követ.

A „Transzformáció” azt jelenti, hogy egy DNS-t úgy juttatunk be egy mikroorganizmusba, hogy ott a DNS szaporodni legyen képes, akár extrakromoszomábs elemként, akárkromoszomális integrátumként.

Hacsak másként nem említjük, erre a célra a Mandel sé mtsai., 1970, „J.MoLBiol.”55:154 általleírtE. coli

Caa₂-os módszert használjuk.

A „ligáció” a foszfodiészter kötések létrehozását jelenti két kettős szálú nuklemsavfragmentum között 1 (T. Maniatis és mtsai., Id., 146). Hacsak másként nem említjük, a ligációt ismert pufferek felhasználásával, 0,5 pg, megközelítőleg ekvimoláris mennyiségben vett, ligáiul kívánt DNS fragmentumra számítva 10 egység T4 DNS Iigázt (hgáz”) alkalmazva, i A DNS „elkészítése” a transzformánsokból a plazmid DNS izolálását jelenti a mikroorganizmus tenyészetből. Hacsak másként nem említjük, Maniatis és mtsai (Id. 90) alkáli/SDS módszerét használjuk. Az „oligonukleotidok” rövid hosszúságú egyes- vagy kettősszálú polidezoxinukleotidok, melyeket az 1. példában megadott módszer szerint kémiailag szintetizálunk, majd poli(akril-amid) gélen tisztítunk.

Valamennyi irodalmi hivatkozás a bejelentés szervesrészét képezi.

1. példa

A Iimfotoxin tisztítása és székvenálása

Az RPMI-1788 humán Iimfoblasztoid sejtvonalat (ATCC CCL-156) 151-es lombikban 4xl0⁵ sejt/ml sejt sűrűség eléréséig növesztettük, szérummentes

HU 204 085 Β táptalajt használva (RPMI-1640). A limfotoxin mennyiségét az alapszinthez képest 10-20-szorosra növeltük (500-1000 limfotoxin egység/ml a későbbiekben megadott módon meghatározva), a szérummentes RPMI-1640 táptalajhoz 20 mg/ml forbol-mirisztátot adva. 65 órás tenyésztés után a sejteket szűréssel összegyűjtöttük, és a szűrletből az aktív limfotoxint kontrollált pórusméretű üveg gyöngyökkel töltött (Electronucleunics) 5 cm x 20 cm-es oszlopon különítettük el, melyet 5 mmólos foszfát puuferról (pH 7,4) hoztunk egyensúlyba, és etilén-glikol 50%-os, 5 mmólos foszfát pufferrel (pH 7,4) készült oldatával eluáltuk. A mikroviális növekedés megakadályozására a tisztítás során minden pufferhez egy proteáz inhibitort, 0,1 mmól/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) és 1 mmól/1 nátrium-azidot adtunk. Azu üveggyöngyökön átjuttatott eluátum 84 000 egység limfotoxint tartalmazott egy mg proteinre számítva. Ezt követte a DEAE cellulóz kromatográfia, a Lentil Lectin Sepharose (Pharmacia) kromatográfia, és a preparatív, natívPAGE, a B. Aggarwal és munkatársai által leírt módon (1984, „J. Bioi. Chem.” 259(1): 686691) végrehajtva. A citotoxikus aktivitásért felelős protein homogenitását SDS-PAGE fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerrel Lichrosorb RP-18 oszlopon és amino-terminális szekvenálással határoztuk meg.

Ez a limfotoxin készítmény több, mint 95 tömeg%, megközelítőleg 25 000 molekulatömegű (SDS-PAGE) amino-terminális limfotoxint tartalmazott. Az N-terminális leucil species proteinkomponensének elméleti molekulatömege 18 664 dalton, a különbség (mintegy 6500 dalton) az Asn+62 helyen levő glikozil oldalláncának és talán más, O-hez kapcsolt cukor maradékoknak tulajdonítható. A szövettenyészet felülúszó fázisa vélhetően ennek a species-nek a multimerjeit (TSKHPCL-vel meghatározva 60 000 Da vagy Sephadex G100 oszlopon végzett kromatografálással 64 000 Da) tartalmazta.

A limfotoxin elegy fennmaradó 5%-a körülbelül 20 000 molekulatömegű N-terminális hisztidü species volt. Mindkét species lényegében ugyanazt a citolitikus aktivitást mutatja, legalábbis a későbbiekben leírt patkány fibroblaszt sejt lízis vizsgálati módszerben jelenlevő ingadozások által meghatározott határok között.

Az inakt limfotoxin molekulák tripszines emésztése csak néhány fragmentumhoz vezetett. A hisztidil amino-terminális limfotoxin emésztésével két fragmentumot kaptunk a 89 és 90 aminosav helyzetek között, míg a leucü amino-terminális tripszines emésztés négy fragmentumot eredményezett, ahol a hasítás a 16 és 16,19 és 20 és 89 és 90 pozíciók között következett be.

Az Edman-féle degradációs technikával végzett mikroszekvenálás az érintetlen molekula szekvenciájáról és a tripszines emésztéssel kapott fragmentumokról is információt adott.

A szekvenciáról további információt nyertünk a karboxipeptidáz P-vel, kimotripszinnel és ecetsawal végzett emésztéssel és cián-bromidos hasítással kapott limfotoxin fragmentumok segítségével. Ezzel a módszerrel a humán limfotoxinnak csaknem a teljes szekvenciáját meghatároztuk. Az amino-terminustól kiindulva 156 szomszédos maradékot határoztunk meg. Ebből a szekvenciáról szerzett információból nyilvánvaló volt, hog a két lifotoxin species közötti különbség annak tulajdonítható, hogy a leucil aminoterminális speciesben 23 amino-terminális maradékok vannak, amelyek hiányoznak a hisztidil aminoterminális speciesből. Az első három maradék mögött karboxi-terminális szekvencia meghatározása nehéznek bizonyult, néhány ebben a régióban előforduló peptid-kötés és a maradékok hidrofób jellege következtében.

Olyan szintetikus gént terveztünk, amely a mikroszekvenálással meghatározott mértékig a kívánt protein szekvenciát kódolja. A gén tervezésénél figyelembe vettük az E. coli kodonok gyakoriságát, azaz E. coli által ritkán használt kodonokat nem használtuk a szekvenciában. Ahol E. coli szempontjából ilyen korlátozások nem álltak fenn, humán kodonokat alkalmaztunk. Ezeket a változtatásokat az E. coli-ban lejátszódó expresszió elősegítésére hajtottukvégre, de úgy, hogy a szintetikus gén azért felhasználható legyen a humán cDNS vagy genom könyvtárakban a természetes DNS szekvencia azonosítására. Az Xbal, BamHI, Hindin és Gblíl egyedi restricldós helyeket olyan szekvencia formájában terveztük, hogy segítsék a fragmentumok felépítését, és lehetővé tegyék a gén további manipulációját.

A szintetikus limfotoxin gén céljára tervezett 58 eredeti oligomert szilárd fázisú foszfit módszerrel szintetizáltuk (M. Matteucci és mtsai., 1981, „J. Amer. Chem. Soc. 103: 3185-3190 és S. Baucage és mtsai., 1981, „Tét. Letters” 22:1859-1862).Azoh'gomerek mérete 16 és 20 bázis között változott, amint azt az 1A ábra mutatja. Az oligomerek között 6 bázis hosszúságban voltak átfedések, amelyeket egyedinek terveztünk, a teljes gént az 1.B ábrán bemutatott módon állítottuk össze.

A gént három külön részből konstruáltuk. Az első, A szegmens 117 bázispár hosszúságú volt, és a leucil amino-terminális species amino-terminális végének az 5’ kódoló tartományát képviselte. A B szegmens a lifotoxin molekula középső részét kódoló DNS-t képviselte, és 145 bázispár hosszúságú volt. A C fragmens 217 bázispár hosszúságú volt, és 16 aminosavmaradék kivételével a limfotoxin karboxi-terminusának valamennyi aminosavat kódolta. A szegmensek szintéziséhez szükséges eligomereket elektroforézissel tisztítottuk, majd összegyűjtöttük. Az egyes oligomereket azért választottuk viszonylag rövidnek (16-20 bázis), hogy csökkentsük a szintézis során fellépő hibát.

Az oligomerek mindegyik csoportját 20 mmól/1 Trix-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 20 mmól/1 ditio-treitolt, 0,5 mmól ATP-t és 15 egység T4 polinuldeotid kinázt tartalmazó elegyben, 50 μΐ-es térfogatban foszforileztük, és mindegyik oligomerből körülbelül 50 mól-t megtartottunk az elegyben. 30 perces 37 °C-on végzett reagáltatás után a reakcióele13

HU 204085 Β gyet 65 ’C-ra melegítettük,, hogy megszűntessük a kinéz aktivitást, majd hagytuk lassan, egy óra alatt lehűlni 20 ’C-ra. A foszforilezett oligomereket ezután 10egységT4DNSIigázhozzáadásávalligáltuk,majd2 órán át 20 ’C-on folytattuk a reakciót. Ezután a DNS ligázt hőkezeléssel dezaktiváltuk, majd a ligáit oligomereket 3 órán át 37 ’C-on ólyanrestrikciósendonukleázokkal emésztettük, amelyek felismerték a tervezett terminális helyeket (azazXbal ésBamHIhelyeket az A szegmens esetében). Az egyes szegmensek fragmenseit 7%-os poli(akril-amid) gélen végzett elektroforézissel izoláltuk. Minden szegmens esetében etidium-bromiddal végzett színezéssel, majd gélből történő elektroelucióval elkülönítettük a megfelelő mozgékonyságú fragmentumokat. pHtrp69-et (D. Goeddel és mtsai., 1980, .Natúré” 287:411-416 vagy Crea és mtsai., 0048970 számú európai szabadalmi bejelentés) Xbaí és BamHI-el emésztettünk, és a nagy vektor fragmentumot 6%-os poli(akril-amid) gélen végzett elektroforézissel izoláltuk. Mintegy 50 mg A szegmenst a BamHI és HindlHhelyeke emésztett pBR322beligáltunk, és a Cszegmenst aHindlir és GblHhelyeken emésztett pLeIFA-125-l-be ligáltuk (D. Goeddel és mtsai., 1980, ,Nuc. AcidsRes.” 8; 4057-4073). A

Iígálással kapott reakcióelegyeket E. coli ATCC 31446-ba transzformáltuk, és a kapott rekombináns plazmidokat restrikciós endonukleáz analízissel és Maxam és Gilbert kémiai degradációs módszerével végzett DNS szekvenálással jellemeztük. Az A szegmens hat kiónjából öt tartalmazta a megtervezett szekvenciát. Négy B szegmens és négy C szegmens plazmidot izoláltunk, és azt találtuk, hogymindezekaz inszertek a helyes szekvenciát tartalmazták. Az egyes szegmenseket olyan restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel izoláltuk, amelyek felismerték a terminális helyeket, majd az Xbaí és BglH helyeken emésztett pHtrp69 vektorhoz ligáltuk. A kapott, pLTXBl jelű rekombináns plazmidot az inszertált Xbal-BglH framentum szekventálásával jellemeztük. A fragmentum az 1A ábrán bemutatott szekvenciát tartalmazta.

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk, hogy a szintetikus gén valóban biológiailagaktívlimfotoxint foge termelni, azE. coli pLTXBl transzformánsokat minimális táptalajon, olyan körülmények között növesztettük, amelyek lehetővé teszik a trp promoter derepresszálását és a szintetikus limfotoxin gén expresszióját. A tenyészeteket 1,0 optikai sűrűségűnél 550 nmen növesztettük, és centrifugálással gyűjtöttük össze. Asejteket 1/10-nyi térfogatban szuszpendáltuk, majd 1 ultrahangos kezeléssel elroncsoltuk.

A limfotoxin aktívitástB. Spofford, 1974, „J. Immunoi. 112:2111 módosított sejt-roncsolásos módszerével határoztuk meg. Ehhez egerek L-929 f ibrobIaszt sejtjeit mikrotiter lemezeken, aktinomicin D je- í lenlétében növesztettük. 12-18 óra múlva minden egyes tenyészethez a limfotoxinra vizsgálni kívánt hígítási sorozatából hozzáadtunk 0,125 ml-t. 18 óra múlva a lemezeket lemostuk, és meghatároztuk a sejtek limfotoxin által kiváltott elroncsolódását, a leme- € zeket 1:4 térfogatarányú metanol/víz eleggyel készült

1%-os kristályibolya oldattal színeztük. Az elszíneződés intenzitását vizuálisan és spektrofotometriás úton egyaránt megfigyeltük, az utóbbi esetben Dynatech i spektrofotométerrel a 450 nm-en mért abszorpciót és

570nm-en mért transzmisszióthatározva meg. Amikrotiter edényben, kizárólag táptalajjal befedett sejtek esetében 0%-nak vesszük a roncsolást, míg a 3 mólos guanidin-hidroklorid oldattal fedett sejtek jelentették a végpontot, azaz a 100%-os roncsolást. Egy egység limfotoxint úgy definiálunk, hogy ez az a mennyiség, amely az egyes edényekben lefedett 12000 sejt 50%os roncsolásához szükséges. Megjegyezzük, hogy a citotoxikus aktivitás mérésére más módszereket is hasz5 nálhatunk. Például ilyeneket ismertetnekB. Aggarwal és munkatársai a „Thymic Hormones and Lymphokines, 1983, ed. A Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington Univ. Medical Center publikációban. Az ebben a közleményben em• lített A549 sejtvonal az ATCC törzsgyűjteményben CCL 185 számon van letétbehelyezve.

A tenyészetekből kapott lizátumok nem mutattak érzékelhető citolitikus aktivitást egér sejt vizsgálati módszerrel nézve. A gamma interferont kifejező tenyészetekből kapott kontroll lizátumok nem mutattak gamma-interferon aktivitást. Ez az eredmény arra utal, hogy a szintetikus gén nem kódolt aktív limfotoxint. Erre több lehetséges magyarázatot is találtunk. Például: 1) azE. coli degradálta alimfotoxint, 2) a limfotoxin gén nem íródott át azE. coli-ban, 3) a limf otoxin üzenetnem transzlálódott azE. coliban, 4) a protein, protein szekvenálási hibából, nem tartalmazta a megfelelő szekvenciát, vagy 5) a 16 maradék karboxi terminális szekvencia vagy ennek egy részlete szükséges volt az aktivitáshoz vagy a limf otoxin molekula helyes felépítéséhez.

2. példa

Limfotoxint kódoló cDNS létrehozása

Humán perifériás vér limf ociták nem-adherens sejt frakciójának tenyészetéből RNS-t izoláltunk, 48 órával a forbol-mirisztát-acetáttal (10 ng/ml), Staphylococcus enterotoxinB-vel (1 ;ig/ml) és timozin α-1-gyel (S. Berger és mtsai., 1979, „Biochemistry” 18:51435149) végzett indukció után. Ez a tenyészet 400 egység limfotoxin aktivitást produkált a felülúsző 1 miére számítva. Az mRNS-t immobilizált oligo dT-hez történő adszorpcióval koncentráltuk, eluáltuk, és reverz transzkripció segítségével (P. Gray és mtsai., 1982, .Natúré” 295:503-508) cDNS-t készítettünk.

A hírvivő DNS c-DNS-sé alakítására, az irodalomban ismert módszerek alkalmazásával reverz transzkriptázt használtunk, Klenow kezeléssel egy második szálat készítettünk (szintén standard eljárással), és a cDNS-t a hajtű hurok eltávolítása céljából S-l nuldeázzal kezeltük. Annak érdekében, hogy ez a cDNS beépíthető legyen egy vektorba, a végeit egy adapterhez vagy linkerhezkapcsoltukúgy, hogy 5’ és 3’restrikciós enzim helyek, vagy—előnyösen — egy előre meghatározott restrikciós enzim helyhez alkalmas kohéziós

HU 204085 Β végek jöjjenek létre. Erre a célra az

5’ HO-ATTCATGCGTTCTTACAG GTACGCAAGAATGTO-P 5’ oligonukleotidot használtuk. Az oligonuldeotidot a cDNS-hez ligáltuk, és a cDNS-t poli(akril-amid) gél elektroforézissel ismét izoláltuk. Az XgtlO fágot, amely kereskedelemben hozzáférhető, vagy ekvivalensét, a Xgtll fágot, amely az ATCC törzsgyűjteményben van deponálva, EcoRI-vel emésztettük, és a kapott lineáris fragmentumot visszanyertük (M. Wickens és mtsai., 1978, „J. Bioi. Chem.” 253: 24832495). A kapcsolt reverz transzkriptumot és a XgtlO emésztésével kapott anyagot ligáltuk, és a ligációs elegyet használtuk az E. coli C-600 vagy más, ismert, λ fág infekcióra hajlamos gazda transzfektálására. Körülbelül 10 000 rekombináns fágot egy 15 cm-es lemezre helyeztünk, és a „kis-erejű „plaque hibridizációs módszerrel” (”low-stringency plaque hybridization method”, T. Maniatis és mtsai., 1978, „Cell” 15:687701 és P. Gray és mtsai., „PNAS” 80: 5842-5846) vizsgáltuk, ³²P-ral jelzett próbát készítve az 1 Aábrán bemutatott A szegmensből, J. Taylor és mtsai., 1976 „Biochem. Biophys. Acta” 442: 324-330 módszerével, borjú timusz DNS primerek felhasználásával (PL Biochemicals). A duplikát nitrocellulóz szűrőket a „low stringency” módszerrel hibridizáltuk, 20%-os formamidban, 5xl0⁷ cpm értéken. A szűrőket kétszer 0,3 mólos nátrium-klorid oldattal, 0,03 mólos nátrium-citráttal és 0,1%-os nátrium-dodecil-szulfonáttal (SDS) 37 °C-on mostuk.

Két fág plaque hibridizált a próbával, a plaque-okat tisztítottuk, majd mind az A szegmensből származó próbával, mind a B szegmensből készített próbával hibridizáltuk. A két hibridizáló fág cDNS inszertumait, a XLTl-et és a XLT2-t Ml 3mp8-ba klónoztuk, majd a didezoxi lánc terminációs módszerrel szekvenáltuk (A. Smith, 1980, „methods in Enzymology” 65:560580). ALT2-ben az inszertum csak körülbelül 600 bp hosszúságú volt, és nem tartalmazta a teljes, 3’ limfotoxint kódoló tartományt. A XLTl-ben az inszertum a leucil-amino-terminális limfotoxin teljes kódoló tartományát, és a 650 bp-s 3 ’ nem-transzlált tartományát (amely egy poliadenilező jelet tartalmaz) és a leucil terminálishoz 18 aminosavból álló amino-terminális kodonjait tartalmazta. Miután ez még nem a teljes limfotoxin kódoló tartomány, a ALTI cDNS inszertumából további ³²P-ral jelzett próbát készítettünk, amelyet felhasználtunk további 25 000 rekombináns XgtlO fág tesztelésére (T. Huynh és mtsai., 1984, Practical approaches inBiochemistry IRL Press, Oxford). Tizenkét további hibridizációs fágot izoláltunk, és a XLTll-ből származó leghosszabb inszertum szekvenciáját a 2 A ábrán mutatjuk be. A leghosszabb nyitott leolvasási fázist az első megfigyelt ATG-től kiindulva transzláltuk. Az egyes sorok feletti számok az aminosavak helyzetére vonatkoznak, míg a vonalak alatti számok a nukleotid helyzetet jelölik. Az „Γ’-el jelölt leucil-maradék a leucil amino-terminális limfotoxin első maradék szekvenciája (1A ábra), és egyben valószínűleg a limfotoxin érett speciesének első aminoterminális maradéka. Az első 34 maradék szignál szekvencia. A 156-171 maradékokat nem sikerült meghatározni a limfotoxin protein szekvenciálisával, ehelyett a nukleotid szekvenciából számítottuk ki.

3. példa

Hibrid szintetikus gén/természetes cDNS expressziós vektor konstrukciója leucil amino-terminális limfotoxinhoz

A konstrukciót a 2.B ábrán szemléltetjük. Az inaktív szintetikus gént tartalmazó pLIXBl-et EcoRI-vel és Pstl-vel részlegesen emésztettük, és egy a limfotoxin 125 N-terminális maradékát kódoló 658 bp-s fragmentumot különítettünk el. Részleges Pstl emésztést azért végeztünk, mert a 10 maradékban egy további Pstl hely is jelen van (1 Aábra). ALTI szuh-klónozott cDNS-ének EcoRI-velés Pstl-vel (ezek a helyek a 2 A ábrán az 554 és 855 nukleotid pozícióknál láthatók) végzett emésztésével egy 301 bp hosszúságú fragmentumot izoláltunk, amely a limfotoxin C-terminális 51 aminosavát kódolja. A fragmentumokat 5%-os poli(akril-amid) elektroforézissel és elektroelucióval izoláltuk. A fragmentumokat pBR322-höz ligáltuk, amelyet EcoRI-el emésztettünk, és bakteriális alkálikus foszfatázzal defoszforiieztünk, hogy csökkentsük a háttér transzformánsok számát. A kapott, pLTtrpl expressziós plazmidot a helyes orientáció és szekvencia szempontjából restrikciós endonukleázzal végzett emésztéssel és DNS szekvenciálissal jellemeztük. A leucil amino-terminális limfotoxint őgy fjeztük ki, hogyE. coli 31446-otpLTtrpl-el transzformáltunk, és a transzformánsokat tetraciklint tartalmazó közegben 37 °C-on 4-6 órán át tenyésztettük, egészen addig, amíg 1,0-es OD-t nem értünk el. A sejt törmelék citotoxikus aktivitást mutatott. Azt találtuk, hogy a kifejezett limfotoxin species leucil amino-terminálisát egy védett metionil-maradék helyettesíti. Valószínű, hogy e szintézis terméke nem annyira metionil-, inkább formil-metionil-species.

4. példa

A limfotoxin immun-affinitáson alapuló tisztítása

Anti-limf otoxint kiválasztó egér monoklonális sejtvonalat (8. példa) egerekben növesztettünk, majd ioncserélő kromatográfiával megtisztítottuk a hasi folyadéktól. Az anion-cserélőről lejött eluátumot cián-bromiddal aktivált Sepharose gyantára vittük tovább, mg/ml gyanta mennyiségbn. Egy 20 ml-es oszlopot egymás után TBS-sel (összetétel: 0,05 mól Tris-HCl, pH 7,0, 0,15 mól nátrium-klorid és 2 mmól EDTA), eluciós pufferrel (0,1 mól ecetsav. pH 4,5,150 mmól nátrium-klorid) és végül TBS-sel egyensúlyba hoztuk. A pLTtrpl-transzformait E. coli ultrahangosán kezelt sejttörmelék 40% telített vizes ammónium-szulfáttal kapott csapadékát (melyet előzetesen centrifugálással tisztítottunk), 0,1 mól Tris-HCl-ben (pH 7,4) és 5 mmól EDTA-ban szuszpendáltuk, majd egy oszlop térfogat/óra sebességgel kromatográfiás oszlopra vittük fel. 0,05% Tween-20-at tartalmazó TBS-sel vég15

HU 204 085 Β zett intenzív mosás után a specifikusan kötött anyagot a zeluciós pufferrel eluáltuk, a pH-t azonnal 7,8-ra állítottuk beO.l térfogat 1 mólos Tris-HCl segítségével (pH 8,5), és az anyagot 4 ’C-on tároltuk. A tisztított limfotoxin fajlagos aktivitása 2-10x10⁷ egység/mg volt, afenti egérL-929vizsgálattalmeghatározva.

Az eluátum az oszlopra felvitt aktív anyag legnagyobb részét tartalmazta. A teljes eluált protein mennyiség zöme redukáló és nem-redukáló körülmények között egyaránt egyetlen sávot adva migrált, SDS-poli(akril-amid) gél elektroforézis során. A sáv mozgékonysága megközelítőleg 18 000 mt., ami összhangban van a nem-glukozilezett leucil ammo-terminális limfotoxinra a dedukcióval meghatározott aminosav szekvencia alapján várt 18 664 mt. értékkel. Biológiai aktivitása további jellemzése céljából a tisztított limfotoxin citoliökus aktivitását in vitro, és antitumor aktivitását in vivő vizsgáltuk.

5. példa

A rekombináns limfotoxin in vivő biológiai aktivitása

Arekombináns és limfoblasztoid limfotoxint in vivő tumor nekrózis tesztben vizsgáltuk. Alkalmas egerekben (RALB/C x C57B1/6A vagy CBŐfl) MethA(a) szarkómát hagytunknövekedni 7-10 naponkeresztül, majd a tumorokba közvetlenül a 4. péld aszerint előállított limfotoxint, limfoblasztoidlimfotoxint (melyet a fenti módon állítottunk elő és tisztítottunk) illetve kontroll mintákat injektáltunk. 20-24 óra múlva az egereket megltük, a daganatokat eltávolítottuk és hisztológiailag értékeltük a szövetelhalás mértékét. Mint az 1. táblázatban látható, mind a rekombináns, mind a limfoblasztoid limfotoxin jelentős szövetelhalást okozott MethA(a) szarkómákban.

1. táblázat

SzövetelhaIásMethA(a) szarkómában in vivő, rekombináns és természetes limfotoxin hatására

Kezelés	Az egerek száma a szarkőma nekrózis mértéke
+++	++	+ -
puffer 1 kontroll Iimfoblasztoidlimfotoxin	-	-	-	3
25000 egység Hmfoblasztoidlimfotoxm.	4	—
10 000 egység rekombinánslimfötoxin	4	—
200000 egység rekombináns limfotoxin	14	2	2
25000 egység rekombináns limfotoxin	3	—		1
10 000 egység	3	-	1	-
puffer2kontroll	-	-	-	9

A limfoblasztoid limfotoxint a „puffer l”-hen oldva injektáltuk. A puffer 1 összetétele: 0,01 mól TrisHCI, 0,05 mól/1 (NH^HCOg, pH= 8,0. A rekombináns limfotoxin feloldására a „puffer 2-t használtuk, amelynek összetétele: 0,15 mól/I nátrium-klorid, 0,1 mól/1 nátrium-acetát és 0,1 mól/1 Tris-HCl, pH=7,8.

Az, hogy a szénhidrát rész hiányzik a rekombináns limfotoxinrólnemlátszikhefolyásolniabiológiai aktivitást, mert a rekombináns kultúrában termelt limfotoxin aktivitása (2-10xl0⁷ egység/mg) megközelítőleg megegyezik a limfoblasztoid limfotoxinra közölt értékkel (4xl0⁷ egység/mg).

A rekombináns limfotoxin aktivitása ezen kívül éppúgy hőre érzékenynek mutatkozott, mint a természetes limfotoxiné, azaz vizes oldatban, 80 °C-on 1 óránát végzettmelegítés hatására maktiválódott.

6. példa

Expressziós vektor konstrukcója metionil hisztidil anúno-temánális limfotoxinhoz

Egy olyan plazmid felépítését, amely E. coli-han a metionil hisztidil ammo-terminális limfotoxin expresszióját irányítja a 3. ábrán szemléltetjük. A plazmidba szintetikus oligonukleotidot inszertáltunkúgy, hogy a hisztidil amino-terminális limfotoxin hisztidil Radonja mellett egy iniciátor metionin kodont kódoljon (a 2A ábrán a 24. maradék). Ezt úgy hajtottuk végre, hogy a pLTtrpl-ből Xbal-el és Clal-el végzett emésztéssel egy 4630 hp-s vektor fragmentumot izoláltunk, preparatív 1%-os agaróz gél elektroforézis és elektroelució segítségével. pLTtrpl-ből ugyanezen az úton egy a limfotoxint kódoló szekvencia legnagyobb részéttartalmazó570hphosszúságúBanHI-CIaIfragmentumot is izoláltunk. A korábban tárgyalt módszerekkel két szintetikus oligonukleotidot szintetizáltunk (ezeket a 3. ábrákon mint 13-mert és 15-mert mutatjuk be), majd ezeket az 1A ábra 6,7,52 és 53 oh'gonuldeotidjeivel vegyítettük. Az egyes oligonuldeotidok mintegy 50 pmol mennyiségét az 1. példában leírt módon polinuldeotid kinázzal kezeltük. Az oligonukleotidokat hőkezeltük, majd az 570 bp BamHI-Clal fragmentum és a 4630 bp Xbal-Call vektor fragmentum elegyével lígáltuk. A Iigálással kapott elegyet E. coli ATCC 31446 törzsbe transzformáltuk, és a re16

HU 204 085 Β kombinánsokat a tetraciklin-rezisztencia alapján válogattuk ki. Az egyik transzfonnánsból a p20KLT jel plazmidot különítettük el. Ezt a plazmidot restrikciós enzim és DNS szekvencia analízis alapján jellemeztük. 7. példa

Citotoxikus limfotoxin fúziós variáns előállítása

Egy a limfotoxm struktúra génjével szomszédos helyen bakteriális szignál szekvenciát kódoló szekvencia klónozáásval olyan plazmidot állítottunk elő, amely a limfotoxm és egy bakteriális protein fúziós termékét kódoló DNS-t tartalmaz. AzE. coli hőre stabil Enterotoxin Π (STT) termékét kódoló gén szekvenciáját meghatároztuk (R. N. Picken és mtsai., 1983, „Infection and Immunity” 42: 269-275). Az STH szekrécióját az E. coli plazma körüli terébe egy 23 aminosavból álló szignál szekvencia kódolja.

ApWM501 plazmid tartalmazza (Picken és mtsai., „Infection and Immunity” 42(1): 269-275) a hőre stabil enterotoxin (SIH) gént. Az SIR gént kódoló DNS egy részét pWM501 -bői a következő eljárással különítettük el. A pWM501-et Rsal-el emésztettük, és az 550 bp-s DNS fragmentumot izoláltuk. Ezt a gén fragmentumot az M13mp8 fághoz (J. Messing és mtsai., Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, Ed. A Walton, Elsevier, Amsterdam (1981) 143-153) ligáltuk, melyet előzőleg Smal-el emésztettünk. A ligáit DNS-t használtuk az E. coli JM 101 transzformálásához, ahol az utóbbi egy az Ml 3 taggal együtt használható, a kereskedelmi forgalomban beszerezhető törzs. A tiszta plaque-okat elkülönítettük. A kettős szálú M13mp8 SIH Rsa származékot az ezzel a fággal infektált E. coli JM101 törzsből szokásos eljárásokkal izoláltuk. (J. Messing és mtsai. korábban idézett munkája). Az ismertetett M13mp8 gént tartalmazó, körülbelül 550 bp hosszúságú fragmentumot egy sor, a fág által biztosított különféle restrikciós endonukleáz hely fogja körülvenni. Az M13mp8 SIH Tsa származélcot ezután EcoRI-vel és Pst I-el emésztettük, és egy az 550 bp méretet kissé meghaladó nagyságú DNS fragmentumot izoláltunk.

Az EcoRI-PstI fragmentumot pBR322 vektorba szubkíónoztuk. Ez úgy történt, hogy a pBR 322-t EcoRl-el és Pstl-el emésztettük, és a vektort izoláltuk. Az izolált vektort az EcoRI-PstI DNS fragmentumhoz ligáltuk. Ezt a DNS elegyet használtuk az E. coli ATCC 31446 transzformálására, és a tetraciklin rezisztenciát mutató kolóniákatszelektáituk. A plazmidot egy rezisztens E. coli kolóniából izoláltuk, és pSTH-résznek neveztük el.

A pSlH-résztMnlI-vel és BamHI-el emésztettük, és egy az SIH Shine-Dalgamo szekvenciát, az SIH szignál szekvenciát és az érett SIH gén első 30 codonját tartalmazó, 180 bp hosszúságú fragmentumot izoláltunk. A 180 bp hosszúságú DNS fragmentumot egya trp promotert tartalmazó plazmidhoz ligáltuk. Egy ilyen plazmidot, a pHGH207-l-et korábban ismertettünk (H. deBoer és mtsai., 1982, „Promoterss Structure and Functíon, Eds. R, Rodrequet és mtsai., Chamberlain, Praeger Pub., New York, NY, 462-481). Ebben a példában e plazmádnak egy származékát, a pHGH207-l* plazmidot, amelyben a trp promoterhez az EcoRI helyet rezisztens EcoRI* hellyé alakítottuk DNS polimeráz I-el (DNS pol I) végzett feltöltéssel, és a tompa végek ligálással történő összekötésével (S. Cabilly és mtsai., 1984, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA” 81: 3273-3277) használtuk. A trp promotert tartalmazó plazmidot Xbal-el emésztettük, és DNS pol I-el és mind a négy dNIP-vel kezeltük, a túlnyomó szekvencia feltöltése céljából. A DNS készítményt ezután BamHI-el emésztettük, és a vektort tartalmazó fragmentumot izoláltuk. Ezt a vektor fragmentumot azután a 180 bp-s SIH szignál-tartalmú, a fentiekben izolált DNS fragmentumhoz ligáltuk. A kapott elegyet használtuk fel az E. coli ATCC 31446 ampicillin rezisztenssé tételére. Egy SlH-irányítónak nevezett plazmidot izoláltunk az ampicillinérezisztes kolóniából.

Egy SIH kódoló szekvenciákat tartalmazó M13 fágot hoztunk létre úgy, hogy a pSlH-irányító 180 bp Xbal-BamHI fragmentumát az Xbal és BamHI helyeken emésztett M13mpl0-hez ligáltuk. A kapott fág DNS, a pSTÍI-”shuttle” (inga) jellemzése restrikciós endonukleáz analízissel és nukleotid szekvenálással történt. Ezután LT (limf otoxim) kódoló szekvenciákat építettünk be ebbe a vektorba úgy, hogy pLTtrpl HpalEcoRI 700 bp fragmentumát a Smal-ÉcoRI helyeken emésztett pSTH-shittle replikatív formájú DNS-éhez ligáltuk (RF, kettő szálú); a Smal és Hpal helyek tompa végűek és egymáshoz ligálíak (mely mindkét hely elvesztéséhez vezet). A kapott DNS fágot (M13-SIHLT) ezután a kővetkezőképpen jellemeztük, majd használtuk mutagenezisre: A primer 5’ p CAATGCCTATGCACTGCCAGGCGTAGG-t kinázzal kezeltük, majdligáz puffer jelenlétében a templáttal (M13STU-LT) és az Xbal-EcoRI-al emésztett M13mpl0 RF DNS-sel kevertük el (a DNS feltöltése céljából, lásd J.P.Adelman és mtsai., 1983, DNA, 2:183-193); az elegyet 95 °C-ra melegítettük, majd szobahőmérsékleten, 30 percen át hőkezeltük, és 30 percre jégre helyeztük. Ezután hozzáadtuk mind a négy dezoxinuldeotid-trifoszfátot, az ATP-t, T4 DNS ligázt és az E. coli DNS polimeráz I úgynevezett nagy (Klenow) fragmentumát. Az elegyet 1 órán át 14 °C-on inkubáltuk, majd kereskedelmi forgalomban kapható E. coli JM101 tözs transzfekíálására használtuk, de megjegazdaként. A helyesen mutagenizált fágot ³²P-radioaktív jelzett primer felhasználásával, hibridizációs módszerrel azonosítottuk. Akapott, ST-LT-mut fágot DNS szekvencia analízissel jellemeztük. Ebből a tágból replikatív formájú DNS-t készítettünk, és ezt használtuk egy 761 bp-s Xbal-EcoRI fragmentum izolálására, amely a leucil amino-terminális limfotoxin kódoló szekvenciája mellett az STU szignál szekvenciának megfelelő DNS-t tartalmazta. Ezt a DNS-t XbalBamHI emésztett p20KLT-vel (a nagy 4285 bp vektor fragmentum) és a pBR322 375 bp-s Eco-BamHI fragmentumával ligáltuk. A kapott pST18LT plazmidot

HU 204085 Β restrikciós technikával és DNS szekvenálással jellemeztük. Hasonlóképpen létrehoztunk egy olyan szerkezetet, amely ahisztidil amino-terminális limfotoxin hisztidilmaradéka és azSHE szignál amino-terminális fúzióját kódolta. A kapott plazmidokat E. coli ATCC í 31446-batranszformáltukApSTLT18 és apSTLTló plazmidokat kinyertük. Ezek a restrikciós ezim analízis és a didezoxi szekvenálás szerint igazoltan kódolják a STU fó'ziót. A pSTLT18 vagy pSTLTló plazmidokkal transzformált E. coli STU szignál szekvencia 1 < fúziókathozlétrealeucil amino-terminális és ahisztidil amino-terminális Iimfotoxinnal, ami összhangban van a gél elektroforézissel meghatározott molekulatömeggel. Az ezeket a fúziós proteineket tartalmazó E. colilizátumokcitotoxikus aktivitástmutatnak. 1 í

o.példa

A limfotoxin semlegesítésére alkalmas monoldonális paíkány (egér) antitest előállítása

Az l.példábankapotttisztítottlimfoblasztoidlim- 2( fotoxint foszfát puffért tartalmazó telített vizes konyhasó oldat (PBS) felhasználásával dializáltuk. A diali2átumhoz glutár-aldehidet adtunk, 70 mmól glutár-aldehid koncentrációban, az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk további glutár-aldehidet ad- 2S tünk, egészen 140 mmól teljes koncentráció eléréséig, az inkubálást további 6 órán át folytattuk, majd az elegyet PBS-sel dializáltuk. 50 pg glutár-aldehiddel térhálósított límfotoxmt ( a továbbiakban: polilimfotoxin) és 0,5 ml Freund-féle teljes adjuvánst szubkután 30 úton BALB/c egerekbe injektáltunk. Egy hét múlva az egereket immunizáltuk, félig intramuszkulárisan adott, félig a hasüregbe juttatott 50 pg polilimfotoxin és 0,5mlFreund-félenem-teljes adjuváns elegyével. 7 nap múlva összegyűjtöttük a szérumot, majd a iimfo- 35 toxin aktíviíástELISA vizsgálattal ellenőriztük.

Az ELISA vizsgálatot a következőképpen végeztük: Tisztított limfotoxin puffereit oldatát mikrotiter szondákba helyeztük, és hagytuk, hogy ezeket egyenként kb. 100 ng limfotoxin bevonja. A nem-adszorbe- 40 ált limfotoxin oldatot lecsapoltuk. 50 pl alkalmasan hígított vizsgálati mintát 100 pl, 5 mg/ml szarvasmarha szérum aibumint tartalmazó PBS-sel (PBS-BSA puffer) elegyítettünk, és az elegyet hozzáadtuk az egyes szondákhoz, majd 2 órán átszobahőmérsékleten 45 inkubáltuk, 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel mostuk, majdmindenszondához 100 pl torma peroxidázzal jelzett kecske anti-egérlgG PBS-BSA pufferrel készült oldatát adtuk, és az egészet egy órán át inkubáltuk. A szondákat 0,05% Tween 20-at tartalmazó 50 PBS-sel, majd 0,1 mg/ml o-fenilén-diamint tartalmazó citrát-foszfát pufferrel (pH 5) (szubsztrát oldat) mostuk, és ezután hozzáadtunk szondánként 10 ml szubsztrát oldatra számítva 4 pl 30 tf %-os hidrogénperoxidot A szondákat 30 percen át inkubáltuk, a re- 55 akciót 50 pl 2,5 mólos kénsav-oldattal leállítottuk, és 492 nm hullámhossznál meghatároztuk az abszorpciót. Az 1 OD.-nél nagyobb abszorpciőtmutató edényeket anti-limfotoxmpozitívnakmínósítettük Azt is megvizsgáltuk, hogy a minták mennyire ké- 60 pesek a limfotoxin citolitikus hatásának semlegesítésére L929 egér (patkány) kísérletekben. Az immunizált állatokból vagy hibridoma felülúszókból nyert szérumot kívánság szerint 10% magzati szarvasmarha 5 szérumot és ml-enként kb. 100 limfotoxin egységet tartalmazó RPMI-1640 táptalajjal hígítottuk, ésL929 sejtek tenyészetét tartalmazó mikrotiter szondákba helyeztük. A vizsgálatot a citolízis vizsgálatok szokásos körülményei között végeztük. A kontroliban min10 den sejt elroncsolódott. A semlegesítő ellenanyag jelenlétét az jelezte, hogy ilyenkor a limfotoxin nem roncsolta el azL929sejteket.

Az állatokat glutáraldehiddel polimerizált limfotoxinnal immunizálva a létrejött antitestek aktívnak 15 mutatkoztak azELISA vizsgálatban, de szérum semlegesítő hatást nem sikerült kimutatni.

100 pgümfotoxinból és 1 ml 1,64%-os (tf.) alummium-hidroxíd (A1/OH7₃) szuszpenzióból szuszpenziót készítettünk, amelyet ugyanannak az egérnek az im20 munizálására használtunk Az egérnek 100 pl szuszpenziót adtunk intramuszkuláris injekció formájában, majd 400 μΙ-t intraperítoneálisan. Egy hét elteltével az egeret intravénás injekció formájában 10 pg nem-polímerizált és nem-adszorbált limfoblasztoid 25 limfotoxin 100 pl PBS-sel készült oldatával kezeltük. Az állati szérum 1/80-as hígításával végzett vizsgálat 3 nap múlva kimutatta a limfotoxint semlegesítő ellenanyagjelenlétét.

Az állat lépét eltávolítottuk. 3xl0⁷ lép sejtet 5xl0⁷ 30 egér (patkány) mieloma sejttel elegyítettünk, majd mikrotiter szondákba helyeztük, melyet HAT táptalajt és körülbelül 3000 periotoneális makrofágot tartalmaztak A vizsgált során S. Fazekas, De St. Sroth, 1980, ,J. immunoi; Meth.” 35,1-21, eljárást követ35 tűk A fenti ELISA vizsgálatban pozitívnak talált szupematánsokat tartalmazó szondákat 1 ml DMEM táptalajonnövesztettük, amely tartalmazott 20% magzati borjú szérumot, 10 t% NCTC-135 táptalajt, 5xl0⁵ mól béta-merkapto-etanolt és 10 t% HAT táptalajt, 40 majd úgy osztottuk el a mikrotiter szondák között, hogy az egyes szondákba statisztikus átlagban egy sejt kerüljön, majd a tenyésztést ugyanannak a táptalajnak 1 vagy 5 ml térfogatában folytattuk Ezután megvizsgáltuk a felülúszókban a semlegesítő ellenanyag 45 jelenlétét. Statisztikusan körülbelül az ELISA tesztben pozitívnak talált hibridomák kb. 2%-a szintetizált semlegesítő ellenanyagot. Ha szükséges, a nagy affinitásé limfotoxin ellenanyagot kiválasztjuk a hibrídomáknak ebből a csoportjából.

9.példa limfotoxin hely-specifikus mutagenezise Ebben a példában pontosan a 3. példában ismertetettmődon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a színlelő tikus oligonuldeotid 6. szegmensét úgy módosítottuk, hogy az 5’CTCAACTCTGCACCCA3’ szekvenciát tartalmazza, míg a komplementer szál 53. szegmensét 3 AGACGTGGGTCGTCGT5’ szekvenciára módosítottuk ’0 A módosított oligonuldeotidokat a többi oligonuk18

HU 204085 Β leotidhoz kapcsoltuk, és a 6. példában ismertetett módon expressziós vektorhoz ligáitok. A vektor egy 2 bp helyettesítést tartalmazott, a lizin +28 kodontlizinről hisztidinre változtatta. AhisztidinmutánstE. coli ATCC 31446 transzformációjával fejeztük ki.

Más helyzet-irányított mutánsokat ugyanilyen módon készítettünk, előnyösen úgy szelektálva a kodonokat, hogy ne vigyünk be egy olyan EcoRI restrikciós helyet, amely részleges EcoRI restrikciós emésztést tenne szükségessé a pLTXBl emésztése során. A 3. példában leírtakhoz hasonlóan. A mutációknak nem szabad további Xbal vagy BamHI helyeket sem eredményezniük az, A fragmentumban” (1.B ábra), BamHI vagy Hindin helyeket a „B fragmentumban” illetve Hindin illetve BglII helyeket a C fragmentumban. Ellenkező esetben részleges emésztést kell végezni ahhoz, hogy a pLTXBl mutánshoz jussunk; a teljes emésztés a kívánt szúbsztitúciós mutáns helyett inkább a deléciós mutánst eredményezné.

10. példa

A genom DNS kódolásának azonosítása

Egér vagy szarvasmarha limfotoxin; az egér és a szarvasmarha limfotoxin aminosav szekvenciája.

Az egér és szarvasmarha limfotoxin géneket genom-λ könyvtárakból izoláltuk. A humán limfotoxin cDNS fragmentumát (PvuH-EcoRI, 600 bp) nicktranszlációval ³²P izotóppal jeleztük, majd ezt használtok próbaként az egér genom DNS-λ könyvtár (M600 egér genom DNS kCharon4A-ban, T. Maniatis és mtsai., Molecular Cloning, 31,1982), és függetlenül egy szarvasmarha genom DNS könyvtár (88622A számú közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) szkrinelésére. A hibridizálást „low stríngency” módszerrel, 20%-os formamidban végeztük (Gray és Goeddel, „P.NA.S. USA” 80: 5842-5846 /1983/), és a szűrőket kétszer 0,3 mólos vizes nátrium-ldorid, 0,03 mólos vizes nátrium-ciírát és 0,1%-os SDS-sel mostok. Néhány a humán limfotoxin próbával hibridizált fágot plaque tisztítással tisztítottunk (T. Maniatis és mtsai., „Cell” 15: 687-701 /1978/), restrikciós endonuldeázokkal emésztettünk, és Southern hibridizációval analizáltunk. Egy 3500 bp-s EcoRI egér DNS fragmentum és egy 2200 bp-s EcoRI szarvasmarha DNS fragmentum hibridizált a humán limfotoxin próbával. Ezeket a DNS fragmentumokat átklónoztok a pBR322 plazmidba, majd a didezoxi lánc-terminációs módszerrel meghatároztok az aminosav szekvenciát (A.J.H. Smitth,Meíhods in Enzymology, 65:560-580/1980/). Az egér és szarvasmarha limfotoxin dedukált protein szekvenciáját, a humán limfotoxinéval összehasonlítva a 4. ábrán mutatjuk be.

11. példa

A limfotoxin expressziója élesztőn, az ADH promoter ellenőrzése mellett pLTtrpl plazmidot Xbal-el emésztettünk, hogy a plazmidot a limfotoxin start kodonnal éppen szomszédos Xbal helynél felnyissuk. Az Xbal kohéziós végeket azE.coliDNSpolimerázIKlenowfragmentuma segítségével, négy dNTP jelenlétében tompa végűvé tettük.

A következő EcoRI adaptert ligáltuk a tompa végű plazmidhoz:

OH

5’AATTCCCGGG 3’

3’GGGCC-P5’, a túlnyúló 5’ hidroxil véget polinukleotid kinázzal foszforileztük, a ligációs elegyet E. coli ATCC 31446 törzs transzformálására használtok, és restrikciós analízissel egy olya npLTtrplRl plazmidot azonosítottunk, amely a limfotoxin start kodonnal szomszédos helyzetben egy további EcoRI helyet tartalmaz. A pLTtrplRl plazmidot izoláltuk, EcoRl-el emésztettük, és a limfotoxin DNS-t tartalmazó SP fragmentumot kinyertük.

A pERPn plazmidot (60 057 A számú közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) EcoRI-el emésztettük, a recirkularizáció elkerülésére alkái-foszfatázzal kezeljük, az SP limfotoxin fragmentumhoz ligáltuk T4 DNS Ilgáz felhasználásával, és a ligációs elegyet E. coli ATCC 31446 törzs transzformálására használtok fel. Az ampicillin rezisztens kolóniák két olyan plazmid sorozatot eredményeznek, amelyekbe naz SP inszertum agaróz elektroforézis gélen végrehajtott restrikciós analízissel meghatározva ellenkező orientációt mutat. Az E. coli transzformánsokból a plazmídokat megtisztítottuk, majd trpl mutációt tartalmazó élesztő (például az RH218 élesztő törzs, ATCC 44076) trp⁺ fenotípusossá alakítására használtuk. Azok a plazmidok, amelyekben az SP fragmentum start kodon ja az alkohol dehidrogenáz promoter fragmentum mellett helyezkedik el, a kísérletek szerint limfotoxin expresszióra késztetik az élesztőt. A limfotoxint kinyertük az élesztő transzformáns k extraktumából. Nagyüzemi fermentáció során a plazmid stabilitása javítható egy olyan expressziós plazmid felhasználásával, amely a pERPn kromoszomális replikációs origó helyett (ars 1) a 2 mikronos replikációs origót tartalmazzák, egy kompatibilis törzzsel kombinálva (J. Beggs, 1978, „Natúré” 275; 104:109).

12.példa

Limfotoxin expresszió emlősök sejtjeiben

XLTll-et (2. példa) EcoRI-el emésztettünk, és a limfotoxint tartalmazó DNS fragmentumot (a reverz transzkriptumot) kinyertük. A pEHR. plazmidot (117 060 A számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) EcoRI-el emésztettük, borjú intesztinális alkáli foszfatázzal kezeltük, és a XLTll linket cDNShez ligáitok.

A kapott, E. coli ATCC 31446 törzsön (117 060 A számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) növesztett plazmídokat pEHERLT I-nek és pEHERLT H-nek nevezzük. A plazmidok a limfotoxin DNS-t poli(akril-amid) gélen végzett restrikciós analíket a plazmidokat használjuk a CHO DHFR-DUXBll, CHO (ATCC 00L61) és Ltk sejtek transzfektálására és szelektálására.

A szövettenyészet sejtjeit transzfektáltok úgy,

HU 204085 Β hogy 1 pg pEHERLT I-et vagy p-EHERLT Π-t, melyek a fenti módon készültek, 10 pg patkány hordozó DNS-sel, 250 pl 0,25 mólos kalcium-kloriddal elkeverjük, majd hozzácsepegtetünk 250 pl HEPES-el pufferolt konyhasó-oldatot (280 mmól MaCl, 1,5 mmól Na₂P0₄, 50 mmól HEPES, pH 7,1). 30 perces tárolás után szobahőmérsékleten, az oldatot 60 mm átmérőjű műanyag edényekben növesztett szövettenyészetekhez adjuk. CHO 1, CHO DBFR-DUX-B11 és Ltk sejteket használunk. Az edények 3 ml, a gazda sejtnekmegfelelő táptalajt tartalmaznak.

CHO 1 és CHO DHER.-DÜX-B11 sejteknél a táptalaj Ham F-12 táptalaj (Gibco) volt, amelyet 10% borjú szérummal, 100 pg/ml penicillinnel, 100 pg/ml sztreptomicinnel, és 2 pmmól L-glutaminnal egészítettünk ki. AzLtk' sejtvonal esetén a táptalaj a Dulbecco által módosított Eagle-féle táptalaj (DMEM), melyet afentimódon egészítettünkki.

3—16 óra múlva a táptalajt eltávolították, és asejteket 20%-os, foszfáttal puffereit konyhasó oldattalké- í szült glicerollal mostuk. Minden edénybe friss táptalajt adunk, és a sejteket 2 további napon át inkubáltuk.

Atranszfektált gazda sejtek szelekciójátúgyvégeztük, hogy a sejteket 2 napos növesztés után tripszineztük (ez abból áll, hogy a sejteket 0,2 mg/ml EDTA-t 2 tartalmazó 0,5mg/mlkoncentrációjú steril tripszinnel kezeltük), és 10 mm átmérőjű szövettenyészetekhez, melyeket szelektív táptalajjal készítettünk, körülbelül 3xl0⁵ sejtet adtunk, dhfr' sejteknél a táptalaj egy F12 GIBCO táptalaj, melyből hiányzik a glicin, ahipox- 3 tantin és a timidin (GHT^- táptalaj). A DHFR+ gazda sejteknél a metotrexátot adták (100-100 nmól) a növesztéshez használt normál táptalajhoz. Kontrollként plaTnnid nélkül éspFD-í I plazmiddal (117 060Aszámon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) 3i (amely normál DHFR-t tartalmaz) végzett kísérletek szolgáltak. A sejtekből 1-2 héten belül kifejlődtek azok a kolóniák, amelyek a DHFR plazmidot felveszik és kifejezik. A transzformánsok természetes limfotoxintfejeztekki. 4(

Claims (16)

1. l.EIjárás limfotoxin előállítására, azzal jellemezve, hogy 4(

   I. valamely pronarióta, élesztő vagy emlős gazdasejtet transzformáinak egy olyan replikálható vektorral, amely a 2A. ábra aminosavszekvenciájával bíró Iimfotoxxt vagy ennek olyan variánsait kódoló nukleinsavat tartalmaz, amely variánsokban egyes 5C aminosavgyökök más aminosavgyökökkel vannak helyettesítve, vagy amelyekből valamely aminosavgyök ki van iktatva, vagy amelyekbe valamely aminosavgyök be van iktatva, és amelyek aminosav-szekvenciájában az aminosavak legfeljebb 65 10%-a tér el a limfotoxin aminosav-szekvenciájától, és a variánsok még limfotoxin-aktivitást mutatnak;

   H. a transzformált gazdasejtet tenyésztik és a tenyészetben alimfotoxinthagyjákfelgyülemleni; és 60

   IH. a limfotoxint a tenyészetből kinyerjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nuídeinsavat tartalmazó vektorral transzformálunk, amelyhumán limfotoxintkódol.

   5
3. 3. Az 1. igéynpont szerinti eljárás, ű2za/je//emezve, hogy olyan nukleinsavat tartalmazó vektorral transzformálunk, amely mentes a 284. és 285. nuldeotidok közötti introntóL
4. 4. Az 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jel10 lemezve, hogy nukleinsavként cDNS-t tartalmazó vektorral transzformálunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nukleinsavat tartalmazó vektorral transzformálunk, amely valamely limfotoxin-variánst kódol.

   í 5
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariótákban replikálható vektorral transzformálunk.
7. 7. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőben vagy emlős állati sejttenyészetben rep!0 Iikáiható vektorral transzformálunk.
8. 8. Az 1. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformálunk, amely valamely bakteriális promotort is tartalmaz működőképesen kapcsolva alimfotoxint kódoló nukieinsavhoz.

   5
9. 9. Az 1. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformálunk, amely bakteriális kiválasztó vezető és limfotoxin fúziós termékétkódolóDNS-ttartalmaz.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez0 ve, hogyvaktorkéntpLTtrpl-gyeltranszformálunk.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként p20KLT-vel transzformálunk.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként prokarióta sejtet transzformá3 lünk
13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogygazdasejtként élesztő vagy emlős sejtet transzformálunk.
14. 14. Eljárás monoklonális anti-limfotoxin antitestek ) előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely melegvérő állatot immunizálunk valamely 1-13. igénypont szerint előállított limfotoxint vagy limfotoxin-variánst — ahol a variánsok az 1. igénypont jellemző részében leírt jelentéssel búnak—az állatba juttatva, az állatból i az antitestet termelő sejteket kinyerjük, míeloma sejtekkel fúzionáljuk, a megfelelő antitesteket termelő sejteket szelektáljuk, tenyésztjük, majd a keletkezett antitestet ismert módon kinyerjük, és kívánt esetben jelezzükés/vagyimmobilizáljuk.

    ¹
15. 15. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestet valamely kimutatható anyaggal jelezzük, vagy immohilizáljuk.
16. 16. Eljárás limfotoxin elkülönítésére valamely keverékből, azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerint előállított antitestet a keverékkel érintkezésbe hozva a limfotoxint az antitesten adszorbeáljuk, majd az antitest-adszorbeált limfotoxin komplexet a keverékből elkülönítjük, végül a limfotoxint az antitesttől elválasztjuk.