PL155410B1 - Method of obtaining lymphotoxins - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 155 410 POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr-Zgłoszono: 85 05 31 (P. 253739)

Int. Cl.⁵ C12P 21^/02 C12N15/28

Pierwszeństwo: 84 05 31 dla zastrz. 1,3

Stany Zjednoczone Ameryki

05 09 dla zastrz. 2

Stany Zjednoczone Ameryki

Zgłoszenie ogłoszono: 86 03 11

Opis patentowy opublikowano: 1992 04 30

Twórcy wynalazku: Bharat B. Aggarwal, Timothy S. Bringman, Patrick W. Gray, Glenn E. Nedwin

Uprawniony z patentu: Genentech Inc., South

San Francisco (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania limfotoksyn

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania limfotoksyn i jej pochodnych.

Limfotoksyna jest określana jako czynnik biologiczny działający na komórki neoplastyczne. Aktywność limfotoksyn wytworzonych przez limfocyty stymulowane mitogenem jest związana z aktywnością cytotoksyczną, taką jak działanie cytostatyczne na pewne linie komórek rakowych i działanie cytolityczne na inne komórki transformowane. Jednak limfotoksyny nie działają wcale, lub działają tylko w niewielkim stopniu na normalne linie komórkowe. Te selektywne właściwości limfotoksyn spowodowały podjęcie badań in vivo, sugerujących, że limfotoksyny maję silne działanie przeciwrakowe.

Termin limfotoksyna jest stosowany dla określenia pewnej grupy cząsteczek, zidentyfikowanych jako glikoproteiny i podzielonych pod względem masy cząsteczkowej na pięć grup, z których każdajest niejednorodna pod względem ładunku cząsteczek. W większości supernatantów limfocytowych dominują limfotoksyny klasy alfa (o masie cząsteczkowej 70000-90000 i klasy beta (o masie cząsteczkowej 25000-50000). Klasę alfa można podzielić, ze względu na ładunek cząsteczek, przynajmniej na 7 podklas, a klasę beta na dwie podklasy. (G. Granger i inni, wyd. Mozes i inni, 1981, Cellular Responses to Molecular Modulators, str. 287-310). Zidentyfikowano również kompleksy limfotoksyn) o masie cząsteczkowej powyżej 200000), oraz formy gamma limfotoksyn) o masie cząsteczkowej 10000-20000). Różne formy i klasy limfotoksyn różnią się od siebie stabilnością i kinetyką pojawiania się w hodowli. Co więcej, mogą one w warunkach małej siły jonowej tworzyć agregaty. Stwierdzono, że limfotoksyny należące do klasy o niższej masie cząsteczkowej są mniej stabilne i wykazują niższą aktywność lityczną niż limfotoksyny o wyższej masie cząsteczkowej. (Hiserodt i inni, 1976. „Celi Immun, 26,211; Granger i inni, DeWeck i inni, 1980, Biochemical Characterization of Lymphokines, str. 279-283). Limfotoksyny klasy gamma nie są dokładnie zbadane ze względu na ich niestabilność (G. Granger i inni, 1978, „Cellular Immunology 38, 388-402). Limfotoksyny klasy beta są również niestabilne (Walker i inni, „J. of Immun“ 116 (3), 807-815, 1976).

155 410

Należy podkreślić, że terminologia dotycząca limfokin jest niejednorodna. Obecnie nazwy nadawane produktom hodowli komórkowej w znacznej mierze odnoszą się do funkcji komórek, które wytwarzają te produkty i do zachowania tych produktów w próbach biologicznych. Produkty są słabo scharakteryzowane, ponieważ wiele badań prowadzi się przy użyciu preparatów częściowo oczyszczonych, i niespecyficznych testów. Prawdziwa identyfikacja różnych czynników cytotoksycznych nie może być przeprowadzona ze względu na brak znanej terminologii opartej na wyraźnie zbadanej różnicującej charakterystyce, takiej jak sekwencja aminokwasów, lub odpowiedź imunologiczna. Przykładami nazw nadawanych cytotoksycznym produktom hodowli komórkowej są: czynnik martwicy przeciwrakowy, czynnik cytotoksyczny przeciw komórkom NK, cytotoksyna makrofaga lub czynnik cytotoksyczny.

W europejskim zgłoszeniu patentowym K00641A (opublikowanym w dniu 15 lutego 1984) podano sekwencję aminokwasów ludzkiej limfotoksyny wyizolowanej z hodowli ludzkich komórek limfoblastoidalnych linii RPMI-1788.

W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 132124 A (opublikowanym w dniu 23 stycznia 1985) opisano białko uzyskane z królika po stymulacji jego układu retikuloendotelialnego. Białko to wykazywało działanie przeciwnowotworowe i na jego N-końcu występowała następująca sekwencja aminokwasów: Ser-Ala~Ser-Arg~Ala—Leu-Ser-Asp—Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-ValAla—Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Trp-Leu.

Ujawniono oczyszczanie i syntezę drogą rekombinacji cytotoksycznego ludzkiego polipeptydu, zidentyfikowanego jako czynnik martwicy przeciwrakowy i wykazującego następującą sekwencję aminokwasów na końcu N-terminalnym: Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-AspLys-Pro-Val-Ala—His-Val-Val-Ala-Asn—Pro.

W zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 481 137 ujawniono otrzymywanie substancji o masie cząsteczkowej 7000-9000, o nazwie CB_xa, z hodowli komórek BaLL-1. Substancja ta hamuje wzrost komórek rakowych i ma na N-końcu dwie resztki Ala-Ala.

Według badań Totha i Grangcra „Mol. Immun“ 16, 671-679 (1979), na lityczną aktywność limfotoksyn in vitro, nie ma wpływu ani usunięcie z supernatantu limfocytów wytwarzających limfotoksyny, kwasu siarkowego przez działanie neuraminodazą, ani dodatek N-acetyloglukozaminy, galaktozy, laktozy, mannozy, c^-r^^t.t^ilo^3^^^^inozydu lub fukozy. Autorzy wnioskują, że cukry proste nie mają żadnego wpływu na aktywność limfotoksyn, przez nich badanych. Jednak ci sami autorzy zaobserwowali, że sacharydy mają znaczny wpływ na aktywność innych limfokin, co pozwala przypuszczać, że dla cytotoksycznej aktywności limfotoksyn znaczenie ma obecność bardziej skomplikowanych form oligosacharydów.

Proctor, Klostergaard i Granger („Clinical Research, 1982, 30 (1), 55A) zaobserwowali, że ludzkie limfocyty, aktywowane PHA, w obecności tunikamacyny (w celu zahamowania przyłączania cząsteczki węglowodanu do cząsteczki limfotoksyny) wytwarzają nietkniętą biologicznie limfotoksynę. Według rych autorów, badania immunochemiczne wykazały, że podczas gdy cząsteczka węglowodanu nie jest potrzebna do transportu i uwolnienia limfotoksyny z aktywowanego limfocytu do supernatantu, jest ona potrzebna w celu efektywnego zniszczenia komórki docelowej, ponieważ węglowodan jest odpowiedzialny za odpowiednią konformację cząsteczki limfotoksyny.

Dalsza literatura, którą należy studiować w związku z niniejszym wynalazkiem, obejmuje: Evans, „Cancer lmmunol. Immunother, 12, 181^-190 (1982); Lee i inni, „Celi Immunol, 48, 166-181 (1979); wyd. De Weck i inni (1980) Biochemical Characterization of lymphokines str. 279-312; wyd. Khan i inni (1982) Humań Lymphokinse, str. 459-477; Aggarwal i inni, komunikat na 3^ίώ International Lymphokine workshop w Haverford, PA, 1-5 sierpnia 1982; Ransom i inni, „Cancer Research 43, 5222-5227 (1983); Kuli i inni, „J. of Immun“ 126, (4), 1279-1283 (1981); J. Sawada i inni, „Jpn. J. Exp. Med 46, 263-267 (1976); G. Geanger i inni, „Celi lmmunol. 38, 388-402 (1978); J. Rundell i inni, „Imffiunopharmacology 3, 9-18 (1981); G. Granger i inni, „J. Lyphokine Res 1, 45-49 (1982); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 H^<6117; europejskie zgłoszenie patentowe nr 87 087A; B. Wiliamson i inni, „P.N.A.S. USA 80,5397-5401 (1983) i S. Wright i inni „J. lmmunol. 126, 1516-1521 (1981).

Limfotoksyny (lub substancje zidentyfikowane jako limfotoksyny) otrzymane z hodowli limfocytów, występują w niskich stężeniach, rzędu 0,05-2X^^^^^s Jednostek/litr supernatantu komórek RPMI-1788 lub limfocytów. Ilości zebrane są różne, a limfocyty kosztowne. Dlatego

155 410 3 potrzebna jest ekonomiczna metoda wytwarzania limfotoksyn (Yamoto i inni, „J. of Biological Response Modifiers” 3 (1) 76-87 (1984).

Znane metody nie pozwalały otrzymać limfotoksyny jednorodnej pod względem sekwencji aminokwasów, która to cecha jest ważna przy wytwarzaniu substancji używanej jako leku. Limfotoksyna uzyskiwana z hodowli komórkowych wykazuje niejednorodne aminokwasy na N-końcu, prawdopodobnie z powodu zachodzących procesów proteolitycznych. Hodowle prostych limfocytów, np. krwi obwodowej, muszą koniecznie zawierać komórki wielu donorów, ze względów ekonomicznych. Jednak produkty tych komórek będą wykazywać genetyczne zmiany donorów, tak że uzyskana limfotoksyna może w rzeczywistości stanowić mieszaninę różnych gatunków. Oczywiście każdorazowa identyfikacja proporcji takich alleli nie będzie możliwa. Konieczne jest znalezienie metody produkowania limfotoksyny jednorodnej pod względem sekwencji aminokwasów.

Metody dotychczas stosowane są również ograniczone jeśli chodzi o wytwarzanie sekwencji aminokwasów identycznej z występującą w przyrodzie. Podstawienie, wycinanie lub wstawianie różnych aminokwasów do wytworzonych sekwencji wymaga trudnych i kosztownych chemicznych modyfikacji, jeśli takie zmiany mogą być w ogóle wprowadzone. Potrzebne są metody łatwego wprowadzania zmian do sekwencji aminokwasów limfotoksyny.

Chociaż działanie przeciwnowotworowe i niewątpliwą wartość terapeutyczną limfotoksyny opisywano w literaturze już od roku 1968, nie była ona intensywnie badana w klinikach, ani wytwarzana przemysłowo, oprócz niewielkich ilości niejednorodnej limfotoksyny wytwarzanej znanymi metodami. Konieczne jest opracowanie metody ekonomicznego wytwarzania limfotoksyny w ilościach potrzebnych do przeprowadzenia badań klinicznych.

W literaturze opisany jest fakt, że przeciwciała z królika są zdolne do neutralizowania cytolitycznej aktywności różnych cytotoksyn, a w tym również substancji zidentyfikowanych jako limfotoksyny (Yamoto i inni, „Celi Immun“ 38, 403-416 (1978); Cately i inni. „Celi Immun. 27, 82-93 (1976); Hiserodt i inni, „J. of Immun“ 119 (2), 374-380 (1977); Zacharchuk i inni, „P. N. A. S. USA“ 80,6341-6345 (1983); Ruddle i inni, „Lymphokine Research” 2(1), 23-31 (1983); Mannel i inni, „Infection and Immunity 33 (1), 156-164 (1981); Wallach i inni, E. De Mayer i inni, The Bioogy of the Interferon System, str. 293-302(1983) i Stone-Wolff i inni „J. Exp. Med.“ 159,828-843 (1984). Ponieważ te przeciwciała są poliklonalne, obejmują wielką ilość przeciwciał skierowanych przeciwko immunogenowi limfotoksynie. Wszystkie lub większość tych przeciwciał neutralizuje aktywność „limfotoksyczną. Literatura nie podajejednoznacznych danych dotyczących charakterystyki substancji odpowiedzialnej za aktywność limfotoksyny, która była stosowana jako immunogen. Dla celów diagnostycznych i dla przeprowadzenia oczyszczania limfotoksyn drogą immunopowinowactwa, konieczne jest wytworzenie specyficznego przeciwciała skierowanego przeciwko zidentyfikowanej cząsteczce limfotoksyny.

Celem wynalazku jest opracowanie ekonomicznych metod syntezy limfotoksyny w formie, w której wszystkie cząsteczki związku posiadają tę samą pierwszorzędową sekwencję aminokwasów.

Dzięki temu wynalazkowi możliwe jest również przeprowadzenie założonych zmian w sekwencji aminokwasów wytworzonych limfotoksyn, a w szczególności wycięcie reszty aminokwasu, jej wstawienie, podstawienie lub kombinacja takich operacji.

Cel wynalazku osiągnięto na drodze udanej rekombinantowej ekspresji białka o aktywności limfotoksyny. Ten rodzaj limfotoksyny, który opisano tutaj określającjego aktywność i naturalną lub zmienioną sekwencję aminokwasów, będzie dalej nazywany limfotoksyną. Nieoczekiwanie stwierdzono, że DNA kodujący limfotoksynę jest identyfikowany w komórce w tym samym czasie co m-RNA kodujący limfotoksynę w komórce homologicznej. Również nieoczekiwanie stwierdzono, że biologicznie aktywna limfotoksyna ulega ekspresji w komórkach rekombinowanych, które nie glikolizują limfotoksyny 0ub w których nie powinny zachodzić procesy glikozyłacji identyczne, jak w komórkach homologicznych) i wyodrębniona po ekspresji limfotoksyna wykazuje zasadniczo jednolitą sekwencję aminokwasów, bez występowania enzymatycznej hydrolizy reszt aminokwasowych na N-końcu. DNA kodujący limfotoksynę ulega ekspresji w komóre w ilości kopii 0,1-1 X 10¹¹ jednostek/litr lizatu hodowli.

155 410

Na limfotoksynę powstawającą w rekombinowanej komórce gospodarza ma wpływ DNA stosowany do kodowania limfotoksyny, lub jej prekursorów, oraz rodzaj wybranej komórki gospodarza. Według wynalazku, w sposobie wytwarzania limfotoksyny stosuje się nową sekwencję kwasów nukleinowych. Stosowana sekwencja nukłeotydów różni się od sekwencji występującej naturalnie, jedną lub większą liczbą następujących cech: DNA jest wolny od intronów, w przypadku limfotoksyny ludzkiej od intronu obecnego pomiędzy nukleotydami 284 i 285 (Rys. 2a). DNA jest wolny od kwasów nukleinowych kodujących inne białka organizmu, z którego DNA pochodzi; kwas nukleinowy kodujący limfotoksynę jest przyłączony do wektora; i/łub kwas nukleinowy jest zdolny do hybrydyzowania z kwasem nukleinowym kodującym limfotoksynę, jednak hybrydyzujący kwas nukleinowy ma sekwencję nukłeotydów inną, niż naturalny DNA lub RNA kodujący limfotoksynę.

Kwasy nukleinowe stosowane do kodowania limfotoksyny są produktem rekombinacji. Mutacja na końcu 5' kwasu nukleinowego do kodowania limfotoksyny jest dokonywana w celu zwiększenia poziomu ekspresji w wybranym gospodarzu, np. przez zmniejszenie możliwości występowania struktur podobnych do struktury m-RNA w części 5' kwasu nukleinowego, lub przez podstawienie kodonów preferowanych przez gospodarza, zamiast naturalnego kwasu nukleinowego.

Mutacja w kwasach nukleinowych, które przeważnie podlegają ekspresji, umożliwiają wytworzenie rodzajów limfotoksyny mających sekwencję aminokwasów natywnej limfotoksyny, lub pierwszorzędową sekwencję jej wariantów, z sekwencją aminokwasów różniącą się od natywnej linkomycyny. Mutantową limfotoksynę wyodrębnia się jako taką, lub dalej poddaje się przekształceniu przez komórkę gospodarza dla otrzymania żądanego gatunku limfotoksyny. Te kwasy nukleinowe lub kwasy nukleinowe, które z nimi hybrydyzują, lub ich fragmenty, są znakowane i używane w próbach hybrydyzacyjnych do identyfikacji lub oznaczania materiału genetycznego kodującego limfotoksynę.

W procesie syntezy limfotoksyny DNA kodujący limfotoksynę przyłącza się do wektora, wektorem transformuje się komórki gospodarza, komórki gospodarza hoduje się, a limfotoksynę wyodrębnia się z komórki. Ten ogólny proces stosuje się do syntezy limfotoksyny zawierającej sekwencję aminokwasów natywnej limfotoksyny, lub do konstrukcji nowych wariantów limfotoksyny, w zależności od budowy wektora i komórki gospodarza, wybranych do transformacji. Rodzaje limfotoksyny, które mogą być syntetyzowane sposobem według wynalazku obejmują: limfotoksynę z resztą leucylową na końcu aminokwasowym, limfotoksynę z resztą histydylową na końcu aminokwasowym, pre-limfotoksynę i warianty limfotoksyny jak: a/ białka po fuzji, w których do aminowej i/lub karboksylowej grupy limfotoksyny przyłączone są wiązaniem peptydowym inne białka lub polipeptydy, b/ fragmenty limfotoksyny, szczególnie fragmenty prelimfotoksyny, w których każdy aminokwas pomiędzy -34 i +23 jest amino-końcowym aminokwasem fragmentu, c/ mutanty limfotoksyn, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest podstawionych, wstawionych łub wyciętych, d/pochodne zawierające na końcu aminowym resztę metioniny, lub zmodyfikowaną resztę metioniny (taką jak formylo-metionylo lub inny rodzaj zblokowanej reszty metionylowej), i/lub e/ nieglikozylowane lub różne glikozylowane powyższe rodzaje limfotoksyny.

Jeśli komórkę ssaka transformuje się kwasem nukleinowym kodującym limfotoksynę, powiązanym z eukariotyczną sekwencją liderową (włącznie z natywnym liderem limfotoksyny), lub jeśli kwas nukleinowy kodujący limfotoksynę wiąże się w wektorze z prokariotycznym lub drożdżowym liderem, który jest rozpoznawany przez komórkę gospodarza (zwykle organizm, z którego uzyskano sekwencję lidera) i hoduje się komórki gospodarza transformowane tym wektorem, otrzymuje się zwykle rodzaje limfotoksyny niemetionylowane na końcu aminowym.

Jeśli DNA kodujący limfotoksynę wiąże się z wektorem bez sekwencji liderowej, a następnie używa do transformacji komórki gospodarza, uzyskuje się na ogół rodzaje limfotoksyny z grupą aminową podstawioną resztą metionylową lub zmodyfikowaną resztą metionylową, takąjak reszta formylometionylowa.

Przedstawione metody mutagenezy in vitro kwasów nukleinowych kodujących limfotoksynę prowadzą do ekspresji wariantów limfotoksyny, które w inny sposób nie mygłyby być wytworzone.

155 410

Po pierwsze, w komórkach gospodarza transformowanych kwasem nukleinowym kodującym limfotoksynę, który nie jest połączony z sekwencją liderową, powstaje i ulega ekspresji limfotoksyna z resztą metionylową, lub zmodyfikowaną resztą metionylową na końcu aminowym.

Po drugie, dla wywołania wycięcia, zamiany i/lub włączenia odcinka w kwasie nukleinowym kodującym limfotoksynę stosuje się in vitro mutagenezę w specyficznym miejscu, zaplanowaną lub przypadkową. W ten sposób wytwarza się limfotoksynę po fuzji. Pochodne limfotoksyny uzyskane przy użyciu zmutowanych kwasów nukleinowych wykazują zmodyfikowaną charakterystykę.

Ostatecznie otrzymuje się nieglikozylowane lub różne głikozylowane nowe rodzaje limfotoksyny. Limfotoksynę nieglikozylowaną wytwarza się przez prokariotyczną ekspresję DNA kodującego limfotoksynę. Rodzaje limfotoksyny glikozylowanej w różny sposób są produktem hodowli rekombinatowej w transformowanych eukariotycznych komórkach zazwyczaj komórkach ssaków.

Wytworzoną limfotoksynę oczyszcza się z supernatantów lub lizatów hodowlanych drogą adsorpcji na zasadzie immunopowinowactwa, przy użyciu nierozpuszczalnego neutralizującego limfotoksynę przeciwciała. Przeciwciało to, które jest najefektywniej produkowane w hodowli komórek monoklonałnych, otrzymuje się przez immunizację myszy zaadsorbowaną na glinie limfotoksyną.

Limfotoksynę wytworzoną sposobem według wynalazku, łączy się w celu użycia terapeutycznego z fizjologicznie obojętnymi stabilizatorami i zarobkami i przygotowuje w postaci sterylnych dawek, poprzez liofilizację w ampułkach, lub przechowuje w postaci stabilizowanych roztworów wodnych. Alternatywnie, limfotoksynę włącza się do matrycy polimerowej dla implantacji w miejsca zaatakowane nowotworem, lub z których nowotwór był chirurgicznie usunięty, tak aby następowało efektywne uwalnianie limfotoksyny w zlokalizowanym wysokim stężeniu.

Środki terapeutyczne poddaje się w odpowiednich dawkach drogą implantacji, injekcji lub infuzji zwierzętom lub ludziom cierpiącym na nowotwory złośliwe.

Krótki opis rysunków. Fig. 1 a przedstawia sekwencję DNA i sekwencję aminokwasów kodujących fragment limfotoksyny. Fig. Ib — konstrukcję syntetycznego DNA kodującego fragment przedstawiony na fig. la. Fig. 2a — kompletną sekwencję aminokwasów pre-limfotoksyny, jej kodujący DNA plus 5' i 3' boczne regiony, które nie uległy translacji. Fig. 2b — metodę konstrukcji i ekspresję wektora dla otrzymania limfotoksyny zawierającej na końcu aminowym resztę metionylo-leucylową i jej pochodnych metionylowanych na końcu aminowym. Fig. 3 — metodę konstrukcji i ekspresję wektora dla otrzymania limfotoksyny zawierającej na końcu aminowym resztę metionylo-histydylową. Fig. 4 — sekwencję aminokwasów dla ludzkiej, mysiej i bydlęcej limfotoksyny i zgodność reszty limfotoksyny ssaków. Fig. 5a i 5b przedstawiają konstrukcję plazmidu kodującego limfotoksynę i bakteryjne białko sygnałowe.

Dla celów niniejszego opisu limfotoksynę zdefiniowano jako biologicznie aktywny polipeptyd, zawierający odcinek o strukturze aminokwasów homologicznej z przynajmniej częścią sekwencji aminokwasów limfotoksyny przedstawionej na fig. 2a. Aktywność biologiczną zdefiniowano jako wybiórczą aktywność cytotoksyczną, immunologiczną reakcję krzyżową z cytotoksyczną limfotoksyną lub zdolność do współzawodniczenia z cytotoksyczną limfotoksyną o receptory limfotoksyny na powierzchni komórki. W dwóch ostatnich przypadkach limfotoksyną nie musi być cytotoksyczną per se. Mutanty wykazujące immunologiczną reakcję krzyżową są stosowane jako immunogeny dla wywołania przeciwciał przeciwko limfotoksynie u zwierząt, np. do wytwarzania odczynników do testów immunologicznych, natomiast nie-cytotoksyczne kompetytywne mutanty znajdują zastosowanie jako znakowane odczynniki w niekompetytywnym typie testów immunologicznych biologicznie aktywnej limfotoksyny.

Wybiórczą cytotoksyczną aktywność zdefiniowano jako wybiórcze niszczenie, lub hamowanie wzrostu komórek rakowych in vivo lub in vitro, w porównaniu ze wzrostem normalnych komórek w tych samych warunkach. Korzystną metodą oznaczania aktywności jest określanie stopnia zniszczenia komórek rakowych in vitro lub martwicy in vivo, ale stosowane są również metody oznaczania aktywności cytostatycznej lub antyproliferacyjnej.

Odpowiednie testy dla wykrywania aktywności limfotoksyny opisali B. Aggarwal i inni, 1984, „J. Biol. Chem“ 259 (1), 686-691 i E. Carswell i inni, 1975, „Proc. Natl. Acad. Sci. UsA“ 72,

3666-3670.

155 410

Specyficzną aktywność limfotoksyny zdefiniowano w oparciu o lizę komórki docelowej (raczej niż w oparciu o działanie cytostatyczne). Jedna jednostka limfotoksyny jest to ilość potrzebna do 50 — procentowej lizy komórki docelowej, jak to opisano w przykładzie I. Inne metody oznaczania aktywności cytotoksycznej są również akceptowane.

Podstawowa homologia strukturalna ogólnie oznacza, że więcej niż 70% reszt aminokwasów w polipeptydzie jest takich samych lub konserwatywnie podstawionych jak odpowiednie reszty w sekwencji przedstawionej na fig. 2a.

Nie cała sekwencja polipeptydu limfotoksyny musi być homologiczna z sekwencją przedstawioną na fig. 2a. Jedyniejej część musi być homologiczna zjakąkolwiek częścią sekwencji z fig. 2a, pod warunkiem, że związek wykazuje wymaganą aktywność biologiczną. Ogólnie rzecz biorąc, homologia powinna występować w regionie 20- 100 aminokwasów, z tym, że występowanie kilku przerw zwiększa homologię.

Mniejszy procent homologii jest wymagany, jeśli odcinki homologiczne polipeptydu nie pokrywają się z kluczowymi regionami sekwencji limfotoksyny przedstawionej na fig. 2a, to jest regionami ważnymi dla cytotoksycznej aktywności związku. Kluczowymi regionami sekwencji przedstawionej na fig.2a są reszty aminokwasów 162-171 52-83 i 127-148.

Limfotoksynę definiuje się jako specyficzny czynnik przeciw ludzkiemu rakowi i jego analogom występującym u zwierząt (D. Pennica i inni, „Naturę 312,1984, str. 724-729 i B. Aggarwal i inni, „J. Biol. Chem.“ 260 (4), 2345-2354 (1985).

Strukturalne podobieństwo dotyczy ogólnej charakterystyki bocznych łańcuchów aminokwasów, takiej jak występowanie aminokwasów zasadowych, obojętnych łub kwaśnych, hydrofiowych lub hydrofobowych, oraz wiązań przestrzennych. Podstawienie jednego strukturalnie podobnego aminokwasu drugim nazywane jest podstawieniem konserwatywnym.

Ważnym czynnikiem przy określeniu identyczności polipeptydu jako limfotoksynyjest to, aby przeciwciało zdolne do całkowitej neutralizacji cytolitycznej aktywności całkowicie homogennej, limfoblastoidalnej (lub naturalnej) limfotoksyny było również zdolne całkowicie neutralizować cytolityczną aktywność badanego polipeptydu. Należy jednak pamiętać, że identyczność immunologiczna i identyczność cytotoksyczna nie są równoznaczne. Przeciwciało neutralizujące limfotoksynę przedstawioną na fig. 2a, może nie wiązać się z badanym połipeptydem, jeśli akurat zdarzy się, że jest ono wiązane z odcinkiem sąsiadującym z odcinkiem krytycznym dla cytotoksycznej aktywności limfotoksyny, i działa jako przeciwciało neutralizujące poprzez sferyczne blokowanie centrum aktywnego limfotoksyny. Badane białko, zmienione w tym właśnie odcinku, nie jest zdolne do wiązania neutralizującego przeciwciała, lecz pomimo to jest limfotoksyną, pod względem homologii i aktywności biologicznej.

Limfotoksyną otrzymywana z hodowli komórek limfoblastoidalnych ma następującą charakterystykę: masa cząsteczkowa 20000 lub 25000, w zależności od stopnia glikozylacji i heterogenności N-końca: giikozylacja Asn+ 62 fig. 2a; tendencja do agregacji z wytworzeniem multimerów; punkt izoelektryczny około 5,8; labilność przy zmianie pH (strata ponad 50% aktywności cytolitycznej przy przechowywaniu w ciągu 24 godzin w buforze węglanowym o stężeniu JO^g/ml o pH poniżej 5 lub powyżej 10); znaczna strata aktywności przy inkubacji w roztworze wodnym w ciągu 5 minut w temperaturze 80°C. Występują dwa rodzaje limfoblastoidalnej limfotoksyny różniące się masą cząsteczkową. Limfoblastoidalna limfotoksyną o masie cząste-czkowej 25000 daitonów zawiera ua końcu aminowym resztę łeucyny. Polipeptydy mające pierwszorzędową sekwencję aminokwasów identyczną z sekwencją rodzaju limfotoksyny o masie cząsteczkowej 25 000 daltonów, nazywane są leucylo-limfotoksynami. Limfoblastoidalna limfotoksyną o masie cząsteczkowej 20000 daitonów zawiera na końcu aminowym resztę histydyny i odpowiadające jej sekwencje noszą histydylo-limfotoksyn. Ważne jest, że charakterystyka ta dotyczy natywnego łub dzikiego typu limfotoksyny ludzkiej otrzymywanej z hodowli komórek limfoblastoidalnych.

Podczas gdy scharakteryzowano tutaj natywną glikolizowaną limfotoksynę, inne pochodne polipeptydy cytotoksyczne mogą nie odpowiadać tej definicji. Dla przykładu glikolizacja zachodząca przy wytwarzaniu zwierzęcej limfotoksyny może przebiegać w rekombinantowej komórce eukariotycznego gospodarza, w sposób zmodyfikowany, co powoduje powstanie zmodyfikowanej limfotoksyny o masie cząsteczkowej lub punkcie izoelektrycznym nie odpowiadającym wartościom określonym dla limfotoksyny z ludzkich limfoblastów. W rekombinantowych hodowlach

155 410 bakteryjnych produkowana jest całkowicie nieglikozylowana limfotoksyna o odpowiednio zmodyfikowanej masie cząsteczkowej, punkcie izoelektrycznym i innych cechach. Poza tym posttranslacyjne tworzenie pre-limfotoksyny z pierwszego gatunku zwierzęcia w hodowli komórek pochodzących z innego gatunku zwierzęcia może powodować powstanie innej reszty aminoterminainej niż w przypadku zwierzęcia pierwszego gatunku. Podobnie, prowadzenie mutagenezy może na przykład umożliwiać zmiany sekwencji aminokwasów N-końca cząsteczki limfotoksyny, modyfikując stabilność zależną od pH, punkt izoelektryczny i tym podobne.

Sekwencja aminokwasów dla ludzkiej limfotoksyny po translacji podana jest fig. 2a. Należy podkreślić, że sekwencja ta zawiera 34 reszty aminokwasowe presekwencji, które jak się przypuszcza są usuwane podczas normalnych procesów translacji transkryptu w komórkach ludzkich (razem z jej mutantami, pre-Iimfotoksyna“) występujących w rodzajach leucylo-limfotoksyn. Histydylo-limfotoksyna jest homologiczna do leucylo-limfotoksyny, z wyjątkiem pierwszych 23 aminokwasów, które w histydylo-limfotoksynie są nieobecne. Wszystkie trzy rodzaje, to jest pre-limfotoksyna, leucylo-limfotoksyna i histydylo-limfotoksyna, podobnie jak ich formy metionylowane, zmodyfikowane metionylowane, zmutowane i nieglikozylowane są objęte terminem limfotoksyna. Nieglikozylowane gatunki leucylo- i histydylo-limfotoksyn mają mniejszą masę cząsteczkową niż wyżej opisane rodzaje homologiczne z komórek limfoblastoidalnych.

Pre-limfotoksyna jest rodzajem limfotoksyny zdefiniowanym następująco. Charakteryzuje się występowaniem polipeptydu sygnałowego (lub lidera) na aminowym końcu cząsteczki. Ogólnie rzecz biorąc, natywny polipeptyd sygnałowy limfotoksyny jest proteolitycznie odszczepiany od limfotoksyny w czasie wydzielania białka z komórki. Peptyd sygnałowy może pochodzić z drobnoustroju lub ssaka (włącznie z natywną, liczącą 34 reszty aminokwasowe pre-sekwencją), ale korzystnie jest jeśli jest homologiczny do komórki gospodarza. Niektóre fuzje peptydu sygnałowego i limfotoksyny nie są rozpoznawane przez komórkę gospodarza, w przypadku limfotoksyn zawierających N-terminalnej metioniny. Takie fuzje, w przypadku peptydów sygnałowych z drobnoustrojów, są użyteczne na przykład jako immunogeny limfotoksyn.

Termin „zdolny do aktywności cytotoksycznej oznacza, że limfotoksyna zawierająca polipeptydy może być przekształcona, drogą hydrolizy enzymatycznej, z nieaktywnego analoga do zymogenu, do fragmentu polipeptydowego, który wykazuje żądaną aktywność biologiczną. Termin „zdolny do aktywności cytotoksycznej in vitro lub in vivo oznacza, że niecytotoksyczne polipeptydy mogą być przekształcone, drogą hydrolizy enzymatycznej, z nieaktywnego analoga do zymogenu, do fragmentu polipeptydowego, który wykazuje zdefiniowaną aktywność biologiczną. Zazwyczaj nieaktywnymi prekursorami są białka po fuzji, w których limfotoksyna jest połączona wiązaniem peptydowym, swoim karboksylowym końcem z innym białkiem, lub polipeptydem. Sekwencja tego wiązania, lub sekwencja występująca w jego pobliżu, jest tak dobrana, aby była podatna na proteolityczną hydrolizę dla uwolnienia limfotoksyny, zarówno in vivo, jak i jako część postępowania produkcyjnego in vitro. Typowymi sekwencjami wiązania są Lys-Lys łub Arg—Lys. Drugim komponentem takiej pro-limfotoksyny jest korzystnie białko homologiczne, tak aby zmniejszyć immunogenność fuzji. Białko homologiczne powinno być obojętne i nie wiązać się do powierzchni komórki. Tak przygotowana limfotoksyna wykazuje zdefiniowaną, żądaną aktywność cytotoksyczną.

Podczas gdy terminem limfotoksyna określa się przeważnie limfotoksynę ludzką, limfotoksyna z innych źródeł, jak mysia, świńska, końska lub bydlęca odpowiada tej definicji, jeśli wykazuje opisane powyżej odcinki homologiczne i aktywność biologiczną. Na przykład limfotoksyny bydlęca i mysia wykazują około 80% odcinków homologicznych z limfotoksyną ludzką. Limfotoksyna nie wykazuje specyficzności rodzajowej, np. ludzka limfotoksyna jest aktywna przeciwko nowotworowi myszy i liniom komórek neoplastycznych. Tak więc limfotoksyna jednego rodzaju może być użyta w terapii innego rodzaju.

Limfotoksyna obejmuje również formy multimeryczne. Limfotoksyna spontanicznie agreguje do multimerów, zwykle dimerów lub wyższych multimerów. Multimery są cytotoksyczne i mogą być stosowane w terapii in vivo. Limfotoksyna w komórce gospodarza występuje w postaci monomeru. Jednak, w późniejszych etapach ma ona tendencje do tworzenia multimerów. Homogenne multimery lub mieszaniny różnych multimerów są użyteczne w terapii.

155 41®

Limfotoksyny wariantowe obejmują nacelowane, to jest specyficzne co do miejsca, mutacje struktury przedstawionej na fig. 2a łub jej fragmentów. Limfotoksyny wariantowe są definiowane jako polipeptydy, odpowiadające charakterystyce limfotoksyny, wykazujące sekwencję aminokwasów różniącą się od przedstawionej na fig. 2a, ze względu na ominięcie, podstawienie lub włączenie niektórych reszt. Opisane tutaj limfotoksyny nie pochodzące z komórek ludzkich, oraz allele limfotoksyn ludzkich, mogą być uważane za limfotoksyny wariantowe, które jako mutanty miejscowe nie mają naturalnego odpowiednika. Celem mutagenezy jest skonstruowanie DNA, który koduje limfotoksynę, scharakteryzowaną powyżej, ale modyfikuje aktywność biologiczną naturalnej limfotoksyny, lub ułatwia produkcję limfotoksyny. Na przykład mituje się kodon lizyny 89, w celu zastąpienia reszty lizyny resztą histydyny. Histydyna ⁺89 nie ulega hydrolizie pod wpływem trypsyny (która rozcina białka w wiązaniu Arg-X lub Lys-X).

Odporność na proteazę, jak się przypuszcza, zapewnia dłuższy biologiczny okres półtrwania mutantu niż w przypadku limfotoksyny zawierającej sekwencję przedstawioną na fig. 2a (lub jej fragment). Inne lizynowe i argininowe reszty limfotoksyny, również mogą być mutowane do histydyny, na przykład lizyna +28, lizyna +19 lub arginina +15.

Jak opisano powyżej, pewne odcinki cząsteczki limfotoksyny wykazują homologię z podobnie działającym białkiem określanym jako czynnik martwicy nowotworów. Reszty aminokwasowe w tym homologicznym odcinku, oraz otaczające odcinek homologiczny, są korzystne dla mutagenezy kierowanej do wytwarzania mutantów limfotoksyny, które wykazują zmienioną aktywność biologiczną lub cytostatyczną. Takie mutanty są wytwarzane metodami znanymi i są poddawane skriningowi na żądaną aktywność biologiczną, na przykład na zwiększoną cytotoksyczność przeciwko-szczególnym neoplazmom, lub w przypadku limfotoksyn przeznaczonych do immunizacji zwierząt, na zdolność do wywołania silniejszej reakcji immunologicznej. Przykłady takich wariantów limfotoksyny są następujące: AIa+168 jest zmutowana do aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu (Val, Ile lub Leu); hydrofobowy aminokwas (np. Phe, Val, Ile lub Leu) jest wstawiony pomiędzy Thr+163 i Val+164; Thr+163 jest zastąpiona tyrozyną, Ser⁺82 jest zastąpiona licyną, Ser+42 jest zastąpiona izoleucyną, leucyną, fenyloałaniną, waliną lub histydyną, Lys⁺84 jest zastąpiona glutaminą, tryptofanem, seryną lub histydyną; Ser+ 82 jest wycięta; hydrofobowy dwu lub trójpeptyd jest przyłączony przez fuzję do Leu+171; Thr+163 jest zastąpiona kwasem asparaginowym lub lizyną; sekwencja Ala-Lys jest wstawiona pomiędzy Glu+127 i Pro+128; Ser+70 jest zastąpiona lizyną lub glicyną, Thr*90 jest zastąpiona tyrozyną; Lys+28 jest zastąpiona argininą lub histydyną; His+32 jest zastąpiona argininą lub lizyną; Asp+36 jest zastąpiona proliną, seryną, treoniną, tyrozyną lub kwasem glutaminowym; Ser+38 jest zastąpiona tyrozyną, metioniną lub kwasem glutaminowym; Ser+61 jest zastąpiona treoniną, tyrozyną, histydyną lub lizyną; GIy+124 jest zastąpiona kwasem asparaginowym, seryną lub tyrozyną; His+135 jest zastąpiona argininą, lizyną, tyrozyną, tryptofanem łub proliną; Thr+142 jest zastąpiona kwasem asparaginowym, Gln⁺146 jest zastąpiona lizyną lub treoniną.

Szczególnie cenną grupą mutantów są te, w których reszty metioniny w' ludzkiej limfotoksynie — reszty +20, +120 i *133 są wycięte, lub, korzystnie, zastąpione odpowiednimi resztami limfotoksyn innych rodzajów, jak to opisano powyżej. Na przykład metioninowe reszty + 20,+120 i * 133 są zastąpione odpowiednio treoniną, seryną i waniliną. Są to odpowiadające reszty w limfotoksynie bydlęcej. Wymianę prowadzi się metodą opisaną w przykładzie ΠΙ, z wyjątkiem tego, że Met+133 zmutuje się do waliny w dalszym etapie mutagenezy przy użyciu faga Ml 3 Mp8, zgodnie ze znanymi metodami. Ten mutant hybrydowy DNA limfotoksyny stosuje się zamiast DNA kodującego leucylo-limfotoksynę według przykładu V. Postępując zgodnie ze znanymi metodami, stosuje się bromocyjan do odszczepienia peptydu sygnałowego STU z hybrydowej limfotoksyny i uzyskuje się doj'rzałą leucylo-limfotoksynę.

Innymi użytecznymi limfotoksynami wariantowymi są te, w których odpowiednie reszty limfotoksyny są zastąpione resztami czynnika martwicy nowotworowej z wytworzeniem hybrydowych wariantów czynnik martwicy nowotworowej — limfotoksyna. Reprezentatywnym przykładem jest zastąpienie pierwszych 27 reszt leucylo-limfotoksyny pierwszymi 8, 9 lub 10 resztami dojrzałego czynnika martwicy nowotworowej (np. Val-Arg-Ssr-Ser-Ser-Arg-Thr~PnoSer^Asp-). Jest bardziej prawdopodobne, że wariant ten w czasie ekspresji w E. coli wytworzy pochodną pozbawioną grupy metionylowej na N-końcu.

155 41©

Ponieważ miejsce mutacji jest wcześniej określone, konieczne jest aby sama mutacja była również wcześniej określona. Na przykład w celu zwiększenia możliwości dokonania mutacji limfotoksyny w histydynie *89, prowadzi się przypadkową mutagenezę kodonu lizyny *89 i wytworzone mutanty poddaje się skriningowi na optymalną kombinację aktywności cytostatycznej i oporności na proteazę.

Limfotoksyna może również zawierać wstawki, zwykłe około 1-10 reszt aminokwasowych, lub być pozbawiona około 1 -30 reszt. Można również stosować kombinacje zastępowania, usuwania lub wstawiania dla osiągnięcia końcowej konstrukcji. Wstawki obejmują fuzje na końcu aminowym lub karboksylowym, np. hydrofobowy związek przedłużający może być przyłączony do końca karboksylowego. Korzystne jest jednak prowadzenie jedynie mutagenezy, powodującej zastępowanie reszt. Oczywiście mutacja kodująca DNA nie może następować w sekwencji poza miejscem odczytu i korzystne jest jeśli nie następuje w komplementarnych odcinkach, które wytwarzają drugorzędową strukturę mRNA. Ekstrakty z E. coli transformowanej wektorami zawierającymi DNA kodujący mutanty limfotoksyny pozbawione ostatnich 16 aminokwasów z karboksylowego końca lub około 33 reszt aminokwasów z aminowego końca cząsteczki leucylolimfotoksyny nie wykazują aktywności cytostatycznej. Jednak przyczyny braku aktywności nie są znane i można przypuszczać że mogą to być przyczyny przedstawione w przykładzie I.

Nie wszystkie mutacje w DNA kodującym limfotoksynę ulegają ekspresji w podstawowym produkcie hodowli rekombinantowych komórek. Na przykład główna klasa mutantów zastępczych DNA, są to te DNA, w których sekwencja liderowa przedstawiona na fig. 2a jest zastąpiona inną sekwencją liderową, albo przez wycięcie reszt w obrębie 34 reszt lidera, albo przez zamiany, które zmieniają większość, lub wszystkie natywne lidery w lidery lepiej rozpoznawalne przez wybranego gospodarza. Na przykład przy konstrukcji prokariotycznego wektora, sekwencja liderowa przedstawiona na fig. 2a jest wycięta na korzyść liderów bakteryjnej alkalicznej fosfatazy, lub odpornej na ogrzewanie enterotoksyny II, a przy konstrukcji wektora drożdżowego sekwencja liderowa przedstawiona na fig. 2a jest zamieniona na lidery drożdżowej inwertazy, czynnika alfa lub kwaśnej fosfatazy. Nie znaczy tojednak, że ludzka sekwencja liderowa niejest rozpoznawana przez inne linie niż komórki ludzkie. Jeśli sekwencja liderowajest rozpoznawana przez gospodarza, połączone białka składające się z limfotoksyny i lidera, zwykle są rozszczepiane na wiązaniu peptydowym łączącym lider i limfotoksynę co prowadzijednocześnie do wydzielania limfotoksyny. Więc, jeśli nawet zmutowany DNA jest używany do transformacji gospodarza, wytworzona limfotoksyna może być albo połączona z innym białkiem, albo natywna, w zależności od wydajności procesu fuzji w komórce gospodarza.

Inna duża klasa mutantów DNA, które nie ulegają ekspresji jako warianty limfotoksyny, są to zmienione przez zastępowanie reszt nukleotydy tworzone w celu zwiększenia ekspresji, głównie przez uniknięcie występowania pętlowej struktury w transkrybowanym mRNA (patrz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 303 687), lub w celu wytworzenia kodonów, które są łatwiej transkrybowane przez wybranego gospodarza, np. dobrze znanych korzystnych kodonów preferowanych w ekspresji u. E. coli.

Mutantowe kwasy nukleinowe są wytwarzane znanymi metodami (A. Hui i inni, 1984 „The EMBO Journal 3 (3), 623-629; J. Adelmanet i inni, 1983, „DNA 2 (3), 183-193; zgłoszenie patentowe Wielkiej Brytanii 2130219A; G. Winter i inni, 1982, „Naturę 299,756-758; i R. Wallace i inni, 1981, „Nucleic Acid Research 9 (15), 3647-3656). Metody te, włącznie z mutagenezą przy użyciu faga Μ13, syntezą zmutowanego genu limfotoksyny,jak opisano w przykładzie I, oraz inne metody są powszechnie znane.

Kwas nukleinowy kodujący limfotoksynę jest jakąkolwiek sekwencją DNA lub RNA kodującą polipeptyd odpowiadający definicji limfotoksyny, niezależnie od tego czy ta sekwencja odpowiada sekwencji występującej w przyrodzie. Oprócz tego kwas ten należy do grupy, która jest zdolna do hybrydyzacji, przynajmniej w mniej surowych warunkach, z kwasem nukleinowym kodującym limfotoksynę, nawet jeśli hybrydyzujący kwas nukleinowy nie koduje białek typu limfotoksyny, a koduje na przykład krótki polipeptyd, niezdolny do ekspresji w postaci biologicznie aktywnej limfotoksyny. Kwas nukleinowy kodujący limfotoksynę lub zdolny do hybrydyzacji z nim, uzyskuje się drogą organicznej syntezy, metodą przedstawioną w przykładzie I, lub otrzymuje się ze źródeł naturalnych, lub z banku cDNA, jak to opisano w przykładach.

155 410

Limfotoksynę sposobem według wynalazku otrzymuje się, ogólnie rzecz biorąc przez transformację gospodarza wektorem noszącym kwas nukleinowy kodujący żądaną limfotoksynę. Wektor jest skonstruowaną, replikującą się cząsteczką DNA. Wektory są używane w celu wzmocnienia lub umożliwienia ekspresji DNA kodującego limfotoksynę. Wektor ekspresyjny jest to skonstruowana cząsteczka dNa, w której sekwencja DNA kodującego limfotoksynę jest połączona z odpowiednią sekwencją kontrolną, zdolną do efektywnej ekspresji limfotoksyny w odpowiednim gospodarzu. Taka sekwencja kontrolna zawiera promotor transkrypcji, sekwencję operatorową kontrolującą transkrypcję, sekwencję kodującą rybozomalne miejsca wiązania odpowiednich mRNA i sekwencje, które kontrolują zakończenie transkrypcji i translacji.

Wektorem może być plazmid, wirus (włącznie z fagiem), lub fragment cząsteczki DNA (np. włączony do genonu gospodarza drogą rekombinacji). Transformowany do komórki odpowiedniego gospodarza wektor replikuje się i funkcjonuje niezależnie od genomu gospodarza, lub w niektórych przypadkach może włączać się do samego genonu. W obecnej nomenklaturze nazwa „plazmid i „wektor są używane często zamiennie, ponieważ plazmid jest najczęściej używanym wektorem. Jednak wszystkie inne formy wektorów, spełniających te same funkcje, które są, lub będą znane, mogą być także używane.

Odpowiednie wektory muszą zawierać replikon i sekwencje kontrolne, które pochodzą z gatunków zgodnych z przewidywanym gospodarzem. Transformowane komórki gospodarza, są to komórki, które poddano transformacji lub transfekcji wektorami limfotoksyny, zbudowanymi przy użyciu techniki rekombinacji DNA. Transformowane komórki gospodarza zwykle produkują limfotoksynę. Wytworzona limfotoksyna gromadzi się wewnątrz komórki, lub jest wydzielana albo do przestrzeni periplazmicznej, albo do supernatantu hodowli, w zależności od wybranej komórki gospodarza.

Odcinki DNA są funkcyjnie związane, jeśli są zależne od siebie nawzajem. Na przykład DNA kodujący presekwencję lub sekwencję liderową jest funkcyjne związany z DNA kodującym polipeptyd, jeśli ulega on ekspresji jako preproteina, która bierze udział w wydzielaniu polipeptydu; promotor jest funkcyjnie związany z sekwencją kodującą, jeśli kontroluje on transkrypcję tej sekwencji; lub miejsce wiązania na rybozomie jest funkcyjnie związane z sekwencją kodującą, jeśli znajduje się ona w pozycji umożliwiającej translację. Ogólnie rzecz biorąc funkcyjnie związany znaczy sąsiadujący i w przypadku sekwencji liderowej, sąsiadujący z fazą odczytywaną.

Odpowiednimi gospodarzami są prokarioty, drożdże lub komórki wyższych eukariotów. Prokarioty obejmują organizmy Gram-dodatnie i Gram-ujemne, np. E. coli lub Bacilli. Komórki eukariotyczne obejmują hodowle komórek ssaków, których pochodzenie jest opisane poniżej. Korzystną komórką gospodarza jest odporny na faga szczep E. coli W3110 (ATCC 27 325), opisany w przykładach, chociaż inne prokarioty takie jak E. coli B, E. coli Χ1776 (ATCC 31 537), E. coli 294 (ATCC 31 446), gatunki pseudomonas lub Serratia marcesans są również odpowiednie.

Dla ekspresji limfotoksyny korzystne są wektory pochodzące z prokariotów. Istnieje wiele odpowiednich wektorów bakteryjnych. Ogólnie rzecz biorąc, wektor bakteryjny powinien zawierać odcinek podlegający replikacji w planowanym gospodarzu, promator, który będzie funkcjonować w komórkach gospodarza i gen fenotypowej selekcji, na przykład gen kodujący białka odpowiedzialne za odporność na antybiotyk, lub powodujący auksotrofię. E. coli typowo transformuje się przy użyciu pBR322, plazmidu pochodzącego z gatunków E. coli (Bolivar i inni, 1977, „Gene 2,95). pBR322 zawiera geny odporności na ampicylinę i tetracyklinę, i dlatego pozwala na łatwą identyfikaję transformowanych komórek.

Wektor ekspresji musi zawierać promotor, któryjest rozpoznawany przez komórkę gospodarza, ale wektor klonujący nie musi zawierać promotora. Promotor przeważnie jest homologiczny do białek gospodarza. Promotory najpowszechniej stosowane w konstruowaniu rekombinowanego DNA obejmują /ł-laktamazę (penicylinazę) i laktozowy system promotora) Chang i inni, 1978, „Naturę 275, 615; Goeddel i inni, 1979, „Naturę 281, 544), tryptofanowy (trp) promotor (Goeddel i inni, 1980, „Nucleic Acids Res.“ 8,4057 i EPO App Publ. Nr 36 776) i promotor tac (H. De Boer i inni, „Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21-25 (1983)). Pomimo, że te promotory są powszechnie używane, inne, znane promotory bakteryjne są również odpowiednie. Szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydów są publikowane, podobnie jak sposób ich wiązania z DNA kodującym limfotoksynę w wektorze plazmidowym (Siebenlist i inni, 1980 „Celi 20,269). Obecnie

155 410 korzystnym wektorem jest pBR322 zawierający promotor alkalicznej fosfatozy z E. coli z sekwencją trp Shine-Dalgarno. Promotor i sekwencja Shine-Dalgarno są funkcyjnie związane z DNA kodującym limfotoksynę, to znaczy są one tak umieszczone, aby przyspieszać transkrypcję mRNA limfotoksyny z DNA.

Oprócz prokariontów, wektorami kodującymi limfotoksynę można transformować drobnoustroje eukariotyczne, takie jakie hodowle drożdży. Spośród niższych drobnoustrojów eukariotycznych powszechnie używa się Saccharomyce cerevisiae lub zwykłych drożdży piekarnicznych, chociaż stosuje się również wiele innych szczepów. Wektory drożdżowe zawierają plazmidowy odcinek replikacyjny z drożdży lub sekwencję replikującą się autonomicznie (ARS), promotor, DNA kodujący Umfotoksynę (włącznie ze szczególną ludzką prelimfotoksyną), sekwencje dla zakończenia poliadenylacji i transkrypcji i gen selekcyjny. Odpowiednim plazmidem do ekspresji limfotoksyny u drożdży jest YRp7 (Stinchcomb i inni, 1979, „Naturę*, 282, 39; Kingsman i inni, 1979, „Gena“ 7,141; Tschemper i inni, 1980, „Gena“ 1®, 157). Plazmid zawiera gen trpl. który służy jako marker selekcji, ponieważ zmutowany szczep drożdży traci zdolność wzrostu na tryptofanie, np. szczep ATCC nr 44076 lub PEP4-1 (Jones, 1977, „Genetyce*, 85,12). Obecność genu trpl w komórce gospodarza drożdżowego stwarza korzystne warunki dla wykrycia transformacji przez prowadzenie wzrostu w nieobecności tryptofanu.

Odpowiednia sekwencja promotora w wektorze drożdżowym obejmuje promotory zawierające metalotioneinę, kinazę 3-fosfoglicerynianu (Hitzeman i inni, 1980, „J. Biol. Chem.“ 255,2073), lub inne enzymy glikolityczne (Hess i inni, 1968 „J. Adv. Enzyme Reg.“, 7, 149 i Holland i inni, 1978, „Biochemistrę*, 17,4900), takie jak enolaza, dehydrogeneza 3-fosfogliceraldehydu, heksokinaza, dekarboksylaza, pirogronianu, fosfofruktokinaza, izomeraza glikozo-6-fosforanu, mutaza

3-fosfoglicetynianu, kinaza pirogronianowa, izomeraza fosfoglukozy i glukokinaza. Odpowiednie wektory i promotory do zastosowania u drożdży opisane są w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 73657.

Innymi promotorami, które dają dodatkową korzyść kontroli transkrypcji przez warunki hodowli są: odcinki promotora dla dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochrom C, kwasowa fosfataza, enzymy degradujące związane z metabolizmem azotu, metalotioneina i dehydrogenaza 3-fosfo-glicetaldehrdu, jak również enzymy odpowiedzialne za degradację maltozy i galaktozy. Przy konstrukcji odpowiednich plazmidów ekspresyjnych końcowe sekwencje związane z genem są również wiązane z wektorem ekspresyjnym 3' sekwencji kodującej limfotoksynę, dla kontroli zakończenia poliadenylacji mRNA. .

Oprócz drobnoustrojów, jako komórka gospodarza może być użyta również komórka organizmu wielokomórkowego. Nie jest to jednak korzystne ze względu na doskonałe rezultaty uzyskane jak dotąd przy stosowaniu drobnoustrojów przy ekspresji limfotoksyny. W zasadzie można stosować hodowle każdej wyższej komórki eukariotycznej, kręgowców lub bezkręgowców. Jednak większe zainteresowanie wzbudziły komórki kręgowców i stosowanie hodowli komórek kręgowców (hodowli tkankowych) stało się rutynową metodą postępowania w ostatnich latach (Tissue Culture, Acad, Press wyd. Kruse and Patterson (1973)). Przykładami stosowanych linii komórek gospodarza są komórki VERO i Hela, linie komórek z jajnika chińskiego chomika (CHO), linie komórek WI 38, BHK, COS-7. MDCK. Wektory ekspresyjne dla takich komórek przeważnie zawierają (jeśli to potrzebne) odcinek replikacyjny, promator umieszczony przed genem, który ma ulegać ekspresji, miejsce wiązania na rybozomie, miejsce rozszczepiania RNA (jeśli stosowany jest genon DNA zawierający introny), miejsce poliadenylacji i sekwencję zakończenia transkrypcji.

Sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację w stosowanych wektorach ekspresyjnych w transformowanych komórkach kręgowców, często pochodzą ze źródeł wirusowych. Na przykład powszczechnie używane promotory pochodzą z polyoma, Adenovirus 2 i najkorzystniej z Simian Virus 40 (SV40). Pierwszy i ostatni promotor są szczególnie użyteczne, ponieważ oba można łatwo otrzymać z wirusa, jako fragmens,któty zawiera również region replikacyjny SV40 (Fiers i inni, 1978 „Nature*. 273, 113). Większe lub mniejsze odcinki SV40 mogą być również stosowane ze względu na przybliżoną sekwencją 250 par zasad od miejsca Hind III w kierunku miejsca Bgl w rejonie replikacji wirusa. Jest również możliwe, a często pożądane, stosowanie promotora z genomu ludzkiego, którego odcinek kontrolujący i/lub sekwencja sygnałowa są połączone z limfotoksyną, o ile taka sekwencja kontrolna jest zgodna z systemem komórkowym gospodarza.

155 410

Odcinek replikacyjny można uzyskać albo przez konstrukcję wektora, z włączeniem odc^;nka egzogennego takiego jak odcinek pochodzący z SV40 lub innego wirusa, albo przy użyciu chromosomalnego mechanizmu replikacyjnego komórki gospodarza. Innymi wirusami, z których może pochodzić włączony odcinek, są np. Polyoma, Adenovirus, VSV lub BPV. Jeśli wektor jest włączony do chromosomu komórki gospodarza, jest to wystarczające. Limfotoksyna pozbawiona grupy metionylowej na końcu aminowym może być wytwarzana przez transformację komórek wyższych eukariontów przy użyciu DNA ludzkiej prelimfotoksyny.

Przy wyborze korzystnej komórki ssaka jako gospodarza, do transfekcji wektorem, który zawiera sekwencje ^DNA koduj^ące zarówno Hmfotoksy^ ^jak i re^dukta^zę ^dwuhy^dro^fo^lianu (DHFR), należy wybrać gospodarza na podstawie typu białek DHFR. Jeśli wybiera się białka DHFR typu dzikiego, to korzystnie jest wybrać taką komórkę gospodarza, która nie produkuje DHFR, co pozwoli na wykorzystanie sekwencji kodującej DHFR jako markera efektywności transfekcji, na odpowiednim podłożu selekcjonującym, pozbawionym hypoksantyny, glicyny i tymidyny. Odpowiednim gospodarzem jest w tym przypadku linia komórek CHO, pozbawionych aktywności DHFR, przygotowana według metody Urauba i Chasina (1980) “Proc. Natl. Acad. Sci. USA“ 77, 4216.

Z drugiej strony, jeśli jako sekwencję kontrolującą stosuje się DNA kodujące białka DHFR o małym powinowactwie do metotrexatu (ΜΤΧ), nie jest konieczne używanie komórek opornych na DHFR. Ponieważ mutant DHFR jest oporny na μΤχ, stosuje się podłoże zawierające ΜΤΧ, jako podłoża selekcjonujące, ze względu na fakt, że same komórki gospodarza są wrażliwe na ΜΤΧ. Większość eukariotycznych komórek, które są zdolne do absorpcji na ΜΤΧ, wydaje się być wrażliwa na ten preparat. Jedną z takich użytecznych linii jest linia CHO-KL (ATCC nr CCL 61).

Transformowane komórki gospodarza są to komórki, które zostały poddane transformacji lub transfekcji wektorami limfotoksyny skonstruowanymi techniką rekombinacji DNA. Transformowane komórki zwykle wytwarzają limfotoksynę. Wytworzona limfotoksyna zwykle jest zatrzymywana w komórce.

Limfotoksynę uzyskuje się z rekombinantowej hodowli wydzielających, jej komórek drogą lizy komórek i usunięcia części nierozpuszczalnych przez wirowanie lub podobnym sposobem. Komórki wydzielające limfotoksynę odwirowuje się, a roztwór limfotoksyny oczyszcza się metodami opisanymi powyżej, lub metodą immunopowinowactwa opisaną w przykładzie ΠΙ. Limfotoksynę oczyszcza się do poziomu odpowiedniego do stosowania farmakologicznego i umieszcza w typowych dawkach w ampułkach łub strzykawkach. Stosowane są mieszaniny wariantów limfotoksyny, np. bank mutantów różnych rodzajów limfotoksyny o aktywności cytotoksycznej. Optymalne jest przechowywanie limfotoksyny w postaci liofilizatu. Sporządza się również roztwory wodne, zawierające stabilizatory i zarobki, np. izotoniczny roztwór soli i podaje pacjentom (europejskie zgłoszenie patentowe nr 1^0641).

Środki zawierające limfotoksynę podawane są zwierzętom cierpiącym na nowotwór. Limfotoksynę podaje się w znany sposób, to jest dożylnie, dootrzewnowo, podskórnie, domięśniowo przez infuzję lub wstrzykiwanie jałowych roztworów limfotoksyny do miejsca uszkodzenia, lub w postaci układu do przedłużonego uwalniania opisanego poniżej.

Limfotoksynę można podawać do miejsca uszkodzenia, np. przez bezpośrednie wstrzyknięcie do nowotworu. W przypadku nowotworów rozproszonych, takich jak leukemia, korzystne jest podawanie dożylne lub poprzez układ limatyczny. Nowotwory organów wewnętrznych, takich jak jajniki, korzystnie leczy się przez infuzję dootrzewnową przy użyciu dializy i urządzeń do dializy dootrzewnowej i roztworów nie uszkadzającej otrzewnej. Zwyklejedna.k limfotoksynę podaje się w sposób ciągły przez infuzję, chociaż dopuszczalne jest również wprowadzenie implantu.

Korzystne jest podawanie limfotoksyny w postaci wszczepialnego preparatu o przedłużonym uwalnianiu. Przykłady odpowiednich układów dla białek posiadających ciężar cząsteczkowy dimerów, lub trimerów limfotoksyny obejmują kopolimery kwasu glutaminowego i gamma-etyloglutaminianu (U. Sidman i inni, 1983, .,Biopolvmers“ 22, (1), 547-566), metakrylanu) (R. Langer i inni, 1981, „Chem. Tech“, 12,98-105), łub octan etylenowinylowy (R.

Langer i inni, 1981, „J. Biomed. Mater. Res.“ 15, 167-277 i R. Langer, 1982, „Chem. Tech.“ 12,

98-105). Preparaty zawierające limfotoksynę wszczepia się chirurgicznie w miejsca, z których

155 410 usunięto nowotwór. Alternatywnie, limfotoksynę umieszcza się w półprzepuszczalnych mikrokapsułkach lub lipozomach i wprowadza do nowotworu. Ten sposób podawania jest szczególnie dogodny w przypadku nowotworów nie podlegających usunięciu chirurgicznemu ,np. nowotworów mózgu.

Ilość podawanej limfotoksyny zależy na przykład od drogi podawania, rodzaju nowotworu i stanu pacjenta. Konieczne jest aby terapeuta ustalił dawkę i zmodyfikował sposób podawania, dla uzyskania żądanej optymalnej aktywności cytotoksycznej przeciwko danemu nowotworowi, który może być określony np. drogą biopsji nowotworu lub drogą diagnostycznych testów z użyciem markerów, takich jak antygen rakoembrionalny, ze względu na toksyczność wywołaną zwiększoną dawką. Zwykle dawki rekombinowanej limfotoksyny rzędu 50-200/zg/kg wagi ciała podawane myszom okazywały się nietoksyczne i efektywne in vivo. Oczywiście dawkowanie zmienia się dla różnych zwierząt.

W niniejszym opisie podano również metodę otrzymywania przeciwciała neutralizującego limfotoksynę. Przeciwciało neutralizujące jest zdefiniowane jako takie przeciwciało, które jest zdolne do immunologicznego wiązania limfotoksyny tutaj zdefiniowanej, w taki sposób, aby całkowicie znieść jej aktywność w testach na cytostatyczną lub cytolityczną aktywność limfotoksyny, takich jak test mysi L929 opisany poniżej. Fakt, że przeciwciało jest zdolne neutralizować aktywność limfotoksyny nie oznacza, że musi ono wiązać się bezpośrednio z miejscem aktywnym lub receptorowym limfotoksyny. Przeciwciało może całkowicie neutralizować aktywność limfotoksyny, jeśli przyłącza się do obszaru sąsiadującego z miejscem krytycznym, to jest sąsiadującym ze względu na konformację cząsteczki, a nie ze względu na sekwencję aminokwasów.

Przy prowadzeniu prób wytwarzania neutralizującego monoklonalnego przeciwciała przeciwko limfotoksynie okazało się trudne immunizowanie myszy w taki sposób, aby neutralizujące przeciwciało było wytwarzane w zwierzęciu. Ani immunizacja iimfoblastoinalną limfotoksyną, ani limfotoksyną usieciowaną aldehydem glutarowym nie powodowała powstawania żadnego) wykrywalnego przeciwciała neutralizującego w surowicy myszy, chociaż powstawało przeciwciało nie mające zdolności neutralizowania limfotoksyny i wykrywano je w testach immunoenzymatycznych. Jednak immunizacja kompleksem adsorpcyjnym limfotoksyna-ałum (wodorotlenek glinu lub tlenek glinu, AI2O3 · 3H2O), powodowała powstawanie przeciwciała neutralizującego, nawet u zwierząt, które uprzednio nie wykazywał}' żadnej aktywności. Przygotowanie ałunu i jego zastosowanie w produkcji surowicy opisano w publikacji Williamsa i innych, 1967, Methodes in Immunology and Immunochemistry I, str. 197-229.

Przeprowadzono fuzję komórek śledziony zwierząt wytwarzających przeciwciało neutralizujące i komórek mysiego szpiczaka. Średnio przetestowano około 50-100 klonów, aby znaleźćjeden syntetyzujący przeciwciało neutralizujące. Sposób skriningu klonów na żądaną aktywność jest rutynowy i znany fachowcom i może być powtórzony przy mininalnym doświadczeniu. Można tutaj używać zarówno surowicy, plazmy lub frakcji IgG immunizowanych zwierząt, jak i immunoglobulin wydzielanych przez hybrydomy wytworzone z komórek śledziony lub komórek limfatycznych. Najkorzystniej jest otrzymywać całkowicie wolne od innego przeciwciała przeciwko limfotoksynie, przeciwciało neutralizujące w hodowli hybrydomy.

Przeciwciało neutralizujące można immobilizować poprzez adsorbcję na powierzchni np. substancji termoplastycznej, takiej jak polistyren, lub wiązanie do matrycy, takiej jak substancja o nazwie Sepharose aktywowana bromocyjanem. Immobilizowane przeciwciało używane jest w próbach immunologicznych lub procesach oczyszczania na drodze immunopowinowactwa. Ponieważ przeciwciało jest przeciwciałem neutralizującym, najprawdopodobniej adsorbuje ono lub wykrywa biologicznie aktywną limfotoksynę lub jej fragmenty. Przeciwciało jest szczególnie użyteczne w immunoradiometrycznych immunotestach („Sandwich), w połączeniu z monoklonalnym przeciwciałem nie neutralizującym anty-limfotoksyny, lub poliklonalną antysurowicą zawierającą nie-neutralizującą anty-limfotoksynę. Test immunologiczny prowadzi się przy użyciu neutralizującego lub nie-neutralizującego przeciwciała, jako komponenty znakowanego, przy czym do znakowania stosuje się wykrywalną substancję, taką jak substancja fluorescencyjna, luminescencyjna lub radioizotopowa,zgodnie ze znanymi metodami. Dla przeprowadzenia testów immunologicznych dla limfotoksyny typu kompetytywnego, limfotoksynę znakuje się w ten sam

155 410 sposób. Odpowiednią substancję do znakowania zarówno limfotoksyny jak i przeciwciała przeciwko limfotoksynie jest Chloramine-T-znakowana izotopem jodu, albo stosuje się metodę J. Klostergaard i innych, Mol. Immun.“ 18, 455 (1980).

W celu uproszczenia przykładów, pewne często występujące metody będą podane w skrócie.

Plazmidy są oznaczone małą literą p, przez którą i/lub po której następują duże litery i/lub liczby. Plazmidy wyjściowe tutaj stosowane są dostępne w handlu lub publicznie dostępne bez żadnych ograniczeń albo mogą być skonstruowane z innych dostępnych plazmidów, zgodnie z opublikowanymi metodami. Inne równoważne plazmidy są znane i dla fachowca oczywiste.

Termin „trawienie DNA oznacza katalityczne rozszczepienie DNA enzymem, który działa tylko w określonym miejscu DNA. Enzymy takie nazywają się enzymami restrykcyjnymi, a miejsca w których specyficznie działają, miejscami restrykcji. „Częściowe trawienie oznacza niecałkowite rozszczepienie przez enzym restrykcyjny, np. w tak dobranych warunkach, aby rozszczepienie nastąpiło w niektórych lecz nie wszystkich miejscach wrażliwych na dany enzym restrykcyjny w cząsteczce DNA. Różne enzymy restrykcyjne tutaj stosowane są dostępne w handlu. Stosowano warunki reakcji, koenzymy i spełniono inne wymagania stawiane. przez dostawców enzymów restrykcyjnych. Zwykle enzymy restrykcyjne oznacza się przez skrót złożony z dużych liter, po których następują inne litery, a następnie, na ogół liczba reprezentująca drobnoustrój, z którego enzym restrykcyjny otrzymano. Na ogół stosuje się około 1/zg plazmidu lub fragmentu DNA z 1 jednostką enzymu w 20pl roztworu buforowego. Odpowiednie bufory i ilość substratów dla poszczególnych enzymów restrykcyjnych są podane przez producenta. Stosowany czas inkubacji zwykle wynosi około 1 godziny w temperaturze 37°C, ale może zmieniać się, w zależności od zaleceń dostawcy enzymu. Po inkubacji usuwa się białko drogą ekstrakcji fenolem i chloroformem, a strawiony kwas nukleinowy odzyskuje się z frakcji wodnej przez wytrącenie etanolem. Czasami, po trawieniu enzymem restrykcyjnym stosuje się hydrolizę bakteryjną, alkaliczną fosfatazą fosforanów na końcu 5', aby zabezpieczyć dwa rozszczepione restrykcyjne końce DNA przed utworzeniem fragmentu kołowego, lub wytworzeniem zamkniętej pętli, która uniemożliwi włączenie fragmentu innego DNA w miejscu restrykcji. Jeśli nie jest to specjalnie zaznaczone, plazmidy nie były traktowane fosfatazą. Metody i odczynniki stosowane przy defosforylacji są znane (T. Maniatis i inni, 1982, Molecular Cloning, str. 133-134).

Terminy „odzyskanie lub „izolacja“danego fragmentu DNA z mieszaniny po trawieniu enzymem restrykcyjnym oznacza rozdzielenie mieszaniny drogą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym, identyfikację żądanego fragmentu DNA poprzez porównanie jego ruchliwości elektroforetycznej z fragmentem DNA o znanej masie cząsteczkowej, służącym jako marker, oddzielenie odcinka żelu, zawierającego żądany fragment i oddzielenie żelu od DNA. Jest to metoda ogólnie znana. Na przykład patrz R. Łowniinni, 1981, „Nucleic Acids Res.“ 9,6103-6114 i D.Goedel i inni, 1980, „Nucleic Acids Res 8, 4057.

Termin „analiza Southerna oznacza metodę potwierdzenia obecności sekwencji DNA lub kompozycji zawierającej DNA w mieszaninie po trawieniu, przez hybrydyzację ze znanym, znakowanym oligonukleotydem lub fragmentem DNA. W niniejszym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej, termin ten oznacza rozdzielenie mieszaniny po trawieniu na 1 %-owej agarozie, denaturację i przeniesienie na nitrocelulozę metodą opisaną przez E. Southerna, 1975, „J. Mol. Biol. 98,503-517, i hybrydyzację metodą opisaną przez T. Maniatisa i innych, 1978, „Celi, 15, 687-701.

Termin „transformacja oznacza wprowadzenie DNA do organizmu w taki spósób, że DNA replikuje się albo jako element poza chromozomalny albo jako składnik chromozomu. Jeśli nie zaznaczono inaczej, oznacza to, że stosowano metodę transformacji E. coli z chlorkiem wapnia, opisaną przez Mandela i innych, 1970, „J. Mol. Biol. 53, 154.

Termin „Jgacja oznacza wytworzenie wiązania fosfodwuestrowego pomiędzy dwoma dwuniciowymi fragmentami DNA (T. Maniatis i inni, 1978, „Celi, 15, 146). Jeśli nie zaznaczono inaczej, oznacza to, że ligację przeprowadzono przy użyciu znanych buforów, i 10 jednostek ligazy 14 DNA („ligaza) na 0,5//g równomolowej ilości fragmentów DNA podlegających ligacji.

Termin „preparowanie DNA z transformantów oznacza izolowanie DNA plazmidowego z hodowli drobnoustroju. Jeśli nie zaznaczono inaczej, oznacza to, że stosowano metodę Maniatisa i innych Id, str. 90, przy użyciu alkaliów/SDS.

155 410

Termin „oligonukleotydy oznacza krótkie jedno lub dwuniciowe polidezoksynukleotyck, chemicznie zsyntetyzowane metodą podaną w przykładzie I, a następnie oczyszczone na żelu poliakryloamidowym.

Przykład I. Oczyszczanie i sekwencjonowanie limfotoksyny.

Prowadzono hodowlę ludzkich komórek limfoblastoidalnych linii RPMI-1788 (ATCC nr CCL-156) w 15-litrowych naczyniach, do uzyskania gęstości komórek 4X 10^s komórek/ml, przy użyciu wolnego od surowicy podłoża hodowlanego (RPMI-1640). Limfotoksynę indukowano 10-20-krotnie ponad poziom wyjściowy (do 500-1000jednostek limfotoksyny/ml, określonych jak podano niżej), poprzez inkluzję 2θ ng/ml octano-mirystynianu forbolu do podłoża RPMI-1640. Po 65 godzinach hodowli komórki zbierano poprzez odsączenie i aktywną limfotoksynę adsorbowano z przesączu na porowatych perełkach lanych (Elektronucleinics), na kolumnie (5 cm X 20 cm), zrównoważonej 5 mM buforem fosforanowym o pH 7,4, i eluowano 50%-owym roztworem glikolu etylenowego w 5 mM buforze fosforanowym pH 7,4. Wszystkie bufory stosowane przy oczyszczaniu limfotoksyny zawierały 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), inhibitor proteazy i 1 mM azydku sodu, dla zahamowania wzrostu drobnoustrojów. Eluant z perełek szklanych zawierał 84 000 jednostek limfotoksyny/mg białka. Następnie stosowano chromatografię na celulozie DEAF, chromatografię na Lentil Lectil Sepharose i oczyszczenie na PAGE według metody B. Aggarwala i innych, 1984, „J. Biol. Chem. 259, (1), 686-691. Homogenność białek odpowiedzialnych za aktywność cytotoksyczną oznaczano metodą SDS/PAGE, HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Lichrosorb RP-18 i przez oznaczenie aminokwasów terminalnych.

Preparat limfotoksyny zawierał więcej niż 95 procent wagowych limfotoksyny z resztą leucylową na końcu aminowym (leucylo-limfotoksyny) o przybliżonej masie cząsteczkowej 25000 oznaczonej na SDS-PAGE. Teoretycznie masa cząsteczkowa składnika białkowego zawierającego leucynę na N-terminalnym końcu wynosi 18 664 daltonów; pozostałe około 6500 daltonów należy przypisać glikozylowemu łańcuchowi bocznemu przy Asn + 62, i być może innym resztom cukrowym. Supernatant z hodowli tkankowej zawiera inne multimery tego rodzaju (60000 daltonów, analiza metodą TSK-HPLC, lub 64000 daltonów, analiza drogą chromatografii na Sephadex G-100). Pozostałe 5% mieszaniny limfotoksyn były to limfotoksyny zawierające resztę histydylową na N-końcu (histydylo-limfotoksyny) o przybliżonej masie cząsteczkowej około 20000. Oba rodzaje wykazywały tę samą aktywność cytostatyczną, przynajmniej w warunkach opisanego poniżej testu na lizę mysich komórek fibroblastu.

Trawienie trypsyną cząsteczek limfotoksyny powodowało powstanie tylko kilku fragmentów Histydylo-limfotoksyna była trawiona na dwa fragmenty, przez rozszczepienie aminokwasów w pozycjach 89 i 90, natomiast leucylo-łimfotoksyna dawała cztery fragmenty po rozszczepieniu aminokwasów w pozycjach 15 i 16, 19 i 20 oraz 89 i 90.

Sekwencję całej cząsteczki i jej fragmentów po trawieniu trypsyną oznaczano techniką degradacji Edmana.

Dalsze informacje o sekwencji uzyskano przez fragmentowanie wyprodukowanej limfotoksyny karboksypeptydazą P i chemotrypsyną, trawienie kwasem octowym i rozszczepianie bromocyjanem. Prawie cała sekwencja ludzkiej limfotoksyny została ustalona tymi metodami. Oznaczono 156 reszt przylegających do końca aminowego. Ustalenie sekwencji wykazało, że różnica pomiędzy dwoma rodzajami limfotoksyn polega na obecności 23 reszt na końcu aminowym leucylo-limfotoksyny, których brak jest w cząsteczce histydylo-limfotoksyny. Oznaczenie sekwencji końca karboksylowego, oprócz trzech reszt, okazało się trudne, ze względu na obecność pewnych wiązań peptydowych obecnych w tym regionie i na hydrofobowy charakter reszt aminokwasowych.

Wyprodukowano syntetyczny gen, kodujący białko według oznaczonej mikro-sekwencji. Gen ten włączono do ogólnego kodonu bias E. coli, to znaczy nie używano kodonów rzadziej stosowanych. W niektórych przypadkach zamiast kodonu bias stosowano kodony ludzkie. Kodon bias wybrano ze względu najego ekspresję w E. coli, oraz aby syntetyczny gen był przydatny w próbach identyfikowania sekwencji na turałnego DNA z ludzkiego cDNA lub banków genów. Do sekwencji wprowadzono specyficzne miejsca restykcyjne Xbal, BamHI, Hind III i Bhlll, aby umożliwić tworzenie fragmentów i późniejszą manipulację genem.

155 410 oryginalnych oligomerów, zaprojektowanych do syntetycznego genu limfotoksyny, wytworzono na stałych fosforynach, metodą Matteucci'ego i innych, 1981, „J. Amr. Chem. Soc.“ 103 3185-1190 i S. Beaucage'a i innych, 1981, „Tet. Letters“,22,1859-1862. Rozmiar tych oligomerów waha się od 16 zasad do 20 zasad i przedstawiony jest na fig. la. Zakładki pomiędzy oligomerami wynosiły 6 zasad. Cały gen jest przedstawiony na fig. lb.

Gen konstruowano w trzech oddzielnych odcinkach. Pierwszy, segment A, liczył 117 par zasad długości i stanowił region 5' kodujący koniec aminowy leucylo-limfotoksyny. Segment B kodował środkową część cząsteczki limfotoksyny i liczył 145 par zasad. Segment C, o długości 217 par zasad, kodował wszystkie, oprócz 16, reszty aminokwasowe końca karboksylowego. Oligomery potrzebne do syntezy każdego z segmentów oczyszczano elektroforetycznie i zbierano. Stosunkowo mały rozmiar każdego oligomeru (16-20 zasad) zmniejsza możliwość błędu w syntezie.

Każdą grupę oligomerów poddawano fosforylacji w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 20 mM Tris-HCl (pH7,5), 10 mM MgCk, 20 mM dwutiotritolu, 0,5 mM ATP i 15 jednostek kinaz.y polinukleotydowej T4 w objętości 50 pi; przy czym mieszanina zawierała około 50 mmola każdego oligomeru. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37°C mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury 65°C w celu zniszczenia aktywności kinazy, a następnie mieszaninę powoli ochłodzono w ciągu jednej godziny, do temperatury 20°C. Fosforylowane oligomery poddano następnie ligacji dodając 10 jednostek ligazy DNA T4 i prowadząc reakcję w ciągu 2 godzin w temperaturze 20°C. Następnie inaktywowano ligazę DNA przez ogrzanie, a zligowane oligomery trawiono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C endonukleazą restrykcyjną, która rozpoznaje określone miejsca terminalne (np. Xbal i BamHl dla segmentu A). Fragmenty każdego segmentu izolowano elektroforetycznie na 7% żelu poliakrylamidowym. Fragmenty o prawidłowej ruchliwości zidentyfikowano przez barwienie bromkiem etydyny i eluowano elektroforetycznie z żelu.

Następnie plazmid pFIFtrp69 trawiono w miejscach Xbal i BamHI (F. Goeddel i inni, 1980, „Nature“ 287, 411-416, lub europejskie zgłoszenie patentowe 0048970), do uzyskania dużego fragmentu wektora, który izolowano elektroforetycznie na 6%-owym żelu poliakrylamidowym. Do tego fragmentu pFIFtrp69 ligowano około 50 mg segmentu A. Podobnie segment B ligowano do fragmentu plazmidu pBR322 trawionego BamHI i Hindlll, a segment C do fragmentu plazmidu pLeFA-125-1. trawionego Hindlll i BglH (D. Goeddel i inni, 1980, „Nuc. Acids Res. 8, 4057 -4073). Zligowaną mieszaninę reakcyjną transformowano do Eżcoli ATCC 31446 i uzyskane plazmidy rekombinantowe charakteryzowano przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej i sekwencjonowano DNA metodą Maxama i Gilberta. Pięć lub sześć klonów segmentu A zawierało żądaną sekwencję. Wyizolowano cztery plazmidy z segmentem B i cztery plazmidy z segmentem C i wszystkie one posiadały prawidłową sekwencję. Każdy segment izolowano przez trawienie endonukleazą restrykcyjną rozpoznającą miejsca terminalne, a następnie ligowano do wektora plazmidowego pFlFtrp69 trawionego w miejscach Xbal i BglH. Uz.yskany plazmid rekombinatowy, pL ΤΧΒ1, zawierał w miejscu Xbal-Bglll wstawiony fragment o sekwencji przedstawionej na fig. la.

Dla określenia, czy syntetyczny gen rzeczywiście produkuje biologicznie aktywną limfdtoksynę, transformanty E. coli pL ΤΧΒ 1 hodowano na podłożu minimalnym w warunkach derepresji promotora trp. pozwalających na ekspresję syntetycznego genu limfotoksyny. Hodowle prowadzono do gęstości optycznej 1,0 przy 550 nm i komórki odwirowywano. Następnie osad komórek zdyspergowano w 1/10 objętości wyjściowej i lizowano za pomocą ultradźwięków.

Aktywność limfotoksyny oznaczano zmodyfikowanym testem lizy komórek według B. Spofforda, 1974, J. Immunol, 1ί2,2111. W skrócie, komórki fibroblastu myszy L-929 hodowano na płytkach do mikromiareczkowania, w obecności aktynomycyny D. Po 12-18 godzinach do każdej studzienki płytki dodano po 0,125 ml seryjnie rozcieńczonej próbki badanej na limfotoksynę. Po 18 godzinach płytki przemyto i określono lizę komórek indukowaną przez limfotoksynę na podstawie przylegania do płytek, przez wybarwienie płytek 1%-owym roztworem krystalicznego fioletu w mieszaninie metanol-woda w stosunku 1:4 (objętościowo). Intensywność wybarwienia określono zarówno wizualnie, jak i spektrofotometrycznie przy 450 i 570 nm przy użyciu spektrofotometru Dynatech. Płytki z komórkami i samym podłożem określano jako zero procent lizy, natomiast płytki z dodatkiem 3M roztworu chlorowodorku guanidyny jako 100% lizy. Jedną jednostkę limfotoksyny zdefiniowano jako ilość potrzebną do 50% lizy 12000 komórek na każdej płytce. Należy zaznaczyć, że inne próby na aktywność cytotoksyny mogą być również stosowane. Na przykład patrz. B. Aggarwal i inni, „Thymic Hormones and Lymphokines, 1983-wyd. A. Gołd155 410 stein, Spring Symposium on Health Sciences George Washington Univ. Medical Center (linia komórek A549, potrzebnych do tego testu jest dostępna w kolekcji ATCC jako CCL185). Lizaty hodowli nie wykazywały wykrywalnej aktywności cytolitycznej, w wyżej opisanym teście na komórkach mysich. Lizaty kontrolne z hodowli wytwarzających gamma interferon, miały aktywność gamma-interferonu. Ten wynik sugerował, że syntetyczny gen nie koduje aktywnej limfotoksyny. Było kilka możliwych wytłumaczeń tego faktu. Na przykład: (1) E. coli degraduje limfotoksynę, (2) Gen limfotoksyny nie ulega transkrypcji w E. coli. (3) informacja genu limfotoksyny nie ulega translacji w E. coli, (4) białko nie posiada odpowiedniej sekwencji, ze względu na błąd w określaniu sekwencji białka, (5) 16 reszt aminowych z karboksylowego końca jest rzeczywiście potrzebnych do wytworzenia aktywnego białka lub do wytworzenia odpowiedniej konfiguracji cząsteczki limfotoksyny.

Przykład H. Sposób wytworzenia limfotoksyny kodowanej przez cDNA.

Izolowano RNA z hodowli frakcji i komórek nie-adherentnych limfocytów ludzkiej krwi obwodowej, 48 godzin po indukcji octano-mirytynianem forbolu (lOng/ml), enterotoksyna B ze stafilokoka (lzg/ml) i tymozyną a-l (S. Berger i inni, 1979, „Biochemistry 18, 5143-5149). Hodowla ta wytwarzała 400 jednostek limfotoksyny w ml supernatantu. mRNA zatężono przez adsorpcję na im mobilizowanym oligo dT, eluowano i przygotowano cDNA przez odwrotną transkrypcję (P. Gray i inni), 1982, „Nature“, 295,503-508). Do wytworzenia kopii cDNA z mRNA znanymi metodami stosowano odwrotną transkryptazę, a drugą nić przygotowano znanymi metodami w reakcji Klenowa, a cDNA traktowano S-l nukleazą, w celu usunięcia pętli o strukturze spinki do włosów. W celu włączenia tego cDNA do wektora, końce ligowano do adaptora lub linkera tak aby wytworzyć miejsca enzymów restrykcyjnych 5' i 3', lub, korzystnie, lepkie końce, dla predeterminowanej restrykcji. W tym celu stosowano oligonukleotyd 5'HO-AATTCATGCGTTCTTACAGGTACGCAAGAATGTC-P-5'. Oligonukleotyd ten ligowano do cDNA, a cDNA ponownie izolowano elektroforetycznie na żelu poliakrylamidowym.

Ogólnie dostępny fag 3gtlO (lub jego równoważnik Agtll, dostępny w ATCC), trawiono EcoRi i odzyskiwano liniowy fragment (M. Wickens i inni, 1978, „J. Biol. Chem.“ 253 2483-2495). Liniowy odwrotny transkrypt i strawiony fag Agtll ligowano i mieszaninę po ligacji użyto do transfekcji E. coli C-600 lub innego znanego gospodarza odpowiedniego do infekcji fagiem λ. Około 10000 rekombinantów fagowych umieszczono na 15 cm płytce i poddano skriningowi metodą hybrydyzacji (T. Maniatis i inni, 1978, „Celi, 15, 687-701 i P. Gray i inni, „PNAS“ 80, 5842-5846) po użyciu próby znakowanej ³²P, wytworzonej z segmentu A przedstawionego na fig. la, metodą J. Taylor i innych, 1976 „Biochem. Biophys. Acta, 442,324-330, stosując primery DNA grasicy cielęcej (PL Biochemistry). Podwójne filtry nitrocelulozowe hybrydyzowano z 5 X 10⁷ cpm próby w 20%-owym formamidzie. Filtry przemyto dwukrotnie 0,3 M chlorkiem sodu, 0,03 M cytrynianem sodu i 0,1%-owym siarczanem dodecylu (SDS) w temperaturze 37°C.

Dwa fagi hybrydyzujące z próbą oczyszczano. Oczyszczone fagi hybrydyzowały zarówno z segmentem-A jak i segmentem B. Włączone odcinki cDNA dwóch hybrydyzujących fagów ALTl i Λ LT2 subklonowano do Μ l3mp8 i sekwencjonowaną metodą łańcuchów terminalnych (A. Smith, 1980, „Methods in Enzymology, 65, 560-580). Odcinek włączony do ALT2 liczył tylko 600 par zasad i nie zawierał całego regionu 3' kodującego limfotoksynę. Insert λ LT1 zawierał cały odcinek kodujący leucylo-limfotoksynę, plus nietranslatowany region liczący 650 par zasad na końcu 3' i kodon dla 18 aminokwasów terminalnych, na końcu leucylowym. Ponieważ to nie obejmowało całego kodonu limfotoksyny przeprowadzono następną próbę i przetestowano następnych 25 000 rekombinantów faga AgtO (patrz T. Huynh i inni), 1984, Practical Approaches in Biochemistry IRL Press, Oxford). Wyizolowano dodatkowo 12 hybrydyzujących fagów. Sekwencja najdłuższego odcinka włączonego przedstawiona jest na fig. 2a. Najdłuższy obszar odczytywany był translatowany począwszy od pierwszego napotkanego ATG. Liczby nad każdą linią oznaczają pozycję aminokwasu, a liczby pod linią pozycję nukleotydu. Reszta leucylowa oznaczona cyfrą „1“ jest pierwszą resztą sekwencji leucylo-limfotoksyny fig. ła) i pierwszą amino-terminalną resztą dojrzałych rodzajów limfotoksyny. Pierwsze 34 reszty są sekwencją sygnałową. Reszty 156-171 nie były oznaczone drogą sekwencjonowania białka limfotoksyny, lecz określone teoretycznie na podstawie sekwencji nukleotydów.

155 410

Przykład III. Wytwarzanie oczyszczonej leucylo-limfotoksyny i jej mutantów.

A. Konstrukcja wektora ekspresyjnego — hydrydu syntetyczny gen/naturalny cDNA do wytwarzania leucylo-limfotoksyny i jego ekspresja.

Metodę konstrukcji przedstawiono na fig. 2b. Plazmid pL ΤΧΒ1 (zawierający nieaktywny gen syntetyczny) poddano częściowemu trawieniu EcoRI i Pstl i izolowano fragment liczący 685 par zasad, zawierający DNA kodujący 125 N-terminalnych reszt limfotoksyny. Zastosowano częściowe trawienie Pstl, ze względu na obecność dodatkowego miejsca Pstl w reszcie 10 (fig. la). Izolowano fragment liczący 301 par zasad, zawierający DNA kodujący 51 C-terminalnych aminokwasów limfotoksyny, poprzez trawienie subklonowanego cDNA w ALTl przy użyciu EcoRI i Pstl (miejsca te są przedstawione w górnej części fig. 2a w pozycjach nukleotydów 554 1855). Fragmenty te izolowano przez elektroforezę na 5%-owym żelu poliakrylamidowym i elektroelucję. Fragmenty ligowano plazmidem pBR322, który uprzednio był trawiony EcoRI i defosforylowany bakteryjną fosfatazą alkaliczną, dla zmniejszenia ilości transformantów podstawowych. Uzyskany plazmid ekspresyjny pLTtrpl analizowano endonukleazą restrykcyjną i sekwencjonowano DNA. Po transformacji E. coli 31466 plazmidem pLTrpl i przeprowadzeniu hodowli transformantów na podłożu zawierającym tetracyklinę w temperaturze 37°C, w ciągu 4-6 godzin, do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0, osiągnięto ekspresję leucylo-limfotoksyny. Lizaty komórkowe miały aktywność cytotoksyczną. Stwierdzono, że koniec leucylowy, wytworzonej limfotoksyny jest podstawiony zablokowaną resztą metionylową. Prawdopodobnie produkt tej syntezy jest raczej formylo-metionylo-limfotoksyną, niż metionylo-limfotoksyną.

B. Oczyszczanie limfotoksyny drogą immunopowinowactwa.

Linię monoklonalnych komórek mysich, wydzielających anty-limfotoksynę hodowano w myszy i oczyszczono z płynu puchlinowego drogą chromatografii jonowymiennej. Eluat z wymieniacza jonowego (aminowego) przyłączono do substancji o nazwie Sepharose, aktywowanej bromocyjanem, stosując stężenie 2 mg/ml żywicy. Kolumnę o objętości 20 ml zrównoważono kolejno TBS (zawierającym 0,05M Tris-HCl, pH7,0, 0,15M chlorku sodu i 2mM EDTA); następnie buforem do elucji (zawierającym 0,1 M kwasu octowego pH 4,5 i 150 mM chlorku sodu); a w końcu TBS. Osad, otrzymany poprzez wytrącenie siarczanem amonu do 40% nasycenia lizatu wytworzonego za pomocą ultradźwięków, E. coli transformowanej plazmidem pLTtrpl (uprzednio sklarowanego przez wirowanie) zdyspergowano w 0,1 M Tris-HCl pH7,4 i 5mM EDTA i zawiesinę przepuszczano przez kolumnę z szybkością jednej objętości kolumny na godzinę. Po intensywnym przemywaniu TBS zwierającym 0,05% Tween 20, specyficznie związany materiał eluowano buforem do elucji, doprowadzono pH natychmiast do 7,8 za pomocą 0,1 objętości 1M Tris-HCl pH 8,5 i przechowywano w temperaturze 4°C. Aktywność specyficzna tej oczyszczonej limfotoksyny wynosiła 2-10 X 107 jednostek/mg, według pomiarów testem mysim L-929, podanym powyżej.

Eluat zawierał większość aktywności wprowadzonej na kolumnę. Większość całkowitych białek eluatu migrowało jako pojedyńczy prążek zarówno w warunkach redukujących jak i nieredukujących w elektroforezie na żelu poliakrylamidowym, z dodatkiem SDS. Ruchliwość tego prążka odpowiadała w przybliżeniu masie cząsteczkowej 18 000, która jest zgodna z poprzednią wartością masy cząsteczkowej 18664 dla nieglikozylowanej leucylo-limfotoksyny, wydedukowanego na podstawie sekwencji aminokwasów. Dla dalszego scharakteryzowania aktywności biologicznej, oczyszczoną limfotoksynę rekombinantową testowano na aktywność cytolityczną in vitro i aktywność przeciwnowotworową in vivo.

C. Specyficzna co do miejsca mutageneza limfotoksyny.

Postępowano zgodnie z metodą opisaną w punkcie A, z tą różnicą, że segment 6 syntetycznego oligonukleotydu zmodyfikowano do sekwencji 5' CTCAACTCTGCACCA 3', a jego nić komplementarna (segment 53) do sekwencji 3' AGACGTGGCTCGTCGT 5'.

Modyfikowane oligonukleotydy „sklejano z pozostałymi oligonukleotydami oraz ligowano z wektorem ekspresyjnym opisanym w punkcie B. Wektor ten zawiera 2 pary zasad podstawione, co zmienia lizynę w pozycji +28 kodonu na histydynę Mutant histydynowy podlega ekspresji po transformacji E. coli ATCC 31446.

Inne mutanty określonego miejsca są przygotowane w ten sposób, korzystnie selekcjonując kodony, tak aby nie angażować miejsca EcoRI, co wymagałoby użycia częściowego trawienia enzymem restrykcyjnym EcoIRI plazmidu pLTXB 1, opisanego w punkcie A. Mutacje nie powinny

155 410 również wprowadzać dodatkowych miejsc Xbal lub BamHI do fragmentu A (patrz fig. lb), miejsce BamHI lub Hindlll do fragmentu B, albo miejsc Hindlll lub BgHI do fragmentu C. Z drugiej strony, zastosowanie częściowego trawienia będzie konieczne w przypadku użycia plazmidu pLTXBl; całkowite trawienie prowadziłoby raczej do powstania mutanta z delecją niż do muntanta podstawionego, który jest przedmiotem niniejszego przykładu.

Przykład IV. Biologiczna aktywność in vivo rekombinantowej limfotoksyny.

Testowano łimfotoksyny rekombinantową i limfoblastyczną w próbie in vivo - w martwicy nowotworowej. Hodowano raki MethA(a) w ciągu 7 dni w odpowiednich szczepach myszy BALB(Cx C57Bl(6fl lub CBófl), a następnie do nowotworów złośliwych wstrzyknięto limfotoksynę otrzymaną według przykładu III limfotoksynę limfoblastoidalną (przygotowaną i oczyszczoną jak podano powyżej) i próbki kontrolne. Po 20-24 godzinach myszy uśmiercono, nowotwory wycięto i badano histologicznie określając stopień martwicy. Jak wykazuje tabela, łimfotoksyny — zarówno rekombinantowa jak i limfoblastoidalna powodowały znaczną martwicę nowotworu złośliwego (MethA) in vivo. Próbki kontrolne nie indukowały martwicy nowotworu MethA(a).

Tabela

Martwica nowotworu złośliwego MethA(a) in vivo wywołane limfotoksyną rekombinantową i naturalną

	Liczba myszy
Współczynnik martwicy nowotworu
	+++	++	+	-
Bufor 1 — kontrola		-		3
Limfotoksyną limfoblastoidalna, 25 000 jednostek	4
Limfotoksyną limfoblastoidalna, 10000 jednostek	4
Limfotoksyną rekombinantowa, 200000 jednostek	14	2	2
Limfotoksyną rekombinantowa 25 000 jednostek	3			1
Limfotoksyną rekombinantowa, 10000 jednostek	3		1
Bufor 2 — kontrola	-	-	-	9

Limfotoksynę limfoblastoidalną wstrzyknięto po rozpuszczeniu w buforze 1 (0,01 M TrisHC1, 0,05 M siarczan amonu, pH 8,0) a limfotoksynę rekombinantową wstrzyknięto po rozpuszczeniu w buforze 2 (0,15 M NaCl, 0,1 M octan sodu o 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8).

Nieobecność węglowodanów w limfotoksynie rekombinantowej wydaje się nie wpływać na aktywność biologiczną, ponieważ aktywność specyficzna łimfotoksyny produkowanej przez hodowlę rekombinantową (2-10 X 10⁷ jednostek/mg) jest w przybliżeniu taka sama jak łimfotoksyny limfoblastoidalnej (4X 10⁷ jednostek/mg).

Aktywność łimfotoksyny rekombinantowej wykazuje również podobną do łimfotoksyny naturalnej termolabilność, to jest ulega inaktywacji w roztworach wodnych ogrzewanych do temperatury 80°C w ciągu 1 godziny.

Przykład V. Wytwarzanie histydylo-limfotoksyny.

A. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.

Konstrukcja plazmidu, który kieruje ekspresję metionylo-histydylo-limfotoksyny u E. coli, jest przedstawiona na fig. 3. Włączono syntetyczny nukleotyd do plazmidu ekspresyjnego tak aby kodował kodon inicjujący metioniny, przylegający do kodonu histydylowego histydylolimfotoksyny (reszta 24 na fig. 2a). Dokonano tego przez izolację fragmentu wektora liczącego 4630 par zasad po trawieniu plazmidu pLTrpl enzymami Xbal i Ciał, oczyszczenie elektroforetyczne na 1% agarozie i elektroelucję. W ten sam sposób izolowano fragment liczący 570 par zasad, zawierający większość sekwencji kodującej limfotoksynę, po trawieniu plazmidu pLTtrpl enzymami BamHI i Ciał. Dwa syntetyczne oligonukleotydy syntetyzowano metodą opisaną poprzed20

155 410 nio i mieszano je z oligonukleotydami 6, 7, 52 i 53 przedstawionymi na fig. la. Około 50pmola każdego nukleotydu trawiono kinazą polinukleotydową w sposób opisany w przykładzie I. Oligonukleotydy ligowano z mieszaniną opisanych wyżej fragmentów wektora liczących 570 par zasad i 4630 par zasad. Mieszaninę ligocyjną transformowano E. coli ATCC 31446 i selekcjonowano rekombinanty na podstawie oporności na tetracyklinę. Z jednego z transformantów wyizolowano plazmid p20KLT. Plazmid ten scharakteryzowano przy użyciu enzymów restrykcyjnych i analizy sekwencji DNA.

B. Wytwarzanie wariantu hybrydowego cytotoksycznej limfotoksyny.

Skonstruowano plazmid zawierający DNA kodujący hybryd limfotoksyny z białkiem bakteryjnym przez sklonowanie sekwencji kodującej bakteryjne białko sygnałowe w strukturalnym genie limfotoksyny. Scharakteryzowano sekwencję genu termostabilnej enterotoksyny II (STU) z E. coli (R. N. Picken i inni, 1983, Infection and Immunity“ 42, 269-275) i kodowano sekwencję 23 aminokwasów sygnałowych, która kieruje wydzielaniem STU do przestrzeni periplazmicznej E. coli.

Plazmid pWM501 (Picken i inni), 1983, „Infection and Immunity 42 (1), 26^<^-2Ί^/ zawierał gen termostabilnej enterotoksyny (STU). Odcinek DNA kodujący gen STU izolowano z plazmidu pWM501 w następujący sposób. Plazmid pWM501 trawiono Rsal i izolowano fragment DNA liczący 550 par zasad. Ten fragment genu ligowano z fagiem M13mp8 (J. Messing i inni), Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, wyd. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), str. 143-153), który był uprzednio trawiony Smal. Zligowany DNA użyto do transformowania E. coli JM101, dostępnego w sprzedaży szczepu do stosowania razem z fagiem M13. Izolowano czyste łysinki. Następnie izolowano znanymi metodami (J. Messing i inni, jak wyżej) z E. coli JM101 pochodną dwuniciową M13mp8 STII Rsa. Fragment liczący około 550 par zasad, zawierający gen liderowy STU wiązano, przy użyciu wyżej opisanej metody subklonowania M13mp8, do serii różnych miejsc, rozszczepianych endonukleazą restrykcyjną faga. Następnie traktowano pochodną M13mp8 STU enzymami EcoRI i Pst i izolowano fragment DNA liczący niewiele ponad 550 par zasad.

Fragment EcoRI-Pstl subklonowano do pBR322. Dokonano tego przez trawienie pBR322 enzymami EcoRI i Pstl i izolację wektora. Izolowany wektor ligowano z fragmentem DNA EcoRI-Pstl. Tę mieszaninę DNA używano do transformowania E. coli ATCC 31446 i selekcjonowano kolonie oporne na tetracyklinę. Z opornej kolonii E. coli izolowano plazmid, który oznaczono pSTII — częściowy pSTII — częściowy plazmid trawiono enzymami MnII i BamHI i izolowano fragment liczący 180 par zasad, zawierający sekwencję STU Shine-Dalgarno, sekwencję sygnałową STU i pierwsze 30 kodonów dojrzałego genu STU. Fragment DNA liczący 180 par zasad ligowano do plazmidu zawierającego promotor trp. Jeden taki plazmid opisano poprzednio — plazmid pHGH207 (H. DeBoer i inni), 1982, Promoters Stucture and Function, wyd. R. Rodrigus i inni, Chamberlin, Praeger Pub., New York, NY, str. 462-481). W przykładzie tym użyto pochodnej tego typu plazmidu pHGH207/l, w której miejsce 5' EcoRI trp promotora przekształcono w EcoRI' poprzez wypełnienie polimerazą DNA I (DNApolI) i połączenie tępych końców przez ligację (S. Cabilly i inni, 1984, „Proc. Nat. Acad. Sci. USA“, 81,3273-3277). Plazmid zawierający promotor trp trawiono Xbal i traktowano DNApolI i wszystkimi czterema dNTP aby wypełnić sekwencję.

Następnie preparat DNA trawiono BamHI i izolowano fragment zawierający wektor. Wektor ten ligowano z opisanym poprzednio, liczącym 180 par zasad fragmentem zawierającym DNA sygnałowego STU. Mieszaninę po ligacji użyto do transferowania E. coli ATCC 31446, opornej na ampicylinę. Z kolonii opornej na ampicylinę izolowano plazmid oznaczony jako STII-lider.

Fag Ml3, zawierający sekwencję kodującą STU był po raz pierwszy skonstruowany poprzez ligację, liczącego 180 par zasad fragmentu Xba I-BamHi plazmidu STII-lider do M13mpl0 trawiono enzymami Xbal- BamHI. Uzyskany DNA faga, PSTII-shuttle charakteryzowano przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej i sekwencjonowania nukleotydów. Następnie wprowadzono sekwencję kodującą LT do tego wektora przez ligację, liczącego 700 par zasad fragmentu Hpa-IEcoRI plazmidu pLTtrpl i replikacyjnej formy DNA (RF, podwójnoniciowa) plazmidu pSTIIshuttle, trawionego Smal i EcoRI; miejsca Smal i Hpal mają tępe końce i ligują razem (z utratą obu tych miejsc). Uzyskany fag DNA, MI3-STII-LT, scharakteryzowano, a następnie użyto do mutagenezy w następujący sposób. Primer 5'p CaAaTGCCTATGCACTGcCaGGCCTAGG po

155 410 uprzednim traktowaniu kinazą, zmieszano z matrycą (M13-STII-LT) w obecności buforu do ligacji i DNa faga Ml3mpl0 RF trawionego Xbal i EcoRI (według J. P. Adelmana i innych), 1983, „DNA 2, 183-193); mieszaninę ogrzewano do 95°C, następnie pozostawiono do „sklejenia w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, a następnie umieszczono w lodzie na 30 minut. Wszystkie cztery trójfosforany dezoksynukleotydów dodano do mieszaniny razem z ΑΤΡ, T4 DNA ligazą i dużym fragmentem (Klenowa) DNA polimerazy ItE. coli. Mieszaninę inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 14°C, a następnie użyto do transfekcji odpowiedniego E. coli JM101, szczepu dostępnego w sprzedaży, lub innego gospodarza faga M13. Prawidłowo zmutagenizowane fagi identyfikowano metodą hybrydyzacji przy użyciu znakowanego ³²P primera jako wzorca. Uzyskany fag ST-LT-mut charakteryzowano przez analizę sekwencji DNA. Z tego faga przygotowano replikującą się formę DNA, której użyto do izolacji, liczącego 761 par zasad fragmentu Sbal-EcoRI, zawierajcego DNA dla sekwencji sygnałowej STU sąsiadującej z sekwencją kodującą leucylo-limfotoksynę. Ten DNA ligowano z liczącym 4285 par zasad fragmentem (duży fragment) plazmidu p20KLT trawionego Xbal i BamHI i liczącym 375 par zasad fragmentem plazmidu pBR322 trawionego EcoRI i BamHI. Uzyskany plazmid, pST18LT, charakteryzowano przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA.

W podobny sposób przygotowywano konstrukcję kodującą sygnałowego białka STU do reszty histydyny histydylo-limfotoksyny. Uzyskany plazmid transformowano do E. coli ATCC 31446. Izolowano plazmidy pSTLTIS i pSTLTló. Następnie potwierdzono ich zdolność do kodowania fuzji STU drogą analizy przy użyciu enzymów restrykcyjnych i sekwencjonowania dwudezoksynukleotydów. E. coli transformowano plazmidami pSTLT18 lub pSTLTló syntetyzuje białko hybrydowe złożone z sekwencji sygnałowej STU i leucylo- lub hystydylo-limfotoksyny, jak to stwierdzono z wyliczeń masy cząsteczkowej przez elektroforezę na żelu. Lizaty E. coli zawierające to białko hybrydowe wykazują aktywność cytotoksyczną.

Przykład VI. Identyfikacja DNA genomu kodującego mysią i bydlęcą limfotoksynę.

Sekwencja aminokwasów mysiej i bydlęcej limfotoksyny.

Wyizolowano geny mysiej i bydlęcej limfotoksyny z banku genów A. cDNA fragment ludzkiej limfotoksyny (PvuII-RcoRI, 600 par zasad) oznakowano ³²P, metodą nicktranslacji i użyto jako wzorce do skriningu DNA genomu mysiego z banku A (DNA genomu szczepu mysiego z A Charon4A, T. Maniatis i inni, Molecular Cloning, str. 31, 1982) i niezależnie DNA genomu bydlęcego z banku (EP 88622A). Prowadzono hybrydyzację, w łagodnych warunkach, w 20%owyra formamidzie (Gray i Coeddel „P. N. A. S. USA, 80,5842-5856 (1983) i filtry przemywano dwukrotnie, 0,3 M roztworem wodnym chlorku sodu, 0,03 M cytrynianem sodu i 0,1% SDS. Kilka fagów, które hybrydyzowaiy z wzorem ludzkiej limfotoksyny oczyszczono z łysinek (T. Maniatis i inni, „Celi 15,687-701 (1978). Przygotowano DNA faga (T. Maniatis i inni), jak wyżej, trawiono endonukleazą restrykcyjną i analizowano metodą hybrydyzacji Southema. Oba fragmenty hybrydyzowały z wzorcem ludzkim limfotoksyny — fragment DNA mysiego po trawieniu EcoRI, liczący 3500 par zasad i fragment DNA bydlęcego po trawieniu EcoRI, liczący 2200 par zasad. Te fragmenty DNA subklonowano do plazmidu pBR322, a natępnie sekwencjonowano metodą określania końcowych łańcuchów dwudezoksy (A. J. H. Smith, Methods in Enzymology 65, 560-580 (1980). Wydedukowane sekwencje białek limfotoksyny mysiej i bydlęcej, w porównaniu z sekwencją limfotoksyny ludzkiej, przedstawiona jest na fig. 4.

Przykład VII. Ekspresja limfotoksyny u drożdży, pod kontrolą promotora ADH.

Trawiono plazmid pLTtrp enzymem Xbal w celu otwarcia plazmidu w miejscu Xbal, znajdującym się w pobliżu startowego kodonu limfotoksyny. Lepkie końce Xbal tępiono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA z E. coli z czterema dNTP. Adaptor EcoRI, o strukturze:

OH

I .

AATTCCCGGC 3 . GGGCCC-P

3' Oh

5'

155 410 licowano do stępionego fragmentu plazmidu, sterczącą terminalną grupę hydroksylową poddawano fosforylacji, przy użyciu kinazy polinukleotydowej, mieszaninę ligocyjną użyto do transformowania E. coli ATCC 31446, i identyfikowano przez analizę restrykcyjną plazmid pLTtrpRl, który zawiera dodatkowe miejsce EcoRI, sąsiadujące ze startowym kodonem limfotoksyny. Plazmid pLTtrpfRl izolowano, trawiono EcoRI i wydrębniono fragment SP, zywierający DNA limfotoksyny.

Plazmid pFRPn (EP 60o57A) trawiono EcoRI, traktowano fosfatazą alkaliczną aby zapobiec recyrkularyzacji, ligowano do fragmentu SP limfotoksyny przy użyciu ligazy DNA T4 i mieszaninę ligacyjną użyto do transformowania E. coli ATCC 31446. Kolonie oporne na ampicylinę dały dwie serie plazmidów zawierających wstawkę SP, w odwrotnej orientacji, jak to wykazywała analiza restrykcyjna w elektroforezie na żelu agarozowym. Plazmidy z transformantów E. coli oczyszczono i użyto do transformowania drożdży mających mutację trpl (na przykład szczep drożdży RH218, niezastrzeżony ATCC depozyt Nr 44076), do fenotypu trp+. Transformowane drożdże, które zawierały plazmidy tak zorientowane, że kodon startowy segmentu SP przylegał do fragmentu promotora dehydreogenazy alkoholowej, wykazywały ekspresję limfotoksyny. Limfotoksynę wyizolowano z ekstraktów transformantów drożdżowych. Stabilność plazmidu w fermantacji na dużą skalę może być polepszona przez zastosowanie plazmidu ekspresyjnego, zawierającego 2mikronowy odcinek replikacyjny, zamiast chromozomalnego odcinka replikacji pFRPn (ars 1) i odpowiedni szczep gospodarza (J. Meggs, „Naturę 275, 1104-109, 1978).

Przykład VIII. Ekspresja limfotoksyny w komórkach ssaków.

Fag Tl 1 (przykład II) trawiono EcoRI i izolowano fragment zawierający DNA limfotoksyny (odwrotny transkrypt). Plazmid pFHER (EP 117, 060A) trawiono EcoRI, traktowano fosfatazą alkaliczną z przewodu pokarmowego cielęcia i ligowano do odwrotnego transkryptu ALT11. Uzyskane plazmidy hodowano w E. coli ATCC 31446 (EP 117060A) i oznaczono pFHERLT i pFHFRLT II. Jak wykazała analiza restrykcyjna na żelu poliakrylamidowym zawierają one DNA limfotoksyny w odwrotnych orientacjach. Plazmidy te używano do transfekcji wybranych komórek CHO DHFR-DUX-B11, CHO i Ltk'.

Hodowle tkankowe transfekowano w następujący sposób. Zmieszano 1/tg pFHFRLT I, lub pFHFRLT II, przygotowanych metodą opisaną wyżej, z 10/zg nośnikowego DNA szczura, w objętości 250 /zl, 0,25 M CaCb, i dodano kroplami 250μ\ buforu HEPES z dodatkiem soli (280 mM NaCl, 1,5 mM NazPCL, 50 mM HEPES, pH 7,1) — po 30 minutach w temperaturze pokojowej, roztwór ten dodano do hodowli tkankowej rosnącej na plastikowych szalkach do hodowli tkankowych, o średnicy 60 mm. Używano komórki CHO 1, CHO DHfR-DUX-B1 1 i Ltk'. Szalki zawierały po 3 ml podłoża odpowiedniego dla hodowanych komórek.

Do komórek CHO i CHO DHFR-DUX-B11 stosowano podłoże Ham F-12 (Gibco) wzbogacone 10% surowicy cielęcej, 100 /zg/ml penicyliny, 100//g/ml streptomycyny i 2/tmM L-glutaminy. Dla komórek Ltk' stosowano podłoże Dulbecco zmodyfikowane przez Eagla (DMEM) wzbogacone składnikami podanymi dla położą Ham F-12. Po 3-16 godzinach podłoże usunięto, a komórki przemyto 20%-owym glicerolem i buforem fosforanowym z dodatkiem soli. Do każdej płytki dodano następnie świeże podłoże i komórki inkubowano w ciągu dwóch natępnych dni.

Selekcję transfekowanych komórek gospodarza prowadzono przez trypsynizację komórek po dwóch dniach wzrostu (która obejmowała traktowanie komórek sterylnych roztworem trypsyny o stężeniu 0,5mg/ml zawierającym 0,2mg/ml EDTA) i przeniesienie około 3Χ10⁵ komórek na płytki o średnicy 10 mm, zawierająca podłoże selekcyjne. Do komórek dhfr” jest to podłoże F-J2 Gibco bez glicyny, hypoksantyny i tymidyny (GHT- podłoże). Dla komórek gospodarza DHFR* do normalnego podłoża wzrostowego dodawano 100 - 1000 nM metotreksatu. Kontrole prowadzono w warunkach prowadzenia transfekcji, bez użycia plazmidu, lub przy użyciu plazmidu pFD-11 (EP 117060A), zawierającego normalny DHFR. Kolonie powstałe z komórek, które przeżyły i wykazują ekspresję plazmidu DHFR pojawiają się po około 1-2 tygodniach. Zidentyfikowano transformanty wytwarzające dojrzałą limfotoksynę.

155 410

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania limfotoksyny, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek stransformowanych replikującym się wektorem zawierającym kwas nukleinowy wybrany z grupy obejmującej DNA kodujący limfotoksynę o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig. 2a, lub jej warianty, wolny od wstawek nie ulegających translacji, DNA kodujący limfotoksynę o sekwencji przedstawionej na fig. 2a, lub jej warianty, wolny od DNA kodującego inne białka organizmu, z którego pochodzi DNA, i kwas nukleinowy zdolny do hybrydyzowania z kwasem nukleinowym kodującym limfotoksynę o sekwencji przedstawionej na fig. 2a, lubjej warianty, przy czym ten hybrydyzujący kwas nukleinowy ma sekwencję nukleotydów inną, niż naturalny DNA lub RNA kodujący limfotoksynę, we wspomnianej hodowli komórek gromadzi się limfotoksynę i wydrębnia się ją.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki stosuje się komórki drożdżowe lub komórki ssaka innego niż człowiek i stosuje się kwas nukleinowy kodujący ludzką prolimfotoksynę, a z hodowli wyodrębnia się limfotoksynę o wariantowej glikozylacji.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki stosuje się komórki prokariorta.

   flLPGVG_LTPSA_AOTAROHPKRH_>_LAHSTjLKP -1-v-2-v-3-v--—s V-5 - v-------ii/ A V ' ‘ν’ ’ ' ‘ 3”'··' X V*“

   TCTAGAATTATGCTGCCAGGCGTAGGTCTGACTCCATCTGCAGCACAGACTGCACGCCAGCACCCAAAG^^GCACCTGGCACACTCAACTCTGAASCCAG AGATCnMTACGACGGTCCGCATCCAGACT6AGGTAGACGTCGTGTCTGACGTGCGGTCGT6GGTTTCTACGTGGACCGTGTGAGTrGAGACTrCGGTC ^v-58-A--57-A-56-A-55-a-54-a-55—

   XbaI

   100

   CAGCACACCTGATCGGGGGTrCCArCAAACAGGACCrCCTTGCrGTGGGGCGAAACACCCGTCGGGGAπCCTGCAAGATGGCπcrCCCTGrCCAACAA GTCGT6TGGACTAGCCCCTAGGGAGGGTTTTrCTGAGG6ACGACACCGCαGGπrTGCrTGCGCGrTAAGAAGTTTrAACGGAGGAG6GACAGGπGTT - -a-52-a-50-a-Ag-a_ BamHI

   200

   -52-A8-A7SLLVPTS61YFVYS0VVFSGKAYSPKATSSPLY

   -23-----ji|--15-v-16-v-27---- ^- ' ^-18-ν^-

   CTCCCTGCrGGTGCCAACCTCCGGTArCTACΠC6TATACTCACAGGrGGrGTTCTCCGGTAAAGC'ΠΆCTCCCCAAAGGCAACTTCCrCCCCACrGTAC 500

   GAGGGACGACCACGGπGGGGGCCATAGATTMGGATATGAGGrGrCACCACAAGAGGGCArIrrCGGATTAGGG6GTTCCGGTGAGGAG6GGTGACATG

   -AG-A5-AA-A3KindIH

   -A2LAHEVOLFSSOYPFHVPLLSSOKRYYPGLOEPK -19-y-20--—v-21-v-22 v-23-v 2A-v

   ATGGTGTACCl

   ĆĆ6TGrGCKCAC6TrfAĆ.AAGAGGAGGGrCATAG6rAAAG'rGCACGGTG₁ACGAAAGGGGGGGCππACCACAT _£0-^A-59-^A-38-a-37-^A-35TGCAGGAGCCATGGC CAGACGTCCTCGGTACCG Ρ,τΐ ~⁵⁵A00

   LHSRYHGAAFOLTOGDOLSrHTDGIP -25--v-26-v-27-v-28-v-29-

   BeUI

   Fig. 1A.

   A8A

   58 ST S? 55 4 55 52 5i 50 ^1?° «ΪΓ 47 48 45 44 43 ii Kinaza, Ugacja | i Kinaza. ugacja

   2 Przecięcie enzymami ΧΒαΙ, BamHI ł 2 Przecięte enzymami Barn HI, Hind UL 3 Holowanie fragmentu 116 par zasad J 3 Holowanie fragmentu Vt6 par zasad

   1 Klonowanie do pflF trp 69

   2 Skwencjonowanie wstawki

   3 Klonowanie wstawki do pFlF trp 69 i tronowanie do pBP322 zSekwencjonowanie wstawki 3 Klonowanie wstawki do p FiF trp 69 _ ¹

   Fig. 1B.

   ii Kinaza, Ugacja 2 Preciecie enzymami Find UL, Bgi K 3 Holowanie fragmentu 216 par zasad i Klonowanie do plelFA 25-1 z tekwirionownie wstawki 3 Klonowanie wstawki do FiF trp 69

   FiglB(cn) et thr pro pro glu

   6A.eeTTTATTGGGCCTC66TCCTCC7GCACCTeCT6£CTeGATC(^CC(GC:cr(CCrseCCCTeGGCCT7GGTTCTCCCC ATS ACA CCA CCT GAA T %

   -20 -10 arg leu phe leu pro arg val cys gly thr thr leu his leu leu leu leu gly leu leu leu val leu leu pro CGT CTC TTC CTC CCA AGG GTG T6T ACC ACC CTA CAC CTC CTC CTT CTG GGG CTG CTG CTG GTT CTG CTG CCT

   130 150

   1 10 20 giy ala gin giy Leu Pro oiy Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gin Thr Ala Arg Gin His Pro Lys Met His

   GGG GCC CAG GGG CTC CCT GGT GTT GGC CTC ACA CCT TCA GCT GCC CAG ACT GCC CGT CAG CAC CCC AAG ATG CAT

   230

   30 40

   Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala His Leu He G1y Asp Pro Ser Lys Gin Asn Ser Leu Leu Trp Arg

   CTT GCC CAC AGC ACC CTC AAA CCT GCT GCT CAC CTC ATT GGA GAC CCC AGC AAG CAG AAC TCA CTG CTC TGG ASA

   250 330

   SO GO 70

   Ala Asn ThrAsp Arg Ala Phe Leu G1n Aap Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Ser Leu Leu Yal Pro Thr Ser Gly

   GCA AAC ACGGAA CGT GCC TTC CTC CAG GGT GGT TTC TCC TTG A(G MC AAT TCT CTC CTG GTC CCC ACC AGT GGC

   350

   80 90

   Ile Tyr PheYal Tjy Ser Gin Val Yal Phe Ser Gly Lys Ala Tjyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro Leu Tyr

   ATC TAC TTCGTC TAC TCC CAG GTG GTC TTC TCT G(G5 AAA GCC TAC TCT CCC AAG GCC ACC TCC TCC CCA CTC TAC
4. 4(53 450

   100 110 120 Leu Ala His Glu Yal Gin Leu Phe Ser Ser Gin Tyr Pro Phe His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gin Lys Met Val CTG GCC CAT GAG GTC CAG CTC TTC TCC TCC CAG TAC CCC TTC CAT GTG CCT CTC CTC AGC TCC CAG AAG ATG GTG

   530

   Fig.2A.

   130 140 Tyr Pro Gly Leu Gin Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gin Leu Thr Gin Gly Asp Gin TAT CCA GGG CTG CAG GAA CCC TGG CTG CAC TCG ATG TAC CAC GGG GCT GCG TTC CAG CTC ACC CAG GGA GAC CAG 550 Pstl 630 150 160 170 Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Va1 Leu Ser Pro Ser Thr aal Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu CTA TCC ACC CAC ACA GAT GGC ATC CCC CAC CTA GTC CTC AGC CCT AGT ACT GTC TTC TTT GGA GCC TTC GCT CTG

   650

   TAG AACHGGAAAAArCCAGAAAGAAAAAArAArrGArrrCAASACCTrcrCCCCArrCrGC.CTCCArrCr&ACCArrrCAGGSGrCGrCACCA£CrC ζδο 5o rCCrrrG£CCAΠCCAACA6CrCAAGrcrrCCCrGArCAASrCACCGGAGCrrrCAAAGAAGGAArTLTAGGCArCCCA.GSΰSACCCACA£rCCCrGAAC 800 850) EcoftI

   CArcccrGArGrcrGrcrGGcrGAGGAτrrcAAGCcrGCcrAGGAAπcccAGCCCAΛAGcrGrrGGrcπGTccACCAεcrAGsrGSGGCcrAGArccA 930 950

   CACACAGASGAAGAGCAGGCACArGGAGGAGCrrGGGGGATGACTAGAGGCAGGGΛGGGGACTATTTATIAASGCAAAAAAAlTrAAArTA'ΠrATΠΆrS 1090 nSR)

   GASGATGGAGAGAGGGAArAATAGAAGAACATCCAAGGASAAACAGA5ACAGGCCCAAGAGArGAAGAGTGAGAGGGCATGCGCACAAGGCr5AΓCAAGΛ 1130 1150

   G^^SAASTAGSCArGASGSArCACASSSCCCCA(AAG^^^AAAOl^T(^^<SAAAGCCASCrSCCGA£CAGASCCCCACACSSASECArCTSCACC 1230 1250

   CrCGArGAAαCCCAATAAΛCCTCTTTTCTCTGAAAAAAAAAAAAA 3*

   1300

   Fig.2A (c.d)

   155 410

   Xba\

   DNA

   AmHI ^C^tA6J

   I3mar

   TOGGG^ 'TbGAATftirGCACTCMCTCTGAMCICAGCAGCIlClAOCTGATC

   TTAATACGTGAGTTGAGtCTTCGGTCGiTCGTGTGGACTAGODClCTAi

   -ISmar -53-52X»

   Κΐηαζα

   Fig. 3 (c.ct)

   Am^p* p2OKLT

   -34 -30 ludzka ret thr pro pro glu arg leu Mysia ret thr leu leu gly arg leu Bydlęca ret thr pro pro gly arg ser Zgodność ret thr arg -20 thr thr leu his leu leu leu pro pro val phe leu pro pro leu leu leu 1 leu ludzka gly ala gin gly LEU PRO GLY Mysia gly ala gin LEU SER GLY Bydlęca zgodność glu ala ala gin gin gly LEU LEU ARG GLY GLY ALA GLN THR ALA ARG GLN HIS ALA ARG THR ALA HIS PRO LEU ALA GLN PRO ALA HIS GLN GLN ALA ALA

   phe leu pro arg val cys gly his leu leu arg val leu gly leu pro pro ser val gin val his -10 leu gly leu leu leu val leu leu pro leu gly leu leu leu ala leu pro leu leu gly leu leu leu pro ret pro leu leu gly leu leu leu 10 YAL GLY LEU THR PRO SER ALA YAL ARG PHE SER ALA ILE GLY LEU THR PRO SER ALA SER ALA 20 PRO LYS MT HIS LEU ALA HIS SER THR PRO GLN LYS HIS LEU THR HIS GLY ILE LEU PRO THR PRO PHE THR ARG GLY THR

   Fig.UD

   Ludzka

   Mysia

   Bydlęca

   Zgodność

   Ludzka

   Mysia

   Bydlęca

   Zgodność

   30 40

   LEU LYS PRO ALA ALA HIS LEU ILE GLY ASP PRO SER LYS GLN LEU LYS PRO ALA ALA HIS LEU YAL GLY TYR PRO SER LYS GLN LEU LYS PRO ALA ALA HIS LEU YAL GLY ASP PRO SER ASN PRO LEU LYS PRO ALA ALA HIS LEU GLY PRO SER ASN SER LEU LEU TRP ARG ALA ASN THR 50 ASP ARG ALA PHE LEU GLN ASP ASN SER LEU LEU TRP ARG ALA ASN ALA ASP ARG ALA PHE LEU ARG HIS ARG THR LEU THR LEU ARG ALA ASN THR ASP ARG ALA PHE LEU PRO THR LEU ARG ALA ASN ASP ARG ALA PHE LEU 60 70 GLY PHE SER LEU SER ASN ASN SER LEU LEU YAL PRO THR SER GLY PHE SER LEU SER ASN ASN SER LEU LEU ILE PRO THR SER ALA PHE SER LEU SER ASN ASN SER LEU LEU YAL PRO THR SER PHE SER LEU SER ASN ASN SER LEU LEU PRO THR SER GLY ILE TYR PHE YAL TYR SER GLN YAL 80 YAL PHE SER GLY LYS ALA TYR GLY LEU TYR PHE VAL TYR SER GLN YAL YAL PHE SER GLY GLU SER CYS GLY LEU TYR PHE YAL TYR SER GLN YAL VAL PHE SER 6LY ARG GLY CYS GLY TYR PHE YAL TYR SER GLN YAL YAL PHE SER GLY

   FigMJ)

   Ludzka Mysia Bydlęca zgodność SER PRO LYS ALA THR SER SER PRO LEU TYR SER PHE PRO ARG ALA ILE PRO THR PRO ILE TYR PRO ARG PRO ALA THR ALA PRO THR PRO LEU TYR PRO TYR 110 VAL GLN LEU PHE SER SER GLN TYR PRO PHE YAL GLN LEU PHE SER SER GLN TYR PRO PHE YAL GLN LEU PHE SER PRO GLN TYR PRO PHE YAL GLN LEU PHE SER GLN TYR PRO PHE 120 Ludzka SER GLN LYS MT VAL TYR PRO GLY LEU GLN Mysia ALA GLN LYS SER YAL TYR PRO GLY LEU GLN Bydlęca ALA GLN LYS SER YAL CYS PRO GLY PRO GLN Zgodność GLN LYS YAL PRO GLY 140 GLN KIS SER MT TYR HIS GLY ALA ALA PHE GLN LEU ARG SER MET TYR GLN GLY ALA VAL PHE LEU LEU ARG SER YAL TYR GLN GLY ALA VAL PHE LEU LEU SER TYR GLY ALA PHE LEU

   100 LEU ALA HIS GLU LEU ALA HIS GLU LEU ALA HIS GLU LEU ALA HIS GLU HIS YAL PRO LEU LEU SER HIS YAL PRO LEU LEU SER HIS YAL PRO LEU LEU SER HIS YAL PRO LEU LEU SER 130 GLU PRO TRP LEU GLY PRO TRP YAL GLY ARG TRP YAL TRP THR GLN GLY ASP 0LN SER LYS GLY ASP GLN THR ARG GLY ASP GLN GLY ASP GLN

   Fig. A (HF)

   150 160 Ludzka LEU SER THR HIS THR ASP GLY ILE PRO HIS LEU YAL LEU SER Mysia LEU SER THR HIS THR ASP GLY ILE SER HIS LEU HIS PHE SER Bydlęca LEU SER THR HIS THR ASP GLY ILE SER HIS LEU LEU LEU SER Zgodność LEU SER THR HIS THR ASP GLY ILE HIS LEU SER 170 PRO SER THR VAL PHE PHE GLY ALA PHE ALA LEU PRO SER SER YAL PHE PHE GLY ALA PHE ALA LEU PRO SER SER YAL PHE PHE GLY ALA PHE ALA LEU PRO SER YAL PHE PHE GLY ALA PHE ALA LEU

   Fig.AUS)

   ο. Λ» ę» j* δ S ·«

   Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 tgi.

   Cena 3000 zł