JPS63105680A - ヒト・リンホトキシン発現ベクタ−、該発現ベクタ−による形質転換細胞および該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 - Google Patents
ヒト・リンホトキシン発現ベクタ−、該発現ベクタ−による形質転換細胞および該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法Info
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- JPS63105680A JPS63105680A JP61251344A JP25134486A JPS63105680A JP S63105680 A JPS63105680 A JP S63105680A JP 61251344 A JP61251344 A JP 61251344A JP 25134486 A JP25134486 A JP 25134486A JP S63105680 A JPS63105680 A JP S63105680A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上利用分野]
本発明はヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用
したヒト・リンホトキシン発現ベクター、該ヒト・リン
ホトキシン発現ベクターによる動物培養細胞の形質転換
細胞および該形質転換細胞を利用したリンホトキシンの
製造方法に関する。
したヒト・リンホトキシン発現ベクター、該ヒト・リン
ホトキシン発現ベクターによる動物培養細胞の形質転換
細胞および該形質転換細胞を利用したリンホトキシンの
製造方法に関する。
リンホトキシン(LT)は、癌細胞に対し選択的に毒性
を示し壊死させる作用をもち[エバンス・シイ−・エイ
チ(Evans、C,H,)ら(1977年)キャンサ
ー・リサーチ(Cancer Res、)、37巻、8
98頁参照]、制癌剤としての応用が期待されている。
を示し壊死させる作用をもち[エバンス・シイ−・エイ
チ(Evans、C,H,)ら(1977年)キャンサ
ー・リサーチ(Cancer Res、)、37巻、8
98頁参照]、制癌剤としての応用が期待されている。
[従来の技術]
LTは、ヒトまたはマウスなどの動物のリンパ球細胞を
フイトヘムアグルチニン、コンカナバリンAなどのレク
チンまたはフォルボールエステルで刺激することにより
誘導されるリンホカインの一種である[デブリンナジェ
イ・ジエイ(Devlini、J、)(1984年)リ
ンホカインズ(Lymphokines) 、 9巻、
313頁参照] 、 LTの蛋白化学的研究はいくつか
のグループで研究されているが、分子量約20,000
の成分がその最小単位であり、その単位成分が会合した
ものや他の成分との複合体があるとされている[アガー
ワル・ビー・ビー[(Aggarwal 、B、B、)
ら(1984年)ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、259巻、686頁参照〕。
フイトヘムアグルチニン、コンカナバリンAなどのレク
チンまたはフォルボールエステルで刺激することにより
誘導されるリンホカインの一種である[デブリンナジェ
イ・ジエイ(Devlini、J、)(1984年)リ
ンホカインズ(Lymphokines) 、 9巻、
313頁参照] 、 LTの蛋白化学的研究はいくつか
のグループで研究されているが、分子量約20,000
の成分がその最小単位であり、その単位成分が会合した
ものや他の成分との複合体があるとされている[アガー
ワル・ビー・ビー[(Aggarwal 、B、B、)
ら(1984年)ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、259巻、686頁参照〕。
LTは、フォルボールエステル、マイト−ジエンなどで
刺激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、
このような生産法では生産されるLTはきわめて微量で
あり、また大沿の新鮮なリンパ球が必要となり量産には
不向きである。
刺激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、
このような生産法では生産されるLTはきわめて微量で
あり、また大沿の新鮮なリンパ球が必要となり量産には
不向きである。
また株化されたリンパ球由来の細胞(株化細胞)をマイ
ト−ジエンなどで刺激するとLTが誘導的に産生される
ことが知られているが、生産能は用いる細胞の能力に大
きく依存しており、やはり量産に適した系とはいえない
。近年)、TのcDNAがクローニングされ、大腸菌で
LT様蛋白の生産が可能になった[グレイ・ビー・ダブ
リュ(Gray、P、W、)ら(1984年)ネイチャ
ー(Nature)。
ト−ジエンなどで刺激するとLTが誘導的に産生される
ことが知られているが、生産能は用いる細胞の能力に大
きく依存しており、やはり量産に適した系とはいえない
。近年)、TのcDNAがクローニングされ、大腸菌で
LT様蛋白の生産が可能になった[グレイ・ビー・ダブ
リュ(Gray、P、W、)ら(1984年)ネイチャ
ー(Nature)。
312巻、721頁参照]。しかし微生物でつくられる
LT様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成機構が多
少異なるため、つくられる蛋白のアミノ末端が天然のそ
れと異なるばあいが多い。さらに微生物によってつくら
れる17王様蛋白は、天然のLTが糖鎖を有しているの
に対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋
白合成系によってつくられた]、T様蛋白と天然の17
1′とは物質として明らかに異なり、治療薬として長期
間使用したり、頻回使用するばあいには、抗原抗体反応
の問題が懸念される。
LT様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成機構が多
少異なるため、つくられる蛋白のアミノ末端が天然のそ
れと異なるばあいが多い。さらに微生物によってつくら
れる17王様蛋白は、天然のLTが糖鎖を有しているの
に対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋
白合成系によってつくられた]、T様蛋白と天然の17
1′とは物質として明らかに異なり、治療薬として長期
間使用したり、頻回使用するばあいには、抗原抗体反応
の問題が懸念される。
[発明が解決しようとする問題点]
蛋白のアミノ末端が天然のLTと同じでかつ糖鎖を有す
るLTを生産するためには、動物培養細胞を宿主とした
遺伝子組換えの手法の適用が考えられる。このばあい、
単にLT遺伝子を動物培養細胞に導入しても1、Tの産
生をみることはできないと推定される。すなわちLTは
誘導蛋白であり、その発現は遺伝子のレベルで制限され
ているからである。実際に本発明者らは、プロモーター
などの発現の制御領域を含むLT遺伝子を種々の培養細
胞に導入してもきわめて微量し□かLTの発現がみられ
ないことを知った。このことはLTの遺伝子を細胞に導
入し、細胞に効果的なLT産生能を付与するためには、
LTの遺伝子に何らかの改良を加える必要があることを
示している。
るLTを生産するためには、動物培養細胞を宿主とした
遺伝子組換えの手法の適用が考えられる。このばあい、
単にLT遺伝子を動物培養細胞に導入しても1、Tの産
生をみることはできないと推定される。すなわちLTは
誘導蛋白であり、その発現は遺伝子のレベルで制限され
ているからである。実際に本発明者らは、プロモーター
などの発現の制御領域を含むLT遺伝子を種々の培養細
胞に導入してもきわめて微量し□かLTの発現がみられ
ないことを知った。このことはLTの遺伝子を細胞に導
入し、細胞に効果的なLT産生能を付与するためには、
LTの遺伝子に何らかの改良を加える必要があることを
示している。
本発明者らはすてにLTをコードするDNA配列に動物
細胞で機能する、すなわちmRNA合成を開始すること
が可能なプロモーター領域のDNA配列を結合させ動物
培養細胞に導入し、形質転換細胞にLTを分泌させるこ
とに成功した(特願昭60(47371号明細書参照)
。本発明者らがこのLT発現ベクターに利用したプロモ
ーターはSV40の初期遺伝子、’l’純ヘルペスウィ
ルスのチミジンキナーゼ遺伝子またはSV40の後期遺
伝子のプロモーターである。この中で比較的強いプロモ
ーターと考えられているSV40のプロモーターは、S
V40感染細胞中テS■40山来(7)IIRNAを全
m I? N A ノ約1〜4%に蓄積させる能力をも
っている。しかしSV40感染細胞中でのSV40のゲ
ノムは細胞あたり致方コピーにもなっているので、SV
40のプロモーターがきわめて強いプロモーターである
とはいえない。
細胞で機能する、すなわちmRNA合成を開始すること
が可能なプロモーター領域のDNA配列を結合させ動物
培養細胞に導入し、形質転換細胞にLTを分泌させるこ
とに成功した(特願昭60(47371号明細書参照)
。本発明者らがこのLT発現ベクターに利用したプロモ
ーターはSV40の初期遺伝子、’l’純ヘルペスウィ
ルスのチミジンキナーゼ遺伝子またはSV40の後期遺
伝子のプロモーターである。この中で比較的強いプロモ
ーターと考えられているSV40のプロモーターは、S
V40感染細胞中テS■40山来(7)IIRNAを全
m I? N A ノ約1〜4%に蓄積させる能力をも
っている。しかしSV40感染細胞中でのSV40のゲ
ノムは細胞あたり致方コピーにもなっているので、SV
40のプロモーターがきわめて強いプロモーターである
とはいえない。
アクチンは細胞骨格を形成する主要蛋白であり細胞の蛋
白としてはきわめて含量の高い蛋白のひとつである。し
たがってアクチン遺伝子のプロモーターは動物培養細胞
で強い活性を示す可能性をもっている。このアクチン遺
伝子のプロモーターをLTの動物培養細胞での発現に利
用することが本発明が解決しようとする主たる問題点で
ある。
白としてはきわめて含量の高い蛋白のひとつである。し
たがってアクチン遺伝子のプロモーターは動物培養細胞
で強い活性を示す可能性をもっている。このアクチン遺
伝子のプロモーターをLTの動物培養細胞での発現に利
用することが本発明が解決しようとする主たる問題点で
ある。
本発明者らはアクチン遺伝子のプロモーターとしてヒト
β−アクチン遺伝子のプロモーターを用いた。ヒトのア
クチン遺伝子のプロモーターを活用したLT発現ベクタ
ーをヒト培養細胞を宿主としてLT生産性の形質転換株
をうるばあいには、基本的にヒト細胞にヒトに由来する
DNAのみを導入することになりウィルスなどの他の生
物に由来するプロモーターに用いる他のLT生産法にく
らべ安全性が高い。
β−アクチン遺伝子のプロモーターを用いた。ヒトのア
クチン遺伝子のプロモーターを活用したLT発現ベクタ
ーをヒト培養細胞を宿主としてLT生産性の形質転換株
をうるばあいには、基本的にヒト細胞にヒトに由来する
DNAのみを導入することになりウィルスなどの他の生
物に由来するプロモーターに用いる他のLT生産法にく
らべ安全性が高い。
またヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターは種特異性
があり、ヒト細胞を宿主としたばあいには他の生物由来
の細胞を宿主とするばあいにくらべLT高度生産性の形
質転換株をうる可能性が高い。
があり、ヒト細胞を宿主としたばあいには他の生物由来
の細胞を宿主とするばあいにくらべLT高度生産性の形
質転換株をうる可能性が高い。
ヒトβ−アクチン遺伝子のmRNAの構造を調べた結果
、蛋白合成開始のメチオニンコドンの5′上流がたがい
にホモロジーを持つ15ベース長の配列の繰返し配列か
らなることを見出した。またそれらの繰返し配列は18
Sリボゾーマル(以下単に、rという)RNAの3′末
端に見られる配列と高い相補性を持っており、これらの
繰返し配列がヒトβ−アクチン遺伝子mRNAの高い翻
訳活性またはmRNAの安定性に関与している可能性が
ある。この繰返し配列をLTの発現ベクターに利用する
ことも本発明が解決しようとする問題点のひとつである
。
、蛋白合成開始のメチオニンコドンの5′上流がたがい
にホモロジーを持つ15ベース長の配列の繰返し配列か
らなることを見出した。またそれらの繰返し配列は18
Sリボゾーマル(以下単に、rという)RNAの3′末
端に見られる配列と高い相補性を持っており、これらの
繰返し配列がヒトβ−アクチン遺伝子mRNAの高い翻
訳活性またはmRNAの安定性に関与している可能性が
ある。この繰返し配列をLTの発現ベクターに利用する
ことも本発明が解決しようとする問題点のひとつである
。
[問題点を解決するための手段]
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝
子はナカジマーイイジマ(Nakajima−1iji
ma)らによってクローニングされた[ナカジマーイイ
ジマら(1985年)プロシーデインダス・オブφザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニス
−r−−(Proc、Natl、Acad。
子はナカジマーイイジマ(Nakajima−1iji
ma)らによってクローニングされた[ナカジマーイイ
ジマら(1985年)プロシーデインダス・オブφザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニス
−r−−(Proc、Natl、Acad。
Sci、USA)、 82巻、 6133頁参照]ヒト
β−アクチン遺伝子の構造を第1図に示した。ヒトβ−
アクチン遺伝子は6つのエクソン(R)と5つのイント
ロン(1)および5′側と3′側に隣接した配列からな
る。ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とはヒ
トβ−アクチン遺伝子の転写に必要な領域をさす。すな
わち第1図に示したヒトβ−アクチン遺伝子の5′末端
のSma1部位から第2エクソンに存在するNco1部
位までの配列のすべてまたは一部を含む配列をさす。ヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とLTをコー
ドするDNA配列との結合は、LTのn+RNAの合成
がヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターによってコン
トロールされるように結合されておればどのような結合
部位を用いてもよい。たとえばヒトβ−アクチン遺伝子
のmRNA合成開始点(キャップ部位)の3′下流にL
TをコードするDNA配列を結びつけた発現ベクターを
つくりうる。またヒトβ−アクチン遺伝子の第1イント
ロン中でLTをコードするDNA配列を結びつけるばあ
いには、イントロンのスプライシングが起こるように3
′側のスプライシングシグナルを介してLTをコードす
るDNA配列をヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター
に結びつけることが必要である。さらにヒトβ−アクチ
ン遺伝子の第1イントロンの後に1、TをコードするD
NA配列を結びつけた発現ベクターもつくりうる。
β−アクチン遺伝子の構造を第1図に示した。ヒトβ−
アクチン遺伝子は6つのエクソン(R)と5つのイント
ロン(1)および5′側と3′側に隣接した配列からな
る。ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とはヒ
トβ−アクチン遺伝子の転写に必要な領域をさす。すな
わち第1図に示したヒトβ−アクチン遺伝子の5′末端
のSma1部位から第2エクソンに存在するNco1部
位までの配列のすべてまたは一部を含む配列をさす。ヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とLTをコー
ドするDNA配列との結合は、LTのn+RNAの合成
がヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターによってコン
トロールされるように結合されておればどのような結合
部位を用いてもよい。たとえばヒトβ−アクチン遺伝子
のmRNA合成開始点(キャップ部位)の3′下流にL
TをコードするDNA配列を結びつけた発現ベクターを
つくりうる。またヒトβ−アクチン遺伝子の第1イント
ロン中でLTをコードするDNA配列を結びつけるばあ
いには、イントロンのスプライシングが起こるように3
′側のスプライシングシグナルを介してLTをコードす
るDNA配列をヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター
に結びつけることが必要である。さらにヒトβ−アクチ
ン遺伝子の第1イントロンの後に1、TをコードするD
NA配列を結びつけた発現ベクターもつくりうる。
本発明者らは、ヒトβ−アクチン遺伝子の成熟型mRN
Aの塩基配列を調べた結果5′側非翻訳領域がたがいに
ホモロジーを有する約15塩基の配列の繰返しからなる
ことを見出した。その配列は、 (AUG :メチオニンコドン) であり、繰り返し配列は枠で囲んだ。メチオニンコドン
に近い2つの15塩基配列は相同性が高く、これらの配
列は18SrRNAの3′側に見られる配列(以下*は
非相同塩基対塩基を示す)零* 3’ ・・・・CGCGLICGυCCAAGUGGA
UG ・・・・5’と相補性があることを見出した。そ
の相補性(各塩基間を「:」で結び示す。)は ヒトβ−アクチンのmRNA 18SrRNA :::: :: :*
*::::3’ ・・−・AUUACUAGGAAGG
CGUCGUCCAAGUGUAUG−・−のようであ
った。
Aの塩基配列を調べた結果5′側非翻訳領域がたがいに
ホモロジーを有する約15塩基の配列の繰返しからなる
ことを見出した。その配列は、 (AUG :メチオニンコドン) であり、繰り返し配列は枠で囲んだ。メチオニンコドン
に近い2つの15塩基配列は相同性が高く、これらの配
列は18SrRNAの3′側に見られる配列(以下*は
非相同塩基対塩基を示す)零* 3’ ・・・・CGCGLICGυCCAAGUGGA
UG ・・・・5’と相補性があることを見出した。そ
の相補性(各塩基間を「:」で結び示す。)は ヒトβ−アクチンのmRNA 18SrRNA :::: :: :*
*::::3’ ・・−・AUUACUAGGAAGG
CGUCGUCCAAGUGUAUG−・−のようであ
った。
動物細胞由来のmRNAの配列中においては原核生物で
知られるリボゾーム結合部位であるSD(シャイ゛ン・
ダルガノ)配列に相当するコンセンサス配列は知られて
いないが、ヒトβ−アクチン遺伝子のlllRNAの非
翻訳領域に見られるこの15塩基繰返し配列がヒトβ−
アクチンmRNAの高い翻訳活性またいはInRNAの
安定性に関与している可能性がある。この繰り返し配列
をLTの発現ベクターに利用するにはヒトβ−アクチン
遺伝子とLTをコードするDNA配列とを両遺伝子の蛋
白合成開始アミノ酸であるメチオニンコドンを介して結
びつけるのがもっとも自然である。
知られるリボゾーム結合部位であるSD(シャイ゛ン・
ダルガノ)配列に相当するコンセンサス配列は知られて
いないが、ヒトβ−アクチン遺伝子のlllRNAの非
翻訳領域に見られるこの15塩基繰返し配列がヒトβ−
アクチンmRNAの高い翻訳活性またいはInRNAの
安定性に関与している可能性がある。この繰り返し配列
をLTの発現ベクターに利用するにはヒトβ−アクチン
遺伝子とLTをコードするDNA配列とを両遺伝子の蛋
白合成開始アミノ酸であるメチオニンコドンを介して結
びつけるのがもっとも自然である。
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用したLT
発現ベクターに利用可能なLTをコードするDNA配列
は、1.Tの染色体DNA配列、染色体DNA配列から
一部のイントロンを欠失させたDNA配列、1、Tのc
DNA配列および変異を有するそれらのDNA配列など
がある。
発現ベクターに利用可能なLTをコードするDNA配列
は、1.Tの染色体DNA配列、染色体DNA配列から
一部のイントロンを欠失させたDNA配列、1、Tのc
DNA配列および変異を有するそれらのDNA配列など
がある。
遺伝子を細胞に導入したばあい、導入遺伝子は宿主染色
体DNAに安定に組み込まれるばあいがある。遺伝子が
組み込まれる染色体−にの位置は一見でたらめであり、
また組み込まれるI)NAのコピー数も不規則である。
体DNAに安定に組み込まれるばあいがある。遺伝子が
組み込まれる染色体−にの位置は一見でたらめであり、
また組み込まれるI)NAのコピー数も不規則である。
LT発現ベクターを導入した細胞のLT生産量は、LT
遺伝子のコピー数に相関があると考えられ、遺伝子数の
増加した細胞はLTの生産能が向」二するものと期待さ
れる。
遺伝子のコピー数に相関があると考えられ、遺伝子数の
増加した細胞はLTの生産能が向」二するものと期待さ
れる。
LT遺伝子のコピー数の多い、すなわちLTの生産性の
高い細胞は、増幅可能な遺伝子を有するLT発現ベクタ
ーを導入後、単細胞分離または増幅可能な遺伝子の増幅
した細胞が選択的に増殖する条件で細胞を選択すること
により分離することができた。増幅可能な遺伝子として
はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子、アスパラギン酸トラ
ンスカルバミラーゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子が
利用できる。またその他の増幅可能な遺伝子[スターク
・ジー・アール(Stark、G。
高い細胞は、増幅可能な遺伝子を有するLT発現ベクタ
ーを導入後、単細胞分離または増幅可能な遺伝子の増幅
した細胞が選択的に増殖する条件で細胞を選択すること
により分離することができた。増幅可能な遺伝子として
はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子、アスパラギン酸トラ
ンスカルバミラーゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子が
利用できる。またその他の増幅可能な遺伝子[スターク
・ジー・アール(Stark、G。
R,)とウオール・ジー・エム(Wahl 、G、M、
)(1984年)アニュアル・レビュー・オン・バイオ
ケミストリー、53巻、477頁参照]も利用できる。
)(1984年)アニュアル・レビュー・オン・バイオ
ケミストリー、53巻、477頁参照]も利用できる。
ジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子を有するLT発現ベクタ
ーの形質転換細胞からジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子の
増幅した細胞は、形質転換後1nM以上の濃度のメソト
レキセートを含む培地で選択されうる。選択された細胞
はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子ばかりでなく、L丁遺
伝子も増幅しているばあいが多い。同様にメタロチオネ
イン遺伝子は重金属で、またアスパラギン酸トランスカ
ルバミラーゼ遺伝子はN−(フォスフオンアセチル)−
L−(アスパルテート)[N−(phosphonac
etyl)−L−aspartatc(PALA)]で
遺伝子が増幅した細胞が分割できる。
ーの形質転換細胞からジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子の
増幅した細胞は、形質転換後1nM以上の濃度のメソト
レキセートを含む培地で選択されうる。選択された細胞
はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子ばかりでなく、L丁遺
伝子も増幅しているばあいが多い。同様にメタロチオネ
イン遺伝子は重金属で、またアスパラギン酸トランスカ
ルバミラーゼ遺伝子はN−(フォスフオンアセチル)−
L−(アスパルテート)[N−(phosphonac
etyl)−L−aspartatc(PALA)]で
遺伝子が増幅した細胞が分割できる。
本発明者らが宿主として試用した動物培養細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)
から入手可能なハムスターおよびヒト由来の細胞である
が、本明細書に示されているLTの製造法を用いれば、
少なくともを椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正常お
よび変異細胞、ウィルスによる形質転換細胞などにおい
て活性あるLTを生産することが可能である。また宿主
細胞は、生産目標濃度以上のLTに対して耐性を示す細
胞であることが望ましい。
カン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)
から入手可能なハムスターおよびヒト由来の細胞である
が、本明細書に示されているLTの製造法を用いれば、
少なくともを椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正常お
よび変異細胞、ウィルスによる形質転換細胞などにおい
て活性あるLTを生産することが可能である。また宿主
細胞は、生産目標濃度以上のLTに対して耐性を示す細
胞であることが望ましい。
発現ベクターを導入し、L Tを産生ずるようになった
細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を含んだ培地
ばかりでなく、まったく血清を含まない無血清培地でも
LTを産生ずることを見出した。LTの生産に無血清培
地を用いることはLTの培地からの回収精製をより容易
にするばがりでなく、製品への血清成分の混入を防ぐこ
とになる。
細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を含んだ培地
ばかりでなく、まったく血清を含まない無血清培地でも
LTを産生ずることを見出した。LTの生産に無血清培
地を用いることはLTの培地からの回収精製をより容易
にするばがりでなく、製品への血清成分の混入を防ぐこ
とになる。
[実施例]
以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えDNA実験指針」にしたがって行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、DNA
、種々の酵素、大腸菌等を扱う諸操作は下記の雑誌、
成書を参考とした。
大臣の定める「組換えDNA実験指針」にしたがって行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、DNA
、種々の酵素、大腸菌等を扱う諸操作は下記の雑誌、
成書を参考とした。
(1)蛋白質 核酸 酵素、26巻、4号(1981年
)臨時増刊 遺伝子操作(共立出版) (2)遺伝子操作実験法、高木康敬編著(1980年)
講談社 (3)遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著(1982
年)講談社 (4)モルキュラー・クローニング・ア・ラブラドすφ
マニュアル、ティー・マニアティス(Molecula
r Cloning a 1aboratory ma
nual、T。
)臨時増刊 遺伝子操作(共立出版) (2)遺伝子操作実験法、高木康敬編著(1980年)
講談社 (3)遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著(1982
年)講談社 (4)モルキュラー・クローニング・ア・ラブラドすφ
マニュアル、ティー・マニアティス(Molecula
r Cloning a 1aboratory ma
nual、T。
Maniatjs)ら編(1,982年)コールド・ス
プリング争ハーバ−・ラブラトリ(Cold Spri
ngIt a r b o r L a b o r
a t o r y )(5)メソッズ・イン・エン
ザイモロジー(Methodsin EnZymOlo
gy、)85巻、エル・グロスマン(L、 Gross
IIlan)ら編(1980年)アカデミツク・プレス
(Academic press)(6)メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー(Mctl+odsin Enz
ymology、138巻、アール・ウー(R,Wu)
編(1979年)アカデミツク・プレス(Academ
icPress) 実施例1 ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用したLT
発現ベクターpβLTI、 pβLT1dl+1’rお
よびpβLTMLの作製。
プリング争ハーバ−・ラブラトリ(Cold Spri
ngIt a r b o r L a b o r
a t o r y )(5)メソッズ・イン・エン
ザイモロジー(Methodsin EnZymOlo
gy、)85巻、エル・グロスマン(L、 Gross
IIlan)ら編(1980年)アカデミツク・プレス
(Academic press)(6)メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー(Mctl+odsin Enz
ymology、138巻、アール・ウー(R,Wu)
編(1979年)アカデミツク・プレス(Academ
icPress) 実施例1 ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用したLT
発現ベクターpβLTI、 pβLT1dl+1’rお
よびpβLTMLの作製。
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用したLT
発現ベクターpβLTI、 pβLT1.dhfrおよ
びpβL T M Lはつぎの(1)から(1)のステ
ップにより作製した。
発現ベクターpβLTI、 pβLT1.dhfrおよ
びpβL T M Lはつぎの(1)から(1)のステ
ップにより作製した。
(1)LT遺伝子の蛋白合成開始点へのNeo 1部位
の導入。
の導入。
すでに作製されているLT遺伝子およびアンピシリン耐
性遺伝子(Amp)を有するプラスミドpLTE 2.
3 (特願昭Go−230744号明細書参照)を制限
酵素PstlおよびAcclで切断し、LTの蛋白合成
開始アミノ酸であるメチオニンのコドンATGを含む断
片をファージM1g+++pH[メシング・ジェイ(M
essing、J、)(1983年)メソッズ・イン・
エンザイモロジー、101巻 、20頁参照] DNA
のPstl−Acc1部位に挿入し組換え型ファージ旧
3MetLTを作製した(第2図参照)。
性遺伝子(Amp)を有するプラスミドpLTE 2.
3 (特願昭Go−230744号明細書参照)を制限
酵素PstlおよびAcclで切断し、LTの蛋白合成
開始アミノ酸であるメチオニンのコドンATGを含む断
片をファージM1g+++pH[メシング・ジェイ(M
essing、J、)(1983年)メソッズ・イン・
エンザイモロジー、101巻 、20頁参照] DNA
のPstl−Acc1部位に挿入し組換え型ファージ旧
3MetLTを作製した(第2図参照)。
組換え型ファージ旧3 M e t L Tを大腸菌J
MLO8(ファルマシア社製)を宿主として培養し、フ
ァージ粒子から1本鎖DNAを調整した。この1本鎖D
NA 0.4μmol 、ホスホトリエステル法[ミヨ
シ・ケイ(旧yoshi、に、)ら(1980年)ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ、8巻、 5507頁参
照]で合成したNco1部位を有するオリゴヌクレオタ
イドpGciTcGTGccATGGGG 20pmo
lおよび旧3プライマー旧pAGTcAcGAcGTT
GTA (蜜酒造■製) 10pmol、Tr!5−
IC# 86mM(pH7,5) 、MgCN 2B、
BmMを含む溶液16゜5μgを65℃、2時間インキ
ュベートし45℃まで徐冷した。室温で20分放置後り
、8n+Hの4種のデオキシヌクレオシド三燐酸、AT
P2mM、ジチオスレイト−ル2mM、0.02%牛血
清アルブミン、6ユニツl−1)NAポリメラーゼ1(
フレノウ(Klonow)フラグメンl−)、3ユニツ
トT4DNA リガーゼ、 Trls−11c(! 0
[imM(pH7,5) MgCl 7 6.6mMを
含む溶液L8.5pflを加え16℃、2.5時間反応
さヒ・、DNA鎖を伸長させた後に65℃、20分処理
により反応を停市させた。
MLO8(ファルマシア社製)を宿主として培養し、フ
ァージ粒子から1本鎖DNAを調整した。この1本鎖D
NA 0.4μmol 、ホスホトリエステル法[ミヨ
シ・ケイ(旧yoshi、に、)ら(1980年)ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ、8巻、 5507頁参
照]で合成したNco1部位を有するオリゴヌクレオタ
イドpGciTcGTGccATGGGG 20pmo
lおよび旧3プライマー旧pAGTcAcGAcGTT
GTA (蜜酒造■製) 10pmol、Tr!5−
IC# 86mM(pH7,5) 、MgCN 2B、
BmMを含む溶液16゜5μgを65℃、2時間インキ
ュベートし45℃まで徐冷した。室温で20分放置後り
、8n+Hの4種のデオキシヌクレオシド三燐酸、AT
P2mM、ジチオスレイト−ル2mM、0.02%牛血
清アルブミン、6ユニツl−1)NAポリメラーゼ1(
フレノウ(Klonow)フラグメンl−)、3ユニツ
トT4DNA リガーゼ、 Trls−11c(! 0
[imM(pH7,5) MgCl 7 6.6mMを
含む溶液L8.5pflを加え16℃、2.5時間反応
さヒ・、DNA鎖を伸長させた後に65℃、20分処理
により反応を停市させた。
つぎに制限酵素EcoRlと旧ndmを加え37℃、1
時間処理後フェノール抽出を行ないエタノール沈澱によ
りDNAを回収した。
時間処理後フェノール抽出を行ないエタノール沈澱によ
りDNAを回収した。
えられたDNAをpUc9 (ファルマシア社製)のH
i nd m −EcoR1部位に結合させプラスミド
pMutLTを作製した(第3図参照)。
i nd m −EcoR1部位に結合させプラスミド
pMutLTを作製した(第3図参照)。
(2)LT発現ベクターpβ■、T1の作製プラスミド
pLTE2.3を制限酵素ΔpalとEcoRIで切断
しLT遺伝子を有する断片を(1)でえられた1)Mt
ltLTのAI)at−EcoR1部位に導入しプラス
ミドpUcLTNcoを作製した(第4図参照)。
pLTE2.3を制限酵素ΔpalとEcoRIで切断
しLT遺伝子を有する断片を(1)でえられた1)Mt
ltLTのAI)at−EcoR1部位に導入しプラス
ミドpUcLTNcoを作製した(第4図参照)。
一方すでに作製されているヒトβ−アクチン遺伝子のプ
ロモーター領域を有するプラスミドpuβ1100 (
特願昭61−1.07181号明細書参照)をSal
lおよびPvu IIで切断し pβ(ヒトβ−アクチ
ン遺伝子のプロモーター領域)を含む断片をすでに作製
されているLT遺伝子を有するプラスミドpLT’
(特願昭[il−34982号明細書参照)の5alt
−Ba11部位に結合しpβΔを作製した(第5図参照
)。ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いたL
T発現ベクターpβLTIはpβΔのNeo I−Ec
oRI断片をp U CL T N c oのLT遺伝
子を含むNeo I−EcoRI断片と置きかえること
により作製した(第6図参照)。pβLTIはヒトβ−
アクチン遺伝子のプロモーター領域とLT遺伝子が、両
遺伝子の蛋白合成開始アミノ酸であるメチオニンのコド
ンATG(Nco1部位)を介して、結合しており、L
Tの転写はヒトβ−アクチンのプロモーターによってコ
ントロールされている。
ロモーター領域を有するプラスミドpuβ1100 (
特願昭61−1.07181号明細書参照)をSal
lおよびPvu IIで切断し pβ(ヒトβ−アクチ
ン遺伝子のプロモーター領域)を含む断片をすでに作製
されているLT遺伝子を有するプラスミドpLT’
(特願昭[il−34982号明細書参照)の5alt
−Ba11部位に結合しpβΔを作製した(第5図参照
)。ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いたL
T発現ベクターpβLTIはpβΔのNeo I−Ec
oRI断片をp U CL T N c oのLT遺伝
子を含むNeo I−EcoRI断片と置きかえること
により作製した(第6図参照)。pβLTIはヒトβ−
アクチン遺伝子のプロモーター領域とLT遺伝子が、両
遺伝子の蛋白合成開始アミノ酸であるメチオニンのコド
ンATG(Nco1部位)を介して、結合しており、L
Tの転写はヒトβ−アクチンのプロモーターによってコ
ントロールされている。
また転写終結およびP(A) (ポリ(A)付加シグナ
ル)の付加のための必要な配列はSV40の後期遺伝子
のものを利用している。さらにこのベクターは選択マー
カー遺伝子としてEcogpt (大腸菌のグアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子)[マリガンφ
アール・シー(Mul、ligan。
ル)の付加のための必要な配列はSV40の後期遺伝子
のものを利用している。さらにこのベクターは選択マー
カー遺伝子としてEcogpt (大腸菌のグアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子)[マリガンφ
アール・シー(Mul、ligan。
R,C,)ら(1980年)サイエンス(Sclenc
e)、209巻、1422頁参照]を有している。
e)、209巻、1422頁参照]を有している。
[3)LT発現ベクターpβLTIdhf’rの作製p
sV2dhfr [スプラマニ・ニス(Subrama
nj、S、)ら(1981年)モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー、1巻、854頁参照]のPv
u U部位とBamt11部位をそれぞれx b o
Iと5allに変換したプラスミドpsV2dbrrX
sかうdbf’r(ジヒドロ葉酸還元酵素)遺伝子をX
ll0+および5ailで切り出しこの断片をpβL
T IのSal 1部位に挿入しpβLT1dhfrを
作製した。pβLT1dbfrは選択可能なマーカーと
して■シeogptとdhfrの2種の遺伝子を有して
いる(第7図参照)。
sV2dhfr [スプラマニ・ニス(Subrama
nj、S、)ら(1981年)モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー、1巻、854頁参照]のPv
u U部位とBamt11部位をそれぞれx b o
Iと5allに変換したプラスミドpsV2dbrrX
sかうdbf’r(ジヒドロ葉酸還元酵素)遺伝子をX
ll0+および5ailで切り出しこの断片をpβL
T IのSal 1部位に挿入しpβLT1dhfrを
作製した。pβLT1dbfrは選択可能なマーカーと
して■シeogptとdhfrの2種の遺伝子を有して
いる(第7図参照)。
(4)LT発現ベクターpβLTMLの作製発現ベクタ
ーpβLTMl、はpβLTI (7)L′r遺伝子を
有する旧ndllI −13g1 II断片をpUc9
のlllndm−Bam旧部位に挿入し作製した(第8
図参照)。
ーpβLTMl、はpβLTI (7)L′r遺伝子を
有する旧ndllI −13g1 II断片をpUc9
のlllndm−Bam旧部位に挿入し作製した(第8
図参照)。
pβLTMLは選択マーカー遺伝子を持たないLT発現
ベクターである。
ベクターである。
実施例2
LT発現ベクターの動物培養細胞への導入とLTの生産
。
。
LT発現ベクターpβLTIをBHK−21(C−13
) [ATCC,CCL−101、CHO−に1[AT
CC,CCL−81]、PL[ATCC,CCL−82
コを宿主として、ウィグラー(νjgler)らの方法
[ウィグラーら(1977年)セル、11巻、223頁
参照]に準じて形質転換を行なった。プラスミド−リン
酸カルシウム共沈澱物をあらかじめ5%PC8(牛胎児
血清)を含む培地で生育させた細胞(2X 105細胞
/3m1培地/直径6 am培養皿)に加え、4時間後
に培地を更新し、48時間後に培地上に含まれるLTを
L929細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定した
[ラフφエム・アール(Ruff 、M、R,)とギフ
オード・ジー・イー(Gifford、G、E、)、(
1981年)リンホカインズ、2巻、235頁参照コす
なわち96穴マルチディツシュ2X104細胞/wel
l/100μg培地で1日培養後、培養液を除き、アク
チノマイシンD/μg / ml、5%FC3を含むイ
ーグルMEM培地で種々の濃度に希釈したサンプルを1
00μg加え、20時間後の細胞の変性致死効果を測定
した。LTIユニットは50%の致死率を与える濃度と
した。その結果を第1表に示す。第1表に示すようにヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用した発現ベ
クターはSV40の初期プロモーターを利用した発現ベ
クターpsVes[1lalLT (特願昭GO−14
7371号明細書参照)にくらべ高単位のLTを生産し
た。
) [ATCC,CCL−101、CHO−に1[AT
CC,CCL−81]、PL[ATCC,CCL−82
コを宿主として、ウィグラー(νjgler)らの方法
[ウィグラーら(1977年)セル、11巻、223頁
参照]に準じて形質転換を行なった。プラスミド−リン
酸カルシウム共沈澱物をあらかじめ5%PC8(牛胎児
血清)を含む培地で生育させた細胞(2X 105細胞
/3m1培地/直径6 am培養皿)に加え、4時間後
に培地を更新し、48時間後に培地上に含まれるLTを
L929細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定した
[ラフφエム・アール(Ruff 、M、R,)とギフ
オード・ジー・イー(Gifford、G、E、)、(
1981年)リンホカインズ、2巻、235頁参照コす
なわち96穴マルチディツシュ2X104細胞/wel
l/100μg培地で1日培養後、培養液を除き、アク
チノマイシンD/μg / ml、5%FC3を含むイ
ーグルMEM培地で種々の濃度に希釈したサンプルを1
00μg加え、20時間後の細胞の変性致死効果を測定
した。LTIユニットは50%の致死率を与える濃度と
した。その結果を第1表に示す。第1表に示すようにヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用した発現ベ
クターはSV40の初期プロモーターを利用した発現ベ
クターpsVes[1lalLT (特願昭GO−14
7371号明細書参照)にくらべ高単位のLTを生産し
た。
[以下余白]
第 1 表
つぎにpβLTIを導入したBHK−21(C−13)
およびPLの培地を5%FC8、25,cz g /
m+ミコフェノール酸、250μg / mlキサンチ
ン、0.1μg/m1アミノプテリンを含むMEM培地
に換え、約3週間培養した。生じたコロニーを分離し、
24穴マルチウエルプレートに生育させ72時間後の培
地に含まれるLTを前記測定方法と同じ方法によって測
定しその結果を第2表に示す。第2表に示すように分離
した形質転換細胞はLTを生産した。
およびPLの培地を5%FC8、25,cz g /
m+ミコフェノール酸、250μg / mlキサンチ
ン、0.1μg/m1アミノプテリンを含むMEM培地
に換え、約3週間培養した。生じたコロニーを分離し、
24穴マルチウエルプレートに生育させ72時間後の培
地に含まれるLTを前記測定方法と同じ方法によって測
定しその結果を第2表に示す。第2表に示すように分離
した形質転換細胞はLTを生産した。
第 2 表
実施例3
実施例2と同様にBIIK−21,(C−13)および
T’LをpβLT1dhfrまたはpβL T M L
に1:10で形質転換し形質転換株をえた。形質転換株
をそれぞれ直径10cmのディツシュに103〜5X1
05細胞を植え、IIIIM〜500nMのメントレキ
セート(Mtx)を含む培地で約1ケ月培養し、種々の
濃度のMtxに対して耐性を示すコロニーを分離した。
T’LをpβLT1dhfrまたはpβL T M L
に1:10で形質転換し形質転換株をえた。形質転換株
をそれぞれ直径10cmのディツシュに103〜5X1
05細胞を植え、IIIIM〜500nMのメントレキ
セート(Mtx)を含む培地で約1ケ月培養し、種々の
濃度のMtxに対して耐性を示すコロニーを分離した。
24穴マルチウエルプレートに生育させ培地を5%FC
8を含む培地または血清を含まない培地に更新し、72
時間後の培地に含まれるLTを測定し、その結果を第3
表に示す。第3表に示すようにMtxで選択した細胞か
らは親株よりも高いLT生産性を示す株かえられた。
8を含む培地または血清を含まない培地に更新し、72
時間後の培地に含まれるLTを測定し、その結果を第3
表に示す。第3表に示すようにMtxで選択した細胞か
らは親株よりも高いLT生産性を示す株かえられた。
[以下余白]
第1図はヒトβ−アクチンの遺伝子の構造を示す模式図
である。E−1からE−V Iは第1エクソンから第6
エクソンを、I−1からI−Vは第1イントロンから第
5イントロンを示す。CCAAT 。 TATA、 ATGおよびTGAはそれぞれプロモータ
ー領域」二のCATボックス、TATAボックス、蛋白
合成開始コドンおよび終止コドンを示す。Smal。 Neo lまたは5ailは代表的な制限酵素認識部位
を示す。 第2図はファージM13MetLT作製の模式図であり
、第3図はプラスミドpMutLT作製の模式図であり
、第4図はプラスミドptlCLTNco作製の模式図
であり、第5図はグラスミ1986作製の模式図であり
、第6図はプラスミドpβLTL作製の模式図であり、
第7図はプラスミドpβLT1dhf’r作製の模式図
でありまた第8図はプラスミドpβL T M L作製
の模式図である。第2図から第8図中に代表的な制限酵
素による認識部位を示した。 A′2図 一74図 才5図
である。E−1からE−V Iは第1エクソンから第6
エクソンを、I−1からI−Vは第1イントロンから第
5イントロンを示す。CCAAT 。 TATA、 ATGおよびTGAはそれぞれプロモータ
ー領域」二のCATボックス、TATAボックス、蛋白
合成開始コドンおよび終止コドンを示す。Smal。 Neo lまたは5ailは代表的な制限酵素認識部位
を示す。 第2図はファージM13MetLT作製の模式図であり
、第3図はプラスミドpMutLT作製の模式図であり
、第4図はプラスミドptlCLTNco作製の模式図
であり、第5図はグラスミ1986作製の模式図であり
、第6図はプラスミドpβLTL作製の模式図であり、
第7図はプラスミドpβLT1dhf’r作製の模式図
でありまた第8図はプラスミドpβL T M L作製
の模式図である。第2図から第8図中に代表的な制限酵
素による認識部位を示した。 A′2図 一74図 才5図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータDNA配列と
ヒト・リンホトキシンをコードする DNA配列とを結合したDNA配列を有するヒト・リン
ホトキシン発現ベクター。 2 ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータDNA配列と
ヒト・リンホトキシンをコードする DNA配列が両配列の蛋白合成開始アミノ酸であるメチ
オニンのコドンを介して結合してなる特許請求の範囲第
1項記載のヒト・リンホトキシン発現ベクター。 3 増幅可能な遺伝子のDNA配列が、前記ヒト・リン
ホトキシン発現ベクターのDNA鎖上に配列されてなる
特許請求の範囲第1項または第2項記載のヒト・リンホ
トキシン発現ベクター。 4 増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素の遺
伝子である特許請求の範囲第3項記載のヒト・リンホト
キシン発現ベクター。 5 ヒト・リンホトキシンをコードするDNA配列が、
正常ヒト染色体のDNA配列である特許請求の範囲第1
項、第2項、第3項または第4項記載のヒト・リンホト
キシン発現ベクター。 6 ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、プラスミド
pβLT1、pβLT1dhfrまたはpβLTMLで
ある特許請求の範囲第1項または第2項記載のヒト・リ
ンホトキシン発現ベクター。 7 ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とヒト
・リンホトキシンをコードするDNA配列とを結合した
DNA配列を有するヒト・リンホトキシン発現ベクター
による動物培養細胞の形質転換細胞。 8 ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、ヒトβ−ア
クチン遺伝子のプロモーターDNA配列とヒト・リンホ
トキシンをコードするDNA配列が両配列の蛋白合成開
始アミノ酸であるメチオニンのコドンを介して結合して
なるものである特許請求の範囲第7項記載の形質転換細
胞。 9 ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、増幅可能な
遺伝子のDNA配列を同一のDNA鎖上に有してなるも
のである特許請求の範囲第7項または第8項記載の形質
転換細胞。 10 形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝子
の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択され
た細胞である特許請求の範囲第9項記載の形質転換細胞
。 11 増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素の
遺伝子である特許請求の範囲第9項記載の形質転換細胞
。 12 形質転換細胞が、形質転換後、1nM以上の濃度
のメソトレキセートに耐性を示す細胞として選択された
細胞である特許請求の範囲第11項記載の形質転換細胞
。 13 形質転換細胞の由来が、BHK−21(C−13
)またはCHO−K1である特許請求の範囲第7項、第
8項、第9項、第10項、第11項または第12項記載
の形質転換細胞。 14 形質転換細胞の由来が、ヒトである特許請求の範
囲第7項、第8項、第9項、第10項、第11項または
第12項記載の形質転換細胞。 15 ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータ配列とヒト
・リンホトキシンをコードするDNA配列とを結合した
DNA配列を有するヒト・リンホトキシン発現ベクター
による動物培養細胞の形質転換細胞を培養し、リンホト
キシンを生成せしめ、これを採取することを特徴とする
リンホトキシンの製造方法。 16 ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、ヒトβ−
アクチン遺伝子のプロモータDNA配列とヒト・リンホ
トキシンをコードするDNA配列が両配列の蛋白合成開
始アミノ酸であるメチオニンのコドンを介して結合して
なるものである特許請求の範囲第15項記載の製造方法
。 17 ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、増幅可能
な遺伝子のDNA配列を同一のDNA鎖上に有してなる
ものである特許請求の範囲第15項または第16項記載
の方法。 18 形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝子
の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択され
た細胞である特許請求の範囲第17項記載の製造方法。 19 増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素の
遺伝子である特許請求の範囲第17項記載の製造方法。 20 形質転換細胞が、形質転換後、1nM以上の濃度
のメソトレキセートに耐性を示す細胞として選択された
細胞である特許請求の範囲第19項記載の製造方法。 21 形質転換細胞の由来が、BHK−21(C−13
)あるいはCHO−K1である特許請求の範囲第15項
、第16項、第17項、第18項、第19項または第2
0項記載の製造方法。 22 形質転換細胞の由来が、ヒトである特許請求の範
囲第15項、第16項、第17項、第18項、第19項
または第20項記載の製造方法。 23 培養に用いる培地が無血清培地である特許請求の
範囲第15項、第16項、第17項、第18項、第19
項、第20項、第21項または第22項記載の製造方法
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61251344A JPS63105680A (ja) | 1986-10-22 | 1986-10-22 | ヒト・リンホトキシン発現ベクタ−、該発現ベクタ−による形質転換細胞および該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61251344A JPS63105680A (ja) | 1986-10-22 | 1986-10-22 | ヒト・リンホトキシン発現ベクタ−、該発現ベクタ−による形質転換細胞および該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63105680A true JPS63105680A (ja) | 1988-05-10 |
Family
ID=17221427
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61251344A Pending JPS63105680A (ja) | 1986-10-22 | 1986-10-22 | ヒト・リンホトキシン発現ベクタ−、該発現ベクタ−による形質転換細胞および該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63105680A (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
JPS61108389A (ja) * | 1984-09-13 | 1986-05-27 | ザ ボ−ド オブ トラステイ−ズ オブ ザ リ−ランド スタンフオ−ド ジユニア ユニバ−シテイ | β−アクチン遺伝子 |
-
1986
- 1986-10-22 JP JP61251344A patent/JPS63105680A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
JPS61108389A (ja) * | 1984-09-13 | 1986-05-27 | ザ ボ−ド オブ トラステイ−ズ オブ ザ リ−ランド スタンフオ−ド ジユニア ユニバ−シテイ | β−アクチン遺伝子 |
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