SK157498A3 - Isolated and recombinant nucleic acid, bas-1 protein or peptide thereof, and agent, antibody, expression vector, host cell and method of their use - Google Patents

Description

Predkladaný vynález sa týka radu biologických látok, ktoré sa používajú na modulovanie ludskej imunitnej odpovede. Predovšetkým je zameraný na použité látky a spôsoby, napríklad pri interakcii B a T buniek.

Doterajší stav techniky

Leukémia, lymfómy, karcinómy a iné zhubné bujnenia sú opísané napríklad vo Wilson a kol. (eds.) Harrison's Principles of Internal medicíne, McGraw-Hill, New York, str. 1599-1612. Jeden z príkladov takých ochorení, malígne lymfómy sú neoplastické transformované bunky, ktoré sa prevažne vyskytujú v lymfoidných tkanivách (napríklad Ňadier L. M. v Harrisonovi). 90 % lymfómov, ktoré nepatria medzi Hodgkinsonove, z ktorých sa v USA vyskytuje približne 30000 nových prípadov ročne, sú B bunkové lymfómy. Menej ako 25 % týchto prípadov sa. lieči. Iným príkladom je leukémia, ktorej sa v USA vyskytuje ročne približne 30000 nových prípadov. Preto je potrebné, aby sa B a T bunkové lymfómy, leukémia, karcinómy a iné zhubné bujnenia liečili efektívnejšie.

r

Rast normálnych kludových B buniek (tiež označovaných ako B lymfocyty) zahŕňa dva rozdielne spôsoby. Prvým kľudové bunky aktivujú prechod z Gq fázy do fázy bunkového cyklu. Viď. napríklad Alberts a kol. (eds. 1989) Molecular Biology of the Celí, Garland Publ., NY a Darnell a kol. (1990) Molecular Celí Biology, Freeman, NY. Ďalej aktivované bunky indukujú proliferáciu. Viď. napríklad Paul, ed. (1989) Fundamental

Immunology, 2. ed., Raven Press, NY a tretia edícia. Identifikovalo sa niekolko faktorov, ktoré indukujú rast B buniek s obsahom interleukínu-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-10 a IL-13. Okrem toho sa zistilo, že protilátky proti určitým B bunkovým povrchovým molekulám podporujú B bunkovú proliferáciu. U T buniek (tiež označované ako T lymfocyty) tiež indukujú proliferáciu niektoré faktory, ktoré obsahujú fytohemaglutinín, anti-T bunkové receptorové monoklonálne protilátky, anti-CD3 monoklonálne protilátky a iné látky. Rad štúdií zahŕňa molekulu CD40 ako rastový faktorový receptor a dôležitý regulátor ľudskej B bunkovej proliferácie a vývoja. B lymfocyty sú aktivované tak, že príde k interakcii molekuly CD40 na povrchu B lymfocytov s ligandom, čím sa prechodne exprimuje v aktivovanom helperi T buniek.

CD40 je membránový glykoproteín exprimovaný v normálnych B lymfocytoch a B bunkách zhubných nádorov, intersticiálnych bunkách, folikulárnych dendritických bunkách, tymických epiteliálnych bunkách a iných karcinómoch. Ľudský CD40 bol prvýkrát identifikovaný v roku 1985 ako epitop monoklonálnej protilátky, ktorý sa takmer výhradne exprimoval v B lymfocytoch a preto sa používa ako znak pre B bunky. Ľudský CD40 antigén je 45 až 50 kD glykoproteín. Anti-CD40 protilátky spôsobujú silný kostimulačný signál pre B bunkovú proliferáciu indukovanú acetátom kyseliny forbolmyristovej (PMA), anti-CD20 protilátkami alebo antiimunoglobulínovými protilátkami. Okrem toho anti-ľudské CD40 protilátky s IL-40 na aktivovaných B bunkách tiež spôsobujú rad vplyvov, vrátane krátkodobej replikácie, indukcie syntézy IgE a dlhodobej proliferácie, keď sa kultúry ďalej dopĺňajú CD32 transfektovanými L bunkami.

B7 (CD80) a B70 (CD86) sú druhou skupinou molekúl, ktoré sprostredkujú pevnú B a T bunkovú interakciu. Tieto molekuly interagujú s ligandami CD28 na B bunkách a CTLA-4 na T bunkách. Tieto interakcie sú hlavnými kostimulačnými signálmi aktivácie B aj T buniek.

Počas posledných 15 rokov sa objasnilo, že tieto dvojice povrchových molekúl majú základnú funkciu v aktivácii T a B buniek. Preukázal sa rad in vitro a in vivo pokusov, kde tieto dve dvojice molekúl predstavujú v imunosupresii dôležitú úlohu. Viď. napríklad Banchereau a kol. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12: 881-922, van Kooten a kol. (1996) Adv. Immunol. 61: 1-77

Linsley and Ledbetter (1993) Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212.

Imunosupresia predstavuje velmi dôležitý imunologický zákrok na ochranu a liečenie autoimúnnych chorôb a odmietnutie štepu počas transplantácie. Imunosupresia sa môže dosiahnuť:

a) antiproliferačnými liekmi (cyklofosfamidom, 15-deoxystergualínom atď),

b) glukokortikosteroidmi,

c) inhibítormi intracelulárnych signalizačných dráh (napríklad cyklosporínom),

d) imunosupresívnymi cytokínmi (napríklad TGF-β, IL-10),

e) špecifickou tolerančnou indukciou antigénmi a

f) inhibíciou bunkových povrchových molekúl zahrnutých v aktivácii T a B lymfocytov, ako sú CD40/CD40 ligand a B7/B70 s CD28/CTLA-4.

V roku 1995 sa iná molekula, nazvaná ako RP105, klonovala'zo slezinných buniek myši. Napríklad Miyake a kol. (1995) RP105, a novel B celí surface molecule implicated in B celí activation, is a number of the leucine-rich repeat protein family J. Immunol. 154: 3333-3340. Monoklonálna protilátka proti RP105 indukuje silnú proliferáciu myších B buniek a chráni myšie B bunky proti apoptóze indukovanej ožiarením podobným spôsobom ako anti-CD40 protilátka alebo CD40-ligand. Viď. Miyake a kol.

(1994) Murine B celí proliferation and protection from apoptosis with an antibody againts a 105 kDa molecule: Unresponsiveness of

X-linked immunodeficient B cells J. Exp. Med. 180: 1217-1224.

RP105 a jeho údajný ligand môžu byť treťou dvojicou molekúl, ktoré majú dôležitú úlohu v aktivácii T a B buniek. Avšak až dosial nebola ludská sekvencia dostupná a ani jeho štruktúra a aktivity neboli stanovené. Predkladaný vynález poskytuje tento a mnoho iných používaných postupov.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa zaoberá zložkami vybranými zo skupiny, ktorá sa skladá: z izolovanej alebo rekombinantnej nukleovej kyseliny, ktoré kódujú ludský BAS-1 proteín alebo jeho fragment, zo značne čistého BAS-1 proteínu alebo jeho peptidu, z fúzneho proteínu, ktorý obsahuje proteínové sekvencie BAS-1 a z protilátky vyvolanej proti rekombinantnému alebo purifikovanému opičiemu BAS-1 proteínu.

V prípadoch izolovanej alebo rekombinantnej nukleovej kyseliny, môže táto kyselina obsahovať sekvenciu, ktorá je definovaná v SEKV. ID ČÍS.: 1.

V prípadoch proteínov, môže byť proteínom značne čistý BAS-1 proteín alebo jeho peptid, môže sa vybrať zo skupiny, ktorá sa skladá z: proteínu alebo peptidu z primátov s obsahom ludského proteínu, proteínu alebo peptidu s obsahom aspoň jedného polypeptidového segmentu definovaného v SEKV. ID ČÍS.: 2, proteínu alebo peptidu, ktorý vykazuje posttranslačný modifikovaný vzor odlišný od prírodného BAS-1 proteínu a proteín, ktorý neobsahuje intracelulárnu doménu BAS-1 a môže to byť látka, ktorá obsahuje proteín a farmaceutický prijatelný nosič.

V prípadoch protilátky sú zahrnuté tie, kde BAS-1 proteín je opičí proteín, ktorý obsahuje jeden z ľudských proteínov, protilátka je vyvolaná proti peptidu so sekvenciou definovanou v SEKV. ID ČÍS.: 2, protilátka vykazuje Kd aspoň okolo 10 μΜ, protilátkou je monoklonálna protilátka alebo je protilátka značená. Ďalšie prípady zahŕňajú tie, keď protilátka indukuje silnú proliferáciu B buniek alebo chráni B bunky proti apoptóze vyvolanej ožiarením alebo steroidným hormónom.

Predkladaný vynález tiež zahŕňa súpravu, ktorá obsahuje napríklad nukleovú kyselinu kódujúcu BAS-1 proteín alebo peptid, značne čistý BAS-1 proteín alebo fragment alebo protilátku alebo receptor, ktorý špecificky viaže BAS-1 proteín. Súprava, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu zahŕňa kódujúcu sekvenciu definovanú v SEKV. ID ČÍS.: 1. Pre súpravu, ktorá obsahuje proteín alebo peptid, sa polypeptid často vyberá zo skupiny, ktorá sa skladá: z proteínu alebo peptidu primáta s obsahom ludského proteínu, proteínu alebo peptidu s obsahom aspoň jedného polypeptidového segmentu definovaného v SEKV. ID ČÍS.: 2 a proteínu alebo peptidu, ktorý vykazuje posttranslačný modifikovaný vzor odlišný od prírodného BAS-1 proteínu.

Iná súprava môže zahŕňať protilátku alebo receptor, kde BAS-1 proteín je opičí proteín, ktorý obsahuje jeden z ľudských proteínov. Tvorba protilátky je vyvolaná proti peptidovej sekvencií definovanej v SEKV. ID ČÍS.: 2, protilátka vykazuje Kd aspoň okolo 10 μΜ a je monoklonálnou protilátkou alebo je značená.

Vynález tiež poskytuje spôsob preskúmania vzorky väzbového partnera pre BAS-1 proteín, ktorý zahŕňa postup tvorby purifikovaného alebo rekombinantného BAS-1 proteínu a preskúmania vzorky pre špecifickú väzbu väzbového partnera na BAS-1 proteín. V niektorých prípadoch vzorka obsahuje proteíny z T bunky, dentritickej bunky, ktorá zahŕňa folikulárnu dentritickú bunku alebo obsahuje stromatickú bunku, ktorá zahŕňa väzivovú bunku, endotelovú bunku a epitelovú bunku. V iných prípadoch je väzbovým partnerom protilátka a vzorka je hybridómový supernatant.

Z iného pohľadu predkladaný vynález zahŕňa spôsob modulácie fyziológie alebo vývoja bunky, ktorý obsahuje spojenie bunky s agonistom alebo antagonistom BAS-1 proteínu. Fyziológia je vybraná z: imunosupresie, aktivácie cytotoxickej smrti, modulácie tvorby cytokínu alebo rastu lymfómu. Antagonistom je často protilátka proti opičiemu BAS-1 proteínu. A spôsob môže zahŕňat práve v kombinácii s mediátorom signálu cez antigénový receptor, dráhu ligandu CD40:CD40 alebo dráhu CD28/CTLA-4:B7/B70, napríklad anti-CD3, anti-CD40, ligand anti-CD40, anti-CD28, anti-CTLA-4, anti B7, anti B70 alebo rozpustnú časť vhodne povrchovo značenej molekuly.

I. Všeobecne

Predkladaný vynález poskytuje aminokyselinovú sekvenciu a sekvenciu DNA ľudského proteínu, ktorý vykazuje vlastnosti aktivovaného antigénu. Tento proteín je označený ako BAS-1 (B celí Activation and Survival antigen-1). Tu opísaná sekvencia primáta bola nájdená až potom, ako bol opísaný myší gén. Viď Miyake a kol. (1995) J. Immunol. 154: 3333-3340. Podobné proteínové sekvencie v iných druhoch primátov by sa tiež mohli použiť. Nižšie uvedené príklady sú, vo vzorových prípadoch, zamerané na opísanú ludskú BAS-1 prírodnú alelu, ale sú rovnako tak aplikovateľné do alelických a/alebo polymorfných variantov, napríklad z iných jedincov, tak ako z variantov upravených zostrihom, napríklad prírodných druhov.

z

Tieto gény umožňujú izoláciu iných opičích génov kódujúcich proteíny podobné tomuto, ďalej rozširujú skupinu mimo opísaných špecifických prípadov. Spôsob je podrobne opísaný nižšie.

Ľudský BAS-1 je takto nazvaný podľa jeho biologickej aktivity. Monoklonálna protilátka proti myšiemu homológu RP105 indukuje silnú proliferáciu myších B buniek a chráni myšie

B bunky proti apoptóze indukovanej ožiarením podobným spôsobom ako anti-CD40 protilátka alebo CD40-ligand.

ľudská BA$-1 cDNA sa izolovala s použitím sekvencie nukleovej kyseliny, založenej na sekvencií myšieho RP105. Analýza príslušného kódovaného proteínu naznačuje, že íudský BAS-1 patrí do skupiny proteínov, ktoré obsahujú úsek bohatý na leucín. Iný zástupcovia tejto skupiny zahŕňajú CD14-LPS receptor, FSN/LH/TSH receptory a neurotropné receptory. Predpokladá sa, že sú tieto receptory zahrnuté v signálnej transdukcii.

ľudská BAS-1 cDNA bola odvodená s použitím sekvencií radu oblastí myšieho RP105. Porovnanie homológie otvorených čítacích rámcov medzi myším a ludským BAS-1 ukazuje priližne 67 % homológiu DNA sekvencie a približne 73 % zhodnosť aminokyselinovej sekvencie s myším RP105. ľudský BAS-1 môže mať značnú úlohu vo vonkajšom imunitnom systéme, napríklad vo bunkách.

vývojovej regulácii v iných (1991) Developmental Biology Sunderland, MA, Browder a kol. ed.), Saunders, Philadelphia,

Viď. napríklad Gilbert (3. ed.), Sinauer Associates, (1991) Developmental Biology (3. PA., Russo a kol. (1992)

Development: The Molecular Genetic Approach, Springer-Verlag, New York, N.Y. a Wilkins (1993) Genetic Analysis Development (2. ed.) Wiley-Liss, New York, N.Y. Identifikácia ligandu pre íudský BAS-1 môže zodpovedať niektoré otázky, ktoré sa naskytli týmto pozorovaním.

II. Purifikovaný ludský BAS-1 proteín.

SEKV. ID ČÍS.: 1 opisuje nukleotidovú sekvenciu cDNA a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu. Aminokyselinovú sekvenciu tiež vyjadruje SEKV. ID ČÍS.: 2. Domnievame sa, že signálna sekvencia ide od Met (1) po Val (20), N-koniec, ktorý obsahuje na asparagíne (zvyšok 34, 53) dve potenciálne N-väzbové glykozylované miesta, ide od Cys (28) po Leu (58), tandemové repetície oblasti bohatej na leucín, ktorá obsahuje potenciálnych miest pre N-väzbovú glykozyláciu na asparagíne (zvyšky 70, 78, 201, 234, 244, 394, 402, 451 a 573), ide od Thr (55) po Tyr (592). C-lemovacia oblast ide od Leu (574) po Cys (625), transmembránová oblast je od Ala (629) po Val (650), intracelulárna oblast,¹ ktorá obsahuje dve potenciálne fosforylované miesta na tyrozíne (652 a 658), ide od Lys (651) po Phe (661).

Nasledujúca tabuľka zobrazuje zoradenie repetícií bohatých na leucín ľudského BAS-1 proteínu opísaného v SEKV. ID ČÍS.: 2.

Tabuľka 1

C 1 I

LXXLXLXXNXLXXLXXXXXXXLXX konsenzus:

1:	55-78
2:	79-102
3 :	103-126
4 :	127-150
5:	151-174
6:	175-198
7:	199-223
8:	224-246
9:	247-275
10	276-299
11	300-322
12	323-346
13	347-371
14	372-397
15	398-421
16	422-446
17	447-470
18	471-497
19	498-521
20	522-544
21	545-568
22	569-592

TEFLEFSFNFLPTIHNRTFSRLMN

LTFLDLTRCQINWIPEDTFQSHHQ

LSTLWTGNPLIFMAETSLNGPKS

LKHLFLIQTGISNLEFIPVHNLEN

LESLYLGSNHISSIKFPKDFPARN

LKVLDFQNNAIHYISREDMRSLEQ

AINLSLNFNGNN-ÄZKGIELGAFDSTV

FQSLNFGGTPNL-SVIFNGLQNST

TQSLWLGTFEDIDDEDI SS AMLKGLCEMS

VESLNLQEHRFSDISSTTFQCFTQ

LQELDLTATHLKGLPSGMKG -LNL

LKKLVLSVNHFDQLCQISAANFPS

LTHLYIRGN-VKKLHLGVGC -LEKLGN

LQTLDLSHNDJľEASDCCSLQ-LKNLSH

LQTLŇLSHNEPLGLQSQAFKECPQ

LELLDLAFTRLHINAPQSPFQNLHF

LQVLNLTYQFLDTSNQHLLAGLPV

LRHLNLKGNHFQDGTITKTNLLQ'l VG S

LEVLILSSCGLLSIDQQAFHSLGK

MSHVDLSHNSLTCDSIDSLSHLK

GIYLNLAANSINIISPRLLPILSQ

QSTINLSHNPLDCTCSNIHF-LTWY

V súvislosti s proteínom sa, tu používaný termín ludský BAS-l, odkazuje na proteín s aminokyselinovou sekvenciou opísanou v SEKV. ID ČíS.: 2. Predkladaný vynález tiež zahŕňa proteíny, ktoré obsahujú jeho veíký fragment, napríklad mutanty a polymorfné varianty, spoločne so získaným íudským polypeptidom, ktorý vykazuje zhodné biologické funkcie alebo interakcie s väzbovými zložkami špecifickými k ľudskému BAS-l. Tieto väzbové zložky sa typicky viažu na ludský BAS-l s vysokou afinitou, napríklad aspoň 100 nM, obvykle lepšie ako 30 nM, častejšie lepšie ako 10 nM a najčastejšie lepšie ako 3 nM. Homológne proteíny sa nachádzajú v iných druhoch ako ľudských, napríklad u primátov.

Tu používaný termín polypeptid vyjadruje fragment alebo segment a zahŕňa úsek aminokyselinových zvyškov aspoň 8 aminokyselín, vo všeobecnosti aspoň 10 aminokyselín, najvšeobecnejšie aspoň 12 aminokyselín, často aspoň 14 aminokyselín, častejšie aspoň 16 aminokyselín, typicky aspoň 20 aminokyselín, obvykle aspoň 22 aminokyselín, častejšie aspoň 24 aminokyselín, lepšie aspoň 26 aminokyselín, častejšie aspoň 28 aminokyselín a čiastočne uprednostňované aspoň 30 alebo viac aminokyselín, napríklad 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57 atď.

Termín ligand alebo väzbová zložka sa odkazuje na molekuly, ktoré sa špecificky viažu na BAS-l, napríklad protilátka-antigén. Iné interakcie zahŕňajú napríklad typ ligand-receptor, alebo s látkami, ktoré sa spájajú s BAS-l, napríklad v interakcii proteín-proteín, buď kovalentnou alebo nekovalentnou väzbou. Molekula môže byt polymér alebo chemické činidlo. Žiadny iný náznak pokiaí ide o to, či je BAS-l v interakcii ligand-receptor buď ligand alebo receptor, nie je uvedený, len to, že interakcia vykazuje špecifickú afinitu. Funkčným analógom môže byt ligand so štruktúrnymi modifikáciami alebo úplne iná molekula v takom molekulovom tvare, ktorý reaguje s vhodným ligandovým väzbovým determinantom. Ligandy môžu slúžiť ako agonisty alebo antagonisty, viď. napríklad Goodman a kol.

(eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. ed.), Pergamon Press.

Rozpustnosť polypeptidu a fragmentu záleží na prostredí a polypeptide. Rozpustnosť je ovplyvnená mnohými faktormi, napríklad teplotou, prostredím elektrolytu, velkosťou a molekulárnymi vlastnosťami polypeptidu a pôvodom rozpúšťadla. Bežne je teplota, pri ktorej sa polypeptid používa, v rozsahu od 4 ’C do 65 ’C. Obvykle sa používa teplota vyššia ako 18 ’C a častejšie je vyššia ako 22 ’C. Na diagnostické účely sa obvykle používa izbová teplota alebo teplejšia, ale pri stanovení sa používa teplota nižšia ako je denaturačná teplota zložiek. Na terapeutické účely sa obvykle používa telesná teplota, typická pre ludí je 37 ’C, aj keď za určitých situácií môže byt vyššia alebo nižšia in situ alebo in vitro.

Elektrolyty sa obvykle blížia in situ k fyziologickým podmienkam, ale môžu sa modifikovať na vyššiu alebo nižšiu iónovú silu, ktorá je výhodná. Konkrétne ióny sa môžu modifikovat, aby sa upravili na štandardné pufre používané vo fyziologických alebo analytických podmienkach. Veľkosť a štruktúra polypeptidu by mala byť obvykle v dostatočne stabilnom stave, v žiadnom prípade v denaturovanej forme. Polypeptid môže byt spojený s inými polypeptidmi za vzniku kvartérnej štruktúry, napríklad na umožnenie rozpustnosti, alebo spojený s lipidmi alebo detergentmi spôsobom, ktorý je podobný prírodnej lipidovej dvojvrstve. Predovšetkým sa zdá, že prírodný proteín je často spojený s lipidom PI väzbou.

Rozpúšťadlo je obvykle biologicky kompatibilný pufor používaný na zachovanie biologických aktivít a je obvykle upravený fyziologickým rozpúšťadlom. Rozpúšťadlo má bežne neutrálne pH medzi 5a 10, ale lepšie okolo 7,5. V niektorých prípadoch sa pridáva mierny nedenaturovaný detergent, napríklad CHS (cholesteryl hemisukcinát) alebo CHAPS (3-([3-cholamidopropyl]dimetylamonio)-l-propánsulfonát) alebo sa pridá v dostatočne nízkej koncentrácii, aby nenarušil terciárnu štruktúru proteínu.

Rozpustnosť je vyjadrená sedimentáciou meranou v Sedbergových jednotkách, ktoré sú za konkrétnych podmienok mierou sedimentačnej rýchlosti molekuly. Stanovenie sedimentačnej rýchlosti sa klasicky uskutočnilo v analytickej ultracentrifúge, ale teraz sa bežne uskutočňuje v štandardnej centrifúge. Viď. Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2. ed.), W. H. Freeman a Cantor and Schimel (1980) Biophysical Chemistry, časť 1 až 3, W. H. Preeman & Co., San Francisko. Po približnom stanovení sa vzorka, ktorá obsahuje údajne rozpustný polypeptid, stočí v štandardnej ultracentrifúge pri 50 K rpm 10 minút a rozpustné molekuly zostanú v supernatante. Rozpustné častice alebo polypeptid budú menej ako 30 S, bežne menej ako 15 S, obvykle menej ako 10 S, často menej ako 6 S, najmä častejšie menej ako 4 S a najčastejšie menej ako 3 S.

III. Fyzikálne varianty

Tento vynález tiež zahŕňa proteíny alebo peptidy so značne zhodnou aminokyselinovou sekvenciou, ako je aminokyselinová sekvencia ludského BAS-1. Obsahuje napríklad jedno-, dvoja trojvlásenkové konzervatívne substitúcie. Vhodnejšia je substitúcia mimo konzervatívnych cysteínov a občas je mimo oblasť helikálnej štruktúrnej domény. Také varianty sa môžu používať na tvorbu špecifických protilátok a často spolu majú vela alebo všetky biologické vlastnosti. Zhodnosť aminokyselinovej sekvencie je stanovená optimalizovaním zvyškových zodpovedajúcich častí. Tie sa zmenia kedykolvek vzhladom na konzervatívne substitúcie. Konzervatívna substitúcia bežne zahŕňa substitúcie v nasledujúcich skupinách: glycín, alanín; valín, izoleucín, leucín; aspartámová kyselina, glutámová kyselina; asparagín, glutamín; serín, treonín; lyzín, arginín a fenylalanín, tyrozín. Predpokladá sa, že podobné aminokyselinové sekvencie zahŕňajú v jednotlivých proteínových sekvenciách prírodné alelické varianty. Bežné homológne proteíny alebo peptidy môžu mat s aminokyselinovou sekvenciou ľudského BAS-1 85 až 100 % zhodnosť (ak sú uvedené medzery) a do 90 až 100 % (ak je zahrnutá konzervatívna substitúcia). Stupeň zhodnosti je aspoň okolo 85 %, vo všeobecnosti okolo 87 %, často aspoň okolo 89 %, bežne aspoň 91 %, obvykle aspoň okolo 93 %, častejšie aspoň okolo 95 %, lepšie aspoň okolo 97 % a najčastejšie aspoň okolo 98 % a najmä najlepšie aspoň okolo 99 % alebo viac. Viď. tiež Needleham a kol. (1970) 48: 443-453, Sankoff a kol. (1983) kapitola prvá v Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Addison - Wesley, Reading, MA a Software od IntelliGenetics, Mountain View, CA a University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

predeterminované proteínu alebo

Vyizolovaná ludská BAS-1 DNA sa môže ľahko modifikovať substitúciou nukleotidov, nukleotidovou deléciou, inzerciou a inverziou nukleotidového úseku. Výsledkom týchto modifikácií budú nové DNA sekvencie, ktoré kódujú užitočné antigény, ich deriváty alebo proteíny s podobnou alebo opačnou aktivitou. Tieto modifikované sekvencie sa môžu použiť na tvorbu mutantných antigénov alebo zosilňovať expresiu. Zosilnenie expresie môže zahŕňať génovú amplifikáciu, zvýšenú transkripciu, transláciu a ďalšie mechanizmy. Mutantné BAS-1 deriváty obsahujú alebo miestne špecifické mutácie príslušného jeho fragmentov. Mutant BAS-1 obsahuje polypeptid, ktorý inak zahŕňa dôležitú črtu ľudského BAS-1, ako je uvedené vyššie, ale má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši od pôvodného BAS-1, čo je spôsobené deléciou, substitúciou alebo inzerciou. Najmä miestne špecifický mutant BAS-1 je definovaný tak, že je homológny s antigénom opísariym v SEKV. ID ČÍS.: 2 a tak má s týmto antigénom rad biologických aktivít. Podobné poňatia sa vzťahujú na rôzne BAS-1 proteíny, najmä tie, ktoré sú už nájdené v rôznych iných primátoch. Ako bolo skôr uvedené a zdôraznené, príklady vo všeobecnosti uvádzajú ďalšie BAS-1 proteíny, ktoré sa výhradne neobmedzujú na konkrétne diskutované ľudské prípady.

Aj keď sú miesta miestne špecifickej mutácie predeterminované, mutanty nemusia byt miestne špecifické. Mutagenézia ľudského BAS-1 môže byt spôsobená inzerciou alebo deléciou aminokyseliny. Substitúcia, delécia, inzercia alebo iné kombinácie môžu byt generované, aby sa dosiahla konečná podoba. Inzercia zahŕňa spojenie N- a C-konca. Náhodná mutagenéza môže viest k cieľovému kodónu a potom sa môže u exprimovaných mutantov skúmat požadovaná aktivita. Spôsoby substituovaných mutácií na vopred určených miestach DNA so známou sekvenciou sú v odbore dobre známe, napríklad mutagenéza M13 priméru. Viď. tiež Sambrook a kol. (1989) a Ausubel a kol. (1987 a doplnok).

Mutáciou DNA by sa bežne nepremiestnila kódujúca sekvencia mimo čítací rámec a lepšie sa nevytvorí komplementárna oblast, ktorá by mohla hybridizovat za vzniku sekundárnej mRNA štruktúry, ako sú slučky alebo vlásenky.

Predkladaný vynález tiež zahŕňa rekombinantná proteíny, napríklad heterológnu fúziu proteínmi, ktorá využíva segmenty z týchto proteínov. Heterológna fúzia proteínov je taká fúzia proteínov alebo segmentov, ktoré obvykle nefúzujú rovnakým spôsobom. A tak je produktom fúzie imunoglobulínu s BAS-1 polypeptidom spojená molekula so sekvenciou, ktorá vznikne charakteristickou peptidovou väzbou. Molekula je typicky vytvorená ako jednoduchý translačný produkt a vykazuje vlastnosti, ktoré pochádzajú z obidvoch peptidových zdrojov. Podobné poňatie sa aplikuje aj na heterológne sekvencie nukleovej kyseliny.

Okrem toho môže nový konštrukt vzniknúť kombináciou podobných funkčných domén z iných proteínov. Napríklad segmenty, ktoré viažu ligand alebo iné segmenty, sa môžu vymeniť s rôznymi novými fúznymi polypeptidmi alebo fragmentárni. Viď. napríklad Cunningham a kol. (1989) Science 243: 1330-1336 a O'Dowd a kol. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. Nové chimerické polypeptidy vykazujú nové kombinácie špecifít, ktoré sú výsledkom funkčnej väzby špecifít, ktoré viažu ligand a iných funkčných domén.

Fosforamiditovým spôsobom opísaným Breaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, vznikajú vhodné syntetické DNA fragmenty. Dvojreťazcový fragment sa často získava buď syntézou komplementárneho reťazca a súčasne za vhodných podmienok teplotnou hybridizáciou reťazca alebo pridaním komplementárneho reťazca k vhodnému priméru s použitím DNA polymerázy.

IV. Funkčné varianty

Blokácia fyziologickej odpovede na BAS-1 antigény môže vyplývať z inhibície väzby ligandu na BAS-1, pravdepodobne kompetitívnou inhibíciou. Teda pri stanovení in vitro predkladaného vynálezu sa bude často používať izolovaný proteín, membrány z buniek, ktoré exprimujú rekombinantný BAS-1, rozpustné fragmenty, ktoré obsahujú .segmenty viažuce ligand týchto antigénov alebo fragmenty upevnené na tuhej fáze substrátov. Tieto stanovenia budú tiež pripúšťať pri diagnostickom stanovení vplyvy buď mutáciou a modifikáciou väzbového segmentu alebo mutáciou a modifikáciou ligandu, napríklad analógy ligandu.

Vynález tiež pozoruje použitie preskúmavania kompetitívneho liečiva, kde napríklad neutralizujúce protilátky proti antigénu alebo antigénovým fragmentom súťažia s testovanou látkou o väzbu na proteín. Takto sa môžu použiť protilátky na detekciu prítomnosti niektorých polypeptidov, ktoré majú jedno alebo viacero miest antigénu a tiež sa môžu použiť na obsadenie väzbových miest na proteíne, ktoré môžu byť inak obsadené ligandom.

Navyše, neutralizačné protilátky proti BAS-1 a jeho rozpustnému fragmentu, ktorý obsahuje vysoko afinitné väzbové miesto, sa môžu použiť na inhibíciu funkcie ligandu v tkanivách, napríklad tkanivách, ktoré podstupujú abnormálnu fyziológiu.

Deriváty BAS-1 antigénov obsahujú aminokyselinové mutanty, glykozylované varianty a kovalentné konjugáty alebo konjugáty spojené s inými chemickými zložkami. Kovalentné deriváty sa môžu pripraviť väzbou funkčných skupín, ktoré sa nachádzajú na aminokyselinovom mieste reťazcov BAS-1 antigénu alebo na N- alebo C-konci polypeptidu spôsobom, ktorý je v odbore dobre známy. Tieto deriváty môžu zahŕňať bez obmedzenia alifatické estery alebo amidy na C-konci polypeptidov alebo zvyšky, ktoré obsahujú karboxylové miesto reťazcov, O-acylové deriváty hydroxylových skupín, ktoré obsahujú zvyšky, a N-acylové deriváty N-konca aminokyselín alebo aminoskupinu, ktorá obsahuje zvyšky, napríklad lyzín alebo arginín. Acylové skupiny pochádzajú z alkylových skupín, ktoré obsahujú C_g až C_lg alkyl, čím sa tvoria alkanoylaroylové druhy. Najmä sú tu zahrnuté glykozylové úpravy, napríklad modifikácia glykozylového vzoru polypeptidu počas jeho syntézy a postupu alebo iné spôsoby. Mimoriadne vhodným spôsobom na toto uskutočnenie je pôsobenie glykozylačných enzýmov získaných z buniek, ktoré obvykle zabezpečujú tento proces, napríklad ľudské glykozylačné enzýmy. Tiež sa študujú deglykozylačné enzýmy. Vynález tiež zahŕňa variant rovnakej primárnej aminokyselinovej sekvencie, ktorá je trochu modifikovaná a obsahuje fosforylované aminokyselinové zvyšky, napríklad fosfotyrozín, fosfoserín alebo fosfotreonín.

Hlavnou skupinou derivátov sú kovalentné konjugáty BAS-1 antigénov alebo jeho fragmentov s inými polypeptidovými proteínmi. Tieto deriváty sa môžu syntetizovať v rekombinantnéj kultúre, ako sú N- a C-koncová fúzia alebo použitím činidiel známych v odbore pre ich užitočnosť v zosieťovaných proteínoch ha reaktívnych miestach skupín. Vhodnejšie miesta na derivatizáciu ligandov so zosietovacími činidlami sú na voľných aminoskupinách, uhľovodíkových častiach a cysteínových zvyškoch.

Tiež sa uskutočnila fúzia polypeptidov medzi BAS-1 antigénmi a inými homológnymi a heterológnymi proteínmi. Homológne proteíny môžu byť spojené s rôznymi povrchovými vzormi, napríklad hybridný proteín vykazuje ligandovú špecifitu jedného alebo viacerých vzorových proteínov. Podobne sa môže vytvoriť heterológna fúzia, ktorá by vykazovala kombináciu vlastností a aktivít odvodených proteínov. Typickým príkladom je fúzia reportérového polypeptidu, napríklad luciferázy so segmentom alebo doménou antigénu, napríklad segment, ktorý viaže ligand, takto sa môže ľahšie určiť prítomnosť alebo umiestnenie požadovaného ligandu. Viď. napríklad Duli a kol., U. S. Patent No. 4 859 609, ktorý je tu citovaný. Iných génových fúznych partnerov zahŕňa bakteriálna β-galaktozidáza, trpE, proteín A, β-laktamáza, a-amyláza, alkoholdehydrogenáza a kvasnicový a mating faktor. Viď. napríklad Godowski a kol. (1988) Science 241: 812-816.

Fosforamiditovým spôsobom opísaným autormi Beaucage a Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1589-1862 vznikajú vhodné syntetické DNA fragmenty. Dvojreťazcový fragment sa často získava buď syntézou komplementárneho reťazca a súčasne za vhodných podmienok teplotnou, hybridizáciou reťazca alebo pridaním komplementárneho reťazca k vhodnému priméru s použitím DNA polymerázy.

Také polypeptidy môžu mat zvyšky aminokyselín, ktoré sú chemicky modifikované fosforyláciou, sulfonáciou, biotinyláciou alebo pridaním alebo odstránením iných častí, najmä tých, ktorých tvar molekuly je podobný fosfátovej skupine. V niektorých prípadoch budú modifikáciami vhodné značené látky alebo poslúžia ako purifikačné ciele, napríklad ligandová afinita.

Fúzia proteínov môže vo všeobecnosti nastať buď spôsobmi rekombinantných nukleových kyselín alebo syntézou polypeptidov. Spôsoby manipulácií s nukleovou kyselinou a spôsoby expresie sú vo všeobecnosti opísané napríklad v Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Spôsoby syntetizovania polypeptidov sú opísané napríklad v Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, Merrifield (1986) Science 232: 341-347 a Atherton a kol. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford.

Tento vynález tiež opisuje použitie derivátov BAS-1 antigénov iných, ako sú varianty v aminokyselinovej sekvencií alebo glykozylácie. Také deriváty môžu byt s chemickými časťami spojené kovalentne alebo nahromadené do zhlukov. Tieto deriváty patria vo všeobecnosti do troch tried: (1) soli, (2) retazcové miesto a koncové časti kovalentných modifikácií a (3) adsorpčné komplexy, napríklad s bunkovými membránami. Také kovalentné a nahromadené deriváty sa používajú ako imunogény, látky pri imunologických stanoveniach alebo purifikačných spôsoboch, ako je afinitná purifikácia ligandov alebo väzbových ligandov. Napríklad BAS-1 antigén sa môže, v odbore dobre známymi spôsobmi, imobilizovat kovalentnou väzbou na tuhý povrch, ako je Sepharoza aktivovaná kyanogénbromidom alebo adsorpciou na polyolefínové povrchy zo zosieťovaným glutaraldehydom alebo bez neho, na stanovenie alebo na purifikáciu anti-BAS-1 protilátok alebo jeho ligandu. Na diagnostické stanovenia sa môžu BAS-1 antigény tiež značiť detegovatelnou skupinou, napríklad rádiojódovaným chlóramínom T, kovalentne viazanou na výnimočné pôdne cheláty alebo sa môžu konjugovat na iné fluoreskujúce časti.

Rozpustný BAS-1 antigén, v tomto vynáleze, sa môže používať ako imunogén na tvorbu antiséra alebo protilátky špecifickej proti antigénu alebo niektorej jeho časti. Purifikované antigény sa môžu použiť na skúmanie monoklonálnych protilátok alebo fragmentov viažúcich antigén, ktoré sa pripravili imunizáciou rôznych druhov znečistených preparátov s obsahom proteíno'v. Termín protilátky zahŕňa najmä fragmenty prírodných protilátok, ktoré viažu antigén. Purifikovaný BAS-1 antigén sa môže tiež používať ako látka na detekciu protilátok vzniknutých ako odpoveď na prítomnosť zvýšenej hladiny BAS-1 alebo bunkových častí s obsahom antigénu za podmienok abnormálne diagnostických alebo špecificky fyziologických, či pri chorobe. Navyše v predkladanom vynáleze môžu BAS-1 fragmenty slúžiť ako imunogény na tvorbu protilátok, ako je opísané nižšie. Napríklad predkladaný vynález skúma protilátky získané proti aminokyselinovým sekvenciám alebo kódované nukleotidovou sekvenciou opísané v SEKV. ID ČÍS.: 1 alebo ich fragmenty. Tento vynález pozoruje protilátky, ktoré majú väzbovú afinitu k špecifickým fragmentom alebo sú získané proti špecifickým fragmentom, ktoré podlá predpokladov ležia mimo oblasti lipidovej dvojvrstvy. Navyše môže rad konštruktov vzniknúť fúziou membránovo nahromadených segmentov s inak extracelulárne voľnými časťami molekúl.

Predkladaný vynález preskúmava izoláciu ďalších podobných druhov. Je velmi pravdepodobné, že alelické druhy existujú v rôznych jedincoch, napríklad je tu opísaná viac ako 90 až 97 % zhodnosť s prípadom opísaným vyššie.

Vynález tiež predkladá spôsoby izolácie skupín príbuzných antigénov z rôznou aj podobnou štruktúrou, expresiou a funkciou. Vysvetlenie mnohých fyziologických vplyvov antigénov sa velmi urýchli izoláciou a charakterizáciou odlišných druhov protiľahlých častí antigénov. Predkladaný vynález predkladá najmä použitie nukleotidových sond na identifikáciu ďalších homológnych genetických entít vo rôznych druhoch.

Vyizolované gény umožňujú transformáciu buniek bez expresie BAS-1, napríklad iné druhové typy alebo bunky, ktoré nemajú zodpovedajúce antigény a vykazujú negatívnu aktivitu. Expresia transformovaných génov umožňuje izoláciu antigénovo čistých bunkových línií, s definovanými alebo jednodruhovými variantami. Tento prístup umožňuje ovela citlivejšiu detekciu a rozlíšenie fyziologických vplyvov akýchkoľvek ligandov. Subcelulárne fragmenty, napríklad cytoplasty alebo membránové fragmenty sa môžu izolovať a používať.

Rozbor kritických štrukturálnych častí, ktoré ovplyvňujú rad rôznych funkcií zabezpečovaných ligandami, umožňuje používanie štandardných spôsobov modernej molekulárnej biológie, najmä v porovnaní členov podoných tried. Viď. napríklad spôsob mutagenézie, ktorý zaznamenáva homológ, opísaný v Cunnigham a kol. (1989) Science 243: 1339-1336 a postupy používané v O'Dowd a kol. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992 a Lechleiter a kol. (1990) EMBO J. 9: 4381-4390.

Segmenty, ktoré viažu ligand, sa môžu substituovať druhovými variantami, aby sa určilo, aké štruktúrne črty sú dôležité v obidvoch ligandových väzbových afinitách a špecificitách. Rad rôznych BAS-1 variantov sa použije na sledovanie ligandov vykazujúcich kombinované interakčné vlastnosti s inými druhovými variantami.

Intracelulárna funkcia by sa zrejme týkala antigénových segmentov, ktoré sú bežne dostupné v cytozole. Avšak antigénová internalizácia môže nastať za istých okolností a môže dôjsť k interakcii medzi intracelulárnymi zložkami a určenými extracelulárnymi segmentami. Špecifické väzbové segmenty BAS-1 antigénu s inými intracelulárnymi zložkami sa môžu identifikovať mutagenézou alebo priamo biochemický, napríklad zosietením alebo afinitnými spôsobmi. Tiež sa bude aplikovať štruktúrna analýza kryštalografiou alebo inými fyzikálnymi spôsobmi. Ďalší výskum mechanizmu signálnej transdukcie môže zahŕňať štúdium nahromadených zložiek, ktoré sa môžu izolovať afinitnými spôsobmi.

Ďalej sa bude študovať expresia a kontrola BAS-1 antigénov. Kontrolované zložky spojené s antigénmi vykazujú rôzne vývojové, tkanivovo špecifické alebo iné expresné vzory. Predmetom záujmu sú horné a dolné genetické oblasti, napríklad kontrola zložiek.

Štúdium štruktúry BAS-1 antigénov vedie k zostrojeniu nových ligandov, najmä analógov, ktoré a antagonistické vlastnosti. Toto sa opísanými a sledovanými spôsobmi s požadovaným spektrom aktivít.

vykazujú agonistické môže kombinovať so skôr na izoláciu ligandov

Expresia v iných bunkových druhoch bude často v konkrétnych antigénoch spôsobovať rozdielnu glykozyláciu. Rad druhov môže mat rozdielne funkcie založené na rôznej štruktúre v porovnaní s aminokyselinovou sekvenciou. Rozdielna modifikácia môže byt zodpovedná za rozdielne funkcie a teraz je možné tieto vplyvy objasniť.

V predkladanom vynáleze sú zdôraznené dôležité vývojové antigény a látky na nich závislé. Aj keď sa uvedené príklady zameriavajú predovšetkým na ľudský BAS-1, odborníci v odbore ihneď spoznajú, že vynález obsahuje ďalšie BAS-1 antigény, napríklad primátov a iných cicavcov.

V. Protilátky

Protilátky môžu byt vytvorené proti radu alelických variantov BAS-l antigénov a ich fragmentov, ako v pôvodne vyskytujúcom sa tvare, tak v ich rekombinantnej podobe. Navyše môžu protilátky vzniknúť proti BAS-1 buď vo svojej aktívnej alebo v inaktívnej forme. Často sú pozorované protilátky antiidiotypové.

Protilátky, a jednoreťazcové BAS-1 vznikajú väzbové definovaným konjugátmi fragmenty fragmentom fragmentov ktoré obsahujú formy, proti vopred imunizáciou zvierat s imunogénnymi proteínmi. Monoklonálne protilátky sa pripravujú z buniek, ktoré vylučujú požadované protilátky. U týchto protilátok sa môže sledovať väzba na normálny a chybný BAS-1 alebo aktivita ligandu agonistov alebo antagonistov. Tiďto monoklonálne protilátky sú obvykle viazané s K_D aspoň viac ako 1 mM, bežnejšie aspoň viac ako 300 μΜ, typicky viac ako 30 μΜ, vhodnejšie viac ako 10 μΜ a najlepšie viac ako 3 μΜ, napríklad 1 μΜ, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM atď.

Tieto protilátky, ktoré obsahujú fragmenty viažúce antigén, môžu mať v diagnostike a terapeutike podstatný význam. Môžu byť silnými antagonistami, ktoré viažu BAS-1 a inhibujú väzbu ligandu alebo schopnosť ligandu vyvolať biologickú odpoveď. Tiež sa môžu používať ako protilátky bez neutralizačných účinkov a pripojiť sa na toxíny alebo rádionuklidy tak, že sa protilátka naviaže na antigén a samotná bunka sa zničí. Ďalej sa môžu tieto protilátky konjugovať s liekmi alebo inými terapeutickými činidlami a to buď priamo alebo nepriamo cez spojovník.

Protilátky v tomto vynáleze sa môžu použiť v diagnostike. Ako zachytené alebo protilátky bez neutralizačných účinkov sa môžu viazať na BAS-1 bez inhibičnej ligandovej väzby. Ako neutralizačné protilátky sa môžu použiť pri kompetitívnych väzbových stanoveniach. Tiež sa môžu využiť na detekciu alebo kvantifikáciu BAS-1 alebo jeho ligandov.

BAS-1 fragmenty sa môžu viazať na iné materiály, najmä polypeptidy a tak fúzovať alebo sa kovalentne spojiť s polypeptidmi a použiť sa ako imunogény. BAS-1 a jeho fragmenty sa môžu fúzovať alebo kovalentne spojiť na rad imunogénov, ako sú hemocyanín kužalnatky, hovädzí sérový albumín, tetanus toxoid atď. Viď. Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969, Landsteiner (1962) Specifity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, a Williams a kol. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry Vol. 1, Academic Press, New York, na opis spôsobov prípravy polyklonálneho antiséra. Typický spôsob sa týka hyperimunizácie zvierat antigénmi. Krv zvieraťa sa potom odoberie krátko potom, čo sa zopakuje imunizácia a gama-globulín sa vyizoluje. Alebo sa môžu na tvorbu hybridómov odobrať bunky/

V niektorých príkladoch sa požaduje príprava monoklonálnych protilátok z iných cicavčích hostiteľov, ako sú myši, krysy, opice, ľudia a pod. Opis spôsobu prípravy monoklonálnych protilátok bol nájdený napríklad v Stites a kol. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4. ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA a citácie tu uvedené, Harlow and Lane (1988)

Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practise (2. ed.) Academic Press, New York a čiastočne v Kohler and Milstein (1975) v Náture 256: 495-497, kde sa diskutuje jeden spôsob generovania monoklonálnych protilátok. Krátko zhrnuté, tieto spôsoby sa týkajú injektovania zvierat imunogénom. Zviera sa potom obetuje a bunky zo sleziny sa odoberú a spoja sa s myelocytmi. Výsledkom je hybridná bunka alebo hybridom schopný reprodukcie in vitro. Populácia hybridómov sa potom sleduje izoláciou jednotlivých klonov, z ktorých každý vylučuje k imunogénu jeden druh protilátky. Týmto spôsobom získané jednotlivé druhy protilátok sú produkty stále živých a klonovaných jednotlivých B buniek z imúnnych zvierat, ktoré vznikli ako odpoveď na špecifické miesto rozpoznané imunogénnou bunkou.

Iné vhodné techniky sa týkajú in vitro prejavu lymfocytov na antigénne polypeptidy alebo na selekciu protilátkovej knižnice vo fágu alebo podobných vektoroch. Viď. Huse a kol. (1989) Generation of Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246: 1275-1281 a Ward a kol. (1989) Náture 341: 544-546. Polypeptidy a protilátky v predkladanom vynáleze sa môžu použiť ako modifikované alebo nemodifikované, vrátane chimerických alebo humanizovaných protilátok. Polypeptidy a protilátky sú častejšie značené látkou, buď kovalentne alebo nekovalentne viazanou, ktorá vykazuje detegovatelný signál. Je známe široké spektrum značených látok a konjugačných techník a sú početne uvedené vo vedeckej aj Medzi vhodné značené látky patria substráty, kofaktory, inhibítor'y, chemiluminiscenčné skupiny, magnetické patentovej literatúre, rádionuklidy, enzýmy, fluorescenčné skupiny, častice atď. Použitie týchto značených látok obsahujú tieto U. S.

Patenty č.

277 437; 4 rekombinantné 4 816 567.

817 837; 3 850 752; 3 939 350;

275 145 a 4 366 241. Tiež sa môžu imunoglobulíny, viď. Cabilly U. S.

996 345; produkovať Patent č.

Protilátky tohto vynálezu sa môžu tiež použiť na izoláciu proteínov afinitnou chromatografiou. Kolóny sa môžu pripraviť vtedy, keď sú protilátky naviazané na tuhý povrch, napríklad na častice, ako je agaróza, SEPHADEX a pod. Potom ako bunkový lyzát prejde kolónou, kolóna sa premyje, nasleduje zvýšenie koncentrácií mierneho denaturujúceho činidla, čím sa uvolní purifikovaný BAS-1 proteín. Protilátky sa môžu použiť na sledovanie expresie knižníc pre konkrétne expresné produkty. Obvykle sú protilátky použité v takých prípadoch, kde sú značené skupinami, ktoré väzbou na protilátku lahko detegujú prítomnosť antigénu.

Protilátky získané proti BAS-1 antigénu sa tiež použijú na získanie antiidiotypových protilátok. Toto bude užitočné na detegovanie alebo stanovenie rôznych imunologických podmienok, ktoré súvisia s expresiou príslušných antigénov.

VI. Nukleové kyseliny

Sonda ľudského BAS-1 alebo jeho fragmenty budú identifikované alebo budú izolované nukleové kyseliny, ktoré kódujú homológne proteíny z iných druhov alebo iné podobné proteíny z rovnakých alebo iných druhov.

Tento vynález sleduje použitie izolovanej DNA alebo fragmentov, ktoré kódujú biologicky aktívny príslušný BAS-1 polypeptid. Okrem toho sa vynález zaoberá izolovanou alebo rekombinovanou DNA, ktorá kóduje biologicky aktívny proteín alebo polypeptid, ktorý je schopný za vhodných podmienok hybridizovať s DNA sekvenciou tu opísanou. Uvedený biologicky aktívny proteín alebo polypeptid môže mať celý BAS-1 alebo fragment a má aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleovou kyselinou uvedenou v SEKV. ID ČÍS.: 1. Ďalej sa v tomto vynáleze uvádza použitie izolovanej alebo rekombinovanej DNA kódujú proteín, ktorý je homológny alebo fragmentov, ktoré k BAS-1 alebo ktoré sa vyizolovali s použitín cDNA kódujúcej ľudský BAS-1 ako sondy.

Izolovaná DNA môže mať vlastnú regulátorovú sekvenciu na 5' a 3' koncoch, napríklad promótory, zosilňovače, polyadenylačné signály a ďalšie.

Izolovaná nukleová kyselina je nukleová kyselina, napríklad RNA, DNA alebo zmiešaný polymér, ktorý je úplne oddelený od iných zložiek, ktoré sa bezprostredne nachádzajú v pôvodnej sekvencií, napríklad ribozómy, polymerázy a lemovacie genómové sekvencie z pôvodných druhov. Vynález zahŕňa nukleovú kyselinu, ktorá je odobratá z prostredia, kde sa pôvodne vyskytovala a obsahuje rekombinantné alebo klonované DNA izoláty a chemicky syntetizované analógy alebo analógy biologicky syntetizované heterológnymi systémami. Značne čistá molekula obsahuje izolované formy molekuly.

Izolovaná nukleová kyselina bude vo všeobecnosti homogénna molekula, ale v niektorých prípadoch bude mať menšiu rôznorodosť. Heterogenita sa obvykle nachádza na polymérnych koncoch alebo častiach, ktoré sú náročné na požadovanú biologickú funkciu alebo aktivitu.

Rekombinantné nukleová kyselina je definovaná buď spôsobom jej produkcie alebo jej štruktúrou. V citácii pre spôsob produkcie, napríklad produkt sa získal spôsobom, spôsob je použitím techník rekombinantnéj nukleovej kyseliny, napríklad zahŕňa ludský zásah do nukleotidovej sekvencie. Alebo sa môže nukleová kyselina vytvoriť generovaním sekvencie, ktorá obsahuje dva spojené fragmenty, ktoré si pôvodne nie sú navzájom blízke, ale je zaznamenané, že nepripúšťa prírodné produkty, napríkl'ad prírodné sa vyskytujúce mutanty. Teda, napríklad produkty vzniknuté transformáciou buniek s akýmkoľvek neprírodne sa vyskytujúcim vektorom, ako sú nukleové kyseliny s obsahom sekvencie, ktorá vznikla s použitím niektorých syntetických oligonukleotidových spôsobov. To sa často uskutoční, aby sa premiestnil kodón s redundantným kodónom, ktorý kóduje rovnakú alebo konzervatívnu aminokyselinu, zatial čo charakteristicky zavedenie alebo premiestnenie, napríklad reštrikcia alebo sekvencia rozpoznávacieho miesta. Uskutoční sa teda spojenie segmentov nukleovej kyseliny s požadovanými funkciami, aby sa vytvorili jednoduché genetické entity, ktoré obsahujú požadovanú kombináciu funkcií, ktoré sa vo všeobecne dostupných prírodných formách nenašli. Reštrikčné enzýmy rozpoznávacích miest sú často cielom takých umelých manipulácií, s výnimkou iných miest špecifických cielov, napríklad promótory, DNA replikačné miesta, regulačné sekvencie, kontrolné sekvencie alebo iné použité znaky sa môžu zahrnúť do plánu.

Podobné poňatie je určené pre rekombinanty, napríklad fúzie, polypeptid. Konkrétne sú zahrnuté syntetické nukleové kyseliny, ktoré prebytočným genetickým vybavením kódujú podobné polypeptidy na fragmenty týchto antigénov a fúzie sekvencií radu rôznych druhov.

Fragment v súvislosti s nukleovou kyselinou je príbuzný segment s velkosťou aspoň 17 nukleotidov, obvykle aspoň 20 nukleotidov, častejšie aspoň okolo 23 nukleotidov, bežne aspoň 26 nukleotidov, bežnejšie aspoň 29 nukleotidov, často aspoň 32 nukleotidov, častejšie aspoň okolo 35 nukleotidov, charakteristicky aspoň 38 nukleotidov, charakteristickejšie aspoň 41 nukleotidov, obvykle aspoň 44 nukleotidov, obvyklejšie aspoň 47 nukleotidov, lepšie aspoň 50 nukleotidov, výhodnejšie aspoň 53 nukleotidov a predovšetkým vhodné je aspoň 56 a viac nukleotidov, napríklad 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 atď.

DNA, ktorá kóduje BAS-1 proteín sa bude používať najmä'na identifikáciu génov, mRNA a homológne antigény, rovnako proteíny z rôznych druhov.

cDNA, ktoré kódujú podobné alebo ako DNA, ktorá kóduje homológne Rôzne BAS-1 proteíny by mali mať podobné sekvencie a sú tu opísané. Avšak zhodné proteíny, ktoré majú evolučné rozdielny vzťah k BAS-1, sa môžu lahko izolovať použitím týchto sekvencií, pokial vykazujú dostatočnú podobnosť. Opičie BAS-1 proteíny majú konkrétny význam.

Tento vynález ďalej opisuje rekombinantné DNA molekuly a fragmenty s DNA sekvenciou zhodnou alebo vysoko homológnou s izolovanými DNA, ktoré sú tu uvedené. Najmä sekvencie budú často použiteľné spojené k DNA segmentom, ktoré sú zodpovedné za kontrolu transkripcie, translácie a. DNA replikácie. Alebo rekombinantné klony získané z genómových sekvencií, t.j. s obsahom intrónov, sa budú používať na transgénne štúdiá, ktoré zahŕňajú napríklad transgénne bunky a organizmy a na génovú terapiu. Viď. napríklad Goodnow (1992) Transgenic Animals v Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego, 1502-1504, Tráviš (1992) Science 256: 1392-1394, Kuhn a kol. (1991) Science 254: 707-710, Capecchi (1989) Science 244: 1288, Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford, a Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10: 180-199.

Homológne sekvencie nukleovej kyseliny, ktoré sa porovnávajú, vykazujú významnú sekvenčnú podobnosť. Štandardy pre homológiu v nukleových kyselinách sa merajú buď pre homológiu všeobecne používanú v odbore porovnávaním sekvencie alebo sú založené na hybridizačných podmienkach. Hybridizačné podmienky sú detailne opísané nižšie.

Porovnaním sekvencie nukleovej kyseliny sa zistila značná zhodnosť, čo znamená, že porovnávané segmenty alebo ich komplementárne reťazce sú identické vtedy, keď sú optimálne alebo deléciami všeobecnosti v obyčajnejšie aspoň 65 %, %, typicky aspoň 74 %, obvykle aspoň 80 %, obvyklejšie výhodnejšie aspoň 95 až 98 % alebo viac viac ako 99 % alebo viac nukleotidov. sa vyskytuje, pokiaľ segmenty budú za selektívnych hybridizačných podmienok hybridizovať s reťazcom alebo jeho komplementárnym úsekom, typicky používaná sekvencia je zarovnané vhodnými inzerciami v aspoň 50 % nukleotidov, vo nukleotidov, obyčajne aspoň 62 %, aspoň 68 %, častejšie aspoň 71 typickejšie aspoň 77 %, %, lepšie aspoň 90 %, a niektorých prípadoch

Alebo značná zhodnosť nukleotidov, aspoň 56 % čas'to oveľa aspoň vybraná zo SEKV. ID ČÍS.: 1. Typicky môže hybridizácia nastať, keď je aspoň 55 % homológia oblastí aspoň 14 nukleotidov, lepšie keď je homológia aspoň okolo 65 %, výhodnejšie aspoň okolo 75 % aspoň okolo 90 %. Viď. Kanehisa (1984) Nuc. 203-213. Dĺžka porovnávanej homológie, ako je opísaná, môže byť dlhšia oblasť a v niektorých prípadoch bude oblasť aspoň 17 nukleotidov, obvykle aspoň 20 nukleotidov, 24 nukleotidov, typicky aspoň 28 nukleotidov, aspoň 40 nukleotidov, výhodne aspoň okolo 50 nukleotidov a oveía výhodnejšie aspoň okolo 75 až 100 alebo viac nukleotidov, napríklad 125, 150, 200, 250, 300 atď.

a najvýhodnejšie Acids. Res. 12:

obvyklejšie aspoň oveía typickejšie

Prísne podmienky, v odkaze na identitu v súvislosti s hybridizáciou, budú prísne kombinované podmienky solí, teploty, organických rozpúšťadiel a iných parametrov typicky kontrolovaných pri hybridizačných reakciách. Prísne teplotné podmienky budú obvykle zahŕňať teploty cez 30 °C, obvykle cez 37 °C, typicky cez 45 C, oveľa typickejšie cez 55 °C, výhodne cez 65 “C a oveľa výhodnejšie cez 70 C. Prísny obsah solí bude obyčajne nižší ako 500 mM, obvykle nižší ako 350 mM, ovela obvyklejšie nižší ako 200 mM, typicky nižší ako 150 mM, vhodnejšie nižší ako 100 mM a oveľa výhodnejšie nižší ako 50 mM. Avšak kombinácia parametrov je oveľa dôležitejšia ako meranie jednotlivých parametrov. Viď. napríklad Wetmur and Davidsom (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370.

BAS-1 proteín z iných ľudských objektov sa môže naklonovat a izolovať hybridizáciou alebo PCR. Alternatívna príprava protilátkového prípravku, ktorý vykazuje nižšiu alelickú špecifitu sa môže použiť pri klonovaní expresie. Alelické varianty sa môžu charakterizovať použitím napríklad kombinácie redundantnej PCR a sekvenčnej analýzy, napríklad použitím definovaných primérov tak, že poskytujú informácie o alelických obmenách v ľudskej populácii.

VII. Príprava BAS-1, mimetiky

DNA, ktorá kóduje BAS-1 antigén alebo jeho fragmenty, sa môže získať chemickou syntézou, preskúmaním knižníc cDNA alebo preskúmaním génových knižníc pripravených zo širokého výberu bunkových línií alebo vzoriek tkaniva.

Táto DNA sa môže exprimovať v širokom výbere hostiteľských buniek na syntézu celého antigénu alebo jeho fragmentov, ktoré sa môžu ďalej napríklad použiť na generovanie polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok, na väzbové štúdie, na konštrukciu a expresiu modifikovaných molekúl a na štúdie, ktoré sa zaoberajú štruktúrou a funkciou. Každý antigén alebo jeho fragment sa môže exprimovať v hostiteľských bunkách, ktoré sú transformované alebo transfektované s vhodnými expresnými vektormi. Tieto molekuly sa môžu úplne purifikôvať, aby neobsahovali žiadne bielkoviny alebo celulárne kontaminanty, napríklad kontaminanty od rekombinantného hostiteľa, a tak sa po zlúčení s farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo rozpúšťadlami využijú najmä vo farmaceutických prostriedkoch. Antigén alebo jeho časti sa môžu exprimovať pri fúziách s inými proteínmi.

kontrolné expresie.

sekvencie, ktoré kódujú a sekvencie, ktoré zakončujú

Expresné vektory sú typicky DNA alebo RNA konštrukty, ktoré obsahujú požadovaný antigénový gén alebo jeho fragmenty, obvykle použiteľné spojené s vhodnými geneticky kontrolovanými prvkami, ktoré sa môžu vo vhodnej hostiteľskej bunke poznať. Tieto prvky sú vo vhodnom hostiteľovi schopné účinnej Špecifické typy kontrolných prvkov nutných na účinnú expresiu závisia na type použitej hostiteľskej bunky. Obyčajne môžu geneticky kontrolované prvky obsahovať prokaryotický promótorový systém alebo eukaryotický promótorový expresný kontrolný systém a typicky zahŕňajú transkripčný promótor, voliteľný operátor na kontrolu začiatku transkripcie, transkripčný zosilňovač na zvýšenie hladiny expresie mRNA, vhodné väzbové miesto ribozómu, transkripciu a transláciu. Expresné vektory tiež obvykle obsahujú začiatok replikácie, čo umožňuje, aby sa vektor replikoval nezávisle na hostiteľskej bunke.

Vektory v tomto vynáleze obsahujú DNA, ktorá kóduje ľudský BAS-1 antigén alebo jeho fragment, ktorý kóduje biologicky aktívny polypeptid. DNA môže byt pod kontrolou vírusového promótora a môže kódovať selekčný vzor. Tento vynález ďalej obsahuje použitie takých expresných vektorov, ktoré sú schopné expresie eukaryotickej cDNA, ktorá kóduje ľudský BAS-1 antigén v prokaryotickom alebo eukaryotickom hostiteľovi, kde je vektor kompatibilný s hostiteľom a kde je eukaryotická cDNA, ktorá kóduje antigén, vložená do vektora tak, že rast hostiteľa, ktorý obsahuje vektor exprimuje príslušnú cDNA. Obvykle sú expresné vektory navrhnuté na stabilnú replikáciu vo svojich hostiteľských bunkách alebo na amplifikáciu, aby došlo k zvýšeniu celkového počtu kópií požadovaného génu na bunku. Nie je vždy nutné požadovať, aby sa expresný vektor replikoval v hostiteľskej bunke, napríklad sa môže uskutočniť prechodná expresia antigénu alebo jeho fragmentov vo rôznych hostiteľoch pomocou vektorov, ktoré neobsahujú začiatok replikácie, ktorý hostiteľská bunka rozpozná. Môžu sa tiež použiť vektory, ktoré spôsobujú integráciu ľudského BAS-1 génu alebo jeho fragmentov do hostiteľskej DNA pomocou rekombinácie.

Vektory, ktoré sa tu používajú, zahŕňajú plazmidy, vírusy, bakteriofágy, integrovateľné DNA fragmenty a iné, ktoré umožňujú integráciu DNA fragmentov do genómu hostiteľa. Expresné vektory sú špecializované vektory, ktoré obsahujú prvky genetickej kontroly, ktoré spôsobia expresiu použiteľné spojených génov. Plazmidy sú najviac používanou formou vektorov, ale všetky iné formy vektorov, ktoré poskytujú ekvivalentné funkcie a ktoré sú alebo sa stávajú v odbore známe, sú vhodné na to, aby sa tu použili. Viď. napríklad Powels a kol. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y. a Rodriquez a kol. (1988) (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Ventors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

- 3Ô

Transformované bunky sú bunky, lepšie cicavčie, ktoré sa transformovali alebo transfektovali s ľudskými BAS-1 vektormi vytvorenými pomocou techník rekombinácie DNA. Transformované hostiteľské bunky obvykle exprimujú antigén alebo jeho fragmenty, ale s cieľom klonovania, amplifikácie a manipulácie DNA nemusia exprimovať proteín. Tento vynález ďalej obsahuje kultiváciu transformovaných buniek v živnom médiu, čo umožňuje akumuláciu proteínu v kultúre. Proteín sa môže získať buď z kultúry alebo z kultivačného média.

Kvôli tomuto vynálezu sú DNA sekvencie použiteľné spojené, pokiaľ sú funkčne navzájom podobné. Napríklad DNA je na presekvenciu alebo sekrečné váčiky použiteľné spojená s polypeptidom, ak je exprimovaný ako preproteín alebo sa podiela na zapojení polypeptidu na bunkovú membránu alebo v sekrécii polypeptidu. Promótor je použiteľné pripojený ku kódujúcej sekvencii, ak kontroluje transkripciu polypeptidu. Väzbové miesto ribozómu je použiteľné pripojené ku kódujúcej sekvencii, ak je umiestnený tak, aby mohla prebehnúť translácia. Obvykle použiteľné pripojený znamená susediaci, avšak v čítacom rámci nie sú určité genetické prvky, ako sú represorové gény, priľahlo spojené ale stálo viazané k operátorovým sekvenciám, ktoré zapínajú kontrolovanú expresiu.

Vhodnými hostiteľskými bunkami sú prokaryotá, nižšie a vyššie eukaryotá. Medzi prokaryotá sú zahrnuté obidve grampozitívne aj gramnegatívne organizmy, napríklad E. coli a B. subtilis. Nižšie eukaryotá sú kvasinky S. cerevisiae a Pichia a druhy rodu Dictyostelium. Vyššie eukaryotá zahŕňajú uvede'né tkanivové bunkové kultúry zo živočíšnych buniek, ako pôvodu necicavčieho, napríklad hmyzu, vtákov, tak cicavčieho, napríklad ludské, opičie a krýs.

Prokaryotické systémy hostiteľských vektorov obsahujú široké spektrum vektorov mnohých rôznych druhov. Ako je tu použité, E. coli a jej vektory budú vo všeobecnosti použité, aby obsahovali ekvivalentné vektory používané v iných prokaryotách. Reprezentatívnym vektorom na amplifikáciu DNA je pBR322 alebo vela jeho derivátov. Vektory, ktoré sa môžu použiť na expresiu ľudských BAS-1 antigénov alebo ich fragmentov, zahŕňajú, ale nie sú napríklad obmedzené na vektory, ktoré obsahujú lac promótor (pUC druhy), trp promótor (pBR322-trp), Ipp promótor (pIN druhy), lambda-pP alebo pR promótory (pOTS) alebo hybridné promótory, ako je ptac (pDR540). Viď. Brosius a kol. (1988) Expresion Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and IPP-derived Promoters v Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, kapitola 10, str. 205 až 236.

Nižšie eukaryotá, napríklad kvasinky a Dictyostelium, sa môžu transformovať s ľudským BAS-1 antigénom, ktorý obsahuje vektory. Cieľom tohto vynálezu je, aby najbežnejším hostiteľom nižších eukaryot bola kvasinka Saccharonyces cerevisae. Tá bude použitá a bude vo všeobecnosti predstavovať nižšie eukaryotá, aj keď je tiež k dispozícií rad iných kmeňov a druhov. Kvasinkové vektory sa prevažne skladajú z replikačného začiatku (podľa možností integratívneho typu), selekčného génu, promótora, DNA, ktorá kóduje požadovaný proteín alebo jeho fragment, a sekvencie na termináciu translácie, polyadenylácie a terminácie transkripcie. Vhodnými expresnými vektormi kvasiniek sú ako konštruktívne promótory, tak 3-fosfoglycerátkináza a rad iných promótorov glykolytických enzýmov alebo ako inducibilné promótory, tak promótor alkoholdehydrogenázy 2 alebo metalotionínový promótor. Vhodné promótory obsahujú deriváty nasledujúcich typov: samoreplikačný nízkokópiový (ako sú druhy YRp), samoreplikačný vysokokópiový (ako sú YEp), integratívne typy (ako sú Yip druhy) alebo minichromozómy (ako sú YCp druhy).

Vhodnými hostiteľskými bunkami na expresiu funkčne aktívneho ľudského BAS-1 antigénového proteínu sú tkanivové bunkové kultúry vyšších eukaryot. V podstate funguje veľa tkanivových bunkových kultúr vyšších eukaryot, napríklad expresné systémy hmyzieho baculovírusu, či sú zo stavovcov alebo bezstavovcov. Avšak v kotranslačných aj posttranslačných postupoch sa dáva prednosť bunkám cicavcov.

Transformácia alebo transfekcia a propagácia takých buniek sa stala rutinným spôsobom. Príkladom používaných bunkových línií sú HeLa bunky, Chinese harmster ovary (CHO) bunková línia, baby rat kidney (BRK) bunková línia, hmyzia bunková línia, vtáčia bunková línia a myšia bunková línia (COS). Expresné vektory pre také bunkové línie obvykle obsahujú začiatok replikácie, promótor, iniciačné miesto translácie, miesto zostrihu RNA (ak sa používa genómová DNA), polyadenylačné miesto a terminačné miesto transkripcie. Tieto vektory tiež obvykle obsahujú selekčný alebo amplifikačný gén. Vhodnými expresnými vektormi môžu byt plazmidy, vírusy alebo retrovírusy, ktoré nesú promótory získané, napríklad z takých zdrojov, ako sú adenovírusy, SV40, parvovírusy, vírus vakcíny alebo cytomegalovírus. Reprezentatívnym príkladom vhodných expresných vektorov sú pCDNAl, pCD viď. Okayama a kol. (1985) Mol. Celí Biol. 5: 1136-1142, pMClneo Poly-A viď Thomas a kol. (1987) Celí 51: 503-512 a vektor baculovírusu, ako je pAC 373 alebo pAC 610.

Často sa požaduje, aby sa polypeptid ludského BAS-1 antigénu exprimoval v systéme, ktorý dáva špecifický alebo definovaný glykozylačný vzor. V takom prípade bude obvyklý vzor prirodzene vybavený expresným systémom. Avšak vzor bude modifikovatelný tak, že na polypeptid, napríklad neglykozylovanú formu, pôsobia vhodné glykozylačné proteíny uvedené v heterológnom expresnom systéme. Napríklad gény antigénu BAS-1 môžu byť kontransformované jedným alebo viacerými génmi, ktoré kódujú cicavčie alebo iné glykozylačné enzýmy. Použitím tohto prístupu budú určité cicavčie glykozylačné vzory dosiahnuteľné alebo priblížené v prokaryotických alebo iných bunkách.

BAS-1 antigén by sa mohol tiež produkovať vo forme, ktorou je viazaný fosfatidylinozitol (PI), ale môže sa odstrániť z membrán použitím enzýmu štiepiaceho fosfatidylinozitol, napríklad fosfatidylinozitol fosfolipáza-C. Tak sa uvolní antigén v biologicky aktívnej forme a umožní purifikáciu štandardnými biochemickými spôsobmi. Viď. napríklad Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988: 427-454, Tse a kol. (1985) Science 230:

1003-1008 a Bruner a kol. Alebo sa môžu zostrojiť napríklad na N-konci alebo alebo detekcii proteínového takých segmentov sa tiež štiepiacou miesta.

(1991) J. Celí Biol. 114: 1275-1283. purifikované segmenty v sekvencií, C-konci, aby pomáhali pri purifikácii produktu. To znamená, že odstránenie môže zostrojiť., napríklad proteázou

Teraz je známa táto celá sekvencia a tak sa ľudské BAS-1 antigény, fragmenty alebo ich deriváty môžu pripraviť konvenčnými postupmi pre syntézu peptidov. Zahŕňajú tiež postupy, ako sú opísané v Stewart and Young (1984) Solid Phase peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York a Bodanszky (1984) The Principles of peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York. Napríklad sa môžu použiť azidový spôsob, chlorovodíkový spôsob, spôsob anhydridu kyseliny, spôsob miešaného anhydridu, spôsob aktívneho esteru (napríklad p-nitrofenylester, N-hydroxysukcínimidester alebo kyanometylester), karboxyimidazolový spôsob, oxidačno-redukčný spôsob alebo spôsob dicyklohexylkarbodiimid (DCCD)/aditívny. Tuhá fáza a roztok syntéz sú tiež pre skôr uvedené spôsoby aplikovateľné.

Ľudské BAS-1 antigény, fragmenty alebo deriváty sa vhodne pripravia v súlade s vyššie uvedenými spôsobmi, ktoré sa typicky používajú v syntéze peptidov, vo všeobecnosti ktorýmkoľvek tzv. postupným spôsobom, ktorý zahŕňa kondenzáciu aminokyselín na koncovej aminokyseline v sekvencií alebo párovaním peptidových fragmentov na koncovej aminokyseline. Aminoskupiny, ktoré sa nepoužívajú na párovanie, sa musia chrániť, aby nedošlo k párovaniu v nesprávnej oblasti.

Ak sa zvolí syntéza v tuhej fáze, C-koniec aminokyseliny sa naviaže na nerozpustný nosič alebo podklad svojou karboxylovou skupinou. Nerozpustný nosič nie je zvlášt limitovaný pokial má väzbovú kapacitu k reaktívnej karboxylovej skupine. Príkladom takých nerozpustných nosičov sú halogénmetylové živice, ako je chlórmetylová živica alebo brómmetylová živica, hydroxymetylové živice, fenolové živice, terc.-alkylkarbonylhydrazidované živice a pod.

Chránená aminoskupina aminokyseliny je viazaná v sekvencií kondenzáciou svojej aktivovanej karboxylovej skupiny a reaktívnej aminokyseliny skôr vzniknutého peptidu alebo reťazca, aby sa postupne syntetizoval peptid. Po syntéze kompletnej sekvencie sa peptid odtrhne od nerozpustného nosiča a vznikne samotný peptid. Získanie tuhej fázy vo všeobecnosti opisuje Merrifield a kol. (1963) v J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156.

Pripravovaný antigén a jeho fragmenty sa môžu izolovať a purifikovat z reakčnej zmesi separáciou peptidov, napríklad extrakciou, precipitáciou, elektroforézou a radom rôznych chromatografii a pod. Ľudské BAS-1 antigény v tomto vynáleze sa čistoty v závislosti na môže dosiahnuť tu objavenými alebo použitím tu opísaných môžu získať v rôznych stupňoch požadovanom použití. Purifikácia sa technikami proteínovej purifikácie protilátok v aminoabsorpčnej afinitnej chromatografii. Táto aminoabsorpčná afinitná chromatografia sa uskutoční najskôr väzbou protilátky na tuhý podklad a potom spojením naviazanej protilátky s rozpustnými lyzátmi malej bunky pľúcnych rakovinových buniek, lyzátmi iných buniek, ktoré exprimujú BA^-1 antigény alebo lyzátmi alebo supernatantmi buniek, ktoré produkujú BAS-1 antigény ako výsledok DNA techník, viď. nižšie.

VIII. Použitie

Predkladaný vynález poskytuje látky, ktoré nájdu použitie v diagnostike, ako je tu niekde opísané, napríklad všeobecný opis vývojových a fyziologických abnormalít alebo v nižšie uvedenom opise súprav na diagnostiku.

Tento vynález tiež poskytuje látky s dôležitým terapeutickým významom. Ľudský BAS-1 (prírodné sa vyskytujúci rekombinant), jeho fragmenty a protilátky spolu s identifikovanými látkami, ktoré majú väzbovú aktivitu k ludskému BAS-1, by sa mohli použiť na liečenie stavu spojeného s abnormálnou B bunkovou odpoveďou, ktorá zahŕňa abnormálnu proliferáciu, napríklad rakovinové stavy alebo degeneratívne stavy. Abnormálna proliferácia, regenerácia, degenerácia a atrofia sa môžu modulovať vhodnou terapeutickou liečbou s použitím zložiek, ktoré sú tu poskytnuté. Napríklad choroba alebo ťažkosti spojené s abnormálnou expresiou alebo abnormálnym pôsobením BAS-1 by mohli byť pravdepodobne cielom agonistov alebo antagonistov antigénu. BAS-1 pravdepodobne hrá úlohu v aktivácii alebo regulácii B buniek, ktoré ovplyvňujú imunologické odpovede, napríklad autoimúnne ťažkosti alebo alergické odpovede.

Okrem iného, interakcia BAS-1:BAS-1 väzbový partner môže byt zahrnutá v T:B bunkovej interakcii, ktorá pripúšťa aktiváciu, proliferáciu a/alebo diferenciáciu jednoduchých B buniek, ako bolo pozorované v hyper-IgM syndróme. Teda liečenie môže spôsobovať druh interferencie s BAS-1:BAS-1 signálnou transdukciou. Blokovanie signálu môže byť spôsobené, napríklad rozpustným BAS-1 alebo protilátkou k BAS-1.

Interakcia BAS-1:BAS-1 väzbového partnera sa môže tiež vyžadovať v iniciácii a/alebo regulácii silnej proliferác'ie B bunkových blastov a centroblastov v tmavej oblasti zádoročných centier. Viď. napríklad Banchereau and Rosset (1992) Adv. Immunol. 125: 868-877. Interakcie bunkového povrchu zahrnuté v signáli, aby iniciovali a/alebo regulovali somatický mutačný proces Ig, môžu tiež vyžadovať BAS-1 a môžu sa regulovať agonistickými alebo antagonistickými zákrokmi.

Iné abnormálne vývojové stavy sú známe v každom bunkovom type, analýzou Nothernovho prenosu dokazujú, že majú BAS-l mRNA. Viď. Berkow (ed.) The Merck Manual Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway N. J. a Thorn a kol. Harrison's Principles of Internal Medicíne, McGraw-Hill, N. Y. Napríklad terapeutická imunosupresia sa môže dosiahnuť blokáciou T lymfocytu a interakciou B lymfocytu s touto molekulou. Predstavuje dôležitú terapiu na kontrolu autoimúnnych ochorení a odmietnutia štepu počas transplantácie. Alebo anti-B bunková tumorová terapia sa môže dosiahnuť blokáciou rastu a zostávajúcich vplyvov BAS-l na B bunky. Blokácia sa môže ovplyvniť zložením blokujúcich väzieb, napríklad neutralizačnými protilátkami alebo molekulami, ktoré interferujú s interakciou BAS-l s protireceptorom. Rozpustný BAS-l môže blokovať protireceptorovú väzbu.

Rekombinantný purifikovať a potom terapeutické účely

BAS-l alebo BAS-l protilátky sa môžu zaviesť do pacienta. Tieto látky sa môžu na kombinovať s ďalšími aktívnymi zložkami, napríklad konvenčnými farmaceutický prijatelnými nosičmi alebo rozpúšťadlami, napríklad imunogénne adjuvans spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a mastovými základmi. Tieto kombinácie sa môžu sterilizovať filtráciou a nadávkovať do dávkovacích flaštičiek lyofilizáciou alebo uskladniť vo forme stabilizovaného vodného roztoku. Tento vynález tiež opisuje použitie protilátok alebo ich väzbových fragmentov, ktoré nie sú doplnené väzbou.

Preskúmanie lieku, ktorý používa BAS-l alebo jeho fragmenty, sa môže uskutočniť tak, aby sa identifikovali zlúčeniny s väzbovou afinitou k BAS-l vrátane izolácie spojených zložiek. Potom sa môžu využiť ďalšie biologické stanovenia na určenie, či má látka skutočnú stimulačnú aktivitu a teda spôsobuje blokáciu a/alebo je antagonista, teda blokuje aktivitu ligandu. Rovnako tak môže látka s vlastnou stimulačnou aktivitou aktivovať antigén a je teda agonista tým, že simuluje aktivitu BAS-l. Tento vynález ďalej opisuje terapeutické využitie protilátok proti BAS-l ako antagonistom. Toto zistenie by sa mohlo predovšetkým použiť s ďalšími druhmi BAS-1.

Množstvo látok nevyhnutných na účinnú terapiu bude závisieť na mnohých rôznych faktoroch, ako sú riadenie, cielové miesto, fyziologický stav pacienta a ďalšie podávané lieky. Liečebné dávky by sa a efektívnosť, užitočnú radu optimálnu bezpečnosť vitro môžu poskytovať in situ podanie týchto zvierat pri liečení teda mali titrovať na Typické dávky použité in o množstve použitom na látok. Testovanie efektívnej dávky u konkrétnych ťažkostí poskytuje ďalšie predbežné indikácie ludskej dávky. Rad prípadov opisujú napríklad Gilman a kol. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of

Therapeutics, 8. ed., Pergamon Press a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Spôsoby podávania sú tu aj nižšie diskutované, napríklad na orálne, intravenózne, intraperitoneálne alebo vnútrosvalové, transdermálne difúzie a ďalšie. Farmaceutický vhodnými nosičmi sú voda, solné roztoky, pufre a ďalšie, ktoré uvádza napríklad Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Rozpätie dávok sa bežne predpokladá, že je v množstve koncentrácie menšej ako 1 mM, typicky menšej ako 10 μΜ, obvykle menšej ako 100 nM, lepšie nižšej ako 10 pM (pikomolárne) a najlepšie menšie ako 1 fm (femtomolárne) vo vhodnom nosiči. Pomaly sa uvoľňujúce látky alebo zariadenie na pomalé uvoľňovanie látok sa často používajú na nepretržité podávanie.

Ľudský BAS-1, jeho fragmenty a protilátky proti nemu alebo jeho fragmentom, antagonisty a agonisty sa môžu zaviesť priamo do hostiteľa, aby ho liečili alebo v závislosti na veľkosti zlúčenín sa požaduje, aby konjugovali na nosičových proteínoch, ako sú ovalbumín, sérový albumín, ešte pred ich podávaním. Terapeutické látky sa môžu podávať v mnohých konvenčných dávkach. Zatiaľ čo sa môže aktívna zložka zavádzať samotná, je vhodnejšie podávať ju ako farmaceutickú látku. Látky skôr obsahujú aspoň jednu aktívnu zložku, ako je definované vyššie, spolu s jedným alebo viacerými prijateľnými nosičmi. Každý nosič by mal byť ako farmaceutický,

- 38 tak fyziologicky prijateľný z hľadiska kompatibility s inými zložkami a nemal by byť pre pacienta škodlivý. Látky sa podávajú miestne, orálne, rektálne, nasálne alebo parenterálne (toto zahŕňa subkutánne, vnútrosvalovo, intravenózne a intradermálne). Látky sa môžu vhodne podávať v jednotkovej dávkovej forme a môžu sa pripraviť spôsobmi v odbore farmácie dobre známymi. Viď. napríklad Gilman a kol. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. ed., Pergamon Press a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Terapia v tomto vynáleze sa môže kombinovať alebo používať v spojení s inými chemoterapeutickými alebo chemopreventívnymi činidlami.

Obidve formy BAS-1 antigénu, pôvodne sa vyskytujúci a rekombinantný tvar, sa v tomto vynáleze používajú najmä v súpravách a pri spôsoboch stanovenia, ktoré sú schopné preskúmavat väzbovú aktivitu zlúčenín na proteíny. V posledných rokoch sa vyvinuli niektoré spôsoby automatických stanovení, ktoré umožňujú počas krátkeho času preskúmavat desaťtisíce látok. Viď. napríklad Fodor a kol. (1991) Science 251: 767-773, kde je opísané testovanie väzbovej afinity množstvom definovaných polymérov syntetizovaných na tuhom substráte. Vývoj vhodných stanovení sa môže značne ulahčit dostupnosťou velkého množstva purifikovaného, rozpustného BAS-1, ako poskytuje tento vynález.

Napríklad, antagonisty sa môžu obvykle zistiť, akonáhle je BAS-1 štruktúrne definovaný. Testovať potencionálne ligandové antagonisty je teraz možné vďaka rozvoju vysoko automatizovaných spôsobov stanovenia, ktoré používajú purifikovaný BAS-1. Použitím tu opísaných techník preskúmavania je najmä možné objaviť nové agonisty a antagonisty. Predovšetkým dôležité sú tie zistené látky, ktoré majú kombinovanú väzbovú aktivitu k početným BAS-1 proteínom, napríklad zlúčeniny, ktoré môžu slúžiť ako antagonisty pre alelické varianty BAS-1.

Okrem toho, keďže signalizovanie BAS-1:BAS-1 väzbový partner môže fungovať v kombinácii s inými signálmi, napríklad CD28/CTLA-4:B7/B70 a/alebo dráhou CD40:CD40 ligand, kombinácia zložiek alebo kombinácia terapie s takými dráhami sa môže tiež brať do úvahy. Teda sa môže použiť antagonizmus početných signálových dráh alebo stimulácia s mnohými dráhami.

Tento vynález je predovšetkým zameraný na preskúmanie zlúčenín pomocou rekombinantných antigénov akýmkoľvek druhom techniky preskúmania liekov. Výhody používania rekombinantných proteínov v preskúmavaní špecifických ligandov sú:

a) zlepšenie obnovitelného zdroja BAS-1 zo špecifického zdroja,

b) teoreticky väčší počet molekúl antigénu na bunku s lepším pomerom signálu k šumu v stanovení a

c) druh variantovej špecificity (teoreticky s väčšou biologickou špecificitou a špecificitou choroby).

Jedna zo spôsobov preskúmavania liekov využíva eukaryotické a prokaryotické bunky hostitela, ktoré sú stabilne transformované rekombinantnými molekulami DNA, ktoré exprimujú BAS-1. Bunky sa môžu izolovať, pričom sa počas izolácie z iných exprimuje BAS-1. Také bunky sa môžu, buď živé alebo vo fixovanej forme, použiť na štandardné antigén/ligand väzbové stanovenie. Viď. tiež Parce a kol. (1989) Science 246: 243-247 a Owicki a kol. (1990) Proc. Naťl Acad. Sci. USA 87: 4007-4011, kde sa opisujú citlivé spôsoby detekcie bunkových odpovedí. Kompetitívne stanovenia sa používajú najmä, keď sú bunky (zdroj BAS-1) naviazďné a inkubované so značeným ligandom so známou väzbovou afinitou k antigénu, ako je ligand _a testovaná zlúčenina, ktorej väzbová afinita k BAS-1 je zmeraná. Naviazaný a volný ligand sa potom oddelia, aby sa určil stupeň väzby ligandu. Množstvo viazanej testovanej zlúčeniny je nepriamo úmerné množstvu meranej značenej ligandovej väzby. Akákolvek z mnohých techník sa môže použiť na oddelenie väzby z volného ligandu, aby sa určil stupeň ligandovej väzby. Tento separačný krok by mohol vyžadovať postup, ako je adhézia na filter, následné premytie alebo bunky by sa mohli tiež funkcie BAS-1, napríklad následne premytie, adhézia na plast, centrifugácia bunkových membrán. Živé použiť na skúmanie vplyvov liekov na druhá mediátorová hladina, t.j. Ca²⁺, bunková proliferácia, zmeny inozitolfosfátových zásob a ďalšie. Niektoré spôsoby detekcie umožňujú elimináciu separačného kroku, napríklad blízkosť senzitívneho detekčného systému. Farbivo citlivé na vápnik sa môže použiť na detekciu hladiny Ca²⁺ s využitím fluorimetra alebo prístrojom, ktorý rozdeluje bunky podlá fluorescencie.

Iné spôsoby využívajú membrány transformovaných eukaryotických alebo prokaryotických buniek hostitela ako zdroja ludského BAS-1. Tieto bunky sú stabilne transformované s DNA vektormi, ktoré riadia expresiu ludského BAS-1 antigénu. V podstate by sa membrány pripravili z iných buniek a použili sa v akýchkoľvek receptor/ligand väzbových stanoveniach, ako je kompetitívne stanovenie uvedené vyššie.

Ešte ďalším prístupom je nepurifikovaného alebo rozpustného, z transformovaných eukaryotických a hostitela. Toto umožňuje stanovenie použitie rozpustného, purifikovaného BAS-1 prokaryotických buniek molekulárnej väzby s výhodami zvýšenia špecificity, schopnosti automatizovať a vysokého výkonu testovaného lieku.

Iná technika skúmania lieku zahŕňa prístup, ktorý zabezpečuje vysoký výkon preskúmavania zlúčenín s vhodrfou väzbovou afinitou k BAS-1 a podrobne ju opisuje Geysen, European Patent Application 84/03564, publikovaná 13. septembra 1984. Najskôr sa na tuhom substráte, napríklad umelohmotné špendlíky alebo niektoré iné vhodné povrchy, viď. Fodor a kol (1991), syntetizuje veľké množstvo rôznych malých peptidových testovaných zlúčenín. Potom všetky špendlíky reagujú s rozpustným, nepurifikovaným alebo rozpustným, purifikovaným BAS-1 a premyjú sa. Ďalším krokom je detekcia viazaného BAS-1.

Racionálna forma lieku môže byt tiež založená na štrukturálnych štúdiách molekulárneho tvaru BAS-1 a iných efektorov alebo ligandov. Efektory môžu byt iné proteíny, ktoré sprostredkujú iné funkcie v odpovedi na ligandovú väzbu alebo iné proteíny, ktoré obvykle interagujú s antigénom. Jedným zo spôsobov, ako určiť miesto interakcie so špecifickými ďalšími proteínmi, je určenie fyzikálnej štruktúry, napríklad štruktúrnej kryštalografie alebo technika dvojrozmernej NMR. Tieto poskytnú informácie o tom, na ktorých aminokyselinových zvyškoch sa tvoria molekulárne spojenia. Podrobnejší opis určenia štruktúry proteínu

je napríklad v Blundell	and	Johnson	(1976)	Protein
Crystallography, Academic Press,	New	York.
Purifikovaný BAS-1 sa môže	na	použitie	vo vyššie	uvedenej
technike skúmania liečiv naliať	priamo	na misky.	Avšak

protilátky, ktoré nie sú neutralizačné proti týmto antigénom, sa môžu použiť ako nosiče protilátok pri imobilizácii príslušného BAS-1 na tuhú fázu.

IX. Súpravy

Tento vynález tiež zahŕňa použitie BAS-1 proteínov, jeho fragmentov a ich fúznych produktov v rade diagnostických súprav a spôsoby na detekciu prítomnosti BAS-1 alebo ligandu. Bežne má súprava časť, ktorá obsahuje buď definovaný BAS-1 peptid alebo génový segment alebo látku, ktorá rozpozná jeden alebo druhý.

Z

Súprava na detekciu väzbovej afinity testovanej zlúčeniny k BAS-1 bežne obsahuje testovanú látku, značenú látku, napríklad ligand alebo protilátku so známou väzbovou afinitou k BAS-1, zdroj BAS-1 (prírodné sa vyskytujúci alebo rekombinantný) a prostriedok na oddelenie väzby z volne značenej látky, ako je tuhá fáza pre imobilizovaný BAS-1. Akonáhle sú zlúčeniny preskúmané, tak tie látky, ktoré majú väzbovú afinitu k BAS-1 sa môžu vyhodnotiť vhodnými v odbore dobre známymi biologickými rozbormi, aby sa určilo, či ide o agonisty alebo antagonisty. Použiteľnosť rekombinantných BAS-1 polypeptidov tiež zabezpečuje dobre definované štandardy na kalibráciu takých stanovení.

Vhodnejšia súprava na určenie koncentrácie, napríklad BAS-1 vo vzorke, by mala bežne obsahovať značenú látku, napríklad ligand alebo protilátku, s dobre známou väzbovou afinitou k BAS-1, zdroj BAS-1 (prírodné sa vyskytujúci alebo rekombinantný) a prostriedok na oddelenie väzby z voľne značenej látky, napríklad tuhá fáza pre imobilizovaný BAS-1. Časť, ktorá obsahuje činidlá a inštrukcie sa obvykle poskytne.

Spôsob na určenie koncentrácie BAS-1 vo vzorke by mal typicky zahŕňať tieto kroky:

1) prípravu membrán zo vzorky s obsahom zdroja BAS-1,

2) premytie membrány a suspendovanie v pufri,

3) rozpustenie BAS-1 inkubáciou membrány v kultivačnom médiu, do ktorého je pridaný vhodný detergent,

4) upravenie koncentrácie detergentu rozpusteného BAS-1,

5) spojenie a inkubáciu uvedeného roztoku s rádioznačeným ligandom do komplexov,

6) opätovne získanie komplexov filtráciou cez polyetylénimíňom upravený filter a

7) meranie rádioaktivity opätovne získaných komplexov.

Prolilátky vrátane špecifické pre ľudský v diagnostike používajú, fragmentov, ktoré viažu antigén, BAS-1 alebo BAS-1 fragmenty sa napríklad na detekciu prítomnosti zvýšenej hladiny BAS-1 a/alebo jeho fragmentov. V takých diagnostických stanoveniach sa môžu používať lyzáty, živé bunky, fixované bunky, imunofluorescencia, bunkové kultúry, telesné tekutiny a ďalšie, ktoré môžu detegovať antigény príbuzné k BAS-1 v sére alebo podobne. Diagnostické rozbory môžu byť homogénne (bez separačného kroku medzi volnou látkou a komplexom antigén-ligand) alebo heterogénne (vrátane separačnho kroku). Existuje vela komerčných stanovení, ako sú rádioimunoanalýza (RIA), enzýmovo spriahnuté imunochemické stanovenia (ELISA), enzýmová analýza (EIA), mnohonásobne enzýmová imunoanalyzačná technika (EMIT), substrátovo značená fluorescenčná imunoanalýza (SLFIA) a podobne. Napríklad neznačené protilátky sa môžu použiť s druhou protilátkou, ktorá je značená a ktorá rozpozná protilátku proti BAS-1 alebo proti jeho konkrétnemu fragmentu. Tieto stanovenia boli v literatúre značne diskutované. Viď. napríklad Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.

Antiidiotypové protilátky sa môžu podobne používať na stanovenie prítomnosti protilátok proti ludskému BAS-1, ako také môžu byť diagnostické pre rôzne abnormálne stavy. Napríklad nadprodukcia BAS-1 môže byť výsledkom produkcie rôznych imunologických reakcií, ktoré môžu byť diagnostické pre abnormálne fyziologické stavy, najmä v rozrastaní bunkových foriem ako je rakovina alebo abnormálna diferenciácia.

Často sa činidlá na diagnostické stanovenia dodávajú v súpravách tak, aby sa optimalizovala citlivosť stanovenia. Predmet vynálezu, ktorý závisí na podstate rozboru, protokole a značenej látke, buď značenej alebo neznačenej protilátky BAS-1 je zabezpečený. Obvykle je v spojení s ďalšími prísadami, ako sú pufre, stabilizátory, materiály nevyhnutné na signálnu produkciu, ako sú enzýmové substráty a pod. Je vhodné, keď bude súprava obsahovať inštrukcie pre správne použitie a odstraňovanie obsahu po použití. Súprava má bežné časti pre každé použité činidlo. Činidlá sa vhodne dodávajú vo forme suchého lyofilizovaného prášku, čím sa môžu rozpustiť vo vodnom médiu, ktoré zabezpečuje vhodné koncentrácie činidiel pre funkčné stanovenie.

Niektoré z vyššie uvedených základných zložiek skúmania liekov a diagnostických rozborov sa môžu použiť bez modifikácií alebo sa môžu rôznymi spôsobmi modifikovať. Napríklad značenie sa môže dosiahnuť väzbou kovalentnéj alebo nekovalentnej skupiny, ktorá poskytuje priamo alebo nepriamo detegovateľný signál. V niektorých týchto stanoveniach môžu byť ligand, testovaná látka, BAS-1 alebo protilátky značené buď priamo alebo nepriamo. Možnosti priameho značenia zahŕňajú značené skupiny: látka značená rádioaktívne, ako je I, enzýmy (U. S. Patent č. 3 645 090), ako sú peroxidáza a alkalická fosfatáza a látky značené fluorescenčné (U. S. Patent č. 3 940 475) schopné zaznamenávať zmenu vo fluorescenčnej intenzite, posun vlnovej dĺžky alebo fluorescenčná polarizácia. Obidva patenty sú tu uvedené v citáciách. Možnosti nepriameho značenia zahŕňajú biotinyláciu jednej zložky, následnú väzbu na avidinový pár na jednu zo značených skupín.

Je tiež rad spôsobov, ktoré oddeíujú väzbu z voíného ligandu alebo inak väzbu z voíne testovanej látky. BAS-1 sa môže imobilizovať na rôzne matrice a následne premyť. Vhodnými matricami môže byť plast, ako je ELISA doštička, filtre alebo guíôčky. Spôsob imobilizácie BAS-1 na matrici bez obmedzenia zahŕňa priamu adhéziu na plast, použitie zachytenej protilátky, chemické spriahnutie a biotín-avidín. Posledný krok v poslednom prípade vyžaduje precipitáciu antigén-ligandového komplexu ktorýmkoívek spôsobom vrátane tohto využitia, napríklad organičké rozpúšťadlo, ako je polyetylénglykol alebo soí, ako je síran amónny. Iná vhodná separačná technika bez obmedzenia zahŕňa spôsob fluorescenčnej protilátky, ktorý priťahuje častice a je opísaný v Rattle a kol. (1984) Cli. Chem. 30: 1457-1461 a dvojnásobná separácia protilátky magnetickou časticou, ako je opísané v U. S. Patente č. 4 659 678.

Spôsob väzby proteínov alebo ich fragmentov na rôzne značené látky bol v literatúre značne opísaný. Vela techník sa týka použitia aktivovaných karboxylových skupín buď použitím karbodiimidu alebo aktívneho esteru za vzniku peptidových väzieb, tvorby tioéterov reakciou merkaptovej skupiny s aktivovaným halogénom, ako je chlóracetyl alebo s aktivovaným olefínom, ako je maleimid chemickou väzbou alebo podobne. Fúzia proteínov nachádza v tejto prihláške tiež uplatnenie.

v opise a diskutovaná oligonukleótidová sonda

Iný diagnostický aspekt tohto vynálezu zahŕňa použitie polynukleotidových alebo oligonukleotidových sekvencií z BAS-1 sekvencie. Tieto sekvencie sa môžu použiť ako sondy na detekčnú hladinu antigénu vo vzorkách pacientov, u ktorých je podozrenie na abnormálny stav, napríklad rakovina alebo vývojový problém. Príprava obidvoch RNA a DNA nukleotidových sekvencií, značenie sekvencií a preferovaná veľkosť sekvencií je bohato obsiahnutá v literatúre. Obvykle by mala mať aspoň 14 nukleotidov, bežne aspoň 18 nukleotidov a polynukleotidové sondy môžu mať najviac niekolko kilobáz. Môže sa použiť rad značených látok, najbežnejšie sú to rádionukleotidy, najma P. Ine techniky sa však môžu tiež použiť, ako sú biotínom modifikované nukleotidy na zavedenie do polynukleotidu. Biotín sa potom podáva ako miesto pre väzbu avidínu alebo protilátok, ktoré sa môžu značiť rôznymi druhmi značených látok, ako sú rádionukleotidy, fluorescenčné značené látky, enzýmy a podobne. Alebo sa môžu použiť protilátky, ktoré rozpoznávajú špecifické dvojskrutkovice vrátane DNA dvojskrutkovice, RNA dvojskrutkovice, hybridnej DNA-RNA dvojskrutkovice alebo DNA-proteínovej dvojskrutkovice. Protilátky môžu byt značené za sebou a stanovenie sa uskutoční vtedy, keď je skrutkovica naviazaná na povrch tak, že po vytvorení dvojskrutkovice na povrchu sa môže detegovať prítomnosť protilátky naviazanej na dvojskrutkovici. Použitie sondy k novej antimediátorovej RNA sa môže uskutočniť akoukoľvek konvenčnou technikou, ako je hybridizácia nukleových kyselín, s a bez preskúmavania, rekombinácia, translácia, ktorá uvoľňuje hybrid (HRT) a translácia, ktorá zadržiava hybrid (HART). Tiež sa môžu zahrnúť techniky amplifikácie, ako je polymerázová retazcová reakcia (PCR).

Sú tiež opísané diagnostické súpravy, ktoré tiež testujú kvantitu a kvalitu ďalších vzoriek. Diagnóza alebo prognóza sú závislé na kombinácii niekoľkonásobných indikácií používaných ako vzory. Teda súpravy môžu testovať kombinácie vzorov. Viď. napríklad Viallet a kol. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97.

X. Ligand alebo protireceptor

BAS-1 s dostatočne poskytujú ďalšie

Opis BAS-1 proteínu tu poskytuje prostriedky na identifikáciu protireceptoru alebo ligandu. Taký ligand alebo protireceptor by sa špecificky viazal na vysokou afinitou. Rad konštruktov, ktoré značenie BAS-1, aby sa detegoval jeho partner, sa pripraví tak, aby boli dostupné. Napríklad priame značenie BAS-1, fúzia na znaky na sekundárne značenie, napríklad FLAG alebo iné epitopové nádory, fúzie Ig domény atď., poskytujú detekciu väzbových partnerov. Môže ísť o hystologické, ako afinitný spôsob biochemickej purifikácie, tak značenie alebo selekcia v expresnom klonovaní. Dvojhybridný selekčný systém, ktorý vytvára vhodné konštrukty s dostupnými BAS-1 sekvenciami, sa tiež môže aplikovať. Viď. Fields and Song (1989) Náture 340: 245-246.

Široké poňatie tohto vynálezu sa najlepšie pochopí, ak ide o nasledujúce príklady, ktoré nie sú myslené tak, aby limitovali vynález na špecifické prípady.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Všeobecné spôsoby

Niektoré štandardné spôsoby sú opísané alebo uvedené napríklad v Maniatis a kol. (1982) Molecular Cloning,

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning,

A Laboratory Manual (2.ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY, Ausubel a kol., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY alebo Ausubel a kol. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Spôsoby proteínovej purifikácie zahŕňajú také spôsoby, ako je zrážanie síranom amónnym, kolónová chromatografia, elektroforézy, centrifugácia, kryštalizácia a ďalšie. Viď. napríklad Ausubel a kol. (1987 and periodic Supplements), Deutscher (1990) Guide to Protein Purification v Methods in Enzymology, vol 182 a ďalšie zväzky v tejto sérii a literatúra na použitie proteínových purifikovaných produktov, napríklad Pharmacia, Piscataway N. J. Alebo Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinácia s inými rekombinantnými technikami umožňuje fúziu s vhodnými segmentami, napríklad s FLAG sekvenciou alebo ekvivalentom, ktorý sa môže fúzovať cez proteázou-odstranitelnú-sekvenciu. Viď. napríklad Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70, Hochuli (1990) Purification of

Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent v Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plénum Press, N. Y. a Crowe a kol. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification Systen QUIAGEN, Inc. Chatsworth, CA.

Uskutočnila sa počítačová sekvenčná analýza, napríklad použitie dostupných softvárových programov, obsiahnutých v zdrojoch GCG (U. Wisconsion) a GenBank. Tiež sa použila verejná sekvenčná databáza, napríklad GenBank a ďalšie.

Príklad 2

Amplifikácia fragmentu ludského BAS-1 spôsobom PCR

Podlá myších sekvencií RP105 sa navrhli dva priméry. Viď. Miyake a kol. (1995) J. Immunol. 154: 3333-3340. Poradie nukleotidov sa vypočítalo z CTT sekvencie. 5’-primér A (TTG...) sa zhoduje s 24 nukleotidmi od 162 po 185 a 3'-primér F (...TTC) zodpovedá 24 nukleotidom od 1462 po 1485. Z ludských tonzilárnych B buniek neboli zistené žiadne produkty PCR.

Boli vytvorené tri 5'-priméry: primér B (ACA...) zahŕňa nukleotidy v polohe 321 až 344, primér C (AAG...) obsahuje nukleotidy v polohách 568 až 591 a primér D (TCT...) zahŕňa nukleotidy v polohe 859 až 882. Tiež boli vytvorené ďalšie tri 3'-priméry: primér G (...TTA) s obsahom nukleotidov 1765 až 1788, primér H (...GAA) s obsahom nukleotidov v polohe 2024 až 2047 a primér E (...TGG) s obsahom nukleotidov 1164 až 1187.

Na zvýšenie pravdepodobnosti na získanie PCR produktov z ludských tonzilárnych B buniek sa použili PCR reakcie jedného 5'-priméru v kombinácii so štyrmi 3'-primérmi. Zo štyroch skupín PCR reakcií sa získal len jeden čistý 300 bp produkt, ktorý spojil úsek od 5'-priméru D k 3'-priméru E. Tento produkt sa. purifikoval, subklonoval do pCR^X11 vektora (Invitrogen, San Diego CA) a potom sa sekvencoval. Viď. SEKV. ID ČÍS.: 1.

Podlá 300 bp ludskej sekvencie sa navrhli 3 priméry: 5'-primér K, 3'-priméry la L. Použitím obdobného PCR spôsobu 'sa kombináciou primérov C a I (viď. SEKV. ID ČÍS.: 1) získali ďalšie 300 bp ludské fragmenty.

Príklad 3

Tkanivové rozšírenie ludského BAS-1

Ako sonda (sonda D-E) na štúdium tkanivového rozšírenia BAS-1 v ľudských tkanivách sa použil PCR produkt amplifikovaný dvojicou primérov D-E (viď. SEKV. ID ČÍS.: 1). V ľudskej slezine a vo vyššej hladine v ľudskom srdci sa spôsobom Nothernovho prenosu detegovala 2,6 kb mRNA. Čo nebolo tak ľahko detegované v ľudskom mozgu, detskej žľaze, pľúcach, pečeni, kostrovom svale, obličkách, prostate, varlatách, vaječníku, tenkom čreve, hrubom čreve a periférnych krvných leukocytoch. Okrem toho sa spôsobom Nothernovho prenosu v sIgD⁺ lymfómovej bunkovej línii B104 a vo vyššej hladine v Burkitovej lymfómovej bunkovej línii BL2, detegovala 2,6 kb mRNA. Avšak nebola detegovaná v obličkovej epiteliálnej karcinómovej bunkovej línii CHA, pľúcnej epiteliálnej karcinómovej bunkovej línii MRC-5, EBV bunkovej línii JY alebo monocytnej bunkovej línii U937.

Spôsobom PCR bola ľudská BAS-1 mRNA nájdená v sIgD⁺CD38 jednoduchých B bunkách, sIgD⁺CD38⁺ zárodočnom centre B buniek, sIgD^-CD38⁺ zárodočnom centre B buniek, v sIgD^-CD38“ pamäťových B bunkách, v sCD38⁺⁺CD20^nizke plazmatických bunkách, dendritických bunkách generovaných z CD14+ monocytov kultivovaných s GM-CSF a IL-4 a dentritických bunkách generovaných z CD34+ strunových krvných buniek kultivovaných s GM-CSF a TNF-α. Toto nebolo v ľudskej T bunkovej línii MT9 spôsobom PCR detegovateľné.

Príklad 4

Preskúmavanie plazmidovej knižnice cDNA odvodenej z ľudskej slgDt lymfómovej bunkovej línie B104 '

Z výsledkov analýzy Nothernovho prenosu sa v 6 μg poly-A mRNA bunkovej línie B104 detegovala expresia BAS-1. Podľa toho sa v plazmide pSPORTl (Gibco Life Technologies, Cergy Pontoise, Francúzsko) skonštruovala B104 knižnica cDNA. Po dokončení sledovania 150 000 bakteriálnych kolónií sa s použitím sondy D-E nenašli žiadne pozitívne klony. Čo nasvedčuje tomu, že expresia preskúmanie klonov. Tie

BAS-1 v ludských bunkách môže byť velmi nízka.

Príklad 5

Preskúmavanie knižnice lambda-gtlO bakteriofágu ludskej sleziny

Na skúmanie väčšieho množstva klonov sa použila knižnica lambda-gtlO bakteriofágu ludskej sleziny (Clontech). Na

2,4 x 10θ klonov sa identifikovalo 8 pozitívnych sa izolovali, prečistili a subklonovali do plazmidu pME18S (DNAX, Palo Alto, CA). Po sekvencovaní sa našli dva klony S2 a Ll, ktoré označujú celú dĺžku ludského BAS-1 (viď. SEKV. ID ČÍS.: 1). Celá dĺžka izolovanej ludskej BAS-1 cDNA je asi 2635 bp a kóduje protein s velkosťou asi 661 aminokyselín. Tento proteínový produkt obsahuje okolo 11 potenciálnych glykozylačných miest a okolo 22 repetícií bohatých na leucín. Kódovaná oblasť tejto ludskej BAS-1 cDNA má okolo 72 % homológiu s kódovanou oblasťou myšej RP105 sekvencie a táto úplná BAS-1 cDNA má 67 % homológiu s úplnou myšou cDNA sekvenciou. Aminokyselinová homológia medzi ludskou BAS-1 a myšou RP105 je asi 73,5 %.

Príklad 6

Expresia ludského BAS-1 proteínu

Všetky nekódujúcich Chem. 266: SEKV. ID ČÍS.

konštrukty sa vytvorili odstránením 5' a 3' oblastí a pridaním Marylin Kozák (Ref: J. Biol. 19867, 1991) konsenzusovej sekvencie (ACCATGG, : 3), aby sa zvýšila translačná hladina.

Rozpustný BAS-l-FLAG protein bol dočasne exprimovaný do Cos-7 buniek. Rekombinantná forma BAS-1 s FLAG peptidom na karboxylovom konci (Hoppe a kol. (1988) Biotechnológie 6: 1205-1210) sa vložila do expresného vektora pME18S a následne sa elektroporáciou transfektovala do Cos-7 buniek. Elektropórované bunky rástli v DMEM médiu doplnenom buď 1 % Nutridoma HU (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) alebo v samotnom DMEM médiu počas 5 dní.

Príklad 7

Purifikácia rozpustného BAS-1 FLAG proteínu

Bežne sa 208 ml supernatantu s obsahom rozpustného BAS-1 FLAG dalo na 20 ml kolónu s Cu²⁺ iónmi pripojenými na Chelating Sepharose Fast Flow matricu (Pharmacia, Upsalla, Sweden). Po premytí 16 objemami väzbového pufra (His-Bind Buffer Kit, Novagen, Madison, WI), sa proteíny zachytené na kovové ióny eluovali gradientom 20 až 100 mM imidazolu. Obsah ľudského BAS-1 FLAG v eluátovej frakcii sa stanovil spôsobom bodkového prenosu s použitím anti-FLAG monoklonálnej protilátky M2 (Eastman Kodak, New Haven, CT) a Coomassie modrej a striebrom zafarbenou SDS-PAGE. Frakcie BAS-1 FLAG proteínu sa potom spojili dohromady a dialyzovali proti PBS. Ako sa vopred odhadlo z aminokyselinových sekvencií spôsobom Westernovho prenosu, obohatený ľudský BAS-1 zodpovedá proteínom s veľkosťou okolo 95 a 97 kD.

Príklad 8

Stabilná expresia membránového BAS-1 v NIH-3T3 bunkách

Prírodná membránová forma sa subklonovala do expresného vektora pMAMneo (Clontech, Palo Alto, California), ktorý obsahuje RSV-LTR zosilňovač pripojený na dexametazón induktívny MMTV-LTR promótor. Tento konštrukt sa potom elektroporáciou transfektoval do NIH-3T3 buniek. Transfektované NIH-3T3 bunky sa preočkovali na selektívne 0,5 mg/ml Geneticin (G418) (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany) DMEM médium doplnené 10 % Fetal Calf sérom.

Biochemická charakterizácia membránového BAS-1 proteínu v týchto stabilných transfektovaných NIH-3T3 bunkách sa uskutoční metabolickým značením. Bunky sa potom kultivovali 24 hodín v DMEM médiu doplnenom 10 % Fetal Calf sérom a 1 μΜ dexametazónom (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko). Na značenie

35, celulárnych proteínov sa potom bunky a 3⁵s-Cys počas posledných 12 hodín, redukčných podmienok na SDS-PAGE predpokladaného 110 kD proteínu v lyzáte transfektovaných NIH-3T3 buniek, ale nie v lyzáte netransfektovaných NIH-3T3 buniek.

inkubovali s ^J~’S-Met Analýza proteínov za dokázala prítomnosť

Príklad 9

Príprava protilátok špecifických proti BAS-1

Inbredné Balb/c myši sa intraperitoneálne imunizovali rekombinantnými formami ľudského proteínu. Najskôr sa získal purifikovaný rozpustný BAS-1 FLAG a ďalej boli stabilné transfektované NIH-3T3 bunky. Zvieratá sa povzbudili vo vhodnom čase proteínom s alebo bez ďalších pomocných látok na ďalšiu stimuláciu tvorby protilátky. Sérum sa získa alebo hybridómy sa produkujú získanými slezinami.

Inak sa Balb/c myši imunizujú bunkami transformovanými génmi alebo fragmentárni, buď endogénnych alebo exogénnych buniek, alebo sú imunizované vyizolovanými membránami obohatenými o expresiu antigénu. Sérum sa vhodne získa bežne po rade ďalších aplikácií. Na vyvolanie imunitnej odpovede sa môžu použit rôzne génové terapeutické techniky, napríklad v produkovaní proteínu in sitď.

Môžu sa vytvoriť monoklonálne protilátky. Napríklad splenocyty sa spoja s vhodným fúznym partnerom a hydridómy sa selektujú v rastovom médiu štandardnými spôsobmi. Supernatanty hybridómu sa skúmajú na zistenie prítomnosti protilátok, ktoré sa viažu na ľudský BAS-1, napríklad spôsobom ELISA alebo ďalšími stanoveniami. Protilátky, ktoré špecificky rozpoznajú ľudský

BAS-1, nie však druhové varianty, sa môžu tiež selektovať alebo pripraviť.

Iným spôsobom predstavujú syntetizované polypeptidy alebo purifikovaný proteín imunitného monoklonálne alebo polyklonálne Coligan (1991) Current Protocols a Harlow and Lane (1989) Antibodies systému, ktorý vyvoláva protilátky. Viď. napríklad in Immunology Wiley/Greene A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Press. Za vhodných okolností je väzbové činidlo buď značené, ako je uvedené vyššie, napríklad fluorescenčné alebo inak, alebo je imobilizované na substrát pri panning spôsobe. Nukleové kyseliny sa môžu zaviesť do buniek zvierat, aby dochádzalo k produkcii antigénu, ktorý slúži na vyvolanie imunitnej odpovede. Viď. napríklad Wang a kol. (1993) Proc. Naťl. Acad. Sci. 90: 4156-4160, Barry a kol. (1994) BioTechniques 16: 616-619 a Xiang a kol. (1995) Immunity 2: 129-135.

Príklad 10

Veľkoobjemová produkcia BAS-1 v NSO bunkách

Velké množstvo rozpustného BAS-1 a rozpustného BAS-1 FLAG sa môže produkovať zo stabilných transformantov NSO buniek pripravených napríklad podľa metodológie rozpracovanej v Celltech (Slough, Berkshire, UK, International Patent Applications WO 86/05807, WO 87/04462, WO 89/01036 a WO 89/10404). Obidva BAS-1 a BAS-1 FLAG sa subklonovali do pEE12 a následne sa transfektovali eletroporáciou do NSO buniek. Transfektované NSO bunky sa naočkovali do selektívneho DMEM bez glutamínu doplného 10 % Fetal Calf sérom, ako je opísané v Celltechovom protokole. Supernatanty z najlepšie produkujúcej línie sa použili v biologických analýzach a purifikácii rozpustného BAS-1 a rozpustného BAS-l-FLAG.

Na väčšiu produkciu rekombinantných proteínov sa môžu použiť aj ďalšie expresné systémy.

Príklad 11

Produkcia fúzie proteínov s BAS-1

Vytvoril sa rad fúznych konštruktov s BAS-1 extracelulárnou doménou. Táto časť génu je pripojená na iný proteín, napríklad FLAG epitopový nádor, Ig doménu alebo na dvojhybridný systémový konštrukt. Viď. napríklad Field and Song (1989) Náture 340: 245-246.

Epitopový nádor sa môže použiť v expresnom klonovaní s detekciou väzbového partnera anti-FLAG protilátkou, napríklad ligand pre BAS-1. Inak sa Ig domény môžu použiť na purifikáciu použitím látky podobnej antigénu s afinitou k ligandu. Dva hybridné systémy sa môžu tiež použiť na izoláciu proteínov, ktoré sa špecificky viažu na BAS-1.

Príklad 12

Mapovanie ľudského BAS-1 spôsobom hybridizácie in situ

Pripravil sa chromozóm. Hybridizácia in situ sa uskutočnila na chromozómovom preparáte získanom z ľudských lymfocytov stimulovaných fytohemaglutinínom kultivovaných 72 hodín. Na zabezpečenie dobrej kvality posthybridizačných pásov chromozómov sa na posledných 7 hodín kultivácie pridal 5-brómdeoxyuridín (60 μg/ml média).

655 bp PCR fragment amplifikovaný pomocou primérov, napríklad zodpovedajúci nukleotidom 395 až 411 a 1027 až 1050, na celkovom B bunkovom cDNA templáte, sa klonoval do vhodného vektora. Vektor sa značil ^JH posunom jednoretazcového zlomu. Rádioaktívne značená sonda hybridizovala do metafázy v koncovej koncentrácii 200 ng/ml hybridizačného roztoku, ako je opísané v Mattel a kol. (1985) Hum. Genet. 69: 327-331.

Po poliatí nukleárnou stopovou emulziou (KODAK NTB₂) sa diapozitívy exponovali 18 dní pri 4 °C. Aby sme sa vyhli akýmkoľvek prúžkom strieborných zrniek počas väzbovej procedúry, polial sa chromozóm pufrovaným roztokom Giemsa a metafáza sa odfotografovala. R-pásy sa potom ukázali spôsobom fluorochrómfotolýzy-Giemsa (FPG) a metafáza sa znova odfotografovala pred analýzou.

V 100 metafázových bunkách testovaných po hybridizácii in situ sa 20 % strieborných zŕn umiestnilo na chromozóme 5. Rozšírenie zŕn nebolo náhodné, 67 % z nich mapovalo v oblasti qll.2-ql3.1 chromozómu 5 dlhé rameno. Toto mapuje ľudský BAS-1 v oblasti 5qll.2-ql3.1 ľudského genómu.

Príklad 13

Izolácia receptoru pre ľudský BAS-1

Ľudský BAS-1 sa môže použiť ako špecifické väzbové činidlo na identifikáciu svojho väzbového partnera, kvôli jeho výhodnej väzbovej špecificite by sa mali použiť radšej protilátky. Väzbové činidlo je buď značené, ako je opísané vyššie, napríklad fluorescenčné alebo inak alebo panning spôsoby.

imobilizované na substrát pre

Väzbová zmes sa používa na sledovanie expresnej knižnice, ktorá sa vytvorila z bunkovej línie exprimujúcej väzbového partnera, napríklad receptor. Štandardné farbiace techniky sa použijú na detekciu alebo zaradenie intracelulárneho alebo exprimovaného povrchového receptora alebo sa povrchovo exprimujúce transformované bunky sledujú spôsobom pannig. Sledovanie intracelulárnej expresie sa uskutoční radom farbiacich alebo imunofluorescenčných postupov. Viď. tiež McMahan a kol. (1991) EMBO J. 10: 2821-2832.

Napríklad 0. deň vopred potiahnuť dvojkomorové permanoxové podložné sklíčko fibronektínom 1 ml na komoru, 10 ng/ml v PBS 30 minút pri izbovej teplote. Jedenkrát opláchnuť PBS. Potom zaočkovať COS bunkami na 2-3 x 10⁵ buniek na komoru v 1,5 ml rastového média. Inkubovať cez noc pri 37 ’C.

1. deň pre každú vzorku pripraviť 1,5 ml roztoku 66 μg/ml DEAE-dextránu, 66 μΜ chlorquin a 44 μg DNA v sére bez DME. Pre každú sadu sa pripravila pozitívna kontrola, napríklad ľudská BAS-l-FLAG cDNA v riedení 1 a 1/200 a negatívna kontrola. Bunky opláchnuť sérom bez DME. Pridať pri 37 ’C. Odstrániť médium a

2,5 minúty. Odstrániť a premyť roztok DNA a inkubovať 5 hodín pridať 0,5 ml 10 % DMSO v DME vodou jedenkrát v DME. Pridať

1,5 ml rastového média a inkubovať cez noc.

2. deň vymeniť médium. 3. a zafarbia. Bunky opláchnuť Buffered Saline Solution) a paraformaldehyd (PFA)/glukóza.

deň alebo 4. deň sa bunky fixujú dvakrát roztokom HBSS (Hank's fixovať 5 minút v 4 % roztoku Omyť trikrát roztokom HBSS. Po odstránení všetkej kvapaliny sa podložné sklíčka uchovali pri teplote -80 ’C. V každej komore sa uskutočnilo 0,5 ml inkubácií nasledujúcim spôsobom. Pridať na 20 minút roztok HBSS/saponín (0,1 %) s 3 2 μΐ/ml 1 M NaN-j. Bunky sa potom jedenkrát premyli roztokom HBSS/saponín. K bunkám pridať ľudský BAS-1 alebo komplex BAS-l/protilátka a inkubovať 30 minút. Bunky premyť dvakrát roztokom HBSS/saponín. Ak je to vhodné, pridať na 30 minút prvú protilátku. Pridať druhú protilátku, napríklad vektor protilátky proti myšiam v riedení 1/200 a inkubovať 30 minút. Pripraviť ELISA roztok, napríklad vektor elitného ABC chrenového peroxidázového roztoku a vopred inkubovať 30 minút. Použiť napríklad 1 kvapku roztoku A (avidín) a roztoku B (biotín) na

2,5 ml HBSS/saponín. Bunky premyť dvakrát roztokom HBSS/saponín. Pridať ABC HRP roztok a inkubovať 30 minút. Bunky premyť dvakrát roztokom HBSS, druhýkrát premývať počas 2 minút, čím sa bunky uzavrú. Potom pridať na 5 až 10 minút vektor kyseliny diamínbenzoovej (DAB). Použiť 2 kvapky pufra so 4 kvapkami DAB

- 57 a kvapkami H₂O₂ na 5 ml destilovanej vody. Opatrne odstrániť komoru a omyť sklíčko vodou. Na vzduchu sušiť na niekolko minút, potom pridať 1 kvapku Crystal Mount a prikryť krycím sklíčkom. Sušiť 5 minút pri 85 až 90 ’C.

Vyhodnotiť pozitívne farbenie a postupne subklon na izoláciu jednotlivých génov zodpovedných za väzbu.

Alebo sa BAS-1 činidlá používajú na afinitnú purifikáciu alebo na výber buniek exprimujúcich receptor. Viď. napríklad Sambrook a kol. alebo Ausubel a kol.

Ďalším spôsobom je sledovanie membránovo viazaného receptora spôsobom panning. Receptor cDNA je skonštruovaný, ako je opísané vyššie. Ligand sa môže imobilizovať a použiť na imobilizáciu exprimujúcich buniek. Imobilizácia sa môže dosiahnuť použitím vhodných protilátok, ktoré rozpoznajú napríklad FLAG sekvenciu BAS-1 fúzneho konštruktu alebo použitím protilátok vybraných proti prvým protilátkam. Znovu použitelné cykly selekcie a amplifikácie vedú k obohateniu vhodných klonov a konečnej izolácii receptorov exprimujúcich klony.

Fágové expresné knižnice sa môžu skúmať ľudským BAS-1. Vhodné techniky značenia, napríklad anti-FLAG protilátky, umožňujú špecifické značenie vhodných klonov.

Všetky uvedené citácie sú zahrnuté v referenciách v rovnakom rozsahu, ako by jednotlivé publikácie alebo patentové prihlášky boli konkrétne a jednotlivo uvedené, aby boli zahrnuté v referenciách.

Môže sa vypracovať veľa modifikácií a variácií tohto vynálezu bez odchýlenia sa od jeho podstaty a sféry pôsobnosti, ako bude zrejmé odborníkom v odbore. Špecifické príklady tu opísané sú predložené len vo forme príkladov a vynález môže byt limitovaný termínami doplnenými nárokmi spolu s radom ekvivalentov, na ktoré tieto nároky poukazujú.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) PRIHLASOVATEĽ: Schering Corporation (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Izolovaná a rekombinantná nukleová kyselina, BAS-1 proteín alebo jeho peptid a prostriedok, protilátka, expresný vektor, hostiteľská bunka a spôsoby ich použitia.

(iii) POČET SEKVENCÍ: 3 (iv) KONTAKTNÁ ADRESA:

(A)	ADRESA :	Schering-Plough Corporation
(B)	ULICA :	2000 Galloping Hill Road
(C)	MESTO :	Kenilworth
(D)	ŠTÁT :	New Jersey
(E)	KRAJINA:	USA
(F)	PSČ: :	07033
(v) DRUH	POČÍTAČOVÉHO SPRACOVANIA:
(A)	TYP MÉDIA	: Disketa
(B)	POČÍTAČ	: Macintosh
(C)	OPERAČNÝ	SYSTÉM: 7.5.3

(vi) SÚČASNÉ ÚDAJE PRIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO (B) DÁTUM

PRIHLÁŠKY: PODANIA:

(vii) PREDOŠLÉ ÚDAJE PRIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA: 17.5.1996 (viii) INFORMÁCIA O PRÁVNOM ZÁSTUPCOVI A AGENTOVI (A) MENO: Cynthia L. Foulke, Esq.

(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 32.364 (C) ČÍSLO POSUDKU: DX0580PCT (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE (A) TELEFÓN: 908-298-2987 (B) FAX: 908-298-5388 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEKV. ID ČÍS.: 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2635 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (ix) ZNAK:

(A) NÁZOV/ZNAČKA: CDS (B) POLOHA: 97..2082 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID ČÍS.: 1:

ATTCCGGCGG CTGCCAAATT GCCAGGGCCT TCACAGTTTG ATTCCATT'rC

TCAGCTCCAA

GCATTAGGTA AACCCACCAA GCAATCCTAG CCTGTG ATG GCG TTT GAC GTC AGC 114

Met 3

Ala

Phe

Asp

> Val 5

Ser

TGC 162

TTC

TTT

TGG

GTG

GTG

CTG

TTT

TCT

GCC

GGC

TGT

AAA

GTC

ATC

ACC

Cys

Phe

Phe

Trp 10

Val

Val

Leu

Phe

Ser 15

Ala

Gly

Cys

Lys

Val 20

Ile

Thr

TCC 210

TGG

GAT

CAG

ATG

TGC

ATT

GAG

AAA

GAA

GCC

AAC

AAA

ACA

TAT

AAC

Ser

Trp

Asp 25

Gin

Met

Cys

íle

Glu 30

Lys

Glu

Ala

Asn

Lys 35

Thr

Tyr

Asn

TGT 258

GAA

AAT

TTA

GGT

CTC

AGT

GAA

ATC

CCT

GAC

ACT

CTA

CCA

AAC

AC/i

Cys

Glu 40

Asn

Leu

Gly

Leu

Ser 45

Glu

Ile

Pro

Asp

Thr 50

Leu

Pro

Asn

Thr

ACA 306

GAA

TTT

TTG

GAA

TTC

AGC

TTT

AAT

TTT

TTG

CCT

ACA

ATT

CAC

AAT

Thr 55

Glu

Phe

Leu

Glu

Pli e 60

Ser

Phe

Asn

Phe

Leu 65

Pro

Thr

Ile

His

Asn 7 0

AGA 354

ACC

TTC

AGC

AGA

CTC

ATG

AAT

CTT

ACC

TTT

TTG

GAT

TTA

ACT

AGG

Arg

Thr

Phe

Ser

Arg 7 5

Leu

Met

Asn

Leu

Thr 80

Phe

Leu

Asp

Leu

Thr 85

Arg

TGC 402

CAG

ATT

AAC

TGG

ATA

CAT

GAA

GAC

ACT

TTT

CAA

AGC

CAT

CAT

CAA

Cys

Gin

Ile

Asn 90

Trp

Ile

His

Glu

Asp 95

Thr

Phe

Gin

Ser

His 100

His

Gin

TTA 450

AGC

ACA

CTT

GTG

TTA

ACT

GGA

AAT

CCC

CTG

ATA

TTC

ATG

GCA

GAA

Leu

Ser

Thr 105

Leu

Val

Leu

Thr

Gly 110

Asn

Pro

Leu

Ile

Phe 115

Met

Ala

Glu

ACA 498

TCG

CTT

AAT

GGG

CCC

AAG

TCA

CTG

AAG

CAT

CTT

TTC

TTA

ATC

CAA

Thr

Ser 120

Leu

Asn

Gly

Pro

Lys 125

Ser

Leu

Lys

His

Leu 130

Phe

Leu

Ile

Gin

ACG 546

GGA

ATA

TCC

AAT

CTC

GAG

TTT

ATT

CCA

GTG

CAC

AAT

CTG

GAA

AAC

Thr 135

Gly

Ile

Ser

Asn

Leu 140

Glu

Phe

Ile

Pro

Val 145

His

Asn

Leu

Glu

Asn 150

TTG 594

GAA

AGC

TTG

TAT

CTT

GGA

AGC

AAC

CAT

ATT

TCC

TCC

ATT

AAG

TTC

Leu

Glu

Ser

Leu

Tyr 155

Leu

Gly

Ser

Asn

His 160

Ile

Ser

Ser

Ile

Lys 165

Phe

CCC 642

ZlAA

GAC

TTC

CCA

GCA

CGG

AAT

CTG

AAA

GTA

CTG

GAT

TTT

CAG

AAT

Pro

Lys

Asp

Phe 170

Pro

Ala

Arg

Asn

Leu 175

Lys

Val

Leu

Asp

Phe 180

Gin

Asn

AAT 690

GCT

ATA

CAC

TAC

ATC

TCT

AGA

GAA

GAC

ATG

AGG

TCT

CTG

GAG

CAG

Asn

Ala

Ile 185

His

Tyr

Ile

Ser

Arg 190

Glu

Asp

Met

Arg

Ser 195

Leu

Glu

Gin

GCC 738

ATC

AAC

CTA

AGC

CTG

AAC

TTC

AAT

GGC

AAT

AAT

GTT

AAA

GGT

ATT

Ala

íle 200

Asn

Leu

Ser

Leu

Asn 2.05

Phe

Asn

Gly

Asn

Asn 210

Val

Lys

Gly

íle

GAG 786

CTT

GGG

GCT

TTT

GAT

TCA

ACG

GTC

TTC

CAA

AGT

TTG

ZlAC

TTT

GGA

Glu 215

Leu

Gly

Ala

Phe

Asp 220

Ser

Thr

Val

Phe

Gin 225

Ser

Leu

Asn

Phe

Gly 230

GGA 834

ACT

CCA

AAT

TTG

TCT

GTT

ΛΤΛ

TTC

AAT

GGT

CTG

CAG

AAC

TCT

ACT

Gly

Thr

Pro

Asn

Leu 235

Ser

Val

íle

Phe

Asn 240

Gly

Leu

Gin

Asn

Ser 245

Thr

ACT 882

CAG

TCT

CTC

TGG

CTG

GGA

ACA

TTT

GAG

GAC

ATT

GAT

GAC

GAA

GAT

Thr

Gin

Ser

Leu 250

Trp

Leu

Gly

Thr

Phe 255

Glu

Asp

íle

Asp

Asp 260

Glu

Asp

ATT 930

AGT

TCA

GCC

ATG

CTC

AAG

GGA

CTC

TGT

GAA

ATG

TCT

GTT

GAG

AGC

íle

Ser

Ser 265

Ala

Met

Leu

Lys

Gly 270

Leu

Cys

Glu

Met

Ser 275

Val

Glu

Ser

CTC 978

AAC

CTG

CAG

GAA

CAC

CGC

TTC

TCT

GAC

ATC

TCA

TCC

ACC

ACA

TTT

Leu

Asn 280

Leu

Gin

Glu

His

Arg 285

Phe

Ser

Asp

íle

Ser 290

Ser

Tlir

Thr

Phe

CAG

TGC

TTC

ACC

CAA

CTC

CAA

GAA

TTG

GAT

CTG

ACA

GCA

ACT

CAC

TTG

1026

Gin Cys

Phe

Thr

Gin

Leu 300

Gin

Glu

Leu

Asp

Leu 305

Thr

Ala

Thr

His

Leu 310

295

ΛΑΑ GGG 1074

ΤΤΛ

CCC

TCT

GGG

ATG

AAG

GGT

CTG

AAC

TTG

CTC

AAG

AAA

TTA

Lys Gly

Leu

Pro

Ser 315

Gly

Met

Lys

Gly

Leu 320

Asn

Leu

Leu

Lys

Lys 325

Leu

GTT CTC 1122

AGT

GTA

AAT

CAT

TTC

GAT

CAA

TTG

TGT

CAA

ATC

AGT

GCT

GCC

Val Leu

Ser

Val 330

Asn

His

Phe

Asp

Gin 335

Leu

Cys

Gin

íle

Ser 340

Ala

Ala

AAT TTC 1170

CCC

TCC

CTT

ACA

CAC

CTC

TAC

ATC

AGA

GGC

AAC

GTG

AAG

AAA

Asn Phe

Pro 345

Ser

Leu

Thr

His

Leu 350

Tyr

íle

Arg

Gly

Asn 355

Val

Lys

Lys

CTT CAC 1218

CTT

GGT

GTT

GGC

TGC

TTG

GAG

AAA

CTA

GGA

AAC

CTT

CAG

ACA

Leu His 360

Leu

Gly

Val

Gly

Cys 365

Leu

Glu

Lys

Leu

Gly 370

Asn

Leu

Gin

Thr

CTT GAT 1266

TTA

AGC

CAT

AAT

GAC

ΛΤΑ

GAG

GCT

TCT

GAC

TGC

TGC

AGT

CTG

Leu Asp 375

Leu

Ser

His

Asn 380

Asp

íle

Glu

Ala

Ser 385

Asp

Cys

Cys

Ser

Leu 390

CAA CTC 1314

AAA

AAC

CTG

TCC

CAC

TTG

CAA

ACC

TTA

AAC

CTG

AGC

CAC

AAT

Gin Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

His

Leu

Gin

Thr

Leu

Asn

Leu

Ser

His

Asn

59 5

400

4 05*

GAG CCT 1362

CTT

GGT X

CTC

CAG

AGT

CAG

GCA

TTC

AAA

GAA

TGT

CCT

CAG

CTA

Glu Pro

Leu

Gly 410

Leu

Gin

Ser

Gin

Ala 415

Phe

Lys

Glu

cys

Pro 420

Gin

Leu

GAA CTC 1410

CTC

GAT

TTG

GCA

TTT

ACC

CGC

TTA

CAC

ATT

AAT

GCT

CCA

CAA

Glu Leu

Leu 425

Asp

Leu

Ala

Phe

Thr 430

Arg

Leu

His

íle

Asn 435

A] o

Pro

Gin

AGT CCC 1450

TTC

CAA

AAC

CTC

CAT

TTC

CTT

CAG

GTT

CTG

AAT

CTC

ACT

TAC

Ser Pro 440

Pli e

Gin

Asn

Leu

His 445

Phe

Leu

Gin

Val

Leu 450

Asn

Leu

Thr

Tyr

TGC TTC 1506

CTT

GAT

ACC

AGC

AAT

CAG

CAT

CTT

CTA

GCA

GGC

CTA

CCA

GTT

Cys Phe 455

Leu

Asp

Thr

Ser 460

Asn

Gin

His

Leu

Leu 465

Ala

Gly

Leu

Pro

Val 470

CTC CGG 1554

CAT

CTC

AAC

TTA

ΛΛΛ

GGG

AAT

CAC

TTT

CAA

GAT

GGG

ACT

ATC

Leu Arg

His

Leu

Asn 475

Leu

Lys

Gly

Asn

His 480

Phe

Gin

Asp

Gly

Thr 4 85

íle

ACG AAG 1602

ACC

AAC

CTA

CTT

CAG

ACC

GTG

GGC

AGC

TTG

GAG

GTT

CTG

ATT

Thr Lys

Thr

Asn 490

Leu

Leu

Gin

Thr .

Val 495

Gly

Ser

Leu

Glu

Val 500

Leu

íle

TTG TCC 1650

TCT

TGT

GGT

CTC

CTC

TCT

ATA

GAC

CAG

CAA

GCA

TTC

CAC

AGC

Leu Ser

Ser 505

Cys

Gly

Leu

Leu

Ser 510

íle

Asp

Gin

Gin

Ala 515

Phe

His

Ser

TTG GGA 1698

AAA

ATG

AGC

CAT

GTA

GAC

TTA

AGC

CAC

AAC

AGC

CTG

ACA

TGC

Leu Gly 520

Lys

Met

Ser

His

Val 525

Asp

Leu

Ser

His

Asn 530

Ser

Leu

Thr

Cys

GAC AGC 1746

ATT

GAT

TCT

CTT

AGC

CAT

CTT

AAG

GGA

ATC

TAC

CTC

AAT

CTG

Asp Ser 535

íle

Asp

Ser

Leu 540

Ser

His

Leu

Lys

Gly 545

íle

Tyr

Leu

Asn

Leu 550

GCT GCC 1794

AAC

AGC

ATT

AAC

ATC

ATC

TCA

CCC

CGT

CTC

CTC

CCT

ATC

TTG

Ala Ala

Asn

Ser

íle 555

Asn

íle

íle

Ser

Pro 560

Arg

Leu

Leu

Pro

íle 565

Leu

TCC CAG 1842

CAG

AGC

ACC

ATT

AAT

TTA

AGT

CAT

AAC

CCC

CTG

GAC

TGC

ACT

Ser Gin

Gin

Ser 570

Thr

íle

Asn

Leu

Ser 575

His

Asn

Pro

Leu

Asp 580

Cys

Thr

TGC TCG 1090

AAT

ATT

CAT

TTC

TTA

ACA

TGG

TAC

AAA

GAA

AAC

CTG

CAC

AAA

Cys Ser

Asn 585

íle

His

Phe

Leu

Thr 590

Trp

Tyr

Lys

Glu

Asn 595

Leu

His

Lys

CTT GAA 1938

GGC

TCG

GAG

GAG

ACA

CGT

GTG

CAA

AAC

CCG

CCA

TCT

CTA

AGG

Leu Glu Gly Ser Glu Glu Thr Arg Val Gin Asn Pro Pro Ser Leu Arg 600 605 610

GGA GTT AAG CTA TCT GAT GTC AAG CTT TCC TGT GGG ATT ACA GCC ATA 1986

Gly Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser Cys Gly Íle Thr Ala He

615 620 625 ~ 630

GGC ATT TTC TTT CTC ATA GTA TTT CTA TTA TTG TTG GCT ATT CTG CTA

2034

Gly íle Phe Phe Leu íle Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala íle Leu Leu 635 640 645

TTT TTT GCA GTT AAA TAC CTT CTC AGG TGG AAA TAC CAA CAC TTT TAG 2082

Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp Lys Tyr Gin His Phe

	650	655	660
TGCTGAAGGT 2142	TTCCAGAGAA	AGCAAATAAG	TGTGCTTAGC	AAAATTGCTC	TAAGTGAAAG
AACTGTCATC 2202	TGCTGGTGAC	CAGACCAGAC	TTTTCAGATT	GCTTCCTGGA	ACTGGGCAGG
GACTCACTGT 2262	GCTTTTCTGA	GCTTCTTACT	CCTGTGAGTC	CCAGAGCTAA	AGAACCTTCT
AGGCAAGTAC 2322	ACCGAATGAC	TCAGTCCAGA	GGGTCAGATG	CTGCTGTGAG	AGGCACAGAG
CCCTTTCCGC 2382	ATGTGGAAGA	GTGGGAGGAA	GCAGAGGGAG	GGACTGGGCA	GGGACTGCCG
GCCCCGGAGT 2442	CTCCCACAGG	GAGGCCATTC	CCCTTCTACT	CACCGACATC	CCTCCCAGCA
CCACACACCC 2502	CGCCCCTGAA	AGGAGATCAT	CAGCCCCCAC	AATTTGTCAG	AGCTGAAGCC
AGCCCACTAC 2562	CCACCCCCAC	TACAGCATTG	TGCTTGGGTC	TGGGTTCTCA	GTAATGTAGC
CATTTGAGAA 2622	ACTTACTTGG	GGACAAAGTC	TCAATCCTTA	TTTTAAATGA	AAAAAGAAAA
GAAAAGCATA 2635	ATA
INFORMÁCIA	0 SEKVENCII SEKV.	ID ČÍS.:	2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 661 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein

:i) «	OPIS	SEKVENCIE: SEKV.	ID	ČÍS. :	2:
Met 1	Ala	Phe Asp Val Ser Cys 5	Phe	Phe Trp ' 10	Val Val Leu Phe Ser Ala 15
Gly	Cys	Lys Val He Thr Ser 20	Trp	Asp Gin 25	Met Cvs íle Glu l.v« 30
Ala	Asn	Lys Thr Tyr Asn Cys 35	Glu 40	Asn Leu	Gly Leu Ser Glu íle Pro 45
Asp	Thr 50	Leu Pro Asn Thr Thr 55	Glu	Phe Leu	Glu Phe Ser Phe Asn Phe 60
beu 65	Pro	Thr íle His Asn Arg 70	Thr	Phe Ser	Arg Leu Met Asn Leu Thr 75 80
Phe	Leu	Asp Leu Thr Arg Cys 85	Gln	Ile Asn 90	Trp íle His Glu Asp Thr 95
Phe	Gin	Ser His His G]n Leu 100	Ser	Thr Leu 105	Val Leu Thr Gly Asn Pro 110
Leu	íle	Phe Met Ala Glu Thr 115	Ser 120	Leu Asn	Gly Pro Lys Ser Leu Lys 125
His	Leu 130	Phe Leu íle Gin Thr 135	Gly	íle Ser	Asn Leu Glu Phe íle Pro 140
Val 145	His	Asn Leu Glu Asn Leu 150	Glu	Ser Leu	Tyr Leu Gly Ser Asn His 155 160
íle	Ser	Ser íle Lys Phe Pro 165	Lys	Asp Phe 170	Pro Ala Arg Asn Leu Lys 175
Val	Leu	Asp Phe Gin Asn Asn 180	Ala	íle His 185	Tyr íle Ser Arg Glu Asp 190
Met	Arg	Ser Leu Glu Gin Ala 195	íle 200	Asn Leu	Ser Leu Asn Phe Asn Gly 205
Asn	Asn 210	Val Lys Gly íle Glu 215	Leu	Gly Ala	Phe Asp Ser Thr Val Phe 220
Gin 225	Ser	Leu Asn Phe Gly Gly 230	Thr	Pro Asn	Leu Ser Val íle Phe Asn 235 240
Gly	Leu	Gin Asn Ser Thr Thr 245	Gin	Ser Leu 250	Trp Leu Gly Thr Phe Glu 255
Asp	íle	Asp Asp Glu Asp íle 260	Ser	Ser Ala 265	Met Leu Lys Gly Leu Cys 270
Glu	Met	Ser Val Glu Ser Leu 275	Asn 280	Leu Gin	Glu His Arg Phe Ser Asp 285

Ile Ser Ser Thr Thr Phe Gin Cys 290 295

Leu Thr Ala Thr His Leu Lys Gly 305 310

Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu 325

Cys Gin Ile Ser Ala Ala Asn Phe 340

Arg Gly Asn Val Lys Lys Leu His 355 360

Phe Thr Gin Leu Gin Glu Leu Asp 300

Leu Pro Ser Gly Met Lys Gly Leu 315 320

Ser Val Asn His Phe Asp Gin Leu 330 335

Pro Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile 345 350

Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys 365

Leu Gly Asn Leu Gin Thr Leu Asp 370 375

Ser Asp Cys Cys Ser Leu Gin Leu 385 390

Leu Asn Leu Ser His Asn Glu Pro 405

Lys Glu Cys Pro Gin Leu Glu Leu 420

His íle Asn Ala Pro Gin Ser Pro 435 440

Val Leu Asn Leu Thr Tyr Cys Phe 450 455

Leu Ala Gly Leu Pro Val Leu Arg 465 470

Phe Gin Asp Gly Thr Ile Thr Lys 485

Ser Leu Glu Val Leu Ile Leu Ser 500

Gin Gin Ala Phe His Ser Leu Gly 515 .. 520

His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser 530 535

Gly Ile Tyr Leu Asn Leu Ala Ala 545 550

Arg Leu Leu Pro íle Leu Ser Gin 565

Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala 380

Lys Asn Leu Ser His Leu Gin Thr 395 400

Leu Gly Leu Gin Ser Gin Ala Phe 410 415

Leu Ašp Leu Ala Phe Thr Arg Leu 425 430

Phe Gin Asn Leu His Phe Leu Gin

445

Leu Asp Thr Ser Asn Gin His Leu 460

His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His 475 480

Thr Asn Leu Leu Gin Thr Val Gly 490 495

Ser Cys Gly Leu Leu Ser íle Asp 505 510

Lys Met Ser His Val Asp Leu Ser 525

Ile Asp Ser Leu Ser His Leu Lys 540

Asn Ser Ile Asn Ile Ile Ser Pro 555 560

Gin Ser Thr Ile Asn Leu Ser His 570 575

Asn

Pro

Leu

Asp 580

Cys

Thr

Cys

Ser

Asn 585

íle

His

Phe

Leu

Thr 590

Trp

Tyr

Lys

Glu

Asn 595

Leu

His

Lys

Leu

Glu 600

Gly

Ser

Glu

Glu

Thr 605

Arg

Val

Gin

Asn

Pro 610

Pro

Ser

Leu

Arg

Gly 615

Val

Lys

Leu

Ser

Asp 620

Val

Lys

Leu

Ser

Cys 625

Gly

íle

Thr

Ala

íle 630

Gly

íle

Phe

Phe

Leu 635

íle

Val

Phe

Leu

Leu 640

Leu

Leu

Ala

íle

Leu 645

Leu

Phe

Phe

Ala

Val 650

Lys

Tyr

Leu

Leu

Arg 655

Trp

Lys

Tyr

Gin

His 660

Phe

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEKV. ID ČÍS.: 3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 7 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) 'REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV. ID ČÍS.: 3:

ACCATGG

7/

Claims (25)

1. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina kódujúca ľudský BAS-1 proteín alebo jeho fragment.

2. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina podľa nároku

1, kde uvedená nukleová kyselina obsahuje sekvenciu definovanú v SEKV. ID ČÍS.: 1.

ť

3. Nukleová kyselina podľa nároku 2, kde uvedená nukleová * kyselina vykazuje aspoň 80 % zhodnosť k prírodnej cDNA kódujúcej uvedený fragment.

4. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina podľa nároku

2, ktorá kóduje aspoň 8 po sebe idúcich zvyškov SEKV. ID ČÍS.: 2.

5. Nukleová kyselina podľa nároku 4, ktorá kóduje aspoň 12 po sebe idúcich zvyškov.

6. Nukleová kyselina podľa nároku 4, kde uvedená nukleová kyselina vykazuje aspoň 80 % zhodnosť k prírodnej cDNA kódujúcej uvedený segment.

7. V podstate čistý BAS-1 proteín alebo jeho peptid.

8. Proteín alebo peptid podľa nároku 7 vybraný zo skupiny, ktorá * sa skladá z:

Z *

a) proteínu alebo peptidu z opíc, vrátane ľudského,

b) proteínu alebo peptidu, ktorý obsahuje aspoň jeden polypeptidový segment definovaný v SEKV. ID ČÍS.: 2,

c) proteínu alebo peptidu, ktorý vykazuje posttranslačný modifikačný profil odlišný od prírodného BAS-1 proteínu a

d) proteínu, ktorému chýba intracelulárna doména BAS-1.

9. Protein alebo peptid podlá nároku 8, ktorý obsahuje segment, ktorý vykazuje sekvenčnú homológiu k zodpovedajúcej časti ludského BAS-1: ¹

a) uvedená homológia má aspoň 90 % zhodnosť a uvedená časť je aspoň 9 aminokyselín,

b) uvedená homológia má aspoň 80 % zhodnosť a uvedená časť je aspoň 17 aminokyselín alebo

c) uvedená homológia má aspoň 70 % zhodnosť a uvedená časť je aspoň 25 aminokyselín.

10. Fúzny protein podlá nároku 7, ktorý obsahuje BAS-1 peptid.

11. Prostriedok podlá nároku 7, ktorý obsahuje protein a farmaceutický prijatelný nosič.

Protilátka alebo protilátkou špecificky viaže rekombinantný BAS-1 protein alebo jeho fragment viazaný fragment, ktorý alebo purifikovaný opičí

13. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedený BAS-1 protein je opičí protein vrátane jedného ludského.

14. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedená protilátka sa získa proti peptidovej sekvencií definovanej v SEKV. ID ČÍS.: 2.

15. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedená protilátka má Kd aspoň 10 μΜ.

16. Protilátka podlá nároku 12, kde uvedená protilátka je monoklonálna protilátka.

17. Protilátka podľa nároku 12, kde uvedená protilátka je značená.

18. Protilátka podľa nároku 12, ktorá:

a) indukuje silnú proliferáciu B buniek a/alebo

b) chráni B bunky pred apoptózou indukovanou ožiarením.

19. Expresný vektor podľa nároku 1, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu.

20. Hostiteľská bunka podľa nároku 19, ktorá obsahuje vektor.

21. Spôsob skúmania vyznačujúci sa puri f ikovaného vzorky pre väzbového partnera k BAS-1, tým, že obsahuje kroky produkcie alebo rekombinantného BAS-1 proteínu a sledovanie v uvedenej vzorke pre špecifickú väzbu uvedeného partnera na uvedený BAS-1.

22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedená vzorka obsahuje proteíny získané z T buniek, dendritických buniek, vrátane folikulárnych dendritických buniek alebo stromatických buniek vrátane fibroplastických buniek, endoteliálnych a epiteliálnych buniek.

23. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedeným väzbovým partnerom je protilátka a uvedeným príkladom je hybridómový supernatant. «·

24. Spôsob modulovania fyziológie a vývoja buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa spojenie uvedených buniek s agonistom alebo antagonistom BAS-1 proteínu.

25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedený antagonista je protilátka proti myšiemu BAS-1 proteínu.

26. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedené spojenie je v kombinácii s mediátorom signálu cez antigénový receptor, CD40:CD40 ligandová dráha alebo dráha .CD28/CTLA-4:B7/B70.