SE439322B - Forfarande for framstellning av seskviterpenderivat genom odling av en mikroorganism tillhorande slektet stachybotrys - Google Patents

Forfarande for framstellning av seskviterpenderivat genom odling av en mikroorganism tillhorande slektet stachybotrys

Info

Publication number
SE439322B
SE439322B SE7805606A SE7805606A SE439322B SE 439322 B SE439322 B SE 439322B SE 7805606 A SE7805606 A SE 7805606A SE 7805606 A SE7805606 A SE 7805606A SE 439322 B SE439322 B SE 439322B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
stachybotrys
colony
cultivation
compound
strain
Prior art date
Application number
SE7805606A
Other languages
English (en)
Other versions
SE7805606L (sv
Inventor
M Shinohara
H Kaise
Y Nakano
T Izawa
Y Oshiro
W Miyazaki
Original Assignee
Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP52078641A external-priority patent/JPS589114B2/ja
Priority claimed from JP15895977A external-priority patent/JPS5492680A/ja
Priority claimed from JP53014674A external-priority patent/JPS5936913B2/ja
Application filed by Otsuka Pharma Co Ltd filed Critical Otsuka Pharma Co Ltd
Publication of SE7805606L publication Critical patent/SE7805606L/sv
Publication of SE439322B publication Critical patent/SE439322B/sv

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/94Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom spiro-condensed with carbocyclic rings or ring systems, e.g. griseofulvins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10Spiro-condensed systems
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

7805606-6 Olika föreningar är kända såsom substanser med antikomplementär aktivitet, såsom etylendiamintetraättiksyra (EDTA), "Saldox", Elorizin [såsom beskrivits av Borsos. J. Immunol. gg (4), 629 (1964), hydroxibensenderivat (såsom beskrivits a\rShir Mayer, Biochemistry N.Y., Z, 3003 (1968), guanidiner och fenoxiacet- amider (såsom beskrives av B.R. Baker, J. Med. Chem., lg, 408 (1968), fosfonatestrar (såsom beskrivits av E.L. Becker, B.B.A., lgl, 289 (l967)], klorofyllin, glycyrrizin, etc.
Dessa föreningar är emellertid icke tillfredsställande för praktiska ändamål, eftersom de är i hög grad toxiska eller upp- visar en låg antikomplementär aktivitet. Såsom för närvarande är känt finns det icke några antikomplementära föreningar eller medel som är tillgängliga i handeln.
Det är därför ett ändamål med uppfinningen att tillhandahålla ett förfarande för framställning av nya seskviterpenderivat och salter därav, vilka uppvisar en hög antikomplementär akti- vitet och en låg toxicitet.
Föreliggande uppfinning avser således förfarande för framstäl- lning av nya seskviterpenderivat med den allmänna formeln no-T/Éätrno /” cno en / I LZU (Ia) no- _cnq J no í)\\cn ° 3 3 Föreliggande uppfinning ger även farmaceutiskt godtagbara salter av seskviterpenderivaten med den allmänna formeln (Ia), vilka erhålles genom omsättning av seskviterpenderivaten med den allmänna formeln (Ia) med ifrågavarande basiska föreningar. 7805606-6 Fig. l och 2 avser mikrofotografier av Stachybotrys complementi nov sp. K-76 med förmåga att producera föreningen med formeln (Ia) enligt uppfinningen; Fig. 3 är ett mikrofotografi av Stachybotrys complementi nov sp.
T-789; Fig. 4 är ett mikrofotografi av Stachybotrys echinata var.
T-791; Fig. 5 avser ett kärnmagnetiskt resonansspektrum av den före- ning med formeln Ia som erhålles i exempel l enligt uppfinningen; Fig. 6-8 avser kärnmagnetiska resonansspektra för den förening med formeln Ib enligt uppfinningen som erhålles i exempel 5, uppmätta i tre olika lösningsmedel; och Fig. 9 avser ett kärnmagnetiskt resonansspektrum för den förening enligt uppfinningen som erhålles i exempel 9.
Specifika exempel på seskviterpenderivat enligt uppfinningen anges i det följande. Uppfinningen är emellertid icke avsedd att begränsas till dessa specifika exempel. (1) 6,7-dihydroxi-2,5,5,8a-tetrametyl-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a- dekahydronaftalen-l-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxi-2',3'- dihydrobensofuran).
Förfaranda1för framställning av seskviterpenderivat enligt uppfinningen med formeln (I) beskrives närmare i det följande. l(a). Framställning av föreningar med den allmänna formeln (Ia) Seskviterpenderivaten med formeln (I) enligt uppfinningen kan framställas enligt olika metoder, alltefter typen av däri när- varande substituenter. Således kan exempelvis en förening med l 5 formeln (I), vari både R och R är väte, R2 och R3 är båda formyl och R4 och R6 är båda hydroxi, med den allmänna formeln Peer QUALITr 7805606-6 lIO- -CHO CUO CH ' (Ia) H0- CH3 HO CH3'CH3 framställas med användning av följande kända mikroorganismer tillhörande släket Stachybotrys, eller mikroorganismer av släktet Stachybotrys som nyligen isolerats i samband med utvecklingen av denna uppfinning.
Stachybotrys alternans IFO 9355, Stachybotrys chartarum IFO 5369, Stachybotrys chartarum IFO 7222, Stachybotrys cylíndrospora IFO 8858, Stachybotrys echinata IFO 7525, och V Stachybotrys reniformis IFO 7067.
De nyligen isolerade mikroorganismerna utgöres av nya stammar som tillhör släktet Stachybotrys, såsom beskrives i det följande, och de har benämnts Stachybotrys complementi nov sp. K-76 (i det följande angivna såsom Stachybotrys sp. K-76), Stachybotrys complementi nov sp. T-789 (i det följande angivna såsom Stachy- botrys sp. T-789),och Stachybotrys (Memmoniella) echinata var.
T-791 (i det följande angivna såsom Stachybotrys sp. T~79l).
(A) Förekomstort (l) Stachybotrys sp. K-76 Denna stam isolerades ur jord vid Ishigaki City, Okinawa, Japan. (2) Stachybotrys sp. T-789 Denna stam isolerades ur jord vid Naruto City, Tokushima, Japan- 7805606-6 (3) Stachybotrys sp. T-791 Denna stam isolerades ur jord vid Tokushima City, Tokushima, Japan.
(B) Karaktäristika för olika odlingsmedier (l) Stachybotrys sp. K-76 Odlingskaraktäristika för denna stam på olika odlingsmedier baserade på visuella och mikroskopiska observationer (fig. l och 2): (a) Visuell observation Mycket god tillväxt observerad på olika odlingsmedier som vanligen användes för odling av mögelsvampar, men adhesionen av fialosporer är icke nödvändighetsgod med undantag för på vetemjölsagarmedium. Odlingsbetingelserna för typiska medier visas i det följande. (i) Maltextrakt/agarmedium Tillväxten är relativt långsam och vid odling under 30 dagar vid 27°c bildas dn stor koloni med en storlek av 30-35 mm.
Kolonien tillväxer i cirkelform och koloniperiferien är i hög grad fransig. Ytan av kolonien är jämn och tjocka lufthyfer sträcker sig likt en cirkulär matta från koloniens centrum i tätt bestånd. Kolonien övergår så småningom från vitt i det tidiga odlingsstadiet till "light ivory“ (Li Ivory, 2ca). Två veckor efter odlingens början börjar en ringa mängd fialosporer bildas, men de kan knappast uppfattas med ögat. Sklerotium eller andra sexualsporogena organ bildas icke. Färgen på koloniens baksida varierar från färglös till "copper tan" (Copper Tan, Sie).
Ett “copper tan" (Copper Tan, Sie), lösligt pigment produceras. (ii) Potatisglukos/agarmedium Tillväxten är god och vid 30 dagars odling vid 27°C når kolonien en storlek av 45-47 mm. Kolonitillväxten är konvex vid koloniens centrum och koloniperiferien har en fransad form. Kolonien ger koncentriska cirklar eller veck som utgår från koloniens centrum.
Från det första odlingsstadiet täckes kolonien med ett tätt bestånd av vita till “pearl pink" (Pearl Pink, 4ca) hyfer. Allt- eftersom odlingen förlöper, blir färgen på kolonien "black gray“ (Gray, i). Ymniqa fialospormassor bildas. Stora mängder flytande POOR QUALITY 78056 06- 6 droppar observeras. Färgen på baksidan varierar från "rust tan' (Rust Tan, 5ie) till “light rose brown" (Li Rose Brown, 6 l/2 lg).
Ett bildat lösligt pigment har en "butter scotch" (Butter Scotch, 3ne) färg, men färgen är svag. (iii) Czapek-agarmedium Tillväxten är god och vid 30 dagars odling vid 2700 växer kolonien till en storlek av 40-45 mm. Kolonien uppvisar ett koncentriskt veck och har en upphöjning vid kolonicentret.
.Koloniens periferi är vågformig. Färgen på koloniens baksida är "luggage tan" (Luggage Tan, 4ne). Koloniytan uppvisar ett tunnt bestånd av färglösa till vita hyfer i koncentrisk form från den centrala delen, vilken icke täckes med lufthyfer med en “toast tan" färg (Toast Tan, 4 lg). Några flytande droppar observeras icke, men den centrala delen av kolonien är hygro- skopisk. Endast få om ens några fialosporer bildas. Det lösliga pigmentet är svagt och uppvisar en guldfärg (Gold, Zle). (iv) Havremjölsagarmedium Tillväxten är mycket snabb och vid 30 dagars odling vid 27°C uppnår kolonien en storlek av 60-70 mm. Kolonien är tunn och plan och från det första odlingsstadiet bildas färglösa till vita hyfer på koloniens hela yta. Uppresta hyfer, 3-4 mm, bildas endast vid den centrala delen av kolonien, men är icke täta. Två veckor efter odlingens början sprider sig vidhängande fialosporer över koloniens hela yta och koloniens färg övergår till "light olive drab" (Li Olive Dab, l li). Färgen på koloniens baksida är "beige brown" (Beige Brown, 3ig) till "tan" (Tan, 3ie).
Det producerade lösliga pigmentet är svagt "colonial yellow" (Colonial Yellow, Zca). (2) Stachybotrys sp. T-789 Odlingskaraktäristika för T-789-stammen, som tillhör Fungi imperfecti, på olika odlingsmedier observerades visuellt och mikroskopiskt (såsom visas i fig. 3) och de erhållna resultaten beskrives i det följande. De morfologiska karaktäristika för T-789-stammen vid mikroskopisk observation överensstämmer väl med dem för Stachybotrys sp. K-76. Det finns emellertid -. »ç-fïv-Iwß-.vyl 78Û5606~6 skillnader i egenskaper på odlingsmedier. På följande två medier, skiljer sig nämnda karaktäristika högst markant. (a) Visuell observation (i) Maltextrakt-agarmedium Tillväxten är mycket långsam och vid 30 dagars odling vid 27°C uppnår kolonien en storlek av 17-20 mm. Den perifera delen av kolonien tillväxer på ett vågformigt sätt och är begränsad vid centrum. Kolonien uppvisar en upphöjning och en radiell veckning på periferien av kolonien. Man finner ett tunnt be- stånd av hyfer som häftar fast vid hela ytanav kolonien.
Vid det ursprungliga odlingsstadiet är hyferna vita och konidier bildas så småningom. Den centrala delen av kolonien antager en "mole" färg (Mole, l), och konidierna tillväxer i ett tätt bestånd. Konidiebildningen är ringformig mot koloniens periferi.
Färgen på koloniens baksida är "cork tan" (Cork Tan, 4ie). Det lösliga pigmentet är ymnigt och är "amber" till färgen (Amber, 3le). (ii) Czapek-agarmedium Tillväxten är god och vid 30 dagars odling vid 27°C uppnås en storlek av 45 mm. Koloniens centrum är konvext och kolonien bildar ett radiellt veck. Den perifera delen av kolonien upp- visar en vågformig tillväxt. Ett tunnt bestånd av vita luft- hyfer finner man i en koncentrisk cirkulär form utåt från den centrala konvexa delen av kolonien. Konidier bildas koncen- triskt endast vid den perifera delen av kolonien. Hyferna före- ligger i upplöst tillstånd vid den konvexa delen och är mycket hygroskopiska. Färgen på baksidan av kolonien är "mustard brown" (Mustard Brown, Zpi). Något lösligt pigment bildas icke. (3) Stachybotrys sp. T-791 Odlingskaraktäristika för T-791, som tillhör Fungi imperfecti, på olika odlingsmedier baserade på visuella och mikroskopiska observationer (visade i fig. 4) är såsom följer: (a) Visuell observation (i) Maltextrakt-agarmedium 7805606-6 Tillväxten är snabb och oregelbunden. Färgen på koloniens bak- sida är "tan" (Tan, 3ie) till mörkbrun (Dk Brown, 2pn). Kolonien är plan och konidiebildningen är god. Färgen på hyferna är "biscuit" (Biscuit, Zec) till "tan" (Tan, 3ie) och exuderade flytande droppar observeras. Något lösligt pigment bildas icke. (ii) Potatisglukos-medium Tillväxten är mycket god och vid 30 dagars odling vid 27°C uppnår kolonien en storlek av 70 mm. Den perifera delen av kolonien sprider sig dendritiskt och vidhängande vita hyfer observeras. Ett stort antal flytande droppar är närvarande.
Knappast någon sporbildning observeras. Färgen på koloniens baksida är “light amber“ (Li Amber, 3ie). Något lösligt pigment bildas icke. (iii) Czapeks Dox-agarmedium Tillväxten är dålig. (iv) Syntetiskt slemagarmedium Tillväxten är dålig.
(V) Vetemjölsagarmedium Tillväxten är mycket god, varför petriskålen är täckt inom 2 veckor. Kolonien är tunn och plan. Bildning av hyfer är ymnig från första odlingssteget och även konidiebildníngen är snabb. Färgen på kolonien ändrar sig från vit till mörkbrun (Dk Brown, 3pn), allteftersom odlingen fortlöper. Stora mängder flytande droppar visar sig på hyferna. Något lösligt pigment bildas icke.
(C) Fysiologiska egenskaper Stachybotrys K-76, T-789 och T-791 är samtliga aeroba stammar och uppvisar följande fysiologiska egenskaper. (l) Stachybotrys sp. K-76 pg Temperatur T111växtbet1nge1ser= 3,5 ~ 11,5 15 - 35°c optimala ti11växtbet1nge1ser= 6,0 ~ 9,5 2o - 32°c 7805606- 6 (2) Stachybotrys sp. T-789 Tillväxtbetingelser: 3,5 - 11,5 15 - 38OC optmaia tiuväxtbetinqelser: 4,5 - 10,5 20 - 32% (3) Stachybotrys sp. T-791 T111växtbet1nge1ser= , - 11,5 15 - 38°c Optimala tillväxtbetingelser: , - 9,5 20 - 3OOC (D) Morfologiska egenskaper (1) Följande fakta framgår tydligt av Fig. l och 2. Sklerotium Stachybotrys sp. K-76 och andra sexuella reproduktiva organ observeras icke på de olika odlingsmedierna, men asexuella sporer av fialosportyp synes bildas.
Hyfer bildas på olika odlingsmedier, ger ett komplicerat gren~ system och sträcker sig longitudinellt och transversalt med en hyfbredd av 2-4/L.
Fialosporer grenar sig på ett enkelt sätt från hyferna (ingen grenbildninq från den ena fialoforen till den andra) och har 3-4 septa från fotcellerna vid basdelen, de sträcker sig upp- rätt eller något kurvformigt. Fialoforens hyfbredd är 4,3 till 4,7fiLvid basdelen och 3,6 till 4,5u,vid den centrala delen.
Fialoforens toppar är något ansvällda och från de extrema ändarna av fialoforen sträcker sig 3-7 ellipsoida till obklavata fialider med ensxorlek av 7,9f9,3 x 3,6-4,7¿L. Fialiden är jämn och har en färg från färglös till svagt gulaktigt brun.
Fialosporerna bildas basipetalt förenade från fialidens ändar.
Fialosporerna bildar icke raka kedjor, utan bildar slemmiga hängande små halvcirkulära massor i ett antal av 7-26. Fialo- foren är subglobos till oval med en storlek av 4,9-8,0 x 3,3 - 4,7/L och fialoforens ytor är ojämna till vårtformiga och fialoforens färg varierar från "dark ivy" (Dk ivy 24po) till gråaktigt svagt. Något membran på grund av slemhaltigt material visar sig icke på fialospormassorna. wššoaatounnxw? u 78056 06-6 10 Den taxonomiska statusen för föreliggande stam med nämnda mikrobiologiska egenskaper har undersökts av G.L. Barron, The Genera of Hyphomycetes from Soil, The Williams & Wilkins Company, Baltimore (1968), J.C. Gilman, A Manual of Soil Fungi, The Iowa State University Press, Ames, Iowa (1971) och J.A., von Arx, The Genera of Fungi Sporelating in Pure Culture, Verag von J. Cremer 3301 Lehre (1970). Enligt Saccardos taxono- miska system tillhör föreliggande stam klassen Hyphomycetes, familjen Dematiaceae, släktet Stachybotrys. Med andra ord karaktäriseras egenskaperna av föreliggande stam av frånvaron av askokarper och andra sexuella reproduktive organ, bildningen av mörkbruna fialosporer från fialider och ansamling av de bildade fialosporerna i en halvcirkulär form vid de extrema ändarna av fialiderna, vilka egenskaper väl överensstämmer med egenskaperna av släktet Stachybotrys.
De olika karaktäristika för föreliggande stam har identifierats på basis av nämnda forskningsmanualer och litteraturreferenser, såsom G.R. Bisby Trans. Brit. Mycol. Soc., EQ, 133-132 (l943), R.K. Zuck, Mycologia, §§, 69-76 (1946), G.L. Barron, Can. J. Bot., åâ, 153-157 (l96l) och i jämförelse med de typstammar som är deponerade vid Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO).
Såsom en följd därav har föreliggande stam K-76 bedömnts mest likna-Stachybotrys lobulata IFO 5369 på grund av att fialo- sporerna av föreliggande stam K-76 uppvisar en ojämn till vårt- formig förhöjning och är ovala till ellipsoida. Skillnader före- kommer emellertid genom att Stachybotrys lobulata har en fialo- for som uppnår en storlek av l mm och medan K-76-stamnen uppvisar enkel förgrening har Stachybotrys lobulata den egenskapen att en annan fialofor utgrenar sig och sträcker sig ut från en fialo- for. Med hänsyn till tillväxten på olika odlingsmedier producerar K-76-stammen en stor mängd lösligt pigment och konidiebildningen är mycket dålig på agarmedier med undantag för på potatisglukos- agarmedium och havremjölsagarmedium. Å andra sidan tillväxer Stachybotrys lobulata mycket hastigt på olika odlingsmedier och en veckningsfri plan koloni bildas. Konidiebildningen är 7805606-6 ll god på nästan samtliga medier med undantag för Czapeks Dox-agar- medium för typifiering av koloniens färg. Något lösligt pigment bildas icke eller produceras endast i mycket ringa omfattning.
På basis av nämnda skillnader har föreliggande stam K-76 bedömts vara en ny stam som skiljer sig från Stachybotrys lobulata och föreliggande stam har benämnts Stachybotrys sp. K-76. (2) Stachybotrys sp. T-789 Från fig. 3 finner man följande fakta. Denna stam har i huvudsak samma morfologi som Stachybotrys sp. K-76, ehuru det föreligger viss skillnad beträffande kolonistorleken.
På samma sätt som hos Stachybotrys sp. K-76 har nämnda mikro- biologiska egenskaper jämförts med ovan nämnda forsknings- manualer och litteraturreferenser och med IFO-typstammar.
Denna stam har således visat sig mest likna Stachybotrys lobulata IFO 5369 och Stachybotrys sp. K-76. Föreliggande stam uppvisar god bildning av fialosporer på Czapeks agarmedium. Bildningen av fialosporer på Czapeks Dox-agarmedium är emellertid knappast märkbar för de båda första stammarna. Detta innebär en skillnad vid odlingen.
Såsom nämnts i samband med Stachybotrys sp. K-76 skiljer sig de morfologiska egenskaperna för föreliggande stam tydligt från Stachybotrys lobulata. Vidare ligger det optimala tillväxt- pH-intervallet för föreliggande stam vid pH 4,5-10,5. Även i detta fall skiljer sig således föreliggande stam från K-76- stammen.
Av nämnda skäl har man därför ansett att föreliggande stam utgör en ny stam, vilken benämnes Stachybotrys sp. T-789. (3) Stachybotrys sp. T-791 Följande data framgår av fig. 4. Fialoforerna grenar sig på ett enkelt sätt och står upprätta. Fialofortopparna föreligger i en något ansvälld stavform. Ansvällningen är emellertid icke 7805606-6 12 så stor som observeras hos typstammarna av Stachybotrys echi- nata IFO 7525 och 8856. Denna stam.uppvisar en hyfbredd av 4,0-4,5;¿, vilket är något större än för fialoforen. Fíaloforerna som grenar sig upprätt med fotceller från vegetativa hyfer eller lufthyfer med 2-3 septa och har en storlek 40-80 x 3,0- 3,5¿¿. Fialoforens cellvägg är icke taggiq, utan jämn. 3-6 fialider bildas från den ansvällda delen av fialofortopparna.
Vidare bildas sfäriska till subglobosa fialosporer på en cell med en taggig upphöjning och en storlek av 4,3-5,2 x 3,0-4,2/4 kontinuerligt och basipetalt vid topparna av fialiden och en kedja av 24-70 konidier bildas. Fialiden uppvisar en obklavat form och har en storlek av 6,9-10,7 x 3,5-4,7;¿. Fialoforerna och fialiden är färglösa och fialiden uppvisar en kaffefärg (Coffee, 3pn) till svart färg.
Den taxonomiska statusen av föreliggande stam med nämnda mikro- biologiska egenskaper undersöktes med hjälp av de forsknings- manualer som nämnts ovan i samband med K-76-stammen. Såsom en följd därav fann man att föreliggande stam tillhör släktet Stachybotrys (släktet Memmoniella). Specifikt uppvisar före- liggande stam icke några askokarper eller andra sexuella repro- duktiva organ och mörkbruna fialosporer bildar kontinuerligt från fialiden. Långa kedjor av sporer bildas. Egenskaperna av föreliggande stam T-791 överensstämmer med dem av släktet Stachybotrys (släktet Memmoniella).
De olika egenskaperna av föreliggande stam har undersöktes med hjälp av nämnda forskningsmanualer och litteraturreferenser, såsom R.K. Zuck Mycologia, gå, 69-76 (1964) och G. Smith, Trans.
Brit. Mycol. Soc., gå, 387-394 (1962) och jämförts med de typ- stammar som är deponerade hos IFO. Såsom en följd därav har man bestämt att eftersom fialosporer bildas kontinuerligt och basipetalt från fialiden tillhör stammen T-791 Memmoniella echinata benämnd av Höhnel. Från rapporterna av R.K. Zuck och G. Smith supra, ansågs emellertid föreliggande stam T-791 vara en stam analog med Stachybotrys echinata. Den jämfördes därför med Stachybotrys echinata IFO 7525 och IFO 8856. 78056Û6~6 13 Morfologiskt observeras taggiga upphöjningar specifika för de båda typstammarna icke på cellväggarna av fialoforerna i före- liggande stam T-791. I typstammarna är vidare topparna av fialo- forerna ansvällda till 2-3 gånger hyfbredden av fialoforerna, men någon markant ansvällning observeras icke hos föreliggande stam. Vidare uppvisar de båda typstammarna god tillväxt på olika odlingsmedier, speciellt på potatisglukos-agarmedium, och bildar církulära, något upphöjda kolonier och hyfer bildas ymnigt. Vidare uppkommer en iögonenfallande konidiebildning.
I motsats därtill uppvisar föreliggande stam en dendritisk oregelbunden tillväxt, såsom nämnts ovan, och dålig hyfbildning och dålig konidiebildning. På grund av nämnda mikrobiologiska skillnader har föreliggande stam ansetts vara en ny stam, vilken benämnts Stachybotrys sp. T-791.
Indikationen av färgerna ovan och i det följande är i överens- stämmelse med den metod som beskrives i Color Harmony Manual, Container Corporation of America (1958).
Proverna på de nya stammarna, Stachybotrys sp. K-76, Stachybotrys sp. T-789 och Stachybotrys sp. T-791, har deponerats hos Fermenta- tion Research Institute, Agency of Industrial Science and Techno- logy, Japan under deponeringsbeteckningarna FERM-P nr. 3801, FERM-P nr. 3802 resp. FERM-P nr. 3803. l(b) Produktion av en förening med den allmänna formeln (Ia) med mikroorganismer av släktet Stachybotrys Det ovan beskrivna förfarandet för framställning av föreningen med formeln (Ia) med mikroorganismer av släktet Stachybotrys utföres på följande sätt.
Mikroorganismerna odlas först i ett medium, innehållande sed- vanliga näringskällor och additiv. Såsom odlingssubstrat van- ligen använda kvävekällor omfattar exempelvis sojapulver, sojaolja, majsstöpsvatten, jästextrakt, torkad jäst, havremjöl, köttextrakt, hydrolyserat kasein, ammoniumsalter och nitrat- EBB-*áfiwgmiflï 7805606-6 14 salter. Exempel på lämpliga kolkällor är glukos, glycerol, maltos, stärkelse, laktos, sackaros och melass. Exempel på additiv till odlingsmediet omfattar oorganiska salter, såsom kalciumkarbonat, natriumklorid och magnesiumsulfat, och fosfor- syra. Om så erfordras kan odlingsmediet innehålla ytterligare små mängder av salter av metaller, såsom av järn, koppar, mangan och zink. Odlingen kan utföras i ett ordinärt vatten- medium, innehållande nämnda substrat, med användning av en ytodlingsteknik eller en submersodlingsteknik med luftning och omröring. Submers odling med luftning och omröring är lämpligast. Odlingen kan med fördel utföras vid en temperatur av ungefär 15-35°C, företrädesvis 20¿32°C, under en tidrymd av vanligen ungefär 3-7 dagar under normala luftningsbetingel- ser, medan pH i odlingsmediet upprätthålles vid ungefär 3,5- ll,5, företrädesvis 4,5-9,5.
Efter odlingen tillvaratages den producerade substansen i odlingsvätskan. Isoleringsmetoden är icke särskilt kritisk och olika kända metoder på basis av de fysikalisk-kemiska egenskaperna av de producerade substanserna kan användas.
Tillvaratagandet kan utföras exempelvis enligt en metod på basis av skillnaderna i löslighet mellan produkterna och föroreningarna, en metod på basis av skillnaderna i adsorptions- kraft och affinitet för sedvanliga adsorbenter, såsom aktivt kol, silikagel, jonbytarhartser eller Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals), en metod på basis av skillnaderna i fördelninge- koefficienten mellan två flytande baser eller en kombination av sådana metoder.
Närmare bestämt filtreras odlingsvätskan eller centrifugeras på konventionellt sätt för eliminering av cellerna. Metanol sättes sedan till den överstående vätskan och blandningen omröres och förvaras 2-3 timmar. Fällningen avlägsnas medelst en ytterligare separering i Centrifug. Återstoden extraheras med en lika stor volymmängd etylacetat och lösningsmedlet avdestilleras. Extraktet nedföres i metanol och metanollösningen föres igenom en pelare av aktivt kol och lösningsmedlet avdestilleras från eluatet. Återstoden gelfiltreras med användning av Sephadex LH-20. 15 De bildade fraktionerna underkastas vardera ett test avseende antikomplementär aktivitet, som beskrives i det följande.
Aktiva fraktioner tillvaratages och lösningsmedlet avdestilleras.
På så sätt kan man således isolera ren 6,7-dihydroxi-2,5,5,8a- -tetrametyl-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydronaftalen-1-spiro-2'- -(6',7'-diformyl-4'-hydroxi-2',3'-dihydrobensofuran) med formeln (Ia).
Exempel på basiska föreningar som kan användas för framställning av salterna av seskviterpenderivaten med formeln (Ia) omfattar hydriderna och karbonaterna av alkalimetaller och jordalkali- metaller, såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, kalciumhydroxid, natriumkarbonat, kaliumkarbonat och natriumvätekarbonate Organiska aminer, såsom metylamin, etylamin, isopropylamin, morfolin, pipera- zin, piperidin och 3,4-dimetoxifenetylamin, kan även användas såsom basiska föreningar.
Saltbildning med användning av basiska föreningar kan med lätthet utföras i ett lämpligt lösningsmedel med tillämpning av konven- tionell saltbildningsteknik. Exempel på lämpliga lösningsmedel är vatten, lägre alkoholer, såsom metanol, etanol och propanol, etrar, såsom dioxan och tetrahydrofuran, aceton, bensen, etyl- acetat, dimetylsulfoxid, dimetylformamid, metylenklorid och kloroform. Saltbildning kan utföras vid en temperatur från rumstemperatur till ungefär 100°C, företrädesvis mellan rums- temperatur och 5000, under ungefär 5 minuter till ungefär 6 timmar, vanligen i kontakt med atmosfären eller under syrefria betingel- ser, företrädesvis i en atmosfär av en inert gas, såsom kväve eller argon. Mängden använd basisk förening är icke särskilt kritisk, men man använder lämpligen en mängd av minst ungefär l ekvivalent, företrädesvis 1-2 ekvivalenter, räknat på de sura grupperna i utgângsföreningen (I).
När de ovan beskrivna reaktionerna avslutats, kan den önskade slutliga föreningen med lätthet separeras och renas med tillämp- ning av kända konventionella separationsprocedurer. Således kan man exempelvis utföra destillation av lösningsmedel, lösnings- v-»m-...m POOR QUFLLETÉÉ 78056 06- 6 16 medelsextraktion, utfällning, omkristallisation, pelarkromato- grafering och preparativ kromatografering såsom separations- metoder.
III. Terapeutiska medel De bildade seskviterpenderivaten med formeln (Ia)och salterna därav enligt uppfinningen är värdefulla såsom medel för behandling av nefrit och vid användning såsom nefritbehandlingsmedel be- redes de i farmaceutiska kompositioner tillsammans med sedvanliga pfarmaceutiskt godtagbara bärare. Lämpliga bärare är exempelvis utspädningsmedel eller excipienter såsom fyllmedel, utdrygnings- medel, bindemedel, vätmedel, desintegreringsmedel, ytaktiva medel och smörjmedel, som vanligen användes för framställning av sådana medel, alltefter doseringsformen.
Olika doseringsformer av de terapeutiska medlen såsom nefrit- behandlingsmedel kan väljas med hänsyn till den avsedda terapin.
Typiska doseringsformer som kan användas omfattar tabletter, piller, puder, flytande preparat, suspensioner, emulsioner, granuler, kapslar, suppositorier och injicerbara preparat (lös- ningar, suspensioner, etc.).
Vid beredning av en farmaceutisk komposition, innehållande seskviterpenderivatet med formeln (Ia) eller ett farmaceutiskt godtagbart salt därav såsom aktiv komponent, i tablettform, kan ett flertal olika kända bärare användas. Exempel på lämpliga bärare omfattar excipienter, såsom laktos, vitt socker, natriumklorid, glukoslösning, karbamid, stärkelse, kalciumkarbo- nat, kaolin, kristallin cellulosa och kiselsyra, bindemedel, såsom vatten, etanol, propanol, enkel syrup, glukos, stärkelse- lösning, gelatinlösning, karboximetylcellulosa, shellack, metyl- cellulosa, kaliumfosfat och polyvinylpyrrolidon, desintegrerings- medel, såsom torkad stärkelse, natriumalginat, agarpulver, laminariapulver, natriumvätekarbonat, kalciumkarbonat, Tween , natriumlaurylsulfat, stearinsyramonoglycerid, stärkelse och laktos, desintegreringsinhibitorer, såsom vitt socker, stearin- syraglycerylester, kakaosmör och hydrerade oljor, absorptions- promotorer, såsom kvaternära ammoniumbaser och natriumlauryl- sulfat, humektanter, såsom glycerol och stärkelse, adsorberings- medel, såsom stärkelse, laktos, kaolin, bentonit och kolloidal 78056 06-6 17 kiselsyra, och smörjmedel, såsom renad talk, stearinsyrasalter, borsyrapulver, "Macrogol" (en polyetylenglykol framställd av Shinetsu Chemical Industry Co., Ltd.) och fast polyetylenglykol.
Vid beredning av den farmaceutiska kompositionen i tablettform kan ett flertal olika konventionella bärare användas. Exempel på lämpliga bärare är excipienter, såsom glukos, laktos, stärkelse, kakaosmör, härdade vegetabiliska oljor, kaolin och talk, binde- medel, såsom gummi arabikumpulver, dragantpulver, gelatin och etanol, och desintegreringsmedel, såsom laminaria och agar.
Tabletterna kan eventuellt beläggas för bildning av sockerbelagda tabletter, gelatinbelagda tabletter, enteriskt belagda tabletter, filmbelagda tabletter eller tabletter belagda med två eller flera skikt.
Vid beredning av den farmaceutiska kompositionen i suppositorie- form kan ett flertal olika kända bärare användas. Exempel på lämpliga bärare omfattar polyetylenglykol, kakaosmör, högre alko- holer, estrar av högre alkoholer, gelatin och halvsyntetiska glycerider.
När den farmaceutiska kompositionen beredes i form av ett injicerbart preparat, steriliseras företrädesvis den bildade lösningen och suspensionen och göres isotona i förhållande till blod. Vid beredning av de farmaceutiska kompositionerna i form av en lösning eller suspension kan man använda allmänt kända utspädningsmedel. Exempel på lämpliga utspädningsmedel är vatten, etylalkohol, propylenglykol, etoxylerad isostearyl- alkohol, polyoxietylensorbitol och sorbitanestrar. Natriumklorid, glukos eller glycerol kan införlivas med ett terapeutiskt medel, såsom i form av ett nefritbehandlingsmedel i en mängd tillräcklig för beredning av isotona lösningar. Det terapeutiska medlet kan vidare innehålla sedvanliga upplösningshjälpmedel, buffertmedel, smärtlindrande medel och konserveringsmedel, och eventuellt färg- ämnen, parfymer, aromämnen, sötningsmedel och andra terapeutiska medel.
'Poon QUzxLITYJ 78056 06- 6 18 Den mängd av föreningen med formeln(Ia) och de farmaceutiskt godtagbara salterna därav enligt uppfinningen såsom aktiv komponent att införlivas i en farmaceutisk komposition användbar såsom ett nefritbehandlingsmedel är icke speciellt kritisk och kan variera inom ett brett intervall. En lämplig terapeutiskt effektiv mängd av föreningen med formeln (Ia)och de farmaceutiskt godtagbara salterna därav enligt uppfinningen är vanligen ungefär l-70 viktprocent, företrädesvis 5-50 viktprocent, räknat på hela kompositionen.
Det föreligger icke någon speciell begränsning av det sätt på vilket man använder det terapeutiska medlet såsom nefritbehand- lingsmedel och det terapeutiska medlet kan administreras enligt metoder lämpliga för de speciella formerna av det terapeutiska medlet. Således kan exempelvis tabletter, piller, flytande preparat, suspensioner, emulsioner, granuler och kapslar admini- streras oralt. De injicerbara preparaten administreras intra- venöst, antingen separat eller tillsammans med sedvanliga hjälp- medel, såsom glukos och aminosyror. Om så erfordras kan vidare det terapeutiska medlet separat administreras intramuskulärt, intakutant, subkutant eller intraperitonealt. Suppositorier administreras intrarektalt.
Doseringen av nefritbehandlingsmedlet väljes lämpligen med hän- syn till användningsändamålet, symtomen, etc. En särskilt lämplig dosering av föreningen enligt uppfinningen är vanligen ungefär 0,5 till 20 mg/kg kroppsvikt och dag i enkeldoser eller multipel- doser.
Föreningarna enligt uppfinningen uppvisar antikomplementär aktivitet och är användbara såsom terapeutiska medel vid autoimmuna sjukdomar, kollagensjukdomar och reumatiska sjukdomar, vilka omfattar ett komplementsystem.
Resultaten av tester avseende de farmakologiska effekterna av föreningarna enligt uppfinningen med den allmänna formeln (ia) och de farmaceutiskt godtagbara salterna därav sammanställes i det följande. 78056 06-' 6 19 (1) Testad förening Ho-/š I [ÜÜÜ J? cno / .
CH3/ X0 (Ia) 110.? / -cin 3 no \ 3 C113 (2) Antikomplementär aktivitet Den antikomplementära aktiviteten uppmättes och bekräftades enligt den testmetod som beskrives av Meneki Kagaku (Immuno- Chemistry), Yuichi Yamamura et al., Ed. p. 830-834, Asakura Shoten, Tokyo, Japan (1973). Specifikt chargerades ett provrör med 0,5 ml av en vattendispersion av vardera av testföreningarna, 0,5 ml sensibiliserade erytrocyter (EA) innehållande l x 108 celler/ml, l ml av en 5-faldig utspädd lösning av en veronal- buffertlösning, innehållande gelatin, Ca++ och Mg++ (GVB++), och 0,5 ml komplementserum (marsvinskomplement), utspätt till 150 gånger med GVB++. Blandningen upprätthölls 60 minuter vid 37°C. Därefter tillsattes 5 ml av en iskyld fysiologisk natrium- kloridlösning och blandningen centrifugerades. Absorbansen i den avskilda överstående vätskan uppmättes vid 0D4l3och den grad i vilken testföreningen inhiberade hemolysen av de sensi- biliserade erytrocyterna bestämdes. Värdet på 50 % hemolys- inhiberande aktivitet (y/ml) uppmättes enligt nämnda metod, såsom visas i tabell II för varje testförening. ~f.~.._,;,,_ P-”WW nïïnfg ha' XÄÃÄ. så md, _-__¿'_l¿ TY 13056Û6~6 20 L3}-Akut toxicitet LÛ50°Väråenä (mä/kg) av testföreningarna vid intravenös admini- stration på mus uppmättes och de erhållna resultaten visas i tabell II.
Tábell II Förening Anti-komplement- LD50-värde (mg/kg) aktivitetsvärde (77ml) Enl- upp- 10 i 40 finningen Klorofyllin 40 0 -~ (4) Terapeutisk effekt på nefrit av nefrotoxin-typ KRåttnefrotoxin ("NT" förkort.) erhölls på i det följande be- skrivet sätt. Njurbark från råtta homogeniserades med en lika stor mängd fysiologisk natriumkloridlösning. Den homogeniserade lösningen blandades med Freunds fullständiga adjuvant (en pro- dukt från Difco Company) i ett volymförhållande av l:l. Två ml av den bildade blandningen injicerades intramuskulärt på en kanin (kroppsvikt 3.100 g) för immunisering därav. 1,5 månader senare uttogs blod från kaninens hjärta och serum erhölls.
Det erhållna serumet inaktiverades 30 minuter vid 56°C, utsaltades med en 40%-ig mättad vattenlösning av ammoniumsulfat och fraktionerades. 7=globulin (IgG)-fraktionen tillvaratogs för erhållande av NT.
Utvärderingen utfördes med användning av Wistar-hanråttor med en kroppsvikt av 150-160 g med tre replikationer för varje test- förening. Testföreningen administrerades intraperitonealt var 24:e timme under 7 dagar. l timme efter administrationen av testföreningen på den tredje dagen tillfördes NT. NT injicerades intravenöst i en mängd av l ml vid svansvenen på varje råtta.
Klorofyllin (CP) användes såsom jämförelseförening och fysiologiskt natriumkloridlösning användes såsom kontroll. 7805606-6 21 Proteinkarbamidnivån (total mängd utsöndrad i urinen under en period av 24 timmar) uppmättes turbidometriskt med användning av bovint serumalbumin såsom kontroll med hjälp av sulfosalicyl- syra.
De erhållna resultaten anges i tabell III.
Tabell III Förening Dos Replika- Dagantal* (mg/råtta)tionstal L 2 1 ig 1 2.5** 1.5 0.8 8 __ _ 2 4.3 2.1 1.8 10 Forenlngen 3 enligt uppfin- 3 1-7 1-1 0-9 7 ningen medeltal 2.8 1.6 1.2 8 1 Zß L5 W9 C 2 4.4 'rm 1.7 s Klorfyllin 5 _ _ (jämförelse) 3 .LZ 2.1 3.5 6 medeltal 3.4 2.1 2.0 8 l 13 16 21 29 2 19 23 25 35 (Kontroll) a 11 is va ao 23 35 medeltal 16 19 *Daqantalet i tabell III räknas från tidpunkten för administra- tionen av testföreningen, vilken var l timme före applikationen av NT **Mängden proteinkarbamid anges i enheter av mg/dag.
. “I 7805606-6 22 Proteinkarbamidnivån hos en frisk råtta är 0,5 till 5 mg/dag.
Här proteinkarbamidnivån överstiger denna nivå, särskilt när proteinnivân ligger högre än 10 mg/dag, kan man med säkerhet säga att nefrit uppkommit. Såsom framgår av resultaten i tabell III uppkom nefrit i kontrollgruppen och vad beträffar före- ningarna enligt uppfinningen och CP, var mängden proteinkarbamid från tidpunkten för administration av NT till 10 dagar efter administrationen i huvudsak densamma som den hos en frisk råtta.
Administrationen av föreningarna enligt uppfinningen inhiberar således primära och sekundära immunreaktioner. (5) Terapeutiska effekter på nefrit av Heymann-typen Wistar-hanråttor med en kroppsvikt av 180-200 g användes vid testet. Njurbark från råtta extraherades och homogeniserades med en lika stor volymmängd fysiologisk natriumkloridlösning.
Homogenatet centrifugerades vid lS0O G under en timme. Den över- stående vätskan renades enligt metoden beskriven av T.S. Edgington et al., Journal of Experimental Medicine, lgl, 555 (1968), och blandades med Freunds fullständiga adjuvant 37 Ra (en produkt från Difco Company) i ett volymförhållande av O,4:l. Den er- hållna blandningen injicerades intraperitonealt till isologa råttor i en mängd av 0,5 ml per råtta. Därefter administrerades sama mängd adjuvant var annan vecka, tills proteinkarbamid- nivån översteg 100 mg/dag. (Denna period var ungefär 6-8 veckor.) Testföreningen administre- rades intraperitonealt till råttor behäftade med nefrit av Hey- mann-typen (med en kroppsvikt av 300-350 g) varje dag under 7 dagar och mängden proteinkarbamid (mg/dag) uppmättes på samma sätt som beskrivits ovan. CP användes såsom jämförelseförening och fysiologisk natriumkloridlösning användes såsom kontroll.
Tre replikationer utfördes på varje testförening. De erhållna resultaten sammanställes i tabell IV. 78056 06-6 23 Tabell IV Dagantal Dos Replika- Före Fören'ng (' tl°nS_ ' ' 1 rïïéa EÉí_____ ._______ _Ä_ _í_ _1_ _11” _ÃÄ_ Föreningen 1 9 s 90 4 7 17 9 10 enligt 3 _ uppflnninqen 2 1 3 z 12 s ss s s 1 s 1 2 s 121 120 70 27 10 0 Medeltal 110 111 61 20 11 10 1<1orfy111n 1 123 116 72 32 10 10 (jämf.) Z 117 108 03 29 12 8 s 3 129 121 sz 22 15 13 medeltal 123 115 sz 2s 14 10 1 135 127 132 13.0 114 120 (xontron) ' z 121 105 121 103 105 109 s 137 117 1ss 121 100 12.2 Medeltal 131 116 129 119 109 122 i 2-3 veckor efter testningen början ökade kroppsvikterna hos råttorna till 400-500 g och normala proteinkarbamidnivåer ansågs ligga vid 5-15 mg/dag. Såsøm framgår av resultaten i tabell IV kan föreningar enligt uppfinningen kurera nifrit av Heymann-typen.
PO G12 QUALITY: . - H1,- ' f.1:y;-.'m-| f? 78056Û6~ 6 24 Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande exempel, vari de angivna temperaturerna avser Celsius-grader. Däri be- skrives närmare i detalj framställningen av föreningarna enligt uppfinningen med den allmänna formeln (I) och produktionen av nefritbehandlingsmedel, innehållande föreningar enligt upp- finningen med den allmänna formeln (I) såsom aktiv komponent beskrives i följande referensexempel. Såvida icke annat anges avser samtliga delar, procenttal, förhållanden och liknande vikten och med uttrycket "rumstemperatur" avses häri 15-2500.
Exempel l.
En 500 ml-Sakaguchi-kolv chargerades med 100 ml av ett odlings- medium med följande sammansättning och Stachybotrys sp. K-76 odlades under 4 dagars skakning vid 28° och ett pH av 6.
Sammansättning av odlingsmediet: (%) Glycerol I 0,5 Stärkelse 1,0 Laktos 0,2 Sojapulver 0,5 Jästextrakt 0,l Maltextrakt 0,2 CaCO3 O ,3 MgS04 7 0,05 En 30-liters fermentor av kruktyp chargerades med 20 liter av ett odlingsmedium med nämnda sammansättning och en kolv av den erhflälna groddkulturer odlades i odlingsmediet under 5 dagars omröring vid 280 med en hastighet av 400 varv/minut och en luftningshastighet av l liter/liter odlingsmedium per minut. Den erhållna odlingsvätskan centrifugerades med en hastig- het av 8000 varv/minut för eliminering av de mikrobiella cellerna.
Den överstående vätskan försattes med 5 liter metanol och bland- ningen omrördes och förvarades sedan 3 timmar. Blandningen centri- fugerades och det fasta materialet avlägsnades. Den överstående vätskan extraherades med en lika stor volymmängd etylacetat. Lös- ningsmedlet i etylacetatskiktet avdestillerades under reducerat tryck. Återstoden löstes i metanol och fördes genom en pelare av aktivt kol. Eluatet konoentrerades till torrhet under reducerat *a 'lf-- .I 78056 06- 6 25 tryck. Den torkade massan löstes i en blandning av kloroform och etylacetat (l:l, volym) och gelfiltrerades genom en pelare av Sephadex LH-20. Filtratet underkastades tunnskiktskromatografering [med användning av en blandning av etylacetat, kloroform och ättiksyra (volymförhållande 50:50:2) såsom framkallninqslösnings- medel] och en fraktion med anti-komplementär aktivitet motsvarande Rf = 0,34 tillvaratogs. Alternativt underkastades filtratet tunn- skiktskromatografering [med användning av en blandning av bensen, butanol och ättiksyra (volymförhållande 60:l5:5) såsom framkall- ningslösningsmedel] och en fraktion med anti-komplementär aktivitet motsvarande Rf = 0,58 tillvaratogs. Avdunstning av lösningsmedlet från fraktionen gav 2,0 g 6,7-dihydroxi-2,5,5,8a-tetrametyl- -1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydronaftalen-1-spiro-2'-(6',7'-di- formyl-4'-hydroxi-2',3'-dihydrobensofuran), en ljusgul, svagt sur substans med anti-komplementär aktivitet. Produktionen av denna förening bekräftades av följande fysikalisk-kemiska karak- täristika: (1) [a]šO = -480 (C = 2,5, metanol) (2) Elementaranalys: C23H3OO6 Beräknat: C 68,64 H 7,51 % Funnet: C 68,58 H 7,55 % (3) UV-spektral analys: etanol = 246 nm (6 = 16474) 1 = 307 nm (¿,= 6659) max (4) NMR-spektral-analys: NMR-analys utfördes med användning av pyridin-ds [natrium-2,2- dimetyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) såsom inre standard] såsom lösningsmedel. Det erhållna NMR-mönstret visas i fig. 5. ï?c){>ïš QÉÄJÅ' .a fiIILïL' IJ 7805606- 6 NMR-mätningsbetingelserna var följande: Spektralamplitud: 4 x 100 filæn mlsfl.
RF-"output": 0,5 mG Sveptid: f 5 minuter Svepbredd: 10 ppm Svepslut: 0 ppm Exempel 2.
En 500 ml Sakaguchi-kolv charqerades med l0O ml av ett odlings- medium med följande sammansättning och Stachyhotrys chartarum IFO 5369, en känd stam, odlades i mediet under 4 dagars skakning vid 280 och ett pH av 6.
Sammansättning av odlingsmediet: (%) Glycerol _ o , 5 Stärkelse 1,0 Laktos _ 0,2 Sojapulver 0,5 Jästextrakt 0,1 Maltextrakt 0,2 CaCO3 0,3 Mgso4 o , 05 En 30-liters fermentor av kruktyp chargerades med 20 liter av ett odlingsmedium med nämnda sammansättning och två kolvar av den bildade groddkulturen odlades under 5 dagars omröring vid 280 vid en hastighet av 30 varv/minut och en luftningshastig- het av 1 liter per liter av mediet per minut. Den erhållna odlingsvätskan centrifugerades med en hastighet av 8000 varv/ minut för eliminering av de mikrobiella cellerna. Den över- stående vätskan försattes med 5 liter metanol och blandningen om- rördes och förvarades sedan 3 timmar. Blandningen centrifugerades och-det fasta materialet avlägsnades. Den överstående vätskan extraherades med en lika stor volymmängd etylacetat. Lösnings- medlet i etylacetatskiktet avlägsnades under reducerat tryck för koncentrering till torrhet. Återstoden löstes i metanol och fördes genom en pelare av aktivt kol. Eluatet koncentrerades till torrhet under reducerat tryck, löstes i en blandning av kloroform och etylacetat (lzl, volym) och gelfiltrerades genom 7805606-6 27 en pelare av Sephadex<š)LH-20. Fraktionerna med aktiva toppar motsvarande tunnskiktskromatograferings-Rf-värdena angivna i exempel 1 tillvaratogs. Avdunstning av lösningsmedlet gav 2,2 g (6,7-dihydroxi-2,5,5,8a-tetrametyl-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a- -dekahydronaftalen-l-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxi-2',3'- -dihydrobensofuran), en ljusgul, svagt sur substans med anti- komplementär aktivitet. Denna förening uppvisade samma fysikalisk- kemiska karaktäristika som den i exempel l beskrivna och produk- tionen av denna förening bekräftades på basis av dessa karaktäris- tika; Exemgel 3.
Stachybotrys sp. T-789 odlades och renades på samma sätt som i exempel l, men med det undantaget att man använde ett odlings- medium med följande sammansättning, inställt på pH 7,5, och odlingstemperaturen upprätthölls vid 320.
Sammansättning av odlingsmediet: (%) Glycerol 0,5 Glukos l,2 , Majsstöpsvatten 0,5 Torkad jäst 0,1 Maltextrakt 0,2 MgS04 0,05 NaCl 0,3 På så sätt erhöll man 6,7-dihydroxi-2,5,5,8a-tetrametyl-l,2,3, 4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydronaftalen-l-spiro-2'-(6',7'-diformyl- -4'-hydroxi-2',3'-dihydrobensofuran), en ljusgul, svagt sur substans med anti-komplementär aktivitet. De fysikalisk-kemiska egenskaperna av denna förening överensstämde med dem av den förening som isolerades och renades enligt exempel l.
Exemgel 4.
Stachybotrys sp. T-791 odlades och renades på i exempel l angivet sätt, men med det undantaget att man använde ett odlingsmedium med följande sammansättning, inställt på pH 5,5, och odlingstemperaturen upprätthölls vid 250.
'PI ï?c>()Éš c:\§IÄ3Ä1 . 7805606-6 28 (%) Sammansättning av odlingsmediet: Glycerol 0,5 § stärkelse 1.0 “ Sackaros 0,2 i Sojapulver 0,5 Pepton 0,1 Maltextrakt 7Q,2 MQSO4 0:3 Hgcl 0,05 På så sätt erhöll man 6,7-dihydroxi-2,5,5,8a-tetrametyl-1,2,3, 4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydronaftalen-l-spiro-2'-(6',7'-diformyl- -4'-hydroxi-2',3'-dihydrobensofuran), en ljusgul, svagt sur substans med anti-komplementär aktivitet. De fysikalisk-kemiska egenskaperna av denna förening överensstämde med dem-av den enligt exempel 1 erhållna föreningen.
Referensexempel l Föreningen enligt uppfinningen 500 mg Glukos ° 250 mg Destillerat vatten för injektion till 5 ml Dinatriumsaltet /III/ av föreningen enligt uppfinningen och glukos löstes i destillerat vatten för injektion. Lösningen hälldes i en 5 ml-ampull. Luften utspolades med kväve och ampullen upphettades 15 minuter vid 1210 för sterilisering av lösningen i och för bildning av ett injicerbart preparat.

Claims (4)

Q, 7305606-6 PATENTKRAV
1. Förfarande för framställning av en förening med formeln (Ia) no-/š- cHo / cHo cHí/ O Ho C113 - (Ia) no CÉINCH 3 3 och farmaceutiskt godtagbara salter därav, k ä n n e t e c k ~ n a t därav, att man aerobt odlar en mikroorganism av släktet Stachybotrys i ett odlingsmedium, innehållande assimilerbara källor för kväve, kol, oorganiska salter och spårmineral, vid ett pH av ungefär 3,5 - ll,5 och en temperatur av ungefär 15- 35°C och tillvaratager den bildade produkten med formeln (Ia) ur odlingsvätskan och eventuellt omvandlar den till ett farma- ceutiskt godtagbart salt. 7
2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att man överför den bildade produkten till ett farma- ceutiskt godtagbart salt därav.
3. Förfarande enligt patentkravet l eller 2, k ä n nte t e c k - n a t därav, att mikroorganismen väljes bland Stachybotrys altermans IFO 9355, Stachybotrys chariarum IFO 5369, Stachy- botrys chartarum IFO 7222, Stachybotrys cylindrospora 8858, Stachybotrys echinata 7525, Stachybotrys reniformis 7067, Stachy- botrys sp. K-76, Stachybotrys sp. T-789 och Stachybotrys sp. T-791. vsossoe-e í 3D
4. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a t _dârav, att mikroorganismen väljas bland Stachybotrys sp. K-76, Stachybotrys sp. T-789 och Stachybotrys sp. T~791.
SE7805606A 1977-06-30 1978-05-16 Forfarande for framstellning av seskviterpenderivat genom odling av en mikroorganism tillhorande slektet stachybotrys SE439322B (sv)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP52078641A JPS589114B2 (ja) 1977-06-30 1977-06-30 セスキテルペン類縁体、その製造法及び腎炎治療剤
JP15895977A JPS5492680A (en) 1977-12-29 1977-12-29 Novel microorganism
JP53014674A JPS5936913B2 (ja) 1978-02-10 1978-02-10 セスキテルペン誘導体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE7805606L SE7805606L (sv) 1979-01-08
SE439322B true SE439322B (sv) 1985-06-10

Family

ID=27280728

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE7805606A SE439322B (sv) 1977-06-30 1978-05-16 Forfarande for framstellning av seskviterpenderivat genom odling av en mikroorganism tillhorande slektet stachybotrys
SE8305390A SE452008B (sv) 1977-06-30 1983-09-30 Forfarande for framstellning av seskviterpenderivat

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8305390A SE452008B (sv) 1977-06-30 1983-09-30 Forfarande for framstellning av seskviterpenderivat

Country Status (17)

Country Link
US (1) US4229466A (sv)
AR (1) AR228011A1 (sv)
CA (1) CA1142106A (sv)
CH (1) CH641452A5 (sv)
DE (1) DE2821403C2 (sv)
DK (2) DK154704C (sv)
ES (2) ES469821A1 (sv)
FR (1) FR2405941A1 (sv)
GB (1) GB1601479A (sv)
IE (1) IE46785B1 (sv)
IT (1) IT1103138B (sv)
MX (1) MX6053E (sv)
NL (1) NL181804C (sv)
NO (2) NO152220C (sv)
NZ (1) NZ187243A (sv)
PT (1) PT68035B (sv)
SE (2) SE439322B (sv)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5630917A (en) * 1979-08-22 1981-03-28 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Preventive and remedy for hepatitis
US4423027A (en) * 1982-12-22 1983-12-27 Simon Lionel N Pharmaceutical compositions of deglycyrrhizinated licorice (DGL)
JPS6193179A (ja) * 1984-10-15 1986-05-12 Takara Shuzo Co Ltd グアニジルフンジン類の誘導体及びその製造方法
JPS646214A (en) * 1987-02-13 1989-01-10 Otsuka Pharma Co Ltd Remedy for ulcerative colonopathy
US5506247A (en) * 1988-04-15 1996-04-09 T Cell Sciences, Inc. Compounds that inhibit complement and/or suppress immune activity
US5173499A (en) * 1988-04-15 1992-12-22 T Cell Sciences, Inc. Compounds which inhibit complement and/or suppress immune activity
US5366986A (en) * 1988-04-15 1994-11-22 T Cell Sciences, Inc. Compounds which inhibit complement and/or suppress immune activity
US4981980A (en) * 1989-09-14 1991-01-01 Merck & Co., Inc. Drug for treating manic depression
EP0447813A1 (en) * 1990-02-28 1991-09-25 GRUPPO LEPETIT S.p.A. Water soluble salts of purpuromycin and pharmaceutical formulations thereof
US5532416A (en) * 1994-07-20 1996-07-02 Monsanto Company Benzoyl derivatives and synthesis thereof
DE69509643T2 (de) * 1994-03-25 1999-10-14 Gruppo Lepetit S.P.A. Sesquiterpenderivate
US5869688A (en) * 1994-07-20 1999-02-09 Monsanto Company Preparation of substituted 3-aryl-5-haloalkyl-pyrazoles having herbicidal activity
US5698708A (en) * 1996-06-20 1997-12-16 Monsanto Company Preparation of substituted 3-aryl-5-haloalkyl-pyrazoles having herbicidal activity
JP4194196B2 (ja) * 1999-02-22 2008-12-10 花王株式会社 浴用剤組成物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3985896A (en) * 1975-07-15 1976-10-12 Smithkline Corporation Benzophenalenofurans
US4046805A (en) * 1976-05-10 1977-09-06 American Cyanamid Company Substituted-hydroxy-naphthalenedisulfonic acid compounds

Also Published As

Publication number Publication date
DK212778A (da) 1978-12-31
NO781704L (no) 1979-01-03
FR2405941A1 (fr) 1979-05-11
SE7805606L (sv) 1979-01-08
NL7805160A (nl) 1979-01-03
NL181804C (nl) 1987-11-02
NO834363L (no) 1979-01-03
CH641452A5 (de) 1984-02-29
SE8305390L (sv) 1983-09-30
MX6053E (es) 1984-10-16
DE2821403C2 (de) 1984-01-26
ES477771A1 (es) 1979-12-01
ES469821A1 (es) 1979-09-16
IE46785B1 (en) 1983-09-21
PT68035B (en) 1979-10-24
GB1601479A (en) 1981-10-28
CA1142106A (en) 1983-03-01
DE2821403A1 (de) 1979-01-25
IT1103138B (it) 1985-10-14
NL181804B (nl) 1987-06-01
SE452008B (sv) 1987-11-09
NO152220B (no) 1985-05-13
NZ187243A (en) 1984-07-31
DK58487D0 (da) 1987-02-04
SE8305390D0 (sv) 1983-09-30
US4229466A (en) 1980-10-21
IT7849342A0 (it) 1978-05-15
DK154704C (da) 1989-05-08
IE780975L (en) 1978-12-30
DK154704B (da) 1988-12-12
AR228011A1 (es) 1983-01-14
DK155670B (da) 1989-05-01
DK155670C (da) 1989-09-18
PT68035A (en) 1978-05-31
DK58487A (da) 1987-02-04
NO154013C (no) 1986-07-02
NO152220C (no) 1985-08-21
NO154013B (no) 1986-03-24
FR2405941B1 (sv) 1983-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI66427B (fi) Foerfarande foer framstaellning av en ny som laekemedel anvaendbar foerening monacolin k
SE439322B (sv) Forfarande for framstellning av seskviterpenderivat genom odling av en mikroorganism tillhorande slektet stachybotrys
HINO et al. FK409, a novel vasodilator isolated from the acid-treated fermentation broth of Streptomyces griseosporeus I. Taxonomy, fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics
KR0135600B1 (ko) 항암 항생물질 mi43-37f11, 그 제조방법 및 그 용도
JPH06506202A (ja) 医薬用キサントン誘導体
US5334587A (en) Compounds, named the &#34;Leustroducsins&#34;, their preparation and their therapeutic uses
SU1074408A3 (ru) Способ получени 3-0/ @ - @ -глукуронпиранозил/-со сапогенола
US4831053A (en) Composition for prophylaxis and therapy of hepatitis
JP2003529585A (ja) ケモカインレセプターアンタゴニスト
DE69519669T2 (de) Cyclodepsipeptide
US5338758A (en) Bicyclic diterpene PAF antagonist compounds
US7414069B2 (en) Antituberculosis compounds, Hirsutellones A, B, and C
JP2004512257A (ja) メムノペプチド、その製造方法および使用
CA2244142C (en) Antifungal compound from hormonema sp.
EP0371762B1 (en) New platelet activating factor antagonists, named &#34;the phomactins&#34;, their preparation and use
US4902781A (en) Novel tripetide derivatives
JP2646707B2 (ja) 新規化合物wf2015aおよびb、それらの製造法ならびにそれらを含有する組成物
EP0525361A1 (en) Novel antibiotics NK374186A, NK374186B, NK374186B3 and NK374186C3, process for producing the same, and use of the same
JPH04368388A (ja) ダイネマイシンc抗腫瘍抗生物質
US5308867A (en) Platelet activating factor antagonists, named &#34;the phomactins&#34;, their preparation and use
FI69485B (fi) Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt aktiv 6,7-dihydroxi-2,5,5,8a-tetrametyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydronaftalen-1-spiro-2&#39;-(6&#39;,7&#39;-diformyl-4&#39;-hydroxi-2&#39;,3&#39;-dihydrobensofuran)
KR830000619B1 (ko) 3-0(β-D-글루쿠로노피라노실)-소야사포게놀 B의 제조방법
WO1995018142A1 (en) Wf15604 substances
JPH07285862A (ja) 脂質低下剤
JPS5942894A (ja) 生理活性物質ss12538c及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 7805606-6

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed

Ref document number: 7805606-6

Format of ref document f/p: F