DK154704B - Fremgangsmaade til fremstilling af et sesquiterpenderivat eller salte deraf - Google Patents

Description

DK 154704 B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt sesquiterpenderivat med den i krav 1's indledning anførte formel (la) eller salte deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Dette sesquiterpenderivat og dets salte har en hæmmende virkning over for dyrs komplementsystem (en antikomplementær aktivitet) og antitumor-aktivitet og er anvendelige som aktive bestanddele i terapeutiske kompositioner, der er effektive over for f.eks. autoimmun-sygdomme, nephritis, rheumatisme, collagen-sygdomme, allergisygdomme eller kræftsygdomme, eller som mellemprodukter ved fremstilling af sådanne aktive bestanddele.

Betegnelsen "komplement" refererer til en kompleks gruppe af

2 DK 154704 B

proteiner i legemsvæsker, der i samarbejde med antistoffer eller andre faktorer spiller en vigtig rolle som mediatorer for immune, allergiske, immunokemiske og/eller immunopatologiske reaktioner. Reaktioner, hvori et komplement deltager, finder sted i blodserum eller i andre legemsvæsker og betragtes derfor som humorale reaktioner.

Det er rapporteret, at komplementsystemet har vist sig at være involveret i inflammation, koagulering, fibrinolyse, antistof-anti-gen-reaktioner og andre metaboliske processer (jvf. U.S. patentskrift nr. 4.021.544, Bull. World Health Org., 39_r 935-938 (1968), Scientific American, 929 (nr. 5), 54-56 (1973), Medical World News, 11. Oktober, 53-58, 64-66 (1974) , Harvey Lectures, 66^, 75-104 (1972) , The New England Journal of Medic., 282/ 489-495, 545-549, 592-596, 642-646 (1972), The John Hopkins Med. J., 128, 57-74 (1971), og Federation Proceedings, 32^, 134-137 (1973)).

Forskellige forbindelser er kendt som forbindelser med en anti-komplementær aktivitet, såsom ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), Saldox, phlorizin (som beskrevet i Borsos. J. Immunol. 94 (4), 629 (1964)) hydroxybenzen-derivater (som beskrevet i Shir Mayer: Biochemistry N.Y., 2/ 3003 (1968), guanidiner og phenoxyacetamider (som beskrevet i B.R. Baker: J. Med. Chem. 12, 408 (1968)), phosphonat-estere (som beskrevet i E.L. Becker: B.B.A. 147, 289 (1967)), chloro-phyllin, glycyrrhizin, osv. Disse forbindelser er imidlertid ikke tilfredsstillende for praktiske formål, fordi de er meget toxiske, eller de har en lav antikomplementær aktivitet. Så vidt vides, findes der i handlen ingen antikomplementær forbindelse eller noget anti-komplementært middel.

Det ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede hidtil ukendte sesquiterpenderivat med høj antikomplementær aktivitet og lav toxicitet er derivatet 6,7-dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalen-l-spiro-21-(61,71-difor-myl-4'-hydroxy-21,3'-dihydrobenzofuran) med formlen (la): ho

3 . DK 154704 B

-CHO

--\ -CH0 σι3 / / L--o' da) HO r -CH3 H0_ ch3 ch3 og salte deraf, og fremstillingen foregår ved, at en mikroorganisme af slægten Stachybotrys dyrkes aerobt i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kilder for nitrogen, carbon, uorganiske salte og spormineraler, ved et pH på fra ca. 3,5 til ca. 11,5 og en temperatur på fra ca. 15°C til ca. 35°C, og det resulterende produkt med formlen (la) udvindes fra dyrkningsvæsken og, om ønsket, overføres i et salt deraf.

Den anvendte mikroorganisme vælges hensigtsmæssigt blandt:

Stachybotrys alternans IFO 9355,

Stachybotrys chartarum IFO 5369,

Stachybotrys chartarum IFO 7222,

Stachybotrys cylindrospora IFO 8858,

Stachybotrys echinata IFO 7525,

Stachybotrys reniformis IFO 7Q67 og især de nyligt isolerede hidtil ukendte stammer hørende til slægten Stachybotrys, som har fået navnene Stachybotrys complementi nov sp. K-76 (i det følgende omtalt som Stachybotrys sp. K-76), Stachybotrys complementi nov sp. T-789 (i det følgende betegnet som Stachybotrys sp. T-789) og Stachybotrys echinata var. T-791 (i det følgende betegnet som Stachybotrys sp. T-791).

Disse hidtil ukendte stammer er beskrevet nærmere nedenfor og under henvisning til tegningerne, på hvilke: fig. 1 og 2 er mikrofotografier af Stachybotrys complementi nov sp. K-76, fig. 3 er et mikrofotografi af Stachybotrys complementi nov sp. T-789, fig. 4 er et mikrotofografi af Stachybotrys echinata var. T-791, og

DK 154704 B

4 fig. 5 er et NMR-spektrum for forbindelsen med formlen (la) vundet i eksempel 1.

A. Findested.

(1) Stachybotrys sp· K-76.

Denne stamme blev isoleret fra jorden ved Ishigaki City, Okinawa, Japan.

(2) Stachybotrys sp. T-789.

Denne stamme blev isoleret fra jorden ved Naruto City, Tokushima, Japan.

(3) Stachybotrys sp. T-791

Denne stamme blev isoleret fra jorden ved Tokushima City, Tokushima, Japan.

(B) Karakteristika på forskellige dyrkningsmedier.

(1) Stachybotrys sp. K-76.

Kulturkarakteristika for denne stamme på forskellige dyrkningsmedier baseret på visuelle og mikroskopiske observationer (fig.

1 og 2) er som følger: (a) Visuel observation.

Der er observeret udmærket vækst på forskellige dyrkningsmedier, der er sædvanligt anvendt ved dyrkning af skimmelsvamp, men vedhæftningen af phialosporer er ikke nødvendigvis god undtagen på havremelagarmedium. Vækstbetingelserne på typiske medier er vist nedenfor.

(i) Maltekstrakt-Agarmedium.

Væksten er relativt langsom, og ved dyrkning ved 27°C i 30 dage dannes en stor koloni med en størrelse på 30 til 35 mm. Kolonien vokser i en cirkulær form, og koloni-periferien er stor med små uregelmæssige indskæringer. Overfladen af kolonien er glat, og lufthyfer strækker sig tykt som en cirkulær måtte ved koloniens midte og vokser tæt. Kolonien ændrer sig gradvis fra hvid på et tidligt dyrkningsstadium til let elfenbensfarvet (Li Ivory, 2ca). To uger efter dyrkningens begyndelse begynder phialosporer at dannes i let grad, men er knapt synlige for det blotte Øje. Sclerotium og andre seksuelle sporogene organer dannes ikke. Farven af koloniens bagside går fra farveløs til kobber-gyldenbrun (Copper Tan, 5ie). Et kobber-gyldenbrunt (Copper Tan, 5ie), opløseligt pigment dannes.

(ii) Kartoffel-Glucose-Agarmedium.

5

DK 154704 B

Væksten er god, og ved dyrkning ved 27°C i 30 dage når kolonistørrelsen 45 til 47 mm. Kolonivasksten er konveks ved koloniens midte, og koloni-periferien har en form med små uregmæssige indskæringer. Kolonien viser koncentriske cirkler eller folder startende ved koloniens midte. Fra det indledende dyrkningstrin er kolonien tykt dækket med hvide til perle-lyserøde (Pearl Pink, 4ca) hyfer. Efterhånden som dyrkningen skrider frem, bliver farven af kolonien sort-grå (Gray, i). En hel del sterigmasporemasser dannes. Store mængder små væskedråber ses. Farven af bagsiden går fra rust-gyldenbrun (Rust Tan, 5ie) til lys rosabrun (Li Rose Brown, 6½ lg). Et dannet opløseligt pigment har en flødekaramelfarve (Butter Scotch, 3ne), men er svagt.

(iii) Czapek's Dox-Agarmedium.

Væksten er god, og ved dyrkning ved 27°C i 30 dage når kolonistørrelsen 40 til 45 mm. Kolonien viser en koncentrisk fold, og kolonien har en bukkel ved koloniens midte. Koloniens periferi er bølget. Farven af koloniens bagside er gyldenbrun (Luggage Tan, 4ne), Ved koloniens overflade hæfter farveløse til hvide hyfer tyndt i en koncentrisk form fra midterdelen, der ikke er dækket med lufthyfer og har en toast-gyldenbrun farve (Toast Tan, 4Ag). Der ses ingen små væskedråber, men midterdelen af kolonien er meget hygroskopisk. Sterigmasporer dannes så at sige ikke. Det opløselige pigment er svagt og har en guldfarve (Gold, 2Ae).

(iv) Havremel-Agarmedium.

Væksten er meget hurtig, og ved dyrkning ved 27°C i 30 dage når koloniens størrelse 60 til 70 mm. Kolonien er tynd og flad, og fra det indledende dyrkningstrin dannes farveløse til hvide hyfer på hele overfladen af kolonien. Oprejste hyfer, 2 til 4 mm i størrelse, dannes kun ved koloniens midterdel, men er ikke tætte. To uger efter dyrkningens begyndelse spreder vedhæftningen af phialo-sporer sig over hele koloniens overflade, og farven af kolonien bliver lys oliven-gråbrun (Li Olive Drab, 1 Ai)· Farven af koloniens bagside er beige-brun (Beige Brown, 3ig) til gyldenbrun (Tan, 3ie). Det dannede opløselige pigment er svagt colonial-gult (Colonial Yellow, 2ca).

(2) Stachybotrys sp. T-789.

Kulturkarakteristika for stammen T-789, der er Fungi-Imper-fecti, på forskellige dyrkningsmedier blev observeret visuelt og

6 DK 154704 B

mikroskopisk (som vist i fig. 3), og resultaterne er beskrevet nedenfor, De morfologiske karakteristika for stammen T-789 ved mikroskopisk observation stemmer godt overens med de morfologiske karakteristika for Stachybotrys sp. K-76. Der er imidlertid forskelle i egenskaber på dyrkningsmedier. På de følgende to medier afviger deres karakteristika tydeligst.

(a) Visuel observation.

(i) Maltekstrakt-Agarmedium.

Væksten er meget langsom, og ved dyrkning ved 27°C i 30 dage når koloniens størrelse 17 til 20 mm. Den perifere del af kolonien vokser bølget og er begrænset. Kolonien har en buklet form ved midten af kolonien og en radial fold på koloniens periferi. Lufthyfer hæfter tyndt til hele koloniens overflade. Ved det indledende dyrkningstrin er hyferne hvide, og konidier dannes gradvis. Koloniens midterdel antager en muldvarpegrå farve (Mole, &), og konidierne vokser tæt. Konidiedannelse er ring-lignende mod koloniens periferi. Farven af koloniens bagside er kork-gyldenbrun (Cork Tan, 4ie). Det opløselige pigment er rigeligt, og er ravfarvet (Amber, 3£e).

(ii) Czapek's Dox-Agarmedium.

Væksten er god, og ved dyrkning ved 27°C i 30 dage når væksten 45 mm. Koloniens midterdel er konveks, og kolonien danner en radial fold. Koloniens perifere del viser en bølget vækst. Hvide lufthyfer hæfter tyndt i en koncentrisk cirkulær form udad fra den centrale konvekse del af kolonien. Konidier dannes koncentrisk kun ved koloniens perifere del. Hyferne er i den opløste tilstand ved den konvekse del og er meget hygroskopisk. Farven af koloniens bagside er sennepsbrun (Mustard Brown, 2pi). Intet opløseligt pigment dannes.

(3) Stachybotrys sp. T-791.

Kulturkarakteristika for T-791, der er Fungi-Imperfecti, på forskellige dyrkningsmedier baseret på visuelle og mikroskopiske observationer (vist i fig. 4) er som følger: (a) Visuel observation.

(i) Maltekstrakt-Agarmedium.

Væksten er hurtig og uregelmæssig. Farven af koloniens bagside er gyldenbrun (Tan, 3ie) til mørkebrun (Dk Brown, 2pn). Kolonien er flad, og konidiedannelse er god. Farven af hyferne er bis-quit (Bisquit, 2ec) til gyldenbrun (Tan, 3ie), og små væskedråber, der er ekssuderede, iagttages. Der dannes intet opløseligt pigment.

7 DK 154704 B

(ii) Kartoffel-Glucose-Medium.

Væksten er meget hurtig, og ved dyrkning ved 27°C i 30 dage når koloni-størrelsen 70 mm. Den perifere del af kolonien spredes dendritisk, og vedhæftede fortyndet-hvide hyfer iagttages. Små væskedråber er fremtrædende. Der iagttages så at sige ingen sporedannelse. Koloniens bagside er lys ravfarvet (Li Amber, 3ie). Intet opløseligt pigment dannes.

(iii) Czapek's Dox-Agarmedium.

Væksten er ringe.

(iv) Syntetisk skimmelsvamp-Agarmedium.

Væksten er ringe.

(v) Havremel-Agarmedium.

Væksten er udmærket, således at Petri-skålen er dækket i løbet af to uger. Kolonien er tynd og flad. Dannelse af hyfer er rigelig fra det indledende dyrkningstrin, og konidiedannelse er også hurtig. Koloniens farve ændres fra hvid til mørkebrun (Dk Brown, 3pn), efterhånden som dyrkningen skrider frem. Store mængder små væskedråber forekommer på hyferne. Intet opløseligt pigment dannes.

(C) Fysiologiske Egenskaber.

Stachybotrys K-76, T-789 og T-791 er alle aerobe stammer og har følgende fysiologiske egenskaber.

(1) Stachybotrys sp. K-76.

pH Temperatur

Vækstbetingelser 3,5-11,5 15 - 35°C

Optimale vækstbetingelser 6,0 - 9,5 20 - 32°C

(2) Stachybotrys sp. T-789 pH Temperatur

Vækstbetingelser 3,5-11,5 15 - 38°C

Optimale vækstbetingelser 4,5-10,5 20 - 32°C

(3) Stachybotrys sp. T-791 pH Temperatur

Vækstbetingelser 3,5-11,5 15 - 38°C

Optimale vækstbetingelser 4,5 - 9,5 20 - 30°C

(D) Morfologiske Egenskaber.

(1) Stachybotrys sp. K-76.

8

DK 154704 B

Det følgende ses klart af fig. 1 og 2. Sclerotium og andre seksuelle reproduktionsorganer ses ikke på forskellige dyrkningsmedier, men aseksuelle sporer af phialospore-typen ses at blive dan net.

Hyfer dannes på forskellige dyrkningsmedier, forgrenes kompliceret og strækker sig i langsgående og tværgående retning med en hyfebredde på 2-4ym.

Phialophorer forgrener simpelthen fra hyferne (ingen forgrening fra den ene phialophor til den anden) og har 3 til 4 septa fra fodcellerne ved basisdelen. Phialophorerne strækker sig opretstående eller svagt krummet. Hyfebredden fra phialophoren er 4,3 til 4,7ym ved basisdelen og 3,6 til 4,5ym ved den centrale del. Spidserne af phialophorerne er let udbulnet, og fra de yderste ender af phialophorerne dannes 3 til 7 elliptiske til omvendt kølleformede opretstående phialider med en størrelse på 7,9-9,3 x 3,6-4,7ym. Phialiderne er glatte og har en farve varierende fra farveløs til bleg gulbrun. Phialosporerne dannes forbundet basipetalt fra enderne af phialiderne. Phialosporerne danner ikke lige kæder, men bliver slimet-nedhængende små halvcirkulære masser, hvis antal er 7 til 26. Phialophorerne er sub-kugleformede til ovale med en størrelse på 4,9-8,0 x 3,3-4,7ym, og overfladerne af phialophorerne er grove til vortede, og farverne af phialophorerne er mørk efeu (Dk Ivy 24 po) til gråligsort. På phialosporemasserne ses ingen membran stammende fra mukøst materiale.

Taxionomi-status for den foreliggende stamme med de ovennævnte mikrobiologiske egenskaber er efterforsket gennem G.L. Barron,

The Genera of Hyphomycetes from Soil, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, (1968), J.C. Gilman, A Manual of Soil Fungi, The Iowa State University Press, Ames, Iowa (1971), og J.A. von Arx,

The Genera of Fungi Sporelating in Pure Culture, Verag von J. Cremer 3301 Lehre, (1970). Efter det taxionomiske system ifølge Saccardo hører den foreliggende stamme til klassen Hyphomycetes, familien Dematiaceae, slægten Stachybotrys. Egenskaberne af den foreliggende stamme, kendetegnet ved fravær af ascocarper og andre seksuelle reproduktionsorganer, dannelse af mørkebrune phialosporer fra phialider og samling af de resulterende phialosporer i en halvcirkulær form ved topenderne af phialiderne, stemmer med andre ord godt overens med egenskaberne af slægten Stachybotrys.

9

DK 154704 B

De forskellige karakteristika for den foreliggende stamme er blevet identificeret i henhold til den ovenfor beskrevne forskningshåndbøger og litteratursteder, såsom G.R. Bisby, Trans. Brit. Mycol. Soc., 26^, 133-143, (1943), R.K. Zuck, Mycologia, 38: 69-76, (1946), G.L. Baron, Can. J. Bot., 39: 153-157, (1961), og ved sammenligning med de type-stammer, der er deponeret hos Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO). Den foreliggende stamme K-76 er som et resultat heraf blevet bedømt som værende af størst lighed med Stachybotrys lobulata IFO 5369, fordi phialosporerne af den foreliggende stamme K-76 har et groft, vortet fremspring og er oval til ellipsoid. Der er imidlertid forskelle, idet Stachybotrys lobulata har en phialo-phor, der kan nå en størrelse på 1 mm, og mens stammen K-76 viser simpel forgrening, har stammen lobulata den egenskab, at en anden phialophor forgrener og strækker sig fra én phialophor. Med hensyn til vækst på forskellige dyrkningsmedier frembringer stammen K-76 en stor mængde opløseligt pigment, og konidiedannelse er meget ringe på agarmedier undtagen på kartoffel-glucose-agarmedium og havremel-agarmedium. På den anden side vokser Stachybotrys lobulata meget hurtigt på forskellige dyrkningsmedier, og en foldfri flad koloni dannes. Konidiedannelse er god på næsten alle medier undtagen på Czapek's Dox-agarmedium, således at det typebestemmer koloniens farve. Intet opløseligt pigment dannes, eller det dannes kun i ringe mængde.

På basis af de ovennævnte forskelle er den foreliggende stamme K-76 blevet vurderet som værende en hidtil ukendt art forskellig fra Stachybotrys lobulata, og den foreliggende stamme har fået navnet Stachybotrys sp. K-76.

(2) Stachybotrys sp. T-789.

Følgende kan ses af fig. 3. Denne stamme har ganske samme morfologi som Stachybotrys sp. K-76, selvom der er nogen forskel med hensyn til kolonistørrelse.

På samme måde som for Stachybotrys sp. K-76 er de ovennævnte mikrobiologiske egenskaber blevet sammenlignet med ovennævnte forskningshåndbøger og litteratursteder og med IFO-typestammerne. Herved har denne stamme vist sig mest i lighed med Stachybrotrys lobulata IFO 5369 og Stachybotrys sp. K-76. Den foreliggende stamme viser god dannelse af phialosporer på Czapek's Dox-agarmedium. Dannelsen af phialosporer på Czapek's Dox-agarmedium ses imidlertid så at sige ikke for de første to stammer. Dette er en kultur-forskel.

ln DK 154704 B

10

Som anført i forbindelse med Stachybotrys sp. K-76 ovenfor, er endvidere de morfologiske egenskaber af den foreliggende stamme klart forskellige fra Stachybotrys lobulata. Endvidere ligger pH-området for optimal vækst for den foreliggende stamme ved pH 4,5-10,5. Også på dette punkt afviger den foreliggende stamme fra stammen K-76.

Af ovennævnte grund er den foreliggende stamme derfor blevet betragtetsom en en hidtil ukendt art og har fået navnet Stachybotrys sp. T-789.

(3) Stachybotrys sp. T-791.

Følgende kan ses af fig. 4. Phialophorerne forgrener simpelthen og står oprejst. Phialophor-spidserne svulmer lidt i stavform. Opsvulmningen er imidlertid ikke så kraftig, som det ses for type-stammerne af Stachybotrys echinata IFO 7525 og 8856. Denne stamme viser en hyfebredde på 4,0-4,5ym, hvilket er lidt større end phialo-phoren. Phialophorerne, der forgrener sig oprejst med fodceller fra vegetative hyfer eller lufthyfer, har to til tre septa og har en størrelse på 40-80 x 3,0-3,5ym. Cellevæggen af phialophoren er ikke besat med små pigge, men er glat.

Tre til seks phialider dannes fra den opsvulmede del ved spidserne af phialophorerne. Endvidere bliver sfæriske til sub-kugle-formede phialosporer fra én celle med et med små pigge besat fremspring og en størrelse på 4,3-5,2 x 3,0-4,2ym dannet kontinuerligt basipetalt ved spidserne af phialiderne, og en kæde på 24 til 70 ko-nidier dannes. Phialiderne har en omvendt kølleform og har en størrelse på 6,9-10,7 x 3,5-4,7ym. Phialophorerne og phialiderne er farveløse, og phlålosporén har en kaffefarve (Coffee, 3pn) til sort farve.

Den taxionomiske status for den foreliggende stamme med de ovenfor beskrevne mikrobiologiske egenskaber blev udforsket ved hjælp af de forskningshåndbøger, der er omtalt i afsnittet vedrørende stammen K-76. Som et resultat heraf fandtes den foreliggende stamme at tilhøre slægten Stachybotrys (slægten Menmoniella). Mere specielt har den foreliggende stamme ikke ascocarper og andre seksuelle reproduktionsorganer, og mørkebrune phialosporer dannes kontinueligt fra phialiderne. Lange kæder af sporer dannes. Egenskaberne af den foreliggende stamme T-791 stemmer overens med egenskaberne af slægten Stachybotrys (slægten Menmoniella).

11 DK 154704 B

De forskellige egenskaber af den foreliggende stamme er udforsket ved hjælp af de ovennævnte forskningshåndbøger og litteratur-steder, såsom R.K. Zuck, Mycologia, _38: 69-76 (1964) , og G. Smith, Trans. Brit. Mycol. Soc., 45: 387-394 (1962), og sammenlignet med de hos IFO deponerede typestammer. Som et resultat har man vurderet, at da phialosporer dannes kontinuerligt og basipetalt fra phialider, hører stammen T-791 til Menmoniella echinata, navngivet af Hohnel.

Ud fra rapporterne ifølge R.K. Zuck og G. Smith ovenfor er den foreliggende stamme T-791 imidlertid blevet betragtet som værende en stamme analog med Stachybotrys echinata. Den blev derfor sammenlignet med Stachybotrys echinata IFO 7525 og 8856.

Morfologisk ses på cellevæggene af phialophorerne hos den foreliggende stamme T-791 ikke fremspring med små pigge, der er specifikke for de to typestammer. Hos typestammerne svulmer endvidere spidserne af phialophorerne op til 2 til 3 gange hyfebredden for phialophorerne. Der iagttages imidlertid ingen tydelig opsvulmning hos den foreliggende stamme. Endvidere viser de to typestammer god vækst på forskellige dyrkningsmedier, navnlig på kartoffel-glucose-agarmedium, og danner cirkulære, noget rejste kolonier, og hyfer hæfter i rigelig mængde. Endvidere ses tydelig konidie-dannelse. I modsætning hertil viser den foreliggende stamme en dendritisk uregelmæssig vækst som ovenfor anført, og der iagttages ringe hyfedannelse og ringe konidie-dannelse. På grund af de ovennævnte mikrobiologiske forskelle er den foreliggende stamme blevet vurderet til at være en hidtil ukendt . art og har fået navnet Stachybotrys sp. T-791.

Farveangivelserne ovenfor og i det følgende er i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet i Color Harmony Manual, Container Corporation of America (1958).

Prøver af de hidtil ukendte stammer Stachybotrys sp. K-76, Stachybotrys sp. T-789 og Stachybotrys sp. T-791 er blevet deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, under deponeringsnumrene henholdsvis FERM-p Nr. 3801, FERM-P Nr. 3802 og FERM-P Nr. 3803.

Fremstillingen af forbindelsen med formlen (la) ved hjælp af de ovenfor beskrevne mikroorganismer af slægten Stachybotrys opnås på følgende måde.

12 DK 154704 B

Mikroorganismerne dyrkes først i et medium indeholdende sædvanlige næringskilder og additiver. Nitrogen-kilder, der er almindeligt anvendt som et dyrkningssubstrat, omfatter for eksempel sojabønnepulver, sojabønneolie, majsstøbevæske, gærekstrakt, tørret gær, havremel, kødekstrakt, hydrolyseret kasein, ammoniumsalte og nitratsalte. Eksempler på egnede carbonkilder er glucose, glycerol, maltose, stivelse, lactose, sucrose og melasse. Eksempler på additiver til dyrkningsmediet omfatter uorganiske salte, såsom calciumcarbonat, natriumchlorid og magnesiumsulfat, og phosphorsyre. Om ønsket kan dyrkningsmediet yderligere indeholde små mængder af salte af metaller, såsom jern, kobber, mangan og zink. Dyrkning kan foregå i et sædvanligt vandigt medium indeholdende det ovennævnte substrat under anvendelse af en overfladedyrkningsteknik eller en teknik med neddykket dyrkning under luftning og omrøring. Neddykket dyrkning med luftning og omrøring foretrækkes. Dyrkningen kan med fordel gennemføres ved en temperatur på fra ca. 15° til ca. 35°C, fortrinsvis fra 20° til 32°C, over en periode på sædvanligvis fra ca. 3 til ca. 7 dage under sædvanlige luftningsbetingelser, idet pH for dyrkningsmediet holdes ved fra ca. 3,5 til ca. 11,5, fortrinsvis fra 4,5 til 9,5.

Efter dyrkningen udvindes det dannede stof fra dyrkningsvæsken. Udvindingsmetoden er ikke kritisk, og der kan anvendes forskellige i og for sig kendte metoder, der gør brug af de fysisk-kemiske egenskaber af de dannede stoffer. Udvinding kan ske for eksempel ved en metode, der gør brug af forskellene i opløselighed mellem produkterne og urenhederne, eller en metode, der gør brug af forskellene i adsorptiv evne og affinitet over for sædvanlige adsorbentier, såsom aktiveret carbon, XAD-2, silicagel, ionbytterharpikser eller"Sepha-dex" (varemærke for produkt fra Pharmacia Fine Chemicals),eller en metode, der gør brug af forskellene i fordelingskoefficient mellem to væskefaser, eller en kombination af sådanne metoder.

Nærmere betegnet bliver dyrkningsvæsken filtreret eller centrifugeret på sædvanlig måde for at fjerne cellerne. Derefter sættes methanol til den overliggende væske, og blandingen omrøres og henstilles i 2 til 3 timer. Bundfaldet fjernes ved en anden centrifugering. Resten ekstraheres med samme volumen ethylacetat, og opløsningsmidlet afdestilleres. Ekstrakten indføres i methanol, og metha-nolopløsningen ledes gennem en søjle af aktiveret carbon, og opløs-

13 DK 154704 B

ningsmidlet afdestilleres fra eluatet. Inddampningsresten gel-filtreres under anvendelse af"Sephadex LH-20. De resulterende fraktioner bliver hver især underkastet en antikomplement-aktivitetsprøve beskrevet nedenfor. Aktive fraktioner samles, og opløsningsmidlet sidestilleres. Herved kan der isoleres det rene sesquiterpenderivat 6,7-dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydro-naphthalen-l-spiro-2'-(6',7'-diformy1-4’-hydroxy-2',3'-dihydroben-zofuran) med formlen (la) .

Til dannelse af salte af sesquiterpenderivatet med formlen (la) kan der eksempelvis anvendes hydroxider og carbonater af alkalimetaller og jordalkalimetaller, såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, calciumhydroxid, natriumcarbonat, kaliumcarbonat og natriumbicarbonat. Organiske aminer, såsom methylamin, ethyl-amin, isopropylamin, morpholin, piperazin, piperidin og 3,4-dime-thoxyphenethylamin, kan også anvendes som basiske forbindelser til saltdannelsen.

Saltdannelsen kan let gennemføres i et egnet opløsningsmiddel under brug af sædvanlig saltdannelsesteknik. Eksempler på egnedé opløsningsmidler, der kan anvendes, er vand, lavere alkoholer, såsom methanol, ethanol og propanol, ethere, såsem dioxan og tetrahydrofuran, acetone, benzen, ethylacetat, dimethylsulfoxid, dimethylformid, methylenchlorid og chloroform. Saltdannelse kan gennemføres ved fra stuetemperatur til ca. 100°C, fortrinsvis fra stuetemperatur til 50°C, i løbet af fra ca. 5 minutter til ca. 6 timer, sædvanligvis i åben atmosfære eller under oxygen-frie betingelser, fortrinsvis i en atmosfære af et indifferent luftformigt medium, såsom nitrogen eller argon. Mængden af den anvendte basiske forbindelse er ikke kritisk, men sædvanligvis er en egnet mængde på mindst ca. 1 ækvivalent, fortrinsvis fra 1 til 2 ækvivalenter, baseret på de sure grupper i udgangsforbindelsen.

Efter at de ovenfor beskrevne reaktioner er fuldendt, kan den ønskede slutforbindelse let fraskilles og renses under anvendelse af kendte sædvanlige fraskillelsesoperationer. For eksempel kan der som fraskillelsesoperation anvendes afdestillation af opløsningsmiddel, opløsningsmiddelekstraktion, udfældning, omkrystallisation, søjle-chromatografi og præparativ chromatografi.

'Dét resulterende sesquiterpenderivat med formlen (la) og saltene deraf er anvendelige som et middel til behandling af nephritis og bliver, når de anvendes som et behandlingsmiddel for nephritis, oparbejdet til farmaceutiske kompositioner samnen med sædvanlige farmaceu- 14

DK 154704 B

tisk acceptable bærestoffer, Egnede bærestoffér,der kan anverdés, esc for eksempel fortyndingsmidler eller excipienser, såsom fyldstoffer, strækmidler, bindemidler, befugtningsmidler, disintegrationsmidler, overfladeaktive midler og smøremidler, der er almindeligt anvendt ved fremstilling af sådanne lægemidler alt efter anvendelsesmetoden og dosisformen.

Forskellige anvendelsesmåder og dosisformer for de terapeutiske midler som et behandlingsmiddel for nephritis kan vælges alt efter formålet med terapien. Typiske dosisformer, der kan anvendes, er tabletter, piller, pulvere, flydende præparater, suspensioner, emulsioner, granuler, kapsler, suppositorier og injektionspræparater (opløsning, emulsion, suspension, osv.).

Ved formning af en farmaceutisk komposition, indeholdende ses-quiterpenderivatet med formlen (la) eller et salt deraf som en aktiv bestanddel, til en tabletform kan der anvendes mange forskellige på området kendte bærestoffer. Eksempler på egnede bærestoffer omfatter excipienser, såsom lactose, sucrose, natriumchlorid, glucoseopløsning, urinstof, stivelse, calciumcarbonat, kaolin, krystallinsk cellulose og kieselsyre, bindemidler, såsom vand, ethanol, propanol, simpel sirup, glucose, stivelsesopløsning, gelatineopløsning, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, kaliumphos-phat og polyvinylpyrrolidon, disintegrationsmidler, såsom tørret stivelse, natriumalginat, agarpulver, laminariapulver, natriumbi-carbonat, calciumcarbonat, Tween, natriumlaurylsulfat, stearinsyre-monoglycerid, stivelse og lactose, disintegrations-inhibitorer, såsom sucrose, stearinsyreglycerylester, kakaosmør og hydrogenerede olier, absorptionsfremmende midler, såsom kvaternære ammoniumbaser og natriumlaurylsulfat, fugtighedsbevarende midler, såsom glycerol og stivelse, adsorbenter, såsom stivelse, lactose, kaolin, bentonit og kolloidal kiselsyre, og smøremidler, såsom renset talkum, stearinsyresalte, borsyrepulver, macrogol eller fast polyethylenglycol.

Ved formning af den farmaceutiske komposition til pilleform kan der anvendes mange forskellige på området kendte sædvanlige bærestoffer. Eksempler på egnede bærestoffer er excipienser, såsom glucose, lactose, stivelse, kakaosmør, hærdede vegetabilske olier, kaolin og talkum, bindemidler, såsom gummi arabicum-pulver, tragacanth-pulver, gelatine og ethanol, og disintegrationsmidler, såsom laminaria og agar. Tabletterne kan, om ønsket, belægges og omdannes til sukker-belagte tabletter, gelatine-belagte tabletter, belagte ente-

15 DK 154704 B

riske tabletter, filmbelagte tabletter eller tabletter belagt med to eller flere lag.

Ved formning af den farmaceutiske komposition til en supposi-torie-form kan der anvendes mange forskellige på området i og for sig kendte bærestoffer. Eksempler på egnede bærestoffer omfatter po-lyethylenglycol, kakaosmør, højere alkoholer, estere af højere alkoholer, gelatine og semi-syntetiske glycerider.

Når den farmaceutiske komposition oparbejdes til et injektionspræparat, bliver den resulterende opløsning og suspension fortrinsvis steriliseret og er isotonisk med hensyn til blodet. Ved oparbejdning af den farmaceutiske komposition til opløsning eller suspension kan der anvendes på området sædvanligt anvendte fortyndingsmidler. Eksempler på egnede fortyndingsmidler er vand, ethanol, propylengly-col, ethoxyleret isostearylalkohol, polyoxyethylensorbitol og sorbi-tanestere. Natriumchlorid, glucose eller glycerol kan inkorporeres i et terapeutisk middel, f.eks. som et behandlingsmiddel for nephritis, i en mængde, der er tilstrækkelig til at fremstille isotoniske opløsninger. Det terapeutiske middel kan yderligere indeholde sædvanlige opløsningsfremmende midler, pufferstoffer, smertestillende midler og præserveringsmidler og eventuelt farvningsmidler, parfumer, duft/-smagsstoffer, sødemidler og andre lægemidler.

Den mængde af forbindelsen med formlen (la) og saltene deraf, der som aktiv bestanddel skal inkorporeres i en farmaceutisk komposition, der kan anvendes som et behandlingsmiddel for nephritis, er ikke særligt begrænset og kan variere over et vidt område. En passende, terapeutisk effektiv mængde af forbindelsen med formlen (la) og Saltene deraf ligger sædvanligvis fra ca. 1 til ca. 70 vægtprocent, fortrinsvis fra 5 til 50 vægtprocent, baseret på den totale komposition.

Der er ingen særlig begrænsning vedrørende anvende'lsesmåden for det terapeutiske middel som et behandlingsmiddel for nephritis, og det terapeutiske middel kan anvendes ad veje, der er egnet for de særlige former, hvori det terapeutiske middel foreligger. For eksempel bliver tabletter, piller, flydende præparater, suspensioner, emulsioner, granuler og kapsler indgivet oralt. De injicerbare præparater anvendes intravenøst enten alene eller sammen med sædvanlige hjælpemidler, såsom glucose og aminosyrer.Endvidere kan det terapeutiske middel, om ønsket, indgives alene intramuskulært, intracutant, subcutant eller intraperitonealt. Suppositorier indgives intrarectalt .>

Dosen af behandlingsmidlet for nephritis vælges passende efter 16

DK 154704 B

anvendelsesformålet, symptomerne, osv. Sædvanligvis ligger en foretrukket dosis af forbindelsen på fra ca. 0,5 til ca. 20 mg/kg legemsvægt pr. dag.

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen har antikomple-ment-aktiviteter og er også anvendelige som terapeutiske midler for autoimmune sygdomme, collagensygdomme og rheumatiske sygdomme, der hver især involverer komplementsystem.

Resultaterne af prøver vedrørende de farmakologiske virkninger af forbindelsen med formlen (la) og saltene deraf er anført nedenfor.

(1) Antikomplement-Aktivitet.

Antikomplement-aktiviteten blev målt og bekræftet ved prøvemetoden beskrevet i en japansk-sproget publikation med titlen "Meneki Kagaku" (Immunochemistry), Yuichi Yamamura et al. Ed., side 830-834, Asakura Shoten, Tokyo, Japan (1973). Nærmere betegnet indførtes i et prøverør 0,5 ml af en vandig dispersion af hver af forsøgsforbindel-

O

serné, 0,5 ml sensibiliserede erythrocyter (EA) indeholdende 1 x 10 celler/ml, 1 ml af en 5 gange fortyndet opløsning af en Veronal- ++ ++ ++ pufferopløsning indeholdende gelatine, Ca og Mg (GVB ), og 0,5 ml komplementserum (marsvin-komplement) fortyndet til 150 gange med GVB . Blandingen holdtes varm ved 37 C i 60 minutter. Derefter blev der tilsat 5 ml af en iskold fysiologisk saltopløsning, og blandingen blev centrifugeret. Adsorbansen af det fraskilte overliggende materiale måltes ved OD4]_3/ og den grad, hvori forsøgsforbindelsen hæmmede hæmolysen af de sensibiliserede erythrocyter, bestemtes. Værdien for 50% hæmolysehæmmende aktivitet (γ/ml) målt ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde var for sesquiterpenderivatet med formlen (la) på 10 γ/ml.

(2) Akut Toxicitet.

LDj.Q-Værdierne (mg/kg) for sesquiterpenderivatet med formlen (Ta) måltes ved intravenøs indgift på mus og fandtes at være på 40 mg/kg.

(3) Terapeutisk Virkning på Nephritis af Nephrotoxin-type.

Rotte-nephrotoxin (forkortet "NT") vandtes som beskrevet nedenfor. Rottenyrecortex blev homogeniseret med samme mængde fysiologisk saltopløsning. Den homogeniserede blanding blev blandet med "Freund's 17

DK 154704 B

complete adjuvant" (et produkt fra Difco Company) i et volumenforholde på 1:1. To milliliter af den resulterende blanding blev injiceret intramuskulært på en kanin (legemsvægt 3100 g) for at immunisere kaninen. Halvanden måned senere blev blod taget fra kaninens hjerte, og serum vandtes. Det resulterende serum blev inaktiveret ved 56°C i 30 minutter og derefter udsaltet med en 40% mættet vandig opløsning af ammoniumsulfat og fraktioneret. γ-Globulinet (IgG)-fraktionen blev indsamlet for at vinde NT.

Vurderingen foregik under anvendelse af han-Wistar-rotter med en legemsvægt på 150 til 160 g, idet der blev benyttet tre replika- tioner for forsøgsforbindelsen.Forsøgsforbindelsen blev ind- «» givet intraperitonealt én gang hver 24 timer i syv dage.. En time efter indgift af forsøgsforbindelsen på den tredie dag anvendtes NT.

NT blev injiceret intravenøst i en mængde på 1 ml ved en halevene på hver rotte. Chlorophyllin (CP) anvendtes som sammenligningsforbindelse, og fysiologisk saltopløsning anvendtes som kontrol.

Proteinuria-niveauet (total mængde udskilt i urinen over en periode på 24 timer) blev målt under anvendelse af turbidometri, idet der blev benyttet okseserumalbumin som kontrol ved hjælp af sulfo-salicylsyre.

De opnåede resultater er anført i tabel I nedenfor.

Tabel I

Forbindelse Dosis Replikation Dag-tal (mg pr. Nr.

rotte) 1 4 7 10

Sesquiterpen-r. 1 2,5 1,5 .0,8 8 derivat med 3 2 4,3 2fl j.,8 10 formlen (la) 3 1,7 1,1 .0,9 7 gennemsnit 2,8 1,6 “1,2 8

Chloro- 1 2,4 1,5 0,9 9 phyllin 5 , 2 4,4 2,6 1,7 8 (sammenligning) 3 3,2 2,1 3,5 6 gennemsnit 3,4 2,1 2,0 8

1# DK 154704 B

-Lo

Tabel I (fortsat)

Forbindelse Dosis Replikation Dag-tal (mg pr. Nr. 1 4 7 10 rotte) .......

1 13 16 21 29 2 19 23 25 35 ik0ntrol) 3 11 18 24 40 gennemsnit 14 19 23 35 x) Dag-tallet i tabel III er beregnet fra tidspunktet for indgift af forsøgsforbindelsen, der var 1 time før anvendelsen af NT. xx) Mængden af proteinurea er anført i enheder af mg/dag.

Proteinurea-niveauet hos en rask rotte er på 0,5 til 5 mg/dag. Når proteinurea-niveauet overstiger dette område, navnlig når proteinurea-niveauet er højere end 10 mg/dag, kan det med sikkerhed siges, at der er indtrådt nephritis. Som det fremgår af resultaterne i tabel .1, forekom der nephritis hos kontrol-gruppen, og i tilfælde af sesquiterpenderivatet med formlen (la) og CP var størrelsen af proteinurea fra tidspunktet for indgift af NT til 10 dage efter indgift i det væsentlige den samme som hos en rask rotte. Indgiften af forbindelsen (la) ses således at hæmme primære og sekundære reaktioner.

(4) Terapeutiske Virkninger på Nephritis af Heymann-type.

Han-Wistar-rotter med en legemsvægt på 180-200 g anvendtes ved prøven. Rottenyrecortex blev ekstraheret og homogeniseret med samme volumenmængde af en fysiologisk saltopløsning. Homogenatet blev centrifugeret ved 1500 G i 1 time. Den overliggende væske blev renset ved metoden ifølge T.S. Edgington et al., Journal of Experimental Medicine, 127, 555 (1968), og blandet med "Freund's complete adjuvant 37 Ra" (et produkt fra Difco Company) i et volumenforhold på 0,4:1. Den resulterende blanding blev injiceret intraperitonealt på isologe rotter i en mængde på 0,5 ml pr. rotte. Derefter blev den samme mængde af nævnte "adjuvant" indgivet hver 2 uger, indtil proteinurea-niveauet oversteg 100 mg/dag. (Denne periode var ca. 6 til 8 uger).

19

DK 154704 B

Forsøgsforbindelsen.blev indgivet intraperitonealt på rotter angrebet af nephritis af Heymann-type (med en legemsvægt på 300 til 350 g) én gang dagligt i 7 dage, og derefter blev størrelsen af proteinurea (mg/dag) målt på samme måde som ovenfor beskrevet.

CP anvendtes som sammenligningsforbindelse, og fysiologisk saltopløsning anvendtes som kontrol. Tre replikationer blev foretaget for hver forbindelse. De opnåede resultater er vist i tabel II.

Tabel II

Forbindelse Dosis Replikation Dag-,tal ‘rotte) Nr‘ ** 1 4 7 14 21 ' Ind- gift

Sesquiterpen- 3 1 95904717 9 10 derivat med 2 132 125 65 35 15 12 formlen (la) 3 121 120 70 27 10 9 gennemsnit 116 111 61 26 11 10

Chloro- 1 123 116 72 32 16 10 phyllm 5 2 117 108 63 29 12 8 , 3 129 121 52 22 15 13 gennemsnit 123 115 62 28 14 10 1 135 127 132 135 114 126 2 121 105 121 103 105 109 (kontrol) 3 137 117 135 121 109 132 _gennemsnit 131 116 129 119 109 122

To til tre uger efter prøvens indledning er rotternes legemsvægt forøget til 400-500 g, og de normale proteinurea-niveauer antages at ligge på 5-15 mg/dag. Som det fremgår af resultaterne i tabel II, kan sesquiterpenderivatet (la) kurere nephritis af Heymann-type.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler, hvori, med mindre andet er anført, ’alle dele, procenter, forhold og lignende er efter vægt, og anvendt "stuetemperatur" ligger fra ca. 15° til ca. 25°C.

Eksempel 1 I en Sakaguchi-kolbe på 500 ml indførtes 100 ml -af et dyrkningsmedium med følgende sammensætning, og Stachybotrys sp. K-76 blev dyrket ved 28°C og en pH-værdi på 6 i 4 dage med rystning.

20 DK 154704B

Sammensætning af dyrkningsmedium (%)

Glycerol 0,5

Stivelse 1/0

Lactose 0/2

So j abønnepulver 0,5 Gæreks trakt 0,1

Maltekstrakt 0/2

CaC03 0/3

MgS04 0/05 I et forgæringskar på 30 liter indførtes 20 liter af et dyrkningsmedium med ovennævnte sammensætning, og én flaske af den resulterende podningskultur blev dyrket i dyrkningsmediet ved 28°C i 5 dage under omrøring ved 300 rpm og ved en luftcirkulationshastighed på 1 liter pr. liter kulturdyrkningsmedium pr. minut. Den resulterende kulturvæske blev centrifugeret ved en hastighed på 8000 rpm for at fjerne de mikrobielle celler. Til den overliggende væske blev der sat 5 liter methanol, og blandingen blev omrørt og derefter henstillet i 3 timer. Blandingen blev centrifugeret, og de dannede faste stoffer blev fjernet. Det overliggende materiale blev ekstraheret med samme volumenmængde ethylacetat. Opløsningsmidlet fra ethylace-tatlaget blev afdestilleret under reduceret tryk. Inddampningsresten blev opløst i methanol og ledt gennem en søjle af aktiveret carbon. Eluatet blev koncentreret til tørhed under reduceret tryk. Den tørrede masse blev opløst i en blanding af chloroform og ethylacetat (1:1, volumen/volumen) og gel-filtreret gennem en søjle af Sephadex LH-20. Filtratet blev underkastet tyndlagschromatografi (under anvendelse af en blanding af ethylacetat, chloroform og eddikesyre (volumenforhold 50:50:2) som fremkaldende opløsningsmiddel), og en fraktion med en antikomplement-aktivitet svarende til Rf = 0,34 blev indsamlet. Alternativt blev filtratet underkastet tyndlagschromatografi (under anvendelse af en blanding af benzen, butanol og eddikesyre (volumenforhold 60:15:5) som fremkaldende opløsningsmiddel), og en fraktion med en antikomplement-aktivitet svarende til Rf = 0,58 blev indsamlet. Fordampning af opløsningsmidlet fra fraktionen gav 2,0 g 6,7-dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydro-naphthalen-l-spiro-21-(6',7'-diformyl-41-hydroxy-21,31-dihydrobenzo-

21 DK 154704 B

furan), et lysegult svagt surt stof med en antikomplement-aktivitet. Dannelse af denne forbindelse blev bekræftet ved følgende fysiskkemiske karakteristika: (1) [a]p° = -48° (c = 2,5, methanol) (2) Elementæranalyseværdier for C23H3o°6: beregnet (%): C: 68,64, H: 7,51 fundet (%): C: 68,58, H: 7,55 (3) UV-Analyse: ·> ethanol „., , λ = 246 nm (ε = 16474) • max = 307 nm (ε = 6659) (4) NMR-Analyse: NMR-Analyse blev gennemført under anvendelse af pyridin-d^ (DSS) (DSS står for natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-iSulfonat) som opløsningsmiddel. Det opnåede NMR-diagram er vist i :Fig. 5. NMR-Målebetingelserne var følgende:

Spektral Amplitude: 4 x 100

Filter: 0,1 sekund

RF-Effekt: 0,05 mG

Afsøgningstid 5 minutter

Afsøgningsbredde 10 ppm

Afsøgningsende: 0 ppm

Eksempel 2 I en Sakaguchi-kolbe på 500 ml blev der indført 1Ό0 ml af et dyrkningsmedium med følgende sammensætning, og Stachybotrys charta-rum IF0 5369, en kendt stamme, blev dyrket i mediet ved "28°C i 4 dage ved en pH på 6 med rystning.

Sammensætning af dyrkningsmedium (%)

Glycerol 0,5

Stivelse 1,0

Lactose 0,2

Soj abønnepulver 0,5 Gærekstrakt 0,1

Maltekstrakt 0,2

CaCOg 0,3

MgS04 0,05

22 DK 154704 B

I et forgæringskar på 30 liter indførtes 20 liter af et dyrkningsmedium med ovennævnte sammensætning, og to flasker af den resulterende podningskultur blev dyrket ved 28°C i 5 dage med omrøring ved en hastighed på 300 rpm ved en luftningshastighed på 1 liter pr. liter af mediet pr. minut. Den resulterende kuturvæske blev centrifugeret ved en hastighed på 8000 rpm for at fjerne de mikrobielle celler. Til den overliggende væske blev der sat 5 liter methanol, og blandingen blev omrørt og henstillet i 3 timer. Blandingen blev centrifugeret, og de faste komponenter blev fjernet. Det overliggende materiale blev ekstraheret med samme volumenmængde ethylacetat. Opløsningsmidlet fra ethylacetatlaget blev fjernet under reduceret tryk for at koncentrere til tørhed. Inddampningsresten blev opløst i methanol og ledt gennem en søjle af aktiveret carbon. Eluatet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk, opløst i en blanding af chloroform og ethylacetat (1:1, volumen/volumen) og gelfiltreret gennem en søjle af Sephadex LH-20. Fraktioner med aktive toppe svarende til tyndlagschromatografi-Rf-værdierne beskrevet i eksempel 1 blev indsamlet. Fordampning af opløsningsmidlet gav 2,2 g 6,7-di-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphtha-len-l-spiro-2(6',7'-diformyl-4,-hydroxy-2I,3'-dihydrobenzofuran), et lysegult svagt surt stof med en antikomplsnentraktivitet. Denne forbindelse havde de samme fysisk-kemiske karakteristika som beskrevet i eksempel 1, og dannelse af denne forbindelse blev bekræftet af disse karakteristika.

Eksempel 3

Stachybotrys sp. T-789 blev dyrket og renset på samme måde som i eksempel 1, bortset fra at der anvendtes et dyrkningsmedium med følgende sammensætning indstillet på en pH-værdi på 7,5, og at dyrkningstemperaturen holdtes ved 32°C.

Sammensætning af dyrkningsmedium (%)

Glycerol 0,5

Glucose 1,2

Majsstøbevæske 0,5 Tørret gær 0,1

Malteks trakt 0,2

MgS04 0,05

NaCl 0,3

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et sesquiterpenderivat med formlen (la): j

24 DK 154704 B VS-CHO —CH0 CH3/ / (la) HO- H°— å3 ch3 eller salte deraf, kendetegnet ved, at en mikroorganisme af slægten Stachybotrys dyrkes aerobt i et dyrkningsmedium indeholdende assimi-lerbare kilder for nitrogen, carbon, uorganiske salte og spormineraler, ved et pH på fra ca. 3,5 til ca. 11,5 og en temperatur på fra ca. 15°C til ca. 35°C, og det resulterende produkt med formlen (la) udvindes fra dyrkningsvæsken og, om ønsket, overføres i et salt deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen er valgt blandt S tachybotry s alter hans IFO 9355, Stachybotrys chartarum IFO 5369, Stachybotrys chartarum IFO 7222, Stachybotrys cyllndrospora IFO 8858, Stachybotrys echinata IFO 7525, Stachybotrys rehifOfmis·IFO 7067,Stachybotrys sp. K-76 (FERM-P nr. 3801) , Stachybotrys sp.· T-789 (FERM-P nr. 3802) og Stachybotrys sp. T-791 (FERM-P nr. 3803).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at mikroorganismen er valgt blandt Stachybotrys sp. K-76 (FERM-P nr. 3801), Stachybotrys sp. T-789 (FERM-P nr. 3802) og Stachybotrys sp. T-791 (FERM-P nr. 3803).