RU2676324C2 - Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер - Google Patents

Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер Download PDF

Info

Publication number
RU2676324C2
RU2676324C2 RU2014122036A RU2014122036A RU2676324C2 RU 2676324 C2 RU2676324 C2 RU 2676324C2 RU 2014122036 A RU2014122036 A RU 2014122036A RU 2014122036 A RU2014122036 A RU 2014122036A RU 2676324 C2 RU2676324 C2 RU 2676324C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mmol
linker
resin
group
prodrug
Prior art date
Application number
RU2014122036A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014122036A (ru
Inventor
Феликс КЛЕЕМАН
Ульрих ХЕРЗЕЛЬ
Сильвия КАДЕН
Харальд РАУ
Томас ВЕГГЕ
Original Assignee
Асцендис Фарма Ас
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Асцендис Фарма Ас filed Critical Асцендис Фарма Ас
Publication of RU2014122036A publication Critical patent/RU2014122036A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2676324C2 publication Critical patent/RU2676324C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/553—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having at least one nitrogen and one oxygen as ring hetero atoms, e.g. loxapine, staurosporine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom

Abstract

Настоящее изобретение относится к пролекарству, содержащему конъюгат лекарственное средство-линкер D-L, где D представляет собой азотсодержащее моноклональное или поликлональное антитело, или его фрагмент, или продукт его слияния; a L представляет собой биологически неактивный линкерный фрагмент L, представленный структурной формулой (I)где пунктирная линия показывает присоединение к азоту моноклонального или поликлонального антитела, или его фрагмента, или продукта его слияния посредством образования амидной связи; X представляет собой C(RR), C(RR)-C(RR) или C(RR)-C(RR); Xпредставляет собой С; Xпредставляет собой C(R, R) или C(R, R)-C(R, R); Xпредставляет собой О; R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, Rнезависимо выбирают из группы, состоящей из Н и Салкила; при необходимости одна или более пар R/Rили R/Rвместе с атомами, к которым они присоединены, соединяются с образованием кольца А; при необходимости R/Rвместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 5- или 6-членного гетероцикла; А представляет собой Сциклоалкил и где Lзамещен одной группой L-Z, при условии, что водород, отмеченный символом * в формуле (I), не может быть замещен заместителем, где Lпредставляет собой одинарную химическую связь или алкильную цепь, имеющую от 1 до 20 углеродных атомов, которая при необходимости прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -О- и C(O)N(R); при необходимости замещенную одной или нескольких группами, независимо выбранными из ОН и C(O)N(RR), и в которой R, Rнезависимо выбирают из группы, состоящей из Н и Салкила; и где Lприсоединен к Z через концевую группу, выбранную изи Z представляет собой гидрогель. 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 52 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к пролекарству, содержащему конъюгат лекарственное средство-линкер D-L, или его фармацевтически приемлемой соли. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные пролекарства, и их использованию в качестве лекарственных препаратов.
Для улучшения физико-химических или фармакокинетических свойств лекарственного средства in vivo оно может быть конъюгировано с носителем.
Как правило, носители в системах доставки лекарственных средств используют либо в нековалентной форме, с лекарственным средством, составленным физико-химическим образом в виде смеси носителя с растворителем, либо посредством ковалентного присоединения реагента-носителя к одной из функциональных групп лекарственного средства.
Однако нековалентный метод требует инкапсулирования высоко эффективного лекарственного средства для предотвращения его неконтролируемого, внезапного высвобождения. При ограничении диффузии несвязанной водорастворимой лекарственной молекулы необходимы сильные ван-дер-ваальсовы контакты, часто опосредованные гидрофобными частями молекулы. Многие конформационно чувствительные лекарственные средства, такие как белки или пептиды, теряют свою функциональность в процессе их инкапсулирования и/или при последующем хранении инкапсулированного лекарственного средства. Кроме того, такие содержащие аминогруппы лекарственные средства легко вступают в побочные реакции с продуктами деградации носителя (см., например, работу D.H. Lee и др., J. Contr. Rel, 2003, 92, 291-299). Более того, зависимость механизма высвобождения лекарственного средства в результате биодеградации может привести к межиндивидуальной вариабельности.
В альтернативном варианте лекарственные вещества могут быть конъюгированы с носителем посредством ковалентных связей. Этот метод применим к различным классам молекул от так называемых малых молекул, включая природные продукты вплоть до более крупных белковых молекул. Ковалентно связанные конъюгаты лекарственного средства с носителем можно подразделить на две группы. Во-первых, это конъюгаты, где ковалентная связь между носителем и лекарством обычно существует во время действия лекарственного средства ("перманентная ковалентная связь"), то есть производное лекарственного средства проявляет свои фармакологические эффекты, которые известны для данного лекарства как такового. Во-вторых, ковалентная связь по большей части предварительно разорвана с высвобождением лекарства как такового, которое может проявлять свои известные фармакологические эффекты. В последнем случае ковалентный конъюгат лекарственного средства с носителем называется пролекарством, связанным с носителем, или пролекарством с носителем.
Для обеспечения разрыва ковалентной связи между носителем и лекарственным средством необходимо легкое удаление указанной связи in vivo для высвобождения лекарственного вещества (активация пролекарства).
Активация пролекарства может являться результатом ферментативного или неферментативного расщепления указанной связи между носителем и молекулой лекарственного средства, или последовательной комбинацией обоих, т.е. через стадию ферментативной реакции, сопровождаемую неферментативной перегруппировкой.
Ферментативно индуцированная активация пролекарства характеризуется тем, что в безферментной in vitro среде, такой как водный буферный раствор, может происходить расщепление, например, сложного эфира или амида, но соответствующая скорость гидролиза может быть чрезвычайно мала и терапевтически непригодной. В in vivo среде обычно присутствуют эстеразы или амидазы, и указанные эстеразы и амидазы могут приводить к существенному каталитическому ускорению кинетики гидролиза в интервале от двукратного увеличения вплоть до величины в несколько порядков. Таким образом, разрыв ковалентной связи контролируется, главным образом, ферментативной реакцией.
Главным недостатком в основном ферментативного расщепления являются межиндивидуальная вариабельность. Уровни ферментов могут существенно различаться между отдельными лицами, что приводит к биологической изменчивости активации пролекарства под действием ферментативного гидролиза. Уровни ферментов также могут меняться в зависимости от места введения. Например, известно, что при подкожной инъекции в некоторых областях тела возникают более предсказуемые терапевтические эффекты, чем в других. Для уменьшения этого непредсказуемого эффекта неферментативное расщепление или внутримолекулярный катализ представляет особый интерес.
Таким образом, ферментнезависимое автокаталитическое расщепление связи между носителем и биологически активным фрагментом является предпочтительным. В большинстве случаев это достигается посредством соответствующим образом сконструированного линкерного фрагмента между носителем и биологически активным фрагментом, который непосредственно присоединен через ковалентную связь к функциональной группе биологически активного фрагмента.
Специфические типы линкеров известны в данной области техники. Y. Sohma и др., описывают в журнале J. Med. Chem. 46 (2003), 4124-4135 пролекарства на основе сложных эфиров, в которых носитель является водорастворимым, а биологически активный фрагмент получен из ингибитора KNI-727 протеазы ВИЧ-1. Используемый линкерный фрагмент присоединен к биологически активному фрагменту через сложноэфирную группу. Механизмом этой системы пролекарства является активация реакции циклизации, приводящая к образованию циклического имида для разрыва сложноэфирных связей.
Однако имеет недостаток из-за нестабильности сложноэфирной функциональной группы. Более того, сложноэфирные функциональные группы могут представлять собой менее хемоселективно доступные группы для конъюгирования носителя или линкера с лекарством.
A.J. Garman др., (А J. Garman, S.B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223 (2), 361-365 1987) используют ПЭГ5000-малеиновый ангидрид для обратимой модификации аминогрупп в активаторе плазминогена тканевого типа и урокиназы. Восстановление функционального фермента из конъюгата ПЭГ и uРА при инкубации в буферном растворе с pH 7,4 посредством расщепления связи малеаминовой кислоты протекает по кинетике реакции первого порядка при периоде полужизни 6,1 часа. Недостатком связи малеаминовой кислоты является отсутствие стабильности конъюгата при более низких значениях pH. Это накладывает ограничение на применимость связи малеаминовой кислоты с биологически активными веществами, которые стабильны при щелочных (высоких) значениях pH, поскольку для предотвращения преждевременного расщепления пролекарства очистку полимерного конъюгата с биологически активным агентом необходимо осуществлять в щелочных условиях (высоких значениях pH).
В WO 2004/108070 описывается система пролекарства на основе линкера амидного производного N,N-бис-(2-гидроксиэтил)глицина (бицина). В этой системе две молекулы ПЭГ-носителя соединены с бициновой молекулой, соединенной с аминогруппой молекулы лекарственного средства. Первые две стадии активации пролекарства заключаются в ферментативном расщеплении первых связей, соединяющих обе молекулы ПЭГ-носителя с гидроксильными группами бициновой активирующей группы. В этом документе описаны различные связи между ПЭГ и бицином, приводящие к различной кинетике активации пролекарства. На второй стадии активации пролекарства происходит расщепление второй связи, соединяющей бицин-активирующую группу с аминогруппой молекулы лекарственного средства. Основным недостатком этой системы является присоединение полимера к бициновому линкеру, приводящее к медленной скорости гидролиза этой второй амидной связи бицина (t1/2>3 ч в фосфатном буфере). Вследствие этого высвобождение бицин-модифицированного интермедиата пролекарства может демонстрировать различные фармакокинетические, иммуногенные, токсикологические и фармакодинамические свойства по сравнению с молекулой исходного нативного лекарственного средства.
Другая система на основе бицина описана в WO 2006/136586.
Таким образом, существует потребность в создании альтернативных связанных с носителем пролекарств, в которых линкер обеспечивал бы автокаталитическое расщепление для высвобождения лекарства в немодифицированной форме, в которой не оставалось бы остатков, происходящих из линкера.
Таким образом объектом настоящего изобретения является обеспечение таких конъюгатов лекарственное средство-линкер, где линкер ковалентно присоединен через расщепляемую связь к биологически активному фрагменту (представляющему собой лекарственное средство после его высвобождения), и где линкер также ковалентно присоединен через постоянную связь непосредственно к носителю или через спейсер с образованием пролекарства, связанного с носителем.
Эта задача решается посредством пролекарства или его фармацевтически приемлемой соли, содержащего конъюгат лекарственное средство-линкер D-L, где
-D представляет собой азотсодержащий биологически активный фрагмент; а
-L представляет собой биологически неактивный линкерный фрагмент L1, представленный формулой (I)
Figure 00000001
где пунктирная линия показывает присоединение к азоту биологически активного фрагмента посредством образования амидной связи;
X представляет собой C(R4R4a), N(R4), О, C(R4R4a)-С(R5R5a), C(R5R5a-C(R4Ra4), C(R4R4a)-N(R6), N(R6)-C(R4R4a), C(R4R4a)-O или O-C(R4R4a);
X1 представляет собой С или S(O);
X2 представляет собой C(R7, R7a) или C(R7,R7a)-C(R8,R8a);
X3 представляет собой О, S или N-CN;
R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a независимо выбирают из группы, включающей Н и C1-4алкила;
при необходимости одна или более пар R1a/R4a, R1a/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a образуют химическую связь;
при необходимости одна или более пар R1/R1a, R2/R2a, R4/R4a, R5/R5a, R7/R7a, R8/R8a вместе с атомом, к которому они присоединены, соединяются с образованием С3-7циклоалкила или 4-7-членного гетероциклила;
при необходимости R4/R6 вместе с атомами, к которым они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероциклила;
при необходимости одна или более пар R1/R4, R1/R5, R1/R6, R4/R5, R4/R6, R7/R8, R2/R3 вместе с атомами, к которым они присоединены, соединяются с образованием цикла А;
при необходимости R3/R3a вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла;
А выбирают из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, С3-10циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила и 9-11-членного гетеробициклила; и
где L замещен 1-4 группами L2-Z и при необходимости дополнительно замещен, при условии, что водород, отмеченный символом * в формуле (I), не замещен заместителем, где
L2 представляет собой одинарную химическую связь или спейсер; и
Z представляет собой группу-носитель.
Неожиданно было обнаружено, что область применения активации циклизации посредством образования циклического имида может быть расширена в диапазоне от производных сложных эфиров вплоть до пролекарств, связанных посредством амидной связи с носителем, несмотря на значительно большую стабильность амидной связи в водных условиях. Было отмечено, что N,N'-бискарбоксамиды, соединенные посредством одной амидной связи с нуклеофильным несущим фрагментом и молекулой лекарственного средства посредством второй амидной связи, демонстрируют способность к автогидролизу в диапазоне, который можно использовать в области применений пролекарств. Кроме того, было также обнаружено, что линкеры могут быть сконструированы так, что они включают носитель, перманентно присоединенный к N,N'-бискарбоксамидному мотиву таким образом, что образование циклического имида можно использовать в качестве основы самоактивации в конструировании пролекарств, связанных с носителем через амидную связь.
Примерами таких предпочтительных циклических продуктов с расщепляемой связью являются структуры с замещенным сукцинимидным или глутаримидным кольцом. Предварительным условием такой активации реакции циклизации является присутствие аминосодержащего нуклеофила в линкерной структуре и другой амидной связи, которая не является амидной связью в пролекарстве, а представляет собой амидную связь, замещенную атомом водорода.
В случае расщепления сукцинимид- или глутаримид-активированного пролекарства аминосодержащий нуклеофил выступает в качестве соседней группы для усиления нуклеофильности азота, содержащегося в постоянной амидной связи, которая в свою очередь атакует амидную карбонильную группу пролекарства и, таким образом, индуцирует внутримолекулярное ацилирование постоянной амидной связи, приводящее к образованию циклического имидного кольца.
Следовательно, предпочтительные структуры линкера включают в себя постоянную связь с носителем, аминосодержащий нуклеофил и постоянную амидную связь водородом, присоединенным к азоту амидной связи. Связанные с соответствующим носителем пролекарства содержат линкер, содержащий постоянную связей с носителем, аминосодержащий нуклеофил и указанную постоянную амидную связь, и азотсодержащий биологически активный фрагмент молекулы, образованный из лекарственного средства, конъюгированного с линкером посредством расщепляемой амидной связи.
На Фиг. 1 показан пример расщепления, приводящего к образованию циклического имида. Азот биологически активного фрагмента представлен как водород-содержащий амин, который приводит к лекарственному средству, имеющему первичную аминную функциональную группу. При этом, также, например, вторичный амин может быть частью лекарственного средства. По соображениям упрощения не показаны от одного до четырех обязательных заместителей структуры L2-Z, в том числе носитель.
Предпочтительные свойства пролекарства настоящего изобретения приведены по периоду его полужизни при гидролизе в водном буферном растворе при pH 7,4 и 37°C в интервале от 1 часа до 3 месяцев; аналогичные скорости гидролиза в физиологических условиях в буфере и плазме крови.
Пролекарство в соответствии с настоящим изобретением может демонстрировать превосходную in vivo и in vitro корреляцию данных расщепления линкера, высокую степень независимости от фермента и его можно хранить при пониженных значениях pH (pH зависимое расщепление).
Используемые термины в объеме существа настоящего изобретения имеют следующие значения.
"Биологически активный фрагмент D" означает часть конъюгата лекарственное средство-линкер, которое после расщепления приводит к лекарственному соединению D-H известной биологической активности.
"Неактивный линкер" означает линкер, который не демонстрирует фармакологического действия лекарственного средства, образованного из биологически активного агента.
"Алкил" означает прямую или разветвленную углеродную цепь. Каждый атом водорода углерода в алкильной группе может быть замещен заместителем.
"C1-4алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 4 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил, трет-бутил, или, например, -CH2-, -СН2-СН2-, -СН(СН3)-, - СН2-СН2-СН2-, -СН(С2Н5)-, -С(СН3)2-, если два фрагмента молекулы связаны алкильной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в C1-4алкиле может быть замещен заместителем.
"C1-6алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: C1-4алкил, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил или, например, группу -СН2-, -СН2-СН2-, -СН(СН3)-, -СН2-СН2-СН2-, -CH(C2H5)-, -С(СН3)2-, если два фрагмента молекулы связаны алкильной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в C1-6алкиле может быть замещен заместителем.
Соответственно, "C1-18алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 18 атомов углерода, a "C8-18алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 8 до 18 атомов углерода. Соответственно, "С1-50алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 50 атомов углерода.
"С2-50алкенил" означает разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, содержащую от 2 до 50 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: -СН=СН2, -СН=СН-СН3, -СН2-СН=СН2, -СН=СН-СН2-СН3, -СН=СН-СН=СН2, или, например, -СН=СН-, если два фрагмента молекулы связаны алкениль-ной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в C2-50алкениле может быть замещен заместителем, как дополнительно указано. Таким образом, термин "алкенил" относится к углеродной цепи с, по меньшей мере, одной двойной углерод-углеродной связью. При необходимости может встречаться одна или более тройных связей.
"С2-50алкинил" представляет собой разветвленную или неразветвленную алкиниль-ную цепь, содержащую от 2 до 50 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: -С≡СН, -СН2-С=СН, СН2-СН2-С=СН, СН2-С=С-СН3, или, например, -С≡С-, в случае, когда два фрагмента молекулы связаны алкинильной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в C2-50алкиниле может быть замещен заместителем, как дополнительно указано. Таким образом, термин "алкинил" относится к углеродной цепи с, по меньшей мере, одной тройной углерод-углеродной связью. При необходимости может встречаться одна или несколько двойных углерод-углеродных связей.
"С3-7циклоалкил" или "С3-7циклоалкильное кольцо" означает циклическую алкильную цепь, содержащую от 3 до 7 атомов углерода, которая может содержать по меньшей мере частично насыщенные двойные углерод-углеродные связи, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил циклогексенил, пиклогептил. Каждый атом водорода у атома углерода циклоалкила может быть замещен заместителем. Термин "С3-7циклоалкил" или "С3-7пиклоалкильное кольцо" также включает в себя мостиковые бициклы, аналогичные норборнану или норборнену. Соответственно, "С3-5циклоалкил" означает циклоалкил, содержащий от 3 до 5 атомов углерода.
Соответственно, "С3-10циклоалкил" означает циклический алкил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, например С3-7циклоалкил; циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил. Термин "С3-10циклоалкил" также включает в себя, по меньшей мере, частично насыщенные карбомоноциклы и бициклы.
"Галоген" означает фтор, хлор, бром или йод. Особенно предпочтительно галоген представляет собой фтор или хлор.
"4-7-членный гетероциклил" или "4-7-членный гетероцикл" представляет собой кольцо, содержащее 4, 5, 6 или 7 кольцевых атомов, которое может содержать максимально возможное число двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое полностью насыщенное, частично насыщенное или ненасыщенное), в котором, по меньшей мере, от одного до 4 кольцевых атомов заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-,-S(O)2-), кислорода и азота (включая =N(О)-), и в котором кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примеры 4-7-членных гетероциклов включают в себя азетидин, оксетан, тиетан, фуран, тиофен, пиррол, пирролин, имидазол, имидазолин, пиразол, пиразолин, оксазол, оксазолин, изоксазол, изоксазолин, тиазол, тиазолин, изотиазол, изотиазолин, тиадиазол, тиадиазолин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, оксазолидин, изоксазолидин, тиазолидин, изотиазолидин, тиадиазолидин, сульфолан, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, имидазолидин, пиридин, пиридазин, пиразин, пиримидин, пиперазин, пиперидин, морфолин, тетразол, триазол, триазолидин, тетразолидин, диазепан, азепин или гомопиперазин.
"9-11-членный гетеробициклил" или "9-11-членный гетеробицикл" представляет собой гетероциклическую систему, состоящую из двух колец с числом кольцевых атомов от 9 до 11, в которой, по меньшей мере, один атом кольца разделен обоими кольцами, и которая может содержать вплоть до максимально возможного числа двойные связи (полностью насыщенное, частично насыщенное или ненасыщенное ароматическое или неароматическое кольцо), где, по меньшей мере, от одного до 6 кольцевых атомов заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (в том числе -S(O)-, -S(O)2-), кислорода и азота (в том числе =N(O)-), и где указанное кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. В качестве примера 9-11-членного гетеробицикла могут служить индол, индолин, бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензизооксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензимидазол, бензимидазолин, хинолин, хиназолин, дигидрохиназолин, хинолин, дигидрохинолин, тетрагидрохинолин, декагидрохинолин, изохинолин, декагидроизохинолин, тетрагидроизохинолин, дигидроизохинолин, бензазепин, пурин или птеридин. Термин 9-11-членный гетеробицикл также включает в себя спиро-структуры из двух колец, например, как 1,4-диокса-8-азаспиро[4,5]декан или гетероциклы мостиковой структуры, например, как 8-аза-бицикло[3.2.1]октан.
В случае, когда соединения формулы (I) содержат одну или несколько кислотных групп или основных групп, настоящее изобретение также содержит их соответствующие фармацевтически или токсикологически приемлемые соли, в частности их фармацевтически пригодные соли. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением соединения формулы (I), которые содержат кислотные группы, можно использовать в соответствии с изобретением, например, в виде солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов или солей аммония. В качестве конкретных примеров таких солей могут служить соли натрия, соли калия, соли кальция, соли магния или соли, полученные из аммиака или органических аминов, такие как, например, этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты. Соединения формулы (I), которые содержат одну или несколько основных групп, т.е. групп, которые могут быть протонированными, могут присутствовать и их можно использовать в соответствии с изобретением в форме их аддитивных солей с неорганическими или органическими кислотами. Примеры подходящих кислот включают хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, метансульфоновую кислоту, паратолуолсульфоновую кислоту, нафталиндисульфоновую кислоту, щавелевую кислоту, уксусную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, пивалиновую кислоту, диэтилуксусную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, пимелиновую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, сульфаминовую кислоту, фенилпропионовую кислоту, глюконовую кислоту, аскорбиновую кислоту, изоникотиновую кислоту, лимонную кислоту, адипиновую кислоту и другие кислоты, известные специалистам в данной области техники. Если соединения формулы (I) одновременно содержат кислотные и основные группы в молекуле, данное изобретение также включает, кроме вышеуказанных солевых форм, внутренние соли или бетаины (цвиттер-ионы). Соответствующие соли соединений в соответствии с формулой (I) можно получать традиционными способами, которые известны специалистам в данной области техники, такими как, например, путем взаимодействия их с органической или неорганической кислотой или основанием в растворителе или диспергаторе, или посредством анионного обмена или катионного обмена с другими солями. Настоящее изобретение также включает все соли соединений формулы (I), которые в силу низкой физиологической совместимости не пригодны непосредственно для использования в фармацевтических препаратах, но которые могут быть использованы, например, в качестве промежуточных химических соединений или для получения фармацевтически приемлемых солей.
Под термином "фармацевтически приемлемый" подразумевается одобренное регулирующим органом, таким как Европейское агентство по оценке медицинской продукции (ЕМЕА) и/или Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) и/или любым другим Национальным регулирующим органом использование для животных, предпочтительно для человека.
Под "фармацевтической композицией" подразумевается один или более активных ингредиентов в комбинации с одним или более инертными ингредиентами, а также любой продукт, который образуется прямо или косвенно в результате объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или более указанных ингредиентов, или в результате диссоциации одного или более указанных ингредиентов, или других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Таким образом, фармацевтические композиции настоящего изобретения охватывают любую композицию, полученную путем смешивания соединения настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым наполнителем (фармацевтически приемлемым носителем).
Термин "наполнитель" относится к разбавителю, адъюванту или носителю с помощью которых вводят терапевтический препарат. В качестве примера такого фармацевтически пригодного наполнителя могут служить стерильные жидкие среды, такие как вода и масла, в том числе любое масло нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, включая, но не ограничивая их объема арахисовым маслом, соевым маслом, минеральным маслом, кунжутным маслом и тому подобные. Вода является предпочтительным наполнителем, в случае, когда фармацевтическая композиция вводится перорально. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы являются предпочтительными наполнителями, в случае, когда фармацевтическая композиция предназначена для внутривенного введения. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина предпочтительно используют в качестве жидких наполнителей для приготовления инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, натрия хлорид, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобные. Композиция настоящего изобретения, по желанию, может также содержать незначительные количества смачивающих агентов или эмульгаторов, или буферных веществ для стабилизации pH. Эти композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и тому подобное. Композиция настоящего изобретения может быть получена в форме суппозитория на основе традиционных связующих и наполнителей, таких как триглицериды. Пероральный состав может включать стандартные наполнители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, натриевой соли сахарина, целлюлозы, карбоната магния и тому подобные. Примеры подходящих фармацевтических наполнителей описаны E.W. Martin в "Remington's Pharmaceutical Sciences". Такие композиции обычно содержат терапевтически эффективное количество терапевтических средств предпочтительно в очищенном виде вместе с подходящим количеством наполнителя так, чтобы обеспечить форму для подходящего введения пациенту. Данный состав должен удовлетворять режиму его приема.
Предпочтительно X3 представляет собой О.
Предпочтительно Х представляет собой N(R4), X1 представляет С, и Х3 представляет собой О.
Предпочтительно X2 представляет собой C(R7R7a).
Предпочтительно L1 выбирают из группы, состоящей из
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
где R представляет собой Н или C1-4алкил; Y представляет собой NH, О или S; и R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, X, X1, X2 имеют вышеуказанные значения;
Еще в более предпочтительном варианте L1 выбирают из группы, состоящей из
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
где R имеет вышеуказанное значение. По меньшей мере один (вплоть до четырех) атомов водорода заменены группой L2-Z. В случае, когда присутствует более одной группы L2-Z, каждый L и каждый Z может быть выбран независимо друг от друга. Предпочтительно, чтобы присутствовала только одна группа L2-Z, что приводит к образованию структуры формулы D-L1-L2-Z.
Обычно L2 может быть соединен с L1 в любом положении за исключением положения замены водорода, отмеченного символом * структуры формулы (I). Предпочтительно, чтобы от одного до четырех атомов водорода, заданных непосредственно радикалами R, R1-R8, или например, водород С1-4алкила или дополнительных групп и колец, задаваемых радикалами R и R1-R8, были заменены группой L2-Z.
Кроме того, L1 может при необходимости дополнительно замещаться. Обычно можно использовать любой заместитель, поскольку он не оказывает влияния на основополагающий принцип расщепления связи.
В предпочтительном варианте один или несколько дополнительных необязательных заместителей независимо выбирают из группы, состоящей из галогена, CN, COOR9, OR9, C(O)R9, C(O)N(R9R9a), S(O)2N(R9R9a), S(O)N(R9R9a), S(O)2R9, S(O)R9, N(R9)S(O)N(R9aR9b), SR9, N(R9R9a), NO2, OC(O)R9, N(R9)S(O)2R9a, N(R9)S(O)2R9a, N(R9)S(O)R9a, N(R9)C(O)OR9a, N(R9)C(O)N(R9aR9b), ОС(О)N(R9R9a), Т, C1-50алкила, C2-50алкенила или C2-50алкинила, где Т, С1-50алкил, C2-50алкенил и C2-50алкинил при необходимости замещены одним или более R10, которые одинаковые или различные, и где C1-50алкил; C2-50алкенил; и C2-50алкинил при необходимости прерваны одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-, -O-, -С(O)-, - C(O)N(R11)-, -S(O)2N(R11)-, -S(O)N(R11)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R11S(O)2N(R11a)-, -S-, - N(R11)-, -OC(O)R11, -N(R11)C(O)-, -N(R11)S(O)2-, -N(R11)S(O)-, -N(R11)C(O)O-, -N(R11)C(O)N(R11a)- и -OC(O)N(R11R11a);
R9, R9a, R9b независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Т, Z и С1-50алкила, C2-50алкенила или C2-50алкинила, где Т, C1-50алкил, C2-50алкенил и C2-50алкинил при необходимости замещены одним или несколькими заместителями из R10, которые одинаковые или различные, и где С1-50алкил, C2-50алкенил и C2-50алкинил при необходимости прерываются одной или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-, -O-, -С(O)-, - C(O)N(R11)-, -S(O)2N(R11)-, -S(O)N(R11)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R11)S(O)2N(R11a)-, -S-, -N(R11)-, -OC(O)R11, -N(R11)C(O)-, -N(R11)S(O)2-, -N(R11)S(O)-, -N(R11)C(O)O-, -N(Rll)C(O)N(Rlla)- и -ОС(О)R11R11a);
Т выбирают из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С3-10циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; или 9-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одним или несколькими заместителями из R10, которые одинаковые или отличаются друг от друга;
R10 представляет собой Z, галоген, CN, оксо (=O), COOR12, OR12, C(O)R12, C(O)N(R12R12a), S(O)2N(R12R12a), S(O)N(R12R12a), S(O)2R12, S(O)R12, N(R12)S(O)2N(R12aR12b), SR12, N(R12R12a), NO2, OC(O)R12, N(R12)C(O)R12a, N(R12)S(O)2R12a, N(R12)C(O)OR12a, N(R12)C(O)OR12a, N(R12)C(O)N(R12aR12b), OC(O)N(R12R12a); или C1-6алкил, где C1-6алкил при необходимости замещен одним или несколькими атомами галогена, которые одинаковые или отличаются друг от друга;
R11, R11a, R12, R12a, R12b независимо выбирают из группы, состоящей из Н или C1-6алкила, где C1-6алкил при необходимости замещен одним или несколькими атомами галогена, которые одинаковые или различные;
Термин "прерванный" означает, что между двумя атомами углерода или на конце углеродной цепи между углеродом и водородом вставлена группа.
L2 представляет собой одинарную химическую связь или спейсер. В случае, когда L2 является спейсером, предпочтительно, чтобы он представлял собой один или несколько необязательных заместителей, определенных выше, при условии, что L2 замещен группой Z.
Соответственно, в случае когда L2 не является одинарной химической связью, L2-Z представляет собой COOR9, OR9, C(O)R9, C(O)N(R9R9a), S(O)2N(R9R9a), S(O)2N(R9R9a), S(O)2R9, S(O)R9, N(R9)S(O)2N(R9aR9b), SR9, N(R9R9a), OC(O)R9, N(R9)C(O)R9a, N(R9)S(O)2R9a, N(R9)S(O)R9a, N(R9)C(O)OR9a, N(R9)C(O)N(R9aR9b), OC(O)N(R9R9a), T, C1-50алкил, С2-50алкенил или C2-50алкинил, где Т, C1-50алкил, C2-50алкенил и C2-50алкинил являются при необходимости замещенными одним или несколькими радикалами R10, которые одинаковые или различные, и где C1-50алкил, C2-50алкенил и С2-50алкинил при необходимости прерываются одной или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из -Т-, -С(O)0-, -O-, -С(O)-, -C(O)N(R11)-, -S(O)2N(R11)-, -S(O)N(R11)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(Rll)S(O)2N(Rlla)-, -S-, -N(R11)-, -OC(O)R11, -N(R11)C(O)-, -N(R11)S(O)2-, -N(R11)S(O)-, -N(R11)C(O)O-, - N(R11)C(O)N(R11a)- и -OC(O)N(R11R11a);
R9, R98, R913 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Т и C1-50алкила, C2-50алкенила или C2-50алкинила, где Т, C1-50алкил, C2-50алкенил и C2-50алкинил при необходимости замещены одним или несколькими R10, которые одинаковые или различные, и где C1-50алкил, C2-50алкенил и C2-50алкинил при необходимости прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-, -O-, -С(O)-, -C(O)N(R11)-, -S(O)2N(R11)-, -S(O)N(R11)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R11)S(O)2N(R11a)-, -S-, -N(R11)-, -OC(O)R11, -N(R11)C(O)-, -N(R11)S(O)2-, -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)R11a)- и -OC(O)N(R11R11a);
Т выбирают из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, С3-10циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила или 9-11-членного гетеробициклила, где Т при необходимости замещен одним или более R10, которые одинаковые или различные;
R10 представляет собой Z, галоген, CN, оксо(=O), COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a), S(O)2N(R12R12a), S(O)N(R12R12a), S(O)2R12, S(O)R12, N(R12)S(O)2N(R12aR12b), SR12, N(R12R12a), NO2, OC(O)R12, N(R12)C(O)R12a, N(R12)S(O)2R12a, N(R12)S(O)R12a, N(R12)C(O)OR12a, N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a) или C1-6алкил, где C1-6алкил при необходимости замещен одним или более атомами галогена, которые одинаковые или различные;
R11, R11a, R12, R12a, R12b независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Z или C1-6алкила, где C1-6алкил при необходимости замещен одним или несколькими атомами галогена, которые одинаковые или различные;
при условии, что один из R9, R9a, R9b, R11, R11a, R12, R12a, R12b представляют собой группу Z.
Более предпочтительно L2 представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20 углеродных атомов, которая при необходимости прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -О- и C(O)N(R3aa); при необходимости замещенную одной или более группами, независимо выбранными из ОН и C(O)N(R3aaR3aaa), и где R3aa, R3aaa независимо выбирают из группы, состоящей из Н и C1-4алкила.
Предпочтительно L2 имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 750 г/моль.
Предпочтительно L2 присоединен к Z через концевую группу, выбранную из
Figure 00000010
В случае, если L2 имеет такую концевую группу, также предпочтительно, чтобы L2 имел молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 500 г/моль, рассчитанную без учета такой концевой группы.
L предпочтительно представлен формулой (Ia)
Figure 00000011
где R4, L2 и Z имеют значение, указанное выше, и где R3aa, R3aaa независимо выбирают из группы, состоящей из Н и C1-4алкила? или R3aaa и R3aaa вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла. R4 предпочтительно представляет собой Н или метил.
L предпочтительно представлен формулой (Ib)
Figure 00000012
где R1, R1a, R4, L2 и Z имеют значение, указанное выше, и где R383 представляет собой Н или C1-4алкил. R4 предпочтительно представляет собой Н или метил.
R1 в формуле (I) предпочтительно представляет собой L2-Z.
R3 в формуле (I) предпочтительно представляет собой L2-Z.
R3, R3a в формуле (I) предпочтительно вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла, при этом указанный гетероцикл замещен L2-Z.
D-H предпочтительно представляет собой низкомолекулярный биологически активный агент или биополимер.
D-H предпочтительно представляет собой биополимер, выбранный из группы биополимеров, состоящей из белков, полипептидов, олигонуклеотидов и пептидонуклеиновых кислот.
"Олигонуклеотиды" означают ДНК, РНК, как одноцепочечные, так и двухцепочечные, siPHK (малую интерферирующую РНК), miPHK (микроРНК), аптамеры, и любые их химические модификации, которые предпочтительно имеют длину от 2 до 1000 нуклеотидов. Указанные модификации включают, но не ограничиваются теми, которые обеспечивают другие химические группы, которые придают дополнительный заряд, поляризуемость, водородное связывание, электростатическое взаимодействие и плавкость (fluxionality) основаниям нуклеиновой кислоты-лиганда или нуклеиновой кислоте-лиганду в целом. Такие модификации включают, не ограничиваются модификациями во 2'-положении сахара рибозы, модификациями в 5-положении пиримидина, модификации в 8-положении пурина, модификациями по экзоциклическим аминам, замещением 4-тиоуридина, замещением 5-бромо или 5-иодоурацила, модификациями остова, метилированиями, необычными комбинациями спаривания оснований, такими как изооснования изоцитидин и изогуанидин, и тому подобные. Модификации также могут включать в себя 3' и 5' модификации, такие как кэппирование и изменение стереохимии.
Предпочтительно D-H представляет собой полипептид, выбранный из группы полипептидов, состоящей из адренокортикотропного гормона АСТН, аденозиндезаминазы, агальзидазы, альфа-1-антитрипсина (ААТ), ингибитора альфа-1-протеиназы (API), альтеплазы, амилинов (амилина, симлина), анистреплазы, анкродсеринпротеазы, антител (моноклональных или поликлональных, и их фрагментов или продуктов слияния), антитромбина III, антитрипсинов, апротинина, аспарагиназы, атосибана, бифалина, бивалирудина, костных морфогенных белков, бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (BPTI), фрагментов кадгерина, кальцитонина (лосося), коллагеназы, ингибитора системы комплемента с эстеразной активностью С1, конотоксинов, фрагментов цитокиновых рецепторов, ДНКазы, динорфина А, эндорфинов, энфувиртида, энкефалинов, эритропоэтинов, эксендинов, фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора IX, фибринолизина, фактора роста фибробластов (FGF), высвобождающего гормон роста пептида-2, (GHRP2), слитых белков, фолликулостимулирующего гормона, грамицидина, грелина, дезацилгрелина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), галактозидазы, глюкагона, глюкагон-подобных пептидов, глюкоцереброзидазы, гранулоцитарно-макрофагального колониестамулирующего фактора (GM-CSF), белков теплового шока человека (HSP), белка, активирующего фосфолипазу, (PLAP), хорионического гонадотропина человека (hCG), гемоглобинов, вакцин против гепатита В, гирудина, ингибитора серинпротеазы человека, гиалуронидаз, идуронидазы, иммунноглобулинов, вакцин против гриппа, интерлейкинов (1-альфа, 1-бета, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12, 13,21), антагониста рецептора IL-1 (rhIL-Ira), инсулинов, инсулиноподобных факторов роста, белка, связывающего инсулшюподобный фактор роста (rhi GFBP), интерферонов (альфа 2а, альфа 2b, альфа 2с, бета-1a, бета 1b, гамма-1a, гамма 1b), молекулы внутриклеточной адгезии, фактора роста кератиноцитов (KGF), гликопротеинового лиганда Р-селектина (PSGL), трансформирующих факторов роста, лактазы, лептина, лейпролида, левотироксина, лютеинизирующего гормона, вакцины против болезни Лайма, натрийуретических пептидов (ANP, BNP, CNP и их фрагментов), нейропептида Y, панкрелипазы, панкреатического полипептида, папаина, паратиреоидного гормона, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), пепсина, пептида YY, ацетилгидролазы тромбоцит-активирующего фактора (PAF-AH), пролактина, С-белка, тимальфазина, октреотида, секретина, серморелина, растворимого рецептора фактора некроза опухоли (TNFR), супероксиддисмутазы (SOD), соматропинов (гормонов роста), соматоприма, соматостатина, стрептокиназы, сахаразы, терлипрессина, фрагмента столбнячного токсина, тилактазы, тромбинов, тимозина, гормона, регулирующего деятельность щитовидной железы, тиреотропина, фактора некроза опухоли (TNF), рецептора TNF, соединенного с Fc-участком IgG, тканевого активатора плазминогена (tPA), тиреотропного гормона (TSH), уродилатина, уратоксидазы, урокиназы, вакцин, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), вазоактивного интестинального пептида, вазопрессина, циконотида, лектина и рицина.
Предпочтительно D-H представляет собой белок, полученный технологиями рекомбинантных ДНК.
Предпочтительно D-H представляет собой белок, выбранный из группы белков, состоящей из фрагментов антител, одноцепочечных антиген-связывающих белков, каталитических антител и слитых белков.
Предпочтительно D-H представляет собой низкомолекулярный биологически активный агент, выбранный из группы, состоящей из агентов, воздействующих на центральную нервную систему, противоинфекционных, противоаллергических, иммуномодулирующих агентов, агентов от ожирения, антикоагулянтов, антидиабетических агентов, антиопухолевых, антибактериальных, противогрибковых, болеутоляющих, противозачаточных, противовоспалительных, стероидных, сосудорасширяющих, сосудосуживающих и сердечно-сосудистых агентов, имеющих, по меньшей мере, одну первичную или вторичную аминогруппу.
Предпочтительно D-H представляет собой низкомолекулярный биологически активный агент, выбранный из группы агентов, состоящей из акарбозы, алалроклата, алендроната, амантадина, амикацина, аминептина, аминоглютетимида, амисульприда, амлодипина, амотосалена, амоксапина, амоксициллина, амфетамина, амфотерицина В, ампициллина, ампренавира, амринона, анилеридина, апраклонидина, апрамицина, артикаина, атенолола, атомоксетина, авизафона, баклофена, беназеприла, бенсеразида, бензокаина, бетаксолола, блеомипина, бромфенака, брофаромина, карведилол, катина, катинона, карбутамида, цефалексина, клинафлоксацина, ципрофлоксацина, дефероксамина, делавирдина, дезипрамина, даунорубицина, дексметилфенидата, диафенилсульфона, дизоцилпина, допамина, добутамина, дорзоламида, доксорубицина, дулоксетина, эфлорнитина, эналаприла, адреналина, эпирубицина, эрголина, эртапенема, эсмолола, эноксацина, этамбутола, фенфлюрамина, фенолдопама, фенотерола, финголимода, флекаинида, флувоксамина, фосампренавира, фроватриптана, фуросемида, флуоксетина, габапентина, гатифлоксацина, гемифлокацина, гентамицина, грепафлоксацина, гексилкаина, гидралазина, гидрохлоротиазида, икофунгипена, идарубицина, имиквимода, инверсина, изопротеренола, исрадипина, канамицина А, кетамина, лабеталола, ламивудина, левобунолола, леводопы, левотироксина, лизиноприла, ломефлоксацина, лоракарбефа, мапротилина, мефлохина, мелфалана, мемантина, меропенема, месалазина, мескалина, метилдопы, метилендиоксиметамфетамина, метопролола, милнаципрана, митоксантрона, моксифлоксацина, норадреналина, норфлоксацина, нортриптилина, неомицина В, нистатина, осельтамивира, памидроновой кислоты, пароксетина, пазуфлоксацина, пеметрекседа, периндоприла, фенметразина, фенелзина, прегабалина, прокаина, псевдоэфедрина, протриптилина, ребоксетина, ритодрина, сабарубицина, сальбутамола, серотонина, сертралина, ситаглиптина, соталола, спектиномицина, сульфадиазина, сульфамеразина, сертралина, спректиномицина, сульфалена, сульфаметоксазола, такрина, тамсулозина, тербуталина, тимолола, тирофибана, тобрамипина, токаинида, тосульфлоксацина, трандолаприла, транексамовой кислоты, транилципромина, тримерексата, тровафлоксапина, валацикловира, валганцикловира, ванкомицина, виомицина, вилоксазина и зальцитабина.
Предпочтительно Z представляет собой полимер, имеющий молекулярную массу, по меньшей мере, 500 Да или C8-18алкильную группу.
В предпочтительном варианте Z выбирают из группы при необходимости сшитых полимеров, состоящей из поли(пропиленгликоля), поли(этиленгликоля), декстрана, хитозана, гиалуроновой кислоты, альгината, ксилана, маннана, каррагинана, агарозы, целлюлозы, крахмала, гидроксиалюилированного крахмала (HAS), поли(виниловых спиртов), поли(оксазолинов), поли(ангидридов), сложных полиортоэфиров, поликарбонатов), поли(уретанов), поли(акриловых кислот), поли(акриламидов), поли(акрилатов), поли(метакрилатов), поли(органофосфазенов), полиоксазолина, поли(силоксанов), поли(амидов), поли(винилпирролидона), поли(цианакрилатов), сложных полиэфиров, поли(иминокарбонатов), поли(аминокислот), коллагена, желатина, гидрогеля или белка плазмы крови, и их сополимеров.
В предпочтительном варианте Z представляет собой белок.
В предпочтительном варианте Z представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из альбумина, трансферрина, иммуноглобулина.
В предпочтительном варианте Z представляет собой линейный или разветвленный поли(этиленгликоль) с молекулярной массой от 2000 до 150000 Да.
В еще более предпочтительном варианте предлагается пролекарство настоящего изобретения, в котором D-H представляет собой агонист рецептора глюкагон-подобного пептида GLP-1, L представляет собой L1, представленный формулой (I), как указано выше, а Z представляет собой гидрогель. Еще в более предпочтительном варианте в формуле (I) Х представляет собой N(R4), X1 представляет собой С, а X3 представляет собой О. В особенно предпочтительном варианте L представлен формулой (Ia), указанной выше.
GLP-1 (глюкагон-подобный пептид-1) является одним из интестинальных пептидных гормонов, который высвобождается в кровеносную систему после приема пищи. Он усиливает постпрандиальное высвобождение инсулина в случае, когда происходит усвоение пищи (особенно углеводов), и их уровень в крови постпрандиально повышен. GLP-1 связан с сайтами рецептора GLP-1, расположенными на β-клетках поджелудочной железы, и повышает уровни эндогенного цАМФ в дозозависимой манере. В изолированных островках крыс в присутствии повьдпенных концентраций глюкозы в нормогликемическом диапазоне GLP-1 стимулирует секрецию инсулина. Ранее высказывалась возможность применения GLP-1 в терапии больных сахарным диабетом 2 типа благодаря мощному стимулирующему действию этого инсулинотропного пептида для секреции инсулина, когда повышается уровень глюкозы в крови, и прекращению его действия при возвращении в состояние нормогликемии. Антидиабетогенный эффект амида глюкагонподобного пептида-1 (7-36) у субъектов в норме и пациентов с сахарным диабетом описан, например, в журнале N. Engl. J. Med. 326 (20): стр. 1316-1322. В исследованиях in vitro и экспериментах на животных показано, что GLP-1 улучшает чувствительность к инсулину и оказывает анабо-лический эффект на панкреатические β-клетки. Также сообщалось, что у человека GLP-1 угнетает секрецию глюкагона, замедляет желудочное опустошение, и вызывает субъективное ощущение сытости, что приводит к снижению веса, если его принимают на протяжении нескольких недель и месяцев.
Сообщают, что эксендин-4 связан с рецепторами GLP-1, расположенными на панкреатических β-клетках, и имеет аффинность в 2,5 раза выше, чем GLP-1. В изолированных островках крыс и β-клетках в присутствии глюкозы эксендин усиливает секрецию инсулина в дозозависимой манере. Эксендин-4 является высоко активным агонистом, а усеченный эксендин 9-39-амид - антагонистом к рецептору на секретирующих β-клетках глюкагон-подобного пептид 1-(7-36) амида (см. J. Biol. Chem 268 (26):19650-19655). В исследованиях на грызунах с диабетом 2 типа было показано, что эксендин-4 в 5530 раз более мощный агент, чем GLP-1 по снижению уровня глюкозы в крови. Кроме того, продолжительность глюкозоснижающего действия после однократного введения эксендина-4 значительно больше, по сравнению с GLP-1 (см., например. Diabetes 48(5): 1026-1034). Сообщалось, что период полужизни в плазме эксендина-4 у людей составлял только 26 минут. Эксендин-4 снижает уровни глюкозы в крови натощак и постпрандиальной глюкозы и снижает потребление энергии у здоровых людей-добровольцев (см., например. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 281(1): Е155-61).
Используемые в соответствии с данным изобретением гидрогели известны специалистам в данной области. В качестве подходящих гидрогелей могут служить, такие которые используют в WO-A 2006/003014. В соответствии с этим, гидрогель может быть определен как трехмерные гидрофильные или амфифильных полимерные сетчатые структуры, способные поглощать большие количества воды. Такие сетчатые структуры состоят из гомополимеров или сополимеров, и они нерастворимы из-за наличия ковалентных химических или физических узлов-сшивок (в результате ионных, гидрофобных взаимодействий, переплетений). Узлы-сшивки обеспечивают сетчатую структуру и физическую целостность. Гидрогели демонстрируют термодинамическую совместимость с водой, которая обеспечивает их набухание в водной среде. Цепи указанной сетки связаны так, что имеются поры, и что основная фракция этих пор имеет размеры от 1 нм и 1000 нм.
Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в соответствии с настоящим изобретением пролекарство или его фармацевтическую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем.
Еще одним объектом настоящего изобретения является в соответствии с настоящим изобретением пролекарство или фармацевтическая композиция для применения в качестве лекарственного препарата.
Еще одним объектом в соответствии с настоящим изобретением является способ лечения, регулирования, замедления или предупреждения развития у пациента-млекопитающего при необходимости лечения одного или нескольких состояний, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества пролекарства в соответствии с настоящим изобретением или его фармацевтической композиции или фармацевтически приемлемой соли.
Еще другим объектом настоящего изобретения является химический предшественник пролекарства формулы Act-L, где L имеет значение, указанное выше, a Act представляет собой уходящую группу.
Act предпочтительно представляет собой хлорид, бромид, фторид, нитрофенокси, имидазолил, N-гидроксисукцинимидил, N-гидроксибензотриазолил, N-гидроксиазобензотриазолил, пентафторфенокси, 2-тиооксотиазолидинил, или N-гидроксисульфосукцинимидил.
Примеры
Материалы и методы
Материалы: защищенный в боковой цепи эксендин-4, (J. Eng et al, J. Biol.Cheni. 1992, 267, 11, 7402-7405) на амидной смоле Ринка, защищенный в боковой цепи BNP-32a, (человеческий, в котором Cys 10 и Cys 26 заменены на Ala) на хлортритильной смоле, защищенный в боковой цепи BNP-32b (человеческий, в котором Cys 10 и Cys 26 заменены на Ala), с защитной группой ivDde в боковой цепи на Lys в положении 14 на хлортритильной смоле, и амид защищенного в боковой цепи фрагмента высвобождающего фактора человеческого гормона роста 1-29 (GRF(1-29) на амидной смоле Ринка, которые синтезированы по Fmoc стратегии синтеза, получали у фирмы Peptide Specialty Laboratories GmbH, Heidelberg, Germany. В боковой цепи использовали стандартные защитные группы, за исключением того, что для Lys 27 эксендина-4 и Lys 21 соединения GRF(1-29) использовали Mmt-защитные группы боковой цепи.
40 кДа метокси(полиэтиленгликоль)малеимид-пропионамид (производное ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа, содержащее малеимидную группу) получали у фирмы Chirotech Technology Ltd, Cambridge, UK.
2-Хлортритилхлоридную смолу, амидную смолу Зибера, и аминокислоты получали у фирмы Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Germany. Fmoc-D-гомоцистеин (Trt)-OH и S-тритил-3-меркаптопропионовую кислоту (TRT-MPA) получали у фирмы Bachem AG, Bubendorf, Switzerland. O-(N-Fmoc-2-аминоэтил)-O'-(2-карбоксиэтил)-ундека-этиленгликоль (Fmoc-Pop-OH) получали у фирмы Polypure AS, Oslo, Norway.
Fmoc-4-(2-аминоэтил)-1-карбоксиметилпиперазин (Fmoc-Acp-ОН) покупали у фирмы NeoMPC SA, Strasbourg, France. Цис-циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты ангидрид получали у фирмы Alfa Aesar GmbH & Со KG, Karlsruhe, Germany.
Все другие химические реактивы получали у фирмы Sigma-ALDRJCH Chemie GmbH, Taufldrchen, Germany.
Твердофазный синтез пептидных соединений осуществляли на 2-хлортритилхлоридной смоле с загрузкой 1,3 ммоль/г смолы или амидной смоле Зибера с загрузкой 0,55 ммоль/г смолы. В качестве реакционных сосудов использовали шприцы, оснащенные полипропиленовыми фриттами.
Загрузку первой аминокислоты в смолы осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.
Снятие Fmoc-защиты:
Для удаления Fmoc-защищающей группы, используемую смолу перемешивали с 2/2/96 (об./об./об.) пиперидина/DBU/DMF (два раза по 10 мин каждый) и промывают DMF (десять раз).
Снятие ivDde-защиты:
Для удаления ivDde-защитной группы используемую смолу перемешивали с 98/2 (об./об.) смеси DMF/гидрат гидразина (трижды по 10 мин каждый) и промывают DMF (десять раз).
Вос-защита:
N-конец пептида защищали Вос-группой перемешиванием смолы с 30 экв. (Вос) 20 и 60 экв. пиридина в DCM. Через 1 час смолу промывают DCM (10 раз).
Стандартные условия связывания кислот:
Связывание кислот (алифатических кислот, Fmoc-аминокислот) со свободными аминогруппам на смоле проводили путем перемешивания смолы с 3 экв. кислоты, 3 экв. РуВОР и 6 экв. DEEA в отношении свободных аминогрупп на смоле (рассчитываемых на основе теоретической загрузки смолы) в ДМФА при комнатной температуре. Через 1 час смолу промывают DMF (10 раз).
Связывание 3-малеимидопропионовой кислоты:
Связывание 3-малеимидопропионовой кислоты со свободными аминогруппами на смоле проводили путем смешивания смолы с 2 экв. кислоты, 2 экв. ОПК и 2 экв. HOBt в отношении свободных аминогрупп в ДМФА при комнатной температуре. Через 30 мин смолу промывают DMF (10 раз).
Протокол стандартного синтеза производных мочевины на смоле:
Синтез производных мочевины на смоле проводили путем перемешивания смолы с 2,5 экв. бис(пентафторфенил)карбоната, 5 экв. диизопропилэтиламина (DIEA) и 0,25 экв. диметиламинопиридина (DMAP) в отношении свободных аминогрупп в смеси дихлорметана и ацетонитрила (DCM/ACN) 1/1 при комнатной температуре. Через 15 мин смолу промывают N,N-диметилформамид (DMF) (10 раз). 5 экв. амина растворяют в ДМФА. Смесь вводили в смолу и перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре. Смолу промывают с использованием DMF (10 раз).
Протокол расщепления для амидной смолы Зибера:
По завершении синтеза смолу промывали дихлорметаном (DCM) (10 раз), сушили под вакуумом и обрабатывали несколько раз (пять раз по 15 минут) смесью DCM/TES/TFA 97/2/1 (об./об./об.). Элюаты объединяли, летучие компоненты удаляли в потоке азота и полученный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ. Фракции ВЭЖХ, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали.
Протокол расщепления для 2-хлортритилхлоридной смолы:
По завершении синтеза, смолу промывают DCM, сушили под вакуумом и обрабатывали 2 раза в течение 30 минут смесью DCM/HFIP 6/4 (об./об.). Элюаты объединяли, летучие компоненты удаляли в потоке азота и полученный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ. Фракции ВЭЖХ, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали.
Протокол расщепления для амидной смолы Ринка:
По завершении синтеза смолу промывали DCM, сушили под вакуумом и обрабатывали 2 мл смеси TFA для снятия продукта (TFA/TES/HbO/DTT 95/2/2/1) на 100 мг смолы в течение 60 минут. Летучие компоненты удаляли в потоке азота. Неполярные продукты боковой цепи и защитные группы удаляли осаждением пептида из диэтилового эфира. Осажденный продукт сушили под вакуумом и растворяли в смеси ACN с водой 1/1, а затем очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Аминосодержащие продукты, полученные в виде солей трифторуксусной кислоты, превращали в соответствующие соли HCl на ионообменной смоле (Discovery DSC-SAX, Supeico, USA). Эту стадию проводили в случае, когда ожидалось, что остаточная TFA будет мешать, например, последующим реакциям связывания.
Очистка с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ:
Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на колонке с силикагелем С 18 ReproSil-Pur 300 фаза ODS-3 5 мкм размером 100×20 или 100×40 мм (Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany), подсоединенной к системе ВЭЖХ Waters 600 и детектору поглощения Waters 2487. Использовали линейные градиенты раствора А (0,1% TFA в Н2О) и раствора В (0,1% TFA в ацетонитриле). Фракции ВЭЖХ, содержащие продукт, лиофилизировали.
Анализ образцов: масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) осуществляли на измерительной системе Waters ZQ 4000 ESI и, при необходимости, масс-спектры расшифровывали с использованием программного обеспечения Waters MaxEnt.
Эксклюзионную хроматографию (SEC) проводили с использованием системы Amersham Bioscience AEKTAbasic, оснащенную колонкой Superdex200 10/300 (Amersham Bioscience/GE Healthcare), если не указано иное. В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ фосфата натрия, 140 мМ NaCl, pH 7,4, 3 мМ EDTA.
Катионнобменную хроматографию проводили с использованием системы Amersham Bioscience AEKTAbasic, оснащенную колонкой Source 15S, заполненную HR16/10 (Amersham Bioscience/GE Healthcare).
Обессоливание проводили с использованием системы Amersham Bioscience AEKTAbasic, оснащенной колонкой для обессоливания HiPrep 26/10, и 0,1% уксусной кислоты в воде в качестве подвижной фазы.
Гидролиз линкера in vitro и высвобождение лекарственного средства: соединения растворяли в буфере А (10 мМ натрия фосфата, 140 мМ NaCl, pH 7,4, 3 мМ EDTA) или буфере В (0,1 мМ ацетата и 3 мМ EDTA, pH 4,0), и затем раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм и инкубировали при 37°C. Отбирали пробы с задержкой по времени и анализировали обращенно-фазовой ВЭЖХ при 215 нм и ESI-MS. УФ сигналы, коррелирующие с освобожденной молекулой лекарственного средства, объединяли и изображали на графике в зависимости от времени инкубации. В случае одинакового времени удержания пролекарства и лекарственного средства соотношение сигналов масс использовали для определения кинетики высвобождения.
В случае гидрогелевых конъюгатов соединения суспендировали в буфере А и инкубировали при температуре 37°C. Аналиты отбирали после центрифугирования суспензии и анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ при 215 нм. УФ сигналы, коррелирующие с освобожденной молекулой лекарственного средства, объединяли и изображали на графике в зависимости от времени инкубации.
Для оценки соответствующего периода полужизни при высвобождении использовали программное обеспечение для обработки кривых.
Пример 1
Синтез носителя на основе жирных кислот (1)
Figure 00000013
1 синтезируют на амидной смоле Зибера (477 мг, 0,262 ммоль), путем связывания Fmoc-Lys(ivDde)-OH, снятия Fmoc-защиты, связывания додекановой кислоты, снятия ivDde-защиты, связывания Fmoc-Pop-OH, снятия Fmoc-защиты, связывания 3-малеимидопропионовой кислоты, отщепления от смолы и последующую очистку, как показано выше и описано в разделе "Материалы и методы".
Выход: 128 мг (0,119 ммоль).
МС: м/з 1101,0=[M+Na]+ (Расчетная Мм=1078,4 г/моль).
Пример 2
Синтез линкерного реагента (2)
Figure 00000014
Линкерный реагент 2 синтезируют на 3-хлортритилхлоридной смоле (300 мг, 0,39 ммоль) путем нагружения смолы Fmoc-Cys (Trt)-OH, снятия Fmoc-защиты и образования на смоле производного мочевины, используя N,N-диметилэтилендиамин в качестве амина, отщепления продукта от смолы, как показано выше и описано в разделе "Материалы и методы". Для разделения методом обращенно-фазовой ВЭЖХ использовали 0,01% HCl в воде в качестве раствора А и 0,01% HCl в ацетонитриле в качестве раствора В.
Выход: 82 мг продукта в виде HCl-соли (0,16 ммоль).
МС: м/з 478,2=[М+Н]+ (Расчетная Мм=477,6 г/моль).
Пример 3
Синтез интермедиата линкера, связанного с эксендином-4 (3)
Figure 00000015
2 (14 мг, 0,027 ммоль), РуВОР (14 мг, 0,027 ммоль) и США (17 мкл, 0,10 ммоль) растворяют в 0,2 мл безводного DMF. Полученную смесь добавляют к 22 мг защищенному в боковой цепи эксендину-4 на смоле (0,1 ммоль/г, 2,2 мкмоль) и интенсивно перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз) и DCM (10 раз). 3 отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ по методике, описанной в разделе "Материалы и Методы". Выход: 1,7 мг 3 в виде трифторацетатной соли (0,38 мкмоль).
МС: м/з 1468,7=[М+3Н]3+(Расчетная Мм=4403 г/моль).
Пример 4 Синтез конъюгата жирная кислота-ПЭГ-линкер-эксендин-4 (Соединение 4)
Figure 00000016
3 (1,7 мг, 0,38 ммоль) и 1 (0,6 мг, 0,58 ммоль) растворяют в 500 мкл смеси ацетонитрил/вода 7/3 (об./об.). Прибавляют 40 мкл 0,5 М фосфатного буфера (pH 7,4), и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Конъюгат 4 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
МС: м/з 1828,7=[М+3H]3+(Расчетная Мм=5480 г/моль).
Пример 5
Синтез линкерного интермедиата (5а)
Figure 00000017
Fmoc-Acp-OH⋅2HCl (100 мг, 0,21 ммоль) суспендируют в 400 мкл DMF/DMSO 1/1 (об./об.). Добавляют S-тритилцистеамина гидрохлорид (75 мг, 0,21 ммоль), РуВОР (109 мг, 0,21 ммоль) и DIEA (146 мкл, 0,86 ммоль) и смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. Fmoc-группу снимают путем добавления 75 мкл пиперидина и 25 мкл DBU. Через 15 минут смесь подвергают гидролизу и подкисляют уксусной кислотой (АсОН) и полученное соединение очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизапии получают 98 мг продукта (0,14 ммоль, в виде двойной трифторацетатной соли).
МС: м/з 511,6=[М+Na]+(Расчетная Мм=488,7 г/моль).
Синтез цис-циклогексан-дикарбоновой кислоты амоксапина моноамида (5b)
Figure 00000018
Амоксапин (200 мг, 0,64 ммоль) и пис-циклогексан-1,2-дикарбоновый ангидрид (108 мг, 0,70 ммоль) растворяют в 700 мкл сухого DMF. Добавляют пиридин (130 мкл, 1,6 ммоль) и смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. Смесь гасят 2 мл смеси ацетонитрил/уксусная кислота/вода (1/1/1) и очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизапии получают 344 мг 5b (0,49 ммоль, в виде двойной трифторацетатной соли).
МС: м/з 468,5=[М+Н]+ (Расчетная Мм=468,0 г/моль).
Синтез конъюгата линкер-амоксапин (5с)
Figure 00000019
5b (7 мг, 0,010 ммоль) предварительно активируют инкубацией с использованием РуВОР (12,5 мг, 0,024 ммоль) и DIEA (5 мкл, 0,03 ммоль) в 200 мкд безводного DMF в течение 45 мин при комнатной температуре. Добавляют 5а (20 мг, 0,028 ммоль) и DIEA (15 мкл, 0,09 ммоль) и смесь инкубируют еще 60 мин. Смесь гасят 0,5 мл смеси ацетонитрил/уксусная кислота/вода (1/1/1) и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизапии получают 3 мг 5 с (0,0026 ммоль, в виде двойной трифторацетатной соли).
МС: м/з 939,3=[М+НГ (Расчетная Мм=938,6 г/моль).
Для снятия тритильной защиты лиофилизат инкубируют в 1 мл HFIP и 3 мкл TES в течение 30 мин. Смесь упаривают и полученный тиол очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизапии получают 2 мг (2,2 мкмоль, в виде двойной трифторацетатной соли) конъюгата амоксапин-линкер 5с.
МС: м/з 697,1=[М+НГ (=[М+Н:Г (Расчетная Mw=696,3 г/моль).
Синтез конъюгата жирная кислота-ПЭГ-амоксапин (5)
Figure 00000020
Конъюгат амоксапин-линкер 5с (2 мг, 2,2 мкмоль) и 1 (3,5 мг, 3,2 мкмоль) растворяют в 900 мкл смеси ацетонитрил/вода 7/3 (об./об.). Прибавляют 60 мкл 0,5 М фосфатного буфера (pH 7,4), и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. 5 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
МС: м/з 1774,9=[М+Н]+(Расчетная Мм=1774,7 г/моль).
Пример 6
Синтез линкерного реагента (Соединение 6)
Figure 00000021
Fmoc-Asp (t-Bu)-OH (411 мг, 1 ммоль), HOBt (153 мг, 1 ммоль) и DIC (160 мкл, 1 ммоль) растворяют в 2 мл DMF и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Прибавляют HN-диметилэтилендйамин (160 мкл, 1,5 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Прибавляют уксусную кислоту (300 мкл) и Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH2)2-N(CH3)2 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 220 мг (0,46 ммоль)
МС Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH2)2-N(CH3)2: м/з 504,6=[М+Na]+ (Расчетная Мм=481,6 г/моль).
Fmoc-Asp (t-Bu)-NH-(CH2)2-N(CH3)2 (220 мг, 0,46 ммоль) растворяют в 3 мл смеси TFA/TES 98/2 (об./об.). Через 30 мин растворитель удаляют в потоке азота и 6 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием 0,01% HCl в воде в качестве растворителя А и 0,01% HCl в ацетонитриле в качестве растворителя В.
Выход: 146 мг (0,32 ммоль, в виде HCl-соли).
МС: м/з 426,5=[М+Н]+ (Расчетная Мм=425,5 г/моль).
Пример 7
Синтез линкерных реагентов 7а и 7b
Figure 00000022
7a: R=Н
7b: СН3
Синтез 7а:
Fmoc-Asp (t-Bu)-OH (300 мг, 0,73 ммоль), HOBt (1112 мг, 0,73 ммоль) и DIC (117 мкл, 0,73 ммоль) растворяют в 2 мл DMF и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Прибавляют Вос-этилендиамин (230 мг, 1,44 ммоль) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Прибавляют уксусную кислоту (300 мкл) и Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH2)2-NH-Boc очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 205 мг (0,37 ммоль)
МС промежуточного соединения: м/з 576,6=[М+Na]+ (Расчетная Мм=553,7 г/моль).
Fmoc-Asp (t-Bu)-NH-(CH2)2-NH-Boc (205 мг, 0,37 ммоль) растворяют в 3 мл 98/2 (об./об.) TFA/TES. Через 30 мин растворитель удаляют в потоке азота и полученный Fmoc-Asp(H)-NH-(CH2)2-NH2 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 140 мг (0,27 ммоль, в виде трифторацетатной соли)
МС промежуточного соединения: м/з 398,8=[М+Н]+ (Расчетная Мм=397,4 г/моль).
Fmoc-Asp(H)-NH-(CH2)2-NH2 (140 мг, 0,27 ммоль, в виде трифторацетатной соли) растворяют в 1 мл DMF и DIEA (140 мкл, 0,81 ммоль) и прибавляют boc2O (100 мг, 0,46 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем подкисляют уксусной кислотой (300 мкл). 7а очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход 7а: 120 мг (0,24 ммоль)
МС 7а: м/з 520,5=[М+Na]+ (Расчетная Мм=497,6 г/моль).
7b получают по методике, описанной выше за исключением того, что на первой стадии синтеза используют H2N-(СН2)2-N(СН3)-boc вместо Вос-этилендиамина в качестве амина.
Выход 7b: 115 мг
МС 7b: м/з 534,5=[M+Na]+ (Расчетная Мм=511,6 г/моль).
Пример 8
Синтез конъюгатов эксендин-линкер (8а, 8b и 8с)
Figure 00000023
8a: Rl=H, R2=H
8b: Rl=H, R2=CH3
8с: R1=СН3, R2=СН3
Синтез соединения 8а:
7а (30 мг, 60 мкмоль), HOBt (9 мг, 60 мкмоль), DIEA (12 мкл, 70 мкмоль) и DIC (10 мкл, 63 мкмоль) растворяют в 200 мкл DMF, и сразу же вводят в смолу, несущую защищенный в боковой цепи эксендин-4, (40 мг, 4 мкмоль), и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Смолу промывают десять раз DMF, а затем инкубируют в течение 5 мин в 500 мкл 1/1/2 уксусного ангидрида/пиридина/DMF. Смолу промывают 10 раз DMF и fmoc-группу удаляют. Присоединяют trt-меркаптопропионовую кислоту и 8а отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 3,6 мг
МС 8а: м/з 1108,5=[М+4Н]4+, 1477,8=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4432 г/моль).
8b получают по методике синтеза 8а за исключением того, что вместо 7а используют 7b.
Выход: 3,5 мг
МС 8b: м/з 1112,5=[М+4H]4+, 1482,5=[М+3Н]3+; (Расчетная Мм=4446 г/моль).
8с получают по методике синтеза 8а за исключением того, что вместо 7а используют 6.
Выход: 3,2 мг
МС 8 с: м/з 1116,2=[М+4Н]4+, 1487,8=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4460 г/моль).
Пример 9
Синтез конъюгатов ПЭГ40 кДа-линкер-эксендин (9а, 9b и 9с)
Figure 00000024
9a: Rl=H, R2=H
9b: Rl=H, R2=CH3
9c: Rl=CH3, R2=CH3
Синтез 9а:
8а (3,6 мг) растворяют в 300 мкл смеси вода/ацетонитрил 2/1 и прибавляют 50 мг ПЭГ40кДа-малеимида. Прибавляют 100 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, pH 7 и через 5 минут раствор подкисляют 50 мкл уксусной кислоты.
9а очищают ионообменной хроматографией с использованием 10 мМ натрий-цитратного буфера pH3 в качестве растворителя А и 10 мМ натрий-нитратного буфера, pH 3 и 1М NaCl в качестве растворителя В и ступенчатого градиента (от 0 до 40% растворителя В). Фракции, содержащие 9а, высаливают и лиофилизируют.
Выход: 14 мг
9b синтезируют как описано выше за исключением того, что используют 8b.
Выход: 15 мг
9с синтезируют как описано выше за исключением того, что используют 8с.
Выход: 13 мг
Пример 10
Синтез конъюгата жирная кислота-линкер-эксендин (10)
Figure 00000025
8с (1 мг) растворяют в 100 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и добавляют 1 (1 мг) в 100 мкл смеси 3/1 ацетонитрил/вода. Добавляют 100 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин, и полученное 10 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 1,3 мг
МС 10: м/з 1385,9=[M+4H}4+, 1846,3=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=5528,3 г/моль).
Пример 11
Синтез NHS-активированного лннкерного реагента (11)
Figure 00000026
7b (20 мг, 40 мкмоль), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (10 мг, 48 мкмоль) и N-гидроксисукцинимид (NHS) (8 мг, 70 мкмоль) растворяют в 300 мкл безводного DCM и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляют в потоке азота и 11 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и лиофилизируют.
Выход: 22 мг (36 мкмоль)
МС: м/з 631,5=[M+Na]+ (Расчетная Мм=608,7 г/моль).
Пример 12
Синтез конъюгата линкер-эксендин (флуоресцеин) (12а) и конъюгата линкер-GRF (1-29) (флуоресцеин) (12b)
Figure 00000027
12а: R= эксендин (εК27-флуоресцеин)
12b: R=GRF (1-29) (εК21-флуоресцеин)
6 (60 мг, 130 мкмоль HCl-соль), HOBt (20 мг, 130 мкмоль), DIEA (40 мкл, 230 мкмоль) и DIC (20 мкл, 126 мкмоль) растворяют в 700 мкл DMF и сразу же вводят в защищенный в боковой цепи эксендин-4 на полимерной смоле (120 мг, 12 мкмоль), и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Смолу промывают десять раз DMF, а затем инкубируют в течение 5 мин в 1 мл смеси уксусный ангидрид/пиридин/DMF (1/1/2, об./об./об.). Смолу промывают десять раз DMF и защитную группу Fmoc удаляют.Trt-меркаптопропионовую кислоту связывают по стандартной методике реакции сочетания и полученную смолу промывают пять раз DMF и затем еще десять раз DCM. Mmt-защитную группу лизина в положении 27 (Lys 27) удаляют при инкубации смолы пять раз в 2 мл смеси DCM/HFIP 9/1 (об./об.) в течение 5 мин. Смолу промывают пять раз DCM и затем еще десять раз DMF, после чего в смолу вводят 5,6-карбокси-флуоресцеин-МН8-сложный эфир (20 мг, 42 мкмоль) и DIEA (20 мкл, 115 мкл) в 300 мкл DMF и инкубируют в течение 30 мин. Полученное 12а отделяют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 12 мг
МС 12а: м/з 1205,9=[М+4Н]4+, 1607,0=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4818,3 г/моль).
12b синтезируют по методике синтеза соединения 12а за исключением того, что используют GRF (1-29) на полимерной смоле (120 мг, 12 мкмоль).
Выход: 11 мг
МС 12b: м/з=998,6=[M+4H]4+, 1330,5=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3989,6 г/моль).
Синтез меркаптопропионил-эксендина(флуоресцеин) (12с) и меркаптопропионил-GRF (1-29) (флуоресцеин) (12d)
Figure 00000028
12с: R= Эксендин (εК27-флуоресцеин)
12d: R=GRF (1-29) (εК27-флуоресцеин)
Trt-меркаптопропионовую кислоту связывают по стандартной методике реакции сочетания с защищенным в боковой цепи фрагментом эксендина-4 на полимерной смоле (120 мг, 12 мкмоль). Удаление Mmt-защитной группы Lys27 удаляют и реакцию сочетания 5,6-карбокси-флуоресцеин-МН8-сложного эфира проводят по методике синтеза 12а. 12 с отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 13 мг
МС 12с: м/з 1545,6=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4633 г/моль).
12d получают по методике синтеза 12с, за исключением того, что используют GRF (1-29) на смоле (120 мг, 12 мкмоль).
Выход: 11 мг
МС 12d: м/з 1269,1=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3804,3 г/моль).
Пример 13
Синтез обратимого ПЭГ40кДа-линкер-эксендин (флуоресцеин) конъюгата (13а) и обратимый PEG40kDa-линкер-GRF (1-29) (флуоресцеин) конъюгат (13b)
Figure 00000029
13a: R= эксендин (εК27-флуоресцеин)
13b: R=GRF(1-29) (εК21-флуоресцеин)
12а (12 мг) растворяют в 500 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и добавляют 120 мг ПЭГ40кДа-малеимида в 1 мл смеси 1/1 ацетонитрил/вода. Затем прибавляют 300 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера pH 7,0 и через 10 мин реакционный раствор подкисляют 300 мкл уксусной кислоты. 13a очищают методом катионообменной хрома-тографии, высаливают из раствора и лиофилизируют.
Выход: 51 мг
13b получают по методике синтеза 13a за исключением того, что вместо 12а используют 12b.
Выход: 46 мг
Синтез постоянного ПЭГ40кДа-эксендин (флуоресцеин) конъюгата (13с) и постоянного ПЭГ40кДа-GRF(1-29) (флуоресцеин) конъюгата (13d)
Figure 00000030
13с: R= эксендин (εК27-флуоресцеина)
13d: R=GRF (1-29) (εК21-флуоресцеина)
13с получают по методике синтеза 13a за исключением того, что вместо 12а используют 12с.
Выход: 55 мг
Соединение 13d получают по методике синтеза 13a за исключением того, что используют 12d вместо 12а.
Выход: 45 мг
Пример 14
Синтез конъюгата линкер-СКР-(1-29) (14)
Figure 00000031
14 получают по методике синтеза 8 с за исключением того, что используют защищенный в боковой GRF (1-29) на смоле.
Выход: 10 мг
МС 14: м/з 908,2=[М+4H]4+, 1211,2=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3631,3 г/моль).
Пример 15
Синтез конъюгата ПЭГ40кДа-линкер-GRF (1-29) (15)
Figure 00000032
15 получают по методике синтеза 9с за исключением того, что используют 14, а для осуществления катионообменной хроматографии используют 10 мМ цитрат натрия, pH 4 в качестве растворителя А и 10 мМ цитрат натрия pH 4 и 1 М хлорид натрия в качестве растворителя В.
Выход: 11 мг
Пример 16 Синтез линкерного интермедиата (16)
Figure 00000033
N,N-диметилэтилендиамин (198 мкл, 1,8 ммоль) и NaCNBH3 (58 мг, 0,9 ммоль) растворяют в метаноле (5 мл) и раствор доводят до pH 5,5 прибавлением уксусной кислоты (250 мкл). Прибавляют суспензию 2,4,6-триметоксибензальдегида (294 мг, 1,5 ммоль) в этаноле (5 мл) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляют 5 н HCl (0,5 мл) и смесь перемешивают в течение еще 12 часов. Растворитель упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в насыщенном растворе NaHCO3 и трижды экстрагируют в DCM. Объединенные органические фазы сушат над NaSO4 и растворитель упаривают при пониженном давлении.
Выход: 303 мг (1,13 ммоль)
МС: м/з 269,3=[M+H]+ (Расчетная Мм=268,4 г/моль)
Пример 17
Синтез линкера 17а и 17b
Figure 00000034
Синтез 17а:
Fmoc-Asp(OtBu)-OH (322 мг, 0,78 ммоль), Тmob-защищенный диамин (соединение 16) (150 мг, 0,56 ммоль), HATU (0-7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат) (255 мг, 0,67 ммоль) и DIEA (290 мкл, 1,68 ммоль) растворяют в DMF (1,5 мл). Смесь перемешивают в течение 30 мин, подкисляют уксусной кислотой и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 463 мг (5,97 ммоль, в виде трифторацетатной соли, чистота около 90%.)
MC Fmoc-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH2CH2N(CH3)2: м/з 662,5=[М+Н]+ (Расчетная Мм=661,8 г/моль)
Fmoc-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH2CH2N(CH3)2 (225 мг, 0,29 ммоль) растворяют в растворе пиперидина (50 мкл) и DBU (15 шел) в DMF (1,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Прибавляют АсОН и полученное соединение H-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH2CH2N(CH3)2 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 114 мг (0,21 ммоль, в виде трифторацетатной соли)
MC H-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH2CH2N(CH3)2: м/з 462,4=[М+Н]+ (Расчетная Mw=439,6 г/моль)
Трифторацетатную соль H-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH2CH2N(CH3)2 (114 мг, 0,21 ммоль) растворяют в насыщенном растворе NaHCO3 (10 мл) и экстрагируют DCM (3×10 мл). Объединенные органические слои сушат над NaSO4 и растворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в DMF (1,0 мл), и к полученному раствору прибавляют 6-тритилметилмеркаптогексановую кислоту (121 мг, 0,31 ммоль), HATU (118 мг, 0,31 ммоль) и DIEA (108 мкл, 0,62 ммоль). Смесь перемешивают в течение 30 мин. Прибавляют АсОН (200 мкл) и TrtS(CH2)5CONH-Asp(OtBu)-N(TmOb)CH2CH2N(CH3)2 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 95 мг (0,10 ммоль, в виде трифторацетатной соли)
MC TrtS(CH2)5CONH-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH2CH2N(CH3)2: м/з 812,64=[М+Н]+ (Расчетная Мм=812,1 г/моль)
TrtS(CH2)5CONH-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH2CH2N(CH3)2 (95 мг, 0,10 ммоль) растворяют в смеси МеОН/Н2О 3:1 (1,0 мл), прибавляют LiOH (7,4 мг, 0,31 ммоль) и реакционную смесь встряхивают в течение 5 часов при 60°C. Прибавляют АсОН (100 мкл) и 17а очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 64 мг (0,07 ммоль, в виде трифторацетатной соли)
MC 17а: м/з 756,5=[М+Н]+ (Расчетная Мм=756,0 г/моль)
17b синтезируют по методике, описанной выше за исключением того, что на первой стадии вместо Fmoc-Asp(OtBu)-OH используют Fmoc-NMe-Asp(OtBu)-OH.
Выход 17b: 16 мг (18 мкмоль, в виде трифторацетатной соли)
MC 17b: м/з 770,5=[М+Н]+ (Расчетная Мм=770,0 г/моль)
Пример 18
Синтез конъюгатов линкер-BNP (18а и 18b)
Figure 00000035
Синтез 18а:
17а (8,0 мг, 0,01 ммоль), РуВОР (5,2 мг, 10 мкмоль) и DIEA (7 мкл, 40 мкмоль) растворяют в DMF (400 мкл) и полученный раствор сразу же добавляют к смоле, связанной с защищенным в боковой цепи BNP-32a (50 мг, 5 мкмоль). После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре, смолу промывают десять раз DMF, затем еще 10 раз DCM и сушат под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 10,6 мг
MC 18а: м/з 930,4=[M+4H]4+, 1240,1=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3717,2 г/моль)
18b синтезируют по методике, описанной выше за исключением того, что 17b используют вместо 17а.
Выход: 4,7 мг
MC 18b: м/з 933,9=[М+4Н]4+, 1244,7=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3731,0 г/моль)
Пример 19
Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер-BNP (19а и 19b)
Figure 00000036
18а (5,2 мг) растворяют в смеси H2O/ацетонитрил 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Прибавляют раствор, содержащий ПЭГ40кДа-малеимид, (70 мг) в смеси 1:1 H2O/ацетонитрил (1,5 мл) и фосфатный буфер (30 мкл, pH 7,4, 0,5 М). Раствор инкубируют при комнатной температуре, и через 5 мин прибавляют АсОН (30 мкл). 19а очищают методом катионообменной хроматографии, высаливают из раствора и лио-филизируют.
Выход: 19,2 мг
19b получают по методике синтеза 19а за исключением того, что вместо 18а используют 18b.
Пример 20
Синтез линкера 20
Figure 00000037
Fmoc-Asp(OH)OtBu (100 мг, 0,24 ммоль), H2N-(CH2)2-N(CH3)-boc (36 мкл, 0,20 ммоль), HATU (92 мг, 0,24 ммоль) и DEEA (105 мкл, 0,60 ммоль) растворяют в 1 мл DMF. Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре, подкисляют уксусной кислотой (100 мкл) и очищают методом ВЭЖХ.
Выход: 91 мг (0,13 ммоль)
MC Fmoc-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu: 590,3=[M+Na]+ (Расчетная Мм=567,7 г/моль)
Fmoc-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu (91 мг, 0,13 ммоль) растворяют в DMF (1,0 мл), прибавляют пиперидин (50 мкл) и DBU (15 мкл) и полученную смесь перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Добавляют уксусную кислоту (100 мкл) и полученный NH2-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 39 мг (0,09 ммоль, в виде трифторацетатной соли)
MC NH2-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu: м/з 368,1=[M+Na]+ (Расчетная Мм=345,4 г/моль)
NH2-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu (36 мг, 0,09 ммоль) растворяют в DMF (0,5 мл), к полученному раствору прибавляют 6-тритилметилмеркаптогексановую кислоту (55 мг, 0,14 ммоль), HATU (53 мг, 0,14 ммоль) и DIEA (49 мкл, 0,28 ммоль). Смесь перемешивают в течение 45 мин. Прибавляют АсОН (100 мкл) и TrtS(CH2)5CONH-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 41 мг (0,06 ммоль)
MC TrtS(CH2)5CONH-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu: м/з 740,6=[M+Na]+ (Расчетная Мм=718,0 г/моль)
TrtS(CH2)5CONH-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu (41 мг, 0,06 ммоль) растворяют в смеси 1:1 диоксан/Н2О (1,0 мл), прибавляют LiOH (4,1 мг, 0,17 ммоль) и смесь перемешивают при 60°C в течение 1 часа. Прибавляют АсОН (50 мкл) и 20 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 31 мг (0,05 ммоль)
MC 20: м/з 684,5=[M+Na]4+ (Расчетная Мм=661,9 г/моль)
Пример 21
Синтез конъюгата линкер-эксендин (21)
Figure 00000038
Связанный с полимерной смолой защищенный в боковой цепи эксендин (50 мг, 5 мкмоль) с Mmt-защитной группой по Lys27 сначала защищают на N-конце Вос-группой (см. Материалы и методы), а затем инкубируют пять раз (по 5 мин) 2 мл смеси DCM/HFIP 9/1 (об./об.) для снятия Mmt защитной группы с Lys27. Соединение 20 (6,6 мг, 10 мкмоль), РуВОР (5,2 мг, 10 мкмоль) и DIEA (7 мкл, 40 мкмоль) растворяют в DMF (400 мкл) и сразу же добавляют к смоле. После инкубации в течение 3 часов при комнатной температуре смолу промывают десять раз DMF и десять раз DCM и сушат под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 2,4 мг
МС 21: м/з 1497,2=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4488,0 г/моль)
Пример 22
Синтез конъюгата жирная юнслота-линкер-эксендин (22)
Figure 00000039
21 (2,6 мг) растворяют в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и прибавляют соединение 1 (0,8 мг) в 400 мкл смеси ацетонитрил/вода, 7/3. Прибавляют 100 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин, после чего 22 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 2,4 мг
МС 22: м/з 1388,3=[М+4Н]4+; 1857,1=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=5566,4 г/моль).
Пример 23
Синтез предшественника 23
Figure 00000040
6-Тритилмеркаптогексановую кислоту (200 мг, 0,51 ммоль), (PfpO)2CO (202 мг, 0,51 ммоль) и коллидин (340 мкл, 2,65 ммоль) растворяют в DMSO (1 мл) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смесь прибавляют к раствору Fmoc-Lys-OH (170 мг, 0,46 ммоль) в смеси Н2О/пиридине/tBuOH (3:03:01, 6 мл). Реакционную смесь затем нагревают при 60°C в течение 2 часов, затем разбавляют EtOAc, экстрагируют дважды 0,1 М H2SO4, обрабатывают дважды солевым раствором и сушат на Na2SO4. Растворитель отгоняют при пониженном давлении и остаток очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 109 мг
МС 23: м/г 741,3=[М+Н]+ (Расчетная Мм=741,0 г/моль)
Пример 24
Синтез линкера (24а-24с)
Figure 00000041
24а: R1=Н, R2=boc
24b: R1=Me, R2=boc
24c: Rl=R2=Me
23 (186 мг, 0,25 ммоль) и DEEA (160 мкл, 0,92 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), вводят в 2-хлортритилхлоридую смолу (312 мг, 1,3 ммоль/г) и перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Добавляют метанол (0,6 мл) и смолу инкубируют еще 15 мин. Смолу промывают DCM (10 раз) и ДМФ (10 раз). Снятие Fmoc-защиты и образование мочевины осуществляют в соответствии с общими методами синтеза (см. Материалы и методы) путем проведения взаимодействия с N-boc-этилендиамином (57 мкл, 0,34 ммоль). Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 14 мг
МС 24а: м/з 705,4=[М+Н]+, 727,3=[M+Na]+ (Расчетная Мм=704,9 г/моль)
Соединение 24b получают по методике синтеза 24а за исключением того, что используют N-boc-N-метилэтилендиамин вместо N-boc-этилендиамина.
Выход: 21 мг
МС 24b: м/з 719,3=[М+Н]+, 741,4=[M+Na]+ (Расчетная Мм=719,0 г/моль)
24c получают по методике синтеза 24а за исключением того, что используют N,N-диметилэтилендиамин вместо N-boc-этилендиамина.
Выход: 10 мг
МС 24c: м/з 633,2=[М+Н]+ (Расчетная Мм=632,9 г/моль)
Пример 25
Синтез конъюгатов эксендин-линкер (25а-25с)
Figure 00000042
24а (7,0 мг, 0,01 ммоль), РуВОР (5,2 мг, 10 мкмоль) и DIEA (7 мкл, 40 мкмоль) растворяют в DMF (250 мкл), полученный раствор сразу же добавляют к смоле, связанной с защищенным в боковой цепи эксендином (50 мг, 5 мкмоль), и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз), DCM (10 раз) и сушат под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 1,6 мг
МС 25а: м/з 1511,8=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4530,8 г/моль)
25b получают по методике синтеза 25а за исключением того, что вместо 24а используют 24b.
Выход: 4,3 мг
МС 25b: м/з 1516,3=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4544,8 г/моль)
25с получают по методике синтеза 25а за исключением того, что используют 24с вместо 24а.
Выход: 1,3 мг
МС 25с: м/з 1520,4=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4558,8 г/моль)
Пример 26
Синтез конъюгатов жирная кислота-линкер (26а-26с)
Figure 00000043
25а (1,6 мг) растворяют в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и добавляют соединение 1 (0,11 мг) в 200 мкл ацетонитрил/вода, 7/3. В реакционную смесь добавляют 30 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин, после чего 26а очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
МС соединения 26а: м/з 1870,0=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=5609,2 г/моль).
26b получают по методике синтеза 26а за исключением того, что используют 25b вместо 25а.
МС 26b: м/з 1875,9=[М+3Н]3+, 1406,7=[M+4H]4+, (Расчетная Мм=5623,2 г/моль)
26с получают по методике синтеза 26а за исключением того, что вместо 25а используют 25с.
МС 26с: м/з 1879,4=[М+3Н]3+, 1410,5=[М+4Н]4+, (Расчетная Мм=5637,2 г/моль)
Пример 27
Синтез конъюгатов ПЭГ20кДа-линкер-эксендин (Соединение 27а-27с)
Figure 00000044
25а (2,0 мг) растворяют в смеси H2O /MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (18 мг) в смеси 1:1 H2O/MeCN (1 мл) и фосфатный буфер (15 мкл, pH 7,4, 0,5 М). Раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 27а очищают методом катионо-обменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.
27b получают по методике синтеза 27а за исключением того, что используют 25b вместо 25а.
27с получают по методике синтеза 27а за исключением того, что используют 25с вместо 25а.
Пример 28
Синтез линкера 28
Figure 00000045
6-Бромгексаноилхлорид (46 мкл, 0,31 ммоль) растворяют в 0,2 мл CH2Cl2 и вводят в раствор, содержащий H2N-CH2-CH2-STrt (100 мг, 0,28 ммоль), DEEA (97 мкл, 0,56 ммоль) в CH2Cl2 (0,8 мл). Смесь перемешивают в течение 2 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь подкисляют АсОН (50 мкл) и растворитель отгоняют под вакуумом. После очистки остатка на силикагеле (гептан/EtOAc=1:1) получают соединение Br-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 137 мг (0,276 ммоль, 98%)
МС Br-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt: 518,9=[M+Na]+, (Расчетная Мм=496,5 г/моль)
N-boc-этилендиамин (81 мкл, 0,51 ммоль) добавляют к раствору, содержащему Br-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt (230 мг, 0,46 ммоль) и Na2CO3 (196 мг, 1,85 ммоль) в ДМФ (0,8 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 10 часов при 70°C. После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляют 4 мл смеси MeCN/H2O, 25:75 в присутствии 1% TFA и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Boc-NH-(CH2)2-NH-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 189 мг (0,27 ммоль, 59%, в виде трифторацетатной соли)
МС соединения Boc-NH-(CH2)2-NH-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt: 576,5=[M+H]+, (Расчетная Мм=575,5 г/моль)
Boc-NH-(CH2)2-NH-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt (189 мг, 0,27 ммоль) и НСНО (35% водный раствор, 113 мкл) растворяют в MeCN (1,5 мл) и к полученной смеси добавляют СНВН3 (34 мг, 0,54 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре. После завершения реакции (при мониторинге масс-спектрометрией) раствор разбавляют H2O (5 мл) и экстрагируют CH2Cl2 (трижды по 5 мл). Объединенные органические слои сушат над MgSO4, фильтруют и растворитель отгоняют под вакуумом. После очистки остатка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Boc-NH-(CH2)2-N(CH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 62,8 мг (0,11 ммоль, 39%)
МС Boc-NH-(CH2)2-N(CH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt: 590,6=[М+Н]+, (Расчетная Мм=5 89,0 г/моль)
Boc-NH-(CH2)2-N(CH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt (62,8 мг, 0,11 ммоль) растворяют в THF (6 мл) и прибавляют раствор HCl в диоксане (130 мкл, 4 М раствор). Реакционную смесь перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Прибавляют 200 мкл HCl в диоксане и растворитель отгоняют под вакуумом. После очистки остатка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают смесь H2N-(CH2)2-N(CH3-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt и не прореагировавшее исходное соединение Boc-NH-(CH2)2-N(CH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 32,8 мг (0,062 ммоль, 44%, в виде гидрохлоридной соли) соединения 28 и 14,7 мг (0,025 ммоль, 23%, в виде трифторацетатной соли) исходного соединения МС 28: 490,5=[М+Н]+, (Расчетная Мм=489,0 г/моль)
Пример 29
Общая методика синтеза замещенных карбоновыми кислотами предшественников BNP (29а и 29b)
Figure 00000046
Цис-пиклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты ангидрид (231 мг, 1,5 ммоль) и пиридин (271 мкл, 2 ммоль) растворяют в DCM (2 мл) и полученный раствор сразу же добавляют к смоле, связанной с защищенным в боковой цепи BNP-32a (300 мг). После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре полученный продукт промывают 10 раз DCM и высушивают под вакуумом.
Figure 00000047
Защищенный в боковой цепи фрагмент BNP-32, связанный со смолой, несущий ivDde-защитную группу у Lys 14, вначале защищают Вос-группой на N-конце, снимают защиту в положении Lys14 (см. Материалы и методы), а затем подвергают взаимодействию с пис-пиклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты ангидридом, как описано выше для 29а.
Пример 30
Синтез BNP-лннкер-тиолов (30а и 30b).
Figure 00000048
Соединение 28 H2N-(CH2)2-N(CH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt (5,2 мг, 0,01 ммоль), РуВОР (5,2 мг, 0,01 ммоль) и DIEA (7,0 мкл, 0,04 ммоль) растворяют в DMF (300 мкл) и полученный раствор добавляют к защищенному в боковой цепи BNP, связанному со смолой, 29а (50 мг, 0,005 ммоль). После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре смолу промывают DMF (10 раз), DCM (10 раз) и высушивают под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 9,8 мг
МС 30а: м/з 947,6=[M+4H]4+, 1263,1=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3786,3 г/моль)
Figure 00000049
30Ь получают по методике описанной выше за исключением того, что вместо 29а используют связанное со смолой производное BNP 29b.
Выход: 7,4 мг
МС соединения 30b: м/з 947,5=[M+4H]4+, 1263,0=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3786,3 г/моль)
Пример 31
Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер-BNR (31а и 31b)
Figure 00000050
30а (4 мг) растворяют в смеси H2O/MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (42,2 мг) в смеси H2O/MeCN, 1:1 (1 мл) и фосфатный буфер (15 мкл, pH 7,4, 0,5 М). Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 31а очищают методом катионообменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.
Выход: 2,0 мг
Figure 00000051
31b получают по методике синтеза 31а за исключением того, что вместо 30а используют 30b.
Выход: 16,8 мг
Пример 32
Синтез линкера 32
Figure 00000052
3-Бромпропионилхлорид (62,5 мкл, 0,62 ммоль) растворяют в 0,5 мл CH2Cl2 и добавляют в раствор H2N-CH2-CH2-STrt (200 мг, 0,56 ммоль), DDBA (196 мкл, 1,1 ммоль) в CH2Cl2 (1 мл). Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь подкисляют АсОН (100 мкл) и растворитель удаляют под вакуумом. После очистки остатка на силикагеле (гептан/EtOAc=1:1) получают Br-(CH2)2CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 223 мг (0,49 ммоль, 87%)
МС Br-(CH2)2CONH-(CH2)2-STrt: 478,7=[M+Na]+, (Расчетная Мм=454,7 г/моль)
N-Alloc-этилендиамина гидрохлоридную соль (43,5 мг, 0,24 ммоль) и DIEA (38 мкл, 0,22 ммоль) прибавляют к раствору, содержащему Br-(CH2)2CONH-(CH2)2-STrt (100 мг, 0,22 ммоль) и Na2CO3 (93 мг, 0,87 ммоль) в DMF (1 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 10 часов при температуре 70°C. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляют 4 мл (MeCNZHhO=25:75 в присутствии 0,1% TFA) и очищают ВЭЖХ с получением Alloc-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 61 мг (0,096 ммоль, 44%, в виде трифторацетатной соли)
МС Alloc-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-CONH-(CH2)2-STrt: 540,8=[M+Na]+, (Расчетная Мм=517,8 г/моль)
Alloc-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-CONH-(CH2)2-STrt (60,9 мг, 0,096 ммоль) растворяют в CH2Cl2 и Boc2O (42 мг, 0,19 ммоль). Раствор перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре. По завершения взаимодействия реакционную смесь гасят добавлением 70 мкл АСОН и растворитель упаривают под вакуумом. Остаток разбавляют 4 мл MeCNZH2O (25:75, в присутствии 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Alloc-NH-(CH2)2-N(Boc)-(CH2)2-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 53,3 мг (0,086 ммоль, 89%)
MC Alloc-NH-(CH2)2-N(Boc)-(CH2)2-CONH-(CH2)2-STrt: 640,6=[M+Na]+, (Расчетная Мм=617,9, г/моль)
Alloc-NH-(CH2)2-N(Boc)-(CH2)2-CONH-(CH2)2-STrt (48,3 мг, 0,078 ммоль) растворяют в THF, прибавляют формиат триэтиламмония (62 мкл) и Pd (PPh3)4 (16 мг). Раствор перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре с осуществлением масс-спектрометрического мониторинга протекания реакции. По завершении реакции растворитель упаривают под вакуумом. Остаток растворяют в MeCN/Н2О (50:50, с 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают H2N-(CH2)2-N(Boc)-(CH2)2-CONH-(CH2)2-STrt (31).
Выход: 20,1 мг (0,031 ммоль, 40%, в виде трифторацетатной соли)
MC 31: 534,6=[М+Н]4+, 556,6=[M+Na]+, (Расчетная Мм=533,5 г/моль)
Пример 33
Синтез BNP-линкер-тиолов (Соединение 33а и 33b)
Figure 00000053
Соединение 33а получают по методике синтеза соединения 30а за исключением того, что вместо соединения 28 используют 32.
Выход: 8,0 мг
MC 33а: м/з 933,5=[М+4Н]4+, 1244,3=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3729,9 г/моль)
Figure 00000054
33b получают по методике синтеза 30Ь за исключением того, что вместо 28 используют 32.
Выход: 5,0 мг
MC 33b: м/з 933,5=[М+4Н]4+, 1244,3=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3715,9 г/моль)
Пример 34
Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер-BNP (34а и 34b)
Figure 00000055
33а (4,3 мг) растворяют в смеси H2O/MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (42,2 мг) в смеси Н2О/МеСМ, 1:1 (1 мл) и фосфатный буфер (20 мкл, pH 7,4, 0,5 М). Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 34а очищают методом катионообменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.
Выход: 9,7 мг
Figure 00000056
34b получают по методике синтеза 34а за исключением того, что вместо 33а используют 33b.
Выход: 11,5 мг
Пример 35
Синтез линкера 35
Figure 00000057
Бромацетилбромид (54 мкл, 0,62 ммоль) растворяют в 0,5 мл CH2Cl2 и добавляют к раствору, содержащему H2N-CH2-CH2-STrt (200 мг, 0,56 ммоль) и DEEA (196 мкл, 1,1 ммоль) в CH2Cl2 (1 мл). Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь подкисляют уксусной кислотой (100 мкл) и растворитель упаривают под вакуумом. После очистки остатка очищают на силикагеле (гептан/EtOAc=1:), получая Br-CH2-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 245 мг (0,55 ммоль, 99%)
МС Br-CH2-CONH-(CH2)2-STrt: 462,4=[M+Na]+, (Расчетная Мм=440,4 г/моль)
N-Alloc-этилендиамина гидрохлоридную соль (45 мг, 0,25 ммоль) и DIEA (79 мкл, 0,45 ммоль) прибавляют к раствору, содержащему Br-CH2-CONH-(CH2)2-STrt (100 мг, 0,23 ммоль) в DMF (1 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 10 часов при температуре 70°C. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляют H2O/Et2O (1:1, 40 мл) и образованные слои разделяют. Водный слой экстрагируют несколько раз Et2O. Объединенные органические слои сушат над MgSO4, фильтруют и растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают на силикагеле (DCM/MeOH=95:5), давая Alloc-NH-(CH2)2-NH-CH2-CONH-(CH2)2-STrt. Выход: 94 мг (0,186 ммоль, 82%, содержит остаточный DMF)
МС Alloc-NH-(CH2)2-NH-CH2-CONH-(CH2)2-STrt: 526,8=[M+Na:T, (Расчетная Мм=503,8 г/моль)
Alloc-NH-(CH2)2-NH-CH2-CONH-(CH2)2-STrt (94 мг, 0,186 ммоль, с остатком DMF) растворяют в CH2Cl2 и к полученному раствору прибавляют Boc2O (81 мг, 0,37 ммоль). Раствор перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре. По завершения взаимодействия реакционную смесь гасят добавлением 100 мкл АсОН и растворитель упаривают под вакуумом. Остаток разбавляют 4 мл MeCN/H2O (25:75, в присутствии 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Alloc-NH-(CH2)2-N(Boc)-CH2-CONH-(CH2)2-STrt.
Выход: 34,7 мг (0,057 ммоль, 26%)
МС Alloc-NH-(CH2)2-N(Boc)-CH2-CONH-(CH2)2-STrt: 603,9=[M+Na:T (Расчетная Мм=603,9 г/моль)
Alloc-NH-(CH2)2-N(Boc)-CH2-CONH-(CH2)2-STrt (34,7 мг, 0,048 ммоль) растворяют в THF, прибавляют формиат триэтиламмония (38 мкл) и Pd (PPh3)4 (5 мг). Раствор перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре с осуществлением масс-спектрометрического мониторинга протекания реакции. По завершении реакции растворитель упаривают под вакуумом. Остаток растворяют в MeCN/H2O (50:50, с 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают H2N-(CH2)2-N(Boc)-CH2-CONH-(CH2)2-STrt соединения 35.
Выход: 12,6 мг (0,019 ммоль, 42%, в виде трифторацетатной соли)
МС 35: 520,1=[М+Н]+, 542,2=[М+Na]+, (Расчетная Мм=519,2 г/моль)
Пример 36
Синтез BNP-лннкер-тиолов (36а и 36b)
Figure 00000058
36а получают по методике синтеза 30а за исключением того, что вместо 28 используют 35.
Выход: 9,1 мг
МС 36а: м/з 930,0=[M+4H]4+, 1239,6=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3715,9 г/моль)
Figure 00000059
36b получают по методике синтеза 30b за исключением того, что вместо соединения 28 используют соединение 35.
Выход: 8,0 мг
МС 36b: м/з 929,5=[М+4Н]4+, 1239,5=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=3715,9 г/моль)
Пример 37
Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер-BNP (31а и 31b)
Figure 00000060
Соединение 36а (4,2 мг) растворяют в смеси H2O/MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (68 мг) в смеси H2O/MeCN, 1:1 (1 мл) и фосфатный буфер (20 мкл, pH 7,4, 0,5 М). Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 37а очищают методом ионнообменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.
Выход: 16 мг
Figure 00000061
37b синтезируют по методике получения 37а, за исключением того, что вместо 36а используют 36b.
Выход: 18,5 мг
Пример 38
Синтез конъюгатов линкер-эксендин
Конъюгаты линкер-эксендин получают в соответствии с общим методами синтеза С, D, Е или F.
Figure 00000062
Метод А
Синтез: Ангидрид дикислоты (0,2 ммоль) и пиридин (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь добавляют к защищенному в боковой цепи эксен-дину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). РуВОР (0,1 ммоль) и диамин (0,1 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь вводят в смолу и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".
Метод В
Синтез проводят по методике Метода А исключением того, что вместо ангидрида дикислоты и пиридина используют дикислоту (0,2 ммоль), HOBt (0,2 ммоль), DIC (0,2 ммоль), и коллидин (0,4 ммоль).
Метод С
Синтез: диамин (0,6 ммоль) растворяют в 1 мл сухого DCM и к полученному раствору прибавляют ангидрид дикислоты (0,4 ммоль). Смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. DCM упаривают, остаток растворяют в смеси ACN/вода/АсОН, полученную аминокислоту очищают методом обращенно-фазовой хроматографии и лиофилизируют.
Полученную аминокислоту (0,1 ммоль), HOBt (0,1 ммоль), DIC (0,1 ммоль) и коллидин (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь прибавляют к эксендину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".
Метод D
Синтез: Ангидрид дикислоты (0,2 ммоль) и пиридин (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь добавляют к эксендину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). РуВОР (0,1 ммоль), HOBt (0,1 ммоль) и коллидин (0,4 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь вводят в смолу и интенсивно перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Диамин (0,1 ммоль) и DIEA (0,3 ммоль) растворяют в смеси 0,4 мл DMF и 0,4 мл этанола. Полученную смесь добавляют к смоле и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".
Метод Е
Синтез: Fmoc-аминокислоту (0,1 ммоль), РуВОР (0,1 ммоль) и DIEA (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь добавляют к эксендину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Fmoc защитную группу удаляют путем инкубации смолы в смеси DMF/пиперидин, 4/1 (об./об.) 2 раза по 10 мин. Смолу промывают DMF (10 раз) и DCM (10 раз). Пара-нитрофенилхлорформиат (0,1 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого THF и DIEA (0,2 ммоль). Полученную смесь добавляют к смоле и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DCM (10 раз). Диамин (0,1 ммоль) растворяют в 0,3 мл DMF. Смесь добавляют к смоле и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обра-щенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".
Метод F
Синтез проводят по методике Метода А с последующим снятием Fmoc-защиты и ацетилированием: Fmoc защитную группу удаляют посредством инкубации смолы в смеси DMF/пиперидин, 4/1 (об./об.) 2 раза по 10 мин. Смолу промывают DMF (10 раз). Ацетилирование осуществляют инкубацией смолы в смеси ангидрид уксусной кислоты/пиридин/DMF (1/1/2, (об./об./об.) в течение 30 мин. Полученную смолу промывают DMF (10 раз).
Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".
Более подробная информация, касающаяся синтезированных соединений, исходных материалов, методе синтеза, молекулярной массе (Мм) и данные масс-спектрометрии приведены на Фиг. 2.
Пример 39
Синтез конъюгатов гидрогель-линкер-эксендин (39)
Figure 00000063
Функционализированные малеиимидом гидрогелевые микрочастицы синтезируют методом, описанным в ЕР 1625856 А1.
30 мг микрочастиц малеимид-модифипированного гидрогеля (загрузка 40 мкмоль/г, 1,2 мкмоль) подвергают взаимодействию с 6 мг соединения 25а (1,32 мкмоль, 1,1 экв) в 600 мкл смеси ацетонитрил/50 Мм фосфатный буфер (pH 7,4), 20/80 (об./об.) в течение 10 минут с образованием микрочастиц гидрогеля 39, нагруженного конъю-гатом эксендина с линкером. Нагруженный гидрогель 39 промывают 5 раз смесью ацетонитрил/вода 50/50 (об./об.) и три раза водой.
Пример 40
Синтез линкера 40
Figure 00000064
Fmoc-Ala-OH (250 мг, 0,8 ммоль) и DEEA (170 мкл, 1,0 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), полученную смесь добавляют 2-хлортритилхлоридной смоле (312 мг, 1,3 ммоль/г) и перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Прибавляют метанол (0,6 мл) и смолу инкубируют еще 15 мин. Смолу промывают DCM (10 раз) и DMF (10 раз). Снятие Fmoc-защиты и образование мочевины обеспечивают в соответствии с общей методикой проведения синтеза (см. раздел "Материалы и методы") путем проведения взаимодействия с линкерным промежуточным соединением 5а, полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 53 мг
МС соединения 40: м/з 604,4 [М+Н]+ (Расчетная Мм=603,8 г/моль)
Пример 41
Синтез конъюгата эксендин-линкер (41)
Figure 00000065
Соединение 40 (в виде гидрохлоридной соли, 14,0 мг, 0,02 ммоль), РуВОР (10,2 мг, 0,02 ммоль) и DIEA (17 мкл, 0,1 ммоль) растворяют в DMF (300 мкл), полученный раствор сразу же добавляют к защищенному в боковой цепи эксендину-4, связанному со смолой, (100 мг, 10 мкмоль) и инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10x), DCM (10х) и высушивают под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход: 5,4 мг МС 40: м/з 1510,9=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4530,1 г/моль)
Пример 42
Синтез конъюгата жирная кислота-линкер (42)
Figure 00000066
41 (1,6 мг) растворяют в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 3/1 и к полученному раствору прибавляют соединение 1 (0,11 мг) в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 3/1. Затем прибавляют 30 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 минут, после чего 42 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
МС 42: м/з 1870,2=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=5608,4 г/моль).
Пример 43
Синтез конъюгата гадрогель-линкер-эксендин (43)
Figure 00000067
43 получают по методике синтеза 39 за исключением того, вместо 25 используют 41.
Пример 44
Синтез линкера (44)
Figure 00000068
44 получают по методике синтеза 40 за исключением того, вместо 5а используют 28.
Выход: 74 мг
МС 44: м/з 605,4=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=604,8 г/моль)
Пример 45
Синтез конъюгата эксендин-линкер (45)
Figure 00000069
45 получают по методике синтеза 41 за исключением того, вместо 40 используют 44. Выход: 6,0 мг
МС 45: м/з 1511,3=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4531,1 г/моль)
Пример 46
Синтез конъюгата жирная кислота-линкер (46)
Figure 00000070
46 получают по методике синтеза 42 за исключением того, вместо 41 используют 45. МС соединения 46: м/з 1870,5 3=(Расчетная Мм=5609,5 г/моль).
Пример 47
Синтез промежуточного линкерного соединения 47
Figure 00000071
Тритилсульфид (247 мг, 0,89 ммоль) суспендируют в 1 мл DMSO. Добавляют DBU (152 мкл, 1,02 ммоль) и 6-бромегексан-1-ол (173 мг, 0,96) и полученную смесь перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь растворяют в 20 мл этилацетата и промывают 1 н H2SO4 (2х) и солевым раствором (3х). Органический слой сушат (Na2SO4) и летучие компоненты упаривают в вакууме. Полученный продукт очищают флэш-хроматографией на силикагеле (гептан/AcOEt, 1/1). Выход: 283 мг (8-тритил)-6-меркаптогексан-1-ола.
(S-тритил)-6-меркаптогексан-1-ол (466 мг, 1,24 ммоль) растворяют в смеси растворителей, содержащей 3,5 мл DCM, 0,5 мл ДМСО и 0,6 мл NEt3, и затем реакционную смесь охлаждают на ледяной бане. SO3-пиридин (408 мг, 2,57 ммоль) суспендируют в 0,5 мл DMSO и добавляют к реакционной смеси. Убирают ледяную баню и реакционную смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь растворяют в 20 мл Et2O и экстрагируют с использованием 1 н H2SO4 (2х) и солевого раствора (3х). Органический слой сушат (Na2SO4) и летучие компоненты упаривают в вакууме. Полученный продукт очищают флэш-хроматографией на силикагеле (гептан /AcOEt 1/1).
Выход: 390 мг соединения 47 в форме (8-тритил)-6-меркаптогексан-1-аля.
МС 47: м/з 243,1=[Trt]+ 413,1=[М+К]+ (Расчетная Мм=374,4 г/моль)
Пример 48
Синтез линкера (48)
Figure 00000072
Fmoc-Ala-OH (250 мг, 0,8 ммоль) и DIEA (170 мкл, 1,0 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), полученную смесь добавляют к 2-хлортритилхлоридной смоле (312 мг, 1,3 ммоль/г) и перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Прибавляют метанол (0,6 мл) и смолу инкубируют еще 15 мин. Смолу промывают DCM (10х) и DMF (10х). Снятие Fmoc-защиты и образование мочевины обеспечивают в соответствии с общей методикой проведения синтеза (см. раздел "Материалы и методы") посредством проведения взаимодействия смолы с этилендиамином. Для восстановительного алкилирования соединение 47 (299 мг, 0,8 ммоль) и Na(OAC)3BH (340 мг, 1,6 ммоль) растворяют в 0,5 мл DMF, 0,5 мл метанола и 10 мкл АсОН, добавляют к смоле и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10х) и DCM (10х). Защиту Вос-ангидридом осуществляют интенсивным перемешиванием смолы в растворе, содержащем Вос-ангидрид (218 мг, 1,0 ммоль) и DIEA (170 мкл, 1,0 ммоль) в DCM. Смолу промывают DCM (10х) и образованный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выход: 34 мг
МС 48: м/з 634,2 [М+Н]+ (Расчетная Мм=633,9 г/моль)
Пример 49
Синтез конъюгата эксендин-лиякер (49)
Figure 00000073
49 получают по методике синтеза 41 за исключением того, вместо 40 используют 48. Выход: 4,8 мг
МС 49: м/з 1487,3=[М+3Н]3+ (Расчетная Мм=4460,0 г/моль)
Пример 50
Синтез конъюгата гидрогель-линкер-эксендин (50)
Figure 00000074
50 получают по методике синтеза 39 за исключением того, вместо 25а используют 49.
Пример 51
Кинетика высвобождения in vitro
Высвобождение молекулы лекарственного средства из 38a-38z, 38aa-38ab, 4, 5, 9а, 9b, 9с, 10, 13а, 15, 19а, 19b, 22, 26а-26с, 31а, 31b, 34а, 34b, 37а, 37b, 42, 43, 46 и 50 осуществляется в результате гидролиза в буферном растворе при pH 7,4 и температуре 37°C или pH 4 и температуре 37°C, как описано в разделе "Материалы и методы".
Соединение t1/2, буфер А (pH 7,4) t1/2, буфер B (pH 4,0)
38а <1 часа 13 часов
38b 20 часов 72 дня
38с >3 мин >3 мин
38d 58 дней не определено
38е 41 день не определено
38f 23 часа 114 дней
38g 19 дней нет данных
38h 47 дней нет данных
38i 69 часов 108 дней
38j 16 дней не определено
38k 40 мин 6 дней
381 16 часов не определено
38m 17 часов 66 дней
38n 18 дней не определено
38o 11-12 часов 22 дня
38p 26 дней 178 дней
38q 26 часов 210 дней
38r 26 часов 47 дней
38s 80 мин 80 часов
38t 96 мин 67 часов
38u 51 день нет данных
38v 47 дней нет данных
38w 8 дней 3,2 а
38x 72 дня не определено
38y 11-14 часов 105 дней
38z 11 дней 1,6 а
38aa 40 часов 65 дней
38ab 20 часов 20 дней
38ac 14 часов не определено
38ad 18 часов не определено
4 15 дней не определено
5 22 часа не определено
9а 340 часов не определено
9b 360 часов не определено
9с 120 часов не определено
10 130 часов не определено
13а 120 часов не определено
13b 160 часов не определено
15 160 часов не определено
19а 31 час не определено
19b 18 часов не определено
22 40 дней не определено
26а 34 дня не определено
26b 40 дней не определено
26с 18 дней не определено
31а 22 часа не определено
31b 95 часов не определено
34а 42 часа не определено
34b 205 часов не определено
37а 138 часов не определено
37b 639 часов не определено
42 10 дней не определено
43 17 дней не определено
46 13 дней не определено
50 35 дней не определено
Пример 52
Корреляционный анализ кинетики высвобождения in vivo - in vitro/in vivo
Кинетику высвобождения in vivo определяли путем сравнения фармакокинетических параметров соединения 13а с фармакокинетическими параметрами соединения 13с и соединения 13b с соединением 13d, соответственно, после внутривенного их введения в крысу. Исследования на животных проводили в Heidelberg Pharma AG, Heidelberg, Germany.
Соединение 13а (27 мг) растворяли в 3,5 мл PBS и 500 мкл полученного раствора вводили внутривенно каждой из шести испытуемых крыс. Использовали мужские особи крыс линии SD с массой примерно 270 г. Забор образцов крови производили при Т=0,2 ч, 24 ч, 32 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч и 168 ч, после чего получали образцы плазмы крови, которые анализировали по флуоресценции флуоресцеина на спектрометре Perkin - Elmer LS 30В.
Фармакокинетику соединения 13 с определяли по методике, описанной для соединения 13а. Фармакокинегику соединений 13b и 13d определяли, как описано для соединения 13а, за исключением того, что использовали 20 мг соединения 13b и 13d, каждое в 2,5 мл PBS, и четыре крысы.
Период полужизни линкера при гидролизе рассчитывали на основе данных отношения флуоресценции соединения 13а по сравнению с флуоресценцией 13с и 13b по сравнению с 13d, соответственно, в соответствующие моменты времени.
Было определено, что период полужизни линкера при гидролизе in vivo составлял 115 и 160 часов для соединений 13а и 13b, соответственно, что является превосходной корреляцией с результатами, полученными в отношении периода полужизни линкера при гидролизе in vitro, составляющем 120 и 160 часов для соединений 13а и 13b, соответственно.
Фиг. 3 представляет данные расщепления связи линкера с соединением 13b in vivo и in vitro, где в полулогарифмическом виде показана in vivo (треугольниками) и in vitro (ромбами) кинетика расщепления.
Сокращения:
Аср-4-(2-аминоэтил)-1-карбоксиметил-пиперазин;
АсОН - уксусная кислота;
Вое - трет-бутоксикарбонил;
Dab - 2,4-диаминомасляная кислота;
DBU - 1,3-диазабицикло[5.4.0]ундецен;
DCM - дихлорметан;
Dda - додекановая кислота;
DIC - диизопропилкарбодиимид;
DIEA - диизопропилэтиламин;
DMAP - диметиламинопиридин;
DMF - N, N-диметилформамид;
DMSO - диметилсульфоксид;
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота;
Eq - стехиометрический эквивалент;
Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;
HATU O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат;
HFIP - гексафторизопропанол;
HEPES - N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота;
HOBt - N-гидроксибензотриазол;
ivDde - 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил;
LCMS - жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией;
Ма1 3-малеимидопропионил;
Mmt - 4-метокситритил;
МС - масс-спектр;
MW - молекулярная масса;
n.d. - не установлено;
PfpOH - пентафторфенол;
РуВОР - бензотриазол-1-ил-окси-Трис-пирролидино-фосфония гексафторфосфат;
RP-HPLC - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ);
RT - комнатная температура;
SEC - эксклюзионная хроматография молекул по размеру;
Sue - сукцинимидопропионил;
TCP - 2-хлортитилхлоридная смола;
TES - триэтилсилан;
ТМОВ - 2,4,6-триметоксибензил;
TFA - трифторуксусная кислота;
THF - тетрагидрофуран;
UV - ультрафиолетовый;
VIS - визуальный

Claims (33)

1. Пролекарство, содержащее конъюгат лекарственное средство-линкер D-L, где
D представляет собой азотсодержащее моноклональное или поликлональное антитело, или его фрагмент, или продукт его слияния; и
L представляет собой фрагмент биологически неактивного линкера - L1, представленного формулой (I)
Figure 00000075
где пунктирная линия показывает присоединение к азоту моноклонального или поликлонального антитела, или его фрагмента, или продукта его слияния посредством образования амидной связи;
X представляет собой C(R4R4a), C(R4R4a)-C(R5R5a) или C(R5R5a)-C(R4R4a);
X1 представляет собой С;
X2 представляет собой C(R7, R7a) или C(R7, R7a)-C(R8, R8a);
X3 представляет собой О;
R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R7, R7a, R8, R8a независимо выбирают из группы, состоящей из Н и С1-4 алкила;
при необходимости одна или более пар R1/R4 или R2/R3 вместе с атомами, к которым они присоединены, соединяются с образованием кольца А;
при необходимости R3/R3a вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 5- или 6-членного гетероцикла;
А представляет собой С6 циклоалкил и
где L1 замещен одной группой L2-Z при условии, что водород, отмеченный символом * в формуле (I), не может быть замещен заместителем, где
L2 представляет собой одинарную химическую связь или алкильную цепь, имеющую от 1 до 20 углеродных атомов, которая при необходимости прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -О- и C(O)N(R3aa); при необходимости замещенную одной или нескольких группами, независимо выбранными из ОН и C(O)N(R3aaR3aaa), и в которой R3aa, R3aaa независимо выбирают из группы, состоящей из Н и С1-4 алкила; и где L2 присоединен к Z через концевую группу,
выбранную из
Figure 00000076
и Z представляет собой гидрогель.
2. Пролекарство по п. 1, где X2 представляет собой C(R7, R7a).
3. Пролекарство по п. 1, где L1 выбирают из группы, состоящей из
Figure 00000077
Figure 00000078
Figure 00000079
Figure 00000080
где R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, X, X1, X2 имеют значение, указанное в п. 1.
4. Пролекарство по п. 1, где L1 выбирают из группы, состоящей из
Figure 00000081
Figure 00000082
Figure 00000083
5. Пролекарство по п. 1, где L2 имеет молекулярную массу в интервале от 14 до 750 г/моль.
6. Пролекарство по п. 1, где R1 в формуле (I) замещен L2-Z.
7. Пролекарство по п. 1, где R3 в формуле (I) замещен L2-Z.
8. Пролекарство по п. 1, где R3, R3a в формуле (I) вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 5- или 6-членного гетероцикла, и где указанный гетероцикл замещен L2-Z.
9. Пролекарство по п. 1 для применения в качестве лекарственного препарата.
RU2014122036A 2008-02-01 2014-05-30 Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер RU2676324C2 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08150973.9 2008-02-01
EP08150973 2008-02-01
EP08170872 2008-12-05
EP08170872.9 2008-12-05

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010136023/15A Division RU2010136023A (ru) 2008-02-01 2009-01-30 Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018143571A Division RU2798085C9 (ru) 2008-02-01 2018-12-10 Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014122036A RU2014122036A (ru) 2015-12-10
RU2676324C2 true RU2676324C2 (ru) 2018-12-28

Family

ID=40823379

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010136023/15A RU2010136023A (ru) 2008-02-01 2009-01-30 Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер
RU2014122036A RU2676324C2 (ru) 2008-02-01 2014-05-30 Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010136023/15A RU2010136023A (ru) 2008-02-01 2009-01-30 Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер

Country Status (23)

Country Link
US (6) US8906847B2 (ru)
EP (3) EP2596805B1 (ru)
JP (2) JP5588354B2 (ru)
CN (1) CN101980725B (ru)
AU (1) AU2009209565B2 (ru)
BR (1) BRPI0906643A2 (ru)
CA (1) CA2712224C (ru)
CY (1) CY1121961T1 (ru)
DK (2) DK2237799T3 (ru)
ES (2) ES2904673T3 (ru)
HK (1) HK1152240A1 (ru)
HR (1) HRP20191052T1 (ru)
HU (1) HUE044174T2 (ru)
IL (1) IL207150A (ru)
LT (1) LT2237799T (ru)
MX (1) MX2010008024A (ru)
PL (1) PL2237799T3 (ru)
PT (1) PT2237799T (ru)
RS (1) RS58948B1 (ru)
RU (2) RU2010136023A (ru)
SI (1) SI2237799T1 (ru)
WO (1) WO2009095479A2 (ru)
ZA (1) ZA201005413B (ru)

Families Citing this family (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2507098T3 (es) 2005-11-07 2014-10-14 Indiana University Research And Technology Corporation Análogos de glucagón que muestran solubilidad y estabilidad fisiológicas
EP2124974B1 (en) 2007-01-05 2017-03-15 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility in physiological ph buffers
US8454971B2 (en) 2007-02-15 2013-06-04 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
JP5771005B2 (ja) 2007-10-30 2015-08-26 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ グルカゴンアンタゴニスト及びｇｌｐ−１アゴニスト活性を示す化合物
WO2009058662A2 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon antagonists
CN101983066B (zh) 2008-01-30 2016-06-29 印第安那大学科技研究公司 基于酯的胰岛素前药
EP2596805B1 (en) * 2008-02-01 2021-10-27 Ascendis Pharma A/S Prodrug comprising a drug-linker conjugate
US9272048B2 (en) 2008-04-29 2016-03-01 Ascendis Pharma Growth Disorders Division A/S PEGylated recombinant human growth hormone compounds
JP5753779B2 (ja) 2008-06-17 2015-07-22 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体
US8546327B2 (en) 2008-06-17 2013-10-01 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
PL2300035T3 (pl) 2008-06-17 2016-04-29 Univ Indiana Res & Tech Corp Mieszani agoniści na bazie GIP do leczenia zaburzeń metabolicznych i otyłości
WO2010042596A2 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 The Uab Research Foundation Photo-activated protecting groups
US8697632B2 (en) 2008-12-19 2014-04-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based insulin prodrugs
CA2747490C (en) 2008-12-19 2017-02-14 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analogs
KR20110110174A (ko) 2008-12-19 2011-10-06 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 아미드 기반 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드 프로드럭
WO2010099200A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Nektar Therapeutics Oligomer-amino acid conjugates
HUE032582T2 (en) 2009-05-20 2017-09-28 Biomarin Pharm Inc Variants of C-type natriuretic peptide
MX2011013625A (es) 2009-06-16 2012-01-20 Univ Indiana Res & Tech Corp Compuestos glucagon activo de receptor de gip.
BR112012002280B1 (pt) 2009-07-31 2020-04-07 Ascendis Pharma As hidrogel insolúvel em água baseado em polietileno glicol biodegradável, seu processo de preparação, conjugado, composto ligado a veículo e composição farmacêutica.
EP2459227B1 (en) 2009-07-31 2021-03-17 Ascendis Pharma A/S Prodrugs containing an aromatic amine connected by an amide bond to a carrier
PE20120918A1 (es) 2009-07-31 2012-08-14 Sanofi Aventis Deutschland Profarmacos que comprenden un conjugado de insulina-conector
RU2556340C2 (ru) 2009-07-31 2015-07-10 Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх Композиция инсулина длительного действия
EP2485712A1 (en) 2009-10-06 2012-08-15 Ascendis Pharma A/S Subcutaneous paliperidone composition
MX2012004499A (es) 2009-10-29 2012-05-29 Ascendis Pharma As Esterilizacion de hidrogeles biodegradables.
ES2667025T3 (es) * 2009-12-15 2018-05-09 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Composición seca de hormona de crecimiento unida transitoriamente a un portador de polímero
WO2011075393A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
WO2011089216A1 (en) * 2010-01-22 2011-07-28 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aliphatic amine-containing drugs
WO2011089215A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aromatic amine-containing drugs
US9561285B2 (en) 2010-01-22 2017-02-07 Ascendis Pharma As Carrier-linked carbamate prodrug linkers
RU2012136450A (ru) 2010-01-27 2014-03-10 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Конъюгаты антагонист глюкагона - агонист gip и композиции для лечения метаболических расстройств и ожирения
US20120035320A1 (en) * 2010-04-03 2012-02-09 University Of Iowa Research Foundation Polyacridine nucleic acid delivery peptide complexes
CA2797095A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
KR20130111923A (ko) 2010-05-13 2013-10-11 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 G-단백결합 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
EP2582719B1 (en) 2010-06-16 2016-08-10 Indiana University Research and Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
CA2803164C (en) 2010-06-24 2018-08-21 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
CA2796894A1 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
EP2438930A1 (en) * 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
MA34885B1 (fr) 2010-12-22 2014-02-01 Indiana Unversity Res And Technology Corp Analogues du glucagon presentant una ctivite de recepteur de gip
CN103748109A (zh) 2011-06-22 2014-04-23 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰高血糖素/glp-1受体共同激动剂
CN103857440B (zh) 2011-06-22 2018-09-25 维奥姆生物科学有限公司 基于缀合物的抗真菌和抗细菌前药
LT2723367T (lt) 2011-06-22 2017-08-25 Indiana University Research And Technology Corporation Bendri gliukagono/glp-1 receptoriaus agonistai
US9353172B2 (en) 2011-07-18 2016-05-31 Arts Biologics A/S Long acting biologically active luteinizing hormone (LH) compound
US20140296257A1 (en) 2011-08-12 2014-10-02 Ascendis Pharma A/S High-Loading Water-Soluable Carrier-Linked Prodrugs
CA2843503C (en) 2011-08-12 2020-12-22 Ulrich Hersel Polymeric hyperbranched carrier-linked prodrugs
CA2843504C (en) * 2011-08-12 2020-08-25 Ascendis Pharma A/S Protein carrier-linked prodrugs
AU2012296955B2 (en) 2011-08-12 2016-12-15 Ascendis Pharma A/S Carrier-linked prodrugs having reversible carboxylic ester linkages
RU2014118642A (ru) 2011-10-12 2015-11-20 Асцендис Фарма Офтальмолоджи Дивижн А/С Предотвращение и лечение глазных нарушений
US20140256626A1 (en) * 2011-10-18 2014-09-11 Prolynx Llc Peg conjugates of exenatide
WO2013074910A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting glucocorticoid receptor activity
CN104114183A (zh) 2011-12-20 2014-10-22 印第安纳大学研究及科技有限公司 用于治疗糖尿病的基于ctp的胰岛素类似物
CA2868925C (en) * 2012-04-25 2020-01-21 Ascendis Pharma A/S Prodrugs of hydroxyl-comprising drugs
US20150133383A1 (en) 2012-05-11 2015-05-14 Prorec Bio Ab Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
RU2015101697A (ru) 2012-06-21 2016-08-10 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Аналоги глюкагона, обладающие активностью рецептора gip
CA2883320A1 (en) * 2012-08-30 2014-03-06 The Scripps Research Institute Small molecules targeting repeat r(cgg) sequences
AU2013323669B2 (en) 2012-09-26 2018-03-01 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analog dimers
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
US10980860B2 (en) * 2012-10-11 2021-04-20 Ascendis Pharma A/S Diagnosis, prevention and treatment of diseases of the joint
SG11201501914XA (en) * 2012-10-11 2015-05-28 Ascendis Pharma Ophthalmology Division As Vegf neutralizing prodrugs for the treatment of ocular conditions
AU2013328785B2 (en) 2012-10-11 2016-07-21 Ascendis Pharma A/S Hydrogel prodrugs
DK2924053T3 (da) 2012-11-22 2020-12-14 Glytech Inc Glycosyleret linker, forbindelse, der indeholder glycosyleret linker-del og fysiologisk aktiv stofdel eller salt deraf, og fremgangsmåder til fremstilling af forbindelsen eller saltet deraf
WO2014084110A1 (ja) 2012-11-30 2014-06-05 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
ES2688367T3 (es) 2012-12-21 2018-11-02 Sanofi Derivados de exendina-4 como agonistas duales de GLP1/GIP o trigonales de GLP1/GIP/glucagón
RU2678134C2 (ru) 2013-03-14 2019-01-23 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Конъюгаты инсулин-инкретин
EP2988783A1 (en) 2013-04-22 2016-03-02 Ascendis Pharma A/S Hydrogel-linked prodrugs releasing modified drugs
WO2014187315A1 (zh) * 2013-05-21 2014-11-27 成都先导药物开发有限公司 一种化合物给药前体及药物载体制剂
JP6276390B2 (ja) * 2013-05-21 2018-02-07 成都先導薬物開発有限公司 化合物の細胞膜透過の方法
US20180042996A1 (en) * 2013-10-08 2018-02-15 Ascendis Pharma Osteoarthritis Division A/S Hydrogel-Linked IL-1ra Prodrug
AU2014333954C1 (en) * 2013-10-08 2020-08-27 Ascendis Pharma A/S Protecting group comprising a purification tag
WO2015067791A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Ascendis Pharma Relaxin Division A/S Relaxin prodrugs
CA2932477C (en) * 2013-12-06 2023-10-10 Baikang (Suzhou) Co., Ltd Bioreversable promoieties for nitrogen-containing and hydroxyl-containing drugs
EP3080152A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
WO2015086733A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
EP3080154B1 (en) 2013-12-13 2018-02-07 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
KR101768446B1 (ko) 2014-03-21 2017-08-17 애니젠 주식회사 신규한 엑세나타이드 유사체 및 그의 용도
CN104945499B (zh) * 2014-03-31 2019-12-10 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 结构修饰的glp-1类似物及其制备方法
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
CN106456768B (zh) 2014-06-13 2019-12-03 腾博龙公司 含有抗egfr1抗体的缀合物
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
EP3193941A1 (en) 2014-08-06 2017-07-26 Ascendis Pharma A/S Prodrugs comprising an aminoalkyl glycine linker
EP3197912B1 (en) 2014-09-24 2023-01-04 Indiana University Research & Technology Corporation Lipidated amide-based insulin prodrugs
US10232020B2 (en) 2014-09-24 2019-03-19 Indiana University Research And Technology Corporation Incretin-insulin conjugates
US9585934B2 (en) 2014-10-22 2017-03-07 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin D conjugates
US10265413B2 (en) 2014-11-05 2019-04-23 University Of The Sciences In Philadelphia High molecular weight biodegradable gelatin-doxorubicin conjugate
US20170368189A1 (en) * 2015-01-09 2017-12-28 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs
US11298427B2 (en) 2015-05-29 2022-04-12 Ascendis Pharma A/S Prodrugs comprising a pyroglutamate linker
AR105319A1 (es) * 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物
TWI748962B (zh) 2015-09-23 2021-12-11 美商建南德克公司 抗ｖｅｇｆ抗體之最佳化變異體
CN106554403B (zh) * 2015-09-25 2021-08-31 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 艾塞那肽修饰物及其用途
TWI660741B (zh) 2015-11-03 2019-06-01 財團法人工業技術研究院 抗體藥物複合物及其製造方法
PL3400019T3 (pl) * 2016-01-08 2023-01-23 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Proleki cnp z przyłączeniem nośnika w ugrupowaniu pierścieniowy
AU2017205273C1 (en) 2016-01-08 2022-12-01 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release CNP agonists with reduced side-effects
NZ743488A (en) * 2016-01-08 2023-02-24 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with low initial npr-b activity
WO2017118700A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with increased nep stability
EP3400020A1 (en) 2016-01-08 2018-11-14 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with large carrier moieties
SG11201805026SA (en) * 2016-01-08 2018-07-30 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with low npr-c binding
WO2017127528A1 (en) * 2016-01-19 2017-07-27 University Of Florida Research Foundation, Inc. Peptoid agonists of fibroblast growth receptors
EP3423103A1 (en) * 2016-03-01 2019-01-09 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Pth prodrugs
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
US20190192626A1 (en) 2016-04-29 2019-06-27 Defensin Therapeutics Aps Treatment of liver, biliary tract and pancreatic disorders
WO2018011266A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Ascendis Pharma A/S Conjugation method for carrier-linked prodrugs
CN109789189B (zh) 2016-09-29 2024-01-23 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 控释pth化合物的剂量方案
CN109843295B (zh) 2016-09-29 2022-04-05 阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司 控释cnp激动剂的组合疗法
JP7039574B2 (ja) * 2016-09-29 2022-03-22 アセンディス ファーマ ボーン ディジージズ エー／エス 放出制御ｐｔｈ化合物の漸増用量設定
CN117257922A (zh) 2016-09-29 2023-12-22 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 具有低峰-谷比的pth化合物
AR110299A1 (es) 2016-12-02 2019-03-13 Sanofi Sa Conjugados que comprenden un agonista dual de glp-1 / glucagón, un conector y ácido hialurónico
MX2019006848A (es) 2016-12-13 2019-10-07 Defensin Therapeutics Aps Metodos para tratar condiciones inflamatorias de los pulmones.
EP3598866A1 (en) * 2016-12-29 2020-01-29 Development Center for Biotechnology Klk6-mediated cns-specific antibody prodrug activation
EP3592393B1 (en) 2017-03-10 2021-12-01 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Releasable conjugates
JP7216006B2 (ja) 2017-03-22 2023-01-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒドロゲル架橋ヒアルロン酸プロドラッグ組成物及び方法
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
AU2018351936A1 (en) * 2017-10-06 2020-05-14 Fundação Calouste Gulbenkian Treatment of obesity-related conditions
GB2571696B (en) 2017-10-09 2020-05-27 Compass Pathways Ltd Large scale method for the preparation of Psilocybin and formulations of Psilocybin so produced
RU2020115758A (ru) 2017-11-10 2021-12-10 Дефенсин Терапьютикс Апс Созревание защитной функции слизистых оболочек и функции кишечника/легких у недоношенного ребенка
US20200291082A1 (en) 2017-11-24 2020-09-17 Defensin Therapeutics Aps Prevention and treatment of graft-versus-host-disease with defensins
CN109160883B (zh) * 2017-11-30 2021-10-08 银隆新能源股份有限公司 一种蒽醌盐正极材料及其合成方法
BR112020011189A2 (pt) 2017-12-05 2020-11-17 Sunovion Pharmaceuticals Inc. misturas não racêmicas e usos das mesmas
MX2020005517A (es) 2017-12-05 2020-11-09 Sunovion Pharmaceuticals Inc Formas cristalinas y metodos de produccion de las mismas.
WO2019113393A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 Avidity Biosciences Llc Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy
WO2019185706A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Ascendis Pharma A/S Conjugates
AU2019246389A1 (en) 2018-03-28 2020-08-27 Ascendis Pharma Oncology Division A/S IL-2 conjugates
US10799138B2 (en) 2018-04-05 2020-10-13 University Of Maryland, Baltimore Method of administering sotalol IV/switch
CN112543763A (zh) 2018-04-10 2021-03-23 赛诺菲-安万特德国有限公司 从固相裂解固相结合肽的方法
WO2019197469A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Lixisenatide synthesis with capping
KR20210013584A (ko) * 2018-05-18 2021-02-04 아센디스 파마 본 디지즈 에이/에스 Pth 접합체의 개시 용량
TW202015735A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 法商賽諾菲公司 包含ｇｌｐ－１／升糖素／ｇｉｐ三重受體促效劑、連接子及透明質酸之接合物
US11610660B1 (en) 2021-08-20 2023-03-21 AltaThera Pharmaceuticals LLC Antiarrhythmic drug dosing methods, medical devices, and systems
US11344518B2 (en) 2018-08-14 2022-05-31 AltaThera Pharmaceuticals LLC Method of converting atrial fibrillation to normal sinus rhythm and loading oral sotalol in a shortened time frame
US10512620B1 (en) 2018-08-14 2019-12-24 AltaThera Pharmaceuticals, LLC Method of initiating and escalating sotalol hydrochloride dosing
US11696902B2 (en) 2018-08-14 2023-07-11 AltaThera Pharmaceuticals, LLC Method of initiating and escalating sotalol hydrochloride dosing
JP2021535920A (ja) 2018-09-12 2021-12-23 キアペグ ファーマシューティカルズ アクチエボラグ 放出可能なｇｌｐ−１コンジュゲート
SG11202101982RA (en) 2018-09-26 2021-03-30 Ascendis Pharma As Degradable hyaluronic acid hydrogels
AU2019350376A1 (en) 2018-09-26 2021-03-18 Ascendis Pharma A/S Treatment of infections
CA3114329A1 (en) 2018-09-26 2020-04-02 Ascendis Pharma A/S Novel hydrogel conjugates
AR116566A1 (es) 2018-10-03 2021-05-19 Novartis Ag Administración sostenida de polipéptidos similares a la angiopoyetina 3
CN109125707B (zh) * 2018-10-19 2022-01-04 艾伟伦 GnRH类似物缓释组合物及其制备方法
US20220054478A1 (en) 2019-01-04 2022-02-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Minimization of systemic inflammation
US20220054477A1 (en) 2019-01-04 2022-02-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Induction of sustained local inflammation
JP2022516314A (ja) 2019-01-04 2022-02-25 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス 自然免疫アゴニストのための持続性局所性薬物レベル
JP2022516308A (ja) 2019-01-04 2022-02-25 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス パターン認識受容体アゴニストのコンジュゲート
US20220088149A1 (en) 2019-02-11 2022-03-24 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Liquid Pharmaceutical Formulations of PTH Conjugates
EP3923906A1 (en) 2019-02-11 2021-12-22 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Dry pharmaceutical formulations of cnp conjugates
WO2020212948A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Compass Pathfinder Limited Methods of treating neurocognitive disorders, chronic pain and reducing inflammation
US11160758B2 (en) 2019-06-04 2021-11-02 Sunovion Pharmaceuticals Inc. Modified release formulations and uses thereof
WO2020254613A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Controlled-release tyrosine kinase inhibitor compounds with localized pk properties
WO2020254617A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Anti-ctla4 compounds with localized pk properties
WO2020254611A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Anti-ctla4 conjugates
US20230102309A1 (en) 2019-06-21 2023-03-30 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Tyrosine kinase inhibitor conjugates
WO2020254612A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Controlled-release tyrosine kinase inhibitor compounds with localized pd properties
WO2020254607A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Anti-ctla4 compounds with localized pd properties
AU2020295721A1 (en) 2019-06-21 2021-12-23 Ascendis Pharma A/S Conjugates of π-electron-pair-donating heteroaromatic nitrogen-comprising compounds
CA3143442A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma A/S Conjugates of heteroaromatic nitrogen-comprising compounds
JP2023512427A (ja) 2020-01-03 2023-03-27 アセンディス ファーマ エー／エス 分子内転位を受けるコンジュゲート
WO2021144249A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Hypoparathyroidism treatment
AU2021237465A1 (en) 2020-03-19 2022-10-13 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
EP4146281A1 (en) 2020-05-04 2023-03-15 Ascendis Pharma A/S Hydrogel irradiation
EP4161956A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 sequences and uses thereof
AU2021319863A1 (en) 2020-08-05 2023-02-16 Ascendis Pharma A/S Conjugates comprising reversible linkers and uses thereof
JP2023540701A (ja) 2020-08-28 2023-09-26 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス グリコシル化ｉｌ－２タンパク質及びその使用
WO2022053696A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 Compass Pathfinder Limited Novel safrylamine derivatives having prodrug properties
IL301411A (en) 2020-09-28 2023-05-01 Ascendis Pharma Bone Diseases As Improving the physical and mental condition of patients with hypoparathyroidism
KR20230164709A (ko) 2021-04-01 2023-12-04 아센디스 파마 에이에스 염증 유발 질환을 치료하기 위한 지속형 성장 호르몬의 용도
CN113842379B (zh) * 2021-09-12 2024-04-23 东北农业大学 倍他洛尔作为ndm-1抑制剂或抗生素保护剂的新用途
US11912779B2 (en) 2021-09-16 2024-02-27 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
AU2022350937A1 (en) 2021-09-22 2024-03-21 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Long-acting pth compound treatments
US11845736B2 (en) 2021-10-01 2023-12-19 Empathbio, Inc. Prodrugs of MDMA, MDA, and derivatives thereof
WO2023110758A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Effective doses of cnp conjugates
WO2023110727A2 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Novel cancer treatments with tlr7/8 agonists
US11912680B2 (en) 2021-12-28 2024-02-27 Empathbio, Inc. Nitric oxide releasing prodrugs of MDA and MDMA
WO2023227505A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Liquid pharmaceutical formulations of cnp compounds

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
RU2180595C2 (ru) * 1996-05-31 2002-03-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты интерферона
WO2004108070A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
WO2006136586A2 (en) * 2005-06-22 2006-12-28 Complex Biosystems Gmbh N, n-bis- (2-hydroxyethyl) glycine amide as linker in polymer conjugated prodrugs

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6253997A (ja) * 1985-09-03 1987-03-09 Kowa Co 新規なアミノ配糖体及びこれを含有する製剤
EP0986539A1 (en) * 1997-04-06 2000-03-22 California Institute Of Technology Dna-binding pyrrole and imidazole polyamide derivatives
CA2623458A1 (en) 1999-05-17 2000-11-23 Conjuchem Biotechnologies Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
EP1764360A4 (en) * 2004-07-02 2010-08-11 Sankyo Co UREA DERIVATIVE
US7968085B2 (en) 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
EP1625856A1 (en) 2004-08-13 2006-02-15 Complex Biosystems GmbH Hydrogel polymeric conjugates of a prodrug
US20060115865A1 (en) * 2004-10-25 2006-06-01 Anlong Ouyang Lamotrigine analogs
US7678551B2 (en) 2004-10-25 2010-03-16 Seradyn, Inc. Immunoassays for lamotrigine
US7407117B2 (en) 2004-10-28 2008-08-05 Meadwestvaco Calmar, Inc. Liquid sprayer assembly
EP1838317A4 (en) * 2005-01-05 2012-02-29 Univ Minnesota ANALGESIC CONJUGATES
US20090017004A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric drug delivery systems containing an aromatic allylic acid
EP2596805B1 (en) * 2008-02-01 2021-10-27 Ascendis Pharma A/S Prodrug comprising a drug-linker conjugate
EP2438930A1 (en) * 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
RU2180595C2 (ru) * 1996-05-31 2002-03-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты интерферона
WO2004108070A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
RU2005141550A (ru) * 2003-05-30 2006-06-27 Энзон, Инк. (Us) Высвобождаемые полимерные конъюгаты на основе алифатических биоразлагаемых сшивающих агентов
WO2006136586A2 (en) * 2005-06-22 2006-12-28 Complex Biosystems Gmbh N, n-bis- (2-hydroxyethyl) glycine amide as linker in polymer conjugated prodrugs

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Youhei Sohma et al. Development of Water-Soluble Prodrugs of the HIV-1 Protease Inhibitor KNI-727: Importance of the Conversion Time for Higher Gastrointestinal Absorption of Prodrugs Based on Spontaneous Chemical Cleavage // Journal of Medicinal Chemistry. -2003. - 46(19):4124-35. *
Youhei Sohma et al. Development of Water-Soluble Prodrugs of the HIV-1 Protease Inhibitor KNI-727: Importance of the Conversion Time for Higher Gastrointestinal Absorption of Prodrugs Based on Spontaneous Chemical Cleavage // Journal of Medicinal Chemistry. -2003. - 46(19):4124-35. КОНДРАТЬЕВА Т.С. Технология лекарственных форм. Т.1, М.:Медицина, 1991г., -496 с., стр.72-73. БЕЛИКОВ В.Г. Фармацевтическая химия. М., Высшая школа, 1993, с. 43-47. Д.А. Харкевич. "Фармакология". М., Медицина, 1987, стр. 47-48, 50-52. А.Н. Кудрин. "Проблемы взаимодействия лекарственных веществ", Фармация, 1983, N 2, стр. 71. Bundgaard H, et al. Hydrolysis and rearrangement of phthalamic acid derivatives and assessment of their potential as prodrug forms for amines // Acta Pharm Nord. - 1990. -2(5):333-42. *
А.Н. Кудрин. "Проблемы взаимодействия лекарственных веществ", Фармация, 1983, N 2, стр. 71. Bundgaard H, et al. Hydrolysis and rearrangement of phthalamic acid derivatives and assessment of their potential as prodrug forms for amines // Acta Pharm Nord. - 1990. -2(5):333-42. *
БЕЛИКОВ В.Г. Фармацевтическая химия. М., Высшая школа, 1993, с. 43-47. *
Д.А. Харкевич. "Фармакология". М., Медицина, 1987, стр. 47-48, 50-52. *
КОНДРАТЬЕВА Т.С. Технология лекарственных форм. Т.1, М.:Медицина, 1991г., -496 с., стр.72-73. *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0906643A2 (pt) 2019-09-10
JP2011510954A (ja) 2011-04-07
RU2010136023A (ru) 2012-03-10
LT2237799T (lt) 2019-07-25
WO2009095479A2 (en) 2009-08-06
PL2237799T3 (pl) 2019-09-30
US20240041897A1 (en) 2024-02-08
CA2712224A1 (en) 2009-08-06
RU2014122036A (ru) 2015-12-10
US20110053848A1 (en) 2011-03-03
PT2237799T (pt) 2019-07-05
AU2009209565B2 (en) 2013-09-19
US20170100490A1 (en) 2017-04-13
DK2237799T3 (da) 2019-06-11
EP2596805B1 (en) 2021-10-27
RU2018143571A (ru) 2020-06-10
EP2237799A2 (en) 2010-10-13
EP2237799B1 (en) 2019-04-10
US20200046725A1 (en) 2020-02-13
RS58948B1 (sr) 2019-08-30
IL207150A (en) 2013-07-31
SI2237799T1 (sl) 2019-07-31
CN101980725A (zh) 2011-02-23
ES2904673T3 (es) 2022-04-05
ZA201005413B (en) 2012-04-25
US20220331334A1 (en) 2022-10-20
CA2712224C (en) 2016-03-08
AU2009209565A1 (en) 2009-08-06
IL207150A0 (en) 2010-12-30
EP3981761A2 (en) 2022-04-13
CN101980725B (zh) 2013-06-12
WO2009095479A3 (en) 2009-10-01
JP5588354B2 (ja) 2014-09-10
HUE044174T2 (hu) 2019-10-28
HRP20191052T1 (hr) 2019-11-01
ES2733355T3 (es) 2019-11-28
US8906847B2 (en) 2014-12-09
CY1121961T1 (el) 2020-10-14
MX2010008024A (es) 2010-12-21
EP3981761A3 (en) 2022-08-24
DK2596805T3 (da) 2021-12-13
JP2014193908A (ja) 2014-10-09
EP2596805A1 (en) 2013-05-29
US20150057221A1 (en) 2015-02-26
HK1152240A1 (en) 2012-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2676324C2 (ru) Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер
JP5908000B2 (ja) 長期間作用性ペプチド類似体のための組成物
RU2593774C2 (ru) Пролекарства, содержащие конъюгат эксендин-линкер
US20110009315A1 (en) Long-acting transient polymer conjugates of exendin
US20100291021A1 (en) Aliphatic prodrug linker
CN105934257B (zh) 用于含氮和羟基的药物的生物可逆引入基团
AU2005232371A1 (en) Polymeric prodrug with a self-immolative linker
KR20120089843A (ko) 인슐린 링커 접합체를 포함한 프로드럭
TW201832783A (zh) 包含ｇｌｐ－１／胰高血糖素雙重激動劑、連接子和透明質酸的接合物
RU2798085C9 (ru) Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер
RU2798085C2 (ru) Пролекарство, содержащее саморасщепляемый линкер
JP2023512427A (ja) 分子内転位を受けるコンジュゲート
TW201300131A (zh) 包含艾塞那肽（ｅｘｅｎｄｉｎ）連接子接合物之前藥