BRPI0906643A2 - profármaco compreendendo um conjugado fármaco-ligante - Google Patents

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Rau Harald
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Abstract

"profármaco compreendendo um conjugado f ármaco-ligante". a presente invenção refere-se a um profármaco ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo compreendendo um conjugado fármaco- ligante d-l, onde -d é uma amina contendo porção biologicamente ativa; e -l é uma porção de ligante não-biologicamente ativa -l 1 representada pela fórmula (1),em que a linha pontilhada indica a ligação à amina da porção bi- ologicamente ativa e onde r1, r1a, r2, r2a, r3, r3a, x, x\ x2, x3têm o significado conforme indicado no relatório e nas reivindicações e onde l 1 é substituído com um a quatro grupos l 2 -z e opcionalmente substituído mais, contanto que o hidrogênio marcado com o asterisco na fórmula (i) não seja substituído por um substituinte; onde l 2 for uma ligação simples ou um es- paçador; e z for um grupo veículo. a invenção refere-se também a a-l, onde a é um grupo de saída, composição farmacêutica compreendendo os ditos profármacos e seu uso como medicamentos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’PROFÁRMACO COMPREENDENDO UM CONJUGADO FÁRMACO-LIGANTET
A presente invenção refere-se a um profàrmeco ou um sal farmaceuticamente aceitável de mesma compreendendo um conjugado fárma5 co~iigante D~L. A invenção refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo os ditos profármacos e seu uso como medicamentos.
Para aumentar as propriedades físico-quimicas ou farmacoctné·· ticas de um fármaco rn vivo tal fármaco pode ser conjugado com um veículo.
Tipicamente, veículos em liberação de fármaco ou são usados de uma maneira não-covalente, com o fármaco fisico-quimicamente formulado em uma mistura solvente-veioulo. ou através de ligação covaiente de um reagente veicula com um das grupas funcionais do fármaco.
No entanto, a abordagem nâc-covalente requer uma encapsulação de fármaco altamente eficiente para prevenir liberação tipo reforço, não- 15 controlada, do fármaco. Conter a difusão de uma molécula de fármaco solúvel em água, não-ligada. requer contatas van der Waals fortes, frequentemente mediados através de porções bidrofobicas. Muitas fármacos conformacionalmente sensíveis, tais como proteínas ou peptideos, são tomados disfuncionais durante o processo de encapsulação e/ou durante armazena20 mento subsequente do fármaco encapsulado. Ainda, tais fárrnacos contendo amino sofrem imedíatamente reações colaterais com produtos de degradação de veículo (vide, por exempla, D..H. I..ee e outros, J. Cante Ref, 2003, 92, 291-299). Ainda, dependência dc mecanismo de liberação do fármaco da biodegradaçán pode causar variabilidade interpaciente.
Altemativamente, os farmaons podem ser conjugados a um veículo através de ligações covalentes, Esta abordagem é aplicada a várias classes de moléculas, das chamadas moléculas pequenas, de produtos naturais até proteínas maiores. Conjugados de fármaco-veículo covalentes podem ser divididos em dois grupos. Primeiro, conjugados, onde a ligação co30 valente entre veículo e fármaco está principalmente presente durante a ação do fármaco (’ligação covaiente permanente), isto è, um derivado do fármaco exibe seus efeitos farmacalògicos como é conhecido para α fármaco. Se gundo, a ligação covalente ê principalmente previamente clivada para liberar o fármaco como é, que pode exibir seus efeitos farmacológicos conhecidos. No último caso o conjugado de fármaco-velculo covalente é chamado profármaco ligado a veiculo ou profàmiaco veiculo.
A fim de assegurar divagem da ligação covalente entre veiculo e fármaco, remoção fácil da dita ligação m vw é necessária para liberar o fármaco (ativação de profármaco).
Ativação de profármaco pode acontecer através de divagem enzimática ou nào-enzimática da ligação entre o veículo e a molécula de 10 fármaco. ou uma combinação sequencial de ambas, isto é, uma etapa enzimátioa seguido por uma disposição nào-enzímátíca.
Ativação de fármaco enzimaticamente induzida é caracterizada pelo fato que a divagem em ambienta to vitro livre de enzima tal como uma solução tampão aquosa de, por exemplo, um éster ou amida. pode aconte15 cer, mas a taxa correspondente de hidrólise pode ser muito lenta e não terapeuticamente útil.. Em um ambiente in wVo, esterases ou amidases estão tipicamente presentes e as esterases e as amidases podem causar aceleração catalítica signiflcante da cinétíca de hidrólise de duas vezes até várias ordens de magnitude.. Desta maneira, a divagem è predominantemente con20 trolada pela reação enzimâtioa.
Um grande inconveniente de divagem predominantemente enzimátíca è variabilidade interpaciente. Níveis de enzima podem diferir sígnifioantemente entre indivíduos resultando em variação biológica de ativação de profármaco pela divagem enzimática. Os níveis de enzima podem também 25 variar dependendo do sítio de administração. Por exemplo, é oonheddo que no caso do injeção subcutãnea. certas áreas do corpo dão efeitos terapêuticos mais previsíveis do que outras. Para reduzir este efeito Imprevisível a divagem não-enzimátsoa ou oatálise intramolecular é de interesse particular.
Desta maneira, divagem autooataíihca independente de enzima 30 de veículo e porção biologicamente ativa è preferida. Na maioria dos casos, isto é conseguido através de uma porção ligante apropriadamente projetada entre o veiculo e a porção biologicamente ativa, que está diretamente ligada ο
ao grupo funcional de uma porção biologicamente ativa através da ligação cova lente.
Tipos de lígante específicos são aanhecidos na ténnioa. Y. Sobma e outros, >./. Meat Ch&m. 46 (2003), 4124-4135, descrevem profármacos à base de éster, onde o veículo é solúvel em água e a porção biologicamente ativa é derivada de inibidor de protease de HIV-1 KNl-727. O lígante usado é ligado à porção biologicamente ativa através de grupa éster. O mecanismo deste sistema de profármaco é cidizaçãe-ativação através de formação de imida cíclica para a divagem de ligações éster.
No entanto, isto é desvantajoso por causa da instabilidade da grupo funcional éster, Ainda, grupos éster podem ser menos quimíusseietivamente endereçáveis para a conjugação do veículo ou liganfe e α fármaco,
AJ. Garman e outros (A, J. Garman. S.B. Kalíndjan, FEBS Left. 1987, 223 (2), 361-365,1987) usam anidrído maieico PEG5000 para a modificação reversível de grupos amino em ativador de píasminogênio tipo tecido e urocinase. Regeneração de enzima funcional a partir do conjugado PEGuPA quando da incubação em tampão de pH 7,4 através da divagem da ligação do àcído maleâmíco segue cinética de primeira ordem com uma meiavida de 6,1 h. Uma desvantagem da ligação da ácida maleàmico é a falta de estabilidade do conjugado em valores de pH menores. Isto limita a aplicabilidade da ligação de ácido maleàrnico a agentes biologicamente ativos que são estáveis em valores de pH básicos (altos), uma vez que a purificação do conjugado de agente biologicamente atívo-polímero tem que ser realizada sob condições básicas (pH alto) para prevenir ciivagem de profàrmaco prematura.
No WO-A 2004/108G7G sistema de profàrmaco baseado no ligante N,N~bis-(2~hidroxetil)glicino amida (bicina) é descrito. Neste sistema duas moléculas veículos de PEG são ligadas a uma molécula de bioina acoplada a um grupo amino da molécula de fánnaco. As primeiras duas etapas em ativação de prcfármaoo sâo a ciivagem enzimátioa das primeiras ligações ligando ambas as moléculas veículos de PEG com os grupas hidróxi do grupo de ativação de bicina. Ligações diferentes entre PEG e bicína são descritas resultando em cínética de ativação de profármaco diferente. A segunda etapa em ativação de profármaco é a divagem da segunda ligação ligando o grupo de ativação de bicina ao grupo amino da molécula de fármaco. A principal desvantagem deste sistema é a ligação do polímero ao ligan5 te bicina resultando em uma taxa de hrdróhse lenta desta segunda ligação de amida bicina (t 1/2 > 3 h em tampão de fosfato). Consequentemente, a liberação de um intermediário de profármaco modificado por bicina pode mostrar propriedades lármacocinêfioa, imunogênica, toxicológica e farmaoodinàmica diferentes comparadas oom a molécula de fármaco de origem nativa.
Outro sistema baseado em bicina é descrito no WO-A
2008/136586.
Desta maneira, há a necessidade de profármaces ligados a veiculo alternativos, onde o ligante permsta uma divagem natalities, para liberar um fármaco em uma forma nào-modificada sem permanecerem residues se S originando do ligante.
Então, um objetivo da presente invenção é prover tais conjugados fármaco-ligante. onde o ligante está covalentemente ligado através de uma ligação clivàvel a uma porção biologicamente ativa (representando o fármaco após liberação), e onda o ligante está ainda covalentemente ligado 0 através de uma ligação permanente a um veículo direiamente ou através de um espaçador para formar o profármaco ligado a veiculo,
Este objetivo é alcançado por um profármaco ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo compreendendo um conjugado de fármacoligante D-L, onde
-D é um nitrogênio contendo porção biologicamente ativa; e
- L è uma porção de ligante não-biologicamente ativa ™lJ representada pela fórmula (l).
Figure BRPI0906643A2_D0001
em que a linha pontilhada indica a ligação ao nitrogênio da porção biologi oamente ativa através da formação d® uma ligação arnida;
X é C(R4R4*); N(R4): O; C(RR43)-C(RSRS3); C(Rf;RSa)C(R4R4s); C(R4R4s)NíR*); N(R?>C(R4R43); O(R4R43)-O; ou O-C(R4R.4s);
é C; ou SfOk
X2 é C(R?, R?a); ou C(R\ R73)-C(RS, R8s):
XséO; S; ou N CN;
R\ R's, R\ R*3, R3, R3a, R4, R4a, R5, R*8, Re, R7 R7a, R8, R83 são índependentemente selecionados do grupe consistindo em H; e Cm alquila;
Opcionaimente, um ou reais des pares R'A'R^, R‘3/R^, R4Ô'R&3 ; p ^/R^’formxam uma ligação química;
Opdonalmente, um ou mais dos pares rVr?3, R7R';a< R4/R43, R‘7Rfí3, R7R'A Rá/RSa são unidos com o átomo ao qual elos estão ligadas para formar uma C$.? cicloalquila; eu heterocidiia de 4 a 7 membros;
Opcionaimente, R4/R~: são unidos com os átomos aos quais eles estão ligados para formar uma heterocidiia de 4 a 7 membros saturada;
Opcionaimente, um ou mais dos pares rVr4, RWí R'/R§< R4/R\ R4/R?í R'7R4\ R2/R3são unidos aos átomos aos quais eles estão ligados para formar um anel A;
Opcionaimente, R7Rí,s são unidos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados para formar um heterociclo de 4 a 7 membros.
A é selecionado do grupo consistindo em fenila: naftüa; indenila; indaníia; teiraliníla; dcloalquila; heterocidiia de 4 a 7 membros: e heterobiciolila de 9 a 11 membros; e onde L1 è substituído com um a quatro grupos t?-Z e opcionalmente substituídos mars, contanto que o hidrogênio marcado oom o asterisco na fórmula (i) não seja substituído por um substituinte; onde L? for uma ligação química simples ou um espaçador; e
Z for um grupo veículo.
Foi surpreendentemente constatado que o escopo da cidizaçãoativação através de formação de rmida cíclica pode ser estendido de éster até mesmo a profármacos de amida ligada a veículo, apesar da estabilidade muito maior da arnida ligada sub condições aquosas. Foi observado que
Ν,Ν’-biscarboxamidas ligadas a uma porção veícuíca ida nucleófiio através de uma ligação amida e à molécula de fármaco através da segunda ligação amida exibem auto-hídrôlise em uma faixa que é útil para aplicações de profármaco. Ainda, foi constatado que ligantes podem ser projetados, os quais incluem um veiculo permanentemente ligado ao motivo N,N! biscarboxamida de tal maneira que a formação de imida cíclica pode se empregada como um principio de autoativação em projeto de profármaoo de amida ligada a veícuExemplos de tais produtos de divagem cíclica preferidas são estruturas de anel succinimida ou glutarimida substituídas. Pré-requisito para tal ativação por ciclização é a presença de um nucleófiio contendo amina na estrutura ligante e outra amina ligada que não é o profármaco com amida ligada, mas uma amida ligada substituída com um átomo de hidrogênio.
No caso de divagem de profármaoo ativada por succinimida ou uma glutarimida, o nucleófiio contendo amina serve como um grupo vizinho para aumentar a nucleofilicídade do nitrogênio contido na amida ligada permanente que por sua vez ataca o grupo oarbonil amida do profármaco gerando o anel imida ciciico.
Desta maneira, estruturas de ligante preferidas compreendem uma ligação permanente a um veículo, um nucleófiio contendo amina e urna amida permanente ligada com um hidrogênio ligado ao nitrogênio da amida ligada. Profármacos ligados a veículo correspondentes compreendem um ligante contendo uma ligação permanente a um veículo, um nucleófiio contendo amina e a dita amida permanente ligada, e um nitrogênio contendo porção biologicamente ativa derivada do fármaco conjugada ao ligante por meio de uma amida ligada divávei
A Figura 1 mostra um exemplo da divagem resultando ern uma imida cíclica. O nitrogênio da porção biologicamente ativa é mostrado somo nitrogênio contenda amina, que resulta em um fármaco tendo um grupo funcional amina primário. No entanto também, por exemplo, uma amina secundária pode ser parte da fármaco. Por razões de simplicidade, o um a quatro substituintes principais LÂZ incluindo o veículo não são mostradas.
Propriedades preferidas de profãrrnaco são dadas por ama mel·· a-vida de hidrélise em tampão aquoso em pH 7,4 e 37° C entre 1 h e 3 meses; taxas de hidròlise similares sob condições fisiológicas em tampão e plasma.
O profàrmaco da acordo com a presente invenção pode mostrar excelente correlação m wVo/ro vitro de divagem de ligante, um grau de independência de enzima aito e pode ser armazenado em pH menor (divagem dependente de pH).
Dentro do significado da presente invenção, os termos são usadas corno segue.
''Porção D biologicamente ativa significa a parte do conjugado fármaoo-ligante que resulta após clívagem em um fármaco D-H de atividade biológica conhecida.
Ligante não-ativo significa um ligante que não mostra os efeitos farmacológícos do fármaco derivado du agente biologicamente ativo.
Alquila significa uma cadeia de carbono de cadeia reta ou ramificada. Dada hidrogênio de um carbono de alquila pede ser substituído por um substituinte.
Ci.4 alquila significa uma cadeia alquila tendo 1-4 átomos de carbono, por exemplo, se presente no final de uma molécula: rnetila, etíla, n propila, isopropila, n-butila, isobutila. sec-butila, terc-butila ou, por exemplo, CHS-, -CHz-CHr. -CH(CH3)-, -CÍ-VCHx-CHx-, ~CH(C2Hsh -C(CHs)r. quando duas porções de uma molécula são ligadas pelo grupe alquila.. Cada hidrogênio de um carbono C^.4 alquila pode ser substituído por um substltuinte.
alquila significa uma cadeia alquila tendo 1-6 átomos de carbono, por exemplo, se presente no final de uma molécula: Cs.4 alquila, media, etila, n-propila, isopropila, n-budla, isobutila, sec-butila; terc-butila, npentila, n-hexlla ou. por exemplo, -OH2-, -CH2 CH3··, -CH(CH3)-, -CH2-CH2· CHj-, -CHtCsHs)-, -CfCHsjz-, quando duas porções de uma molécula são ligadas pelo grupo alquila, Cada hidrogênio de um carbono C-..$ alquila pode ser substituído por um substltuinte.
Desta maneira, “C<-8<! alquila significa uma cadeia alquila tendo 1 a 18 átomos de carbono a alquila significa uma cadeia alquila tendo 8 a 18 átomos de carbono. Desta maneira, ”Cr·^ alquila'1 significa uma cadeia alquila tendo í a 50 átomos de carbono..
“Cs-so alquenila” significa uma cadeia alquenila ramificada ou 5 nâo-ramificada tendo 2 a 50 átomos de carbono, por exernplo, se presente no final de uma molécula: -CH~CH?: -CH-CH-CHs, -CIC-CH-CH?, -CH~CH-CH-CH-CH-CH?, ou, por exemplo, -CH-CH, quando duas porções de uma molécula são ligadas pelo grupo alquenila. Dada hidrogênio de um carbono alquenila pode ser substituído por um substifuinte confer10 me adidonalrnente especificado. Desta maneira, o termo ’'alquenila referese a uma cadeia de carbono com pelo menos uma ligação dupla carbonocarbono. Opcionalmente. uma ou mais ligações triplas podem ocorrer.
”Cz..5e alquinila” significa uma cadeia alquinila ramificada ou nâoramificada tendo 2 a 50 átomos de carbono, por exemplo, se presente no 15 final de uma molécula: -CssCH, -CH^-G-CH, CHa-CHs-C-CH, CH2-C-C-CH3 ou, por exernplo, -OC- quando duas porções de uma molécula são ligadas por um grupo alquinila. Cada hidrogênio de um carbono C2.^ alquinila pode ser substituído por um substifuinte conforme adioíonaimente especificado. Desta maneira, o termo ’’alquinila refere-se a uma cadeia de carbono com 20 pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Opcionalmente, uma ou mais ligações duplas podem ocorrer.
cicloalquila” ou ’’anel C3.- cioloalquiia” significa uma cadeia de alquila cíclica tendo 3 a 7 átomos de carbono, que pode ter ligações duplas cafoono-carbono sendo pela menos parcialmente saturadas, por exem25 pio, dclopropila. dclobutila. dclopentíla, ciclo-hexíla, ciclo-hexeníla, c-idoheptila. Cada hidrogênio de um carbono cicloalquila pode ser substituído por um substifuinte Q termo Cs·? cicloalquila ou anel C3.? cicloalquila’ também inclui bicidos em ponta tal como norbornsno ou nurborneno. Desta maneira, ”03-5 dcloslquila” significa uma cícloalquüa tendo 3 a 5 átomos de carbono.
Desta maneira, “Cj.íü cícloalquila significa uma alquila cíclica tendo 3 a 10 átomos de carbono, por exemplo, C3..7 cícloalquila; dclopropila, ciclobutíla, cidopentíla. ciclo-hexila, oido-hexenila, cido-heptila, cido-octila.
ciclononüa, ciclodecíla. O termo C-<..w cinloalquila também inclui carbomono- e -biciclos pelo menos parcialmente saturados,
Halogênio significa flúor, cloro, bromo ou iodo. È geralmente preferido que halogênio seja flúor ou cloro.
Heterocicliía de 4 a 7 membros ou heterocido de 4 a 7 membros significa um anel com 4, 5, 6 ou 7 átomos no anel que podem conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromática ou nãn-aromáticu que é integralmente, parcialmente ou insaturado) onde polo menos um átomo no anel atè 4 átomos no anel são substituídos por um heteroátomo selecionado do grupo consistindo em enxofre (incluindo -8(0)-, -S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo ~N(O)-) e onde o anel ê ligado ao resto da molécula através de um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para um heterociclo de 4 a 7 membros são azetidina. oxetano, tietano, furano, tiotono, pirrol, pirrolina, ímidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazoi, oxazohna, isoxazcl, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetra-hidrofurano, tetra-hidrofiofeno, pirrolidína, imidazolidina, pirazolidina, oxazolídina, isoxazolidina, tíazclidína. isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolane, pirano, di-hidropirano, tetra-hidropirano, imidazolidina, pirídina, pirídazina, pirazina, pirímldina, piperazina, piperidine, morfolína, tetrazol, triazol. triazolidina, tetrazolidina, diazepano, azepina ou homopiperazina..
Heterobíciclila de 9 a 11 membros ou heterobiciolo de 9 a 11 membros significa um sistema heterooiclico de dois anéis com 9 a 11 átomos no anel, onde pelo menos um átomo no anel é compartilhado por ambos os anéis e que pode conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não-arumáticu que ê integralmente, parcialmente ou insaturado) onde pelo menus um átomo no anel atè 6 átomos no anel são substituídos por um heteroátomo selecionado do grupo consistindo em enxofre (incluindo-S(Q)-, -S(C))H, oxigênio e nitrogênio (incluindo --N(O)-) e onde o anel está ligado ao resto da molécula através de um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para um heterobiciolo de 9 a 11 membros são indol, indclína, benzofurano, benzofiofeno, benzoxazol, benzisoxazol, benzotiazol, benzisotiazol, benzimidazol, benzimidazollna, quinolína, quínazolina, di hidroquinazolina, quinoíina, di-hidraquinohna, tetra-hrdroquinalina. decahidroquinolina, isoquinoíina, deca-hidroísoquínofína. tetra-hidroisaqumolina, di-hidroisoquinolina, benzazepína, purína ou pteridina. O termo heterobiciclo de 9 a 11 membros também inclui estruturas aspiro de dois anéis tal como 1,4-dioxa-8-azaespiro[4,5]decano ou heterocidos ern ponte tal corno 8-aza·· bicíclo(3.2.1 Joctano.
No case dos compostos de acordo com a fórmula (I) conterem um eu* mais grupes ácidas ou básicas, a invenção também compreende seus sais farmaceuticamente ou toxicologicamente aceitáveis, em particular seus saís farmaceuticamente úteis. Então, as compostas da fórmula (I) que contêm grupas ácidos podem ser usados de acordo oom a invenção, por exemplo, como sais de metal alcalino, sais de metal alcaíinoterroso ou sais de amônio. Exemplos mais precisos de tais sais incluem sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio, sais de magnésio ou sais com amônia ou aminas orgânicas tais como, par exempla, etilamína, etanalamina, trietanolamina au aminoácidos. Compostas da fórmula (I) que contêm um ou mais grupos básicos, isto é, grupos que podem ser profanados, podem estar presentes e podem ser usados de acordo com a invenção na forma de seus sais de adição com ácidos inorgânicos ou orgânicos. Exemplos para ácidas adequados incluem cloreto de hidrogênio, brometo de hidrogênio, ácido fosfórico, ácida sulfúrico, ácida nltrico, ácido metanossuífônicc, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftalenodissulfônico, ácido oxálico, ácido acético. ácido tartárioo, ácido láctico, ácido salicílicu, ácido benzoico, ácido formica, ácido propiônico, ácida piválíca, ácida dietilacêtico, ácido malônico, ácido succínico, ácido piméiico, ácido fumáríoo, ácido malelco, ácido málioo, ácido sulfâmico, ácido fenilpropiônico. ácido glucônico. ácido ascórbíco, ácido isonicotlnico, ácido cítrico, ácido adipico e outros ácidos conhecidos do versado na técnica. Se os compostos da fórmula (I) contiverem simultaneamente grupos ácidas e básicos na molécula, a invenção também inclui, em adição ás formas de saí mencionadas, saís internos ou betaínas (zwitterions). Os respectivos sais de acorde com a fórmula (I) podem ser obtidos através de métodos comuns que são conhecidos do versada na técnica tal como, por exemplo, contatando esses oom urn áoido orgânico ou inorgânico ou base em um solvente ou dispersarrte, ou através de troca de ânion ou troca de cation com outros sais. A presente invenção também inclui todos os sais dos compostos da fórmula (!) que, devido à baixa compatibilidade fisiológica, não são diretamente ade5 quados para uso em farmacêuticos, mas que podem ser usados, por exemplo, como intermediários para reações químicas ou para a preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis,
O termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por uma agência reguladora tal como o EMEA (Europa) e/ou FDA (US) e/ou 10 qualquer outra agência reguladora nacional para uso em animais, preferivelmente em seres humanos,
Composição farmacêutica” significa um ou mais ingredientes ativos, e um eu mais ingredientes inertes, bem como qualquer produto que resulte, diretamente ou indiretamente, de combinação, compiexação ou οι 5 gregação de quaisquer dois ou mais dos ingredientes, ou da dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Desta maneira, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem qualquer combinação feita através da mistura de um composto da presente invenção e um excipiente farmaoeutí20 semente aceitável (veículo farmaceuticamente aceitável)..
O termo excipiente” refere-se a um diluente, adjuvante ou veiculo com o qual o agente terapêutico é administrado. Tal excipiente farmacêutico pode ser líquidos estéreis, tal como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal nu sintética, incluindo, mas não limi25 tado a, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e similar, Água é um excipiente preferido quando a composição farmacêutica é administrada oraímente. Solução salina e dextrose aquosa são exdpientes preferidas quando a composição farmacêutica é administrada íntravenosamente. Soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas são pre30 ferivelmente empregadas como exciplentes líquidos para soluções injetáveis, Exciplentes farmacêuticos adequadas incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, silica gel, estearato de sódio, glicerol monaestearaio, talco, cloreto de sódio, leite desnatada em pó, glioerol, propiieno glicol, água, etanol e similar. A composição, se desejado, pode também conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsíficantes ou agente de tamponamento de pH. Essas composições podem tomar a forma 5 de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, põs, formulações de liberação sustentada e similar. A composição pode ser formulada como um supositóao, com llgantes e exoiplentes tradicionais tais como tríglicerideos. Formulação oral pode incluir exoipientes-padrâo tais como graus farmacêuticos de manitol. lactose, amido, estearato de magrte10 sio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de excipientes farmacêuticos adequados são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences de E.W. Martin. Tais composições vão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente terapêutico, preferivelmente em forma purificada, junto com uma quantidade adequada de excipiente de 15 maneira a prover a forma para administração apropriada ao paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração.
Preferivelmente, X3 è O.
Preferivelmente, X é N(R4), X' é C e X'5 é O. Preferivelmente, X*é C(R' R'f<í).
Preferivelmente, iJ é selecionado do grupo consistindo em
Figure BRPI0906643A2_D0002
Figure BRPI0906643A2_D0003
Figure BRPI0906643A2_D0004
em que Ré H; eu aiquila: Y è NH; O; au S;eR\ R';í, R \ R^, R'\ FVl R4, X, Xs, X2têm o significada conforme acima indicada.
Cam mais preferência ainda, L! é selecionado do grupo consis-
Figure BRPI0906643A2_D0005
Figure BRPI0906643A2_D0006
Figure BRPI0906643A2_D0007
Figure BRPI0906643A2_D0008
em que R tem o significado conforme acima indicado.
Peto menos um (até quatro) hidrogênio é substituído por um grupo 1ÀZ. No caso de mais de um grupo L2-Z estar presente, cada t? e ca~ da Z pode ser selecionado índependentemente. Preferivelmente, apenas um grupo I.AZ este presente resultando na fórmula D-íAlAZ.
Em geral, L'“ pode ser ligado a L? em qualquer posição exceto a substituição de hidrogênio marcada corn um asterisco na fórmula (i). Preferi» 5 velmente, um a quatro do hidrogênio dado por R< R1 a R* diretamente ou como hidrogênio da alquila ou grupos e anéis adicionais dados pela de» finição de R e R! a R“ são substituídos por lAz.
Ainda. íJ pode ser opclonalmente adicionaímente substituído.
Em geral, qualquer substít.uinte pode ser usado contanto que o principio de 10 divagem não seja afetado.
Preferivelmente, um ou mais substituintes opcionais adicionais são independentemente selecionados do grupo consistindo em halogênio; CN, COORS; OR&: C(O)RS; C(O)N(R9RSa); S(O)2N(R&R^); S(O)N(R&R&S); S(O)2R3; S(O)R9; N(R9)S(0hN(RS3R&b); SFA N(RSRS3); NOa; OC(O)RS;
N(R^O)RA N(Rs)S(O)2RS8; N(R9)S(O)R98; N(Rô)C(0)0Râ8;
N(Rs)C(O)N(Rfe:R&!:); OC(O)N(RsRSa); T; alquila; Cs.ü0 alquenila; ou C2.5o aiquinila. onde T; Cuo alquila; Gzoo alquenila; e alquiníla são opcionalmente substituídos com um ou mais R5<1. que são iguais ou diferentes e onde Cvso alquila; alquenila; e Ο?.?# aíquinila são opcionalmente interrompidas 20 por um ou mais grupos selecionados do grupo consistindo em Τ, T, -C(O)O»;
-O-; -C(O)~; -C(O)N(R·’)-; -S(O)2N(R1>; -S(O)N(Rn)-; -S(O)2q --S(O)-; N(Rn)S(Ô)2N(R!'a)-; -Sc -OC(O)RA -N(Rn)C(O)»; -N(R';)S(O).r; N(Rn)S(G)-; -N(R’V)C(O)O»; -N(R^)C(O)N{RníS)··; e -OC(0)N(R'-Rns);
R'\ RÍ,S, Rw são independentemente selecionados do grupo consistindo em 25 Η; T; e alquila; C^o alquenila; ou üs-50 alquenila, onde T; alquila;
Cs-δδ alquenila; e alquiníía são opcionaImente substituídos com um ou mais R·0, que são iguais ou diferentes e onde C<.alquila; C2.sa alquenila; e C-í-ss alquiníía são opclonalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados do grupo consistindo em Τ, T, -0(0)0-: -O-; -0(0)-; -C(O)N(Rn)··; 30 S(O)2N(RnE “S(O)N(R; )-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R''\)S(G)gN(Rn3)-; -S-; .NCR5’)-; -0C(0)RA -N(Rn)C(O)-; -N(Rr')S(O)2»; -N(Rr;)S(O)-, N(R’’)C(O)O-; -N(R^)C(O}N(Rm)·; e -00(0)^'^A;
w
T é selecionado do grupo consistindo em fenila; naftila; indemls; tetralinila; C3.i(j cicloalquila; heterociclila de 4 a 7 membros; ou heterobioiclila de 9 ou 11 membros, onde T é opcionalmente substituído corn um ou mais R1fí, que são iguais ou diferentes;
R10 é halogênio; CN; oxo feO); COOR·2; OR12; C(O)R·2; C(O)N(R1?;R^a); S(O)2N(Rí2Rí2ií); S(O)N(R^R'2?:); S(O)2R·2; S{O)R·2; N(R'2)S(O)2N (R'^Rí2&); SRí2; N(R12R'2s); NOy OC(O)RÍ2; N(R52)C(O)R12á; N(R12)S(O)2 R52*; N(R'QS(O)R·^; N(R52)C(O)ORJ2a; N(R’2)C(O)N(Rí2aR-2b): 00(0)N (R:ZR12); ou alquila, onde C;..§ alquila é opcionalmente substituída com 10 um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes;
Rn, Rns, R·^ R.12! R,2tí são Índependentemente selecionados do grupo consistindo em H; ou C5.§ alquila, onde C^. alquila é opcíonalmente substituída com um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes.
O termo interrompido” significa que entre dois carbono é inseri15 do um grupo ou no final da cadeia carbono entre o carbono e o hidrogênio.
11' è urna ligação química simples ou espaçadoc No caso de Lz ser um espaçador, ele é preferivelmente definido como o um ou mais substítuintes opcíonalmente definidos acima, contanto que 1/ seja substituído oom Z.
Desta maneira, quando L2 é outro que não uma ligação química simples, L<Z é COORS; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R93); S(O)2N(R8Rs*); S(O}N(R9R9*); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)sN(RSsRSíí); SR5: N(R9R%); OC(O)R9; N(R&)C(0)Râ3; N(R9)S(O)2R9*: N(íV)S(Q)R9;5; N(R9)G(O)QR'te; N(Rs)C(O)N(R9sR^): OQ(0)N(RsR^); T; C}^ alquila; C^alquenila; ou C2.&ü 25 alguíníla, onde T; Gi-sr? alquila; C2.5q alquenila: e C2.^ alquinila são opcionalmente substituídos com um ou mais R10, que são iguais ou diferentes e onde C-j.® alquila; C2..so alquenila; e C?,^ aíguinila são opcíonalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados do grupo consistindo em -T- , -C(O)O-, O-; C(O)-; -C(O)N(Rn)··; -S(O)2N(RV>; -S(O)N(R’‘i)-; -S(O)2-; -S(O}~; 30 N(Rn)S(O)2N(Rn>; -S-; -N(R5·)-; -OC(O)R’’; -N(Rn)C(O>; -N(Rn)S{O)2~; N(Rn)S(O)-; -N(Rn)0(0)0-: -N(R’-)C(O)N(R'n>; e -OC(O)N(R· Wla);
R;í, R:íí!, R9ís são Índependentemente selecionados do grupo consistindo em
Η; Ζ; Τ; e alquila; alquenila; e C-^o alquinila são opaionalmente substituídos com um ou mais RA que são iguais ou diferentes e ande C^.50 alquila; alquenila; e C2.50 alquinila são opcionaimeníe interrompidas por um gu mais grupos selecionados do grupo consistindo em T; -0(0)0-: -O-; C(O)-; -C(O)N(R’·)-; -S(O)2N(R1 A; -S(O)N(R1!)-; -S(O)?-; -S(O)-; N(R--)S(OhN(R··3)-; -S-; -N(R;í)-: -OC(O)R!': ~N(R’n)C(O)-; -N(R1?)S(O)?.-; N(R;')S(O)-; -N(RAC(O)O-; -N(R1s)C(0)N(R1!8)-; e -OC(0)N(RnRríí:);
T é selecionado do grupo consistindo em fenila; naftila; indenila; indanila; tetraliníla; C^-o cicloalquila; hetercciclila de 4 a 7 membros; ou heterabiciciila de 9 a 11 membros, onde t ê opcionalmente substituído com um ou mais rA que são iguais ou diferentes;
Rw é Z; haiogõnio; CN; oxo («O); COOR12; OR A C(O)RA C(O)N(R’3R'A; S(O)2N(R1sR·2*); S(O)N(R'2R!A; S(O)zRA S(O)R·2; N(Ru)S(O)2N (R'?aR-A; SRA N(R‘sR·**); NO3; OC(O)RA N(R-2)C(O)R'A N(R^)S(O)2 R$A N(R12)S(O)R$2a; N(RAC(O)OR’A N(Ri2)C(O)N(R^aR12b); OC(O)N ou alquila, onde C;.?, alquila è opcionaimante substituída com um ou mass halogênio, que são iguais ou diferentes;
R!\ R1’8, rA R!A R'2k> são independentemente selecionados do grupo consistindo em Η; Z; ou alquila, onde C·?^ alquila é epcíonaímente substituída com um ou mais halogènio. que são iguais ou diferentes;
contento que um de R* rA rA RA RA R1 A RA R1A R,2fe seja Z.
Mais preferivelmente, A ê uma cadeia C-,.^ alquila, que é opcicnalmente interrompida por um ou mais grupos independentemente selecionados de -O-; e C(O)N(RáSá); opcienalmente substituído com um ou mais grupas independentemente selecionadas de OH; e C(0)N(RoAAaA; © onde RA8, Rí8íia são independentemente selecionados do grupo consistindo em H; e Cm alquda.
Preferivelmente, I? ten? um peso molecular na faixa de a partir de 14 g/moi a 750 g/mol.
Preferivelmente, selecionada de
L2 é ligado a Z através de um grupo terminal . No caso de A ter tal grupo termina:
é ainda preferido que L4 tenha urn peso .molecular na faixa de a partir de 14 g/mol a 500 g/mol calculado sem tal grupo terminal.
Preferivelmente, L ó- representado pela fórmula (La)
Figure BRPI0906643A2_D0009
em que R4, L? e Z têm o significado conforme acima indicado, e onde RY 5 R$as3 são independentemente selecionados do grupo consistindo em H, e C,..
aiquila; ou são unidos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados para formar um heterocício de 4 a 7 membros. Preferivelmente, R4 è H; ou metila.
Preferivelmente, L è representado pela fórmula (Ib)
Z
I O Ri Ris •;;V! ...N, .À, ''<-· qt'
R 'N‘ Ν' Y'
H* R^ Õ em que R\ R’a, R4, I? e Z têm o significado conforme acima indicado e onde R3aa é H; ou Cx.4 aiquila. Preferivelmente, R4 é H; ou metila.
Preferivelmente, R' na fórmula (I) é LAZ. Preferivelmente. R' na fórmula (I) è íAZ.
Preferivelmente. Rç Rúa na formula (l) são unidos com o átomo 15 de nitrogênio ao qual eles estão ligados para formar um heterociclo de 4 a 7 membros, onde o heterooicio é substituído com L/-Z..
Preferivelmente, D-H é um agente bioativo de molécula pequena ou um biopolímero.
Preferivelmente, D-H é um biopolímero selecionado de grupo de 20 biopolímeros consistindo ern proteínas, polipeptídeos, oligonucleotídeos e ácidos nucleicos de peptídeo.
<!Oligonucteotideosi! significa ou DNA, RNA, de filamento simples ou filamento duplo, siRNA, miRNA, aptâmeros, e quaisquer modificações químicas dos mesmos com preferivelmente 2 a 1000 nucleotideos. Modificações incluem, mas não estão limitadas àquelas que proveem outros grupos químicos que incorporam carga, capacidade de polarização, ligação de hidrogênio, interação eletrostática e capacidade da fluxo adicionais às bases de ligante de ácido nucléico ou ao ligaste de ácido rmcleico como um todo. Tais modificações Incluem, mas não estão limitadas a. modificações de açúcar na posição 2’, modificações de pirimidina na posição 5, modificações de purina na posição B, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4tiourídína, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracils; modificações de estrutura principal, metílações, combinações de emparelhamenfo de base incomuns tais como isobases ísocitidina e isoguarfidiaa e similar. Modificações podem também incluir modificações 3’ e 5’ tais como capearnento e mudança de estereoquímica.
Preferivelmente, D-H è um polípeptídec selecionado do grupo de polipepiideos consistindo em ACTH, adenosina desaminase, agalsidase, alfá-1 antitripsina (AAT), inibidor de alfa-1 proteinase (API), aiteplase, amllinas (amilina, simlina), anlstreplase, ancrode serina protease., anticorpos (monoclonal ou policlonal, e fragmentos ou fusões), antitrombma III, antitripsinas, aprotinina, asparaginases, atosibano, bifalína. bivalírudina, proteínas morfogenéticas do osso, imbteor de tripsina pancreòtíca bovina (BPTI), fragmentos de caderina, calcitonina (salmão), oolagenase, inibidor de esterase Cl de complemento, conotoxinas, fragmentos de receptor da citocina, DNase, dinorfina A, endorfinas, enfuvírtida, enoefalinas, eritropoietinas, exendinas, fator VII, fator Vila, fator VHI, fator Villa, fator IX, fibrinolisina, fator de crescimento de fibroblasts (FGF). peptídeo de liberação de hormônio do crescimento 2 (GHRP2), proteínas de fusão, hormônios de estimulação de folículo, gramsoidina. grelina, desacil-grelina, fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), galactosidase, glucagon, peptideos tipo glucagon, glucocerebresidase, fator de estimulação de colônia de granulócito macrôfa· go (GM-CSF), proteínas de choque térmico humanas (HSP), proteína de ativação de fosfoiipase (PLAP), gonadotropina coriõníca (hCG). hemoglobinas, vacinas da hepatite B, hmudina, inibidor de serina protease humana.
hialuromdase. idumonidase, imuno globulínas, vacinas para influenza, interleucinas (1 alfa, 1 beta. 2; 3. 4, 6, 10, 11, 12, 13, 21). antagonista do receptor de IL-1 (rhlL-1 ra), insulinas, fatores de crescimento do tipo insulina, proteina de ligação de fator de crescimento do tipo insulina (rhIGFBP), interferons (alfa 2a, alfa 2b, alfa 2c, bata 1a, bela 1b, gama la, gama 1b), molécula de adesão intracelular, fator de crescimento de queratinócíto (KGF), ligante de glicoproteína P-selectina (PSGl), fatores de crescimento transformantes. lactase, leptina. leuprdida, levotiroxina. hormônio luteínizante. vacina para doença de Lyme, peptídeos natriurétioos (ANP, BNP, CNP e fragmentos), neuropeptldeo ¥„ pancrelipase, polipeptídeo pancreático, papaina. hormônio paratíreoíde, PDGF, pepsina, peptideo ΥΎ, fator de ativação de plaqueta acetil hidrolase (PAF-AH). prolactina, proteina C, timalfasina, octreotideo, secretina. sermorelina, receptor de fator de necrose de tumor solúvel (TNFR), superoxide dismutase (SOD), somatropinas (hormônio do crescimento), somatoprima, somatostatins, estreptocinase, sucrase, terlipressina. fragmento de toxina do tétano, filactase, trombinas, timosina, hormônio de estimulação da tireoide, tirotropina, fator de necrose de tumor (TNF), receptor de TNFIgG Fc, ativador de plasminogènio de tecido (tPA), TSH. urodilatina, urato oxidase, urocinase, vaccines, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), peptideo intestinal vasoativo, vasopressins. ziconotida. lectina e ricins.
Preferivelmente, D-H é uma proteina preparada através de tecnologias de DNA recombinants.
Preferivelmente, D-H é uma proteína selecionada do grupo de proteinas consistindo em fragmentos de anticorpo, proteínas de ligação de antígeno de cadeia simples, anticorpos catalíticos e proteínas der fusão.
Preferivelmente. D-H é um agente bioativo de molécula pequena selecionado do grupo de agentes consistindo em agentes ativos no sistema nervoso central, agentes antiínfectívos, antialêrgicos. de irnunomodulação. antiobesídade, antícoagulantes, antidiabéticos, anti-neoplástícos, antíbacteríanos, antifúngicos, analgésicos, contraceptives, antí-inflarnatórios, esteroidais, vasodilatadores, vssoconstritores e cardiovasculares com pelo menos um grupo ammo primário ou secundário.
Preferivelmente, D-H è um agente bioativo de molécula pequena selecionado do grupo de agentes consistindo em acarbose, alaproclato, aiendronato, amaníadina, amicacina, amineptina, aminoglutetimida, amisulpri5 da, amlodipina, amotosaleno. amoxapina, amoxiàlina, anfetamina, anfotericina B, ampicilina, amprenavir, amrinona, anileridine. apradonidina, aprarnicina, artícaína, atenolol, atomoxetina, avizafona, bedafeno, benazepril, bem serszida, benzocai'na, betaxolol, bleomicina, bronfenaca, brofaromina, carvediiol, catina, catinona, carbutamida, cefalexina, clinafloxadna, dprofloxad10 na, deferoxamine, delavirdina, desipramina, daunorrublcina, dexmetilfenidato, dexmetilfenidato. diafenilsulfona, dizociípína, dopamína, dobutamína, dorzolamida. doxorrubicíne, duloxetina, eflomitina, enalapril, epínefrine, epirrubicina, ergolina, eriapenem, esmolai, enoxsoina, etambutol, fenfluramine, fe~ noidopam, fenoterol, fingolimcda, ftecainida, fluvoxamina, fasamprenavir, 15 frovatriptano, furosemida, fluoexetina, gabapentins, gatrfluxscina. gemiflocacina, gentamicins, grepafloxadna, hexilcalna, hidralazina, hidrociorotiazida, icofungipeno, idarrubidna, imiquimode, ínversina, Isoproterenol, isradípína, canamicina A, cetamina, labetalol, lamívudina, levobunolol, ievodopa, levotl· roxina, lisinopril, lornefloxacina, ioracarbefe, maprotilina, mefloquine, rnelfa20 lano, memantine, meropenem. mesalazina, mescalina, metiídopa, metilenodiaximetanfetamina, metoprolol, milnaaiprana, mitoxantrana, moxsfloxacina, norepinefrina, norfloxacina, nortriptilina, neomicina B, nistatina, oseltamivir, ácido pamidrônico, paroxetine, pazufloxacina, pemetrexede, perindopril, fenmetrazina, fenolzina. pregabalina, procaína, pseudoefedrina, protriptllina, 25 reboxetina, ritodrina, sabarrubicina, salbutamol, serotonina, sertralinaa, sitegiiptina, sotaiol, espectinomicina, sulfadiazine, sulfamerazina, sertralina, es~ prectinomicina, sulfaleno. suifametoxezol, tacrine, tamsulosine, terbutallna, timolol, tírofibano, tobremicina, tocainide, tosufloxsoins, trendolspril, ácido tranexâmico, tranilcipromina, trimerexato, trovafloxacina, valaciclovir, valgan30 ciclovir, vancomicina, viomldna, viloxazine e zateitabina.
Preferivelmente, Z é um polímero de pelo menos 500 Da ou um grupo Cm* alquila.
Preferivelmente, Z è selecionado do grupo de polímeros opcionaimente reticulados consistindo em poli(propileno glicol), poli(etüeno glicol), dextrano, quítosana, ácido hialurônicc, alginato, xilano. manana, carragenana, agarose, celulose, amido, hidroxialquii amido (HAS), poiíÇvinil alcoóis), 5 poli(oxazolinas), poli(anídrídos), poií(ortc ésteres), polí(carbonatos), poll(uretanas), ácido poli(acrííicos), poll(acrílamidas), poíi(acnlatos), poli(metacriiatos), poli(organofosfazenos), polioxazolina, poli(síloxanas), poíi(amidas), poli(viníípirroiidona), poli(cianoacrílatos), polítèsteres), poii(iminooarbonatos), politaminoácidos), colãgeno. gelatina, hid rogei ou uma 1Q proteína do plasma sanguíneo e copolímeros dos mesmos.
Preferivelmente, Z è urna proteína.
Preferivelmente, Z é uma proteína selecionada do grupo consistindo e,m albumins, transferrina, ímunoglobuiina.
Preferivelmente, Z é um poiiÇetileno glicol) linear ou ramificado 15 com um peso molecular de a partir de 2.000 Da a 150.000 Da.
Mais preferivelmente ainda é um profârmaoo da presente invenção, onde D-H é um agonists do receptor de GLP-1; l. é 1/ representado pela fórmula (I) conforme indicado acima; e Z é um hidrogel. Mais preferivelmente ainda, na fórmula (I), Z é N(R4). X? é Ce X3 é O. Mais preferível20 mente ainda, I.. è representada pela fórmula (Ia) conforme acima indicado,
GLP-1 é um dos hormônios de peptideo intestinais que são liberados no sistema circulatório após ingestão de alimento. Ele aumenta a liberação pús-prandial de insulina, quando alimentos (especlaímente carbaidratos) são absorvidos e seu nível pés-prandialmente elevado, GLP-1 associa 25 com sítios de receptor de GLP-1 localizados em células β pancreátioas e eleva os níveis de cAMP endógenos de uma maneira dependente da dose. Em ilhotas de rato isoladas na presença dos níveis de glicose normoglícêmicos acima, GLP-1 estimula a liberação de insulina. Um potencial terapêutico para GLP-1 em pacientes com diabetes tipo 2 foi sugerido antes, devido à 30 profunda eficácia deste peptideo ínsulíno trópico em estimular secreção de insulina quando níveis de glicose são elevados e parar de fazer isso então retornando para normoglicemia. O efeito antídiabetogênico de amida de pep26 tídeo-l tipo glucagon (7-36) em indivíduos normais e pacientes com diabetes mellitus é descrito, por exernplo, em N. Engí J. Med. 326(2'0): 1316-1322. Estudos /n iwo e experimentos em animais sugerem que GLP-1 melhora a sensibilidade á insulina e tem um efeito anabóíico sobre células β pancreáiicas. Em humanos, GLP-1 foi também relatado suprimir secreção de glucagon, desacelerar esvaziamento gástrico e induzir saciedade, levando à perda de peso se administrado por semanas e meses.
Exendma-4 é relatada se associar cem receptores de GLP-1 localizados em células beta pancreáticas com afinidade 2,5 vezes maior do que GLP-1. Em ilhotas de rato isoladas e células beta na presença de glicose, a exendina aumenta a secreção de insulina de urna maneira dependente da dose.. A exendina-4 é um agonista de alta potência e a exendina-(9-39)amida truncada um antagonista no receptor de 1-(7-36)-amida de peptídeo tipo glucagon de células beta de secreção de insulina (vide J. Bial. Criem. 268(26):19650-19655), Estudos em roedores diabéticas tipo 2 revelaram que a exendína-4 è 5530 vezes mais potente do que GLP-1 em diminuição dos níveis de glicose no sangue. Também, a duração de ação de diminuição de glicose após uma única administração de exendina-4 é signífíeantemente mais longa comparado com GLP-1 (vide, por exemplo, Diabetes 48(5): 10261034). A meia-vida no plasma de exendina-4 em seres humanos foi descrita ser apenas 26 minutos. zX exendina-4 reduz a glicose em jejum e pósprandial e diminui a ingestão de energia em voluntários saudáveis (vide, por exemplo, Am. >./. Physiol. Endocrinol. Mefab. 281 (1 ):E155-61).
Desta maneira, em uma modalidade ainda mais preferida, o agomsta do receptor de GLP-1 é Exendina-4.
Hidrogéis a serem usados são conhecidos na técnica. Hidrogéis adequados podem ser usados, os quais sae descritos no WO-A 2006/003014. Desta maneira, um hidrogel pode ser definido como uma rede polimérica tridimensional, hidrofíliea ou aufifíiica capaz de absorver grandes quantidades de água. As redes são compostas de homopolímeros ou copolímeros, são insolúveis devido à presença de reticuiações químicas ou tísicas covalentes (tônicas, interações hidrofóbicas, emaranhamento). As reticu iaçôes proveem a estrutura de rede e integridade física. Hidrogêis exibem urna compatibilidade termodinâmica com água que permite que eles inchem ern meio aquoso. As cadeias da rede são conectadas de tal maneira que poros existem e que uma fração substancial desses poros são de dimensões entre 1 nm e 1000 nm.
Outro objetivo da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um profármaco da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo junto com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Ainda outro objetivo da presente invenção é um profármaco da presente invenção ou uma composição farmacêutica da presente invenção para uso como um medicamento.
Ainda outro objetive da presente invenção é um método de tratamento, controle, retardo ou prevenção em um paciente mamífero com necessidade de tratamento de uma ou mais condições compreendendo administrar ao dito paciente uma quantidade terapeutícamente eficaz de um profármaco da presente invenção ou uma composição farmacêutica da presente invenção ou urn sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Outro objetivo da presente invenção é um precursor de profármaco de fórmula Act-L, onde L tem o significado conforme indicado acima e Act é um grupo de saída.
Preferivelmente, Act è cloro, bromo, flúor, nitrofenóxi, imídazolila, N-hídroxissuccinímida, N-hidroxíbenzotriazulila, N-hídroxiazabenzotriazoiila, pentafluorfenóxi, 2-tiooxo~tiazolidiniía ou N-hídrexissulfossuccínimidila. Exemplos
Materiais e Métodos
Materials: Exendina-4 protegida na cadeia lateral (J. Eng e outros, J. Biol. Chem., 1992, 267, 11, 7402-7405} em resina de amina Rink, BNP-32a protegida na cadete lateral (humana, Cys1Q e Cys26 trocadas por Ala) em resina de clorctritila, BNP-32b protegida na cadeia lateral com grupo de proteção de cadeia lateral ivDde em Lys14 (humana, CysIQ e Cys26 trocadas por Ala) em resina de clorotritiia e amida 1 -29 de fragmento de fator de liberação de homnõnio do crescimento humano protegido na cadeia lateral (GRF(1-29)) em amida Rínk (cada uma sintetizada através da estratégia Fmoc) foram obtidos da Peptide Specialty Laboratories GmbH, Heidelberg, Alemanha. Grupos de proteção de cadeia lateral padrão foram usadas excels to l..ys27 de Exendina-4 e Lys21 de GFR(1~29) onde as grupos de proteção da cadeia lateral Mmf foram usadas. Metóxi polifetiieno glicoljmalelmidaprapionamída de 40 kDa (PEGUOkDa-maleirnida) fui obtida da Chirotech Technology, Ltd., Cambridge, RU.
Resina de cloreto de 2-clorotritíla, resina de amida Sieber e arni10 noácidos eram da Merck Biosciences GmbH, Schwalbacn, Alemanha, se não declarados de outra maneira. Fmoc-D-Homocistelna(Trt)~OH e ácido STntil-3-mercaptaprapíônico (Trt-MPA) furam obtidas da Bachem AG, Bubendorf, Suíça. 0-(N'Fmoc-2-aminaetil)-0’-(2-uarbaxiet.il)-undecaetilenogiico! (Frnoc-Pop-OH) foi obtido da Polypore AS, Olso, Norway. Fmec-4-(215 amínoetíl)~1-carbuxi.metil“píperazína (Fmoc-Acp-OH) foi comprada da NeoMPS SA, Strasbourg, França, Anidrido cis-Cicla-hexano-1,2-dicarboxílico foi obtida da Alfa Aesar GmbH 8 Co, KG, Karlsruhe, Alemanha,
Todos os outras agentes químicos eram da Sigma-ALDRICH Chemie GmbH-Taufkirchen, Alemanha.
Síntese de fase sólida fai realizada em resina de cloreto de 2clorotritila corn uma carga de 1,3 mrnol/g ou resina de amida Sieber com uma carga de 0.55 rnrnol/g. Seringas equipadas com fritas de polípropíleno foram usadas como recipientes de reação.
A carga do primeiro aminoàcído em resinas foi realizada de a25 corda com as instruções do fabricante
Desproteção de Fmoc.
Para remoção de grupa de proteção Fmoc, a resina foi agitada com 2/2/06 (v/v/v) de piperidina/DBU/DMF (duas vez.es, 10 min cada) e lavada corn DMF (dez vezes),
Ltesprateçãu de ivOde:
Para remoção do grupo de proteção svDde. a resina foi agitada corn 98/2 (v/v) de DMF/hídrato de hidrazína (3 vezes, 10 min cada) e lavada cum DMF (dez vezes).
Proteção de Boe:
O terminal N de um peptidec foi protegido com Boc através da agitação da resina cum 30 eq. (bochO e 60 eq. de piridina em DCM. Apos 1 h a resina foi lavada com DCM (10 vezes).
Condição de acoplamento padrão para ácidos:
Acoplamento de ácidos (ácidas alifátiaos, Fmoa-aminaáaidos) a grupos amino livres em resina foi conseguido agitando a resina com 3 eq, de ácido, 3 eq. de PyBOP e 6 eq, de Dl EA em relação a grupos amino livres na resina (calculada com base em carga teórica da resina) em DMF em temperatura ambiente. Após 1 hera a resina foi lavada cem DMF (10 vezes). Acoplamento com ácido 3~maieimido propiônicc:
Acoplamento de ácido 3-maleimido propiônico com grupos amino livres ern resina foi conseguido agitando a resina corn 2 eq. de ácida, 2 eq. de DIC e 2 eq, de HOBt em relação a grupos arnino livres em DMF em temperatura ambiente. Após 30 minutos, a resina foi lavada com DMF (10 vezes).
Protocola padrão para síntese de ureias em resina:
Síntese de ureias em resina foi conseguida agitando a resina com 2,5 eq. de carbonata de bis(penfafiucrfenila), 5 eq. de DIE.A e 0,25 eq. de DMAP em relação aos grupos amino livres em DCM/ACN 1/1 em temperatura ambiente. Após 15 minutos, a resina foi lavada com DMF (10 vezes). 5 eq. de amlna foram dissolvidos em DMF. A mistura foi adicionada à resina e agitada por 60 min em temperatura ambiente. A resina fui lavada com DMF (10 vezes).
Protocolo de divagem para resina de amide Sieber:
Quando dc término da síntese, a resina foi lavada com DCM (10 vezes), seca a vácuo e tratada repetidamente (cinco vezes em 15 minutes) com 97/2/1 (v7v) DCM/TES/TFA, Os eluatos foram combinados, os voláteis foram removidos sob uma carrente de nitrogênio e produto foi purificado através de RP-HPLC. Frações de HPLC contendo produto foram combinadas e liofíüzadas.
Protocolo de divagem para resina de cíorete de 2-dorotrítüa:
Quando do término da síntese, a resina foí lavada com DCM. seca a vácuo e tratada duas vezes por 30 minutos oom 6/4 (v/v) de 5 DCM/HFIP. Os eluates foram combinados, os voláteis foram removidos sob uma corrente de nitrogênio e produto foi purificado através de RP-HPLC. As frações de HPLC contendo produto foram combinadas e liofilizadas. Protocolo de divagem para resina de amída Rink:
Quando do término da síntese, a resina foi lavada com DCM.
seca a vácuo e tratada com 2 ml de coquetel de divagem de TFA (TFA/TES/Água/DTT 95/2/2/1) por 100 mg de resina por 60 min em temperatura ambiente. Os voláteis foram removidos sob uma corrente de nitrogênio. Subprodutos não-poíares e grupos de proteção foram removidos precipitando peptídeo do dietil éter. O precipitado fui seco a vácuo e dissolvido em
ACN/água 1/1 e purificado através de RP-HPLC.
Produtos contendo amina obtidos como sais de TFA foram convertidos nus sais de HCi correspondentes usando resina de troca de íon (Discovery DSC-SAX. Supelco, USA). Esta etapa foí realizada no caso de TFA residual ser esperado interferir com, por exemplo, uma reação de aco20 pia mento subsequente.
Purificação por RP-HPLC.'
RP-HPLC foi realizada em uma coluna de 100x20 ou uma 100x40 mm Cl8 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5 μ (Dr. Maisch, AMmerbuch. Alemanha) conectada a um Waters 600 HPLC System e Waters 2487 Absor2.5 banca detector. Gradientes lineares de solução A (TFA 0,1 % em H?O) e solução B (TFA 0.1% em acetonitrile) foram usados Frações de HPLC contendo produto foram liofilizadas.
Analítico? Espectromstria de massa de ionização por pulverização (ESLMS) fui realizada em um instrumento Waters ZQ 4000 ESI e espectros foram, se 30 necessário, interpretados pelu software Waters MaxEnt.
Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi realizada usando um Amersham Eioscience AEKTAbaslc system equipada core uma coluna Superdex200 10/300 (Amersham Bioscience/GE Healthcare), se não declarado de outra maneira. Fosfato de sódio 10 mM, NaC1140 mM, pH 7.4 EDTA 3 mM foram usados como tose móvel
Para Cromatografia de Troca de Càtion, um Amersham Biosci5 enue AEKTAbasic system foi equipado com uma coluna Source 15S filled HR16/10 (Amersham fôiosoience/GE Healthcare).
Dessalinizaçào foi realizada usando um Amersham Bioscieace AEKTAbasic system equipado com uma coluna HiPrep 26/10 Desalting e ácido acético 0.1¾ em água como fase móvel
Hidrólise de ligante rn vz/ra e liberação de fármaco: os compostos foram dissolvidos em tampão A (fosfato de sódio 10 mM, NaDi 140 mM, pH 7,4, EDTA 3 mM) ou tampão 8 (acetato 0.1 M. EDTA 3 mM. pH 4.0) e solução foi filtrada em um filtro de 2 pm e incubada a 37° C. As amostras foram obtidas em intervalos de tempo e analisadas através de RP-HPLC em 215 nm e ESl-MS. Sinais de UV se relacionando á molécula de fármaco liberada foram integrados e postos em gráfico contra tempo de incubação. No caso de tempos de retenção idênticos de profármaco e fármaco, razão de sinais de massa foi usada para determinar a cinéfica de liberação.
Para conjugados de hidrogel. os compostos foram suspensos
2.0 em tampão A e incubados a 37° 0. As amostras foram obtidas após centòfugação da suspensão e analisadas através de RP-HPLC a 125 nrn. Sinais de UV se relacionando à molécula de fármaco liberada foram integrados e postos em gráfico contra tempo de incubação.
Software de ajuste de curva foi aplicado pare estimar a meia25 vida de liberação correspondente.
Exemplo 1
Síntese de veiculo de ácido graxo (1)
Figure BRPI0906643A2_D0010
Resina de amide Sieber Fmoo-Lys<jvD<fc>) 1. Desproteçâo de Fmoc
β) f S.âcepismfinííiAísí âactó i
.. ,' ... .... . &x$ecam>ico {Dd3} j3ds-Lys(ivDdej r mocLysi-vOife; ' i CesjxGteçáa de ivüde 1. Desproteção de Fmoc Clivagem. puriücaçào
Ãrx^ísresrsto &! a-T:Sí.- = 2. ewWffc os Msl-OH , >
PopOW .....\ ·''< - .\ pç.o rte<>c Mal foi sintetizado em resina de amida Sieber (477 mg, 0,262 mmol) através do acoplamento de Fmoc-Lys(ivDde) OH. desproteção de fmoc, acoplamento de ácido dodecanoico, desproteção de ivüde. acoplamento de Fmoc-Pop-OH, desproteção de fmoc, acoplamento de ácido 3maieimido propiõnico, divagem a partir da resina e purificação conforme mostrado acima e descrito em Materiais e Métodos.
Rendimento: 128 mg (0,119 mmol)
MS: m/z 1101.0 “ [M-*Naf (MW calculado - 1078,4 g/mol).
Exemplo 2
Síntese de reagents Ligante (2)
Η H '·, ..·-'.x ..·% ,N. y -p·' i o
TrtS
Figure BRPI0906643A2_D0011
^íisí-ís rfe ss S-ciorotriíiiB '' Fwo,” Oys{Trti·· OH
2. desproteção de Fmoc
Figure BRPI0906643A2_D0012
H-GysCm) | Vf A Clivagem, punficação ,.s ...s tj || J( „ns ..--. A i .....................................*- A 's'x‘ 'v’: Ά Oh
- - N 'ryrtm I 4 ..;
T:1S .2
O reagente Ligante 2 foi sintetizado em resina de cloreto de 3& clorotritda (3D0 mg, 0,39 mmol) através de carregamento da resina com Fmoc-CysíTry-QH, desproteçào de fmoc e formação de areia em resina usando yN-dimetiPetilenodiamina como amina, divagem a partir da resina conforme acima mostrado e descrito em Materiais e Métodos. Para separação por RP-HPLC, HCI 0.01% em água foi usado como solução A e HCI
0,01 % em acetonitrila foi usado como solução B.
Rendimento: 82 mg de sal de HCI (0,16 mmol)
MS: m/z 476,2 -~- [MeHf (MW calculado ™ 477,6 g/moi). Exemplo 3
Síntese de intermediário Exendina~4 ligante (3)
O Η Η H m, ...Nx ,.NV A-v f- ,. hf N— txendina l· H : H :S O A
SH
2 (14 mg( 0,027 mmol), PyBOP (14 mg. 0,027 mmol) e DlEA (17 pl,
0,10 mmol) foram dissolvidos em 0(2 ml de DMF seca. A mistura foi adicionada a 22 mg de Exendina-4 protegida na cadeia lateral em resina (Ô,1 mmol/ 2,2. pmoles) e agitada por 30 mio em temperatura ambiente, A resina
-.>4 foi lavada com DMF (10 vezes) e DCM (10 vezes). 3 foi ciivado a partir da resina e purificado através de RP-HPLC conforme descrito em Materiais e Métodos.
Rendimento: 1,7 mg de 3 como sal de TF A (0,38 pmol)
MS: m/z 1468,7 ~ (MW calculado = 4403 g/mol).
Exemplo 4
Síntese do conjugado ácido graxo-PEG-ligante-Exendina-A (4)
Figure BRPI0906643A2_D0013
(1,7 mg, 0,38 prnol) e 1 (0,6 mg, 0,58 pmol) foram dissolvidos em 500 pi de acetonitrila/água 713 (vór). 40 pl de tampão de fosfato 0,5 M (pH
7,4) foram adicionados e a mistura foi incubada em TA por 10 min. Conjugado 4 foi purificado através de RP-HPLC,
MS: m/z 1828.7 (M^HY (MW calculado 5480 g/mol).
Exemplo 5
Síntese do Intermediário lígante (5a)
Figure BRPI0906643A2_D0014
S»
Fmoc- Acp-OH 2 HCI (100 mg, 0,21 mmol) foi suspenso em 400 pl de
DMF/DMSO 1/1 (v/v). S-tntilcisteamina · HCI (75 mg, 0,21 mmol), PyBOP (109 mg, 0,21 mmol) e DIEA (146 pl, 0,86 mmol) foram adicionados e a mistura foi agitada por 60 minutos em temperatura ambiente, O grupo fmoc foi removido através da adição de 75 pl de piperidina e 25 pl de DBU. Após 15 20 min a mistura foi ãidrolísada e acidificada (AcOH) e c composto fos purificado através de RP-HPLC. Após hofilização 98 mg (0,14 mmol sai de TFA dupla) foram obtidos.
MS: m/z 511,6 ~ (M-r Na]* (MW calculado - 488,7 g/mol).
Síntese do monoamída de amoxapina do ácido cis-cícto~hexano dícarbuxiHco (5b)
Figure BRPI0906643A2_D0015
' * enantiômero
Amexapina (200 mg, 0,64 mmoi) e anidridu cis~ciolo-hexana-1,2dícarboxílico (108 mg, 0,70 mmol) foram dissolvidos em 700 pi de DMF seco, Piridina (130 pl, 1,6 mmol) foi adicionada e a mistura fui agitada por 60 min em TA. A mistura foi extinta com 2 ml de acetonítrila/àcido acético/àgua (1/1/1) e purificada através de RP-HPLC. Após liofillzação. 344 mg (0,49 mmol, sal de TFA duplo) de 5b foram obtidos
MS: m/z 468,5 ~ (M+Hf (MW calculado ~ 468,0 g/mol).
Síntese do conjugado íigante-amoxapina (Sc)
Figure BRPI0906643A2_D0016
Figure BRPI0906643A2_D0017
5b (7 mg, 0.010 mmol) foi preativadu através de incubação corn PyBOP (12.5 mg, 0,024 mmol) e DIEA (5 pl, 0,03 mmol) em 200 pí de DMF seco por 45 min em temperatura ambiente. 5a (20 mg, 0.028 mmol) e Dl EA (15 pi, 0,09 mmol) foram adicionados e a mistura foi incubada per mais 60 min. A mistura foi extinta com 0,5 ml de acefonitrila/ácido acético/àgua (1/1/T) e purificada através de RP-HPLC. Após líofilização, 3 mg (0,0026 mmol, sal de TEA duplo) de 5c foram obtidos.
MS: m/z 939,3 “ (M-t-Hf (MVV calculada - 038.6 g/mol).
Para desproteçâo de tritila, α iiofilisate foi incubado em 1 ml de HFIP e 3 pi de TES por 30 min, A mistura foi evaporada e tini foi purificado através de RP-HPLC. Após liufílização, 2 mg (2,2 pmoles, sal de TFA duplo) de conjugada amoxapina-ligante 5c foram obtidos.
MS: m/z 697,1 ~ [M*Hf (MW calculado ~ 696.3 g/mol).
Síntese de conjugado ácido graxo-PEG-amoxapina (5)
Figure BRPI0906643A2_D0018
Conjugado Amoxapina-ligante 5c (2 mg, 2,2 pmoles) e 1 (3,5 mg, 3,2 pmoles) foram dissolvidos em 900 pl de aeetonítnla/àgua 7/3 (v/v). 50 pl de tampão de fosfato 0,5 M (pH 7,4) foram adicionados e a mistura foi Incubada em temperatura ambiente por 10 min. 5 foi purificado através de RP-HPLC, MS? m/z 1774,9 - [M* H'f (MW calculado ~ 1774,7 g/mol),
Exemplo 6
6 Síntese de reagente ligante (6) r õ
Fmoc-Asp(t8u)OH (411 mg. 1 mmol), HOBí (153 mg, 1 mmol) e DIC (160 pl, 1 mmol) foram dissolvidos em 2 ml de DMF e incubados por 10 minutos em temperatura ambiente. Ν,Ν-dimeiil etilenodiamina (160 pl, 1,5 mmol) foi adicionada e agitada em TA por 30 min. Ácido acético (300 pí) foi 15 adicionado e FA^oc~Asp(tBu)-NH-(CH2)2-N(CH3)2 foi purificado através de RP-HPI..C.
Rendimento: 220 mg (0,46 mmol)
MS Fmoc-Asp(t8u)-NH-(CH2)2-N(CH3)2: m/z 504,6 - [M*Naf (MW calculado “481,6 g/mol).
Fmoc-Asp(tBu)-NH-(CH2)2-N(CH3)2 (220 mg, 0,46 mmol) foi dissolvido em 3 ml de 98/2 (v/v) TFA/TES. Apôs 30 min o solvente foi removido sob corrente de nitrogênio e 6 foi purificado através de RP-HPLC usando HCI
0,01% em âgua como solvente A e HCi 0,01% em acetonitrila como solvente
B.
Rendimento: 146 mg (0,32 mmol, sal de HCl)
MS: m/z 426,5 ~ [M*H]* (MW calculado ” 425,5 g/mol).
Exemplo 7 Síntese de reagentes lígaotes 7a e 7b
OR ·· ·· RS:'' SÍp:<<<<<
A. A ,-'·χ a\ fmoc' V N Y Ύ’ l H Hi
Y ...OH O*
Ϊ
O
7a: R H 7b: R = CH3
Síntese de 7a:
Fmoc-Asp(tBu)-OH (300 mg, 0.73 mmol). HOBt (1112 mg, 0.73 mmol) e DIC (117 pi, 0,73 mmol) foram dissolvidos em 2 ml de DMF e incubados por 10 min em temperatura ambiente. Boc-etilenodiamina (230 mg, 1,44 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente por 30 min. Ácido aoético (300 pl) foi adicionado e Fmoc~Asp(tBu)-NH~(CHs)2-NH~Boc foi purificado através de RP-HPLS.
Rendimento: 205 mg (0,37 mmol) Intermediário de MS: m/z. 576,6 ~ [M+Na]+ (MW calculado ™ 553,7 g/mul).
Fmoc-AspCtBuj-NH-fCHjirNH-boo (205 mg, 0,37 mmol) foi dissolvido em 3 ml de 98/2 (v/v) de TFA/TES, Após 30 min, o solvente foi removido sob uma corrente de nitrogênio o Fmoc~Asp(H)-NH“(CH2)2“NH2 foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 140 mg (0,27 mmol, sal da TFA)
Intermediário de MS: m/z 398,8 ~ (M+H]* (MW calculado ~ 397,4 g/mol).
Fmoc Asp(H)-NH-(CH2)2 NH^ (140 mg, 0,27 mmol, sal de TFA) foi dissolvido em 1 ml de DMF e DIEA (140 pl, 0,81 mmol) e boç^O (100 mg. 0,46 rnmol) adicionado. A solução foi agitada em TA por 15 min a então acidificada com ácido acéticu (300 pl). 7a foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento de 7a: 120 mg ((124 mmol)
MS de 7a: m/z 520,5 ~ (MW calculado ~ 497,6 g/mol).
7b foi sintetizado conforme acima descrito exceto pelo uso de HyN-tCH^-NCCHVj-boc ao invés de boc-etílenodiamina como amina na pri5 meira etapa.
Rendimento de 7b: 115 mg
MS 7b: m/z 534,5 ~ (M-^Naf (MW calculado ~ 511,6 g/mol).
Exemplo 8
Síntese de conjugados Exendinadigante 8a, 8b e 8o
O R1
Figure BRPI0906643A2_D0019
8a: RI ~ H, R2 ~ H
8b: R1 H. R2 ~ CH3 8c; R1 s·· CHj, R2 CH5
Síntese de 8a:
7a (30 mg, 60 pmol). HOBt (9 mg. 60 prnoles), DIEA (12 pl, 70 pmoles) e DIC (10 pl, 63 prnoles) foram dissolvidos em 200 pl de DMF e imediatamente adicionados à Exendina-4 protegida na cadeia lateral em resina (40 mg, 4 prnoles) e incubados por 1 h em temperatura ambiente. A re15 sina foi lavada dez vezes com DMF e então incubada por 5 min com 500 pl de 1/1/2 de anidrido acétíco/piridína/DMF. A resina foi lavada 10 vezes oom DMF e grupo frnoo foi removido. Ácido Trt-mercaptopropiônico foi acoplado e 8a foi clivado da resina e purificado através de RP HPLC.
Rendimento: 3.6 mg
MS 8a: m/z 1108,5 [Μ+4ΗΓ; 1477,8 [M*3H]'V (MW calculado - 4432 g/mol).
8b foi sintetizado conforme acima descrito para 8a exceto pelo uso de
7b ao invés de 7a.
Rendimento.' 3,5 mg
MS 8b: m/z. 1112,5 ~ (M*4Hp*; 1482,5 - (M*3Hf* (MW calculado ~ 4446 g/mol).
8c foi sintetizada conforme acima descrito para 8a exceto pelo usa de 6 ao invés de 7a.
Rendimento: 3,2 mg
MS Sc: m/z 1116,2. 1487,8 (M*3Hp* (MW calculado 4466 g/mol)
Exemplo 9
Síntese de conjugados PEGéÔkDadigante-E.xcudma 9a, 9b e 9c
PEG40kDa
Figure BRPI0906643A2_D0020
Figure BRPI0906643A2_D0021
9a: R1 ~ H, R2 » H
9b. RI - H, R2 ~ OHj
9c. R1 CH3, R2 CHS
Síntese de 9a:
8a (3,8 mg) foi dissolvido em 300 pl de água/acetonitriia 2/1 e 50 mg de PEG40kDa~maleimida foram adicionados. 100 pi de tampão de fosfato de sódio 0,25 M pH 7 foram adicionados e após 5 min a solução foi acidifioada com 50 pl de ácido aaética,
9a fai purificado através de crornaíografia de troca de ion usand citrato de sódio 10 rnM pH 3 como solvente A a citrato de sódio 10 mM pH e NaCI 1 mM como solvente B e um gradiente em etapa (0 a 40% de 8), Frações contende 9a foram dessaíinizadas e iicfilizadas.
Rendimento: 14 mg
9b foi sintetizado conforme acima descrito exceto peio use de
Rendimento’ 15 mo
9c fui Sintetizado conforme acima descrito exceto pelo uso de
Sc.
Rendimento'. 13 mg
Exemplo 10
Síntese do conjugado ácido graxo-ligante-Exendina 10
..... x ...... xiy ·>«ί ........
Exendine i-í ,N r i'rt Μ·!
Exendina
8c (1 mg) fui dissolvido em 100 yl de 1/1 acetonitrilaAágua e 1 (1 mg) em 100 pl de 3/1 acetunítnla/água foi adicionado. 100 yl de tampão de fosfato de sódio 0,25 M foram adicionados, a reação foi agitada por 5 min, após o que 10 foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 1,3 mg
MS 10: m/z 1385.9 [M-4H14*; 1846,3 [M*3H]3* (MW calculado ~ 6528,3 g/mol).
Exemplo 11
Síntese de reagent© ligante ativado por NHS 11
H „N fmoc
7b (20 mg, 40 ymol), N.N'-dicidu-hexiloaFbodiimida (10 mg, 48 pmoles) e NHS (8 mg, 70 pmoles) foram dissolvidos em 300 ul de DCM seco e agitados em temperatura ambiente por 1 h. Solvente foi removida sob uma corrente de nitrogênio e 11 foi purificado através de RP-HPLC e liafilizado. Rendimento·. 22 mg (36 pmoles)
MS: MS: rn/z 631,5 ~ [M+Naf (MW calculado ~ 608,7 g/mal).
Exemplo 12
Síntese de conjugado figante-Exendina (Fluoresceína) (12a) e conjugado !igante~GFR(1~29)(Fluoraseema) (12b)
O I
H ii ί
HS
12a: FteExendina (εΚ2?-fluoresceins)
12h: R =GR F( 1 -29)kK27-fiuorescelna) (60 mg, sal de HCI 130 pmoles), HOBt {'20 mg, 130 pmoles), DiEA (40 pmoles, 230 pmoles) e DIC (20 pl, 126 pmoles) foram dissolvidos em 700 pl de DMF e imediatamente adicionados à Exendina-4 protegida na cadeia lateral em resina (120 mg, 12 pmoles) e incubados por 1 h em temperatura ambiente. A resina foi lavada dez vezes cum DMF e então incubada por 5 min com 1 ml de 1/1/2 (v/v/v; de anidrído acético/piridina/DMF. A resina foi lavada dez vezes com DMF e grupo fmoc foi removido. Trt-àcido mercaptopropiônioo foí acoplado de acorda com método de acoplamento padrão e resina foí lavada cinco vezes cum DMF e dez vezes com DCM. Grupo de proteção Mrnt de Lys27 foi removido através de incubação de resina cinco vezes em 2 ml de 9/1 (v/v) de DCM/HFIP por 5 min. A resina foi lavada cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF e éster da 5,6-carbéxl· fluaresceina-NHS (20 mg. 42 pmoles) e DIEA (20 pl, 115 pl) em 300 pi de DMF foram adicionados á resina e incubados por 30 min. 12a foí clívado da resina e purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 1.2 mg
MS 12a: rn/z 1205,9 - [M+4H]4’; 1607.0 ~ [M+3HJ5* (MW calculado 4818,3 g/mol).
12b foi sintetizado conforme descrito para 12a exceto pelo uso de GRF(1-29) em resina (120 mg, 12 pmoles).
Rendimento'. 11 mg
MS 12b: m/z 998,6 [M-MHf*; 1330,5 ~ (MW calculada ~
3989.6 g/mol).
Síntese de mercaptopropianila-Exeadma(Fluorescema) (12c) e merca p~ toprepianíla-GRF(1-29)(FIuarescema) (12d)
Figure BRPI0906643A2_D0022
12c. R~Exendina (sK27-fiuoresceina) 12d: R~GRF(1 -29)(sK27-fluaresceína)
Trt-ácido mercaptoproplônico foi acoplado de acordo com o método de acoplamento padrão à E.xendina-4 protegida na cadeia lateral em resina (120 mg, 12: pmoles). Remoção do grupo de proteção Mmt de Lys27 e acoplamento do éster de 5,6-carbõxi-fluoresceÍna NHS foram realizados conforme descrito para 12a. 12c foi divado da resina e purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 13 mg MS 12c: m/z 1545,8 «(MW calculado * 4633 g/mol).
12d foi sintetizado conforme descrito para 12c exceto pelo uso de GRF(1~29) em resina (120 mg, 12 pmoles).
Rendimento: 11 mg
MS 12d: m/z 1269,1 ~ (Μ-βΗ)3* (MW calculado = 3804,3 g/mol).
Exemplo 13
Síntese de conjugado PEG40kDa4igaHte-Exendina(Fluorescema) (13a) e conjugado PEG40kDa4ígante-GRF(1-29)(Fluorescaína) reversível (13b)
PEG40kDa
13a: R~E.xendina (sK27-fluoresceina)
13b: R-GRF(1 -29)(sK27-fluoresceína)
12a (12 mg) foi dissolvida em 500 pl de 1/1 acetonitnla/água e 120 mg de PEG4QkDa~maleimida em 1 ml de 1/1 acetonitríla/água foram adicionados. 300 pl de tampão de fosfato de sódio 0,25 M pH 7,0 foram adicionados e a solução foi acidificada apôs 10 min com 300 μΙ de ácido acético. 13a foi purificado através de cromatografia de troca de cátion,. dessa.liniz.ado e então líofilizado.
Rendimento: 51 mg
13b foi sintetizado conforme descrito para 13a exceto pelo uso de 12b ao invés de 12a..
Rendimento: 46 mg.
Síntese de conjugado PEG400kDa~Exendina (Fluoresceína) permanente (13) e conjugado PEG40kDa-GRF(1-29) permanente (13d)
H
N~ R
PEG40kDa
13c: R-Exendina (eK27~fluoresceína)
13d: RGRF( 1 ~29)(sK27-fluoresce'ina)
13c foi sintetizado conforme descrito para 13a exceto pelo uso de 12c ao invés de 12a.
Rendimento: 55 mg
13d foi sintetizado conforme descrito para 13a exceto pelo use de 12d ao invés de 12a.
Rendimento: 45 ma
Exempla 14
Síntese de conjugada Hgante-GRF(1-2S) 14
HS
H .0
HN.
xGRF(1-29) foi sintetizado conforme descrito para 8c exceto pelo uso da resina de GRF(1-29) protegido na cadeia lateral.
Rendimento: 10 mg
MS 14: m/z 908,2 - (M*4Hf g/mol).
Exemplo 15
Síntese de conjugado PEG49kOa-ligante~GRF(1-29) (15)
PEG40kDa foi sintetizado conforme descrito para Sc exceto pelo uso de 14 e citrato de sódio 10 mM pH 4 como solvente A e citrato de sódio 10 mM pH 4 e cloreto de sódio 1 M como solvente B para cromatografia de troca de cà~ fion.
Rendimento; 11 mg
Exemplo 15
Smtese de intermediária ligante 16
H 'N-.....N
1S
N.N-dimetlletilenodiamina (198 pL: 1,8 mmoi) e NaCBH3 (53 mg, 0,9 mmoi) foram dissolvidos em metanol (5 ml) e trazidos para pH 5,5 através da adição de AcOH (250 pL), Uma suspensão de 2,4,6trimetoxibenzaldeido (294 mg, 1,5 mmol) em EtOH (5 ml) foi adicionada e a reação foi agitada em TA por 1 h. MG! 5N (Q;5 mL) foi adicionado e a mistura foi agitada por mais 1.2 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em NaHCOj saturado e extraído 3x com DCM. As fases orgânicas combinadas foram secas em Na^SCL e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida.
Rendimento' 303 mg (1,13 mmol)
MS: m/z 269.3 - (MiHf (MW calculado ~ 2.68.4 g/mol)
Exemplo 17
Síntese de ligantes 17a e17b o
Trnob,. aL ..--'x .OH
T lí ,N. I
17a. R-H
J 17b; R-Me
TríS
Sí ntese de 17ai
Fmoc-Asp(QiBu)-OH (322 mg, 0,78 mmol), diamma protegida corn Trnob 16 (150 mg, 0,56 mmol), HATU (.255 mg, 0,67 mmol) e DIEA (290 pl, 0,67 rnrnol) e DIEA (290 pL, 1,68 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 ml). A mistura foi agitada por 30 min, acidíficada com AcOH e purificada através de RP-HPLC.
Rendimento: 463 mg (5,97 mmoles, sal de TF A, cerca de 9035 puro)
MS Fmos-AspíOtBuj-NflMOBiCH-íCHjNtCHj);; : m/z. 862,5 ~ [M+Hf (MW calculada ~ 661,8 g/mol).
Fmoc-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH2CH2N(CH3)2 (225 mg, 0,29 mmol) foi dissolvido em uma solução de píperidina (50 pL) e DBü (15 pL) em DMF 20 (1,5 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1,5 h. AcGH foi adicionado e H-Asp(Ot8u)-N(TMOB)CH;?CH?N(CH-.ò;? foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 114 mg (0,21 mmol, sal de TFA)
MS H-Asp(OtBu)~N(Tmob)Cí4?CHsN(CH3)2·' m/z 462,4 - [M^Naf (MW calcu25 lado ~ 439.6 g/mol).
Q sal de TFA de H-Asp(OtBu)~N(Tmab)CH3CH;N(CH;:)2 (114 mg. 0,21 mmol) foi dissolvido em NaHCOs saturado (10 rnL) e extraído 3x com DCM (3 x 10 mt). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na^SCq e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em DMF (1,0 ml..), ácido 6-t.ritilmereapto hexanoicc (1.21 mg, 0,31 mmol), HATU (118 mg, 0,31 mmol) e DIEA (108 pL, 0,62 mmol) foram adicionados. A mistura foi agitada por 30 min. AcOH foi adicionado (200 pL) e TrtSíCHj^CONH-zXspCOtBul-NfTmobrCHjCH^NfCHj^ foi purificado através de RP HPLC.
Rendimento: 95 mg (0,10 mmol. sal de TEA)
MS TftS(CH2)sCONH-Asp(OtBu)~N(Tmob)CH2CH2N(CH3)z: m/z 812,64 ~ (MW calculado ~ 812,1 g/mol).
TrtS(CH2)5CONH-Asp(OtBu)“N(Tmob)CH2CH2N(CH3)2 (95 mg, 0,10 mmol) foi dissolvido em uma mistura 3.Ί de MeGH/H2O (1,0 ml..), L.iOH (7,4 mg, 0,31 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada por 5 h a 60G C. AcOH foi adicionado (100 pL) e 17a fci purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 64 mg (0,07 mmol. sal de TFA)
MS 17a: m/z 756,5 ~ (M+Hf’ (MW calculado ~ 756,0 g/mol)
17b foi sintetizado conforme acima descrito exceto pelo uso de FmoCNMe-Asp(ÜtBu)-ÜH ao invés de Fmoc-AsptOtRueGH na primeira e20 tapa.
Rendimento 17b: 16 mg (18 prnol, sal de TFA)
MS 17b. m/z 770,5 [M*Hf (MW calculado 770.0 g/mol)
Exemplo 18
Síntese de conjugadas ligante-BNP 18a e 18b o
I.
HN Ar' > RÃ
,.N.
.·> >..
r 18a: R ~ H
J 18b: R Ma
HS '
Síntese de 18a:
-.íSsíí
H
17a (8,0 mg, 0,01 mmol), PyBOP (5,2 mg, 10 pmol) e DIEA (7 pL, 40 pmoles) foram dissolvidos em DMF (400 pl.) e imediatamente adicionados a BNP-32a protegido na cadeia lateral, ligado à resina (50 mg, 5 pmoles). Apôs incubação por 2 h em temperatura ambiente, a resina foi lavada com lOx DMF, lOx DCM e seca a vácuo. O produto foi clivado a partir da resina e purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 10,6 mg
MS 18a: m/z 030,4 ~ 1240.1 ~ [M*-3H]3í (MW calculado * 3717,2 g/moi),
18b foi sintetizado conforme acima descnfo exceto pelo uso de 17b ao invés de 17a.
Rendimento: 4,7 mg
MS 18b: m/z 933,9 - (M-MHA: 1244,7 * [M+3H]3* (MW calculado 3731,0 g/mol).
Exemplo 19 Síntese de conjugados PEG40kDa-ligante~BNP 19a s 19b ? H > «- IV 0
Γ * \..<O
...-< t
1Sx: R ~ H
1Sb: R ~ Ma
18a (5,2 mg) foi dissolvido em 1:1 de HeO/acetonitrila contenda TF A 0,1 % (200 pL). Uma solução de PEG40kDa-maleimida (70 mg) em 1:1 de H2O/aaetomt.rila (1,5 mL) e tampão de fosfato (30 pL, pH 7,4, 0.5 M) foi adicionada. A solução foi incubada em temperatura ambiente, após 5 rnin AcOH (30 pL) foi adicionado. 19a foi purificada através de cromatografia de troca de cátion, dessalinizado e liofilizado.
Rendimento: 19,2 mg.
19b foi sintetizado conforme descrito para 18a exceto pelo uso de 18b ao Hives de 18a,
Exempla 20
Síntese de ligante 2Ô
O
Η I
..-•x ..N, .-'x ,.·< v BocNH γ j OH { Ò HN.^,0
Fmoc-Asp(OH)OtBu (100 mg, 0,24 mmol), HsN-tCHslg-NCCHjpbua (30 pl. 0,20 mmol), HATH (02 mg, 0,24 mmol) e DIEA (105 pl, 0,60 mmol) foram dissolvidas em 1 mL de DMF. A mistura foi agitada por 1 h em temperatura ambiente, acidífioada com AcOH (100 uL) e purificada através de HPLC. Rendimento: 91 mg (0.13 mmol)
MS Fmoc-Asp(NH(CHg);>N(CH3nbnc)OtBu: 590,3 ~ [M*Na]+ (MW calculado ~ 567.7 g/mc-l)
Frnoc Asp(NH(CH2)zN(CH3)--boc)OtBu (91 rng, 0,13 mmol) foi dissolvido ern DMF (1,0 ml), piperldlna (50 pl) e DBU (15 pL) foram adicionados e a mistura foi agitada por 45 min em temperatura ambiente. AcOH (100 yl) foi adicionado e NH2-Asp(NH(CH2)2N(CH3)-boc)OtBu foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 39 mg (0,09 mmol, sal de TFA)
MS NH2-Asp(NH(CH2hN(CH3)-boc)OtBu: m/z 368,1 ™ (M-rNaf (MW calculado 345,4 g/moí)
NH2-Asp(NH(CH2j?N(CH3)-boc)OtBu (36 mg, 0,09 mmol) foi dissolvido em DMF (0,5 mL), àcído 6-trltilmercapto bexanoico (55 mg, 0,14 mmol), HATU (53 mg, 0,14 mmol) e DIEA (49 pt, 0,28 mmol) foram adicionados, A mistura foi agitada por 45 min. AcOH foi adicionado (100 yL) e TrtS(CH2)5CONH~Asp(NH(CHa);?N(CH3)-buc)OtBu foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 41 mg (0,06 mmol)
MS TrtS(CH3hCONH-Asp(NH(CH2hN(OH3)--boc)OtBu: m/z 740,6 * (M-í-Naf (MW calculado ~ 718,0 g/mol)
TrtS(CH2)5CONH-Asp(NH(CH2).2N(CH3)-boc)OtBu (41 rng, 0,06 mmoljfoi dissolvido em T1 dioxana/lbO (1,0 mL), LiOH (4,1 mg, 0,17 mmol) fol adicionado e a mistura foi agitada a 605 C por 1 h. AcGH (50 pl) foi adicionado e 20 foi purificado através de RPHPLC.
Rendimento: 31 mg (0,05 mmol)
MS 20-. m/z 604,5 [M+Naf (MW calculado * 681,9 g/mul)
Exempla 21
Síntese de conjugado hgante-exendma 21
Η 4 j-r.vssr
Μ ,-. 4, ,,. ..
Exendine protegida na cadeia lateral ligada à resina, (50 mg, 5 pmoles) com um grupo de proteção Mmt em Lys27 foi primeiro boc protegida Q no terminai N (vide Materiais e Métodos) e então incubada cinco vezes (5 min) com 2 mL de 9/1 (v/v) de DCM/HFIP para remover o grupo de proteção Mmt de Lys27, 2Q (6,6 rng, 10 pmoles), PyBQP (5,2 rng, 10 pmoles) e Dl EA (7 pl, 40 pmoles) foram dissolvidos em DMF (400 pt) e imediatamente adicionados à resina, incubação per 3 h em temperatura ambiente, a resina foi 5 lavada com DMF lOx, DCM IQx e seca a vácuo. O produto foi clívado a partir da resina e purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 2,4 mg
MS 21: m/z 1497,2 - (M-rãHf* (MW calculado ~ 4488,0 g/mol)
Exemplo 22
Síntese de conjugado ácido graxodigante-Exendina 22
Figure BRPI0906643A2_D0023
(2,6 mg) foi dissolvido em 200 pl de 1/1 acetonitrila/água e 1 (0,8 mg) em 400 pl de 7/3 aceíonitrila/água foi adicionado, 100 pl de tampão de fosfato de sódio 0,25 M foram adicionados e a reação foi agitada por 5 min apôs o que 22 foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 2,4 mg
MS 22: m/z 1388,3 ~ |M*4H]4*; 1857,1 - [M*3H]S* (MW calculado - 5586,4 g/mol).
Exemplo 23
Síntese de precursor 23
FmocNr
0H
Acido 6-trítilrnercapto hexanoico (200 mg. 0.51 mmol), (PfpO)? (202 mg, 0,51 mmol) e colidina (340 pl, 2.65 mmoles) foram dissolvidos em DMSG (1 ml.) e agitados por 30 min em temperatura ambiente. A mistura foi adicionada a uma solução de Pmoc-Lys-OH (170 mg, 0,46 mmol) em HsO/piridina/tBuQH (3.3:1. 6 mL), A reação foi aquecida a 6CF c por 2 h, díluida com EtOAo, extraída 2x com H2SO4 0,1M, 2x com salmoura e seca em Na;?SO4. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o residue foi purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 109 mg
MS 23: m/z 741,3 (M*Hf (MW calculado
Exemplo 24
Sintese de ligante 24a-24c
741,0 g/mol) RS'· i
R2
...NR
24a: RI ~ H. RS - boc 24b: R1 “ Me. R2 ~ boc
24c: RI = R2 = Me (186 mg, 0,25 mmol) e DIEA (160 μΙ, 6,92 mmol) foram dissol des em BCM (2 ml), adicionados à resina de Hereto de 2-olorotritila (312 mg, 1,3 mmoi/g) e agitados por 45 min em temperatura ambiente. MeOH (0,6 ml) foi adicionado e a resina foi incubada por mais 15 min. A resina foi lavada com DCM (10x) e DMF (10 x). Desproteção de Fmoc e formação de ureia foram conseguidas de acordo cem procedimentos gerais (vide Materiais e Métodos) através de reação com N-boc-etilenodiamina (57 pl, 0,34 mmol). o produto foi clívado da resina e purificado através de RP-HPLC. Rendimento: 14 mg
MS 24a: m/z 705,4 727,3 [M-rNaJ* (MW calculado ~ 704,9 g/mol)
24b foi sintetizado conforme descrito para 24a exceto pelo uso de N boc- N metiletiíenodiamina ao invés de N-boc-etilenodiamina. Rendimento’ 21 mg
MS 24b: m/z 71$),3 [M<Hf, 741,4 [MrNaf (MW calculado ~ 719,0 g/mol)
24c foi sintetizado conforme descrito para 24a exceto pelo uso de Ν,Ν-dimetiietilenodiamina ao invés de N-boc-etilenodiamina.
Rendimento. 10 mg
MS 24c; m/z 633,2 (M^Hf (MW calculado ~ 632,9 g/mol) Exemplo 25
Síntese de conjugados exendina-Hgante 25a-25c
H ii «H(sl f N-Exendina
A. H
Ris N
HS .NH
25a. RI - R2 ~ H 25b: RI = Me, R2 - H 25c. R1 R2 = bte
24a (7,0 mg, 0,01 mmol), PyBOP (5,2 mg, 10 pmoles) e DEIA (7 pL. 40 pmoles) foram dissolvidos em DMF (250 pL), imediatamente adicionados à exendina protegida na cadeia lateral, ligada á resina, (50 mg, 5 pmoles) e incubados per 2 h em TA. A resina foi lavada com DMF (10x), DCM (10x) e seca a vácuo. O produto fui cllvado da resina e purificado atra25 vês de RP-HPLC.
Rendimento: 1,6 mg
MS 25a: m/z 1511,8 ~ [Mt3H]3<' (MW calculado ~ 4530,8 g/mol)
25b foi sintetizado conforme deserdo para 25a exceto polo use do 24h ao invés de 24a.
Rendimento: 4,3 mg
MS 25b: m/z 1516,3^ [M+3H]34 (MW calculado 4544,8 g/mol)
25c foi sintetizado conforme descrito para 25a exceto pelo uso de 24c ao invés de 24a.
Rendimento: 1,3 g
MS 25c: m/z 1520,4 - (Μ*3Η]';> (MW calculado ~ 4558,8 g/mol)
Exemplo 26 ., ., u
Η H 8 «.His':
W Rt » R2 - H .-xx .N.x ,Λ’ ,Xt.
Figure BRPI0906643A2_D0024
25a (1,6 mg) foi dissolvido em 200 pl de 1/1 acetonitrila/águs e 1 (0,11 mg) em 200 pl de 7/3 aoetonitrila/água fui adicionado. 30 pL de tampão de fosfato de sódio 0,25M foram adicionados e a reação foi agitada por 5 min, após o que 26a foi purificado através de RP-HPLC,
MS 26a. m/z 1870,0 - (MW calculado 5600,2 g/mol),
26b foi sintetizado conforme descrito para 26a exceto pelo uso de 25b ao invés de 25a.
MS 26b: m/z 1875,9 = (M*3Hj3*, 1406,7 [Μ-ΜΗ^ (MW calculado 5623,2 15 g/mol)
26e foi sintetizado conforme descrito para 26a exceto pelo uso de 25c ao invés de 25a,
MS 26c: m/z 1879,4 [M+3H]3*, 1410,5 [MMHf4 (MW calculado = 5637.2 g/mol)
Exemplo 27
Síntese de conjugados 20kDa-PEG~ligante-exendina 27a-27c
Ο
PEG40kí>a'
27a: Rí ~ Rz H
27b- R1 =: Me. R2 ·=
27c: RI R2 Me
25a (2,0 mg) fai dissolvida em 1:1 de H5O/MeCN contendo TFA 0,1% (200 pl). Uma solução de PEGáOKDa-maleimída (18 mg) em 1.Ί de H^O/MeCN (1 ml) e tampão de fosfata (15 pl, pH 7,4, 0,5 M) foi adicionada. A solução foi incubada em temperatura ambiente, após 5 min AcOH (20 pl) foi adicionado e 27 a foi purificado através de cromatografia de traoa de cation, dessalimzada e liofihzada.
b foi sintetizado conforme descrito para 27a exceto pelo usa de 25b ao invés de 25a.
27c foi sintetizado conforme descrito para 27a exceto pela uso de 25c ao invés de 25a.
Exemplo 28
Síntese de ligante 28:
H.X ,.-··χ ,..-vx \l ' Ν’ χ· Y STrt * Ò
2S
Cloreto de 6-bromo hexanoíla (46 pL, 0.31 mmol) foi dissolvido em CH3CI2 0,2 mi e adicionado a uma solução de H;>N-CHa-CHs-STrt (100 mg, 0,28 mmol), Dl EA (97 pl.. 0,56 mmol) em CH^CE (0,8 ml). A mistura foi agitada por 2 h em temperatura ambiente. A mistura foi agitada por 2 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi acidificada com AcOH (50 pL) e 0 solvente foi removido a vácuo. O resíduo foi purificado em silica gel (hepfano/EtOAc ~ 1:1) para obter Br-CCHsh-CONH-fCHah-STrt.
Rendimento: 187 mg (0.276 mmol, 98 %)
MS 8r(CH2)5’CONH-(CH2)rSTftí 518.9 [M-Naf, (MW calculado = 496.5 g/mol).
N'-Boc-etilenodiamina (81 pl, 0,51 mmol) foi adicionada a uma solução de BrqCHsIs-OONH-fCHa^-SIrt (230 mg. 0,46 mmol) e Na^COa (196 mg,
1,85 mmol) em DMF (0.8 ml). A mistura de reação fol agitada per 10 h a 70°
C. Após esfriar para temperatura ambiente a mistura foi diluída com 4 ml (MeCN/H2O ~ 25:75, cem TFA 0,1 %) e purificada através de RP-HPLC para dar Boc-NH-(CH2)2-NH-(GH2)5-CONH-(CH2)2-STrt.
Rendimento: 189 mg (0,27 mmol. 59 %, sal de TFA)
MS Boc-NH^CHxh-NH-CCHsIs-CONH-CCHat^STrt? 578,5 ® [M+H]''> (MW calculado ~ 575,5 g/mol)
Boc-NH-(CH2)2-NH-(CH2^CONH-(CH2)5-STrt (189 mg, 0.27 mmol) e
HCHO (35 % aqueous, 113 pl) foram dissolvidos em MeCN {1,5 ml) e 10 NaCNBHs (34 mg, 0,54 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 5 π em temperatura ambiente. Após o término da reação (MS) a solução foi diluída com H?O (5 ml) e extraída com CH2CI2 (3x5 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas em MgSO^, filtradas e o solvente foi removido a vácuo. O resíduo foi purificado através de RP-HPLC para dar Boo15 NH-(CH2)2-N(CH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt.
Rendimento; 62.8 mg (0.11 mmol, 39 %)
MS Boc~NH-(CH2)2-N(CH2}~(CHz)5-CONH-(CH2)rSTrt: 590,6 * (M*HÊ (MW calculado ~ 589,0 g/mol)
Boc-NH-(OH2)2-N(GH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt (62.8 mg. 0,11 mmol) foi dissolvido em THF (6 ml) e HCl em dioxana (130 pl. solução 4M) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 12 h em temperatura ambiente. 200 pl de HCl ern dioxana foram adicionados e o solvente foi removido a vácuo, O resíduo foi purificado através de RP-HPLC para dar ΗχΝ· (CH2h N(CH$)-(CH2)5-GONH-{GH2)2-STrt e nenhum material de partida con25 surnidoBac-NH~(CHs)2“N(CH!0“(GH2)^ONH^CH2)rSTfL
Rendimento: 32,8 mg (0.062 mmol, 44 *4, sal de HCl) 28 e 14.7 mg (0,925 mmol., 23 %, sal de TFA) de material de partida.
MS 28. 490.5 ~ [M*H]\ (MW calculado ~ 489,0 g/mol).
Exemplo 29
Procedimento geral para a síntese de precursores de 8NP substituídos per ácido carboxílico 29a e 29b
QoSsri .BNP-OTCP * N
H
29a
Anidrido Cis-ciclo-hexanc-1(2-dicafboxillco (231 mg, 1,5 mmol) e pindina (271 pl. 2 mmoles) foram dissolvidos em DCM (2 ml) e adicionados a 8NP-32a protegido na cadeia lateral, ligado à resina, (300 mg). Incubados por 1 h em temperatura ambiente, lavados com DCM 10x e secos a vácuo
Qstyslí y ;,BNP-OTCP n
...OH
29b
BNP-32P protegida na oadesa lateral, ligado á resina, carregando grupo de proteção ivDde em Lys14. foi primeira boc protegida no terminal N, desprotegido na posição Lys14 (vide Materiais e Métodos) e então reagido com anidrido cis-ciclo-hexano-1,2-dicartooxilico conforme descrito acima para
29a.
Exemplo 30
Síntese de BNP-iigante-tíóis 30a © 30b sSert .BNP
N .-N.
- n
SH
HxN-(CH2)3-N(CH3)-(CH2)5-CONH-(CH2)2-STrt 2S (5,2 mg, 0,01 mmol'), PiBQP (5,2 mg, 0,01 mmol) e DIEA (7,0 pl, 0,04 mmol) foram dissolvidos em DMF (300 pl) e adicionados a BNP 29a protegido na cadeia lateral, ligado à resina, (50 mg, 0,005 mmol). Incubação por 2 h em temperatura ambiente, a resina foi lavada com DMF (10x), DCM (10x) e seca a vácuo. O produto fos clívado da resina e purificado através de RP-HPLC.
F^endrmento'. 9,8 mg
MS 30a: m/z 947,6 [M*4H]4*, 1263,1 [M*3Hf* (MW calculado ~ 3785,3 α/mol)
Figure BRPI0906643A2_D0025
30b
30b foi sintetizado conforme acima descrito exceto pelo use de derivado de BNP ligado à resina 29b ao invés de 29a.
Rendimento: 7,4 mg
MS 38b. m/z 947.5 - =M+4Hf\ 1263,0 ~ [M*3H]3* (MW calculado ~ 3786.3 g/mol)
Exemplo 31
Síntese de conjugados 40-kDa-PEG4igante-BNP 31a e 31b
Figure BRPI0906643A2_D0026
3te
30a (4 mg) foi dissolvido em 1:1 de H^G/MeCN contendo TFA 0,1% (200 μΙ). Uma solução de PEGéOKda-maleimida (42,2 mg) em 1:1 de H2O/MeCN (1 ml) e tampão de fosfato (15 pl pH 7,4. 0,5M) foi adicionada. A solução foi incubada em temperatura ambiente, após 5 min AcOH (20 μΙ) foi adicionado e 31a foi purificado através de cromatografía de troca de cátion, 15 dessalinizado e Hof iiizado.
Rendimento: 2.0 mg q :d.yxi4
Figure BRPI0906643A2_D0027
31b
31b foi sintetizado conforme descrito para 31a exceto pelo uso de 30b ao invés de 30a.
Rendimento', 16,8 m$i
Exemplo 32
S'intss© da ligante 32 O
H,,N. ,..-. ,.-. Λ, .--v, ..STrt x' N N
J H buc
Cloreto de 3-bromopropionila (62,5 μΙ, 6,62 mmol) foi dissolvido em CHjCI^ 0,5 ml e adicionado a uma solução de HaN-CHs-CHs-STri (20() mg, 0.56 mmol), DIEA (196 μ!, 1,1 mmol) em (1 ml). A mistura foi agitada por 1 h em temperatura ambiente. A mtsfura de reação foi acidificada com AcOH (100 pl) e o solvente foi removido a vácuo, O resíduo foi purificado em silica gel (heptano/EtCAc -1:1) para obter Br-fCH^CONH-CCH^-STrt.
Rendimento: 223 mg (0,49 mmol, 67 %)
MS Br-(CH2)2CONH«(CH2)rSTrt.·. 478,7 [M+Naf, (MW calculado » 454,7 g/mol)
Sal de HCl de ALAlloc-etilenodiamina (43,5 mg, 0,24 mmol) e DIEA 15 (38 μΙ, 0,22 mmol) foram adicionados a uma solução de Br-(CH2hCONH(CHjI-STrt (100 mg, 0,22 mmol) e Na^COs (93 mg, 0,87 mmol) em DMF (1 ml), A mistura de reação foi agitada por 10 h a 70& C. Após esfriar para RT a mistura de reação foi diluída com 4 ml (MeCN/HgO ~ 25:75, corn UFA 0,1%) e purificada através de HPLC para dar Alloc~NH(CH^)s-NH-(CH3)2-CONH~ 20 (CH2)g~STrt.
Rendimento: 61 mg (0,096 mmol, 44 %. sal de TFA)
MS Alloc-NH-(CH2)rNH-(OH2h-DONH-(CH;:)rSrrt: 540,8 ~ [M+Naf, (MW calculado - 517,8 g/mol).
Ailoc-NH-(CH2)rNH-(CH2)2-ODNH-(CHs)?-STrt (60,9 mg, 0,096 25 mmol) foi dissolvido em CH^Ch a BocaQ (42 mg, 0,19 mmol) foi adicionado.
A solução foi agitada por 20 h em temperatura ambiente. Após o término, a reação foi extinta através da adição de 70 pl de AcOH e o solvente foi removido a vácuo. O resíduo foi diluído com MeCN/Η,Ό 4 ml (25:75, com TFA
0,1%) e purificado através de RP-HPLC para dar Alloc--NH-(CH2)s-N(Boc)·· (CHArCONH-AAOrSTA
Rendimento: 53,3 mg (0,036 mmol. 80 %}
MS Alloc-NH-(CH2h-N(BcA(CH2)s-CQNH-(C.H2)rSTri·. 640,6 ^RNaf, 5 (MW calculado ~ 617,9 gfmol).
Alloc-NH (CHz)2N(Boc)~(CH2)A>GNH~(CH.2)2~STrt (48,3 mg, 0,078 mmol) foi dissolvido em THF, formato de trietilamônio (62 μl) e Pd(PPhs';u (16 mg) foram adicionados, A solução foi agitada por 12 h em temperatura ambiente e monitorada através de MS, Após o término, o solvente foi removido 10 a vacua, O resíduo foi dissolvido em MeCN/ΗχΟ (50:56. com TFA 0,1%) e purificado através de RP-HPLC para dar HsN-(CH;d2-N(8oc)-(GH;>h CONH(CH2)2-STrt (31),
Rendimento: 20,1 mg (0,031 mmol, 40 %, sal de TFA)
MS 31: 534,6 ~ [M^Hf, 556,6 ~ [NHNaf, (MW calculado ~ 533,5 g/mol)
Exemplo 33
Síntese da BNP-ligante-tiòís 33a e 33b c «SeH
Figure BRPI0906643A2_D0028
SH
33s foi sintetizado conforme descrito para 30a exceto pele uso de 32 ao invés de 28,
Rendimento: 8,0 mg
MS 33a: m/z 933,5 ~ [M+4Hf, 1244,3 ~ [M+3Hf (MW calculado 3729,9 g/mol), o d.ysi4
.. J ,.BNP I i |,8
A------ A --- -SH
Π N N
O 8 8
WS
33b foi sintetizado conforme descrito para 3Gb exceto peto use de 32 ao invés de 28.
Rendimento: 5,0 g
MS 33b: m/z 933.5 « [MMHf, 1244,3 ~ [M+3H]* (MW calculado - 3715,9 g/mai).
Exemplo 34
Síntese de conjugados 40KDa-PEG-ligante»BNR 34a e 34b
Figure BRPI0906643A2_D0029
34a
33a (4,3 mg) foi dissolvido em 1:1 de HjO/MeCN contendo TF A 0,1% (200 μΙ). Uma soiuçao de PEG40Kda~maleimida (46,8 mg) em 1:1 da HaO/MeON (1 ml) e tampão de fosfato (20 μΙ, pH 7,4, 0,5 M) foi adicionada. A solução foi incubada em temperatura ambiente, apòs 5 min AcOH (20 pl) foi adicionada e 34a foi purificado através de cromatografia de troca de cation, dessalinizado e liofilizado.
Rendimento: 9,7 mg.
O >.;Lysl4
„...x
O
N \ J
H A N
O .....PEG40K
34b
34b foi sintetizado conforme descrito para 34a exceto pela uso de 33b ao invés de 33a.
Rendimento: 11.5 mg.
Exemplo 35
Síntese de Ligante 35
Figure BRPI0906643A2_D0030
Figure BRPI0906643A2_D0031
Brometo de bromuaoetila (54 pl, 0,62 mmol) foi dissolvido em CH2CI2 0.5 ml e adicionado a uma solução de HjN-CH^-CHs-STrt (206 mg, 0,56 mmol) e DIEA (196 pl, 1,1 mmol) em CH2CI2 (1 ml). A mistura foi agitada por 1 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi acídífícada com 5 AcOH (100 pl) e o solvente foi removido a vácuo. O resíduo foi purificado em silica gel (heptano/EtOAc ~ 1:1) para obter produto 8r-CHg~CONH-(CH2)2~ STrt
Rendimento: 245 mg (0,55 mmol, 99 %)
MS Br CH2-CONH-(CH2)3-STrt: 462,4 ~ [M*Nal*f (MW calculada 10 -· 440,4 g/mol).
Sal de HCI de N-Alluc-etilenodiamína (45 mg, 0,25 mmol) e DIEA (79 pl, D,45 mmol) foram adicionados a uma solução de ESr-CH^-CONH(CH2)2~STrt (100 mg, 0,23 mmol) em DMF (1 mi), .A mistura de reação foi agitada por 10 h a 70' C. Apôs esfriar para temperatura ambiente, a mistura 15 de reação foi diluída com H2O/Et2O (1:1, 40 ml) e as camadas foram separadas A camada aquosa foi extraída vânas vezes com Et2O As camadas orgânicas combinadas foram secas com MgSO^, filtradas e 0 solvente fui removida a vácuo. O resíduo foi purificada em silica gel (DCM/MeQH ~ 95:5) para dar Alloc-NH-íCH^-NH-CHa-CONH-CCH^-STrt.
Rendimento.· 94 mg (0,186 mmol, 82 %, contém DMF residual)
MS Altoc-NH (CHAz NH-CHrCONH-(CH2)2-STrt: 526,8 - (M^Naf. (MW calcalado ~ 503.8, g/mol).
ΑΙΙθθ-ΝΗ-(ΟΙ·1;42-ΝΗ-ΟΙ·1;ΓθΟΝί··ί~(01·ω^~3Τό. (94 mg, 0.186 mmol., com DMF)) foi dissolvido em CHsCh e Bocj.O (81 mg, 0.37 mmol) foi 25 adicionado. A solução foi agitada por 2.0 h em temperatura ambiente. Após 0 término a reação fui extinta através da adição de 100 pl de AcOH e 0 solvente foi removido a vácuo. O residue foi diluída com 4 ml de MeGn/HsO (25'75 com TFA 0,1%) e purificado através de RP-HPLC para dar Altoc-NH-CCH^hN(Bou)-CH2-CONH-(CH2h-STrt.
<30 Rendimento: 34,7 rng (0,057 mmol, 26 %)
MS Alloc-NH-(CH2)2-N(Boc)-CH2-CONH-(CH2)-r-STit 603,9 (M^Naf, (MW calculado ~ 603,9 g/moi).
AOoc-NH-(CH2)5-N(8oc)-CH2-CONH-(CH2)2-STrt (34.7 mg, 0.048 mmol) foi dissolvido em THF, formato de trietilamônio (38 pl) e Pd(PPh3)4 (5 mg) foram adicionados. A solução foi agitada por 12 h em temperatura ambiente e monitorada através de MS. Apôs o término, o solvente foi removida 5 a vácuo, O residue foi dissolvido em MeChlfosO (50:50,. oom TFA 0,1%) α purificada através de RP-HPLC para dar RP-HPLC para dar HsN-tCHa)^N(8oc)-CHs-CONH-(CH2)s-STrt 3§.
Rendimento: 12,6 mg (0,019 mmol. 42 %, sal de TFA)
MS 35: 520,1 ~ (M * Hf, 542,2 - IM ·* Naf, (MW calculado ~ 519.2 g/mol)
Exemplo 36
Síntese de BNP-ltgante-tiôis 36a e 36b n. totert
Figure BRPI0906643A2_D0032
3Sa
36a foi sintetizada conforme desanto para 30a, exceto pelo uso de 35 ao invés de 28.
Rendimento: 9,1 mg.
MS 36a: m/z 930,0 * [M+4H^: 1239,6 [M*3H]5* (MW calculada 3715,9 g/mol).
A.ys14
O
Figure BRPI0906643A2_D0033
3Sb
36b foi sintetizado conforme descrito para 30b exceto pelo uso de 36 ao invés de 28.
Rendimento: 8.0 mg
MS 36b: m/z 9.29,9 * , 1239.5 - [M+3H]3* (MW calculado ~ 3715,9 g/mol)
Exemplo 37
Síntese de conjugados 40KDa-PEG-ligante-BNP 37a e 37b ~ aSerl
Figure BRPI0906643A2_D0034
37a
36a (4,2 mg) foi dissolvida em 1:1 de H2O/MeCN contendo TFA 0;T% (200 pi). Uma solução de PEG40KDa~rnaleirnida (68 mg) em 1:1 de 5 H^G/MeCN (1 ml) e tampão de fósforo (20 pl. pH 7,4; 0,5 M) foi adicionada.
A solução foi incubada em temperatura ambiente, após 5 min AcOH (20 μΙ) foi adicionado e 37a foi purificado através de cromatografia de troca de Dion. dessaiínizadu e liofilizadu.
Rendimento: 16 mg
Figure BRPI0906643A2_D0035
37b
37b fui sintetizada conforme descrito para 37a exceto pelo uso de 38b ac invés de 36a.
Rendimento: 18,5 mg
Exemplo 38
Síntese para conjugados ligante-exendina
Ctonjugados liganie-exendina foram sintetizados de acordo com o método de síntese A, B, C, D, E ou F.
ο &
a
Método A
Método 8 éaagsíjis: r!-- scss-srss^> h*i -Çx^txíinsí rs&: na) .....................»··
Reagents s$r «cfíC-amen·
Método C !'® ;;w$aaWs
'.iíK.'ÍKá íísESCfCÍS
Método D
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Método E ;)JS SíÇXs^XJ^s η <.;.
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2.^rr^áa^Bü * > * λ a /y H às pioisçaa Wsc’'
Método A
Síntese: Anidndo díàcido (0,2 mmol) e píridina (Q.2 mmol) foram dissolvidos em 0,3 rnl de DMF seoo. A mistura foi adicionada à exendina-4 protegida na cadeia lateral em resina (2 pmnies) e agitada por 30 min em temperatura ambiente. Resina foi lavada com DMF (10 vezes). PyBOP (0,1 mmol) e diamina (0,1 mmol) foram dissolvidos em 0,3 ml de DMF’ seco. A mistura foi adicionada à resina e agitada por 30 min em temperatura ambiente A resina foi lavada com DMF (10 vezes). Conjugados de exendina-ligante foram chvados e purificados através de RP-HPLC conforme descrito em “Materiais e Métodos”.
Método S
Síntese: Conforme descrito pare e Método A, exceto pelo foto que o anidrido diácido e a pirídína são substituídos por dtecido (0,2 mmol), HOBt (0,2 mmol). DIC (0,2 mmol) e colídina (0,4 mmol).
Método C
Síntese- Diamine (0,6 mmol) foi dissolvida em 1 ml de DCM seco e anidrido diácido (0,4 mmol) foi adicionado.. A mistura foi agitada por 60 min em temperatura ambiente. DCM foi removida, o residue foi dissolvido em ACN/água/AcOH e aminoácido foi purificado através de RP-HPLC e liofilizado.
Aminoácido (0,1 mmol), HOBt (0,1 mmol), DlC (0,1 mmol) e colidina (0,2 mmol) foram dissolvidos em 0,3 ml de DMF seco. A mistura foi adicionada à exendina-4 em resma (2 pmol) e agitada por 30 min em temperatura ambiente. A resina foi lavada com DMF (10 vezes). Conjugados exendína-ligante foram divados e purificados através de RP-HPLC conforme des15 onto em Materiais e Métodos.
Método D
Síntese: Anidrido diácido (0,2 mmol) e piridina (0,2 mmol) foram dissolvidos em 0,3 ml de DMF seco. A mistura foi adicionada à exendina-4 em resina (2 pmoi) e agitada por 30 min em temperatura ambiente. A resina 20 foi lavada com DMF (10 vezes). PyBOP (0,1 mmol), HOBt (0,1 mmol) e coli· dina (0,4 mmol) foram dissolvidos em 6,3 ml de DMF seco, A mistura foí adicionada à resina e agitada por 30 min em temperatura ambiente. A resina foi lavada com DMF (10 vezes). Diamína (0,1 mmol) e DIEA (0,3 mmol) foram dissolvidos em uma mistura de 0,4 ml de DMF e 0,4 mi de EtOH. A mistura .25 foi adicionada à resina e agitada por 30 min em temperatura ambiente. A resina foi lavada com DMF (10 vezes).
Conjugados exendlna-llgante foram divados e purificadas através de RP-HPLC conforme descrito em “Meterieis e Métodos.
Método B
Sintese: Amlno ácido Fmoc (0,1 mmol), PyBOP (0,1 mmol) e
DIEA (0,2 mmol) foram dissolvidos em 0,3 ml de DMF seco. A mistura foí adicionada à exendína -4 em resina (2 pmoles) e agitada por 30 min em tem peratura ambiente. Grupa de proteção Frnoc roí removido através de incubação da resina em DMF/pípendina 4/1 (v/v) por 2x 10 min. A resina foi lavada com DMF (10 vezes) e DCM (10 vezes). Cloroformiato de p~nitrafenila (0,1 mmol) foi dissolvido em 0,3 ml de THF seco e DIEA (0,2 mmol). A mistura fc-i 5 adicionada à resina e agitada por 30 min em temperatura ambiente. A resina foi lavada com DCM (10 vezes).. Dlamina (0,1 mmol) foi dissolvida em 0,3 ml de DMF. A mistura foi adicionada à resina e agitada por 30 min em temperatura ambiente. Â resina foi lavada com DMF (10 vezes).
Conjugados exendina-ligante foram clívados e purificados atra10 vés de RP-HPLC conforme descrito em Materiais e Métodos'.
Método F
Síntese: conforme descrito para o Método A, seguido por desproteção de frnoc e acetílação.· Grupo de proteção Frnoc foi removido através de incubação da resina em DMF/plperidina 4/1 (v/v) por 2x10 min. Reto sina foi lavada com DMF (10 vezes). Acefilação foi realizada incubando resina com anidrido acêtice/piridina/DMF 1/1/2 (v/v/v) por 30 min. A resina foi lavada com DMF (10 vezes).
Conjugados exendina-ligante foram clívados e purificados através de RP-HPLC conforme descrito em Materiais e Métodos.
Detalhes adicionais com relação a numerais de composto, materiais de partida, método de síntese, peso molecular (MW) e dados de MS são dados na Figura 2.
Exemple 39
Síntose de conjugadas hidragel-ligante-exendina 39
Figure BRPI0906643A2_D0036
Microparticuías de hidrogel funcionaíizadas por malesmida foram sintetizadas conforme descrito na EP 1 625 856 Al.
mg de micropartíoulas de hídrogeí derivatlzadas de maleímida (carga 40 pmul/g, 1.2 pmol) foram reagidos corn 6 mg de composto 25a (1,32 pmol, 1.1 eq.) em 600 μΙ de 20/80 (v/v) de acetonitríladampão de fosfato 50 mM (pH 7,4) por 10 min para dar micropartículas de hidrogel carregado 5 com exendina-ligante 39 O hldrogel carregado 39 foi lavado 5 vezes com
50/50 (v/vj de acetonitrila/água e trés vezes com água.
Exemplo 40
Síntese de Ligante 40
H
...N. .-., ...-.,
T>ts y fo· > o *
Ό k .N. A ,L .OH '·.··· N ?s(\γΜ ΜH
4G°
Fmoc-Ala-OH (250 mg; 0,8 mmol) e DlEA (170 pL, 1.0 mmol) foram dissolvidos em DCM (2 mL), adicionados á resina de cloreto de 2-clorotrííiia (312 mg, 1,3 mmol/g) e agitadas por 45 min em temperatura ambiente. Metanol (0,6 ml.) foi adicionado e a resina foi incubada por mais 15 min A resina foi lavada com DCM (1()x) e DMF (10x). Desproteção de Fmoc e formação de ureia foram conseguidas de acordo com pro(x?dimentos gerais (vide
Materiais e Métodos) através de? reação com intermediário de ligante 5a. o produto foi clivado da resina e purificado através de RP-HPLC. Rendimento: 53 mg
MS 40: m/z 604,4 [M+Hf (PM calculado 603,8 g/mol)
Exemplo 41
Síntese de conjugado exendina-ligante 41
H
HS’ '·' V 71 > O*
V I |i IH0 k ,..7y ....-ré. .,,4..
’’ O (sal de HC, 14,0 mg, 0,02 mmol), PyBOP (10,2 mg, 0,02 mmol) e DlEA (17 pL, 0,1 mmol) foram dissolvidos ern DMF (300 pl). irnediatamente adicionados à exendina protegida na cadeia lateral, ligada à resina, (100 mg, 10 pmoíes) e incubados por 4 h em temperatura ambiente. A resina foi lavada com DMF (10x), DCM (10x) e sec-a a vácuo. O produto foi clivado da resina e purificado através de RP-HPLC. Rendimento'. 5,4 mg
MS 40: m/z 1510,9 - (Mí-3H]·'* (PM calculado “ 4530,1 g/mol) Exemplo 42
Sintese de conjugado âcide-graxo ligante 42
R: R 9
Figure BRPI0906643A2_D0037
(1,6 mg) foi dissolvido em 200 pi de 3/1 de acetonitrila/ãgua e (0,11 mg) em 200 pi de 3/1 de acetonitrila/ãgua foi adicionado. 30 pl de tampão de fosfato de sódio 0,25 M foram adicionados, a reação foi agitada por 5 min, epos o que 42 foi purificado através de RP-HPLC.
MS 42: m/z 1,870,2 ~ (M+3Hf' (PM calculado - 5608,4 g/mol).
Exemplo 43
Síntese de conjugado hidrogel-ligante-exendina 43
Figure BRPI0906643A2_D0038
foi sintetizado conforme descrito para 39 exceto pelo uso de ao invés de 25a..
Exemplo 44
Síntese de Ligante 44 Ο > Ο I
w. A ...x ,..-x A A a .oh
Η Η H 0 foi sintetizado conforme descrito pana 40 exceto peto uso de ao invés de 5a.
Rendimento; 74 mu
MS 44; m/z 605,4 ih/HHJ* (PM calculada ~ 604,8 g/mol)
Exempla 45
Síntese de conjugada exendina-ligante 45
9i 9 i hs.s ....-- ,A.x ....,,. ..Λ„„}t^·
H ' ~ ' Η H 'lí 'Çxen^ln» foi sintetizada conforme descrita para 41 exceto pele uso de aa invés de 40,
Rendimento; 6,0 mg
MS 45: m/z 1511 ;3 * [M*3Hf * (PM calculada - 4531,1 g/mol)
Exemplo 46
Síntese de conjugado ácido graxo-ligante 46
O í Q i ir « il I ~ N γ 'êxendtne
Figure BRPI0906643A2_D0039
foi sintetizada conforme descrita para 42, exceto pelo uso de 45 ao invés de 41.
MS 46; m/z 1876,5 “ [Μ+3ΗΓ* (PM calculado ~ 5609,5 g/mol).
Exemplo 47
Síntese do intermediário ligante 47
Figure BRPI0906643A2_D0040
,t
Suífetu de tritila (247 mg, 0,89 mmol) foi suspenso em DMSO 1 ml 08U (152 pl, 1,02 mmol) e 6-brnmo-hexan~1-ol (173 mg, 0,98) foram a dicionados e a mistura foi agitada par 5 min em temperatura ambiente. A mistura de reação foi dissolvida em 20 ml de acetato de etila e lavada com NH2SO41 N (2.x) e salmoura (3x). A camada orgânica foi seca (NasSO.s) e os voláteis foram removidos a vácuo. Produto foi purificado através de cromatografia flash em silica (heptano/AcOEt 1/1).
Rendimento: 2.83 mg (S-tofil)~6-mercapto-hexan-1-cl (S-Tritil)-6-mercapto-hexan-1-ol (466 mg; 1,24 mmol) foi dissolvido em 3,5 ml de DCM. 0.5 ml de DMSO e 0,6 ml de Net3 e esfriado em um banho gelado. SCE-pirídina (408 mg, 2,57 mmoles) foi suspensa em DMSO 0,5 ml e adicionada à mistura de reação. Banho gelado foi removido e a reação foi agitada por 60 min em temperatura ambiente. A mistura de reação foi dissolvida em 20 ml de Ef^O e extraída com NH2SO4 1 N (2x) e salmoura (3x). A camada orgânica foi seca (Na-SCA? e os voláteis foram removidos a vácuo. Produto foi purificado através de cromatografia flash em silica (heptano/AcOEt 1/1).
Rendimento: 390 mg (S~tritü)~6-mercapto-hexan-1-al 47
MS 47: m/z 243,1 * [I rt]*, 413,1 = [Μ-^ΚΓ (PM calculado * 374,4 g/mol) Exemplo 48
Síntese de ligante 48
Figure BRPI0906643A2_D0041
FmooAía-OH (250 mg, 0,8 mmol) e DIEA (170 pL, 1,0 mmol) foram dissolvidos em DCM (2 mL), adicionados à resina de cloreto de 2dorotritila (312 mg, 1,3 mmol/g) e agitados por 45 min em temperatura ambiente. Metanol (0,6 mL) foi adicionado e a resina foi incubada por mais 15 min. A resina foi lavada cam DCM (lOx) e DMF (lOx). Desproteçâo de Fmoc e formação de uréia foram conseguidas de aooteo com procedimentos gerais (vide Materiais e Métodos) através de reação com etileno diamina. Para alquilação redut.iva 47 (299 mg, 0,8 mmol) e Na(OAc) 43Η (340 mg, 1,6 mmol) foram dissolvidos em 0,5 mL de DMF, 0,5 ml de MeOH e 10 pL de
AcOH, adicionados á resina e agitados por 2 h em temperatura ambiente, A resina foi lavada com DMF (10x) e DCM (lOx). Proteção cem 8oc foi realizada agitando a resina em uma solução de anidrido de Boc (218 mg, 1,0 mmol) e DIE A (170 pL, 1,0 mmol) em DCM. A resina foi lavada com DCM (10x) e 5 produto foi clivado da resina e purificado através de RP-HPLC.
Rendimento: 34 mg
MS 48: m/z 634,2. [Mí-Hf (PM calculado ~ 633,9 g/mol)
Exemplo 49
Síntese de conjugado exendina-ligante 49
Figure BRPI0906643A2_D0042
49 foi sintetizado conforme descrito para 41 exceto pelo uso de 48 ao invés de 40.
Rendimento: 4,8 mg
MS 49: m/z 1487,3 ~ (Μ*3Η]·* (PM calculado ~ 4460.0 g/mol)
Exemplo 50
Síntese de conjugado hidrogel-liganta-exendina 50 hidrogei .J/ /\ .....N, ,.-·Α JL. ,,bL '
Η Ϊ T Exendsna ír 50 ° foi sintetizado conforme descrito para 39 exceto pelo uso de 49 ao invés de 25a,
Exemplo 51
Cinétícas de liberação m Wtro
Liberação de molécula de fàrmaco de 38a a 38z, 38a a 38ab, 4,
5, 9a, 9b, 9c, 10,13a, 15, 19a, 19b, 22, 26a a 26c, 31a, 31b, 34a. 34b, 37a, 37b( 42, 43, 46 e 50 foi realizada através de hidróhse em tampão em pH 7,4 e 37í! C ou pH 4 e 37° C conforme descrito em ’’Materiais e Métodos”.
*74
I ϊ
Composto t-s/2 tampão A (pH 7,4) tvs temp
38a < 1h 13 h
38b 20 h 72 d
38a >3 Hl > 3m
38d 58 d n.d.
38e 41 d n. d.
38f 23 h 114d
38g 19 d nenhum
38h 47 d nenhum
38i 69 h 108 d
38j 15 d n.d.
38k 40 min 6d
381 15 h n.d.
38m 17 h 66 d
38n 18 d n.d.
38o 11-12 h 22 d
38p 26 d 178 d
38q 26 d 210 d
38r 26 h 47 d
38s 80 min 80h
38t 96 min 67 h
38u 51 d nenhum
38v 47 d nenhum
38w 8d 3,2 a
38x 72 d n.d.
38y 11-14 h 105 d
38z 11 d 1.6 a
38aa 40 h 65 d
38ab 20 h 20 d
38ac 14h n d.
38ad 18h n d.
B (pH 4,0)
Composto ti/? tampão A (pl I 7,4) tb-2 tampão B (pH 4,
4 15 d nd.
5 22 h n.d.
9a 340 h n.d
9b 360 b n.d
9o 120 h n.d
10 130 h n.d
13a 1.20 h n.d
13b 160 h n.d.
15 160 h n.d
19a 31 h n.d.
19b 18h n.d.
22 40d n.d.
26a 34d n.d.
26b 40d nd.
26c 16d nd.
31a 22h n.d.
31b 95h n.d.
34a 42 h n.d.
34b 205h n.d..
37a 138h n.d.
37b 639h n.d.
42 lOd n.d.
43 17d n.d.
46 13d nd.
50 35d n.d.
Exemplo 52 Cínétieaa de liberação m wvo - correlação m vítro/m Wvo
Clnéticas de liberação ía vivo foram determinadas comparando as farmacooinéticas de 13a com as farmacocinéticas de 13c e 13h com 13d; respectivamente, após injeção intravenosa em rato.. Os estudos em animais foram realizados na Heidelberg Pharma AG, Heidelberg, Alemanha. 13a (27 mg) foi dissolvido em 3,5 ml de PBS e 500 pl da solução resultante foram injetados intravenosamente em seis ratos oada. Ratos SD machos com peso de aproximadamente 270 g foram usados. Amostras de sangue foram tira5 das em t ~ 0,2 h, 24 h, 32 h, 48 h, 72 h, 12.0 h e 168 h, plasma foi preparado e o plasma foi analisado quanto à fluorescência de fluoresceina usando espeotrômetro Perkin-Elmer IS 50B,
As fannacouinétioas de 13c foram determinadas conforme descrito para 13a. As farmacocínéticas de 13b e 13d foram determinadas con10 forme descrito para 13a, exceto pelo uso de 20 mg de 13b e 13d oada um em 2,5 ml de PBS e quatro ratos.
A meia-vida de hidrólíse de ligante foi calculada a partir da razão de fluorescência do 13a comparado com fluorescência da 13c a 13b comparado com 13d, respeotivamente, nos respectivas pontas de tempo,
Ί5 A meia-vida de hidrólíse de ligante to wo foi determinada ser
115 h e 160 h para 13a e 13b, respectivamente, que ê uma excelente correlação corn a meía-vida de hidrólise de ligante to v.4ro de 120 h e 100 h para 13a e 13 b. respectivamente.
A Figura 3 mostra dados de divagem de ligante to wvo e to vrtoo de 13b, onde cinêticas de divagem .to vivo (triângulos) e ,fo v/fro (diamantes) são mostradas através de representação semilogarítmtoa.
Abreviações.
Acp 4-(2-amínoetll)-l -carboxímetil-piperazina
AcOH ácido aoético
Boc t-butitoxioarbonila
Dab ácido 2.4-diam i nobutirico
DBU 1,3-diazablciclo(5,4.ü]undecenn
DCM diclorometano
Dda ácido dodecanoico
DIG di-lsopropilcarbodiimida
Dl EA di-lsopropiletilamina
DMAP dímotílamino-pirídina
DMF N. N dimetilformamida
DMSO dimetilsulfoxido
EDTA ácido etilenodíaminotetraacéüco
eq equivalente estequíomêtrico
6 Fmoc 9-fl uoreni Imetoxíoarbon ila
HATU Hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1il)-N<N,N*,N' tetrametílurônio
HFIP hexafluonaisopropanol
HEPES ácido N-(2-hidroxiet?í) píperazino-N'-(2-etanossulfõnico)
10 HOBt N~hid roxíbe nzotriazoí
ívDde 1 -(4 <4 -Dim et ií~2,6-d ioxo-cic Io- hexi lideno) -3- metilb utila
LCMS cromatografia liquida acoplada à espoctrometria de massa
Mal 3-mateímido propionila
Mmt 4-metoxitritila
15 MS espectro de massa
MW massa molecular
n.d. não-determinado
PfpOH pentatluerofenol
PiBOP hexafluorfosfato de benzotriazc-l-1 -il-óxí-tris-pirrolídínu-fosfênio
20 RP-HPLC cromatografia liquida de alto desempenho de fase reversa
RT temperatura ambiente
SEC cromatograha de exclusão de tamanho
Sue s uccinim ídopropionila
TCP resina de cloreto de 2-clorotritila
25 TES trietilsilanc-
TMOB 2,4,6-trimetoxibenziía
TFA ácido trifluoracético
THF tetra-hídrofurano
uv ultravioleta
VIS visual

Claims (35)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Profármaco ou um sai farmaceuticamente aceitável do mesma compreendendo um conjugada fármaoo-ligante DL, onde D é urn nitrogênio cantando porção biologicamente ativa; a
    5 - L ê urna porção de ligante não-bialagicamente ativa ™L‘ representada pela fórmula (I),
    R3 X3 Rl R'3
    I 2 IL \/
    „..Xx V ,·η
    R3 X N X ¥' °··
    RS H* Q em que a linha pontilhada indica a ligação ao nitrogênio da porção biologicamente ativa através de formação de uma ligação amido;
    10 X é C(R4R4S); N(R4); O; C(R4R4a)~C(R5RSa); C(RsR5>C(R4R4a);
    Q(R4R4S)-N(R'S); N(R6)-C(R4R48); C(R*R50í ou OC(R4R4S):
    X: é C·; ou 5(0);
    X2 é C(RL R?Si); ou C(R?, R7s)-O(RS, R*3);
    X3 ê O; S; ou N-CN;
    15 R\ Ría, R2, R2®, R3, R38, Rt R43, R5, Rs®< RÁ R\ R7®, R* R*3 são independentemerite selecionados do grupo consistindo em H; e alquila;
    Opcicmalmeníe, um uu mais das paras R^/R48, R'7R53, R-7RSa, r^/r08 formam uma ligação química;
    Opcíonalmente, um ou mais des pares R'/R'3, R7P/S, R4/R4â, R5ZRfe3, R7R7®, 20 r7rSs são unidos com o átomo ao qual eles estâc- ligados para formar uma C3.7 dcíoalquíla: ou heterociclila de 4 a 7 membros;
    Opcíonalmente, um ou mais das pares R7R4, R7R?í, R7'Ra, R'7r!j, R*/R\ R7R8, R7R3 são unidos com us átomos aos quais eles estão ligadas para formar um anel A;
    25 Opcíonalmente, R7RS& são unidos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados para formar um heterociclo de 4 a 7 membros;
    A é selecionado do grupo consistindo em fenila: naftila; indenila; indanlla; tetralínila: cicloalquila; heterociclüa de 4 a 7 membros; e heterobiciclila de 9 a 11 membros; e onde lJ é substituído com um a quatro grupas LA e opcionalmente substituído mais, contanto que o nitrogênio marcado com o asterisco na fórmula (I) não seja substituído por um substituinte: ande
    L'; for uma ligação quimíca simples ou um espaçador; e
    Z for um grupo veículo.
  2. 2. Profármaco de acordo oom a reivindicação 1: onde X3 é O.
  3. 3. Prafãrmaco de acordo com a reivindicação 1 ou 2, unde X é N(R4),X1 êCeX3éO.
  4. 4. Profàrmacc de acorde com qualquer uma das reivindicações 1 a 3S onde X3 é C(R‘R?S).
  5. 5. Profármaca de acorda com qualquer uma das reiviudsnaçôes 1 a 4, onde L; é selecionado do grupo consistindo em
    Figure BRPI0906643A2_C0001
    Figure BRPI0906643A2_C0002
    í-γ 6 ά* 6
    Figure BRPI0906643A2_C0003
    em que R ê H; ou Cm alquila; ¥ © NH; O; ou S: e R\ R'3, R2. RS3, R'\ Rs*. R\ X< X!, X‘ têm o significado conformo indicado na reivindicação 1.
  6. 6 Profármaco de acordo oom qualquer uma das reivindicações 1
    Figure BRPI0906643A2_C0004
    Figure BRPI0906643A2_C0005
    Figure BRPI0906643A2_C0006
    Figure BRPI0906643A2_C0007
    em que R tem α significado conforme Indicado na reivindicação 5,
  7. 7. Profámnaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, onde Lz é uma ligação química simples; Lz-Z é COOR9; OR&; C(O)R3; C(O)N(R9RSa); S(O)2N(RVs); S(O)N(R9R9®); S(O)2R9; S(O)R°;
    5 N(R9)S(O)sN(R'3aR9i;·)·: SRs; N(R''R&3); OC(O)RS; N(Rs)C(O)RA N(R3)S(O)2 R*'3; N(R&)3(O)RSa; N(Rs)C(0)0R$3; N(R9)C(O)N(R3í5RA; OC(O)N(R?íRA; T;
    (>.so alquila: C2.50 alquenila; ou alquinila, onde T; Cvso alquila; OSvS0 alquenila; e C2..&} alquinila são opcionalmente substituídas com um ou mais
    RA que são iguais ou diferentes e onde (^.«0 alquila; alquenila; e C2.50
    10 são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados do grupo consistindo ern -T-. -C(Q)O-; -O-; -C(Q)-; -C(O)N(Rr’)··; -S(O)2N(Rn)-; ~S(Q)N(Rn)-; -S(Oh-; -S(O)< -N(Rn)S(O)2N(Rne}·; -S-; -N(Rn)··; -QC(O)R''; -N(R?')C(O)~; -N(R'-)S(O)r; -N(R;-)8(0)-: -N(Rn)C(O)O-;
    N(Rn)C(O)N(Rns)-; e -0C(0)N(RnR-t8):
    15 R°< R9*, R'^ são Índependentemente selecionados do grupe consistindo em
    Η; Ζ; Τ; e Cj-j-qalquila; Cz-so alquenila: ou alquinila, onde T; C^.5o alquila; Cz-ss alquenila; e Cj.-sc alquinilas são substituídos por uní ou mais R;<\ que são iguais ou diferentes e onde Cr«o alquila: alquenila; e CWi alquinila são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados do
    5 grupo consistindo em T} -C(O)O-; -0-; -0(0)-: -C(O)N(R'!)-; -S(O);>N(Rr;)··; · S(O)N(R'): -S(O)r; -S(0)-; -N(Rn)S(O)2N(R-'>; -S-; -N(R'1)-: ~OC(O)Rn: -N(R-')G(Q)-; -N{R-')S(0)r; -N(Rn)S(O)-; -N(R;-)0(0)0-:
    N(Rn)C(O)N(R' ·)-: e -OC(O)N(RnRn3);
    T é selecionado do grupo consistindo em fenila: naftila; indenila; índanila; 10 tetralinila: Ο$.·?0 acloalquila: heterociclila de 4 a 7 membros; eu haterobíciclila de 9 a 11 membros, onde t é opcionalmente substituído com um ou mais R!T que são iguais ou diferentes;
    R-° é Z; halogênio: CN; oxo («O); COOR12; OR13; C(O)R33; C(G)N(R!W3*); S(O)2N(R'2R-i>Sí); S(O)N(R12R·53); SfOkR13; S(Q)R'2; N(R'2)S(O)2N 15 (Rt2*R12b); SR'2; N(R-2R^a); N02: OC(O)R12; N(R'~)C{O)R'^; N(R'2)S (O)zR'2a; N{R12)S(O)R^*; N(R^)C(O)OR^s; N(Rn)C(O)N(RfeR^); OC(O)N (R’4R!za); ou C-i-g alquila, onde 0^ alquila é opcionalmente substituída com um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes;
    R'-< R!Y R1z, RVa, R: ;b são Índependentemente selecionadas do grupo 20 consistindo em Η; Z; ou C·;^ alquila, onde alquila é apcionaímente substituída com um ou mais halogênio, que são iguais ou diferentes: contanto que um de R* R*8, R^, R1'3, Rn. R- u. R'2, Ru‘s, R-^seja Z.
  8. 8. Profãrmaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, onde L2 è uma cadeia alquila, que é apcionaímente interrompida
    25 por um au mais grupos Índependentemente selecionados de -O-; e C(O)N(R>S3); opcionalmente substituída com um ou mais grupos independentemente selecionados de OH; e C(O)N(R3s5R33í!&): e code R3as, RiSaa são índependentemente selecionados do grupo consistindo em H; e Cm alquila.
  9. 9. Profármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 3D a 8, onde l? tem um peso molecular na faixa de a partir de 14 g/mol a 750 g/mol.
  10. 10. Profármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 9; onde 1/ é ligado a Z através de um grupo terminai selecionado de
    4 ; a 5·
  11. 11, Profàrmaco de acorda com qualquer uma des reivindicações
    1 a 10, onde L é representado pela fórmula (la)
    R^ em que R\ 1/ e Z têm o significado conforme indicado na reivindicação 1 e onde R'ysa, Ríis8S são índependentemente selecionados do grupo consistindo em H; e Cm alquila; ou são unidos com o átomo de nitrogênio aa qual eles estão ligados para formar um heterociclo de 4 a 7 membros.
  12. 12. Profàrmaco de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 10, onde L é representado pela fórmula (Ib) (ib) com qualquer unia das reivindicações
    Ν' H* R' em que R1, RR R* L? e Z têm u significado conforme indicado na reivindicação 1 e onde R33a é H; ou Cm alquila.
  13. 13. Profàrmaco de acordo
    1 a 10. onde R’ na fórmula (!) e (Λζ.
  14. 14. Profàrmaco de acordo
    1 a 10. onde R3 na fórmula (I) é ΐΛζ.
  15. 15. Prsfármaca de acordo corn qualquer uma das reivindicações ;om qualquer uma das reivindicações 1 a 10, onde Rõ R'ia na fórmula (I) são unidas com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados para formar um heterociclo de 4 a 7 membros e onde o heterociclo é substituído cam ΐΛΖ.
  16. 16. Profàrmaco de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 15, ande D-H é um agente bioativo de molécula pequena ou um biopolí13 meco
  17. 17, Pcofármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, onde D-H é um biopolímero selecionado do grupo de bíopoíimeros consistindo em proteínas, polipeptídeos, ohgonucleotídeos e ácidos nucleicos de peptídeo.
  18. 18. Prcfármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, onde ΟΉ é um polipeptídeo selecionado do grupo de polipeptídeos consistindo em ACTH, adenosina desaminase, agalsidass, alfa-1 aniitripsina (AAT), inibidor de alfa-1 proteinase (API), alteplase, amilinas (arnílína, sirnlina), anistreplase, ancrode serina protease, anticorpos (monoclonal ou policlonal. e fragmentos ou fusões), antítrombina lil. antifripsinas. aproiinina, asparaginases, atosibano... bifaüna, bivalirudina, proteínas morfogenéticas do osso, inibidor de trípsína pancreátíca bovina (BPTl), fragmentas de caderina, caícitenína (salmão), celagenase, inibidor de esterase C1 de complemento, conotoxinas, fragmentos de receptor de citocina, DNase, dinorflna A, endorfinas, enfuvirtida, enoefaíinas, entropnietinas, exendinas, fator VII, fator Vila, fator VIII, fator Villa, fator IX, fibrinolisina, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), peptídeo de liberação de hormônio do crescimento 2 (GHRP2), proteínas de fusão, hormônios de estimulação de foliculo, gramicidina, grelína, desacíl -grelina, fator de estimulação de colônia de granuíõcito (G -CSF), galactosidase, glucagon, peptídeos tipo glucagon, glucocerebrosidase, fator de estimulação de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), proteínas de choque térmica humanas (HSP), proteína de ativação de fosfollpase (PLAP), gonaduíropina coriônica (hCG), hemoglobinas, vacinas da hepatite 8, hirudina, inibidor de serina protease humana, hialuronidase, ídurnonidase, imuno globulinas, vacinas para influenza, interleucirias (1 alfa, 1 beta, 2, 3, 4, 6, 13, 11. 12, 13, 21), antagonista do receptor de iL-1 (rhlL-1ra), insulinas, fatures de crescimento do tipo insulina, proteína de ligação de fator de crescimento do tip-ο insulina (rhIGFBP), interferons (alfa 2a, alfa 2b, alfa 2c, beta 1a, beta 1b, gama Ta, gama 1b). molécula de adesão intracelular, fator de crescimento de queratínócito (KGF), ligante de glícoproteína P-selectina (PSGL), fatores de crescimento transformantes, lactase, leptins, ieuprolida, levotiroxína, ΐ Ί ft ¢.
    hormônio luteinizante. vacina para doença da Lyme, peptídeos natríuréticos (ANP, BNP. CNP e fragmentas! neuropeptideo Y, pancrelípase, palipeptídeo pancreático. papaina, hormônio paratireoide, PDGF, pepsina, peptideo YY, fator de ativação de píaqueta acetíl hidrolase (PAF-AH), pralactina, pro5 teina C. timalfasina. octreotideo, secretina, sermorelina, receptor de fator de necrose de tumor solúvel (TNFR), superoxide dismutase (SOO), samatropínas (hormônio do crescimento), somatoprima, ssmatostatína, estreptocinase, sucrase, terlipressina, fragmento de toxina do tétano, tilaclase, trombinas, timosina. hormônio de estimulação da fíreoide, tirotropína, fator de necrose 10 de fumar (TNF). receptor de TNFIgG Fc, ativador de plasmlnogénio de tecido (tPA). TSH, urodiiatíná, urato oxidase, urooinase, vaccines, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), peptideo intestinal vasoat.ivo, vasapressina, ziconotida, lectina e riaina.
  19. 19. Profármaco de acorda com qualquer uma das reivindicações
    15 1 a 18. onde D-H è uma proteína preparada através de tecnologias de DNA reeombinante.
  20. 20. Profánnaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ande D-H é uma proteina selecionada do grupo de proteínas consistindo em fragmentos de anticorpo, proteínas de ligação de antígeno de ea-
    20 deía simples, anticorpos catalíticos e proteínas de fusão.
  21. 21. Profàrmaco de acordo cam qualquer uma das reivindicações
    1 a 16, onde D-H é urn agente bioativode molécula pequena D-H selecionado do grupo de agentes consistindo em agentes ativas no sistema nervoso central, agentes antiínfectivos, antiatérgicos, de ímunsmadulaçâa, antiobesí25 dade, antíccagulantes, antídiabêticos, antineoplãsticos, antibacterianas, antífúngícos, analgésicas, contraceptives. antMnflamatõrios. esteroidais, vasomlatadores, vascconstritures e cardiovasouíares cam pelo menos um grupo amina primário eu secundário.
  22. 22. Profármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações
    30 1 a 16 e 21, onde O H é um agente bioativo de molécula pequena selecionado do grupo da agentes consistindo em acarbose, appreciate, alaprociato, alendronate, amantadlna. amíeacina, amineptina, amínogíutetímida,. amisul12 prlda, amlodipine, amotosaleno, amoxspina, amoxicilina: anfetamina, anfbtericins 8, ampicilina, amprenavlr, amrinona, anileridina, apraclonidina. apramicina, articaina, atenolol, atomoxetina, avizafona, baclofeno, benazepril, bsnserazida, benzocaine, betaxolol, bleornicina, bronfenaco. brofaromina,
    5 carvedilol, catine, oatinona, cerbutamida, cefalexins, clinafloxacina, ciprofloxacins, deferoxamine, delavirdina, desipramina, daunorrubicina, dexmetihenidato, dexmetiKenidato, diafenilsulfbna, dizocilpina, dopamine, dobufamina, dorzolamida, doxorrubicina, duloxetina, eflornitina. enaiapnl, epinefrina, epirrubicina, ergolina, ertapenem, esmolol, enoxacina, etambutol, fenfluramina,
    10 fenoldopam, fenoterol, fingolimoda, flecainida, fluvoxamina, fosamprenavir, frovatriptano, furosemide, fluoexetina, gabaperrtina, gatifloxacina, gemiflocaclna, gentamicina, grepafloxadna, hexilcaina, hidralazina, hidroolorotiazida, icofungipeno, idarrubioina, imiquimode, inversina, isoproterenol, isradipina, canamlcina A, cetamina, labetalol, lamivudina, levobunolol ievodupa, levoti15 roxlna, lisinopril lornefioxacina. loracarbefe, maprotilina, mefloquine, melfalano, memaniina, meropenem, mesalazine, rnescalina, rnetildopa, metilene·· dioximetanfetamlna, metoprolol rnilnaciprana, mitoxantrona, moxifloxacina, norepinefrins, norfloxaclna, nertriptilina, neomicina B, nisiatina, oseltamivir, ácido pamidronico, psroxetina, pazufloxacina, pemetrexede, perindopril,
    20 fenmetrazina, fenolzina, pregabahna, procaine, pseudoefedrina, protriptilina, reboxetlna, ritodrina, sabarrobidna, salbutamol serotonins, sertralinaa, silagliptiaa, sotaloi, espectinomicina, sulfadiazine, suifamerazina, sertratina, esprectinomicina, sulfaleno, sulfametoxazol, tacrina, tamsulosina, terbutaline, timolol, tirofibano, tobramicina, tocainida, tosufloxacina, trandolapril, ácido
    25 tranexâmíoo, tranilcipromine, trimerexato, trovafioxaclna, valaclclovir, valganciclovir, vsncomlcina, vlomicina, viloxazina e zalcitabina.
  23. 23. Profármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, onde Z é urn polímero de pelo menos 500 Da ou um grupo C8.^ alquite.
    >0
  24. 24. Profármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 23, onde Z é selecionado do grupo de polímeros opcionalmonte reticulados consistindo em polirpropileno glicol), polifetileno glicol), dexfrano, quito sana, ácido hialurônlco, alginata. xilano, manana. carragenana, agarose, celulose, amido, hidroxialquil amido (HAS), poli(vinil alcoóis), ραli(oxazolinas), poli(anidridos). poli(orto èsteres), poli(carbonatos), poli(uretanas), ácido poli(acrílicos), poli(acrilamídas), poli(aculatos), poli(metacrilatos)> poliforganofosfazenos), polioxazolina, polí(siloxanas), poli(amidas), palí(vinilpirroíidona), poli(cianoacnlatos), poli(ésteres). poli(iminacarbunatos), pcMí(aminoácidos), colágeno, gelatina, hidrogel ou uma proteína do plasma sanguíneo e copolímeros dos mesmos.
  25. 25. Profàrmaco de acorda com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, onde Z é uma proteína.
    25. Profàrmaco de acorda com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, onde Z é uma proteína selecionada da grupo consistindo em albumins, transfernna, imunoglobulina.
  26. 27. Profàrmaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23. onde Z é um polifetileno gliaol) hnear gu ramificado com um pesa molecular de 2.000 Da a 150,000 Da.
  27. 28. Profàrmaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, ande D-H é um agonists de receptor de GLP-1; L é L? representado pela formula (I) conforme indicado na reivindicação 1; e Z é um hidrogel.
  28. 29. Profàrmaco de acordo com a reivindicação 28, onde o agonista de receptor de GLP-1 è í::.xend;na-4.
  29. 30 Profàrmaco de acorda com a reivindicação 28 ou 29, onde na fórmula (I) X é N(R4), X5 é C e Xa é O.
  30. 31. Profàrmaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30. onde l. ê representado pela fórmula <la) conforme indicado na reivindicação 11 ou L é representado pela fórmula (íb) conforme indicado na reivindicação 12,
  31. 32. Precursor de profàrmaco de fórmula Act-L, onde L tem o significado conforme indicada na reivindicação 1 e Act ê um grupo da salda.
  32. 33. Precursor de profàrmaco de acordo oom a reivindicação 32, onde Act é cloro, bromo, flúor, nitrafenóxi, imidazolila, Nbidroxissucainimidila, N-hidroxibenzotríazoiíla. N hidroxiazobenzotriazolila, pantafluorfenóxl 2-tioxo-tiazoiidlnila ou N-hidroxissulfosuccinimidiía.
  33. 34, Composição farmacêutica compreendendo um profármaco eomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, cu um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo junto com um exciptente farmacêutica-
    5 mente aceitável
  34. 35, Profárrnaco de acordo cem qualquer uma das reivindicações 1 a 31, cu uma composição da reivindicação 30 para uso como um medicamento.
  35. 36, Método de tratamento, controle, retardo ou prevenção em
    IO um paciente mamífero com necessidade do tratamento de uma ou mais condições compreendendo administrar ao dito paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um profármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, ou uma composição farmacêutica da reivindicação 34 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
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