PT87688B - Processo para a preparacao de proteina hibrida c - Google Patents

Processo para a preparacao de proteina hibrida c Download PDF

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Description

S umár io da Invenç ão (1) Domínios aplicados na indústria:
A presente invenção refare-se a uma nova proteína híbrida C com actividade anti-coagulante do sangue.
(2) Fundamento tecnológico:
A proteína C humana é um precursor de uma protease de serina detectado no plasma humano.
á bem conhecido que a proteína C humana é activada por um complexo de trornbina-trombomodulina. A proteína C activada inibe a coagulação do sangue através da
inactivação do factor VlIIa e a do factor V na presença de iões cálcio.
Cionou-se e sequenciou-se o gene correspondente à expressão da proteína G humana, de acordo com
Foster et al., Prqc, Natl, Acad».....Sei. USA, 82, 4673-4677, (1985). Determinou-se também a sequência de aminoácidos da proteína C humana, a partir da sequência de nucleótidos gue codifica para a proteína C humana, segundo Foster et al., ibid.
A proteína G humana tem 9 grupos ácido glutâmico característicos nas posições 6*, 7*, 14*, 16s, 19-=, 20a, 25s, 26a, e 29a na região aminoterminal. dstes grupos áci do glutâmico encontram-se carboxilados nos seus carbonoatravés duma modificação pós-translaccional dependente da vitamina Κ. A região gue inclui estes grupos ácido glutâmico X -carboxilatos (designada no gue se segue como região Gla) é necessária para a formação da. complexo na presença de cálcio com fosfolípidos carregados negativamente na membrana celular. A função ca região Gla encontra-se revista em Taisha (Metabolism), 19, if2 9 (1982) (em japonês).
Fara além da proteína G, tem-se investigado detalhadamente até agora, vários outras proteínas do sangue humano dependentes da vitamina k, com uma estrutura da região Gla semelhante mas com um efeito de pro-coagulação inversa, como sejam a protrombina, o factor 711, o factor IX e o factor X.
Obteve-se recentemente a informação interessante, referida por k'awroth et al., Thrombosis Research, 44, 625-637 (1986), de que o péptido cobrindo do l2 ao 432 grupo aminoácido da. região aminoterminal do factor X, inibe competitivamente a actividade do factor X e, por sua vez, suprime a coagulação do sangue.
(3)
Objectivo da invenção:
objectivo desta invenção é a obtenção de novas proteínas híbridas com uma actividade anti-coagulante mais potente, construídas por substituição de um segmento da proteín G humana por um segmento correspondente das outras proteínas de coagulação dependentes da vitamina k.
(4) Construção da invenção:
A presente invenção tem por objectivo a construção da proteínas híbridas por meio da substituição da região Gla da proteína C humana pela região Gpa d.a outras proteínas dependentes da vitamina a, responsáveis pela coagulação do sangue humano, ou pelo seu equivalente. A protrombina, o factor VII, o factor IX e o factor X são conhecidos como as proteínas dependentes da vitamina k relacionadas com o sistema de coagulação do sangue humano.
As sequências de aminoácidos próximas da região aminoterminal de cada proteína dependente da vitamina a, encontram-se listados na Tabela 1, apresentadas de modo a maximizar a homologia entre os vários grupos aminoácidos, considerados a homologia físico-química baseada na definição de Dayhoff (1978).
Os grupos aminoácidos apresentados na Tabela 1, abreviam-se do seguinte modo:
A, Ala; N, Asn; s, Ser; ?, Phe; A, /.•eu; b, Glu;
R# Arg; H, His; C, Cys; I, Ile; D, Asp; hys;
Q, Gin; v, Vai; IX I Γθ' X, Thr; X, Trp; ι·;, Xet;
G, Gly; V * t Tyr
designa um codão sem sêntido.
Os grupos ácido glutâmico, designados por S nesta tabela, tncontram-se y -carfooxilados.
Nesta invenção, a sequência, da aminoáci dos do l2 ao 432 grupo da proteína G humana é substituída por uma sequência de aminoácidos do l2 ao 43s grupo da protrombina humana, do factor VII, do factor IX ou do factor X.
á possível substituir um ou mais grupos aminoácido por um outro ou mais grupos aminoácido, desde gue a actividade da. proteína híbrida construída não se deteriore.
Ag proteínas híbridas desta invenção podem pre parar-se por meio de técnicas de engenharia genética. Por isso, esta invenção refera-se também ao DNA codificante para estas proteínas híbridas e ao método de preparação destas proteínas híbridas por meio de técnicas de engenharia genética.
G gene codificante para proteínas níbri das nesta invenção pode construir-se substituindo a sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos incluindo a região Gla e a sequência de sinal do gene da proteína C humana pela sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos incluindo a região Gla e a sequênc^a óe sinal de proteínas de coagulação do sangue dependentes da vitamina A. Neste caso, é também possível ligar a sequência de nucleótidos gue codifica a região Gla do factor IX com a sequência de sinal do factor X.
A sequência de nucleótidos que codifica a proteína C foi publicada na referência de Póster acima mencionada e na revista Japonese Laid-Open Unexamined Patent Fublication 205487/86.
As sequências de nucleótidos dos genes que codificam para a protrombina, o factor VII, o factor IX e o factor X, foram publicadas em Biochemistry, 22 2073 (1983),Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 83, 2412(1986), £roc., Pfatl, Acad. Sei. USA, 79, 6461 (1982) e Biochemistry, 25, 5098 ,·]
-r-fMM
(1986), respectivamente.
Na presente invenção, é preferível - sin tetizar as sequências de nucleófidos que codificam as sequências de aminoácidos incluindo a região Gj.a e as sequências de sinal, de acordo com estas sequências de nucleótidos publicados nas referências acima mencionadas.
Os genes construídos de acordo com os métodos acima mencionados podem exprimir-se em células hospedeiras adequadas transformadas por vectores de expressão ad quados, construídos ligando a sequência que codifica para a proteína com um promotor, um terminador, etc., de acordo com os métodos usuais da especialidade. Os hospedeiros preferenciais são células eucarióticas que podem modificar as proteínas recombinantes de vários modos pós-translaccionados, por exemplo, glicosilação, -carboxilação ou R-hidroxilação. Os promotores preferenciais para células eucarióticas são o promotor primário SV4O ou o virus do tumor mamário do rato, etc.
Exemplos de células hospedeiras favoráveis para a produção são células animais tais como células CHO, 8HK, HEk ou ,iepG2. A construção de genes ascombinantes, a ligação adicional das regiões funcionais necessárias para uma expressão eficiente, a transfecçâo para células hospedeiras, a expressão dos produtos recombinantes nas células hospedeiras e o isolamento dos produtos recombinantes, etc., podem efectuar-se por qualouer dos métodos geralmente utilizáveis nesta especialidade.
Sspera-se que as proteínas a produzir de acordo com esta invenção tenham uma actividade inibitória competitiva em relação às proteínas de coagulação do sangue dependente da vitamina K para além da actividade de neutralis ção em relação ao inibidor activador do plasminogénio e da inactivaeão do factor V e do factor VIII a, que são funções
originais da proteína G. Por isso, as proteínas híbridas desta invenção, apresentam uma melhor actividade contra a formação de coágulos sanguíneos ou o efeito acelerador da fibrinótise.
Utilizaram-se, como exemplos, um gene, codificante para a proteína G humana recentemente preparado e um novo método de expressão, que se explicam brevemente em seguida.
Os inventores construíram um gene codificante para a proteína C humana, constituída por 1389 bp (pares de bases) de nucleótidos e contendo adicionalmente uma posição EcoRI num extremo e posições Smal e HindIII no outro extremo. L-‘reparou-se o gene com base na sequência de nucleótidos codificantes para a proteína C humana, publicada por Foster et al., ibid., com algumas mudanças de bases sem alterar os grupos aminoácidos.
Formou-se o plasmídeo pPGlintegrando o gene entre as posições EcoRI e HindIII do vector plasmídeo gue se obteve a partir de pUG9 (fornecido comerciaimente por Pharmacia) e gue tinha a mesma posição de polilincagem gue pUC9 e menos um gene resisténte à ampicina com Pvul. O plasmídeo trans for mou-se em E. coli x\-12/0m 225 que se registou no Fermentation Research Institute, Agence of Industrial Science and Technology como FíiíRi-i 8F-1958.
Além disso, construiu-se um vector de expressão pGsl a partir do gene. Para tal, cortou-se o plasmídeo pSVAstopl, no qual se ligou um fragmento contendo o promotor primário SV4O e um fragmento contendo um agente de polilincagem para a inserção do gene e uma posição primária de poliadenilação de mRKA SV40 com um fragmento PvuII-Eco.RI cora 2,3 2.3 Kbp do plasmídeo p3R322 (gue contém um gene resistente à ampicilina e uma posição de iniciação de duplicação), na posição Xbal presente no agente de polilincagem
e encheram-se os extremos com DKA polimerase T^. Digeriu-se então o pPCl com EcoRI e Smal e isolou-se um fragmento âe DNA com 1,4 ix-bp contendo um gene âe proteina C e purificou-se por electroforese de gel âe poliacrilamida e converteu-se num fragmento de extremos cheios com DKA polimerase ϊ , que se ligou então com DKA ligase ΤΛ ao extremo cheio do plasmídeo pSVAstopl.
Examinaram-se os DKA plasmídeos recombinantes para seleccionar um clono em que estivesse integrado um gene de proteína C na orientação expressável sob o promotor primário SV4O. Designou-se o clono seleccionado por pCsl. Transformou-se o plasmídeo em E.coli Α-12/Η3101 que se registou no Fermentation Research Institute como PERA 3P-1473. Νθ Figura 1 apresenta-se o respectivo mapa de restri ções.
Construiu-se o pCs4 a partir do pCsl.
pCs4 tem duas posições 3stXI a montante do promotor primário SV4O e a jusante do sinal de poli-A como se ilustra na Figura 2. Arranjou-se a posição 3st'-.I de modo a obter os seguintes extremos coesivos assimétricos, por digestão com BstXI.
...CTGG _
Gene
GCCCGACC -LACeGGG ·
3'
GGTG.....5'
Os fragmentos ligam-se entre si necessariamente em repetição sucessiva. Isto torna possível a preparação de DNA compreendendo várias repetições sucessivas da unidade de expressão da proteína C (um promotor mais um gene de proteína C mais um sinal de poli-A). Produz-se a proteína C cultivando células do animal hospedeiro transfectadas com o DNA gue compreende várias repetições sucessivas.
processo de produção do pGs4 é o seguintes ligou-se o frag7 mento obtido por digestão do pCsl com EcoRI com o oliçonucle· ótido de cadeia dupla sintetizado quimicamente como se indica a seguir,
5 ' pAATTG GGA GGGGGG TGG
3' .....G GGT GGCCCG ACC
t
C..... 3'
GAGTFp 5' em gue p representa o grupo fosfato acoplado aos extremos 51 para a ligação, □ representa a posição de reconhecimento de BstXI, e indica a posição de clivagem pelo enzima referido.
A parte esquerda do oligonucleótido arranja-se de modo a constituir uma sequência emergente 5' gue se pode ligar ao extremo coesivo do pGsl cortado com EcoRI, o que não conduz è regeneração da posição EcoRI. Este arranjo efectua-se de modo que a posição EcoRI produzida no passo subsequente seja uma posição única. A parte direita é a posição que se vai ligar com o extremo coesivo Xhol.
Digeriu-se o produto de ligação com Xhol seguido novamente pela ligação. Ambos osextremos do pCsl cortado com EcoRI se ligaram com uma molécula do oligonucleótido sintético. Sujeitaram-se ambos os extremos do produto à ligação (em gue as forma a posição Xhol) de modo a formar-se um plasmídeo circular.
D,·geriu-se depois o plasmídeo resultante parcialmente, com PvuII. Gomo existiam duas posições PvuII no pCsl, a cisão ocorreu em ambos, numa delas ou em nenhuma, obtendo-se uma mistura dos vários produtos possíveis. Ror isso, submeteu-se a mistura a um fraccionamento de tamanho por meio de electroforese num gel de agarose para isolar o produto em gue sa tivesse apenas cindido o PvuII localizado a montante do promotor primário 3V40. 7jigou-se a cadeia de
DNA isolada com um oligonucleótido de ca do quimicamente, com a estrutura química
eia dupla sintetiza abaixo apresentada.
J.
5' pTT OCA GGCGGG TGG
3 ' .AA GGT CGGGGG AGG
t
..... 3'
TTAAp
5' em gue os símbolos se definem como anteriormente e a parte direita é a porção que esta ligada à secção cortada por EcoRI.
A parte esquerda do oligonucleótido ligou-se à posição PvuII do DNA plasmídeo cindido, o que não conduziu a regeneração da posição PvuII. Digeriu-se o produto de ligação coz EcoRI seguido novamente por ligação. Ligaram-se ambos os extremos do DNA plasmideo cindido com PvuII com uma molécula do oligonucleótido sintético. Sujsitaram-se ambos os extremos do produto a ligação (em que se situa a posição EcoRI) para formar um plasmídeo circular. Gindiu-se o plasmídeo resultante com Xhol e EcoRI, e clonou-se o fragmento em pHSG396 contendo um marcador resistente ao clorafenicol (fornecido por Taxara Shuzo Go., Ltd) cortado com Xhol e EcoRI. 0 vector plasmídeo de expressão da proteína G resistente ao cloramfenicol assim obtido designou-se por pCs4. Na Figura 2 apresenta-se o respectivo mapa de restrição.
Construiu-se também o pnSõ-293 contendo um neo-gene como marcador de selecção e uma posição DstXI obtendo-se os mesmos extremos coesivos assimétricos que no pCs4 por digestão. 0 fragmento obtido por digestão do pHSG293 com ôstXI ligou-se o fragmento obtido por digestão do pCs4 de modo a tornar possível a selecção da transfectantes. Um processo de produção é o seguinte: digeriu-se com BstXI o pH3G274, registado como ATCC 37301, um vector
cosmídeo contendo neo-gens gue confere resistência à canamicina ao hospedeiro 3. coli e resistência à G418 (geneticina) em células eucarióticas, ocorrendo a cisão corno ss mostra no diagrama de fluxo seguinte. Ligou-se então um nucleótido sintético apresentado no diagrama de fluxo.
I
w..,. ,„.
cos cos cos
pHSG274 j BstXI
CCA TCATG A TGG
GGT A GTACT ACC
-- HindIII _ (fjligonucleótido intétic0 GTAC
CCA GCCCCG TGG
GGT CGGGGC ACC
Xbal—lacOP—
BstXI (BstXI )
Ligação .BstXI'
CCA GCCCCG TGG
GGT CGGGGC ACC
Xbal—lacOP—
BstXI
A
GTACT
HindIII .BstXI'
CCA GCCCCG TGG
GGT CGGGGC ACC
-Xbal—lacOP—
BstXI
TGG
ACC
TTCGA (HindIII)
TTCGA (HindIII)
HindIII
TTCGA (HindIII) (HindIII) Ί
Ligação pHSG 293
BstXI fragmento com 3,6 kb
A partes esquerda do oligonucleótido sintético ligou-se com o DNA do vector cosmídeo cortado com BstXI e destruiu-se a posição BstXI. A digestão subsequente do produto de clivagem cora iiindlll resulta na remoção da região HindllI-BstXI contida no vector cosmídeo e ligam-se sucessivamente os fragmentos sintéticos em excesso. 0 produto obtido sujeitou-se a ligação de modo a obter-se um plasmídeo circular ao gual se ligou a parte direita do oligonucleótido sintético com a posição Hindlll do vector cosmídeo.
Introduziu-se a posição X3a'í na sequência do oligonucleótido sintético para se distinguir entre o pHSG274 e o pHSG293. Introduziu-se o operador lac no oligonucleótido sintético para seleccionar os transformantes por meio de resistência à canamicina aços o empacotamento do cosmídeo e para distinguir os transformantes que formam colónias azuis na presença de A-gal.
Designou-3e o plasmídeo por pNSG293.
respectivo mapa de restrições apresentasse na Figura 3.
No exemplo seguinte sintetizaram-se oligonucleótidos contendo as sequências de sinal e a região Gla de proteínas de coagulação do sangue dependentes da vitamina K. A sequência de nucleótido gue codifica a sequência de sinal e a região Gla da proteina Q no pCs4 substituiu-se pelos oligonucleótidos sintéticos. As unidades genéticas constituídas responsáveis pela expressão da proteína híbrida e o neo-gene removido do pNSG293 ligaram-se múltiplas vezes na mesma orientação usando os extremos coesivos unidireccionais do SstZII.
Empacotaram-se então in vitro estes genes multi-ligados em partículas de fagos e transfectaram-se em células de Ξ.coli. Seleccionaram-se os transfectantes de modo a obterem-se clonos com os DNA's cosmídeos reconfinantes desejados por meio de resistência à canamicina deri12 -
vada do neo-gens. Introduziram-se depois os DNA's cosmídeos recombinante obtidos pelo método acima descrito, em células
C.-£), de acordo com um método usual da especialidade. SQleccionaram-se novamente as células CHO resistentes ao G418 derivadas do neo-gene, o gue deu origem a uma produção eficiente das proteínas híbridas desejadas.
As proteínas híbridas da presente invenção podem preparar-se por quaisquer técnicas de engenharia genética. Deste modo, os exemplos mencionados em seguida são apenas um tipo de exemplos para preparar proteínas híbridas sem no entanto limitarem a invenção a esses mesmos exemplos.
Sxemplo 1 síntese de um fragmento de,.DMA codificando uma sequência de aminoácido que inclui a região Gla do Factor X
Sintetizou-se um fragmento de DNA, cuja sequência se apresenta na Tabela 2, de modo a estar flanqueada por uma posição Sall e por uma posição ScoRI por conveniência de ligação e abrangendo (a) os 40 grupos aminoácido da sequência de sinal do factor X, (fo) do is ao 432 grupo aminoácido do terminal azotado do factor X maduro seguindo a sequência de sinal, e (c) a sequência de nucleótidos crus codifica do 442 ao 462 grupo aminoácido da proteína G humana. Selecccionou-se a adenina imediatamente antes do início ATG esperando-se um efeito preferencial na expressão de protei nas híbridas. Introduziu-se ainda a sequência de nucleótidos que codifica do 442 ao 462 grupo aminoácido da proteína G de modo a criar uma nova posição Sall para ligar o fragmento de DNA com o gene da proteína G humana.
Sintetizaram-se oito oligonucleótido s oe onde resultaram quatro fragmentos de DNA separados com AinlII, Xbal e PstI, como se mostra na Tabela 2, por meio de um sintetizador de DNA, modelo 330A (Applied Diosçstem Go., U.S.A.).
_ ft.* 'Τ*”»·- -·,.„.
er*xsie«»i»*íBl»itARtí?»rtÃfriLíiV?A‘ari-»’;--^.:s · ;ν- ^£.Ώ » .; - Γ ·_·—-
Após aquecimento ligaram-se quatro fragmentos de cadeia dupla por meio de DNA ligase I*4 nas posições NindlII, Xbal e PstI, respectivamente. Inseriu-ss o fragmento de DNA ligado, flanqueado por posições Sall, em pUC18, fornecido comercialmente pela firma Takara Shuzo Co., Ltd., e amplificou-se em Ξ.coli K-12/HB101. 0 vector amplificado digeriu-se com Sall e obteve-se o fragmento de DMA sintético em quantidade média por meio de métodos de purificação correntes.
Pr^parou-se, essencialmente pelos mesmos métodos, um DNA sintético contendo um codão ACC para o grupo isolencina na 30 2 posição do gene de Pastor X em vez do codão GTC para o grupo valina.
Eyemplo 2
Sintetese de fragmentos de DNA codificantes de grupo aminoáçi· do incluindo a região Gla da protrombina, do factor VII pu do factor IX
Utilizando praticamente os mesmos métodos descritos no exemplo 1, sintetizaram-se os fragmentos de DNA apresentados nas Tabelas 3-5, flanqueados por uma posi ção Sall e por uma posição DcoRI por conveniência de ligação e abrangendo (a) os 4o grupos aminoácidos da sequência de sinal do factor X, (e,) <3o is ao 432 grupo aminoácido do terminal azotado da protrombina madura, do factor VII, madura, ou do factor IX madura, seguindo a sequência de sinal, e (c) a sequência de nucleótidos que codifica do 442 ao 452 grupo aminoácido da proteína C humana.
Exemplo 3
Construção de vector.es de expressão para proteínas híbridas
Pôde remover-se do pCs4 o gene que codifica parcialmente a proteína C, por meio de digestão com — 14 —
Sall, na posição Sal I imediatamente a montante da sequência de sinal-seguência codificante e na posição Sall correspondente ao 452 grupo valina e ao 462 grupo ácido aspártico da proteína C. Inseriu-se o fragmento de DNA sintetisado no exemplo 1 no pCs4 entre estas duas posições Sall e introduziu-se em Ξ.coli k-12/Ν.ãlOjSeleccionaram-se e cultívaram-se os transformantes contendo um plasmídeo numa orientação apropriada, chamado pGsõ. 0 pCs6 tinha a sequência de nucleótidos apresentada na Tabela 6, da proteína híbrida entre a proteína C e o factor X.
Usando o mesmo método, combinou-se o DNA sintético do factor X, cujo 302 grupo aminoácido fora substituído por isolencina preparada no exemplo 1, com os fragmentos de DNA sintéticos preparados no exemplo 2, para construção de um vector de expressão para outra proteína híbrida. Os DNA's sintéticos apresentados nas Tabelas 3-5 empregaram-se também para a construção de vectores de expressão de outras proteínas híbridas.
Exemplo 4
Produção de proteínas híbridas.....em células animais e confirmação das_ suas actividades análogas às da proteína G
Após digestão do pCsõ, preparado no exemplo 3, com BstXl, isolou-se um fragmento de DNA com 2,0 Kpb por meio de electroforese em gel de agarose. Ligaram-se este DNA com 2,0 Kbp e o pHSG293 digerido com BstXl, na razão molar de 20:1, respectivamente. Empacotou-se este DITA ligado in vitro com a mistura de empacotamento de lambda-fogos fornecida comercialmente por Taxara Shuzo Co., Ltd., Transfectaram-se depois os genomas lombda recombinantes em coli K-12/Om2O6, registados como F3RX LP-1472 no Fermentation Research Institute. Cultivaram-se os transfectantes nas condições gue permitem a selecção dos resistentes à caramicina. Escolheram-se as colónias cue continham um
elevado número de cópias dos genes gue codificam uma proteína híbrida e cultivaram-se no meio de cultura para isolar DNA's cosmídeos circulares para a expressão de uma proteína híbrida.
Introduziram-se estés DNA's cosmídeos circulares em células CHO pelo método do fosfato de cálcio.
Seleccionaram-se então transfectantes resistentes a G418 com pHSG293 e cultivaram-se em meio MEMcc, fornecido comercialmente por Gibco Laboratories In©·/ incluindo 10% de FCS, fornecido por Gibco Laboratories Inc., e 0,1 ug/ml de vitamina K^.
Efectuou-se uma sementeira de cerca de 5 x 10 transfectantes numa caixa de Petri de 6 cm de diâmetro e cultivaram-se a 37°G durante a noite. Após substituir o meio de cultura anterior por meio fresco, cultivaram-se as células durante pelo menos mais 24 horas. Depois de recolher a camada sobrenadante da cultura, determinou-se a quantidade do antigene do análogo da proteína C no meio pelo método ELISA usando anticorpo anti-proteína C humana.
Em consequência, confirmaram-se cinco de entre 20 clonos como produzindo 420 ng/ml, 530 ng/ml, 550 ng/ml, 910 ng/ml ou 1030 ng/ml de proteína G imunoreactiva no meio. Analisou-se ainda a melhor colónia em relação à sua actividade de serina protease e à sua actividade anticoagv· lante, por meio do kit de teste a proteína G humana, fornecido por Yamanouchi Pharmaceutical Go., Ltd (cat. N2 917567 e 917435), e do kit de teste à actividade anticoagulante da proteína G humana, fornecido por Sehringwerke AG, respectivamente. 0 resultado foi de 56% de actividade de serina protease e 62% de actividade anticoagulante, comparadas com as do pias ma humano como controlo padrão.
Exemplo 5
Purificação de uma proteína. G híbrida
Cultivaram-se as .'células CHO produtoras da proteína C híbrida (PcGFX), construída por substituição da sua região Gla pela região Gla do Factor X (PcGFX), segundo o mstodo de cultura em placas. Neste exemplo recolheram -se 27,5 litros da camada sobrenadante de cultura. Purificou-se a PcGFX pelo método de Kisiel, J. Çlin.. Invest. 64, 761-769 (1979). A fracção do sobrenadante absorvido em BaCl2 tratou-se com sulfato de amónio a 40% para precipitação e sujeitou-se depois a cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais anti-proteína C humana. A PcGFX eluída após cromatografia de afinidade tinha uma pureza superior a 95% e a quantidade de proteína era de 4,85 mg.
rendimento global conseguido com este processo de purificação foi de cerca de 30%. A análise da composição em aminoácidos revelou a existência na PcGFX dos 13 grupos gla esperados.
Exemplo 6
Inactivação do Factor Va pela PcGFX
Testou-se o efeito da PcGFX no Factor Va, uma serina protease fundamental no processo de coagulação sanguínea, que se sabe ser inactivada pela proteína G in vivo, medindo in vitro a actividade de conversão da trombina do Factor Va em plaquetas, na presença de PcFGX ou de proteína G humana natural ccmo controlo padrão. Activaram-se , (P) a PcGFX e a proteína G natural com Protac ' , aescnto em Thromb. Res. 43, 253-264 (1986). Gomo se verifica na Tabela seguinte, 0, 2 unidades/ml de PcGFX apresentaram uma maior actividade inibitória da geração de trombina pelo factor Va comparada com a da proteína C natural (proteína G-n, na tabela seguinte).
Tempo de Geração de trombina (IU/ml)
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Exemplo 7
Inactivação do Factor VIIIc pela PcGFX
Testou-se o efeito da PcGEí no factor (R)
VIIIc por meio do kit TESTZYM FVIII, fornecxdo comercialmente por Daiichi Pune Chemicals Co., Ltd. Efectuou-se a activação da PcGFX e da proteína C natural pelo método descrito no exemplo 6. Misturou-se a rcGFX ou a proteína C natural, activadas, com Factor VIIIc e incubou-se a mistura durante 0, 15, 30, 45 e 60 minutos, diluiram-se depois as misturas reaccionais a 1:121, misturaram-se ainda com fosfolípidos, com Factor IXa, Factor X e CaCl2/ ® incubaram-se durante pelo menos 5 minutos a 37°C.
Após a incubação adicionou-se S-2222, obtido comercialmente de AS Kabivitrum (Suécia), como substrato de Factor Xa produzido na mistura reaccional. Quantificou-se a produção de factor Xa por meio da actividade inibitória da PcGFX ou da proteína C natural contra o Factor 'fílíc. 0 resultado apresentado na Tabela seguinte mostra que a actividade inibitória da PcGFX contra o Factor VIIIc é quase a mesma cfue a da proteína C natural.
Tempo de Geração do Factor Xa (%) incubação Controlo proteína C-n r-PcGPN* (min)
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30 7S.9 5.5 5.5
45 7S.0 2.1 3. · «j
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Explicação das Tabelas
A Tabela 1 mostra os alinhamentos da sequência de aminoácidos perto da região amino-terminal da protrombina, do Factor VIII/ do Factor IX, do Factor X e da proteína C.
A tabela 2 mostra a sequência, de nuclef ótidos do DNA sintético que codifica a sequência de aminoácido gue inclui a região Gla do Factor X'.
A Tabela 3 mostra a sequência de nucleó tidos do DNA sintético gue codifica a sequência de aminoácidos que inclui a região Gla da protrombina.
A Tabela 4 mostra a sequência de nucleótidos do DNA sintético gue codifica a sequência da aminoácidos gue inclui a região Gla do Factor VII.
A Tabela 5 mostra a sõguência de nucleótidos do DNA sintético que codifica a sequência de aminoácidos que inclui o Gla do Factor IX.
A Tabela 6 mostra a sequência de núcleo tidos gue codifica a proteína híbrida construída por substituição da região Gla da proteína C pela região Gla do Factor X, e a sequência de aminoácidos da proteína híbrida.
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Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - IS Processo para a preparação de uma proteína híbrida, caracterizado por se empregar o DNA gue codifi ca a proteína humana C, mas em gue a sequência de aminoácidos da proteína humana C, a partir do is até ao 432 elemento, é substituído por uma sequência de aminoácidos da protrombina humana, do factor VII, do factor IX ou do factor X, tanhérn do is até a 432 elemento^ se exprimirem os genes assim preparados em células hospedeiras transformadas por meio de vectores de expressão adequados.
    - 2s Frocesso de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de urna proteína híbrida como a reivindicada na reivindicação 1, caracterizado por se sintetizar uma cadeia de DNA que codifique uma proteína híbrida, em que o 302 grupo Valina do factor X se encontra também substituído por isoleucina.
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