PT91268A - Processo para preparacao de mutantes da proteina c humana - Google Patents

Description

^•Τίλ. -

Descrição referente a patente de invenção de HOECHST JAPAN LIMITED, japonesa > industrial e comercialj com sede em 10-16} 8- chome , Alta sakaj Minato-ku, Tokyo, Japão (inventores: Ta-mot su Hashimoto e Masahiro Sa— toj residentes no Japao) para "PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE MUTANTES DA PROTEÍNA C HUMANA» DESCRI Ç A 0 w* ...

Descrição Pormenorizada da Invenção (l) Campos requeridos na Indústria A presente invenÇao relaciona-se com mutantes de proteína C de cadeia simples novos que possuem uma ac-tividade anticoagulante· (2) Antecedentes tecnológicos! A proteína C humana ê um precursor duma se— rina protease designada por "proteína C reactiva" presente no plasma e que desempenha um papel fisiológico importante na rd gulaçao da coagulaçao sanguínea· Esta e convertida para uma forma activada por proteólise restrita numa reacçao catalisada pela trombina ou por uma protease proveniente do veneno de * | víbora designada por "prota c". A proteína C reactiva exá be uma * forte actividade anticoagulante que I devida à sua inactiva-

N 1 -

I

Çao do factor VlIIa e factor Va na presença do iao cálcio (Har ler» R· A. > Kleiss? A· J· e GriíTin* J· ? Blood 59 ? 1067-1072 (1982) } Vehar > G. A. e Davi e > E. W. » Bio chem. 19 ? 401—4l0 ( 1980)) A activaçao da proteína C pela trombina I acelerada acentuada mente por um co-factor designado por trombomodulitia (Esmon? C.T. e Owen? W. G. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA £8, 2249-2252 (1981)). Também ê acelerada pelo sistema fibrinolítico ? pela activaçao do inibidor do activador do piasminogenio recidular (t-PAl). A sequência de DNA de cDNA que codifica a proteína C humana foi determinada por Foster e Davie (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 4766-4770 (1984)).

A proteína C humana ê uma glicoproteína dependente da vitamina K com nove resíduos de ácido gama-carbo— xiglutámico nas posições 6, 7 > l4> 16, 19? 20« 25? 26 e 29 do terminal amina. Esta região rica em acido gama— ca r bo xi g lutami co ê designada por domínio Gla e julga-se desempenhar um papel importante na actividade anticoagulante de proteína C por interaeçao com o fosfolipido presente na superfície da célula endotelial. 0 desempenho do domínio Gla estl descrito pormeno rizadamente na literatura "Taisha” (Metabolismo) > vol. 19? NQ 9 (1982). (3) Finalidade da invenção <h0

Constitui um objectivo desta invenção propor çionar um novo mutante de proteína C» mediante a alteraÇao du ma porção duma sequencia de aminoacidos da proteína C humana· A proteína C mutante resultante tem propriedades de modo que a taxa de activaçao pelo complexo trombina/trombomodulxna I muito reduzida e o tempo de duraçao da actividade é ? eventual mente j prolongado.

Concepção da presente invenção 0 processo de coagulaçao sanguínea conduz á èí 0 μ formaÇao dum coagulo de fibnna que envolve interaeçoes com—Λ - 2

ϊ * plexas entre uma diversidade de componentes do sangue e dos» tecidos. Durante o processo» existe o envolvimento de uma serie de cascatas enzimáticas» um zimogénio, uma proteína precursora relacionada com a correlação sanguínea converte-se a uma forma activada por outro factor da coagulaÇao sanguínea activado e a proteína activada» por sua vez» activa o zimoge— nio seguinte.

No estádio final da coagulação sanguínea a í protrombina e converti da para uma trombina activada por um fa ctor Xa activado na presença dum co—factor» factor Va activa— do. A forma de trombina activa converte o fibrinogenio em fi— brina. Esta também activa o factor VIII e o factor V para ace ierar a reacçao da coagulaÇao sanguínea com um "feedback" positivo. Por outro lado a trombina funciona para converter a proteína C numa forma activa por um mecanismo de "feedbacky negativo. A activaçao da proteína C pela trombina e enormemen te acelarada pelo co-factor trombornodulina presente na superfície das células endoteliais (Esmon > C.T. e Owen» W. G. » Proo. Nat 1. Acad. Sei. USA 7S» 2249-2252 (1981)). A proteína C reac tiva serve como um factor anticoagulante para inactivar as formas activas dos factores Va e VIIIa (Kisiel» W. et al.» Biochem· l6» 5824—5831 (1977))» Marlar» R.À. » Kleiss» A.J. e Griffin» J.H., Blood 1067-1072 (1982)). Alem disso a pro-teína C reactiva inactiva t-PAI. Como resultado, a formaÇao da piasmina a partir do plasminogênio, que provoca a degrada— çao dos quadros de fibrina» ê acelerada. Deste modo * a protei na C julga—se servir nao apenas como um factor anticoagulante mas também como um factor fibrinolítico (Sakata Y. et al.» Proc. Natl. Acad. Sei. 82» 1121-1125 (1985) )· Os doentes com níveis baixos plasmaticos de proteína C estão sujeitos a sofrerem de trombose (Griffin» J.H. et al. » J. Clin. Xnvest. 68» 1370-1373 (1981))} Griffin, J.H. et al.> Blood 60, 261-264 (1982))» Comp. P.C. et al. , J. Lin» Invest. 74, 2082—2088 (1984)). Nos doentes exibindo uma ausência virtual de proteína C caracterizado por o estado homozigotico, observa-se fre-* quentemente trombose fetal grave durante o período neo-natal r - 3 -

A proteína C humana ê uma glicoproteína dependente da vitamina K com um peso molecular aparente (PM) de 62 .Kilodalton (kd). Esta possui nove resíduos do acido gama--carboxilglutâmi co e o equivalente do ácido hidroxiaspárti— co (HO-Asp) (Kisiel, W. J., Clin- Invest. 64, 761-769 (1979)) separado por uma peptidase de sinal apôs o resíduo de alanina (Ala) na posição -10· Assim gerâ-se um zimogenio com um prope ptido básico elevado de nove resíduos de aminoácidos· 0 processamento para a proteína madura» que circula no plasma» envolve a clivagem proteolítica adicional após os resíduos —1» 155 e 157 para eliminar o propeptido amino-terminal e o dipe-ptido Lys-Arg que liga as cadeias leve e pesada. A forma ds duas cadeias de proteína C é em seguida convertida para uma proteína C reactiva por um complexo trombina/trombomodulina jkt pela clivagem a seguir ao resíduo Arg na posição 169· Contudo» in vivo» o processamento do precursor de cadeia simples parece ser incompleto devido ao facto de no plasma humano 5-10% da proteína C existir sob a forma duma molécula de cadeia sim pies (Miletich, J.P. et al., Blood 62, Suppl. 1, 306a (1983)).

Pensou-se, amplamente, que as proteínas de recotnbinação isentas de vírus seriam um reagente terapêutico óti1. Os presentes inventores já tinham isolado o cDNA que co difica a proteína C humana e obtido exito na produção de proteína C recombinante em células de mamífero cultivadas após transfecção do cDNÀ cuja transcrição esta sob a regulaçao de diversos promotores. Além disso, verificou-se recentemente que os polipeptidos de cadeia simples da proteína C recombinante dos quais as moléculas de cadeia ónica e de duas cadeias podem ser separadas por via bioquímica exibiam uma menor taxa de activação pelo complexo trombina/trombomodulina do que os polipeptidos de duas cadeias, sugerindo que aqueles primeiros polipeptidos podem manifestar a sua aetividade enzimática len tamente in vivo e que o tempo de duraçao da sua actividade es tá possivelmente prolongado. 4

Os mutantes de proteína C humana 4a presente invenÇao exibem ama sequência 4© aminoácidos que ê dife rente» nas posiçoes 156 e 157» da sequencia natural Lys-Arg. Isto ê» um ou ambos os aminoácidos re feridos estão delectados ou substituídos por um aminoáci do ou aminoácidos diferentes dos da sequencia ou um dos dois referidos está delectado e o outro substituído. Como resultado espera-se que a proteína C humana mutante seja caracterizada como uma molécula de protei na C de cadeia única. A fi.m de se criar a proteína C de cadeia ánioa» é apropriado substituir a sequência Lys-Arg por dois outros aminoácidos. Alternativamente tambêm e possível substituir a sequência Lys-Arg por um» três ou mad s aminoaci— dos. Além disso a delecção desse dipeptido também produz uma proteína de cadeia simples.

Para a substituição da sequência Lys-Arg por outros aminoácidos» ê importante utilizar aminoácidos com pro priedades químicas idênticas às de Lys e de Arg« se possível. Tendo em consideração a hidrofilieidade, a carga iánica» a efe ctividade para a estrutura terciária duma proteína etc., preferem— se alguns dos aminoácidos neutros que incluem a serina (Ser)» a asparagina (Asn) e a glutamina (Gin)* As sequências que incluem Asn-Ser» Ser-Asn» Gln-Ser» Ser—Gin» Asn-Gin ou ' Gin-Asn sao adequadas para a substituição.

Os mutantes de proteína G humana da presente invenÇao podem ser criados por alteraçao duma parte da sequen cia de DNA que codifica a proteína C mediante a utilizaÇao de técnicas de recombinaçao de proteínas. Mais precisamente este DNA modificado pode preparar-se por substituição duma parte de cDNA que codifica a proteína C humana por um fragmento de DNA sintetizado quimicamente. 0 DNA que Codifica os mutantes de proteína C» referidos anteriormente> é expresso num hospe- m deiro quando este é ligado a um vector de expressão e o seu vector de DNA é introduzido nos cromossomas do hospedei.ro. . Neste caso, deve designar-se um vector de expressão para fun-'.t\ oionar no hospedeiro particular. Por outro lado, sao apropria - 5 -

das como hospedeiras» as células eucarioticas em que as modificações pós—translaciona is» tais come a glicosilaçao» a gama -carboxilação ou a A-hidroxilaçao duma proteína possam reali zar—se«.I*ara este fim sao preferíveis as ©elulas de mamífero cultivadas» tais como as células de ovário de hamster chinés (CHO) e as células de rim de hamster bebé (BHK.)· A criaçao de mutantes de proteína C de cadeia simples humana recombinante podem realizar-se por qualquer dos meios em que as varias fases incluem a construção de genes mu 00 tantes, a construção duma unidade de transcrição para a ex- 'φφ· ... . pressão dos genes mutantes num hospedeiro» a introdução dum vector de expressão que contem as unidades de transcrição nas 00 células hospedeiras» a selecçao de transformantes e a caraete rização bioquímica das proteínas recombinantes segregadas num meio de cultura· .00 (5) Efeitos da presente invenÇao ί

As mutantes de proteína C humana de cadeia m. simples recombinantes possuem uma actividade anticoagulaçao» '.00. avaliada pela capacidade do sistema de activaçao catalizado pela trombina/trombomodulina da proteína Cj para inactivar as formas activadas dos factores Va e VlIIa e para neutralizar t-PAI. Também são activados mais lentamente in vitro do que os polipeptidos de duas cadeias de proteína C» sugerindo a po s sibilidade da consequência da proteína C de cadeia única ser uma activaçao menor e mais durável no sangue normal» isto I» possuir uma semivida biológica maior. (6) AxplicaÇao através de exemplost A presente invenÇao será descrita em seguida nos Exemplos de Referência e nos Exemplos· Nos Exemplos utili zou—se o DNA que codifica para a proteína C humana descrito no pedido de patente de invenÇao japonês na 963^1/19^7 (haid-—Open Unexamined Publication Ns 263083/1988)· Utilizou—se o - 6

'βφ me método de expressão descrito no pedido de patente de invenção japonês n- 96340/1987 (Laid-Open Unexamined Publication ns 267288/1988). Este está descrito nos Exemplos de Referência 2 e 3. Os exemplos e os exemplos de referencia nao se conside-ram como limitantes da presente invenção.

Exemplos de Referência 1 (Construção de pCsl)

Os presentes inventores construiram um gene que codifica para a protesna C humana» con si stindo em núcleo— tidos com 1389 pares de bases e tendo ainda um sitio EcoRI nu ma extremidade e sítios Smal e HindIXX na outra extremidade. Preparou—se o gene com base na sequencia nucleotídica que codifica a proteína C humana publicada por Foster et al«» ibid.* com algumas modificaçoes de bases sem alterar os resíduos de aminoáeidos. Formou—se o plasmídeo pPCl por integraçao do gene entre EcoRI e HindIII do vector piaSmidico que era derivado de pUC9 (comercializado por Pharmacia) e que tinha o mesmo sítio poliadaptador do que pUC9 e um gene perdido de ré si st ên. cia à ampi cilina com Pvul. 0 pla smidio transformou—se em ^^E^ coli-K-12/0m225 que foi depositada no Fermentation Research Institutej Agency of Industrial Science and Technology sob a designação de FERM BP-I858. Em seguida construiu-se o vector de expressão pCsl a partir do plasmídio citado anteriormente. Isto ê* o plasmídeo psVAstopl em que o fragmento contendo o promotor próximo de SV40 e um fragmento contendo um poliadap— tador para a inserção do gene ê o sítio de poliadenila"ao de mRNA próximo de SV40 foram ligados com o fragmento PvulI-EcoRI de 2,3 Kpb do plasmídeo pBR322, que contém um gene de resis-tência a ampi cilina e um sítio de ini ciaçao de duplicação, foi cindido-no sítio Xbal presente no poli-adaptador e moldado pa ra uma extremidade coincidente (flush—end) com T^ DNA polime— rase. Em seguida digeriu—se o pPCl com EcoRI e Smal e 1 solou— -se o fragmento de DNA de 1,4 Kpb contendo um gene de proteína C e purificou— se por electroforese em gel de poliacrilami— . da convertendo—se para uma extremidade tornada coincidente com * DNA polimerase que em seguida se ligou com DNA ligase a

extremidade tornada coincidente do plasmideo pSVAstopl. Examinaram-se os plasmideos de DNA recombi-nante para seleccionar um clone em que fora integrado um gene de proteína C na orientação expressável* sob o promotor préxi mo de SV40. 0 clone seleccionâdo foi designado por pCsl. 0 plasmideo foi transformado em E. coli K-12/HB101 e depositado sob a designaÇao Ferm BP-1473 no Fermentation Research Insti— M tute. 0 mapa de restrição representa-se na Fig. 2· Exemplo de Referencia 2 (Construção de pCs4) Construiu—se pCs4 a partir de pCsl. 0 pCsft tem dois sítios BstXI a montante do promotor préximo SVkO e a juzante do sinal de poli A* ® sítio BstXI foi dividido para prbdnair as extremidades coesivas assimétricas seguintes > por té digestão com BstXI. 5* .....CTGG 3' ·CCCCGACC

Gene

Os fragmentos ligam-se* necessariamente * em tandem* o que toma possível preparar DNA contendo muitas se— ψφ. quéncias repetidas em tandem duma unidade de expressão de pro teína C (um promotor mais um gene de proteína fi mais um sinal poli A). A proteína C ê produzida por cultura de células hospedeiras animais transfectadas com o DNA que contém muitas re petições em tandem (repeats). 0 processo de produção de pCs4 M é o seguinteί o fragmento obtido por digestão de pCsl com EcoRX ligou—se com o oligonuceótido de cadeia dupla sintetiza do quimicamente» como a seguir se refere* C* · * * « 3» GAGCTp5' Tem que p representa um grupo fosfate ligado as extremidades 5’para '9é a ligaçao *

5·pÁATTG 3»· · · ··C

CCA GGT

CGGGGC GCCCCG

TGGACC - 8 *

I ' ι representa o sítio de reconhecimento BstXI e indica o sítio de clivagem pela enzima referida. © lado esquerdo do oligonucleótido ê disposto de forma constituir uma sequência 5' protrudente que pode ligar— se com a extremidade coesiva de pCsl cindido por EcoRI* que regenera o sitio EcoRI. Este arranjo ;é realizado de modo a que o sítio de EcoRI produzido na fase seguinte seja um sitio único. 0 lado direito constitui a fracçao que se ligou com a extremidade coesiva Xhol. 0 produto de ligaçao foi digerido com Xhol se

M guido novamente de ligaçao. Ambas as extremidades de pCsl cin didas com EcoRI foram ligadas respectivamente com uma molécula do oligonucleótido sintético. Ambas as extremidades do pro duto foram submetidas a ligaçaoj em que se formou o sitio Xhol para formar um plaSmídeo circular. Em seguida o plasmídeo resultante foi digerido parcialmente com PvuII como existiam dois sítios PvuII em Pcsl teve lugar * a clivagem> em qualquer dos sítios> em um ou em nenhum para se obter uma mistura destes» Consequentemente j a mistura foi submetida a fraccionamen to por electroforese em gel de agarose para se isolar o produ to em que o sítio em que tinha sido separado o sítio PvuII lo calizado a montante do promotor próximo de SV40. A cadeia de DNA i solada foi ligada com um oligonucleótido de cadeia dupla sintetizado quimicamente cuja estrutura química se representa a seguir 5'3'

j' pTT CCA GCCCCG TGG ♦AA GGT CGGGGC ACC T • · ·: .· ·· ^ ·TTAAp5‘ em que os símbolos têm os significados definidos anteriormente e em que o sitio direito representa a fracçao que e ligada com a secção cindida por EcoRI. 0 lado esquerdo do oligonucleoti do foi ligado - 9 -

com © sitio PvuII do DNA plasmí dico cindido o que nao regenerou o sítio PvuII. 0 produto da ligaçao foi dividido com EcoRI e novamônte seguido de ligaçao. Ambas as extremidades do DNA plasmídico cindido por PvuII se ligaram» respectivamente> com uma molécula do oligonucleótido sintético.

Ambas as extremidades do produto (em que se :mâ' localiza o sítio EcoRI) foram submetidas a ligaçao para forma rem um plasmídeo circular. 0 plasmídeo resultante foi cindido com Xhol e com EcoRI e o fragmento clonado em pHSG396 comportando um marcador resistente ao cloranfenicol (comercializado por Takara Shuzo Co.» Ltd.) cindido com EcoRI. 0 plasmídeo ve ctor de expressão de proteína C resistente ao cloranfenicol obtido deste modo foi designado por pCs4. 0 seu mapa de restrição apresenta-se substancialmente o mesmo do pCslO representado na Fig. 1.

Exemplo 1 (Construção de pCslO) A sequência de DNA que codi.fi ca o dipeptido de ligaçao Lys—Arg da proteína C está localizada entre os sítios BglII e SacII do cDNA da proteína C presente em pCsl e pCs4. Á fim de substituir a sequência Lys-Arg natural pela se quência Asn-Ser sintetizou-se quimicamente um fragmento de DNA curto em que as extremidades 5' e 3' exibiam uma estrutu— . ra reconhecida pelas enzimas de restrição BglII e SacII> respect ivament e. A sequência de DNA deste fragmento é a seguinte:

PCNS- oi-i GATCTCACCTGAACTCCGACACAGAAGACCAAGAAGACCAAGTAGATCCGC

PCNS— fii A GTGG A CTTGAGGCTGTGTCTTCT GGTTCTT CT GGTT CAT CTA GG Ί em que as porçoes sublinhadas AACTCC> que codificam Asn—Ser» correspondem ao dipeptido de ligaçao natural Lys-Arg /XAACCA7· A outra sequência permanece inalterada.

Sintetizaram-se os DNAs de cadeia (mica j • PCNS-d. e PCNS-/3 j por meio dum sintetizador de DNA (Applied . Biosystem Co.) dissolvendo-se em seguida 40 nmol de cada oli-

gonucleótido liofilizado em l60 jil de água destilada* Retira— ram-se l6 ^il de cada uma das soluçoes e misturaram-se com 2 yxl de tampao PNK diluído 10 vezes (500 triM Tris—Cl» pH 7 >0» 1®0 mM MgCl > 10 mM 2-mercaptoetanol» 25 mM ATP) e 2 μΐ de po- mi. linucleotidoquinase (5 unidades). Em seguida deixou— se reagir a mistura à temperatura de 37° durante 1 hora· Retiraram-se 10 jí.1 de cada mistura reaccional e mi sturaram-se conjuntamen— te· A mistura permaneceu em repouso a temperatura de 65 C durante 10 minutos e em seguida colocou—se a temperatura ambien te durante 45 minutos para circularazaçao*

Por outro lado» um segmento de DNA de 356 pb contendo uma região codificadora Lys-Arg foi isolada por digestão de DNA de pCs4 com ClaX e Xbal segu.i da de fraccionamen to em gel de agarose* Este fragmento foi depois: subclonado en tre os sítios Ciai e Xbal de pHSG396 para originar p396pCCIxlyí> A sequência codificador Lys-Arg apresentou-se num fragmento Clal-Xbal de 356 pb entre os sítios BglII de cDNA de proteína C. A fim de substituir 0 fragmento BgllI-SacII do gene da pro teína C natural por um o1igonuc1e61ido sintetizado qUimicamên te (PCNS-0(/PCNS-^) , digeriu-se primeiro p396pCCI-xb/5 com as enzimas de restrição BglII e Sacll. Após remoção dos fragmen— tos menores BgllI-SacII por electroforese em gel de agarose isolou—se o fragmento maior contendo o gene re si st ente ao cio ranfenicol s: ligou-se Com os oligonucleótidos referidos ante-riormente na presença de DNA ligase· Em seguida* a mistura ligadat foi transformada em E. coli K-T2/0m225· Processou—se a análise de sequência de DNA para a região do fragmento ClaX— -Xbal inserido num vector, utilizando-se o método de terminação de cadeia didesoxi como descrito por Sanger et al·

Como resultado observou-se que o oligonucleo-tido introduzido > fora inserido de modo correcto e a sua sequência era a mesma da designada iniciaImente· Consequentemen te» excisou—se um fragmento ClaX—Xbal do DNA piasmidico para • o transfeirir para pCs4 entre os sitios ClaX e Xbal* de onde , se removera um fragmento pequeno ClaX e Xbal· 0 plasmideo re li -

sultante designou—se por pCslO· 0 pCslO contêm um cDNA que co difica uma proteína mutante de proteína C em que o dipeptido de ligação Lys-Arg está substituído por Asn-Ser. 0 mapa da restrição de pCslO representa-se na Fig* 1. A sequencia de DNA da proteína C mutante e a sua sequencia de aminoácidos deduzi da a partir da sequência de DNA também estão representadas na Fig. 1. ι'Λ· / ^

Exemplo de Referencia 3 (Construção de 0 pHSG293 também construído e que possui um gene neo como um marcador de selecçao e um sítio BstXI que proporciona as mesmas extremidades coesivas assimétricas» co- 0+ .Há mo pCslO» por digestão. 0 fragmento obtido por digestão de pHSG293 com BstXI foi ligado com o fragmento obtido por diges tao de pCslO de modo a ser possível aceleraçao de transfectan tes. Um processo para a produção ê como seguei quando o pHSG-27%> depositado sob o némero de aceitaçao da ATCC 37301» um vector plasmídico com © gene neo que confere resistência á ca namicina ao hospedei ro E. colj e resistência a G%l8» genetici na» em células eucari 6t i cas» foi digerido com BstXI» deu-se a clivagem como se mostra no esquema seguinte. Depois ligou-se um nucleêtido sintêti co que se representa no mesmo esquema·

12

pHSG27^ | BstXI

ψ HindiII

.BstXI - CCA GCCCCG TGG GGT CGGGGC ACC -Xbal-lacOP- BstXI co s TTCGA (HindiII) (HindIIl) 1

Li gaçao pHSG 293

BstXI fragmento com 3 > 6 kb

0 lado esquerdo do oligonucleôtido sintético ligou-se com o DNA vector cosmí di co, cindiu-se com BstXI e des truiu-se o sítio BstXI. A digestão subsequente do produto de l éa clivagem com HindiII resulta na remoção da fracçao HindiII--BstXI contida no vector cosmídico e nos fragmentos ligados repetidamente sintéticos excessivos» 0 produto resultante submeteu-se a ligação para se produzir um plasmídeo circular em que o lado direito do oligonucleôtido sintético se apresentava ligado com o sítio HindIII do vector coSmidico. I Introduziu-se o sítio Xbal na sequência oligo i; nucleotídica sintética para distinguir pHSG274 de pHSG293» *n troduziu—se o operador lac no oligonucleôtido sintético para seleccionar transformantes por resistência à canamicina apôs incorporação do cosmídeo e para distinguir os transformantes que formam colônias azuis na presença de X—gal» 0 plasmídeo foi designado por pHSG293» 0 seu mapa de restrição representa-se na Fig. 3·

Exemplo 2

Ampliação in vitro de fragmentos de DNA contendo uni | dades que exprimem a proteína C mutante de cadeia sim pies e a sua preparaçao em larga escala em E. coli»

Quando se digeriu o DNA de pCslO descrito no Exemplo 1» com BstXI> obteve-se um fragmento de 2*2 kb conten do a unidade de transcrição e Um fragmento de 2?1 kd da porção de vector. Contudo» é difícil isolar cada fragmento num estado purificado por fraccionamento apôs a electroforese em gel de agarose. Para ultrapassar este problema * digeriu—se DNA de pCslO com a enzima de restrição EcoRI e inseriu-se o fragmento lineari zado de 4>3 kb no sítio EcoRI de pHSGIl. Este j com @ dimensão de 9>1 Kb constitui um derivado duma variante sensível à temperatura de pSClOl» pHSGl (Hashimoto—Gotoh> T» e • Sekiguchi» M. J. , Bacteriology 2i> 405-412 (1977))» em que o » ôttico sítio BstXI se destruirá por DNA polimerase. 0 plasmídeo - 14 -

resultante , designado pCsll, tem 13 »4 Kb e contêm um componen te de vector de 11,2 Kb contendo o gene de resistência ao cio ranfenicol, derivado de pCslO e o gene de resistência a tetra ciclina proveniente de pHSGll e uma unidade de transcrj çao de 2,2 Kb.

Digeriu—se o DNA de pCsll com BstXX e submeteu-se a electroforese em gel de agarose a 0,7% para purificar o fragmento de 2,2 Kb. Separadamente digeriu—se o DNA pHSG293 com BstXI e tratou-se subsequentemente com fosfatase alcalina de intestino de vitela (CIAP). Misturaram-se 2,0 p.g de fragmento de BstXI de 2,2 Kb contendo uma unidade de expressão da mutante de proteína C com 0,1 jXE de DNA de pHSG239 digerido com BstXI e tratado com CXAP numa relaçao de 10:1 em 10 ^l1 de solução contendo DNA ligase (5 unidades).

Retiraram-se 5 microlitros da mistura de liga çao e introduziram-se em partículas de fago lambda mediante utilização dum kit de "empacotamento" in vitro (Strategene Co.). A reaoçao realizou-se de acordo com o protocolo dos fabricantes. Em seguida células DH-1, da estirpe de E. coli K— -12, foram infectadas com partículas de fago e desenvolveram--se durante a noite ã temperatura de 37° c em placas de agar LS contendo 25 ^ig/ml- de canamicina. Cada colónia formada foi transferida para 100 ml dum meio LS líquido contendo canaroici na e incubada durante a noite a temperatura de 37 C. Dessa cultura recolheu-se cerca de 1Θ yug de DNA cosmídico mediante aplicação dum processo convencional para isolamento de DNA plasmí di co.

Digeriu-se o DNA cosmídico com cerca de %5 Kb com BstXI para se obterem dois tipos de fragmento de DNA, um fragmento com 11,2 Kb contendo o vector pHSG293 e um fragroen—

M to com 2,2 Kb contendo unidades de transcrição.

Após a electroforese do DNA cosmídico digerido com BstXI sobre gel de agarose a 0,7% contendo 0,5 ^ig/ml i

de brometo de etldio (PtBr)» mediu-se a intensidade de cada banda» que fora fotografada por radiaçao ultravioleta» por var riraento densitométrico* Como resultado obteve-se um cosmídio típico transportando 8 copias de unidades de transcrição e 2 cópias de vectores pHSG293· Este coemídeo foi designado por PCNS701.

Exemplo 3

Produção duma mutante de proteína C de cadeia sim- i pies em células animais culti vadas e demonstração de actividade idêntica à de proteína C.

A

Introduziu—se DNA cosmidico de pCNS701 em células BHK e CHO-dhfr- (desprovidas de actividade deshidrofora M .. to redutase) por um método de transfecçao convencional descri 6 *" to por Wigler et al. Semearam-se 1x10 células numa placa de cultura de tecidos de 100 mm de diâmetro» Falcon 3®dl» em 8 mm de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME)» complementado com 10% de sor© bovino fetal inactivado pelo calor (FBS) e 40 fig/ml de prolina > no caso de BHK ou de meio de Eagle Essencial Mínimo» contendo um núcleo si. do» complementado com FBS a 10% (MEM-0C) no caso das células CHO-dhfr · Estas células cultivaram-se durante cerca de 20 horas à temperatura de 37°C sob uma atmosfera de 5% de diôxido de carbono e 95% de ar durante o tempo até as células em desenvolvimento alcançarem a confluência de 20%. Para transfecçao» dissolveram—se 7 /ig de pCNS701 em 900 ^ul de l40 mM de cloreto de sódio» 0»75 mM de NaHPO^ e 25 mM de HEPES (pH 7»1)» e finalmente adicionaram—se a solução 60 μΐ de CaCl2 2M. Agitou-se cuidadosamente a mxstu ra e deixou-se» em seguida > em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente. A mistura resultante com um volume de* 9Ó0 jil foi adicionada gota a gota ao meio nas placas de cultu ra mencionadas anteriormente. Incubou-se a mistura durante 24 horas à temperatura de 37 C para permitir a incorporação do DNA exógeno nas células. Em seguida» o meio de cultura fbi • substituído por 8 ml de meio recente e continuou-se a cultura * durante 18 horas. 42 horas após a transfecçao» as células re-

colheram—se por tratamento por tripsina/EDTA e dividiram-se por 10 placas com 100 ml de diâmetro· Cada piada contendo 80 ml de meio de cultura» suplementado com FBS a 10%» 400 ^ig/ml de G-4l8 (GIBCO) e 40 jig/ml de prolina > no caso de BHK, foi incubada durante 7 a 14 dias à temperatura de 37 C· Obtiveram—se 85 colónias resistentes a G—4l8 derivadas de BHh e 57 derivadas de CHO— dhfr per jig de pCNS701. A partir de cada colónia isolaram-se clones de células simples e» em seguida» pro pagaram-se.

Para análises bioquímicas» incluindo ELISA (ensaio de imunoabsorçao ligado a enzima) e para o ensaio an-ticoagulaçao» semearam-se 1x10® células numa placa de cultura de tecidos» de 60 mm de diâmetro» Falcon» 30002) contendo 3 ml de meio de cultura e 0»1 jig/ml de vitamina K e incubaram-se durante 24 horas â temperatura de 37°C. Após um dia de cultura substituiu—se m meio por um meio recente» com o volume de ml» contendo 0,1 ^ig/ml de vitamina K e prolongou-se a cultu ra pôr mais 24 horas. Em seguida recolheu-se o meio de cultura » dividiu-se em alíquotas de 1 ml e conservaram-se a temperatura de -70°C até âs análises bioquímicas· * :Ai

Para determinar o conte&do de proteína C huma na mutante segregada no meio de cultura> realizou-se um ELISA. Colocaram-se 56 microlitros de anticorpos policlonais de carneiro » purificados pôr afinidade > para proteína C (5 pg de prote4na/ml em cada cavidade de uma placa microtituladora de 96 cavidades» Petra» e deixou-se a placa em repouso dutante 1 hora â temperatura ambiente.

Em seguida retirou-se o anticorpo e adicionaram— se a cada cavidade 250 jiX de PBS (solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato» de pH 7»2) contendo 1% de sero-—albumina bovina (BSA). Após repouso da placa durante 3O minu tos â temperatura ambiente» retirou-se a solução de cada cavi da de* Depois de lavagem quatro vezes com 200 jil de PBS secou— -se a p3sea ao ar e conservou-se à temperatura de 4°C até uti- - 17 -

11zaçaó· Em cada cavidade da uma placa microtituladora revestida com anticorpo, coloraram—se 40 do meio de cultura des congelados e deixou-se a placa à temperatura ambiente durante 1 hora· Em seguida retirou-se a‘solução e lavou-se a cavidade com quatro vezes com 200 μΐ de PBS.

Subsequentemente , adicionou-se a cada cavidade 40 jul de anticorpo de carneiro antiproteína C humana marca do com peroxidase de rábano (HRP) e deixou-se a placa durante 1 hora à temperatura ambiente· Apás remoção do anticorpo e subsequente lavagem com PBS colocou-se em cada cavidade 50 pi de solução tamponada com citrato contendo 1 pg/pl de ortofe— nildiamina (OPD) e 0,006% de peroxido de hidrogénio seguido de repouso durante 10 a 15 minutos á temperatura ambiente· Em peguida» o produto reaccional que exibia a cor castanha avermelhada ffei quantificado por um leitor de placa ELISA (Dyna-tech). No Quadro 2 representa—se cerca ce k79Á dos clonos resistentes a G-418 segregaram 0,5 jpug/twl ou mais de proteína C mutante no meio de cultura· Particularmente» o clone B-7 proveniente das células BHK. e o clone C-5 proveniente das células CH0-dhfr~, exibiram níveis elevados de produção da ordem de 0,74 pg/ml e 0,94 pg/ml respectivamente.

Em seguida» a fim de se examinar se as mutantes de proteína C segregadas possuíam uma activi dade biolági-ca, realizou—se um ensaio anticóagulaçao utilizando-se um kit de ensaio fornecido por Behringwerke (Cat. Ns 2577» 0TXA 11)· Este ensaio é fundament a do na capacidade da proteína C reacti vada por "protão" para inibir ou retardar, in vjtro» a coagu-laçao sanguínea. Como se representa no Quadro 2, B-7 e C-5 exibiram actividade anticoagulante nos níveis de 2,7 e de 11,0% dos do plasma normal de controlo, respectivamente.

Exemplo 4

Demonstração de qUe as moléculas de cadeia simples da proteína C sao segregadas predominantemente porr células que contém DNA que codifica a proteína C humana mutante nos seus cromossomas. - 18 -

A fim de determinar se a proteína C mutante recombinante segregada no meio consiste predominantemente em moléculas de cadeia simples, analisou—se um meio de cultura por hibridaçao de manchas de blote utilizando—se anticorpos policlonais para a proteína C humana.

Semearam— se independentemente 1x10 células de B—7 e células C—5 em placas de cultura de tecido, 60 mm de diâmetro, Falcon, 3002, e cultivaram-se no meio referido ante riormente durante 3 dias. Em seguida lavou-se a placa de ©ul— tura duas vezes com meio de cultura isento de soro e cultivou -se no mesmo meio durante mais 2h horas. Apés cultura retirou —Se 1 ml de sobrenadante, misturou—se com 333 pl de acido tri cloroacêtico a 100% (TCA) num tubo de Eppendorf de 1,5 ml de volume e deixou-se a mistura durante 30 minutos a temperatura de 0°C.

Apés centrifugação a 13 000 rpm durante 15 mi nutos dissolveram—se os precipitados em 20 pl de tampao de * amostra e em seguida adicionou-se cerca de 1 pl de solução ba se Trisma saturada, à solução, para se ajustar o pH para valores entre 7,0 e 7,5· A suspensão continha, normalmente $ 0*5 a 1 jxg de proteína· Em seguida separaram-se as amostras por SPS-PAGE e transferiraro-se por electroforese para um filtro de nylon na presença de 25 mM de Tris—192 mM de glicina (pH 8,3)-etanol a 20%. Subsequentemente fixou-se um filtro com 20 nflg Tris-HCL pH 7,5-500 mM de NaCl durante 60 minutos à temperatura ambiente. Em seguida submeteu-se o filtro a uma imuno-cloraçao j aquele reagiu com anticorpo de caprino anti proteína C humana, lavou-se duas vezes, incubou-se com anticorpo IgG de coelho anticaprino marcado com HRP e finalmente lavou--se duas vezes.

Como se representa na figura a proteína C purificada proveniente de plasma humano, exxhiu duas bandas principais, uma molécula de cadeia pesada com um peso molecu— . xar de cerca de 4© Kd (observam*· se na Fig. 4 isoformas de um - 19

polipeptido de cadeia pesada e cadeias e jjy) e uma molécula de cadeia leve de 21 Kd. Também se encontrou outra banda menor com um peso molecular de 62 Kd que corresponde a uma forma de cadeia simples de proteína C.

Nas amostras provenientes de B—7 e C-15 apenas se pode observar uma banda principal com um peso molecular de 62 Kd (ver Fig. 4, pistas 1 e 2). Estes resultados indicam que ao contrario da proteína C humana de origem plasma— tica cuja ligaçao dipeptídica Lys—Árg é processada por uma pe· ptidase Sinal» a proteína C humana recombinante > mutante» ê resistente a um ataque enzimatico por aquela protease» possi-velmente devido a presença do dipeptido Asn—Ser insensível a protease. 4 A

H O « a <P& -k2 • 1 • 1 • 1 • 1 9 I • I d a H 0 Eh M d a O O Φ O o © d u O k d k O < d Eh d v© υ Hi a H d a O < ca P d Eh a d < • 1 9 1 9 1 • 1 '· 1 • 1 d •P a (0 < W d 3 O © υ to a Φ o H < < d O H d < £ o < < d P CJ CJ < a u '· 1 * 1 • 1 • 1 • 1 0 O b0 < © CJ a d 0 d u P k Eh di Eh φ o k CJ Ph o < < H U d u a • 1 9 1 • 1 • 1 ·' 1 u k o Φ U (0 < k d to o X Eh H CJ O d- < •ri < Eh < H Eh o < Eh d X 9 1 • 1 • 1 t: 1 • 1 a * P bO P 3 O a d 3 P H P k < d < 10 < H d P o < P P CJ < d d • 1 9 1 .· 1 9 1 • 1 o k d a d bD Eh a d 3 o Φ ch φ P k < « a Φ H w O d O < CJ < a a • | • 1 • 1 e 1 • 1 H 0) o H CJ a CJ d d 0 &H H Eh © < rH Eh © d k < H P > P CJ CJ >- d a • 1 9 1 9 1 • 1 « 1 < P P P a Eh d d 3 p H < H Eh φ < to a d) d P O d O d .< '<S a a '· 1 • 1 9 1 9 1 • 1 d a o tfl O b < R d H d í-l « •H CJ Φ < d; a © Eh Eh o a < w O d d > .· 1 t 1 • 1 9 1 • 1 o d k o o © o b O © d 3 <Λ o Λ d υ d CJ Φ Eh a ã Φ 1 < Η 1 P < < Ui Eh a a J • 1 1 9 I ·' 1 • I o © Eh b0 o P to o Eh Φ O d to d H P k d < -rí «n Eh d ir\ d ?T) α < u < o a < H a d 1 1 9 1 9 1 1 1 • 1 CD H d a EH óC < 3 d P H © <; H CJ ^1 < ri < H O > P P α < CJ d d d • 1 • 1 • 1 • 1 '· 1 υ © o k o a CJ to d a H Λ o Φ Eh φ < >, < to EH X < m O d < d d < ·' 1 9' 1 • j • 1 ·' 1 d 3 d b CJ a u © a w Eh φ d © < α H d H O d < M P CJ CJ < d d1 • 1 9 1 9 I • 1 • 1 CD s o b P 3 CJ a d a H Φ o Φ < d < H < (0 d d Eh (Λ P CJ d d d < • 1 • 1 9 1 ·' 1 © 1 d d O © P a d 3 d H Eh φ H d Eh φ < d a © O d Eh a d d P CJ d i> 9 1 1« 1 • 1 9· 1 • 1 d k d d υ φ O Φ d 10 d © Eh « Eh d ÉH d < •-ri < m O > Eh a Eh a d 33 • i • I t i .· 1 • l k < b O k O a d 10 O d υ Φ O Φ < (0 < >> < Eh Eh w Eh m d < < a • 1 • 1 ·: 1 • 1 • 1 O d O a u a Eh 10 d k Eh φ < <o < tn CJ >> d Φ υ d1 d < < < Eh o a (0 • 1 • | 9 1 ·' 1 9 1 O CJ P O ÉH a © O Φ P a. Jj* < H CM Eh © υ d ÉH d d k 1 o d 1 O d H P < hÇ H a a 21

• I · I · I · Ο o 71 o ca 3 O 6-· 71 o y ¢0 (5 * o E-< 0) cu <a -íf o y O H υ 0 H 6-· 0 H o • I ·' 1 • 1 • 0 A Eh Ih α 3 υ < «3 o 01 ca 01 6-c ca < Eh Ui < UI 6h • 1 t 1 • I « o <0 O ifi 7] ca ca ca ca < ϋ Eh o 6-t 0 < • 1 • 1 • 1 '· o 3 H 3 o bO ca ca 01 < «1 o 3 H < uí < < o < ca • 1 §' 1 t 1 ·' 0 01 0 3 ca bO < 6-i Λ 6-· 01 ca o Eh A O 0 o < ca • 1 • 1 t 1 • u 3 0 01 ca A: o ca 0) (H 4 ca 3 o < ui 6h A 6-· y o • 1 • 1 9 1 • o SH O 3 0 >v o ca rH ca1 01 ca H <c ca ca < ui ca ca α • 1 • 1 • 1 • α 01 < rH O rH 6h (r> H 6h (C y © ca < H ca > ca > H 9 1 • 1 • 1 • 0 !>1 ca 3 ca 3 ca ca H < H < H' < ca ca ca ca ca ca o • í • 1 • 1 • y a o bO ca 3 ca < <0 ca 3 < H 6h ca < u < ca ca O • 1 • l • 1 ·: © o oi O ca 3 O < 3 O U ts 6H H ON < rH rH 6-· 01 y < H 0 ca rH υ 0 H o • 1 • 1 1 '· 0 m O μ υ 71 υ ca ί* ca >> ca >v < 6h O 6h o O ca • 1 • 1 • 1 f ca 3 o 0) o 3 o υ 4 Eh 4 < i* <í < y % y e ca • 1 ·' 1 • 1 • u >» α b0 H 71 ca <a H ca k < •H ca ca ca 0 < u E ca • 1 • j 9 1 « υ w o >> ca 3 ca < •ri ca H o Λ 6h o E ca ca < υ • 1 .· 1 • 1 • ca >v cã 3 o 71 ca ca H < H C3 < ca C3 ca ca 6-i α < • 1 t 1 • 1 • o 71 ca a 0 >1 υ ca >> ca k ca rH < H 0 6-i H ca ca y * 1 • 1 • 1 » O 71 υ >, υ ÍH o ca >. ca r-i ca H ca e· o ca ca ca ca ca • 1 • 1 • 1 • ca 3 o k υ 3 y e* 0) ca 0) < 71 O o tJ < m < < o • 1 • 1 • 1 • u Ih ca bO o 1¾ ca ca 01 ca 3 < ifi o < UI o < ca < ca 1 • 1 • 1 • 1 o· o < 3 o α a o o 3 k CO' < rH 00 < 7l o Eh 01 A rH ca ca rH ca < CJ O 1 • 1 • 1 • 1 01 < k < 0 rH Λ o Λ ca rH 6h © A < 6h ca 0 0 > 1 B 1 « 1 • 1 © 71 υ A ca bO < < 71 ca 3 O H α α < o < 0 < 1 9 1 • 1 • 1 rH υ 3 ca bO 0 © Ο 01 ca 3 0 H t> 6η Ui < < 0 0 1 • 1 1 • 1 © υ 3 CJ 3 υ «1 rH < 71 o 4 0 >> < < < < 6h Eh o 1 • 1 • 1 • 1 0 C3 3 ca P υ © u y 01 6h 01 o rH A ο < 2 0 < 1 β 1 9 1 9' 1 71 ο 71 ca 73 cã 3 •ri < •ri < 6h 01 M ο E « o ij 1 • 1 « 1 • 1 71 Β 3 ca 0 71 >. Ο dl ca H < * O 6η Ui ca 0 < 1 1 ·. 1 9 1 3 < b0 y A 0 71 H C3 3 < 71 < >>, ca < < ca < < J 1 • 1 • 1 9 1 3 C3 71 ;6h 01 <3 (0 01 < 6h H J < y < H *3 1 • 1 • 1 • 1 3 o ca 7] O CJ 3 o < 3 01 ιλ < >» IN 6h © σ\ CJ 01 l-Õ H < »3 H O A rH 6H Ui 1 • 1 é 1 • 1 ft ca 3 ca bO 0 A 71 < H ca 3 < 71 <ç ca ca o < 0 < 1 • 1 • 1 1 A ca μ ca 0 < 3: 71 Η 01 o 3 Ή 01 < < 2 o A O 1 • 1 • 1 • 1 >1 ca b0 6h A 6h 3 Á ca 3 < m Eh 01 ca o < ca < O 4 1 • 1 • 1 • 1 3 ca 73 < H CJ H 0) < >> y © Eh © J < >3 ca > 0 > 1 • 1 • 1 9 1 Ifi ca A < 3 ca H ca 3 < H y © α y Eh CJ 0 0 > 1 * 1 • 1 • 1 k u 0 CJ A 0 3 CJ 3 <s ifi < H y O A ca < O 0 1 t 1 • 1 • 1 ca b0 < 3 0 A H ca 3 < H 0 3 ca < < ca 0 éh y 1 • 1 t 1 9 1 0 ca < 3 O 0 k ca H < H: CJ 3 A ca ca CJ 0 o A 1 ·: 1 • 1 • 1 © ia CJ A. o 3 Ή <3 < 71 0 ai < y o ca < < Ui 22 O (M oa

CAC.CCC.TCC.TGG.GTG.CTG.ACT.GCA.GCC.CAC.TGC.ATG.GAT.GAG. TCC. AAG. AAG.CTC

Eh H O I • 1 1 • 1 ♦ 1 1 a o 0 Φ O 0 a O 0 At O 0 ft O 0 Φ φ tf Eh H \Q Eh φ 00 < <0 O 0 k 01 Eh a ã (N < H oa 0 a N 0 ΓΛ ÉH ÊH e\ Eh A 1 • 1 • 1 a 1 a 1 a 1 a 0 ft < (0 0 0 u 0 A φ < to 0 H 0 k 0 H < to a 0 < 0 < 0 Ah 0 0 < < 1 ·> 1 a | a 1 a 1 a 1 to 0 a 0 Φ 0 d 0 k 0 a !>> Eh φ Eh H Eh φ 0 a Eh φ M 0 a < H 0 a < EH 0 a 1 a 1 a 1 • 1 a 1 a 1 to 0 A 0 A 0 to 0 H 0 pH < (0 < to 0 >> ÊH (0 Eh CC a 0 < 0 < Eh, 0 0 'S> 0 > Eh < < « O < 0

I k Φ 0 I d rk 0 I A. to < I •p © S I to 0 1 10 •rl E I (D H < I (C ã < 1 uaH I a ©a i H (C > I At u ÊH I k Φ 0 1 0 k 1¾ I to K I (D H H 0 Eh O • 0 <

I a © a ia H 0 0 i 0 ca ÊH '· 0 < < a < 0 0 Eh O O co 0<m o 0 ta o • 0 H αo < 0

At k B I <0 5*J r-1 0 0 I

At k Eh I M k < I 60 k <á ©a I At to < I k Eh I a

O o < aoo < • 0 0 < a 0 < < O O m 0 N < •o <í. Eh '· O < < « 0 O I a to < i α to < I k a Eh I k 43 Eh I k Φ 0 1 to *a I k © 0 I k Eh I e to -ΐ I õ k 0 Eh < » O 0 O • 0 Eh 0 • < Eh <C • 0 0 <

I Φ H H I 0 k A. 1 H. <0 5> I© rk H I k a ÉH' i a H 0 ÉH 0 * 0 0 < 0 <

Ia© a I k a Eh Ia H

0 0 I 0 < 0 • 0 0

'f? H 0 I h -H 0 0 I 0 0 0 <0 H <

Eh < Eh 0 < 0 0 I H

< 0 0 0 I

Eh Eh O i 00 < t O Eh 0 a φai to k<I rH 10>

O At I O < 0 ·: 0 ÊH 0 • 0 Eh Eh • 0 ÉH 0 10 •rl K I H to > I Φ a At I H ffi > 0 a s-k 0 0 0 tÓ < >v < h3 0 < 0 0 I o 0 k o 0 c o 0 Φ as < H H Ol Eh 0 Ol 0 0 co a 1 a 1 0 a Eh A Eh φ < to 0 a < < a 1 · 1 0 k 0 a 0 a Eh φ < Eh 0 a a 1 a 1 0 (0 0 a O r-l < H; 0 < 0 0 a I a 1 0 0 0 m 0 .ri 0 k 0 A 0 < a 1 a 1 0 C 0 a < H < H 0 0 0 0 '· 1 a 1 0 te < A 0 H 0 H 0 < 0 < èi 1 • 1 0 a a Eh φ Eh φ O a 0 a a 1 a 1 0 t« 0 >> < *H 0 a 0 3f 0 0 É 1 a 1 0 a 0 k Eh1 φ 0 Φ 0 a < 0 0 ÊH Eh • 0 0 < · 0 0 0 • 0 < < < 0 < 0 < < • 0 0 0 < 0 0 < < * 0 < 0 a < 0 0 • 0 0 < a 0 0 < ·' 0 < 0 0 < <· 0 0 0 I®a AhI ka Eh IfaO k<Ieto < G1 y — Tyr-His-Ser-Ser-Arg-Glu- Ly s— G1 u— Ala—Ly s— Ar g— - 23 -

• 1 • 1 • 1 • 1 4' | O p O H p o et cu o d d o et p O Φ X et Φ co C3 P o B φ (M < Φ r\ Ui ίΛ < w Eh Eh -á4 d d -5j<- Eh, Eh 4 1 ·' 1 '· 1 • l 4 | et H o cu O P d P Eh O Eh (C. < to et Φ < >> d P es e> et <: < to Eh Eh d CU • I • 1 • 1 ·. 1 4 I et +> d >>, et H d bO < as (r< Φ et H B ai es P d rH < s et et et > d < et < 4 1 » 1 1 1 • 1 4 I O p et d et d o P et CU < « < H Eh φ et Φ et p < < et et O d < ΙΛ Eh ÉH 4 1 4 1 • 1 • I '· | O P O <0 O d rH o p et Φ a >) et H Eh aS et Φ < w o et et et !> < m • 1 t 1 • 1 .» 1 • 1 yj ,+> O as et H < to es <0 fr> o o η Eh as < >> < >1 < 8 a < et > < d < d t 1 t 1 ·' 1 • l 4 I d rH Eh a, et d o P et P H (C < 10 EH' φ d X < rH C3 '!> et <ç o d < Eh' o et • 1 • 1 * 1 4 I 4 | et d et P o φ d P O 0 < 1—t < l"H B d < d P es et o et Eh cu Eh: Eh d cu « 1 • 1 • 1 4 1 4 I o p y» 60 et a Eh H d a! et Φ es P et P Eh as d rH < tfl o < ÉH Eh et > et < • 1 * 1 ·' 1 4 1 4 I α ta o o. O P d < d et <: to d d et rH < H &H o et < < Eh es et et es • i 6 1 • 1 ·' l 4 1 O et d O a O d o d P O et ta tr\ *< H ΙΛ et rH tv et H ON < >. H < ΡΛ et es r\ et et ΡΛ et et C"\ EH Eh Ht4 < d • 1 • 1 • 1 • 1 4 l Eh d d d o to d P d cu < ta Eh φ < •H < to < 10 < < a d o 33 < < et < • 1 • 1 • 1 4 1 4 | O to o Φ d φ d to < b0 < •rl Eh H Eh d < •iH es P O 33 < H Eh cu d 33 < < • 1 • 1 • 1 4 1 4 I et o e> >> O P Eh d u Φ o P et H d Φ Eh Φ Eh rH d 1¾ et et Eh m d d < H «' 1 4 1 ·' 1 4 1 • I υ H et as d as d d d (0 6-· (0 o H d rH ÉH φ < •H yj !> et < et < d d d 33 • 1 t t § I 4 l 4 I et H Eh 10: d rH et es >1 Eh as et Eh aS et rH. es d et i> O et > a et et es • 1 • 1 » 1 ·: 1 4 í o 0 et d et P Eh to Eh to o d Eh φ Eh Φ et < •rl o cu d a < 2 Eh o CJ w • 1 • 1 • 1 '· 1 4 1 Eh Φ et V d ò d d Φ ÉH H Eh φ d P et H Eh H < M < S d cu es es < H 4 1 4 1 • 1 r I 4 | et to u P et >s es d et <! >> < to et H: < H et P < d '< <e et et es et Eh Eh • 1 • 1 | «. 1 I O Φ et d et >> Eh >1 d a H < rH et H et H < to < H et et et eí et et es < em que Ter representa o codao de termíaaÇao - 2k -

Claims (1)

1. Breve descrição dos Desenhos Fig. 1 representa o mapa de restrição de pCslO. Fig* 2 representa o mapa de restrição de pCsl# Fig» 3 representa o mapa de restrição de pHSG293· Fig. 4 representa ma perfil de proteína analisado por man chas de Western da proteína C humana mutante segrega da no meio de oultura pelos transformantes. Pista 1? Sobrenadante da cultura de transformante B-7· Pista 2i Sobrenadante da cultura de transformante C-5 Pista 3i Proteína C purificada de plasma humano n°r mal* Flita Mi Marcador de peso molecular de proteína (a partir do topo > bandas de 97 Kd» 68 Kd» 43 Kd, 26 Kd e 18 Kd). REI ? I 1? Π C à C Ô I S ;1ã Processo para a preparaçao de uma protexna C humana mutante cuja sequência de aminoécidos difere nas posições 156 e 157 de Lys-Àrg da sequência natural» caracterizado pelo facto de se expressar> numa célula hospedeira eucarioti-ca apropriada > um DNA que codifica a referida proteína C huma na mutante. Processo de acordo com a reivindicação 1, cara cteriza do pelo facto de o DNA codificar para um mutante em φ 0i que um ou ambos os aminoacidos citadosj estão delectados· - 3a - ia.· Processo de acordo com a reivindicaÇao 15 ca-racterizado pelo facto de o DNA codificar para um mutante na qual um ou dois aminoacidos sao substituidos por um amanoaeido ou aminoacidos diferentes dos aminoacidos da sequência natural. - 4a - Processo de acordo com a reivindicação lj ca-racterizado peio facto de o DNA codificar para um mutante no qual um·>dos dois aminoacidos citados ê delectado e o outro substituído por um aminoácido diferente do aminoaeido da se— quência natural· 5a - Processo de acordo com a reivindicação 3 * ca-racterizado pelo facto de o DNA codificar para um mutante no qual um ou os dois aminoacidos citados sao substituídos por um aminoácido escolhido no grupo constituido por Serj Asn e Gin· 27 - _ 6& * Processo de acordo com a reivindicação 5* cara cteriza do pelo facto de se substituírem ambos os aminoácidos citados por Asn-Ser. 7* - dicaçoes Processo de acordo com uma ou anterioresj caracterizado pelo facto mais das reivin de © DNA se ex pressar numa célula animal. Processo de acordo com a reivindicaÇao 7 > caracterizado pelo facto de se utilizarj como célula; uma célula de mamífero. A requerente reivindica a prioridade do pedido japonês apresentado em 26 de Julho de 1988 sob ô Nô Sho—63— -I84538. Lisboa* 25 de Julbo de 1989 § iHESTE OnCt.il !>i P*;0PR!BIU0B iMítSTJilii