JPH04501508A - ハイブリッド凝固促進蛋白 - Google Patents
ハイブリッド凝固促進蛋白Info
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- JPH04501508A JPH04501508A JP2500402A JP50040289A JPH04501508A JP H04501508 A JPH04501508 A JP H04501508A JP 2500402 A JP2500402 A JP 2500402A JP 50040289 A JP50040289 A JP 50040289A JP H04501508 A JPH04501508 A JP H04501508A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ハイブリッド凝固促進蛋白
人間の凝固補因子である因子VI I I :C(FVI I I)をコードし
ているDNA配列は文献上で知られており [例えばトウール等、1984年、
ネイチャー312巻312−317頁:ウッド等、1984年、ネイチャー31
2巻330−337頁;ベーア等、1984年、ネイチャー312巻337−3
42頁参照]、これらを発現させて組み替え体FVIIIを産生させる方法もま
た知られている[例えばWO37104187、WO38108035およびW
O38103558参照]。凝固促進活性FVI I I類似体及びこれらをコ
ードしているDNA配列もまた報告されている[例えばWO36106101お
よびWO37107144参照]。一般ニコのような類似体は、Bドメインの一
部または全てを欠いており、モして/または特定のアミノ酸の位置が、例えば通
常プロテアーゼに対し不安定な部位が例えばトロンビンまたは活性化蛋白Cによ
る蛋白分解に対して抵抗性となるように修飾されている。他の類似体は■または
それ以上のリジン及び/またはチロシン残基における修飾を含んでいる。
その理由はいまなお確定していないが、組み替え体FVIIIの発現は比較的低
いレベルで進行する。例えば燐脂質もしくは7オン・ウィルブランド因子(v
W F )またはこれらの類似体の存在下での発現[例えばWO8710418
7オよびWO88108035参照]、BiPとして知られる内生小胞体蛋白を
低レベルで発現する細胞中で17)FVlllの発現[例えばWO881035
58参照]ならびにFVIIIおよびその類似体のBドメイン内部での削除[例
えばWO35106101参照]、ノように、FVI I I及びソノ類似体の
低い発現レベルの向上の御坊となる様々な方法が開発されてきた。
因子V(FV)は、凝固カスケード中に含まれるもう一つの高分子糖蛋白補因子
である。人間のFV遺伝子はクローニングされ配列決定されている[例えばジェ
ニー等、1987年、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ・USA184巻4846−4850頁参照1゜その順序は互
いに異なっているものの、FVIIIおよびFVは、共に3個の「A」 ドメイ
ン、1個のrBJ ドメイン及び2個の「C」ドメインをコードしているDNA
によって発現される、ある共通の構成上の特性を持っており、これを下に模式的
に示す:1A=lL−IA=lL IA=lL−IQ=lf−二基]さらにFV
IIIにおいては、高度酸性ペプチド領域がA−2及びA−3に先行する。
また驚くべきことに、BドメインはFVIIIの凝固促進活性にとって重要では
ない事、また活性な凝固促進蛋白は、Bドメインの一部または全てをコードして
いるヌクレオチド領域を欠<FVIII暗号化DNAの発現によって発現され分
泌される事も発見されていた。活性蛋白は産生され分泌されるだけではなく、こ
れは完全な長さのDNAにより発現される場合よりも高いレベルで媒質中に蓄積
される。
媒質中の活性凝固促進物質FVIII蛋白のレベルが低下するのは、少なくとも
部分的には幾つかの因子に起因する[例えばWO37104187、WO871
0803ssよびWO88103558参照]。
本発明は、組み替え技術によって、より高収量で、モして/またはヒトFVI
I Iの組み替え体よりもより均質な形で生産され得るハイブリッド凝固促進蛋
白をコードする新規ハイブリッドDNAを提供するものである。さらに本発明の
蛋白は、より安定な凝固促進物質であり得、またはより安定な活性種を生じさせ
ることができ、そして天然FVIIIに対する抗体によって阻害されず、従って
このような抗体を用いた患者における出血疾患の処置に好ましい。
本発明のハイブリッド蛋白は、lまたはそれ以上のFVIIIドメインの一部ま
t;は全ての代わりに、FVの対応ポリペプチド部分を含む凝固促進活性または
凝固活性FVIII蛋白を含む。これらのハイブリッド蛋白をコードするDNA
は、緊縮条件下でFVlll、好ましくは人間の)”VI I Iをコードする
cDNA、及びFV。
好ましくは人間のFVをコードするcDNAとハイブリダイズすることのできる
、凝固促進または凝固活性(後に記載するような常套的検定により測定される)
を有する蛋白をコードするDNAを含む。
さらに、同義コドンが含まれなければこのようにハイブリダイズするであろうD
NAも勿論包含される。このDNAはさらにWO37107144に開示される
ように、例えば蛋白分解的開裂部位、硫酸化部位などをコードするlまI;はそ
れ以上の部位に於て、そして/またはBドメインをコードする領域の内部での削
除により、修飾することができる。このDNAはWO37107144に記載さ
れるように、対応するFVサイト以外でさらに修飾することができる。
対応するFVIII領域の代わりにFV Bドメインの一部または全てを含んで
いるこれらのキメラ遺伝子によりコードされるハイブリッドFVIII−FV蛋
白は、野生型FVIIIをもって典型的に得られるよりも高いレベルの発現を行
なうことができると考えられる。実際この事は、これまでに評価された事例に於
て真実であると思われる(例えば表II参照)。さらに、生成する蛋白は一本鎖
を(例えば特定の蛋白分解的開裂部位がさらに修飾されている場合)または二本
鎖蛋白として取得し得るということが考えられる。
後者の場合、この蛋白は、FvまたはFVI I IのBドメインの蛋白分解的
切断時におけるおよそ90kDおよび80kDのサブユニットの複合体として、
または、〜90kDから約200kDまでの範囲の重鎖を伴う〜80kDの軽鎖
サブユニットの複合体として得られると考えられる。全ての場合に於て、得られ
た蛋白は以下に詳細を記載するように、常套的凝固検定に於て凝固促進活性を保
持する本発明のDNA配列
本発明の一側面は、人間のFVIIIと実質的に等しいポリペプチド配列または
その変異体(FVIIIドメインの一部または全部をコードする1またはそれ以
上の部分を除いては、現在当分野で知られるまたは種々の特許出願に開示されて
いるように修飾されている)をコードするDNA配列を提供するものである。こ
のようなドメインの一つは、例えば、成熟N末端、Ala−1より始めた番号付
けでアミノ酸位置740から1649に至るBドメインをコードしている。修飾
された領域内に於てこのDNA配列は、人間のFVペプチド配列、好ましくはF
VIIIに於て修飾されているものに対応する配列に等しいまたは実質的に等し
いペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。このDNA配列の
残りは天然のヒトFVIIIをコードすることができ、または例えばWO361
06101もしくはWO87107144に開示されるように、ポリペプチド配
列の一部を除去するためのさらなる修飾、および/または、例えば例示的オリゴ
ヌクレオチド及び係る追加の修飾をもたらすための方法をも開示しているwo8
7107144に開示されるようなlまたはそれ以上の特定部位に於ける修飾を
含むことができるということが理解されるべきである。
本発明に係る変異体DNAは、対立遺伝子変異、即ち個体から個体への自然変異
性に基づく配列の変異、または因子VjIIxc型凝固促進活性を保持する他の
コドン置換もしくは削除を伴う変異をも含む。
従って本発明は、凝固促進蛋白をコードするDNA配列であって、そのDNA配
列が本明細書中に記載されるBドメインをコードする領域内で修飾されている限
り、緊縮条件下でpSP64−VI I Iに於ける野生型ヒ1−FVIII暗
号化cDNA挿入物(後に記載)とハイブリダイズすることのできる配列を包含
するものである。本発明のDNA配列は、緊縮条件下でヒトのFVcDNA、例
えばpMT2−V(ATCCNo、40515)におけるFV cDNA挿入物
とハイブリダイズすることもできる。
本発明のDNA配列の生成
本発明の全ての変異体DNAは、ヒトFVIIIをコードするDNA配列を修飾
することにより製造することができる。この変異体DNA配列は、ヒトの因子V
lll:cまたはその類似体をコードするDNA配列の常套的部位指向性突然変
異生成により、および/または所望のDNA配列をライゲーションする事により
、生成できる。
ヒトの因子VIII:cをコードするDNA配列がクローニングされた。この完
全な長さのヒトの蛋白をコードするcDNAおよび欠失類似体pDGR−2をコ
ードするcDNAは、それぞれ受理番号ATCC39812および53100の
もとでATCCに寄託されている。完全な長さのヒト因子VIII/c cDN
Aの製造および/またはヌクレオチド配列は、米国特許出願第546650号(
1983年lO月28日出願)および644086号(1984年8月24日出
願)並びに1985年5月9日に公開(公開番号W○85101961号)され
た国際特許出1[PcT/US84101641号に詳細が開示されている。完
全な長さのヒトFVIIIヌクレオチド配列を含む、pSP64−VI I I
と称される95264組み替えクローンは、受理番号ATCC39812のもと
でATCCに寄託されている。
完全な長さのヒトFV cDNAの製造及びヌクレオチド配列は、ジェニー等の
前記文献に開示されている。ジェニー等の上記文献に記載されているヒトFV暗
号化ヌクレオチド配列を含む哺乳類の発現ベクターはpMT2−Vと称され、受
理番号ATCC40515のもとてATCCに寄託されている。
遺伝学的操作を単純化するために、部位指向性突然変異生成により独自の制限サ
イトをFVIIIおよびFV cDNA中に作り出した。このような技術は1ま
たはそれ以上の塩基を置換または除去することにより特定の部位でcDNAを修
飾するためにも使用されている。このような突然変異生成法は、−末鎖DNAを
使用する、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ10巻6487−6500頁(19
82年);メソッズ・イン・エンゲイモロジ−100巻468−500頁(19
83年);及びDNA3巻479−488頁(1984年)に記載のシラー及び
スミスのM13系、並びにヘテロ二本鎖DNAを使用するモリナガ等、バイオ/
テクノロジー636−639頁(1984年7月)の方法を含んでいる。このよ
うな方法に従って使用される例としてのオリゴヌクレオチドを表Iに示す。本発
明に係る全ての変異体DNAは、組み立て例のために本明細書中に記載される方
法により当業者によって同様に生成できることが勿論理解されねばならない。
各々の因子をコードするcDNA中にM 1 u Iサイトを導入することによ
り、FVIII及びFV間のドメインの簡便な交換が達成された。M 1 u
IはこれらcDNAのいずれの内部をも切断せず、またベクターの基幹をも切断
しないため、導入された独自のM 1 uIサイトはFVIIIおよびFVのc
DNA間のドメインを意図した通りに交換することを助ける。当然このようなサ
イトが別のcDNAまたはベクターに存在する場合は、所望により係るサイトを
部位指向性突然変異生成によって移動させることができる。M I u 1の代
わりに他の独自の制限サイトも同様にして導入することができ、または天然に存
在する制限サイトを簡匣性のためになくすことができることは理解されるべきで
ある。加えてM I u IはDNA配列[5] ’−ACGCGT−[3’]
を認識するので、これはthr−argをコードするであろう。したがってM
I u Iサイトを特定の開裂サイト、例えばN末端残基がargであるトロン
ビン開裂サイトに導入することが可能となる。この事は、その部位における甚だ
しい配座の変化を避け、且つ生物学的活性に対する有意な妨害を避けるという希
望をもたらす。これまでの結果はこの目標に合致する。因子VおよびV[Iの間
のBドメインの交換を媒介するために導入された特定のM l u Iサイトは
、本発明のFVIII cDNAにおいてはペプチド位置739−740 (コ
ードされている配列−PR−を−TR−に変える)及び1647−1648 (
−QR−を−τR−に変える)に対応するヌクレオチド位置であり、本発明のF
V、cDNAにおいては708−709 (−1R−を−TR−に変える)及び
1544−1545 (−LR−を−TR−に変える)の位置である。部分的制
限地図はここに示すとおりである:XhoI Mlux Salx
Sal工 Mlul BstEIZ 5al工Sal工 BstEII −Ml
ul 、 Sal工したがって、FV Bドメインを伴うFVIIIをコードス
ル例示的DNAを組み立てるために、本発明者等は以下の図式を使用した。まず
、FVIII M]u190に発現ベクターをM l u Iおよび5ailで
消化してFVIII Bドメイン及び軽鎖暗号化領域を切り取った。FVIII
MluI80に発現ベクターを同様にして消化し、軽鎖をコードしているMl
ul−3a117ラグメントを単離した。このFV発現ベクターMIu174に
およf/Mlu I 94KをM l u TおよびBstEIIで消化してF
V Bドメイン暗号化DNAを2つに切断した。次いで、得られたDNAを下記
のようにライゲーションした:
0IC
Xho工 Mlux Sal工
FV 73ドメイン暗号化領域をFVIII暗号化配列の内部に正しり方向で含
んでいる、得られたベクターを同定し、pMT2−VI I IB5と命名した
。所望により、5′及び3’Bドメイン連結部の−T (R)−コドンは、常套
的位置指向性突然変異生成によって、それぞれ−P (R)−及び−L (R)
−コドンに戻し得、または他の任意の所望コドンにできることに留意すべきであ
る。
この工程はBドメイン暗号化領域以外の領域まI;はI領域の一部を交換するた
めに使用でき、また多数の交換を行なうl;めに反復することができ、そして所
望ならばもはや不要となったM l u Iサイトの介入的破壊(突然変異生成
による)を伴うことができる。別法として、多数(例えば4.6.8、等)のM
I u Iサイトを例えば出発ベクター中に作り出して、交換すべき多数の領
域を規定することができる。この場合、得られたベクターを綿密に分析して、全
ての交換がいかなる所望のドメインの喪失または方向変化もなく適正に起こった
ことを確認せねばならない。
Bドメイン交換の例は、本発明の一側面、即ち、M] u Iサイトのごとき簡
便な制限サイトを因子VIIIおよびVをコードするDNAの内部の異なったド
メイン間の連結部に導入すること、及び、このようなりNAをFVI I I−
FV融合蛋白をコードするハイブリッドDNAの組み立てに使用することを説明
するものである。ドメインの境界の定義には幾らかの融通性があるということを
理解すべきである。例えば、FVIIIのAlドメインはアミノ酸残基329及
び336の間にその3′境界を有する。FVIIIのA2ドメインの5′境界は
残基337及び372の間にあると定義される。
FVI I IA2ドメインの3′境界は残基698及び740の間にあると定
義される。FVIIIA3ドメインの5′境界は残基1689及び1721の間
であると定義される。ドメインの境界の定義における融通性は既に論じられてい
る。例えばベーア等、上記;ケイン及びディビー、1988、ブラッド71巻5
39頁;ジェニー等、上記、を参照されたい。*g!のため、ドメインの境界は
トロンビン、活性化蛋白Cまたは因子Xaにより媒介される開裂のサイトとして
頻繁に採用する。勿論本発明は1またはそれ以上のドメインの一部の交換をも包
含する。
本発明のある特別の態様の実施においては、FVIIIおよびFV暗号化DNA
中にM I u Iサイトを1またはそれ以上の以下のドメインの境界にまたは
その内部に作り出すことができる:FVIII:
A1 1 ココ9−336
人2 コア2−377 711−740B 740 1648
λ3 16B9 2019
C12?y2o 2172
c2 21フ3 23コ2
t9酸↑生ドメイシ 336 コツ2
畢そ鎖酉賢・rニドメイン 1649 1689Fv:
Al l 303−317
A2 303−317 656−663B 7os 1545
Aコ 1545 1877−1883
C11日77−188コ 2oコロ
* アミノ酸番号は完全なFVIIIまたはFVポリヌクレオチドについて表示
する。
したがって別のドメイン交換の一例として、FV A2ドメインを、同様に生成
されたハイブリッドDNAの発現により、FVIII A2ドメインの代わりに
挿入することができる。例えばM I u!サイトはFVIIIおよびFV発現
ベクター中、A2ドメインの5′及び3′境界に作り出すことができる。次いで
M 1 u !フラグメントをこのベクターから切取り、FV A2暗号化領域
をFVII■発現ベクターにライゲーションすることができるが、このベクター
からは、FVIII cDNA中に導入されたM] u Iサイトの位置により
FVIII重鎖酸性領域を保存しつつまたは保存せずに、対応するA2暗号化領
域が切り取られである。
DNA交換の他の例は、lまたはそれ以上のFV DNA領域を、非対応領域の
代わりにFVIII DNA中に挿入、例えばFVIII AlドメインをFV
A2ドメインと置換することを含む。
Bドメインの全体まj;は一部の交換の外に特に興味深いのは、FVll1重鎖
の中及び軽鎖C2ドメインの中の特定の面領域に対する修飾である。C2ドメイ
ン中、最もC末端のtoo−200のアミノ酸残基内における修飾がとりわけ興
味深い。重鎮に対する修飾は、天然の配列FVIIIに比較して、より高い収量
で生産されるFVIII変異体を提供し、一方、重鎮及び軽鎖の両領域における
修飾は、ある「阻害」患者においてはFVIIIに対する抗体との交叉反応を受
けにくいFVIII変異体を提供する。
より詳細なFVIII重鎖及び軽鎖の図式的表示を下に示すが、ここで、特定の
ドメインに名称を付け、酸性領域を斜線で示し、連結部のC末端アミノ酸位置を
特記した:1銀 ・
ドーーーーーーーー人1−−−−−−−) V///ドー−−一一一λ2−−−
−−−−−>I\\\\\1軽頷
1 //// l <−−−−−−−一人3−−−−−−−>l<−−−C1−
−>l<−−C2−−−>1したがって、本発明に係るDNAおよび蛋白種は、
A11A2、A3.CIおよびC2ドメインの1またはそれ以上が全体または部
分的にFV由来の対応配列に置換されている態様を含む。FVIIIおよびFV
のドメインの対応は当分野で良く知られており、例えばケインおよびディビー、
1988、ブラッド71巻(3):539−555頁にかなり詳細に示されてい
る。
例えばFVIIIの重鎮ドメインの一部が対応するFV配列に置換されている態
様において、この置換はFVIII領域の1−225.226−372.336
−562および/または562−740の位置であり得る。FVI I I軽鎖
における部分的ドメイン置換を含む態様においては、この置換はFVIIIの1
648−172111689−2020.2020−21738よび/または2
173−2332の位置由来の領域内であり得る。本発明のある態様は、重鎮及
び軽鎖の両領域でこのように修飾される。天然のFVIII配列の置換に用いら
れるFV配列の領域は、対応するFVII■領域より長いことも短いこともあり
得るということは認識されるべきである。この事は、例えばケインおよびディビ
ー、1988、上記、の第4図から明らかである。所望の変異体をコードするD
NA配列をMlul(例えば)制限フラグメントのライゲーションにより生成す
るか、部位指向性突然変異生成によるか、またはその両者の組合せによるかは、
通常、簡便性により決定する。
このドメイン交換工程が所望の発現ベクター以外のベクターにおいて行なわれる
場合は、本発明の変異体をコードする新しいDNA配列を、突然変異生成ベクタ
ーから切取り、好ましくは哺乳類の細胞において発現のt;めの適当なベクター
中に導入することができる。
一時的にトランスフェクトされた、または永続的に形質転換された宿主細胞によ
りもたらされた凝固促進活性は、血漿試料に対する標準検定によって測定できる
。
表1: オリコ”スフレ2チド。lI>’J名季生 ψ 西乙シ・」 ・象 罠
5craan 740 2. 5噌(TTG AAA CTCGTA ccr)
3 I 会(1)Scraan 1648 4. 5’(GCCATA CGC
GTG 入入入)]’ *(3)6、 51(入GA GCk CGCGTA
GCT)3′ 慟(5)Screen:372 8.5’(CCAAACGCG
TTCAGT)3’ *(7)Scr@en 226 10.5’(入TCTA
CGCG TGCCTG)3’ 会(9)Screen 336 12.5’(
CCA AACGCG TAT GAA)31 会(11)Scraan 56
2 14.5’ (GTA GAT ACG CGT GCA)コ書 會(lコ
)Screen698 16.5’(TCAGACACGCGTAAC)3’
”(15)Screen 1313 20.5’(CGT AGT ACG C
GT GCT)3” 慟(19)Screen 1721 22.5’(TAA
GAA CGCGTG CTC)コ轡 會(21)Scraan 2020
24.5’(ACA GCA CGCGTT GTC)コツ 會(2コ)Scr
een 217:l 26.5’(GAT TrA ACG CGT TGC)
3’ 會(25)[第V内シ]
鶴 見刈 ・勘策
Sen 709 2L 5’ (kGG AACGCG TTCATT):l’
☆(27)S(:n154530.5+(TACACGCGTAGCAA)]
’ *(29)sen コ48 コ2. 入A AAA ACG CGT ’r
CT CAG *(31)Scn 506 コ4. GGA CACGCG T
GG AAT 倫(3コ)Scn 505 36. CCT GACGCG T
CG AG *(コ5)Sen 1018 3B、TAT CTA CGCGT
A CCT ☆(3))ScN 1765 40. T TCT ACG CG
τ CTCAC*(コ9)Sen コD 42. G AAA ATTACG
CGT GAGC会(41)Sen 64] 44+ CTAGTACGCGT
AGCA 会(4コ)Scn 187B 46. GGACACGCGTTGT
AG *(45)Scn 203フ 4B、GGTAACGCGTl”GTTC
會(4))* 括弧内に示されたオリゴヌクレオチドにつし1て起こった突然変
異生成のスクリーニングに使用。置換アミノ酸番二対するコドンに下線を付しで
ある。当業者には認識できるであろう力(、オリゴヌクレオチドにおいて各々1
まj;はそれ以上のコドンを除去すること(こより、まt;は、所望アミノ酸に
対するコドンを置換することにより、lまたはそれ以上のアミノ酸の除去におけ
る使用のため、まブこi1異なる(置換)アミノ酸を所望の部位に挿入するtこ
めに、第1ノゴヌクレオチドを容易に組み立てることができる。変更したし1元
のコドンの置換まt;は除去によって、他の突然変異生成オリゴヌクレオチドが
、所望のサイトに至るおよそ20−50ヌクレオチド配列を基礎として設計でき
る。
本明細書中に記載する真核細胞の発現ベクターは当業者に良く知られる技術によ
って製造できる。微生物のレプリコン、選択遺伝子、くエンハンサ−、プロモー
ター等のようなベクターの構成要素は天然の供給源から取得、または既知の方法
により合成できる。カウフマン等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー159巻601−621頁(1982年):カウフマン、グロシーディング
ズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシダ82巻689−693
頁(1985年)を参照されたい。本発明の変異体の製造に有用な真核生物の発
現ベクターは、さらに当分野で知られる誘導可能なプロモーターを含み、または
誘導可能な発現系を含み得る。
形質転換されt;セルラインを含む確立したセルラインは宿主として好適である
。正常な二倍体細胞、−次組織のインビトロ培養から誘導される細胞株、そして
−次外植片(造血幹細胞のような比較的未分化の細胞を含む)もまた適当である
。選択遺伝子が優位に働いている限り、候補となる細胞は遺伝子型のうえで選択
遺伝子を欠失している必要はない。
宿主細胞は好ましくは哺乳類のセルラインで確立する。ベクターDNAを染色体
DNA中に安定に統合するため、そしてその統合されたベクターDNAを引続き
増幅するためには、共に常法により、CHO(チャイニーズ・ハムスターの卵巣
)細胞が現在では好ましい。別法としてベクターDNAはウシ乳頭腫ウィルスゲ
ノムの全体または一部を含むことができ(ラスキー等、セル、36巻391−4
01頁(1984年)、安定なエピソームの要素としての0127マウスの細胞
のようなセルラインに導入することができる。その他の使用可能な哺乳類のセル
ラインは、He L a sサルのCO5−1細胞、ポウニス(Bowes)細
胞のような黒色腫セルライン、マウスL−929細胞、スイス、Ba1b−cま
たはNIHマウス由来の3T3ライン、BHKまたはHaKハムスターセルライ
ン等を含む。
いずれの型の発現ベクターを使用する場合でも、変異体FVIII DNAをv
WFまたはその類似体をコードするDNA配列と共に、または燐脂質の存在下で
、例えばWO37106101およびwo88108035に記載のように同時
発現させるのが好ましい。
サラニ、アプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤を例えば約〜0゜Ol−〜5
%、好ましくは0.5−1.0%(容量/容量)(アプロチニン、15−30)
リプシン阻害剤単位(TIU)/ml、シグマ)の量で、または、他のプロテア
ーゼ阻害剤の対応する活性単位量を含有する培地中で、蛋白を発現させるのが好
ましい。
標準的免疫学的または活性検定により、安定な形質転換体を凝固促進産物の発現
についてスクリーニングする。凝固促進蛋白をコードしているDNAの存在は、
サザン・プロッティングのような標準的手法により検出できる。サルCO3−1
細胞のような適当な宿主細胞中への発現ベクターDNAの導入後数日間における
一時的な凝固促進遺伝子の発現を、選択せずに培地中の蛋白の活性または免疫学
的検定により測定する。
常套的手段により変異体DNAを発現させた後、こうして産生された蛋白を、全
て既知の方法により、回収し、精製し、そして/または物理化学的、生化学的、
及び/または臨床的特質について特性決定することができる。
本発明の蛋白は、ヒトの因子VI I I :CまたはFVに対する適当なモノ
クローナル抗体と結合するはずであり(即ち、認識されるエピトープが所望の蛋
白に存在する場合)、よってこのような抗体を用いる免疫親和クロマトグラフィ
ーによって、及び/または常套的なFVIII精製法によって回収及び/または
精製することができる。そのうえこれらの化合物は凝固促進活性を有するはずで
ある。
本発明にしたがって生産された蛋白は、薬学上許容し得る、例えば非経口的に許
容し得る媒質、及び/または1またはそれ以上の賦形剤と共に、当分野で知られ
る方法を用いて、薬学上許容し得る製剤に製剤化することができる。
非経口投与に好適な、このような薬剤は、簡便性のために該蛋白の滅菌凍結乾燥
調製物を含有させることができ、これは滅菌溶液の添加により再構成されて好ま
しくは被投与者の血液と等張な溶液を生成することができる。製剤は、単位また
は複数用量容器、例えば封入されたアンプルまたはバイアルで与えられ得る。こ
れらの使用はヒト因子VIII(またはlもしくはそれ以上のFV Aおよび/
またはCドメインが存在する場合はFV)と同様であるが、力価を考慮して適当
に調整する。
本発明は以下の説明的実験例および手法を参考に、より良く理解できるであろう
が、これらは純然たる例であり、本発明の真の範囲を限定するものと解してはな
らない。
プラスミドの由来
A、FVI工I
異なったベクターの間で配列が混ざってしまう不都合を最小限にするため、因子
VIII cDNAの突然変異生成を、発現プラスミド中で直接実施した。一般
に突然変異生成のI;めに取られる研究方法は、修飾を施したモリナガの方法か
ら導かれたものであった。
この研究法は、因子VIII発現プラスミドにおいて都合のよい独自の制限サイ
トを有するプラスミドの組み立てによって容易となる。
以下に、独自のEcoRV、HpaI、CIaIおよびXbaI制限サイトを有
する因子VIII発現プラスミドの組み立てを説明する。プラスミドpMT2は
、受理番号ATCC67122の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
シコンに寄託されているpMT2−VWFのEcoRI消化によって得られる。
EcoRI消化はpMT2−VWFに存在するcDNA挿入物を切り取り、線状
のpMT2を生成し、これをライゲーションして、大腸菌HBIO1またはDH
−5をアンピシリン耐性に形質転換するのに使用することができる。プラスミド
I)MT2のDNAは常法により製造できる。次に、pMT2をEcoRVおよ
びXbaIで消化し、この消化されたDNAをDNAポリメラーゼIのタレナラ
フラグメントで処理し、そしてClaリンカ−(NEバイオラブズ、CATCG
ATG)をライゲーションすることによって、pMT2VIIIを組み立てた。
この事により、SV40複製起点付近のHindIIIサイトから始まる塩基2
171−2421及びpMT2のエンハンサ−配列(pMT2のC]aI誘導体
)が除かれる。因子VIIIcDNAを5alTでpsP64VI I Iから
切取り、T4DNAポリメラーゼで平滑化し、そしてEcoR1アダプターを付
加した(AATTCCTCGAGAGCT)、次いでEcoR1適合化因子Vl
ll cDNAを、pMT2のCIaI誘導体のEcoRエサイトにライゲーシ
ョンした。得られたプラスミドをpMT2−VIIIと称する。
B、FV
FV cDNAの突然変異生成を、発現ベクター及びクローニング往復ベクター
の両方で実施した。この突然変異生成方法は、モリナガ、上記より修飾を施して
導いた。
FVの発現に使用する発現ベクターはp M T 2誘導体でもあっt;。
プラスミドpMT2 DNAはpMT2−VWF (ATCC67122)から
、既に記載しI;ように線形で取得した。次にEcoRIサイトを、5alIサ
イトを含むアダプターへのライゲーションにより修飾した(下記参照)。次いで
EcoRVおよびXbaIにより消化し、この消化されf: D N A t−
D N Aポリメラーゼエのタレナラフラグメントで処理し、モしてC1alリ
ンカ−をライゲーションすることにより、p M T 2のC1al誘導体を組
み立てた(N。
E、バイオラブズ、CATCGATG)。このことにより、pMT2 SV40
複製起点の初期サイドにおけるH4ndIIIサイトから右回りに番号を付けて
2267−2421の塩基、及びエンハンサ−配列が除かれる。
FV cDNAは、オリゴdTをプライマーとして付けたヒトの胎児肝cDNA
ライブラリーから誘導されたFV cDNAの一部をそれぞれ含む2個の重複す
るカロン21Aλ組み替え体から組み立てた(ジェニー等、上記参照)。
以下の手法を用いて完全な長さのcDNAを組み立て、並列するDNA配列を除
去した。λV401クローンを5acIIで消化してFV cDNAを除き、こ
れを5ac11線状化ブルースクリプ1−KS (+)クローニングベクター(
ストラタジーン)にライゲーションし、プラスミド401B5−6を得た。Hh
alで消化(FV cDNAにおけるヌクレオチド41)L、DNAポリメラー
ゼIのタレナラフラグメントで処理し、そして次にBglIIで消化(FV c
DNAにおけるヌクレオチド4275)することにより、401B5−6からλ
DNA配列を除去した。これにより、並列するλ配列を持たない4234bp平
滑Bgll17ラグメントが得られた。この4234bpフラグメントをライゲ
ーションによってブルースクリプトKS (+)のEcoRVおよびBamHI
クローニングサイトの中に挿入して、プラスミドBlu401を生成させた。
^vlの5acII消化により、λv1クローン中のFV cDNAを除去した
。次いでこのSac 117ラグメントを線状化5acllブルースクリプトK
S (+)クローニングベクターにライゲーションしてプラスミドVIBSIO
を得た。次にVIBSIOをHpalで消化(FV cDNAにおけるヌクレオ
チド6854)し、以下のEcoRI修飾アダプター:にライゲーションして、
プラスミドBluVl−R1を得た。
完全な長さのFV cDNAを含む発現ベクターの組み立てには、3個の制限サ
イトが重要であった。ブルースクリプトKS(+)のポリリンカークローニング
領域中の5allサイトは、Fv CDNA配列の5″にある独自の5alIサ
イトを提供する。さらに、Blu401及びBluVl−R1の両プラスミドに
存在するFVcDNAには独自のBstEIIサイト(ヌクレオチド3666)
もある。独自の5allサイトは、BluVl−R1の3′末端に導入されたE
coRI修飾アダプターの添加から得られる。
組み替え体Blu401はFV eDNAの5′末末端列に貢献し、一方BIu
V1−R1は無傷のcDNAの3′末端を含んでいる。pMT2誘導体、B]u
401及びBIuVl−R1由来の3個の制限7ラグメントを、トリス酢酸塩中
1%の低融解温度アガロースゲル上の電気泳動で精製した。3625bpSa
] l−Bs tElfフラグメントの単離は、汚染し同時拡散した7ラグメン
トを際くためのXMNIによる消化によってもまた促進された。pNT2発現ベ
クターは5all消化により線状化し、付いて子牛の腸のホスファターゼで処理
した。3個の7ラグメント: (i)3625bp 5alI/BstEII
B]u401フラグメント、(ii)3188bp 5ail/BstEII
Blu Vl−R1フラグメント、及び(iii)SalI消化pMT2、をラ
イゲーションして発現プラスミドpMT 2−Vを生成し、これを受理番号40
515の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。
完全な長さのFV cDNAを含む第二のプラスミドをブルースクリ、ブトKS
(+)において組み立てた。B1u401を5acII (ブルースクリプト
クローニングポリリンカーの3′サイト)およびBstEII(FV cDNA
におけるヌクレオチド3666)で消化した。ブルースクリプトベクター配列お
よびFV cDNAの5′末端から始まりBstEIIサイトに至るFV配列の
3625bpフラグメントを含むこのフラグメントを単離した。BluVl−R
I DNAをBstEII(ヌクレオチド3666)およびSa l I (E
coRI修飾アダプターの3′)で消化して、FVcDNA配列の3′末端を含
むおよそ3900bpの7ラグメントを解放した。このフラグメントはλDNA
配列を尚含んでいるため、正確な大きさは明らかでない。BstEII/5ac
lI Blu401およびBstEII/5aclI Btu Vl−R1をラ
イゲーションしてプラスミドBluVを生成した。
BluVの5alI消化によりλDNA配列を除去し、5al17ラグメント上
に含まれる無傷の完全な長さのFV cDNA (6813bp)を単離した。
ブルースクリプトKS(+)を5all消化により線状化し、子牛の腸のアルカ
リホスファターゼで処理し、そして完全な長さのFV cDNAを含む5al1
7ラグメントにライゲーションした。B l uKSV△λと命名された得られ
たプラスミドは、λ配列の全く無い完全な長さのFV cDNAを含む。
突然変異生成
(1)以下のDNA調整物を用いて突然変異生成を実施した。プラスミドpMT
2−VI I IをCIaIで線状化し、子牛の腸のホスファターゼで処理し、
そして低融解温度トリス酢酸塩アガロースゲル上で分離した。次いで線状化DN
Aのバンドを、シリカジオキサイドへの吸着により抽出し、トリスEDTAで溶
出するか、またはフェノール抽出及びエタノール沈澱により抽出した。pMT2
−VIIIの第二のロットをKpnl−XhoI、Kpnl−Ec。
RVまたはEcoRV−XbaIで消化し、このDNAフラグメントを低融解温
度アガロースゲル上での電気泳動により分離し、上記のように抽出した。プラス
ミドpMT2−VをNheIで線状化し、子牛の腸のホスファターゼで処理し、
低融解温度トリス酢酸塩アガロースゲル上の電気泳動により分離した。この線状
化したDNAバンドをフェノールで抽出しエタノール中で沈澱させた。このDN
AペレットをトリスEDTA中に再懸濁した。pMT2−Vの第二のロフトをA
paIおよびDra I Iで消化し、このDNAフラグメントを低融解温度ア
ガロースゲル上で分離し、上記のように抽出した。プラスミドB ] uKSV
をSac I Iで線状化し、子牛の腸のホスファターゼで処理し、このDNA
を低融解温度アガロースゲル上の電気泳動により分離した。B I uKSVの
第二のロフトをEcoRVおよびsph Iで消化し同じ方法で分離した。DN
A7ラグメントは記載したようにフェノールで抽出した。
(2)適当なプラスミド各jugを混合し、容量を18ulに調節し、2NNa
OH2,Ou lを加えた。
(3)この混合物を室温で10分間変性し、次いで0.02NHC1、およびO
,IMトリスHCI (pH8,0)の溶液180u 1で中和した。
(4)燐酸化した突然変異誘発性オリゴヌクレオチド20ピコモルをヘテロ二本
鎖混合物40u1に加えた。
(5)この混合物を68℃のヒートブロックに90分間装いた。
インキュベージコン後、混合物を室温で徐々に冷却させた。
(6)各々の突然変異誘発反応に対し、ヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド混合物
40u1を使用した。この反応は、2mMMgCI8.1mMβ−メルカプトエ
タノール、400uM ATP、1100uデオキシヌクレオチド三燐酸、大腸
菌DNAポリメラーゼIのフレナラフラグメント3−4単位/ul及びT4DN
Aリガーゼ400単位/ulで行なった。
(7)反応物を室温で10分間インキュベートし、16℃に変えて一夜インキユ
ベートした。
(8)7zノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により反応を停止させ
、得られたベレットを70%エタノールで洗浄し、滅菌水10u】中に再懸濁し
た。
(9)次いでDNAをコンピテントな細菌HBIOIまたはDH−5の形質転換
に使用した。5xSSC,0,1%SDS、5xデンハート試薬、及び1100
u/m+の変性鮭***DNA中の1x10’cpm/mlのs!P標識化スクリ
ーニングオリゴヌクレオチドを用いて、アンピシリン耐性コロニーをスクリーニ
ングした。
(10)算出されたオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より5度低い温度で
、フィルターを5xSSC,Q、1%SDSで洗浄した。
(11)確実にハイブリダイズしているクローンからDNAを調製し、まず異な
った制限酵素による消化及びアガロースゲル電気泳動によって分析した。DNA
をニトロセルロースに移しフィルターを調製し、突然変異生成オリゴヌクレオチ
ドが正しいフラグメントに導入されたことを確認するためにスクリーニングプロ
ーブとハイブリダイズさせた。
(12)次いでDNAを大腸菌に再導入し、アンピシリン耐性コロニーをスクリ
ーニングオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについてスクリーニン
グした。
(13)DNA配列決定により最終的な突然変異を確認した(例えばサンガー等
、1977、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズUSA、74巻5463−5467頁)。
実験手法及び検定方法
本発明のハイブリッドDNAでトランスフェクトさせたCO5−1サル腎臓細胞
による一時的な該蛋白の発現によって、FVIII−FVハイブリッド蛋白の活
性を分析した。CsCl中でDNAをバンド化することによりプラスミドDNA
を調製し、記載したようにCO3−1をトランスフェクトさせるのに使用した(
カウフマン、1985、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシズUSA、689頁)。トランスフェクトの60時間後に、条
件設定した培地をFVIIIまt;はFV活性検定用に取った。FVIIIは、
カビ・コーチスト(coatest)色素産生検定法(カビ)により、または、
トロンビン活性化の前及び後のFVIII欠損血漿の凝塊形成能(活性化部分的
トロンボプラスチン時間、APTT)により検定する。FVはトロンビン活性化
の前及び後のFV欠損血漿の凝塊形成能(APTT)によって検定する。変異体
分子の合成及び分泌を分析するために、そしてM l u 1制限サイト(Th
r−Ar g)の導入がいかなる突然変異した開裂サイトにおける開裂をも変
えていないことを確認するために、トランスフェクトされた細胞をトランスフェ
クトの60時間後に6時間3$3−メチオニンで標識し、条件設定した培地及び
細胞抽出物を調製して、抗FVIIIまたはFV特異性抗体を用いる免疫沈降及
び5DS−ポリアクリルアミドゲル上における沈降物の電気泳動によって分析し
た。
実施例
実施例1:90kDa FVIII開裂サイトの変更因子VIIIの90kDa
開裂サイトの突然変異生成を、pMT2−Vlll由来のKpn−EcoRVl
o、lkbフラグメント及びC1al線状化pMT2−VIII DNAを間隙
へテロ二本鎖の生成に用いた、記載(モリナガ等、バイオテクノロジー84巻6
36−639頁)されるような間隙へテロ二本鎖法により実施した。突然変異生
成オリゴヌクレオチドは表工のNo、lであり、スクリーニングオリゴヌクレオ
チドは表Iの15量体 No、 2である。得られた変異体が正しいことをDN
A配列決定(サンガーら、1977、PNAS74巻5463頁)により立証し
た。得られるDNA (Mlu I 90K)は、CsCl中での平衡に対して
バンド化することにより調製し、上記のこと<CO5−1細胞中にトランスフェ
クトした。355−メチオニン標識化細胞抽出物及び条件設定しI;培地の免疫
沈降及びゲル電気泳動による分析は、合成された因子VIIIが野生型因子VI
IIと大きさ及び量の上で似かよっており、そしてトロンビンによって適正に開
裂することを示した。カビ−コーチスト活性検定によって測定されるように(表
II)、この突然変異生成は因子VIIIの活性に影響を及ぼさなかった。
実施例I T : 80kDaの因子VIII開裂サイトの変更C1al線状化
pMT2−VIII DNAおよびpMT2−VIIIのEcoRV−Xbal
9.2kbフラグメントを用いて間隙へテロ二本鎖を製造することにより、8
0kDa開裂サイトの突然変異生成を実施した。突然変異生成オリゴヌクレオチ
ドは表IのNO33であり、スクリーニングオリゴヌクレオチドは表IのNo、
4である。得られた変異体が正しいものであることを上記のDNA配列決定によ
り立証した。得られるDNA(Mlu180K)を調製し、上記のごと<CO3
−1細胞中にトランスフェクトした。
カビ−コーチスト法による分泌されたFVIII活性の分析ならびに515−メ
チオニン標識細胞抽出物及び条件設定した培地の免疫沈降及びゲル電気泳動によ
る分析は、この因子VIIIが適切に分泌され、トロンビンにより開裂され、且
つその補因子活性の点で変わっていないことを証明した(表II)。
実施例I11:FVIIIにおける73kDa開裂サイトの突然変異生成
表Iの44量体オリゴヌクレオチドNo、5及び表Iのスクリーニングオリゴヌ
クレオチドNo、6を利用して、実施例IIに記載のように突然変異生成を実施
した。得られf:DNA (M I u 173k)が正しいものであることを
DNA配列決定により立証した。この得られたDNAを前記のようにC03I細
胞にトランスフェクトした。合成された蛋白は、因子Vlll活性及び発現レベ
ルの両方の点て野生型FVI I Iと類似していた(表II)。
実施例IV:94kDa因子V開裂サイトの突然変異生成p M T 2 Vの
Nhe I/Apa I I 0.2kbフラグメント及びDraIlll、8
kb線状化pMT2Vをもって調製した間隙へテロ二本鎖を使用して、因子Vの
94kDA開裂サイトの突然変異生成を実施した。突然変異生成オリゴヌクレオ
チドは表■の43量体NO,27及び表■の15量体スクリーニングオリゴヌク
レオチドNo、28であった。得られたDNA (Ml u I 94K)が正
しいことをDNA配列決定により確認し、前記のようにCO3−1細胞にトラン
スフェクトした。得られた分泌された蛋白は、トロンビン活性化前及び後の因子
V凝塊形成検定により、そして細胞の5ss−メチオニン標識による因子Vの合
成及び分泌の分析により、そして免疫沈降させた因子Vの5DS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による細胞抽出物及び条件設定された培地の分析により測定
されるように、野生型因子Vと量が似かよっていた。
実施例Vニア4kDa因子V開裂サイトの突然変異生成り ] uKSV△λの
EcoRV−3ph19.Okbフラグメント及び5ac19.8kb線状化B
1uKSV△λをもって間隙へテロ二本鎖を調製することにより、そして突然変
異生成オリゴヌクレオチド(No、29、表I)及び15量体スクリーニングオ
リゴヌクレオチド(No、30、表工)を使用して、前記のように突然変異生成
を実施した。得られたDNA (Ml u I 74K)が正しいものであるこ
とをDNA配列決定により確認した。
実施例VI:FV Bドメインを有するFVI I IをコードしているDNA
の調製
以下の手法を用いて因子VIII/因子Vのハイブリッドを組み立てた。因子V
III発現プラスミドMluI90Kを5allおよびM I u Iで消化し
、大きな7.2kb7ラグメントを低融解温度アガロースゲル上の電気泳動によ
り単離した。因子VIII発現プラスミドMIu180KをM l u Iおよ
び5a11で消化し、小さな2.3kbフラグメントを低融解温度ゲル上の電気
泳動により単離した。因子VBドメインは2個の7ラグメント:l)プラスミド
M1u174KをM l u IおよびBstEIIで消化して因子VBドメイ
ンの1.1kb3′末端を得る、モして2)プラスミドMIuI94KをMl
u IおよびBstEIIで消化して因子VBドメインの1.4kb5’末端を
得る、から組み立てた。これらのフラグメントは低融解温度アガロースゲル上の
電気泳動後に単離した。
′ ハイブリッドを低融解アガロース中で上記7ラグメントの4方向ライゲーシ
ヨンにより組み立てた。大量の制限エンドヌクレアーゼ消化及びゲル電気泳動分
析により、そして因子V−因子VIII連結部前後の配列決定により、このハイ
ブリッドが正しく組み立てられたことが立証された。得られたDNA、pMT2
−VI I lB5t−CO3−1細胞にトランスフェクトし、下記のごとく分
析した。
因子VIIIの活性をカビ−コーチスト検定法により測定した(表II)。対照
実験において野生型因子VIIIを二本鎖分子として発現させ分泌させる。因子
Vは一重鎖ポリペプチドとして分泌され、FVI I ll7)10−40倍高
いレベルで発現される。このハイブリッドは、恐らくは細胞からより効率的に分
泌される結果としてであろうが、野生型FVI I 1蛋白の2−4倍高い活性
を示した。3@s−メチオニン標識した条件設定した培地の分析は、ハイブリッ
ド蛋白が因子Vよりわずかに小さな見かけの分子量(およそ3’00kDa)を
有して拡散する一末鎖ポリペプチドとして分泌されることを示した。適当な開裂
産物が、電気泳動に先立つトロンビン消化によって得られた。さらに、このハイ
ブリッドは因子Vlllの重鎮に特異的なモノクローナル抗体によって、そして
因子VのBドメインに特異的なモノクローナル抗体によって免疫沈降し、この事
は、この蛋白が正確に折り畳まれていることを示唆した。
実施例VII:FV軽鎖にょるFVIII軽鎖の置換プラスミドM l u I
90 Kを5alIおよびEcoRVで消化し、8.9kb因千Vll1重鎮
をコードする7ラグメントを単離する。
因子Vlll BドメインをMl u 18よびEcoRVによる消化によりM
l u I 80 KまたはMlu173Kから単離し、各々1178及び1
054bpの7ラグメントを単離する。2.OkbM]aI−5a11因子V軽
鎖をコードするフラグメントをM 1 u 174Kから単離する。標準的技術
によりこのフラグメントを3方向ライゲージ履ンで組み立てる。これによって、
もし1178bpフラグメントを使用すれば因子VIIIの軽鎖の酸性領域を含
むハイブリッドが得られ、また1054bpフラグメントの使用によっては該酸
性領域を欠くハイブリッドが得られるであろう。
実施例VIII:FV重鎖によるFVIIIの重鎖の置換FVlllのBドメイ
ン及び軽鎖をコードする〜9.9kbXhol−MIu17ラグメントをM1u
I90Kから単離し、〜2゜3kb Sall−Mlul FV重鎮暗号化フラ
グメントをM1u194Kから単離する。これらをライゲーションしてプラスミ
ドVIIIHCVを生成し、これをCO3−1細胞にトランスフェクトし、3s
S−メチオニン標識した条件設定した培地の免疫沈降によって分析した。このハ
イブリッドは、CO5細胞により同様に産生される野生型FVIIIの〜20−
50倍高いレベルで、−末鎖ポリペプチド及び二本鎖ポリペプチド種の両者とし
て分泌される。
酊・う程闇、粧
第Vエエエロ5化狂;
二 1.Xl2JL −ム剋
p町2−V + + + −
pMT2−Vエエエ 52 40 218 166pMT2−V工llB5 i
ll 79 42B 284M1u工90X ND 30 NO130,146
M1u工EIOX ND 30 ND 160.176M1u工7コX ND
35 ND 95. 120箪V(ト)5滉性:
旦ΩJ1
pMT2−V 1051
05O工941K B75. 850
M1uエフ4K 900.650
実施例IX:FV軽鎖によるFVIII軽鎖の置換プラスミドM ] u I
73 KをM I u Iおよび5ai1で消化して〜10.1kb FVII
I軽鎖をコードするフラグメントを切り取る。プラスミドM l u 174
KをM I u Iおよび5alIで消化して〜2045bp FV軽鎖を切取
り、次いでこれを単離し、MluI/5all消化M l u 173 Kプラ
スミドDNAとライゲーションする。得られたプラスミドは、FVI I I重
鎖、FVIIIBドメイン、FVIII軽鎖酸性領域及びFV軽鎖を含むハイブ
リッド蛋白をコードしている。もしM 1 u I 80 Kの代わりにMlu
180Kを使用すると、酸性領域を伴うFVIII軽鎖をコードする〜9.95
kbフラグメントが切り取られる。したがってハイブリッド蛋白はその酸性領域
を欠くであろう。
実施例X:FVの対応する要素によるFVIII軽鎖及びBドメインの置換
一組の重複する合成オリゴヌクレオチドを製造し、燐酸化し、ライゲーションし
て以下の合成りNAを生成する:コ(’) 合RD N A ハ、FVIITの
80及び73kD開裂ザイトの間に存在する酸性領域をフードするM I u
1カセツトを表わす。別法として、実施例IIおよびIIIに個別に記載したよ
うに、Mlulサイトは表Iのオリゴヌクレオチド#3および#5を用いてFV
III発現ベクターの80及び73kDサイトに導入することもできる。次いで
、対応するカセットをM l u Iによって単にベクターから切り取ればよい
。次にこのカセットを、実施例VIでM I uI74Kから単離したM I
u I / B s t E I Iフラグメントにライゲーションし、そして
、部分的FV Bドメイン暗号化7ラグメントに対し正しい方向にライゲーショ
ンされたFVI I I酸性領域暗号化7ラグメントを含む得られたM I u
Iフラグメントを単離する。
次いで実施例Vlの方法により、このフラグメントを、M1uI90にのSa
] I/Ml u Iフラグメント、M l u I 94 KのM I u1
/BstEIlyラグメント(共に実施例VIにおいて取得)、及びFV軽鎖を
コードするM l u 174 KのMIuI/5a11フラグメントにライゲ
ーションする。このハイブリッドが正しく組み立てられていることを実施例Vl
のようにして立証する。得られるDNA、pMT2−VI I IB5/LC5
は、N末端からC末端の順に、酸性領域を伴うFVIII重鎖、FV Bドメイ
ン、FVIII軽鎖由来の酸性領域、及びFV軽鎖を含むハイブリッド蛋白をコ
ードしている。
実施例XI:FVIII Bドメインの除去及びその軽鎖のFV軽鎖による置換
実施例Xを以下の修飾を施して反復する。FVIII軽鎖酸性領域をコードして
いるM I u Iカセットを、MIuI/5alI消化MLuI90K FV
IIIプラスミド、及びFV軽鎖をコードしているM l u I 74 Kの
MluI/5alIフラグメントに直接ライゲーションする。正しく組み立てら
れたハイブリッドcDNAは、FVIII軽鎖から誘導された酸性領域によりF
V軽鎖と連結したFVIII重鎖を含む蛋白をコードしている。
実施例XII:A2、B、A3、CIおよびC2FVIIIドメインの置換
A、FVIII軽鎖酸性領域をコードするM I u Iカセットを、FV B
ドメインのC末端部分をコードするBstEII/MluI FVフラグメント
にライゲーションする。このようにして得られた、FVIII軽鎖酸性領域に結
合したFV BドメインのC末端部分をコードする、正しい方向のBstEIt
/MluI反応産物を、FV軽鎖をコードするM I u I 74由来のM
I u I / S a 117ラグメントにライゲーションする。正しい方向
を有するBstEII/5allフラグメント(フラグメント「A」)を同定し
、ゲル精製する。
B、 ペプチド位置312−313のA2ドメインをコードしている領域のちょ
うど5°に導入されたM I u Iサイトを有するFVベクターを、オリゴヌ
クレオチド#41を用いて製造する。FVA2及び部分的FV Bドメインをコ
ードするM I u I / B s t EIIフラグメントをここから切取
り、ゲル精製する(フラグメント「B」)。
C0ペプチド位置372のFVIII A2領域に対しちょうど5゛に導入され
たM l u Iサイトを有するFVI I Iベクターを、オリゴヌクレオチ
ド#7を用いて製造する。次いでこのベクターをM 1 u Iおよび5ail
で消化して、AI及び重鎮酸性領域のみを残し殆どのFVIII暗号化領域を切
り取る。次に、より大きなMIuI/5ailフラグメントをゲル精製し、7ラ
グメントAおよびBにライゲーションする。正しい向きの得られたベクターは以
下の暗号化領域を有する:
FVエエ工
国際調査報告
Claims (10)
- 1.標準的凝塊形成検定により測定される凝固促進活性を有する蛋白をコードす るDNAであって、緊縮条件下でヒトのFVIIIをコードするcDNA配列お よびヒトのFVをコードするcDNA配列とそれぞれバイブリダイズすることの できるDNA。
- 2.FVIII Bドメインの代わりにヒトFVのBドメインを含んでいる、ヒ トFVIIIのポリペプチド配列をコードする請求項1に記載のDNA。
- 3.請求項1に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 4.請求項2に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 5.請求項1のDNAを含み、且つこれを発現できる宿主細胞。
- 6.請求項2のDNAを含み、且つこれを発現できる宿主細胞。
- 7.請求項1または2に記載のDNAを含み、且つこれを発現できるよう遺伝学 的に操作された宿主細胞を、該DNAを発現させ、且つその結果生産される蛋白 の生産をさせる適当な条件の下で培養することからなる、凝固促進蛋白の生産方 法。
- 8.請求項1または2に記載のDNAによりコードされる凝固促進蛋白。
- 9.薬学上許容し得る媒質と混合された請求項8の蛋白を含有する薬学的組成物 。
- 10.請求項7の方法により生産された蛋白を含有する薬学的組成物。
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