PT2566507T - Vacinas de bioconjugado de bactérias gram-positivas capsulares - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
"VACINAS DE BIOCONJUGADO DE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS CAPSULARES"
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o beneficio ao abrigo do artigo 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 61/332170, apresentado a 6 de maio de 2010.
DECLARAÇÃO A RESPEITO DE INVESTIGAÇÃO PATROCINADA FEDERALMENTE
Esta invenção foi realizada com apoio governamental ao abrigo da subvenção 1R01AI088754-2 concedida pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo possui determinados direitos na invenção.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida no formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 2 de maio de 2011, é denominada 031229US.txt e tem 206590 bytes de tamanho.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As vacinas foram uma das grandes invenções de saúde pública da medicina moderna e salvaram milhões de vidas. As imunizações deram provas de serem um meio ideal para prevenir e controlar as infeções. Todos os anos, as vacinas previnem até 3 milhões de mortes e 750000 crianças são protegidas da incapacidade. (Global Alliance for Vaccines and Immunization - Comunicados de Imprensa (11 de março de 2006) em www.gavialliance.org/media_centre/press _releases/2006_ 03_09_en_pr_queenrania_delhi.php). Em 1999, o CDC declarou as imunizações a conquista número um em saúde pública do século XX (Ten great public health achievements-United States, 1900-1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 48:241-3 (2 de abril de 1999)). Algumas bactérias, como aquelas que causam tétano ou difteria, produzem uma toxina que é em grande parte responsável pela doença. Esta toxina pode ser utilizada numa forma destoxifiçada como vacina. Contudo, para a maior parte das bactérias não existe uma toxina única que possa ser utilizada para desenvolver uma vacina.
Entre as vacinas mais bem-sucedidas estão os polissacáridos de superfície de patogénios bacterianos, como Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis e Estreptococus pneumoniae, conjugados a proteínas veículo. Estas bactérias estão rodeadas por uma cápsula, a qual promove a virulência microbiana e a resistência à neutralização fagocítica, assim como evita a sua desidratação.
Os polissacáridos bacterianos podem deduzir uma resposta imunitária duradoura em humanos se forem ligados a um veículo proteico que contenha epitopos de célula T. Este conceito foi elaborado há 80 anos (Avery, 0. T. e W. F. Goebel. 1929. Estudos quimioimunológicos sobre proteínas de hidratos de carbono conjugadas. II Especificidade imunológica de proteínas de açúcar sintéticas. J. Exp. Med. 50:521-533), e provado mais tarde para o polissacárido do Haemophilus influenza tipo B (HIB) ligado ao veículo proteico toxina da difteria (Anderson, P. 1983. Respostas de anticorpo à toxina da difteria de Haemophilus influenzae tipo b e induzidas por conjugados de oligossacáridos de cápsula do tipo b com a proteína não tóxica CRM197. Infect Immun 39:233-8; Schneerson, R., O. Barrera, A. Sutton e J. B. Robbins. 1980. Preparação, caracterização e imunogenicidade de conjugados de polissacárido de Haemophilus influenzae tipo b com proteína. J Exp Med 152:361-76). Este glicoconjugado também foi a primeira vacina conjugada a ser autorizada nos EUA em 1987 e introduzida no programa de imunização infantil dos EUA pouco depois. Além do HIB, as vacinas conjugadas foram utilizadas com êxito contra os patogénios humanos encapsulados N. meningitidis e S. pneumoniae. A utilização de rotina destas vacinas resultou em colonização nasofaríngea, assim como infeção, diminuídas. Atualmente, aproximadamente -25% de todo o mercado de vacinas global compreende vacinas conjugadas.
As bactérias gram-positivas possuem uma membrana celular que está rodeada por polissacáridos capsulares. O Staphylococcus é uma dessas bactérias Gram-positivas. O Staphylococcus aureus causa infeção. O S. aureus é um patogeno bacteriano oportunista, responsável por um espetro diverso de doenças humanas. Embora o S. aureus possa colonizar superfícies de mucosa de humanos normais, também é uma causa muito importante de infeções de feridas e tem o potencial invasivo de induzir infeções graves, incluindo osteomielite, endocardite e bacteriemia, com complicações metastáticas (Lowy, F. D. 1998. Infeções por Staphylococcus aureus. New Engl J Med 339:520-32). 0 S. aureus é um dos agentes mais comuns implicados na pneumonia associada a ventilador e é uma causa importante e emergente de pneumonia adquirida em comunidade, afetando adultos anteriormente saudáveis e crianças desprovidas de fatores de predisposição de risco (Kollef, Μ. H., A. Shorr, Y. P. Tabak, V. Gupta, L. Z. Liu e R. S. Johannes. 2005. Epidemiologia e resultados de pneumonia associada aos cuidados de saúde: resultados de uma base de dados de grandes dimensões dos EUA de pneumonia positiva para cultura. Chest 128:3854-62; Shorr, A. F. 2007. Epidemiologia e impacto económico de Staphylococcus aureus resistente à meticilina: revisão e análise da literatura. Pharmacoeconomics 25:751-68). O S. aureus é a segunda causa mais comum de bacteriemia nosocomial e as estirpes de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) contribuem para mais de 50% de todas as infeções nas unidades de cuidados intensivos nos EUA. As infeções por S. aureus no hospital e na comunidade estão a aumentar. As estirpes de MRSA foram isoladas de 2% das infeções estafilocócicas em 1974 e de 63% das infeções estafilocócicas em 2004. Muitas das estirpes de MRSA nosocomiais são multirresistentes e até as estirpes sensíveis à meticilina podem ser mortais. Um relato recente utilizando verificação de caso ativo baseado em população revelou que ocorreram 94360 infeções por MRSA invasivo nos EUA em 2005 e que a maioria destas (58%) ocorreu fora do hospital (Elevens, R. Μ., M. A. Morrison, J. Nadle, S. Petit, K. Gershman, S. Ray, L. H. Harrison, R. Lynfield, G. Dumyati, J. M. Townes, A. S. Craig, E. R. Zell, G. E. Fosheim, L. K. McDougal, R. B. Carey e S. K. Fridkin. 2007. Infeções por Staphylococcus aureus invasivo resistente à meticilina nos Estados Unidos. JAMA 298:1763-71). Nesta análise, morreram mais Americanos de MRSA (>18000 mortes) em 2005 do que de SIDA. O S. aureus USA100, também conhecido pelo clone de Nova Iorque/Japão, é uma estirpe de MRSA que representa a estirpe de MRSA adquirida em hospital predominante nos EUA (McDougal, L. K., C. D. Steward, G. E. Killgore, J. M. Chaitram, S. K. McAllister e F. C. Tenover. 2003. Tipagem de eletroforese em gel de campo pulsado de isolados de Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina dos Estados Unidos: estabelecimento de uma base de dados nacional. J Clin Microbiol 41:5113-20).
As análises epidemiológicas indicam que, só nos EUA, o S. aureus causa, aproximadamente, 2 milhões de infeções clinicas todos os anos (Fridkin, S. K., J. C. Hageman, M. Morrison, L. T. Sanza, K. Como-Sabetti, J. A. Jernigan, K. Harriman, L. H. Harrison, R. Lynfield e Μ. M. Farley. 2005. Doença de Staphylococcus aureus resistente à meticilina em três comunidades. N Engl J Med 352:1436-44; King, M. D., B. J. Humphrey, Y. F. Wang, E. V. Kourbatova, S. M. Ray e Η. M. Blumberg. 2006. Surgimento do clone de Staphylococcus aureus USA 300 resistente à meticilina adquirido em comunidade como a causa predominante de infeções de pele e de tecidos moles. Ann Intern Med 144:309-17; Elevens, R. Μ., M. A. Morrison, J. Nadle, S. Petit, K. Gershman, S. Ray, L. H. Harrison, R. Lynfield, G. Dumyati, J. M. Townes, A. S. Craig, E. R. Zell, G. E. Fosheim, L. K. McDougal, R. B. Carey, S. K. Fridkin e Μ. I. para a vigilância do Núcleo Bacteriano Ativo. 2007. Infeções por Staphylococcus aureus resistente à meticilina invasivas nos Estados Unidos. JAMA 298:1763-1771). As infeções por S. aureus estão não apenas a aumentar em número, mas a resistência do S. aureus a antibióticos também está a aumentar. O MRSA é responsável por 40%-60% das infeções por S. aureus nosocomiais nos EUA e muitas destas estirpes são muitirresistentes. Conhecido como uma fonte muito importante de infeções nosocomiais, o S. aureus adotou recentemente um novo papel na medida em que causa um número crescente de infeções adquiridas em comunidade, em pessoas não hospitalizadas, sem fatores de predisposição de risco. As estirpes virulentas de MRSA associadas à comunidade (CA-MRSA) estão a tornar-se mais predominantes por todos os EUA e Europa e a sua disseminação foi observada globalmente (Baggett, H. C., T. W. Hennessy, K. Rudolph, D. Bruden, A. Reasonover, A. Parkinson, R. Sparks, R. M. Donlan, P. Martinez, K. Mongkolrattanothai e J. C. Butler. 2004. Staphylococcus aureus resistente à meticilina de começo na comunidade associado com a utilização antibiótica e a citotoxina leucocidina de Panton-Valentine durante um surto de furunculose no Alasca rural. J Infect Dis 189:1565-73; Gilbert, M., J. MacDonald, D. Gregson, J. Siushansian, K. Zhang, S. Elsayed, K. Laupland, T. Louie, K. Hope, M. Mulvey, J. Gillespie, D. Nielsen, V. Wheeler, M. Louie, A. Honish, G. Keays e J. Conly. 2006. Surto em Alberta de Staphylococcus aureus resistente à meticilina adquirido em comunidade (USA300) em pessoas com um historial de uso de drogas, privação de habitação ou reclusão. Canad Med Assoc J 175:149-54; Kazakova, S. V., J. C. Hageman, M. Matava, A. Srinivasan, L. Phelan, B. Garfinkel, T. Boo, S. McAllister, J. Anderson, B. Jensen, D. Dodson, D. Lonsway, L. K. McDougal, M. Arduino, V. J. Fraser, G. Killgore, F. C. Tenover, S. Cody e D. B. Jernigan. 2005. Um clone de Staphylococcus aureus resistente à meticilina entre jogadores de futebol profissionais. N Engl J Med 352:468-75). A resistência do S. aureus à meticilina tornou-se não apenas mais comum, mas foram referidos numerosos isolados com reduzida suscetibilidade à vancomicina. Nos EUA, foram isolados sete isolados clínicos de S. aureus que transportam vanA e são totalmente resistentes à vancomicina. Estes isolados também são resistentes à meticilina (Chang, S., D. M. Sievert, J. C. Hageman, M. L. Boulton, F. C. Tenover, F. P. Downes, S. Shah, J. T. Rudrik, G. R. Pupp, W. J. Brown, D. Cardo e S. K. Fridkin. 2003. Infeção com Staphylococcus aureus resistente à vancomicina contendo o gene de resistência vanA. New Engl J Med 348:1342-7). Em virtude de o S. aureus nem sempre poder ser controlado pelos antibióticos e os isolados de MRSA estarem a tornar-se crescentemente predominantes na comunidade, estratégias adicionais de controlo, tal como uma vacina, são extremamente necessárias.
Os polissacáridos capsulares de S. aureus estão envolvidos na infeção. Muitos fatores de virulência contribuem para a patogénese das infeções estafilocócicas, incluindo adesões associadas à superfície, exoproteínas e toxinas segregadas e fatores de evasão imunitária (Foster, T. J. 2005. Evasão imunitária por estafilococos. Nature Reviews Microbiology 3:948-58). Como muitos patogénios bacterianos invasivos, o S. aureus produz um polissacárido capsular (CP) (FIG. 4) que melhora a sua resistência à eliminação pelas defesas imunitárias inatas do hospedeiro. Muitos isolados clínicos de S. aureus são encapsulados e as estirpes de serotipo 5 e 8 predominam (Arbeit, R. D., W. W. Karakawa, W. F. Vann e J. B. Robbins. 1984 . Predominância de dois tipos de polissacáridos capsulares recentemente descritos, entre isolados clínicos de Staphylococcus aureus. Diagn Microbiol Infect Dis 2:85-91). Os polissacáridos capsulares de tipo 5 (CP5) e tipo 8 (CP8) têm unidades de repetição de trissacáridos semelhantes constituídas por ácido Λί-acetilmanosaminurónico (ManNAcA) , N-acetil-L- fucosamina (L-FucNAc) e N-acetil-D-fucosamina (D-FucNAc) (Jones, C. 2005. Estruturas revistas para os polissacáridos capsulares de Staphylococcus aureus tipos 5 e 8, componentes de novas vacinas de glicoconjugados. Carbohydr Res 340:1097-106). Os CP5 e CP8 são serologicamente distintos e tal pode ser atribuído a diferenças nas ligações entre os açúcares e nos sítios de O-acetilação (FIG. 4).
Estudos anteriores correlacionaram a produção de cápsula do S. aureus com a resistência à absorção e neutralização fagocítica in vitro (Fattom, A., R. Schneerson, S. C. Szu, W. F. Vann, J. Shiloach, W. W. Karakawa e J. B. Robbins. 1990. Síntese e propriedades imunológicas em murganhos de vacinas compostas por polissacáridos capsulares tipo 5 e tipo 8 de Staphylococcus aureus conjugados a exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Infect Immun 58:2367-74; Thakker, M., J.-S. Park, V. Carey e J. C. Lee. 1998. 0 polissacárido capsular de serotipo 5 de Staphylococcus aureus é antifagocítico e melhora a virulência bacteriana num modelo de bacteriemia murina. Infect Immun 66:5183-5189; Watts, A., D. Ke, Q. Wang, A. Pillay, A. Nicholson-Weller e J. C. Lee. 2005. Estirpes de Staphylococcus aureus que expressam polissacáridos capsulares de serotipo 5 ou serotipo 8 diferem em virulência. Infect Immun 73:3502-11). Os neutrófilos humanos fagocitam mutantes negativos para cápsula na presença de soro não imune com atividade de complemento, enquanto os isolados encapsulados requerem anticorpos específicos de cápsula e complemento para neutralização opsonofagocítica ótima (Bhasin, N., A. Albus, F. Michon, P. J. Livolsi, J.-S. Park e J. C. Lee. 1998. Identificação de um gene essencial para a O-acetilação do polissacárido capsular tipo 5 de Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 27:9-21; Thakker, M., J.-S. Park, V. Carey e J. C. Lee. 1998. O polissacárido capsular de serotipo 5 de Staphylococcus aureus é antifagocítico e melhora a virulência bacteriana num modelo de bacteriemia murina. Infect Immun 66:5183-5189; Watts, A., D. Ke, Q. Wang, A. Pillay, A. Nicholson-Weller e J. C. Lee. 2005. Estirpes de Staphylococcus aureus que expressam polissacáridos capsulares de serotipo 5 ou serotipo 8 diferem em virulência. Infect Immun 73:3502-11). Nilsson et al. (Nilsson, I.-M., J. C. Lee, T. Bremell, C. Ryden e A. Tarkowski. 1997. O papel da expressão da microcápsula de polissacárido estafilocócica em septicemia e artrite sética. Infect Immun 65:4216-4221) referiram que macrófagos peritoneais de murganhos fagocitaram números significativamente maiores de um mutante negativo para CP5, em comparação com a estirpe parental Reynolds. Uma vez fagocitada, a estirpe positiva para CP5 sobreviveu intracelularmente em maior extensão do que a estirpe mutante. Cunnion et al. (Cunnion, K. M., J. C. Lee e Μ. M. Frank. 2001. Produção de cápsula e fase de crescimento influenciam a ligação do complemento a Staphylococcus aureus. Infect Immun 69:6796-6803) compararam a opsonização de estirpes isogénicas de S. aureus e demonstraram que a estirpe positiva para CP5 ligou-se 42% menos ao complemento (C') sérico do que o mutante acapsular. O desenvolvimento de vacinas de S. aureus tem, convencionalmente, envolvido a cápsula como um alvo. A conceção de vacinas para proteção contra doença estafilocócica é complicada pelas manifestações proteanas e complexidade clínica de infeções por S. aureus em humanos. Foram investigados muitos candidatos vacinais de S. aureus em modelos animais de infeção, mas foi referido que apenas dois regimes de imunização completaram ensaios clínicos de fase III (Schaffer, A. C. e J. C. Lee. 2008. Vacinação e imunização passiva contra Staphylococcus aureus. Int J Antimicrob Agents 32 Suppl l:S71-8). A primeira vacina é baseada nos dois polissacáridos capsulares (CP) (FIG. 4) que são mais predominantes entre estirpes clinicas de S. aureus. Fattom et al. (Fattom, A.R. Schneerson, S. C. Szu, W. F. Vann, J. Shiloach, W. W. Karakawa e J. B. Robbins. 1990. Síntese e propriedades imunológicas em murganhos de vacinas compostas por polissacáridos capsulares tipo 5 e tipo 8 de Staphylococcus aureus conjugados a exotoxina de Pseudomonas aeruginosa. Infect Immun 58:2367-74) conjugaram os polissacáridos de serotipo 5 (CP5) e serotipo 8 (CP8) à exoproteína A não tóxica recombinante de P. aeruginosa (rEPA). As vacinas conjugadas foram imunogénicas em murganhos e humanos e induziram anticorpos opsónicos que mostraram eficácia a protegerem roedores de letalidade e de infeção estafilocócica não letal (Fattom, A.R. Schneerson, S. C. Szu, W. F. Vann, J. Shiloach, W. W. Karakawa e J. B. Robbins. 1990. Síntese e propriedades imunológicas em murganhos de vacinas compostas por polissacáridos capsulares tipo 5 e tipo 8 de Staphylococcus aureus conjugados a exotoxina de Pseudomonas aeruginosa. Infect Immun 58: 2367-74; Fattom, A., R. Schneerson, D. C. Watson, W. W. Karakawa, D. Fitzgerald, I. Pastan, X. Li, J. Shiloach, D. A. Bryla e J. B. Robbins. 1993. Avaliação laboratorial e clínica de vacinas conjugadas compostas por polissacáridos capsulares tipo 5 e tipo 8 de S. aureus ligados a exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa. Infect Immun 61:1023-32; Fattom, A. I., J. Sarwar, A. Ortiz e R. Naso. 1996. Uma vacina de polissacárido capsular (CP) de Staphylococcus aureus e anticorpos específicos de CP protege murganhos contra estímulo bacteriano. Infect Immun 64:1659-65; Lee, J. C., J. S. Park, S. E. Shepherd, V. Carey e A. Fattom. 1997. Eficácia protetora de anticorpos para o polissacárido capsular tipo 5 de Staphylococcus aureus num modelo modificado de endocardite em ratos. Infect Immun 65:4146-51). Estudos de imunização passiva indicaram que anticorpos específicos para CP5 e CP8 reduziram significativamente a infeção num modelo murino de mastite de S. aureus (Tuchscherr, L. P., F. R. Buzzola, L. P. Alvarez, J. C. Lee e D. 0. Sordelli. 2008. Anticorpos para polissacárido capsular e fator de aglutinação A previnem mastite e o surgimento de variantes não encapsulados e de colónias pequenas de Staphylococcus aureus em murganhos. Infect Immun 76:5738-44). Mostrou-se que a vacina de conjugado de CP5 e CP8 combinada era segura em humanos e deduzia anticorpos que mostraram atividade opsonofagocítica. O desenvolvimento de vacinas de S. aureus também envolveu proteínas de superfície como um alvo. 0 segundo ensaio clínico vacinai de S. aureus foi baseado na eficácia protetora de anticorpos para adesões estafilocócicas na prevenção de infeções estafilocócicas. 0 fator de aglutinação A de S. aureus é uma proteína ancorada à parede celular que é expressa à superfície, medeia a aderência estafilocócica ao fibrinogénio (Foster, T. J. e M. Hook. 1998. Adesões de proteínas de superfície de Staphylococcus aureus. Trends Microbiol 6:484-8) e promove a conjugação de S. aureus a superficies de biomateriais (Vaudaux, P. E., P. Francois, R. A. Proctor, D. McDevitt, T. J. Foster, R. M. Albrecht, D. P. Lew, H. Wabers e S. L. Cooper. 1995. Utilização de mutantes de adesão defeituosa de Staphylococcus aureus para definir o papel de proteínas plasmáticas específicas na promoção da adesão bacteriana a derivações arteriovenosas caninas. Infection & Immunity 63:585-90), coágulos de sangue e superfícies endoteliais danificadas (Moreillon, P., J. M. Entenza, P. Francioli, D. McDevitt, T. J. Foster, P. Francois e P. Vaudaux. 1995. Papel da coagulase e fator de aglutinação de Staphylococcus aureus na patogénese de endocardite experimental. Infection & Immunity 63:4738-43). 0 domínio de ligação ao fibrinogénio de ClfA está localizado na região A da proteína de comprimento completo (McDevitt, D., P. Francois, P. Vaudaux e T. J. Foster. 1995. Identificação do domínio de ligação de ligando do recetor de fibrinogénio localizado à superfície (fator de aglutinação) de Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology 16:895-907). O ClfA desempenha um papel importante na ligação de S. aureus a plaquetas, uma interação que é crítica em modelos animais de endocardite estafilocócica induzida por cateter (Sullam, P. M., A. S. Bayer, W. M. Foss e A. L. Cheung. 1996. A ligação plaquetária diminuída in vitro por Staphylococcus aureus está associada com virulência reduzida num modelo de coelho de endocardite infeciosa. Infection & Immunity 64:4915-21).
Nanra et al. referiram que anticorpos para ClfA induziram a neutralização opsonofagocítica de S. aureus in vitro (Nanra, J. S., Y. Timofeyeva, S. M. Buitrago, B. R. Sellman, D. A. Dilts, P. Fink, L. Nunez, M. Hagen, Y. V. Matsuka, T. Mininni, D. Zhu, V. Pavliak, B. A. Green, K. U. Jansen e A. S. Anderson. 2009. Expressão heterogénea in vivo de fator de aglutinação A e polissacárido capsular pelo Staphylococcus aureus: Implicações para a conceção vacinai. Vaccine 27:3276-80). Além disso, murganhos imunizados com uma forma recombinante da região de ligação A de ClfA mostraram reduções em artrite e letalidade induzidas por S. aureus (Josefsson, E., O. Hartford, L. O'Brien, J. M. Patti e T. Foster. 2001. Proteção contra artrite experimental de Staphylococcus aureus por vacinação com fator de aglutinação A, um novo determinante de virulência. Journal of Infectious Diseases 184:1572-80). Foram realizadas experiências de imunização passiva em coelhos aos quais foi dada uma preparação de imunoglobulina policlonal humana que continha níveis elevados de anticorpos específicos para ClfA (Vernachio, J., A. S. Bayer, T. Le, Y. L. Chai, B. Prater, A. Schneider, B.
Ames, P. Syribeys, J. Robbins, J. M. Patti, J. Vernachio, A. S. Bayer, T. Le, Y.-L. Chai, B. Prater, A. Schneider, B. Ames, P. Syribeys, J. Robbins e J. M. Patti. 2003. Imunoglobulina de fator de antiaglutinação A reduz a duração de bacteriemia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina num modelo experimental de endocardite infeciosa. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 47:3400-6). A terapia de combinação resultou em melhor eliminação bacteriana do sangue de coelhos com endocardite de S. aureus induzida por cateter do que o tratamento de vancomicina isoladamente. Além disso, a transferência passiva de anticorpos específicos de CLfA reduziu significativamente a infeção num modelo murino de mastite de S. aureus (Tuchscherr, L. P., F. R. Buzzola, L. P. Alvarez, J. C. Lee e D. O. Sordelli. 2008. Anticorpos para polissacárido capsular e fator de aglutinação A previnem mastite e o surgimento de variantes não encapsulados e de colónias pequenas de Staphylococcus aureus em murganhos. Infect Immun 76: 5738-44). um ensaio clinico de fase III foi alegadamente concebido para proteger contra sépsis de inicio tardio em 2000 recém-nascidos prematuros de baixo peso à nascença. Os bebés receberam até quatro administrações de Veronate, uma preparação de imunoglobulina humana agregada de dadores com elevados títulos de anticorpo contra ClfA e SdrG. Não obstante os resultados promissores de um ensaio clínico de fase II semelhante, esta terapia profilática não resultou na redução na frequência de infeções estafilocócicas nos recém-nascidos (DeJonge, M., D. Burchfield, B. Bloom, M. Duenas, W. Walker, M. Polak, E. Jung, D. Millard, R. Schelonka, F. Eyal, A. Morris, B. Kapik, D. Roberson, K. Kesler, J. Patti e S. Hetherington. 2007. Ensaio clínico de segurança e eficácia de INH-A21 para a prevenção de infeção da corrente sanguínea estafilocócica nosocomial em bebés prematuros. J Pediatr 151:260-5).
Mostrou-se que a glicosilação proteica ocorre mas, em organismos procarióticos, raramente acontece naturalmente. Por outro lado, a glicosilação proteica ligada a N é um processo essencial e conservado ocorrendo no retículo endoplasmático dos organismos eucarióticos. É importante para o enrolamento proteico, oligomerização, estabilidade, controlo de qualidade, separação e transporte de proteínas secretórias e membranares (Helenius, A. e Aebi, M. (2004). Papéis dos glicanos ligados a N no retículo endoplasmático. Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049). A glicosilação proteica tem uma influência profundamente favorável na antigenicidade, na estabilidade e na meia-vida de uma proteína. Além disso, a glicosilação pode facilitar a purificação de proteínas por cromatografia, e. g., cromatografia de afinidade com ligandos de lectina ligados a uma fase sólida que interage com unidades glicosiladas da proteína. É, deste modo, prática estabelecida produzir muitas proteínas glicosiladas de modo recombinante em células eucarióticas, para proporcionar padrões de glicosilação, biologicamente e farmaceuticamente úteis.
As vacinas conjugadas foram utilizadas com êxito para proteger contra as infeções bacterianas. Para resposta de memória protetora, é requerida a conjugação de um polissacárido antigénico a um veículo proteico, dado que os polissacáridos são antigénios independentes de células T. Os polissacáridos foram conjugados a transportadores proteicos por diferentes métodos químicos, utilizando grupos de reativos de ativação no polissacárido, assim como no veículo proteico. (Qian, F., Y. Wu, O. Muratova, H. Zhou, G. Dobrescu, P. Duggan, L. Lynn, G. Song, Y. Zhang, Κ. Reiter, Ν. MacDonald, D. L. Narum, C. A. Long, L. H. Miller, A. Saul e G. E. Mullen. 2007. Conjugação de proteínas recombinantes à ExoProteína A de Pseudomonas aeruginosa: uma estratégia para melhoramento da imunogenicidade de candidatos vacinais maláricos. Vaccine 25:3923-3933; Pawlowski, A., G. Kallenius e S. B. Svenson. 2000. Preparação de vacinas de conjugados de polissacárido capsular pneumocócico com proteína utilizando novas tecnologias de fragmentação e conjugação. Vaccine 18:1873-1885; Robbins, J. B., J. Kubler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach e R. Schneerson. 2009. Síntese, caracterização e imunogenicidade em murganhos de conjugados de oligossacárido específico de O de Shigella sonnei com proteína nuclear. Proc Natl Acad Sei USA 106:7974-7978).
As vacinas conjugadas podem ser administradas a crianças para as proteger contra infeções bacterianas e podem proporcionar uma resposta imunitária duradoura a adultos. Verificou-se que as construções da invenção produzem uma resposta de IgG em animais. Considera-se que o polissacárido (í. e., resíduo de açúcar) desencadeia uma resposta imunitária de curto prazo que é específica de açúcar. De facto, o sistema imunitário humano produz uma forte resposta a estruturas de superfície de polissacáridos específicas de bactérias, tais como antigénios O e polissacáridos capsulares. Contudo, dado que a resposta imunitária aos polissacáridos é dependente de IgM, o sistema imunitário não desenvolve memória. 0 veículo proteico que transporta o polissacárido, contudo, desencadeia uma resposta de IgG que é dependente de célula T e que proporciona proteção duradoura, dado que o sistema imunitário desenvolve memória. Por esta razão, no desenvolvimento de uma vacina, é vantajoso desenvolvê-la como um conjugado de veículo proteico com polissacárido.
Os organismos procarióticos raramente produzem proteínas glicosiladas. Contudo, foi demonstrado que uma bactéria, o patogeno transmitido por alimentos Campylobacter jejuni, pode glicosilar as suas proteínas (Szymanski, et al. (1999). Evidência para um sistema de glicosilação proteica geral em Campylobacter jejuni. Mol. Microbiol. 32, 1022-1030). A maquinaria requerida para glicosilação é codificada por 12 genes que estão aglomerados no lócus pgl. A perturbação da glicosilação afeta a invasão e a patogénese de C. jejuni, mas não é letal como na maioria dos organismos eucarióticos (Burda P. e M. Aebi, (1999) . A via dolicol da glicosilação ligada a N. Biochim Biophys Acta 1426(2):239-57). Foi mostrado que o lócus pgl é responsável pela glicosilação proteica ligada a N em Campylobacter e que é possível reconstituir a N-glicosilação de proteínas de C. jejuni por expressão recombinante do lócus pgl e glicoproteína aceitadora em E. coli ao mesmo tempo (Wacker, M., D. Linton, P. G. Hitchen, M. Nita-Lazar, S. M. Haslam, S. J. North, M. Pânico, H. R. Morris, A. Dell, B. W. Wren e M. Aebi. 2002. Glicosilação ligada a N em C. jejuni e sua transferência funcional para E. coli. Science 298:1790-3). A via biossintética da glicosilação proteica ligada a N de Campylobacter tem semelhanças significativas com a via da biossíntese de polissacáridos em bactérias (Bugg, T. D. e P. E. Brandish. 1994 . Do peptidoglicano às glicoproteínas: características comuns da biossíntese de oligossacáridos ligada a lípido. FEMS Microbiol Lett 119:255-62) . Com base no conhecimento de que os polissacáridos antigénicos de bactérias e os oligossacáridos de Campylobacter são ambos sintetizados no lípido transportador, undecaprenilpirofosfato (UndPP), as duas vias foram combinados em E. coli (Feldman, M. F., M. Wacker, M.
Hernandez, P. G. Hitchen, C. L. Marolda, M. Kowarik, H. R. Morris, A. Dell, M. A. Valvano e M. Aebi. 2005. Manipulação de glicosilação proteica ligada a N com diversas estruturas de lipopolissacáridos de antigénio O em Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA 102:3016-21). Foi demonstrado que o PglB não tem uma especificidade estrita para o substrato de açúcar ligado a lipido. Os polissacáridos antigénicos agrupados em UndPP são capturados por PglB no periplasma e transferidos para um veiculo proteico (Feldman, M. F., M. Wacker, M. Hernandez, P. G. Hitchen, C. L. Marolda, M. Kowarik, H. R. Morris, A. Dell, Μ. A. Valvano e M. Aebi. 2005. Manipulação de glicosilação proteica ligada a N com diversas estruturas de lipopolissacáridos de antigénio O em Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA 102:3016-21; Wacker, Μ., M. F. Feldman, N. Callewaert, M. Kowarik, B. R. Clarke, N. L. Pohl, M. Hernandez, E. D. Vines, M. A. Valvano, C. Whitfield e M. Aebi. 2006. A especificidade de substrato de oligossacariltransferase bacteriana (OTase) sugere um mecanismo de transferência comum para os sistemas bacterianos e eucarióticos. Proc Natl Acad Sei USA 103:7088-93) . Foi mostrado que o PglB de Campylobacter transfere uma gama variada de oligossacáridos ligados a UndPP se contiverem uma hexosamina 77-acetilada no terminal de redução (Wacker et al. (2006)), permitindo a conjugação de um polissacárido antigénico a uma proteína de escolha através de uma ligação N-glicosídica. Embora tal possa proporcionar uma base teórica para a produção de vacinas conjugadas in vivo, necessitam de ser superados muitos desafios difíceis de modo a compreender-se esta possibilidade teórica.
Com base nesta descoberta anterior, de que o C. jejuni contém um sistema geral de glicosilação proteica ligada a N, a E. coli foi modificada para incluir a maquinaria de glicosilação proteica ligada a N de C. jejuni. Deste modo, foram produzidas formas glicosiladas de proteínas nativas a C. jejuni num hospedeiro de E. coli. Foi ainda mostrado que este processo poderia ser utilizado para produzir proteínas glicosiladas de origens diferentes em hospedeiro de E. coli modificado para utilização como produtos vacinais (o documento WO 06/119987 e "GlycoVaxyn e hospital afiliado da Universidade de Harvard receberam uma subvenção de 3,4 milhões de dólares para o desenvolvimento de vacinas de Staphylococcus aureus". URL: http://www.glycovaxyn. com/content/news/releases/10%2 0 05%2004 .pdf) . A produção por E. coli é vantajosa, porque podem ser produzidas culturas de grandes dimensões desses hospedeiros de E. coli modificados, as quais produzem grandes quantidades de vacina útil. A utilização deste processo para produzir uma proteína glicosilada num hospedeiro de E. coli modificado, para utilização como um produto vacinai para S. aureus, encontra problemas que foram considerados intransponíveis. Em primeiro lugar, a E. coli é uma bactéria Gram-negativa e as suas vias de biossíntese de sacáridos diferem grandemente daquelas de uma bactéria Gram-positiva, tal como S. aureus, após o passo de polimerização. Além disso, seria inexequível manipular geneticamente a E. coli para produzir o polissacárido capsular de S. aureus diretamente consistente com tecnologias anteriores. Por exemplo, o S. aureus é um organismo Gram-positivo e a síntese da sua cápsula está associada com a estrutura do envelope celular e a construção do invólucro celular. A maquinaria biossintética de produção da cápsula está especificamente concebida para dispor o polissacárido capsular (PS) no exterior da célula e sua parede celular. Seria extremamente difícil, pelo menos pela razão de que seria altamente intensivo em termos de recursos, produzir esta cápsula num organismo de E. coli modificado, porque o envelope celular de E. coli é construído numa forma fundamentalmente diferente. A maquinaria biossintética para o agrupamento da cápsula a partir do precursor de PS seria não funcional, devido ao ambiente diferente. Enquanto a cápsula de S. aureus deve transitar uma única membrana, na E. coli existe uma membrana adicional que necessita de ser atravessada para atingir a localização final de uma cápsula autêntica. Além disso, como a cápsula de S. aureus é muito grande, considerou-se ser inexequível preparar uma cápsula de grandes dimensões como a cápsula de S. aureus entre as duas membranas de E. coli. 0 princípio de que as enzimas de organismos diferentes podem funcionar em conjunto foi mostrado anteriormente (e. g., Rubires, X., F. Saigi, N. Pique, N. Climent, S. Merino, S. Alberti, J. M. Tomas e M. Regue. 1997. Um gene (wbbL) de Serratia marcescens N28b (04) complementa a mutação rfb-50 de derivados de Escherichia coli K-12. J. Bacteriol 179(23): 7581-6). Contudo, considera-se que não foi anteriormente produzido num organismo Gram-negativo qualquer polissacárido de LPS modificado de um organismo Gram-positivo.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A requerente identificou, surpreendentemente, uma nova vacina de bioconjugado de S. aureus. Esta nova vacina de S. aureus é baseada na nova e inesperada verificação de que um oligossacárido ou um polissacárido de um procariota que tem uma estirpe Gram pode glicosilar uma proteína num procariota hospedeiro que tem uma estirpe Gram diferente. Consequentemente, é proporcionado um organismo procariótico hospedeiro Gram-negativo, em que o referido organismo procariótico hospedeiro é E. coli, compreendendo: (i) uma sequência nucleotidica que codifica, pelo menos, uma glicosiltransferase de uma bactéria Gram-positiva, em que a referida bactéria Gram-positiva é Staphylococcus aureus; (ii) uma sequência nucleotidica que codifica, pelo menos, uma glicosiltransferase de uma bactéria Gram-negativa, em que a referida bactéria Gram-negativa é Pseudomonas aeruginosa; (iii) uma sequência nucleotidica que codifica uma proteína transportadora, em que a referida proteína transportadora compreende a sequência consenso de aminoácidos D/E-X-N-Z-S/T, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e (iv) uma sequência nucleotidica que codifica uma oligossacariltransferase.
Características novas e inesperadas adicionais da divulgação incluem, sem limitação, as formas de realização apresentadas abaixo.
Mais genericamente, a presente divulgação é dirigida a uma vacina de bioconjugado, tal como uma vacina Gram-positiva, compreendendo um veículo proteico compreendendo uma sequência consenso de ácidos nucleicos inserida; pelo menos um oligossacárido ou polissacárido de uma bactéria, tal como uma bactéria Gram-positiva, ligado à sequência consenso e, opcionalmente, um adjuvante. Além disso, a divulgação é dirigida a uma vacina de bactéria Gram-positiva, tal como uma vacina de S. aureus, ou vacina de outras bactérias, preparada por um sistema de glicosilação utilizando uma via biossintética de LPS modificada, a qual compreende a produção de um polissacárido capsular ou LPS modificado. A presente invenção é adicionalmente dirigida a uma vacina de Staphylococcus aureus, compreendendo: uma proteína compreendendo uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e, pelo menos, um polissacárido de Staphylococcus aureus ligado à referida sequência consenso por ligação iV-glicosídica; e, opcionalmente, um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A presente é, além disso, dirigida a uma combinação de um polissacárido capsular modificado de S. aureus com um antigénio proteico do mesmo organismo por ligação Λί-glicosídica. A invenção é, ainda, dirigida a um organismo procariótico hospedeiro Gram-negativo, em que o referido organismo procariótico hospedeiro é E. coli, compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica, pelo menos, uma glicosiltransferase de uma bactéria Gram-positiva, em que a referida bactéria Gram-positiva é Staphylococcus aureus; uma sequência nucleotídica que codifica, pelo menos, uma glicosiltransferase de uma bactéria Gram-negativa, em que a referida bactéria Gram-negativa é Pseudomonas aeruginosa; uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína transportadora, em que a referida proteína transportadora compreende a sequência consenso de aminoácidos D/E-X-N-Z-S/T, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e uma sequência nucleotídica que codifica uma oliqossacariltransferase. A divulqação é, adicionalmente, diriqida a um organismo procariótico hospedeiro manipulado, compreendendo uma sequência nucleotídica introduzida que codifica glicosiltransferases nativas apenas a um organismo procariótico Gram-positivo; uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína; e uma sequência nucleotídica que codifica uma OTase. A divulgação é, além disso, dirigida a métodos de produção de uma vacina de bioconjugado num organismo procariótico hospedeiro, compreendendo ácidos nucleicos que codificam uma ou mais glicosiltransferases de uma primeira espécie procariótica, tal como uma espécie Gram-positiva, por exemplo, S. aureus; uma ou mais glicosiltransferases de uma segunda espécie procariótica, uma proteína; e uma OTase. Além disso, a presente invenção é dirigida à produção de vacinas de bioconjugado através da produção, em bactérias Gram-negativas, de polissacáridos capsulares modificados, que podem ser transferidos para o núcleo de lípido A por WaaL e/ou ligados a um veículo de escolha pela OTase. A divulgação é, ainda, dirigida a métodos de produção de proteínas glicosiladas num organismo procariótico hospedeiro, compreendendo sequência nucleotídica que codifica glicosiltransferases nativas a um primeiro organismo procariótico e também que codifica glicosiltransferases nativas a um segundo organismo procariótico que é diferente do primeiro organismo procariótico. A presente divulgação é, adicionalmente, dirigida à produção de proteínas Aí-glicosiladas com polissacáridos capsulares de bactérias Gram-positivas, que são sintetizados por uma combinação de diferentes glicosiltransferases de diferentes organismos. A divulgação é, além disso, dirigida à produção de proteínas glicosiladas num organismo procariótico hospedeiro, compreendendo uma sequência nucleotídica introduzida que codifica glicosiltransferases nativas apenas a um organismo procariótico Gram-positivo. A presente divulgação é, além disso, dirigida a plasmídeos, tal como plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 2, SEQ ID N° : 3 e SEQ ID N°: 4. A divulgação também inclui plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 6; SEQ ID N° : 7; SEQ ID N°: 8 e SEQ ID N°: 16. A divulgação também se refere a plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11; e SEQ ID N°: 12. Além disso, a divulgação é dirigida a plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 13; SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 19; SEQ ID N°: 20; SEQ ID N°: 21 e SEQ ID N°: 27. A divulgação é adicionalmente dirigida a células bacterianas transformadas, tal como, por exemplo, células bacterianas transformadas com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°. 2; SEQ ID N°: 3; SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20; SEQ ID N°: 21; e SEQ ID N°: 27. A presente divulgação é, ainda, dirigida a uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°: 9; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 12; SEQ ID N°: 13; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 15 e SEQ ID N°: 16. A presente divulgação é ainda dirigida a um método de indução de uma resposta imunitária contra uma infeção causada por bactérias Gram-positivas e outras bactérias num mamífero. Numa forma de realização, o método compreende a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo: proteína compreendendo, pelo menos, uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e um ou mais oliqossacáridos ou polissacáridos, os um ou mais oliqossacáridos ou polissacáridos que são iquais ou diferentes de outro dos um ou mais oliqossacáridos ou polissacáridos, de uma bactéria Gram-positiva liqada à referida sequência consenso.
Noutro aspeto, a divulgação caracteriza um método de identificação de um polissacárido alvo para utilização na glicosilação de uma proteína com o referido polissacárido alvo, no todo ou em parte. A referida proteína glicosilada compreendendo o polissacárido alvo pode ser utilizada, por exemplo, em composições vacinais. Numa forma de realização, o método de identificação de um polissacárido alvo inclui: identificação de uma bactéria Gram-positiva, tal como S. aureus, como um alvo; identificação de uma primeira unidade de repetição de um polissacárido produzido pela referida bactéria Gram-positiva compreendendo, pelo menos, três monómeros; identificação de um polissacárido produzido por uma bactéria de uma espécie Gram-negativa, compreendendo uma segunda unidade de repetição compreendendo dois dos mesmos monómeros que a referida primeira unidade de repetição. A presente divulgação também é dirigida a um método para a modificação de uma bactéria de uma primeira espécie bacteriana, tal como uma espécie Gram-negativa. Numa forma de realização, o método inclui: identificação de uma primeira unidade de repetição de um polissacárido de uma espécie Gram-positiva, tal como S. aureus, compreendendo três monómeros; identificação de um polissacárido produzido por uma bactéria de uma segunda espécie Gram-negativa, compreendendo outra unidade de repetição compreendendo dois dos mesmos monómeros da primeira unidade de repetição; inserção na referida bactéria de uma primeira espécie Gram-negativa de uma ou mais sequências nucleotidicas que codifica glicosiltransferases que agrupam um trissacárido, compreendendo: a) referida segunda unidade de repetição; e b) um monómero da referida primeira unidade de repetição não presente na referida segunda unidade de repetição; inserção de uma sequência nucleotidica que codifica uma proteina; e inserção de uma sequência nucleotidica que codifica uma OTase.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 representa uma via para a biossintese de antigénio 0 dependente de wzx/wzy, exemplificada pela biossintese do antigénio 0 de P. aeruginosa Oil. Os nomes das proteínas putativamente responsáveis pelas reações apresentadas estão indicados acima ou abaixo das setas, incluindo uridina difosfato (UDP) e uridina monofosfato (UMP). A FIG. 2 representa uma via proposta para a biossintese do polissacárido capsular de serotipo 5 (CP5) de S. aureus manipulado em E. coli. As enzimas proporcionadas pelo aglomerado de antigénio 0 de P. aeruginosa Oil estão indicadas como na FIG. 1. As enzimas de CP5 de S. aureus estão indicadas como Cap5 (comparar com a FIG. 6) . WecB e WecC são enzimas de E. coli requeridas para a produção de UDP-ManNAcA. Outras proteínas e enzimas representadas incluem uridina difosfato (UDP), uridina monofosfato (UMP) e coenzima A (CoA). A FIG. 3 representa uma via proposta para a biossintese do polissacárido capsular de serotipo 8 (CP8) de S. aureus manipulado. Os nomes dos genes estão indicados por setas (comparar com as FIG. 1, 2 e 6) . UDP, UMP: uridina difosfato, uridina monofosfato. CoA: coenzima A. A FIG. 4 representa a sobreposição estrutural de Estruturas de Unidade de Repetição (RU) de antigénio 0 capsular de S. aureus e P. aeruginosa. A FIG. 5A representa a análise de SDS-PAGE do alongamento da RU (unidade de repetição) do antigénio 0 de 011 incompleto por enzimas de S. aureus. A FIG. 5B representa a imunodeteção do alongamento da RU do antigénio 0 de 011 incompleto por enzimas de S. aureus. A FIG. 6 representa uma estratégia, numa forma de realização da invenção, para a construção dos aglomerados dos genes 011/CP55 e 011/CP8 quiméricos. A FIG. 7A representa LPS de CP5 polimerizado de uma forma de realização da invenção detetado em extratos lipidicos de E. coli. A FIG. 7B representa LPS de CP8 polimerizado de uma forma de realização da invenção detetado em extratos lipidicos de E. coli. A FIG. 8A representa a produção de LPS de CP5 recombinante de uma forma de realização da invenção analisada por SDS-PAGE e corada por prata, em dependência de gene de resistência a antibiótico no plasmideo pLAFR contendo o aglomerado quimérico em células W3110 hwecA. A FIG. 8B representa a produção de LPS de CP5 recombinante de uma forma de realização da invenção analisada por SDS PAGE, corada por prata e imunodeteção, em dependência de gene de resistência a antibiótico no plasmideo pLAFR contendo o aglomerado quimérico em células W3110 ΔwecA. A FIG. 9 representa a produção de LPS de CP5 recombinante de uma forma de realização da invenção analisada por SDS PAGE e por imunodeteção, em dependência de promotor na frente do aglomerado quimérico em células W3110 AwecA. A FIG. 10A mostra os resultados da análise de HPLC de uma forma de realização da RU recombinante de CP5 da presente invenção produzida utilizando o aglomerado de CP5 quimérico (SEQ ID N°: 2) . A FIG. 10B mostra os resultados da análise de HPLC de uma forma de realização da RU recombinante de CP8 da presente invenção produzida utilizando o aglomerado de CP8 quimérico desprovido da polimerase cap8l. A FIG. 11A mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico especifico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP5 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 37 minutos observado na FIG. 10A. A FIG. 11B mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico específico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP5 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 40 minutos observado na FIG. 10A.
A FIG. 11C mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico especifico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP8 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 32 minutos observado na FIG. 10B. A FIG. 11D mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico especifico produzido pela expressão de uma forma de realização do aqlomerado de CP8 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 38 minutos observado na FIG. 10B.
A FIG. 11E mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico especifico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP8 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 45 minutos observado na FIG. 10B. A FIG. 11F mostra os resultados da análise de HPLC de uma forma de realização da otimização da estrutura de glicano. A FIG.11G apresenta os resultados da análise de HPLC do repertório de glicano de CP5 completo presente em UndPP em células E. coli numa forma de realização da presente invenção. A FIG. 11H apresenta os resultados da análise de HPLC de glicanos de CP5 desacetilados e homogeneidade de RU numa forma de realização da invenção. A FIG. 111 proporciona os resultados da análise de HPLC do repertório de glicano de CP8 presente em UndPP em células E. coli numa forma de realização da presente invenção. A FIG. 11J mostra resultados de HPLC, numa forma de realização da presente invenção, da desacetilação de glicanos de CP8 e homogeneidade de RU. A FIG. 11K apresenta resultados de HPLC mostrando redução na polimerização de RU e aumento em LLO induzido por co-expressão de wzzOl com o aglomerado quimérico de CP8 numa forma de realização da presente invenção. A FIG. 12 mostra os resultados da análise de SDS-PAGE do bioconjugado EPA-CP5 purificado de cromatografia de afinidade de Ni2+ de células, em formas de realização da presente invenção, sem e com o gene cap5K de flipase de S. aureus (SEQ ID N°: 2 e 3) . A FIG. 13A apresenta a análise de bioconjugado de CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, purificado por cromatografia de afinidade de Ni2+ e cromatografia de troca aniónica. A FIG. 13B representa as massas M/Z verificadas para o sítio de glicosilação no péptido DNNNSTPTVISHR tripsinizado ligado N-glicosidicamente à massa de RU O-acetilada (m/z=2088 ([M+H]+) ) , de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A inserção ilustra a estrutura de RU conjugada ao péptido. A FIG. 13C representa as massas M/Z verificadas para o sítio de glicosilação no péptido DQNR tripsinizado ligado N-glicosidicamente à massa de RU O-acetilada (m/z=1165 ([M+H]+)), de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A inserção ilustra a estrutura de RU conjugada ao péptido. A FIG. 13D representa uma análise de bioconjugado de CP8-EPA purificado por cromatografia de afinidade de Ni2+ e cromatografia de troca aniónica, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 13E representa bioconjugado de CP5-EPA purificado de células contendo 3 (esquerda) ou 2 plasmideos (pista direita) para a produção de glicoconjugado, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 13F representa a análise de bioconjugado de CP8-EPA purificado por cromatografia de afinidade de Ni2+, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 14A apresenta a análise de MALDI de Elevada Massa de um bioconjugado de CP5-EPA purificado de uma forma de realização da invenção produzido utilizando o sistema de 3 plasmideos da FIG. 13A. A FIG. 14B mostra a caracterização por cromatografia de exclusão por tamanho de bioconjugado de CP5-EPA de uma forma de realização da invenção produzido utilizando o sistema de 3 plasmideos da FIG. 13A. A FIG. 14C mostra a análise de SDS PAGE e imunodeteção de bioconjugado de CP5-Hla purificado, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 14D apresenta os resultados de bioconjugado de CP5-AcrA purificado, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 14E apresenta os resultados de bioconjugado de CP5-C1ÍA purificado, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 15A representa os anticorpos anti-CP5 específicos deduzidos em murganhos por bioconjugado de CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 15B representa os anticorpos anti-CP5 específicos deduzidos em coelhos por bioconjugado de CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 16A ilustra a atividade opsonofagocítica in vitro
(em S. aureus Reynolds) de anticorpos específicos de CPS deduzidos por imunização de coelhos com CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 16B ilustra a atividade opsonofagocítica in vitro
(em S. aureus USA 100) de anticorpos específicos de CPS deduzidos por imunização de coelhos com CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A FIG. 17A representa os resultados de imunização passiva utilizando anticorpos anti-CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, em murganhos estimulados i.p. com ~3,6.107 CFU da estirpe Reynolds de S. aureus. A FIG. 17B representa os resultados de imunização passiva utilizando anticorpos anti-CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da invenção, em murganhos injetados com 2 mg de IgG de CP5-EPA.
A FIG. 17C representa os resultados de imunização passiva utilizando anticorpos anti-CP5-EPA, de acordo com uma forma de realização da invenção, em murganhos injetados com 300 yg de IgG de CP5-EPA A FIG. 18 representa os resultados de um ensaio de imunização ativa utilizando diferentes doses de CP5-EPA como vacina, de acordo com uma forma de realização da presente invenção e do modelo de bacteriemia de murganho para estimulo.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
De acordo com uma forma de realização da presente divulgação, foi agora mostrado que um polissacárido de LPS de um organismo Gram-positivo é produzido num organismo Gram-negativo. A requerente considera que se trata de um novo resultado que representa um afastamento importante e significativo da técnica anterior.
Os ácidos nucleicos no âmbito da divulgação são exemplificados pelos ácidos nucleicos da divulgação contidos na Listagem de Sequências. Qualquer ácido nucleico que codifica um componente imunogénico, ou sua parte, o qual seja capaz de expressão numa célula hospedeira, pode ser utilizado na presente divulgação. As seguintes descrições de sequências são proporcionadas para facilitar a compreensão de determinados termos utilizados por todo o pedido e não podem ser interpretadas como limitando as formas de realização da invenção. A SEQ ID N°: 1 representa pLAFRl (Acesso Gene Bank AY532632.1) contendo a sequência de antigénio 0 de 011 de P. aeruginosa PAO103 no sitio EcoRI, cadeia complementar (parcialmente do Acesso Gene Bank AF236052). A SEQ ID N°: 2 representa pLAFRl contendo o aglomerado quimérico de CP5, correspondendo ao pLAFRl-011 com os genes cap5HIJ substituindo wbjA-wzy por recombinação homóloga. A sequência inserida também contém uma cassete de cat para seleção de clones recombinados homólogos. A SEQ ID N°: 3 representa pLAFRl contendo o aglomerado quimérico de CP5 com o gene de flipase cap5K, correspondendo ao pLAFR-011 com os genes cap5HIJ substituindo wbjA-wzy por recombinação homóloga e o cap5K clonado entre cap5J e a cassete de cat. A SEQ ID N°: 4 representa pLAFRl contendo o aglomerado quimérico de CP8 incluindo um gene de flipase, correspondendo ao pLAFRl-011 com os genes cap8KHIJ substituindo wbjA-wzy. A sequência inserida também contém uma cassete de cat para seleção de clones recombinados homólogos. A SEQ ID N°: 5 representa um plasmídeo de expressão para a produção de Hla H35L. A ORF que codifica Hla H351 está clonada em NdellSacI em pEC415. A SEQ ID N°. 6 representa o plasmideo de expressão para a produção do sítio 202 de Hla-H35L. A ORF codifica um péptido sinal de DsbA N-terminal de E. coli, um glicosítio próximo da posição 202 de aminoácido e uma cauda de HIS C-terminal. Esta construção está clonada em Nhel/Sall em pEC415. A SEQ ID N°: 7 representa o plasmideo de expressão para a produção do sítio 238 de Hla-H35L. A ORF codifica um péptido sinal de DsbA N-terminal de E. coli, um glicosítio próximo da posição 238 de aminoácido e uma cauda de HIS C-terminal. A construção acima mencionada está clonada em Nhel/Sall em pEC415. A SEQ ID N°: 8 representa o plasmideo de expressão para a produção do sítio 272 de Hla-H35L. A ORF codifica um péptido sinal de DsbA N-terminal de E. coli, um glicosítio próximo da posição 272 de aminoácido e uma cauda de HIS C-terminal. A construção acima mencionada está clonada em Nhel/Sall em pEC415. A SEQ ID N°: 9 representa um plasmideo de expressão para a produção de ClfA. 0 gene foi sintetizado quimicamente e clonado no Ndell Saci no vetor de expressão pEC415. A SEQ ID N°: 10 representa o plasmideo de expressão para a produção do sítio 290 de ClfA. A ORF codifica um péptido sinal de DsbA N-terminal de E. coli, um glicosítio próximo da posição 290 de aminoácido e uma cauda de HIS C-terminal. A construção acima mencionada está clonada em Nhel/Sall em pEC415. A SEQ ID N°: 11 representa o plasmideo de expressão para a produção do sítio 327 de ClfA. A ORF codifica um péptido sinal de DsbA N-terminal de E. coli, um glicosítio próximo da posição 327 de aminoácido e uma cauda de HIS C-terminal. A construção acima mencionada está clonada em Nhel/Sall em pEC415. A SEQ ID N°: 12 representa o plasmídeo de expressão para a produção do sitio 532 de ClfA. A ORF codifica um péptido sinal de DsbA N-terminal de E. coli, um glicositio próximo da posição 532 de aminoácido e uma cauda de HIS C-terminal. A construção acima mencionada está clonada em Nhel/Sall em pEC415. A SEQ ID N°: 13 representa a sequência de aminoácidos de EPA recombinante geneticamente destoxifiçado, com uma sequência sinal e dois sítios de glicosilação nas posições 260 e 402. A SEQ ID N°: 14 representa a sequência de aminoácidos de EPA recombinante, geneticamente destoxifiçado, sem a sequência sinal e dois sítios de glicosilação nas posições 241 e 383. A SEQ ID N°: 15 representa a ORF que codifica AcrA clonado por meio de Nhel/Sall em pEC415. A A SEQ ID N°: 6 representa o plasmídeo de expressão para a produção do sítio 130 de Hla-H35L. A ORF codifica um péptido sinal de DsbA N-terminal de E. coli, um glicositio próximo da posição 130 de aminoácido e uma cauda de HIS C-terminal. A construção acima mencionada está clonada em Nhel/Sall em pEC415. A SEQ ID N°: 17 representa CP5 que produz o aglomerado génico com cap5K de flipase, seguido de uma cassete de expressão de pglB consistindo da sequência de ADN intergénica entre galF e wbqA do serotipo 0121 de E. coli e a ORF de pglB. Este inserto está clonado no sítio EcoRI de pLAFRl. A SEQ ID N°: 18 representa CP8 que produz o aglomerado génico com cap8K de flipase, seguido de uma cassete de expressão de pglB consistindo da sequência de ADN intergénica entre galF e wbqA do serotipo 0121 de E. coli e a ORF de pglB. Este inserto está clonado no sitio EcoRI de pLAFRl. A SEQ ID N°: 19 representa CP8 que produz o aglomerado génico com cap8K de flipase, seguido de uma cassete de expressão de pglB consistindo da sequência de ADN intergénica entre galF e wbqA do serotipo 0121 de E. coli e a ORF de pglB, além disso, esta sequência tem o gene para wzz do serovar 07 de E. coli clonado em SfaAI/BspTI, i. e., entre wzx de Pseudomonas aeruginosa Oil e cap8H. O inserto está clonado no sítio EcoRI de pLAFRl. A SEQ ID N°: 20 representa um plasmídeo de expressão para EPA e wzz. A estrutura é pACT3, na qual a cassete de resistência foi substituída (canamicina por cloranfenicol) A SEQ ID N°: 21 representa wzz de serotipo 07 de E. coli clonado em pext21 Eco/Sal. A SEQ ID N°: 22 representa uma sequência peptídica apresentada nos Exemplos. A SEQ ID N°: 23 representa uma sequência peptídica apresentada nos Exemplos. A SEQ ID N°: 24 representa uma sequência consenso proteica, D/E-X-N-Z-S/T, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina. A SEQ ID N°: 25 representa um sítio de glicosilação. A SEQ ID N°: 26 representa um sítio de glicosilação. A SEQ ID N°: 27 representa um plasmídeo de expressão contendo a ORF de pglB clonada nos sítios EcoRI/BamHI.
As descrições de termos e abreviaturas surgem abaixo como utilizadas na descrição e consistentes com as utilizações conhecidas de alguém com conhecimentos gerais na técnica. As descrições são proporcionadas para facilitar a compreensão desses termos e abreviaturas e não podem ser interpretadas como formas de realização limitativas da invenção.
AcrA refere-se a uma glicoproteína de C. jejuni.
Imunização ativa refere-se à indução de imunidade (anticorpos) após exposição a um antigénio. APC refere-se a células de apresentação de antigénios.
Amp refere-se a ampicilina.
Bacteriemia refere-se à presença de bactérias viáveis no sangue em circulação. C' refere-se ao complemento.
CapA é uma enzima que se propõe ser um determinante de comprimento de cadeia em CP5 de S. aureus
CapB é uma enzima que se propõe ser um regulador do comprimento da cadeia de polissacárido em CP5 de S. aureus
CapC é uma enzima que se propõe codificar uma proteína veículo em CP5 de S. aureus
CapD uma enzima tendo uma atividade de 4,6 desidratase, convertendo o precursor UDPGlcNAc em UDP-2-acetamido-2, 6 didesoxi-D-xilo-4-hexulose em CP5 de S. aureus.
CapE é uma 4,6-desidratase 3,5-epimerase catalisando a epimerização de UDP-D-GlcNAc em UDP-2-acetamido-2, 6-didesoxi-D-xí_Zo-4-hexulose em CP5 de S. aureus.
CapF é uma redutase, catalisa a redução de UDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-D-xilo-4-hexulose em UDP-L-6dTalNAc em CP5 de S. aureus.
CapG é uma 2-Epimerase, catalisa a epimerização de UDP-L-6dTalNAc em UDP-LFucNAc em CP5 de S. aureus.
CapH em CP5 de S. aureus é uma O-acetiltransferase.
CapH em CP8 é uma transferase semelhante a capl de CP5 de S. aureus.
Capl em CP5 de S. aureus é uma glicosiltransf erase que catalisa a transferência de UDP-ManNAcA em lípido transportador-D-FucNAc-L-FucNAc produzindo o lípido transportador-D-FucNAc-L-FucNAc-ManNAcA.
CapI em CP8 é uma polimerase a qual é semelhante a CapJ em CP5 de S. aureus.
CapJ em CP5 de S. aureus é uma polimerase.
CapJ em CP8 é uma O-acetiltransferase semelhante a CapH em CP5 de S. aureus.
CapK em CP5 de S. aureus é uma flipase em.
CapK em CP8 de S. aureus é uma flipase semelhante à CapK em CP5.
CapL é uma transferase que catalisa a transferência de UDP L-FucNAc para D-FucNAc-lípido transportador produzindo o lípido transportador-D-FucNAc-L-FucNAc em CP5 de S. aureus.
CapM é uma transferase que catalisa a transferência de UDP D-FucNAc para lípido transportador produzindo o lípido transportador-D-FucNAc em CP5 de S. aureus.
CapN é uma 4-redutase que catalisa a redução de UDP 2 acetamido-2, 6-didesoxi-D-xilo-4-hexulose em UDP-D-FucNAc em CP5 de S. aureus.
CapO é uma desidroqenase que catalisa a conversão de UDP D ManNAc em UDP-ManNAcA em CP5 de S. aureus.
CapP é uma 2-epimerase que catalisa a epimerização de UDP D-GlcNAc em UDP-D-ManNAc em CP5 de S. aureus. CFU refere-se a unidade de formação de Colónia.
Cif A refere-se ao fator de aglutinação A de S. aureus, uma proteína ancorada à parede celular.
Vacina conjugada refere-se a uma vacina criada pela conjugação covalente de um antigénio polissacárido a uma proteína transportadora. A vacina conjugada deduz respostas imunitárias antibacterianas e memória imunológica. Em bebés e pessoas idosas, pode ser induzida uma resposta imunitária protetora contra antigénios polissacáridos se estes antigénios estiverem conjugados com proteínas que induzem uma resposta dependente de célula T.
Sequência consenso refere-se a uma sequência de aminoácidos, -D/E - X - N - Z - S/T-, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto Prolina, dentro da qual se encontra o sítio de conjugação de hidrato de carbono a glicoproteínas ligadas a N.
Polissacárido capsular refere-se a uma camada espessa, de tipo mucoso, de polissacárido. Polissacáridos capsulares são solúveis em água; geralmente acídicos que consistem de unidades regularmente repetidas de um a vários monossacáridos/monómeros. CP5 refere-se a polissacárido capsular tipo 5 ou polissacárido capsular de serotipo 5 de Staphylococcus aureus. CP8 refere-se a polissacárido capsular tipo 8 ou polissacárido capsular de serotipo 8 de Staphylococcus aureus. D-FucNAc refere-se a N-acetil D-fucosamina. ECA refere-se a antigénio enterobacteriano comum. ELISA refere-se a ensaio de imunoabsorção enzimática, uma técnica bioquímica utilizada, principalmente, em imunologia para detetar a presença de um anticorpo ou um antigénio numa amostra. EPA ou EP Ar refere-se a exoproteína A de P. aeruginosa recombinante não tóxica
Vacina de glicoconjugado refere-se a uma vacina consistindo de um veículo proteico ligado a um oligossacárido antigénico.
Glicosiltransferase refere-se a enzimas que atuam como um catalisador para a transferência de uma unidade de monossacárido de um açúcar de nucleótido ativado para uma molécula aceitadora de glicosilo.
Estirpe Gram-positiva refere-se a uma estirpe bacteriana que cora de roxo com coloração Gram (uma valiosa ferramenta de diagnóstico). As bactérias Gram-positivas têm uma espessa parede celular semelhante a malha constituída por peptidoglicano (50-90% da parede celular).
Estirpe Gram-negativa refere-se a uma estirpe bacteriana que tem uma camada mais fina (10% da parede celular) que cora de rosa. As bactérias Gram-negativas também têm uma membrana exterior adicional que contém lípidos e está separada da parede celular pelo espaço periplasmático.
Hla (toxina alfa) refere-se a hemolisina alfa, que é uma toxina segregada formadora de poros e um antigénio fator de virulência essencial de S. aureus.
Hla H35L refere-se a uma forma mutante de toxina alfa não tóxica mutante de Hla de S. aureus.
Cauda de histidina ou cauda de poli-histidina, é um motivo de aminoácido em proteinas que consiste de, pelo menos, cinco resíduos de histidina (His), frequentemente no terminal N ou C, da proteína utilizada para purificar de um modo muito simples e rápido, através de ligação específica a uma coluna de afinidade de níquel. IV refere-se a intravenosamente. kDa refere-se a quiloDaltons, é uma unidade de massa atómica. L-FucNAc refere-se a N-acetil L-fucosamina. LPS refere-se a lipopolissacárido. Os lipopolissacáridos (LPS), também conhecidos por lipoglicanos, são moléculas de grandes dimensões consistindo de um lípido e um polissacárido unidos por uma ligação covalente; são encontrados na membrana exterior de bactérias Gram-negativas, atuam como endotoxinas e deduzem fortes respostas imunitárias em animais.
ManNAcA refere-se a ácido N-acetilmanosaminurónico.
Estirpes de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) refere-se a estirpe de S. aureus resistente a meticilina associada com permanência hospitalar mais longa e mais infeções em unidades de cuidados intensivos, o que conduz à administração de mais antibióticos. N-glicanos ou oligossacáridos ligados a N refere-se a monossacáridos, oligossacáridos ou polissacáridos de composições variáveis que estão ligados a um azoto de ε-amida de um resíduo de asparagina numa proteína por meio de uma ligação N glicosídica.
Glicosilação proteica ligada a N refere-se a um processo ou via para ligar covalentemente "glicanos" (monossacáridos, oligossacáridos ou polissacáridos) a um azoto de cadeia lateral de asparagina (N) numa proteína alvo.
Antigénios 0 refere-se a um polímero de glicano repetitivo contido num LPS, também denominado polissacárido 0. 0 antigénio 0 está conjugado ao oligossacárido nuclear e compreende o domínio mais exterior da molécula de LPS.
Oligossacáridos ou Polissacáridos refere-se a homopolímero ou heteropolímero formado por hidratos de carbono ligados covalentemente (monossacáridos) , consistindo de unidades de repetição (monossacáridos, dissacáridos, trissacáridos, etc.) ligadas umas às outras por ligações glicosídicas.
Atividade opsonofagocítica refere-se a fagocitose de um patogeno na presença de complemento e anticorpos específicos. Considera-se que as atividades opsonofagocíticas (OPA) in vitro de anticorpos séricos representam as atividades funcionais dos anticorpos in vivo e, assim, correlacionam-se com imunidade protetora OTase ou OST refere-se a oligossacariltransferase que catalisa uma transferência mecanisticamente única e seletiva de um oligossacárido ou polissacárido (glicosilação) para o resíduo de asparagina (N) na sequência consenso de proteínas nascentes ou enroladas.
Imunização passiva é a transferência de imunidade humoral ativa na forma de anticorpos já preparados, de um indivíduo para outro.
Espaço periplasmático refere-se ao espaço entre a membrana citoplasmática interna e a membrana exterior externa de bactérias Gram-negativas. PMN refere-se a neutrófilos polimorfonucleares, os quais são os glóbulos brancos mais abundantes no sangue periférico de humanos e muitos (embora não todos) mamíferos.
Veículo proteico refere-se a uma proteína que compreende a sequência consenso dentro da qual o oligo-"poli"-sacárido está conj ugado. RU refere-se a unidade de repetição, a qual é constituída por heteropolissacáridos específicos sintetizados através do agrupamento de monossacáridos individuais num oligossacárido num transportador de undecaprenilfosfato (Und-P), seguido de polimerização num oligossacárido.
Sequência sinal refere-se a um curto (e. g., aproximadamente, 3-60 aminoácidos de comprimento) péptido na extremidade ΛΓ-terminal da proteína que dirige a proteína para diferentes localizações. UDP-D-ManNAc é UDP-N-acetil-D-manosamina UDP-D-ManNAcA é ácido UDP-N-acetil-D-manosaminurónico UDP-D-QuiNAc é UDP-N-acetil-D-quinovosamina UDP-L-FucNAc é UDP-N-acetil-L-fucosamina UDP-L-6dTalNAc é UDPN-acetil-L-pneumosamina.
Und refere-se a lípido undecaprenil ou undecaprenol, composto por onze unidades de prenol.
UndP refere-se a undecaprenilfosfato, o qual é um transportador lipídico universal (derivado de Und) de intermediários biossintéticos de glicano para polímeros de hidrato de carbono que são exportados para o envelope da célula bacteriana.
UndPP refere-se a undecaprenilpirofosfato, o qual é uma versão fosforilada de UndP. wbjA é uma glucosiltransferase em P. aeruginosa Oil wbjB é uma putativa epimerase semelhante às enzimas requeridas para a biossíntese da cápsula de CPS e CP8 em S. aureus. wbj C é uma putativa epimerase em P. aeruginosa Oil. wbjD é uma putativa epimerase em P. aeruginosa Oil. wbjE é uma putativa epimerase em P. aeruginosa Oil. wbjF é uma Glicosiltransferase em P. aeruginosa Oil. wbpL glicosiltransferase, participa na biossintese de LPS em P. aeruginosa Oil. wbpM glicosiltransferse, participa na biossintese de LPS em P. aeruginosa Oil
Formas de realização da invenção são, pelo menos parcialmente, baseadas na verificação de que C. jejuni contém um sistema geral de glicosilação de proteína ligada a N, uma característica pouco habitual para organismos procarióticos. Foi mostrado que diversas proteínas de C. jejuni são modificadas por um heptassacárido. Este heptassacárido é agrupado em UndPP, o lípido transportador, no lado citoplasmático da membrana interna, pela adição, passo a passo, de monossacáridos ativados por nucleótido catalisados por glicosiltransferases específicas. 0 oligossacárido ligado a lípido é, depois, deslocado (i. e., difunde-se transversalmente) para o espaço periplasmático por uma flipase, e. g., PglK. No passo final da glicosilação de proteína ligada a N, a OTase (e. g., PglB) catalisa a transferência do oligossacárido do lípido transportador para resíduos de Asn na sequência consenso
Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr (i. e., D/E - X - N - Z - S/T), onde os Xaa e Zaa podem ser qualquer aminoácido, exceto Pro. A requerente transferiu com êxito o aglomerado de glicosilação para o heptassacárido dentro de E. coli e foi capaz de produzir glicoproteínas ligadas a N de Campylobacter.
Foi desenvolvido um método novo e inventivo para modificar uma bactéria de hospedeiro Gram-negativa, tal como E. coli, para produzir proteínas glicosiladas para utilização como produtos vacinais contra uma bactéria Gram-positiva, tal como S. aureus. 0 desenvolvimento deste método requereu a superação de problemas significativos e, em muitos aspetos, inesperados, e afastou-se substancialmente do conhecimento convencional e da técnica anterior.
Neste método novo e inventivo, foi identificada outra bactéria Gram-negativa que produz um polissacárido que tem semelhança estrutural com o polissacárido de interesse do organismo alvo, por exemplo, S. aureus. Para objetivo desta invenção, a semelhança estrutural manifesta-se ela própria como unidades de repetição no polissacárido do alvo (e. g., S. aureus) que são parcialmente idênticas a unidades de repetição no polissacárido da bactéria identificada, outra Gram-negativa. Devido a esta última bactéria ser Gram-negativa, como é o hospedeiro, por exemplo, o organismo E. coli, a requerente admitiu inicialmente a hipótese (e, mais tarde, verificada por experiência, como discutido abaixo) de que a utilização destas vias de biossíntese num organismo E. coli modificado permitiria a biossíntese do antigénio de RU construído e o seu deslocamento do citoplasma para o periplasma do organismo E. coli modificado. Além disso, a requerente admitiu a hipótese (e, mais tarde, verificada por experiência, como discutido abaixo) de que o tamanho do polissacárido produzido através desta via de biossíntese seria muito menor do que o polissacárido produzido pela via de biossíntese do S. aureus Gram-positivo.
Como um resultado, e como discutido abaixo, o método novo e inovador desenvolvido pela requerente resolveu os difíceis problemas mencionados acima.
Além disso, foi surpreendentemente verificado que aspetos da via de LPS num organismo Gram-negativo poderiam ser utilizados para produzir polissacáridos que contêm algumas das mesmas unidades de repetição que polissacáridos capsulares nativos a bactérias Gram-positivas, tal como, por exemplo, S. aureus, como detalhado abaixo.
Deste modo, na preparação da secção de polissacárido da vacina de proteína glicosilada para S. aureus, a construção da secção de polissacárido baseada, pelo menos parcialmente, num polissacárido nativo a uma bactéria Gram-negativa, como E. coli, é uma solução surpreendente. A requerente verificou ainda que, agindo assim, é aparentemente importante encontrar uma bactéria que produza um polissacárido que seja tão semelhante quanto possível ao polissacárido de interesse produzido por S. aureus. P. aeruginosa é essa bactéria. A FIG. 1 proporciona uma representação passo a passo de uma forma de realização da preparação de monossacáridos ativados por nucleótido no citoplasma, por enzimas proporcionadas no aglomerado de antigénio 0, ou por enzimas de gestão da célula hospedeira Gram-negativa, como seria evidente a um especialista na técnica à luz desta descrição. Os passos do processo prosseguem da esquerda para a direita na representação da FIG. 1. Na forma de realização representada na FIG. 1, uma glicosilfosfatotransferase (WbpL) acrescenta D-FucNAc fosfato a UndP, formando UndPP-FucNAc. Glicosiltransferases específicas alongam, depois, ainda mais a molécula de UndPP-D-FucNAc, pela adição de monossacáridos, formando o oligossacárido de unidade de repetição (RU) (WbjE, WbjA) . A RU é, depois, deslocada para o espaço periplasmático pela proteína Wzx. A enzima Wzy polimeriza RU periplasmáticas para formar o polissacárido de antigénio 0. 0 comprimento do polímero é controlado pela proteína Wzz. Muitos oligossacáridos e polissacáridos bacterianos são agrupados em UndPP e, depois, transferidos para outras moléculas. Por outras palavras, a UndPP é uma plataforma de construção geral para açúcares nas bactérias. Em E. coli e, considera-se, muitas outras bactérias Gram-negativas, o antigénio 0 é transferido de UndPP para o núcleo de Lípido A pela enzima WaaL de E. coli, para formar o lipopolissacárido (LPS). A FIG. 2 representa uma forma de realização da preparação de monossacáridos ativados por nucleótido no citoplasma por enzimas proporcionadas no aglomerado de antigénio 0 de P. aeruginosa 011, por enzimas de gestão da célula hospedeira Gram-negat iva e por enzimas de S. aureus e/ou E. coli que se sabe serem requeridas para a biossíntese de UDP-ManNAcA (Cap50P e/ou WecBC), como seria evidente a um especialista na técnica à luz desta descrição. Na representação da FIG. 2, os passos do processo prosseguem da esquerda para a direita. Como na biossíntese de 011, WbpL e WbjE sintetizam o dissacárido nuclear. Depois, a glicosiltransferase Cap5l de S. aureus adiciona D-ManNAcA. Cap5H adiciona um grupo acetilo ao segundo resíduo de FucNAc. A acetilação pode ser o passo final da síntese de RU, como mostrado na FIG. 2. 0 deslocamento é possível de uma ou da totalidade das proteínas Wzx no sistema, as quais são Wzx de P. aeruginosa ou Cap5K expressas recombinantemente, ou enzimas semelhantes a Wzx expressas endogenamente, e. g., do aglomerado de ECA codificado no cromossoma de E. coli. A polimerização é uma atividade exclusiva da polimerase Cap5J que forma o polissacárido CP5 em UndPP. Como outros polissacáridos ligados a UndPP, o açúcar de CP5 é transferido para o núcleo de Lípido A pela enzima WaaL de E. coli, para formar LPS recombinante (cápsula de LPS). A FIG. 3 representa a preparação de monossacáridos ativados por nucleótido no citoplasma, por enzimas proporcionadas no aglomerado de antigénio 0 de P. aeruginosa Oil, por enzimas de gestão da célula hospedeira Gram-negativa e por enzimas de S. aureus e/ou E. coli que se sabe serem requeridas para a biossintese de UDP-ManNAcA (Cap80P e/ou WecBC), como seria evidente a um especialista na técnica à luz desta descrição. Na representação da FIG. 3, os passos do processo prosseguem da esquerda para a direita. Como na biossintese de 011, WbpL e WbjE sintetizam o dissacárido nuclear. Depois, a glicosiltransferase Cap8H de S. aureus adiciona D-ManNAcA. Cap8J adiciona um grupo acetilo ao segundo resíduo de FucNAc. Não se sabe se ocorre acetilação no açúcar ativado ou na RU ligada ao lípido. 0 deslocamento é possível por uma ou a totalidade das proteínas
Wzx no sistema, as quais são Wzx de P. aeruginosa ou Cap8K expressas recombinantemente, ou enzimas semelhantes a Wzx expressas endogenamente, e. g., do aglomerado de ECA codificado no cromossoma de E. coli. A polimerização é uma atividade exclusiva da polimerase Cap8l que forma o polissacárido CP8 em UndPP. 0 açúcar de CP8 é, depois, transferido para o núcleo de Lípido A em E. coli pela enzima WaaL. A FIG. 4 ilustra as diferentes estruturas dos polissacáridos Oil, CP5 e CP8. Mostra-se na FIG. 4 que as RU partilham a estrutura tronco idêntica, consistindo do UndPP e do dissacárido α-D-FucNAc-(1,3)-L-FucNAc. As RU de S. aureus são parcialmente decoradas com um único grupo 0-acetilo, no L-FucNAc do meio ou no resíduo de ManNAcA, o que é característico das RU de S. aureus. A ligação do segundo e terceiro açúcar nas RU de S. aureus difere entre si, assim como a ligação entre as RU polimerizadas. À direita, as estruturas de açúcar são mostradas numa representação diferente. 0 número próximo das setas para trás (CP5 e CP8) indica a posição do carbono modificado com um grupo O-acetilo. Uma representação alternativa das estruturas de RU está mostrada no canto inferior esquerdo. Como mostrado na FIG. 4, existe grande sobreposição entre a RU no antigénio 011 que é parte de um polissacárido nativo a P. aeruginosa e aquelas das cápsulas de CP5 e CP8 das respetivas estirpes de Staphylococcus. Em particular, como mostrado na FIG. 4, a porção L-FucNAc—>D-FucNAc na RU é idêntica em ambas.
Noutro aspeto, a divulgação caracteriza um método de identificação de um polissacárido alvo para utilização na glicosilação de uma proteína com o referido polissacárido alvo, no todo ou em parte. A referida proteína glicosilada compreendendo o polissacárido alvo pode ser utilizada, por exemplo, em composições vacinais. 0 método de identificação de um polissacárido alvo inclui: identificação de uma bactéria Gram-positiva, tal como S. aureus, como um alvo; identificação de uma primeira unidade de repetição de um polissacárido produzido pela referida bactéria Gram-positiva compreendendo, pelo menos, três monómeros; identificação de um polissacárido produzido por uma bactéria de uma espécie Gram-negativa, compreendendo uma segunda unidade de repetição compreendendo, pelo menos, dois dos mesmos monómeros que a referida primeira unidade monomérica de repetição.
Consequentemente, numa forma de realização da divulgação, um método de modificação de uma bactéria de uma primeira espécie Gram-negativa inclui: identificação de uma bactéria Gram-positiva, tal como S. aureus, como um alvo; identificação de uma primeira unidade de repetição de um polissacárido produzido pela referida bactéria Gram-positiva compreendendo, pelo menos, três monómeros; identificação de um polissacárido produzido por uma bactéria de uma segunda espécie Gram-negativa, compreendendo uma segunda unidade de repetição compreendendo, pelo menos, dois dos mesmos monómeros que a referida primeira unidade de repetição; inserção na referida bactéria de uma primeira espécie Gram-negativa de uma ou mais sequências nucleotidicas que codifica glicosiltransferases que agrupam um trissacárido, contendo: a) referida segunda unidade de repetição; e b) um monómero da referida primeira unidade de repetição não presente na referida segundo unidade de repetição; inserção de uma sequência nucleotidica que codifica uma proteína, tal como uma proteína compreendendo, pelo menos, uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e inserção de uma sequência nucleotidica que codifica uma OTase.
Numa forma de realização da divulgação, o método compreende ainda a inserção numa bactéria Gram-negativa hospedeira de uma ou mais sequências nucleotidicas que codifica glicosiltransferases que agrupam um trissacárido contendo um monómero de uma primeira unidade de repetição não presente numa segunda unidade de repetição e que agrupam a segunda unidade de repetição. Uma forma de realização adicional da divulgação, envolve a inserção de uma ou mais glicosiltransferases de uma bactéria Gram-negativa que agrupam, pelo menos, uma unidade monomérica de uma primeira unidade de repetição e uma ou mais glicosiltransferases de uma bactéria Gram-positiva, tal como S. aureus, que agrupam, pelo menos, dois monómeros de uma segunda unidade de repetição. 0 método compreende, adicionalmente, a inserção numa bactéria hospedeira
Gram-negativa de uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína e uma sequência nucleotídica que codifica uma OTase.
Em, pelo menos, uma forma de realização da divulgação, é produzida uma estirpe de E. coli hospedeira que transporta os correspondentes ácidos nucleicos que codificam as requeridas enzimas das estirpes CP5 e CP8 de S. aureus, as quais se acumulam, deslocam e polimerizam as unidades de repetição construídas. Numa forma de realização, as glicosiltransferases específicas necessárias correspondem àquelas que formam a RU L-FucNAc->D-FucNAc que são nativas a P. aeruginosa, e às glicosiltransferases correspondentes às que adicionam o monossacárido D-ManNAcA à RU completa que são nativas a cada das estirpes CP5 e CP8 de S. aureus. Uma tal forma de realização pode, ainda, incluir a utilização de um plasmídeo para injetar os ácidos nucleicos na célula hospedeira. Uma forma de realização adicional envolve a utilização, num plasmídeo, de ácidos nucleicos que codificam para as glicosiltransferases correspondentes a L-FucNAc-->D-FucNAc e, num plasmídeo diferente, ácidos nucleicos que codificam para as glicosiltransferases correspondentes a D-ManNAcA. Um benefício dessas formas de realização, surpreendente, à luz da técnica anterior, é que a via de biossíntese de LPS modificada de P. aeruginosa que é agora responsável pela produção do polímero de RU construído da cápsula de S. aureus resulta numa estrutura que é muito menor do que a cápsula de S. aureus. A presente divulgação é adicionalmente dirigida a uma proteína N-glicosilada recombinante compreendendo, pelo menos, uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e, pelo menos, um oligossacárido ou polissacárido de uma bactéria
Gram-positiva ligado à referida sequência consenso. Noutra forma de realização, a proteína IV-glicosilada recombinante compreende duas ou mais das referidas sequências consenso inseridas. Ainda numa forma de realização adicional, a proteína N-glicosilada recombinante compreende dois ou mais dos referidos oligossacáridos ou polissacáridos de S. aureus. Ainda numa forma de realização adicional, a proteína ΛΓ-glicosilada recombinante compreende duas ou mais das referidas sequências consenso inseridas e oligossacáridos ou polissacáridos de estirpes de S. aureus diferentes, por exemplo, da estirpe do polissacárido capsular 5 e estirpe do polissacárido capsular 8 de S. aureus. A presente divulgação é, além disso, dirigida a uma combinação de um polissacárido capsular modificado de S. aureus com um antigénio proteico do mesmo organismo por ligação W-glicosidica.
Formas de realização da presente divulgação incluem uma proteína que, na natureza, está glicosilada. Essas proteínas naturalmente glicosiladas (e. g., proteínas de C. jejuni) contêm sequências consenso naturais mas não compreendem quaisquer sequências consenso otimizadas (í. e., introduzidas) adicionais. As proteínas naturalmente glicosiladas incluem proteínas procarióticas e eucarióticas. Formas de realização da presente divulgação incluem ainda uma proteína N-glicosilada recombinante, compreendendo uma ou mais da(s) seguinte (s) sequência (s) de aminoácidos parcial (parciais) iV-glicosilada (s) : D/E - X - N - Z - S/T, (sequência consenso otimizada), em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto Pro e em que é introduzida, pelo menos, uma da(s) referida(s) sequência(s) de aminoácidos parcial (parciais) N-glicosilada(s). A introdução da(s) sequência(s) de aminoácidos parcial (parciais) específica (s) (sequência (s) consenso otimizada(s)) em proteínas conduz a proteínas que são IV-glicosiladas eficientemente por uma OTase, tal como, por exemplo, uma OTase de Campylobacter spp., tal como, por exemplo, uma OTase de C. jejuni, nas posições de introdução. A expressão "sequência(s) de aminoácidos parcial (parciais)" como é utilizada no contexto da presente invenção também será referida como "sequência(s) consenso otimizada(s)" ou "sequência(s) consenso". A sequência consenso otimizada é ΛΓ-glicosilada por uma OTase, tal como, por exemplo, uma OTase de Campylobacter spp., tal como, por exemplo, uma OTase de C. jejuni.
De acordo com o código de uma letra internacionalmente aceite para aminoácidos, as abreviaturas D, E, N, S e T denotam ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, serina e treonina, respetivamente. A introdução da sequência consenso otimizada pode ser alcançada pela adição, eliminação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos. A adição, eliminação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos para introdução da sequência consenso otimizada pode ser alcançada por estratégias químicas sintéticas bem conhecidas dos especialistas na técnica, tal como síntese peptídica química assistida por fase sólida. Alternativamente, e preferido para polipéptidos maiores, as proteínas da presente invenção podem ser preparadas por técnicas recombinantes correntes, por adição de ácidos nucleicos que codificam para uma ou mais sequências consenso otimizadas à sequência de ácidos nucleicos de uma proteína de partida, a qual pode ser uma proteína que seja naturalmente glicosilada ou pode ser uma proteína que não seja naturalmente glicosilada.
Numa forma de realização preferida, as proteínas da presente invenção podem compreender uma ou mais, de um modo preferido, pelo menos, duas ou, pelo menos, três e, de um modo mais preferido, pelo menos, cinco das referidas sequências de aminoácidos otimizadas ΛΓ-glicosiladas introduzidas. A presença de uma ou mais sequência (s) de aminoácidos otimizada (s) ΛΤ-glicosilada (s) nas proteínas da presente invenção pode ter a vantagem para aumentar a sua antigenicidade, aumentando a sua estabilidade, afetando a sua atividade biológica, prolongando a sua meia-vida biológica e/ou simplificando a sua purificação. A sequência consenso otimizada pode incluir qualquer aminoácido, exceto prolina, na posição ou posições X e Z. A expressão "quaisquer aminoácidos" pretende abranger aminoácidos naturais comuns e raros, assim como derivados e análogos de aminoácidos sintéticos, os quaisque vão permitir que a sequência consenso otimizada seja iV-glicosilada pela OTase. Os aminoácidos comuns e raros de ocorrência natural são preferidos para X e Z. X e Z podem ser iguais ou diferentes. É de notar que X e Z podem diferir para cada sequência consenso otimizada numa proteína de acordo com a presente invenção. 0 IV-glicano ligado à sequência consenso otimizada será determinado pelas glicosiltransferases específicas e sua interação quando se agrupa o oligossacárido num transportador lipídico para transferência pela OTase. Os especialistas na técnica podem conceber o N-glicano por variação do(s) tipo(s) e quantidade das glicosiltransferases especificas presentes na célula hospedeira desejada. (Raetz & Whitfield, Endotoxinas de Lipopolissacáridos, NIH-PA Manuscrito de Autor 1-57, 19-25 (publicado na forma editada final como: Annual Rev. Biochem., 71: 635-700 (2002)); Reeves et al., Síntese de Polissacárido
Bacteriano e Nomenclatura Génica, Trends in Microbio. 4(3) : 495-503, 497-98 (Dec. 1996); e Whitfield, C. e I. S. Roberts. 1999. Estrutura, agrupamento e regulação da expressão de cápsulas em Escherichia coli. Mol Microbiol 31(5): 1307-19). "Polissacáridos", como aqui utilizado, inclui sacáridos compreendendo, pelo menos, dois monossacáridos. Os polissacáridos incluem oligossacáridos, trissacáridos, unidades de repetição compreendendo um ou mais monossacáridos (ou monómeros) e outros sacáridos, reconhecidos como polissacáridos por alguém com conhecimentos gerais na técnica. Os Λί-glicanos são aqui referidos como monossacáridos, oligossacáridos ou polissacáridos de composições variáveis que estão ligados a um azoto de ε-amida de um resíduo de asparagina numa proteína por meio de uma ligação Aí-glicosídica.
Os polissacáridos das formas de realização da invenção incluem, sem limitação, polissacáridos de S. aureus, tais como CP5 e CP8. A forma de realização da invenção inclui, ainda, polissacáridos de S. aureus que visam uma bactéria, tal como um polissacárido que visa uma estirpe de S. aureus resistente a meticilina. Onde seja aqui mencionado que os polissacáridos visam uma estirpe bacteriana, esses polissacáridos incluem polissacáridos que são da bactéria contra a qual é desejada uma resposta imunitária e incluem polissacáridos que são iguais a, baseados em derivados de, nativos de ou manipulados da bactéria contra a qual é desejada uma resposta imunitária. Não existe limitação no que respeita à origem da proteína recombinante da invenção. Numa forma de realização, a referida proteína é derivada de proteínas de mamífero, bacterianas, virais, fúngicas ou vegetais. Numa forma de realização adicional, a proteína é derivada de proteínas de mamífero, de um modo muito preferido, humanas. Para a preparação de proteínas recombinantes antigénicas de acordo com a invenção, de um modo preferido, para utilização como componentes ativos em vacinas, prefere-se que a proteína recombinante seja derivada de uma proteína bacteriana, virai ou fúngica. A glicosilação de proteínas de diversas origens é conhecida de um especialista na técnica. Kowarik et ai. "Definição da sequência consenso do sítio de N-glicosilação bacteriano" EMBO J. (2006) 1-10.
Num exemplo, numa forma de realização, a Exotoxina de P. aeruginosa (EPA) geneticamente destoxifiçada é um veículo proteico adequado. Para produção de uma versão de EPA que possa ser glicosilada, os ácidos nucleicos que codificam para EPA necessitam de ser modificados por inserção de sítios de glicosilação, como anteriormente discutido.
Os transportadores proteicos destinados à utilização em formas de realização da invenção devem, de um modo preferido, ter determinadas características imunológicas e farmacológicas. De uma perspetiva imunológica, de um modo preferido, um veículo proteico deve: (1) ter epitopos de célula T; (2) ser capaz de distribuir um antigénio a células apresentadoras de antigénios (APC) no sistema imunitário; (3) ser potente e durável; e (4) ser capaz de produzir uma resposta de IgG sistémica específica de antigénio. De uma perspetiva farmacológica, um veículo proteico deve, de um modo preferido: (1) ser não tóxico; e (2) ser capaz de distribuir antigénios eficientemente através de barreiras epiteliais intactas. De um modo mais preferido, além destas caracteristicas imunológicas e farmacológicas, um veículo proteico considerado para utilização na produção de um bioconjugado bacteriano deve: (1) ser facilmente segregado para o espaço periplasmático; e (2) ser capaz de ter epitopos antigénicos facilmente introduzidos como ganchos ou sequências lineares dentro dele. Informado por esta divulgação e conhecimento de alguém com conhecimentos gerais na técnica, um praticante com conhecimentos gerais na técnica pode, rotineiramente, considerar e identificar transportadores proteicos adequados que podem ser utilizados em formas de realização particulares da invenção.
Numa forma de realização da invenção, a proteína AcrA de Campylobacter é um veículo proteico.
Numa forma de realização adicional da invenção, a Exotoxina de P. aeruginosa (EPA) geneticamente destoxifiçada é um veículo proteico, no qual o organismo alvo para o qual se deseja uma vacina é o S. aureus. Contrariamente a AcrA, que contém sítios de glicosilação naturais, o EPA não contém tais sítios de glicosilação naturais e necessita de ser modificado por inserção de sítios de glicosilação (e. g., inserção de ácidos nucleicos que codificam para a sequência consenso otimizada, como discutido anteriormente, na sequência de ácidos nucleicos que codificam para EPA). Numa forma de realização adicional, o EPA é modificado para se introduzir dois sítios de glicosilação que vão permitir a glicosilação com o antigénio de S. aureus. Ainda numa forma de realização adicional, são introduzidas duas sequências consenso, como discutido no Exemplo 10 do documento WO 2009/104074. A sequência de aminoácidos de EPA, como modificada numa forma de realização desta invenção para conter dois sítios de glicosilação, é proporcionada como SEQ ID N°: 13 (com sequência sinal) e SEQ ID N°.: 14 (sem sequência sinal). Os sítios de glicosilação na SEQ ID N°: 13 são DNNNS e DQNRT, nas posições 2 60DNNNS e 402DQNRT. Os sítios de glicosilação na SEQ ID N°: 14 são DNNNS e DQNRT, nas posições 241DNNNS e 383DQNRT.
Uma proteína transportadora, tal como EPA, é uma proteína na qual podem ser adicionados sítios de Aí-glicosilação na produção de um bioconjugado bacteriano. Os sítios de N-glicosilação requerem a introdução das sequências consenso discutidas anteriormente, nomeadamente, inserção dos sequões D/E - X - N - Z-S/T, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina. A requerente verificou que essas sequências consenso, de um modo preferido, são introduzidas em ganchos de superfície, por inserção, ao invés de mutação, e pela utilização de resíduos flanqueantes adicionalmente inseridos e por mutação de resíduos flanqueantes, para otimizar o funcionamento do sítio de Aí-glicosilação.
Alguns antigénios de subunidade de proteína bem caracterizados de S. aureus são a hemolisina alfa (toxina alfa, Hla) , fator de aglutinação alfa (ClfA) , IsdB e Leucocidina de Panton-Valentine (PVL).
Hla é uma toxina de formação de poros segregada e um fator de virulência essencial de MRSA num modelo de murganho de pneumonia de S. aureus. O nível de expressão de Hla por estirpes de S. aureus independentes correlaciona-se diretamente com a sua virulência. Mostrou-se que a imunização ativa com uma forma mutante de Hla (Hla H351, SEQ ID N°: 5), que não consegue formar poros (Menzies, B. E. e D. S. Kernodle. 1996. A imunização passiva com antissoro contra um mutante de toxina alfa não tóxico de Staphylococcus aureus é protetora num modelo murino. Infect Iirrnun 64:1839-41; Jursch, R., A. Hildebrand, G. Hobom, J. Tranum-Jensen, R. Ward, M. Kehoe e S. Bhakdi. 1994. Resíduos de histidina próximos da terminação N de toxina alfa estafilocócica como repórteres de regiões que são criticas para a oligomerização e a formação de poros. Infect Immun 62(6) : 2249-56), produzia respostas de imunoglobulina G específicas de antigénio e proporcionava proteção contra a pneumonia estafilocócica. A transferência de anticorpos específicos de Hla protege animais não imunizados contra estímulo por S. aureus e previne a lesão de células epiteliais de pulmão humano durante a infeção (Bubeck Wardenburg, J., A. M. Palazzolo-Ballance, M. Otto, 0. Schneewind e F. R. DeLeo. 2008. A leucocidina de Panton-Valentine não é um determinante de virulência em modelos murinos de doença de Staphylococcus aureus resistente a meticilina associada à comunidade. J Infect Dis 198:1166-70). Para ser utilizada como uma vacina, a mutação H35L em Hla é requerida para eliminar a toxicidade da proteína (Menzies, B. E. e D. S. Kernodle. 1994. Mutagénese dirigida a sítio do gene da toxina alfa de Staphylococcus aureus: papel das histidinas na atividade da toxina in vitro e num modelo murino. Infect Immun 62:1843-7). O ClfA contém um domínio resistente a protease que é utilizado para imunização. A imunização passiva de murganhos com anticorpos anti-ClfA e anti-CP5 esterilizou eficazmente as glândulas mamárias num modelo de infeção de glândula mamária (Tuchscherr, L. P., F. R. Buzzola, L. P. Alvarez, J. C. Lee e D. O. Sordelli. 2008. Anticorpos para polissacárido capsular e fator de aglutinação A, previnem mastite e o surgimento de variantes não encapsulados e de colónias pequenas de Staphylococcus aureus em murganhos. Infect Immun 76: 5738-44).
Uma forma de realização adicional da invenção inclui a glicosilação de proteínas nativas a S. aureus, por exemplo, Hla e ClfA. Em formas de realização exemplificativas adicionais da invenção, o veículo proteico utilizado pode ser selecionado como sendo a proteína Hla, por exemplo, Hla H351 (por exemplo, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8 ou SEQ ID N°: 16). Noutra forma de realização exemplificativa adicional da invenção, o veículo proteico é a proteína ClfA (por exemplo, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12). A divulgação é ainda dirigida a organismos procarióticos hospedeiros recombinantes, compreendendo: uma sequência nucleotídica que codifica uma ou mais glicosiltransferases de uma primeira espécie procariótica, tal como uma espécie Gram-positiva; uma ou mais glicosiltransferases de uma espécie procariótica diferente, tal como uma espécie Gram-negativa; uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína; e uma sequência nucleotídica que codifica uma OTase. A divulgação é, adicionalmente, dirigida a um organismo procariótico hospedeiro recombinante, compreendendo uma sequência nucleotídica introduzida que codifica glicosiltransferases nativas apenas a um organismo procariótico Gram-positivo; uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína; e uma sequência nucleotídica que codifica uma OTase. A divulgação também é dirigida a um organismo procariótico hospedeiro recombinante ou manipulado, compreendendo: uma sequência nucleotídica que codifica uma glicosiltransferase nativa a uma primeira espécie procariótica, a qual é, por exemplo, diferente do organismo procariótico hospedeiro; uma sequência nucleotidica que codifica uma glicosiltransferase nativa a uma segunda espécie procariótica diferente da espécie do referido primeiro organismo procariótico e, por exemplo, diferente do referido hospedeiro. 0 organismo procariótico manipulado também pode, por exemplo, compreender uma primeira espécie procariótica que seja uma espécie Gram-positiva. 0 organismo procariótico manipulado também pode, por exemplo, compreender uma segunda espécie procariótica que seja uma espécie Gram-negativa. A divulgação inclui, ainda, um organismo procariótico hospedeiro Gram-negativo recombinante ou manipulado, compreendendo: uma sequência nucleotidica que codifica uma glicosiltransferase nativa a uma espécie procariótica Gram-negativa que é, por exemplo, diferente do referido organismo procariótico hospedeiro; uma sequência nucleotidica que codifica uma glicosiltransferase nativa a S. aureus; uma sequência nucleotidica que codifica uma proteína; e uma sequência nucleotidica que codifica uma OTase. A invenção inclui, ainda, um hospedeiro de E. coli recombinante ou manipulado, compreendendo: uma sequência nucleotidica que codifica uma glicosiltransferase nativa a P. aeruginosa; uma sequência nucleotidica que codifica uma ou mais glicosiltransferases nativas a estirpe CP5 de S. aureus e/ou a estirpe CP8 de S. aureus; uma sequência nucleotidica que codifica um EPA de P. aeruginosa, hemolisina alfa de S. aureus ou veiculo proteico do fator de aglutinação A de S. aureus; e uma sequência nucleotidica que codifica uma OTase, por exemplo, e OTase nativa a C. jejuni.
Além da utilização da via de biossíntese do outro organismo Gram-negativo no organismo de E. coli hospedeiro modificado, numa forma de realização adicional, também estão incluídos no organismo de E. coli hospedeiro ácidos nucleicos que codificam para (i) glicosiltransferases para construção da estrutura das unidades de repetição do polissacárido do outro organismo Gram-negativo (que são idênticas às unidades de repetição do polissacárido de interesse do organismo de S. aureus Gram-positivo alvo) e (ii) glicosiltransferases para construção das unidades do polissacárido de interesse do organismo de S. aureus Gram-positivo alvo que não são encontradas no polissacárido relevante do outro organismo Gram-negativo e (iii) enzimas para deslocamento e polimerização da RU de interesse construída do organismo de S. aureus Gram-positivo alvo para formar um polissacárido semelhante à cápsula de S. aureus. Em particular, nesta forma de realização, os ácidos nucleicos que codificam para (i) tiveram origem numa outra bactéria Gram-negativa, enquanto que os ácidos nucleicos que codificam para (ii) e (iii) tiveram origem no organismo de S. aureus Gram-positivo alvo.
Outro aspeto da divulgação é dirigido a: um organismo procariótico hospedeiro manipulado, compreendendo: i) uma sequência nucleotidica que codifica glicosiltransferases nativas a uma espécie procariótica Gram-positiva; ii) uma sequência nucleotidica que codifica uma proteína; e iii) uma sequência nucleotidica que codifica uma OTase, em que as sequências que codifica genes transportadores da referida espécie procariótica Gram-positiva estão eliminadas. Essa forma de realização envolve uma construção de ácido nucleico introduzida que codifica apenas glicosiltransferases Gram-positivas.
Com respeito aos outros ácidos nucleicos que seriam inseridos no hospedeiro em uma ou mais outras formas de realização, ácidos nucleicos que codificam uma proteína, tais como AcrA, Hla, ClfA OU EPA (SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12; SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14) e a oligossacariltransferase de C. jejuni (SEQ ID N°: 27), que são parte da maquinaria de glicosilação desse organismo, são injetados no hospedeiro além dos ácidos nucleicos que codificam para glicosiltransferases de cada de P. aeruginosa e S. aureus. Como um resultado, o organismo de E. coli modificado pode glicosilar a proteína AcrA com o polissacárido produzido nesse organismo por ação das glicosiltransferases de S. aureus e da outra bactéria Gram-negativa.
Uma forma de realização da divulgação envolve um organismo procariótico hospedeiro manipulado, compreendendo: i) uma sequência nucleotídica que codifica uma glicosiltransferase nativa a uma primeira espécie procariótica diferente do organismo procariótico hospedeiro; ii) uma sequência nucleotídica que codifica uma glicosiltransferase nativa a uma segunda espécie procariótica, por exemplo, uma espécie procariótica Gram-positiva, diferente do organismo procariótico hospedeiro; iii) uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína; e iv) uma sequência nucleotídica que codifica uma OTase. Em formas de realização da invenção, a primeira espécie procariótica é uma espécie Gram-negativa, por exemplo, P. aeruginosa.
No contexto da presente divulgação, células hospedeiras referem-se a qualquer célula hospedeira, e. g., uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica. Noutras formas de realização, a célula hospedeira é uma célula hospedeira procariótica, e. g., Escherichia ssp., Campylobacter ssp., Salmonella ssp., Shigella ssp., Helicobacter ssp., Pseudomonas ssp. ou Bacillus ssp. Ainda em formas de realização adicionais, a célula hospedeira é Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, etc. A divulgação é, além disso, dirigida a métodos de produção de uma vacina de bioconjugado, compreendendo a introdução num organismo procariótico hospedeiro de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais glicosiltransferases de S. aureus; uma ou mais glicosiltransferases de uma segunda espécie procariótica, uma proteína; e uma OTase. Além disso, a presente divulgação é dirigida à produção de vacinas de bioconjugado por produção, em bactérias Gram-negativas, de polissacáridos capsulares modificados em undecaprenol (Und) e ligação destes antigénios polissacáridos a um veículo proteico de escolha. A divulgação é ainda dirigida a métodos de produção de proteínas glicosiladas num organismo procariótico hospedeiro, compreendendo sequência nucleotídica que codifica glicosiltransferases nativas a um primeiro organismo procariótico e que também codificam glicosiltransferases nativas a um segundo organismo procariótico que é diferente do primeiro organismo procariótico. A presente divulgação é adicionalmente dirigida à produção de proteínas N-glicosiladas com polissacáridos capsulares de bactérias Gram-positivas, os quais são sintetizados por uma combinação de diferentes glicosiltransferases de diferentes organismos. A divulgação é, além disso, dirigida à produção de proteínas glicosiladas num organismo procariótico hospedeiro, compreendendo uma sequência nucleotídica introduzida que codifica glicosiltransferases nativas apenas a um organismo procariótico Gram-positivo.
Como é conhecido na técnica, a biossintese de diferentes polissacáridos em células bacterianas é conservada. Os polissacáridos são agrupados em lipidos transportadores de precursores comuns (nucleótidos de açúcar ativados) na membrana citoplasmática por diferentes glicosiltransferases com especificidade definida. (Whitfield, C. e I. S. Roberts. 1999. Estrutura, agrupamento e regulação da expressão de cápsulas em Escherichia coli. Mol Microbiol 31: 1307-19). A via biossintética para a produção de polissacáridos de antigénio O em Gram-negativos e para polissacárido capsular Tipo I em Gram-positivos é conservada. O processo utiliza o mesmo transportador lipidico, i. e., UndP, para agrupamento do polissacárido. Começa com a adição de um monossacárido-l-fosfato ao lipido transportador UndP no lado citoplasmático da membrana. O antigénio é acumulado por adição sequencial de monossacáridos de nucleótidos de açúcar, ativados por diferentes glicosiltransferases. O oligossacárido ligado a lipidos ou RU é, depois, deslocado através da membrana pela flipase. As RU são polimerizadas pela enzima Wzy no espaço periplasmático, que formam o denominado antigénio O em bactérias Gram-negativas ou polissacárido capsular em bactérias Gram-positivas. As bactérias Gram-negativas utilizam a enzima Wzz para regular o comprimento do polímero, o qual é, depois, transferido para o núcleo do lipido A, formando LPS. O LPS é, ainda, translocado para a membrana exterior expondo o antigénio O ao exterior (como representado, por exemplo, na FIG. 1) . As bactérias Gram-positivas, em contraste, formam a cápsula deste precursor ligado ao lipido por transporte adicional, utilizando uma maquinaria enzimática diferente e especializada. As vias biossintéticas destes polissacáridos possibilitam a produção de bioconjugados in vivo, pela captura dos polissacáridos no periplasma num veículo proteico. 0 processo da construção de polissacárido difere para polissacáridos capsulares, na medida em que o polissacárido capsular é libertado do lipido transportador após polimerização e exportado para a superfície. Em bactérias Gram-positivas, como S. aureus, os quais não contêm um compartimento periplasmático, a polimerização do antigénio ocorre no lado exterior da membrana. Além disso, a regulação do comprimento em S. aureus está incluída na maquinaria de três enzimas responsáveis pelo agrupamento da cápsula. Neste agrupamento, o polissacárido é libertado do lipido transportador e exportado para a superfície por um processo enzimático.
Os elementos genéticos encontrados no aglomerado génico requeridos para expressão da cápsula funcional em S. aureus assemelham-se à maquinaria genética encontrada em aglomerados de síntese de antigénio 0 dependente de wzy. (Dean, C. R., C. V. Franklund, J. D. Retief, M. J. Coyne, Jr., K. Hatano, D. J. Evans, G. B. Pier e J. B. Goldberg. 1999. Caracterização do lócus do antigénio 0 do serogrupo Oil de Pseudomonas aeruginosa PA103. J Bacteriol 181:4275-4284). Não obstante estas diferenças entre a construção de polissacáridos em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, foi surpreendentemente identificado e verificado que os aspetos da via de LPS num organismo Gram-negativo poderiam ser utilizados para produzir polissacáridos que contêm algumas das mesmas unidades de repetição que polissacáridos capsulares nativos a bactérias Gram-positivas, tal como, por exemplo, S. aureus. Como esses polissacáridos são produzidos pelos mecanismos da via de LPS no hospedeiro Gram-negativo, a estrutura desses polissacáridos é a mesma que em precursores de polissacáridos LPS. Tais polissacáridos produzidos em sistemas Gram-negativos da presente invenção podem, para os fins deste pedido, ser caracterizados, deste modo, como "polissacáridos capsulares modificados" ou "cápsulas de LPS". Além disso, este sistema de expressão e via biossintética sintetizados de novo, os quais combinam as vias biossintéticas de LPS e capsular, podem, para os objetivos deste pedido, ser caracterizados como sendo uma "via biossintética de LPS modificada".
Numa forma de realização da presente invenção, um polissacárido modificado produzido por uma via biossintética de LPS modificada compreende: 3Ac í 1 7+ D-ManNAcA-pT-^L-FucNAc—D-FucNAc ——► 1,4 1,4 1,3 1 n
Numa forma de realização adicional da presente invenção, um polissacárido modificado produzido por uma via biossintética de LPS modificada compreende: 4Ac r i ———► D-ManNAcA —-—►L-FucNAc α » D - FucNAr _^ 1,3 1,3 15 3 1 ^ -'ll
Utilizando a tecnologia da invenção, podem ser produzidos bioconjugados bacterianos que são imunogénicos. Podem ser realizadas modificações genéticas permitindo a conjugação in vivo de polissacáridos bacterianos em proteínas desejadas e em posições desejadas.
Outro aspeto da divulgação envolve a produção de cápsulas de LPS ou LPS modificados conjugados a um veículo proteico utilizando a via biossintética de LPS modificada, como discutido acima.
Uma forma de realização adicional da divulgação inclui uma construção de sequência nucleotídica que codifica o aglomerado de biossíntese do polissacárido completo de Cap5 e Cap8, em que os genes transportadores eliminados são capA, capB e capC de S. aureus (ver a FIG. 6) .
Uma forma de realização adicional da invenção inclui a integração do aglomerado quimérico CP5/011 (SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 17) ou do aglomerado quimérico CP8/011 (SEQ ID N°. 4, SEQ ID N°. 18 ou SEQ ID N°. 19) no genoma de uma célula hospedeira. Uma forma de realização adicional da invenção envolve a integração no genoma de uma célula hospedeira: (a) o aglomerado quimérico CP5/011 (SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 17) ou o aglomerado quimérico CP8/011 (SEQ ID N°. 4 SEQ ID N° . 18 ou SEQ ID N° . 19); (b) ácidos nucleicos que codificam a OTase; e (c) ácidos nucleicos que codificam uma proteína com ou sem uma sequência consenso introduzida.
Outra forma de realização da presente divulgação é dirigida a plasmídeos, tal como, por exemplo, plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 2; SEQ ID N°: 3; SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18 e SEQ ID N°: 19. A invenção também inclui plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 13; SEQ ID N°: 14 e SEQ ID N°: 15. A invenção também se refere a plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 6; SEQ ID N°: 7 e SEQ ID N°: 8. A invenção também se refere a plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12. Além disso, a invenção é dirigida a plasmídeos compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 20; SEQ ID N°: 21 e SEQ ID N°: 27.
Formas de realização da presente divulgação são, além disso, dirigidas a células bacterianas transformadas, tal como, por exemplo, incluindo uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°. 2; SEQ ID N°. 3; SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 19; SEQ ID N°: 20; SEQ ID N°: 21 e SEQ ID N°: 27. Está ainda incluída na invenção uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20. Está adicionalmente incluída uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 21. A presente invenção é, ainda, dirigida a uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 6; SEQ ID N°: 7; SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12. A divulgação é adicionalmente dirigida a células bacterianas transformadas, tal como, por exemplo, incluindo uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°. 3; SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18; e SEQ ID N°: 19 e em que a referida célula bacteriana expressa uma glicosiltransferase nativa a P. aeruginosa e uma glicosiltransferase nativa a CP5 e/ou CP8 de S. aureus. Está ainda incluída na divulgação uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18 e SEQ ID N°: 19, em que a referida célula bacteriana expressa uma glicosiltransferase nativa a P. aeruginosa, uma glicosiltransf erase nativa a CP5 e/ou CP8 de S. aureus e PglB. Está ainda incluída adicionalmente na presente divulgação (a) uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo a SEQ ID N°. 19, em que a referida célula bacteriana expressa uma glicosiltransferase nativa a P. aeruginosa, uma glicosiltransferase nativa a CP8 de S. aureus, Wzz de E. coli serovar 07 e PglB; (b) uma célula bacteriana transformada com um plasmídeo compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°. 19 e SEQ ID N°. 20, em que a referida célula bacteriana expressa uma glicosiltransferase nativa a P. aeruginosa, uma glicosiltransferase nativa a CP8 de S. aureus, Wzz (regulador de comprimento) , EPA e PglB; e (c) uma célula bacteriana compreendendo uma ou mais das SEQ ID N°. 16; SEQ ID N°: 6; SEQ ID N°: 7; SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°. 13; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12.
As formas de realização da presente divulgação são, adicionalmente, dirigidas a um método de indução de uma resposta imunitária contra uma infeção causada por bactérias Gram-positivas e outras bactérias num mamífero, tal como, por exemplo, num humano. Numa forma de realização, o método compreende a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo: proteína compreendendo, pelo menos, uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e um ou mais oligossacáridos ou polissacáridos, os um ou mais oligossacáridos ou polissacáridos que são iguais ou diferentes a outros dos um ou mais oligossacáridos ou polissacáridos, de uma bactéria
Gram-positiva ligada à referida sequência consenso. Uma forma de realização adicional da presente divulgação inclui um método de indução de uma resposta imunitária contra uma infeção causada por S. aureus num mamífero, compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo: uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; pelo menos, um oligossacárido ou polissacárido de S. aureus, tal como polissacárido CP5; e um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Outra forma de realização da divulgação é dirigida à indução de uma resposta imunitária contra uma infeção causada por S. aureus num mamífero, compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo: uma proteína compreendendo uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; pelo menos, um polissacárido CP8 de S. aureus; e um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Ainda uma forma de realização adicional é dirigida à indução de uma resposta imunitária contra uma infeção causada por S. aureus num mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína com duas ou mais sequências consenso e oligossacáridos ou polissacáridos de diferentes estirpes bacterianas Gram-positivas. Ainda uma forma de realização adicional é dirigida à indução de ma resposta imunitária contra uma infeção causada por S. aureus num mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína com duas ou mais sequências consenso e polissacáridos compreendendo CP5 de S. aureus e CP8 de S. aureus.
Nos casos, nesta descrição, onde sejam anotadas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos especificas, será entendido que a presente invenção abrange sequências homólogas que ainda incorporam a mesma funcionalidade que as sequências anotadas. Numa forma de realização da invenção, essas sequências são, pelo menos, 85% homólogas. Noutra forma de realização, essas sequências são, pelo menos, 90% homólogas. Ainda em formas de realização adicionais, essas sequências são, pelo menos, 95% homólogas. A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos ou aminoácidos é conhecida de um especialista na técnica.
As sequências de ácidos nucleicos aqui descritas, tal como aquelas descritas nas listagens de sequências que acompanham esta descrição, são apenas exemplos e será evidente a um especialista na técnica que estas sequências podem ser combinadas de diferentes modos. Formas de realização adicionais da invenção incluem variantes de ácidos nucleicos. Um variante de um ácido nucleico (e. g., um ácido nucleico codão-otimizado) pode ser substancialmente idêntico, ou seja, pelo menos, 70% idêntico, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idêntico às SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N° : 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 e/ou SEQ ID N°: 27. Variantes de ácido nucleico de uma sequência que contêm SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°. 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 e/ou SEQ ID N°: 27. Inclui ácidos nucleicos com uma substituição, variação, modificação, substituição, eliminação e/ou adição de um ou mais nucleótidos (e. g., 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou mais nucleótidos) de uma sequência que contém as SEQ ID N° : 1, SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 3, SEQ ID. N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N° : 7, SEQ ID N° : 8, SEQ ID N° : 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N° : 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 e/ou SEQ ID N°: 27 ou suas partes.
Tais variantes incluem ácidos nucleicos que codificamm glicosiltransferases procarióticas e que i) são expressos numa célula hospedeira, tal como E. coli e ii) são substancialmente idênticos às SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N° : 4, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18 e/ou SEQ ID N°: 19 e/ou suas partes.
Os ácidos nucleicos aqui descritos incluem ADN recombinante e ADN sintético (e. g., sintetizado quimicamente). Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia dupla ou cadeia simples. No caso de ácidos nucleicos de cadeia simples, o ácido nucleico pode ser uma cadeia sentido ou cadeia antissentido. Os ácidos nucleicos podem ser sintetizados utilizando análogos ou derivados oligonucleotídicos, como conhecido de um especialista na técnica à luz desta descrição.
Os plasmideos que incluem um ácido nucleico aqui descrito podem ser transformados em células hospedeiras para expressão. As técnicas para transformação são conhecidas dos especialistas na técnica à luz desta descrição.
Uma forma de realização adicional da divulgação envolve a produção de vacinas de bioconjugado Gram-positivo contendo cápsulas de LPS ou LPS modificados conjugados a um veiculo proteico.
Uma forma de realização adicional da divulgação envolve uma nova vacina de bioconjugado. Uma forma de realização adicional da divulgação envolve uma nova abordagem para a produção dessas vacinas de bioconjugado que utilizam células bacterianas recombinantes que produzem diretamente bioconjugados imunogénicos ou antigénicos. Numa forma de realização, as vacinas de bioconjugado podem ser utilizadas para tratar ou prevenir doenças bacterianas, tais como diarreia, infeções nosocomiais e meningite. Em formas de realização adicionais, as vacinas de bioconjugado podem ter potencial terapêutico e/ou profilático para o cancro ou outras doenças.
Noutra forma de realização da presente divulgação, complexos sintetizados de polissacáridos (i. e., resíduos de açúcar) e proteínas (í. e., transportadores proteicos) podem ser utilizados como vacinas conjugadas para proteger contra infeções, tal como infeções por S. aureus. Numa forma de realização, uma vacina de bioconjugado, tal como uma vacina Gram-positiva, compreende um veículo proteico compreendendo uma sequência consenso de ácidos nucleicos inserida; pelo menos, um oligossacárido ou polissacárido de uma bactéria Gram-positiva ligado à sequência consenso e, opcionalmente, um adjuvante. Noutra forma de realização, a presente divulgação é, ainda, dirigida a uma vacina de bioconjugado Gram-positiva, tal como uma vacina de S. aureus, compreendendo um veiculo proteico compreendendo uma sequência consenso de ácidos nucleicos inserida; pelo menos, um oligossacárido ou polissacárido de uma bactéria Gram-positiva, tais como polissacárido capsular ou cápsula de LPS, ligado à sequência consenso e, opcionalmente, um adjuvante. Noutra forma de realização da invenção, a vacina de bioconjugado de S. aureus compreende duas ou mais destas sequências consenso inseridas. Numa forma de realização adicional, a vacina de bioconjugado de S. aureus compreende dois ou mais de oligossacáridos ou polissacáridos de S. aureus. Ainda uma forma de realização adicional compreende duas ou mais das referidas sequências consenso inseridas e oligossacáridos ou polissacáridos de estirpes de S. aureus diferentes, por exemplo, da estirpe de polissacárido capsular 5 (CP5) e da estirpe de polissacárido capsular 8 (CP8) de S. aureus.
Uma forma de realização adicional da presente invenção envolve uma vacina de S. aureus realizada por um sistema de glicosilação utilizando uma via de LPS modificada, que compreende a produção de um polissacárido capsular ou cápsula de LPS modificados. Ainda uma forma de realização adicional envolve uma vacina de S. aureus realizada por um sistema de glicosilação que utiliza uma via de LPS modificada, o qual compreende a produção de um polissacárido capsular modificado a partir de ácidos nucleicos introduzidos que não codificam glicosiltransferases de uma espécie procariótica Gram-negativa.
Uma forma de realização adicional envolve uma vacina de S. aureus produzida por um sistema de glicosilação, compreendendo ácidos nucleicos que codificam: i) uma ou mais glicosiltransferases responsáveis pela produção do L-FucNAc—>D-FucNAc da RU do antigénio 011 nativo a P. aeruginosa; ii) uma ou mais glicosiltransferases responsáveis pela produção do D-ManNAcA contendo RU nativa a qualquer das estirpes CP5 ou CP8 de S. aureus; iii) uma ou mais enzimas responsáveis pelo deslocamento e polimerização das RU de CP5 ou CP8 construídas, iv) uma proteína recombinante contendo sequências consenso introduzidas; e v) oligossacariltransferase de C. jejuni. Nesta forma de realização, o organismo hospedeiro pode ser uma bactéria Gram-negativa, por exemplo, E. coli.
Uma forma de realização adicional da invenção envolve uma vacina de S. aureus produzida por um sistema de glicosilação compreendendo ácidos nucleicos que codificam: i) glicosiltransferases responsáveis pela produção do L-FucNAc—>D-FucNAc da RU do antigénio 011 nativo a P. aeruginosa; ii) uma glicosiltransferase responsável pela produção do D-ManNAcA contendo RU nativa a qualquer das estirpes CP5 ou CP8 de S. aureus; iii) proteína AcrA de C. jejuni; e iv) oligossacariltransferase de C. jejuni. Nesta forma de realização, o organismo hospedeiro pode ser a bactéria Gram-negativa, E. coli.
As vacinas da presente invenção têm utilidades terapêuticas e profiláticas. Será entendido que a vacina da invenção pode ser útil nas áreas de medicina humana e medicina veterinária. Assim, o sujeito a ser imunizado pode ser um humano ou outro animal, por exemplo, animais de criação, incluindo vacas, ovelhas, porcos, cavalos, cabras e aves domésticas (e. g., galinhas, perus, patos e gansos) e animais de companhia, tais como cães e gatos.
Noutro aspeto, a divulgação é dirigida a um método de produção de vacinas para imunização de um mamífero contra uma bactéria, tal como uma bactéria Gram-positiva. 0 método inclui: imunização de um sujeito com um bioconjugado, tal como um bioconjugado compreendendo um polissacárido Gram-positivo, e. g., um polissacárido de S. aureus e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Esta divulgação também caracteriza composições vacinais para proteção contra infeção por uma bactéria gram-positiva, tal como S. aureus, ou para tratamento de uma infeção gram-positiva, tal como infeção por S. aureus. Numa forma de realização, as composições vacinais compreendem um ou mais componentes imunogénicos, tal como a polissacárido, ou um seu fragmento ou parte, de S. aureus. Numa forma de realização adicional, as composições vacinais compreendem um ou mais componentes imunogénicos, tal como uma proteína, ou um fragmento ou porção desta, de uma bactéria Gram-negativa ou Gram-positiva.
Um aspeto da divulgação proporciona uma composição vacinai para proteção contra infeção por S. aureus que contém, pelo menos, um componente imunogénico ou fragmento de um polissacárido de S. aureus e um veículo farmaceuticamente aceitável. Esses componentes ou fragmentos imunogénicos podem, incluir, por exemplo, um polissacárido de S. aureus de, pelo menos, cerca de dois monómeros em comprimento ou, pelo menos, cerca de três monómeros em comprimento. Num aspeto adicional da invenção, uma RU de S. aureus compreende os referidos monómeros.
Essas unidades de repetição podem incluir, por exemplo, uma RU de S. aureus de, pelo menos, 1 (um) em comprimento.
Os componentes ou fragmentos imunogénicos da divulgação podem ser obtidos, por exemplo, por rastreio de polissacáridos ou polipéptidos produzidos recombinantemente ou através de síntese química ou, por exemplo, por rastreio do bioconjugado compreendendo um polissacárido e uma proteína. 0 rastreio de componentes ou fragmentos imunogénicos da divulgação pode ser realizado, utilizando um ou mais dos vários diferentes ensaios. Por exemplo, os ensaios de rastreio incluem ELISA e outros ensaios conhecidos de alguém com conhecimentos gerais na técnica.
Numa forma de realização, os componentes ou fragmentos imunogénicos são identificados pela capacidade do polissacárido e/ou proteína estimular anticorpos de IgG contra bactérias Gram-positivas, tais como polissacáridos CP5 ou CP8 de S. aureus, como determinado, por exemplo, pela resposta imunitária obtida em murganhos (FIG. 15A) e no coelho (FIG. 15B), medindo anticorpos anti-CP5 específicos (quantificados por ELISA) contra o candidato vacinai de glicoconjugado CP5-EPA e outros meios conhecidos de uma pessoa com conhecimentos gerais na técnica.
Numa forma de realização, os componentes ou fragmentos imunogénicos são identificados pela capacidade do polissacárido e/ou proteína estimular a atividade opsónica, tal como a neutralização opsonofagocítica, como determinado, por exemplo, pela neutralização de S. aureus (atividade "in vitro") com anticorpos anti-CP5-EPA de coelho (obtidos no Exemplo 7 abaixo, ver a FIG. 15B) e outros meios conhecidos de uma pessoa com conhecimentos gerais na técnica.
Ainda numa forma de realização adicional, os componentes ou fragmentos imunogénicos são identificados pela capacidade de o polissacárido e/ou proteína estimular a imunidade humoral e/ou de mediação celular contra bactérias Gram-positivas, tal como S. aureus, como determinado, por exemplo, pela proteção contra a infeção bacteriana ("estímulo") utilizando imunização ativa em murganhos (FIG. 18) com CP5-EPA e outros meios conhecidos de uma pessoa com conhecimentos gerais na técnica.
Numa forma de realização da presente invenção, uma composição vacinai da invenção pode ser baseada numa glicoproteína compreendendo um componente ou fragmento imunogénico de um polissacárido de S. aureus da invenção e, opcionalmente, compreendendo ainda um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Em formas de realização adicionais da presente invenção, uma composição vacinai pode ser baseada numa glicoproteína compreendendo um componente ou fragmento imunogénico de uma proteína de S. aureus da invenção e, opcionalmente, compreendendo ainda um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Ainda noutro aspeto adicional da invenção, uma composição vacinai pode ser baseada numa glicoproteína compreendendo um componente ou fragmento imunogénico de uma proteína de P. aeruginosa da invenção e, opcionalmente, compreendendo ainda um veículo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. É bem conhecido daqueles com conhecimentos gerais na técnica como modificar uma vacina para administração a um tipo de mamífero, por exemplo, murganhos, para administração a outro tipo de mamífero, por exemplo, humanos. Por exemplo, um especialista saberia facilmente que a eliminação da cauda de histidina do veículo proteico de uma glicoproteína utilizada numa composição vacinai em murganhos tornaria a glicoproteína adequada para administração numa composição vacinai em humanos. Por exemplo, a eliminação da cauda de HISTIDINA (cauda de HIS) em transportadores proteicos, tais como, e. g., EPA (SEQ ID N°: 13), ClfA (SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12) e Hla (SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 16), seria reconhecida pela sua utilização numa glicoproteína para administração a um humano.
Deve ser compreendido que o melhoramento de qualquer dos sintomas de uma Gram-positiva, por exemplo, S. aureus, ou outra infeção bacteriana ou doença é um objetivo clínico desejável, incluindo um atenuar da dosagem de medicação utilizada para a infeção ou doença causada por uma Gram-positiva, por exemplo, uma infeção ou doença causada por S. aureus, ou outra infeção ou doença de causa bacteriana ou um aumento na produção de anticorpos no soro ou muco de doentes. Será evidente aos especialistas na técnica que algumas das composições vacinais da divulgação são úteis para a prevenção de uma infeção por Gram-positiva, por exemplo, uma infeção por S. aureus, ou outra infeção bacteriana, algumas são úteis para o tratamento de uma infeção Gram-positiva, por exemplo, uma infeção por S. aureus, ou outra infeção bacteriana e algumas são úteis para a prevenção e o tratamento dessas infeções.
As formas de realização da presente invenção, tais como vacinas e outros agentes farmacêuticos podem, opcionalmente, ser preparadas utilizando veículos, excipientes, diluentes e/ou adjuvantes adequados e farmaceuticamente aceitáveis, como são bem conhecidos na técnica e evidentes à luz desta descrição. Um excipiente, diluente ou adjuvante pode ser um material sólido, semissólido ou líquido que pode servir como um veículo ou meio para o ingrediente ativo. A luz desta descrição, alguém com conhecimentos gerais na técnica no campo da preparação de composições, pode facilmente selecionar a forma e modo de administração apropriados, dependendo das características particulares do produto selecionado, da doença ou estado a ser tratado, da fase da doença ou estado e outras circunstâncias relevantes (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). A proporção e natureza do diluente, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável são determinadas pela solubilidade e propriedades químicas do composto farmaceuticamente ativo selecionado da via de administração escolhida e da prática farmacêutica corrente.
Consequentemente, em formas de realização da invenção, as composições vacinais compreendem componentes ou fragmentos imunogénicos, e. g., polissacárido ou fragmento deste de S. aureus e/ou proteína ou fragmento desta de S. aureus ou P. aeruginosa e, opcionalmente, incluem um veículo farmaceuticamente aceitável. A expressão "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo que é não tóxico. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, um ou mais de água, soro fisiológico, solução salina tamponada com fosfatos, dextrose, glicerol, etanol, e semelhantes, assim como as suas combinações. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ainda compreender quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que melhoram a estabilidade em armazenamento ou eficácia do anticorpo. Esses veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, diluentes líquidos, semissólidos ou sólidos que servem como veículos, excipientes ou meios farmacêuticos. Pode ser utilizado qualquer diluente conhecido na técnica. Diluentes exemplificativos incluem, mas não estão limitados a polioxietileno monolaurato de sorbitano, estearato de maqnésio, metil- e propil-hidroxibenzoato, talco, alginatos, amidos, lactose, sacarose, dextrose, sorbitol, manitol, goma de acácia, fosfato de cálcio, óleo mineral, manteiga de cacau e óleo de teobroma.
Além disso, em formas de realização adicionais da invenção, a composição vacinai pode, opcionalmente, incluir um adjuvante ou uma combinação de adjuvantes, incluindo, mas não limitados a adjuvantes particulados, tais como sais de alumínio (hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de hidroxifosfato de alumínio, etc.); emulsões, tal como óleo em água (MF59, AS03) ; combinações de lípido e sal, tal como AS04; água em óleo (Montanida); ISCOMS, lipossomas/virossomas; nanopartículas e micropartículas, etc.; não particulados, tal como péptidos; saponinas (QS21); MPL A; citocinas; derivados de ADN; toxinas bacterianas; etc. Uma forma de realização adicional inclui adjuvantes utilizados em animais, tais como Adjuvante Completo de Freund e Adjuvante Incompleto de Freund, adjuvantes baseados em micolato (e. g., dimicolato de trealose), lipopolissacárido bacteriano (LPS), peptidoglicanos (i. e., mureínas, mucopéptidos ou glicoproteínas, tais como N-Opaca, dipéptido de muramilo [MDP] ou análogos de MDP), proteoglicanos, preparações estreptocócicas (e. g., OK432), DEAE-dextrano, óleos neutros (tal como migliol) , óleos vegetais (tal como óleo de amendoim) , Pluronic, o sistema adjuvante de Ribi ou interleucinas, particularmente aquelas que estimulam a imunidade de mediação celular. 0 adjuvante utilizado dependerá, em parte, da composição e tipo da vacina de glicoconjugado. A quantidade de adjuvante a administrar vai depender do tipo e estatura do mamífero. As dosagens ótimas podem ser facilmente determinadas por métodos de rotina.
Um aspeto adicional da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica, compreendendo, pelo menos, uma glicoproteína de acordo com invenção. A preparação de medicamentos compreendendo glicoproteínas é bem conhecida na técnica. 0 esquema de preparação para a composição farmacêutica final e o modo e pormenores da sua administração dependerão da proteína, da célula hospedeira, do ácido nucleico e/ou do vetor empregues.
Será evidente aos especialistas na técnica que a quantidade terapeuticamente eficaz de polissacárido ou glicoproteína desta invenção dependerá, inter alia, do programa de administração, da dose unitária de anticorpo administrado, se o polissacárido ou glicoproteína é administrado em combinação com outros agentes terapêuticos, do estado imunitário e saúde do doente e da atividade terapêutica do polissacárido ou glicoproteína particular.
As composições vacinais e/ou preparações farmacêuticas da invenção podem ser adaptadas para utilização oral, parentérica ou tópica e podem ser administradas ao doente na forma de comprimidos, cápsulas, supositórios, solução, suspensões ou qualquer outro meio ou forma de dosagem adequado. Em aspetos adicionais da invenção, as composições vacinais e/ou preparações farmacêuticas podem ser introduzidas no indivíduo a ser imunizado por qualquer método conhecido, incluindo, e. g., por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal ou subcutânea; ou por distribuição oral, sublingual, nasal, anal ou vaginal. Os compostos farmaceuticamente ativos da presente invenção, embora eficazes por si só, podem ser formulados e administrados na forma dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de adição de ácido ou sais de adição de base, para fins de estabilidade, conveniência de cristalização, solubilidade aumentada e semelhantes. As composições vacinais, numa forma de realização da invenção, são administradas parentericamente, e. g., por injeção, subcutaneamente ou intramuscularmente. Os métodos para imunização intramuscular são descritos por Wolff et al. (1990)
Science 247: 1465-1468 e por Sedegah et al. (1994) Immunology 91: 9866-9870. Outros modos de administração incluem oral e transdérmica.
As vacinas da invenção podem ser administradas como um agente profilático primário, e. g., adultos ou em crianças, como uma prevenção secundária, após erradicação com sucesso de bactérias Gram-positivas, tal como S. aureus, num hospedeiro infetado, ou como agente terapêutico com o objetivo de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro para prevenir infeção por uma bactéria Gram-positiva, tal como S. aureus. As vacinas da invenção são administradas em quantidades facilmente determinadas por pessoas com conhecimentos gerais na técnica. O tratamento pode consistir numa dose única ou numa pluralidade de doses, ao longo de um período de tempo. Por exemplo, em algumas formas de realização, é esperado que uma dosagem típica para humanos de uma vacina da presente invenção seja cerca de 1 a 25 yg do antigénio oligossacárido, o qual estará ligado ao (e não inclui a massa do) veículo proteico, em formas de realização adicionais cerca de 1 yg a cerca de 10 yg do antigénio polissacárido e ainda em formas de realização adicionais cerca de 2 yg do antigénio polissacárido. Em formas de realização adicionais, a razão de açúcar/proteína no glicoconjugado ou na vacina é cerca de 1:5 a cerca de 1:10. Opcionalmente, uma vacina, tal como uma vacina de bioconjugado da presente invenção, pode incluir um adjuvante. Os especialistas na técnica reconhecerão que a dose ótima pode ser maior ou menor, dependendo do peso corporal do doente, doença, da via de administração e de outros fatores. Os especialistas na técnica também reconhecerão que os níveis de dosagem apropriados podem ser obtidos com base em resultados com vacinas conhecidas. O número de doses dependerá da doença, da formulação e dados de eficácia de ensaios clínicos.
As composições vacinais podem ser embaladas em formas convenientes para distribuição. São preferidas as formas de distribuição compatíveis com a entrada do componente ou fragmento imunogénico no mamífero recetor.
Uma forma de realização da divulgação é geralmente dirigida à produção recombinante de uma vacina para um organismo Gram-positivo num organismo Gram-negativo, por utilização de uma via biossintética de LPS modificada. Isto é alcançado por inserção num hospedeiro que compreende ácidos nucleicos que codificam para uma oligossacariltransferase e uma proteína e ácidos nucleicos que codificam para glicosiltransferases tendo origem em, pelo menos, dois organismos diferentes. Esta forma de realização é dirigida à manipulação genética de um organismo com base num organismo natural dentro do qual são inseridos ácidos nucleicos que codificam para (i) uma proteína; (i i) uma oligossacariltransferase e (iii) glicosiltransferases de, pelo menos, dois organismos diversos.
Num exemplo dessa forma de realização, é produzido um produto de proteína glicosilada para utilização como uma vacina para Staphylococcus aureus. Os produtos vacinais da invenção são produzidos num hospedeiro de E. coli geneticamente modificado. S. aureus é uma bactéria Gram-positiva e tem uma cápsula de polissacárido. Um produto vacinai para este organismo poderia ser baseado numa proteína glicosilada cuja secção de açúcar tivesse uma estrutura semelhante a este polissacárido capsular.
Noutro aspeto, a presente divulgação é dirigida a uma nova abordagem de biomanipulação para produção de vacinas de conjugados imunogénicos que proporcionam vantagens relativamente aos métodos clássicos de conjugação química. Numa forma de realização, a abordagem envolve a produção in vivo de glicoproteínas em células bacterianas, por exemplo, células Gram-negativas, tal como E. coli.
Como conhecido de uma pessoa com conhecimentos gerais na técnica, a produção e purificação de glicoconjugado pode variar, dependendo do candidato vacinai e da combinação de plasmídeos utilizados. Por exemplo, que processo de purificação escolher é conhecido com base no veículo proteico, no componente de açúcar do glicoconjugado e na utilização pretendida do candidato vacinai purificado, por exemplo, em animais ou humanos. Para utilização em humanos, por exemplo, é conhecido que a cauda de HIS, a qual de outro modo facilitaria a purificação, seria removida.
Deve ser compreendido que o termo "ou", como aqui utilizado, denota alternativas que podem, onde apropriado, ser combinadas; ou seja, o termo "ou" inclui cada alternativa listada separadamente, assim como a sua combinação. Como aqui utilizado, salvo claramente indicado em contrário pelo contexto, as referências ao singular, tais como as formas singulares "um", uma" e "o", incluem o plural e as referências ao plural incluem o singular. A invenção é ainda definida por referência aos seguintes exemplos que descrevem adicionalmente as composições e métodos da presente invenção, assim como a sua utilidade.
Exemplos
Exemplo 1: Sintese de pollssacárldo CP5 e CP8 em células de E. coli
Um objetivo de uma forma de realização da invenção é produzir os polissacáridos antigénicos CP5 e CP8 em E. coli. Como discutido acima, a requerente explorou de um novo modo, surpreendente em consideração da técnica anterior, o facto de que as vias de produção de CP e antigénio 0 se sobrepõem funcionalmente, um facto que está representado na estrutura da RU (Ver as FIG. 1-4) . Os glicanos capsulares de CP5 e CP8 são polímeros consistindo de RU de trissacáridos semelhantes de Ácido 2-acetamido-2-desoxi-D-manurónico (D-ManNAcA) e dois resíduos de 2-Acetamido-2,6-didesoxigalactose com configurações D e L (D- e L-FucNAc) . Os resíduos de ManNAcA estão ligados de um modo diferente nos dois serotipos; adicionalmente, a ligação entre as RU no glicano polimerizado é diferente. Além disso, existe uma modificação O-acetilo imunodominante em diferentes posições nos dois antigénios (Jones, C. 2005. Estruturas revistas para os polissacáridos capsulares de Staphylococcus aureus tipos 5 e 8, componentes de novas vacinas de glicoconjugado. Carhohydr Res 340:1097-106). O antigénio 011 de LPS de P. aeruginosa é semelhante na sua estrutura a CP5 e CP8, dado que o antigénio Oil de P. aeruginosa LPS contém [-3)-α-L-FucNAc-(1,3)-β-D-FucNAc-(1,2)-β-D-Glc-(1-] (FIG. 4). (Knirel, Y. A., V. V. Dashunin, A. S. Shashkov, N. K. Kochetkov, B. A. Dmitriev e I.L. Hofman. 1988. Antigénios somáticos de Shigella: estrutura da cadeia polissacárida especifica de 0 do lipopolissacárido de Shigella dysenteriae tipo 7. Carbohydr Res 179: 51-60). As RU trissacáridas diferem apenas na medida em que o D-ManNAcA de S. aureus está substituído por uma unidade de glucose, não existe modificação O-acetilo em LPS de P. aeruginosa Oil e a diferença no tipo de ligação entre o 2° e 3o monossacárido na RU (FIG. 4).
Para produzir um sistema genético capaz de sintetizar os glicanos de CP5 e CP8 em UndPP, utilizando o método de Dean et al., (Dean, C. R., C. V. Franklund, J. D. Retief, M. J. Coyne, Jr., K. Hatano, D. J. Evans, G. B. Pier e J. B. Goldberg. 1999. Caracterização do lócus do antigénio O do serogrupo 011 de Pseudomonas aeruginosa PA103. J Bacteriol 181:4275-4284), a requerente modificou o aglomerado génico do antigénio 0 de P. aeruginosa Oil da estirpe PA103. Os genes que codificam a maquinaria biossintética para a síntese da estrutura tronco consistindo de UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc foram complementados com as enzimas de S. aureus requeridas para a conclusão do glicano de S. aureus (FIG. 1-4), o que também constituiu uma nova utilização deste processo. Deste modo, utilizando o método de Dean et al., todos os elementos genéticos de P. aeruginosa PA103 requeridos para a biossíntese de UndPP-FucNAc-FucNAc foram expressos. 0 gene que codifica a glicosiltransferase que adiciona o terceiro açúcar foi eliminado e substituído pelos correspondentes genes dos aglomerados de cap5 ou 8 de S. aureus Mu50 (CP5) e MW2 (CP8), com ligeiras modificações.
Os genes que codificam as enzimas que sintetizam os resíduos específicos para o polissacárido capsular de S. aureus foram integrados, passo a passo, no contexto de 011 de acordo com as funções dos genes previstos por Sau et al. (Sau, S., N. Bhasin, E. R. Wann, J. C. Lee, T. J. Foster e C. Y. Lee. 1997.
Os loci genéticos alélicos de S. aureus para a expressão da cápsula de serotipo 5 e 8 contêm os genes específicos de tipo flanqueados por genes comuns. Microbiology 143: 2395-405; O'Riordan, K. e J. C. Lee. 2004. Polissacáridos capsulares de
Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev 17(1): 218-34). Tais passos são explicados abaixo.
Foi predado que o produto génico cap5l/cap8H era a glicosiltransferase que adiciona o ManNAcA a
UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc da RU que forma uma ligação específica para cada serotipo (Sau, S., N. Bhasin, E. R. Wann, J. C. Lee, T. J. Foster e C. Y. Lee. 1997 . Os loci genéticos alélicos de Staphylococcus aureus para a expressão da cápsula de serotipo 5 e 8 contêm os genes específicos de tipo flanqueados por genes comuns Microbiology 143: 2395-405). Para provar isto, a atividade de Cap5l e Cap8H foi analisada em E. coli na presença de um plasmídeo conferindo a produção do antigénio O de P. aeruginosa Oil. Células que expressam o aglomerado de 011 sintetizam o antigénio 0 de 011 primeiro em UndPP, de onde é transferido para o núcleo de lípido A pela enzima WaaL de E. coli, a ligase de antigénio O, formando o lipopolissacárido específico de Oil (LPS) (Goldberg, J. B., K. Hatano, G. S. Meluleni e G. B. Pier. 1992. Clonagem e expressão de superfície de antigénio 0 de Pseudomonas aeruginosa em Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA 89(22): 10716-20). Para sintetizar este lipopolissacárido, o aglomerado de antigénio 0 de 011 de P. aeruginosa PA103 foi clonado em pLAFRl (SEQ ID N° : 1) .
Depois, o gene wbjA que codifica a glucosiltransferase, a enzima que adiciona o terceiro açúcar à RU de 011, foi eliminado por mutagénese de transposão. 0 aglomerado mutado (011 wbjA::Tn50<dhfr-1>) foi ainda modificado por recombinação homóloga, para eliminar a atividade de polimerase do gene wzy, formando Oil wbjA:: Tn50<dhfr-l> wzy::cat, o que denota a SEQ ID N°: 1 mutada, em que os genes para a glicosiltransferase wbjA e a polimerase wzy do aglomerado génico de 011 foram inativados. Este aglomerado modificado foi expresso em células W3110 AwecA, os extratos foram tratados com proteinase K e analisados por SDS PAGE e coloração de prata, de acordo com o método divulgado em Tasi, et ai. (Tsai, C. M. e C. E. Frasch. 1982. Uma coloração de prata sensível para deteção de lipopolissacáridos em géis de poliacrilamida. Anal Biochem 119:115-9). Os resultados são proporcionados na FIG. 5A, mostrando a coloração de prata dos extratos de W3110 ΔwecA que expressam o aglomerado de 011 mutado de pLAFRl, como aqui descrito. A segunda linha indica os genes expressos do plasmídeo indutível pEXT22. Os asteriscos indicam genes sintetizados e codão-otimizados. Diferentes glicoformas relevantes estão indicadas com setas). A análise resultou em duas bandas principais nos géis (FIG. 5A, pista 1) . Os sinais correspondem ao núcleo de lípido A não modificado (FIG. 5A, banda inferior) e LPS consistindo de núcleo de lípido A e dois resíduos de FucNAc, como esperado numa RU de 011 truncada. Após expressão de uma cópia de tipo selvagem de wbjA de um plasmídeo separado, indutível por IPTG, a banda superior mudou para uma mobilidade eletroforética mais lenta, indicando a adição de um resíduo de glucose ao LPS de 011 truncado (FIG. 5A, pista 2). Quando as glicosiltransferases de S. aureus previstas Cap5l (pista 4) e Cap8H (FIG. 5A, pista 3) foram expressas em trans, em vez de WbjA, foi observada uma mudança semelhante do sinal do núcleo de lípido A glicosilado, indicativa de adição de um monossacárido, possivelmente até maior que a glucose, sendo muito provavelmente ManNAcA. Estes dados provam que as glicosiltransferases de S. aureus podem alongar o glicolipido UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc que foi sintetizado por atividade de enzimas de P. aeruginosa.
Deste modo, também foi confirmado que um pré-requisito para o agrupamento da RU de S. aureus em E. coli é a provisão de UDPManNAcA, porque a maquinaria biossintética está presente nos aglomerados de CP5/8 de S. aureus mas não no aglomerado de antigénio 0 de Oil de P. aeruginosa. Todos os outros açúcares ativados por nucleótido requeridos são proporcionados por funções de gestão de E. coli e do aglomerado de antigénio 0 de Oil de P. aeruginosa. Sabe-se que a E. coli produz UDP-ManNAcA, o substrato para a glicosiltransferase de ManNAcA, por expressão de wecB e wecC. Aqueles genes são expressos de modo constitutivo no aglomerado responsável pela biossintese do antigénio enterobacteriano comum (ECA) (Meier-Dieter, U., R. Starman, K. Barr, H. Mayer e P. D. Rick. 1990. Biossintese do antigénio enterobacteriano comum em Escherichia coli. J Biol Chem 265:13490-13497). Verificou-se que o homólogo funcional para a biossintese de UDP-ManMAcA encontrado no aglomerado de CP de S. aureus complementa a atividades de wecBC, como referido anteriormente (Kiser, K. B., N. Bhasin, L. Deng e J. C. Lee. 1999. 0 cap5P de Staphylococcus aureus codifica uma UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase com redundância funcional. J. Bacteriol 181 (16) : 4818-24) . Isto mostra que a produção dos antigénios de CP em E. coli depende da expressão funcional dos genes wecBC na estirpe hospedeira. Assim, para proporcionar UDP-ManNAcA como substrato para Cap5l e Cap8H num sistema recombinante, foi confirmado que WecB e WecC têm que ser expressos. Num tal sistema, pode ser utilizada qualquer estirpe procariótica que expressam o antigénio enterobacteriano comum como estirpe de E. coli de tipo selvagem, e. g., tipos de células baseados em W3110, com ou sem uma eliminação de wecA e com ou sem eliminação adicional de wzzE.
Pensa-se que, para atividade imunológica máxima do glicano, o alongamento adicional do polissacárido capsular de S. aureus seja requerido. Os genes cap5J/cap8l codificam os homólogos wzy que polimerizam as unidades de repetição e cap5K/cap8K codificam a flipase que transloca o trissacárido ligado a UndPP do lado citoplasmático para o lado periplasmático da membrana. Cap5H/cap8J codificam a O-acetiltransferase que modifica o L-FucNAc na posição 3' ou o ManNAcA na posição 4' da RU (Bhasin, N., A. Albus, et al. (1998). "Identificação de um gene essencial para a O-acetilação do polissacárido capsular de Staphylococcus aureus tipo 5". Mol Microbiol 27(1): 9-21. A acetilação é um determinante importante que discrimina a reatividade imunológica do polissacárido (Fattom, A. I., J. Sarwar, L. Basham, S. Ennifar e R. Naso. 1998. Determinantes antigénicos de vacinas de polissacárido capsular tipo 5 e tipo 8 de S. aureus. Infect Immun 66:4588-92). Para mostrar que as RU poderiam ser alongadas e acetiladas, as enzimas de S. aureus responsáveis pela polimerização e O-acetilação foram expressas de plasmideos separados na presença do aglomerado de 011 mutado. Os extratos de células W3110 ΔwecA que expressam o aglomerado wbjA::Tn50<dhfr-l> wzy.-.cat de 011 e diferentes genes do aglomerado de CP5 foram tratados com proteinase K e analisados por SDS PAGE, eletrotransferência seguida de imunotransferência utilizando um açúcar anti-CP5 (obtido de J. C. Lee no Departamento de Medicina, Brigham and Women's Hospital,
Faculdade de Medicina de Harvard, Boston, MA, EUA) . A FIG. 5B mostra os resultados da imunodeteção dos extratos de E. coli tratados com proteinase K separados por SDS PAGE e eletrotransferidos que utilizam o antissoro anti-CP5. Todos os extratos analisados continham um aglomerado de P. aeruginosa Oil com eliminações dos genes wbjA e parcialmente (indicado por um asterisco) wzy expressos a partir do plasmídeo pLAFR, como aqui descrito, e mais dois plasmídeos (pEXT22, pACT3) expressando diferentes proteínas Cap5 (como indicado) que possibilitam a polimerização e O-acetilação de CP5 nestas células. Estão indicados pormenores experimentais, tais como concentrações de indutor e temperaturas de incubação de cultura de expressão.
Na FIG. 5B, os resultados mostram sinais semelhantes a escada, típicos para um polímero de antigénio 0 numa gama de peso molecular mais elevado. As diferentes bandas representam diferentes números de RU polimerizadas linearmente em LPS ou em UndPP, ambos os quais são estáveis à digestão de proteinase K. Foram observadas diferentes intensidades da estrutura semelhante a escada na presença ou ausência de O-acetiltransferase. Enquanto fortes sinais foram detetados na presença de cap5H (FIG 5B, pistas 1-4), estes estavam virtualmente ausentes em pistas sem cap5H (FIG 5B, pistas 5, 6) . Isto significa que a O-acetilação aumenta o reconhecimento pelo antissoro específico, ou que melhora a atividade de polimerização, acelerando o deslocamento ou tornando a polimerização como tal mais eficiente ou induzindo mais produção de RU. 0 gene cap5H é funcional quando expresso a partir de diferentes plasmídeos de estrutura (FIG 5B, pistas 1, 2 e 3, 4), embora a intensidade de sinal seja mais forte quando o cap5H é expresso isoladamente a partir de um plasmídeo separado (comparar a pista 1 com a pista 3 da FIG. 5B e pista 2 com pista 4 da FIG. 5B). É surpreendente e notável que quanto menos IPTG era utilizado para indução dos genes de S. aureus, mais fortes os sinais (comparar a pista 1 com a pista 2 da FIG. 5B e a pista 3 com a pista 4 da FIG. 5B).
Exemplo 2: Síntese de polímero CP5 e CP8 em lipido em células de E. coli
Dado que a expressão elevada dos genes específicos de cap5 conduz a menor formação de polímero, foi construído um sistema de expressão alternativo para os glicanos recombinantes para abordar este problema. Em pormenor, numa nova abordagem, inesperada à luz da técnica anterior, a glucosiltransferase (wbjA) de P. aeruginosa e a polimerase (wzy) de 011 foram substituídas pelos genes que codificam os elementos específicos de CP5/8 do aglomerado génico capsular de S. aureus Mu50/MW2 (cap5/8HIJK e partes destes), produzindo um aglomerado génico único, quimérico, composto pelos genes CP5 ou CP8 de P. aeruginosa Oil e S. aureus (FIG. 6). A construção continha os genes específicos de S. aureus. Cada foi marcado para deteção de expressão e cada continha um sítio de ligação ribossómica introduzido e era seguido de uma cassete de resistência a cloranfenicol (cat) para seleção de clones recombinados, resultando nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, de acordo com o método de Datsenko, et ai. (Datsenko, K. A. e B. L. Wanner. 2000. Inativação de um passo de genes cromossómicos em Escherichia coli K-12 utilizando produtos de PCR. Proc Natl Acad Sei USA 97:6640-5) . A FIG. 6 representa uma forma de realização de uma estratégia da presente invenção para a construção dos aglomerados génicos 011/CP55 e 011/CP8 quiméricos da presente invenção. Os aglomerados de CP de S. aureus CP5 e CP8 (topo) e o aglomerado rfb de P. aeruginosa PA103 (Oil, meio) estão representados como publicado (Dean, C. R., C. V. Franklund, J. D. Retief, M. J. Coyne, Jr., K. Hatano, D. J. Evans, G. B. Pier e J. B. Goldberg. 1999. Caracterização do lócus do antigénio 0 do serogrupo Oil de Pseudomonas aeruginosa PA103. J Bacteriol 181:4275-84; (Sau, S., N. Bhasin, E. R. Wann, J. C. Lee, T. J. Foster e C. Y. Lee. 1997 . Os loci genéticos alélicos de S. aureus para a expressão da cápsula de serotipo 5 e 8 contêm os genes específicos de tipo flanqueados por genes comuns. Microbiology 143 (Pt 7) : 2395-405) . As funções homólogas dos genes estão descritas abaixo. Diagonais para a frente completas indicam os genes responsáveis pela síntese do dissacárido D-FucNAc-L-FucNAc em UndPP nos dois organismos; pontos indicam os genes de glicosiltransferase que adicionam o terceiro monossacárido à RU. Os genes de flipase semelhantes a Wzx estão indicados por diagonais para a frente a tracejado, os genes da polimerase de RU semelhantes a wzy estão indicados por diagonais para trás a tracejado. 0 aglomerado de CP5 não contém um regulador de comprimento de Wzz (seta vazia), mas um conjunto de três genes compondo a maquinaria de exportação para polissacárido capsular que inclui a função reguladora de comprimento em S. aureus (setas vazias) . 0 gene da transferase 0-acetilo, indicado por diagonais para a frente completas, é único ao aglomerado de CP. Os genes requeridos para a biossíntese de UDP-ManNAcA em S. aureus estão indicados a negro. Não são requeridos para a produção do antigénio 0 de P. aeruginosa. Os genes responsáveis pelas diferenças estruturais dos polissacáridos Oil, CP5 e CP8 estão aglomerados uns aos outros no início (011: wbjA e wzy) ou meio (CP5/8: cap5/8HIJK) dos respetivos aglomerados génicos. 0 aglomerado de CP8 é quase idêntico ao aglomerado de CP5 considerando comprimento e sequência de ADN, exceto na parte do meio (cap5/8HIJK) que confere especificidade estrutural. 0 aglomerado quimérico foi construído por substituição dos genes wbjA e wzy de um aglomerado de 011 gerado em plasmídeo, com a parte da especificidade do aglomerado de CP5 (ou CP8) {cap5/8HIJK) e uma cassete de cloranfenicol acetiltransferase representada pela seta vazia rotulada cat (cat, para seleção), por recombinação homóloga e clonagens clássicas, resultando nas SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4. Os asteriscos nas setas a tracejado indicam sequências génicas incompletas utilizadas para recombinação homóloga. Os dois aglomerados quiméricos resultantes estão mostrados no painel inferior, representando o ADN das SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4.
Para provar que os CP5 e CP8 quiméricos da presente invenção agrupam, surpreendentemente, a RU correta em UndPP e garantem que as unidades de repetição são polimerizadas, a digestão de proteinase K de células de E. coli (W3310 AwecA) contendo os aglomerados quiméricos de comprimento completo foi separada por SDS-PAGE. Especificamente, células com um plasmídeo contendo ou desprovido do aglomerado génico de CP5 quimérico
(FIG. 7A) ou o aglomerado génico de CP8 quimérico (FIG. 7B) no plasmídeo pLAFR foram tratadas com Proteinase K, separadas por SDS-PAGE e os lípidos foram visualizados por coloração de prata (painel da esquerda nas FIG. 7A e 7B) ou imunodeteção com antissoro anti-CP5 ou anti-CP8 após eletrotransferência para membranas de nitrocelulose (painel da direita na FIG. 7A e B) ) . As construções desprovidas (SEQ ID N°: 2) e contendo (SEQ ID N°: 3) o gene cap5K de flipase foram testadas. Verificou-se que a última era menos ativa na produção de LPS de CP5.
Após eletrotransferência e imunodeteção com soro específico anti-CP5, extratos expressando os aglomerados de CP5 quimérico integrais mostram um sinal semelhante a escada semelhante às estruturas de antigénio 0 endógenas de E. coli sondadas com o seu soro autólogo (FIG. 7A, últimas duas pistas à direita). Isto sugere fortemente que as unidades de repetição de CP5 são polimerizadas, que existe um comprimento de polímero preferido e que o antigénio de CP5 é transferido para núcleo de lípido A nestas células. Os mesmos extratos foram visualizados por coloração de prata após SDS PAGE (FIG. 7A, no lado esquerdo da figura, as duas pistas à direita rotuladas como: CP5 quimérico (sem cap5K) e CP5 quimérico mostrando que o LPS é, de facto, formado, consistindo do núcleo de lípido A de E. coli decorado com a estrutura semelhante a antigénio 0 de CP5. Diferenças de intensidade foram obtidas de extratos que têm origem em células que expressavam o aglomerado quimérico de CP5 com ou sem o gene de flipase cap5K. A comparação dos dois extratos mostra que a expressão de Cap5K aumenta consideravelmente a produção do polímero (comparar as pistas do meio e da direita em ambos os painéis da FIG. 7A).
Como mostrado na FIG. 7B, os mesmos resultados foram observados com um aglomerado quimérico de CP8. Células contendo um plasmídeo contendo ou desprovido do aglomerado génico de CP8 quimérico no plasmídeo pLAFR foram tratadas com Proteinase K, separadas por SDS PAGE e os lípidos foram detetados por coloração de prata (painéis da esquerda) ou imunodeteção com antissoro anti-CP8, após eletrotransferência para membranas de nitrocelulose (painel da direita). A construção quimérica de CP8 contendo o gene de flipase cap8K corresponde à SEQ ID N°: 4.
Uma extensão nova e surpreendente adicional da invenção foi desenvolvida pela alteração das estruturas do plasmideo utilizadas para manutenção e expressão do aglomerado quimérico em E. coli. A cassete de resistência em pLAFRl contendo o aglomerado de CP5 quimérico foi alterada de Tet para Kan. Adicionalmente, o aglomerado quimérico de CP5 integral contendo o cap5K foi subclonado no plasmideo pDOC-C, de acordo com método de Lee et al. (Lee, D. J., L. E. Bingle, K. Heurlier, M. J. Pallen, C. W. Penn, S. J. Busby e J. L. Hobman. 2009. Adulteração génica: um método para manipular de modo recombinante em estirpes de Escherichia coli de laboratório e patogénicas. BMC Microbiol 9: 252) e pACYC177 (acesso GeneBank N° XO6402) .
Como mostrado nas FIG. 8A e 8B, todos estes plasmideos conferiram produção do polímero CP5, como analisado por SDS PAGE, eletrotransferência e imunodeteção com antissoro específico de anti-CP5. Na FIG 8A, extratos de células totais de células contendo diferentes aglomerados quiméricos foram tratadas com Proteinase K e analisadas por SDS PAGE e coloração de prata. Estão indicados os plasmideos que contêm diferentes genes específicos de S. aureus e diferentes genes de resistência, utilizados para seleção de antibiótico: Tetraciclina (Tet) e HIJ, SEQ ID N°: 2; Tet HIJK, SEQ ID N°: 3, Tet e sem genes, controlo de plasmideo vazio, os números correspondem a marcadores de peso molecular. As pistas rotuladas Canamicina (Kan) contêm uma variação da SEQ ID N°: 3, na qual a cassete de resistência a tetraciclina é substituída por um gene de resistência à canamicina.
Na FIG. 8B, a estirpe hospedeira foi E. coli W3110 Δ wecA, como na FIG. 8A. A pista da esquerda na FIG. 8B corresponde ao marcador de peso molecular como na FIG. 8A. Na FIG. 8B, extratos de células totais de células contendo diferentes aglomerados quiméricos foram tratadas com Proteinase K e analisadas por SDS PAGE e coloração de prata (painel da esquerda) e por imunotransferência anti-CP5 após eletrotransferência (painel da direita). Os plasmídeos utilizados contêm o aglomerado de CP5 quimérico indicado na SEQ ID N°: 3, presente numa estrutura do plasmideo pLAFRl modificada contendo uma cassete de Canamicina, em vez de tetraciclina (ver a FIG. 8A), ou em pACYC contendo uma cassete de resistência a cloranfenicol.
Além disso, foram testados diferentes promotores para expressar o LPS de CP5 de 011 quimérico. Nestes testes, a estirpe hospedeira era E. coli W3110 AwecA transportando o aglomerado de CP5 quimérico. Nesta estirpe, o aglomerado quimérico substituiu os genes wecAwzzE. Extratos de células totais de células contendo diferentes aglomerados quiméricos expressos a partir de pLAFRl foram tratados com Proteinase K e analisados por SDS PAGE e imunotransferência anti-CP5 após eletrotransferência. Os plasmídeos continham aglomerados de 011, onde wbjA e wzy foram substituídos por diferentes genes de especificidade de S. aureus (com uma cassete de cat), como indicado abaixo nas pistas na FIG. 9. Além disso, o ADN em frente dos genes de especificidade de cap5 foi alterado e o efeito na glicosilação lipídica foi analisado. 0 efeito destas regiões promotoras diferentes foi analisado, como representado na FIG. 9. Wzz/wzx denota os genes originais (ver a FIG. 6) em frente dos genes cap após a recombinação homóloga inicial (FIG. 9 correspondente às duas primeiras pistas). Estes dois genes foram removidos (-) (FIG. 9 correspondente às três pistas no meio) e substituídos com a região de 0,6 kb (P0121) (FIG. 9 correspondente às três últimas pistas) presente a montante do aglomerado do antigénio 0 de E. coli 0121 que codifica uma forte sequência promotora. As pistas denotadas wzz/wzx e HIJ na FIG. 9 foram derivadas de células expressando a SEQ ID N°: 2, as pistas denotadas wzz/wzx e HIJK derivam da SEQ ID N°: 3. Na FIG. 9, os marcadores de peso molecular estão indicados à esquerda da moldura do gel.
Como indicado na FIG. 9, os resultados mostraram que uma atividade promotora relevante reside no gene wzx (FIG. 9, primeiras duas pistas- wzz/wzx) e que pode ser funcionalmente substituída por um promotor constitutivo de E. coli, e. g., o promotor do serovar 0121 wb (P0121, últimas três pistas na FIG. 9), sem perda de produção de LPS. Considerados em conjunto, estes resultados significam que os elementos de 011 e de S. aureus para a produção do antigénio O e do polímero capsular CP5 de 011, como aqui descrito, podem ser combinados em muitos sistemas de expressão de E. coli diferentes, resultando na produção de polissacárido de S. aureus recombinante.
Estes resultados mostraram, pela primeira vez, a produção em E. coli de uma estrutura capsular de polissacárido tendo origem num organismo Gram-positivo. Isto significa que foi possível, contrariamente à técnica anterior e expectativas convencionais, combinar as enzimas do aglomerado de Oil e as enzimas do aglomerado de cap de S. aureus para construir um polissacárido quimérico, i. e., que a enzima trabalha conjuntamente na mesma estrutura in vivo.
Exemplo 3: Confirmação da estrutura molecular dos glicanos recombinantes
Para confirmar a atividade do aglomerado de CP5/011 quimérico em E. coli a um nivel molecular, foi desenvolvido um novo método permitindo a análise de açúcares ligados a UndPP, por utilização de marcação fluorescente do açúcar na extremidade de redução com 2-Aminobenzamida (2-AB). Para melhorar a resolução da análise, foram utilizados aglomerados quiméricos contendo eliminações que aumentaram a quantidade de RU não polimerizadas. Os glicolípidos de diferentes células de E. coli expressando o aglomerado quimérico contido no plasmideo pLAFRl e desprovido da flipase de cap5K (SEQ ID N°: 2) foram analisados como descrito abaixo.
Para extrair os glicanos ligados a UndPP, células de
E. coli foram lavadas com NaCl a 0,9% e liofilizadas. As células secas foram extraídas, uma vez, com 30 mL de solvente orgânico (85 a 95% de Metanol = M) . O sedimento celular liofilizado foi ainda extraído, duas vezes, com 5 mL de Clorofórmio: Metanol: Água (C:M:W = 10:10:3; v/v/v). O extrato (M) foi convertido com clorofórmio e água para uma razão final de 3:48:47 (C:M:W). O extrato 10:10:3 (C:M:W) foi convertido para um sistema de duas fases Bligh/Dyer (Bligh, E. G. e W. J. Dyer. 1959. Um método rápido de extração e purificação de lípidos totais. Can J Biochem Physiol 37 (8) : 911-7) por adição de água, resultando numa razão final de 10:10:9 (C:M:W). As fases foram separadas por centrifugação e a fase aquosa superior foi mantida para processamento adicional.
Para purificar os glicolípidos extraídos, a fase aquosa foi submetida a um cartucho tCis Sep-PAK. O cartucho foi condicionado com 10 mL de metanol, seguido de equilibração com 10 mL de 3:48:47 (C:M:W). Após carregamento da amostra, o cartucho foi lavado com 10 mL de 3:48:47 (C:M:W) e eluido com 5 mL de metanol e 5 mL de 10:10:3 (C:M:W). As eluições combinadas foram secas sob N2. As amostras de glicolípido foram hidrolisadas por dissolução das amostras secas em 2 mL de n-propanol:ácido trifluoroacético a 2 M (1:1), aquecimento a 50 °C, durante 15 min e, depois, evaporação até à secura sob N2 (Glover, K. J., E. Weerapana e B. Imperiali. 2005. Agrupamento in vitro do heptassacárido ligado a UndPP para glicosilação procariótica ligada a N. Proc Natl Acad Sei USA 102(40): 14255-9). As amostras secas foram marcadas com 2-AB e a limpeza do glicano foi realizada utilizando o método do disco de papel, como descrito (Bigge, J. C., T. P. Patel, J. A. Bruce, P. N.
Goulding, S. M. Charles, R. B. Parekh. 1995. Marcação fluorescente não seletiva e eficiente de glicanos utilizando 2-aminobenzamida e ácido antranílico. Anal Biochem 230(2): 229-38; Merry, A. H., D. C. Neville, L. Royle, B. Matthews, D. J. Harvey, R. A. Dwek e P. M. Rudd. 2 0 02. Recuperação de 0-glicanos intactos marcados com 2-aminobenzamida libertados de glicoproteinas por hidrazinólise. Anal Biochem 304(1): 91-9). Os glicanos marcados com 2-AB foram separados por HPLC utilizando uma coluna de fase normal GlycoSep-N, de acordo com Royle et al., mas modificada para um sistema de três solventes (Royle, L., T. S. Mattu, E. Hart, J. I. Langridge, A. H. Merry, N.
Murphy, D. J. Harvey, R. A. Dwek, P. M. Rudd. 2002. Uma base de dados analítica e estrutural proporciona uma estratégia para sequenciar O-glicanos a partir de quantidades de micrograma de glicoproteinas. Anal Biochem 304(1): 70-90). O solvente A foi formato de amónio a 10 mM, pH 4,4, em acetonitrilo a 80%. O solvente B foi formato de amónio a 30 mM, pH 4,4, em
acetonitrilo a 40%. O solvente C foi ácido fórmico a 0,5%. A temperatura de coluna foi 30 °C e os glicanos marcados com 2-AB foram detetados por fluorescência (Xex de excitação = 330 nm, Xem de emissão = 420 nm) . As condições de gradiente foram um gradiente linear de 100% de A a 100% de B, ao longo de 160 min, a um caudal de 0,4 mL/min, seguido de 2 min de 100% de B a 100% de C, aumentando o caudal para 1 mL/min. A coluna foi lavada durante 5 min com 100% de C, regressando a 100% de A ao longo de 2 min e correndo durante 15 min a 100% de A, a um caudal de 1 mL/min, depois, restituindo o caudal para 0,4 mL/min, durante 5 min. As amostras foram injetadas em água.
As frações secas foram ressuspensas em 5 yL de acetonitrilo (ACN) a 10%, ácido trif luoroacético (TFA) a 0,1% e misturadas 1:1 com solução de matriz (DHB a 40 mg/mL em ACN a 50%, TFA a 0,1%) na placa alvo. Os dados de MS e MS/MS foram adquiridos manualmente no modo iónico positivo num espetrómetro de massa MALDI-ToF/ToF Ultraflex-II (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha). MS/MS foram obtidos utilizando o método de LIFT. Uma mistura peptidica padrão (Bruker Daltonik GmbH) foi utilizada para calibração externa. Os espetros foram exportados utilizando o software Flex Analysis (Bruker Daltonik GmbH) e analisados manualmente.
Os extratos de metanol de E. coli W3110 AwecA (CP5) contendo plasmideos com (linha grossa) ou sem (linha fina a tracejado) os aglomerados quiméricos foram purificados através de cartuchos tC18 e analisados por HPLC de fase normal. As
frações correspondentes aos picos mostrados na FIG. 10A verificados a 37, 40 e 45 minutos de eluição foram analisados por MALDI-MS/MS. As amostras eluindo a 37 e 40 minutos foram identificadas como RU de CP5 recombinantes, com e sem o grupo O-acetilo conjugado, respetivamente. A amostra eluindo a 45 minutos foi identificada como estrutura de RU de S. aureus não acetilada alongada por uma desoxi-N-acetil-hexosamina (como mostrado na FIG. 11E) . No aglomerado quimérico de CP5, cap5HIJ substituiu os genes wbjA e wzy do aglomerado de 011 em pLAFR. Além dos genes cap5HIJ, a substituição continha a cassete de cat (SEQ ID N°: 2) .
Os extratos de metanol de E. coli W3110 ΔwecAwzzE contendo plasmideos com (linha grossa) ou sem (linha fina a tracejado) o aglomerado quimérico foram purificados através de cartuchos tC18 e analisados por HPLC de fase normal. A FIG. 10B mostra os resultados da análise de HPLC de RU recombinante de CP8 produzida utilizando um aglomerado quimérico (SEQ ID N°: 4 sem polimerase). Os picos específicos para células que expressam o açúcar recombinante foram identificados a 23', 32', 38' e 45 de eluição, recolhidos e analisados por MALDI-MS e MALDI-MS/MS. No aglomerado quimérico de CP8, cap8HJK substituiu os genes wbjA e wzy do aglomerado de 011, i. e., uma construção sem a polimerase para acumular RU única para análise. Além dos genes cap, a substituição continha a cassete de cat. A FIG. 11A mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico específico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP5 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 37 minutos. A massa principal m/z=772 ([M+H]+) foi selecionada e analisada por MS/MS, a qual mostra um padrão de fragmentação consistente com a estrutura de RU de CP5 acetilada que era esperada à luz da invenção divulgada nesta descrição. As espécies O-acetiladas são caracterizadas por uma perda específica de 42 mais a massa do monossacárido FucNAc (dHexNAc(OAc)) na posição do meio da RU. Os iões de fragmentação estão indicados de acordo com nomenclatura do consórcio para a glicómica funcional, CFG (www.functionalglycomics.org/
static/consortium/Nomenclature.shtml). 2-AB, 2-aminobenzamida. A legenda para os iões de fragmentação é dada na inserção da FIG. 11A. A FIG. 11A mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico especifico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP5 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 40 minutos. A massa principal de m/z= 730 ([M+H]+) foi selecionada e analisada por MS/MS, a qual mostra a série iónica de fragmentação consistente com a estrutura de RU de CP5 não acetilada que era esperada à luz da invenção divulgada nesta descrição. 2-AB, 2-aminobenzamida. A legenda para os iões de fragmentação é dada na inserção da FIG. 11B. A FIG. 11C mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico especifico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP8 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 32 minutos. Uma massa principal de m/z=794 ([M+H]+) foi selecionada e analisada por MS/MS, a qual mostra a série iónica de fragmentação consistente com a estrutura de RU de CP8 acetilada que era esperada à luz da invenção divulgada por esta descrição. As espécies O-acetiladas são caracterizadas por uma perda especifica de 42 mais a massa do monossacárido
ManNAcA (HexNAcA(OAc)) na posição mais exterior da RU. Os iões de fragmentação estão indicados de acordo com a nomenclatura do CFG. 2-AB, 2-aminobenzamida. A legenda para os iões de fragmentação é dada na inserção da FIG. 11C. A FIG. 11D mostra os resultados da análise de MALDI-MS/MS do pico especifico produzido pela expressão de uma forma de realização do aglomerado de CP8 quimérico da presente invenção em E. coli eluindo a 38 minutos. A massa de m/z= 730 ([M+H]+) foi selecionada e analisada por MS/MS, a qual mostra a série iónica de fragmentação consistente com a estrutura de RU de CP8 não acetilada que também era esperada à luz da invenção divulgada nesta descrição. A análise adicional mostrou que os picos eluindo mais tarde (mostrados na FIG. 10A a 40 min e FIG. 10B a 38 min) contêm os trissacáridos não O-acetilados das RU de CP5 e 8. Os iões de fragmentação estão indicados de acordo com a nomenclatura do CFG. 2-AB, 2-aminobenzamida. A legenda para os iões de fragmentação é dada na inserção da FIG. 11D.
Os resultados de MS mostraram que as massas e série iónica de fragmentação estão de acordo com a estrutura molecular do oligossacárido de RU de CP5 com a O-acetilação do resíduo de FucNAc do meio (i. e., o pico a 37 minutos na FIG. 10A e na FIG. 11A) ou sem a O-acetilação do resíduo de FucNAc do meio (i. e., o pico 40 minutos na FIG. 10A e em 11B) . O sinal a 45 minutos na FIG. 10A foi identificado como um tetrassacárido, o qual é ainda analisado abaixo. A mesma análise foi repetida com o aglomerado de CP8 quimérico que não possuía o gene de polimerase. Nesses extratos, sinais consistentes com a estrutura de RU O-acetilada esperada à luz da invenção divulgada nesta descrição foram verificados a 23 e 32 minutos de eluição, como mostrado nas FIG. 10B e 11C. A presença de dois tempos de eluição diferentes para a mesma sequência de glicano que a identificada por MALDI-MS/MS indica um evento de migração de 0-acetilo a ocorrer durante a preparação da amostra. As RU não acetiladas foram identificadas para os extratos de CP5 e CP8 a 40' e 38', como mostrado nas FIG. 11B e D, respetivamente. As estruturas de RU de CP5 e CP8 estavam presentes em diferentes estirpes de E. coli, incluindo, por exemplo, W3110, W3310 AwecA, W3110 ΔwecAwzzE e W3110 AwecAwzzE AwaaL.
Exemplo 4: Melhoramento da estrutura da unidade de repetição e sua análise. 0 pico de HPLC mostrado na FIG. 10B eluindo a 45 minutos, derivado de células de E. coli expressando o aglomerado de CP8 quimérico (SEQ ID N°: 4), mas desprovido do gene de polimerase wzy cap8l, também foi analisado por MALDI-MS/MS. 0 ião mais intenso no MS de varrimento completo foi m/z=939 ([M+H]+) e a análise de sequência foi realizada por MS/MS. Os resultados desta análise de MS/MS estão mostrados na FIG. 11E e apresentam uma série iónica de fragmentação consistente com a RU capsular de S. aureus não acetilada, alongada por uma massa de uma desoxi-N-acetil-hexosamina na extremidade não redutora, como esperado à luz da invenção divulgada nesta descrição. Os iões de fragmentação correspondentes às estruturas hipotéticas estão indicados de acordo com a nomenclatura do CFG acima dos picos. 2-AB, 2-aminobenzamida. A legenda para os iões de fragmentação é dada na inserção da FIG. 11E. 0 resultado mostrado na FIG. 11E sugeriu que uma glicosiltransferase de E. coli era capaz de modificar o resíduo de ManNAcA da RU de CP8. Essa RU alterada, muito provavelmente, não estaria polimerizada por cap8l. A análise das especificidades de glicosiltransferase no hospedeiro W3110 de E. coli indicou que uma enzima do aglomerado de ECA pode interferir com o açúcar recombinante, especificamente o produto génico wecF, uma putativa 4-N-acetilfucosaminatransferase. WecF adiciona naturalmente uma 4-N-acetilfucosamina a ManNAcA compreendida em ECA, muito provavelmente a enzima também poderia alongar a RU de CP8 e CP5.
Para resolver este problema, foi desenvolvida outra abordagem nova. Especificamente, os genes do aglomerado de ECA localizados a jusante do gene wecC, incluindo wecF, foram eliminados. Isto foi alcançado utilizando o método descrito por Datsenko et al. (Datsenko, K. A. e B. L. Wanner. 2000. "Inativação de um passo de genes cromossómicos em Escherichia coli K-12 utilizando produtos de PCR". Proc Natl Acad Sei USA 97(12):6640-6645). Diferentes hospedeiros de expressão de E. coli foram eliminados nas regiões génicas de waaL e rmlB-wecG e também em algumas estirpes em wecA-wzzECA. Os extratos Purificados de Sep-PAK (extratos de Metanol e 10:10:3) destas células mutadas expressando o aglomerado quimérico de CP8 mutante de polimerase foram analisados por HPLC de fase normal, como descrito acima. A FIG. 11F apresenta os resultados das análises de HPLC de extratos de metanol de células de E. coli W3110 AwaaL que expressam o mutante de polimerase da SEQ ID N°: 4 (linha fina a tracejado) em comparação com células com uma eliminação adicional dos genes do aglomerado de ECA rmlB-wecG (W3110 AwaaL ArmlB-wecG:: cat) (linha grossa). Os extratos foram purificados através de cartuchos tCl8 e analisados por HPLC de fase normal. Como mostrado na FIG. 11F, o pico principal surgindo a 45 minutos na FIG. 10B estava ausente, resultando em picos específicos para as RU de CP8 acetiladas e não acetiladas (FIG. 11F) , indicando que uma das glicosiltransferases de ECA -muito provavelmente wecF - é responsável pelo fenótipo de alongamento aberrante. Resultados semelhantes foram obtidos quando o aglomerado quimérico de CP5 foi testado em diferentes estirpes. Isto implica que a eliminação de glicosiltransferases e enzimas geradas em E. coli requeridas para a biossíntese de açúcar ativada por nucleótido é uma estratégia possível para otimização da qualidade e quantidade de polissacáridos produzidos recombinantemente em E. coli. As enzimas alvo muito provavelmente seriam codificadas no aglomerado de antigénio 0, o aglomerado de ECA, e nos aglomerados de ácido colânico ou de cápsula.
Evidência adicional para a qualidade do polissacárido recombinante ligado a UndPP foi obtida de uma análise de HPLC de fase normal otimizada de extratos de glicolipidos marcados fluorescentemente, purificados por Sep-PAK, de hospedeiros de expressão cromossomicamente otimizados, como descrito acima. Para desempenho ótimo das colunas Sep-PAK para purificação de lipidos ligados a oligossacáridos e polissacáridos de CP5 e CP8 carregados, fosfato de terc-butilamónio (TBAP) foi adicionado aos extratos antes de carregamento nos cartuchos Sep-PAK. Como referido por Trent, et al., o catião deste sal melhora a ligação de coluna de compostos carregados blindando cargas negativas com cadeias de butilo hidrófobas (Trent, M. S., A. A. Ribeiro, et al. (2001) . "Acumulação de um aminoaçúcar ligado a poliisopreno em Salmonella typhimurium e Escherichia coli resistentes a polimixina: caracterização estrutural e transferência para lípido A no periplasma". J Biol Chem 276(46): 43132-43144.). Este método otimizado foi aplicado às amostras de CP5 e CP8 obtidas por extração com metanol de células expressando aglomerados quiméricos de CP5 ou CP8 contendo uma polimerase. A FIG. 11G proporciona os resultados da análise de HPLC que mostram o repertório de glicano de CP5 completo presente em UndPP em células de E. coli. Os extratos de metanol de E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG:: cat que expressam o aglomerado de CP5 quimérico SEQ 3 (linha a cheio) ou um controlo plasmídico vazio (linha a tracejado) foram extraídos em fase sólida em cartuchos Sep-PAK e tratados com ácido moderado para hidrolisar açúcares de UndPP. 0 material resultante foi colocado em reação com 2AB por aminação redutora, para marcar extremidades de redução dos glicanos e analisado por HPLC de fase normal. Os sinais presentes na linha a cheio, mas não na linha a tracejado, representam material específico de CP5. As letras maiúsculas indicam picos contendo polímeros da RU de CP5 acetilada e/ou não acetilada, como identificado por MALDI-MS/MS das frações recolhidas. A legenda da FIG. 11G indica as estruturas moleculares propostas, como deduzidas a partir da análise de MS/MS. Deve notar-se que os polímeros de RU acetilados e não acetilados mostrados para MS/MS confirmaram estruturas do mesmo grau de polimerização agrupadas no cromatograma, como indicado por barras grossas. As letras maiúsculas mostram os seguintes comprimentos: A e B: uma RU; C, D e E: duas RU; F e G: três RU; e H: quatro RU. 0 pico alargado entre 95' e 125' na FIG. 11G, muito provavelmente, representa 5 ou mais RU polimerizadas não resolvidas pela coluna.
A FIG. 11H apresenta resultados adicionais de HPLC, mostrando glicanos de CP5 acetilados e homogeneidade de RU. Para preparar esta análise de HPLC, amostras de glicano marcadas com 2AB de E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG:: cat expressando o aglomerado de CP5 quimérico SEQ ID N°.: 3 (preparado de acordo com os processos descritos acima fazendo referência à FIG. 11G) foram tratadas com NaOH em solução aquosa e remarcadas. Como mostrando na FIG. 11H, as amostras antes (a tracejado) e após (linha a cheio) tratamento alcalino foram analisadas por HPLC. Os números na FIG. 11H indicam os putativos números das RU nos picos correspondentes. Deve ser observado que, na FIG. 11H, os picos acetilados mostrados na FIG. 11G unificam no sinal de polímero não acetilado e que a desacetilação resolveu as unidades de RU nos tempos de eluição após 95 minutos. A FIG. 111 proporciona os resultados da análise de HPLC mostrando o repertório de glicano de CP8 presente em UndPP em células de E. coli. Os extratos de metanol de E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat expressando o aglomerado de CP8 quimérico SEQ ID N°. : 4 (linha a cheio) ou um controlo plasmídico vazio (linha a tracejado) foram extraídos em fase sólida em cartuchos Sep-PAK e tratados com ácido moderado para hidrolisar açúcares de UndPP. 0 material resultante foi colocado em reação com 2AB por aminação redutora, para marcar extremidades de redução dos glicanos e analisado por HPLC de fase normal. Os sinais presentes na linha a cheio, mas não na linha a tracejado, representam material específico de CP8. Estão indicadas as putativas estruturas de RU de CP8 acetiladas e/ou não acetiladas, como identificadas por MALDI-MS/MS das frações recolhidas. É de notar que como nos resultados de HPLC com CP5 mostrados na FIG. 11G, os polímeros de RU de CP8 acetilados e não acetilados do mesmo grau de polimerização agrupam-se no cromatograma da FIG. 11H, como indicado por barras grossas. 0 material detetado após 110 minutos representa polímeros de CP8 mais longos. A FIG. 11J apresenta resultados adicionais de HPLC, mostrando a desacetliação de glicanos de CP8 e homogeneidade de RU. As amostras de glicano marcadas com 2AB de E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG:: cat expressando o aglomerado de CP8 quimérico SEQ ID N°. : 4 foram tratadas com NaOH em solução aquosa e remarcadas. As amostras antes (a tracejado) e após (linha a cheio) tratamento alcalino foram analisadas por HPLC.
Os números indicam os putativos números das RU nos picos correspondentes. Deve notar-se que os picos acetilados desaparecem em grande parte e que os sinais do polímero não acetilado aumentam e que a desacetilação resolveu as unidades de RU nos tempos de eluição após 110 minutos.
As FIG. 11H e 11J mostram resultados de HPLC indicativos do característico padrão de bandas semelhante a escadas de antigénios O, quando o tratamento alcalino foi realizado nestas amostras de CP5 e CP8, para remover as modificações de acetilação dos oligossacáridos e polissacáridos. Os resultados mostram discretos picos agudos, com incrementos de tempo de eluição diminuindo constantemente. Isto implica que essas cadeias de hidratos de carbono analisadas são polímeros lineares compostos por RU idênticas. Estes dados mostram que os açúcares de CP5 e CP8 recombinantes produzidos em E. coli são polimerizados regularmente e parcialmente acetilados. Os polímeros CP5 e CP8 não acetilados eluem identicamente da coluna de HPLC, como esperado da sua semelhança em estrutura; contudo, a cromatografia de fase normal também revela diferenças: por exemplo, o CP5 polimeriza em menor escala do que o CP8 e a acetilação é mais frequente em CP5; nos comprimentos de RU acima de 4, o CP5 tem uma clara preferência para produzir polímeros de 7 RU, enquanto que o CP8 polimeriza num grau mais amplo; e, como indicado pelos resultados de HPLC e MS/MS, o CP5 é mais eficiente para a produção de glicano do que o CP8.
Nas vias de polimerização dependente de wzy, foi referido por Marolda, et al., que uma enzima específica (wzz ou cld, para determinante de comprimento de cadeia) é responsável por determinar o número médio de passos de polimerização de RU realizados (Marolda, C. L., L. D. Tatar, et al. (2006). "Interação da translocase de Wzx e da correspondente polimerase e proteínas reguladoras do comprimento de cadeia na translocação e agrupamento periplasmático do lipopolissacárido antigénio 0". J Bacteriol 188(14): 5124-5135.)· As enzimas Wzz causam uma média do número específico de repetições, e. g., polímeros de açúcar curtos, longos e muito longos, e são conhecidas por transferirem a sua especificidade de comprimento para vias polissacáridas exógenas. Os comprimentos e quantidades dos glicolípidos de CP8 foram analisados na estirpe de produção, resultando em comprimentos maiores e quantidade menor deste açúcar. Para aumentar a quantidade de moléculas e, desse modo, a eficiência de transferência de açúcar para glicosilação proteica, foi realizada uma regulação negativa do comprimento do açúcar de CP8 utilizando uma enzima Wzz específica.
Para testar o efeito de uma proteína Wzz no tamanho e quantidades de açúcares de CP8 em lípido, foi realizada a co-expressão de Wzz de E. coli wzz 07 a partir de um plasmídeo separado (SEQ ID N°: 19). A FIG. 11K apresenta os resultados deste teste. Os extratos de metanol de E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG:: cat expressando o aglomerado de CP8 quimérico SEQ ID N°: 4 e uma cópia indutível de IPTG produzida em plasmídeo de wzz07 (SEQ ID N°: 21, linha a cheio) ou um controlo plasmídico vazio (linha a tracejado) foram extraídos em fase sólida em cartuchos Sep-PAK e tratados com ácido moderado para hidrolisar açúcares de UndPP. Os glicanos marcados com 2AB foram analisados por HPLC de fase normal. 0 tratamento alcalino da amostra de CP8 mostrou que mais de 85% da área entre 95 e 115' representa 7 ou 8 polímeros de RU de CP8, indicando uma ampla variedade de acetilação. Estes resultados também indicam que o aglomerado de CP8 quimérico induziu: a) uma intensificação em números de repetição do glicano mais abundante de 7 para 8 e b) uma intensidade global mais elevada de sinal fluorescente, como avaliada a partir da área sob o cromatograma. 0 tratamento alcalino confirmou a acetilação do glicano encurtado, como na FIG. Ill e 11J, indicando que o comprimento de um polissacárido recombinante pode ser regulado por uma enzima Wzz estranha. Também é possível regular o comprimento do polímero de açúcar capsular por uma enzima Wzz derivada de antigénio 0. Além disso, diferentes promotores em frente do aglomerado quimérico, quando presentes num plasmídeo, causam diferentes níveis de expressão e diferentes graus de polimerização.
Exemplo 5: Glicosilação proteica com os gllcanos de CP5 e CP8 e caracterização de produto
Foram testados diferentes variantes do aglomerado quimérico para a produção de bioconjugado. Os aglomerados génicos de 011/CP5 quiméricos (SEQ ID N° : 2 e 3), os quais contêm
diferentes variantes de regiões de especificidade de S. aureus no aglomerado de antigénio 0 de 011, em vez de wbjA e wzy, foram expressos na estirpe hospedeira E. coli W3110 AwaaL
AwecAwzzE::cat, na presença de PglB (SEQ ID N°: 27?) e EPA (SEQ ID N°: 13). As células hospedeiras de W3110 AwaaL
AwecAwzzE:: cat expressaram EPA com dois sítios de glicosilação (da SEQ ID N°: 13) e PglB (SEQ ID N°: 27) a partir de plasmídeos separados, além do plasmídeo pLAFRl com o aglomerado de antigénio 0 de 011, onde os genes wbjA e wzy foram substituídos com diferentes conjuntos do gene cap5 (e a cassete de cat, SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3). A proteína EPA é expressa, contendo: a) uma sequência de péptido sinal N-terminal para exportar para o periplasma, b) duas sequências consenso de N-glicosilação bacterianas manipuladas na sequência da proteína (SEQ ID N°: 13), como apresentado no Exemplo 10 do documento WO 2009/104074, aqui incorporado por referência na sua totalidade e c) uma cauda de hexa his para purificação. As células foram cultivadas em frascos Erlenmeyer de 5 L em meio de LB. Uma cultura de um dia para o outro foi diluída para D.O.ôoo ™= 0,05. A D.O.600 nm cerca de 0,5, a expressão de PglB foi induzida por adição de IPTG a 1 mM e a expressão de EPA foi induzida por adição de arabinose (concentração final de 0,2%). As células foram cultivadas durante 4 horas, a indução foi repetida e as células foram cultivadas durante cerca de 16 horas adicionais. As células foram sedimentadas por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. O bioconjugado de EPA-CP5 sem e com o gene cap5K de flipase de S. aureus (SEQ ID N°: 2 e 3) foi eluído por imidazole a 0,5 M e os picos eluído foram agregados e analisados por SDS PAGE e corados por Coomassie e prata (FIG. 12). A FIG. 12 apresenta os resultados de SDS PAGE. O painel esquerdo mostra a coloração de Coomassie e o painel da direita mostra a coloração de prata. Os números no meio indicam os tamanhos do marcador de peso molecular. As letras por baixo das pistas indicam os genes que estavam presentes no aglomerado quimérico expresso nas estirpes utilizadas para produção de bioconjugado. A estirpe hospedeira foi E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzE:: cat. Os resultados mostram sinal de proteína a 70 kDa (mobilidade eletroforética) correspondendo, muito provavelmente, a EPA não glicosilada e uma escada de bandas acima (100-170 kDa) . A escada corresponde, provavelmente, à proteína EPA glicosilada com o glicano CP5 de S. aureus recombinante. Além disso, os resultados indicam que a inclusão do gene de flipase no sistema aumenta o rendimento da glicoproteina (pistas do meio e da direita).
Numa análise separada, o bioconjugado de CP5-EPA foi produzido em E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzE:: cat por co-expressão do aglomerado génico de CP5 quimérico (SEQ ID N°: 3), PglB (SEQ ID N°: 27) a partir do plasmideo pEXT21 e EPA (contendo dois sitios de glicosilação, SEQ ID N°: 13) de plasmídeos separados. Para se obter um processo mais controlado para produção de bioconjugado, as células foram cultivadas num biorreator de 2 L até uma D.O.600 m = 30 a 37 °C e a expressão de PglB e EPA foi induzida pela adição de IPTG a 1 mM e arabinose a 0,2%. As células foram cultivadas durante 18 h, a 37 °C, sob condições limitantes de oxigénio. As células foram sedimentadas por centrifugação, lavadas e ressuspensas em tampão de sacarose a 25%, a uma D.O.600 nm = 200, após incubação de 30 min., a 4 °C, a suspensão foi sedimentada e lisada por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas presentes no sobrenadante foram carregadas numa cromatograf ia de afinidade de Ni2+. As EPA glicosiladas e não glicosiladas foram eluídas da coluna de afinidade por imidazole a 0,5 M e carregadas numa coluna de troca aniónica SourceQ. A EPA glicosilada foi separada da EPA não glicosilada por aplicação de um gradiente de concentração crescente de NaCl.
Como mostrado na FIG. 13A, a EPA glicosilada purificada (CP5-EPA) foi separada por SDS PAGE e corada por Coomassie (pista da esquerda) ou transferida para membranas de nitrocelulose e incubada com anticorpos anti-CP5 (pista do meio) ou anticorpos anti-EPA (pista da direita). 0 bioconjugado
purificado foi reconhecido pelos anticorpos específicos de EPA (pista da direita) , assim como o antissoro policlonal específico de CP5 (pista do meio) . A indica a posição no gel de onde um pedaço foi cortado e utilizado para tripsinização e análise de glicopéptidos por MALDI-MS/MS. A FIG. 13B apresenta as massas MALDI-MS/MS de M/Z verificadas para o sítio de glicosilação no péptido tripsinizado DNNNSTPTVISHR ligado N-glicosidicamente à massa de RU O-acetilada (m/z=2088 ([M+H]+)). A análise de MS/MS da m/z=2088 mostra fragmentação parcial da unidade de açúcar, como indicado. A inserção ilustra a estrutura de RU conjugada ao péptido derivado de tripsinização de CP5-EPA purificado da FIG. 13A. As perdas sequenciais de ManNAcA (HexNAcA, 217 Da) e FucNAc acetilado (dHexNAc(OAc), 229 Da) apoiam a estrutura esperada do glicano. A FIG. 13C apresenta as massas MALDI-MS/MS de M/Z verificadas para o sítio de glicosilação no péptido tripsinizado DQNR ligado N-glicosidicamente à massa de RU O-acetilada (m/z=1165 ([M+H]+)). A análise de MS/MS de m/z=1165 mostra a série iónica de fragmentação completa do ião Y, consistente com a estrutura de RU de CP5. A inserção ilustra a estrutura de RU conjugada ao péptido derivado de tripsinização de CP5-EPA purificado da FIG. 13A. As perdas sequenciais de ManNAcA (HexNAcA, 217 Da), FucNAc acetilado (dHexNAc(OAc), 229 Da) e FucNAc (dHexNAc, 187 Da) estão mostradas, confirmando a estrutura esperada do glicano no péptido DQNR (m/z=532 Da ( [M+H+] ) ) .
Na FIG. 13D, o bioconjugado de CP8 em E. coli foi produzido utilizando a mesma estratégia que a produção do bioconjugado de CP5. 0 bioconjugado de CP8-EPA foi produzido em E. coli por co-expressão do aglomerado génico de CP8 quimérico (SEQ ID N°: 4), PglB (no plasmideo pEXT21 (SEQ ID N°: 27)) e EPA contendo dois sítios de glicosilação (SEQ ID N°: 13) . As células foram cultivadas num biorreator, com um volume de partida de 7 L em meio semidefinido contendo, como fontes de C, glicerol, peptona e extrato de levedura. As células foram cultivadas a 37 °C em modo descontínuo ou descontínuo pulsado até uma D.O. 600 nm de 30 e a expressão de PglB e EPA foi induzida pela adição de IPTG a 1 mM e arabinose a 10%. Após indução, as células foram ainda cultivadas em modo semicontínuo, durante um período de 15 horas, sob condições limitantes de oxigénio. As células foram sedimentadas por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. As EPA glicosiladas e não glicosiladas foram eluídas da coluna de afinidade por imidazole a 0,5 M e carregadas numa coluna de troca aniónica SourceQ. A EPA glicosilada foi separada da EPA não glicosilada por aplicação de um gradiente de concentração crescente de NaCl.
Como representado na FIG. 13D, a proteína purificada foi separada por SDS PAGE e corada por Coomassie (pista da esquerda) ou transferida para membranas de nitrocelulose e incubada com anticorpos anti-CP8 (pista da direita) ou anticorpos anti-EPA (pista do meio).
Foram testadas diferentes estratégias para melhoramento adicional do sistema de glicosilação. Numa estratégia para reduzir o número de plasmideo no sistema de produção para diminuir a carga de um antibiótico adicional, assim como manter um plasmideo extra, a cassete de expressão para pglB foi clonada no plasmideo contendo os aglomerados quiméricos para CP5 (SEQ ID N°: 17) e CP8 (SEQ ID N°: 18). A cassete de expressão é composta pela região intergénica presente entre galF e wbqA do genoma de E. coli 0121 (para uma sequência promotora) e a sequência de pglB a jusante desta. Esta cassete de expressão foi clonada imediatamente a jusante dos aglomerados quiméricos de CP5 e CP8. A requerente testou E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA:: cat contendo o aglomerado de CP5 quimérico (SEQ ID N°: 3) e pglB (SEQ ID N°: 27) em plasmideos separados ou no mesmo plasmideo (SEQ ID N°: 17) . Além disso, a EPA (SEQ ID N°: 13) foi expressa a partir de um plasmideo sob o controlo de um promotor indutível de arabinose. As células foram cultivadas em frascos Erlenmeyer de 5 L em meio de LB, a 37 °C. Uma cultura foi diluída, de um dia para o outro, para D. 0.6 o o nm= 0,05. A D.O. 600 nm cerca de 0,5 de expressão de PglB foi induzida por adição de IPTG a 1 mM e a expressão de EPA foi induzida por adição de arabinose (concentração final de 0,2%). As células foram cultivadas durante 4 horas, a indução foi repetida e as células foram cultivadas durante cerca de 16 horas adicionais. A cultura foi sedimentada por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. O EPA-CP5 foi eluído por imidazole a 0,5 M e os picos eluídos foram agregados e analisados por SDS PAGE e por Coomassie. A FIG. 13E representa os resultados de SDS PAGE. São mostradas as células contendo 3 (esquerda) ou 2 plasmídeos (pista da direita) para produção de glicoconjugado. Os resultados mostram que a produção de glicolipido e conjugado para CP5-EPA foi mantida.
Uma otimização adicional do sistema foi a integração da sequência proteica wzz (reguladora do comprimento do polímero) nos plasmídeos utilizados para a glicosilação proteica. Exemplificado pelo sistema produzindo CP8-EPA, wzz foi integrado no aglomerado de CP8 quimérico plasmídeo gerado em plasmídeo (SEQ ID N°: 19) e a jusante do gene epa no plasmídeo de expressão para a proteína transportadora (SEQ ID N°: 20). O bioconjugado de CP8-EPA foi produzido em E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat compreendendo 2 plasmídeos: um plasmídeo continha além do aglomerado génico de CP8 quimérico uma cópia do gene wzz 07 e uma cassete de ADN para a expressão constitutiva do gene pglB (SEQ ID N°: 19); o segundo plasmídeo continha, em primeiro lugar, o gene para expressão e secreção da proteína EPA destoxifiçada contendo dois sítios de glicosilação e, em segundo lugar, uma cópia de wzz07 sob o controlo do mesmo promotor (SEQ ID N°: 20) . A estirpe resultante, E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG:: cat, contendo os plasmídeos mencionados foi cultivada num biorreator, com um volume de partida de 7 L em meio semidefinido contendo, como fontes de C, glicerol, peptona e extrato de levedura. As células foram cultivadas em modo descontínuo ou descontínuo pulsado até uma D . O . 600 nm de 30 e a expressão de PglB e EPA foi induzida. Após indução, as células foram ainda cultivadas em modo semicontínuo, durante um período de 15 horas, sob condições limitantes de oxigénio e recolhidas por centrifugação. As células foram sedimentadas por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatograf ia de afinidade de Ni2+. As EPA glicosiladas e não glicosiladas foram eluídas da coluna de afinidade por imidazole a 0,5 Μ. A formação do glicoconjugado CP8-EPA é mostrada na FIG. 13F por Coomassie e transferência de western utilizando antissoros anti-his e anti-CP8. A FIG. 13F mostra os resultados da separação de SDS PAGE da proteína purificada e análise por coloração de Coomassie (pista da esquerda) ou transferida para membranas de nitrocelulose e sondada com anticorpos anti-cauda de his (pista do meio) ou anticorpos anti-CP8 (pista da direita). A caracterização do glicoconjugado de CP5-EPA foi ainda refinada por diversos métodos analíticos. O CovalX (Schlieren, Suíça) realizou a análise de MALDI de Elevada Massa de uma amostra de CP5-EPA purificada, produzida utilizando o sistema de 3 plasmídeos como utilizado nas análises representadas na FIG. 13A em W3110 AwaaL AwecAwzzECA:: cat. A FIG. 14A representa os resultados de MALDI de Elevada Massa. A+ e B+ apontam na direção das espécies de proteína de massa ([M+H]+) correspondendo a EPA não glicosilada e EPA glicosilada, respetivamente. As formas oligoméricas podem estar presentes com peso molecular mais elevado e os sinais na área de baixo PM são contaminantes ou produtos de degradação. Os resultados apresentados na FIG. 14A mostram que a preparação de proteína acima continha uma população proteica em grande parte monomérica que é 4 kDa maior que a proteína EPA isoladamente, indicativo de um comprimento médio de açúcar de 5,2 unidades de repetição. Isto está em concordância com o comprimento de açúcar de 5-7 da principal forma de glicoconjugado na preparação, como analisado por SDS-PAGE, coloração de azul brilhante de Coomassie e contagem das unidades de repetição na principal forma de conjugado (ver as FIG. 7, 8 e 13A). 0 CP5-EPA foi ainda caracterizado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC-HPLC). A requerente utilizou o sistema de 3 plasmideos em W3110 AwaaL AwecAwzzECA:: cat, como utilizado nas análises representadas na FIG. 13A. A amostra foi purificada por cromatografia de troca aniónica para remover EPA não glicosilada. A análise foi realizada numa coluna G2000SWXL Supelco TSK. A FIG. 14B mostra os resultados da análise de SEC-HPLC da amostra de CP5-EPA purificada. É mostrado o traçado de UV medido a 280 nm. A linha grossa a cheio deriva da análise de 3,25 yg de CP5-EPA purificado, a linha fina foi obtida de 5 yg de EPA purificada, não glicosilada. Um pico homogéneo principal a 11,5 minutos de eluição está mostrado, enquanto que a EPA não glicosilada eluiu a 12,9 minutos (FIG. 14B). O cálculo dos raios hidrodinâmicos das duas moléculas resultou num tamanho de 42 kDa para EPA não glicosilada e 166 kDa para EPA glicosilada. Isto indica que a EPA glicosilada surge como uma proteína monomérica alongada em solução, como esperado devido à estrutura linear do glicano.
As presentes análises confirmaram, deste modo, que o bioconjugado de CP5-EPA consiste da proteína EPA e da correta estrutura do glicano O-acetilado. Com base nestes resultados, também poderia ser predado que o bioconjugado de CP8-EPA consistia da proteína EPA e da estrutura correta do glicano O-acetilado.
Exemplo 6: Gllcosllação da proteína de S. aureus e caracterização do produto
Para provar a versatilidade da glicosilação "in vivo", para produzir candidatos vacinais de glicoconjugado, foram utilizadas várias proteínas veículo como substrato para serem glicosilados com CP5. Para aumentar adicionalmente a resposta imunitária da vacina de bioconjugado contra S. aureus, a proteína transportadora EPA é trocada pela forma AcrA de C. jejuni e duas proteínas de S. aureus: Hla e ClfA. Para serem utilizadas como proteínas veículo, Hla e ClfA foram modificadas pela inserção dos sítios de Aí-glicosilação bacterianos. 0 processo foi realizado como descrito no documento WO 2006/119987, produzindo quatro versões para Hla H351: SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 16 e três para ClfA: SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N° : 12.
Para glicosilação do sitio 130 de Hla H351, foram utilizadas células de E. coli (W3110 AwaaL AwecAwzzE ArmlB-wecG) , compreendendo dois plasmídeos de expressão: um para a produção de Hla H351 (SEQ ID N°: 16), no qual a expressão de Hla H35L contendo o péptido sinal N-terminal para secreção periplasmática, um sitio de IV-glicosilação e uma cauda de hexa HIS para purificação está sob o controlo do promotor ParaBAD e, em segundo, lugar, um para expressão do aglomerado quimérico de CP5 e pglB (SEQ ID N°.: 17). Este sistema corresponde ao sistema de expressão de 2 plasmídeos otimizado de antemão de CP5-EPA, com um plasmideo de expressão de veículo proteico trocado. As células foram cultivadas num biorreator de 12 L em meio rico até uma D. 0.600 nm = 30, a expressão de Hla foi induzida pela adição de arabinose a 0,2%. As células foram sedimentadas por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas no sobrenadante foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. As Hla glicosiladas (CP5-Hla) e não glicosiladas foram eluídas da coluna de afinidade por imidazole a 0,5 M e carregadas numa cromatografia de troca aniónica. As proteínas foram eluidas com um gradiente linear de 0 a 0,7 M de NaCl para separar CP5-Hla de Hla. A proteína resultante foi separada por SDS PAGE e corada por Coomassie, ou transferida para membranas de nitrocelulose e sondada com antissoros anti-His, anti-Hla ou anti-CP5, como indicado (FIG. 14C) . Os resultados na FIG. 14C mostram a formação de glicoconjugado (CP5-Hla) por Coomassie (pista da esquerda) e transferência de western utilizando antissoros anti-His (pista da esquerda do meio) e anti-Hla (direita do meio) e anti-CP5 (direita) . A identidade de Hla H351 com um sítio de glicosilação 130 manipulado foi confirmada por tripsinização em gel e MALDI-MS/MS.
Para mostrar adicionalmente que a proteína transportadora é permutável para glicosilação por CP5 e CP8, a proteína AcrA de C. jejuni foi utilizada como um aceitador de glicosilação (ver a FIG. 14D) . Utilizando o sistema de 3 plasmídeos (SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 15 e SEQ ID N°: 27), a estirpe de produção para este
conjugado foi W3110 AwaaL albergando o aglomerado quimérico de CP5 (SEQ ID N°: 3), a proteína PglB induzida por IPTG (SEQ ID N°: 27) e a AcrA (SEQ ID N°: 15) sob indução de arabinose em plasmídeos separados. As células foram cultivadas num biorreator, com um volume de partida de 7 L em meio semidefinido contendo, como fontes de C, glicerol, peptona e extrato de levedura. As células foram cultivadas em modo descontínuo ou descontínuo pulsado até uma D.O.600 nm de 30 e a expressão de PglB e AcrA foi induzida pela adição de IPTG a 1 mM e arabinose a 10%. Após indução, as células foram ainda cultivadas em modo semicontínuo, durante um período de 15 horas, sob condições limitantes de oxigénio e recolhidas por centrifugação. As células foram sedimentadas por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. As glicoproteínas CP5-AcrA foram eluídas da coluna de afinidade por imidazole a 0,5 Μ. A proteína purificada foi separada por SDS PAGE e corada por Coomassie, ou transferida para membranas de nitrocelulose e sondada com antissoros anti-AcrA ou anti-CP5, como indicado na FIG. 14D. A inserção dos sítios de iV-glicosilação bacterianos em ClfA foi realizada como descrito no documento WO 2006/119987, produzindo as SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 12. As proteínas veículo foram expressas em células de E. coli a partir de promotores indutíveis de arabinose. Os genes foram concebidos para produzir um péptido sinal N-terminal para secreção periplasmática, vários sítios de N-glicosilação e uma cauda de hexa HIS para purificação. A purificação foi iniciada a partir de extratos periplasmáticos de células de E. coli.
Para glicosilação de ClfA 327, foram empregues os sistemas de expressão otimizados de antemão de CP5-EPA. Utilizando o sistema de 2 plasmídeos (SEQ ID N°: 17 e SEQ ID N°: 11), células de E. coli (W3110 AwecAwzzE ArmlB-wecG AwaaL) compreendendo o aglomerado quimérico de CP5 e pglB (cassete de expressão constitutiva), assim como o plasmideo de expressão para ClfA 327 (sob controlo do promotor ParaBAD), foram cultivadas em frascos Erlenmeyer de 1 L em meio de LB. Uma cultura de um dia para o outro foi diluida para D.O. βοο nm= 0,05. A D.0.6oonm de cerca de 0,5, foi induzida a expressão de ClfA por adição de arabinose (concentração final de 0,2%). As células foram cultivadas durante 20 horas. As células foram sedimentadas por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. O C1ÍA-CP5 foi eluido por imidazole a 0,5 M, foi separado por SDS PAGE e corado por Coomassie ou transferido para membranas de nitrocelulose e sondado com antissoros anti-His ou anti-CP5. A FIG. 14E mostra os resultados obtidos utilizando o variante ClfA com o sitio de glicosilação inserido próximo da posição de aminoácido 327 da proteína (SEQ ID N°: 11) . Eles mostram a formação de ClfA por coloração de Coomassie e transferência de western anti-His e glicoconjugado (CP5-C1ÍA) por transferência de western utilizando antissoros anti-CP5.
Exemplo 7: Atividade de CP5-EPA como vacina de glicoconjugado Células W3110 AwaaL AwecAwzzECA:: cat compreendendo aglomerado quimérico de CP5 (SEQ ID N°: 3) com cap5K no interior, a proteína PglB (SEQ ID N°: 27) e EPA com 2 sítios de glicosilação de sinal em pEC415 (SEQ ID N°: 13) foram cultivadas em frascos Erlenmeyer de 1 L, em meio de LB. Uma cultura foi diluída, de um dia para o outro, para D.O.600 nm 0,05. A D.O.600 nm de cerca de 0,5, foi induzida a expressão de EPA e PglB por adição de arabinose (concentração final de 0,2%) e IPTG a 1 mM, respetivamente. As células foram cultivadas durante 20 horas. As células foram sedimentadas por centrifugação; as células foram lavadas e suspensas em 0,2 vol de tampão de sacarose, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. As EPA glicosiladas e não glicosiladas foram eluídas da coluna de afinidade por imidazole a 0,5 M e carregadas numa coluna de troca aniónica SourceQ. A EPA glicosilada foi separada da EPA não glicosilada por aplicação de um gradiente de concentração crescente de NaCl. As quantidades de proteína eluída foram determinadas pelo ensaio de BCA e, com base no tamanho das bandas obtidas em SDS PAGE corado por Coomassie, a massa teórica do açúcar foi calculada. Juntamente com a determinação de proteína, a quantidade de antigénio polissacárido foi estimada na preparação. Esta quantificação estimada foi confirmada pelo método de MS de maldi de elevada massa (ver a FIG. 14A) .
Para medir a imunogenicidade de CP5-EPA em animais vivos, 1 yg do glicoconjugado purificado foi injetado em murganhos pela via IP (intraperitoneal) , na presença de Hidróxido de alumínio como adjuvante, nos dias 1 (primeira injeção), 21 (segunda injeção) e 56 (terceira injeção) . Após 35 e 61 dias, que foram duas semanas após a segunda e terceira injeções, respetivamente, a resposta de IgG foi medida por ELISA utilizando um CP5 modificado por poli-L-lisina para revestimento (Gray, B.M. 1979. Metodologia de ELISA para antigénios polissacáridos: ligação proteica de polissacáridos para adsorção sobre tubos de plástico. J. Immunol. 28:187-192). Sangue de murganhos imunizados com bioconjugado de CP5 foi analisado para anticorpos específicos de IgG contra polissacárido capsular de CP5. A FIG. 15A apresenta os títulos de IgG deduzidos por CP5-EPA em murganhos. As placas de ELISA foram revestidas com CP5 modificado por poli-L-lisina, a resposta de IgG em murganhos imunizados duas vezes (segunda barra (vazia) a cada diluição) ou três vezes (primeira barra (diagonais para a frente) a cada diluição) com CP5-EPA foi medida em triplicados. Os sinais obtidos com os soros pré-imunes como controlo estão indicados pela terceira barra (diagonais para trás) a cada diluição. A resposta de IgG dos murganhos foi medida com proteína G conjugada a fosfatase alcalina. Como mostrado na FIG. 15A, o bioconjugado de CP5-EPA deduziu um título de anticorpo sérico de 6,4 x 103. Os resultados apresentados na FIG. 15A mostram que o CP5-EPA deduz anticorpos específicos de CP5 em murganhos. Esta experiência mostra que o bioconjugado produzido em E. coli é imunogénico em murganhos.
Uma experiência semelhante foi realizada em coelhos como o organismo hospedeiro. CP5-EPA (15 yg de CP5) foi injetado em coelhos intradermicamente na presença de adjuvante completo de Freund no dia 1 e subcutaneamente na presença de adjuvante incompleto de Freund nos dias 20, 30 e 40. Após 61 dias, a resposta de IgG foi medida por ELISA utilizando um CP5 modificado por poli-L-lisina para revestimento (Gray, B.M. 1979. Metodologia de ELISA para antigénios polissacáridos: ligação proteica de polissacáridos para adsorção sobre tubos de plástico. J. Immunol. 28:187-192). A FIG. 15B apresenta títulos de IgG deduzidos por CP5-EPA em coelhos. Os resultados apresentados na FIG. 15B mostram que o CP5-EPA deduz anticorpos específicos de CP5 em coelhos. A resposta imunitária a bioconjugado de CP5-EPA é a segunda barra (diagonais para a frente) a cada diluição. Os soros de controlo incluem soros absorvidos específicos de CP5 deduzidos para S. aureus neutralizado (extratos de WC, primeira barra (pontos) a cada diluição) e soro pré-imune (terceira barra (vazia) a cada diluição). 0 soro de coelhos imunizados com diversos antigénios foi analisado para anticorpos específicos para CP5 purificados. As placas foram revestidas com CP5 modificado por poli-L-lisina. Os sinais obtidos com os soros pré-imunes como controlo estão indicados pela terceira barra (diagonais para trás) a cada diluição. A resposta de IgG dos coelhos foi medida com proteína G conjugada a fosfatase alcalina em triplicados. 0 bioconjugado de CP5-EPA deduziu um título de 1 x 106, o qual foi 4 vezes superior ao título de soros de controlo (preparados por imunização com S. aureus neutralizado intacto e, depois, absorvidos com Wood 46 e um mutante acapsular isogénico tripsinizado, de modo a que o antissoro fosse tornado específico de CP5). Esta experiência mostra que o bioconjugado foi capaz de deduzir uma resposta de IgG específica de CP5 de elevado título.
Exemplo 8: Atividades funcionais de anticorpos de CP5
Atividade in vitro 0 antissoro policlonal de coelho deduzido como descrito no Exemplo 7 foi purificado por coluna de afinidade de Proteína A, para enriquecimento para anticorpos específicos de IgG. IgG de coelhos imunizados com o bioconjugado de S. aureus CP5-EPA foi testado para atividade funcional num ensaio de neutralização opsonofagocítica clássica in vitro (Thakker, M., J.-S. Park, V.
Carey e J. C. Lee. 1998. 0 polissacárido capsular de serotipo 5 de Staphylococcus aureus é antifagocítico e melhora a virulência bacteriana num modelo de bacteriemia murina. Infect Inrnun 66:5183-5189). 0 S. aureus foi cultivado durante 24 h em ágar
Columbia + NaCl a 2%. As bactérias foram suspensas em meio mínimo essencial + BSA a 1% (MEM-BSA). Os PMN (neutrófilos polimorfonucleares) foram isolados de sangue humano fresco, lavados contados e suspensos em MEM-BSA. As preparações de IgG purificadas de coelhos imunizados com CP5-EPA de S. aureus ou como preparações de IgG purificadas de controlo de coelhos imunizados com 01-EPA de Shigella que foi purificado como descrito no documento WO 2009/104074, foram adicionadas ao ensaio em diluições seriais de fator 10 preparadas em MEM-BSA. Soro de cobaio (Pel-Freez) foi utilizado como uma fonte de C' . Cada ensaio (volume total de 0,5 mL) continha ~5 x 106 PMN, 1 x 106 CFU de S. aureus, 0,5% a 1% de soro de cobaio e concentrações variáveis de IgG, variando entre 140 yg/mL e 1 yg/mL. As amostras de controlo continham 1) S. aureus incubado com C' e PMN, mas sem anticorpo; 2) S. aureus incubado com IgG e C', mas sem PMN; e 3) S. aureus isoladamente. As amostras foram rodadas pelas extremidades (12 rpm), durante 2 h, a 37 °C. As diluições das amostras foram agitadas em vórtice em água estéril e a neutralização bacteriana foi estimada por plaqueamento das amostras diluídas, em duplicado, em TSA. A percentagem de neutralização foi definida como a redução em CFU/mL após 2 h em comparação com aquela no tempo zero.
No primeiro conjunto de experiências, foi testada a neutralização opsonofagocítica da estirpe Reynolds de S. aureus sensível a meticilina (MSSA), o isolado protótipo de CP5, e os resultados estão mostrados na FIG. 16A. A atividade opsónica de anticorpos para CP5-EPA deduzidos em coelho foi testada contra a estirpe Reynolds de S. aureus serotipo 5. Os anticorpos de CP5-EPA eram opsónicos até uma concentração de 1,4 yg/mL, enquanto que os anticorpos de 01-EPA mostraram pouca atividade opsónica a 140 yg/mL. Um soro de controlo positivo deduzido contra extratos de células intactas de S. aureus (obtido de J. C. Lee no Departamento de Medicina, Brigham and Women's Hospital, Faculdade de Medicina de Harvard, Boston, MA, EUA) mostrou atividade semelhante ao soro anti-CP5-EPA (antissoro WC, 1%) .
Como mostrado na FIG. 16A, entre 65-75% de S. aureus Reynolds foi neutralizado pelas PMN quando incubado com anticorpos para CP5-EPA e soro de cobaio a 1% com atividade de complemento. 0 antissoro foi utilizado a 1% final no ensaio e 89% do inoculo de S. aureus foi neutralizado sob estas condições. Foi observada pouca neutralização quando o S. aureus foi opsonizado por C' isoladamente (soro de cobaio a) ou anticorpos e C' sem as PMN. Os dados mostrados são as médias de 2 a 5 experiências. Todas as amostras em gráfico incluíam soro C' de cobaio e, na ausência de C' , não foi observada neutralização. Nem os anticorpos isoladamente nem o complemento isoladamente eram opsónicos e esta particularidade é característica de patogénios bacterianos encapsulados. Em contraste, anticorpos deduzidos pela vacina de controlo (antigénio de Shigella 01 ligado a EPA) não mostraram atividade opsónica, mesmo na presença de C' . Como um controlo positivo neste ensaio, a requerente também testou antissoro de coelho específico de CP5 (obtido de J. C. Lee no Departamento de Medicina, Brigham and Women's Hospital, Faculdade de Medicina de Harvard, Boston, MA, EUA). Estes dados mostram que os anticorpos deduzidos para o bioconjugado de CP5-EPA mostraram atividade opsónica contra S. aureus encapsulado que é comparável a anticorpos de CP5 com atividade opsónica documentada (Thakker, M., J.-S. Park, V. Carey e J. C. Lee. 1998 . O polissacárido capsular de serotipo 5 de Staphylococcus aureus é antifagocítico e melhora a virulência bacteriana num modelo de bacteriemia murina. Infect Immun 66:5183-5189). A atividade opsónica de anticorpos para CP5-EPA testou contra a estirpe USA100 de MRSA de CP5-EPA. A FIG. 16B apresenta os resultados da atividade opsónica de IgG e C' testada contra a estirpe USA100 de S. aureus, um isolado de CP5+, e é denominada NRS382. Os dados mostrados são as médias de 2 a 5 experiências. Todas as amostras em gráfico incluíam soro C' de cobaio e, na ausência de C', não foi observada neutralização. Como mostrado na FIG. 16B, -60% do inoculo de USA100 foi neutralizado pelas PMN incubadas com complemento de cobaio a 0,5% e concentrações de IgG de CP5-EPA variando entre 100 a 1 yg/mL. Foi observada neutralização mínima na ausência das PMN ou quando a IgG foi omitida do ensaio. Não foi alcançada neutralização quando a IgG deduzida para a vacina conjugada de Ol-EPA foi adicionada às PMN + C' (nesta amostra, as bactérias multiplicaram-se). Foi observada pouca neutralização quando o S. aureus foi opsonizado por C' isoladamente ou anticorpos e C' sem as PMN. Assim, os anticorpos de CP5-EPA eram opsónicos a concentrações que variam entre 100 e 1 yg/mL, enquanto que os anticorpos de Ol-EPA mostraram pouca atividade opsónica a 100 yg/mL. Esta experiência mostra que os anticorpos de CP5-EPA exibem atividade opsónica contra as estirpes de MSSA e de MRSA.
Atividade in vivo
Para determinar se a atividade opsónica de IgG deduzida para a vacina do bioconjugado CP5-EPA conferia proteção num modelo de murganho de infeção estafilocócica, foram realizadas experiências de imunização passiva. Nos estudos iniciais, murganhos Swiss-Webster macho (~6 semanas de idade) foram injetados IV (veia da cauda) com 1,4 a 2 mg de IgG de coelhos imunizados com CP5-EPA ou 01-EPA de Shigella. Após 24 h, os murganhos foram estimulados pela via intraperitoneal (IP) com ~3,6 x 107 CFU de S. aureus Reynolds. Os níveis de bacteriemia foram medidos 2 h após o estímulo para avaliar a eliminação mediada por anticorpo da bacteriemia. O limite inferior de deteção pela cultura era 5 CFU/mL de sangue. A FIG. 17A mostra os níveis de bacteriemia resultantes. Cada ponto representa uma cultura de sangue quantitativa realizada por perfuração da veia da cauda num murganho individual 2 h após inoculação bacteriana. As linhas horizontais representam valores medianos de CFU/mL. Os círculos vazios são amostras de sangue de murganhos que obtiveram anticorpos anti-CP5-EPA, os círculos cheios a negro são amostras de animais que receberam uma preparação de anticorpo de controlo que foi deduzida contra EPA conjugado a um glicano diferente (01 de S. dysenteriae) . Os resultados da FIG. 17A mostram que os murganhos que receberam anticorpos de CP5 mostraram uma redução significativa (P = 0,0006 pela análise de Mann-Whitney) nos níveis de bacteriemia, em comparação com murganhos que receberam os anticorpos específicos de 01. De facto, a redução em CFU/mL de sangue foi 98% em murganhos imunizados passivamente com IgG de CP5-EPA vs. murganhos que receberam IgG de 01-EPA.
Em experiências subsequentes de imunização passiva, os
murganhos foram estimulados IP com um inoculo inferior (—5,5 x 106 CFU/murganho) de S. aureus Reynolds. A imunização passiva com anticorpos de CP5-EPA foi testada em murganhos estimulados IP com 5-6 x 106 CFU de S. aureus Reynolds. Os murganhos foram injetados intravenosamente (IV) com 2 mg de IgG de CP5-EPA ou IgG de Ol-EPA, 24 h antes do estímulo bacteriano. A FIG. 17B mostra os níveis de bacteriemia resultantes. Cada ponto representa uma cultura de sangue quantitativa realizada por perfuração da veia da cauda num murganho individual 2 h após inoculação bacteriana. As linhas horizontais representam valores medianos de CFU/mL. Os círculos vazios são amostras de sangue de murganhos que obtiveram anticorpos anti-CP5-EPA, os círculos cheios a negro são amostras de animal que recebeu uma preparação de anticorpo de controlo que foi deduzida contra EPA conjugado a um glicano diferente (01 de S. dysenteriae). Como mostrado na FIG. 17B, os murganhos que receberam 2 mg de IgG de CP5-EPA tiveram níveis de bacteriemia significativamente (P <0,0001 pela análise de Mann-Whitney) inferiores aos animais que receberam 2 mg de IgG de Ol-EPA. De facto, 6 de 7 murganhos imunizados passivamente com anticorpos de CP5-EPA tiveram culturas de sangue estéreis (limite inferior de deteção 6 a 30 CFU/mL de sangue, dependendo do volume de sangue recolhido e plaqueado de cada murganho). A redução nos níveis de bacteriemia atribuível aos anticorpos de CP5 foi 98%, em comparação com murganhos de controlo que receberam IgG de Ol-EPA.
Para determinar se a proteção contra bacteriemia poderia ser conferida por um nível inferior de IgG, foi realizada uma experiência subsequente em que os murganhos foram imunizados passivamente pela via IV com 300 yg de IgG de CP5-EPA ou Ol-EPA. Após 24 h, os murganhos foram inoculados IP com 6 x 106 CFU de S. aureus Reynolds. O limite inferior de deteção pela cultura era 13-67 CFU/mL de sangue. A FIG. 17B mostra os níveis de bacteriemia resultantes. Cada ponto representa uma cultura de sangue quantitativa realizada por perfuração da veia da cauda num murganho individual 2 h após inoculação bacteriana. As linhas horizontais representam valores medianos de CFU/mL. Os círculos vazios são amostras de sangue de murganhos que obtiveram anticorpos anti-CP5-EPA, os círculos cheios a negro são amostras de animal que recebeu uma preparação de anticorpo de controlo que foi deduzida contra EPA conjugado a um glicano diferente (01 de S. dysenteriae) . Como na FIG. 17B, os resultados da FIG. 17C mostram que a proteção mediada por anticorpo de CP5 contra bacteriemia foi alcançada com esta dose inferior de anticorpo. Foi alcançada uma redução de 98% nos níveis de bacteriemia por anticorpos deduzidos pela vacina de bioconjugado de CP5 e 8 de 9 murganhos tiveram culturas de sangue estéreis, em comparação com 0 de 8 murganhos que receberam anticorpos de 01-EPA de Shigella.
Exemplo 9: Imunização ativa em murganhos
Para mostrar que a vacinação de murganhos com o bioconjugado CP5-EPA medeia proteção contra estímulo bacteriano, como no ensaio de imunização passiva, foram realizados estudos de imunização ativa. 0 bioconjugado de CP5-EPA foi produzido em W3110 AwaaL AwecAwzzE:: cat por co-expressão do aglomerado génico de CP5 quimérico (SEQ ID N°: 3), PglB (SEQ ID N°: 27) a partir do plasmídeo pEXT21 e EPA (contendo dois sítios de glicosilação, SEQ ID N°: 13) de plasmídeos separados. As células foram cultivadas num biorreator, com um volume de partida de 7 L em meio semidefinido contendo, como fontes de C, glicerol, peptona e extrato de levedura. As células foram cultivadas em modo descontínuo ou descontínuo pulsado até uma D.O.600 nm de 30 e a expressão de PglB e EPA foi induzida pela adição de IPTG a 1 mM e arabinose a 10%. Após indução, as células foram ainda cultivadas em modo semicontínuo, durante um período de 15 horas, sob condições limitantes de oxigénio e recolhidas por centrifugação. As células foram lavadas e suspensas em tampão de sacarose a 25%, a uma ϋ.Ο.βοο nm = 200, sedimentadas e lisadas por choque osmótico. Os esferoplastos foram sedimentados por centrifugação e as proteínas periplasmáticas foram carregadas numa cromatografia de afinidade de Ni2+. As EPA glicosiladas e não glicosiladas foram eluídas da coluna de afinidade por imidazole a 0,5 M e carregadas numa coluna de troca aniónica SourceQ. A EPA glicosilada foi separada da EPA não glicosilada por aplicação de um gradiente de concentração crescente de NaCl.
Pretende-se que CP5-EPA seja utilizado como uma vacina conjugada para proteger contra estirpes de S. aureus de CP5. Para testar se essa imunização ativa é funcional, a requerente imunizou diferentes grupos de murganhos Swiss Webster fêmea com três doses diferentes de CP5-EPA e analisou a imunização utilizando um modelo de bacteriemia. Três doses foram injetadas subcutaneamente nos dias 0, 14 e 28. Os murganhos foram estimulados intraperitonealmente no dia 42 com a estirpe JL278 de S. aureus, como mostrado na FIG. 18. Cinco grupos de murganhos foram imunizados com três doses diferentes de CP5-EPA, como indicado debaixo do eixo x (círculos ponteados; círculos vazios; e diagonais para trás em círculos) . Dois grupos de controlo receberam adjuvantes (diagonais para a frente em círculos) ou PBS (círculos cheios a negro) isoladamente. Cada ponto representa uma amostra de sangue de um único murganho. A dose mais baixa de vacina (0,2 pg) induziu proteção em todos os murganhos do grupo. Duas horas após estímulo, as amostras de sangue foram analisadas para formação de cfu e anticorpos anti-CP5 por ELISA, utilizando um CP5 modificado por poli-L-lisina para revestimento (Gray et al. (1979)). Em todos os grupos imunizados com CP5-EPA, foi observada uma redução média de cfu no sangue. Contudo, apenas no grupo que recebeu a dose mais baixa de vacina existiu uma proteção geral da bacteriemia em todos os cinco murganhos. A análise de sangue para anticorpos anti-CP5 resultou numa correlação positiva de proteção e títulos médios de ELISA nos diferentes grupos de murganho. Os resultados apresentados na FIG. 18 indicam que os anticorpos induziram a proteção da bacteriemia em murganhos imunizados.
Estes estudos indicam que a vacina de bioconjugado de CP5-EPA induziu anticorpos que opsonizaram S. aureus para neutralização fagocítica pelas PMN humanas e protegeram murganhos contra bacteriemia em estudos de imunização positiva e ativa. Estes dados proporcionam forte evidência de que o bioconjugado apresentado irá proteger contra as doenças provocadas por múltiplas estirpes de S. aureus.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> GLYCOVAXYN AG
<12 0> VACINAS DE BIOCONJUGADO DE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS CAPSULARES
<130> P51971WO <140> <141> <150> 61/332,170 <151> 2010-05-06 <160> 27 <170> Patentln version 3.5 <210> 1
<211> 13369 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Sintético" <4 Ο 0> 1 aattcacatg ttgcccatcc acgaaaccac cttatcgccg tggaacgcac ctggatcgac 60 agccccagca aagcagtcgc ttcctggtcc ggcaccggaa acatcgtacg gagaaaacaa 120 aaaaggccgc taggcggcct tttccggaga acgatgactc agggttctcg ccgcctctgg 180 cgatagatcc agtcgacgat ttcaccgtca ggcgcatagc cgctgacggt ttcccgcagc 240 aactggcgaa cccgcgagta gtcgtccttc tccacggcgg ccagcaactg ctccagcacg 300 accttgaagg cctcccagct caggtgttcc tcgttggccc gcatgatcat cggatggtcg 360 gtgggattca cgttgtcacc gatcagcagc tcttcgtaga gcttctcgcc aggacgcagg 420 ccactgaact cgatggcgat gtcaccatgg ggcgaacgct cggaacgcac gctcaggccg 480 gacaggtgga tcatcttctc ggcgagctcc aggatcttca ccggcggccc catgtccagc 540 acgaatacat ctccgccctg ccccatcgaa ccggcctgga tgaccaactg cgccgcctcg 600 ggaatggtca tgaagtaacg ggtgatgctc gggtgggtga ccgtcaccgg gccgccgcgc 660 ttgatctgct cgcggaacag cggaatgacc gaaccggacg aaccgaggac gttgccgaag 720 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ttcagctccg ctcgaacata ctcaaecccc gtaacgggat tgtacaggga 4140 tcgtacttgt ccgacaacct gaaagggggc ggcagcaagc gacctgcaaa gcgcactccc 4200 gacaaaaccg ctagccccgg ttaccagcac cttcatcata ttttcgactc agacagaagc 4260 ggtcgaacac aggcagcgaa tttttccaat gaaatatatt cagaataatt ttgctgaagg 4320 acactccgcg ggactccgcc taaactagac aagtcgagtt cacaaatctc atcgatcaat 4380 cttgccaaag caaccggatc attcggcgga oagttccaao cgattccggt ctcatctatt 4440 atacgggaga tttcagcocc tttttocatg acagctagaa tcggtttgtc tgctgccatg 4500 gagaaatatg ccttgctggg aaccccaagc ccgaacattc cttcttctaa gcptaactaag 4560 gcaacgtcac aggcagccaa accaaaattc ttttcggeta atggcagoct tccaaaatac 4620 ctcaaccgag cacactgatc ttccagcgcg tgttttttta cactgtcgac caaggcacca 4680 tctccaataa aagcaaaagc cgccttctog tttttaacca actgaatagc agaaagtatg 4740 ttttctatac cttgtaatcg accgacatta ccaaaaaatt ggaaaaccct tttacctttc 4800 cattcaggaa tattgataaa aggagcatcc tctctcggta ctgggaaaac ctctttctca 4860 caggcccaat tcgaaataaa gaccaaagat cgcgggtcat tcacottctc tttcataaga 4920 gcttccatat 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ccttcgccta ctgaacaagc gtaggtatcc ggattttccc gatcaaatac 6660 ttcgttagcc cacaacatga ctaccatatc gtcagttccg acattagtaa tgtcatgagt 6720 ccatccaggfc actgtttcga caatttctgc cttttcacca ttagtgcaaa tttcgtaaaa 6780 tgccccggtc aggatgtttc taaacttgaa acgtgccatc cctttgataa ccagaaactt 6840 fcfccggfcfcttc gagtgatggt aatgcccgcc cctggtaaca cctggatgag cogtaaaaaa 6900 cgagaactgg ccagagtccg cggtcttcag catctcgacg aatgtgccac gcggatccga 6960 atgcattggc acgtcgtaac taaaactafcc ttctggcaag aaacttagat aagtcgagta 7020 caaggcgcgc gfccaatcccg agccaacccfc tgcggtagtc agtgactttc gactattaeg 7080 aaactcatac aattgttctg cgagctcacc aacagaaatc tgafcactggg gctcgacctg 7140 tagtgaaact gcattggata gcttcccatc catgactttc atgaaggtgc gaaccacatc 7200 atctatgtat acaagagtga tctctgccga ggaattgtta atttgaatcg gaatatctcg 7260 aataatatta tgacaaaaag tcgcaaccgc tgaattataa ttcggacgcg accatttacc 7320 gaatacatta ggaaggcgaa atatgtagac aggacaacca atatcctcac ctagcacttg 7380 gagatgctct tctgcggctc gcttgcttaa accgtactca ttatccacct cagcctgaat 7440 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<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Sintético" <400> 4 aattccctga ggcaattctt ctttgatgac ggctgatggt gaggttgacc tggtgaagct 60 ggtcaaggag ctttgggtta acaaggttct gattcttctg actactcttc ttgcattaat 120 egggtctttt acctatgcgt atctgagfcaa gcctgtatat gaatataggg ttgcagfcagt 180 gcctcctgct cttgggtcta tcgaaggttt caatgttggt agaagggaga atggcctaga 240 tgcatatact gttagaagta fcctatgcgat ctfttcgcgc aatctgcttt cggatgagaa 300 taaaaaagag ttcttctata agatatacct tccccaggfcg ggtgagggag cggaaagcga 360 agatgagcag gaggagtttt ataagaagtt cfccaaagag gtaaagattg atcctgctaa 420 caagccagat gcagaccgtt atacggtaat tgtggagggc acgaagcgag aggttcttgc 480 tacatgggca caagctttcg tgcgtttggc tgcggatcçrg gccgtgcatg aggttattga 540 tagtgcaggt agagatttcc aggtaagaaa tgctgcaatg cagagccgca taaccgtgct 600 gcagaatatg gcgaagggcc gccgtgatga tagaattgca cgtttgaagg aggcattgct 660 gattgcggag tcgctcaaga tagatggccc gccattaata gaaggggcgt ccgagcaaca 720 actctcctcg 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<210> 13 <211> 643 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 13
Met Lys Lys lie Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 15 10 15
Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys 20 25 30
Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser 35 40 45
Val Asp Pro Ala lie Ala Asp Thr Asn Gly Gin Gly Val Leu His Tyr 50 55 60
Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala lie Asp 65 70 75 80
Asn Ala Leu Ser lie Thr Ser Asp Gly Leu Thr lie Arg Leu Glu Gly 85 90 95
Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gin Ala 100 105 110
Arg Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro lie Gly His Glu Lys 115 120 125
Pro Ser Asn lie Lys Val Phe lie His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gin 130 135 140
Leu Ser His Met Ser Pro lie Tyr Thr lie Glu Met Gly Asp Glu Leu 145 150 155 160
Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu 165 170 175
Ser Asn Glu Met Gin Pro Thr Leu Ala lie Ser His Ala Gly Val Ser 180 185 190
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<210> 18 <211> 19616 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Sintético" <4 Ο 0> 18 gaattccctg aggcaattct tctttgatga cggctgatgg tgaggttgac ctggtgaagc 60 tggtcaagga gctttgggtt aacaaggttc tgattcttct gactactctt cttgcattaa 120 tcgggtcttt tacctatgcg tatctgagta agcctgtata tgaatatagg gttgcagtag 180 tgcctcctgc tcttgggtct atcgaaggtt tcaatgttgg tagaagggag aatggcctag 240 atgcatatac tgttagaagt atctatgcga tcttttcgcg caatctgctt tcggatgaga 300 ataaaaaaga gttcttctat aagatatacc ttccccaggt gggtgaggga gcggaaagcg 360 aagatgagca ggaggagttt tataagaagt tctccaaaga ggtaaagatt gatcctgcta 420 acaagccaga tgcagaccgt tatacggtaa ttgtggaggg cacgaagcga gaggttcttg 480 ctacatgggc acaagctttc gtgcgtttgg ctgcggatcg ggccgtgcat gaggttattg 540 atagtgcagg tagagatttc caggtaagaa atgctgcaat gcagagccgc ataaccgtgc 600 tgcagaatat ggcgaagggc cgccgtgafcg atagaattgc acgtttgaag gaggcattgc 660 tgattgcgga gtcgctcaag atagatggcc cgccattaat agaaggggcg tccgagcaac 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atagagaaga ttatgtggta acttggtggg attatggtta tcctgtgcgt tattatagcg 18840 atgtgaaaac tttagtagat ggtggaaagc atttaggtaa ggataatttt ttcccttctt 18900 ttgctttaag caaagatgaa caagctgcag ctaatatggc aagacttagt gtagaatata 18960 cagaaaaaag cttttatgct ccgcaaaatg atattttaaa aacagacatt ttgcaagcca 19020 tgatgaaaga ttataatcaa agcaatgtgg atttgtttct agcttcatta tcaaaacctg 19080 attttaaaat cgatacgcca aaaactcgtg atatttatct ttatatgccc gctagaatgt 19140 ctttgatttt ttctacggtg gctagttttt cttttattaa tttagataca ggagttttgg 19200 ataaaccttt tacctttagc acagcttatc cacttgatgt taaaaatgga gaaatttatc 19260 ttagcaacgg agtggtttta agcgatgatt ttagaagttt taaaataggt gataatgtgg 19320 tttctgtaaa tagtatcgta gagattaatt ctattaaaca aggtgaatac aaaatcactc 19380 caattgatga taaggctcag ttttatattt tttatttaaa ggatagtgct attccttacg 19440 cacaatttat tttaatggat aaaaccatgt ttaatagtgc ttatgtgcaa atgttttttt 19500 taggaaatta tgataagaat ttatttgact tggtgattaa ttctagagat gctaaggttt 19560 ttaaacttaa aatttaccca tacgatgttc cagattacgc ttaaacatgt gaattc 19616
<210> 19 <211> 20597 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Sintético" <4 0 0> 19 gaattccctg aggcaattct tctttgatga cggctgatgg tgaggttg&amp;c ctggtgaagc 60 tggtcaagga gctttgggtt aacaaggttc tgattctfect gactactctt cttgcattaa 120 tcgggtcttt tacctatgcg tatctgagta agcctgtata tgaatatagg gttgcagtag 180 tgcctcctgc tcttgggtct atcgaaggtt tcaatgttgg tagaagggag aatggcctag 240 atgcatatac tgttagaagt atctatgcga tcttttcgcg caatctgctt tcggatgaga 300 ataaaaaaga gttcttctat aagatatacc ttccccaggt gggtgaggga gcggaaagcg 360 aagatgagca ggaggagttt tataagaagt tctccaaaga ggtaaagatt gatcctgcta 420 acaagccaga tgcagaccgt tatacggtaa ttgtggaggg cacgaagcga gaggttcttg 480 ctaoatgggo acaagctttc gtgcgtttgg ctgcggatcg ggcegtgcat gaggttattg 540 atagtgcagg tagagatttc caggtaagaa atgctgcaat gcagagccgc ataaccgtgc 600 tgcagaatat ggcgaagggc cgccgtgatg atagaattgc acgtttgaag gaggcattgc 660 tgattgcgga gtcgctcaag atagatggco cgccattaat agaaggggcg tccgagcaac 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tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 3300 accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 3360 gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 3420 tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca 3480 agcgacgccc aaectgccat cacgagattt cgattecacc gccgccttct atgaaaggtt 3540 gggcttcgga atcgtttfccc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat 3600 gctggagttc ttcgcccacc ccagcttcaa aagcgctctg aagttcctat actttctaga 3660 gaataggaac ttcggaatag gaactaagga ggatattcat atggtttttt taaggcagtt 3720 attggtgccc ttaaacgcct ggtgctacgc ctgaataagt gataataagc ggatgaatgg 3780 cagaaattcg aaagcaaatt cgacccggtc gfccggfctcag ggcagggtcg ttaaatagcc 3840 gcttatgtct attgctggtt taccggttta tfcgactaecg gaagcagtgt gaccgtgtgc 3900 ttctcaaatg cctgaggcca gtttgctcag gctctcccGg tggaggtaat aattgacgat 3960 atgatcattt attctgcctc ccagagcctg ataaaaacgg ttagcgcttc gttaatacag 4020 atgtaggtgfc tccacagggt agccagcagc atectgcgat gcagatccgg aacataatgg 4080 tgcagggcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg 4140 gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcafca agtgcggcga 4200 cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctaccgga cagcggtgcg gactgttgta 4260 actcagaata agaaatgagg ccgctcatgg cgttgactct cagtcatagt atcgtggtat 4320 caccggttgg ttccactctc tgttgcgggc aacttcagca gcacgtaggg gacttccgcg 4380 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 4440 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgtfcc gctcgcgtat. cggfcgattca ttctgctaac 4500 cagtaaggca accccgccag cctagecggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 4560 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tgcgccgcgt gcggctgctg gagatggcgg 4620 acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg tttgcgcatt cacagttctc cgcaagaatt 4680 gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca 4740 gçrtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag 4800 ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgfct ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc 4860 cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt taggctggta agagccgcga gcgatccttg 4920 aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg cctggacagc atggcctgca acgcgggcat 4980 cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat aatggggaag gccatccagc ctcgcgtcgc 5040 gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc ggccaattcg cgctaactta cattaattgc 5100 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 5160 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca 5220 ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca 5280 agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttgacggcg 5340 ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa 5400 cgcgcagcec ggacteggta atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa 5460 ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg 5520 acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat 5580 atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca 5640 gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt 5700 catgggagaa aataatactg ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg 5760 gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa 5820 tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga 5880 cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca cgctggcacc cagttgateg gcgcgagatt 5940 taatcgccge gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa 6000 tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct 6060 ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca 6120 ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta 6180 ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc 6240 gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa cgtaaatgca fcgccgcttcg ccttcgcgcg 6300 cgaattggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg 6360 accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc 6420 gatcafccgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgocgaaa atgacccaga gcgctgccgg 6480 cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgeggcga cgatagtcat 6540 gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggcggagc 6600 ttatcgacfcg cacggtgcac caatgcttct ggcgfccaggc agccatcgga agctgtggta 6660 tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct 6720 ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga aatgagctgt 6780 tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 6840 aggaaacaga attcgagctc atgaaaaaga tttggctggc cctggcagga ctggttctgg 6900 ccttttcagc aagtgcagct gaagaagcct ttgatctgtg gaatgagtgt gcaaaagcat 6960 gtgtactgga tctgaaagat ggtgtgagat ccagcagaat gtcagtggat ccagccattg 7020 cagatacaaa tggccagggt gtactgcatt actctatggt tctggaaggt ggtaatgatg 7080 ccctgaaact ggccattgat aatgcactgt ctatcaccag tgatggtctg acaatcagac 7140 tggagggagg ggtggaaccc aataagcctg tcagatacag ctatacaaga caagccagag 7200 gttcttggag cctgaactgg ctggtgccta ttgggcatga aaaaccatct aacattaaag 7260 tttttattca tgaactgaat gcaggeaatc agctgtctca tatgagccca atttatacca 7320 ttgaaatggg ggatgaactg ctggctaaac tggccagaga tgctacattc tttgtcagag 7380 cccatgaatc aaatgagatg cagcctaccc tggccattag ccatgctggt gtgagtgttg 7440 tcatggcaca aactcagccc aggagagaga aaaggtggtc tgagtggacc agtggcaaag 7500 tgctgtgcct gctggatcct ctggatggtg tttataacta tctggcccaa cagaggtgta 7560 acctggatga tacctgggaa ggtaaaatct atagagtgct ggcaggtaat ccagcaaaac 7620 atgacctgga tatcaaggat aataaeaata gcacccctac tgtaatcagc catagactgc 7680 atttcccaga gggaggttca ctggctgccc tgactgctca tcaggcctgt catotgccac 7740 tggaaacttt caccagacac aggcagccaa gaggctggga acagctggaa eaatgtggct 7800 atccagttca gaggctggtt gccctgtaco tggcagcaag actgagctgg aatcaggtag 7860 atcaggttat tagaaatgoa ctggccagcc cagggagtgg gggtgacctg ggtgaggcaa 7920 ttagagaaca gcctgagcag gccagactgg ccctgactct ggcagcagct gaaagtgaaa 7980 gafcttgtgag acaggggaca ggcaatgatg aagcaggtgc agcfcaatgca gatgttgttt 8040 cactgacttg fccctgtfcgct aaagatcaga acaggaccaa aggtgaatgt gctggaccag 8100 ctgattcagg agatgcactg ctggagagga actatccaac tggtgcagaa ttcctgggag 8160 atggtggtga tgtttctttt agcaccagag gcacacagaa ctggactgtg gaaagactgc 8220 tgcaggcaca tagacagctg gaagaaagag gctatgtatt tgttggctac catggtactt 8280 tcctggaagc agcacagtcc attgtctttg gaggggttag agccagaagc oaggatctgg 8340 atgctatttg gagaggtttt tatattgcfcg gggatccagc cctggcctat ggatatgcac 8400 aagatcagga acctgatgcc agaggcagaa tcagaaatgg tgccctgctg agggtttatg 8460 ttcctaggtc tagcctgcca ggattttata gaacctctct gaccctggca gcccctgaag 8520 cagcaggrtga ggtggagaga ctgattggtc atcctctgcc actgagactg gatgccatta 8580 cagggccaga agaagaaggt ggcagagtga caattctggg ttggcccctg gcagagagga 8640 cagtagttat tccttcagca atccctacag atccaaggaa tgtgggtggg gacctggatc 8700 catcctcaat tccagataag gaacaggcaa tttcagcect gcctgattat gctagtcagc 8760 caggtaaacc acctagagaa gatctgaaac accaccacca ccaccactga tctag 8815 <210> 21 <211> 99
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Sintético" <400> 21 gaattcatga gagtagaaaa taataatgtt tctgggcaaa accatgaccc ggaacagatt 60 gatttgattg atttactagt gcagttgtgg cgtggcaaga tgacaatcat catttccgtc 120 attgtggcta ttgccctagc tattggatat ttggcagtag cgaaggagaa atggacgtca 180 acagcaatta tcactcagcc cgatgtgggg caaattgctg gctataacaa tgccatgaat 240 gttatctatg gtcaggctgc accgaaagta tcggatttgc aggagacgtt aattggtcgc 300 ttcagttctg ccttctctgc attagcagaa acgctggata atcaggaaga accagaaaaa 360 cttaccatcg aaccttctgt taagaaccag caattaccat tgactgtttc ttatgttggg 420 caaactgcag agggcgcaca aatgaagttg gcccaataca ttcagcaagt tgacgataaa 480 gtgaatcaag agttagaaaa ggatctcaag gacaacattg ctctgggacg gaaaaacttg 540 caggactctt taagaacgca ggaagtggtt gcgcaggagc agaaagatct gcgtatccgt 600 cagattcagg aagcgttgca gtatgcgaat caggcgcagg tgacaaaacc gcagattcaa 660 cagactggcg aagatatcac acaagatacg ttgttccttt tggggagcga agcgctggag 720 tcgatgatta agcatgaggc gacccgtccg ttggtgttct caccaaacta ctatcagact 780 cgtcaaaacc tgcttgatat cgaaagctta aaggttgatg atcttgatat tcatgcttac 840 cgctatgtaa tgaaaccgac gttacctatt cgtcgtgata gcccgaaaaa ggcaattacc 900 ttgattctgg cggtgctgct gggtggcatg gttggcgcgg ggattgtgct ggggcgtaat 960 gctctacgca attacaacgc gaagtaagtc gac 993
<210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <400> 22
Asp Asn Asn Asn Ser Thr Pro Thr Val lie Ser His Arg 15 10
<210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <400> 23
Asp Gin Asn Arg 1 <210> 24
<211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Sequência consenso sintética" <22 0> <221> VARIANTE <222> (1) .. (1) <223> /substituir="Glu" <22 0> <221> VARIANTE <222> (2) .. (2) <223> /substituir="Arg" ou "Asn" ou "Asp" ou "Cys" ou "Gin" ou "Glu" ou "Gly" ou "His" ou "lie" ou "Leu" ou "Lys" ou "Met" ou "Phe" ou "Ser" ou "Thr" ou "Trp" ou "Tyr" ou "Val" <22 0> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (1) . . (2) <223> /nota=" Os residuos dados na sequência não têm preferência em relação àqueles nas anotações para as referidas posições " <22 0> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> /substituir="Arg" ou "Asn" ou "Asp" ou "Cys" ou "Gin" ou "Glu" ou "Gly" ou "His" ou "He" ou "Leu" ou "Lys" ou "Met" ou "Phe" ou "Ser" ou "Thr" ou "Trp" ou "Tyr" ou "Val" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Thr" <22 0> <221> MISC_CARACTERISTICAE <222> (4) .. (5) <223> /nota="Os resíduos dados na sequência não têm preferência em relação àqueles nas anotações para as referidas posições" <22 0> <221> MISC_CARACTERISTICAE <222> (1) .. (5) <223> /nota="Ver descrição como apresentada para a descrição detalhada de substituições e formas de realização preferidas" <400> 24
Asp Ala Asn Ala Ser 1 5 <210> 25 <211> 5
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <400> 25
Asp Asn Asn Asn Ser 1 5
<210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <400> 26
Asp Gin Asn Arg Thr 1 5
<210> 27 <211> 2160 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Sintético" <400> 27 gaattcatgt tgaaaaaaga gtatttaaaa aacccttatt tagttttgtt tgcgatgatt 60 atattagctt atgtttttag tgtattttgc aggttttatt gggtttggtg ggcaagtgag 120 tttaatgagt attttttcaa taatcagtta atgatcattt caaatgatgg ctatgctttt 180 gctgagggcg caagagatat gatagcaggt tttcatcagc ctaatgattt gagttattat 240 ggatcttctt tatccgcgct tacttattgg ctttataaaa tcacaccttt ttcttttgaa 300 agtatcattt tatatatgag tactttttta tcttctttgg tggtgattcc tactattttg 360 ctagctaacg aatacaaacg tcctttaatg ggctttgtag ctgctctttt agcaagtata 420 gcaaacagtt attataatcg cactatgagt gggtattatg atacggatat gctggtaatt 480 gttttgccta tgtttatttt attttttatg gtaagaatga ttttaaaaaa agactttttt 540 teattgattg ccttgccgtt atttatagga atttatcttt ggtggtatcc ttcaagttat 600 actttaaatg tagctttaat tggacttttt ttaatttata cacttatttt tcatagaaaa 660 gaaaagattt tttatatagc tgtgattttg tcttctctta ctctttcaaa tatagcatgg 720 ttttatcaaa gtgccattat agtaatactt tttgctttat tcgccttaga gcaaaaacgc 780 ttaaatttta tgafctatagg aattttaggfc agtgcaactt tgatattttt gattttaagt 840 çfgtggggttg atcctatact ttatcagctt aaattttata tttttagaag tgatgaaagt 900 gcgaatttaa cgcagggctt tatgtatttt aatgtcaatc aaaccataca agaagttgaa 960 aatgtagate ttagcgaatt tatgcgaaga attagtggta gtgaaattgt ttttttgttt 1020 tctttgtttg gtttfcgtatg gcttttgaga aaacataaaa gtatgattat ggctttacct 1080 atattggtgc ttgggttttt agccttaaaa ggggggctta gatttaccat ttattctgta 1140 cctgtaatgg octtaggatt tggtttttta ttgagcgagt ttaaggctat aatggttaaa 1200 aaatatagcc aattaacttc aaatgtttgt attgtttttg caactatttt gactttagct 1260 ccagtattta tccatattta caactataaa gcgccaacag ttttttctca aaatgaagca 1320 tcattattaa atcaattaaa aaatatagcc aatagagaag attatgtggt aacttgggcg 1380 getfcafcggfct afcectgfcgcg fcfcatsiafeagc gafcgfcgaaaa ctttagfeaga fcggtggaaag 1440 cattefcaggfca aggat-aafcfet ttt-cccfefeot fcttgcfcfefcaa gcaaagatga aeaagcfcgca 1500 gct&amp;afcafcgg oaagacttag tig5agaai.at Maga&amp;aaaa gcfcfcfefcatge tccgcaaaate 1560 gatatttteaa aaacagacat fcfctgcaagec algatgaaag attataafcca aagcaatgtg 1620 gafctfcgfctic tagettestt atcaaaacot gattttaaaa togatacgec aaaaactcgfc 1680 gafcatttate tlfcafcatgcc cgetagaafcg tcfcttgattt tfcfcefcacggt ggctagtttt 1740 icfctfctatfca atfctagatac sggagfcfcfcfcg gafeaaaectt tfcaecfefetag cacagctfcat 1800 ceaettgatg ttaaaaafcgg agaaatttat cttageaacg gagtggtfett aagcgatgat I860 fcfct-agaagt-t ttaaaatagg fcgataatgtg gtttctgfcaa atagtat-cgt agagattaat 1920 tctatfcaaac aaggtgaatta caaaatcacfc ccaafctgafcg ataaggctca gttttatatt 1980 fcfcttafcttaa aggatagtgc tatfeccttac gcacaafetfca tfettaatgga taaaaccatg 2040 fefctaatagtg ctfcatgtgca aafcgfcttfctt ttaggaaatfc atgataagaa tttatfctgac 2100 itggfcgatfca attctagaga fcgctaaggtt tttaaactfea aaatttaccc afcacgafcgtt 2X60

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Organismo procariótico hospedeiro Gram-negativo, em que o referido organismo procariótico hospedeiro é E. coli, compreendendo: (i) uma sequência nucleotidica que codifica, pelo menos, uma glicosiltransferase de uma bactéria Gram-positiva, em que a referida bactéria Gram-positiva é Staphylococcus aureus; (ii) uma sequência nucleotidica que codifica, pelo menos, uma glicosiltransferase de uma bactéria Gram-negativa, em que a referida bactéria Gram-negativa é Pseudomonas aeruginosa; (iii) uma sequência nucleotidica que codifica uma proteína transportadora, em que a referida proteína transportadora compreende a sequência consenso de aminoácidos D/E-X-N-Z-S/T, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; e (iv) uma sequência nucleotidica que codifica uma oligossacariltransferase.
  2. 2. Organismo procariótico hospedeiro da reivindicação 1, em que o referido Staphylococcus aureus é uma estirpe de polissacárido capsular 5 ou uma estirpe de polissacárido capsular 8.
  3. 3. Organismo procariótico hospedeiro da reivindicação 1 ou 2, em que o referido Staphylococus aureus é uma estirpe resistente à meticilina.
  4. 4. Organismo procariótico hospedeiro de qualquer uma das reivindicações 1-3, compreendendo, pelo menos, duas glicosiltransferases de diferentes estirpes de bactérias Gram-positivas.
  5. 5. Organismo procariótico hospedeiro de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a referida proteína transportadora é a Exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, a hemolisina alfa de Staphylococcus aureus ou o fator de aglutinação A de Staphylococcus aureus.
  6. 6. Organismo procariótico hospedeiro de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a referida oligossacariltransferase é de Campylobacter jejuni.
  7. 7. Método de produção de uma proteína ΛΓ-glicosilada recombinante utilizando o organismo procariótico hospedeiro de qualquer uma das reivindicações 1-6.
  8. 8. Vacina de Staphylococcus aureus compreendendo: uma proteína compreendendo uma sequência consenso D/E-X-N-Z-S/T inserida, em que X e Z podem ser qualquer aminoácido natural, exceto prolina; pelo menos, um polissacárido de Staphylococcus aureus ligado à referida sequência consenso por ligação Aí-glicosídica; e, opcionalmente, um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
  9. 9. Vacina de Staphylococcus aureus da reivindicação 8, compreendendo um adjuvante.
  10. 10. Vacina de Staphylococcus aureus da reivindicação 9, em que o adjuvante contém sais de alumínio, emulsões, tais como óleo em água (MF59, AS03) , lípido e combinações de sais (AS04), ISCOMS, lipossomas/virossomas, nano e micropartículas, saponinas (QS21), MPL A, citocinas, derivados de ADN ou toxinas bacterianas.
  11. 11. Vacina de Staphylococcus aureus de qualquer uma das reivindicações 8-10, compreendendo duas ou mais das referidas sequências consenso inseridas e dois ou mais dos referidos polissacáridos de Staphylococcus aureus.
  12. 12. Vacina de Staphylococcus aureus de qualquer uma das reivindicações 8-11, em que o referido, pelo menos, um polissacárido de Staphylococcus aureus compreende o polissacárido 5 capsular ou o polissacárido 8 capsular.
  13. 13. Vacina de Staphylococcus aureus da reivindicação 12, em que a referida proteína é a Exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, ou a hemolisina alfa de Staphylococcus aureus ou o fator de aglutinação A de Staphylococcus aureus.
  14. 14. Vacina de Staphylococcus aureus da reivindicação 13, em que o referido, pelo menos, um polissacárido de Staphylococcus aureus compreende a estrutura: (A)
    ou (B)
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1481057B1 (en) * 2002-03-07 2006-02-15 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich System and method for the production of recombinant glycosylated proteins in a prokaryotic host
EP3427749A1 (en) 2008-02-20 2019-01-16 GlaxoSmithKline Biologicals SA Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
TR201803015T4 (tr) 2009-11-19 2018-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Prokaryotik hücrelerde immünojenik polisakaridler üreten biyosentetik sistem.
US9526775B2 (en) 2012-04-27 2016-12-27 Washington University Glycoengineered outer membrane vesicles and use thereof as vaccines
JP2015522692A (ja) 2012-07-16 2015-08-06 ファイザー・インク 糖およびその使用
BR112015001390B1 (pt) 2012-07-26 2024-04-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc Proteína de fusão, ácido nucleico isolado e uso de uma composição de vacina
TR201904022T4 (tr) 2012-10-12 2019-04-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Konakçı hücre modifikasyon yöntemleri.
EP2917351B1 (en) 2012-11-07 2018-12-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Production of recombinant vaccine in e. coli by enzymatic conjugation
US9931392B2 (en) 2013-01-18 2018-04-03 London School Of Hygiene And Tropical Medicine Glycosylation method
GB201301085D0 (en) 2013-01-22 2013-03-06 London School Hygiene & Tropical Medicine Glycoconjugate Vaccine
SG11201602546RA (en) * 2013-10-11 2016-04-28 Glycovaxyn Ag Methods of host cell modification
JP2016540764A (ja) * 2013-12-04 2016-12-28 グリコヴァキシン アーゲー 大腸菌で合成された糖タンパク質ワクチンによる黄色ブドウ球菌感染の予防
SI3131577T1 (sl) * 2014-04-17 2020-08-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Modificirane gostiljske celice in uporabe le-teh
US10307474B2 (en) * 2014-08-08 2019-06-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Modified host cells and hybrid oligosaccharides for use in bioconjugate production
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
AU2015342943B2 (en) * 2014-11-05 2018-06-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Synthetic antigen constructs against Campylobacter jejuni
US10500261B2 (en) 2014-11-05 2019-12-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Synthetic antigen constructs against campylobacter jejuni
PT3240895T (pt) 2014-12-30 2022-03-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composições e métodos para glicosilação de proteínas
WO2017001586A1 (en) * 2015-07-01 2017-01-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic compositions
GB201518668D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
GB201712678D0 (en) 2017-08-07 2017-09-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for the manipulation of nucleic acids
GB201721576D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hla antigens and glycoconjugates thereof
GB201721582D0 (en) * 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa S aureus antigens and immunogenic compositions
CN108330142B (zh) * 2018-02-09 2021-09-17 河北科技师范学院 一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素Hlych蛋白
GB201802339D0 (en) * 2018-02-13 2018-03-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN109400704B (zh) * 2018-11-14 2020-07-21 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用
US20220054632A1 (en) 2018-12-12 2022-02-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified carrier proteins for o-linked glycosylation
JP2022517981A (ja) * 2019-01-11 2022-03-11 ノースウェスタン ユニバーシティ 原核細胞溶解物におけるバイオコンジュゲートワクチンの合成
EP3757217A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for protein purification
EP3770269A1 (en) 2019-07-23 2021-01-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Quantification of bioconjugate glycosylation
EP3777884A1 (en) 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CN112575041B (zh) * 2019-09-30 2022-12-13 江南大学 一种混合碳源高效发酵生产phb的工程菌及其应用
CA3185642A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified exotoxin a proteins
CN114085255B (zh) * 2020-08-24 2023-08-29 山东大学 一种苏黎世克罗诺杆菌5型脂多糖o-抗原寡糖片段及其制备方法与应用
WO2022171679A2 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Protein
WO2023118033A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1900A (en) 1840-12-14 Machine for extracting stumps
ATE67786T1 (de) 1984-08-01 1991-10-15 Boehringer Ingelheim Int Neue genetische sequenzen, die durch sie codierten interferon-peptide vom typ i und diese sie produzierende organismen.
US5643758A (en) 1987-03-10 1997-07-01 New England Biolabs, Inc. Production and purification of a protein fused to a binding protein
WO1994026906A2 (en) 1993-05-14 1994-11-24 The Upjohn Company CLONED DNA ENCODING A UDP-GALNAc:POLYPEPTIDE,N-ACETYLGALACTOS AMINYLTRANSFERASE
US6503744B1 (en) 1999-02-01 2003-01-07 National Research Council Of Canada Campylobacter glycosyltransferases for biosynthesis of gangliosides and ganglioside mimics
CA2363297C (en) 1999-03-02 2011-08-09 Michael J. Betenbaugh Engineering intracellular sialylation pathways
US20020019342A1 (en) 2000-05-12 2002-02-14 Robert Bayer In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
CA2411968C (en) 2000-06-30 2009-12-15 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology (Vib) Protein glycosylation modification in pichia pastoris
EP1481057B1 (en) 2002-03-07 2006-02-15 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich System and method for the production of recombinant glycosylated proteins in a prokaryotic host
US20040265954A1 (en) 2002-03-07 2004-12-30 Markus Aebi System and method for the production of recombinant proteins
US7598354B2 (en) 2002-08-01 2009-10-06 National Research Council Of Canada Campylobacter glycans and glycopeptides
EP1756149B1 (en) 2004-05-24 2013-09-04 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Live, oral vaccine for protection against shigella dysenteriae serotype 1
EP1888761B1 (en) 2005-05-11 2010-09-29 ETH Zurich Recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
EP2476433A1 (en) 2006-03-30 2012-07-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
US20100286067A1 (en) * 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
EP3427749A1 (en) * 2008-02-20 2019-01-16 GlaxoSmithKline Biologicals SA Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells

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