CN109400704B - 一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学及免疫学领域，具体公开了一种抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素的抗体及其应用。所述抗体的重链可变区和轻链可变区的CDR区包括如SEQ ID NO.1‑3所示的氨基酸序列(或具有同等功能的功能性活性CDR变体)和如SEQ ID NO.4‑6所示的氨基酸序列(或具有同等功能的功能性活性CDR变体)。基于此研究成果，本发明还提供了编码所述抗体的核酸分子以及所述抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌α‑溶血素的产品和制备金黄色葡萄球菌疫苗等方面的应用。同时，基于该抗体所得到的可治疗或辅助治疗抗金黄色葡萄球菌感染的产品，也为寻找新颖、高效低毒的抗MRSA药物成为近年来治疗MRSA研究领域的重要方向。

Description

一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及医学及免疫学领域，具体地说，涉及一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体。
背景技术
人类病原体来源多为革兰氏阳性菌，而其中重要成员则是金黄色葡萄球菌，人类中金黄色葡萄球菌的长期携带者约有20％。其引起的感染以急性、化脓性为特征，可导致皮肤、黏膜、深部组织感染以及心内膜炎、肺炎、脓毒症、骨髓炎、脑膜炎、烫伤样皮肤综合征、中毒休克综合征等多种疾病，严重感染及并发症的感染病死率高达20％。同时，金黄色葡萄球菌在自然界中广泛分布、抵抗力强，是引起细菌性食物中毒的重要病原菌。
金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制。随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出。典型耐药菌代表即被称作“超级病菌”——耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，目前MRSA感染已超过艾滋病、结核和病毒性肝炎成为患者首位致死原因，严重威胁公共卫生安全，目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的院內感染病原菌之一。
虽然FDA已批准多款新药用于MRSA的治疗，但已在临床使用多年的万古霉素仍然是治疗MRSA感染的一线药物。但是，近年来越来越多耐万古霉素MRSA病例被报道。因此，寻找新颖、高效低毒的抗MRSA药物成为近年来治疗MRSA研究领域的重要方向。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区：
所述重链可变区包括：(1)CDR1区中如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或具有同等功能的功能性活性CDR变体，(2)CDR2区中如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或具有同等功能的功能性活性CDR变体，(3)CDR3区中如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或具有同等功能的功能性活性CDR变体；
和/或，
所述轻链可变区包括：(1)CDR1区中如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或具有同等功能的功能性活性CDR变体，(2)CDR2区中如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列或具有同等功能的功能性活性CDR变体，(3)CDR3区中如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列或具有同等功能的功能性活性CDR变体。
作为优选，所述抗体包含三个CDR的重链可变区和三个CDR的轻链可变区。其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，所述轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、5、6所示。
所述具有同等功能的功能性活性CDR变体指保留了原氨基酸序列的生物学特性，同样能够特异性结合金黄色葡萄球菌的α-溶血素的相应片段的CDR变体。
所述功能性活性CDR变体包括在亲代CDR序列中的至少一个氨基酸被修饰的氨基酸序列，并包括与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性，优选具有至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列，或者由与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性，优选具有至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列组成。
所述修饰可以是氨基酸序列的化学变化或部分更改，所述修饰使变体保留未修饰序列的生物学特性所述部分更改可以是删除或替换一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或加入或***一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过化学衍生一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或它们的组合。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，以一个疏水氨基酸替换一个替代疏水氨基酸。
本文使用的术语“变体”指的是通过***、删除或替换一个或多个氨基酸，或通过化学衍生化氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列中的核苷酸，或序列的一个或两个远端来修饰这一序列所得到的序列，还包括天然等位突变，其中，修饰不会影响(特别是不会损失)这一序列的活性。
本发明中，术语“CDR区”意指抗体的互补决定区，即决定抗体对特定抗原的特异性的区域。轻链和重链两者上的三个CDR区(CDR1至CDR3)负责抗原结合。
重链的CDR区位置如下：
VH外显子内的CDR1区氨基酸26至33，
VH外显子内的CDR2区氨基酸51至58，
VH外显子内的CDR3区氨基酸97至107。
轻链的CDR区位置如下：
Vλ外显子内的CDR1区氨基酸26至33，
Vλ外显子内的CDR2区氨基酸51至54，
Vλ外显子内的CDR3区氨基酸90至100。
可以用V Base数据库(http：//imgt.cines.fr/)分析获得抗体基因家族、突变率、亚型及CDR区。
更进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO.7所示的序列，或具有与SEQ ID NO.7所示序列至少70％相同的序列，和/或，所述轻链可变区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO.8所示的序列，或具有与SEQ ID NO.8所示序列至少70％相同的序列。
进一步地，所述抗体能够特异性结合金黄色葡萄球菌的α-溶血素，所述金黄色葡萄球菌的α-溶血素包含全长或其中的部分片段或部分氨基酸的序列。
作为优选，所述全长氨基酸序列包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；作为优选，所述部分片段包括但不限于：SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
本发明经过实验研究发现，本发明所述抗体可与金黄色葡萄球菌的α-溶血素的上述部分片段发生特异性结合。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体以不高于1*10-5M，例如1*10-6M、1*10-7M、1*10-8M、1*10-9M或1*10-10M或更小的KD与金黄色葡萄球菌α-溶血素解离。其中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，表示处于平衡状态时抗体和抗原的解离程度。KD越小说明解离越小，代表抗体与抗原间的亲和力越强。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体TRN1016)以不高于10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的平衡解离常数(KD)与抗原(例如，金黄色葡萄球菌α-溶血素)解离，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
特别地，本发明所提供的抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体，为人源抗体或人抗体和单结构域抗体。
本文使用的术语“抗体”是全长抗体或其抗体片段，其中所述抗体片段包括至少一个带有前述结合位点的抗体区。优选地，抗体选自人源化或人抗体和单结构域抗体，如VH、VHH或VL，和/或包含或由VL/VH区域对和抗体恒定域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体，如IgG型(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)抗体、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
术语“全长抗体”能用于指代任意抗体分子，其包含至少大多数Fc域和其他在天然抗体单体中普遍找到的区域。
优选地，本发明的单克隆抗体的轻链可以是κ型或λ型的。
在一个优选的实施例中，轻链是λ型的。轻链可以是天然存在的链，包括天然重排的、经遗传修饰的或合成的轻链类型。
本发明的单克隆抗体的重链可以选自：同种型IgM、IgA、或IgG，优选地IgG。
在一个优选的实施例中，单克隆抗体的重链是IgG型的。
第二方面，本发明基于前述研究成果，还提供了编码所述抗体的核酸分子。所述核酸分子的核苷酸序列依据前述抗体分子的具体氨基酸序列而定，所述核苷酸序列与氨基酸序列的对应关系属于本领域的公知常识。在所述抗体氨基酸序列或其特征确定的情况下，本领域技术人员能够根据该氨基酸序列获得相应的、合适且合理的核苷酸序列。
编码所述抗体的核酸分子可以是自种系或自B细胞中发生的重排衍生的天然存在的核酸，或者，核酸可以是合成的。合成的核酸还包括具有经修饰的核苷间键，包括硫代磷酸酯以提高核酸免于降解的抗性的核酸。核酸可以遗传工程化改造或者通过核苷酸合成完全合成生成。
在一个优选的实施例中，本发明提供了包含至少一种编码本发明单克隆抗体的轻链的核酸和/或至少一种编码本发明单克隆抗体的重链的核酸的载体。核酸可以存在于同一载体中或者可以以二元载体的形式存在。优选地，载体包含与核酸可操作连接的启动子以便于编码轻链和/或重链的核酸的表达。优选地，载体还包含用于在宿主细胞中复制和维持的起点。载体还可以包含位于编码轻链或重链的核酸的5’的编码信号序列的核苷酸序列。信号序列可以便于编码的肽链分泌入培养基中。
因此，应当理解的是，含有上述核酸分子的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌等也属于本发明的保护范围。
在本领域中，已知许多原核和真核表达***，其中真核宿主细胞诸如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。优选地，哺乳动物细胞自HEK293细胞、PerC6细胞、CHO细胞、COS细胞或HELA细胞及其衍生物等。特别优选的是人生产细胞系。
在一个优选的实施例中，本发明的人单克隆抗体自MRSA疫苗I期临床试验受试者的血液淋巴细胞生成，并且如此生成具有高亲和力的天然精制的且选定的抗体以实现中和和针对感染的有效保护。
本发明还提供了用于生成单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，通过培养转入信号序列的表达载体的的宿主细胞来生成单克隆抗体。生成的单克隆抗体被分泌入上清液中，并且可以通过应用常规的层析技术来自其纯化。
第三方面，本发明还提供了所述抗体在如下a)-d)中任一种中的应用：
a)制备特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品；
b)制备特异性结合游离的α-溶血素抗原的产品；
c)制备治疗或辅助治疗金黄色葡萄球菌的产品；
d)制备金黄色葡萄球菌疫苗。
作为优选，所述产品为药物。
作为一种优选的应用方案，本发明进一步提供一种治疗或辅助治疗抗金黄色葡萄球菌感染的药物，其活性成分为本发明所述的抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体。
本发明的药物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，真空干燥和冷冻干燥从活性成分和其它期望成分的预先无菌过滤过的溶液产生活性成分和其它期望成分的粉末。可选择地，本发明的药物可在溶液中，且在递送之前或递送时可加入和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂以提供可注射的单位剂型。优选地，本发明中使用的药学上可接受的赋形剂适用于高药物浓度，可保持适当的流动性，且如果需要可延迟吸收。
作为优选地，本发明所述的抗体可以与一种药学上可接受的载体配制为药物，并且可以通过本领域已知的多种方法来给予。给药途径和/或方式可以取决于所希望的结果而不同。
术语“药学上可接受的载体”表示不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料，包括但不限于缓冲液、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他添加剂或包封物质。术语“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，活性成分与该载体组合以促进应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
附图说明
图1是本发明单个浆细胞分选图。
图2是本发明实施例5中SDS-PAGE检测结果。
图3是本发明实施例6中表达抗体的结合活性检测。
图4是本发明实施例7中表面等离子共振分析抗原抗体相互作用结果。
图5是本发明实施例8中Hla变性胶WB结果图。
图6是本发明实施例9中Hla Mapping多肽Elisa结果图。
图7是本发明实施例10中TRN1016中和wHla裂解红细胞结果图。
图8是本发明TRN1016中和wHla裂解A549细胞结果图。
图9是本发明TRN1016中和保护wHla小鼠死亡效果图。
图10是本发明MRSA菌血症感染致死模型的建立及保护性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
详细说明
本发明在此披露了结合至金黄色葡萄球菌a-溶血素的抗体，包括人源化或人抗体和单结构域抗体。此类抗体可以有用于检测和/或可视化a-溶血素并且因此可以用在诊断方法和测定中，并且是有效的。在此所述的抗体还可以治疗感染MRSA导致的菌血症，因此对于治疗和预防是有效的。
金黄色葡萄球菌感染引起的一些常见病症的非限制性实例包括烧伤、蜂窝织炎、皮肤坏死、眼睑感染、食物中毒、关节感染、肺炎、皮肤感染、手术伤口感染、烫伤样皮肤综合征以及中毒性休克综合征。另外，它是在异物感染中常见的病原体，例如血管内的线(intravascular line)、起搏器、人工心脏瓣膜以及关节植入物。由金黄色葡萄球菌感染引起的一些病症或疾病进一步描述于下文。以下描述的一些或所有的病症和疾病可以涉及作为感染组分或病症或疾病状态的介质的a-溶血素的直接作用，同时一些或所有的病症可以涉及a-溶血素的间接或继发作用(例如，原发性毒力因子导致与病症相关的主要症状或大多数症状的，a-溶血素通过其对细胞功能和细胞溶解的破坏起着进一步推进疾病的作用)。
烧伤
烧伤伤口常常最初是无菌的。然而，中度和重度烧伤通常损害针对感染的物理和免疫屏障(例如，皮肤的发疱、开裂或剥离)，导致流体和电解质类的丢失，并且引起局部或全身性生理功能障碍。受损皮肤与活细菌接触可以导致在损伤部位的混合定殖。感染可以被限制到烧伤表面上的无活力的碎片(“焦痂”)，或者定殖可以进展为全皮肤感染并且侵袭焦痂下的有活力的组织。更严重的感染可以到达皮肤下，进入淋巴***和/或血液循环，并且发展为败血症。典型地，在定殖烧伤伤口感染处的病原体中发现金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌可以破坏肉芽组织并且产生严重的败血症。
皮肤和软组织感染
蜂窝织炎
蜂窝织炎是皮肤的急性感染，常常开始于可以在皮肤层下蔓延的表面感染。蜂窝织炎最常见地是由金黄色葡萄球菌结合化脓性链球菌的混合感染引起。蜂窝织炎可以导致全身感染。
皮肤坏死
皮肤坏死是皮肤和皮下组织的感染，容易跨越皮下组织内的筋膜面(fascialplane)蔓延。该病症引起皮肤的顶层和/或底层变得坏死，并且可以蔓延至在下面的组织和周围组织。
坏死性筋膜炎
坏死性筋膜炎被称为“食肉病”或“食肉细菌综合征”。坏死性筋膜炎可以由多种微生物感染引起(例如，I型，由混合细菌感染引起)或由单微生物感染引起(例如，II型，由细菌的单个病原菌株引起)。许多类型的细菌可以引起坏死性筋膜炎，这些细菌的非限制性实例包括A群链球菌(例如化脓性链球菌)、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、产气荚膜梭菌、以及脆弱拟杆菌。具有抑制的或受损的免疫***的个体更可能遭受皮肤坏死(例如，坏死性筋膜炎)。
历史上，A群链球菌被诊断为II型皮肤坏死感染的大多数病例的原因。然而，自2001年以来，已经观察到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为单微生物坏死性筋膜炎的原因具有增加的频率。感染局部地(有时在创伤部位)开始，可以是严重的(例如由于手术)、轻微的、或甚至不明显的。患者常常主诉剧烈的疼痛，这种疼痛相对于特定的皮肤外观可能是过度的。随着疾病的进展，组织常常在数小时内变得肿胀。腹泻和呕吐也是常见症状。
如果细菌在组织深处，炎症的体征在感染早期可能不明显。如果细菌不在深处，炎症的体征例如发红和肿胀的或皮肤灼热快速地显示出来。皮肤颜色可以进展为紫色，并且可以形成水疱，伴随皮下组织的随后的坏死(例如，死亡)。具有坏死性筋膜炎的患者典型地会发热并且看起来病得很重。如果不治疗，即在没有合适的医疗救助下，感染进展快速并导致死亡的比例高达73％。
肺炎
金黄色葡萄球菌还已经被鉴定为葡萄球菌肺炎的原因。葡萄球菌肺炎引起肺部炎症和肿胀，进而引起流体聚集在肺中。聚集在肺中的液体可以阻止氧气进入血流。患有流行性感冒的那些人具有发生细菌性肺炎的风险。在已经遭受流行性感冒的那些人中，金黄色葡萄球菌是细菌性肺炎的最常见的原因。葡萄球菌肺炎的常见症状包括咳嗽、呼吸困难以及发热。另外的症状包括疲劳、黄色或带血粘液、以及随着呼吸恶化的胸痛。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)逐渐被诊断为在葡萄球菌肺炎中鉴定的菌株。
手术伤口感染
手术伤口常常深深地穿入身体。因此如果伤口变得被感染，此类伤口的感染对患者造成重大风险。金黄色葡萄球菌时往往是手术伤口中的感染的致病因子。金黄色葡萄球菌非常善于侵入手术伤口，缝合伤口可以被引起正常皮肤感染少得多的金黄色葡萄球菌细胞感染。侵入手术伤口可以导致严重的金黄色葡萄球菌败血症。由金黄色葡萄球菌侵入血流的侵袭可以导致内部器官(特别是心脏瓣膜和骨)的种植(seeding)和感染，引起全身性疾病，例如心内膜炎和骨髓炎。
烫伤样皮肤综合征
金黄色葡萄球菌可能是“烫伤样皮肤综合征”(还被称为“葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征”)、“中毒性表皮坏死”、“局限性大疱性脓疱病”、“里特病(Ritter's disease)”以及“莱尔病(Lyell's disease)”的主要致病因子。烫伤样皮肤综合征频繁发生于大龄儿童中，典型地发生于由产生表皮松解外毒素(例如，表皮剥脱毒素A和B，有时被称为烫伤样皮肤综合征毒素)的金黄色葡萄球菌菌株的繁盛(flowering)所导致的爆发中，这些表皮松解外毒素导致表皮层内的分离。外毒素之一是由细菌染色体编码的，并且另一种是由质粒编码的。外毒素是切割桥粒芯糖蛋白-1的蛋白酶，桥粒芯糖蛋白-1通常将皮肤的颗粒层和棘层(spinosum layer)保持在一起。
细菌可以最初仅感染一个较小的病灶，然而，毒素破坏细胞间连接，蔓延表皮层，并且允许感染渗透皮肤外层，产生象征疾病的脱屑。皮肤外层的脱落通常暴露下面的正常皮肤，但是如果不进行适当治疗，在过程中的液体丢失可以在幼儿中产生严重的损伤。
中毒性休克综合征
中毒性休克综合征(TSS)是由产生所谓的“中毒性休克综合征毒素”的金黄色葡萄球菌菌株引起的。该疾病可以由金黄色葡萄球菌在任何部位的感染引起，但是常常错误地被认为仅仅是使用卫生棉的女性专有的疾病。该疾病涉及毒血症和败血症，并且可以是致命的。
中毒性休克综合征的症状取决于基本病因而不同。由于细菌金黄色葡萄球菌的感染引起的TSS典型地另外表现在其他方面健康的具有高热的个体中，伴有低血压、不适以及意识错乱，可以快速进展至昏呆(stupor)、昏迷、以及多器官衰竭。常常在疾病的早期病程中见到的特征性皮疹类似于晒斑，并且可以累及身体的任何区域，包括嘴唇、嘴、眼睛、手掌以及脚底。在最初的感染猛攻(onslaught)中存活的患者中，在10-14天之后皮疹脱屑、或剥落。
如以上所指出，归因于金黄色葡萄球菌的耐多药菌株的增加，越来越多数目的常用于治疗金黄色葡萄球菌感染的抗生素不再控制或消除耐甲氧西林以及耐多药的金黄色葡萄球菌的感染。针对在此所述的金黄色葡萄球菌a-溶血素的抗体可以帮助降低感染的严重性，并且还可以辅助从感染的宿主中清除、防止(预防性地)或减少病原性金黄色葡萄球菌。还可以使用这些抗体检测金黄色葡萄球菌，并且当在患者样品中时，诊断金黄色葡萄球菌感染。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1野生型金黄色葡萄球菌a-溶血素(wHla)和Hla(H35L)多肽的表达和纯化
将来自金黄色葡萄球菌菌株(ATCC登录号为BAA-1556)的基因组DNA通过PCR扩增wHla基因。然后使用QuickChange II XL定点诱变试剂盒通过野生型基因的定点诱变而产生H35L变体。DNA测序证明后，将其在大肠杆菌中表达，在含有氨苄青霉素的LB培养基内37℃培养过夜，离心收获细胞。利用Ni-NTA纯化获得wHla蛋白和重组Hla蛋白。
将HLA氨基酸序列截断，合成长度为18位氨基酸的多肽，相邻的两个多肽之间的6个氨基酸重叠，据此合成47条多肽。
实施例2 PBMC细胞的分离
招募健康的志愿者和严重感染金黄色葡萄球菌后痊愈的志愿者，进行外周血样本的采集用于分离浆细胞。
采集以上志愿者的静脉血样本于含有肝素的抗凝管中，利用密度离心法分离血浆与PBMC细胞，具体操作如下：取静脉血于400g、22℃、离心15min；吸取离心后上清透明血浆层，分装-80℃冻存；吸取上清后，与等量的RPMI1640(Gibco)充分混匀，缓慢加入到含有淋巴细胞分离液的无菌离心管内，并保持液面分层完整；2000rpm离心20min，用毛细管吸取位于云雾层取单个核细胞，置另一无菌离心管中，加入5倍以上体积的RPMI1640，1500rpm离心10min，洗涤细胞两次，细胞计数后以1×107/支进行冻存备用。
实施例3流式细胞仪分选单个浆细胞
流式细胞术分选单个浆细胞：根据血清学实验(以HLA保护性抗原蛋白(HPLC纯度﹥95％)为抗原进行ELISA检测)确定样本的抗体滴度，选择抗体滴度高的样本，通过流式细胞仪分选单个浆细胞，通过CD3/CD14/CD16/CD235a-CD19+CD20+/-CD38hi CD27hi设门分选。将不同时间点的浆细胞群分离出来。通过血清学实验与B淋巴细胞表型的分析，可以保证我们能从>3％的浆细胞群中获得大量的单个浆细胞，并从中分离抗Hla的全人源单克隆抗体的基因序列，分选到细胞数量较多状态良好(图1)。
实施例4抗Hla抗体的克隆和全人源抗体的表达
使用SuperscriptV逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)和随机引物合成cDNA的第一链。使用Ig引物组(重链的恒定区引物序列：GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG；轻链的恒定区引物序列：AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG)通过PCR扩增人Ig VH和VK/L。将PCR扩增的的VH和VK/L产物克隆到TOPO TA载体中，并进行测序。再将上述扩增产物通过PCR进行再扩增，产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
抗体基因序列测定与生物信息学分析：将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体基因PCR产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并分别从正向与反向进行序列测定，用IMGT在线服务器(http：//imgt.cines.fr/)来分析抗体基因家族、突变率、亚型及CDR区。新的抗体基因录入抗体基因库中。
将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因的PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上，构建全人源抗Hla抗体的表达载体，然后将表达载体转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min。取5μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果显示，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链和轻链基因的转化子。
实施例5全人源抗Hla抗体的表达和纯化
将实施例4中所得阳性转化子中的载体质粒转化DH5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，与转染试剂PolyFect共转染293细胞，转染后6-8小时换大量新鲜培养基(RPMI1640)，并在37℃、8％CO2培养箱中培养96小时，收集细胞上清进行检测。收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白A亲和层析法进行纯化；利用SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况。SDS-PAGE检测结果(见图2)显示，转染细胞成功表达了抗体，命名为全人源HLA单克隆抗体TRN1016，简称TRN1016抗体或TRN1016单克隆抗体，且该抗体的相对分子量约160-180KD，重链约55KD，轻链约25KD。
实施例6表达抗体的结合活性检测
以重组表达的Hla蛋白(H35L)和野生型wHla分别为抗原包被ELISA 96孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个小时。加入100μL Overlapping PCR转染表达抗体(一抗)原液。阳性对照为阳性血浆样本原液(1：50倍稀释)和TRN1016抗体(1：1000倍稀释)每孔100μL 3个复孔。阴性对照为阴性血浆样本原液(1：50倍稀释)和阴性对照无关抗体IgG1 0.5μg/mL，每孔100μL 3个复孔，空白加100μL封闭液3个复孔，37℃孵育1h。
用PBST缓冲液洗板一次(3个循环)，每孔加100μL用封闭液按1:10000进行稀释的Goat-Anti-IgG-Fab-HRP(二抗)，37℃孵育1h。PBST缓冲液洗板一次(5个循环)，避光，每孔加TMB 100μL，37℃放置5min，立即用50μL的2M H2SO4终止。双波长450/630nm检测OD值。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的3倍)，大于阈值为阳性抗体。
实验显示，全人源HLA单克隆抗体TRN1016能与Hla和wHla结合图(图3)，EC50分别为0.261μg/mL和0.558μg/mL(表1)。
表1 TRN1016和HLA与wHLA的EC50
Figure GDA0002519010660000151
实施例7表面等离子共振技术(SPR)测定抗体与抗原的亲和力
使用表面等离子体共振测定来测量KD值(BIACORE3000)，分离得到的TRN1016单克隆抗体用amine偶联试剂盒偶联到CM5芯片，简言之，在这种方法的一个实例中，根据供应商的说明书，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore公司)用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将Protein A用pH4.8的110mM醋酸钠稀释为5μg/微升(约0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速注入从而获得偶联蛋白7min，大致10000个响应单位(RU)。在注入Protein A后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，在25℃将TRN1016以5μL/分钟的流速注入芯片获得150个响应单位(RU)，Hla两倍连续稀释物(3.13nM至50nM)以大致30μL/min的流速注入具有0.05％吐温20(Tween20)(PBST)的PBS中，注入时间，480秒，解离时间480秒。通过同时拟合缔合和解离传感图(图4)，使用简单的一对一朗缪尔结合模型(BIAcore评估软件，3.2版本)计算缔合速率(ka)、解离速率(kd)、平衡解离常数(KD)。TRN1016与Hla蛋白缔合速率(ka)为2.40*105Ms-1、解离速率(kd)6.57*10-4s-1、平衡解离常数(KD)2.74*10-9M。
实施例8 TRN1016抗体表位类型的确定
蛋白样品制备：0.8μg HLA和wHLA蛋白样品中加入2.5μL还原型Loading Buffer(含β－巯基乙醇)，用PBS补足10μL并在沸水浴中煮5min。安装电泳槽和预制胶，加入电泳缓冲液，拔掉梳子后上样。设定电泳仪电压为140V电泳时间1-2h。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。电泳胶用水冲洗后，与转膜试剂盒一起组装后放入转膜仪，使用自动转膜仪转膜；转膜后的薄膜用含5％脱脂奶粉的TBST溶液完全覆盖后封闭，放在摇床上室温封闭1h。薄膜用TBST溶液洗3次，每次5min；然后用TBST配制含有1％脱脂奶粉的溶液，随后按照1:7500加入抗人IgG-AP，将薄膜放入上述溶液中，置于水平摇床上室温孵育1h。
TBST液：50mL 20×TBS，5mL Tween20，945mL水补足1L，混匀后使用。
薄膜用TBST溶液洗3次，每次5min；将薄膜放入干净的平皿中，每块膜避光滴加约1mL的AP显色液，观察条带显色，至条带明显时，加入水终止反应。图5显示，TRN1016能够和变性后的HLA和wHLA结合，由此判断TRN1016抗体的表位为线性表位。
实施例9抗原表位的确定
将实施例1中合成的Hla多肽用DMSO溶解，将多肽用碳酸盐包被液溶解，使其浓度为30μg/mL，取100μL包板4度过夜，用封闭液常温封闭2个小时。加入100μL浓度为2μg/mL的TRN1016单克隆抗体每孔100μL 3个复孔，阳性对照为阳性血浆样本原液(1：50倍稀释)，阴性对照为阴性血浆样本原液(1：50倍稀释)和阴性对照无关抗体IgG1 0.5μg/mL，每孔100μL3个复孔，空白加100μL封闭液3个复孔，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板一次(3个循环)，每孔加100μL用封闭液按1:10000进行稀释的Goat-Anti-IgG-Fab-HRP(二抗)，37℃孵育1h。PBST缓冲液洗板一次(5个循环)，避光，每孔加TMB 100μL，37℃放置5min，立即用50μL的2MH2SO4终止。双波长450/630nm检测OD值。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的3倍)，大于阈值为阳性抗体。图6显示6、7、8号三条多肽能够和TRN1016单克隆抗体结合，6、7、8号三条多肽的序列如表2所示，由此TRN1016单克隆抗体识别的抗原位点至少包括KENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKILVIRTKG(SEQ ID NO.9)整段氨基酸序列全长或者部分片段及部分氨基酸。
表2与TRN1016单克隆抗体结合的多肽氨基酸序列
Figure GDA0002519010660000171
实施例10溶血性活性的中和
将野生型Hla蛋白wHla与TRN1016抗体混合于37℃分别预孵育0.5h、1h、1.5h，确定预孵育时间为0.5h(图7A)；将wHla与TRN1016抗体混合物加入50μL的5％兔红细胞(RBC)，37℃分别孵育0.5h、1h、1.5h，确定孵育时间为1h时wHla裂解红细胞活性最好(图7B)；将wHla与TRN1016抗体在37℃预孵育0.5h、加入5％兔红细胞(RBC)孵育1h后，wHla裂解红细胞的活性如图7C所示，其裂解的EC50为0.939μg/mL；将50μL wHla分别与不同浓度的TRN1016及对照抗体(为与wHla反应的抗体，即IgG1)在37℃预孵育0.5h，加入5％兔红细胞(RBC)孵育1h。孵育后，将完整的细胞通过离心而沉淀。将50μL的上清液转移至新的96孔板，并且用分光光度计测量A490。中和活性是相对于仅使用RBC和wHla的溶解来计算的，并且计算为：抑制％＝100x[100-(A490nwHla+Ab)/(A490nwHla无Ab)]。
在恒定数量的wHla和兔RBC的存在下，将纯化的TRN1016抗体逐步提高剂量，通过上清液中的血红蛋白释放来测量溶血，中和活性如图7D所示，表明TRN1016抗体可以抑制兔RBC中孔的形成。
实施例11 A549细胞裂解性的中和
将wHla与TRN1016抗体混合于37℃分别预孵育0.5h、1h、1.5h，据此结果选择0.5h(图8A)；将A549细胞维持在5％CO2、37℃培养箱中的补充有非必需氨基酸谷氨酰胺和10％的胎牛血清的RMPI中。将细胞用Hank’s平衡培养基(Hank’s balanced media)洗涤一次，并且以104/孔平板接种在RPMI、5％FBS中在50μL以下，然后在37℃用5％CO2孵育20小时。PBS洗涤细胞两次，加入wHla与TRN1016抗体混合物于37℃分别孵育6h、9h、12h，确定孵育为12hwHla活性最好(图8B)；在37℃预孵育0.5h后、加入A549细胞孵育12h裂解A549细胞(图8C)所示，其裂解的EC50为50.51μg/mL；将50μL wHla和不同浓度的TRN1016及阴性对照抗体(为与wHla反应的抗体，即IgG1)在37℃预孵育0.5h，随后添加A549细胞培养12h，遵循制造商的方案，使用Cytotox96非放射性测定试剂盒，将细胞溶解测量为乳酸脱氢酶(LDH)的释放。从每个孔减去背景LDH，并且LDH释放的抑制被计算为：抑制％＝100x[100-(A590wHla+Ab)/(A590nwHla无Ab)]。
人红细胞不具有大量针对Hla的受体。因此，人RBC不如兔RBC对于wHLa介导的溶解同样敏感，并且可能不是感染期间针对Hla的主要目标。其他细胞类型(如上皮细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞)是在葡萄球菌感染期间针对wHla的效应更有意义。在wHla介导的人细胞系A549(肺泡上皮细胞系)的溶解中检查纯化抗体的活性。结果如图8D所示，通过乳酸脱氢酶(LDH)的释放的抑制％来量化细胞溶解，TRN1016的中和活性的EC50为12.1nM。抑制兔RBC溶解的TAN1016抗体也抑制wHla介导的人A549细胞的溶解，体现了TAN1016抗体在感染期间抑制金黄色葡萄球菌溶血素的潜在效用，由此限制金黄色葡萄球菌相关症状和疾病的进展。
实施例12体内中和保护性评价实验
1、将50μL分别含有20μg wHla、15μg wHla、10μg wHla、5μg wHla和0μg wHla的抗原溶液分别与50μL生理盐水混合，于37℃孵育30min后，对小鼠进行腹腔注射。小鼠分为5组，每组6只小鼠。腹腔注射后，记录小鼠生存时间并计算生存率(图9A)。实验结果显示，20μg wHla可致死100％的小鼠，15μg wHla可致死≥80％的小鼠(N＝6)，因此选择17.5μg wHla进行中和保护性评价实验：将抗原、抗体混合后在37℃下预孵30min后，腹腔注射。
2、将50μL分别含有2.5μg TRN1016抗体、5μg TRN1016抗体、10μg TRN1016抗体、20μg TRN1016抗体的抗体溶液分别与50μL含有17.5μg wHla的抗原溶液混合，于37℃孵育30min后，每组6只小鼠，每只老鼠进行腹腔注射。观察小鼠生存时间及计算生存率，图9B。中和保护性评价实验表明：20μg TRN1016抗体能够保护100％小鼠，10μg TRN1016抗体能够保护50％小鼠，5μg及2.5μg TRN1016抗体能够保护≥30小鼠(N＝6)。此结果表明有力的抑制性抗体的被动给予是用于疾病预防的有效途径。总之，该实验结果说明金黄色葡萄球菌a-溶血素在致病菌中的作用，并且提供了抑制黄色葡萄球菌a-溶血素功能以限制金黄色葡萄球菌感染相关的疾病严重性甚至死亡的抗体的用途的证据。
实施例13 MRSA菌血症感染致死模型的建立及保护性评价
实验分组：共分为7组，每组6只小鼠，1x109CFU组：每只小鼠静脉注射1x1010CUF/mL的MRSA菌液100μL(1x109CFU/只)；8x108CFU组：每只小鼠静脉注射8x109CUF/mL的MRSA菌液100μL(8x108CFU/只)；6x108CFU组：每只小鼠静脉注射6x109CUF/mL的MRSA菌液100μL(6x108CFU/只)；4x108CFU组：每只小鼠静脉注射4x109CUF/mL的MRSA菌液100μL(4x108CFU/只)；2x108CFU组：每只小鼠静脉注射2x109CUF/mL的MRSA菌液100μL(2x108CFU/只)；1x108CFU组：每只小鼠静脉注射1x109CUF/mL的MRSA菌液100μL(1x108CFU/只)；生理盐水组：每只小鼠静脉注射100μL生理盐水。观察小鼠生存时间及计算生存率，结果如图10A，显示6x108CFU的菌量可以导致≥80％小鼠死亡，因此选择此菌量作为菌血症感染攻毒菌量。
实验分组：共分为2组，每组5只。生理盐水组：每只小鼠静脉注射6x109CFU的MRSA菌液100μL(6x108CFU/只)，2h后静脉注射100μL生理盐水；30μgTRN1016组：每只小鼠静脉注射6x109CFU的MRSA菌液100μL(6x108CFU/只)，2h后静脉注射100μL TRN1016。观察小鼠生存时间及计算生存率，结果如图10B，生理盐水组小鼠存活情况为第三天后小鼠只存活1只，TRN1016组为第四天后小鼠只存活3只，具有60％保护效果。表明全人源抗Hla抗体TAN1016能够抑制疾病进展、增强清除并且还抑制入侵生物的全身扩散。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure GDA0002519010660000211
Figure GDA0002519010660000221
Figure GDA0002519010660000231
Figure GDA0002519010660000241
Figure GDA0002519010660000251
Figure GDA0002519010660000261
序列表
<110> 珠海泰诺麦博生物技术有限公司
<120> 一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly His Asn Ile Leu Thr Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ser Val Asp Lys Gly Asn Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Arg Gly Gly Glu Thr Tyr Leu Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Ser Asn Ile Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Thr Lys
1
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Arg Gly Trp Val
1 5 10
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly His Asn Ile Leu Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Val Asp Lys Gly Asn Thr Asn Tyr Ala His Asp Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Ile Thr Glu Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Glu Thr Tyr Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Ala Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Thr Ser Asn Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Thr Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Thr Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Glu Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Glu Asn Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp
1 5 10 15
Lys Asn His Asn Lys Lys Ile Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly
20 25 30
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Lys Glu Asn Gly Met Leu Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp
1 5 10 15
Lys Asn
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys
1 5 10 15
Ile Leu
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Phe Ile Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys Ile Leu Val Ile Arg Thr
1 5 10 15
Lys Gly

Claims (11)

1.一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体，其特征在于，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区：
所述重链可变区包括：(1)如SEQ ID NO.1所示的CDR1区(2)如SEQ ID NO.2所示的CDR2区，(3)如SEQ ID NO.3所示的CDR3区；
和/或，
所述轻链可变区包括：(1)如SEQ ID NO.4所示的CDR1区，(2)如SEQ ID NO.5所示的CDR2区，(3)如SEQ ID NO.6所示的CDR3区。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体能够特异性结合金黄色葡萄球菌的α-溶血素，所述金黄色葡萄球菌的α-溶血素包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列或其中的部分片段或部分氨基酸的序列。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述部分片段为SEQ ID NO.10、或SEQ IDNO.11、或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体通过表面等离子体激元共振测定，可以以不高于1×10-5M的平衡解离常数(KD)与金黄色葡萄球菌α-溶血素解离。
6.根据权利要求1～5任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区选自人源IgM、IgA或IgG恒定区中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区为人源IgG恒定区。
8.编码权利要求1～7任一项所述抗体的核酸分子。
9.含有权利要求8所述核酸分子的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。
10.权利要求1～7任一项所述抗体在如下a)-d)中任一种中的应用：
a)制备特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的药物或试剂；
b)制备特异性结合游离的α-溶血素抗原的药物或试剂；
c)制备治疗或辅助治疗金黄色葡萄球菌的药物或试剂；
d)制备金黄色葡萄球菌疫苗。
11.一种治疗或辅助治疗抗金黄色葡萄球菌感染的药物或试剂，其活性成分为权利要求1～7任一项所述的抗体。
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