TR201803015T4

TR201803015T4 - Prokaryotik hücrelerde immünojenik polisakaridler üreten biyosentetik sistem.

Info

Publication number: TR201803015T4
Application number: TR2018/03015T
Authority: TR
Inventors: Walker Michael; Waechter Charles
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2018-03-21
Also published as: PT2501406T; ES2660227T3; CA2780487A1; AU2010322454B2; US8846342B2; AU2010322454A1; JP2013511520A; KR101855380B1; EP2501406B8; CN102724997A; EP2501406A1; LT2501406T; JP5968784B2; CN102724997B; WO2011062615A1; EP2501406A4; CA2780487C; SI2501406T1; HUE038456T2; US20130028926A1

Abstract

Buluş, N-glikosile edilmiş proteinler içeren biyo-konjugat aşılara yöneliktir. Ayrıca mevcut buluş, indirgeyici terminalinde N-asetilgalaktosamin olan bir oligo- veya polisakaridi sentezleyen bir epimerazı şifreleyen nükleik asitler içeren bir rekombinant prokaryotik biyosentetik sisteme de yöneliktir. Buluş ayrıca indirgeyici terminalinde N-asetilgalaktosamin olan bir oligo- veya polisakarid ve bir ekspresyon sistemi içeren N-glikosile edilmiş proteinlere ve bu tür N-glikosile edilmiş proteinleri üretme yöntemlerine de yöneliktir.

Description

TARIFNAMEPROKARYOTIK HUCRELERDE IMMUNOJENIK POLISAKARIDLER URETEN BIYOSENTETIK SISTEMILGILI BASVURUYA ÇAPRAZ REFERANSBu basvuru, buraya kendi bütünlügü içerisinde referans olarak dahil edilmis 35 U.S.C. g ll9(e) kapsaininda 19 Kasim 2009 tarihinde dosyalanmis 61/272,93l N0.1u ABD Geçici Basvurusundan faydaisteminde bulunur.BULUSUN SAHASIMevcut bulus, bir asi hazirlanmasinda bir biyosentetik sistem ve proteinler kullanilmasi ile ilgilidir. Ek olarak bulus, indirgeyici terminalde belirlenmis bir monosakarid ile bir oligo- veya polisakaridin sentezini baslatan bir epimeraza sahip bir rekombinant prokaryotik biyosentetik Sistem ile de ilgilidir. Bulus ayrica bir ekspresyon sisteminde glikanlar ile üretilen N-glikosile edilmis proteinler ve adi geçen N-glikosile edilmis proteinlerden yapilan, immünojenik glikanlar içeren biyo-konjugat asilar ile de ilgilidir ve N-glikosile edilmis proteinler üretmeye yönelik yöntemler sunar.BULUSUN GEÇMISIGlikoproteinler, bir veya daha fazla kovalent bagli seker poliineriiie sahip proteinlerdir. N baglantili protein glikosilasyonu, ökaryotik organizmalarin endoplazmik retikulumunda meydana gelen elzem ve konzerve bir prosestir. Sekretuar ve inembran proteinlerinin protein katlaninasinda, oligomerizasyonuiida, stabilitesinde, kalite kontrolünde, çesitlenmesinde ve tasiiimasinda önemlidir (Heleiiius, A. ve Aebi, M. (2004). Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049).Protein glikosilasyonu, bir proteinin immünojenikligi, stabilitesi ve yari ömrü. üzerinde belirgin bir etki gösterir. Ek olarak glikosilasyon, proteinlerin kroniatografi, örn., proteinin glikosile edilmis yarimlari ile etkilesen bir kati faza bagli lektin ligandlari ile afinite kroiiiatografisi yoluyla saflastirilmasina da destek olabilir. Bu yüzden biyolojik ve farmasötik açidan faydali glikosilasyon paternleri saglamak için ökaryotik hücrelerde rekoinbinant sekilde birçokglikosile edilmis protein üretilmesi, kanitlanmis bir uygulamadir.WO 2003/07467 (Aebi ve arkadaslari), bir bakteri olan gida kaynakli patojen Campylobacter jejuniüiin, kendi proteinleriiii N-glikosile edebildigiiii ve bunun da, bazi aechae türleri disinda bilinen prokaryotik organizmalar arasinda essiz bir özellik oldugunu ortaya koydu. Glikosilasyon için gerekli mekanizma, pgl adiyla bilinen yerde kümelenen 12 gen tarafindan sifrelenir. N-glikosilasyonun bozulmasi, C. jejuni7nin envazyonunu ve patojenezini etkiler ancak çogu ökaryotikj organiziiiada oldugu gibi ölümcül degildir (Burda P. ve M.

Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-linked glycosylation.

Biochem Biophys Acta l426(2):239-57). C. jejuni proteiiilerde N-glikosilasyonun, E. coli°de pgl yerinin ve akseptör glikoproteininin ayni anda rekombinant sekilde eksprese edilmesiyle yeniden teskiledilmesi mümkündür (Wacker ve arkadaslari (2002). N-linked).N-glikanlar, bir protein içinde bir konsensüs sekansa ekli bir glikana sahiptir. Protein içinde bilinen N-glikosilasyon konsensüs sekansi, prokaryotik organizmalarda rekombinant hedef proteinlerin N- glikosilasyonuna izin verir. Bu tür organizmalar, bir oligosakaril transferaz("OT"; "OTase"), 'Örnegin C. jejuni'nin bir oligosakaril transferazini, yani glikani proteinin konsenüs sekansina transfer edenbir enzimi içerir.WO 2003/07467 (Aebi ve arkadaslari), içerisine, (i) bir lipit tasiyici üzerinde bir oligosakarid birlesmesi için spesifik glikosiltransferazlari, (ii) bir konsensüs sekans “N - X - S/T" ki buradaki X, prolin disinda herhangi bir amino asit olabilir, içeren bir rekombinant hedef proteini ve (iii) bir oligosakaril transferazi, örnegin C. jejuninin, adi geçen oligosakaridi hedef proteinin konsensüs sekansina kovalent sekilde baglayan bir oligosakaril transferazini sifreleyen bir nükleik asidin dahil edildigi bir prokaryotik organizmayi ögretir. Adi geçen prokaryotik organizma, spesifik glikosiltransferazlarin tipiyletanimlanan spesifik bir yapiya sahip N- gl yavrulari üretir.WO 2006/1 19987 (Aebi ve arkadaslari), proteinlerin yani sira in vivo prokaryotik organizmalarda N-glikosilasyon etkinligi ile protein üretmeye yönelik yöntemleri açiklar. Ayrica adi geçen proteinlerin immünojenikliginin, stabilitesinin, biyolojik, profilaktik ve/Veyaterapötik aktivitesinin modifiye edilmesi için rekombinant proteinleriçerisine N-glikanlarin verimli bir sekilde dahil edilmesini ve kendi yüzeyi üzerinde mevcut açiklamaya ait rekombiiiant N-glikosile edilmis proteinleri verimli sekilde gösteren bir konakçi hücre tedarik edilmesini de açiklar. Ek olarak asagidaki N-glikosile edilmis optimize edilmis ainino asit sekans(lar)1ndan birini veya daha fazlasini içeren bir rekombinant N-glikosile edilmis proteini de açiklar: D/E - X - N - Z - S/T (optimize edilmis konsens'ûs sekans), buradaki X ve Z, Pro disinda herhangi bir dogal amino asit olabilir ve burada adi geçen N-glikosile edilmis kismi ainino asit sekans(lar)inin en az biri dahil edilir. Spesifik kismi ainino asit sekans(lar)inin (optiinize edilmis konsens'ûs sekans(lar)) proteinler içerisine dahil edilmesi, bu dahil edilen pozisyonlarda bir oligosakaril transferaz tarafindan verimli bir sekilde N-glikosile edilen proteinlere yol açar.Farkli polisakaridlerin biyosentezi, bakteri hücrelerinde konzerve edilir. Polisakaridler, sit0plazmik membrandaki ortak öncülerden (aktiflesmis seker nükleotitleri) gelen tasiyici lipitler üzerinde tanimlanmis spesifiklikte farkli glikosiltransferazlar tarafindan bir araya getirilir. Lipopolisakaridler ("LPS"), sadece gram negatif bakteriler, örn., Shigella spp., Pseudomonas spp. ve E. coli (EXPEC, EHEC) içinde tedarik edilir.LPS sentez, membraiiin sit0plazmik tarafindaki tasiyici lipit undekaprenil fosfata ("Und-P-P") bir monosakarid ilavesiyle baslar.

Antijen, monosakaridlerin aktiflesmis seker nükleotitlerinden farkli glikosiltransferazlar tarafindan sirayla ilave edilmesiyle yapilandirilirve lipit baglantili polisakaride, bir flippaz tarafindan membran yoluylahafifçe vurulur. Antijen tekrarlama ünitesi, bir enziinatik reaksiyon yoluyla polimerize edilir. Polisakarid daha sonra yüzeye ihraç edilen LPS”yi olusturan Ligaz WaaL tarafindan Lipit A°ya transfer edilirken kapsüler polisakarid, polimerizasyondan sonra tasiyici lipitten salinir ve yüzeye ihraç edilir. Bu polisakaridlerin biyosentetik yolagi, polisakaridleri bir protein tasiyicisina göre periplazma içerisindetutarak in VIVO LPS biyo-konjugatlarinin üretilmesini saglar.Oligo- veya polisakaridlerin (yani seker tortulari) ve proteinlerin (yani protein tasiyicilari) bu tür sentezlenmis kompleksleri, birçok bakteriyel enfeksiyona karsi koruma saglamak için konjugat asilar seklinde kullanilabilir. Kon jugat asilar, bakteriyel enfeksiyonlara karsi koruma saglamak için basarili sekilde kullanilmaktadir. Polisakaridler, T hücresinden bagimsiz immünojenler oldugundan koruyucu bellek tepkisi için bir anti jenik polisakaridin bir protein tasiyiciya konjuge edilmesi gerekir. Polisakaridler, protein tasiyicilara polisakarid ve ayrica protein tasiyici içindeki reaktif aktiflestirme gruplarikullanilarak farkli kimyasal yöntemlerle kon juge edilmektedir.Konjugat asilar, çocuklara, bakteriyel enfeksiyonlara karsi koruma saglamak için uygulanabilir ve ayrica yetiskinler için uzun süre kalici bir immün tepkisi saglayabilir. WO 2009/ 104074steki (Fernandez ve arkadaslari) yarilarin, hayvanlarda bir IgG tepkisi ürettigi bulunmustur. Shigella O”ya özel bir polisakarid-protein konjugat asisina bir IgG tepkisinin, insanlarda iminün koruma ile iliskili oldugu bulunmustur. (Passwell, J.H. ve arkadaslari, "Safety and Immunogenicity of Improved Shigella O-Specific Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines in Adults in Israel" Infection andImmunity, 69(3): 1351- 1357 (Mart 2001).) Polisakaridin (yani seker tortularinin), sekere öze kisa süreli bir immün tepkisi tetikledigine inanilir. Gerçekten insan immün sistemi, bakterilerin spesifik polisakarid yüzey yapilarina, örn., O-antijenlere ve kapsüler polisakaridlere karsi kuvvetli bir tepki üretir. Bununla birlikte polisakaridlere karsi immün tepkisi, IgM”ye bagli oldugundan immün istem, bellek gelistirmez. Polisakarid tasiyan protein tasiyici, T hücresine bagli olan ve immün sistem bellek gelistirdiginden uzunsüre kalici bir koruma saglayan bir IgG tepkisi tetikler.E. coli 0157, son zamanlardaki bütün hemolitik-üremik sendrom vakalarinin yaklasik olarak üçte ikisinden sorumlu ve insan sagligi ile ilgili ciddi sorunlar ortaya çikaran bir enteroheniorajik sustur (Law, D. (2000) J. App. Microbiol., 88, 729-745; Wang, L. ve Reeves, P. R. (1998) Infect. Iinmun. 66, 3545-3551).Escherichia coli susu 0157, tekrarlayan tetrasakarid ünitesi (4-N-asetil perosainin->fukoz-glukoz->GaINAc) (a-D-PerNAc-cc-L-Fuc-P-D- Glc-cc-D-GalNAc) içeren bir O-antijen üretir (Perry, M. B., MacLean, L. ve Griffith, D. W. (1986) Biochem. Cell. Biol., 64, 21 -28).

Tetrasakarid, undekaprenil pirofosfat üzerinde önceden toplanir. E. coli hücre kilifi, bir iç plazma membrani, stres tasiyan bir peptidoglikan tabakasi ve bir fosfolipit iç mono-tabakasi ve bir bakteriyel LPS°den mütesekkil bir dis mono-tabakadan olusan bir asimetrik dis membran içerir. LPS, lipit A ankraji, 3-de0ksi-D-mano- 0kt-2-ulosonik asit içerikli göbek ve O-antijen bölgesi olmak üzere üç bilesen içerir (bakiniz: Raetz, C. R. H. ve Whitfield, C. (2002) Annu.

Rev. Biochem., 71, 635-700; Whitfield, C. (2006) Ann. Rev.Biochem. 75, 39-68; Samuel, G. ve Reeves, P. R. (2003) Carbohydrate Research, 338, 2503-2519; ve bakteriyel LPS”nin O-antijenlerinintoplanmasi ile ilgili incelemeler için buradaki referanslar).Bakteriyel LPS”nin O-antijen bilesenleri, tek bir tekrarlayan monosakaridden mütesekkil homopoliinerik yada 3-6 seker ünitesinden 10-30 tekrar içeren heteropoliinerik olabilen büyük, son derece farkli polisakaridlerdir (Reeves, P. R., Hobbs, M.., Valvano, M.

A., Skurnik, M., Whitfield, C, Coplin, D., ido, N., lena, J., Maskell, D., Raetz, C. R. H. ve Rick, P. D. (1996) Trends Microbiol., 4, 495- 503). O-antijenler bu yüzden bakteriyel hücre yüzeyinin baskin özelligidir ve Virülans ve patojenikligin önemli determinantlarini teskil eder (Law, D. (2000) J. App. Microbiol, 88, 729-745; Spears, K. J., Roe, A. J. ve Gaily, D. L. (2006) FEMS Microbiol. Lett., 255, 187- 202; Liu, B., Knirel, Y. A., Feng, L., Perepelov, A. V., Senchenkova, S. N., Wang, Q., Reeves, P. R. ve Wang, L (2008) FEMS Microbiol.

Rev. 32, 627-653; Stenutz, R., Weintraub, A. ve Widmalm, G. (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30, 382-403). Essiz O-antijen yapilarina atfedilen 180,den fazla ayri O-serotipli E. coli suslari tanimlanmistir (Stenutz, R., Weintraub, A. ve Widmalm, G. (2006) FEMS Microbiol.

Rev. 30, 382-403).O-antijen tekrar üniteleri, iç membranin undekaprenil pirofosfata ekli sitosolik yüzünde önceden toplanir. Lipit baglantili tekrar üniteleri, iç membranin periplazmik yüzeyine enine (yanar-döner) difüze olur ve dis membrana tasinmadan ve LPS”ye ligate edilmeden önce polimerize edilir. Çogu heteropolimerik O-antijen tekrar ünitesi,indirgeyici terminalde, ya N-asetilglukosamin ("GlcNAc") yada N-asetilgalaktosamin ("GalNAc") içerir.Lipit ara maddelerinin biyo-sentezinin, GlcNAc-P veya GalNAc- P”nin, kendi ilgili seker nükleotit türevlerinden undekaprenil inonofosfata ("Und-P") WecA katalizinde transfer edilmesiyle basladigi varsayilir (Samuel, G. ve Reeves, P. R. (2003) Carbohydrate Research, 338, 2503-2519; Alexander, D. C. ve Valvano, M. A. (1994) J. Bacteriol, 176, 7079-7084;Zhang, L., Radziejewska- Lebrecht, J., Krajewska-Pietrasik, D., Tolvanen, P. ve Skurkik, M. (1997) Mol. Microbiol. 23, 63-76; Amor, P. A. ve Whitfield, C. (1997) Mol. Microbiol. 26 (145-161); Wang, L. ve Reeves, P. R. (1998) lnfect. lmmun. 66, 3545-3551). WecA”nm GlcNAc- fosfotransferaz aktivitesinin `Özelliklerinin ve spesifitesinin karakterize edilmis olmasina ragmen (Rush, J. S., Rick, P. D. ve Waechter, C. J. (1997) Glycobiology, 7, 315-322) WecA°nin, GalNAc-P-P-Und sentezini katalize ettigi sonucu, genetik çalismalara dayandirildi (Wang, L. ve Reeves, P. R. (1998) Infect. lmmun. 66, 3545-3551). Bu tip erken genetik çalismalar, lipit baglantili tetrasakarid ara maddesinin biyosentezinin, GalNAc-P'nin UDP-GalNAc°den Und- P”ye WecA katalizinde enzimatik transferiyle basladigini isaret etti (Wang, L. ve Reeves, P. R. (1998) Infect. lmmun. 66, 3545-3551).

Bununla birlikte WecAsnin UDP-GalNAc”den bir GalNAc-P donörüolarak faydalandigina dair hiçbir dogrudan enzimolojik kanit yoktu.Ayrica E. coli 055 gne ve gnel genlerinin 'önceleri bir UDP-GlcNAc 4- epimerazini sifreledigi ileri sürülüyordu (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. ve Reeves, PR. (2002) J. Bacterid. 184, 2620-2625; Guo, H., Yi, W., Li, L. ve Wang, P. G. (2007) Biochem.Biophys. Res. Coinmuii., 356, 604-609). Onceki raporlar, E. coli 055”ten (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. ve Reeves, PR. (2002) J. Bacterid. 184, 2620-2625) ve E. coli 086°dan (Guo, H., Yi, W., Li, L. ve Wang, P. G. (2007) Biochem. Biophys.

Res. Commun., 356, 604-609) iki geni, ayri ayri E. coli 055 gne ve E. coli 086 gnel°i, ayni gen familyasi içindeki bir Z3206 genine %100özdes olarak tanimliyordu.Böylelikle uzman kisilerin, Z3206 geninin ayrica bir UDP- GlcNAC/UDP-GalNAc epimerazini da sifreledigine inanmasisaglanmis oluyordu.Feldman ve arkadaslari Proc. Natl. Acad. Sci US (2005) cilt 102, 110.8 sayfa 3016-3021'de, N-baglantili protein glikosilasyonunun, E. coli içinde çesitli O antijen lipopolisakarid yapilari ile degisiklige ugratilmasini açiklar. Rush ve arkadaslari, J. Biol. Chem. (2009) cilt 285, n03, sayfa 1671-1680”de, E. coli 0157 içinde GlcNAc-P-P- undekaprenolü GalNAc-P-P-undekaprenole dönüstüren yeni birepimerazi açiklar.BULUSUN KISA OZETISimdilerde sasirtici bir sekilde E. coli 0157 içinde Z3206 geninin sifreledigi bir epimerazin, undekaprenil pirofosfat üzerinde N- asetilgalaktosamini ("GalNAc") sentezleyen bir reaksiyonu, ki bu, bir oligo- veya polisakarid olusumunu baslatir, katalize ettigi kesfedildi.1. Bir yönde mevcut bulus, sunlari sifreleyen nükleik asitler içerenbir rekombinant prokaryotik organizma, yani E. coli ile ilgilidir:10i) undekaprenil pirofosfat üzerinde N-asetilgalaktosaminisentezleyen bir epimeraz; burada adi geçen epimerazisifreleyen adi geçen nükleik asit, SEK.KIM.NO.:l”e en az%95 özdestir;ii) bir oligo- veya polisakaridi bir lipit tasiyici üzerindetoplayan glikosiltransferazlar;iii) Cainpylobacter je juni”den bir oligosakaril transferaz; veiv) bir veya daha fazla rekoinbinant sekilde dahil edilmiskonsensüs sekans, D/E-X-N-Z-S/T içeren bir protein; buradakiX ve 2- birbirinden bagimsiz olarak prolin hariç herhangi birdogal ainino asittir burada adi geçen glikosiltransferazlar tarafindan toplanan oligosakarid, lipit tasiyicidan bir veya daha fazla optimize edilmis konsens'ûs sekansa sahip hedef proteine oligosakaril transferaz tarafindan transfer edilebilir.

Açiklama ayrica indirgeyici terminalinde GalNAc olan bir polisakaridin tamamini veya bir bölümünü sentezleyen glikosiltransferazlari ve yine ayrica indirgeyici terminalinde GalNAc olan bir antijenik polisakaridin tainainini veya bir bölümünüsentezleyen glikosiltransferazlari da kapsar.Bir baska yönde açiklama, undekaprenil pirofosfat 'üzerinde GalNAc üretme amaçli bir epiineraza yöneliktir ve bir baska yönde epiineraz,23206 geni tarafindan sifrelenir.Ilave bir yönde mevcut açiklama, sunlari içeren bir N-glikosile edilmis protein üretme ainaçli bir ekspresyon sistemine yöneliktir: biroligosakaril transferazi sifreleyen bir nükleotit sekansi; bir proteinlltasiyiciyi sifreleyen bir iiükleotit sekansi; en az bir bakteriden en az bir oligo- veya polisakarid gen kümesi ki buradaki polisakarid, indirgeyici terminalinde GalNAc içerir; ve bir epimerazi sifreleyen bir nükleikasit sekansi.Yine bir baska yönde mevcut açiklama, GlcNAc-P-P-Und°u GalNAc - P-P-Und°a dönüstüren bir epimerazi sifreleyen Z3206 geni içeren birrekombinant prokaryotik biyosentetik sisteme yöneliktir.Yine ilave bir yönde mevcut açiklama, GlcNAc-P-P-Und”u GalNAc - P-P-Undsa dönüstüren bir epimerazi sifreleyen E. coli 055 gne geni veya E. coli 086 gne J geni içeren bir rekombinant prokaryotikbiyosentetik sisteme yöneliktir.Yine bir baska yönde mevcut açiklama, en az bir konsensüs sekans, D/E - X - N - Z-S/T dahil edilmis olan ki buradaki X ve Z, prolin hariç herhangi bir dogal amino asit olabilir, N-glikosile edilmis bir protein ve indirgeyici terminalinde N-asetilgalaktosamin olan bir glikan ileilgilidir.Yine bir baska yönde mevcut açiklama, en az bir konsensüs sekans, D/E - X - N - Z-S/T dahil edilmis olan ki buradaki X ve Z, prolin hariç herhangi bir dogal ainino asit olabilir, N-glikosile edilmis bir protein ve indirgeyici terminalinde N-asetilgalaktosamin olan bir glikan ileilgilidir.Ilave bir yönde bulus, N baglantili glikosile edilmis bir proteinüretmeye yönelik olup sunlari içeren bir yöntemle ilgilidir:12a.) bir E. coli konakçi organizmasi içerisine, sunlari sifreleyennükleik asitlerin dahil edilmesi: i.) undekaprenil pirofosfat üzerinde N-asetilgalaktosamini sentezleyen bir epimeraz; burada adi geçen epimerazi sifreleyen adi geçen nükleik asit, SEK.KIM,NO.:1°e en az %95 özdestir; ii.) bir oligo- veya polisakaridi bir lipit tasiyici üzerinde t0playan glikosiltransferazlar; iii.) Campylobacter je juni°den bir oligosakaril transferaz; ve iv.) bir veya daha fazla dahil edilmis konsensüs sekans, D/E- X-N-Z-S/T içeren bir protein; buradaki X ve Z, prolin hariç herhangi bir dogal amino asit olabilir; veb.) adi geçen konakçi organizmanin, en az bir N-glikosile edilmisprotein üretilene kadar kültürlenmesi.Bir baska yönde mevcut açiklama, bir biyosentetik sistemin ve proteinlerin, bir biyo-konjugat asi hazirlamada kullanilmasi ileilgilidir.Ilave bir yönde mevcut açiklama, mon0-, oligo- ve polisakaridler üretmeye yarayan yöntemlere yöneliktir ve yine bir baska yönde açiklama, antijenik glikanlar ve N-glikosile edilmis proteinlerüretmeye yarayan yöntemlere yöneliktir.ÇIZIMLERIN KISA TARIFISEKIL l,E. coli”den membran fraksiyonlari tarafindan[3H]GlcNAC/GalNAc-P-P-Und senteziiiin zaman sürecini13gösterir. E. coli susu 0157”den membran fraksiyonu, 37°C”de belirtilen sürelerde UDP-[3H]GlcNAc ile inkübe edildi. [3H]lipit ürünleri özümlendi ve [3H]G1cNAc”nin [3H]G10NAc-P-P-Und (O) ve [3H]GalNAc-P-P-Und (')°ya dahil olmasi, Ornek 2”de tarif edildigi gibi deneye tabi tutuldu.SEKIL 2, GlcNAc-P-P-Und”dan GaINAc-P-P-Und olusturulmasi için önerilen biyosentetik yolagi gösterir.SEKIL 3, E. coli susu 0157”den membran fraksiyonlarimn sentezledigi [3H]GalNAc-P-P-Und°un saflastirilmasini ve karakterizasyonunu gösterir. E. coli 0157'den membran fraksiyonlari, UDP-[3H]GlcNAc ile inkübe edildi ve [311] GalNAc lipitleri, Ornek 3 ”te tarif edildigi gibi saflastirildi. SEKIL 3A, DEAE-selüloz üzerinde saflastirildiktan sonra boratla emprenye edilmis silika jel G (Quantum 1) üzerinde [H]HexNAc lipitlerinin preparatif ince katman kromatogrami gösterilir. SEKIL 3B, panel A,da preparatif plakadan geri kazanildiktan sonra boratla emprenye edilmis silika jel G (Baker, Si250) üzerinde saflastirilmis [3H]GalNAc-P-P-Und”un ince katman kromatografisi gösterilir. SEKIL 3C, SEKIL 3B”de saflastirilmis [H]GalNAc-P-P-Und”un hafif asitle hidrolizinden sonra geri kazanilan [H]-amino sekerin azalan kagit kromatogrami (boratla emprenye edilmis Whatman No. 1 kagit) gösterilir. SEKIL 3D, SEKIL 3C7den [3H] amino sekerin NaBFU ile indirgenmesiyle üretilmis [3H]HexNAc-alditolün azalan kagit kromatogrami (Whatman No. 3MM).SEKIL 4, E. coli 21546 hücreleri ve E. coli 21546 hücrelerinin, pMLBAD:Z3206 ile transformasyon sonrasinda metabolik etiketlenmesini gösterir. E. coli 21546 (SEKIL 4A) ve E. coli14215462pMLBAD/Z3206 (SEKIL 4B), 37°C”de 5 dakika süreyle [3H]GlcNAc ile metabolik olarak etiketlendi. [3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und özümlendi, suyla çözülebilir bulaskanlardan kurtarildi ve Örnek 3”te tarif edildigi gibi boratla emprenye edilmis silika jel plakalari (Baker Si250) üzerinde ince katman kromatografisiyle ayrildi. Radyoaktif lipitler, bir Bioscan kromato-tarayici kullanilarak saptandi. GalNAC-P-P-Und ve GlcNAc-P-P-Und°un kromatografik pozisyonlari, oklarla isaret edilir.SEKIL 5, E. coli suslarindan membran fraksiyoiilariiiin UDP- [3H]GlcNAc ile inkübe edilmesiyle olusturulmus [BH]GlcNAc/GalNAC-P-P-Und”un ince katman kromatografisini gösterir. E. coli suslari K12 (SEKIL 5A), 0157 (SEKIL SB), 21546 (SEKIL SC) ve 21546:pMLBAD/Z3206,dan (SEKIL 5D) membran fraksiyonlari, UDP-[3H]GlcNAc ile 37°C°de 10 dakika süreyle inkübe edildi ve [3H]lipit ürünleri özümlendi, bölümlere ayirma yoluyla suyla çözülebilir bulaskanlardan kurtarildi ve Ornek 3”te tarif edildigi gibi boratla emprenye edilmis silika jel plakalari (Baker Si250) üzerinde ince katman kromatografisiyle ayrildi. GalNAc-P-P-Und ve GlcNAc-P-P-Und°un kromatografik pozisyonlari, oklarla isaret edilmektedir.SEKIL 6, UMP ile inkübasyon yoluyla GlcNAc-P bosaltiinini gösterir. E. coli 21546:Z3206'dan membran fraksiyonlari, UDP- [3H]GlcNAc ile ön inkübasyona tabi tutularak GlcNAc-P-P- Und7un 37°C7de 10 dakika süreyle enzimatik olarak etiketlenmesi saglandi (SEKIL 6A), ardindan 1 mM UMP ile ikinci bir inkübasyon periyodu, 1 dakika (SEKIL 6B) veya 215dakika (SEKIL 6C) sürdü. Belirtilen inkübasyon sürelerinin sonunda [3H]GlcNAc/Ga1NAc-P-P-Und Özümlendi ve Örnek 3°te tarif edildigi gibi boratla emprenye edilmis silika jel plakalari (Baker Si250) üzerinde ince katman kromatografisiyle ayristirildi. GalNAc-P-P-Und ve GlcNAc-P-P-Und”un kromatografik pozisyonlari, oklarla isaret edilmistir.SEKIL 7, eksogen [3H]GlcNAc-P-P-Und ve [3H]GalNAc-P-P- Und°un ilgili [3H]HeXNAc-P-P-Und ürününe, Z3206”y1 eksprese eden 21546 susundan meinbraiilariii katalizinde dönüstürülmesini gösterir. E. coli susu 21546 (SEKIL 7B ve SEKIL 715) ve 21546:pMLBAD/Z3206”dan (SEKIL 7C ve SEKIL 7F) membran fraksiyonlari, saflastirilmis [3H]GlcNAc-P-P-Und (SEKIL 7A, SEKIL 7B ve SEKIL 7C) veya [3H]GalNAc-P-P-Und (SEKIL 7D, SEKIL 7E ve SEKIL 7F°deki paneller) (%1 Triton X-lOO içinde ultrasonik olarak disperse edilmis) ile 37°C°de 1 dakika süreyle ink'ûbe edildi. [3H]GlcNAc/Ga1NAc-P-P-Und 'Öz'ümlendi, boratla emprenye edilmis silika jel plakalari (Baker Si250) üzerinde ince katman kroinatografisiyle ayristirildi ve Örnek 3”te tarif edildigi gibi bir Bioscan ARZOOO radyokromato-tarayici ile saptandi.SEKIL 8, glikosile edilmemis ve glikosile edilmis AcrA proteininin SDS-PAGE analizini gösterir. AcrA ekspresyon plazmidini ve pMLBAD:Z3206 (serit 1), pMLBAngne (serit 2) veya kontrol vektörü pMLBAD (serit 3) ile tamamlanmis pgl operon Agneiyi tasiyan E. coli DH5a hücrelerinden hazirlanmis periplazmik 'Özütler, %10 SDS-PAGE yoluyla ayrildi ve nitroseli'iloz membranina aktarildi. AcrA ve bunun glikosileedilmis formlari, anti AcrA antiseruinlari ile saptandi. Glikosile16edilmemis (AcrA) ve glikosile edilmis AcrA°ya (gAcrA) karsilik gelen bantlarin pozisyonlari isaret edilir.SEKIL 9, Liu B ve arkadaslari (Structure and genetics of Shigella O antigens FEMS Microbiology Review, 2008. 32: sayfa 27) tarafindan tanimlanmis olan genleri gösterir.SEKIL 10, S. flexneri 6 O anti jeninin sentezlenmesi için gerekli genleri içeren DNA bölgesini gösteren bir semadir.SEKIL 11, E. coli içinde S. flexneri 6 O anti jeninin ekspresyonunu gösterir. LPS, gümüs boyamasiyla yada nitroselüloz membranlarina aktarilarak görünür hale getirildi ve S. tlexneri 6”ya karsi yönlendirilmis antikorlarla saptama yapildi.

SEKIL 12, O anti jeninin HPLC'sini gösterir. S. flexneri-Z3206 içeren E. coli hücrelerinin (SCM3), S. flexneri+Z3206 içeren E. coli hücrelerinin (SCM3) veya bos E. coli (SCM3) hücrelerinin LLO analizi.SEKIL 13, EPA, ngB ve S. flexneri 6 O-antijen +/- Z3206ay1 eKSprese eden E. coli hücrelerinden Nikelle saflastirilmisproteinlerin Western blot'unu gösterir.BULUSUN DETAYLI TARIFIMevcut açiklama, indirgeyici terminalinde N-asetilgalaktosamin bulunan bir oligo- veya polisakaridi sentezleyen bir epimerazi sifreleyen nükleik asitler ve glikanin indirgeyici terminalinde N- asetilgalaktosamine sahip N-glikosile edilmis proteinler içeren birrekombinant prokaryotik biyosentez sistemini kapsar."Kismi ainino asit sekans(1ar)i" ayrica "optimize edilmis konsensüs17sekans(lar)" veya "konsensüs sekans(lar)" olarak da ifade edilir.

Optimize edilmis konsensüs sekans, bir oligosakaril transferazi ("OST," "OTase") tarafindan, düzenli konsensüs sekans "N-X-S/T"°den çok daha verimli bir sekilde N-glikosile edilir.Genel olarak "rekombinant N-glikosile edilmis protein" terimi, bir konakçi hücre içerisinde üretilen, adi geçen proteini sifreleyen nükleik asidi dogal olarak içermeyen herhangi bir poli- veya olig0peptide karsilik gelir. Mevcut bulus baglaminda bu terim, bir prokaryotik konakçi hücre, örnegin Escherichia spp., Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Helicobacter spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. Ve baska düzeneklerde Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, vb. içinde rekombinant sekilde üretilen bir proteine karsilik gelir ki burada adi geçen proteini sifreleyen nükleik asit, adi geçen konakçi hücre içerisine dahil edilmistir ve buradaki sifrelenmis protein, Otase tarafindan N- glikosile edilir; adi geçen transferaz enziini, adi geçen konakçi hücre içerisinde dogal yollarla meydana gelir veya bunun içerisinerekombinant sekilde dahil edilir.Amino asitler için uluslararasi kabul edilen tek harfli koda uygun olarak D, E, N, S ve T kisaltmalari sirasiyla aspartik asit, glutamikasit, asparagin, serin ve treonini isaret eder.Açiklamaya göre proteinler, protein içerisine dahil edilen ve N- glikosile edilen D/E - X - N - Z - S/T optimize edilmis konsensüs sekans(lar)indan birini veya daha fazlasini içerir. Bu yüzden mevcutaçiklamaya ait proteinler, ayrica optimize edilmis konsensüs sekansi18da içeren ancak ilave (dahil edilmis) optimize edilmis herhangi bir konsensi'is sekansi içermeyen dogal yollarla meydana gelen C. jejuniN-glikoproteinlerinden farklidir.Optimize edilmis konsensi'is sekaiisiiiin dahil edilmesi islemi, bir veya daha fazla amiiio asidin ilave edilmesi, delete edilmesi ve/veya ikame edilmesi yoluyla yapilabilir. Optimize edilmis konsens'ûs sekansin dahil edilmesi amaciyla bir veya daha fazla amiiio asidin ilave edilmesi, delete edilmesi ve/veya ikaine edilmesi islemi, mevcut açiklama açisindan, kati faz destekli kimyasal peptit sentezi gibi bu konuda uzman kisilerce iyi bilinen kimyasal sentetik stratejilerle gerçeklestirilebilir. Alternatif olarak ve daha büyük polipeptitler için tercihen mevcut bulusa ait proteinler, açiklamanin isigi altiiida bu konuda standart teknikler olan rekombinant tekniklerle dehazirlanabilir.Mevcut açiklamaya ait proteinler, yüksek verimlilikler ve herhangi bir konakçida üretilebilme avantajina sahiptir. Açiklamanin bir düzeneginde konakçi, Campylobacter spp.°den, örnegin C. jejuni”den fonksiyonel bir pgl operon içerir. Baska düzeneklerde açiklamanin uygulanmasi için Campylobacter spp.”den olan oligosakaril transferazlar, Cairipylobacter coli veya Campylobacter lari'den gelir.

Açiklama açisindan oligosakaril transferazlar, bu konuda uzman kisiler için anlasilirdir. Örnegin oligosakaril transferazlar, Szymanski, CM. ve Wren, B.W. (2005) Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens, Nat. Rev. Microbiol. 3:225-237 gibi referanslarda açiklanmaktadir. Fonksiyonel pgl operon, adi geçen prokaryotikkonakçiiiin Campylobacter spp. veya 'örnegin C. jejuni oldugu19durumda dogal olarak mevcut olabilir. Bununla birlikte bu konuda daha Önce gösterildigi ve yukarida belirtildigi gibi pgl operon, hücrelere transfer edilebilir ve adi geçen yeni hücre ortaminda halafonksiyonel olabilir."Campylobacter spp., tercihen C. jejuni°den fonksiyonel pgl operon" terimi, Campylobacter spp., örnegin C. jejuni7ye ait fonksiyonel oligosakaril transferazi (OTase) ve bir oligosakaridi bir lipit tasiyici üzerinde toplayabilen bir veya daha fazla spesifik glikosiltransferazi sifreleyen nükleik asit küniesine karsilik gelir ve burada adi geçen oligosakarid, lipit tasiyicidan bir veya daha fazla optimize edilmis amino asit sekansi: D/E - X N - Z - S/T”ye sahip hedef proteine OTase tarafindan transfer edilebilir. Bu bulus baglaminda "Campylobacter spp., tercihen C. je juni'den fonksiyonel pgl operon' teriminin, bir tekil transkripsiyon ünitesi seklinde bir operona karsilik gelmesinin sart olmadigi anlasilacaktir. Terim sadece rekombinant proteinin bir adet konakçi hücre içinde N-glikosile edilmesi için fonksiyonel bilesenlerin var olmasini gerektirir. Bu bilesenler, bir veya daha fazla ayri mRNA halinde transkripte edilebilir ve birlikte veya ayri ayri regüle edilebilir. Örnegin terim ayrica genomik DNA içine konuinlandirilmis fonksiyonel bilesenleri ve bir adet konakçi hücre içindeki plazmid(ler)i de kapsar. Verimlilik amaciyla bir düzenekte bütünfonksiyonel pgl operon bilesenleri ayiii anda regüle ve eksprese edilir.Oligosakaril transferaz, bazi düzeneklerde, Campylobacter spp. ”den ve diger düzeiieklerde C. je juni”den çikabilir. Ilave düzeneklerde oligosakaril transferaz, bu koiiuda uzman kisilerce `Örnegin Wolinellaspp. gibi bir oliosakaril transferaza sahip oldugu bilinen diger20organizmalardan ve ökaryotik organizmalardan çikabilir.Bir oligosakaridi bir lipit tasiyici üzerinde toplayabilen bir veya daha fazla spesifik glikosiltransferaz, konakçi hücreden çikabilir veya adi geçen konakçi hücre içerisine rekoinbinaiit sekilde dahil edilebilir; tek fonksiyonel sinirlama, adi geçen glikosiltransferazlar tarafindan toplanan oligosakaridin, lipit tasiyicidan bir veya daha fazla optimize edilmis konsensüs sekansi olan hedef proteine Otase tarafindan aktarilabilmesidir. Bu yüzden adi geçen dogal olarak spesifik glikosiltransferazlar içeren ve/veya adi geçen konakçida dogal olarak mevcut spesifik glikosiltransferazlari degistiren konakçi hücre seçimi ve ayrica heterolog spesifik glikosiltransferazlarm dahil edilmesi, bu konuda uzinan kisilerin, inevcut açiklamaya ait proteinler içerisinde optimize edilmis N-glikosilasyon konsensüs sahasina bagli N-glikanlari degistirmesiiii saglayacaktir.Yukaridakinin sonucunda mevcut açiklama, mevcut açiklamaya ait proteinler üzerinde ayri ayri N-glikan paternleri tasarlaninasini saglar.

Böylelikle proteinler, biyolojik, farmasötik ve saflastirma ihtiyaçlarina uygun olacak sekilde kendi N-glikan paternleri bakimiiidanbireysellestirilebilir.Mevcut açiklamanin düzeneklerinde proteinler, adi geçen N-glikosile edilmis optimize edilmis amino asit sekanslarindan birini ve ayrica birden fazlasini, örn., en az ikisini, en az 3,ünü veya en az 5”iniiçerebilir.Mevcut açiklamaya ait proteinler içinde bir veya daha fazla N-21glikosile edilmis optimize edilmis amino asit sekansinin var olmasi, bunlarin immünojenikligini arttirma, bunlarin stabilitesini arttirma, bunlarin biyolojik aktivitesini etkileme, bunlarin biyolojik yari ömrünü uzatma ve/veya bunlarin saflastirilmasini basitlestirmebakiinindan avantajli olabilir.Optimize edilmis konsensüs sekansi, X ve Z pozisyonlarinda prolin disinda herhangi bir amino asit içerebilir. "Herhangi bir amino asit" terimi, yaygin ve nadir dogal ainino asitlerin yani sira optiinize edilmis konsens'ûs sekansin OTase tarafindan N-glikosile edilmesine hala izin veren sentetik amino asit türevleri ve analoglari anlamina gelir. Dogal yollarla meydana gelen yaygin ve nadir amino asitler, Xve Z için tercih edilir. X ve Z, ayni veya farkli olabilir.X ve Z”nin, mevcut açiklamaya göre bir protein içindeki her biroptimize edilmis konsensüs sekans için farkli olabilecegi kaydedilir.Optimize edilmis konsensüs sekansa bagli N-glikan, spesifik glikosiltransferazlar tarafindan ve oligosakaridin OTase tarafindan transfer edilmek üzere bir lipit tasiyici üzerinde toplandigi durumda bunlarin etkilesimleriyle belirlenecektir. Mevcut açiklamaya göre bu konuda uzman kisiler, arzu edilen konakçi hücre içinde mevcut spesifik glikosiltransferazlarin tip(ler)ini ve miktarini degistirerek N-glikan tasarlayabilir.Burada kullanildigi gibi "monosakarid", bir adet seker tortusuna karsilik gelir."Oligo- ve polisakarid", iki veya daha fazla seker tortusuna karsilik22gelir. Burada kullanildigi gibi "glikanlar" terimi, mono-, oligo- veya polisakaridlere karsilik gelir. "N-glikanlar", bir protein içindeki bir asparagin tortusunun bir e-amid nitro jenine bir N-glikosidik baglanti yoluyla baglanan degisken kompozisyonlarda m0no-, oligo- veya polisakaridler olarak tanimlanir. Bir düzenekte OTase tarafindan transfer edilen N-glikanlar, gram-negatif veya pozitif bakterilerin sitoplazmik inembraninda mevcut bir undekaprenol pirofosfat ("Und- P-P") lipit-ankraj üzerinde t0planir. Bunlar, 0 antijenin, O polisakaridin ve peptidoglikanin sentezinde yer alir (Bugg, T. D. ve Brandish, P. E. (1994) From peptidoglycan to glycoproteins: common features of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis. FEMS Microbiol Lett 119, 255-262; Valvano, M. A. (2003). Export of O-speeific lipopolysaccharide. Front Biosci 8, S452-471).Bir lipit baglantili tekrarlayan tetrasakaridin (4-N-asetil perosamin->fukoz->glukoz- GaINAc) biyosentezinin, WecA tarafindan GaINAc-P-P-Und olusmasiyla baslatilip baslatilmadigini belirlemek için çalismalar yapildi. E. coli suslari K12, 0157 ve WecA°yi asiri eksprese den bir sus olan PR4019°dan membran fraksiyonlarinin UDP-[3H]GalNAc ile inkübe edildigi durumda ne [3H]GlcNAc-P-P-Und ne de [3H]GalNAc-P-P-Und”da enzimatik sentez saptandi. Bununla birlikte sus 0157°den membran fraksiyonlarinm, UDP-[3H]GlcNAc ile inkübe edildigi durumda [3H]GlcNAc-P-P-Und ve [3H]GalNAC-P-P-Und”un kimyasal ve kromatografik özelliklerini tasiyan enzimatik olarak etiketlenmis iki ürün gözlendi ki bu durum, sus 0157°nin, GlcNAC-P-P-Und ile GalNAc-P-P-Und°u birbirine dönüstürebilen bir epimeraz içerdigini dogrular. Bir epimeraz varligi ayrica eksogen [H]GlcNAc-P-P-Und°un23sus 00157”den membranlar ile inkübe edildiginde [3H]GalNAc-P-P- Undsa dönüstügünün gösterilmesiyle de dogrulandi. Sus 0157°nin [3H]GlcNAc ile metabolik olarak etiketlendigi durumda hem [3H]GlcNAc-P-P-Und hem de [3H]Ga1NAc-P-P-Und saptandi. E. coli susu 21546”nin 23206 geni ile transforme edilmesi, bu hücrelerin, GaINAc-P-P-Und”u in Vivo ve in vitro sentezlemesiiii sagladi.

Epimeraz reaksiyonunun tersine çevrilebilir oldugu, sus 0157'den membranlarin eksogen [H]GalNAc-P-P-Und ile ink'i'ibe edildigi durumda [3H]GlcNAc-P-P-Und°un tekrar olustugunun gösterilmesiyle ortaya konuldu. Z3206°nin, E. coli içinde Campylobacter jejuni N- glikosilasyon sistemindeki gne gen kaybini tamamlayamamasi, bunun, bir UDP-GlCNAC/UDP-GalNAc epimerazi olarak islev görmediginin isaretiydi. Bu sonuçlara dayanarak GalNAC-P-P-Und°un, E. coli 0157 içinde WecA tarafindan GlcNAc-P-P-Und olusturulmasini takiben bir GlcNAc-P-P-Und epimerazi tarafindan tersine çevrilebilir sekildesentezlendigi dogrulandi.E. coli 0157 O-antijeni alt birim birlesiminin baslangiç reaksiyonu, GalNAc-P-P-Und sentezini, WecA'dan çok önceden bilinmeyen bir mekanizmanin katalize ettigini dogrulamak için arastirildi. Burada sunulan kanitlar, GalNAc-P-P-Und”un WecA katalizinde UDP- GalNAc'den GalNAc-P tarafindan sentezlenmedigini daha çok E. coli 0157 içinde 23206 geni tarafindan sifrelenmis bir epimeraz katalizinde GlcNAc-P-P-Und'a ait 4-OH'nin tersine çevrilebilirepimerizasyonuyla sentezlendigini göstermektedir.Buna göre açiklama, önemli bir bakteriyel hücre yüzeyi bileseninintoplanmasi için yeni bir biyosentetik yolagi ve ayrica GalNAc-P-P-24Und”un sentezi için yeni bir biyosentetik yolu kapsar. Açiklamanin bir baska düzenegi, antimikrobiyal ajanlar için yeni bir hedef olarakbakteriyel epimeraz içerir.E. coli 0157, bir O-antijeni tekrarlayan tetrasakarid yapisi (4-N-asetil perosamin- fukoz->glukoz->GalNAc) ile sentezler. Burada, lipit baglantili tetrasakarid ara maddesinin biyosentezinin, önceki genetik çalismalarin (Wang, L. ve Reeves, P. R. (1998) Infect. Iinmun. 66, 3545-3551) aksine, GalNAc-P'nin UDP-GalNAciden Und-P”ye WecA katalizinde enzimatik transferiyle baslamadi gi gösterilmektedir.

Homoloji arastirmalariyla elde edilen ve sonra genetik, enzimoloji ve metabolik etiketleme deneylerinin sonuçlariyla dogrulanan burada verilen açiklama, WecA”nin bir substrat olarak UDP-GalNAc”den faydalanmadigini ve WecA°n1n, GlcNAc-P-P-Und”un sentezleninesi ve daha sonra sus 0157 içinde 23206 geni tarafindan sifrelenmis bir epimeraz tarafindan GalNAc-P-P-Und”a tersine çevrilebilir sekildedönüstürülmesi için gerekli oldugunu ortaya koyar.Mevcut açiklamadaki Z3206 geni, indirgeyici terminallerinde GalNAc olan yüzey O-antijen tekrar üniteleri üreten birkaç susta mevcut bir gen familyasina aittir (Tablo 1). Z3206 gen sekansi, SEK.KIM.NO: 1 olarak gösterilmistir. Onceki raporlar, E. coli 055”ten (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. ve Reeves, PR. (2002) J.

Bacteriol. 184, 2620-2625) ve E. coli 086”dan (Guo, H., Yi, W., Li, L. ve Wang, P. G. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun., 356, 604- 609) iki geni, ayri ayri E. coli 055 gne ve E. coli 086 gnel”i, bir Z3206 genine %100 özdes olarak tanimliyordu (Tablo 1). E. coli 05 5 gne gen sekansi, SEKKIMNO: 3 olarak gösterilmis ve E. coli 086 gnel gen25sekansi, SEKKIMNO: 5 olarak gösterilmistir.

TABLO 1 O-antijen Zincirlerini eksprese eden bakteri suslari içinde Z3206 genininindirgeyici terminallerdeki GalNAc ile iliskisi. Z3206 ile O-antijeni tekrar %100 ünitesinin indirgeyici özdeslik terminalinde GalNAcE. coli OSS gne (SEK.KIM.NO.: 3) 100 VarE. coli 086 gnel (SEK.KIM.NO.:5) 100 VarShigella boydii 018 gne 88 Var(SEK.KIM.NO.: 7)Salinonella 94 Varenterica 030 gne (SEK.KIM.NO.:9)C. jejuni gne (SEK.KIM.NO..: 11) 21 YokE. coli K12 galE (SEK.KIM.NO.: 13) 27 YokE.coli 086 gne2 (SEK.KIM.NO.: 15) 18 Var Buna göre biz, E. coli 055 gne ve E. coli 086 gne I'in ayrica yine indirgeyici terminallerinde GalNAc olan O-antijen tekrar üniteleri üreten ayri ayri 055 ve 086 suslarinda GlcNAc-P-P-Undh GalNAC-P- P-Und”a dönüstürebilen epimerazlari da sifreledigi sonucunuçikariyoruz (Tablo 1).Bu çalismadaki iki deney yaklasimi, Z3206 proteininin, 0157 susunda UDP-GlcNAdnin UDP-GalNAc°ye epimerizasyonunu katalize etmedigini isaret eder. Ilk olarak sus 0157”den membranlarin, [3H]UDP-GalNAC ile ink'ûbe edildigi durumda ne [3H]GlcNAc-P-P- Und ne de [3H]GalNAc-P-P-Und saptandi (Tablo 3). Z3206”nin, [3H]UDP-GalNAc'nin [3H]UDP-GlcNAc°ye dönüsümünü katalize 26etinesi durumunda [3H]GlcNAc-P-P-Und°un gözlenmesi gerektigibeklenir.Ikinci olarak biz, hemaglutinin takili Z3206”nin, UDP-GaINAC”ye bagli C. jejuni N-glikosilasyon raportör sistemini tamamlayamadiginigösterdik (SEKIL 8).Sus 055”ten E. coli 055 gne geni (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. ve Reeves, PR. (2002) J. Bacteriol. 184, 2620-2625) de, ham özütlerin UDP-GalNAc ile inkübe edilmesi ve UDP- GlcNAc”ye dönüsümün, hidroliz sonrasinda p- dimetilaminobenzaldehid ile reaktivitedeki artisin ölçülmesi suretiyle dolayli olarak deneye tabi tutulmasiyla epinieraz aktivitesi bakimiiidan deneye tabi tutuldu. Her iki çalismada da ürün olusumu, p- dimetilaminobenzaldehid ile reaktivitedeki degisikliklere dayaniyordu, seker nükleotit uç ürününün kesin bir karakterizasyonuna degil. %90 saf polihistidin takili E. coli 086 gnel°nin, birlestirilmis bir deneyde Gne2”ye göre düsük seviyede bir UDP-glukoz epimeraz aktivitesinesahip oldugu da gösterildi.Buna göre bulusun bir düzenegi, GlCNAc-P-P-Und°u GalNAc-P-P- Undsa dönüstüren 23206 geni, E. coli 055 gne geni veya E. coli 086 gneI geni içeren bir rekombinant prokaryotik biyosentetik sistemeyöneliktir.Iki GalNAc tortusu içeren bir O-antijeni sentezleyen, ilave, indirgeyici olmayan terminal GalNAc için glikosil donörü olarak UDP-GalNAcgerektirdigi varsayilan E. coli 086”nin ayrica O-antijen gen kümesi27içerisinde gne2 adli ilave bir GlCNAc 4-epimeraz geiii de tasimasi aiilamlidir (Guo, H., Yi, W., Li, L. and Wang, P. G. (2007) Biochem.

Biophys. Res. Commun., 356, 604-609). Bu ilave epimeraz geni, kolanik asit gen kümesinin galE geni ile yüksek homolo ji gösterir ve UDP-GalNAdyi seiitezleyebileii bir UDP-GleNAc 4-epimeraz olarakgörünür.Z3206 geni, GalNAc ile baslayan E. coli O-serotiplerinde yüksek düzeyde konzerve görünür. Son zainanlardaki bir çalismada, kurulu O-antijen tekrar ünitesi yapilari ile 62 E. coli susu, E. coli 0157 Z3206 genini spesifik olarak saptamak için tasarlaiimis iiükleotit primerleri kullanilarak poliineraz zincir reaksiyonu bazli bir yöntemle Z3206 ekspresyonu bakimindan tarandi (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. ve Reeves, PR. (2002) .1. Bacteriol. 184, 2620-2625).

Bu çalismada Z3206, GalNAC içerdigi biliiien 22 E. coli susunun 16”sinda ve GalNAc içermeyen 40 susun sadece 4“ünde saptandi.

Ayrica UDP-GlcNAc 4-epimeraz aktiviteli alternatif bir epiinerazi (E. coli 0113°ün GalE geni) saptamak için tasarlanmis primerler ile 22 GalNAc içerikli susta benzer bir tarama, bu geni tasiyan hiçbir sus saptamadi ki bu, Z3206”nin, E. c01i°nin O-aiitijen tekrar üniteleri içerisinde bir indirgeyici terminal GalNAe varligi ile en yaygin sekildebaglantili GlcNAC 4-epimeraz geiii oldugunuii isaretidir.Z3206 protein sekansinin, çesitli web tabanli topolojik tahmin algoritmalari ile analizi, Z3206 proteininin yüksek düzeyde hidrofobik olmadigini isaret eder. Topolojik tahmin algoritmalariniii çogu, Z3206,nin çözülebilir 37 kDa”lik bir protein oldugunu isaret ederken TMPred (Hofinann, K. ve Stoffel, W. (1993) Biol. Chem. Hoppe-28Seyler 374, 166 (özet)), tek bir zayif N-terminal transineinbran helisi öngördü. Bununla birlikte hemaglutinin takili Z3206'y1 eksprese eden E. coli hücrelerinden hücre fraksiyonlarinin SDS-PAGE sonrasiiida Western blotlaninasi, takili proteinin, hücrelerin hipotonik lizizinin ardindan partikülat fraksiyonu ile baglantili oldugunu gösterir. Onceki deneyler, proteinin, membran fraksiyonunun lM KCl ile inkübe edilinesinin ardindan partikülat fraksiyonu ile baglantili kaldigini ancak %01 Triton X-100 ile inkübasyonla bir aktif formda çözülebiliroldugunu gösterir.E. coli 0157 Z3206, proton çikarma ve vermede yer alan NAD(P) baglanma cebi (Allard, S. T. M., Giraud, M. F. ve Naismith, J. H. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58, 1650-1655) ve konserve S 3/44Y% sekansi ile tutarli olarak GXXGXXG motifi (Rossman katlainasi) dahil oksido-reduktazlarin kisa zincirli dehidrogenaz/reduktaz familyasi ile anlainli sekans homolojisine sahiptir (Field, R. A. ve Naismith, J. H. (2003) Biochemistry 42, 7637-7647). Kisa Zincirli dehidrogenaz/reduktaz familyasinin baska bir elemani olan UDP-Glc 4-epimerazinin kristal yapilarina göre moleküler modelleme, hidrid çikarma sonrasinda 4-ket0 ara inaddesinin, UDP”ye ait [3 fosfat etrafinda dönerek keto ara maddesiniii diger yüzünü gösterdigini ve karsi taraftan gelen hidridin yeniden sokulmasina izin verdigini, böylelikle karbon 4'te hidroksil konfigürasyonunuii bas asagi döndügünü isaret eder. Bu koiizerve sekanslarin varligi, Z3206°nin muhtemelen benzer bir mekanizmayla islev gösterdigini isaret eder.

SEKIL 7°de görülen epimeraz ürünlerinin denge dagilimi, GlcNAc-P- P-Und olusumuna yarar görünse de O-antijen tekrar ünitesi birlesimiiçin GalNAc-P-P-Und”dan faydalanilmasi, epiinerizasyon29reaksiyonunu, kütle etkisiyle GalNAc-P-P-Und yönünde iter.

Poliizoprenoid lipit ara maddelerinin glikosil yarimlarinin epimerizasyonu, tabiati geregi yaygin sekilde bildirilmemistir. Onceki bir çalismada ribosil-P-dekaprenoli'in, mikobakterilerde arabinogalaktan biyosentezinde bir arabinosil donörü olan arabinosil- P-dekaprenol olusturma amaçli 2-epimerizasyonu bildirildi (Mikusova, K., Huang, H., Yagi, T., Holsters, M., Vereecke, D., D'Haeze, W., Scherman, M. S., Brennan, P. J., McNeil, M. R. ve Crick, D. C. (2005) J. Bacteriol. 187, 8020-8025). Arabinosil-P- dekaprenol, Rv3790 ve RV3791 olinak üzere iki mikobakteriyel protein gerektiren iki adimli bir oksidasyon/indirgeme reaksiyonuyla olusturulur. Epimerizasyon, NAD ve NADP ilavesiyle makul sekilde uyarilsa da ne RV3790 nede RV3791, kisa Zincirli dehidrogenaZ/reduktaz familyasinin karakteristigi olan Rossman katlamasi yada S 24YXXXK motifi içerir (Allard, S. T. M., Giraud, M.-F. ve Naismith, J. H. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58, 1650- 1655; Field, R. A. ve Naismith, J. H. (2003) Biochemistry 42, 7637- 7647).Ozetle GlcNAc-P-P-Und”un epimerizasyonu yoluyla GaINAc-P-P- Und olusturulmasina yönelik yeni biyosentetik bir yolak tarifedilinektedir.Birkaç antibiyotigin, GlcNAc-P-P-Und sentezini inhibe ettigi gösterilmistir ancak bunlar, fayda bakimindan sinirlidir çünkü protein N-glikosilasyon yolaginiii bastaki dolikol baglantili ara maddesi olan GlcNAc-P-P-dolikolün sentezini de bloke eder. GlcNAc-P-P-dolikol, bakteriyel glikolipit ara maddesi, GlcNAc-P-P-Und°un yapisal olarak30alakali bir memeli karsiligi olsa da ökaryotik hücrelerde GlcNAc-P-P- dolikolü GalNAc-P-P-dolikole dönüstüren benzer bir epimerizasyon reaksiyonuna iliskin hiçbir kanit yoktur. Bu yüzden bu, indirgeyici terminallerinde GalNAc olan yüzey O-antijeninin patolojik bir proseste yer aldigi suslarda O-antijen sentezinin, bakteriyel epimerazlarin inhibe edilmesiyle potansiyel olarak bloke olmaihtiinalini arttirir.Mevcut açiklamanin bir düzenegi, Ecoli 0157 içinde GlcNAc-P-P- Und”u (N-asetilglukosaminilpirofosforilundekaprenol) GalNAc-P-P- Und.”a (N-asetilgalaktosaminilpirofosforilundekaprenol) dönüstüren bir epimeraz içerir. Bulusun yine bir baska örnek yönü, indirgeyici terminalinde GalNAc olan lipit baglantili tekrarlayan tetrasakaridinsentezinin baslatilmasini kapsar.Bulusun bir baska yönünün temelinde, Cainpylobacter je juni”nin genel bir N baglantili protein glikosilasyon sistemi içerdiginin kesfi yatar. Çesitli C. jejuni proteinlerinin, bir heptasakarid tarafindan modifiye edildigi gösterilmistir. Bu heptasakarid, spesifik glikosiltransferazlarm katalizinde adim adim nükleotitler aktiflestirilmis monosakarid ilave edilmesi suretiyle iç membranin sitoplazmik tarafinda tasiyici lipit olan undekaprenil pirofosfat üzerinde toplanir. Lipit baglantili oligosakarid daha sonra bir flippaz, örn., PglK tarafindan periplazmik bosluga dogru yanardöner ilerletilir (enine difüze edilir). N baglantili glikosilasyonun son adiminda oligosakariltransferaz (örn., PglB), oligosakaridin, konsensüs sekans D/E - X - N - Z - S/T içerisinde ki buradaki X ve Z, Pro hariç herhangi bir amino asit olabilir, tasiyicilipitten asparagin (Asn) tortulariiia transferini katalize eder.31Heptasakarid için glikosilasyon kümesi, E. coli içerisine basarili sekilde transfer edilmis ve Campylobacterîn N baglantiliglikoproteinleri üretilmisti.PglB”nin lipit baglantili seker substrati için kati bir spesifite göstermedigi ortaya konulinustu. Undekaprenil pirofosfat üzerinde toplanmis antijenik polisakaridler, periplazmada PglB tarafindan yakalaiiir ve bir protein tasiyiciya transfer edilir (Feldman, 2005; Wacker, M. ve arkadaslari, Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proc Natl Acad Sci ABD, 2006. 103(l 8): sayfa 7088-93.) Enzim ayrica undekaprenil pirofosfat (UPP) baglantili oligosakaridlerden olusan farkli bir diziyi de, indirgeyici terminallerinde N-asetile edilmis bir heksosamin olmasi durumunda transfer edecektir. PglB için nükleotit sekansi ve PglB için amino asitsekansi, W02009/104074”te yayinlanmistir.Buna göre açiklamanin bir düzenegi, sunlari içeren bir rekombinant N-glikosile edilmis proteini kapsar: dahil edilmis bir veya daha fazla konsensi'is sekans, D/E - X - N - Z - S/T ki burada X ve Z, prolin hariç herhangi bir dogal amino asit olabilir; ve indirgeyici terininalinde N- asetilgalaktosainin olan ve adi geçen bir veya daha fazla dahil edilmis konsensüs sekanstan her birine bir N-glikosidik baglantiyla Nbaglantisi yapilmis bir oligo- veya polisakarid.Bir baska düzenekte mevcut aciklama, undekaprenil pirofosfat üzerinde N-asetilgalaktosamini (("GalNAc") sentezleyeii bir epimeraziçeren bir polisakaridin tamamini veya bir bölümünü üretme amaçli32bir rekombinant prokaryotik biyosentetik sisteme yöneliktir. Bir baskadüzenekte polisakaridin tainaini veya bir bölümü, anti jeniktir.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, sunlari içeren bir rekombinant prokaryotik biyosentetik sisteme yöneliktir: undekaprenil pirofosfat üzerinde GalNAc”yi sentezleyen bir epimeraz; ve indirgeyici terminalinde GalNAc olan bir polisakaridi sentezleyenglikosiltransferazlar.Açiklamanin bir düzenegi ayrica undekaprenil pirofosfat üzerinde GalNAc'yi sentezleyen bir epimeraz ve bir polisakaridi sentezleyen glikosiltransferazlar içeren bir rekoinbinant prokaryotik biyosentetik sistemi de kapsar; burada adi geçen polisakarid, su yapiya sahiptir: (1- D-PerNAc-a-L-Fuc-ß-D-Glc-a-D-GalNAc; ve buradaki GalNAc, adigeçen polisakaridin indirgeyici terminalinde bulunur.Rekombinant prokaryotik biyosentetik sistem, çesitli kaynaklardan m0n0-, oligo- veya polisakaridler üretebilir. Bulusun düzenekleri, çesitli kaynaklardan oligo- ve polisakaridlere yöneliktir. Bu tür oligo- Ve polisakaridler, prokaryotik veya Ökaryotik kaynakli olabilir.

Prokaryotik kaynakli oligo- veya polisakaridler, gram- negatif veya gram-pozitif bakterilerden gelebilir. Bulusun bir düzeneginde oligo- Veya polisakarid, E. coli°den gelir. Bulusun bir baska yönünde adi geçen oligo- veya polisakarid, E. coli 0157”den gelir. Bir baska düzenekte adi geçen oligo- veya polisakarid, su yapiyi içerir: a-D- PerNAc-oi-L-Fuc-ß-D-Glc-a-D-GalNAc. Bulusun bir baska düzeneginde oligo- veya polisakarid, Shigella flexnerisden gelir. Yinebir baska düzenekte oligo- veya polisakarid, Shigella flexneri 6,dan33gelir. Yine bir baska yönde adi geçen oligo- veya polisakarid, su yapiyi içerir:2 1,4---ß-c{LRha--i-çva-Rhav--Ei-oD-GIIA--i :ro-GaINAc “1" .1 ' ' iiOAC.Açiklamanin düzenekleri ayrica çesitli kaynaklardan proteinler de içerir. Bu tür proteinler arasinda prokaryotik ve ökaryotik organizmalar için dogal proteinler yer alir. Protein tasiyici, örnegin AcrA veya protein glikosilasyonu için konsensüs sekans, yani D/E -X - N - Z - S/T içerecek sekilde, ki burada X ve Z, prolin hariç herhangi bir amino asit olabilir, modifiye edilmis bir protein tasiyici (örn., modifiye edilmis bir Eksotoksin Pseudomonas aeruginosa ("EPA")) olabilir. Bulusun bir düzeneginde protein, Pseudomonas aeruginosaEPAsdir.Açiklamanin bir baska yönü, N-glikanin indirgeyici terminalinde GalNAc olan yeni biyo-konjugat asilari kapsar. Açiklamanin ilave bir düzenegi, bu tür biyo-konjugat asilarin üretilmesine yönelik olup, undekaprenil pirofosfat üzerinde GalNAc üreten bir epimeraz içeren rekombinant bakteriyel hücreler kullanan yeni bir yaklasimi kapsar.

Bir düzenekte biyo-konjugat asilar, bakteriyel hastaliklarin tedavisi veya engellenmesi için kullanilabilir. Baska düzeneklerde biyo- konjugat asilar, kanser veya baska hastaliklar için terapötik ve/veyaprofilaktik potansiyele sahip olabilir.Insanlar için tipik bir asilama dozaji, yaklasik 1 ila 25 pg, tercihen34yaklasik 1 ug ila yaklasik lOug arasinda, en fazla tercihen de yaklasik ug°dir. Istege göre mevcut bulusa ait bir biyo-konjugat asi gibi birasi, bir ad juvan içerir.Ilave bir düzenekte mevcut açiklama, en az bir bakteriye karsi bir biyo-konjugat asi üretmeye yönelik olup sunlari içeren bir ekspresyon sistemine yöneliktir: bir oligosakaril transferazi sifreleyen bir nükleotit sekansi; bir protein tasiyiciyi sifreleyen bir nükleotit sekansi; en az bir bakteriden en az bir polisakarid gen kümesi ki buradaki polisakarid, indirgeyici terminalinde GalNAc içerir; ve bir epimerazi sifreleyen bir nükleik asit sekansi. Bir baska düzenekte polisakarid gen kümesi, biranti jenik polisakaridi sifreler.Yine bir baska düzenekte mevcut bulus, en az bir bakteriye karsi bir biyo-konjugat asi üretmeye yönelik olup sunlari içeren bir ekspresyon sistemine yöneliktir: bir oligosakaril transferazi sifreleyen bir nükleotit sekansi; en az bir sokulmus konsensüs sekans, D/E-X-N-Z-S/T içeren ki burada X ve Z, prolin hariç herhangi bir dogal ainino asit olabilir, bir protein tasiyiciyi sifreleyen bir nükleotit sekansi; en az bir bakteriden en az bir polisakarid gen kümesi ki buradaki polisakarid, indirgeyici terminalinde GalNAc içerir; ve 23206 geni. Bir baskadüzenekte polisakarid gen kümesi, bir anti jenik polisakaridi sifreler.Yine bir baska düzenekte mevcut açiklama, sunlari içeren bir biyo- konjugat asiya yöneliktir: bir protein tasiyici; protein tasiyiciya bagli en az bir imniünojenik polisakarid zinciri, ki burada adi geçen polisakaridin indirgeyici terminalinde GalNAc vardir ve ayrica buradaadi geçen GalNAc, direkt olarak protein tasiyiciya baglanir; ve bir35adjuvan.Yine ilave bir düzenekte mevcut açiklama, sunlari içeren bir biyo- konjugat asiya yöneliktir: en az bir sokulmus konsensüs sekans, D/E- X-N-Z-S/T içeren ki burada X ve Z, prolin hariç herhangi bir dogal amino asit olabilir, bir protein tasiyici; en az bir bakteriden, protein tasiyiciya bagli en az bir immünojenik polisakarid ki buradaki en az bir iinmünojenik polisakarid, indirgeyici terminalinde direkt olarakprotein tasiyiciya bagli GalNAC içerir; ve istege göre bir adjuvan.Açiklamanin bir baska düzenegi, bir biyo-konjugat asi üretmeye yarayan bir yönteme yöneliktir; adi geçen yöntem, sunlari kapsar: indirgeyici terminalinde GalNAc olan bir polisakaridin glikosil transferazlar kullanilarak bir rekombinant organizma içinde toplanmasi; adi geçen GalNAc”nin, adi geçen rekombinant organizma içindeki bir veya daha fazla hedef proteinin bir asparagin tortusuna baglanmasi ki burada adi geçen bir veya daha fazla hedef protein, birveya daha fazla T hücre epitOpu içerir.Bir baska düzenekte mevcut açiklama, bir biyo-konjugat asi üretmeye yarayan bir yönteme yöneliktir, adi geçen yöntem, sunlari kapsar: bir hedef proteinin N-glikosilasyonunu gerçeklestiren bir metabolik aparati sifreleyen genetik bilgilerin bir prokaryotik organizma içine dahil edilmesiyle modifiye edilmis bir prokaryotik organizma üretilmesi ki burada bir veya daha fazla rekombinant hedef proteinin ekspresyonu için gerekli genetik bilgiler, adi geçen prokaryotik organizma içerisine dahil edilir; burada E. coli sus 0157 epimerazinin ekspresyonu için gerekli genetik bilgiler, adi geçen prokaryotikorganizma içerisine dahil edilir; ve burada metabolik aparat,36indirgeyici terminalinde GalNAc olan bir polisakaridi bir lipit tasiyici üzerinde toplayan bir tipte glikosiltransferazlar ve polisakaride ait GalNAc'yi hedef proteinin bir asparagin tortusuna kovalent sekilde baglayan oligosakariltransferaz olan bir oligosakariltransferaz ve en az bir T hücre epitopu içeren hedef protein içerir; bir modifiye edilmis prokaryotik organizma kültürü üretilmesi; ve kültür ortamindanglikosile edilmis proteinler elde edilmesi.Mevcut açiklamanin bir baska yönü, bir farmasötik kompozisyon ile ilgilidir. Açiklainanin ilave bir yönü, bulusa göre en az bir N-glikosile edilmis protein içeren bir farmasötik kompozisyonu kapsar. Buradaki açiklamanin isigi altinda proteinler içeren ilaçlarin preparasyonu, bu konuda iyi bilinecektir. Açiklamanin yine bir baska yönü, GlcNAc-P- P-Und°u GalNAc-P-P-Und°a dönüstüren bir epiinerazi inhibe eden bir antibiyotik içeren bir famiasötik kompozisyon ile ilgilidir. Tercih edilen bir düzenekte bulusa ait farmasötik kompozisyon, farmasötikaçidan kabul gören bir eksipiyan, seyreltici ve/Veya ad juvan içerir.Uygun eksipiyanlar, seyrelticiler ve/veya adjuvanlar, bu konuda iyi bilinir. Bir eksipiyan veya seyreltici, aktif muhteviyat için bir araç veya ortam görevi görebilen bir kati, yari kati veya sivi materyal olabilir. Koinpozisyonlarin hazirlanmasi alaninda siradan uzmanliga sahip bir kisi, seçileii ürünün özel karakteristiklerine, tedavi edilecek hastalik veya duruma, hastalik veya durumun evresine ve diger ilgili konulara bagli olarak uygun uygulama formunu ve modunu kolayca seçebilir (Remiiigton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). Farmasötik açidan kabul gören seyreltici veya eksipiyaninorani ve dogasi, seçilen farmasötik açidan aktif bilesigin çözünürlügü37ve kimyasal özellikleri, seçilen uygulama yolu ve standart farmasötik uygulama ile belirlenir. Farmasötik preparasyon, oral, parenteral veya topikal kullanima adapte edilebilir ve hastaya, tabletler, kapsüller, fitiller, çözelti, süspansiyonlar veya benzeri seklinde uygulanabilir.

Mevcut açiklamaya ait farmasötik açidan aktif bilesikler, kendi baslarina etkili iken, stabilite, kristalizasyon uygunlugu, artmis çözünürlük ve benzeri amaçlar için asit ilaveli tuzlar veya baz ilaveli tuzlar gibi farmasötik açidan kabul gören tuzlari seklinde formüleedilebilir ve uygulanabilir.Spesifik nükleotit veya amino asit sekanslarinin kaydedildigi örneklerde mevcut açiklamanin, kaydedilen sekanslarla ayni islevselligi hale koruyan hoinolog sekanslari kapsadigi anlasilacaktir.

Açiklainanin bir düzeneginde bu tür sekanslar, en az %85 homologtur.

Bir baska düzenekte bu tür sekanslar, en az %90 homologtur. Yinebaska düzeneklerde bu tür sekanslar, en az %95 homologtur.Iki nükleotit veya amino asit sekansi arasindaki yüzde özdesliginbelirlenmesi, bu konuda uzman kisilerce bilinir.Burada açiklanan nükleik asit sekanslari, örn., asagidaki sekans listesinde açiklananlar, sadece örnektir ve bu konuda uzman bir kisi, sekanslarin farkli yollarla birlestirilebilecegini anlayacaktir.

Açiklamanin ilave düzenekleri, nükleik asitlerin varyantlarini kapsar.

Bir nükleik asidin bir varyanti (örn., kodon optimizasyonu yapilmis bir nükleik asit), SEK.KIM.NO.: 1, SEK.KIM.NO.: 3, SEK.KIM.NO.: , SEK.KIM.NO.: 7, SEK.KIM.NO.: 9, SEK.KIM.NO.: 11, SEK.KIM.NO.: 13, SEK.KIM.NO.: 15, SEK.KIM.NO.: 17,SEKKIMNO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.:SEK.KIM.NOSEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEKKIMNO.: SEK.KIM.NO.:SEKKIMNOSEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.:SEKKIMNO18, 21,38SEKKIMNO.: SEK.KIM.NO.:19, 22,SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: 24, SEK.KIM.NO.: 27, SEK.KIM.NO.: 28 veya20, 23,.: 29'a önemli ölçüde özdes, yani en az %80, %85, %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 veya %995 özdes olabilir. SEK.KIM.NO.: 1, SEK.KIM.NO.: 3, SEK.KIM.NO.: 5,7,13, 18, 21,SEK.KIM.NO.:SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEKKIMNO.:9, , 19, 229SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: 24, SEK.KIM.NO.: 27, SEK.KIM.NO.: 28 veya11, 17, , 23,.: 29 içeren bir sekansin nükleik asit varyantlari arasinda1, 7, 13, 18,213SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.:SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.:SEK.KIM.NO.: 24, SEK.KIM.NO.: 27, SEKKIMNO.: 28 veya19,22,SEK.KIM.NO.:SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.: SEK.KIM.NO.:SEK.KIM.NO.:5, 11, 17, , 23,.: 29 içeren bir sekans veya bunun kisimlarindan birveya daha fazla nükleotitte (örnegin 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175 veya 200 nükleotit) bir ikame, varyasyon,modifikasyon, degistirme, delesyon ve/veya ilave olan nükleik asitleryer alir.Örnegin mevcut açiklamanin bir düzeneginde but tür varyantlararasinda GlcNAc-P-P-Und”u GalNAc-P-P-Und'a dönüstüren birepiinerazi sifreleyen ve i) bir konakçi hücre, örnegin E. 0011 içinde39eksprese edilen ve ii) SEKKIMNO.: l, SEKKIMNO.: 3, SEK.KIM.NO.: 5, SEK.KIM.NO.: 7 veya SEK.KIM.NO.: 9*a öneinliölçüde özdes olan nükleik asitler veya bunlarin kisimlari yer alir.Burada tarif edilen nükleik aitler arasinda rekombinant DNA ve sentetik (öm., kimyasal olarak sentezlenmis) DNA yer alir. Nükleik asitler, çift iplikçikli veya tek iplikçikli olabilir. Tek iplikçikli nükleik asitlerin durumunda nükleik asit, bir sens iplikçik veya antisens iplikçik olabilir. Nükleik asitler, oligonükleotit analoglari veyatürevleri kullanilarak sentezlenebilir,Burada tarif edilen bir nükleik asidi içeren plazmidler, ekspresyon için konakçi hücreler içerisine transfekte veya transforme edilebilir.

Transfeksiyon ve transformasyon teknikleri, bu konuda uzmankisilerce bilinir.Burada kullanildigi gibi "veya" teriminin, uygun oldugunda birlestirilebilen alternatifleri isaret ettigi anlasilacaktir, yani "veya" terimi, siralanan her bir alternatifi ayri ayri ve ayrica birlesik olarak kapsar. Burada kullanildigi gibi, metin açikça aksini gerektirinedigi sürece, tekil, örn., "bir" ve "bu" gibi tekil formlara göndermeler,çogulu da kapsar ve çogula göndermeler, tekili de kapsar.Bulus ayrica mevcut bulusa ait koinpozisyonlari ve yöntemleri ve ayrica bunun faydasini daha iyi açiklayan asagidaki örneklere gönderme yapilarak daha iyi tanimlanacaktir. Bu konuda uzman kisiler için hem kompozisyonlar hem de yöntemlere yönelik, bulusunkapsaminda yer alan modifikasyonlarin yapilabilecegi açik olacaktir.Örnekler40Bakteriyel Suslar ve Plazmidler- E. coli suslari PR4019 (Rush, J . S., Rick, P. D. ve Waechter, C. J. (1997) Glycobiology, 7, 315-322) ve PR21546 (Meier-Dieter, U., Starman, R., Barr, K., Mayer, H. ve Rick, P. D. (1990) J. Biol. Chem., 265, 13490-13497), Dr. Paul Rick, Bethesda, MD”den cömert hediyelerdi ve E. coli 0157:H45 (Stephan, R., Borel, N., Zweifel, C, Blanco, M. ve Blanco, J.E. (2004) BMC Microbiol 4:10), Dr. Claudio Zweifel, Veterinerlik Enstitüsü, ZürihUniversitesi°nden hediye idi. E. coli H50r (Invitrogen), klonlamadeneyleri ve protein glikosilasyon analizi için konakçi olarakkullanildi. Kullanilan plazmidler, Tablo 2'de gösterilmistir. TABLO 2 Ömeklerde kullanilan plazmidler Plazinid Açiklama Ref. pMLBAD Klonlama vektörü, TmpR Lefebre & Valvano (2002) pMLBAD:Z3206 PMLBAD içinde Z3206, TmpR, Buradaki Örnekler (SEK.KIM.NO.: 23) arabinoz ile indi'ikleiiebilir promoter tarafindan kontrol edilen ekspresyon pMLBAD:gne PMLBAD içinde gne, TinpR, arabinoz Buradaki Örnekler (SEK.KIM.NO.: 24) ile ind'ûklenebilir proinoter tarafindan kontrol edilen ekspresyon pACYCpgl C. jejuni pgl kümesi CmR Wacker ve arkadaslari (2002) pACYane::kan gne içinde bir kan kaseti içeren C. je juiii Linton ve arkadaslari pgl kümesi, CmR, KanR (2005) pWA2 pBR322 içinde Tet promoterinin Feldmanve kontrolü altinda çözülebilir periplazmik arkadaslari (2005) heksa-His takili AcrA, AmpR 41Materyaller- [1,6-3H]GlcNAc (30 Ci/mmol), UDP-[l-3H]GlcNAc (20 Ci/mmol) ve UDP-[6-3H]GalNAc (20 Ci/mmol), American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO)”dan elde edildi. Quantum l silika jel G ince tabaka plaklari, Quantum Industries (Fairfield, NJ) ürünüdür ve Baker Si250 Silika `Tel G plakalari, Mallinckrodt Chemical Works tarafindan üretilir. Maya özütü ve Bakto-pepton, BD Biosciences ürünleriydi. Diger bütün kimyasallar, standart ticari kaynaklardan elde edildi. TrimetOprim (50 ;lg/ml), kloramfenikol (20 tig/ml), ampisilin (100 tig/ml) ve kanamisin (50 g ml), gerektigindeortamlara ilave edildi.Rekombinant Plazmidin Yapilandirilmasi- E. coli susu DH5a, DNA klonlama deneylerinde kullanildi ve yapilandirilmis plazmidler, DNA sekanslama yoluyla dogrulandi. 23206 geni, Z3206-Fw ve Z3206- RVHA oligonükleotitleri (AAACCCGGGATGAACGATAACG TTTTGCTC (SEK.KIM.NO.: 17) ve AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACT CAGAAACAA ACGTTATGTC (SEK.KIM.NO.: 18); kisitlama sahalarinin alti çizilidir) ile PCR yoluyla E. coli 0157:H45°ten amplifiye edildi. PCR fragmani, Smal ve Xbal ile dijest edildi ve Smal-Xbal klivaj edilmis pMLBAD vektörü içerisine ligasyon yapildi (Lefebre, M. D. ve Valvano M. A. (2002) Appl Environ Microbiol 68: 5956-5964). Bu, C terminalinde hemaglutinin takisi olan 23206,yi sifreleyen pMLBAD:Z3206 plazmidi (SEK.KIM.NO.: 23) ilesonuçlandi.gne geni, gne-FW ve gne-RV oligonükleotitleri (AAACCATGGATGAAAATTCTTATTAGCGG (S EK. KIM . NO.:4219) ve AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGC ACTGTTTTTC CCAATC (SEK.KIM.NO.: 20); kisitlama sahalarinin alti çizilidir) ile Campylobacter jejuni pgl kümesini sifreleyen pACYCng”dan amplifiye edildi (Wacker, M., Linton, D., Hitchen, P.G., Nita-Lazar, M., Haslam, S.M., North, S.J., Panico, M., Morris, H.R., Dell, A., Wrenn, B.W., Aebi, M. (2002) Science 298, 1790- 1793). PCR ürünü, N00] ve Xbal ile dijest edildi ve pMLBAD”nin bazi sahalariiia ligasyon yapilarak C terminaliiide hemaglutinin olan Gne°yi sifreleyen pMLBAngne plazmidi (SEK.KIM.NO.: 24) üretildi (Tablo 2).Büyüme Kosullari, Protein Ekspresyonu ve Immüno-saptama- E. coli suslari, Luria-Bertani ortainiiida (%1 maya özütü, %2 Bakto-pepton, %06 NaCl) 37°C 'de kuvvetli çalkalama ile kültürlendi. Arabinoz ile indüklenebilir ekspresyona, A600 0.05-0.4”e kadar büyütülmüs E. coli hücrelerine %0.02-%0.2 (a/h)”1ik nihai konsantrasyonda arabinoz ilave edilerek ulasildi. Indüklemeden 5 saat sonra tekrar ayni miktardaarabinoz ilave edildi ve inkübasyon, 4-15 saat sürdürüldü.Analitik Prosedürler- Protein konsantrasyonlari, membran proteinlerinin Pierce Biotechnology bülteni "BCA Protein Deneyi için Müdahaleci Maddelerin Omeklerden Elimine edilmesi"ne göre deoksikolat ve trikloroasetik asit ile çökeltilmesinden sonra BCA protein deneyi (Pierce) kullanilarak belirlendi. Örnekler, 0.5 ml %1 SDS ve 4 m1 Econosafe Ekonomik Biyo-degrade olabilir Sayim Karisimi (Research Products Intemational, Corp., Mount PrOSpect, IL)ilave edildikten sonra bir Packard Tri-Carb 2100 TR sivi sintilasyon43spektrometresinde sintilasyon spektrometrisiyle radyoaktiviteanalizine tabi tutuldu.Örnek 1: GlcNAc-P-P-Und 4-Epimerazini Sifreleyen bir E. coli 0157 Geninin TanimlanmasiBiz burada GalNAc-P-P-Und°un, bir 4-epimerazin önceden bilinmeyen etkisinin katalize ettigi GlcNAc-P-P-Und”a ait 4-OH°nin epimerizasyonuyla olusturuldu yeiii bir biyosentetik yolagin sasirtici kesfini açiklamaktayiz. Bu yolakta GlcNAc-P-P-Und, GlcNAc-Psnin UDP-GlCNAdden, WecAsnin katalizinde transfer edilmesi yoluyla olusturulur ve sonra GlcNAc-P-P-Und, GaINAc-P-P-Und°a GlcNAc- P-P-Und-4-epimerazi tarafindan epimerize edilir ki bu, 'Öncedenbilinmeyen bir yolakti (SEKIL 2).Bir GlcNAc-P-P-Und 4-epimeraz adayini sifreleyen gen, DNA homoloji arastirmalariyla tanimlandi. Homoloji arastirmalari, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.”de bulunan ABD Ulusal Ilaç veritabanlari Kütüphanesi kullanilarak yapildi. Indirgeyici terminalinde bir GalNAc olan 0 anti jen tekrar ünitelerini sifreleyen farkli bakterilerin genomik sekanslari tarandi. Indirgeyici terininalinde bir GalNAc olan bir grup ve tekrar ünitesinde bir terminal GalNAc olmayan ikinci bir grup karsilastirilarak potansiyel epimerazlar tanimlandi. Bu kriterler kullanilarak 23206, bir aday GlcNAc-P-P-Und 4-epimeraz olarak tanimlandi (Tablo 1).O-antijen tekrar ünitelerinde GalNAc olan E. coli suslari içinde mevcut GlcNAc 4-epimeraz genleri, Tablo lsde gösterildigi gibi ikihomoloji grubuna ayrilabilir. Sasirtici sekilde bir homoloji grubunun44(gnel içeren) açikça O-antijen tekrar ünitesi üzerinde baslatici seker olarak GalNAc varligi ile iliskili oldugu kesfedildi. Yine sasirtici sekilde ikinci grubun (gnel içeren), UDP-Glc epimeraz olan GalE”ye yüksek derecede bir benzerlik gösterdigi ve O-antijen tekrar ünitesi sentezini GalNAc ile baslatmayaii E. coli suslarinda bulundugu da kesfedildi. Gnel°e yüksek derecede bit homoloji gösteren E. coli 0157'deki Z3206, bir aday GlcNAc-P-P-Und 4-epimeraz olarak tanimlandi. Z3206 geiiinin genomik lokasyonu, bu yolaktaki bir rol ile tutarlidir çünkü bu, O-antijen kümesine ait galF ile kolanik asitkümesine ait wcaM arasinda yer alir.Örnek 2-1 l°de tarif edilen arastirma da, GlcNAc 4-epimerazin (E. coli 0157 23206), GalNAc-P-P-Und olusumunu katalize edici olarak tanimlanmasi dahil olmak üzere yukaridaki kesifleri dogrular.Ornek 2: UDP-GalNAC, E. coli WecA (GlcNAc-fosfotransferaz) için bir Substrat DegildirE. coli WecAsnin UDP-GalNAc”den GalNAc-P-P-Und olusturmak için bir GalNAc-P donörü olarak faydalanip faydalanmayacagini belirlemek için E. coli suslari [(12, PR4019, bir WecA asiri eksprese edici sus ve 01573den, indirgeyici terminalinde GalNAc olan bir tetrasakarid O-antijen tekrar ünitesini, tahminen GalNAc-P-P-Und”unsenteziyle baslayarak sentezleyen membran fraksiyonlari, UDP-[3H]Ga1NAc ile inkübe edildi.E. coli membraniniii preparasyonu- Bakteri hücreleri, 10 dakika süreyle 1,000Xg”de santritüjleme yoluyla toplandi, bir kez buzla sogutulmus fosfat tamponlu tuz içinde, bir kez soguk su ile ve bir kezde 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.25 M sukroz ile yikandi. Hücreler, 1045mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.25 M sukroz, 0.2 mg/ml lizozini içeren 10 mM EDTA içinde ~200 A600 birim/mlilik bir yogunluga kadar yeniden süspanse edildi ve 30°C”de 30 dakika süreyle inkübe edildi.

Bakteri hücreleri, 10 dakika süreyle 1,000Xg”de santrifüjleme yoluyla geri kazanildi, 40 hacim buzla sogutulmus 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 içinde çabucak yeniden süspanse edildi ve buz üzerin konuldu. 10 dakika sonra hücreler, siki oturan bir Dounce homojeiilestirici ile 15 vurusla homojenlestirildi ve 0.1 mM fenilmetilsülfonil florid ve sukroz ile 0.25 M°lik nihai bir konsantrasyona kadar desteklendi.

Kirilmamis hücreler, 10 dakika süreyle 1,000xg”de santrifüjleme yapilarak çikarildi ve hücre kiliflari, 20 dakika süreyle 40,000xg°de santrifüjleme yapilarak geri kazanildi. Membran fraksiyonu, 10 HM Tris-HCl, pH 7.4, 0.25 M sukroz, 1 mM EDTA içinde yeniden süspanse edildi ve yine 40,000 xg”de çökeltildi ve ayni tampon içinde ~20 mg/ml°lik bir protein konsantrasyonuna kadar yeniden süspanse edildi. Meinbran fraksiyonlari, gerekli olana kadar -20°C°de depolandi.[3H]GlcNAc-P-P-Uiid ve [3H]GalNAc-P-P-Und°un E. coli Meinbranlari içinde In Vitro Biyosentez Deneyi- GlcNAc-P-P-Und ve GalNAc-P-P-Und°un sentezi için reaksiyon karisimlari, 0.05 ml°lik toplam hacimde 50 mM Tris-HCl, pH 8, 40 mM MgClz, 5 mM ditiyotreitol, 5 mM 5'AMP, E. coli membran fraksiyonu (50-200 ug membran proteini) ve 5 uM UDP-[3H]GlcNAC/GalNAC (500-2500 dpm/pmol) içeriyordu. 37°C°de inkübe edildikten sonra reaksiyonlar, 40 haciin CHCl3/CH3OH (221) ilave edilerek sonlandirildi ve [H]HexNAc-P-P-undekaprenoller içeren toplam lipit özütü, daha46önceden tarif edildigi gibi hazirlandi (Waechter, C. J., Kennedy, J. L. ve Harford, J. B. (1976) Arch. Biochem. Biophys. 174, 726-737).

Bölündükten sonra organik faz, bir nitro jen akisi altinda kurutuldu ve 1 m1 CHCl3/CH3OH (2: l) içinde yeniden çözündürüldü ve bir bölüntü (0.2 ml) çikarildi, bir sintilasyon sisesi içiiide kurutuldu ve bir Packard Tri-Carb 2100 TR sivi sintilasyon spektrometresinde sivi sintilasyon spektrometrisiyle radyoaktivite analizine tabi tutuldu. [3H]G1cNAc-P- P-Und veya [3H]GalNAc-P-P-Und,un sentez oranini belirlemek için lipit özütü, bir nitrojen akisi altinda kurutuldu, küçük hacimde CHClg/CH3OH (2:l) içinde yeniden çözündürüldü ve 10 X 20-cm”lik boratla emprenye edilmis bir Baker Si250 silika jel plakasi üzerine beneklendi ve plaka, CHCl3, CH3OH, HZO, 0.2 M sodyum borat (65:25:22) ile gelistirildi.

Ayri ayri glikolipitler, bir Bioscan AR2000 Görüntülü Tarayici (Bioscan, Washington, D.C) ile saptandi. Her bir glikolipit için biyosentetik oranlar, [3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und”daki toplam radyoaktivite miktarinin ayri ayri [3 H] glikolipitlerin yüzdesi ileçarpilmasi suretiyle hesaplandi.Farkli E. coli suslarindan (K12, PR4019 ve 0157) membran fraksiyonlari, UDP-[3H]GlcNAc yada UDP-[3H]GalNAc ile inkübe edildi ve [3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und içerisine dahil olma, yukarida tarif edildigi gibi belirleiidi. Tablo 3°te görüldügü gibi, UDP- [3H]GalNAc ile inkübasyon sonrasinda hiçbir etiketli glikolipit saptanmadi; membran fraksiyonlarinin UDP-[3H]GlcNAc ile inkübe edildigi durumda sadece GlcNAc-P-P-Und saptanabildi.47TABLO 3 [H]GlcNAc/GalNAc-P-P-undekaprenolün E. coli membran fraksiyonlari içinde substrat olarak UDP-[3H]GICNAC yada UDP- [3H]Ga1NAc kullanilarak sentezi Membran Ilave edilen seker Olusan [3H]Glikolipitkaynagi nükleotit GlcNAc-P-P- GalNAc-P-P- Und Und (pmol/mg) (pmol/mg)K12 UDP-[3H]GlcNAc 6.4 <0.01Kl2 UDP-[3H]GalNAc <0.01 <0.01PR4019 UDP-[3H]GlcNAc 44 <0.01PR4019 UDP-[3H]GalNAc <0.01 <0.010157 UDP-[3H]GlcNAc 1.5 0.50157 UDP-[3H]GalNAc <0.01 <0.01 Ayrica WecA9yi asiri eksprese eden sus olan PR4019'dan membranlar ile inkübasyonlara ne eksogen Und-P ilavesi ne de 0157 hücrelerinden sitosolik fraksiyonlarin ilavesi, UDP-GalNAc'den GalNAc-P-P-Und olusmasina yol açti. Bu sonuçlar, UDP-GalNAdnin, WecA için bir substrat olmadigini ortaya koyar ve GalNAc-P-P-UndSun, alternatifbir mekanizmayla olusturuldugunu isaret eder.Sus K129den membranlarin, UDP-[3H]GlcNAc ile inkübe edildigi durumda [BH]GlcNAc-P-P-Und, beklenen sekilde sentezlendi (Rush, J. S., Rick, P. D. ve Waechter, C. J. (1997) Glycobiology, 7, 315-322).

Bununla birlikte sus 0157°den membranlarin UDP-[H]GlcNAc ile inkübe edildigi durumda [3H]GlcNAc-P-P-Und9a ek olarak 48[3H]GalNAc-P-P-Und (asagi bakiniz) oldugu gösterilen ikinci etiketlenmis bir lipit de gözlendi. Iki glikolipidin olustugu zaman süreci incelendiginde [3H]G10NAc-P-P-Und,a radyoaktivite dahli (SEKIL 1, O), bir öncü-ürün iliskisiyle uyuinlu biçimde (SEKIL 2) [3H]Ga1NAc-P-P-Und°a (SEKIL 1, -) oldugundan çok daha çabuk ve daha yüksek bir ölçüde meydana geldi.E. coli 0157 membranlarinin, GalNAc-P-P-Und sentezinde bir GalNAc-P donörü olarak UDP-GalNAc°den faydalanmadigi gözlemi, SEKIL 2'de gösterilen GalNAc-P-P-Und'un olusmasi için olan biyosentetik yolagi dogrulayan bir örnektir. Bu semada GlcNAc-P-P- Und, GlcNAc-Panin UDP-GlcNAc'den WecA katalizinde transfer edilmesi suretiyle olusturulur ve sonra GlcNAc-P-P-Und, daha önceleri bilinmeyen bir 4-epimerazin GalNAc-P-P-Und üretme amaçliaktivitesiyle epimerize edilir.Ornek 3: E. coli Sulu 01573den Meinbran Fraksiyonlari ile 111 Vitro Olusturulan [3H]GalNAc-P-P-Und”un KarakterizasyonuSEKIL 1'de saptanan ilave 0157”ye özel glikolipit ürünü ile tutarli sekilde GalNAc-P-P-Und olarak bu, hafif alkalin metabolizine (tolüen/metanol 1:3, 0.1 N KOH içerir, 0°C, 60 dak.) dayanikliydi, DEAE-selüloz tarafindan CHCl3/CH3OH/HZO (10:10:3) içinde dengede tutuldu ve daha önceden [3H]GlcNAc,_2-P-P-D01 için bildirildigi gibi (Waechter, C. J. ve Harford, J. B. (1977) Arch.

Biochem. Biophys. 181, 185-198) 20 mM amonyum asetat içeren CHC13/CH30H/H20 (10: 1023) ile elüte edildi.[3H]GalNAc-P-P-Und, [3H]GlcNAc-P-P-Und°dan, boratla emprenye49edilmis silika jel G üzerinde ince katman kromatografisi yoluyla açikça ayristirildi (Kean, E. L. (1966) J. Lipid Res. 7, 449-452) ve SEKIL 3A ve SEKIL 3B”de gösterildigi gibi preparatif TLC yoluyla saflastirildi.Boratla empreiiye edilmis ince Katman Plakalari ve Whatman No. 1 Kagidin Preparasyonu- Silika jel ince katmanli plakalari, plakalarin Kean (Kean, E. L. (1966) J. Lipid Res. 7, 449-452) tarafindan tarif edildigi gibi %95 metanol içinde %25 Na2B4C«7 10 HZO içine kisa bir süre daldirilmasi suretiyle sodsnim borat ile emprenye edildi. Borat ile emprenye edilmis TLC plakalari, oda sicakliginda bir gece süreyle kurutuldu ve Drierite üzerinde vakumlu bir desikatör içinde kullanilana kadar depolandi. Kromatografiden kisa bir süre önce plakalar, 100°C”ye kadar kisa bir süre (~10-15 dak.) isitilarak aktiflestirildi. Whatman No. 1 kagit, 20 X 30 cm,lik Whatman 1 kagit yapraklarinin 0.2 M Nazß 07 10 HZO içine batirilmasi suretiyle sodyum borat ile emprenye edildi. Whatman No. 1 kagit yapraklari, iki adet Whatman No. 3MM kagit yapragi arasinda sikica preslendi ve Cardini ve Leloir tarafindan tarif edildigi gibi (Cardini, C. E. and Leloir, L. F. (1957) J. Biol.

Chem. 225, 317-324) oda sicakliginda birkaç gün süreyle kurumaya birakildi.In Vitro Reaksiyonlarda Olusan Glikan Ürünlerinin Karakterizasyonu- Ayri ayri glikolipitlerin ([3H]GalNAc-P-P-Und ve [3H]GlcNAc-P-P- Und) glikanlari, hafif asit hidroliziyle salindiktan sonra azalan kagit kromatografisiyle karakterize edildi. GlcNAc/GalNAc lipitleri, koni seklinde Vidali kapakli bir tüp içinde bir nitrojen akisi altinda50kurutuldu ve 0.2 ml 0.01 M HCl içinde 15 dakika süreyle 100°C”ye kadar isitildi. Hidroliz sonrasinda örnekler, 0.4 ml of AG50WX8 (H+) ve 0.4 ml AG lX8 (asetat form) içeren 0.8 ml31ik bir karisik yatakli iyon degistirme kolonuna uygulandi ve 1.5 ml su ile elüte edildi.

Elüat, bir nitro jen akisi altinda kurutuldu, küçük hacimde HZO (0.02 ml) içinde yeniden çözündürüldü, boratla einprenye edilinis 30 cin°1ik bir Whatman No. 1 kagit seridi üzerine beneklendi ve azalan modda butanol/piridin/su (6:43) ile 40-50 saat süreyle gelistirildi.

Kurutulduktan sonra kagit seritler, 1cm”lik alanlar halinde kesildi ve sintilasyon spektrometrisiyle radyoaktivite analizine tabi tutuldu.

GlcNAc ve GalNAc standartlari, bir anilin-difenilamin daldirma reaktifi (Schwimmer, S. ve Benvenue, A. (1956) Science 123, 543- 544) kullanilarak saptandi.Glikan ürünleri, yukarida tarif edildigi gibi hafif asit hidrolizini takiben 0.1M NaOH içinde 01 M NaBttt (nihai hacim 0.1 ml) ile indirgeme yapilarak kendi ilgili alditollerine dönüstürüldü. Oda sicakliginda bir gece süreyle inkübe edildikten sonra reaksiyonlar, birkaç dainla glasiye asetik asit ile söndürüldü ve 1 dainla asetik asit içeren metanolden bir nitrojen akisi altinda birkaç kez kurutuldu.

Alditoller, su içinde çözündürüldü, 0.5 ml'lik AG50WX8 (H+) ve AG 1X8 (asetat) kolonlari üzerinden geçirilerek tuzu giderildi, nitrojen altinda kurutuldu ve 30 cm”lik Whatman No. 3MM kagit seritleri üzerine beneklendi. Whatman No. 3 MM seritleri, bir gece süreyle azalan modda etil asetat, piridin, 0.1 M borik asit (65:25:20) ile gelistirildi, kurutuldu, l cm”lik alanlar halinde kesildi ve sintilasyon Spektrometrisiyle radyoaktivite analizi yapildi. GlcNAcitol veGalNAcitol standartlari, periodat-benzidin daldirma prosedürünün bir51modifikasyonu kullamlarak görsellestirildi (Gordon, H. T., Thornburg, W. ve Werum, L. N. (1956) Anal. Chein. 28, 849-855). Kagit seritler, aseton, 0.1 M NaIO4 (9525) içerisine daldirildi, 3 dakika süreyle havayla kurumaya birakildi ve sonra aseton/asetik asit/HZO/o-tolidin (96:0.6:4.4:0.2 gm) içine daldirildi. m-dioller içeren alditoller, mavibir arka plan üzerini sari benekler halinde boyar.Glikolipitlerin Kütle Spektrometrisi ("MS")- Saflastirilmis glikolipitler, bir ABI Turbo V elektrosprey iyon-kaynagi (ABI/MDS- Sciex, Toronto, Kanada) olan bir ABI/MDS Sciex 4000 Q-Trap hibrid üçlü dört kutuplu lineer iyon tuzakli kütle spektrometresi kullanilarak analiz edildi. Kisaca örnekler, deney yoluyla belirlenmis iyon kaynagi ayarlari ile dakikada 10u olacak sekilde infüze edildi ve MS/MS (ikinci bir boyutta kütle spektroskopisi) bilgileri, moleküler iyonunlineer iyon tuzagi modunda parçalara ayrilmasi suretiyle elde edildi.Glikolipidin hafif asit (0.01 N HCl, 100°C, 15 dakika) ile isleme tabi tutuldugu durumda suyla çözülebilir ürün, boratla einprenye edilmis Whatman No. 1 kagitli azalan kagit kromatografisi üzerinde [3H]GalNAc ile birlikte kromatografiye tabi tutuldu (SEKIL 3C). Ek olarak etiketli sekerin indirgendigi durumunda bu, [BH]alditol, GalNAc-OHsye dönüstürüldü (SEKIL 3D). Ayrica negatif-iyon MS analizi, GalNAc-P-P-Und için beklenen sekilde m/z = 1128°de [M-H]- iyon verdi ve MS/MS yavru iyon spektrumu, P-P-Und içeren bir glikolipit için beklenen sekilde m/z=907”de öne çikan bir iyon gösterdi (Guan, Z., Breazeale, S. D. ve Raetz, C. R. (2005) Anal.

Biochem. 345, 336-339). Sus 0157 tarafindan olusturulan glikolipitürününün GalNAc-P-P-Und olarak tanimlanmasi ayrica bunun52eksogen GlcNAc-P-P-Und°dan olusumuyla da desteklenir (bakiniz Ornek 7).Ornek 4: [3H]GalNAc-P-P-Und,un Z3206 Genini Eksprese eden E. coli Hücreleri içinde [3H]GlcNAc ile Metabolik Etiketlenmesi (in vivo)E. coli 0157 23206 geninin ekspresyonunun, hücrelerin GalNAc-P-P- Und sentezlemesini saglayip saglamadigini arastirmak için Z3206 genini eksprese eden E. coli susu 21546 (Meier-Dieter, U., Starman, R., Barr, K., Mayer, H. ve Rick, P. D. (1990) J. Biol. Chem., 265, 13490- 13497), [JH]GlcNAc ile metabolik olarak etiketlendi ve [3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und olusumu bakimindan analiz edildi.Bakteri Hücrelerinin Metabolik Etiketlenmesi- E. coli hücreleri, 37°C”de Luria-Bertani ortaminda kuvvetli çalkalama ile bir A 00 01' 0.5-1 ,e kadar kültürlendi.l uCi/mHIk nihai bir konsantrasyona kadar [3H]GlCNAc ilave edildi ve inkübasyon, 37°C ”de 5 dakika sürdürüldü. Glikolipitler içine radyoetiket dahil edilmesine, 0.5 gm/ml kirilmis buz ilave edilerek son verildi ve kültürler iyice karistirildi. Bakteri hücreleri, 4000xg°de 10 dakika süreyle santriiüjleme yapilarak geri kazanildi ve süpematan iskartaya çikarildi. Hücreler, buzla sogutulmus fosfat tamponlu tuz ile iki kez yikandi, 10 hacim (hücre peleti) metanol içinde kuvvetli vorteks karistirmasi yapilarak yeniden süspanse edildi ve %40 tam güçte problu bir sonikleyici ile kisa bir süre soniklendi. Sonikleme sonrasinda 20 haciin kloroform ilave edildi ve özütler, kuvvetli sekilde karistirildi ve oda sicakliginda 15 dakika süreyle beklemeye birakildi.Çözülmeyen materyal, santrifüjleme yoluyla çökeltildi ve pelet, küçük53hacimde CHCl^CHsOH (2:1) ile iki kez yeniden özümlendi.

Birlestirilen organik özetler daha sonra asagida açiklandigi gibiislemden geçirildi.GlcNAc-P-P-Und ve GalNAc-P-P-Und”un Saflastirilmasi- GlcNAc/GalNAc-P-P-Und, CHC13/CH3OH (2: 1) ile özümlendi ve bir yerde tarif edildigi gibi bölümlere ayrilarak suyla çözülebilir materyalden kurtarildi (Waechter, C. J., Kennedy, J. L. ve Harford, J.

B. (1976) Arch. Biochem. Biophys. 174, 726-737). Organik özüt daha sonra bir nitrojen akisi altinda kurutuldu ve gliserofosfolipit yigini, 60 dakika süreyle 0°C”de 0.1N KOH içeren tolüen/metanol (123) içinde deasile edilerek imha edildi. Deasilasyon reaksiyonu, asetik asit ile nötralize edildi, 4 hacim CHCi CH^H (2: 1) ile seyreltildi ve 1/5 hacim %0.9 NaCl ile yikandi. Organik (alt) faz, 1/3 hacim CHC13, CH3OH, %09 NaCl (3:48:47) ile yikaiidi ve sulu faz iskartaya çikarildi. Organik faz, organik faz içinde rezidual sulu fazi barindirmak için yeterli inetanol ile seyreltildi ve CHCl3/CH30H (2: 1) ile dengelenmis bir DEAE-selüloz kolonuna (5 m1) uygulandi. Kolon, kolon hacminde CHC13/CH3OH HZO (10:10:3) ile yikandi ve 20 mM ainonyumasetat içeren CHC13/CH30H/H20 (10:10:3) ile el'ûte edildi. Fraksiyonlar (2 ml) toplandi ve radyoaktivite bakimindan yada boratla emprenye edilmis silika plakalari üzerinde ince katman kromatografisiyle ayristirildiktan sonra (daha önce tarif edildigi gibi) GlcNAc/GalNAc-P-P-Und bakimindan bir anisaldehid püskürtme reaktifi (Dunphy, P. J., Kerr, J. D., Pennock, J. F., Whittle, K. J. ve Feeney, J. (1967) Biochim. Biophys. Acta 136, 136-147) kullanilarakizlendi.54E. coli susu 21546, Z3206 ekspresyon çalismalarinda konakçi olarak seçildi çünkü UDP-ManNAcA sentezindeki bir mutasyon, GlcNAc-P- P-Und°un, eiidobakteriyel ortak anti jeiiin sentezinde kullanilmasinda bir engel yaratir. E. coli 21546, E. coli K12”den türetildigi için bu, bir O-antijen tekrarini sentezlemez (Stevenson, G., Neal, B., Liu, D., Hobbs, M., Packer, N. H., Batley, M., Redniond, J . W., Lindquist, L. ve Reeves, P. (1994) J. Bacteriol., 176, 4144-4156) ve böylece GalNAc-P-P-Und,a dönüstürülmek için daha büyük miktarlarda GlcNAc-P-P-Und birikir. 21546 susu ve Z3206 genini eksprese eden transformant, [3H]GlcNAc ile etiketlendi ve radyo-etiketli lipitler, boratla emprenye edilmis silika jel plakalari 'uzerinde ince katman kromatografisiyle analiz edildi, ana sus (SEKIL 4A), sadece bir adet etiketli lipit,GlcNAc-P-P-Und”u sentezledi. Bununla birlikte Z3206 geniiii eksprese eden 21546 hücreleri (SEKIL 4B) ayrica GalNAc-P-P-Und oldugu gösterilen ilave bir etiketli lipidi de sentezledi.Ornek 5: Z3206 Genini EkSprese eden E. coli Hücrelerinden Membran Fraksiyonlari GalNAc-P-P-Und”u In Vitro SentezlerE. coli 0157 Z3206 geni tarafindan sifrelenen proteinin, GalNAc-P-P- Und”un sentezini katalize ettigini dogrulamak için Z3206 genini eksprese eden E. coli hücrelerinden membran fraksiyonlari, [3H]UDP- GlcNAc ile ink'ûbe edildi ve [3H]glikolipit ürünleri, SEKIL 5°te gösterildigi gibi boratla emprenye edilmis silika jel plakalari üzerinde ince katman kromatografisiyle analiz edildi (kromatografik preparasyoii ve karakterizasyon yöntemleri, Ornek 3”te açiklanmistir).

E. coli K12 veya konakçi sus E. coli 21546 hücrelerinden membran fraksiyonlarinin UDP-[3H]GlcNAc ile inkübe edildigi durumda sadece [3H]GlcNAc-P-P-Und gözlendi (SEKIL 5A ve SEKIL 5C). Bununla55birlikte Z3206°yi eksprese eden E. coli 0157 ve E. coli 2'1546”dan membran fraksiyonlari, GalNAc-P-P-Und da olusturdu (SEKIL 5B ve SEKIL 5D).Örnek 6: GlcNAc-P-P-Und Degil UMP Varliginda GalNAc-P-P- Und°un Olusumu Tersine çevrilirGalNAc-P-P-Und”un, bir glikosil donörü olarak UDP-GalNAc kullanilarak WecA etkisiyle degil GlcNAc-P-P-Und'dan sentezlendigine dair ilave kanit suninak için endogen, önceden etiketlenmis [3H]GlcNAc-P-P-Und ve UMP”li [3H]GalNAc-P-P- Und.”un bosaltilmasinin etkisi incelendi. WecA,nin katalize ettigi GlcNAc-fosfotransferaz reaksiyonu, UDP-GlcNAc”yi yeniden sentezleyen ve Und-P salan fazladan UMP ilavesiyle serbestçe tersineçevrilebilir.Bu deneyde Z3206”yi eksprese eden E. coli susu 21546'dan ineinbran fraksiyonlari, 10 dakika süreyle önceden UDP-[3H]GlcNAc ile etiketlendikten sonra 1 mM UMP ilave edildi ve geriye kalan etiketli her bir glikolipidin miktari belirlendi. SEKIL 6A”da gösterilen sonuçlar, 10 dakikalik etiketleme periyodunun sonunda [3H]GlcNAc- P-P-Und ve [3H]GalNAc-P-P-Und”un göreli miktarlarini gösterir. 1 dakika süreyle l mM UMP ile inkübasyon sonrasinda [3H]GlcNAe-P- P-Und°da önemli bir kayip oldugu görülebilirken [3H]GalNAc-P-P- Und piki, nispeten degismez (SEKIL 6B) (kromatografik preparasyon ve karakterizasyon yöntemleri, Ornek 5”te açiklanmistir). Bu gözlem, WecA'nin, GalNAc-P°nin UDP-GalNAcSden GalNAc-P-P-Und içerisine transferini katalize etmedigini isaret eden Tablo 3”tekisonuçlarla tutarlidir. UMP ile inkübasyonun ikinci dakikasinda56(SEKIL 6C) GlcNAc-P-P-Und kaybinin yavaslamasi ve [3H]GalNAc- P-P-Und pikinde hafif bir düsüs olmasi dikkate degerdir ki bu, [3 H] GalNAc-P-P-Und”un, epimeraz reaksiyonunun tersine çevrilmesiyle [3H]GlcNAc-P-P-Und havuzu ile yenidendengelendiginin göstergesidir (bakiniz Ornek 7).Örnek 7: Eksogen, Saflastirilmis [3H]GlcNAC-P-P-Und ve Z3206”y1 EkSprese eden E. coli Hücrelerinden Membranlarin Katalize ettigi [3H]GalNAc-P-P-Und,un tercon versiyonuGlCNAc-P-P-Und ve GalNAc-P-P-Undhn Z3260”i eksprese eden E. coli hücrelerinden membran fraksiyonlari tarafindan direkt olarak birbirine dönüstürülebildigine dair dogrudan kanitlar sunmak için saflastirilmis [3H]GlcNAc-P-P-Und ve [3H]GalNAc-P-P-Und,eksogen substratlar olarak test edildi.Saflastirilmis [3H]GlcNAc-P-P-Und/[3H]GalNAc-P-P-Und, Ornek 4”teki gibi hazirlandi (Bakteri Hücrelerinin Metabolik Etiketlenmesi Ve GlcNAc-P-P-Und”un Saflastirilmasi ve GalNAc-P-P-Und)` [3H]HexNAc-P-P-undekaprenoller (2000 dpin/pmol, %1 Triton X-100 içine disperse edilmis, nihai konsantrasyon %01), [3H]G1cNAc-P-P- Und”un ve In Vitro E. coli inembranlari içinde [3H] GalNAc-P-P- Und,un Biyosentezine Yönelik Deneyde Ornek 2°deki gibi E. colimembranlari ile inki'ibe edildi.Onceki deneyler, epimerazin, Triton X-100, CHAPS (3-[(3- ko1amidopropil)dimetilamonyo]-I-propansülfonik asit), Nonidet P-40 veya oktilglukosid içinde disperse edilmis reaksiyon karisimlarinaeksogen [3 H] GlcNAc-P-P-Und ilave edildigi duruinda aktif oldugunu57ve pH optimumunun 7-8.5 araliginda oldugunu gösterdi. Membran fraksiyonu ile ink'ubasyon öncesinde saflastirilmis [3H]GlcNAc-P-P- Und7un ve [3H]GalNAc-P-P-Und7un kromatografik mobilitesi, SEKIL 7A ve SEKIL 7D°de gösterilmistir. SEKIL 7B ve 7G”de görüldügü üzere glikolipitler, E. coli 21546°dan membran fraksiyonlari ile inkübasyondan etkilenmedi. Bununla birlikte saflastirilmis glikolipitlerin Z3206°yi eksprese eden E. coli 215467dan membran fraksiyonlari ile inkübasyonu, eksogen [3H]GlcNAc-P-P-Und”un [3H]GalNAc-P-P-Und,a dönüsümünü (SEKIL 7C) ve [3H]GalNAc-P- P-Und°un [3H]GlcNAc-P-P-Und°a dönüsümünü katalize eder (SEKIL 7F). Bu sonuçlar, GlcNAc-P-P-Und ve GalNAc-P-P-Und”un Z32069y1 eksprese eden E. coli suslar içinde enzimatik olarak birbirinedönüstürülebilecegini direkt olara ortaya koyar.Ornek 8: E. coli 23206, Bir UDP-GlcNAc 4-Epimerazi DegildirZ3206,nin UDP-GalNAc olusumunu katalize edebilip edemeyecegini belirlemek için C. jejuni”den N-glikosilasyon aparati, E. coli içinde eksprese edildi. Bu raportör sistemde hedef protein AcrA°nin glikosilasyonu, pgl konumunun (Waeker, M., Linton, D., Hitchen, P.G., Nita-Lazar, M., Haslam, SM., North, SJ., Panico, M., Morris, HR., Dell, A., Wrenn, B.W., Aebi, M. (2002) Science 298, 1790- 1793), fonksiyonel bir Giie UDP-GlC/UDP-GlcNAc epimerazi dahil olmak 'uzere (Bernatchez, S., Szymanski, CM., Ishiyama, N., Li, J., Jarrell, H.C., Lau, P.C., Berghuis, A.M., Young, N.M., Wakarchuk, W.W. (2005) J. Biol. Chem. 280, 4792-4802) varligina baglidir.

AcrA°nin glikosilasyonu, pgl kümesinin bir gne delesyonu içermesi durumuiida kaybolur (Linton, D., Dorrell, N., Hitchen, P.G., Amber, S., Karlyshev, A.V., Morris, HR., Dell, A., Valvano, M.A., Aebi, M.58ve Wren, B.W. (2005) M0] Microbiol. 55, 1695-1703). Z3206”nin pgl operon Agne varliginda AcrA-glikosilasyonunu geri getirme kabiliyeti, AcrA (pWA2)7nin Gne (pMLBAngne) yada Z32063nin (pMLBADIZ3206) tamamladigi pgl konuinu Agne ile birlikteeksprese edilmesi suretiyle in VIVO arastirildi.Toplam E. coli hücre özütleri, l A600 biriinine denk bir konsantrasyonda hücreler kullanilarak immüno-saptama analizi için hazirlandi; bunlar, 100 ul SDS yükleine tamponu içinde yeniden süspanse edildi (Laeminli, U. (1970) Nature 227, 680-685). 10 |Jl°lik bölüntüler, %10 SDS-PAGE üzerine yüklendi. Periplazmik E. coli özütleri, lizozim islemiyle hazirlandi (Feldman, M.F., Wacker, M., Hernandez, M., Hitchen, P.G., Marolda, CL., Kowarik, M., Morris, H.R., Dell, A., Valvano, M.A., Aebi, M. (2005) Proc Natl Acad Sci ABD 102, 3016-3021) ve nihai örnegin 10 u1”si (0.2 A600 birimi hücreye karsilik gelir), SDS-PAGE yoluyla analiz edildi. Nitroselüloz membran üzerinde blotlandiktan sonra örnek, spesifik antiserum ile immüno-boyandi (Aebi, M., Gassenhuber, J., Doindey, H. ve te Heesen, S. (1996) Glycobiology 6, 439-444). Anti- AcrA (Wacker, M., Linton, D., Hitchen, P.G., Nita-Lazar, M., Haslam, S.M., North, SJ., Panico, M., Morris, H.R., Dell, A., Wrenn, B.W., Aebi, M. (2002) Science 298, 1790-1793) antikorlari kullanildi.

Anti-tavsan IgG-HRP (Bio-Rad), sekonder antikor olarak kullanildi.

Saptama, ECLTM Western blotlaina saptaina reaktifleri (AinershamBiosciences) ile yapildi.SEKIL 8”de gösterildigi gibi glikosile edilmemis formdan daha yavasgöç eden glikosile edilmis protein, sadece pgl konumu Agne'yi59eksprese eden hücrelerin Gne tarafindan tamamlandigi durumda (serit 2) olustu. Z3206, raportör glikoproteinin glikosilasyonunu geri getiremedi (SEKIL 8, serit l). Buna göre Z3206, Gne'ye bagli bir glikosilasyon sisteminde AcrA”nin glikosilasyonunu tamamlamaz.

Gne ve membran baglantili Z3206”nin ekspresyonlari, immüno-saptama yoluyla dogrulandi.Ornek 9: 5. flexneri 6 +/- Z3206 LPS AnaliziSekil 9”da, Shigella flexneri 6 O-antijeninin biyosentezi için gerekli genlerden bazilari gösterilmistir: nükleotit seker öncülerinin biyosentezi için olan enzimleri Sifreleyen genler; glikosiltransferazlari sifreleyen genler; O anti jen isleme proteinlerini sifreleyen genler; ve O-asetilasyondan sorumlu proteinleri sifreleyen genler. O antijenin yapisi, Dmitriev, B.A. ve arkadaslari tarafindan aydinlatilinistir (Dmitriev, B.A. ve arkadaslari Somatic Antigens of Shigella Eur JBiochem, 1979. 98: sayfa 8;Liu B ve arkadaslari Structure and genetics of Shigella O antigens FEMS Microbiology Review, 2008. 32: sayfa 27).Shigella flexneri 6 O-antijenin biyosentezi için gerekli bütün genleritanimlamak için bir genomik kütüphane yapilandirildi.S. flexneri 6 genomik DNA”sinin klonlanmasi_ S. flexneri 6 genoinik DNA°s1, bakterilerden DNA izolasyonuna yönelik protokol izlenerek bir Macherey-Nagel NucleoSpin® Doku Kiti kullanmak suretiyle izole edildi. DNA, her biri 2 ml olmak üzere bes adet S. flexneri 6 gecelik kültüründen izole edildi ve nihai elüsyon, 100 u] elüsyontainponu (5 mM Tris/HCl, pH 8.5) ile yapildi. Elüte edilen60fraksiyonlar havuzda toplandi, izopropanol ile çokeltildi ve nihai pelet, 52 ul TE tamponu içinde yeniden süspanse edilerek bunun toplam hacmi, CopyControlTM Fosmid Kütüphane Uretim Kiti (EPICENTRE) tarafindan verilen protokole göre son onarima tabi tutuldu. Son onarima tabi tutulmus olan DNA, lXTAE tamponu ile %l”lik erime noktasi düsük bir agaroz jel üzerinde saflastirildi, geri kazanildi ve kit protokolünde tarif edildigi gibi etanolle çökeltildi. Çökeltilmis olan DNA, 7 pl TE tamponu içinde yeniden süspanse edildi ki bundan 0.15 ul DNA, EPlCENTRE protokolüne göre pCCIFOS (SEK.KIM.NO.: 27) içerisine ligate edildi. Ligasyon ürününün faj halinde paketlenniesi islemi, protokole göre yapildi ve paketlenmis faj, faj seyreltine tamponu içinde 1:1 oraninda seyreltildi ki bunun 10 ul'si, 'Önceden EPICENTRE tarafindan açiklanan sekilde büyütülmüs olan 100 L!] EP1300-T1 hücresini enfekte etmek için kullanildi. Hücreler, (110 ul), alti kez plaka basina yaklasik olarak 100 koloni ile olmak üzere alti plaka, bütün S. flexneri 6 genomik kütüphanesini içerecek sekilde plakalandi. Plakalar, koloni blotlama yoluyla gelistirildi ve pozitif/negatif koloniler, western blotlamayapildi ve gümüs boyandi.Koloni blotlama_ Koloni blotlari için bir nitroselüloz membrani, kati agar plakasi üzerine yayildi, çikarildi, leBST içinde üç kez yikandi ve ayni sekilde isleme tabi tutuldu. Membran önce oda sicakliginda bir saat süreyle %10 süt içinde bloklandi, ardindan 2 m1 %1 süt (PBST içinde) içerisinde oda sicakliginda bir saat süreyle anti-tip VI antiserumu (primer aiitikor) ile inkübe edildi. Her bir 10 dakika olmaküzere PBST içinde üç yikama sonrasinda membran, 2 ml %1 süt61(PBST içinde) içerisinde 1220000 peroksidaza konjuge edilmis keçi- anti-tavsan IgG'si (BioRad) olan sekonder antikor içinde oda sicakliginda bir saat daha inkübe edildi. PBST ile son üç yikamanin (her biri 10 dakika) ardindan membran, SuperSignal® West Dura Süresi Uzatilmis Substrat Kiti (Thermo Scientific) tarafindan tedarik edilen 1:l°lik bir luminol-peroksid tamponu karisiminin yer aldigi birUVP Chemi Doc Görüntüleme Sisteminde gelistirildi.Bir 5. flexneri 6 genomjk kütüphanesinin üretilmesini takiben S. flexineri 6 antiserumu ile reaksiyona giren klon, daha Önceden Liu ve arkadaslari (Liu ve arkadaslari, 2008) tarafindan sekanslanmis olan bölgeden ayrilan primerin rmlB°den WfbZ”ye ulasmasiyla sekanslandi (SEKIL 9). Prinierler rmlB_reV ve WfbZ_fWd (S. flexneri - 23206), rmlB ve WfbZ halinde tavlandi ve ayri ayri wcaM ve hisI/F°ye ulasilana kadar (S. flexneri + 23206) klon sokmasini sekanslamada kullanildi (SEKIL 10).O anti jen sentezinin, Z3206°dan yoksun (böylelikle und-GlcNAC”nin und-GalNAdye epimerizasyonunun engellendigi) klonlarda muhafaza edilip edilmedigini belirlemek için iki plazmid yapilandirildi (SEK.KIM.NO.. 28 ve SEK.KIM.NO.. 29) (Sekil 10), E. coli hücrelerine transforme edildi ve gümüs boyama ve western blotyoluyla analiz edildi.SEKIL ll'de gösterildigi gibi LPS, E. coli hücreleri + veya -Z3206 içinde üretilir. O antijen, daha düsük bir üretim verimiyle olsa da Z3206 olmadan üretilebilir ki bu durum, epimerazsiz (Z3206)polisakarid üretim verimliliginin daha düsük Oldugunu isaret eder.62Örnek '10: S.flexneri 6 +/- 23206 LLO”nun AnaliziUndekaprenol-PP-O anti jeninin C18 kolon kromatografisiyle saflastirilmasi _ S. flexeneri antijeni +/- Z3206”y1 eksprese eden E. coli hücreleri pelet haline getirildi, 50 ml %09 NaCl içinde bir kez yikandi ve nihai peletler, bir gece süreyle liyofilize edildi. Peletler bir kez 30 ml %85 - 95 metanol içinde yikandi, 10:10:3 kloroform- metanol-su (h/h/h) ile yeniden özümlendi ve özütler, su ilave edilerek iki fazli bir Bligh/Dyer sistemine dönüstürülerek lO:10:9 (C:M:W)”lik bir nihai oran elde edildi. Fazlar, santrifujleme yoluyla ayrildi ve üstteki sulu fazlarin her biri '10 ml metanol ile kosullanmis ve 10 ml 3:48:47 (C:M:W) ile dengelenmis bir C18 Sep-Pak kartus 'üzerine yüklendi. Yüklemenin ardindan kartuslar, 10 ml 3:48:47 (C:M:W) ile yikandi ve 5 ml 10:10:3 (C:M:W) ile eli'ite edildi. 20 0D yükleme örnekleri, devridaimler, yikamalar ve C 18 kolonu elüsyonlari, bir Eppendorf Concentrator Plus içinde kurutuldu, 250 pl metanol ile yikandi, tekrar buharlastirildi ve üç kez daha 30 u] ddH2O ile yikandi.

Glikolipit hidrolizi C 18 kolonu yikamasindan gelen glikolipit örnekleri, kurutulmus örneklerin 2 ml n-propanol:2 M trifloroasetik asit (lzl) içinde çözündürülmesi, 15 dakika süreyle 50°C°ye isitilmasi ve kuruyana kadar N2 altinda buharlastirilmasi suretiyle hidrolizeedildi.2-amin0benzoat ile oligosakarid etiketleme ve HPLC Etiketleme, Bigge ve arkadaslari (Bigge, l995)°e göre yapildi ve glikan teinizleme, Merry ve arkadaslari (2002) (Merry ve arkadaslari, 2002)”de tarif edilen kagit disk yöntemi kullanilarak yapildi. 2-AB etiketli glikanlarin ayrilmasi islemi, Royle ve arkadaslari (Royle,2002)'ye göre ancak üç solventli bir sistem halinde modifiye edildi bir63GlycoSep-N normal fazda kolon kullanilarak HPLC yoluyla gerçeklestirildi. Solvent A, %80 asetonitril içinde 10 mM amonyum format pH 4.4 idi. Solvent B, %40 asetonitril içinde 30 mM amonyum format pH 4.4 idi. Solvent C, %0.5 formik asit idi. Kolon sicakligi, °C idi ve 2-AB etiketli glikanlar, tlöresanla (isx = 330 nm, mi: 420 nm) saptandi.Gradyan kosullari, dakikada 0.4 ml71ik bir akis hizinda 160 dakika zarfinda %100 A ila %100 B, ardindan akis hizi dakikada 1 ml°ye çikarilarak 2 dakika %100 B ila %100 C°den olusan lineer bir gradyandi. Kolon, 5 dakika süreyle %100 C ile yikandi, 2 dakika %100 A”ya dönüldü ve 15 dakika süreyle dakikada 1 ml'lik bir akis hizinda %100 A'da yürütüldükten sonra 5 dakika süreyle dakikada 0.4ml'lik akis hizina dönüldü. Bütün örnekler, su içinde enjekte edildi.Z3206 ile (SEK.KIM.NO.: 29) veya onsuz (SEK.KIM.NO.: 28) s. flexineri O antijenini eksprese eden plazmidler, SCM3 hücrelerine transforme edildi (SEKIL 10). Geç elüsyon haciinlerindeki izler, S. flexneri O anti jen +/- Z3206 içeren iki örnegin egrileri arasindaki farki gösterir (SEKIL 12). Elüsyon paternindeki bu farklilik, indirgeyici ucunda farkli bir monosakarid: epimeraz (Z3206) varligina bagli olarak GlcNAc veya GalNAc tasiyan farkli bir oligosakarid yapisiylaaçiklanabilir.Ornek 11: 5. flexneri 6 +/- Z3206”dan üretilen biyo-konjugatin üretilmesi ve karakterize edilmesiyle pglB spesifitesinin analizi PglB°nin, indirgeyici ucunda GlcNAc olan oligosakaridleri (5. flexneri6 O-antijen), tasiyici protein EPA,ya transfer edebilip edemeyecegini64degerlendirmek için EPA (SEK.KIM.NO.: 25), PglB (SEK.KIM.NO.: 26) ve S. flexneri 6 O-antijen+/-Z3206”yi (SEK.KIM.NO: 29/SEK.KIM.NO.: 28) eksprese eden E. coli hücrelerinden Nikelle saflastirilmis 'Özütler, anti EPA ve anti tip VI antikorlar kullanilarak western bot yoluyla analiz edildi. Indirgeyici ucunda GalNAc olan ve olniayan S. flexneri 06 anti jeni, antiEPA ve anti VI anti-serumlariylasaptanan sekilde EPA7ya PglB vasitasiyla transfer edildi (SEKIL 13).O antijen, daha düsük bir üretiin verimiyle olsa da hala üretilir ve saptanir ki bu durum, epimerazsiz polisakarid üretiminin daha düsükoldugunu isaret eder.Bu bulus, özellikle düzenekleri referans alinarak gösterilip tarif edilirken bu konuda uzman kisiler, istemlerle kusatilmis bulusun kapsamiiidan uzaklasilmadan sekil ve detay bakimiiidan çesitli degisiklikler yapilabilecegini anlayacaktir. Bu konuda uzman kisilerce, bulusun kapsaminda yer aldigi anlasilacak bu tür çesitli degisiklikler arasinda özellikle N-glikosile edilmis proteinler ve indirgeyici terminalinde GalNAc olan E. coli ve S. flexneri°denolanlarin disinda bir glikan içeren biyo-konjugatlar yer alir.65Sekans ListesiBasvuran: GlycoVaxyn AGBaslik: Prokaryotik Hücrelerde Immünojenik Polisakaridler Ureten Biyosentetik SistemSEK.KIM.NO. sayisi: 29SEK.KIM.NO.: l - E. coli 0157 23206 için nükleotit sekansiBoy: 993Tip: DNAOrganizma: E. coli 0157Sekans:ATGAACGATAACGTTTT GCTCATAGGAGCTTCCGGATTCGTAGGAACCCGAC TA CTT GAAACGG CAATTGCTGACTTI'AATATCAAGAACCTGGACAAACAGCAGAGCCACTTTTATCC AGAAATCAC ACAGATTGGCGATGTTCGCGATÇAACAGGCACTCGACCAGGCGTTAGTCGGTT T T GAC ACTGTTG TACTACTGGCAGCG GAACACC GCGATGACGTCAGCCCTACTTCTC TCTATTAT GATGTCAACG TTCAGGGTACCCGCAATGTGCTGGCGGCCATGGAAAAAAATGGCGTTAAAAAT ATCATCTTTACCAGTTCCGTTGCTGTTTATGGTTTGAACAAACACAACCCTGACGAAAACCATCC ACACGACCCT TTCAACCACTACGGCAAAAGTAAGTGGCAGGCAGAGGAAGTGCTGCGTGAATG GTATAACAAAG CACCAACAGAACGTTCATTAACCATCATCCGTCCTACCGTTATCTTCGGTGAAC OCAACCGÇGOCGCAGGGACTAACTATAAGTCCATG GCTTATGTTGGAAACATI'GTTGAGTTTATCAAGTACAAAC TGAAGAATGI IGCCGCAGGI IAIGAGGI I IAIAACIACGI IGAIAAGCCAGACC I (SAAÇAIGA ACCAGI TGGT TGCTGAAGTTGAACAAAGCCTGAACAAAAAGATCCCTTCTATGCACTTGCCTTA CCCACTAGGA ATGCTGGGTGGATATTGCTTTGATATCCTGAGCAAAATTACGGGCAAAAAATAC GCTGTCAGCT (CAGTGCG(IGTGAAAAAATTCTGCG(JAACAACACAGTTT(`5AC(`5(`ZAAC(`5AAAGTG CAT TCT TCAGG `TÜTGTGGCACCGTATACGCTGTCGCAAGGTCTGG/ÃTCGAACACTGCAGTATGA ATTCGTTCAT GCCAAAAAAGACGACATAACGTTTGTTTCTGAGSEK.KIM.NO.: 2 - Z3206 için amino asit sekansi66Boy: 331Tip: PRTOrganizma: E coli 0157Sekans: MNDNVLLIGASGFVGTRLLETAIADFNIKNLDKOOSHFYPEITOIGDVRDOOALDOA LV GFDTWLLAAEHRDDVSPTSLYYDVNVOGTR VLAAMEK GVK i IFTSSVAWGLNKHNPDEN HPHDPFNHYGKSK OAEEVLRE YNKAPTERSLTI IRPTVI FGERNRG VYNLLKQIAGGKF M VGAGTNYKSMAYVGNIVEFlKYKLK VAAGYEJYNYVDKPDLN NQLVAEVEOSLNKKI PSMHL PYPLGMLGGYCFDlLSKITGKKYAVSSVRVKKFCATTQFDATKVHSSGFVAPYTLSQ GLDRTLQ YE F VHAKKDD IT F vs ESEK.KIM.NO.: 3 - E. coli OSS gne için nükleotit sekansiYer AF461121_1 BCT 02 MAYIS 2002Tanim (UDP-GlcNAc 4-epimeraz Gne [Escherichia coli])Erisim AAL67550Boy: 993Tip: DNAOrganizma: E. coli 055Sekans:67ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATAGGAGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCG ACTACTTGAA ACGGCAATTG CTGACTTTAA TATCAAGAAC CTGGACAAAC AGCAGAGCCA CTTTTATCCA GAAATCACAC AGATTGGTGA TGTTCGTGAT GGCAGCGGAA CACCGCGATG ACGTCAGCCC TACTTCTCTC TATTATGATG IÇAAÇGI ICA OGG IACCCGC AA I (5 I (SC I GG CGGÇÇA I GGA AAAAAAI GGC GTTAAAAATA TCATCTTTAC CAGTTCCGTT GCTGTTTATG GTTTGAACAA ACACAACCCT GACGAAAAC C ATCCACACGA TCCTTTCAAC CACTACGGCA AAAGTAAGTG GCAGGCAGAG GAAGTGCTGC GTGAATGGTA TAACAAAGCA CCAACAGAAC GTTCATTAAC CATCATCCGT CCTACCGTTA TCTTCGGTGA ACGGAACCGC GGTAACGTCT ATAACTTGCT GAAACAGATÇ GCTGGCGGCA AGTTTATGAT CCTGGGCGCA GGGACTAACT ATAAGTCCAT GGCTTATGTT GGAAAÇAI IG I IGAGI I IAI CAAGIACAAA CIGAAGAAIG IIG ICGCAGG TTACGAGGTT TATAACTACG TTGATAAGCC AGACCTGAAC ATGAACCAGT TGGTTGCTGA AGTTGAACAA AGCCTGAACA AAAAGATCCC TTCTATGCAC TTGCCTTACC CACTAGGAAT GCTGGGTGGA TATTGCTTTG ATATCCTGAG CAAAATTACG GGCAAAAAAT ACGCTGTCAG CTCTGTGCGC GTGÂAAAAAT TCTGCGCAAC AACACAGTTT GACGCAACGA AAGTGCATTC TTCAGGTTTTGTGGCACCGT ATACGCTGTC GCAAGGTCTG GATCGAACTC TGCAGTATGA ATTCGTCCAT GCCAAAAAAG ACGAGATAAC GTTTGTTTCT GAGSEK.KIM.NO.: 4 - E. coli 055 UDP-GlcNAc 4-epimeraz Gne için amino asit sekansiYer AF461 121_1Tanim (UDP-GlcNAc 4-epiineraz Gne [Escherichia coli])Erisim AAL67550Boy: 331 aa lineerTip: PRTOrganizma: E. coli 055Sekans:68rTindiw'iiiga sgîigirle :aiadfnikn tnquiswiyp eiîqigcwd (anîdqre ag !Cinnillaae hrddvspts: yydwwugli rw!'r'.;»i.'1'iukrlg vkniiltssv ;ivyghikl'inp dunhpriüpfii hygkskwqeiu (w ruwyzikn iilumiiiii ;ilv1gi-yni gi'uyiiHkk; uggwiirrizvgei gtnykisriiaviyv çali-wâikyk lki'v›i&igyt.-v 'yvyvdkiidlii riiruilwtw'uq bliikI-xiiianih :iiwyplgi'iîgg y<_.|d E-n'ml gikkyavsavi vkk1i;;i1:ul dalkvhssg! vapyîîsqgî dr! unyvh akkdudlw tSEK.KIM.NO.. 5 - E. coli 086 gneI için nükleotit sekansiYer AAO37706 BCT 06 ARALIK 2005Tanim UDP-GlcNAc C4-epimeraz [Escherichia coli 086].Erisim AAO37706Boy: 993Tip: DNAOrganizma: E. coli 086Sekans: ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATAGGAGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCG ACTACTTGAA ACGGCAATTG CTGACTTTAA TATCAAGAAC CTGGACAAAC AGCAGAGCCA CTTTTATCCA GAAATCACAC AGATTGGTGA TGTTCGTGAT CAACAGGCAC TCGACCAGGC GTTAGCCGGT TTTGACACTG TTGTACTACT GGCAGCGGAA CACCGCGATG ACGTCAGCCC TACTFCTCTC TATTATGATG TCAACGTTCA GGGTACCCGC AATGTGCTGC CGGCCATGGA AAAAAATGGC GTTAAAAATA TCATCTTTAC CAGTTÇCGTT (BCT GTTTATG (STTTGAACAA ACACAACCCT GACGAAAACC ATCCACACGA CCCTTTCAAC CACTACGGCA AAAGCAAGTG GCAGGCGGAG GAAGTGCTGC GTGAATGGTA TAACAAAGCA CCAACAGAAC GTTCATTAAC TATCATCCGT CCTACCGTTA TCTTCGGTGA ACGCAACCGC GGTAACGTCT ATAACTTGCT GAAACAGATC GCTGGCGGCAAGTTTATGAT GGTGGGCGCA GGGACTAACT ATA/"GTCCAT GGCTTATGTT69GGAAACATTG TTGAGTTTAT CAAGTACAAA CTGAAGAATG TTGCCGCAGG TTACGAGGTT TATAACTACG TTGATAAGCC AGACCTGAAC ATGAACCAGT TGGTTGCTGA AGTTGAACAA AGCCTGAACA AAAAGATCCC TTCTATGCAC TTGCCTTACC CACTAGGAAT GCTGGGTGGA TATTGCTTTG ATATCCTGAG CAAAATTACG GGCAAAAAAT ACGCTGTCAG CTCTGTGCGC GTGAAAAAATTCTGCGCAAC AACACAGTTT GACGCAACGA AAGTGCATTC TTCAGGTTTTGTGGCACCGT ATACGCTGTC GCAAGGTCTG GATCGAACTC TGCAGTATGA ATTCGTCCAT GCÇAAAAAAC ACCACATAAC GTTTCTTTCT CAC-SEK.KIM.NO.: 6 - E. coli 086 UDP-GlcNAc C4-epimeraz için aminoasit sekansiYer AAO37706Tanim UDP-GlcNAc C4-epimeraz [Escherichia coli 086].Erisim AAO37706Boy: 331 aa lineerTip: PRTOrganizma: E. coli 086Sekans: mndrwlliga sgivgtrHe :aiadfnikn lcquswfyp eitqigcvrd qqaldqa ag fdtwllaae hrddvsptsl yydvnvuglr rwlaarnekng vknirflssv avyglnkhnp denhphdpfn hygkskwqae ev rewyrika plerslliir plv fgernr gr'vynllku aggkfin'nvga gznyksrnayv gr' vefikyk lknvaagyev yryxi'dkpdln r'nnq vaeveq slnkkipsmh Ipyplgrr- gg ycîdil-skiî gkkyavssw ukkfcailqf datkvhssgf niauylßqgi drt qyefvh akkdcilfvs eSEK.KIM.NO.: 7 - Shigella boydii 018 gne için nükleotit sekansiYer ACD09753 BCT 05 MAYIS 2008Tanim UDP-N-asetilglukosamin 4-epimeraz [Shigella boydii CDC3083-94].Erisim ACD09753Boy: 993Tip: DNAOrganizma: Shigella boydii 018 70Sekans:ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATAGGAGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCG ACTACTTGAA ACGGCAATTG CTGACTTTAA TATCAAGAAC CTGGACAAAC AGCAGAGCCA TTTTTATCCA GCAATCACAC AGATTGGCGA TGTTCGTGAT CAACAGGCAC TCGACCAGGC GTTAGCCGGT TTTGACACTG TTGTACTACT GGCAGCGGAA CACCGCGATG ACCTCAGCCC TACTTCTCTC TATTATCATC TCAACGTTCA GGGTACCCGC AATGTGCTGG CGGCCATGGA AAAAAATGGC GTTAAAAATA TCATCTTTAC CAGTTCCGTT GCTGTTTATG GTTTGAACAA ACACAACCCT GACGAAAACC ATCCACACGA CCCTTTCAAC CACTACGGCA AAAGTAAGTG GCAGGCAGAG GAAGTGCTGC GTGAATGGTA TAACAAAGCA CCAACAGAAC GTTCATTAAC CATCATCCGT CCTACCCTTA TCTTCGCTGAACÜCAACCGC (3(JIAACG I (:1 AIAACI IGCI (SAAACAGAIC (3(31 (SCSCGGCA AGTTTATGAT GGTGGGCGCA GGGACTAACT ATÂAGTCCAT GGCTTATGTT GGAAACATTG TTGAGTTTAT CAAGTACAAA CTGÄÂGAATG TTGCCGCAGG TTATGAGGTT TATAACTATG TTGATAAGCC AGACCTGAAC ATGAACCAGT TGGTTGCTGA AGTTGAACAA AGCCTGAACA AAAAGATCCC TTCTATGCAC TTGCCTTACC CACTAGGAAT GCTGGGTGGA TATTGCTTTG ATATCCTGAG CAAAATTACG GGCAAAAAAT ACGCTGTCHG CTCTGTGCGC ('STGAAAAAAT TCTGCGCAAC AACACAGTTT GACGCAACGA AAGTGCATTC TTCAGGTTTT GTGGCACCGT ATACGCTGTC GCAAGGTCTG GATCGAACTC TGCAGTATGA ATTCGTCCAT GCCAAAAAAG ACGACATAAC GTTTGTTTCT GAGSEKKIMNO.: 8 - Shigella boydii 018 UDP-N-asetilglukosamin 4- epimeraz için amino asit sekansi Yer ACDO9753 Tanim UDP-N-asetilglukosamin 4-epimeraz [Shigella boydii CDC 3083- 94].

Erisim ACDO9753 Boy: 331 aa lineer Tip: PRT Organizma: Shigella boydii 018 Sekans: mndnvlliga sgfvgtrlle taiadfn m \dqushf\'u aitqigdvrdqqaldqa ag fatuai'llaae hrddvsptsl yydvnvcgtr nvlaamekng71vknnfîssv avyglnkhrp denrphdpfr hygkskwcae evlrewynka ptersltiir ptv fgernr gnvyrllkqi aggklmmvga gtnyksmayv gnivefikyk lmvaagyev yriyvdkodlr' mnqivaeveq slrikoxipsmh lpydgmlgg ycfdilskit gkkyavssv' vkkfcattqf catkvrissgf ve :'ytlsqgl drtlqyefvh akkdditrvs e SEKKIMNO.: 9 - Salmonella enterica 030 gne için nükleotit sekansi Yer AA V34516 BCT 25 EKIM 2004 Tanim UDP-GlcNAc 4-epimeraz [Salmonella enterica subsp. salamae serovar Greenside].

Erisim AAV34516 Boy: 993 Tip: DNA Organizma: Salmonella enterica 030 Sekans: ATGAACGATA ACGTTTTGCT CATTGGTGCT TCCGGATTCG TAGGAACCCG ACTCCTTGAA ACGGCAGTGG ATGATTTTAA TATCAAGAAC CTGGATAAAC AGCAAAGCCA TI'TCTACCCA GAGATTACAC ACATTGGCGA TGTTCGTGAC CAACAAATCC TTGACCAGAC GTTGGTGGGT TTTGACACCG TAGTACTATT GGCTGCGGAG CATCGTGATG ATGTTAGTCC TACCTCGCTT TATTATGATG TCAACGTCCA GGGAACGCGT AATGTACTGG CGGCGATGOA AAAAAATCGT GTAAAAAATA TCATTTTTAC CAGTTCCGTT GCAGTTTATG GACTCAACAÂ*` GAAAAATCCT GACGAAACGC ACCCTCACGA TCCCTTTAAT CATTACGGAA AAAGTAAATG GCAAGCAGAA GAAGTTCTGC GTGAGTGGCA TGCTAAAGCG CCGAATGAGC GTFCTTTGAC CATAATTCGT CCTACCGTTA TUTCGGGGA GCGTAACCGC GGTAATGTAT ACAATCTCTT GAAACAGATC GCTGGTGGTAAATTTGCGAT GGTTGGTCCG GGAACTAÄCT ATAAATCAAT GGCTTATGTT72GGTAATATCG TTGAGTTTAT CAAATTCAAA CTCAAGAATG TTACGGCGGG CTATGAAGTT TATAATTATG TTGATAAACC TGATCTGAAT ATGAATCAAT TGGTYGCTGA AGTAGAGCAG AGCCTGGGCA AAAAAATACC ATCGATGCAC CTTCCATATC CATTAGGTAT GCTGGGGGGT TACTGTTTCG ATATCCTGAG CAAAGTAACG GGCAAGAAGT ACGCTGTAAG TTCGGTTCGT GTTAAAAAAT TCTGTGCGAC AACGCAGTTT GATGCAACAA AAGTGCATTC TTCTGGTTTT GTTGCGCCAT ACACCTTATC TCAGGGGTTG GATCGTACAC TGCAATATGAATTTGTT CAT GCAAAGAAAG ATGACATTAÇ ATTÇGTTTCA GAGSEKKIMNO.: 10 - Salmonella enterica 030 UDP-GlcNAc 4- epimeraz için amino asit sekansi Yer AAV34516 Tanim UDP-GlcNAc 4-epimeraz [Salmonella enterica subsp. salamae serovar Greenside].

Erisim AAV34516 Boy: 331 aa lineer Tip: PRT Organizma: Salmonella enterica 030 Sekans: mndnvl iga sgfvgtrHe tavddînikn ldqushfyp eiîhigdvrd qquQUvg fdlwllaae hrddvsptsl y'ydvnvqgt' nvlaamekrg vkniiftssv avyglnkknp dethpkdpfq hygkskwqae endrewhaka pnersHii' ptvifgernr gnvynllkc aggxfariwgu gtnyksrnayv gnwû'îkfk krwiagycv yi'yvdkpdln rnnu vaevcq s gkkipsmh lpyslgn` gg ycfdwlskvt gkkyavssw vkkfcattqf datkvhssg" vaoytlscgl drtloyefwh akkaditîvs e SEK.KIM.NO.: 11 - C. jejuni gne için nükleotit sekansiYer YP_002344524 BCT 14 EYLÜL 2010 Tanim UDP-GlcNAc/Glc 4-epimeraz [Campylobacter jejuni subsp. Je juni 73Erisim YP_002344524 Boy: 987Tip: DNAOrganizma: C. je juni Sekans:ATGAAAATTCTTATTAGCGGTGGTGCAGGTTATATAGGTTCTCATACTTTAAGAC#ÃAAAACAGATCATGAAATTTGTGTTTTAGATAATCTTTCTAAGGGTTCTAAAA;îSIAG/ÄÂGAI I IÜCAAAAAACAACJAOCI I I IÂAAI I I I ICGAACAAÜAT I IAAGisîéAAGGCGTAAAAGCATTGTTTGAGAGAGAAAAATTTGACGCTATTGTGCATT:ESISAGCATTGAAGTTTTTGAAAGTATGCAAAATCCTTTÂAAATATTATATGAACASSSTTAA TACGACAAATC TCATCGAAACT TG TT TGCAAACTGGAGTGAATAAATT A ATTTTCTTCAACGGC(3GCCACTTATGGCGAACCACAAACTCCCGTTGTGAGCGAA îgêssTAGCACCT/ÄTTAATCCTTATGGGCGTAGTAAGCTTATGAGTGAAGAAGTT ;çgîTGCAAGTATGGCAAATCCTGAATTTAAGCATTGTATTTTAAGATATTTTAAT ggÃGGTGCTTGTATGGATTATACTTTAGGACAACGCTATCCAAAAGCGACTTTGiLE/::SI IGCAGC I (SAAIGIGCCGCAGGAAAACG]GAIAAACI I I ICAIAI l 106ÃSÃsGATACAAAAGATGGTACTTGCATAAGAGATTTTATCCATGTAGATGATAT;isêCAC/WTTAGCGGCTTTGGATTATTTAAAAGAGAATGAAAGCAATGTTTTTA:ggîi'TATGGACATGGTTTTAGCGTAAAAGAAGTGATTGAAGCGATGAAAAAAGT(TîiîcésgGATTTTAAAGTAGAACTTGCCCCACGCCGTGCGGGTGATCCTAGTGTAT :SSÃÃTGCAAGTAAAATCAGAAATCTTACTTCTTGGCAGCCTAAATATGATGATTTAÇA ÇÇTTATTTÇTAAATÇTGCTTTTÇATTÇÇÇAAAAAÇAGTGTTAASEK.KIM.NO.: 12 - C. jejuni UDP-GlcNAc/Glc 4-epimeraz için amino asit sekansiYer YP_002344524Tanim UDP-GlcNAc/Glc 4-epimeraz [Campylobacter jejuni subsp.

JejuniErisim YP_00234452474Boy: 328 aa lineer Tip: PRT Organizma: C. je juni Sekans:mkiiisggag yigshtlrqf lktdheicvi dnlsxgskia ied qktraf kffeqdlsdf qg'i.ikal"e'e kfdaivh'aa siexdesmqn pMyymnntv rünlietd qtgvnkfifsstaaiygepu tpwsetsizi aiiii'ipygrsk 'iiseevlrda smanpefkhc ilryfnvaga cr'idytlgqry pkeiîllikva aecaeigkrdk ififgcdvct «dgtcirdfi hvddissmlaaldylke'ie snvfnvgygh gfsukeviea mkwsgvdfk velaprragd psvlisdask irr* tswqck ycdieiicksaîdwekqc SEK.KIM.NO.: 13 - E. coli K12 galE için nükleotit sekansi Yer AP_001390 BCT 30 NISAN 2010 Tanim UDP-galaktoz-4-epimeraz [Escherichia coli str. K-12 substr.

W31 10].

Erisim AP_001390 Boy: 1 ,017 Tip: DNA Organizma: E. coli K12 Sekans:ATGAGAGTTCT G GTTACCGGTGGTAGCGGTTACATTGGAAGTCATACCTGTGTG CAAT TACTGCAAAACGGTCAT GATGTCATCAT TCTTGATAACCTCTGTAACAGTAAGC GC 75AGCGTACT GCCT GTTATCGAGCGTTTAGGCGGCAAACATCCAACGT TT GTTGAA GGCGATATTCGTAAC GAAGCGTTGATGACCGAGATCCTGCACGATCACGCTATCGAC ACCGTGATCCACTTCGCCGGGCTGAAAGCCGTGGGCGAATCGGTACAAAAACCGC TCGAA [Af TACGACAACAA 1 G T CAACGGCAC TC T GCGCC î GA T TAGCGCCA T GCGC GCCGCIAACGICAAAAACI 1 [A] I I I IAGCIÇCICGGCCACCGI I IAIGGCGAICAG CCCAAAATTCCATACGTTGAAAGCTTC CC GACC GGCACAÇCGCAAAGC CCTTACGG CAACGATATGGGCGAAGAT CCGCAAGGCAT ICCGAATAACC T GAT GCCAI ACA f CGCCCAG GTTGCTGTAGGCCGTCGCGACTCGCTGGCGATTTTTGGTAACGATTATCCGACCGA AGAT(3 GTACTGGCGTACGC GATTACATCCACG TAA TG GATCTGGCGGACGGTÇACGT CGTGGCGATGGAAAAACTGGCGAACAAGCCAGGCGTACACATC TACAACCTC G GCG CTGGCGTAGGCAACAGCGT GC TGGACG TGG TTAATGCCTT CAGCAAAGCC TGCGGC AAACCCGTTAATTATCATTTTGCACCG CGTCGCGAGGGCCACCTTCCGGCCTACTG GGCGGACGCCAGCAAAGCCGACCG TGAACTGAACTGGCGCGTAACGCGCACACT CG ATGAAAT GGC GCAGGACACCT GGCAC TGGCAG TCACGCCATCCACAGGGATATCCC GATTAASEKKIMNO.: 14 - E. coli K12 UDP-galaktoz-4-epimeraz için amino asit sekansiYer AP_001390Tanim UDP-galaktoz-4-epimeraz [Escherichia coli str. K-12 substr.W31 101.76Erisim AP_001390 Boy: 338 aa lineer Tip: PRTOrganizma: E. coli 12Sekans:'nn/lvzggsgyigshtcvqIlqnghdviiidnlcns 'nealrrteilhchaidmhfaglkavgesvqkpleyycwnvngtlrl isamraanvkr f ifsssatvygdqpkipy'ixesfutgIpqspyg ksklrviveqilldl qkaqpdwsial l ry fripvgahpsgdr'igedpqgIprinlmpyiaqvavgrrcslaifgndypledgigwdyihv 'Tid \ adgr'iwa me klankpgv hiynigag »rg nsvld wn a"ska cg kpvny'i fap'regd ::ray wada skadrelrw.'r vîrt ldem acidtwmusrhpqg _vpdSEK.KIM.NO.: 15 - E. coli 086 gne2 için nükleotit sekansi Yer AAV85952 BCT 27 MART 2005Tanim Gne [Escherichia coli 086].Erisim AAV85952Boy: 1,020Tip: DNAOrganizma: E. coli 086Sekans:ATGGTGATTT TCGTAACAGG CGGTGCAGGA TATATTGGAT CCCATACCAT ACTTGAGTTA CTTAATAATG GTCATGATGT CGTTTCGATA GATAATTTTG TCAATTCCTC TATAGAATCA TTAAAAAGAG TAGAGCAAAT AACTAATAAG AAAATTATTT CTTATC AAGG TGATATCCGT GATAAAAATC TACTTGATGA GATTTTTTCA AGACACCATA TCGATGCTGT AAT TCACT TT GCATCGTTAA AATCTGTAGG TGACTCTAAG TTAAAGCCCT TAGAGTATTA TTCTAATAAT GTTGGTGGAA CTTTAGTATT ACTTGAATGC ATGAAGAGAT ATAACATTAA77TAAAATGATA TTTAGCTCTT CTGCTACTGT TTATGGGAGT AACAGTATCC CTCCCCATAC GGAAGATAGA ÇGAATTGGTG AAACTACAAA CCCATATGGG ACATC GAAAT TTATAATAGA AATAATTTTG AGTGATTATT GTGATAGTGA TAATAATAAA TCAGTAATTG CACTGCGTTA CTI'TAATCCA ATCGGAGCAC ATAAGTCCGG GATGATTGGT GAAAATCCTA ACGGGATCCC TAATAATCTG GTTCCTTATA TATCTAAAGT TGCACAAAAT CAACTTCCTG TATTAAATAT TTATGGCAAC GATTATCCAA CTAAAGATGG TACAGGACSTA AGAGACTATA TACATGTCTG TGATTTGGCT AAAGGGCATG TTAAAGCATT AGAATATATG TTTTTAAATG ATGTCAATTA TGAAGCTTTT AATTTAGGTA CTGGTCAAGG TTATTCTGTT TTAGAGATTG TAAAAATGTT TGAGATAGTC ACTAAAAAGA GTATAC CTGT TGCTATTTGT AATAGACGTG AGGGGGATGT TGCGGAGTCA TGGGCGTCTG CTGATTTGGC ACATAAAAAG ÇTTTCCTGGA AAGCGGAAAA AAATTTGAAA GAAATGATCG AAGATGTATG GCGTTGGCAA ACAAACAATC CAAATÇGATA TAAAAAATAA SEK.KIM.NO.: 16 - E. coli 086 Gne için amino asit sekansi Yer AAV85 952 Tanim Gne [Escherichia coli 086].

Erisim AAV85952 Boy: 339 aa (gne2) lineer Tip: PRT Organizma: E. coli 086 Sekaiis: mvifvtggag yigsm lel lnng'idwsi dnfvnssies IKrvecitnK kiisyqgdir cknlldeifs mnidavihf aslksvgesk lkpieyysnn 'uggtlvliec mkryninkmi fsssatvygs nsipphtedr rigettnpyg :skfiieiil sdycdsdr'nk svialryfnp igahksgm g e'ipngipnnl vpyiskvaqr' qlpvlriiygndyvikdgîgv rdyi'wcdla kg'ivkaleyin . ?i'd'i'riyeaf 'ilglgqusv Ieivkmfeiv Ikksipvaic rirregdvaes wasadlahkk lswkaeknlk emiedvimwq Irinp'igykkSEK.KIM.NO.: 17 - Z3206°n1n bir ucunu sifreleyen sentetik oligonükleotit 23206 için nükleotit sekansi-Z3206°nin bir ucunusifreleyen FW (primer); kisitlama sahalarinin alti çizilidir78Boy: 30 Tip: DNA Sekans: AAACCCGGGATGAACGATAACGTTTTGCTC SEK.KIM.NO.: 18 - Z3206”nin hemaglutinin takili (HA takisi) bir ucunu sifreleyen sentetik oligonükleotit Z3206-RVHA (primer) için nükleotit sekansi; kisitlama sahalarinin alti çizilidir Boy: 60 Tip: DNA Organizma: Sekans: AAAICIAGAIIAAGCGTAAIÇIGGAAGAT ÇGT AT (3 GGT ACT ÇAGAAAÇAAAÇÇT TAT GT Ç SEK.KIM.NO.: l9 - Sentetik oligoni'ikleotit gne-FW (primer) için kisitlama sahalarinin altlarinin çizili oldugu nükleotit sekansi Boy: 29 Tip: DNA Organizina: Sekans: AAACCATGGATGAAAATTCTTATTAGCGG SEK.KIM.NO: 20 - Sentetik oligonükleotit gne-RV (priiner) için kisitlama sahalarinin altlarinin çizili oldugu. nükleotit sekansi Boy: 57 Tip: DNA Organizma:Sekans* AAA 1 r; i ArsAi IAAUCU 1 AA 1 L; 1 (stsAAe ATCGTATGGGTAGCACTGTTTTTCCCAATC SEK.KIM.NO.: 21 - NheI kisitlama enzimi için kisitlama sahalariiçeren nükleotit sekansi 79Boy: 1 lTip: DNAOrganizma:Sekans: AAAAAGCTAGCSEK.KIM.NO.: 22 - AscI kisitlama enzimi için kisitlama sahalari içeren oligonükleotit için nükleotit sekansiBoy: 8Tip: DNAOrganizma:Sekans: CCGCGCGGSEK.KIM.NO.: 23 - C terminalinde hemaglutinin takisi olan Z3206'yi sifreleyen pMLBAD:Z3206 plazmidi (plazmid içinde E. coli 0157 sokmasi) için nükleotit sekansiTanim Urünün Z3206-pMLB AD* içerisine ligasyonuOzellikler Lokasyon/NiteleyicilerCDS 21053098/etiket=Z3206CDS 3098..3127/etikeFHABoy: 7794 bpTip: DNA dairesel UNASekaiis:1 TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA ATCGATGAGC TCGCACGAAC CCAGTTGACA61 TAAGCCTGTT CGGTTCGTAA ACTGTAATGC AAGTAGCGTA TGCGCTCACG CAACTGGTCC'121 AGAACCTTGA CCGAACGCAG CGGTGGTAAC GGCGCAGTGG CCGTTTTCAT GCCTTCTTAT 80181 GACTGTTTTT TTGTACAGTC TAGCCTCGGG CATCCMGCT AGCTÂAGCGC GTTACGCCGT?4'T GGGTCGATGT TTGATGTTAT GGAACAGCAA CGATGTTACG30T AACAAAGTTA GGCAGCCGTT GTGCTGGTGC TTTCTAGTAG TTCTTGTGGG GTACGCACTCISE-T AGAGCTCGAT TTGCTTGTCG CCATAATAGA TTCACAAGAA GGATTCGACA TGGGTCAAAG42T IAGCGAI GAA GCCAACGCIC CCGI IGCAGG GCAGI î IGCG CTTCCCCTGA GTGCCACCTT48'T TGGCTTAGGG GATCGCGTAC GCAAGAAATC TGGTGCCGCT TGGCAGGGTC AAGTCGTCGGMT TTGGTATTGC ACAAAACTCA CTCCTGAAGG CTATGCGGTC GAGTCCGAAT CCCACCCAGGBOT CTCAGTGCAA ATTTATCCTG TGGCTGCACT TGAACGTGTG GCCTAAGCGA TATCTTAGGA66% TCTCCCATCG GTGATGTCGG CGATATAGGC GCCAGCAACC GCACCTGTGG CCCCGGTCAT?QT GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT CTGCTCATGT TTGACAGCTT ATCATCGATG/8T CATAATGTGC CTGTCAAATG GACGAAGCAG GGATTCTGCA AACCCTATGC TACTCCGTCA84'T AGCCGTCAAT TGTCTGATTC GTTACCAATT ATGACAACTT GACGGCTACA TCATTÇACTT90T TTTCTTCACA ACCGGCACGG AACTCGCTCG GGCTGGCCCC GGTGCATTTT TTAAATACCCSET GCGAGAAATA GAGTTGATCG TCAAAACCAA CATTGCGACC GACGGTGGCG ATAGGCATCC1071 GGGTGGTGCT CAAAAGCAGC TTCGCCTGGC TGATACGTTG GTCCICGCGC CAGCI IAAGA1081 CGCTAATCCC TAACTGCTGG CGGAAAAGAT GT GACAGACGCGACGGC (SAC AAGCAAACAI 81' 141 GCTGTGCGAC GCTGGCGATA TCAAAATTGC TGTCTGCCAG GTGATCGCTG ATGTACTGAC*201 AAGCCTCGCG TACCCGATTA TCCATCGGTG GATGGAGCGA (ITCGTTAATC (SCTTCCATGC' 261 GCCGCAGTAA CAATTGCTCA AGCAGATTTA TCGCCAGCAG CTCCGAATAG CGCCCTTCCC'321 (31 IGCCCGGC GI IAAIGMII IGCCCAAACÂ (SGICGCIGM ATGCGGCTGG TGCGCTTCAT' 381 CCGGGCGAAA GAACCCCGTA `ITGGCAA/-RTA TTGACGGCCA(5 I TAAGCCAI ICA I (SCCAGIC)C GAGCCTCC G GAT GACGAC'501 CGTAGTGATG AATCTCTCCT GGCGGGAACA GCAAAATATC ACCCGGTCGG CAAACAAATT'081 CTCGTCCCTG ATTTTTCACC ACCCCCTGAC CGCGAATGGT GAGATTGAGA ATATAACCTT'621 TCATTCCCAG CCGTCGGTCG ATAAAAAAAT CGACATAACC'681 AACCCGCCAC CAGATGGGCA TTAAACGAGT ATCCCGGCAG CAGGGGATCA TTTTGCGCTT' 741 CAGCCATACT TTTCATACTC CCGCCATTCA GAGAAGAAAC CAATTGTCCA TATTGCATCA'801 GACATTGCCG TCACTGCGTC TTTTACTGGC TCTTCTCGCT'861 TTATTAAAAG CATTCTGTAA CAAAGCGGGA CCAAAGCCAT GACAAAAACG CGTAACAAAA”921 GTGTCTATAA TCACGGCAGA AAAGTCCACA TTGATTATTT GCACGGCGTC ACACTTTGCT'981 ATGCCATAGC ATTTTTATCC ATAAGATTAG CGGATCCTAC CTGACGCTTT T TÄTCGCAAC 82204' TCTCTACTGT TTCTCCATAC CCGTTTTTTT GGGCTAGCAG GAGGAATTCA CCATGGTACC?10” CGGGATGAAC GATAACGTTT TGCTCATAGG AGCTTCCGGA TTCGTAGGAA CCCGACTACT216' TGAAACGGCA ATTGCTGACT TTAATATCAA (BAACCTGGAC AAACAGCAGA GCCACTTTTA222' TCCAGAAATC ACACAGATTG GCGATGTTCG CGATCAACAG GCACTCGACC AGGCGTTAGT228” COGTTTTCAC ACTOTTGTAC TACTGGCAGC GGAACACCGC GATGACGTCA GCCCTACTTC?34” TCTCTATTAT GATGTCAACG TTCAGGGTAC CCGCAATGTG C I GGCGGCCA IGGAAAAAAA240” TGGCGTTAAA AATATCATCT TTACCAGTTC CGTTGCTGTT TATGGTTTGA ACAAACACAA?46” CCCTGACGAA AACCATCCAC ACGACCCTTI' Ci'\A(3CACTi“\C GGCAAAAGTA AGTGGCAGGÇ252' AGAGGAAGTG CTGCGTGAAT GGTATAACAA AGCACCAACA GAACGTTCAT TAACCATCAT258` CCGTCCTACC GTTATCTTCG GTGAACGCAA CCGCGGTAAC GTCTATAACT TCCTCAAACA264' GATCGCTGGC GGCAAGTTTA TGATGGTOGG CGCAGOGACT AACTATAAGT CCATGGCTTA?YOJ TGTTGGAAAC ATTGTTGAGT TTATCAAGTA CAAACTGAAG AATGTTGCCG CAGGTTATGA2/6' GGTTTATAAC TACGTTGATA AGCCAGACCT GAACATGAAC CAGTTGGTTG CTGAAGTTGA282' ACAAAGCCIG AACAAAAAGA ICCCI ICIAI GCACI IGCCI TACCCACTAG GAATGCTGGG288' TGGATATTGC TTTGATATCC TGAGCAAAAT TACGGGCAAA AAATACGCTG TCAGCTCAGT294” GCGCGIGAAA AAA! IÇIGCG CAAÇAACAÇA CSI 1 IGAÇGÇA 83ACGAAAGTGC ATTCTTCAGG300' TTTTGTGGCA CCGTATACGC TGTCGCAAGG TCTGGATCGA ACACTGCAGT ATGAATTCGT306” TCATGCCAAA AAAGACGACA TAACCTTTGT TTCTGAGTAC CCATACGATG TTCCAGATTA312' CGCTTAATÇT AGAGTCGACC TGCAGGCATG CAAGCTTGGÇ [GI I I IGGÇG GAIGAGAGAA318" GATTTTCAGC CTGATACAGA TTAAATCAGA ACGCAGAAGC GGTCTGATAA AACAGAATTTCCGAAC I CAG AAG I GAAACG 330' CCGTAGCGCC GAIGGIAG I (5 IGGGGIC I CC CCAIGCGAGA GTAGGGAACT GCCAGGCATC336' AAATAAAACG AAAGGCTCAG TCGAAAGACT GGGCCTTTCG TTI'TATCTGT TGTTTGTCGG342' TGAACGCTCT CCTGAGTAGG ACAAATCCGC CGGGAGCGGA TTTGAÃCGTT GCGAAGCAAC348' GGCCCGGAGG GTGGCGGGCA GGACGCCCGC CATAAACTGC CAGGCATCAA AT TAAGCAGA354" AGGCCAICCI GACGGAIGGC CI I I I IGCGI IICIACAAAC TCTTCCACTC ACTACAOCAG360” AGCCATTTAA ACAACATCCC CTCCCCCTTT CCACCGCGTC AGACGCCCGT AGCAGCCCGC366' TACGGGCTTT TTCATGCCCT GCCCTAGCGT CCAAGCCTCA CCGCCGCGCT CGGCCTCTCT372' GGCGGCCTTC TGGCGCTGAG GTCTGCCTCG TGAAGAAGGT GTTGCTGACT CATACCAGGC378' CTGAATCGCC CCATCATCCA GCCAGAAAGT GAGGGAGCCA CGGTTGATGA GAGCTTTGTT384' GTAGGTGGAC CAGTTGGTGA TTTTGAACTT TTGCTTTGCC ACGGAACGGI CIGCGI IGIC 843901 GGGAAGATGC GTGATCTGAT CCTTCAACTC AGCAAAAGTT CGATTTATI'C AACAAAGCCG3961 CCGTCCCGTC AAGTCAGCGT AATGCTCTGC CAGTGTTACA ACCAATTAAC CAATTCTGAT4021 TAGAAAAACT CATCGAGCAT CAAATGAAAC TGCAATTTAT TCATATCAGG ATTATCAATA4081 CCATATTTTT GAAAAAGCCG TTTCTGTAAT GAAGGAGAAA ACTCACCGAG GCAGTTCCAT4141 AGGATGGCAA GATCCTGGTA TCGGTCTGCG ATTCCGACTC GTCCAACATC AATACAACCT4201 ATTAATTTCC CCTCGTCAAA AATAAGGTTA TCAAGCGAGA AATCACCATG AGTGACGACT4281 GAATCCGGTG AGAATGGCAA AAGCTAAAAA GGCCGTAATA TCCAGCTGAA CGGTCTGGTT4371 ATAGGTACAT TGAGCAACTG ACTGAAATGC CTCAAAATGT TCTTTACGAT GCCATTGGGA4381 TATATCAACG GTGGTATATC CAGTGATTTT TTTCTCCATT TTAGCTTCCT TAGCTCCTGA4441 AAAIÇICGAI AACIÇAAAAA AIACGCCCGG IAGIGAIOII A1 I 1CA11A1 GGTGAAAGTT4501 GGAACCTCTT ACGTGCCGAT CAACGTCTCA TTTTCGCCAA AAGTTGGCCC AGGGCTTCCC4561 GGTATCAACA GGCACACCAG GATTTATTTA TTCTGCGAAG IGAICI ICCG 1()A(ZAG(5IA14621 TTATTCGAAG ACGAAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT ATAGGTTAAT GTCATGATAA4681 TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA4741 CTGGCGCTGG GCCTGTWCT GGCGCTGGAC TTCCCGCTGT TCCGTCAGCA GCTTTTCGCC4801 CACGGCCI TG A1 GAICGCGG CGGCCT IGGC CTGCAIAICC CGATTCAACG GCCCCAGGGC 854861 GTCCAGAACG GGCTTCAGGC GCTCCCGAAG GTCTCGGGCC GTCTCTTGGG CTTGATCGGC41921 CTTCTTGCGC ATCTCACGCG CTCCTGCGGC GGCCTGTAGG GCAGGCTCAT ACCCCTGCCG4981 AACCGCTTTT GTCAGCCGGT CGGCCACGGC TTCCGGCGTC TCAACGCGCT WGAGATTCCT CGACCGCTT GCGGGCTGAT5101 GGTGACGTGG CCCACTGGTG GCCGCTCCAG GGCCTCGTAG AACGCCTGAA TGCGCGTGTG5161 ACGTGCCTTG CTGCCCTCGA TGCCCCGTTG CAGCCCTAGA TCGOCCACAG CGGCCGCAAA5221 CGTGGTCTGG TCGCGGGTCA TCTGCGCTTT GTTGCCGATG AACTCCTTGG CCGACAGCCT GGGCTGGTTT CGTCACGGTG5341 GATGCTGGCC GTCACGATGC GATCCGCCCC GTACTTGTCC GCCAGCCACT TGTGCGCCTT5401 (SICCSAAGAAÇ GCCGCC1 (501 (31 IÇI IGGCZI GGÇÇGACI IC CACCATTCCG GGCTGGCCGT 5481 CATGACGTAC TCGACCGCCA ACACAGCGTC CTTGCGCCGC TTCTCTGGCA GCAACTCGCG5521 CAGTCGGCCC ATCGCTTCAT CGGTGCTOCT GGCCGCCCAC IGCICGI ICI (ZIGGCGICCI5581 GCTGGCGTCA GCGTTGGGCG TCTCGCGCTC GCGGTAGGCG TGCTTGAGAC TGGCCGCCAC56:11 GTTGCCCATT TTCGCCAGCT TCTTGCATCG CATGATCGCG5701 TCCCTFTTGG TGTCCAACCG GCTCGACGGG GGCAGCGCAA GGCGGTGCCT CCGGCGGGCC5761 ACTCAATGCT TGAGTATACT CACTAGACTT TGCTTCGCAA AGTCGTGACC GCCTACGGCG 86__________________________GCGCGGTCGC TGCGCTCCCT 588” TGCCAGCCCG TGGATATGTG GACGATGGCC GCGAGCGGCC ACCGGCTGGC TCGCTTCOCT 594' CGGCCCGTCG ACAACCCTGC TCGACAAGCT GATGGACAGG CTGCGCCTGC CCACGAGCTT600” GACCACAGGG ATTGCCCACC GGCTACCCAG CCTTCGACCA CATACCCACC GGCTCCAACTCTCTGGGGAA AAGCCTC OGG612' CCTGCGGCCT GCGCGCTTCG CTTGCCGGTT GGACACCAAG TGGAAGGCGG GTCAAGGCTC618' GCGCAGCGAC CGCGCAGCGG CTTGGCCTTG ACGCGCCTGG AACGACCCAA GCCTATGCGA GAGCCTCACG GCGGCGAGTG630' CGGGGGTTCC AAGGGGGCAG CGCCACCTTG GGCAAGGCCGCGCCGAAGGC GTGGGGGAAC642' CCCGCAGGGG TGCCCTTCTT TGGGCACCAA AGAACTAGAT648' CTTAAAAATC AACAACTTAA AAAAGGGGGG TACGCAACAG CTCATTGCGG CACCCCCCGC654" AATAGCTCAT TGCGTAGGTT AAAGAAAATC TGTAATTGAC TGCCACTT TT ACCCAACGCA660' TAATTGTTGT CCCGCTGCCG AAAAGTTGCA GCTGATTGCG CATGGTGCCG CAACCGTGCG 87686' GCACCCTACC GCATGGAGAT AAGCATGGCC ACGCAGTCCA GAGAAATCGG CATTCAAGCC672' AAGAACAAGC CCGGTCACTG GGTGCAAACG GMCGCAAAG CGCA I GAGGC GIGGGCCGGG678' C1 IAI IGCGA GGAAACCCAC GGCGGCAAIG CIGCIGCAIC ACCTCGTGGC GCAGATGGGC684“ CACCAGAACG CCGTGGTGGT CAGCCAGAAG ACACTTTCCA AGCT CATCGG ACGTTCTTTG 690' CGGACGGTCC AATACGCAGT CAAGGACTTG GTGGCCGAGC GCTGGATCTC CGTCGTGAAG696” CTCAACGGCC CCGGCACCGT GTCGGCCTAC GTGGTCAATG ACCGCGTGGC GTGGGGCCAG702” CCCCGCGACC AGI IGCGCCI GICGGIGI IC AGIGCCGCCG TGGTGGTTOA TCACGACGAC708' CAGGACGAAT CGCTGTTGGG GCATGGCGAC CTGCGCCGCÂ TCCCGACCCT GTATCCGGGC7144 GAGCAGCAAC TACCGACCGG CCCCGGCGAG GAGCCGCCCA (20' ATGGAAÇCAG ACCTGCCAGC CTTGACCGAA ACGGAGGAAT GGGAACGGCG CGGGCAGCAG726' CGCCTGCCGA TGCCCGATGA GCCGTGTTTT CTGGACGATG GCCAGCCGTT GGAGCCGCCC732' ACACGGGTCA CCCTGCCCCG CCGGTAGCAC TTGGGTTCCG CAGCAACCCG TAAGTGCGCT738" GTTCCAGACT ATCGGCTGTA GCCGCCTCGC CGCCCTATAC CTTGTCTGCC TCCCCGCGTT887501 AACGGATTCA CCGTTTTTAT CAGGCTCTGG GAGGCAGAAT AAATGATCAT ATCGTCAATT/561 ATTACCTCCA CGGGGAGAGC CTGAGCAAAC TGGCCTCAGG CATTTGAGAA GCACACGGTC7621 ACACTGCTTC CGGTAGTCAA TAAACCGGTA AACCAGCAAT AGACATAAGC GGCTATTTAA7881 CGACCCTGCC CTGAACCGAC GACCGGGTCG AATTTGCTTT CGAATTTCTG CCATTCATCC7741 GCTTATTATC ACTTATTCAG GCGTAGCACC AGGCGTTTAA GTCGACCAAT AACCSEK.KIM.NO.: 24 - C terminalinde bir hemaglutinin takisi olan Gne'yi sifreleyen pMLBADrgne (plazmid içinde E. coli 0157 sokmasi) için nükleotit sekansiYer gne-pMLBADTanim dig galE'nin pmlbad did içine ligasyonu (Ncol-Xbal) Ozellikler Lokasyon/niteleyicilerCDS 20973080/etiket=galECDS 3081..3107/etiket=HABölge 3108.31 10/etiket=st0pBoy: 7776 bpTip: DNA dairesel UNASekans:1 TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA ATCGATGAGC TCGCACGAAC CCAGTTGACA61 TAAGCCTGTT CGGTTCGTAA ACTGTAATGC AAGTAGCGTA TGCGCTCACG CAACTGGTCC 89121 AGAACCTTGA CCGAACGCAG CGGTGGTAAC GGCGCAGTGG 0601 I I ICAI OGG] IGI TAI181 GACTGTT I TTGTACAGTC TAGCCTCGGG CATCCAAGCT AGCTAAGCGC GTTACGCCGT2:11 GGGTCGATGT TTGATGTTAT GGAACAGCÂA CGATGTTACG CAGCAGGGTA GTCGCCCTAA301 AACAAAGTTA GGCAGCCGTT GTGCTGGTGC TTTCTAGTAG TTGTTGTGGG GTAGGCAGTC361 AGAGCTCGAT TTGCTTGTCG CCATAATAGA TTCACAAGAA GGATTCGACA 1666 1 CAAAG491 TAGCGATGAA GCCAACGCTC CCGTTGCAGG GC/KGTTTGCG CTTCCCCTGA GTGCCACCTT"181 IGGCI IAGGG GATCGCGIAC GCAAGAAATC IGGIGCCGCI TGGCAGGGTC AAGTCGTCGG641 TTGGTATTGC ACAAAACTCA CTCCTGAAGG CTATGCGGTC GAGTCCGAAT CCCACCCAGG601 CTCAGTGCAA ATTTATCCTG TGGCTGCACT TGAACGTGTG GCCTAAGCGA TATCTTAGGAGCACCTGTGG CGCÇGGTGAT721 GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT CTGCTCATGT TTGACAGCTT ATCATCGATG781 CATAATGTGC CTGTCAAATG GACGAAGCAG GGATTCTGCA AACCCTATGC TACTCCGTCA841 AGCCGTCAAT TGTCTGATTC GTTACCAATT ATGACAACTT CACGGCTACA TCATTCACTTGGîGCAI I II IIAAAIACCC 961 GCGAGAAATA GAGTTGATCG TC/Vv'VkCCAA CATTGCGACC GACGG 1 GGCG A 1 AGGCA 1 CC1021 CGGTGGTGCT CAAAAGCAGC TTCGCCTGGC TGATACOTTG GTCCTCGCGC CAGCTTAAGA1081 CGCIAAIÇCC IAACIGCIGG CGGAAAAGA1 GIGACAGACG 90'1'C1 GCTGTGCGAC CCTGGCGATA TCAAAATTGC TGTCTGCCAO GTGATCGCTG ATGTACTGAC1901 AAGCCTCGCG TACCCGATTA TCCATCGGTG GATGGAGCGA CTCGTTAATC GCTTCCATGÇ1281 GCCGCAGTAA CAATTGCTCA AGCAGATTTA TCGCCAGCAG CTCCGAATAG CGCCCTTCCC1321 CTTGCCCGGC GTTAATGATT TGCCCAAACA GGTCGCTGAA ATGCGGCTGG TGCGCTTCAT1381 CCGGOCGAAA GAACCCCGTA TTGGCAAATA TTGACGGCCA GTTAAGCCAT TCATGCCAGT141d1 AGCCGCGCGG ACGAAAGTAA ACCCACTGGT GATACCATTC GCGAGCCTCC GGATGACGAC1501 CCTAGTGATG AATCTCTCCT GGCGGGAACA GCAAAATATC ACCCOGTCGG CAAACAAATTGAGAI IGAGA AIAIAACCH1621 TCATTCCCAG CGGTCGGTCG ATAAAAAAAT CGAGATAACC GTTGGCCTCA ATCGGCGTTA1681 AACCCGCCAC CAGATGGGCA TTAAACGAGT ATCCCGGCAG CAGGGGATCA TTTTGCGCTT17-11 CAGCCATACT TTTCATACTC CCGCCATTCA GAG A AG A A AC CAATTGTCCA TATTGCATCA1801 GACATTGCCG TCACTGCGTC TTTTACTGOC TCTTCTCGCT AACCAAACCG GTAACCCCGCGACAAAAACG CGTAACAAAA1921 GTGTCTATAA TCACGGCAGA AAAGTCCACA TTGATTATTT'1981 ATGCCATAGC ATTTTTATCC ATAAGATTAG CGGATCCTAC CTCACCCTTT TTATCGÇAAÇ 912041 TCTCTACTGT TTCTCCATAC CCGTTTTTTT GGGCTAGCAG GAGGAATTCA CCATGGATGA2101 AAATTCTTAT TAGCGGTGGT GCAGGTTATA TAGGTTCTCA TACTTTAAGA CAATTTTTAA2161 AAACAGATCA TGAAATTTGT GTTTTAGATA ATCTTTCTAA GGGTTCTAAA ATCGCAATAG2221 AAGATTTGCA AAAAATAAGA ACTTT TAAAT TTTTTGAACA AGATT TAAGT GATTTTCAAG2281 GCGIAAAAGC AI [GI I IGAG AGAGAAAAAI I IGACGCIAI TGTGCATTTT GCAGCGAGCA?341 TI'GAAGTI I I TGAAAGTATG CAAAACCCTT TAAAGTATTA TATGAATAAÇ ACTGWAATA2401 CGACAAATCT CATCGAAACT TGTTTGCAAA CTGGAGTGAA TAAATTTATA TTTTCITCAA7461 CGGC AGCC ACI TTATGGCGA A CCACAAACTC CCGTTGTGAG CGAAACAAGT CCTTTAGCAC2521 CTATTAATCC TTATGGGCGT AGTAAGCTTA TGAGCGAAGA GG] I I IGCGI GAIGCAAGIA2581 TGGCAAATCC TGAATTTAAG CATTGTATTT TAAGATATTT TAATGTTGCA GGTGCTTGCA2641 TGGATTATAC TTTAGGACAA CGCTATCCAA AAGCGACTTT GCTTATAAAA GTTGCAGCTG2701AAIGIGCCGC AGAAAAACGI AAIAAACI I I ICAIAI I [GG CGAIGAI IAI GATACAAAAG?76î ATGGCACTTG CATAAGAGAT TTTATCCATG TGGATGATAT TTCAAGTGCG CATTTATCGG28-21CHIGGAHA IIIAAAAGAGAAIGAAAGCAAlGIIIIIAA IG1AGGIIAI GGACATGGTT?881 TTAGCGTAAA AGAAGTGATT GAAGCGATGA AAAAAGTTAG CGGAGTGGAT AAAGTAG294î AACTTGCCÇC ACGCCGTGCG GGTGATCCTA GTGTATTGAT IICIGAIGCA AGIAAAAICA 923001 GAAATCTTAC TTCTTGGCAG CCTAAATATG ATGATTTAGG GCTTATTTGT AAA I C I GG! 13081 TTGATTGGGA AAAACAGTGC TACCCATACG ATGTTCCAGA TTACGCTTÄA TCTACACTCG3' 21 ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT GGCTGTTTTG GCGGATGAGA GAAGATTTTC AGCCTGATAC3 ' 8-1 AGATTAAATC AGAACGCAGA AGCGGTCTGA TAAAACAGAA 3241 CGG 1 GGICCC AOC I GACCGC AIGCCGAAGI CAGAAGIGAA ACGCCGTAGC GCCGATGGTA3301 G I G I GGGGIC ICCÇCAI GCG AGAG T AGGGA AÇIGÇCAGGÇ ATCAAATAAA ACGAAAGGCTCGGTGAACGC TCTCCTGAGT3421 AGGACAAATC CGCCGGGAOC GOATTTGAAC OTTGCGAAGC AMIGGCCCGG AGGGTGGCGG3481 GCAGGACGCC CGCCATAAAC TGCCAGGCAT CAAATTAAGC ACAAGCCCAT CCTGACGGAT3541 GGCCTTTTTG CGTTTCTACA AACTCTTCCA CTCACTACAG CAGAGCCATT TAAACAACAT3601 CCCCTCCCCC TTTCCACCGC GTCAGACGCC CGTAGCAGCC CGCTACGGGC TTTTTCATGC3721 GAGGTCTGCC TCCTGAAGAA GCTGTTGCTG ACTCATACCA GGCCTGAATC GCCCCATCAT3781 CCAGCCAGAA AGTGAGGGÄG CCACGGITGA TGAGAGCTI'T GI [GIAGGIG GAGCAGI 1GG3841 TGATTTTGAA CTTTTGCTTT GCCACGGAAC GGTCTGCGTT GTCGGGAAGA TGÇGTGATÇT 933901 GATCCTTCAA CTCAGCAAAA GTTCGATTTA TTCAACAAAG CCGCCG T CCC G I CAAG I (JAG3961 CGTAATGCTC TGCCAGTGTT I`\C/\I`\CCA/'\TI' fu'\CC/`x/`\TTCT GATTAG/VJxA ACTCATCGAG4021 CATCAAATGA AACTGCAATT TATTCATATC AGGATTATCA ATACCATATT TTTGÂAAAAG'4081 CCGTTTCTGT AATGAAGGAG AAAACTCACC GAGGCAGTTC CATAGGATGG CAAGATCCTG4'41 GTATCGGTCT GCOATTCCGA CTCGTCCAAC ATCAATACAA CCTATTAATT TCCCCTCCTC4201 AAAAATAAGG TTATCAAGCG AGAAATCACC ATGAGTGAÇG ACTOAATCCC GTGAGAATGG GTTATACGTA CATTGAGCAA4321 CTGACTGAAA TGCCTCAAAA TGTTCTTTAC GATGCCATTG GGATATATCA ACGGTGGTAT4381 ATCCAGTGAT TTTTTTCTCC ATTTTAGCTT CCTTAGCTCC TGAAAATCTC GATAACTCAA4441 AAAATACGCC CGGTAGTGAT CTTATTTCAT TATGGTGAAA GTTGGAACCT CTTACGTGCC4501 GATCAACGTC TCATTTTCGC CAAAAGTTGG CCCAGGGCTT CCCGGTATCA ACÂCCCACAC4561 CAGGATTTAT TTATTCTGCG AAGTGATCTT CCGTCACAGG TATTTATTCG AAGACGAAAG4621 CGCCTCGTCA TACGCCTATT TTTATAGGTT AATGTCATGA TAATAATGGT TTCTTAGACGCIGCIGGCGC IGGGCCIGII4741 TCTGGCGCTG GACTTCCCGC TGTTCCGTCA GCAGCTTTFC GCCCACGGCC TTGATGATCG4801 CGGCGGCÇH GGCCIGCAIA IÇCCGAI ICA AÇGGÇCCÇAG GGCGTCCAGA ACGGGCTTCA 944881 GGCGCTCCCG AAGGTCTCGG GCCGTCTCTT GGGCTTGATC GGCCTTCTTG CGCATCTCAC'4921 GCGCTCCTGC GGCGGCCTGT AGGGCAGGCT CATACCCCTG CCGAACCGCT TTTGTCAGCC4981 GGTCGGCCAC GGCTTCCGGC GTCTCAACGC GCTTTGAGAT TCCCAGCTTT TCGGCCAATCGATGGTGACG TGGCCCACTG5101 GTGGCCGCTC CAGGGCCTCG TAGAACGCCT GAATGCGCGT GTGACGTGCC TTGCTGCCCT5161 CGATGCCCCG TTGCAGCCCT AGATCGGCCA CAGCGGCCGC AAACGTGGTC TGGTCGCGGG5221 TCATCTGCGC TTTGTTGCCG ATGAACTCCT TGGCCGACAG CCTGCCGTCC TGCGTCAGCG5281 GCACCACGAA CGCGGTCATG TGCGGGCTGG TTTCGTCACG GIGGAI GCIG GCCGTCACGACTTCTCGAAG AACGCCGCCT5401 GCTGTTCTTG GCTGGCCGAC TTCCACCATT CCGGGCTGGC CG I ÇA 1 (SACG IAC [CGAÇCG 5461 CCAACACAGC GTCCTTGCGC CGCWCTCTG GCAGCAACTC GCGCAGTCGG CCCATCGCTT5521 CATCGGTGCT GCTGGCCGCC CAGTGCTC GT TCTCTGGCGT CCTGCTGGCG TCAGCGTTGG5581 GCGTCTCGCG CTCGCGGTAG GCGTGCTTGA GACTGGCCGC CACGTTGCCC ATTTTCGCCAJ'641 (5(31IC1 IGCA TCGCAIGAIC (SCCSIAIG 3(3(5(3(3A1G(3()1(5(I CCT `CCTTT TGGTGTCCAAO5701 CCGGCTCGAC GGGGGCAGCG CAAGGCGGTG CCTCCGGCGG GCCACTCAAT GCTTGAGTAT5761 ACTCACTAGA CTTTGCTTCG CAAAGTCGTG ACCGCCTACG GCGGCTGCGG CGCCCTACGG 95CCTTGCCAGC CCGTGGATAT588* GTGGACGATG GCCGCGAGCG GCCACCGGCT GGCTCGCTTC GCTCGGCCCG TGGACAACCCCTTGACCACA GGGATTGCCC600' ACCGGCTACC CAGCCTTCGA CCACATACCC ACCGGCTCCA ACTGCGCGGC CTGCGGCCTT606" GCCCCATCAA TTTT TTTAAT TTTCTCTGGG OAAAAGCCTC CGGCCTGCGG CCTGCGCGCTCTCGCGCAGC GACCGCGCAG618' CGGCTTGGCC TTGACGCGCC TGGAACGACC CAAGCCTATGGTGCGGG GGT TCCAAGGG GG630' CAGCGCCACC TTGGGCAAGG CCGAAGGCCG CGCAGTCGATAACCCCGCAG GGGTGCCCTT642' CTTTGGGCAC CAAAGAACTA GATATAGGGC GAAATGCGAA AGACTTAAAA ATCAACAACTCGCAATAGCT CAT TGCGTAG654' GTTAAAGAAA ATCTGTAATT GACTGCCACT TTTACGCAAC GCATAAT TGT TGTCCCGCTG660' CCGAAAACTT GCAGCTGATT GCGCATGOTG CCGCAACCGT 968651 GATAAGCATG GCCACGCAGT CCAGAGAAAT CGGCATTCAAGCCAAGAACA AGCCCGGTCAGGCCACCAGA ACGCCGTGGT6841 GGTCAGCCAG AAGACACTTT CCAAGCTCAT CGGACGTTCT TTGCGGACGG TCCAATACGC8901 AGTCAAGGAC TTGGTGGCCG AGCGCTGGAT CTCCGTCGTG AAGCTCAACG GCCCCGOCAC8961 CGTGTCGGCC TACGTGGTCA ATGACCGCGT GGCGTGGGGC CAGCCCCGCG ACCAGTTGCG7021 CCTGTCGGTG TTCAGTGCCG CCGTGGTGGT TGATCACGAC GACCAGGACG AAICGCIGI IGGCGAGCAGC AACTACCGAC 7141 CGGCCCCGGC GAGGAGCCGC CCAGCCAGCC CGGCATTCCG GGCATGGAAC CAGACCTGCC 7201 AGCCTTGACC GAAACGGAGG AATGGGAACG GCGCGGGCAG CAGCGCCTGC CGATGCCCGA7281 TGAGCCGTGT TTTCTGGACG ATGGCGAGCC GTTGGAGCCG CCGACACGGG TCACGCTGCC7321 GCGCCGGTAG CACTTGGGTT GCGCAGCAAC CCGTAAGTGC GCTGTTCCAG ACTATCGGCT7381 GTAGCCGCCT CGCCGCCCTA TACCTTGTCT GCCTCCCCGC GTTGCGTCGC GGTGCATGGA7441 GCCGGGCCAC CTCGACCTGA ATGGAAGCCG GCGGCACCTCGCTAACGGAT TCACCGTTTT977501 TATCAGGCTC TGGGAGGCAG AATAAATGAT CATATCGTCA!581 AGCCTGAGCA AACTGGCCTC AGGCATTTGA GAAGCACACG GTCACACTGC TTCCGGTAGT7621 CAATAAACCG GTAAACCAGC AATAGACATA AGCGGCTATT TAACGACCCT GCCCTGAACC7681 GACGACCGGG TCGAATTTGC TTTCGAATTT CTGCCATTCA TCCGCTTATT ATCACTTATT7741 CAGGCGTAGC ACCAGGCGTT TAAGTCGACC AATAAC SEK.KIM.NO.: 25 - Sinyal sekansi ile modifiye edilmis EPA için amino asit sekansi WO 2009/ 104074Ste açiklanmistir (SEK.KIM.NO.. 6 olarak) Tip: PRT Organizma: Suni /not=" Suni sekansin tarifi: Sentetik polipeptit"Boy: 643 Sekans: Met Lys Lys He Trp LEL. Ala Leu Ala Gly Leu Va LeJ Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser A ;1 Ala GIJ Giu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys 25 30 Ala Cys Vail Lou Asp LCL. Lys Asp Gly Veil Arg Ser Sor Arg Mc: Sor 40 45 Ve! Asp Pro Ala He Ala Asp [hr Asn Gly Gin Giy Val Leu His Iyr 50 55 60 Met `u'al Leu (3.1 Gly Csiy Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala He Asp 70 75 80Asn Ala Leu Ser He Thr Ser Asp Gly Leu Thr He A'g LeL Glu Gly 9885.1 91'.] 953(5 y Vet Glu P'o Asr L'vs Pro Val Arg IV' Se' Iyr Ir“ Arq Gm Aîa100 *05110Arg Gly Ser Tr:: Ser I eu Asi' Trp l eu Va Pro He Gly Hit-s Glu l ysVE› '20 325Pro Ser Asn He Lys Vas Phe ile His (51.1 Lcu Asn Ala Giy Asn Gin "30 1351-10Leu Ser His Met Se' Pro HE T'yr Thr He Glu Mel Giy Asp GIL. Le.i 145 150 155160 Leu A'a Lys Leu Na Arg Asp Am Thr Ph& Phe Va! i'vg A-a Has (35.1Sor Asn G'u Mcî Gm Pro T'1r Lou Ala :10 Sc-r His Ala G1~,i\.-':›11180 '85 !90Vai Var Met Al:: G 0. Aia Gin Pro Arg Arg GIL Lyts Arg Trp Sei (En-195› 200 205TrL- Ala Ser Gly Lvs Val Leu Cys LGJ Leu Asp Pro Leu Asii G y VEI 210 215 220 Tyr ASI' 75;! LeLi Ala Gr!` Or' Arg Cys Asri Lcu A5:: A5::: Tîir Tip Gli. 225 230 235 240 (3 y Ly's lie Ty( Arg "mi LEU Na Gly ASI` Pro Na Lys HIS ASF: LEU245 260 22:15Asu : e Lys Asp Asn Asri Asw Ser !hr Pro I'v Va lie Ser His Ars;260 265 270luii H 5; F'he Pro Glii Gly Gly Ser l en Aia AJ'A l (H. Thr Alu HI:: (31'2/5 280 ?GbAla Gys H 5 Leu Pro LeL. GIL. Ata Pre Ih' Arg Ilis Arg Gm Pro Arg 290 295 300G y Tip Glu Gm Let. Gîu Giii Cys Gly Ty.' Pro VFîI Gm kg Liêu VHI 305 310 315 320 Ala I i_-i_; Tyr l m. Ala Alçi Arg l ini Sur TrnA5'1 Gm Va! Asp GI!` Veil`325 330 335Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Cry' Ser' Gly Oly Agp Leu Gly Olu 99340 345 350A 3 iie Arg G .1 Gm Pro Glb Gin Ala Arg Leo Ala Leu T'rr Leu Ala 35:› 360 365 A8 A a Glu Ser GIL. Arg Phe Val Arg Gir` Gly Tr" Gly Asn Asp (3 0 3/0 3/5 380 Gr; Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Va Ala390 395 -100Lys Asu Gin Asn Thr Lys Gl'y' Glu Cys A|ei G y Pro A &1 Asp Ser410 415Gr; Asp Ala Lou Lou Arg Asn Tyr Pro Tr" Gly Ala Glu Pro Lcu420 425 4.30Gry Asp Gly Gly Asp Va Se' Phc Ser Tr* Arg (3 'y' Trr Gin Asn Trp43:; 440 445Thr Va GM Arg [eu I @L Gin Ala HIS Arç; Gin I eu Glu GIL. Ars; Gly 450 455 450 Tyr Val P'ie VT: Gly Tyr His Gly T'1r Phe l eu Glo Ala A 3 Gin Ser 485 470 475 48.0 He Va Phe Gry Gly Ve! Arg Ala Arg Ser Gin Asp LEU Asp Ala He485 490 495Trp Arg Gly Ph& Tyr He Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr G y Ty'500 505 510A 3 Çin As:: Gin Glu Pro Agp Ala Arg Gly Arg He Arg Asn Gly A ;1515 590 595l eu l eu Arg Val Tyr VâI Pro A'g Tr:) Ser I eu Gly Pre Tyr Arg 530 535GM.: l en Thr L eu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glo `v'al Glo Arg565 570 575Cm Glu Glu Gly Cly Arg Val Thr lie Leu Gly Trp Pro LeLi Ala (3 o580 585 590 100Arg Thr Val Va ie Pro Ser A 8 Ire Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val 595 600 605 Gly Gly` Asp Leu Asp Pro Ser Ser lie Pro Asp Lys Glu Gin A 3 lie 610 615 820 Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin P*o Gly Lys Pro Pro Arg Glu 625 630 635 640 Asp Leu Lys SEK.KIM.NO.: 26 - PgIB için amino asit sekansi WO 2009/ 104074›te açiklanmistir (SEK.KIM.NO. 2 olarak) Boy: 722 Tip: PRT Organizma: Campylobacter je juni Met LeJ Lys Lys Glu Tyr Leu Lys Asn Pro Tyr Leu Val Leu Phe Ala 1 5 10 15 Met lie He Leu Ala Tyr Val Phe Ser Vai Phe Cys Arg Phe Tyr Trp 25 30Vazl Trp Trp Ala Sor Glu Pho Asu Glu Tyr Pro Pht: Asri Asn Gin LeuMet Iie He Ser Asw Asp Gly Tyr Ala Phe Ala GIL. Gly Ala A'g Asu 50 55 60 Met Iie Ala Gly Pre His Gin Pro Asn Asp Lar Ser Tyr Tyr ('Sly Sa' 85 70 75 80 Ser LEL Ser Ara Leu Thr Tyr Trp LeJ Tyr Lys lie Thr Pro Phe Ser85 90 95Pre G .1 Ser lie lie Leu Tyr Met Ser Thr Phe Le.] Ser Ser Leu Val'00 105 110Ve! lie Pro Thr her 1 eu l eu Ala Asn Glu Tyr l y.? Arg Pro l eu Met'15 120 125(W Phe Val Ala Ala Leu Leu Ala Ser ie Ala Asn Ser Iyr Iyr Asn '30 135140 101Arg Thr Mel Sor Gly Tyr T'yr Asp TH Ass:: Mc“. l ou Veil 10 Val l LEL. 1d!) 1130 '15?) 1613 Pro Me: Phe e Le.i Pre Phe Me: Val Arg Met iie LEJ Lys Lys Asu165 '70 175[31`e Ph& Ser l :-10 l e Ala l eu Pro l a. Ph& lie (513: ie Tyr l eu Tr::180 '85 190Irp I'y'r Pro Ser Ser Iyr In' Leu Asu` '-fal Ala Leu lie Gly Leu Phe195 200 205[eu lie Tyr Tfir l ea ie Phe His Arg 1 'y's Glu l ys lie P'ie Tyr lie ?10 ?15 770Ala Val le Le.i Ser Ser Leu Mr Leu Ser Asn Iie Ala I'p Phe Iyr 225 230 235 210 Gin Ser Ala He He Va1 He LeJ Pre Ala LEL Phe Am Let. OIL. cm?45 ?50 ?55 Arg l &0 Asu P'îe Mel lie HE: Gly He I eu Gly Ser i^~|z1Thrleu260 ?85 270Pro Lou o Lcu Ser Gly G 1./ VE” A5:) Pro Lou Tyr (3 n LCJ 2/1› 280 28:› Lsi's Phe Ty' 1 e Phe Arg Ser Asp GIL Ser A a Leu Twr Gin Gly 290 295 Me: Tyr Phe Asn Val Asn Gm T'îr He G r* Val GLJ Asn Va.TO 315 320Asp Lou Ser Gm Phc Mcî A'g A'g Ho Ser (315! Scr Glu He Val Fm 325 330 335Lau P'ie Sar Lei. PheGI~_.i*P'1eV2ITr;'J Leu Law Arg Lys His Lys Ser 340 345 3.50Mc: lie Mcî A a Lou P'o HC Lou Val Lcu Gly F'hc- Lou A1& Lou Lys355 380 385G y 01-; Len Arg Phe Thr He Ty' Se Va Pro Met Ala Lan G y 370 375 (3 'y Ph& I mi l nu Sur GIL. P'u': 1 vs; A ;i He Mel Va] [ ~_.i':; l yi; Ty'390 395 "-00Ser Gin Leu Thr Ser Asim Val Cys He Va] Ph& Ala Thr He Leu Th' 102405 410 41:)Leu Ala Pro Val P'ic He His He Tyr Asn Tyr Lys Ala Pro Trr `»fal420 425 430Phe Ser Gm Asn G J A a Ser Let, Leu AS'I Giri Leu L'ys Asi' He Ala 435 440 445Asn Arg Glu As: Tyr Val `mi Thr Trp- A 3 Ala Gly TyrPr0`iJaIc150 455 Arg Ty” Tyr Ser Agp Val Lys Thr Leu Val ASp Giy Gly Lys His Leu 465 470 475 480 611./ Lys Asp Asn Phe Phe P'o Ser Phe Ala Le.i Ser Lys Asp Glu Gm 485 490 495Ala Ala Ala Asn Met Ala Arg Leu Ser Val Glu Tyr Thr Glu Lys Ser 500 505 510Phe Ty' A :1 Pro Gin Asn Asp H& I eu I ys Thr Asp lie l eu Gin Ala515 570 5?07Mel Mel Lys Asp Tyr Asw Gii` 86' Asn Val Asp Le`i P"ie Leu Ala Ser 530 535 540 Leu Ser Lys Pro Asp Phe Lys he Asp Trr P'o Lys Thr Arg Asp le 5-45 5550 555 560 Tsrr Leii Tyr Met Pro Ala Arg Met Ser Let. he Ph:: Ser Thr Val Ala555 570 575Phe Ser Phe lie Asn Leu Asp Thr Gly Va Leu Asu Lys Pro P'ie580 585 590Thr Phc Sor Tr' A 8 Tyr Pro Leu Asp Val Lys Asn Gly Glu Ic Tyr595 600 605Leu Ser Asr1G\','\/a|`v'a| Leu Ser Asp Asu P'u: Arg Ser Pre Lys lie 810 610 '320 (311.1 Ass Asn vm `."8|SE`1F`«"8|ASI` Se' lie Val GIL. Iie ASI` Ser l e 625 630 635 640 Lys Gir` C y Giu Tyr Lys lie Thr Pro Iie As:: Asp Lys Ala Gir` PM:6115 650 655 Tyr lie Phe Tyr Leu Lys Asp Ser Ala He Pro Tyr Als GM Pwe 103660 665 670 Leu Mel ASD Lys Ihr mm Prie Asn Ser Aâa Tyr Val Gm Me: Prie- @ne 6/5 680 685 Leu Gly Asn Tyr Asp i ys Asn Lu Phe Asp Leu Va! lie Asr Ser Arg 690 695 700 Asp Ala Lys Val Phe I 5 [eu Lvs lie Tyr Pro Ty' Asp Vr-.l Pro Asp 705 710 715 720 Tyr Am SEK.KIM.NO.: 27 - pCCIFOS Bos plazmidi için nükleotit sekansi Yer MCS kaseti ile pCCIFOS Ozellikle Lokasyon/niteleyiciler Bölge 230.256 /etiket="pCCl/pEpiFOS fWd" Bölge 311.330 /etiket="T7 promoteri" Bölge koinplementi(504..529) /etiket="pCCIpEpiFOS I'V" CDS komplementi(805..1464) /etiket=cat CDS 16832030 /etiketzredF CDS 3425..4180 /etiket=repE CDS 4759..5934 /etiket=parA CDS 5934..6905 /etiket=parB KAYNAK Boy: 8171 bp Tip: DNA dairesel UNA 104Organizma: Suni Sekans:' GCGGCCGCAA GGGGTTCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTGCTTAACTATG51 CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGÄGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACÂGAT' 21 GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT CAGCTGCGCA ACTGTTGGGAGCGAAAGGGG GATGTGCTGC2 1 AAGGCGATTA AGTTGGGTAA CGC CAGGGTT TTCCCAGTCA CGACGTTGTA AAACGACGGCCTCGGTACCC GGGGATCCCA361 CGTGGCGCGC CACTAGTGCT AGCGACGTCG TGGGATCCTC TAGAGT CGAC CTGCAGGCAT421 GCAAGCTTGA GTATTCTATA GTCTCACCTA AATAGCTTGG CGTAAT CATG GTCATAGCTG481 TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA541 AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA601 CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGCGTTT GACA GC`, TTATCATC (3A721 ATTTCTGCCA TTCATCCGCT TATTATCACT TATTCAGGCG TAGCAACCAG GCGTTTAAGG 105CAC1CÄICGC AGIACIGT 10841 TAATTCATU\ AGCATTCTGC CGACATGGAA GCCATCACNX ACGGCATGAT GAACCTGAAT901 CGCCAGCGGC ATCAGCACCT TGTCGCCTTG CGTATAATAT TTGCCCATGG TGAAAACGGG961 GGCGAAGAAG TTGT C CAT AT TGGCCACGTT TAAATCAAAA CTGGTGAAAC TCACCCAGGG1021 AT TGGCTGAG ACGAAAAACA TATTCTCAAT AAACCCTTTA GGGAAAIAGG CCAGGI 1 1 IC1081 AC CGTAACAC GCCACATCTT GCGAATATAT GTGTAGAAAC1'4111CACICCAG AGCGA1GAAA ACGI 1 ICAGI IIGÇICAIGG AAAACGCTOT AACAAGGGTG1201 AACACTATCC CATATCACCA GCTCACCGTC TTTCATTGCC ATACGAÂATT CCGGATGAGC'1261 ATTCATCAGG CCGGCAAGAA TGTGAATAAA GGCCGCATAA AACTTGTGCT TATTTTTCTT1321 TACGGTCTTT AAAAAGGCCG TAATATCCAG CTGAACGGTC [(561 IAIAGG IACAI IGAGC1381 AACTGACTGA AATGCCTCAA AATGTTCTTT ACGATGCCAT TGGGATATAT CAACGGTGGT1441 ATATCCÂGTG ATTTTTTTCT CCATTTTAGC TTCCTTAGCT CCTGAAAATC TCGATAACTC1501 AAAAAATACG CCCCGTAGTG ATCTTATTTC ATTATGGTGA AAGTTGGAAC CTCTTACGTG1 [CCCGGIAT CAACAGGGAC1G?1 AC C AGGATTT ATTTATTCTG CGAÂGTGATC TTCCGTCACA GGTATTI'ATT CGCGATAAGC1681 ICAIGGAGCG GCG IAACCGI CGCACAGGAA GGACAGAGAA AGCGCGCATC TCCCAAGTGA1741 CGGACAGAAC GGTCAGGACC TGGATTGGGG AGGCGGTTGC 106IICCIAIGCGAIGCACAIGC1861 TGT/`\TGCCGG TATACCGCTG IKAAGTTCTGC AAAGCCTGATGGGACATAAG TCCATCAGTT1921 CAACGGAAGT CTACACGAAG GTTTTTGCGC TGGATGTGGC TGCCCGGCAC CGGGTGCAGT1981 TI'GCGATGCC GGAGTCTGAT GCGGTTGCGA TGCTGAAACA ATTATCCTGA GAATAAATGC2041 CTTGGCCTTT ATATGGAAAT GTGGAACTGA GTGGATATGC !(31 1 1 1 1610 161 IAAACAG9' 01 AGAAGCTGGC TGTTATCCAC TGAGAAGCGA ACGAAACAGT C G G GAAAATÇ TÇÇÇ ATT/"TCL 2'61GIAGAGAICC GCAI 1A] IAA ICICAGGAGC CTGIGIAGCG TTTATAGCAA GTAGTGTTCT2221 GTCATGATGC CTGCAAGCGG TAACGAAAAC GATTTGAATA TGCCTTCAGG AACAATAGAA`2281 ATCTTCGTGC GGTCTTACGT TGAAGTGGAG CGGATTATGT CAGCAATGGA CAGAACAACC2341 TAATGAACÂC AGAACCATGA TGTGGTCTGT CCTTTTACAG CCAGIÂGIGC TCGCCGCAGI2401 CGAGCGACAG GGCGAAGCCC TCGGCTGGTT GCCCTCGCCG CTGGGCTGGC GGCCGTCTAT2461 GGCCCTGCAA ACGCGCCAGA AACGCCGTCG AAGCCGTGTG CGAGACACCG CGGCCGGCCG2521 CCGGCGTTGT GGATACCTCO COGAAAACTT GGCCCTCACT2581 TGACACTTGA GGGGCCGAÇT CACCÇGGCGC GGCGTTGACA GAIGAGGGGÇ AGGCICGAHGAAAACGCCT GATTTTACGC 2701 GAGI I [CCC/`1 CAGAI GA] GI GGACAAGCCI GGGGAIAAGI GCCCTGCGGT ATTGACACTT2761 GAGGGGÇGCG ACTACTGACA GATGAGGGGC GCGATCCTFG ACAÇTTGAGG GGÇAGAGTGÇ 1072821 TGACAGATGA GGGGCGCACC TATTGACATT TGAGGGGCTG IÇCACAGGCA GAAAAI CCAG2881 CATTTGCAAG GGTTTCCGCC CGTTTTTCGG CCACCGCTAA C C TGTC TTTT AAC CT G C TTT2941 TAAAC CAATA TTTATAAACC TTGTTTTTAA CCAGGGCTGC (BCCCTGTGCG CGTGACCGCG3001 CACGCCGAAG GGGGGTGCCC CCCCTTCTCG AACCCTCCCG GTCGAGTGAG CGAGGAAGCA3051 CCAGGGAACA GCACTTATAT ATTCTGCTTA CACACGATGC CIGAAAAAAC IICCCI !(5663' ?1 GTTATCCACT TAT C CACGGG GATA I I IA TAATTAT I TTTTATAGTT TTTAGATÇTT3'6-1 Cl I 1 11 IAGA GCGCCI IGIA GGCCI I IAIC CAIGCIGGII CTAGAGAAGG TGTTGTGACA3241 AATTGCCCTT TCAGTGTGAC AAATCACCCT CAAATGACAG TCCTGTCTGT GACAAATTGC3301 CCTTAACCCT GTGACAAATT GCCCTCACAA GAAGCTCT TT TTTCACAAAG TTATCCCTGC3361 TTATTGACTC TTTTTTATTT AGTGTGACAA TCTAAAAACT TGTCACACTT CACA1GGA103421 TGTCATGGCG GAAACAGCGG TTATCAATCA CÄAGAAACGT AAAAATAGCC CGCGAATCGT3481 CCAGTCAAAC GAÇCTCACTG AGGCGGCATA TAGTCTCTCC CGGGATCAAA AACGTATGCT3541 GTATCTGTTC GTTGACCAGA TCAGAAAATC TOATGGCACC CTACAGGAAC ATGACGGTAT3601 CTGCGAGATC CATGTTGCTA AATATGCTGA AATATTCGGAI IGACCICTG CGGAAGCCAG3651 TAAGGATATA CGGCAGGCAT TGAAGAGTTT CGCGGGGAAG GAAGTGGTTT TTT/'JCGCCC3721 IGAAGAGGAI GCCGGÇGAIG AAAAAGGCIA IGAAICI I II CCTTGGTTTA TCAAACGTGC3781 GCACAGTCCA TÇCAGAGGGC TTT/"CAGTGT ACATATCAAÇ CCATATCTÇA TTCCÇTTÇTT 1083811 TATCGGGTTA CAGAACCGGT TTACGCAGTT TCGGCTTAGT GAÂACAAAAG AAA I CACCAA3901 TCCGTÄTGCC ATGCG AT ACGAATCCCT GTGT CAGTAT CGTAAGC OGG ATGGCTCAGG3981 CATCGTCTCT CTGAAAATCG ACTGGATCAT AGAGCGTTAC CAGCTGCCTC AAAGTTACCA4021 GCGTATGCCT GACTTCCGCC GCCGCTTCCT GCAGGTCTGT GTTÂATGÄGA TCÄACAGCAG4081 AACTCCAATG CGCCTCTCAT ACATTGAGAA AAAGAAAGGC CGCCAGÄCGA C1CA1AICG14' 41 ATTTTCC-ITC CGCGATÄTCA CTTCCATGAC GACAGGATAGTÇTGA GC: GTT ATÇTGTÇAÇA4201GA1IIGAGGG [GGIICGICACAHIGIICIGACCTAC1GA GGGTAATTTG TCACACTTTT4261 GCTGTTTÇCT TÇAGCCTGCA TGGATTTTCT CATACTTTTT GAACTGTAAT TTTTAAGGAA4321 GCCAAATTTO AGGGCAGTTT GTCACAGTTC ATTTCCTTCT CTTTCCCTTC GTCATGTGAC4381 CTGATATCGG GGGTTAGTTC GTCATCATTG »ÂTGÂGGGTTG A1 IATCACAG IIIAI [ACIC4451 TGAATTGGCT ATCCGCGTGT GTACCTCTAC CTGGAGTTTT TCCCACGGTG GATATTTCTT4501 CTTGCGCTGA GCGTAAGAGC TATCTGACAG AACAGTTCTT CTTTGCTTCC TCGCCAGTTC4561 CCTCGCTATG CTCGCTTACA CGGCTCCCGC GAGCGCTAGT GATAATAAGT GACTGAGGTA4621 TGTGCTCTTC TTATCTCCTT TTGTAGTGTT GCTCTTATTT TAAACÂACTT IGCGGI 1 I 1 I4681 TGATGAC I I GCGATTTTGT TGTTGCTTTG CAGTAAATTG CAAGATTTAA TÄÂAÂÄA AC G4741 CAAAGCAAIG AI IAAAGGAI GI ICAGAAIG AAACICAIGG AAACACTTAA CCAGTGCATA4801 AAÇGCTGGTC )'\TGI\/`\/`\TGAC GAAGGCTATC GCCATTGCAC AGTTTAATGA TGACAGÇCÇG 1094861 GAAGCGAGGA AAATAACCCG GCGCTGGAGA ATAGGTGAAG CAGCGGAI I I AGI IGGGGII4921 TCTTCTCAGG CTATCAGAGA TGCCG/\GAAI`\ GCAGGGCGAC TACCGCACCC GGATATGGAA4981 ATT CGAGGAC GGGTTGAGCA ACGTGTTGGT TATACAATTGAACAAATTAA TCATATGCGT503.1 GATGTGTTTG GTACGCGATT GCGACGTGCT GAAGACGTAT5 ' 01 GCTGCCCATA AAGGTGGCGT TTACAAAACC TCAGTTTCTG I ICAICI IGC ICAGGAICIG5' 61 GCTCTGAAGG GGCTACGTGT TTTGCTCGTG GAAGGTAACG 5221 AIGIAI CACG GAIGGGIACC AGAICI ICAI Al ICAIGCAG AAGACACTCT CCTCCCTTTC'0281 TATCTTGGGG AAAAGGACGA TGTCACTTAT GCAATAAAGC CCACTTGCTG GCCGGGGCTT5341 GACATTATTC CTTCCTGTCT CCCTCTGCAC CGTATTGAAA CTGAGTTAAT GGGCAAATTT5401 GATGAAGGTA AACTGCCCAC CGATCCACAC CTGATGCTCC GACIGGCCAT IGAAACIGH5461 GCTCATGACT ATGATGTCAT AGTTATTGAC AGCGCGCCTA ACCTGGGTAT CGGCACGATT5521 AATGTCGTAT GTGCTGCTGA TGTGCTGATT GTTCCCACGC CTGCTGAGTT GTTTGACTAC5581 ACCTCCGCAC TGCAGTTTTT COATATOCTT CGTGATCTCC TCAAGAACGT TGATCTTAAA5.1641 GGGTTCGAGC CTGATGTÄCG TÂTTTTGCTT ACCAAATACA GCAAIAG IÄA IGGCIC I CAG5701 TCCCCGTGGA TGGÂGGAGCA AATTCGGGAT GCCTGGGGÂÄ GCATGGTTCT f\2'\iV\/\I'\TG1T5761 (5 I ACG I GAAA CGGA I GAAGI [GG IAAAGGI CAGA I CCGGA TGAGÄACTCT TTTTCAACAG5821 GCCATTGATC AACGCTCTTÇ AACTGGTGCC TGGAGAAATG CTCTTTÇTAT TTGGGAACCT 110'0881 GTCTGCAATG AAATTTTCGA TCGTCTGATT AAACCACGCT GGGAGAI [AG AIAAIGAAGC5941 GTGCGCCTGT TATTCCAAAA CATACGCTCA ATACTC "CC GGTTGAAGAT ACTTCGTTAT6001 CGACACCAGC TGCCCCGATG GTGGATTCGT TAATTGCGCG CGTAGGAGTA ATGGCTCGCG6061 GTAATGCCAT TACI GCCT GTATGTGGTC GGGATGTGAA GTTTACTCTT GAAGTGCTCCG ' 21 GGGGTGATAG TGTTGAGAAG ACCTCTCGGG TATGGTCAGG IAAIGMCGI GACCAGGAGC8' 81 TGCTTACTGA GGACGCACTG GATGATCTCA TCCCTTCTTT TÇTAÇTGAÇT GGTÇAAÇAGA62:11 CACCGGCGH CGGTCGAAGA GIAICIGGIG ICAIAGAAAI TCCCGATGGG ACTCCCCGTC6301 GTAAAGCTGC TGCACTTACC GAAAGTGATT ATCGTGTTCT GGTTGGCGAG CTGGATGATG6361 AGCAGATGGC TCCATTATCC AGATTGCGTA ACGATTATCG CCCAACAÄOT GCTTATGAAC6421 GTGGTCAGCG TTATGCAAGC CGATTGCAGA ATGAATTTGC I GGAAAIAH ICIGCGÇIGG6481 CTGATGCGGA AAATATTTCA CGTAAGATTA TTACCCGCTG TATCAÄCACC GCCAAATTGC6541 CTAAATCAGT TGTTGCTCTT TTTTCTCACC CCGGTGAACT ATCTGCCCGG TCAGGTGATG93801 CACTTCAAAA AOCCTTTACA OATAAAGAOG MTTACTTAA GCAGCAGGCA TCTAACCTTC6661 ATGAGCAGAA AAAAGCTGGG GTGATATTTG AAGCTGAAGA AGI IAICACI Cl 1 I 1AACH(3791 CTGTGCTTAA AACGTCATCT GÇATCAAGAA CTAGWTAAG CTCACGACAT CAGTTTGCTC'5-781CIGGAGCGAC AGIAI IGIAI AAGGGCGAIA AAAIGGTGCI TAACCTGGAC AGGTCTCGTG6841 TTCCÂACTGA GTGTATAGAG I\/`\i"\ATTGAGG CCATTCTTAA GGAAÇTTGAA AAGCÇAGÇAC lll6901 CCTGATGCGA CCACGTTTTA GTCTACGTTT ATCTGTCTTT ACTTAATGTC CI l IGI IACA8951 GGCCAGAAAG CATAACTGGC CTGAATATTC TCTCTGGGCC CAÇTGTTCCA CTTGTATCGT7021 CGGTCTGATA ATCAGACTGG GACCACGGTC CCACTCGTAT CGTCGGTCTG ATTATTAGTC7081 TGGGACCACG GTCCCACTCG TATCGTCGGT CTGATTATTA GTCTGGGACC ACGGTCCCAC7141 TCGTATCGTC GGTGTGATAA TCAGACTGGG ACCACGGTCC CACICGIAIC GICGGICIGA 7701 TTATTAGTCT GGGACCATGG TCCCACTCGT ATCGTCGGTC TGATTATTA (3 TÇTG G (3 AÇ ÇA 7261CGGICCCACI CGIAICGICG GICIGAI IAI IAGICIGGAA CCACCGTCCC ACTCCTATCG7321 TCGGTCTGAT TATTAGTCTG GGACCACGGT CCCACTCGTA TCGTCGGTCT GATTATTAGT7381 CTGGGACCAC OATCCCACTC GTOTTGTCCO TCTGATTATC GGTCTGGGAC CACGGTCCCA7441 CTTGTATTGT CGATCAGACT ATCAGCGTGA GACTACGATT CCATCAAIGC CI GICAAGGG7501 CAAGTATTGA CATGTCGTCG TAACCTGTAG AACGGAGTAA CCTCGGTGTG CGGTTGTATG7551 CCTGCTGTGG ATTGCTGCTG TGTCCTGCTT AT C C AC AAC A TTTTGCGCAC GGTTATGTGG7621 ACAAAATACC TGGTTACCCA CGCCGTOCCG GCACGTTAAC 7681 TGTGTCGCTG TCGACGAGCT CGCGAGCTCG GACATGAGGT IGCCCCGIFH ICAGIGICGC7741 TGATITGTAT TGTCTGAAGT TGTTTTTACG TTAAGTTGAT GCAGATCAAT TMTACGATA7801CCIGCGICAIAAIIGAI1AI HGACGIGGI IIGAIGGCCI CCACGCACGT TGTGATATGT7851 AGATGATAAT CATTATCACT TTACGGGTCC I CCGGTGA 1127921 CGACCTCGCG GGTTTTCGCT ATTTATGAAA ATTTTCCGGT T TAAGGCGT'T TCCGTTCl TC798`i TTCGTCATAA CTTAATGTTT TTAT'TTAAAA TACCCTCTGA AAAGAAAGGA AACGACAGGT8041 GCT'GAAAGCG AGCTTTTTGG CCTCTGTCGT TTCCTTTCTC TGTTTTTGTC CG I (SG/&Al (BA8101 ACAAT GGAAG TCKIGAGCTCA TCGCTAA'TAA CTTCGTATAG CATACA TTAT ACGAAG l TAT8181 ATTCGATCCASEK.KIM.NO.: 28 - Kesilmis pCCIFOS (pFOS) ve Z3206”siz S. flexneri 6 O-antijen için nükleotit sekansiYer kesilmis pFOS ve kesilmis O-antijen (-Z3206)Tanim NheI ve AscI ile kesilmis MCS kasetli devrik pCCIFOSsun galFNheI ile amplifiye edilmis S.flexneri 6 O anti jen kümesi ve NhrI ve AscI ile kesilmis WZZAscI içine ligasyonuÖZELLIKLER Lokasyon/niteleyicilerCDS 3..411/etiket='galFCDS 784..1869/etiket=rmIBCDS l869..2768/etiket=rmIDCDS 2826.3704/etiket=rmIACDS 3709..4266/etiket=rmICCDS 4263..5495/etiket=wzxCDS 5551..6738/etiket=wzy113CDS 6755..7624/etiket=wfbYCDS 7621.8454/etiket:wfbZCDS 8559..9965/etiket=gndCD810187..11380/etiket=ugdCDS komplementi(1 1446..12450) /etiket=ugeCDS 1280212828/etiket=wzz'Bölge komplementi 1286812887) /etiket:"T7 promoteri"Bölge komplementi 1294212968) /etiket="pCCI/pEpiFOS fWd" CDS kompleinenti(14460..15431) /etiketîparBCDS komplementi 15431 .. 16606) /etiket=parACDS komplementi 1718517940) /etiket=repECDS komplementi 193 35.. 1 9682) /etiket=redFCDS 19901..20560/etiket=catBölge 2083620861 /etiket:"pCClpEpiFOS rV" 114Boy: 20982 bp Tip: DNA dairesel UNA Sekans:1' CTAGCGGCAA AACGTATGCC GGGTGACCTC TCTGAATACT CCGTCATCCA GACCAAAGAA61 CCGCTGGATC GCGAAGGTAA AGTCAGCCGC ATTGTI'GAAT TTATCGAAAA ACCGGATCAG' ?1 CCGCAGACGC TGGACTCAGA CATCATGGCC GTTGGTCGCT ATGTGCTTTC TGCCGATATT' 81 TGGCCGGAAC TTGAACGTAC TCAGCCTGGT GCATGGGGAC GTATTCAGCT GACTGATGCC241 ATTGCCGAGC TGGCGAAAAA ACAGTCCGTT GATGCAATGC TGATGACCGG CGACAGCTAC301 GACTGCGGTA AAAAAATGGG CTATATGCAG GCGTTTGTGA AGTATGGGCT GCGCAACCTG361 AAAGAAGGGG CGAAGTTCCG TAAAGGTATT GAGAAGCTGT TAAGCGAATA ATGAAAATCT421 GACCGGATGT AACGGTI'GAT AAGAAAATTA TAACGGCAGT GAAGATTCGT GGTGAAAGTA481 AT TTGT TGCG AATATTCCTG CCGTTGTTTT ATATAAACAA TCAGAATAAC AACGAGTTAG541 CAATAGGATT TTAGTCAAAG TTTTCCAGGA TTTTCCTTGT TTCCAGAGCG GATTGGTAAG601 ACAATTAGCT TTTGAATTTT TCGGGTTTAG CGCGAGTGGG TAACGCTCGT CACATCGTAG661 GCATGCATGC AGTGCTCTGG TAGCTGTAAA GCCAGGGGCG GTAGCGTGÇA TTAATAÇTTC 115IGGAAIAAAI781 TAGGTGIVVRA TACTTGTTAC TGGTGGCGCÄ GG/'ÜTTATTG GTTTTGCTGT AGTTCGTCAC841 ATTATAAATA ATACGCAGGA TAGTGTTGTT AATGTCGATA AATTAACGTA CGCCGGAAAC901 CTGGAATCAC TTGCTGATGT TTCTGATTCT GAACGCTATG T GAACA TGCGGATATT961 TGCGATGCAG CTGCAATGGC ACGGATTTTT GCTCAGCATC AGUCAGAT GC AG I GA 1 GCAC1091 CTGGCTGCTG AAAGCCATGT TG/`\CCGTI'CA ATTACAGGTC CTGCGGCATT TFJTGAAACC108-1AAIAIIGIIG GIACAIAIGI CC! 11 IGGAA GCCGCICGCA ATTATTCCTC TGCTCTTGAT'41 AGCGACAAGA AAACTAGATT CCGTTTTCAT CATATTTCTA CTGACGAAGT CTATGGTGAT1201 TTGCCTCATC CTGACGAGGT AAATAATACA GAAGAATTAC CCTTÄTTTAC AGAGACAACACCAGCGATCA TTTAGTCCGC1321 GCGTGGAAAC GTACCTATGG TTTACCAACC ATTGTGACTA ATTGCTCTAA TAATTATGGT1381 CCTTATCATT TCCCGGÂAAA ATTGATTCCA TTGGTTATTC TGAATGCTCT GGAAGGTAAG14.11 GCATTACCTA TTTATGGCAA AGGCGATCAA ATTCCTGACT GGCTGTATGT TGAAGATCAT1501 GCGCGTGCGT TATATACCGT CGTAACCGAA GGTAAAGCGG GTGAAACTTA TAACATTGCT1581 GGACACAACG AAAAGAAAAA CATCGATGTA GTGCTCACTA IIIGIGAI I I GCIGGAIGAG1621 ATTGTACCGA AAGAGAAATC TTACCGCGAC CAAATTACTT ATGTTGCCGA TCGCCC &GGA1681 CACGA1CGCC GI IAIGCGAT IGAIGCAGAG AAGAI IAGCC 116GC GAATTGGG CTGGAAACCG 174 ' CAGGAAACGT TTGAGAGCGG GATTCGGAAG ACATTGGAAT GG TACCTGTC CAATACAAHA"180' IGGGI IGAIAAIGIGAAAAG IGGIGCI IAI CAAICGIGGA TTCAACAGAA CTATGAGGCC186' CGCCAGTAAT GAATATCCTC CTTTTCGGCA AAACAGGGCA GGTAGGTTGG GAACTACAGC192' GTGCTCTGGC ACCTTTGGGT AATTTGATTG CTCTTGATGT TCACTCCACT GATTATTGTG198' GTGATTTTAG TAATCCTGAA CGTGTAGCTG AAACAOTCAA AAGAATTCGA CCTGATGTTA204' TI'GTTAATGC TGCGGCTCAC ACCGCAGTAG ATAAGGCTGA GTCAGAACCC GAAT TT GCAC2î0' AATTACTCAA TGCGACTAGT GTTGAATCAA TTGCAAAAGA GGCTAATGAA GTTGGGGCTT216“ GGGTAATTCA TTACTCAACT GACTACGTAT TCCCTGGAAA TGGCGACACG CCATGGCTGG222' AGACGGATGC AACCGCACCG CTAAATGTTT ACGGTGAAAC CAAGTTAGCC GGAGAAAAAG228” (301 !ACAGGA ACAI IGCGCG AAGCAICI IA IIHCCGIAC CAGCTGGGTA TACGCACCTA234' AAGGAAATAA CTTCCCCAAA ACGATGTTGC GTCTGGCAAA AGAGCGCGAA GAACTGGCTG?40” TGATAAATGA TCAATTFGGT GCGCCAACAG GTGCTGAGCT (SCTGGCTGAT TGTACGGCAC2:16' ATGCTATTCG TGTGGCACTG AATAAACCGG AAGTCGCAGG IIIGIACCAI CIGGIAGCCA252" GTGCTACCAC AACCTGGCAC GATTATGCTG CGCTCGTTTT TGAAGAGGCG CGCAAAGCAG258' GTATTCCCÇT TGCACTCAAC AAGCTCAACG CAGTACCAAC AACAGCCIAT CCIACACCAG 117264' CTCGTCGTCC ACATAACTCT CGCCTTAATA CAGAAAAATT TCAGCAGAAC TTTGCGCTTG?70* TCTTGCCTGA CTGGCAGGTT GGTGTGAAAC GAATGCTCAA CGAATTAATT ACGACTACAG276' CAATTTAATA GTTTTTGCAT CTTGTTCGTG ATGGTGGAGC AAGATGAATT AAAAGGAATG282' ATGAAATGAA AACGCGTAAA GGTATTATTT TAGCGGGTGG TTCTGGTACA CGTCTTTATC288' CIGIGACIAI GGCIGICAGT AAACAGCIAI IACCTAI I IA TGATAAGCCG ATGATCTATT794* ACCCGCTCTC TACACTGATG TTGGCGGGTA TTCGCGATAT TCTGATTATT AGTACGCCAC300' AGGATACTCC TCGTTTTCAA CAACTGCTAG GTGACGGTAG CCAGTGGGGG CTAAATCTTC306' AGTACAAAGT GCAACCGACT CCAGATGGGC TTGCGCAGGC GTTTATTATC GGTGAAGAGT312' TTATCGGTGG TGATGATTGT GCTTTGGTTC TTGGTGATAA TATCTTCTAC GGTCATGATC318' TGCCGAAGTT AATGGATGTC GCTGTTAACA AAGAAAGTGG TGCAACGGTA TTTG'CCTATC324' ACGTTAATGA TCCTGAACGC TACGGCGTCG TTGAGTTTGA TAAAAACGGT ACGGCAATAA330' GCCIGGAAGA AAAACCGCIA CAACCAAAAA GIAAI [A I GC GGTAACCGGG CTTTATTTCT336' ATGATAACGA CGTTGTCGAA ATGGCCAAAA ACCTTAACCC TTCTGCCCGT GGTGAACTGG342' AAATTACCGA TATTAACCGT ATTTATATGG AACAGGGGCG TTTATCCGTT GCCATGATGG348' GGCGIGGI IA IGCA I GGCIG GAIACGGGGA CACHCAGAG TCTTAT-TGAA GCAAGCAACTCIGCCCAGAA GAAAI IGCII 1183601 ACCGTAAAGG GTTTATTGAT GCTGAACAGG TGAAAGCATT AGCGGAGCCG CTGAAAAAAA3661 ATGCITATGG ACAGTATCTG CTGAAAATGA TTAAAGGTTA TTAATAAAAT GAACGTAATT3/21 AAAACAGAAA TTCCTGATGT GTTAATTTTC GAGCCGAAAG TTTTTGGTGA TGAGCGTGGT3781 TTCTTTATGG AAAGCT'ITAA TCAGAAAGTT TTCGAAGAAG (3 I (3 IAGGACG I AAGG I IGAA3841 TTTGTTCAGG ATAACCATTC GAAGTCTAGT AAAGGTGTTT TACGCGGGCT GCAWATCAG3901 TTAGAACCTT ATGCGCAAGG GAAACTGGTA CGTTGCGTTG TTGGTGAGGT TTTTGATGTA3981 GCTGTTGATA TTCGTAAATC GTCGC `TACC TTTGGTAAAT GGGTTGGGGT GAATI'TATCTCACATGGTTT TTTGGTGCTG4081 AGCGAGACTG CGGAATTTTT ATÄTAAAACG ACGAACTATT ATCATCCTGA TAGTGATAGA4141 (SGGAI IGIAI GGAAIGAICC [A1 ICTGAGC AIAAAAIGGC CGACGATAGA ACATAATAAT4201 TATATTTTAT CGATTAAAGA TGCAAGGGCT AAAGAATTGC ATAACATGAA GGAATTATTT4261 TTGTGAGTAT TGTAAAGAAT ACTTTATGGA ATATAAGTGC GTATATTATA (XIAICAI IAA4321 TAGCAATTCC TGCGTTAGGT ATACTGTCTA GAATTCTAGG GACCGAGCAA TTTGGCCTTT4381 TTACGTTAGC TATTGCCTTA GTTGGATATG CAAGTATTTT TGATGCTGGA TTGACCAGAG4441 CTGTTATAAG AGAAGTATCA ATATATAAAA ATGTTCATAA AGAATTAAGA GCGATCATTT4501 CAACTTCAAC GGTAATTCTA ACTATATTGG GCTTGATTGG CGGTAGTGTA CTATTTTTGA 1194561 GTAGCAATGT AATTGTTAAA TTATTAAACA TTAACGCGAA TCATGTTGTA GAATCTGTCA4621 AAGCAATATA TATTATTTCA GCTACCATAC CCTTATACTF GTTAAACCAA GTCTGGTTGG4681 GGATTTTTGA GGGGATGGAA AAGTTCAGAA AAGTAAATTT AATAAAATCA ATTAACAACT4741 CTTTTGTGGC TGGATTACCA GTGATTTTCT GT TTTTTCA TGGAGGATTA (JIAAGIGCIA4801 TATATGGTTT AGTTATGGCA AGAGTCTTAT CACTTATAGT GACCTTTATA TTTAGTCGAA4861 AACTAATAAT ATCATCTGGG CTGTCTGTAA AAATTGTAAC AGTTAAAAGA TTAATCGGCT4921 TTGGAAGCTG GATAACAGTT AGCAATATTA TTAGCCCTAT TATGACATAT ATGGATCGTT4981 TTATTCTTTC ACACATTGTG GGGGCTGATA AAGTTTCTTT TTATACTGCTCCGTCTGAAG5041 GTATACAACG CTTAACGATA TTACCAAGTG CGTTGTCCAG AGCTATTTTT CCAAGATTAA5101(511(JAGAA11(SCAAIOGGIAAAGCAAAC1AAAA1A11AICA1A1111AIA ATGGTTATTG5161 GTATACTTCC AATTGTAATG TTGATAATTA TTTTATCAGA TTTTATAATG TCCGCTTGGA5221 TGGOACCTAC ATATCATOGG ACGCCAGGTA TAGTATTAAA AA11(311(3(3AA1AG(3111(315281 TTTTTAATTG CATTGCACAA ATCCCATTTG TTTCAGTTCA GGCTAGTGGA AGATCAAAAA5341 TTACAGCTAT TATTCATTTG CTCGÄAGTTA TCCCATATTT ATGCATATTA TATATTTTTA5401 TTTATCATTG GGGAATTGTT GGAGCCGCAA TAGCATGGTC TGTAAGAACA TCGTTAGATT5461 TTTTGATATT ATTATTAATT GATACGAAAT ATTAATAGCG AATTGATTTT AGGGATTACT 12053521 TCCTCAAGCC CATCTAATTA GAGTGCAAAC ATGACTTCTG A FF] ATAA CICAAAAGAC5581 AfxAAGTTT/Vx GTGTTCTTTT GTTI'TTTGGG TTTATATTTT TCCTI'ACACG TAGCTTTCCA56:11 TTTATTCAAT ATAGTTGGAT TATGGAGGGG TTTTTATGTC TTTGTATCAT GTCATTTACA5701 AAGAAAATTG CAAACGGAAT ATATCACTAT CCTGTTATTT TAATATTTCT ATTAGCTCTT5761 TTTATAAATT TTATTTATTC CTATATCAAG GGTAACGATA TAGCGATAAT AA! IAGGI I I5891 Ti”\TAT1'/'\TC.I"\ TATTATTFAT ATTATGTGCT TATTTCTGCT CTTATGGAAC ÇATÇTÇGAÜ5881GIIAAAAIAI 111IA1A1HAAIGGIAHACAGGCGGHA IIAIAICCAI CATTACTATT5941 TATATGACAA AAACATATGG TATTGGTGAT TATTCAGCAC TAAGACATTA TTTTTTGGAG6001 AATGATTATG GTGATGTTTA TACATATGGA AGTGGTTTCT ATACACTTCA AATTAAACGAi5061 AATGCTCTCA TTCCATTTGC CTTTATGTTG CATATAGTCA TAAAAGATTA I I IÇTAI [Al6 ' 21 CGATTCAAAA ATACAATAAC CGTTATTCTG GCTATAG GTA CTATAGTGGC TGGTAATTTT6'81 GCATATTTTG TTTCGATAIG CTTGTTTTTT ATGTATATTA TACTATGTTC TAAATCTAAC8241 TCACGATACC CTAAATTAAG GAAAATTATT TTTGGGGTTT TTCTTACTGT GATTCTCCCT6301 TTTTTTATTA CATATTCAAT TGAGTTGATA ATCATGAAAT CAAATGGAGC IGAI ICI IC]6361 WAGGAGTTA G ATGGGATCA GTTTACTGTA TTAATTAATG ATCTTACAGA GTCTGTATCA ö›'121AAHHGIIA [AGGHCIGG IIIGGGIAAI GICAICAAAA IICAAACICC TATCCGTGAT6481 TATAGTGCAT ATATATATTA TGAATTGCAG TCAGTTTATT AAATCA AÇTTGGCGTT 1216541 ATTTTATTTA CTTTGTTTTT ATTAATTAAT CTCCTTCTCA CGATTAAAAT CATAAAATAC6601 AGTGAGTTGT GTGTGCTATA TI I CTATAT GI CTTATG CAATTACTAA TCCTTATATT6661 TTAGACTCTA ACCATGTTGC TGTAATAATT GTATTAGTGA CATTAAGTAA TGTTCTAAAA8721 AAGATGAAAG CTAAATGAAG GTTTTAAGGT GAAGATGGAC ACTGTATATG CCGTWTGGT6781 TGCTTACAAC CCAGAACATA ATGATTTAAA AAATGCGGTT GAAT-TATI'GT TGAGACAAGT6841 TACTAAAGTT GTCGTTTGCA ATAACTCTAC AAATGGTTAT AAATATGCTG AAAATTCTFC6901 AGGCGATGTA AAAATATTCA ATTTCAATGA TAATTTAGGC ATAGCAGAAG CCCAAAGTAT6961AGGAAIGAAA IGGGCIHIG AAAATGGCGC [SA] 1 I IAIA TTGCAAATGG ATCAGGATAG7091 TATTCCTGAT CCTAAGATGG TAGAGCAGTT ACTTACTTGT TACAAAAAAT IGCT IAAACA7081 AAATGTCAAT GTTGGTTTAG TTGGTTCACA AGATTTTGAT AAAGTAACTG GTGAATTAAA7141 TAAAGCAAGG GTAAAAAAAG GGAAACCACT TACAGAAGTT TATTATGAGG TAGATAGTAC7201 ATTAAGTTCT GGCAGTCTAA TACCAAAAAA TAGTTGGTTG ATTGTTGGAG GAATGAAAGA7281 TGAGCTTTTT ATCGATGCGG TAGACCATOA ATATTGTTCG AGATTAAGAG CTGCTGGGTT7321 TAAAGTAATT AGGAATAAAA ATGCGTTACT TGCACATAGA CTTGGAGATG GGCGATTTAA71381 GAICI IAAAI AI [C] I 1010 ICGGI I IGCC AAGCCCAI I I CGICAI [A1 I ATGCTACTCG7441 AAATATCTTT CTTTTATTAA ATAAAAATTA TGTACCCATC TACTGGAAAA I I IC [AG I CI 122/501 GGTTAAATTA ATTGGAAAGG TTTTTTTATA TCCTATTTTC ÇTTCCAAATG GIAAIAAAAG755.1 GTTATATTTT KAAAG GCATTAATGA CGGTTTAATG GGTCGAAGTG GTAAAATGAA7621 ATGAATCATA GATTAGAAAA AT TCTCAGTT TTAATTAGÇA TTTATAAAAA TGATCTACCG76531 CAATTTTTFG AGGTGGCTCT ACGCTCTATT TTTCACGATC AAACACTTAA GCCAGATCAA775-1 ATAGTAATTG TTGCAGATGG AGAACTCCAT CAAACACACA TCGATATTAT AAA! [CA] IC7801 ATTGATGATG TTGGCAATAA AATAGTAACA TTTGTACCTT TACCTAGAAA TGTTGGATTG7861GCIAAIGCCI IAAAIGAAGG AI IAAAGGCI IGIAGGAAI G ACTTACTCGC AACAATCCAT/921 GCTGATGATA TTTCTTTGCC TCATCGGTTT GAGA AAC AAA TTTCTTTTAT GATTAATAAT7981 TCAGAAATAG ATGTATGTGG CAGTTTTATT GATGAAATTG AAACTCTTAC TGAGGAGTTT8041 ATTTCAACAC GCAAAGTGCC TCTCGAACAT AGAGAAATAGI IAAAI ICGC GAGGAAACGA8 ' 01 AGCGCAGTTA GCCATCCTTC TGTAATTTTT AGÂAAGAATA CAGTATTAGC TGTTGGTGGT8' 61 TATCCTCCAT TCAGAAAATC TCAAGATTTT GCATTGTGGA GCCTATTAAT TGTACATAAT8221 GCAACATTTC CAAATCTTCC AGATATTTTA TTAAAAATCC CAACTOGTCG TAATCTTATG8281 GCTCGACGTG GATTGTCATA TTTATTGTAC GAGTATAAAG TATTGTATTA ICAAIAIAAA8341 ATTGGTTTTA TTCGAAAAAA TGAATTAÄTA f\GT/'\i"\TGCT/\ TGTTGAGAAC ATTTTTTC GT8401 AIAAIGCCAI CIAAA1 !AAA GGAGCIGAIG IAI ICAAICG TTAGGÂATCG ATAATAATAA8481 TTTTCTGATT AAGTGTTATG GATTTATTTF TATI'AGGCAT ATTCTATAAT TAAGCATAAC 1238521 CCGCATACCA CCCAGCGGTA TCCTGACAGG AGTAAACMT GTCAAAGCAA CAGATCGGCG8581 TCGTCGGTAT GGCIKGTGATG GGGCGCAACC TTGCGCTCAA TATCGHAH" " ^ GC CGTGGTTATA8641 CCGTCTCTAT TTTCAACCGT TCCCGTGAAA AGACCGAAGA AGTGATTACC GAAAATCCAG8701 GCAAGAAACT GGTTCCTTAC TATACGGTGA AAGAATTTGT TGAATCTCTG GAAACGCCTC8781 GTCGCATCCT GTTAATGGTG AAAGCAGGTG CTGGCACGGA [GCIGCIAH GA] ICCÇICA8821 AGCCATACCT CGATAAAGGT GACATCATCA TTGATGGTGG TAACACCTTC TTCCATGACA8881 CCATTCGTCG TAACCGTGAG CTTTCTGCAG AAGGCTTTAA CTTTATCGGT ACCGGTGTTT8941 CCGGTGGTGA AGAAGGTGCG CTGAAAGGTC CTTCCATTAT GCCTGGTGGG CAGAAAGAAG9001 (31 IAI (SAACJI (SAI IGCGCCG AICCIGACCA AAAICGCCGC TGTGGCTGAA GACGGCGAAC9081 CGTGCGTTAC CTATATTGGT GCCGATGGTG CÂGGTCATTA TGTGAAGATG GTTCACAACG9121 GTATTGAATA CGGTGATATG CAGCTGATTG CTGAAGCCTA TTCTCTGCTT AAAGGTGGCT9181 TGAACCT CAC CAACGAAGAA CTGGCGCAGA CCTTTACCGA GTGGAATAAC GGTGAACTGA9241 GCAGCTACCT GATCGACATC ACCAAAGATA TCTTCACCAAAAAAGATGAA GAGGGTAACT9301 ACCTGGTTGA TGTGATTCTG GATGAAGCAG CAAACAAAGG TACGGGCAAA TGGACCAGCC9361 AGAGCGCGCT GGATCTCGGC GAACCGCTGT CGCTGATTAC COAGTCTGTG TTTGCACGTT 124AGTTCTCTCT GGCCCGCAAG 948' CGCAGCCAGC TGGCGACAAT GCTGAGTTCA TCGAAAAAGT TCGCCGTGCG CTGTATCTGG954' CCAAAATCGT TTCTTACGCT CAGGGCTTCT CTCAGCTACG CGCTGCGTCT GAAGAGTACA960' ACTGGGATCT GAACTACGGT GAAATCGCGA AGATTTTCCG TGCTGGCTGC ATCATCCGTG966" COCAGTTCCT GCAGAAAATC ACCGATGCTT ATGCCCAAAA TCCGCAGATC GCTAACCTGT97?' TGCTGGCTCC `ITACTTCAAG CAAATTGCCG ATGACTACCA GCAGGCGC 1 G CGCGA 1 GICG978“ TCGCTTACGC AGTACAGAAC GGTATCCCGG TGCCGACCTT CGCCGCTGCG GTTGCCTATTCCAGGCACAG CGTGACTATT990' TCGGTGCGCA TACTTATAAG CGCATTGATA AAGAAGGTGT GTTCCATACC GAATGGCTGG996 AT TAATCTGA TTTAAATCAA TTAATCAAAG CAAGGCCCGG AGAAACCCTC CGGGC I IT10021 TATTATACAA AGCGGCAGGT TAGGGCCTTT TTTTATAATT IAIAGI !AAA AACGCGAIAI10081 AAIACAGCGC CGCACAGCAG GAICGC I (SCC 1 IGACAGI IC ATCTACATCA GCGTTAAAAA'10141 TCCCGCACTA CATGAAGCTG TGGTGGTGGA TTAATCACCA (ITCTAAATGT TTAACCGGAA10201 GAAGTCAGAG CTAATGAAAA TAACAATTTC AGGAACAGGT TATGTTGGTC TTTCAAATGG10261 TATTCTGATF GCGCAAAACC ACGAAGTGGT TGCACTGGAT ATCGTTCAGG CCAAAG TGGA10321 ÇAIGÇI IAAÇ AAGAGGÇAGI ÇAÇCGÇI IGI [GAIAACSGAG 125ATTGAAGAGT ATCTGGCGAC '0381 TAAAGATCTC AATTTCCGCG CTACGACAGA TAAGTATGAC GCGTATAAAA ATGCCGATTA” 0441 (IGTTATTATT ('SCCA('3A(`,('JTA CCGATTATGA TC'ZCGAAAACA AATTATTTTA ATACCTCAAG'0501 CGTGGAAGCG GTCATTCGTG ATGTGACAGA AATTAATCCC AACGCGCSIAA IGAI IAIAAA' 0561 ATCAACTATC CCTGTTGGTT TTACAGAGTC CATTAAAGAA CGTTTTGGTA TTGAAAATGT'0621 GAICI I I [CG (ZÇIGAGI I I I I (BCG I (SAAGG IAAAGCACI I TATGATAACT TACACCCATC'0681 ACGCATTGTG ATTGGCGAGC AGTCTGAACG CGCTAAACGT TTTGCTGCGT TATTACAGGA'07:11 AGGCGCCATT AAGCAAGACA TACCAACATT GTTTACTGAC TCAACCGAGG CTGAGGCGAT"0801 TAAACTTTTT CCGAACACTT ATCTCGCGAT GCGTGTAOCG [AI I ICAAIG AAC! IGAIAG' 0861 TTATGCTGAA AGCCTGGGAC TTAATTCACG CC AG ATT ATT'0921 GCGIAICGGI AAICACIACA ACAACCCXSIC AI TCGGI IAI GGTGGTTATT GTCTGCCGAA'0981 AGATACTAAG CAGTTACTGG CAAATTACCA GTCTGTGCCG AA 1 AACC I (3A l (3 I (JGGCAA I' 1041 TGTTGACGCC AACCGCACGC GCAAAGATTT TATTGCCGAT TCTATCCTTG CACGTAAACC" 1101 GAAAGTTGTT GGCGTCTATC CTTTGATTAT GAAGAATGGT TCAGACAATT TTCGTGCTTC' 1161 CTCGATTCAG GGTATTATGA AGCGAATCAA GGCGAAAGGTGTCCCTOTAA TCÇTTTATOA 126” 1221 GCCAGCTATG AAAGAGGACG ATTTTTTCCG GTCGCGCGTG GTACGTGATC TGGATGCGTT* `1281 CAAACAAGAA GCTGATGTTA TTATTTCTAA CCGTATGTCT GCGGATCTGG C1 (SAT (5 [AOC' 1341 AGATAAAGTT TATACGCGCG ACTTGTTTGG CAATGATTAA TTATTTTGTT TCATTCTAAG” 1401 AAAAGGCCCI AAIAAAI IACS (SGCCT 1 I IC] IAIGGI I 1 [(5 TAAAATCAAA CTTTATAGAA' 1461 GTTACGATAC CATTCTACAA AGTTCTTTAC CCCTTCTTTA ACTGACGTTT CAGGTTTGAA' 1521 TCCTATTACG TCATACAGTG CTTTTGTATC AGCACTGGTT TCCAGTACAT CACCGGGTTG'1581 GAGÂGGCATC ATATTTTTGT TGGCTTCAAT ACCCAGAGCC TCTTCTAACC CATTGATATA' 1841 GTCCATCAAC TCCACAGGCG AACTATTACC AATGTTATAG ACACGATATG GTGCTGAACT" 1701 TOTTGCAGGC GAGCCTGTTT CTACAGCCCA CTGTOOGTTT TTTTCTGGAA TAACATCCTG' 1761 TAAGCGAATA ATAGCTTCGG CAATATCATC AATGTAAGTA AAGTCACGCT TCATTTTGCC' 1821 GAAGTTGTAA ACATCAATGC TTTTACCTTC CAGCATGGCT TTAGTGAATT TAAATAATGC” 1881 CATATCCGGA CGTCCCCATG GACCATAAAC CGTAAAGAAA CGCAGCCCTG TGGTCGGTAA' 1941 GCCATACAAA TGAGAATATG TATGGGCCAT GAGTTCATTC GCTTTTTTAG TTGCTGCATA' 2001 AAGCGAAACA GGATGATCTA CA('5AGTCATC TGTAGAGAAA GGCATCTTGC GGTTCATGCC 1 2061 ATAAACAGAA CTGGAGGAAG CGTAAAGTAG ATGCTGAACATTÂTTATOOC GACATCCTTC 12772121 TAGTATGTTC AGGAATCCAA TCAGGTTTGC ATCTGCATAT GCAI IGGGAI I I ICAAGAGA72181 GTAACGTACA CCGGCTTGCG CAGCGAGGTT TATI'ACGCGT TCGAACCGCT CGTCTGCAAA72241 CAGTGCCGCC ATTTTCTCAC GATCGGCCAG GTCAATTTTA TAAAAACTGA AGTTGTCGTG12301 CTTGAGTAAA TCAAGTCGTG CTTGTTTGAG GTTGACATCG TAATAATCAT TTAAGTTGTCT2361 AATGCCTACA ACCTGATGAC CAGCTGCAAG AAGCCGTTTA CTTAGATAGA AACCGATAAA12421 GCCAGCAGCT CCCGTAACCA (SAAATTTCAT TTATAATCCT CGCICAGGCI AGMIAIAGC17481 CAATCTTCAT (IJTGGCATAACS TGAAAGTTAA ATTATACCGT TAG AC A AG A A AAAAAGATAA72541ICGGIAICAGIICIAAACIIGGCIGIIIIIICIGGIAACG IGCICAI I I I ACAAICAAAGT2601 CTGTTCTAAG CTGACTATAC AAGCCGAC GT CATTATCTCC AACCGTATGG CAGAAGAGCTî2661 TAAGGATGTG GCAGACAAAG TCTACACCCG CGATCTCTTT GGCAGTGACT AACATCCTGTî2721 TATCATGGCG ATTTTCGCCC TGATTCTCTT ATGTTCCCTT TGTAATAATT CATTATTTTTî2781 ATCATTTATC CTATAGCATT CATCCCGATT ATCCCTAAACT2841 GAICCCCGGG IACCGAGCIC GAAI ICGCCC TAIAGIGAGI CGIAI IACAA I ICACIGGCCT7901 GTCGTTI'TAC AACGTCGTGA CTGGGAAAAC CCTGGCGTTA CCCAACTTAA TCGCCTTGCA72961 GCACAICCCC CI I ICGCCAG CIGGCGIAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC73021 CAACAGI [GC GCAGC I GAAI GGCGAAIGGC GCCIGAI GCG GTATTTTCTC CTTACGCATC 12873081 TGTGCGGTAT TTCACACCGC ATATGGTGCA CTCTCAGTAC AA1CIGCICI GAIGCCGCAIT31i1 AGTTAAGCCA GCCCCGACAC CCGCCAACAC CCGCTGACGCT3201GAAIAIAACî ICGIAIAAIGIAIGCIAIAC GAAGI [AHA GCGATGAGCT CGGACTTCCA13961 TTGTTCATTC CACGGACAAA AACAGAGAAA GGAAACGACA GAGGCCAAAA AGCTCGCTTTT3321 CAGCACCTGT CGTTTCCTTT CTTTTCAGAG GGTATTTTAA ATAAAAACAT TAAGTTATGAî3381 CGAAGAAGAA ÇGGAAACGCÇ I TAAAÇCGGA AAA! I I ICAI AAATAGCGAA AACCCGCGAG13441 GTCGCCGCCC CGTAACCTGT CGGATCACCG GAIVkGGACCC GIAAAGIGAI AAIGAI [AIOT3501 ATCTACATAT CAC/'kfxCGTGC GTGGAGGCCA TCAAACCACG TCAAATAATC AATTATGACGî3561 CAGGTATCGT ATTAATTCAT CTGCATCAAC TTAACGTAAA AACAACTTCA CACAATACAAT3621 ATCAGCGACA CTGAATACGG GGCAACCTCA TGTCCGAGCT CGCGAGC TCG TCGACAGCGAT3681 CACACTTGCA TCGGATGCAO CCCOOTTAAC GTCCCGCCAC GGCCTGGGTA ACCAGGTATTî37/-1 TTGTCCACAT AACCGTGCGC AAAATGTTGT GGATAAGCAG GACACAGCAG CÄATCCACAG'T3801 CAGGCATACA ACCGCACACC GAGGTTACTC CGTTCTACAG GTTACGACGA CATGTCAATAî3861 CTTGCCCTTG ACAGGCATTG ATGGAATCGT AGTCTCÄCGC IGAIAGICIGAICGACAAIA 12913921 CAAGTGGGAC CGTGGTCCCA GACCGATAAT CAGACCGACA ACACGAGTGG GATCGTGGTC13981 CCAGACTAAT AATCAGACCG ACGATACGAG TGGGACCGTG GICCCAGACI AAIAATCAGA14041 CCGACGAIAC GAGIGGGACC GIGGI ICCAG ACIAAIAAIC AGACCGACGA TACGAGTGGG14101 ACCGTGGTCC CAGACTAATA ATCAGACCGA CGATACGAGT GGGACCAIGG [CCCAGACIA14161 AIAAICAGAC CGACGA IACG AG1GGGACCG IGGICCCAGI CTGAT TATCA GACCGACGAT14221 ACGAGTGGOA CCCTGGTCCC AGACTAATAA TCAGACCCAC GAIACGAG 1 G GGACCG 1 Gül14281 CCCAGAC IAA IAAI CAGACC GACGA I ACGA (51 GGGACCGI GGTCCCAGTC TGATTATCAG14341 ACCGACGATA CAAGTGGAAC AGTOGGCCCA CACAGAATAT TCAGGCCAGT TATGCTTTCT14401 GGCCTGTAAC AAAGGACATT AAGTAAAGAC AGATAAACGTAGACTAAAAC GTGGTCGCAT14461 CAGGGTGCTC GCTTTTCAAG TTCCTTAACA ATCGCCTCAA TTTTCTCTAT ACACTCAGTT14591 GGAACACGAG ACCTGTCCAG GTTAAGCACC ATTTTATCGC CCI 1AIACAA IAC1GICGCI14581 CCAGGAGCAA ACTGATGTCG TGAGCTTAAA CTAGTTCTTG ATCCAGATCA CGTTTTAACC 14641ACAGAAGIIAAAAGAGIGAI AACIICIICA GCI ICAAAIAIÇAÇÇÇÇAGÇ I IIIIIÇIGÇ 130'4701 TCATGAAGGT TAGATGCCTG CTGCTTAAGT AATTCCTCTT TATCTGTAAA GGCTTTTTGA'4761 AGTGCATCAC CTGACCGGGC AGATAGTTCA CCGGGGTGAG AAAAAAGAGC AACAACTGAT'4821 TTAGGCAATT TGGCGGTGTT GATACAGCGG GTAATAATCT TACGTGAAAT ATTTTCCGCA"4881 TCAGCCAGCG CAGAAATATT TCCAGCAAAT TCATTCTGCA ATCGGCTTGC ATAACGCTGA'4941 CCACGTTCAT AAGCACTTGT TGGGCGATAA TCGTTACCCA A I (Jî GGA 1 AA IGCAGCCA I (1' 3001 TGCTCATCAT CCAGCTCGCC AACCAGAACA CGATAATCAC TTTCGGTAAG TGCAGCAGCT” 5061 TTÂCGACGGC GACTCCCATC GGCÂATTTCT ATGACACCAG ATACTCTTCG ACCGAACGCC' 5121 GGTGTCTGTT GACCAGTCAG TAGAAAAGAA GGGATGAGAT CATCCAGTGC GTCCTCAGTA"5181 AGCAGCTCCT GGTCACGTTC ATTACCTGAC CATACCCGAG AGGTCTTCTC AACACTATCA' 5241 CCCCGGAGCA CTTCAAGAGT AAACTTCACA TCCCGACCAC ATACAGGCAA AGTAATGGCA' 5301 TTACCGCGAG CCATTACTCC TACGCGCGCA ATTAACGAAT CCACCATCGG GGCAGCTGGT“ 5361 GTCGATAACG AAGTATCTTC AACCGGTTGA GTATTGAGCG TATGTTTTGG AATAACAGGC' `»121 GCACGCTTCA TTATCTAATC: TCCCAGCGTG GTTTAATCAG ACGATCGAAA ATTTCATI'GC' 5481 AGACAGGTTC CCAAATAGAA AGAGCATTTC TCCAGGCACC AGTTGAAGAG CGTTGATCAA' 5541 TGGCCTGTTC AAAAACAGTT CTCATCCGGA TCTGACCT TT ACCAACTTCA TCCOTTTCAC 131' 5801 GTACAACATT TTTTAGAACC ATGCTTCCCC AGGCATCCCG AATTTGCTCC TCCATCCACG' 5661 GGGACTGAGA GCCATTACTA TTGCTGTATT TGGTAAGCAA AATACGTACA TCAGGCTCGA' `3721 ACCCTTTAAG ATCAACGTTC TTGAGCAGAT CACGAAGCAT ATCGAAAMC TGC/xGTGCGG' 5781 AGG I (SIAG f (3 AAACAAC I (3A GCAGGCG I (SG (SAACAAICAG CACATCAGCA GCACATACGA' 5841 CATTAATCLGT GCCLGATACCC AGGTTAGGCG CGCTGTCAAT AACTATGACA TCATAGTCAT' 5901 GAGCAACAGT TTCAATGGCC AGTCGGAGCA TCAGGTGTGG ATCGGTGGGC AGTTTACCTT'5961 ÇATCAAATTT GCCCATTAAC TCAGTTTCAA TACGGTGCAG AGCCAGACAG GAAGGAATAA' 6021 TGTCAAGCCC CGGCCAGCAA GTGGGCTTTA TTGCATAAGT GACATCGTCC TTTTCCCCAA” 6081 GATAGAAAGG CAGGAGAGTG TCTTCTGCAT GAATATGAAG ATCTGGTACC CATCCGTGAT' 6141 ACATTGAGGC TGTTCCCTGG GGGTCGTTAC CTTCCACGAG CZAAAACACGI AGCCCCT [CA' 6201 GAGCCAGATC CTGAGCAAGA TGAACAGAAA CTGAGGTTTT GTAAACGCCA CCTTTATGGG '6261 CAGCAACCCC GATCACCGGT GGAAATACGT CTTCAGCACG TCGCAATCGC GTACCAAACA” 6321 CATCACGCAT ATGATTAATT TGTTCAATTG TATAACCAAC ACGTTGCTCA ACCCGTCCTC' 8381 GAATTTCCAT ATCCGGGTGC GGTAGTCGCC CTGCTTTCTC GGCATCTCTG ATAGCCTGAG 13216441 AAGAAACCCC AACTAAATCC GCTGCTTCÂC CTATTÇTCCA GCGCCGGGII A1 I I ICCICG16501 CWCCGGGCT GTCATCATTA AÄCTGTGCÄA TGGCGÄTAGC CTTCGTCATT TCATOACCAG165961 CGTTTATGCA CTGGTTAAGT GTTTCCATGA GTTTCATTCT GAACATCCTT TAATCATTGC16621 TTTGCGTTTT TTTATTAAAT CTTGCAATTT ACTGCAAAGC AACAACAAAA TCGCAAAGTC16681 ATCAAAAAAC CGCAAAGTTG TTTAAAATAA GAGCAACACT ACAAAAGGAG A 1 AAGAAGAG16741 ÇAÇATAÇÇTC AGTÇAÇTTAT TATÇAÇTAGÇ GÇTÇGÇÇGÇA (SCCGTGTAAC CGAGCATAGC16801 GAGCGAACTG GCGAGGAAGC AAAGAAGAAC TGTTCTGTCA GATAOCTCTT ACGCTCACCC16861 C A AG A AGA AA T ATCC ACCGT GGG A AA A ACT CC AGGTAG AG GTACACACGC GGATAGCCAA16991 TTCAGAGTAA TAAACTGTGA TAATCAACCC TCATCAATGA IGACGAACIA ACCCCCGAI A16981 TCAGGTCACA TGACGAAGCO AAAGAGAAGG AAATCAACTO TGACAAACTG CCCTCAAATT17041 TGGCTTCCTT A AAA ATT AC A GTTCAAAAAG TATGAGAAAA TCCATGCAGG CTGAAGGAAA17101 CAGCAAAACI GIGACAAAII ACCCICAG1A GGICAGAACA AATGTGAC GA ACCACCCTCA17161 AATCTGTGAC AGATAACCCT CAGACTATCC TGTCGTCATG GAAGTGATAT CGCGGAAGGA17221 AAATACGATA TGAGTCGTCT GGCGGCCTTT CTTTTTCTCA ATGTATGACA GGCGCATTGG17281 AGTTCTGCTG TTGATCTCAT TAACRCAGAC CTGÇAGGAÄG 133CGGCGGCGGA AGTCAGGCAT173:'-1 ACGCTGGTAA CTTTGAGGCA GCTGGTAACG CTCTATGATC CAGTCGATTT TCAGAGAGACICGIAIAAAÇ GCAIGGCAIA17461 CGGATTGGTG ATHCTTFTG TTTCACTAAG CCGAAACTGC GTAAACC (3 GT TC T GTAACC C17521 GATAAAGAAG GGAATGAGAT ATGGGTTGAT ATGTACACTG TAAAGCCCTC TGGATGCACT1/381 GTGCGCACGT TTGATAAACC AAGGAAAAGA TTCATAGCCT IIIICAICGC CGGCAICCIC17641 TTCAGGGCGA TAAAAAACCA CTTCCTTCCC CGCGAAACTC TTCAATGCCT GCCGTATATC1//01 CTTACTGGCT TCCGCAGAGG TCAATCCGAA TATTTCAGCA TATTTAGCAA CATGGATCTC17761 GCAGATACCG TCATGTTCCT GTAGGGTGCC ATCAGATTTT CTGATCT GGT Ci'M'kCGAikCrîG(BCCTCAG TGA GGTCGT TTGA17881 CTGGACGATT CGCGGGCTAT TTTTACGTTT CTTGTGATTG ATAACCOCTG TTTCCGCCAT17941 GACAGATCCA TGTGAAGTGT GACAAGTTTT TAGATTGTCA CACTAAATAA AAAAGAGTCA18001 AIAAGCAGGG AIAACI T 161 GAAAAAACAG CI IC] ICIGA GGGCAATTTG TCACAGGGTT18061 AAGGGCAAII [GICAÇAGAC AGGACIGICA I I IGAGGGIG ATTTGTCACA CTGAAAGGGC18121 AATTTGTCAC AACACCTTCT CTAGAACCAG CATGGATAAA GGCCIACAAG GCGCICIAAA1 8181 AAAGAAGATÇ TAAAAAÇ TAT i^\fu'\/`\Ai'\i'\/\Ti"\ i'\TT/`\TA»"u'\/`\i^\ 134182“ TAACCCCAAG GGAAGTTTTT TCAGGCATCG TGTGTAAGCA GAATATATAA GTGCTGTTCC1830T CIGGIGCI IC CICGCICACI CGACCGGGAG (501 ICGAGAA GGGGGGGCAC CCCCCTTCGGAACGGGCGGA AACÇÇH IGCA1848'T AATGCTGGAT TTTCTGCCTG TGGACAGCCC CTCAAATGTC AATAGGTGCG CCCCTCATCTî8i›4T GTCAGCACTC TGCCCCTCAA GTGTCAAGGA TCGCGCCCCT CAICIGICAG IAGICGCGCCTBBO'T CCTCAAGTCT CAATACCGCA GCGCACTTAT CCCCAGGCTT GTCCAÇATCA TCTGTG GGAA1856T ACTCGCGTAA AATCAGGCGT TTTCGCCGAT TTGCGAGGCT GGCCAGCTCC ACGTCGCCGGî872î CCGAAATCGA GCCTCCCCCT CATCTGTCAA CGCCGCGCCC GGTGAGTCGG CCCCTCAAGTT8781 GTCAACGTCC GCCCCTCATC TGTCAGTGAG GGCCAAGTTT TCCGCGAGGT ATCCACAACGî88~4î CCGGCGGCCG GCCGCGGTGT CTCGCACACG GCTTCGACGG CGTTTCTGGC GCGTTTGCAG1890T GGCCA I AGAC GGCCGCCAGC CCAGCGGCGA GGGCAACCAG CCGAGGGCTT CGCCCTGTCG1896T CTCGACTGÇG GCGAGCACTA CTGGCTGTAA AAGGACAGAC CACATCATGC TTCTGTCTTCî902î ATTAGGTTGT TCTGTCCATT GCTGACATAA TCCGCTCCAC TTCAACGTAÂ CACCGCACGA 13519081 AGATTTCTAT TGTTCCTGAA GGCATATTCA AATCGTTTTC GI [ACCGCI 1 GÇAGGCAIÇA19141 TG AC AG A AC A CTACTTCCTA TAAACGCTAC ACAGGCTCCT CACATTAATA ATCCGGATCT19201 CTACGATAAT GGGAGATTTT CCCGACTGTT TCGTTCGCTT CTCAGTGGAT AACAGCCAGC1926-1 TTCTCTGTTT AACAGACAAA AACAGCATAT CCACTCAGTT CCACATTTCC ATATAAAGGC19321 CAAGGCATTT ATTCTCAGGA TAATTGTTTC AGCATCGCAACCGCATCAGA CTCCGGCATC 1938-1 GCAAACTCCA CCCGGTGCCC GGCACCCACA TCCAGCGCAA AAACCTTCGT GTAGACTTCC19:!&1 GTTGAACTGA TGGACTTATG TCCCATCAGG CTTTGCAGAA CTTTCAGCGG TATACCGGCA1.9601 TACAGCATGT GC:'\TCGCI`\TA GGAATGGCGG AACGTATGTG G 1 G 1 GACCGG AAÇAGAGAAC1956-1 GTCACACCGT CAGCAGCAGC GGCGGCi"u'\CC GCCTCCCCAA TCCAGGTCCT GACCGTTCTG1915-21ICCGICACIICCCAGAICCG 0601 I ICICI GICCI [CCTG TOCGACGCTT ACGCCGCTCC19881 ATGAGCTTAT CGCGAATAAA TACCTGTGAC GGAAGATCAC TTCGÇAGAAT AAATAAATCC19741 TGGTGTCCCT CTTGATACCG GGAAGCCCTG CGCCAACTTT TGGCGAAAAT GAGACGTTGA19801 TCGGCACGTA AGAGGTTCCA ACTTTCACCA TAATGAAATA AGATCACTAC CGGGCGTATT 19861 TTTTGAGTTA TCGAGATTTT CAGGÂGCTAA GGAAGCTAAA A I GGAGAAAA AAAICAC I GG19921 ATATACC/&CC GTTGATATAT CCCAATGGCA TCGTAAAGAA ÇATTTTGAGG ÇATTTÇAGTC 1361998-1 AGTTGCTCAA TGTACCTATA ACCAGACCGT TCAGCTGGAT AI IACGGCCT II 1 IAAAGAC20061 CGTAAAGAAA AATAAGCACA AGTTTTATCC GGCCTTFATT CACATTCTTC CCCGCCTCAT20101 GAATGCTCAT CCGGAATTTC GTATGGCAAT GAAAGACGGT GAGCTGCTGA TATGCGATAG?0113-1 TGTTCACCCT TGTTACACCG TTTTCCATGA GCAAACTGAA ACG I CAT CGCTCTGGAG20221 IGAATACCAC GACGAI 1 ICC GGCAGI 1 [Cl ACACAIAIAI ICGCAAGAIG IGGCGIGT I,›'-`\2028-1 CGGTGAAAAC CTGGCCTATT TCCCTAAAGG GTTTATTGAG AATATGTTTT TCGTCTCAGC20341 CAATCCCTGG GTGAGTTTCA CCAGTTTTGA TTTAAACGTG GCCAATATGG ACAACTTCTTGACAAGG 1 GC IGAI GCCGCI2046-1 GGCGATTCAG GTTCATCATG CCG I GTGA TGGCTTCCAT GTC GGCAGAA TGCTTAATGATTTTTTTAAG GCACTTATTG2058-1 GTGCCCTTAA ACGCCTGGTT GCTACGCCTG AATAAGTGAT AATAAGCGGA TGAATGGCAG208“ AAATTCGATG ATAACCTGTC AAACATGAGA ATTGCTCGAC20701 GTTCGCGTTG GCCGATTCAT TAATGCAGCT GGCACGACAG GTTTCCCGAC TGGAAAGCGG?0713-1 GCAGTGAGCG CAACGCAATT AATGTGAGTT AGCTCACTCA I IAGGCACCC CAGGCI I TAG20821 ACTTFATGCT TCCGGCTCGT ATGTTGTGTG GAATTGTGAG ÇGGATAAÇ AA TTTÇAÇAÇAG13720881 GAAACAGCTA TGACCATGAT TACGCCAAGC TATTTAGGTG AGACTATAGA ATACTCAAGC 20941 TT (SCAT (5(sz GCAGGT CGAC T CT AGAGGAT CCÇACGACGT CG SEK.KIM.NO.: 29 - Kesilmis pCCIFOS (pFOS) ve Z3206911 S. flexneri 6 O-antijen için nükleotit sekansi Yer kesilmis pFOS ve kesilmis O-antijen (Z3206+) Tanim Z3206NhE ile amplifiye edilmis devrik S. flexineri 6 O antijen kümesinin ve NheI ve AscI ile kesilmis wzzAscI”nin, Nhel ve AscI ile kesilmis MCS kasetli pCCIFOS içerisine ligasyonu Ozellikle Lokasyon/niteleyiciler CDS komplementi(370..396) /etiket=wzz' CDS 748..1752 /etiket=uge CDS komplementi(1818..3011) /etiket=ugd CDS komplementi(3233..4639) /etiket=gnd CDS komplementi(4744..5577) /etiket=wfbZ CDS komplementi(5574..6443) [0429] /etiketzwfbY CDS komplementi(6460..7647) [0431] /etiket=wzy CDS komplementi(7703..8935) [0433] /etiket=wzx CDS komplementi(8932..9489) [0435] /etiket=rmIC CDS komplementi(9494.. 10372) [0437] /etiket=rmIA CDS komplementi(10430..l1329) [0439] /etiket=rmID CDS komplementi(1 1329..12414) [0441] /etiket=rmIB138CDS komplementi(12787..13680) [0443] /etiket=ga1F CDS komplementi 1391214907) [0445] /etiket=Z3206 CDS komplementi(15065.. 15097) [0447] /etiket='W0aM CDS kompleinenti 15525..16184) [0449] /etiketîcat CDS 16403..16750/etiket=redFCD818145..18900/etiket=repECDS 1947920654/etiket=parACDS 20654..21625/etiket=parBBoy: 22887 bpTip: DNA dairesel UNASekans:1 GCGGCCGCAA GGGGTTCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG61 CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT121 ('3('3(3TAA('5GAG AAAATACCGC ATCAOGCGCC ATTCGCCATT CA(`5(3T('S(JGCA ACTGTTGGGA181 AGGGCGATCG GTGCGGGCCT CTTCGCTATT ACGCCAGCTG GCGAAAGGGG GATGTGCTGC241 AAGGCGATTA AGTTGGGTAA CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGACGTTGTA AAACGACGGC301 CAGIGAAI TG IAAIAÇGACI CACIAIAGGG (JGAAI ICGAG CTCGGTACCC GGGGATCCCA361 CGTGGCGCGC CGCCATAGTT TAGCGATAAT CGCCATGAAT GCTATAGGAT AAATGATAAA 139421 AATAATGAAT TATTACAAAG GGAACATAAG AGAATCAGGG CGAAAATCGC CATGATAACA481 GGATGTTÂGT CACTGCCAAA GAGATCGCGG GTGTAGACTT TGTCTGCCAC ATCCTTAAGC5411 TCTTCTGCCA TACGGTTGGA GATAATGACG TCGGCTTGTA TAGTCAGCTT AGAACAGCTT601 TGATI'GTAAA ATGAGCACGT TACCAGAAAA AACAGCCAAG TTTAGAACTG A T AÇÇGAI 1A861 TCTTTTTTTC TTGTCTAACG GTATAATTTA ACTTTCAGTT ATGCCAGATG AAGATTGGCT721 ATATTCTAGC CTGAGCGAGG ATTATAAATG AAATTTCTGG TTACGGGAGC TGCT GGCTTT781 ATCGGTTTCT ATCTAAGTAA ACGGCTTCTT GCAGCTGGTC ATCAGGTTGT AGGCATTGAC841 AACTTAÂATG :RTTATTACGA TGTCAACCTC AAACAAGCAC GACTTGATTT ACTCAAGCAC901 GACAACTTCA GTTTTTATAA AATTGACCTG GCCGATCGTG AGAAAATGGC GGCACTGTTI'961 GÇAGAÇGAGC Gül IÇGAAÇG CCS I AA IAAAÇ ÇICGÇ I 0060 AAGCCGGTGT ACGTTACTCT' 021 CTTGAAAATC CCAATGCATA TGCAGATGCA AACCTGATTGGÂTTCCT GAA CATACTAGAA'081 GGATGTCGCC ATAATAATGT TCAGCATCTA CTTTACGCTT (XIICCAGI IC [GI I IAIGGC' 141 ATGAACCGCA ÂGATGCCTTT CTCTACAGAT GACTCTGTAG ATCATCCTGT TTCGCTTTAT' 201 GCÄGCAACTA AAAAAGCGAA TGAACTCATG GCCCATACAT ATTCTCATTT GTATGGCTTA' 261 CCGACCACAG GGCTGCGTTT CT'ITACGGTT TATGGTCCAT GGGGACGTCC GGATATGGCA' 321 TTATTTAAAT TCACTAAAGC CATGCTGGAA GGTAAAAGCA TTGATGTTTA CAACTTCGGC 140138' AAAATGAAGC GTGÂCTTTAC TTACATTGAT GATATTGCCG AAGCTATTAT TCGCTTACAG144' GATGTTATTC CAGNNAAAAA CCCACAGTGG GCTGTAGAAA CACCCTCGCC TGCAACAAGT150' TCAGCACCAT ATCCTGTCTA TAACATTGGT AATAGTTCGC CTGTGGAGTT GATGGACTAT156' ATCAATGCGT TAGAAGAGGC TCTGGGTATT GAAGCCAACAAAAATATGAT GCCTCTCCAATGTATGACGT AATAGGATTC 168' AAACCTGAAA CGTCAGTTAA ÂGAAGGGGTA AAGAACTTTG TAGAATGGTA TCGTAACTTC“174" TATAAACTTT GATTTTACAA AACCATAACA AAACCCCCTA ATTTATTAGG GCCTTTTCTT180' AGAATGAAAC AAAATAATTA ATCATTGCCA AACAAGTCGC GC GTATAAAC TTTATCTGCT 186' ACÄTCAGCCA GATCGGCAGA CATACGGTTA GAAATAATAACATÇAGCTTC TTGTTTGAACCCICI I ICAI AGCIGGCICA198' TAAACGATTA CAGGCACACC TTTCGCCTTG ATTCGCTTCA TAATACCCTG AATCGAGGAA?04' GCACGAAAAT TGTCTGAACC ATTCTTCATA ATCAAACGAT AGACGCCAAC AACT I ICGGI210' TIACGIGCAA GGAIAGAAIC GGCAAIAAAA ICI I IGCGCG TGCGGTTGGC GTCAACAATT716* GCCGAGATCA GGTTATTCGG CACAGACTGG TAATTTGCCA GTAACTGCTT AGTATCTTTC222' GGCAGACAAT AACCACCATA ACCGAATGAC GGGTTGTTGT AGTGATTACC GATACGCGGG 141CCAGGCI 110 AGCAIAACIA2341 TCAAGTTCAT TGAAATACGC TACACGCATC GCCAGATAAG TGTTC GCAAA AAGTTTAATC21101 GCCTCAGCCT CGGTTGAGTC AGTAAACAAT GTTGGTATGT CTTGÇTTAAT GGCGCCTTCO2481 TGTAATAACG CAGCAAAACG TTTAGCGCGT TCAGACTGCT CGCCAATCAC AATGCGTGAT2521 GGGTGTAAGT TATCATAAAG TGCTTTACCT TCACGCAAAA AC 1 CAGGCGA AAAGA 1 CACA?581 TT'TTCAATAC CAAAACGTTC TTTAATGGAC TCTGTAAAAC CAACAGGGAT AGTTGATTTT2641A1AA1CA11A CCGCGI 1666 A1 IAAI 1101 GICACAICAC CAATGACCGC TTCCACGCTT'2/01 GAGGTATTAA AATAATTTGT TTTCGGATCA TAATCGGTAG GTGTGGCAAT AÂTAACGTAA2781 TCGGCATTTT TATACGCGTC ATACTTATCT GTCGTAGCGC GG A A ATTG AG ATCTTTAGTC2821 GCCAGATACT CTTCAATCTC CTTATCAACÂ AGCGGTGACT GCCICI IGI I AAGÇAIGICC 2881 ACTTTGGCCT GAACGATATC CAGTGCAACC ACTTCGTGGT TTTGCGCAAT CAGAATACCA2941 TTTGAAAGAC CAACATAACC TGTTCCTGAA ATTGTTATTT TCATTAGCTC TGACTTCTTC3001 CGGTTAAACA TTTAGAOTGO TCATTAATCC ACCACCACAG3061 TTAACGCTGA TGTAGATGSAA CTGTCAAGGC AGCGATCCTG CIGIGCGGCG CIGIAI 1A1AT/\Ti'\i'\T/'\Ai^\i'\381AAGCCCGGAG Gül 1 [(21006 GGCCI [(3011 TGAI IAAI [G ATTTAAATCA GATTAATCCA3241 GCCATTCGGT ATGGAACACA CCTTCTTTAT CAATGCGCTT ATAAGTATGC GCACCGAAAT 142330' AGTCACGCTG TGCCTGGATC AGGTTCGCAG GCAGAACAGC GGCGCGGTAG CTGTCGTAAT336' AGGCAACCGC AGCGGCGAAG GTCGGCACCG GGATACCGTT CIGIACIGCG IAAGCGACGA342' CAICGCGCAG CGCCIGCIGG IAGICAICGG CAAI I IGCTI GAAGTAAGGA GCCAGCAACA348' GGTTAGCGAT CTGCGGATTT TCGGCATAAG CATCGGTGAT TTTCTGCAGG AACTGCGCAC354' GGATGATGCA GCCAGCACGG AAAATCTTCG CGATTTCACC GTAOTTCAGA TCCCAGTTGT360* ACTCTTCAGA CGCAGCGCGT AGCTGAGAGA AGCCCTGAGC GTAAGAAACG ATTTTGCCCA366" CATACACCGC ACGGCCAACT TTTTCGATCA ACTCAGCATT GTCGCCAGCT GGCTGÇGCTT3/2' GCGGGCCAGA GAGAACTTTA GATGCGGCAA CACGCTGCTC TTTCAGAGAA GAGATATAAC378' GTGCAAACAC AGACTCGGTA ATCAGCGACA GCGGTTCGCC GAGATCCAGC (BCGÇTCTGGC384' TGGTCCATTT GCCCGTACCT TTGTTTGCTG CTTCATCCAG AA I CACA I CA ACCAGG [AG]390" TACCCTCTTC ATCTTTTTTG GTGAAGATAT CTTTGGTGAT GTCGATCAGG TAGCTGCTCA396' GTTCACCGTT ATTCCACTCG GTAAAGGTCT GCGCCA GTTC IICGT IGGIG AGGI ICAAGC402' CACCT I IAAG CAGAGAAIAG GC! ICAGCAA ICAGCIGCAI ATCACCGTAT TCAATACCGT408* TGTGAACCAT CTTCACATAA TGACCTGCAC CATCGGCACC AATATAGGTA ACGCACGGTT414' CGCCGTCTTC AGCCZACAGCG GCGATTTTGG TCAGGATCGG CGCAATÇAGT TÇATAAGCTT 14341701 CT TTCTGCCC ACCAGGCATA ATGGAAGGAC CTTTCAGCGC ACCI IÇI ICA CCACCGGAAA 4261 CI'\CCGGTACC GATAAAGTTA AAGCCTTCTG CAGMAGCTC ACGGTTACGA CGAATGGTGT&321 CATGGAAGAA GGTGITACCA CCATCAATGA TGATGTCACC TTTATCGAGG TATGGCTTGA:4381 GGGAATCAAT AGCAGCATCC GTGCCAGCAC CTGCTTTCAC CATTAACÂGG ATGCGACGAG4441 GCGTTTCCAG AGATTCAACA AATTCTTTCA CCGTATAGTA AGGAACCAGI HCI IGCCIG4501 GATTTTCGGT AATCACTTCT TCCGTCTTI'T CACGGGAACG CGTTGAAAATA (BAGAÇGGTAT4561 AACC ACGGCI HCGAIAI [G AGCGCAAGGI IGCGCCCCAI CACTGCCATA CCGACGACGC4621 CGATCTGTTG ÇTTTGACATT GTTTACTCCT GTCAGGATAC4681 ATGCTTAATT ATAGAATATG CCTAATAAAA ATAAATCCAT AACACTTAAT CAOAAAATTA4/41 TTATTATCGA TTCCTAACGA TTGAATACAT CAGCTCCTTT AATTTAGATG GCAI IAIACG4801 AAAAAATGTT CTCAACATAG CATTACTTAT TAATTCATTT TTTCGAATAA AACCAATTTT:1861 ATATTGATAA TACAATACTT TATACTCGTA CAATAAATAT GACAATCCAC GTCGAGCCAT4921 AAGATTACGA CCAGTTCGCA TTTTTAATAA AATATCTGGA AGATTTCCAA ATCTTGCATT4981 ATGTACAATT AATAGGCTCC ACAATGCAAA ATCTTGAGAT TTTCTGAATG GAÜGAIAÂCCJT`_ 041 :'\CC/\i'\C/\GCT AATACTGTAT TCTTTCTAAA AATTACAGAA GGATGGCTAA TGCGCTTCGO5'01IIICCICGCGAATIIAÂCIAIIICICIAIGIICGAGAGGCACIIIGCGIG TTGAAATAAA5' 81 CTCCTCAGTA ACAGTTTCAA TTTCATCAAT AAAACTGCCA CATACATCTA TTTÇTGAATT 144522? ATTAATCATA AAAGAAATTI GTTTCTCAAA CCGATGAGGC AAAGAAATAT CATCAGCATC5281 CATT'CTTGCC ACTAACTCAT TCCTACAAGC C I I IAATCCT TCATTTAAGG CATTAGCCAA5341 TCCAACATTT CTAGGTAAAG GTACAAATGT TACTATTTTA TTGCCAACAT CATCAATGAA5401 TGAATTTATA ATATCGATGT GTGîT TGATG GAGTTCTCCA TCTGCAACAA T TACTA TTTGSMS? ATCTGGCTTA AGTGTTTGAT CGTGAAAAAT AGAGCGTAGA GCCACCTCAA AAAATTGCGG5571 TAGATCATTT TTATAAATCC TAATTAAAAC `TG/\G/\ATTTT TCTAATCTAT GATTCATTTC51381 ATTTTACCAC TTCGACCCAT TAAACCGTCA TTAATGCCTT TTAAAAAAAA ATATAACCTT5641 TTATTACCAT TTGGAAGGAA AATAGGATAT AAAAAAACCT TTCCAATTAA i'i IAACCAGA5/01 CTAGAAATTT TCCAGTAGAT GGGTACATAA TTTTTATT TA ATAAAAGAAA GATA' I ICGA5376': GTAGCATAAT AATGACGAAA TGGGCTTGGC AAACCGACAG AAAGAATATT TAAGATC'HA5821. AATCGCCCAT CTCCAAGTCT ATGTGCAAGT AACGCAI l 1 TATTCCTAAT TACTTTAAAC588? CCAGCACCTC T T'AATCTCCA ACAAT'AT ICA TGGTCTACCG (JAI (JGAIAAA AAGCI (IAICI594*- TTCATTCCTC CAACAATCAA CCAACTAI I TTTGGTATTA GACTGCCAGA ACTTAATGTA6001 CTATCTACCT CATAATAAAC TTCTGTAAGT GGTTTCCCTT TTTTTACCCI TGCTI IAT H'3061 AATTCACCAG TTACI I IATC AAAATCTTGT GAACCAACTA AACCAACATT GACATTTTGT*312* TTAAGCAATT TTT T G`I'AACA AGTAAGTAAC TGCTCTACCA TCT TAGGATC AGGAATACTA 145618' I'CCTGATCCA TTTGCAATAT AAAATCAGCG CCATTTTCAA AAGCCCATTT CATTCCTATA674' C? I GGG'ÇZTT CTGCTATGCC TAAATTATCA TTGAAATTGA ATAI I TTAC ATCGCCTGAA630” GAATTTTCAG CATATTTATA ACCATTTGTA GAGTTATTGC AAACGACAAC TTTAGTAACT636' îGTCTCAACA ATAA TICAAC (IGCATTI T IT AAA TCA l' TAT GT TCTGGGTT GTAAGCAACC642” AAAACGGCAI AIACAGIGIC BAICI ICACC I IAAAACCH GAZ î IAGCH TCATCTTT n648 TAGAACATI'A CTTAATGTCA CTAATACAAT TATTACAGCA ACATGGTTAG AGTCTAAAAT654' ATAAGGATTA GTAATI GCAT AAGAAACATA TAGAAÃATAT AGCACACACA ACTCACTGTA660' !I 1 IAIGAI % I IAAICGIGA GAAGGAGAI I A A] I AAIAAA AAC/XAAGTAA ATAAAATAAC666' GCCAAGTTGA I | IAAAAAAT AAACTGACTG CAATTCATAA TATATATATG CACIAIAAIC672' ACGGA'I'AGGA GTTTGAATT r YGATGACATT ACCCAAACCA GAACCTATAA CAAAATTTGA678 ' TACAGACTCT GTAAGATCAT TAATTAATAC AGTAAACTGA TCCCATCTAA CTCCT AAA" GA684' AGAAICAGC'I CCAI I IGAII ICAIGAI IAI CAACICAAII GAAIAIGIAA TAAAAAAAGG690' GAGAATCACA GTAAGAAAAA CCCCAAAAAT AATI I !CCTT AATTTAGCGT ATCGTGAGTT696” AGAI 1 IAGAA (IAIAGIAIAA IAIACATAAA AAACAAGCAI ATCGAAACAA AATATGCAAA702' A1 IACCAGCC AÇIAIAGIAC (JIAIAGCCAG AAIAACGGII AI IGIA! I II TGAATCGATA(08' ATAGAAATAA TCTTTTATGA CTATATG›C`.AA ÇATAAAGGCA AATGGAATGA GAGCAI I [(30 146I' 41 TTTAATTTGA ACTCTATAGA AACCACTTCC ATATGTATAA ACATCACCAT AATCAI ICIC7 2 01 C›'\/\i'\i'\/\/\T/'\i"\ T GTCTTAG TG CT GAATAATC ACC AATAC C A TI\T GTTTTTG TC ATÂTAAAT7261 ACTAATGATG GATATAATAA CCGCCTGTAA TACCATTAAA TATAAAAATA TTTTAACAAT7321 CGAGATGGTT CCATAAGAGC AGAAATAAGC ACATAATATA AATAATATGA TAATATAAAA7381 CCTAATTATT ATCGCTATAT CGTTACCCTT GATATAGGAA TAAATAAAAT TTATAAAAAG7441 AGCTAATAGA AATATTAAAA TAACAGGATA GTGATATATT CCGTTTGCAA I 1 1 101 1 [G]7501 AAATGACATG ATACÂAAGAC i'\T/`u\/'\AACCC CTCCATAATC CI`\/'\CT/\TATT GAATA/”UKT G G7561 AAAGÇIACGI GIAÂGGAAAA AIAIAAACCC AAAAAACAAA AGAACACTTA AACTTTTGTC7621 I 1 1 [GAGT IA IAAAAAICAG AAG1CAIGI 1 [GCACIÇIAA 1 IAGAIGGGC TTGAGGAAGT7681 AATCCCTAAA ATCAATTCGC TATTAATATT TCGTATCAAT TNKTAATAAT ATCAAAAAAT77-41 CTAACGATGT TCTTACAGAC CATGCTATTG CGGCTCCAAC AAT TCCCCAA TGATAAATAA7801 AAATATATAA TATGCATAAA TATGGGATAA CTTCGACCAA ATGAATAATA GCTGTAATTT781731 TTCÂTCTTCC ACTAGCCTOA ACTGAAACAA ATGOGATTTC TGCAATG (IL/"A ”AAA/`Af` GA!921 AACCTATTGC AAGÂATTTTT AATACTATAC CTGGCGTCCC ATGATATGTA GG 1 CCCAI GC 7981 AAGCGGACAT TATAAAATCT Gi'\TA/`\/`w'\T/\I\ TTATCAACAT TACAATTGGA AGTATACCAA80-41 IAACCAI 1A] AAAAIAIGAT AAIAI 1 1 IAG HIGCI 1 [AC ÇGAT IGCAAI TCTGAACTTA 1478107 ATCTTGGAAA AATAGCTCTG GACAACGCAC TTGGTAATAT CGTTAAGCGT TGTATACCTT818î CAGACGGAGC AGTATAAAAA GAAACTTTAT CAGCCCCCAC AATGTGTGAA AGAATAAAAC8227 GATCCATATA TGTCATAATA GGGCTAATAA TATTGCTAAC TGTTATCCAG CTTCCAAAGC828T CGATTAATCT TTTAACTGTI' ACAATTTTTA CAGACAGCCC AGATGATATT AI IAGI I 1 IC83“ GACTAAATAT AAAGGTCACT ATAAGTGATA AGACTCTTGC CATAACTAAA CCATATATAG8407 CACTTAGTAA TCCTCCATGA AAA AA AC AG A AAATCACTGG TAATCCAGCC ACAAAAGAGTBdöî TGTTAATTGA TTTTATTAAA TTTACTTTTC TGAACTTTTC CATCCCCTCA AAAATCCCCA85% ACCAGACTTG GTTTAACAAG TATAAGGGTA TGGTAGCTGA AATAATATAT ATTGCTTTGA868T CAGATTCTAC AACATGATTC GCGTTAATGT TTAATAATTT AACAATTACA TTGCTACTCA&SBM AAAAIAG I AC AC I ACCGCCA A I CAAGCCCA A I A I AGI [AG AATTACCGTT GAAGTTGAAA870T TGATCGCTCT TAATTCTTTA TGAACAI I I TATATATTGA TACTTCTCTT ATAACAGCTC8767 TGCTCAATCC AGCATCAAAA ATACTTGCAT ATCCAACTAA (SGCAA T AGCI AACG I AAAAA8827 GGCCAAATTG CTCGGTCCCT AGAATTCTAG ACAGTATACC TAACGCAGGA ATTGCTATTA8881 ATGATGGTAT AATATACCCA CTTATATTCC ATAAAGTATT CTTTACAATA CTCACAAAAA894T TAATTCCTTC ATGTTATGCA ATTCTTTAGC CCTTGCATCT TTAATCGATA AAATATAATT9OOT ATTATGTTCT ATCGTCGGCC ATTTTATGCT CAGAATAGGA TCATTCCATA CAATCCCTCT 1489061 ATCACTATCA GGATGATAAT AGTTCGTCGT TTTATATAAA AATTCCGCAG TCTCGCTCAG9171 CACCAAAAAA CCATGTGCAA ATCCCTCAGG GATCCACAAT TGCCGCTTAT TCTCAGCAGA9181 TAAATTCACC CCAACCCATT TACCAAAGGT AGGCGACGAT TTACGAATAT CAACAGCTAC9241 ATCAAAAACC TCACCAACAA CGCAACGTAC CAGTTTCCCT TGCGCATAAG GTTCTAACTG9301 AIAAIGCAGC CCGCGIAAAA CACCI 1 IACI AGACI ICGAA TGGTTATCCT GAACAAATTC9361 AACCTTACGT CCTACAGCTT CTTCGAAAAC TTTCTGATTA AAGCTTTCCA TAAAGAAACC9421 ACGCTCATCA CCAAAAACTT TCGGCTCGAA AATTAACACA TCAGGAATTT CTGTTTTAAT9481 TACGTTCATT TTATTAATAA CCTTTAATCA TTTTCAGCAG ATACTGTCCA TAAGCATTTT95411 TTTTCAGCGG CTCCGCTAAT GCTTTCACCT GTTCAGCATC AATAAACCCT TTACGGTAAG9601 CAATTTCTTC TGGGCAGGAA ACCTTTAGTC CCTGGCGCTC TTCAATGGTG GCAATGAAGTCCATGCATAA CCACGCCCCA9771 TCATGGCAAC GGATAAACGC CCCTGTTCCA TI\TN\/\TACG GTTAATATCG (STAATTTCCA9781 GTTCACCACG GGCAGAAGGC TTAAGGTTTT TCGCCATTTC GACAACGTCG TTATCATAGA9841 AATAAAGCCC OGTTACCGCA TAATTACTTT TTGGTTCTAG CGGTTTTTCT TCCAGGCTTA9901 TTGCCGTACC GTTTTTATCA AACTCAACGA CGCCGTAGCG TTCAGGATCA TTAACGTGAT9961 AGGCAAATAC CGTTGCACCA CTTTCTTTGT TAACAGCGAC ATCCATTAAC TTCGGCAGAT10021 CATGACCGTA GAAGATATTA TCACCAAGAA CCAAAGCACA 149ATCATCACCA CCGATAAACT10081 CTTCACCGAT AATAAACGCC TGCGCAAGCC CATCTGGAGT CGGTTGCACT TTGTACTGAA10141 GATTTACCCC CCACTGGCTA CCGTCACCTA GCAGTTGTTC AAAACOAGGA GTATCCTGTG 10201 GCGTACTAAT AATCAGAATA TCGCGAATÄC CCGCCAACAT CAGTGTAGAG AGCGGGTMT10?G1 AGATCATCGG CTTATÇATAA ATÄGGTAATA GCTGTTTACT (SACAGCCATA GTCACAGGATACGCGTTTTC ATTTCATCAT'10381 TCCTTTTAAT TCATCTTGCT CCACCATCAC GAACAAGATG CAAAAACTAT TAAATTGCTG10441 TAGTCGTAAT TAATTCGTTG AGCATTCGTT TCACACCAAC C 1 GCCAG I CA GGCAAGACAA10501 GCGCAAAGT 1 CIGCIGAAAI HHCIGIAI IAAGGCGAGA GTTATGTGGA CGACGAGCTG10561 GTGTAGGATA GGCTGTTGTT GGTACTGCGT TGAGCTTGTT GAGTGCAAGG GGAATACCTG10621 Cl 1 1606060 0101 ICAAAA ÂCCAGCGCAG CAIAATCGIG CCAGGTTGTG GTACCACTGG10681 CTACCAGATG GTACAAACCT GCGACTTCCG GTTTATTCAG TGCCACACGA ATAGCATGTG10741 CCGTACAATC AGCCAGCAGC TCAGCACCTG TTGGCGCACC AAATTGATCA TTTATÇACAG10801 CCAGTTCTTC GCGCTCTTTT GCCAGACGCA ACATCGTTTT GGCGAAGIIA 1110011 IAG10861 CTCCGTATAC CCAGCTGGTA CGGAAAATAA GATGCT TCGC GCAATGTTCC TGTAACGCTT10921 TTTCTCCGGC TAACTTGGTT TCACCGTAAA CATTTAGCGG [GCGGT IGÇA TÇÇGIÇIÇÇA 15010981 GCCATGGCGT GTCGCCATTT CCAGGGAATA CGTAGTCAGT TGAGTAATCA ATTACCCAAG1' 041 CCCCAACTTC ATTAGCCTCT TTTGCAATTG ATTCAACACT AGTCGCATTG AGTAATTGTG1 ' 101 CAAATTCGGG TTCTGACTCA GCCTTATCTA CTGCGGTGTG AGCCGCAGCA TTAACAATAAî '161 CATCAGGTCG AATTCTTTTG ACTGTTTCAG CTACACCTTC AGG ATT ACTA AAATCÂCCAC1' 221 AAIAATCAGT GGAGTGAACA TCAAGAGCAA TCAAATTACC CAAAGGTGCC AGAGCACGCT1' 281 GTAGTTCCCA ACCTACCTGC CCTGTTTTGC CGAAAACCAG GATATTCATT ACTGGCGOCC1' 3-41 CTCATAGTTC TGTTCAATCC ACGATTGATA AGCACCACTT TTCACATTAT CAACCCATTT1 ' 401 TCTATTGGAC AGGTACCATT CCAATGTCTT CCGAATCCCG CTCTCAAACG TTTCCTGCGG1'-'$E-1IIICCAGCCC AAI ICGÇGGC IAAICI TCIC TGCAICAÂIC (BCATAACGGC GATCGTGTCC1' 621 CGGGCGATCG GC»'\ACATAAG TAATTTGCTC GCGGTAAGAT TTCTCTTTCG GTACAATCTC1' 581 ATCCAGCAAA TCACAAATAG TGAGCACTAC ATCGATGTTT TTCTTTTCGT TGTGTCCACC1 ' 541 AATOTTATAA GTTTCACCCC CTTTACCTTC GGTTACCACG1"701 AICI ICAACA [ACAGCCAGI CACGAAI I IG AICCCCI l [(5 CCAIAAAIAGGIAAIGCCH1 ' 781 ACCTTCCAGA GCATTCAGAA TAACCAATGG AATC AATTTT TCCGGGAAAT GATAAGGACC1'821AIAAIIAIIA GAGCAAI IAG IÇACÄAIGGI IGGIAAACCA TAGGTACCTT TCCACCCGCG1* 8-81 GACTAAATGA TCGCTGGATG CTTTTGAAGC GGAATAAGGGCTGCTTGGCG CGTAAGCTGT 1511 1941 TGTCTCTGTA AATAAGGGTA ATTCTTCTGT ATTATTTACC TCGTCAGGAT GAGGCAAATC12001 ACCATAGACT TCGTCAGTAG AAATATGATG AAAACGGAAT CTAG ITCT TGTCGCTATC12061 AAG AGÇ AG AC C AATA ATTGC (BAGCGGCTTC (3 A AAAGG AC A TATGTACCAA CAATATTGGT12121 TTCAATAAAT GCCGCAGGAC CTGTAATTGA ACGGTCAACA TGGCTTTCAG CAGCCAGGTG'12181 CATCACTGCA TCTGGCTGAT CCTGAOCAAA AATCCGTCCC ATTGCAGCTG CATCGCAAAT17741 ATCCGCATGT TCAAAAACAT AGCGTTCAGA ATCAGAAACA TCAGCAAGTG ATTCCAGGTT12301 TC CGGCGTAC GTTAATTTAT CGACATTAAC AACACTATCC TGCGTATTAT TTATAATGTG12361 ACGAACIACA GCAAAACCAA 1AAAICC, 1 GC, GCCACCAGIA ACAAGIAI 11 ICACCIAATI'12421 TATTCCATAT TGCTTCAGAG CATGCTGTGA AATAAGCGGC TCTCAGTTTG l`\TT/`\f\T/\GAA17481 GTATTAATGC ACGCTACCGC CCCTGGCTTT ACAGCTACCA GAGCAC [GCA [GCAI GCCIAATTCAAAAGC TAATTGTCTT 12601 ACCAATCCGC TCTGGAAACA AGGAAAATCC TGGAAAACTT IGACTAAAAI CCIAI IGCIA12661 ACICGI IGH AI ICIGAHG 11 IAIAIAAAACAACGGCAG GAATATTCGC AACAAATTAC17771 TFTCACCACG AATCWCACT GCCGTTATAA TTTTCTTATC AACCGTTACA TCCGGTCAGA12/81 TTTTCATTAT TCGCTTAACA GCTTCTCAAT ACCTTTACGG AACTTCGCÇÇ CTTCTTTCAG 15212841 (STTGCGCAGC CCATACTTCA CIAAACGCCTG CATATAGCCC ATTTTTTTAC CGCAGTCGTA12901 GCTGTCGCCG GTC/"TCAGCA TTGCATCAAC GGACTGTTTT TTCGCCAGCT CGGCAATGGC12961 ATCAGTCAGC TGAATACGTC CCCATGCACC AGGCTGAGTA CGI ICAAGI 1 CCGGCCAAAI13021 AICGGCAGAA AGCACA1AGC GACCAACGGC CAIGAI GICI GAGTCCAGCG TCTGCGGCTG'13081 ATCCGGTTTT TCCATAAATT CAACAATGCC GCT GACTTTA CCTTCGCGAT C(Ii"\Ci`(IIGGTTCAIACGI 1 1 16 CCAGCACCIG'13201 GCTACGGCCC GTTTCATTGA AGCGCGCAAT CATGGCAGCA AGGTTGTAGC GTAGCGGGTC13261 GGCGÇ 1 GGCG ICGTCGAI CA CAACGIÇ I GG CAGCACCACG ACAAAIGGAI IGICACCAAI13321 GGCGGGTCGT GCACACAAAA TGGAGTGACC TAAACCTAAA GGTTCOCCCT GACGCACGTT13381 CAIAAIAGIC ACGCCCGGCG GGCAGAIAGA I I GCACI [CC GCCAGIAGI l GACGCI ICAC'13441 GCGCTGCTCA AGGAGAGATT CTAATTCATA AGAGGTGTCG AAGTGGTTTT CGACCGCGTT13501 CTTGGACGCA TGAGTI'ACCA GGAGGATTTC TTTGATCCCT GCAGCCACAA IC ICGICAAC13561AAIGIACIGAAICAHGGCI IGICGACGAI CGGIAGCAIC TCTTTGGGTA TCGCCTTÄGT'13671 GGCAGGCAAC ATATGCATCC CAAGACCCGC TACCGGTATA ACTGCTTTTA AATTCGTCAT13681 TATTTTCCTA CCTCTAAGGG GCTGATAGTG CGTAAATTAT TGTCATAGGTTAGCCAAACG 15313/41 GTATGGCTAT ATACCAAGCA TAACTTTGAT TAAACCTTAC GA IAACAC I A CACACCAICA13801 GCATCTGGGT TACTCGGATT ACTCGGAAAT CCACATACTG ATiVJTTAAT CÄGTACCTCT13861 TTCCGAATAA TCGTAGTCCA ACCTGGTCCT TTTTTCTCTG ACTCGTCTGC ATTACTCAGA13921 AACAAACGTT ATGTCGTCTF TTTTGGCATG GACGAATFCA TACTGCAGAG TTCGATCCAG1398-1 ACCTTGCGAC AGCGTATACG GTGCAACAAA ACCTGAAGAA TGCACTTTCG TTGCGTCAAA14041 CTGTGTTGTT GCGCAGAATT TTTTCACGCG CACAGAGCTG ACAGCGIAH IIIIGCCCGI14101 AATTTTGCTC AGGATATCÄA AGCAATATCC ACCCAGCATT CCTAGTGGGT i"v\GGCi^u'\GTG111161CAIAGAAGGGAIÇIIIHGI ICAGGUIHGIICAACHCA GCAACCAACI (361 ICAIGII14221 CAGGTCTGGC TTATCAACAT AGTTATAAAC CTCATAACCT14281 GTACTTGATA AACTCAACAA TGTTTCCAAC ATAAGCÇATG GACTTATAGT TAGTCCCTGCAAGTTATAGA CGTTACCGCG 14501 GTTGCGTTCA CCGAAGATAA CGGTAGGACG GATGATGGTT AATGAACGTT CTGTTGGTGC146161IIIGIIAIACCAIICACGCA GCACI ICCIC IGCCîßcßAC IIACITIIGCCGIAGIGGH14591 GAAAGGGTCG TGTGGATGGT T“TTCGTCAGG GTTGTGTTTG TTCAAACCAT AAACAGCAAC111581GGAACIGGIAAAGAIGAIAI 111IAACGCC AI I I I I I TCG ATGOCCCCCA GCACATTGCC14641 GGTACCCTGA ACGTTGACAT CATAATAGAG AGAAGTAGGGCTGACGTÇAT CGCGGTGTTC 15414 /01 CGCTGCCAGT AGTACAACAG TGTCAAAACC GGCTAACGCC TGGTCGAGTG CCTGTTGATC14761 ACGAACATCA CCAATCTGTG TGATTTCTGG ATAAAAGTGG CTCTCCCGTT TGTCCAGGTT14821 CTTGATATTA AACTCAGCAA TTGCCGTTTC AAGTAGTCGG GTTCCTACGA ATCCGGAAGC14881 TCCTATGAGC AAAACGTTAT TGTTCATAAA TCACTTTAGT CTGGTTGTTA CGTAAGAAAC1 49411 ACAAGATAAA GATGAGTACC TTCCCTGAOT AGTCAATCCT GCCCAGCCCC AGCTTTAACA15001 GTTAGTGTGA GGATTATAAT CTTTTAGAAC ATTATATCCA GTAAGTTTA` GAATGGTCGC16061 AAATCTACTC TCTCCGTTCC GGCAATCTAA AGTTAATGCT AGCGACGTCG TGGGATCCTC15121IAGAGICGAC CIGCAGGCAI GCAAGCI [GA GIA1 ICIAIA GTCTCÂCCTA AATAGCTTGG15181 CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA15241 ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG CCTGGGGTGCCIAAIGAGIGAGCIAACICA15421 GTTTGACAGC TTATCATCGA ATTTCTGCCA TTCATCCGCT TATTATCACT TATTCAGGCG154181 TAGCAACCAG GCGTTTAAGG GCACCAATAA CTGCCTTAAA AAAATTACGC CCCGCCCTGC15541 CACTCATCGC AGTACTGTTG TAATTCATTA AGCATTCTGC ÇGAÇATGGAA GÇCATÇACAA 155113601. ACGGCATGAT GAACCTGAAT CGCCAGCGGÇ ATCAGCACCT TGTCGCCTTG CGT ATAATAT15861 TTGCCCATGG TGAAAf-xCGGG GGCGAAGAAG TTGTCCATAT IGGCCACGI 1 IAAAICAAAA15721 CTGGTGAAAC TCACCCAGGG ATTGGCTGAG ACGAA/'\f\/\Cf\ TATTCTCAAT AAACCÇTTTA1578: GGGAAATAGG CCAGGTTTTC ACCGI AACAC GCCACATCTTGCGMTATAT GTGTAGAAAC1584'? IGUCGGAAAI CGICGIGGIA I IÇACIÇÇAG AGÇGAIGAÄA .ÃCGI I TÇAGI I IGCIÇAIGG15901 AAAACGGTGT AACAAGGGTG AACACTATCC CATATCACCA GCTCACCCTC TTTCATTGCC 1596'? ATACGAAATT CCC) 3ATGACC ATTCATCAGG CGGGCAACM TGTGAATAAA (SGCCGGATAA'î602'î AACTTGTGCT TATTTTTCTT ?ACGGTCTTT ACURAAGGCCG TAATATCCAG CTGAACGG TC16081. TGGTTATAGG TACATTGAGC AACTGACTGA AATGCCTCAA AATGTTCTTT ACGATGÇ CAT18141IGGGAIAIAICAACGGIGGIA'IAICCAGIG A] I I I I I ICI CCATTT TAGC TTCCTTAGCT”3201 CCTGAAAATC TCGATAACTC AAAAAATACG CCCGGTAGTG ATCTTAI C ATT/'xTGGTGA16261AAGHGGAAÇ CICI îACGIÜ CCGAI'CAACG ICICAI I I 10 GCCAAAAGI T GGÇCCAGGGC'16321 TTCCSCGGTAT CMCAGGGAC ACCAGGATTT ATTTATTCTG CGAAGTGATC TTCCGTCACA1638-1 GGTATTTATT CGCGATAAGC TCATGGAGCG GCGTAACCGT CGCACAGGAA GGACAGAGAA154141 AGÇGCGGATÇ TGGGAAGTGA CGGACAGAAC GGTCAGGAÇC 156TGGATTGGGG AGGCGGTTGC16501 CGCCGCTGCT GCTGACGGTG TGACGTTCTC TGTTCCGGTC ACACCACATA CGTTCCGCCAAAAGTTCTGC AAAGCCTGAT'16621 GGGACATAAG TCCATCAGTT CAACGGAAGT CTACACGAAG GTTTTTGCGC TGGATGTGGC16681 TGCCCGGCAC CGGGTGCAGT TTGCGATGCC GGAGTCTGAT GCGCTTGCGA TGCTGAAACA16/41 ATTATÇCTGA GAATAAATGC CTTGGCCTTT ATATGGAAAT GIGGAACîGA GIGGAIAIGÇ16801 TGTTTTTGTC TGTTAAACAG AGAAGCTGGC TGTTATCCAC TGAGAAGCGA ACOAAACAGT16861 CGGGAAAATC TCCCATTATC GTAGAGATCC GCATTATTAA TCTCAGGAGC CTGTGTAGCG16921 TTTATAGGAA GTAGTGTTCT GTCATGATGC CTGCAAGCGG TAACGAAAÄC GATTTGAATA1698-1IGCCIICAGG AACAA1AGAAAIGI ICGIGC GGIGI IACGI TGAACTGGAG CCGATTATCT1 /041 CAGCAATGGA CAGAAÇAACÇ TAATGAAÇAC AGAACCATGATGTGGTCTGT CCTTTTACAGICGGCIGGII GCCCICGCCG 17161 CTGGGCTGGC GGCCGTCTAT GGCCCTGCAA ACGCGCCAGA 17221 CGAGACACCG CGGCCGGCCG CCGGCGI 1G] GGAIACCICG CGGAAAACTT GGCCCTCACT1728-1 GACAGAIGAG GGGCGGACGI IGAÇAÇI IGA GGGGÇCGACI 157173111 GATGAGGGGC AGGCTCGATT TCGGCCGGCG ACGTGGAGCT GGCCAGCCTC GCAAATCGGC17401 GAAAACGCCT GA] I I TACGC GAGI I ICCCA CAGAI GAIGI GGACAAGCCI GGGGAIAAGI17461 GCCCTGCGGT ATTGACACTT GAGGGGCGCG ACTACTGACA GATGÄGGGGC GCGATCCTTG17521 ACACI IGAGG GGCAGAG I GC IGACAGAIGA GGGGCGCACC IAI IGACAI I IGAGGGGCIG17581 TCCACAGGCA GAAAATCCAG CATTTGCAAG GGTTTCCGCC CGTTTTFCGG CCACCGCTAA17641 CCTGTCTI I AACCTGCTTT TAAACCAATA I ATAAACC TTGTTTTTAA CCAGGGCIGC17/01 GCCCTGTGCG CGTGACCGCG CACGCCGMG GGGGGTGCCC CCCCTTCTCG AACCCTCCCG17761 GTCGAGTGAG CGAGGAAGCA CCAGGGAACA GCACTTATAT AI ICIGCT IA CACACGAIGC17821CIGAAAAAAC IICCCIIGGG GI IAICCACI IAICCACGGG GATATTTTTA TAATTATTTT17881 TTTTATAGTT IAGATCTT CTTTTTTAGA GCGCCTTGTA GGCCTTTATC CATGCTGGTT1 7941 CTAGAGAAGG TGTTGTGACA AATTGCCCTT TCAGTGTGAC AAATCACCCT CAAATGACÂG18001 TCCTGTCTGT GACAAATTGC CCTTAACCCT GTGACAAATT GCCCTCAGAA GAAGCTGTTT18061 TTTCACAAAG TTÄTCCCTGC TTATTGACTC TT I ATTT AGTGTGACAA TCTAAAAACT18121 IGICACACII CACAIGGAIC IGICAIGGCG GAAACAGCGG TTATCAATCA CAAGAAACGT 158' 8181 AAAAATAGCC CGCGAATCGT CCAGTCAAAC GACCTCACTG AGGCG GCATA TAGTCTCTCC' 8741 CGGGATCAAA AACGTATGCT GTATCTGTTC GTTGACCAGA ICAGAAAAIC IGAIGGCACC' 8301 CTACAGGAAC ATGACGGTAT CTGCGAGATC CATGTTGCTA AATATGCTGA AATATTCGGA' 8361 TTGACCTCTG CGGAAGCCAG TAAGGATATA CGGCAGGCAT TGAAGAGTTT CGCGGGGAAG” 8421 GAAGTGGÜ-T WATCGCCC TGAAGAGGAT GCCGGCGATG AAAAAGCCTA TGAATCTTTT' 8481 CCTTGGTTTA TCAAACGTGC GCACAGTCCA TCCAGAGGGC TTTACAGTGT ACATATCAAC' 8541 CCATATCTCA TTCCCTTCTT TATCGGGTTA CAGAACCGGT TTACGCAGTT TCGGCTTAGT' 8601 GAAACAAAAG AAATCACCAA TCCGTATGCC ATGCGTTTAT ACGAATCCCT GTGTCAGTAT' 8661 CGTAAGCCGG ATGGCTCAGG CATCGTCTCT CTGAAAATCG ACTGGATCAT AGAGCGTTACGCCGCTTCCT GCAGGTCTOT ' 8781 GTTAATGAGA TCAACAGCAG AACTCCAATG CGCCTCTCAT ACATTGAGAA AAAGAAAGGC'8841 (ZGCCSAGACGA CICAIAICGI Al 1 I [CGI [(3 (LGCGAIAICA CI ICCAIGAC GACAGGAIAG' 8901 TCTGAGGGTT ATCTGTCACA GATTTGAGGG TGGTTCGTCA CATTTGTTCT GACCTACTGA' 8981 GGGTAATTTG TCACAGTTTT (SCTGTTTCCT TCAGCCTGCA TGGATTTTCT CATACTTTTT 1591902î GAACTGTAAT TTTTAAGGAA GCCAAATTTG AGGGCAGT TT GICACAGI IGAI I [CGI ICT19081 CTTTCCCTTC GTCATGTGAC CTGATATCGG GGGTTAGTTC GTCATCATTG ATGAGGGTTG191/-T ATTATCACAG TTTATTACTC TGAATTGGCT ATCCGCGTGT GTACCTCTAC CTGGAGTTTT19201 TCCCACGGTG GATATTTCTT CTTGCGCTGA GCGTAAGAGC TATCTGACAG AACAGTTCTT'19267 CTTTGCTTCC TCGCCAGTTC GCTCGCTATG CTCGGTTACA CGGCIGCGGC GAGCGCIAGI193W GATAATAAGT GACTGAG GTA TGTGCTCTTC TTATCTCCTT TTGTAGTGTT GCTCTTAI I193& IAAACAACI I IGCGGI I I I I IGAIGACI I I GCGAT I I [GI TGTTGCTTTG CAGTAAATTG191.41 CAAGATTTAÄ TAAAAAAACG CAAAGCAATG ATTAAAGGAT GI ICAGAAIG AAÂÇICATGG19501 AAACACTTAA CCAGTGCATA AACGCTGGTC ÂTGAÄATGAC GAAGGCTATC GCCATTGCAC19581 AGTTTAATGA TGACAGCCCG GAAGCGAGGA i"xi\/`\Ti^u'\t`,(`.('l(`5 GCGCTGGAGA ATAGGTGAAG1962`T CAGCGGATTT AGTTGGGGTT TCTTCTCAGG CTATCAGAGA TGCCOAGAAA GCAGOOCGAC1968T TACCGCACCC GGATATGGAA ATTCGAGGAC GGGTTGAGCA ACGTCTTCGT TATACAATTG197±1î Ar'\C/\i"\/\TTAA TCATATGCGT GATGTGTTTG GTACGCGATT GCGACGTGCT GAAGACGTAT1953-01 TTCCACCGGT GATCGGGGTT GCTCCCCATA AAGGTGGCGT TTACAAAACC TCAGTTTCTG19861 TTCATCTTGC TCAGGATCTG GCTCTGAAGG GGCTACGTGT HIGCICGIG GAAGGIAACG1992'T ACCCCCAGGG MÇAGCCTCA ÄTGTATCACG GATGGGTACC 160AGATCTTCAT ATTCATGCAG19981 ÄACACACTCT CCTGCCTTTC TATCTTGGGC AMAGGACGA TGTCACTTAT GCAATAAAGCGGCTCTGCAC CGTAT TGAAA 20101 CTGAGTTAAT GGGCAAATTT GATGAAGGTA AACTGCCCAC CGATCCACAC CTGATGCTCC20164 GACTGGCCAT TGAAACTGTT GCTCATGACT AT GATGTCAT AGTTATTGAC AGCGCOCCTA20221 ACCTGGGTAT CGGCACGATT AATGTCGTAT GTGLJTGCTGA TGTGCTGATT GTTCCCACGC20281 CTGCTGAGTT GTTTOACTAC ACCTCCGCAC TGCACTTTTT CGATATGCTT CGTGATCTGC20341 TCAAGAACGT TGATCTTAAA GGGTTCGAGC CTGATGTACG IAI I I IGCH ACCAAATACA20401 GCAATAGTAA TGGCTCTCAG TCCCCGTGGA TGGAGGAGCA AA] [CGGGAI GCCIGGGGAA20f-6'T GCATGGTTCT AAAAAATGTT GTACGTGAAA CGGATGAAGT TGGTAAAGGT CAGATCCGGA2052î TGAGAACTGT ITTTGAACAG GCCATTGAIC AACGCTCTTC AACTGGTGCC TGGAGAAATG?0581 CTCTTTCTAT TTGGGAACCT GTCTGCAATG AAATTTTCGA TCGTCTGATT AAACCACGCT208“ GGGACATTAG ATAATGAAGC CTGCGCCTGT TATTCCAAAA C ATAC GCTC i“s ATACTCA AC C2070î GGI IGAAGAI ACI [CGI IAI CGACACCAGC [GCCCCGAIG GTGCATTCCT TAATTGCGCO20/61 CGTAGGAGTA ATGGCTCGCG GTAATGCCAT TACTTTGCCT GTATGTGGTC GGGATGTGAA20821 GTTTACTCTT GAAGTOCTCC OGGGTGATAG TCTTCAGAAC ACCTCTCGGG TATGGTCÄGG 16120881 TAATGAACGT GACCAGGAGC TGCTTACTGA GGACGCACTG GATGATCTCA TCCCTTCTTT 209111 ICIACTGACT GGICAACAGA CACCGGCG1 I CGGICGAAGA GTAICIGGTG ICAIAGAAAI 21001 IGCCGAIGGG AGICGCCG1C GIAAAGCIGC IGCACI IACC GAAAGTGATT ATCGTGTTCT 21061 GGTTGGCGAG CTGGATGATG AGCAGATGGC TGCATTATCC AGAI IGGGIA ACGAI IAICG 21121CCCAACAAGIGC11AIGAAC GIGGICAGCG IIAIGCAAGC CGATTGCAGA ATGAATTTGC21 '181 TGGAAATATT TCTGCGCTGG CTGATGCGGA AAATATTTCA21301 ATCTGCCCGG TCAGGTGATG CACTTCAAAA AGCCTTTACA GATAAAGAGG AATTACTTAA 21361 GCAGCAGGCA ICIAACCI IC AIGAGCAGAA AAAAGCTGGG GIGAIAI 1 IGAAGCIGAAGA21421 AGTTATCACT CTTTTAACTT CTGTGCTTAA AACGTCATCT GCATCAAGAA CTAGT'ITAAG21481 CTCACGACAT CAG GÇTC ÇTGGAGCGAÇ nGTATTGTAT21541 TAACCTGGAC AGGTCTCGTG TTCCAACTGA GTGTATAGAG AAAATTGAGG CCATTCTTAA21601 GGAACTTGAA AAGCCAGCAC CCTGATGCGA CCACGTTTTA GTCTACGTTT ATCTGTCTTT21661 ACTTAATGTC CTTTOTTACA GCCCAGAAAG CATAACTGCC 16221721 CACTGTTCCA CTTGTATCGT CGGTCTGATA ATCAGACTGG GACCACGGTC CCACTCGTAT21781 CGTCGGTCTG ATTATT AGTC TGGGACCACG GTCCCACTCG TATCGTCGGT CTGATTATTA21841 GTCTGGGACC ACGGTCCCAC TCGTATCGTC GGTCTGATAA TCAGACTGGG ACCACGGTCC21901 CACTCGTATC GTCGGTCTGA TTATTAGTCT GGGACCATGG TCCCACTCGT ATCGTCGGTC21961 TGATTATTAG TCTGGGACCA CGGTCCCACT CGTATCGTCG GTCTGATTAT TAGTCTGGAA22021 CCACGGTCCC ACTCGTATCG TCGGTCTGAT TATTAGTCTG GGACCACGGT CCCACTCGTA22081 TCGTCGGTCT G ATTAWT AGT CTGGGACCAC GATCCCACTC GTGTTGTCGG TCTGATTATC22141 GGTCTGGGAC CACGGTCCCA CTTGTATTGT CGATCAGACT AICAGCGI (SA (SACIACGAI 122201 CCATCAATGC CTGTCAAGGG CAAGTATTGA CATGTCGTCG TAACCTGTAG AACGGAGTAA22261 CCTCGGTGTG CGGTTGTATG CCTGCTGTGG ATTGCTGCTG TGICÇIGCI I AICÇAÇAACA22321 I GCGCAC GGTTATGTGG ACAAAATACC TGGTTACCCA GGCCGTGCCG GCACGTTAAC22381 CGGGCTGCAT CCGATGCAAG TGTGTCGCTG TCGACGAGCT (ZGCGAGC: I (3(3 (SACA 1 GAGGI22441 TGCCCCGTAT TCAGTGTCGC TGATTTGTAT TGTCTGAAGT TGTTTTTACG TTAAGTTGAT22501 GCAGATCAAT TAATACGATA CCTGCGTCAT AATTGATTAT TTGACGTGGT TTGATGGCCT22561 CCACGCACGT TGTGATATGT AGATGATAAT CATTATCACT TTACGGGTCC TTTCCGGTGA22621 TCCGACAGGT TACGGGGCGG CGACCTCGCG GGTTTTCGCT ATTTATGAAA ATTTTCCGGT 16322681 TTAAGGCGTT TCCGTTCTTC TTCGTCATAA CTTAATGTTT TTATTTAAAA TACCCTCTGA22741 AAAGAAAGGA AACGACAGGT GCTGAAAGCG AGCTTTTTGG CCTCTGTCGT TTCCTTTCTC?9801 TGTTTTTGTC CGTGGAATGA ACAÄTGCAAG TCCGAGCTCA TCGCTAATAA CTTCGTATAG22861 CATAÇATTAT ACGAAGTTAT ATTCC-AT164TARIFNAME IÇERISINDE ATIF YAPILAN REFERANSLARBasvuru sahibi tarafindan atif yapilan referanslara iliskin bu liste, yalnizca okuyucunun yardimi içindir ve Avrupa Patent Belgesinin bir kismini olusturmaz. Her ne kadar referanslarm derlenmesine büyük 'önem verilmis olsa da, hatalar veya eksiklikler engellenememektedirve EPO bu baglamda hiçbir sorumluluk kabul etmemektedir.Tarifname içerisinde atifta bulunulan patent dökümanlari:-US 61272931 A [0001] 'WO 2006119987 A, Aebi [0008] 'WO 200307467 A, Aebi [0005] [0007] 'WO 2009104074 A, Fernandez [0012]

[0071] [0151]Tarifnamede belirtilen patentlestirilmemis literatür:o HELENIUS, A. ; AEBI, M. Roles of 0 ZHANG, L. ; RADZIEJEWSKA- N-linked glycans in the endoplasmic LEBRECHT, J. ;KRAJEWSKA-reticulum. Annu. Rev. Biochem., PIETRASIK, D. ; TOLVANEN, P. ; 2004, vol. 73, 1019-1049 [0003] SKURKIK, M. Mol. Microbiol., 1997, ° BURDA P. ; M. AEBI. The dolichol vol. 23, 63-76 [0017]pathway of N-linked glycosylation. - AMOR, P. A., WHITFIELD, C.

Biochem Biophys Acta, 1999, MOL. MICROBIOL.,1997, vol. 26, 145- Vol. 1426 (2), 239-57 [0005] 161 [0018]0 WACKER et al. N-linked ° RUSH, J. S. ; RICK, P. D. ; glycosylation in Campylobacter je juni WAECHTER, C. J. Glycobiology, and its functional transfer into E. 1997, vol. 7, 315-322 [0018] [0096] coli.Science, 2002, vol. 298, 1790-1793 [0111][0005] - WANG, L. ; HUSKIC, S. ;0 PASSWELL, J.H. et al. Safety and CISTERNE, A. ;ROTHEMUND, D. ; Imrnunogenicity of Improved Shigella REEVES, PR. .1. Bacterid., O-Specific Polysaccharide-Protein 2002, vol. 184, 2620-2625 [0019]Con jugate Vaccines in Adults in Israel. ° GUO, H. ; YI, W. ; LI, L. ; WANG, lnfection and Immunity, March 2001, P. C. Biochem.Bi0phys. Res. Commun.,vol. 69 (3), 1351-1357 [0012] 2007, vol. 356, 604-609 [0019]° LAW, D. J. App. Microbiol., 2000, ° FELDMAN et al. Proc. Natl. Acad. vol. 88, 729-745 [0013] Sci US, 2005, vol. 102 (8), 3016-3021 ° WANG, L. ; REEVES, P. R. lnfect. [0021]Immun., 1998, vol. 66, 3545-3551 0 RUSH et al. 1. Biol. Chem., 2009,

[0013] [0018] [0053] vol. 285 (3),]671-1680 [0021]- PERRY, M. B. ; MACLEAN, L. ; . SZYMANSKI, CM. ; WREN, B.W.

GRIFFITH, D. W. Biochem. Cell. Protein glycosylation in bacterialBiol., 1986, vol. 64, 21-28 [0014] mucosal pathogens. Nat. Rev. icrobiol., 165. RAETZ, C. R. H. ; WHITFIELD, C. Annu. Rev. Biochem.,2002, vol. 71, 635-700 [0014]0 WHITFIELD, C. Ann. Rev.

Biochem., 2006, vol. 75, 39-68 [0014] ' SAMUEL, G. ; REEVES, P. R.

Carbohydrate Research, 2003, vol. 338, 2503-2519 [0014] [0017]° REEVES, P. R. ; HOBBS, M.. ; VALVANO, M. A. ;SKURNIK, M. ; WHITFIELD, C ; COPLIN, D. ; IDO,N. ; LENA, J. ; MASKELL, D. ; RAETZ, C. R. H.Trends Microbiol., 1996, vol. 4, 495-503 [0015]0 LAW, D. J. App. Microbiol, 2000, vol. 88, 729-745 [0015]o SPEARS, K. J. ; ROE, A. J. ; GAILY, D. L. FEMS Microbiol. Lett., 2006, vol. 255, 187-202 [0015]- LIU, B.; KNIREL, Y. A. ; FENG, L.

; PEREPELOV,A. V. ; ENCHENKOVA, S. N. ; WANG, Q. ; REEVES, P. R. ; WANG, L. FEMS Microbiol. Rev.,2008, vol. 32, 627-653

[0015]- STENUTZ, R. ; WEINTRAUB, A. ; WIDMALM, G.FEMS Microbiol.

Rev., 2006, vol. 30, 382-403 [0015]o ALEXANDER, D. C. ; VALVANO, M. A. J. Bacteriol,1994, vol. 176, 7079-7084 [0017]° FIELD, R. A. ; NAISMITH, J. H.

Biochemistry, 2003, vol. 42, 7637-7647

[0065] [0066]0 MIKUSOVA, K. ; HUANG, H. ; YAGI, T. ; HOLSTERS, M. ; VEREECKE, D. ; D'HAEZE, W. ; SCHERMAN, M. S. ; BRENNAN, P.

J. ; MCNEIL, M. R. ; CRICK, D. C. .1. Bacteriol., 2005, vol. 187, 8020-8025

[0066]° ALLARD, S. T. M. ; GIRAUD, M.- F. ; NAISMITH, J.H. Cell. Mol. Life Sci., 2001, vol. 58, 1650-1655 [0066]o FELDMAN ; WACKER, M. et al.

Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the2005, vol. 3, 225-237 [0039]o BUGG, T. D. ; BRANDISH, P. E.

From peptidoglycan to glycoproteins: common features of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis. F EMS Microbiol Lett, 1994, vol. 119, 255-262

[0049]o VALVANO, M. A. Export of 0- specific lipopolysaccharide.Fr0nt Biosci, 2003, vol. 8, 452-471 [0049]o WANG, L. ; HUSKIC, S. ; CISTERNE, A. ;ROTHEMUND, D. ; REEVES, P.R. J. Bacteriol.,2002, vol. 184, 2620-2625 [0054]

[0058] [0062]o GUO, H. ; YI, W. ; LI, L. ; WANG, P. G. BiocheinBiophys. Res. Coinin., 2007, vol. 356, 604-609 [0054]- GUO, H. ; YI, W. ; LI, L. ; WANG, P. G. BIOCHEMBIOPHYS. RES.

COMJVIUN., 2007, vol. 356, 604-609

[0060]° BIOCHEM. BIOPHYS. RES.

COlVHVlUN., vol. 356, 604-609 [0061] ° HOFMANN, K. ; ST OFFEL, W.

Biol. ChemHoppe-Seyler, 1993, vol. 374, 166 [0064]0 ALLARD, S. T. M. ; GIRAUD, M.

F. ; NAISMITH, J. H. Cell. Mol. Life Sci., 2001, vol. 58, 1650-1655 [0065]. SCHWIMMER, s. ; BENVENUE, A. Science, 1956,v01. 123, 543-544

[0116]- GORDON, H. T. ; THORNBURG, W. ; WERUM, L.N. Anal. Chem., 1956, vol. 28, 849-855 [0117]- GUAN, Z. ; BREAZEALE, S. D. ; RAETZ, C. R. Anal. Biochem., 2005, vol. 345, 336-339 [0119]' MEIER-DIETER, U. ; STARMAN, R. ; BARR, K. ;MAYER, H. ; RICK, P. D. J. Biol. Chem., 1990, vol.265, 13490-13497 [0121]- DUNPHY, P. J. ; KERR, J. D. ; PENNOCK, J. F. ; WHITTLE, K. J.

; FEENEY, J. Biochim. Biophys. Acta, 1967, vol. 136, 136-147 [0124]' STEVENSON, G. ; NEAL, B. ; LIU, 166bacterial and eukaryotic systems. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, vol.103 (18), 7088-93 [0071]0 Remington°s Pharmaceutical Sciences. Mack PublishingCo, 1990 [0087]o MEIER-DIETER, U. ; STARMAN, R. ; BARR, K. ; MAYER, H. ; RICK, P. D. 1. Biol. Chem., 1990, vol.265, 13490-13497 [0096]- STEPHAN, R. ; BOREL, N. ; ZWEIFEL, C ; BLANCO,M. ; BLANCO, J.E. BMC Microbiol, 2004, vol. 4 (10 [0096]o LEFEBRE, M. D. ; VALVANO M.

A. Appl Environ Microbiol, 2002, vol. 68, 5956-5964 [0098]o WACKER, M. ; LINTON, D. ; HITCHEN, P.G. ; NITA- LAZAR, M. ; HASLAM, S.M. ; NORTH, S.J.

;PANICO, M. ; MORRIS, H.R.; DELL, A. ; WRENN, B.W. Science, 2002, vol. 298, 1790-1793 [0099]

[0133] [0134]o WAECHTER, C. J. ; KENNEDY, J. L. ; HARFORD, J. B. Arch.

Biochem. Biophys., 1976, vol. 174, 726-737 [0108] [0124]o WAECHTER, C. J. ; HARFORD, J. B. Arch. BiochemBiophys., 1977, vol. 181,185-198 [0113]o KEAN, E. L. J. Lipid Res., 1966, vol. 7, 449-452 [0114] [0115]0 CARDINI, C. E. ; LELOIR, L. F. J.

Biol. Chem., 1957, vol. 225, 317-324

[0115]D. ; HOBBS, M. ; PACKER, N. H. ; BATLEY, M. ; REDMOND, J. W. ; LINDQUIST, L. ; REEVES, P. .1.

Bacteriol., 1994, vol. 176, 4144-4156

[0125]. BERNATCHEZ, s. ; SZYMANSKI, CM. ; ISHIYAMA,N. ; LI, J. ; JARRELL, H.C. ; LAU, P.C. ; BERGHUIS,A.M. ; YOUNG, N.M. ; WAKARCHUK, W.W. J. Bi01.Chem., 2005, vol. 280, 4792-4802 [0133]- LINTON, D. ; DORRELL, N. ; HITCHEN, P.G. ; AMBER, S. ; KARLYSHEV, A.V. ; MORRIS, H.R. ; DELL, A. ; VALVANO, M.A.

; AEBI, M. ; WREN, B.W. Mol Microbiol., 2005, vol. 55, 1695-1703

[0133]o LAEMMLI, U. Nature, 1970, vol. 227, 680-685 [0134]0 FELDMAN, M.F. ; WACKER, M. ; HERNANDEZ, M. ; HITCHEN, P.G.

; MAROLDA, C.L. ; KOWARIK, M. ; MORRIS, H.R. ; DELL, A. ; VALVANO, M.A. ;AEBI, M. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, vol. 102, 3016-3021 [0134]0 AEBI, M. ; GASSENHUBER, J. ; DOMDEY, H. ; TE HEESEN, S.

Glycobiology, 1996, vol. 6, 439-444

[0134]o DMITRIEV, B.A. et al. SomaticAnti gens of Shigella Eur JBiochem, 1979, vol. 98, 8 [0136]o LIU B et al. Structure and genetics of Shigella O antigens FEMS Microbiology Review, 2008, vol. 32, 27

[0136] SEKILLERDEKI YAZILARIN ANLAMLARISEKIL 1 A = Olusan [3H]HexNAc-P-P-Und (pmol/mg) B : Süre (dakika)SEKIL 2 C = UDP-GlcNAc 4-epimerazD = Yeni epimerazSEKIL 3A E : Detektör tepkisi F = Mobilite (mm)SEKIL 8 G : KontrolSEKIL 9H = UDP-glukoz pirofosforilaz I : Ramnoz öncü biyosenteziJ = FlipazK : PolimerazL = Glikosil transferazM = 6-fosfaglik0nat dehidrogenaz

Claims

ISTEMLER

1. Sunlari sifreleyen nükleik asitler içeren E. coli gibi bir rekombinant prokaryotik organizma: i) undekaprenil pirofosfat üzerinde N-asetilgalaktosamini sentezleyen bir epimeraz; burada adi geçen epimerazi sifreleyen adi geçen nükleik asit, SEK.KIM.NO.:1”e en az ii) bir oligo- veya polisakaridi bir lipit tasiyici üzerinde toplayan glikosiltransferazlar; iii) Cainpylobacter je juni”den bir oligosakaril transferaz; ve iv) bir veya daha fazla rekombinant sekilde dahil edilmis konsensüs sekans, D/E-X-N-Z-S/T içeren bir protein; buradaki X ve Z birbirinden bagimsiz olarak prolin hariç herhangi bir dogal amino asittir burada adi geçen glikosiltransferazlar tarafindan toplanan oligosakarid, lipit tasiyicidan bir veya daha fazla Optimize edilmis konsensüs sekansa sahip hedef proteine oligosakaril transferaz tarafindan transfer edilebilir.

2. Istem l'e ait rekombinant prokaryotik biyosentetik sistem; burada adi geçen protein, P. aeruginosa eksoproteinidir.

3. 1-2 istemlerinden birine ait rekombinant prokaryotik biyosentetik sistem; burada adi geçen oligo- veya polisakarid, bir Gram negatif bakteridendir.

4. Istein 3°e ait rekombinant prokaryotik biyosentetik sistem; burada adi geçen oligo- veya polisakarid, Shigella flexneri, tercihen Shigella flexneri6”dan; veya E. coli, tercihen de E coli 0157”dendir. 1 ila 4 istemlerinden birine ait rekombinaiit prokaryotik biyosentetik sistem; burada adi geçen oligo- veya polisakarid, (i) asagidaki yapiyi: giiLfîtia ijiyL-Rtia "rgiQ-Gala `ll",;›[)-Cialrvlißc 1 › veya (ii) asagidaki yapiyi içerir: a-D-PerNAc-a-L-Fuc-(ß-D-Glc- a-D-GalNAc. N baglantili glikosile edilmis bir protein üretmeye yönelik olup, 1-5 istemlerinden birine ait rekombinant prokaryotik organizmamn, protein üretimine uygun kosullar altinda kültürlenmesini ve N-glikosile edilmis proteinin kültürden izole edilmesini kapsayan bir yöntem. Bir N baglantili glikosile edilmis protein üretilmesine yönelik olup sunlari kapsayan bir yöntem: a.) bir E. coli konakçi organizinasi içerisine, sunlari sifreleyen nükleik asitlerin dahil edilmesi: i) undekaprenil pirofosfat üzerinde N-asetilgalaktosamini sentezleyen bir epimeraz; burada adi geçen epimerazi sifreleyen adi geçen nükleik asit, SEK.KIM.NO.:l'e en az ii) bir oligo- veya polisakaridi bir lipit tasiyici üzerinde toplayan glikosiltransferazlar; iii.) Campylobacter jejunisden bir oligosakaril transferaz; ve iv.) bir veya daha fazla dahil edilmis konsensüs sekans, D/E- X-N-Z-S/T içeren bir protein; buradaki X ve Z, prolin hariç herhangi bir dogal amino asit olabilir; ve b.) adi geçen konakçi organizmanin, en az bir N-glikosile edilmis protein üretilene kadar kültürlenmesi. Istem 7”de ait yöntem; burada adi geçen protein, P. aeruginosa eksoproteinidir. 7 ila 8 istemlerinden birine ait yöntem; burada adi geçen oligo- Veya polisakarid, bir Gram negatif bakteridendir. 7 ila 9 istemlerinden birine ait yöntem; burada adi geçen oligo- Veya polisakarid, Shigella flexneri, tercihen de Shigella flexneri 6”dand1r. 7 ila 10 istemlerinden birine ait yöntem; burada adi geçen oligo- Veya polisakarid, E. coli”den, tercihen de E. coli 0157”dendir. 7 ila ll istenilerinden birine ait yöntem; burada adi geçen oligo- veya polisakarid, (i) asagidaki yapiyi: veya (ii) asagidaki yapiyi içerir: u-D-PerNAc-a-L-Fuc-(ß-D-Glc- a-D-GalNAC.