JP5752687B2 - Ｅｒｂｂ３の外部ドメインに対する抗体およびその使用 - Google Patents

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Description

発明の背景
ポリペプチド増殖因子受容体のＥｒｂＢ／ＨＥＲサブファミリーには、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ｎｅｕ癌遺伝子産物（ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２）、ごく最近に同定されたＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４の受容体タンパク質が挙げられる（例えば、非特許文献１を参照されたい）。これらの受容体の各々は、外部ドメイン（細胞外のリガンド結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、細胞質のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインおよびＣ末端リン酸化ドメインからなることが予測されている（例えば、非特許文献２を参照されたい）。ＥｒｂＢ受容体の外部ドメインは、さらに、４つのドメイン（Ｉ〜ＩＶ）に分けられると特徴付けられる。ＥｒｂＢ外部ドメインのドメインＩおよびＩＩＩはリガンド結合に関与する（例えば、非特許文献３を参照されたい）。これらの受容体のためのリガンドには、ヘレグリン（ＨＲＧ）およびベタセルリン（ＢＴＣ）が含まれる。
インビトロでの実験によって、ＥｒｂＢ３受容体（ＥｒｂＢ３）タンパク質のタンパク質チロシンキナーゼ活性は、他のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーメンバーのものと比較して顕著に減衰しており、この減衰は、部分的には、ＥｒｂＢ３の予測される細胞内触媒ドメインにおける非保存的なアミノ酸置換の発生によることが示された（例えば、非特許文献４；非特許文献５を参照されたい）。しかしながら、ＥｒｂＢ３タンパク質は、様々な細胞状況においてリン酸化されることが示されている。例えば、ＥｒｂＢ３は、このタンパク質を過剰発現するヒト乳癌細胞系統的にリン酸化される（例えば、非特許文献６；、上掲を参照されたい；また、非特許文献７、並びに、非特許文献８を参照されたい）。
癌におけるＥｒｂＢ３の役割は研究されてはいるが（例えば、Ｈｏｒｓｔら（２００５）１１５，５１９−５２７；非特許文献９を参照されたい）、ＥｒｂＢ３は、臨床的介入の標的として、依然としてそれほど評価されていない。現在の免疫治療は、主に、ＥｒｂＢ２の作用、特に、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３複合体のヘテロ二量化の阻害に焦点が当てられている（例えば、非特許文献１０を参照されたい）。したがって、本発明の目的は、ＥｒｂＢ３シグナル伝達を効果的に阻害し、様々な癌を処置および診断するために用いることができる改善された免疫治療を提供することである。
Ｈｙｎｅｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １１９８，１６５−１８４ Ｋｉｍら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４，１８９−１９５ Ｈｙｎｅｓら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ５， ３４１−３５４ Ｇｕｙら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，８１３２−８１３６ Ｓｉｅｒｋｅら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２２，７５７−７６３ Ｋｒａｕｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，２９００−２９０４ Ｓｃｈａｅｆｅｒら（２００６）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８（７）：６１３−２２ Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００４）６４（１０）：３３９５−４０５ Ｘｕｅら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６，１４１８−１４２６ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）
特定の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ３受容体に結合して、種々のＥｒｂＢ３機能を阻害する新しい種類の抗体（例えばモノクローナル抗体）を提供する。例えば、本明細書に記載されている抗体は、ＥｒｂＢ３に結合し、ＥＧＦ様リガンドを介した受容体のリン酸化を阻害することができる。本明細書に記載されるように、ＥＧＦ様リガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、ビレグリンおよびアンフィレグリンが含まれ、それらは、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との二量化を誘導する。次に、この二量化は、ＥｒｂＢ３のリン酸化を引き起し、その受容体を介してシグナル伝達を活性化する。このようにして、本発明の抗体は、ＥｒｂＢ３を介した細胞のシグナル伝達と関連した様々な癌の処置および診断に有用である。したがって、一実施形態では、本発明は、ＥｒｂＢ３に結合し、ＥＧＦ様リガンドを介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗体（その抗原結合部分を含む）を提供する。
別の実施形態では、抗体およびその断片は、さらに、下記の特徴のうちの１以上によって特徴付けられる：（ｉ）ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびビレグリンなどのＥｒｂＢ３リガンドのＥｒｂＢ３との結合によって媒介されるシグナル伝達を含む、ＥｒｂＢ３リガンドを介したシグナル伝達の阻害；（ｉｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖の阻害；（ｉｉｉ）細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力（例えば、ＥｒｂＢ３の内在化を誘導することによる）；（ｉｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞によるＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）分泌の阻害；（ｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害；（ｖｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害；および（ｖｉｉ）成熟ＥｒｂＢ３のアミノ酸残基１から約１９０（配列番号７３）、例えば配列番号７３の残基１〜１８３の任意の部分を含むまたは該部分にわたる、より好ましくは配列番号７３の残基９３〜１０４または９２〜１２９を含むまたは該部分にわたる、より好ましくは配列番号７３の残基９２、９３、９９、１０１、１０２、１０４および１２９または配列番号７３の残基９３、１０１、１０２、および１０４を含むまたは該部分にわたるエピトープに対応する、外部ドメイン（細胞外ドメイン）ドメインＩ上に位置したエピトープとの結合。
好ましい実施形態では、抗体は、配列番号７３の残基９３〜１０４もしくは９２〜１２９を含むまたは該部分にわたるエピトープ、より好ましくは配列番号７３の残基９２、９３、９９、１０１、１０２、１０４および１２９、または配列番号７３の残基９３、１０１、１０２、および１０４を含むまたは該部分にわたるエピトープに結合するが、ただし、該抗体は、（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６ではなく；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示すＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体ではなく；かつ、(ｉｉｉ)配列番号７、８および９にそれぞれ示すＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示すＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む抗体ではない。
別の好ましい実施形態では、抗体は、配列番号７３の残基９３〜１０４または９２〜１２９を含むもしくは該部分にわたるエピトープ、より好ましくは配列番号７３の残基９２、９３、９９、１０１、１０２、１０４および１２９、または配列番号７３の残基９３、１０１、１０２、および１０４を含むもしくは該部分にわたるエピトープに結合するが、ただし、該抗体は（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６ではなく；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示すＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体ではなく；かつ、(ｉｉｉ)配列番号７、８および９にそれぞれ示すＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示すＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む抗体ではなく；（ｉｖ）本明細書に開示されるＡｂ＃３抗体；（ｖ）配列番号３および４にそれぞれ示すＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体ではなく；（ｖｉ）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ示すＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列、ならびに配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示すＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む抗体ではなく；（ｖｉｉ）本明細書に開示するＡｂ＃１７ではなく；（ｖｉｉｉ）配列番号３５および３６にそれぞれ示すＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体ではなく；（ｉｘ）配列番号３９、４０および４１にそれぞれ示すＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列、ならびに配列番号４２、４３および４４にそれぞれ示すＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む抗体ではなく；（ｘ）本明細書に開示するＡｂ＃１９ではなく；（ｘｉ）配列番号３７および３８にそれぞれ示すＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体ではなく；かつ、（ｘｉｉ）配列番号４５、４６および４７にそれぞれ示すＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列、ならびに配列番号４８、４９および５０にそれぞれ示すＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む抗体ではない。
本明細書に開示される好ましい抗体およびその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定すると、ＫＤが５０ｎＭ以下を示す。
さらなる実施形態では、本発明の特定の抗体およびその抗原結合部分は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号３５、または配列番号３７に記載される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の他の特定の抗体およびその抗原結合部分は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号３６、または配列番号３８に記載される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。また、抗体は、前記の重鎖および軽鎖の両可変領域を含んでもよい。
抗体またはその抗原結合部分の可変重鎖および軽鎖の領域は、典型的には、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。これらには、１以上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の領域が含まれる。したがって、本開示の他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本開示のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本開示のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本開示のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号３９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本開示のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、および配列番号４５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；それらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
また、抗体およびその抗原結合部分は、前記ＣＤＲのいずれかまたはＣＤＲの組み合わせと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一である１以上のＣＤＲを含んでもよい。
一実施形態では、抗体およびその抗体部分は、完全にヒトである（すなわち、ヒトＣＤＲおよびフレームワークの配列を含む）。本開示の特定のヒト抗体は、ヒトＶＨ３生殖細胞系列遺伝子由来である重鎖可変領域、および／またはヒトＶＬ２生殖細胞系列遺伝子由来である軽鎖可変領域を有するものが含まれる。
また、本明細書に記載される抗体およびその部分のいずれかによって結合される、同じであるかまたは重複しているエピトープ（例えば、ＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに位置するエピトープ）、成熟ＥｒｂＢ３（配列番号７３）のアミノ酸配列の残基１〜１８３のいずれかを含むまたは該部分にわたる、より好ましくは、配列番号７３の残基９３〜１０４または９２〜１２９を含むまたは該部分にわたる、さらにより好ましくは配列番号７３の残基９２、９３、９９、１０１、１０２、１０４および１２９、または配列番号７３の残基９３、１０１、１０２および１０４を含むまたは該部分にわたるエピトープなどのエピトープに結合する抗体およびその抗原結合部分が本発明に包含される。本明細書に記載されている抗体と同じエピトープ結合活性を有する抗体、例えば、Ａｂ＃６と同じ配列を有する抗体または配列番号７３の残基９３〜１０４を含む結合エピトープが本発明に包含される。
また、ヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインに結合する抗体およびその抗原結合部分が本発明に包含され、かつ
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域を含み、
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列が、配列番号６０または７５（ＣＤＲ１）、６１（ＣＤＲ２）および６２（ＣＤＲ３）にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のコンセンサス配列を含み、ならびに
軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列が、配列番号６６または７７（ＣＤＲ１）、６７（ＣＤＲ２）および６８または７９（ＣＤＲ３）にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のコンセンサス配列を含み、ただし、該抗体は、（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６ではなく；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体ではなく；かつ（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体ではない。
好ましい実施形態では、単離した抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号７３の残基９２〜１２９または９３〜１０４を含むヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩ内のエピトープに結合する。さらに好ましくは、単離した抗体、またはその抗原結合性部分は、配列番号７３の残基９２〜１２９または９３〜１０４を含むヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩ内のエピトープに結合して、ＥｒｂＢ３を発現する癌細胞の増殖を阻害する。好ましくは、癌細胞は、ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞、ＡｄｒＲ（ＡＤＲｒ）卵巣腺癌細胞またはＡＣＨＮ腎癌細胞であり、対照（すなわち、対応する非処理細胞）と比べると増殖が少なくとも１０％減少する。
ヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに結合する、単離した抗体またはその抗原結合部分の別の実施形態では、単一アミノ酸置換によって変異体ＥｒｂＢ３を作製するために、配列番号７３の残基９３（アスパラギン）、残基９９（フェニルアラニン）、残基１０１（メチオニン）、残基１０２（ロイシン）、および残基１０４（チロシン）から選択されるヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩのアミノ酸残基のいずれか１つがアラニンで置換されるかまたは配列番号７３の残基９２（チロシン）もしくは１２９（チロシン）がフェニルアラニンで置換される場合に、抗体またはその抗原結合部分の、配列番号７３（もしくはその対応する断片）の不変アミノ酸配列を含むヒトＥｒｂＢ３に対する結合と比較すると、抗体またはその抗原結合部分の、変異ＥｒｂＢ３（もしくはその断片）に対する結合は、実質的に減少している。好ましくは、結合の実質的な減少は、結合のＫＤ値における少なくとも１０倍の変化である。
また、ヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに結合する抗体およびその抗原結合部分が本発明に包含され、かつ
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
重鎖可変領域のパラトープが、配列番号６３または７６（ＣＤＲ１）、６４（ＣＤＲ２）および６５（ＣＤＲ３）にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含み、ならびに
軽鎖可変領域のパラトープが、配列番号６９もしくは７８（ＣＤＲ１）、７０（ＣＤＲ２）および７１もしくは８０（ＣＤＲ３）にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ただし、該抗体は（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６ではなく；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体ではなく；かつ、(ｉｉｉ)配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む抗体ではない。
また、ヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに特異的に結合する抗体およびその抗原結合部分が本発明において包含され、前記抗体またはその抗原結合部分が、
配列番号７またはその保存的アミノ酸置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号８またはその保存的アミノ酸置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
配列番号９またはその保存的アミノ酸置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号１０またはその保存的アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号１１またはその保存的アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
配列番号１２またはその保存的アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、
該抗体または抗原結合部分のＥｒｂＢ３との結合が、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定すると、ＫＤが５０ｎＭ以上を示す。
本発明の抗体には、全ての知られている形態の抗体、および抗体様の特性を有する他のタンパク質骨格が含まれる。例えば、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体または抗体様の特性を有するタンパク質骨格、例えば、フィブロネクチンまたはアンキリンのリピートであり得る。また、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ＳＭＩＰ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはドメイン抗体であり得る。また、抗体は、次のアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかを有することができる。
さらに別の実施形態では、本発明は、さらに、許容される担体および／またはアジュバントとともに製剤化される、本明細書に記載されている抗体または抗原結合部分の組み合わせを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は、ＥｒｂＢ３に結合しない抗癌抗体と組み合わせた、本明細書に記載されているＥｒｂＢ３または抗体の異なるエピトープに結合する２以上の抗体を含む。
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている抗体およびその抗原結合部分をコードする単離された核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３５、もしくは配列番号３７と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるヌクレオチド配列、または高ストリンジェントな条件下で配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３５、もしくは配列番号３７にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む重鎖可変領域；または、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３６、もしくは配列番号３８と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるヌクレオチド配列、または高ストリンジェントな条件下で配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３６、もしくは配列番号３８にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；あるいは、このような重可変領域および軽可変領域の組み合わせをコードする。
本発明は、さらに、本明細書に記載されている抗体および抗原結合部分を発現および／または産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、ハイブリドーマ、およびトランスジェニック植物を提供する。
また、本発明は、本明細書に記載されている１以上の単離された抗体または抗原結合部分、場合により、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患、例えば癌の処置または診断に用いるための取扱説明書を含むキットを提供する。
本明細書に開示される抗体および抗原結合部分は、多様な治療および診断用途、特に腫瘍用途に用いることができる。したがって、別の態様では、本発明は、ＥＧＦ様の媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するのに十分な量で、本明細書に記載されている１以上の抗体または抗原結合部分を投与することによって、被験体におけるＥＧＦ様リガンド媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する方法を提供する。本発明は、さらに、癌を処置するのに十分な量で、本明細書に記載されている１以上の抗体または抗原結合部分を投与することによって、被験体における種々の癌、例えば、限定されないが、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎臓癌腫、消化管／結腸癌、肺癌、明細胞肉腫、および前立腺癌を処置する方法を提供する。一実施形態では、癌はＫＲＡＳ変異を有する細胞を含む。代表的なＫＲＡＳ変異は、ヒトＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２およびコドン１３のいずれか、または両方に存在する。それぞれ、グリシン（野生型グリシン１２またはグリシン１３をセリン、アルギニン、システイン、アスパラギン酸またはバリンに変えるいずれのものも含む）を通常コードするコドン１２またはコドン１３における変異は、ヒトＫＲＡＳ遺伝子のコドン１５、２０、６１および１４６に変異が存在すると、発癌を促進するＫＲＡＳ変異を活性化する。別の実施形態では、癌は、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）変異を有する細胞を含む。代表的なＰＩ３Ｋ変異は、エキソン９またはエキソン２０のいずれかまたは両方におけるヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子での変異を活性化する。抗体または抗原結合部分は、単独で、または他の治療薬物、例えば、抗癌剤、例えば他の抗体、化学療法薬および／または放射線照射と併用して投与され得る。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は第２の剤と併用して投与され、第２の剤は、タンパク質合成阻害剤、ソマトスタチン類似体、免疫治療剤、および酵素阻害剤からなる群から選択される。他の実施形態では、第２の剤は、ＩＧＦ１Ｒを標的とする小分子、ＥＧＦＲを標的とする小分子、ＥｒｂＢ２を標的とする小分子、ｃＭＥＴを標的とする小分子、代謝拮抗薬、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤、ホルモン療法、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害薬、ｍＴＯＲ阻害剤、化学療法薬、プロテインキナーゼＢ阻害剤、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、およびＭＥＫ阻害剤から選択される。併用療法の第２の剤として使用するための代表的な抗体には、抗Ｈｅｒ２抗体、例えばトラスツズマブ、および抗ＥＧＦＲ抗体、例えばパニツムマブまたはセツキシマブが含まれる。併用療法の第２の剤として使用するためのいくつかの好ましい抗癌剤には、エルロチニブ、ラパチニブ、パクリタキセルおよびシスプラチンが含まれる。
さらに他の実施形態では、本発明は、ＥｒｂＢ３と関連した疾患（例えば、癌）を診断および予知する方法を提供する。一実施形態では、これは、本開示の抗体または抗原結合部分と被験体に由来する細胞とを接触（例えば、エクスビボまたはインビボ）させて、該細胞上のＥｒｂＢ３との結合レベルを測定することによって達成され、ここで、ＥｒｂＢ３との結合の異常に高いレベルが、該被験体がＥｒｂＢ３と関連した癌を有することを示す。
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲から明らかとなる。
[本発明1001]
ヒトＥｒｂＢ3の外部ドメインのドメインＩと結合しかつ
重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3の配列を含む重鎖可変領域と；
軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3の配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
該重鎖ＣＤＲ1配列が配列番号60または75を含み、
該重鎖ＣＤＲ2配列が配列番号61を含み、
該重鎖ＣＤＲ3配列が配列番号62を含み、
該軽鎖ＣＤＲ1配列が配列番号66または77を含み、
該軽鎖ＣＤＲ2配列が配列番号67を含み、
該軽鎖ＣＤＲ3配列が配列番号68または79を含み、
ただし該抗体は、（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃6ではなく；（ｉｉ）配列番号1および2にそれぞれ示されるＶ Ｈ 配列およびＶ Ｌ 配列を含む抗体ではなく；かつ（ｉｉｉ）配列番号7、8および9にそれぞれ示されるＶ Ｈ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列と、配列番号10、11および12にそれぞれ示されるＶ Ｌ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列とを含む抗体ではない、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1002]
配列番号73の残基92〜104を含むヒトＥｒｂＢ3のエピトープに結合し、かつＥｒｂＢ3を発現する癌細胞の増殖を阻害することによって特徴付けられる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ただし該抗体は、（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃6ではなく；（ｉｉ）配列番号1および2にそれぞれ示されるＶ Ｈ 配列およびＶ Ｌ 配列を含む抗体ではなく；かつ（ｉｉｉ）配列番号7、8および9にそれぞれ示されるＶ Ｈ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列と、配列番号10、11および12にそれぞれ示されるＶ Ｌ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列とを含む抗体ではない、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1003]
配列番号73の残基92〜104を含むヒトＥｒｂＢ3のエピトープに結合し、かつＥｒｂＢ3を発現する癌細胞の増殖を阻害することによって特徴付けられる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ただし該抗体は、（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃6ではなく；（ｉｉ）配列番号1および2にそれぞれ示されるＶ Ｈ 配列およびＶ Ｌ 配列を含む抗体ではなく；（ｉｉｉ）配列番号7、8および9にそれぞれ示されるＶ Ｈ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列と、配列番号10、11および12にそれぞれ示されるＶ Ｌ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列とを含む抗体ではなく；（ｉｖ）本明細書に開示されるＡｂ＃3ではなく；（ｖ）配列番号3および4にそれぞれ示されるＶ Ｈ 配列およびＶ Ｌ 配列を含む抗体ではなく；（ｖｉ）配列番号13、14および15にそれぞれ示されるＶ Ｈ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列と、配列番号16、17および18にそれぞれ示されるＶ Ｌ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列とを含む抗体ではなく；（ｖｉｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃17ではなく；（ｖｉｉｉ）配列番号35および36にそれぞれ示されるＶ Ｈ 配列およびＶ Ｌ 配列を含む抗体ではなく；（ｉｘ）配列番号39、40および41にそれぞれ示されるＶ Ｈ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列と、配列番号42、43および44にそれぞれ示されるＶ Ｌ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列とを含む抗体ではなく；（ｘ）本明細書に開示されるＡｂ＃19ではなく；（ｘｉ）配列番号37および38にそれぞれ示されるＶ Ｈ 配列およびＶ Ｌ 配列を含む抗体ではなく；かつ（ｘｉｉ）配列番号45、46および47にそれぞれ示されるＶ Ｈ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列と、配列番号48、49および50にそれぞれ示されるＶ Ｌ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列とを含む抗体ではない、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1004]
前記エピトープが配列番号73の残基129をさらに含む、本発明1002または1003の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1005]
前記癌細胞がＭＡＬＭＥ−3Ｍ細胞、ＡｄｒＲ細胞、またはＡＣＨＮ細胞であり、前記増殖が対照と比べると少なくとも10％減少する、本発明1002または1003または1004の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1006]
配列番号73の残基93（アスパラギン）、残基101（メチオニン）、残基102（ロイシン）および残基104（チロシン）から選択されるヒトＥｒｂＢ3のアミノ酸残基のいずれか1つがアラニンで置換されて単一アミノ酸置換を有する変異体ＥｒｂＢ3を作製する場合に、配列番号73のアミノ酸配列を含むヒトＥｒｂＢ3に対する前記抗体またはその抗原結合部分の結合と比較すると、該変異体ＥｒｂＢ3に対する該抗体またはその抗原結合部分の結合が実質的に減少する、本発明1001または本発明1002または本発明1003または本発明1004の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1007]
結合の実質的な減少が結合のＫ Ｄ 値で少なくとも10倍の変化である、本発明1006の抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1008]
ヒトＥｒｂＢ3の外部ドメインのドメインＩに結合しかつ
重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3の配列を含む重鎖可変領域と；
軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3の配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
該重鎖ＣＤＲ1配列が配列番号63または76を含み、
該重鎖ＣＤＲ2配列が配列番号64を含み、
該重鎖ＣＤＲ3配列が配列番号65を含み、
該軽鎖ＣＤＲ1配列が配列番号69または78を含み、
該軽鎖ＣＤＲ2配列が配列番号70を含み、
該軽鎖ＣＤＲ3配列が配列番号71または80を含み、
ただし該抗体は、（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃6ではなく；（ｉｉ）配列番号1および2にそれぞれ示されるＶ Ｈ 配列およびＶ Ｌ 配列を含む抗体ではなく；かつ（ｉｉｉ）配列番号7、8および9にそれぞれ示されるＶ Ｈ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列と、配列番号10、11および12にそれぞれ示されるＶ Ｌ ＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3の配列とを含む抗体ではない、単離された抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1009]
ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、またはキメラ抗体である、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1010]
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体の一部である、本発明1001〜1008のいずれかの抗原結合部分。
[本発明1011]
Ｆａｂ、Ｆａｂ’2、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、アフィボディ、アビマー、ナノボディ、およびドメイン抗体からなる群から選択される、本発明1001〜1008のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1012]
ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプである、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1013]
薬学的に許容される担体中に本発明1001〜1012のいずれかの抗体またはその抗原結合部分を含む、組成物。
[本発明1014]
患者において癌を処置する方法であって、本発明1013の組成物の治療有効量を該患者に投与することを含む方法。
[本発明1015]
前記癌が、ＫＲＡＳ変異またはＰＩ3Ｋ変異のいずれかまたは両方を含む細胞を含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記患者がヒトであり、前記ＫＲＡＳ変異がヒトＫＲＡＳ遺伝子のコドン12またはコドン13の変異を含む、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記患者がヒトであり、前記ＰＩ3Ｋ変異がヒトＰＩＫ3ＣＡ遺伝子のエキソン9またはエキソン20の変異を含む、本発明1014の方法。
[本発明1018]
患者において癌を処置する方法であって、本発明1001〜1012のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である第1の剤の治療有効量と、該第1の剤以外の抗がん剤である第2の剤の治療有効量とを組み合わせて、該患者に投与することを含む、方法。
[本発明1019]
前記第2の剤が抗体またはその抗原結合部分を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記第2の剤が、タンパク質合成阻害剤、ソマトスタチン類似体、 免疫治療剤、および酵素阻害剤から選択される、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記第2の剤が、ＩＧＦ1Ｒを標的とする小分子、ＥＧＦＲを標的とする小分子、ＥｒｂＢ2を標的とする小分子、ｃＭＥＴを標的とする小分子、代謝拮抗薬、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤、ホルモン療法、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害薬、ｍＴＯＲ阻害剤、化学療法薬、プロテインキナーゼＢ阻害剤、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、およびＭＥＫ阻害剤から選択される、本発明1018の方法。
[本発明1022]
前記第2の剤がパニツムマブ、トラスツズマブまたはセツキシマブである、本発明1019の方法。
[本発明1023]
前記第2の剤がパクリタキセルである、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記第2の剤がシスプラチンである、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記第2の剤がエルロチニブまたはラパチニブである、本発明1021の方法。
ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ ６４７二次抗体（ＧＡＨｕ−Ａｌｅｘ６７４）を用いて、ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞に発現したＥｒｂＢ３との、種々の抗ＥｒｂＢ３抗体候補の結合を示す棒グラフである。これらの実験では、「Ａｂ＃」と示す抗体をＦａｂ断片の形状で用い、および「ＧＡＨｕ−Ａｌｅｘａ６７４」は、対照として単独で用いた蛍光色素結合二次抗体を示し、一方「非染色」は二次抗体の非存在下での対照を示す。 ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ ６４７二次抗体（ＧＡＨｕ−Ａｌｅｘ６７４）を用いて、ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞に発現したＥｒｂＢ３との、種々の抗ＥｒｂＢ３抗体候補の結合を示す棒グラフである。これらの実験では、「Ａｂ＃」と示す抗体をＦａｂ断片の形状で用い、および「ＧＡＨｕ−Ａｌｅｘａ６７４」は、対照として単独で用いた蛍光色素結合二次抗体を示し、一方「非染色」は二次抗体の非存在下での対照を示す。 種々の抗ＥｒｂＢ３抗体の候補のＫＤ値として記載された、ＥｒｂＢ３との抗体の結合を示すグラフである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術と、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａとを用いて測定した、Ａｂ＃６のＫＤ値を示すグラフである。 種々の抗ＥｒｂＢ３抗体の候補のＫＤ値として記載された、ＥｒｂＢ３との抗体の結合を示すグラフである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術と、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａとを用いて測定した、Ａｂ＃３のＫＤ値を示すグラフである。 種々の抗ＥｒｂＢ３抗体の候補のＫＤ値として記載された、ＥｒｂＢ３との抗体の結合を示すグラフである。ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞を用いた細胞結合アッセイと、式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／ＫＤ＋Ｘとを用いて測定した、Ａｂ＃６のＫＤ値を示すグラフである。 種々の抗ＥｒｂＢ３抗体の候補のＫＤ値として記載された、ＥｒｂＢ３との抗体の結合を示すグラフである。ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞を用いた細胞結合アッセイと、式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／ＫＤ＋Ｘとを用いて測定した、Ａｂ＃３のＫＤ値を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡを用いた、ＥｒｂＢ３に対する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の結合特異性を示すグラフである。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴＧＦαを対照として用いた。 ＥＬＩＳＡを用いて測定した、インビトロでのＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞における全ＥｒｂＢ３レベルを低下させる抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図５Ａおよび図５Ｂは、以下の実施例５に記述されるようにＦＡＣＳ分析を用いて測定した、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞のＥｒｂＢ３受容体をダウンレギュレートする抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。図５Ａは、抗体のＩｇＧ１アイソタイプを用いた結果を示す。図５Ｂは、抗体のＩｇＧ２アイソタイプを用いた結果を示す。 ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、抗体を介したＥｒｂＢ３ダウンレギュレーション（Ａｂ＃６）の時間経過を示すグラフである。 ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、抗体を介したＥｒｂＢ３ダウンレギュレーション（Ａｂ＃６）の時間経過を示すグラフである。 ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、抗体を介したＥｒｂＢ３ダウンレギュレーション（Ａｂ＃６）の時間経過を示すグラフである。 ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、抗体を介したＥｒｂＢ３ダウンレギュレーション（Ａｂ＃６）の時間経過を示すグラフである。 薬力学試験の結果を示す。示した抗ＥｒｂＢ３抗体の注射から２４時間後の、インビボでの異種移植片におけるＭＡＬＭＥ３Ｍメラノーマ細胞の全ＥｒｂＢ３レベルについての結果を示す棒グラフである。図に示すように、データはＥｒｂＢ３をダウンレギュレートするＡｂ＃６の能力を示す。 インビボでのＡｄｒＲ異種移植片におけるＥｒｂＢ３をダウンレギュレートする抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示す棒グラフである。ＡｄｒＲ異種移植片における全ＥｒｂＢ３のレベルを示す。 ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ(登録商標）アッセイにおけるＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞の増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 ＡｄｒＲ細胞の増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 ＡＣＨＮ細胞の増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 インビボでのＡｄｒＲ異種移植片におけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示す棒グラフである。 ＡｄｒＲ細胞におけるベータセルリン、ヘレグリン、およびＴＧＦαが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 ＡｄｒＲ細胞におけるベータセルリン、ヘレグリン、およびＴＧＦαが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 ＡｄｒＲ細胞におけるベータセルリン、ヘレグリン、およびＴＧＦαが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 卵巣腫瘍細胞系統であるＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８におけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。 卵巣腫瘍細胞系統であるＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８におけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。 ＥｒｂＢ１陰性ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞との結合の欠如によって示される、ＥｒｂＢ１に結合するベータセルリン（ＢＴＣ）の能力、並びにセツキシマブによるこのような結合の阻害を示すグラフである。 １０ｎＭの濃度でのＥｒｂＢ１陽性ＡｄｒＲ細胞との結合によって示される、ＥｒｂＢ１に結合するベータセルリン（ＢＴＣ）の能力、並びにセツキシマブによるこのような結合の阻害を示すグラフである。 ２００ｎＭの濃度でのＥｒｂＢ１陽性ＡｄｒＲ細胞との結合によって示される、ＥｒｂＢ１に結合するベータセルリン（ＢＴＣ）の能力、並びにセツキシマブによるこのような結合の阻害を示すグラフである。 ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞におけるヘレグリンが媒介したシグナル伝達を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（ＩＣ５０＝１．５ｅ−８）におけるヘレグリンが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を示す。 ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞におけるヘレグリンが媒介したシグナル伝達を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（ＩＣ５０＝１．１ｅ−８）におけるＡＫＴのリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を示す。 ＯＶＣＡＲ８細胞におけるヘレグリンが媒介したシグナル伝達を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。ＯＶＣＡＲ８細胞（ＩＣ５０＝２．４ｅ−８）におけるＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を示す。 ＯＶＣＡＲ８細胞におけるヘレグリンが媒介したシグナル伝達を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。ＯＶＣＡＲ８細胞（ＩＣ５０＝６．７ｅ−８）におけるＡＫＴのリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を示す。 異種移植試験を介した、卵巣（ＡｄｒＲ細胞）の腫瘍増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 異種移植試験を介した、前立腺（Ｄｕ１４５細胞）の腫瘍増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 異種移植試験を介した、卵巣（ＯＶＣＡＲ８細胞）の腫瘍増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 異種移植試験を介した、膵臓（Ｃｏｌｏ３５７細胞）の腫瘍増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１８Ａおよび１８Ｂは、ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞のＥｒｂＢ３とのヘレグリン結合を阻害するＡｂ＃６（図１８Ａ）およびＡｂ＃３のＦａｂ（図１８Ｂ）の能力を示すグラフである。 図１９ＡはＡｄｒＲ細胞とのエピレグリンの結合を示し、および図１９ＢはＡｄｒＲ細胞とのエピレグリンの結合を阻害するが、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）とのエピレグリン結合は阻害しないＡｂ＃６の能力を示す。 ＡｄｒＲ細胞に結合するヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の能力を示すグラフである。 抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。 抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。 抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。 抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、およびＡｂ＃１４の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す。 抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、およびＡｂ＃１４の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す。 対応する生殖細胞系列のアミノ酸配列に戻された、抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。この復帰変異（図２１と比較して）を成し遂げるアミノ酸残基の変化を下線で示す。 腫瘍細胞のＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を示すグラフである（実施例１１を参照されたい）。 腫瘍細胞のＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を示すグラフである（実施例１１を参照されたい）。 癌細胞におけるＡｂ＃６によるＶＥＧＦ分泌の阻害と、ｐＥｒｂＢ３の阻害の相互関係を示す。 Ａｂ＃６の細胞移動への効果を示すグラフである（実施例１２を参照されたい）。対照０ｕＭ＝ＲＰＭＩ培地単独、対照８ｕＭ＝ＲＰＭＩ培地＋８ｕＭ Ａｂ＃６、ＦＢＳ ０ｍＭ＝ＲＰＭＩ培地＋１０％のＦＢＳ、ＦＢＳ ８ｕＭ＝ＲＰＭＩ培地＋１０％のＦＢＳ＋８ｕＭ Ａｂ＃６。 ＡｄｒＲ細胞におけるスフェロイド増殖の阻害を示すグラフである。 ＡｄｒＲにおけるＨＲＧ誘導スフェロイド増殖の阻害を示すグラフである。 Ｄｕ１４５細胞におけるＨＲＧ誘導スフェロイド増殖の阻害を示すグラフである。 図２７ＡおよびＢは、Ａｂ＃６のＡｄｒＲ細胞に結合するＨＲＧ（図２７Ａ）への効果、およびＢＴＣ（図２７Ｂ）への効果を示すグラフである。 ＡｄｒＲ細胞においてＨＧＦ（肝細胞増殖因子）誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化へのＡｂ＃６の効果を示すグラフである。ＨＧＦに対するＩＣ５０を２．４３９ｅ−１０であると決定した。 図２９ＡおよびＢは、Ａｂ＃６の（図２９Ａ）ｐＥｒｂＢ１および(図２９Ｂ)ｐＥｒｂＢ３のＨＲＧ誘導ＥｒｂＢ２／３複合体形成のリン酸化への効果を示す。 Ａｂ＃６単独、エルロチニブ単独またはＡｂ＃６＋エルロチニブのヌードマウスにおけるＡＣＨＮ異種移植腫瘍の増殖への効果を示すグラフである。３００ｕｇのＡｂ＃６（単独で投与されたときの最適下限用量）＋エルロチニブの併用投与から２７日後に腫瘍増殖が、統計的に有意な程度まで相乗的に阻害されることをデータは示している。 Ａｂ＃６単独、タキソール単独またはＡｂ＃６＋タキソールのヌードマウスにおけるＤＵ１４５異種移植腫瘍の増殖への効果を示すグラフである。３００ｕｇのＡｂ＃６（単独で投与されたときの最適下限用量）＋タキソールの併用投与から２７日後に腫瘍増殖が、いずれか単独の薬物による処理で統計的に有意な程度まで阻害されるよりも大きい程度まで阻害されることをデータは示している。 ＫＲＡＳ変異Ａ５４９肺癌細胞の多細胞腫瘍スフェロイドの増殖へのＡｂ＃６単独処理の効果を示すグラフである。細胞は、７日の間、０、０．００１、０．０１、０．１または１μＭのＡｂ＃６で処理された。Ｘ軸の上の「−４」は「０」用量に相当する。結果は、ＫＲＡＳ変異体腫瘍スフェロイド増殖へのＡｂ＃６用量応答効果を示す。 １μＭのＡｂ＃６で非処理または処理のいずれかを施された代表的なＡ５４９スフェロイドの処理１日目および７日目の一組の写真である。 ヌードマウスにおけるＫＲＡＳ変異体Ａ５４９皮下異種移植腫瘍の増殖へのＡｂ＃６単独処理の効果を示すグラフである。Ａｂ＃６（３日ごとに６００μｇ）の投与は、２２日目に中止された。 図３３Ａは、Ａｂ＃６単独処理、エルロチニブ単独処理またはＡｂ＃６とエルロチニブの併用処理の、ヌードマウスにおけるＫＲＡＳ変異体Ａ５４９皮下異種移植腫瘍の増殖への効果を示すグラフである。図３３Ｂは、Ａｂ＃６単独処理、タキソール単独処理またはＡｂ＃６とタキソールの併用処理の、ヌードマウスにおけるＫＲＡＳ変異体Ａ５４９皮下異種移植腫瘍の増殖への効果を示すグラフである。 野生型ＥｒｂＢ３を発現するＣＨＯ細胞へのＡｂ＃６および対照の抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１）の結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 点変異Ｄ９３Ａを有するＥｒｂＢ３を発現するＣＨＯ細胞へのＡｂ＃６および対照の抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１）の結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 点変異Ｍ１０１Ａを有するＥｒｂＢ３を発現するＣＨＯ細胞へのＡｂ＃６および対照の抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１）の結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 点変異Ｌ１０２Ａを有するＥｒｂＢ３を発現するＣＨＯ細胞へのＡｂ＃６および対照の抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１）の結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 点変異Ｙ１０４Ａを有するＥｒｂＢ３を発現するＣＨＯ細胞へのＡｂ＃６および対照の抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１）の結合に関するＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図３５Ａは、マウスにおけるＰＩ３Ｋ変異体ＳＫＯＶ３異種移植腫瘍の増殖へのＡｂ＃６単独処理の効果を示すグラフである。図３５Ｂは、マウスにおけるＰＩ３Ｋ変異体ＳＫＯＶ３異種移植腫瘍の増殖へのＡｂ＃６単独処理またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）との併用の効果を示すグラフである。 パラトープマッピング実験からのデータを示す。Ａｂ＃６の同じ変異体のプロテインＡとの結合と比較して、単一のアミノ酸変異（示した変異の同一性に関しては実施例２０、表２を参照されたい）のＥｒｂＢ３へのＡｂ＃６変異体の結合への効果を示す。グラフを二分している対角線は、ＥｒｂＢ３およびプロテインＡの結合への効果の１：１の対応を示す。変異を３つのカテゴリー（結合への効果大、効果小および効果無）に便宜的にグループ分けするために、さらなる平行線を、対角線をｙ軸に対して０．３３および０．６６移動させることで作成して位置付けた。野生型Ａｂ＃６に標準化した変異の結合への効果をグラフは示している。Ｙ軸上の値は、野生型Ａｂ＃６の結合対ＥｒｂＢ３へのＡｂ＃６変異体の結合の割合である。＜１の割合は、野生型Ａｂ＃６と比較すると、変異体がＥｒｂＢ３との結合の減少を有することを意味するが、＞１の割合は、変異体が野生型Ａｂ＃６よりもＥｒｂＢ３との結合がより強いこと示すことを意味する。 以下の概略図である：Ａｂ＃６野生型重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号７、８および９）、コンセンサスＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号６０、６１および６２）、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のパラトープ配列（それぞれ配列番号６３、６４および６５）、Ａｂ＃６野生型軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号１０、１１および１２）、コンセンサスＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号６６、６７および６８）、ならびにＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のパラトープ配列（それぞれ配列番号６９、７０および７１）。これらの図では、標準一文字アミノ酸略記が用いられ、およびアミノ酸を示す一文字群がダッシュで分離されているのは、その配列中の配列残基を示すが、１以上のスラッシュで分離されたアミノ酸を示す２以上の隣接する一文字群のいずれのグループも、そのように分離された、グループ分けした隣接するアミノ酸のいずれも配列中のその位置で、他のいずれに対して置換し得ることを示す。例えば、表示法「（Ｘａａ）７−Ｗ−Ｔ／Ａ／Ｇ／Ｓ−Ｌ−（Ｘａａ）７」は、以下のようにアミノ終端からカルボキシ終端に及ぶ配列を示す：７つの特定されてないアミノ酸に続いてトリプトファン、続いて（スレオニンまたはアラニンまたはグリシンまたはセリン）、続いてロイシン、続いて７つの特定されてないアミノ酸が続く。本明細書で用いる「特定されてないアミノ酸」は、いずれのアミノ酸も、いくつかのそのような位置が一緒に現れる場合でも、Ｘａａと名付けられた各位置で別々に現れることもあり得ることを示す。ＸａａまたはＸａａ＃（例えば「（Ｘａａ）７」）と名付けられたいずれのグループの反復は、これらの配列中の一位置で特定されてないアミノ酸の名付けられたグループと、いずれの他の位置で特定されてないアミノ酸の名付けられたグループとの間にいかなる対応も示さない。したがって、配列「（Ｘａａ）７−Ｗ−Ｔ／Ａ／Ｇ／Ｓ−Ｌ−（Ｘａａ）７」の始めと終わりの（Ｘａａ）７の反復は、各７つの特定されてないアミノ酸を含むこと以外、各（Ｘａａ）７の配列間にいずれの対応も示さない。 以下の概略図である：Ａｂ＃６野生型重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号７、８および９）、コンセンサスＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号７５、６１および６２）、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のパラトープ配列（それぞれ配列番号７６、６４、６５）、Ａｂ＃６野生型軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号１０、１１および１２）、コンセンサスＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列（それぞれ配列番号７７、６７および７９）、ならびにＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のパラトープ配列（それぞれ配列番号７８、７０および８０）。これらの図では、標準一文字アミノ酸略記が用いられ、およびアミノ酸を示す一文字群がダッシュで分離されているのは、その配列中の配列残基を示すが、１以上のスラッシュで分離されたアミノ酸を示す２以上の隣接する一文字群のいずれのグループも、そのように分離された、グループ分けした隣接するアミノ酸のいずれも配列中のその位置で、他のいずれに対して置換し得ることを示す。例えば、表示法「（Ｘａａ）７−Ｗ−Ｔ／Ａ／Ｇ／Ｓ−Ｌ−（Ｘａａ）７」は、以下のようにアミノ終端からカルボキシ終端に及ぶ配列を示す：７つの特定されてないアミノ酸に続いてトリプトファン、続いて（スレオニンまたはアラニンまたはグリシンまたはセリン）、続いてロイシン、続いて７つの特定されてないアミノ酸が続く。本明細書で用いる「特定されてないアミノ酸」は、いずれのアミノ酸も、いくつかのそのような位置が一緒に現れる場合でも、Ｘａａと名付けられた各位置で別々に現れることもあり得ることを示す。ＸａａまたはＸａａ＃（例えば「（Ｘａａ）７」）と名付けられたいずれのグループの反復は、これらの配列中の一位置で特定されてないアミノ酸の名付けられたグループと、いずれの他の位置で特定されてないアミノ酸の名付けられたグループとの間にいかなる対応も示さない。したがって、配列「（Ｘａａ）７−Ｗ−Ｔ／Ａ／Ｇ／Ｓ−Ｌ−（Ｘａａ）７」の始めと終わりの（Ｘａａ）７の反復は、各７つの特定されてないアミノ酸を含むこと以外、各（Ｘａａ）７の配列間にいずれの対応も示さない。 ＡｄｒＲ細胞におけるリガンド誘導ＥｒｂＢ３リン酸化（ｐＥｒｂＢ３レベル；示すように、Ｙ軸に沿って濃度が増加）へのＡｂ＃６（示すように、Ｘ軸に沿って濃度が減少）の効果を示す。リガンドはＨＲＧである。 ＡｄｒＲ細胞におけるリガンド誘導ＥｒｂＢ３リン酸化（ｐＥｒｂＢ３レベル；示すように、Ｙ軸に沿って濃度が増加）へのＡｂ＃６（示すように、Ｘ軸に沿って濃度が減少）の効果を示す。リガンドはＢＴＣである。 ＡｄｒＲ細胞におけるリガンド誘導ＥｒｂＢ３リン酸化（ｐＥｒｂＢ３レベル；示すように、Ｙ軸に沿って濃度が増加）へのＡｂ＃６（示すように、Ｘ軸に沿って濃度が減少）の効果を示す。リガンドはＨＧＦである。 ＡｄｒＲ細胞におけるリガンド誘導ＥｒｂＢ３リン酸化（ｐＥｒｂＢ３レベル；示すように、Ｙ軸に沿って濃度が増加）へのＡｂ＃６（示すように、Ｘ軸に沿って濃度が減少）の効果を示す。リガンドはＥＧＦである。 Ａｂ＃６がＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに結合すること示すＦＡＣＳプロファイルである。
発明の詳細な説明
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な記載を通じて示されている。
Ｉ．定義
用語「ＥｒｂＢ３」、「ＨＥＲ３」、「ＥｒｂＢ３受容体」、および「ＨＥＲ３受容体」とは、本明細書で互換可能に使用されるとき、米国特許第５，４８０，９６８号、およびＰｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４９０５−４９０９（１９９０）に記載されているヒトＥｒｂＢ３タンパク質を呼び；また、Ｋａｎｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：１５８４２−８５７（２００５），ＣｈｏおよびＬｅａｈｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１３３０−１３３３（２００２））を参照されたい。完全長の、成熟ヒトＥｒｂＢ３タンパク質配列（リーダー配列を含まない）は、配列番号７３に示される。この配列は、図４と、米国特許第５，４８０，９６８号の配列番号４から、成熟タンパク質から切断される１９アミノ酸リーダー配列を引いた配列とに相当する。
用語「ＥＧＦ様リガンド」とは、本明細書で使用するとき、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のリガンドをいい、それには、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）および密接に関連したタンパク質、例えば形質転換増殖因子−α（ＴＧＦα）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ビレグリン（ＢＩＲ）およびアンフィレグリン（ＡＲ）が含まれ、それらは、細胞表面のＥＧＦＲに結合して、受容体の内在性タンパク質−チロシンキナーゼ活性を刺激する。典型的には、ＥＧＦ様リガンドは、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３タンパク質との複合体の形成を誘導し（例えば、Ｋｉｍら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３３４：１８９−１９５を参照されたい）、複合体のチロシン残基のリン酸化をもたらす。
本明細書に開示されている好ましい抗体およびその抗原結合部分は、ＥＧＦ様リガンドを介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害し、特定の実施形態では１以上の下記の追加の特性を示す：（ｉ）ＥｒｂＢ３を介した、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびビレグリンのうちの１以上に媒介されるシグナル伝達の阻害；（ｉｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖阻害；（ｉｉｉ）細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力；（ｉｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害；（ｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害；（ｖｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害；および／または（ｖｉｉ）ＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに位置したエピトープ、例えば、成熟ＥｒｂＢ３のアミノ酸配列（配列番号７３）の残基１〜１８３を含むまたは該部分にわたる、より好ましくは配列番号７３の残基９２〜１２９または９３〜１０４を含むまたは該部分にわたる、より好ましくは配列番号７３の残基９２、９３、１０１、１０２、１０４および１２９または残基９３、１０１、１０２、および１０４を含むまたは該部分にわたるエピトープとの特異的結合。そのような一抗体、Ａｂ＃６は、ＭＭ−１２１として第１相臨床試験が現在実施されている。
用語「阻害」とは、本明細書で用いるとき、活性の完全なブロックを含む生物活性のいずれかの統計学的に有意な減少をいう。例えば、「阻害」は、生物活性における約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少をいうことができる。
したがって、句「ＥＧＦ様リガンドを介したＥｒｂＢ３のリン酸化の阻害」とは、本明細書で使用するとき、非処理（対照）細胞におけるリン酸化と比較して、ＥＧＦ様リガンドによって誘導されたＥｒｂＢ３のリン酸化を統計的に有意に減少させる、抗体または抗原結合部分の能力をいう。ＥｒｂＢ３を発現している細胞は、自然に存在している細胞または細胞系統であってもよく、あるいは、宿主細胞へのＥｒｂＢ３をコードする核酸を導入することによって組換え的に生成されてもよい。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％までＥＧＦ様リガンドによって媒介されるＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害し、それは、例えば、Ｋｉｍら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３３４：１８９−１９５、並びに以下の実施例に記載されるウェスタンブロッティング、続く、抗ホスホチロシン抗体を用いた探査によって測定される。
句「ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンに媒介されるシグナル伝達の阻害」とは、本明細書で使用するとき、抗体の非存在下（対照）でのシグナル伝達と比較して、ＥｒｂＢ３を通したＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびビレグリン）によって媒介されたシグナル伝達を統計的に有意に減少させる、抗体またはその抗原結合部分の能力をいう。また、ＥｒｂＢ３リガンドは、本明細書では「ヘレグリン様リガンド」とも称される。これは、抗体またはその抗原結合部分の存在下において、対照（抗体なし）と比較して、ＥｒｂＢ３を発現細胞における、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびビレグリンのうちの１以上によって媒介されるシグナルが統計的に有意に減少されることを意味する。ＥｒｂＢ３リガンド媒介のシグナルは、ＥｒｂＢ３基質、および／またはＥｒｂＢ３と関係する細胞カスケードに存在するタンパク質のレベルまたは活性を評価することによって測定することができる。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３基質のレベルもしくは活性、および／またはＥｒｂＢ３と関係する細胞カスケードに存在するタンパク質のレベルもしくは活性を、そのような抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）でのレベルまたは活性と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少させる。このようなＥｒｂＢ３リガンド媒介のシグナル伝達は、ＥｒｂＢ３の基質（例えば、ＳＨＣもしくはＰＩ３Ｋ）、またはＥｒｂＢ３と関係する細胞カスケードのタンパク質（例えば、ＡＫＴ経路−ＡＫＴは、タンパク質キナーゼＢまたはＰＫＢとも称される一組のセリン／スレオニンキナーゼをいう）を、このようなタンパク質のためのキナーゼアッセイを用いて測定する当技術分野で認識されている技術を用いて測定することができる（例えば、Ｈｏｒｓｔら．上掲，Ｓｕｄｏら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２２：３８８−９２；およびＭｏｒｇａｎら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１：７６１−７６７を参照されたい）。
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３へのＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンのうちの１以上）の結合を阻害することによって、ＥｒｂＢ３を介したＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）媒介のシグナル伝達を阻害する。いくつかのリガンド（例えば、ビレグリン、人工キメラリガンド：Ｂａｒｂａｃｃｉら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９５ ２７０（１６）９５８５−９）は、ＥＧＦ様リガンド（すなわち、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１に結合する）として、並びにＥｒｂＢ３様リガンド（すなわち、ＥｒｂＢ３に結合する）として両方に機能する。
句「ＥｒｂＢ３とのヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンの結合の阻害」とは、本明細書で使用するとき、抗体の非存在下での結合（対照）と比較して、ＥｒｂＢ３とのＥｒｂＢ３リガンド（例えば、１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力をいう。これは、抗体またはその抗原結合部分の存在下で、対照（抗体なし）と比較して、ＥｒｂＢ３に結合するＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の量が統計的に有意に減少されることを意味する。ＥｒｂＢ３を結合するＥｒｂＢ３リガンドの量は、本開示の抗体またはその抗原結合部分の存在下で、抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）での量と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少させることができる。ＥｒｂＢ３リガンドの結合の減少は、抗体またはその抗原結合部分の存在下または非存在下（対照）で、ＥｒｂＢ３を発現している細胞への標識されたＥｒｂＢ３リガンド（例えば、放射線標識されたヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合レベルを測定する当分野で認識される技術を用いて測定することができる。
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖の阻害」とは、本明細書で使用するとき、抗体の非存在下での増殖と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力をいう。一実施形態では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の増殖は、細胞が本開示の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）で測定された増殖と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少され得る。細胞増殖は、（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイまたはチミジン取り込みを用いて）細胞***の速度、細胞***を行っている細胞集団内の細胞の分画、および／または最終分化もしくは細胞死による細胞集団からの細胞損失の率を測定する当分野で認識されている技術を用いて評価することができる。
句「細胞表面のＥｒｂＢ３レベルを減少させる能力」とは、本明細書で使用するとき、非処理（対照）細胞と比較して、抗体に晒された細胞の表面に見いだされるＥｒｂＢ３の量を統計的に有意に低下させる抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。例えば、細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルの減少は、ＥｒｂＢ３の内在化の増加（またはＥｒｂＢ３のエンドサイトーシスの増加）に起因する場合がある。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）での細胞表面発現または内在化と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％までＥｒｂＢ３の細胞表面発現を減少させ、および／または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％までＥｒｂＢ３受容体の内在化を増加させる。抗体またはその抗原結合部分の非存在下および存在下で細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルおよび／またはＥｒｂＢ３受容体の内在化は、当分野で認識されている技術、例えば、Ｈｏｒｓｔら、上掲、および本明細書の実施例に記載される技術を用いて容易に測定することができる。
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害」とは、本明細書で使用するとき、抗体の非存在下でのＶＥＧＦ分泌と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力をいう。一実施形態では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）のＶＥＧＦ分泌は、細胞が本開示の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）で測定されたＶＥＧＦ分泌と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少されてもよい。ＶＥＧＦ分泌は、本明細書に記載される技術などの当分野で認識されている技術を用いて評価することができる。
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害」とは、本明細書で使用するとき、抗体の非存在下での細胞の移動と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力をいう。一実施形態では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の移動は、細胞が本開示の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）で測定された細胞移動と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少されてもよい。細胞移動は、本明細書に記載される技術などの当分野で認識されている技術を用いて評価することができる
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害」とは、本明細書で使用するとき、抗体の非存在下での細胞の移動と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力をいう。一実施形態では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の移動は、細胞が本開示の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）で測定される細胞移動と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少されてもよい。細胞移動は、本明細書に記載される技術などの当分野で認識されている技術を用いて評価することができる。
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、本明細書で互換可能に使用するとき、全抗体、その任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。典型的な「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬから構成されている。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在した、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、それらは、下記：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で、アミノ末端からカルボキシ末端に整列されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）などの宿主組織または因子との免疫グロブリンの結合を媒介することができる。本開示の典型的な抗体には、抗体＃１、３、６および１４、並びにその抗原結合部分が含まれる。
抗体の「抗原結合部分」（または、単に「抗体部分」）なる用語は、本明細書で使用するとき、抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片によって行われ得ることが示された。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１のドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１のドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨのドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨおよびＶＬのドメインを含むｄＡｂ；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６）；（ｖｉｉ）ＶＨまたはＶＬのドメインからなるｄＡｂ；および（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｉｘ）場合により合成リンカーによって接続されてもよい２以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、一価の分子を形成させるためにＶＬおよびＶＨ領域が対となる単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３−４２６；並びに、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，５８７９−５８８３、を参照されたい）としてそれらを作製することができる合成リンカーによって接続され得る。また、このような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用するとき、実質的に均質な抗体の集団から得られるまたは調製される抗体をいう。すなわち、この集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であって、単一の抗原部位に対して作られる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して作られる様々な抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、典型的に抗原の単一の決定基に対して作られる。モノクローナル抗体は、任意の当分野で認識されている技術、および本明細書に記載されている技術、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されるハイブリドーマ法、例えば、（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照されたい）によって記載されるトランスジェニック動物、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）を用いて、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、並びに、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いるファージ抗体ライブラリーを用いて調製することができる。モノクローナル抗体には、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体が含まれ、自然に存在するかまたは組換え的に生成されてもよい。
用語「組換え抗体」とは、組換え手法によって調製、発現、作製または単離された抗体をいい、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）に対してトランスジェニックであるかもしくは導入染色体である動物（例えば、マウス）、またはそれらから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するために形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）ファージディスプレイを用いた組換え、コンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含む）から単離された抗体、（ｄ）他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）のスプライシグを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体が挙げられる。このような組換え抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列から得られる可変領域および定常領域を含んでもよい。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロの変異誘発に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、およびそれらと関連するが、インビボでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリーには、自然に存在しない場合がある。
用語「キメラ免疫グロブリン」または「キメラ抗体」とは、可変領域が第１の種由来であり、定常領域が第２の種由来である免疫グロブリンまたは抗体をいう。キメラ免疫グロブリンまたはキメラ抗体は、例えば、遺伝子操作によって、異種に属する免疫グロブリン遺伝子のセグメントから構築することができる。
用語「ヒト抗体」とは、本明細書で使用するとき、フレームワーク領域とＣＤＲ領域との両方が、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）によって記載されるヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来である。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでいてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」とは、本明細書で使用するとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移入された抗体を含むことは意図されない。
ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていない、活性を高めるアミノ酸残基で置換された少なくとも１以上のアミノ酸を有することができる。典型的には、ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列の部分ではないアミノ酸残基で置換された最大２０箇所を有することができる。特定の実施形態では、これらの置換は、下記に詳述されるように、ＣＤＲ領域内にある。
用語「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」とは、少なくとも１つのヒト化免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち、少なくとも１つのヒト化軽鎖または重鎖）を含む免疫グロブリンまたは抗体をいう。用語「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」または「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）とは、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する可変フレームワーク領域、および実質的には非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に]由来する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）を含み、さらに、定常領域（例えば、軽鎖の場合には少なくとも１つの定常領域またはその部分、好ましくは重鎖の場合には３つの定常領域）を含む可変領域を有する免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち、それぞれ軽鎖または重鎖）をいう。用語「ヒト化可変領域」（例えば、「ヒト化軽鎖可変領域」または「ヒト化重鎖可変領域」）とは、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する可変フレームワーク領域、および実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に由来する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域をいう。
「二重特異性」または「二機能性」の抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ'断片の連結を含む種々の方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９，３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照されたい。特定の実施形態では、本発明に係る二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３とＩＧＦ１−Ｒ（すなわち、インスリン様増殖因子１−受容体）との両方に対する結合部位を含む。別の実施形態では、本発明に係る二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３とＣ−ＭＥＴとの両方に対する結合部位を含む。他の実施形態では、二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３に対する結合部位、およびＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ、ルイスＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、Ｃ−ＫＩＴ、または任意のＦＧＦ受容体に対する結合部位を含む。
本明細書で使用するとき、「異種抗体」は、このような抗体を生成するトランスジェニック非ヒト生物または植物に関して定義される。
「単離された抗体」とは、本明細書で使用するとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＥｒｂＢ３に特異的に結合する単離された抗体は、ＥｒｂＢ３以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）をいうことが意図される。さらに、単離された抗体は、典型的には、他の細胞の材料および／またはタンパク質を実質的に含まない。本発明の一実施形態では、異なるＥｒｂＢ３結合特異性を有する「単離された」抗体の組み合わせは、明確な組成物に組み合わせられる。
本明細書で使用するとき、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体アイソタイプから選択されるアイソタイプの抗体またはその抗原結合部分である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体またはその抗原結合部分である。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体またはその抗原結合部分である。
本明細書で使用するとき、「アイソタイプスイッチ」とは、抗体のクラス、またはアイソタイプが、１つのＩｇクラスから他のＩｇクラスのうちの１つに変化する現象をいう。
本明細書で使用するとき、「非スイッチアイソタイプ」とは、アイソタイプスイッチが起こらない場合に生成される重鎖のアイソタイプクラスをいう；非スイッチアイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、典型的には、機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子からすぐ下流にある第１のＣＨ遺伝子である。アイソタイプスイッチは、古典的または非古典的なアイソタイプスイッチとして分類されている。古典的なアイソタイプスイッチは、抗体をコードする遺伝子の少なくとも１つのスイッチ配列領域を含む組換え事象によって発生する。非古典的なアイソタイプスイッチは、例えば、ヒトσμとヒトΣμ（δ−関連欠失）との間の相同組換えによって発生する場合がある。とりわけ、トランスジーン間および／または染色体間の組換えなどの代替の非古典的なスイッチ機序が発生し、アイソタイプスイッチを生じさせる場合がある。
本明細書で使用するとき、用語「スイッチ配列」とは、スイッチ組換えに関与するそれらのＤＮＡ配列をいう。「スイッチドナー」配列、典型的にはμスイッチ領域は、スイッチ組換え中に欠失されるコンストラクト領域の５'（すなわち、上流）である。「スイッチアクセプター」領域は、欠失されるコンストラクト領域と置換定常領域（例えば、γ、εなど）との間にある。組換えがいつも起こる特定の部位は存在しないため、最終の遺伝子配列は、典型的には、コンストラクトから予測され得ない。
「抗原」は、抗体またはその抗原結合部分が結合する実体（例えば、タンパク性実体またはペプチド）である。本明細書で開示される種々の実施形態では、抗原は、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ３様分子である。本発明に係る特定の実施形態では、抗原はヒトＥｒｂＢ３である。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の両者から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に対して保持され、そこでは三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理に対して消失する。エピトープは、典型的には、独自の空間構造の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間構造を測定する方法には、当技術分野における技術、および本明細書に記載される技術、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
また、そのアミノ酸配列が本明細書に開示される抗体、すなわち、ＥｒｂＢ３との結合に競合する抗体と同じエピトープまたは重複しているエピトープに結合する抗体、または本明細書に記載される抗体によって結合されるエピトープ、すなわち、ＥｒｂＢ３の外部ドメイン上、好ましくはＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩ上に位置したエピトープと重複するエピトープに結合する抗体が本発明に包含される。同じエピトープを認識する抗体は、例えば標的抗原との別の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示すことによる免疫アッセイ、すなわち、競合結合アッセイなどの日常的な技術を用いて同定することができる。競合結合は、試験用の免疫グロブリンがＥｒｂＢ３などの共通の抗原との参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて測定される。多数のタイプの競合結合アッセイが知られている。例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４を参照されたい）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら（１９９０）Ｓｃａｎｄ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７）が挙げられる。典型的には、このようなアッセイは、これらの非標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンのいずれかを持つ固体表面または細胞に結合された精製された抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）の使用を伴う。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で、固体表面または細胞に結合された標識量を測定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在している。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％７０〜７５％以上まで、参照抗体による共通抗原との特異的結合を阻害する。
用語「パラトープ」とは、抗体が特異的に結合する抗原上のエピトープを認識して接触することに直接的に関与するようにみえる抗体の部分、またはアミノ酸残基をいう。パラトープは、典型的には、重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内のすべてのアミノ酸残基ではなくその一部を含む。パラトープは、ＶＨとＶＬのＣＤＲのすべて、またはＣＤＲの一部のみ（例えば、特定のＣＤＲは、抗原を結合することに関与しないこともある）においてアミノ酸残基を含むことがある。特定の抗原のためのパラトープは、例えば、表面に露出され（例えば結晶モデリングによって測定されたとき）、およびおそらく抗原結合に関与すると思われる抗体内、特にＣＤＲ内のアミノ酸残基の系統的変異導入法（たとえばアラニン置換）によって規定されることができる。次いで、変異体の抗原との結合を評価することで、変異アミノ酸の位置が抗原結合に関与し、かつ抗体のパラトープの一部を形成しているかどうかを決定することができる。抗体パラトープを決定する方法を、実施例２０でさらに詳細に記述する。
好ましい実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号６３もしくは７６（ＣＤＲ１）、６４（ＣＤＲ２）および６５（ＣＤＲ３）にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖パラトープを含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
別の好ましい実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号６９もしくは７８（ＣＤＲ１）、７０（ＣＤＲ２）および７１もしくは８０（ＣＤＲ３）に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖パラトープを含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号６３、６４および６５にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖パラトープと、ならびに配列番号６９、７０および７１にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖パラトープとを含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号７６、６４および６５にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖パラトープと、配列番号７８、７０および８０にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖パラトープとを含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
相補性決定領域（ＣＤＲ）に関し本明細書で用いるとき、用語「コンセンサス配列」とは、ＣＤＲのコンポジット配列または総称化配列をいう。これはＣＤＲ内のアミノ酸残基が、抗原結合を損なわずに改変を受け入れられることに関する情報に基づいて規定された。したがって、ＣＤＲの「コンセンサス配列」では、特定のアミノ酸位置は、その位置での複数の可能なアミノ酸残基のうちの１つによって占有される。例えば、ＣＤＲ内で、抗原結合が特定の位置でチロシンまたはフェニルアラニンのいずれかの存在に影響を受けないことがわかった場合、該コンセンサス配列内のその特定の位置は、チロシンまたはフェニルアラニンのいずれか（Ｔ／Ｆ）であり得る。ＣＤＲのコンセンサス配列は、例えば、抗体ＣＤＲ内のアミノ酸残基についての系統的変異導入法（例えば、アラニン置換）によって、続いてその変異アミノ酸位置が抗原結合に影響を及ぼすかどうかを決定するために、その変異体の抗原との結合を評価することによって規定され得る。抗体ＣＤＲコンセンサス配列を決定する方法を、実施例２０でさらに詳細に記述する。
好ましい実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号６０または７５（ＣＤＲ１）、６１（ＣＤＲ２）および６２（ＣＤＲ３）それぞれ示されるコンセンサス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域を含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
別の好ましい実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号６６または７７（ＣＤＲ１）、６７（ＣＤＲ２）および６８または７９（ＣＤＲ３）それぞれ示されるコンセンサス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域を含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
別の実施形態では、配列番号６０、６１および６２にそれぞれ示されるコンセンサス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６６、６７および６８にそれぞれ示されるコンセンサス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とを含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
別の実施形態では、配列番号７５、６１および６２にそれぞれ示されるコンセンサス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７７、６７および７９にそれぞれ示されるコンセンサス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とを含み、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
本明細書で使用するとき、用語「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」、および「選択的に結合する」とは、抗体またはその抗原結合部分が特定の抗原またはエピトープへの感知できる親和性を示し、かつ通常、他の抗原およびエピトープとは有意な交差反応を示さないことを意味する。「感知できる」または好ましい結合には、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性を有する結合が含まれる。１０７Ｍ−１を超える親和性、好ましくは１０８Ｍ−１を超える親和性がより好ましい。また、本明細書に記載されている値の中間の値も本発明の範囲内にあることが意図され、好ましい結合親和性は、親和性の範囲、例えば、１０６〜１０１０Ｍ−１、好ましくは１０７〜１０１０Ｍ−１、より好ましくは１０８〜１０１０Ｍ−１として指示され得る。「有意な交差反応を示さない」抗体は、望ましくない実体（例えば、望ましくないタンパク性実体）に感知できるほどに結合されないものである。例えば、一実施形態では、ＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、そのＥｒｂＢ３分子に感知できるほどに結合するが、他のＥｒｂＢ分子および非ＥｒｂＢタンパク質またはペプチドとは有意に反応しない。特異的または選択的結合は、このような結合を決定するための任意の当分野で認識されている手段にしたがって、例えば、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイにしたがって測定することができる。
用語「ＫＤ」とは、本明細書で使用するとき、好ましくは、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析物として組換えＥｒｂＢ３、およびリガンドとして抗体を用いることで測定するように）または細胞結合アッセイを用いて測定するとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に対する抗体の親和性をいうことが意図される。これら両アッセイを以下の実施例３に詳述する。一実施形態では、本発明に係る抗体またはその抗原結合部分は、５０ｎＭまたはそれよりも良好な（すなわちそれよりも小さい）（例えば、４０ｎＭまたは３０ｎＭまたは２０ｎＭまたは１０ｎＭまたはそれよりも小さい）親和性（ＫＤ）で、抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）に結合する。特定の実施形態では、本発明に係る抗体またはその抗原結合部分は、８ｎＭまたはそれよりも良好な（例えば、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、１ｎＭまたはそれ未満）親和性（ＫＤ）で、ＥｒｂＢ３に結合する。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、約１０−７Ｍ未満、例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満またはそれよりもさらに低い親和性（ＫＤ）で、抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）に結合し、かつ所定の抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原に結合する。
用語「Ｋｏｆｆ」とは、本明細書で使用するとき、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関するｏｆｆ速度定数をいうことが意図される。
用語「ＥＣ５０」とは、本明細書で使用するとき、インビトロアッセイまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインとの間の中間である、応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度をいう。
本明細書で使用するとき、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合で結合される炭水化物単位のパターンとして定義される。
用語「自然に存在する」とは、本明細書で使用するとき、被験体に適用される場合、被験体が自然に見出され得る事実を指す。例えば、有機体（ウイルスを含む）に存在し、自然の供給源から単離することができ、実験室にいる者によって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は自然に存在する。
用語「再配列された」とは、本明細書で使用するとき、重鎖または軽鎖の免疫グロブリン遺伝子座の立体配置をいい、ここで、Ｖセグメントは、それぞれ完全なＶＨまたはＶＬドメインを本質的にコードする立体配座におけるＤ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して位置される。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ＤＮＡと比較することによって同定することができる；再配列された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられた７量体／９量体の相同エレメントを有する。
用語「再配列されていない」または「生殖細胞系列の立体配置」とは、Ｖセグメントと関連して本明細書で使用するとき、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントと直接隣接するようには組み換えられていない立体配置をいう。
用語「核酸分子」とは、本明細書で使用するとき、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
用語「単離された核酸分子」とは、ＥｒｂＢ３に結合する抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関連して本明細書で使用するとき、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ＥｒｂＢ３以外の抗原に結合する抗体をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子をいうことが意図され、その場合、他の配列は、ヒトゲノムＤＮＡの核酸の側面に自然に位置してもよい。
用語「改変すること」または「改変」とは、本明細書で使用するとき、抗体またはその抗原結合部分において１以上のアミノ酸を変化させることをいうことが意図される。この変化は、１以上の位置でアミノ酸を付加、置換または欠失させることによって生じさせることができる。この変化は、ＰＣＲ変異誘発などの知られている技術を用いて生じさせることができる。例えば、一部の実施形態では、本開示の方法を用いて同定された抗体またはその抗原結合部分は改変され、それによって、ＥｒｂＢ３に対する抗体またはその抗原結合部分の結合親和性を改変することができる。
また、本発明は、本発明の抗体またはその断片の配列における「保存的アミノ酸置換」、すなわち、抗原すなわちＥｒｂＢ３に対する、ヌクレオチド配列によってコードされるかまたはアミノ酸配列を含む抗体の結合を無効にしない、該ヌクレオチドおよび該アミノ酸の配列改変を含む。保存的アミノ酸置換には、同じクラスのアミノ酸による、あるクラスのアミノ酸の置換が含まれ、この場合、クラスは、例えば、標準的なＤａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスによって測定すると、自然に見いだされる相同タンパク質における共通の物理化学的なアミノ酸配列特性および高い置換頻度によって規定される。アミノ酸側鎖の６個の一般的なクラスが分類され、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；クラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基によるＡｓｐの置換は、保存置換である。このようにして、抗ＥｒｂＢ３抗体における予測された非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスから得られる別のアミノ酸残基により置換される。抗原結合を除去しないアミノ酸保存置換を同定する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；並びに、Ｂｕｒｋｓら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照されたい）。
用語「非保存的アミノ酸置換」とは、別のクラスから得られるアミノ酸を用いた１つのクラスのアミノ酸の置換をいう：例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎなどのクラスＩＩＩ残基を用いて、クラスＩＩ残基であるＡｌａの置換が挙げられる。
あるいは、別の実施形態では、変異（保存または非保存）は、飽和変異誘発によるなどの抗ＥｒｂＢ３抗体をコードする配列の全部または一部に沿って、無作為に導入することができ、得られた改変抗ＥｒｂＢ３抗体は、結合活性についてスクリーニングされ得る。
「コンセンサス配列」は、関連する配列のファミリーにおける最も頻繁に発生するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列である（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７）を参照されたい。タンパク質のファミリーでは、コンセンサス配列の各位置は、ファミリーのその位置で最も頻繁に発生するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸は等しく頻繁に発生する場合、いずれかがコンセンサス配列に含まれ得る。免疫グロブリンの「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域をいう。
同様に、ＣＤＲに対するコンセンサス配列は、そのＣＤＲアミノ酸配列が本明細書で開示されるＥｒｂＢ３抗体のＣＤＲアミノ酸配列の最適アラインメントによって誘導されることができる。
核酸に関して、用語「実質的な相同性」とは、２つの核酸、またはその指定された配列が、最適に整列および比較された場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を含み、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、およびより好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％で同一であることを示す。あるいは、実質的な相同性は、鎖の相補体に対して、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。
２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／位置の全体の数×１００）であり、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮して、２つの配列の最適アラインメントに対して導入される必要がある。配列の比較、および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非制限的な実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重量、および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウェアのＧＡＰプログラムを使用して測定することができる。また、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量、および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて決定できる。
さらに、本開示の核酸およびタンパク質の配列は、例えば、関連した配列を同定するために、公的なデータベースに対する検索を実施するための、「クエリー配列」として用いることができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行可能である。比較を目的としたギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように利用可能である。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。
核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、標準的な技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知である他の技術によって、他の細胞成分または他の混入物、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質から切り離して精製された場合、「単離されている」または「実質的に純粋の状態にある」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編集，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。
本開示の核酸組成物は、多くの場合、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはそれらの混合物のいずれから天然の配列（改変された制限部位などを除く）にあるが、遺伝子配列を与えるために標準的な技術に従って変異させることができる。コード配列については、これらの変異は、目的どおりにアミノ酸配列に影響を与えることができる。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ、および本明細書に記載される他のこのような配列に実質的に相同であるかまたはそれらに由来するＤＮＡ配列が意図される（この場合、「由来する」は、配列が別の配列と同一であるかまたは改変されることを示す）。
用語「操作可能に連結されている」とは、別の核酸配列と機能的な関連性があるように配置されている核酸配列をいう。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、このＤＮＡは該ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーが、コード配列の転写に影響を与える場合、それらは該コード配列に操作可能に連結されている；またはリボソーム結合部位が、翻訳を促進するように位置されている場合、それはコード配列に操作可能に連結されている。一般的に、「操作可能に連結されている」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接し、分泌リーダーの場合には、隣接し、読み取られる状態にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の実施に従って用いられる。核酸は、別の核酸配列と機能的な関連性があるように置かれている場合に「操作可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に操作可能に連結されている。転写制御配列に関して、操作可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接し、２つのタンパク質の翻訳領域を連結することが必要なところでは、隣接し、読み取りフレームにあることを意味する。スイッチ配列に関して、操作可能に連結されているとは、配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。
用語「ベクター」とは、本明細書で使用するとき、それが連結されている別の核酸の輸送を可能にする核酸分子をいうことが意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントが連結されてもよい環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を指向することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用性のある発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。用語「プラスミド」および「ベクター」は、互換可能に用いられてもよい。しかしながら、本発明は、同等の機能を供給するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのこのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
用語「組換え宿主細胞」（または、単に「宿主細胞」）とは、本明細書で使用するとき、組換え発現ベクターが導入される細胞をいうことが意図される。そのような用語が特定の従属する細胞にだけでなくそのような細胞の子孫をいうことが意図されることを理解すべきである。特定の改変は、変異または環境の影響のいずれかにより、続く世代において発生する場合があるため、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、なおも、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」とは、本明細書で使用するとき、本明細書に記載される治療的処置または予防措置をいう。「処置」の方法は、疾患もしくは障害または再発性の疾患もしくは障害の１以上の症状を予防、治癒、遅延、重症度の減少、または改善するために、あるいは、このような処置がない場合に期待されるものを超えて被験体の生存を延長するために、被験体に、例えば、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患または障害を患っている被験体、またはこのような疾患または障害を患い易い被験体への本明細書に開示される抗体または抗原結合部分の投与に使用する。
用語「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患」、または「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した障害」には、本明細書で使用するとき、ＥｒｂＢ３のレベル上昇および／またはＥｒｂＢ３が関与した細胞カスケードの活性化が見られる疾患状態および／または疾患状態と関連した症状が含まれる。ＥｒｂＢ３は、ＥｒｂＢ３のレベル上昇が見られる場合に、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２などの他のＥｒｂＢタンパク質と異種二量化するものと理解されている。したがって、用語「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患」にも、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３異種二量体のレベル上昇が見られる疾患状態および／または疾患状態と関連した症状が含まれる。一般に、用語「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患」とは、ＥｒｂＢ３の関与を必要とする任意の障害、症状の開始、進行または持続をいう。例示的なＥｒｂＢ３媒介の障害には、限定されないが、例えば、癌が含まれる。
用語「癌」および「癌性」とは、典型的には、無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態をいうかまたはそれを説明するものである。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア芽腫および神経線維腫症などのグリア細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、メラノーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性の癌腫、および種々のタイプの頭頸部癌が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法を用いて処置または診断される癌は、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎臓癌腫、胃腸／結腸癌、肺癌、および前立腺癌から選択される。
用語「ＫＲＡＳ変異」とは、本明細書で用いるとき、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスの癌遺伝子のヒト相同体における特定の癌に見出される変異をいう。ヒトＫＲＡＳ遺伝子ｍＲＮＡ配列の非限定例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４９８５およびＮＭ＿０３３３６０が挙げられる。ＫＲＡＳ変異は、膵臓腫瘍の７３％、直腸結腸腫瘍の３５％、卵巣腫瘍の１６％および肺腫瘍の１７％に見つかると報告されている。
用語「ＰＩ３Ｋ変異」とは、本明細書で用いるとき、特定の癌においてホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ遺伝子に見出され、典型的には癌細胞においてＰＩ３Ｋの活性化を引き起こす変異をいう。ＰＩ３Ｋ変異は、直腸結腸腫瘍の１２％、頭頚部腫瘍の１５％および乳腺腫瘍の２６％に見つかると報告されている。
用語「有効量」とは、本明細書で使用するとき、被験体に投与された場合、本明細書に記載されるように、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患の処置、予後または診断を達成させるのに十分である、ＥｒｂＢ３に結合する抗体またはその抗原結合部分の量をいう。治療有効量は、当業者によって容易に決定され得る、処置される被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などに依存して変化する。投与のための投与量は、例えば、本発明に係る抗体またはその抗原結合部分の約１ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５ｎｇ〜約９，５００ｍｇ、約１０ｎｇ〜約９，０００ｍｇ、約２０ｎｇ〜約８，５００ｍｇ、約３０ｎｇ〜約７，５００ｍｇ、約４０ｎｇ〜約７，０００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約６，５００ｍｇ、約１００ｎｇ〜約６，０００ｍｇ、約２００ｎｇ〜約５，５００ｍｇ、約３００ｎｇ〜約５，０００ｍｇ、約４００ｎｇ〜約４，５００ｍｇ、約５００ｎｇ〜約４，０００ｍｇ、約１μｇ〜約３，５００ｍｇ、約５μｇ〜約３，０００ｍｇ、約１０μｇ〜約２，６００ｍｇ、約２０μｇ〜約２，５７５ｍｇ、約３０μｇ〜約２，５５０ｍｇ、約４０μｇ〜約２，５００ｍｇ、約５０μｇ〜約２，４７５ｍｇ、約１００μｇ〜約２，４５０ｍｇ、約２００μｇ〜約２，４２５ｍｇ、約３００μｇ〜約２，０００、約４００μｇ〜約１，１７５ｍｇ、約５００μｇ〜約１，１５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，１２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，１００ｍｇ、約１．２５ｍｇ〜約１，０７５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約１，０５０ｍｇ、約２．０ｍｇ〜約１，０２５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約３．０ｍｇ〜約９７５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約４．０ｍｇ〜約９２５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約９００ｍｇ、約５ｍｇ〜約８７５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８２５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約７７５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７２５ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６７５ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ、または約５２５ｍｇ〜約６２５ｍｇの範囲であり得る。投与計画は、最適な治療応答を与えるように調整されてもよい。また、有効量は、抗体またはその抗原結合部の任意の毒性または有害な影響（すなわち、副作用）が最小化され、および／または有益な影響が上回るものである。さらなる好ましい投与計画を、以下の医薬組成物に関連する節でさらに後述する。
用語「患者」とは、予防的処置または治療上の処置のいずれかを受けているヒトおよび他の哺乳動物被験体が含まれる。
本明細書で使用するとき、用語「被験体」または「患者」には、いずれかのヒトまたはヒト以外の動物が含まれる。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、癌を患っている被験体を処置するために用いることができる。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。用語「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物が含まれ、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシなどが挙げられる。
用語「試料」とは、患者または被験体からの組織、体液、または細胞をいう。通常、組織または細胞は、患者から取り出されるが、インビボでの診断も意図される。固形腫瘍の場合には、組織試料は、外科的に取り出された腫瘍から採取することができ、従来技術によって試験のために調製することができる。リンパ腫および白血病の場合には、リンパ球、白血病細胞、またはリンパ組織が得られ、適切に調製することができる。また、尿、涙、血清、脳脊髄液、糞便、痰、細胞抽出物などを含む他の患者試料も特定の腫瘍に有用であり得る。
用語「抗癌剤」および「抗腫瘍剤」とは、癌性増殖などの悪性腫瘍を処置するために用いられる薬物をいう。薬物治療は、単独で、または外科的処置もしくは放射線治療などの他の処置と併用して用いられてもよい。いくつかのクラスの薬物は、関与する器官の性質に依存して、癌処置に用いることができる。例えば、乳癌は、通常、エストロゲンによって刺激され、性ホルモンを不活性化する薬物で処置されてもよい。同様に、前立腺癌は、男性ホルモンであるアンドロゲンを不活性化する薬物で処置されてもよい。本発明の特定の方法で用いられる抗癌剤には、とりわけ、下記の薬物が含まれる。
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１以上の抗癌剤は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合部の投与と同時またはその前またはその後に投与されてもよい。
本発明の種々の態様が、下記の小節においてさらに詳細に記載されている。
ＩＩ．抗体を生成する方法
（ｉ）モノクローナル抗体
本開示のモノクローナル抗体は、種々の知られている技術、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に記載される標準的な体細胞のハイブリダイゼーション技術、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換またはヒト抗体遺伝子のライブラリーを用いたファージディスプレイ技術を用いて生成することができる。特定の実施形態では、抗体は、完全なヒトモノクローナル抗体である。
したがって、一実施形態では、ハイブリドーマ法は、ＥｒｂＢ３に結合する抗体を生成するために用いられる。この方法では、免疫付与のために用いられる抗原に特異的に結合する抗体を生成するかまたはそれを生成することができるリンパ球を誘発するために、適切な抗原を用いて、マウスまたは他の適した宿主動物を免疫することができる。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫されてもよい。次に、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成させるために、ポリエチレングリコールなどの適した融合剤を用いて、ミエローマ細胞と融合することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対して作られたモノクローナル抗体の生成について評価される。所望の特異性、親和性、および／または活性のある抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし得、標準的な方法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６、上掲）。この目的に適した培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から分離することができる。
別の実施形態では、ＥｒｂＢ３に結合する抗体および抗体部分は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）．Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１），Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）、並びにＨｏｅｔら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，３４４−３４８；Ｌａｄｎｅｒらに関する米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，５７１，６９８；Ｄｏｗｅｒらに関する米国特許第５，４２７，９０８号および同第５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに関する米国特許第５，９６９，１０８号および同第６，１７２，１９７号；並びに、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓらに関する米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号および同第６，５９３，０８１号に記載される技術を用いて作製した抗体ファージライブラリーから単離することができる。さらに、チェインシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、並びに非常に巨大なファージライブラリー（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を構築するための戦略としての組み合わせ感染およびインビボでの組換えによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生成も用いてもよい。
特定の実施形態では、ＥｒｂＢ３に結合する抗体またはその抗原結合部は、Ｈｏｅｔら、上掲、によって記載されるファージディスプレイ技術を用いて生成される。この技術は、ヒトドナーから単離された免疫グロブリン配列の独特の組み合わせを有し、重鎖ＣＤＲにおける合成多様性を有するヒトＦａｂライブラリーの生成を含む。次に、このライブラリーは、ＥｒｂＢ３に結合するＦａｂについてスクリーニングされる。
さらに別の実施形態では、ＥｒｂＢ３に対して作られたヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもむしろヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニックまたはトランス染色体マウスを用いて生成することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４），上掲；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１に概説される；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３、並びに、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６を参照されたい。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに関する米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；Ｓｕｒａｎｉらに関する米国特許第５，５４５，８０７号；全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに関するＰＣＴ国際公開第９２／０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７／１３８５２号、同第９８／２４８８４号および同第９９／４５９６２号；並びに、Ｋｏｒｍａｎらに関するＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号を参照されたい）。
別の実施形態では、本明細書に開示されるヒト抗体は、トランス遺伝子およびトランス染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウス、例えば、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体を担持するマウスを用いて産生させることができる（例えば、Ｉｓｈｉｄａらに関するＰＣＴ国際公開第０２／４３４７８号を参照されたい）。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系は、当技術分野において利用可能であり、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片を産生させるために用いることができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれるトランスジェニック系を用いることができる；このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに関する米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランス染色体の動物系は、当技術分野において利用可能であり、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片を産生させるために用いることができる。例えば、ヒト重鎖トランス染色体とヒト軽鎖トランス染色体の両方を担持するマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２−７２７に記載されるように用いることができる。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を担持するウシは、当技術分野（Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９−８９４）において記載されており、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片を産生させるために用いることができる。
なお別の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、このような抗体を生成するトランスジェニック植物および／または培養された植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシおよびアオウキクサ）を用いて調製することができる。例えば、抗体またはその抗原結合部分を発現するトランスジェニックタバコの葉は、例えば、誘導プロモーターを用いることによって、このような抗体を生成するために用いることができる（例えば、Ｃｒａｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５ １１８（１９９９）を参照されたい）。また、トランスジェニックトウモロコシを用いて、このような抗体およびその抗原結合部分を発現させることができる（例えば、Ｈｏｏｄら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．４６４：１２７ １４７（１９９９）を参照されたい）。また、抗体は、例えば、タバコの種子およびジャガイモ塊茎を用いて、１本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）などの抗体部分を含むトランスジェニック植物種子から大量に生成することができる（例えば、Ｃｏｎｒａｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１ １０９（１９９８）を参照されたい）。また、植物における抗体または抗原結合部分を生成する方法は、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９ １０８（１９９９）Ｍａら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２ ７（１９９５）；Ｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１ ６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０ ９４４（１９９４）、並びに米国特許第６，０４０，４９８号および同第６，８１５，１８４号に見出すことができる。
本明細書に開示された技術を含むいずれかの技術を用いて調製されたＥｒｂＢ３に結合する抗体またはその部分の結合特異性は、免疫沈降によるか、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などインビトロの結合アッセイによって測定することができる。また、抗体またはその部分の結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
特定の実施形態では、上記で検討された方法のいずれかを用いることによって生成されたＥｒｂＢ３抗体またはその部分は、本明細書に記載される技術などの当分野で認識されている技術を用いて、所望の結合特異性および／または親和性を達成するためにさらに変更または最適化されてもよい。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３抗体に由来する部分的な抗体配列は、構造的および機能的に関連した抗体を生成するために用いられてもよい。例えば、抗体は、６個の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置されるアミノ酸残基を主に介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲを除く配列よりも各抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、大部分の抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からフレームワーク配列に移入された特定の自然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の自然に存在している抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することができる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；および、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３を参照されたい）。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから得ることができる。
このようにして、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片の１以上の構造的特徴、例えばＣＤＲは、本発明の他の抗体またはそれらの断片の少なくとも１つの機能的特徴、例えば、ＥＧＦ様リガンド媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害すること；ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン媒介のシグナル伝達の１以上を阻害すること；増殖またはＥｒｂＢ３を発現している細胞を阻害すること；および／または細胞表面のＥｒｂＢ３レベルを減少させることを保持している、構造的に関連した抗ＥｒｂＢ３抗体を作製するために用いることができる。
特定の実施形態では、配列番号７〜１２、配列番号１３〜１８、配列番号１９〜２４、配列番号３９〜４４、および配列番号４５〜５０から選択される１以上のＣＤＲ領域は、知られているヒトのフレームワーク領域およびＣＤＲを用いて組換え的に組み合わせて、追加的な、組換え操作された本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片を作製する。重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、同一であるかまたは異なった抗体配列に由来し得る。
抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３ドメインが、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことは、当技術分野において周知である（例えば、Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ，１４９：１６０５−１６１２（１９９２）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３１８−５３２９（１９９４）；Ｊａｈｎら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ，１９３：４００−４１９（１９９５）；Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２９６：８３３−８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８９１０−８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１６：２１６１−２１６２（１９９４）；Ｄｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５７：７３９−７４９（１９９６）を参照されたい）。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される特定の抗体の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３（例えば、配列番号９、１５、２１、４１、４７および／または配列番号１２、１８、２４、４４、５０）を含む抗体が生成される。抗体は、さらに、本明細書に具体的に開示される抗体の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２（例えば、配列番号７〜８および／または配列番号１０〜１１；配列番号１３〜１４および／または配列番号１６〜１７；配列番号２０〜２１および／または配列番号２２〜２３；配列番号３９〜４０および／または配列番号４２〜４３；あるいは配列番号４５〜４６および／または配列番号４８〜４９）を含むことができる。
上述の操作された抗体のＣＤＲ１、２、および／または３の領域は、本明細書に開示されたものと正確なアミノ酸配列（例えば、配列番号７〜１２、１３〜１８、１９〜２４、３９〜４４、および４５〜５０に記載される、それぞれＡｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、またはＡｂ＃１９のＣＤＲ）を含むことができる。しかしながら、当業者は、効果的にＥｒｂＢ３に結合する抗体の能力をなおも保持しながら、正確なＣＤＲ配列からのいくつかの逸脱は可能であり得ることを認識する（例えば、保存的アミノ酸置換）。したがって、別の実施形態では、操作された抗体は、例えば、Ａｂ＃６、Ａｂ＃３またはＡｂ＃１４のうちの１以上のＣＤＲと９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％同一である１以上のＣＤＲから構成されてもよい。
別の実施形態では、ＣＤＲの１以上の残基は、より好都合な結合オン速度を達成するために、結合を改変するように変更されてもよい。この戦略を用いて、例えば１０１０Ｍ−１以上の極めて高い結合親和性を有する抗体が達成され得る。当技術分野において周知である親和性成熟技術、および本明細書に記載されている技術を用いて、ＣＤＲ領域を変更することができ、その後、結合における所望の変化について、得られた結合分子をスクリーニングする。したがって、ＣＤＲが変更されるため、結合親和性並びに免疫原性の変化は、モニターされ、スコア化でき、その結果、最良の組み合わせ結合に最適化された抗体および低免疫原性が達成される。
実施例２０でさらに詳細に記述するように、ＥｒｂＢ３との結合に関与するアミノ酸残基を同定するために、変異誘発（例えば、アラニン走査変異誘発）がＡｂ＃６の重鎖および軽鎖のＣＤＲで行われ、それによって抗体のパラトープが規定された。
抗ＥｒｂＢ３抗体のためのパラトープＣＤＲ配列は、この変異誘発分析に基づいて、図３７Ａおよび３７Ｂに示す。図３７Ａに示すように、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片は、配列番号６３、６４および６５にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖パラトープと、配列番号６９、７０および７１にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖パラトープとを含み得るが、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
図３７Ｂに示すように、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片は、配列番号７６、６４および６５にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖パラトープと、配列番号７８、７０および８０にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖パラトープとを含み得るが、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号６３または７６（ＣＤＲ１）、６４（ＣＤＲ２）および６５（ＣＤＲ３）にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖パラトープを含む抗ＥｒｂＢ３抗体を提供するが、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号６９または７８（ＣＤＲ１）、７０（ＣＤＲ２）および７１または８０（ＣＤＲ３）にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖パラトープを含む抗ＥｒｂＢ３抗体を提供するが、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片のコンセンサスＣＤＲ配列も、この変異誘発分析に基づいて、図３７Ａおよび３７Ｂに示す。図３７Ａに示すように、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片は、配列番号６０、６１および６２にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６６、６７および６８にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とを含み得るが、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
図３７Ｂに示すように、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその断片は、配列番号７５、６１および６２にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７７、６７および７９にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とを含み得るが、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号６０または７５（ＣＤＲ１）、６１（ＣＤＲ２）および６２（ＣＤＲ３）にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域を含む抗ＥｒｂＢ３抗体を提供するが、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号６６または７７（ＣＤＲ１）、６７（ＣＤＲ２）および６８または７９（ＣＤＲ３）にそれぞれ示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥｒｂＢ３抗体を提供するが、ただし、該抗体は以下の抗体ではない：（ｉ）本明細書に開示されるＡｂ＃６；（ｉｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬの配列を含む抗体；または（ｉｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体。
ＣＤＲ内の改変に加えて、またはそれに代えて、これらの改変が抗体の結合親和性を排除しない限り、改変も、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域の１以上のフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４内で行われ得る。
別の実施形態では、抗体は、例えば、癌の処置における抗体の有効性を高めるように、エフェクター機能に関して、さらに改変される。たとえば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入されてもよく、それにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして産生されたホモ二量化抗体は、内在化能力を改善し、および／または補体媒介の細胞死滅および抗体に依存した細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増加させる場合がある。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）、並びにＳｈｏｐｅｓ、Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。また、抗腫瘍活性が高まったホモ二量化抗体は、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、それにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を高めた可能性がある抗体が操作され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。
本明細書で開示されるＣＤＲ、フレームワーク領域、Ｆｃ領域、または他の抗体領域における１以上の変異誘発は、これらに限定されないが部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発を含む標準組換えＤＮＡ技術を用いて達成され得る。抗原結合（例えば、ＥｒｂＢ３との結合）での変異の影響および他の機能特性をスクリーニングも、標準方法を用いて達成され得る。例えば、変異したＣＤＲを含有する抗体（例えば、ｓｃＦｖバージョン）は、哺乳動物細胞、酵母細胞またはバクテリア細胞などの細胞表面に発現することができ（ファージディスプレイ系を用いることで）、および抗原とこれらの細胞との結合は、標準方法、例えば、細胞に結合した抗原を、例えば、標識した二次抗体を用いて検出するフローサイトメトリーを用いて測定されることができる。さらに、または代わりに、抗体は可溶型で発現することもでき、および抗体と抗原との結合は、ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡＣＯＲＥ分析などの標準結合アッセイを用いて評価されることができる。このような目的の前述の技術および関連技術の詳細な説明は、多数のよく知られている教科書およびラボマニュアルに見出され得る。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｖｏｌｓ．１−３， Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌ，編集， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ ２００７；Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｇａｒｙ Ｃ． Ｈｏｗａｒｄ， ＣＲＣ ２００６；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｂｅｎｎｙ Ｋ． Ｃ． Ｌｏ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００３；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａｎｔｏｎｙ Ｓ． Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，編集， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００９；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版． Ｒｏｂｅｒｔ Ａｉｔｋｅｎ，編集， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００９；Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版． Ｔｅｒｅｓａ Ｓ． Ｈａｗｌｅｙ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｇ． Ｈａｗｌｅｙ，編集， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００４；Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｉｏｎ Ｇ． Ｍａｃｅｙ，編集， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００７が挙げられる。”Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，”Ｈ．Ｒ． Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：１１０５−１１１６；２００５も参照されたい。
また、下記に記載される二重特異性抗体および免疫結合体も本発明に包含される。
（ｉｉ）二重特異性抗体
本開示の二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３に対する少なくとも１つの結合特異性、および癌遺伝子の生成物などの別の抗原に対する少なくとも１つの結合特異性を含む。二重特異性抗体は、全長の抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ'）２二重特異性抗体）として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野において周知である（例えば、国際公開第０５１１７９７３号および同第０６０９１２０９号を参照されたい）。例えば、全長の二重特異性抗体の生成は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくことができ、この場合、２つの鎖は、異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）を参照されたい）。二重特異性抗体を生じさせるためのさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）、および二重特異性抗体を作製するための化学的連結法を記載するＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）に見いだすことができる。また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作製および単離するための種々の技術が記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成されている（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）。また、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略が報告されている（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３に結合する第１抗体またはその結合部分、およびＥｒｂＢ２、ＥＲｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１−Ｒ、Ｃ−ＭＥＴ、ルイスＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、Ｃ−ＫＩＴ、またはＦＧＦ受容体のいずれかに結合する第２抗体またはその結合部分を含む。
（ｉｉｉ）免疫結合体
本開示の免疫結合体は、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部分を別の治療薬に結合させることによって形成することができる。適切な剤には、例えば、細胞傷害性剤（例えば、化学療法剤）、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、および／または放射性同位体（すなわち、放射性結合体）が挙げられる。このような免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は、上記されている。用いることができる酵素的に活性な毒素およびそれらの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性な断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。種々の放射性核種が、放射性結合された抗ＥｒｂＢ３郊外の生成に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
本発明の免疫結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、２−イミノチオレン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性なエステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トリレン−２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの種々の二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。 炭素１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン トリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドを結合させるための典型的なキレート剤である（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい）。
（ｉｖ）ＥｒｂＢ３外部ドメインペプチドに対して産生される抗体
Ａｂ＃６（例えば、癌細胞増殖を阻害し、かつ細胞上のＥｒｂＢ３をダウンレギュレートする抗体）の種々の所望の特性を有するモノクローナル抗体および単一特異性ポリクローナル抗体、またはＡｂ＃６とＥｒｂＢ３との結合を競合することを当業者が認識する場合、それらの抗体は、免疫原としてペプチド（例えば合成ペプチド）、またはその結合体（例えばＫＬＨ結合体）を用いる従来の免疫法を用いて、容易に得ることができる。本実施形態で免疫原として用いるペプチドは、配列番号７３の残基１〜１８３からのいずれか１０以上の隣接するアミノ酸残基を含むペプチドである。好ましくは、該１０以上の隣接するアミノ酸残基は、ＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに由来し、好ましくは、該アミノ酸残基は、配列番号７３の残基９２〜１０４内またはその範囲に少なくとも部分的に収まる。
ＩＩＩ．抗体をスクリーニングするための方法
ＥｒｂＢ３に結合する抗体または抗原結合部分を生成後、このような抗体、またはその部分は、当技術分野において周知である種々のアッセイを用いて、種々の特性、例えば本明細書に記載される特性についてスクリーニングすることができる。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥＧＦ様リガンド媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、抗体またはその抗原結合部分の存在下および非存在下で、ＥＧＦ様リガンドを用いて、ＥｒｂＢ３を発現している細胞を処理することによって行うことができる。次に細胞を溶解し、粗製溶解物を遠心分離して、不溶性物質を除去することができる。ＥｒｂＢ３リン酸化は、例えば、ウェスタンブロッティング、その後の抗ホスホチロシン抗体を用いた探査により測定可能であり、Ｋｉｍら、上掲、並びに下記の実施例に記載されている。
他の実施形態では、抗体および抗原結合部分は、さらに、下記の特性：（１）ＥｒｂＢ３を介したＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）媒介のシグナル伝達の阻害；（２）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖阻害；（３）細胞表面上のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力（例えば、ＥｒｂＢ３の内在化を誘導することによる）；（４）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害；（５）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害；（６）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害；および／または（７）ＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩに位置したエピトープとの結合、のうちの１以上についてスクリーニングされ、各々は、当分野で認識されている技術、および本明細書において検討された技術を用いて容易に測定することができる。
ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンによって媒介されるシグナル伝達の１以上の阻害は、日常的なアッセイ、例えば、Ｈｏｒｓｔら、上掲、に記載されるアッセイを用いて容易に測定することができる。例えば、ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンによって媒介されるシグナル伝達を阻害する、抗体またはその抗原結合部分の能力は、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンのうちの１以上によって刺激後、例えば、Ｈｏｒｓｔら、上掲，Ｓｕｄｏら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２２：３８８−９２；並びに、Ｍｏｒｇａｎら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１：７６１−７６７に記載される、例えば、ＳＨＣおよびＰＩ３Ｋなどの既知のＥｒｂＢ３の基質についてのキナーゼアッセイによって測定することができる。したがって、ＥｒｂＢ３を発現している細胞は、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンのうちの１以上を用いて刺激され、候補抗体またはその抗原結合部分とともにインキュベートすることができる。その後にこのような細胞から調製された細胞溶解物は、ＥｒｂＢ３の基質（またはＥｒｂＢ３に関与する細胞経路にあるタンパク質）に対する抗体、例えば、抗ＪＮＫ−１抗体を用いて免疫沈降され、当分野で認識されている技術を用いて、キナーゼ活性（例えば、ＪＮＫキナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ活性）についてアッセイすることができる。抗体またはその抗原結合部分が存在する場合のＥｒｂＢ３基質またはＥｒｂＢ３に関与する経路にあるタンパク質のレベルまたは活性（例えば、キナーゼ活性）の減少または完全な消失は、抗体またはその抗原結合部分の非存在下でのレベルまたは活性と比較して、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンのうちの１以上が媒介するシグナル伝達を阻害する抗体または抗原結合部分を示す。
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンのうちの１以上のＥｒｂＢ３との結合を減少させることによって、ＥｒｂＢ３−リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）媒介のシグナル伝達を阻害する。
ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンのうちの１以上のＥｒｂＢ３との結合を阻害するそれらの抗体またはその抗原結合部分について選択するために、ＥｒｂＢ３を発現する細胞（例えば、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞、下記の実施例において記載される）は、抗ＥｒｂＢ３抗体またはその抗原結合部分の非存在下（対照）または存在下で、標識されたＥｒｂＢ３−リガンド（例えば、放射線同位元素標識されたヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）と接触させることができる。抗体またはその抗原結合部分がＥｒｂＢ３とのヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンの結合を阻害すれば、抗体またはその抗原結合部分の非存在下での量と比較して、回収された標識量（例えば、放射線同位元素標識されたヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）における統計的に有意な減少が観察される。
抗体またはその抗原結合部分は、任意のメカニズムによって、ＥｒｂＢ３−リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合を阻害することができる。例えば、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３リガンドと同じＥｒｂＢ３の部位または重複している部位に結合することによって、ＥｒｂＢ３とのＥｒｂＢ３リガンド（例えばヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンのうちの１以上）の結合を阻害してもよい。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３の構造を変更させるかまたは歪めることによって、ＥｒｂＢ３リガンドの結合を阻害してもよく、その結果、ＥｒｂＢ３リガンドに結合できなくなる。
細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる抗体およびその抗原結合部分は、腫瘍細胞のＥｒｂＢ３をダウンレギュレートするそれらの能力によって同定することができる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、Ｅｒｂｂ３の内在化を誘導する（またはエンドサイトーシスを増加する）ことによって、ＥｒｂＢ３の細胞表面の発現を減少させる。これを試験するために、ＥｒｂＢ３は、ビオチニル化することができ、細胞表面のＥｒｂＢ３分子の数は、例えば、Ｗａｔｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），２７３：１３８１９−２７に記載されるように、抗体またはその抗原結合部分の存在下または非存在下で、培養中の細胞の単層上のビオチン量を測定し、その後、ＥｒｂＢ３を免疫沈降し、ストレプトアビジンを用いて探査することによって、容易に測定することができる。抗体または抗原結合部分の存在下で、ビオチニル化されたＥｒｂＢ３の経時的な検出における減少は、細胞表面のＥｒｂＢ３レベルを減少する抗体を示す。
また、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３を発現している細胞、例えば、腫瘍細胞の増殖を阻害するそれらの能力について、当分野で認識されている技術、例えば、下記の実施例に記載されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ａｓｓａｙを用いて試験することができる（さらに、例えば、Ｍａｃａｌｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（１９９８）２０；９５（２）：７０８−１３；Ｐｅｒｅｚら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５，３９２−３９８を参照されたい）。
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，＃ＤＹ２９３Ｂから入手可能なＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットなどの周知なアッセイを用いることによってなされ得る。同様に、この抗体または部分は、本明細書に記載される、トランスウェルアッセイ（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ ａｓｓａｙ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，＃ＥＣＭ５５２）を用いて、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞）の移動を阻害する能力についてスクリーニングすることができる。
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、本明細書に記載されるように、発達している腫瘍増殖の状態を近似するアッセイ（例えば、Ｈｅｒｍａｎら（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎを参照されたい）を用いることによって行うことができる。
また、本明細書に具体的に開示される１以上の抗体と同じであるかまたは重複しているエピトープに結合する抗体またはその抗原結合部分は、当技術分野において知られている標準的な技術、および本明細書に記載される技術を用いることによって同定することができる。例えば、興味のある抗体によって結合されるＥｒｂＢ３の同じであるかまたは重複しているエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、交差ブロッキングアッセイ、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるアッセイを行うことができる。
ＩＶ．医薬組成物
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合部分の１つまたは組み合わせを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、ＥｒｂＢ３の異なるエピトープに結合する、複数（例えば、２以上）の単離された抗体の組み合わせを含む。
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての生理学的に適合する溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に依存して、活性剤、すなわち、抗体、抗体断片、二重特異性分子および多重特異性分子は、酸の作用および活性剤を不活性化し得る他の天然の状態から活性剤を保護するために物質で被覆されてもよい。
「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いずれの望ましくない毒性学的影響も与えない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒な無機酸から得られるもの、並びに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒な有機酸から誘導さるものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から得られるもの、並びにＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒な有機アミンから得られるものが含まれる。
本発明の医薬組成物は、他の剤を含むことができる。例えば、組成物は、少なくとも１以上の追加の治療薬、例えば、下記に記載される抗癌剤を含むことができる。医薬組成物は、放射線治療および／または外科的処置と併用して投与することができる。代わりに、本発明の組成物は、下記の抗癌剤などの少なくとも１以上のさらなる治療薬と別々に同時投与されることができる。
本開示の組成物は、当技術分野において知られている種々の方法によって投与されることができる。当業者に認識されるように、投与の経路および／または方法は、所望の結果に依存して変更される。活性剤は、急速な放出に対して活性剤を保護する担体とともに調製可能であり、例えば、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系など放出制御製剤が挙げられる。生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができ、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル類、およびポリ乳酸を用いることができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許されているか、または、一般に、当業者に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
特定の投与経路による本発明の抗体またはその断片を投与するためには、該抗体の失活を防ぐ物質を用いてそれを被覆するか、またはそれと同時に投与することが必要な場合がある。例えば、該抗体またはその断片は、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤に入れて被験体に投与されてもよい。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。リポソームには、水中油中水型ＣＧＦエマルジョン、並びに従来のリポソームが含まれる（Ｓｔｒｅｊａｎら（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
薬学的に許容される担体には、無菌水性溶液または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末または凍結乾燥物が含まれる。このような媒体および薬学的に活性抗体の使用は、当技術分野において知られている。任意の従来の媒体または薬物が活性剤と不適合でない限り、本発明の医薬組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物も組成物に取り入れることができる。
治療用組成物は、典型的には、無菌でなければならず、製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、ミクロエマルジョン、リポソーム、または他の規則正しい構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの適した混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによりもたらすことができる。
無菌の注射用溶液は、必要量の活性剤を適した溶媒に、必要に応じて上記で列挙された成分の１つまたは組み合わせとともに組み込んだ後、滅菌微細ろ過により、調製することができる。一般に、分散液は、塩基性の分散媒体と、上記で列挙されたものから必要とされる他の成分とを含む無菌のビヒクルに活性剤を組み込むことによって調製される。無菌の注射用溶液の調製用無菌粉末の場合、好適な調製法は、減圧乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））であり、その結果、有効成分および任意の付加的な所望の成分の粉末が、予め滅菌ろ過されたその溶液から生じる。
投与計画は、最適な所望の応答（例えば治療反応）が得られるように調節される。例えば、一個のボーラスを投与してもよく、いくつかに分割された用量を経時的に投与してもよく、または用量は治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に減少もしく増加させてもよい。例えば、本明細書に開示されるヒト抗体は、皮下注射により週に１回または２回、あるいは皮下注射により月に１回または２回投与されてもよい。
適切な投与量範囲および投与計画の非限定例は、２〜５０ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重）を週１回、週２回、もしくは３日ごとに１回、もしくは２週間に１回、および１〜１００ｍｇ／ｋｇを週１回、週２回、もしくは３日ごとに１回、もしくは２週間に１回投与することを含む。種々の実施形態では、抗体は、３．２ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ，３５ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇの投与量を週１回、または週２回、または３日ごとに１回、または２週間に１回のタイミングで投与される。さらなる投与量範囲は、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１〜４００ｍｇ／ｋｇ、１〜３００ｍｇ／ｋｇおよび１〜２００ｍｇ／ｋｇを含む。適切な投与計画は、３日ごとに１回、５日ごとに１回、７日ごとに１回（すなわち、週１回）、１０日ごとに１回、１４日ごとに１回（すなわち、２週間に１回）、２１日ごとに１回（すなわち、３週間に１回）、２８日ごとに１回（すなわち、４週間ごとに１回）および月１回を含む。
実施例に示すように、本明細書に開示される抗体をさらなる治療薬と併用して使用すると、抗腫瘍活性に対して相加効果をもたらすことができる。したがって、併用療法の場合、抗体もしくは第２の治療薬、または両方の最適以下の投与量を用いて、これらの剤の相加効果による所望の治療成績を達成することができる。例えば、別の治療薬と組み合わせで用いられるとき、種々の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、該抗体が単独で投与されるときに用いられる投与量の９０％、または８０％、または７０％、または６０％、または５０％の投与量で投与されてもよい。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤化することが特に有利である。単位形態とは、本明細書で使用するとき、処置される被験体にとって単一の投与量として調整された物理的に別個の単位をいう；各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性剤を含む。本発明の投与単位形態の仕様は、（ａ）活性剤の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、並びに（ｂ）このような活性剤を、個体の感受性の処置のために配合する当技術分野における固有の限定によって決定され、それらに直接的に依存する。
薬学的に許容される抗酸化剤の例には：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
治療用組成物に関して、本開示の製剤には、経口、鼻腔、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口の投与に適したものが含まれる。製剤は、都合良くは、単位剤形で提供されてもよく、薬学の分野において知られている任意の方法によって調製されてもよい。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される被験体、および特定の投与方法に応じて変更することになる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．００１パーセント〜約９０パーセントの有効成分、好ましくは約０．００５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約０．０１パーセント〜約３０パーセントの範囲である
また、膣投与に適した本開示の製剤には、当技術分野において適していることが知られているこのような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレーの製剤もまた含まれる。本発明の組成物の局所または経皮投与用の剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。活性剤は、薬学的に許容される担体、および必要とされ得るいずれかの保存剤、緩衝剤、または噴霧薬と無菌条件下で混合されてよい。
句「非経口投与」および「非経口的に投与される」とは、本明細書で使用するとき、通常、注射による経腸的および局所投与以外の投与用法を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
本発明の医薬組成物に用いられてもよい、適した水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、多価アルコール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル類が含まれる。適した流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
また、これらの組成物には、保存剤、湿潤剤、乳濁剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。当技術分野において周知であるアジュバントの具体例としては、例えば無機アジュバント（アルミニウム塩、例えば、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなど）、有機アジュバント（例えば、スクアレン）、油性アジュバント、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（例えば、インフルエンザウイルスに由来する膜結合型赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含むビロソーム）が挙げられる。
微生物の存在の予防は、上掲の滅菌手順によって、並びに例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの種々の抗菌剤および抗真菌剤の含有の両者によって確保され得る。また、糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望まれる場合がある。さらに、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅らせる作用物質の含有によってもたらすことができる。
本開示の抗体が医薬品としてヒトおよび動物に投与される場合、それらは、単独で、または、例えば０．００１〜９０％（より好ましくは、０．００５〜７０％、例えば０．０１〜３０％）の有効成分を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物としても与えることができる。
選択した投与経路に関係なく、適した水和型で用いられてもよい本開示の抗体、および／または本開示の医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。
本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物、および投与方法にとって所望の治療反応を達成するために有効な量の有効成分を得るように変更されてもよい。選択される投与量レベルは、本明細書に示される抗体またはその断片と同時投与される化合物の場合、用いられる特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、用いられる特定の剤の排出速度、処置期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および以前の病歴などを含む様々な薬物動態学的因子、および医療の分野において周知である因子に依存する。当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効な量を容易に決定および処方することができる。例えば、該医師または獣医師は、医薬組成物に用いられる本発明の抗体またはその断片の用量を、所望の治療効果を得るために必要な量より低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで投与量を次第に増加させることができる。一般に、本発明の組成物の適した１日あたりの用量は、治療効果を生むために有効な最も少ない用量をもたらす量である。このような有効量は、一般に、上述の諸因子に依存する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。必要に応じて、治療用組成物の有効な１日量は、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の別々に投与されるサブ用量として、終日にわたって適切な間隔で、任意に単位剤形で投与されてもよい。
本開示の抗体を単独で投与することも可能であるが、該抗体を医薬製剤（組成物）として投与されることが好ましい。
治療用組成物は、当技術分野において知られている医療用デバイスを用いて投与されることができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に開示されたデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与されることができる。本発明に有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、制御された速度で薬物を分注するインプラント可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通じて薬物を投与する治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達する薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための可変流量式のインプラント可能な注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバー・コンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のこのようなインプラント、送達システム、及びモジュールは当業者に知られている。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、インビボで適切な分布を確保するように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の組成物中の治療用化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために（必要に応じて）、例えばリポソームにそれらを製剤化することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は器官に選択的に輸送されて、標的とした薬物の送達を高める１以上の成分を含んでいてもよい（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照されたい）。典型的な標的成分には、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらによる米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）、その様々な種が本発明の製剤、並びに本発明の分子の成分を含んでもよい；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられる；さらに、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３も参照されたい。
Ｖ．抗体を用いる方法
また、本発明は、様々なエクスビボおよびインビボでの診断用途および治療用途において、ＥｒｂＢ３に結合する抗体およびその抗原結合部分を用いる方法を提供する。例えば、本明細書に開示される抗体は、種々の癌を含む、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患を処置するために用いることができる。
一実施形態では、本発明は、疾患を処置するために有効な量で、本発明の抗体またはその抗原結合部分を被験体に投与することによって、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患を処置するための方法を提供する。適した疾患には、例えば、限定されないが、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、消化管癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、および前立腺癌が含まれる。
好ましい実施形態では、患者から得られる腫瘍試料は検査され、処置は、２００９年８月１７日に提出された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／０５４０５１、表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｔｏ Ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔ Ａｎｄ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａ Ｐａｔｉｅｎｔ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」に従って行われる。該出願は、参照によって本明細書に援用される。例えば、患者は悪性腫瘍の治療を受けることになり、腫瘍の試料は採取され、試料中のリン酸−ＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）のレベルは測定され、その後に少なくとも１種の抗悪性腫瘍治療薬が該患者に投与される。しかし、該試料で測定されたｐＥｒｂＢ３レベルが、無血清培地での２０〜２４時間の培養の後にＡＣＨＮ細胞の培養物で測定されたｐＥｒｂＢ３のレベルの５０％より低くない場合、続いて該患者に投与される少なくとも１種の抗悪性腫瘍治療薬は、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体、たとえばＡｂ＃６を含み、および該試料で測定されたｐＥｒｂＢ３のレベルがＡＣＨＮ細胞の培養物で測定されたｐＥｒｂＢ３のレベルの５０％より低い場合、続いて該患者に投与される少なくとも１種の抗悪性腫瘍治療薬は、抗ＥｒｂＢ３抗体を含まない。
一実施形態では、癌はＫＲＡＳ変異を含む。実施例１７に示すように、本明細書に開示される抗体（例えば、Ａｂ＃６）抗体は、単一剤（単剤療法）としてまたは別の治療薬との併用のいずれかで用いられるとき、ＫＲＡＳ変異を含む腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。別の実施形態では、癌はＰＩ３Ｋ変異を含む。実施例１９に示すように、本明細書に開示される抗体（例えば、Ａｂ＃６）抗体は、単一剤（単剤療法）としてまたは別の治療薬との併用のいずれかで用いられるとき、ＰＩ３Ｋ変異を含む腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。
抗体は、ＥｒｂＢ３が媒介したシグナル伝達と関連した疾患を処置するために、単独で、または抗体と組み合わせてもしくはそれと相乗的に作用する別の治療薬とともに投与されてもよい。このような治療薬には、例えば、下記に記載される抗癌剤（例えば、細胞毒素、化学療法剤、小分子および放射線照射）が含まれる。実施例１６、１７および１９に示すように、本明細書に開示される抗体（例えばＡｂ＃６）は、別の治療薬と併用で用いられるとき、単剤療法で用いられるときと比較すると、腫瘍増殖の阻害が増大することを示す。併用療法のための好ましい治療薬には、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）が挙げられる。
特定の態様では、本明細書に開示される抗体は、患者に投与される。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される抗体または抗原結合部分を（例えば、エクスビボまたはインビボで）被験体に由来する細胞と接触させ、細胞上のＥｒｂＢ３との結合レベルを測定することによって、被験体におけるＥｒｂＢ３アップレギュレーションと関連した疾患（例えば、癌）を診断する方法を提供する。ＥｒｂＢ３との結合の異常に高いレベルは、被験体がＥｒｂＢ３アップレギュレーションと関連した疾患を有することを示す。
また、本発明の抗体およびその抗原結合部分を含むキットは、本発明の範囲内である。このキットは、キットの内容物の意図された使用を指示するラベルを含んでもよく、かつ該ラベルは、ＥｒｂＢ３アップレギュレーションおよび／またはＥｒｂＢ３依存性のシグナル伝達と関連した疾患の処置または診断、たとえば腫瘍の処置においてキットの使用説明書を任意に含む。ラベルなる用語には、キット上にもしくはキットとともに供給されるいずれかの文書、マーケッティング資料または記録資料が含まれるか、あるいはこれらは別の方法でキットに添付される。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、それをさらなる限定として解釈すべきでない。
本出願の全体にわたって引用されている配列表、図面、並びに全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に援用される。
材料および方法
実施例の全体を通して、下記の材料および方法は、特に記述がない限り用いられる。
一般に、本発明の種々の態様の実施は、他に指示がなければ、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）、並びにポリペプチド調製における標準的な技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，ＩｒＩ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照されたい。ＨＣＶ生物学のアッセイのためのインビトロおよびインビボのモデル系は、例えば、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｐａｒｔ ＩＩ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．（ＮＹ）．；３４（２）：３９−４７（２００５）およびＴｈｅ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ＩＬＡＲ Ｊ．；４２（２）：１１７−２６（２００１）に記載されている。
ヘレグリン
これらの実施例および図面で用いるように、ＨＲＧとは、ヘレグリン１β１、ＨＲＧ１−Ｂ、ＨＲＧ−β１、ニューレグリン１、ＮＲＧ１、ニューレグリン１β１、ＮＲＧ１−ｂ１、ＨＲＧ ＥＣＤ、などとさまざまに知られているヘレグリンのアイソフォームをいう。ＨＲＧは、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃３７７−ＨＢ−０５０／ＣＦから市販されている。
細胞系統
下記に記載される実験で用いた全ての細胞系統は、表示したように、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ，ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）から、例えばＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＤＣＴＤ）から、または刊行物の引用で表示したように、研究者から入手した。
・ＭＣＦ７−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−２２
・Ｔ４７Ｄ−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−１３３
・Ｃｏｌｏ３５７−Ｋｏｌｂら（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２０：５１４−５２３。Ｍｏｒｇａｎら（１９８０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２５：５９１−５９８も参照されたい。
・Ｄｕｌ４５−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−８１
・ＯＶＣＡＲ８−ＮＣＩ
・Ｈ１９７５−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−５９０８
・Ａ５４９−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣＬ−１８５
・ＭＡＬＭ−３Ｍ−ＮＣＩ
・ＡｄｒＲ−ＮＣＩ
・ＡＣＨＮ−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−１６１１
腫瘍細胞の粉砕
腫瘍の粉砕のために凍結粉砕機（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｉｎｃ）を用いる。
特別のバッグ（腫瘍を添加する前に予備秤量しておく）に腫瘍を保存し、それらを取り扱う間、液体窒素中に配置する。小さな腫瘍については、最初に２００μＬの溶解バッファーを、腫瘍を含むバッグに加えて、液体窒素中で凍結させ、次に、バッグからの腫瘍の回収を改善するために粉砕する。粉砕した腫瘍を２ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ試験管に移し、さらなる処理の準備が整うまで液体窒素中に配置しておく。
腫瘍細胞の溶解
プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を補充した溶解バッファー中で腫瘍を溶解させる。約６２．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度の腫瘍アリコートに溶解バッファーを加える。腫瘍試料を、３０秒間ボルテックスしてホモジナイズし、氷上で約３０分間インキュベートする。溶解物は、試料のさらなる均質化のために、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＱＳＨＲＥＤＤＥＲカラム中で約１０分間回転させる。澄明になった溶解物を、さらに処理するために新しい試験管に分注する。
ＢＣＡアッセイ
ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）は、全ての腫瘍試料について、製造業者のプロトコールに従って行う。各腫瘍試料の総タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬで）を後でＥＬＩＳＡ結果の標準化において用いる。
ＥＬＩＳＡアッセイ
全体およびホスホ−ＥｒｂＢ３ ＥＬＩＳＡのための全てのＥＬＩＳＡ試薬は、ＤＵＯＳＥＴキットとしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入する。９６ウェルのＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＢプレートを、５０μＬの抗体を用いて被覆して、室温で一晩インキュベートする。翌朝、プレートをＴｗｅｅｎ界面活性剤（ＰＢＳＴ）（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えた、カルシウムまたはマグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルを用いて３回洗浄する。続いて、ＰＢＳ中２％ＢＳＡを用いて、約１時間、室温でプレートをブロックする。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルを用いてプレートを３回洗浄する。５０％溶解バッファーおよび１％ＢＳＡで希釈した５０μＬの細胞溶解物および標準物は、さらなる処理のために２連で用いる。プレートシェーカー上で２時間、４℃で試料をインキュベートし、前述のように洗浄する。２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴで希釈した約５０μＬの検出抗体を加え、約１時間、室温でインキュベートする。リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）−ＥｒｂＢ３に対しては、検出抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接結合させて、２時間、室温でインキュベートする。プレートを前述のように洗浄する。約５０μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを加え、３０分間、室温でインキュベートする（ｐＥｒｂＢ３を除く）。プレートを前述のように洗浄する。約５０μＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）基質を加えて、プレートをＦＵＳＩＯＮプレートリーダーで読む。ＥＸＣＥＬを用いてデータを分析する。２連の試料を平均し、エラーバーを用いて、２つの複製物間での標準偏差を表す。
実施例１： ファージディスプレイを用いた抗体の生成
本明細書でＡｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９と呼ぶヒト抗ＥｒｂＢ３抗体を得るために、ヒトドナーから採取した免疫グロブリン配列の独自の組み合わせを含むヒトＦａｂ−ファージライブラリー（Ｈｏｅｔら、上掲）をＥｒｂＢ３結合物について最初にスクリーニングする。
精製したＥｒｂＢ３、細胞表面ＥｒｂＢ３を発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統を用いて、ライブラリー（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて取得した）に由来する７３個の独自のＦａｂ配列を同定する。次に、これらの７３のクローンを、ファージを含まないＦａｂのみを再編成する。ハイスループット法を用いて、これらのＦａｂを小規模で発現させ、ＥＬＩＳＡ法と、ハイスループット表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術であるＦＬＥＸＣＨＩＰ法とを用いて結合に対する検査をする。ファージを含まない７３個のＦａｂを、チップ表面にスポットし、ＥｒｂＢ３−ｈｉｓ融合標的タンパク質またはＥｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する結合反応速度およびエピトープブロックを測定する。Ｆａｂについての平衡結合定数およびオン／オフ速度を、得られたデータから算出する。
次に、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞との種々のＦａｂの結合を、約５００ｎＭのＦａｂ、および１：７５０に希釈したヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて調べる。図１Ａおよび１Ｂに示すように、上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞の感知できる染色を示したいくつかの候補Ｆａｂを示す。
実施例２：抗ＥｒｂＢ３ Ｆａｂの最適化
ＥｒｂＢ３リガンドであるヘレグリンのＥｒｂＢ３との結合をブロックするＦａｂの同定に続いて、ＦａｂのＶＨおよびＶＬの配列を下記のようにコドン最適化する。
ＶＨおよびＶＬの領域をＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプとして発現するための発現構築物を用いて再編成する。構築物は、適切な重鎖および軽鎖の配列の置換のために設計されたカセットを有するＳＥＬＥＸＩＳ骨格を含む。ＳＥＬＥＸＩＳベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびマッチングポリＡシグナルを含む。
Ａｂ＃６のコドン最適化ＶＨおよびＶＬの核酸配列（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて取得した）を、図２２に示すように、それぞれ配列番号２５および２６に記載し、Ａｂ＃３の核酸配列を、それぞれ配列番号２７および２８に記載する。
実施例３：ＥｒｂＢ３に対する結合親和性
抗ＥｒｂＢ３抗体の解離定数を、２つの独立した技術、すなわち、表面プラズモン共鳴アッセイと、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を用いた細胞結合アッセイとを用いて測定する。
表面プラズモン共鳴アッセイ
表面プラズモン共鳴アッセイ（例えばＦＬＥＸＣＨＩＰアッセイ）を、Ｗａｓｓａｆら（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５１：２４１−２５３に記載されるように、分析物として組換えＥｒｂＢ３と、リガンドと主題の抗体とを用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００装置などで実質的に行う。ＫＤ値は、式ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａに基づいて算出する。
上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定したＡｂ＃６およびＡｂ＃３のＫＤ値は、それぞれ、図２Ａおよび２Ｂに示す。Ａｂ＃６は、約４ｎＭのＫＤ値を示し、およびＡｂ＃３は、約８ｎＭのＫＤ値を示した。さらに、Ａｂ＃６がＥｒｂＢ３との結合をＨＲＧと競合することを表面プラズモン共鳴が示した。
細胞結合アッセイ
Ａｂ＃６およびＡｂ＃３のＫＤ値を決定するための細胞結合アッセイを、下記のように行う。
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を、室温で５分間、２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ＋２ｍＬのＲＭＰＩ＋５ｍＭのＥＤＴＡを用いて解離させる。完全ＲＰＭＩ（１０ｍＬ）をトリプシン処理した細胞に直ちに加えて、穏やかに再懸濁し、次いでＢｅｃｋｍａｎ卓上型遠心分離機で１１００ｒｐｍ、５分間遠心沈殿させる。細胞を２×１０６細胞／ｍＬの濃度で、ＢＤ染色バッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で再懸濁させ、５０ｕＬ（１×１０５細胞）アリコートを９６ウェル滴定プレートに播種する。
ＢＤ染色バッファーに含まれる２００ｎＭ抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６またはＡｂ＃３）の１５０μＬ溶液を、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ試験管で調製し、次いで７５μＬのＢＤ染色バッファーに連続的に２倍希釈する。希釈抗体の濃度は、２００ｎＭ〜０．４ｎＭにわたった。次に、異なるタンパク質希釈物の５０μＬのアリコートを５０μＬの細胞懸濁液に直接加えて、最終濃度１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２ｎＭ、６ｎＭ、３ｎＭ、１．５ｎＭ、０．８ｎＭ、０．４ｎＭおよび０．２ｎＭの抗体を得る。
９６ウェルプレートに分注した細胞を、プラットフォームシェーカー上で３０分間、室温でタンパク質希釈物とともにインキュベートし、３００μＬのＢＤ染色バッファーを用いて３回洗浄する。次に、細胞を、低温室のプラットフォームシェーカー上で、４５分間、ＢＤ染色バッファーで１：７５０希釈したＡｌｅｘａ６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧの１００μｌとともにインキュベートする。最終的に、細胞を２回洗浄し、ペレット状にして、２５０μＬのＢＤ染色バッファー＋０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム中で再懸濁させる。１０，０００個の細胞の分析を、ＦＬ４チャネルを用いるＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで行う。抗ＥｒｂＢ３抗体のＭＦＩ値および対応する濃度をそれぞれｙ軸およびｘ軸にプロットする。分子のＫＤ値を、非線形回帰曲線についての単一部位結合モデルを用いるＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して決定する。
ＫＤ値は、式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／ＫＤ＋Ｘ（Ｂｍａｘ＝飽和の蛍光。Ｘ＝抗体濃度。Ｙ＝結合程度）に基づいて算出する。図２Ｃおよび２Ｄに示すデータから算出されるように、Ａｂ＃６およびＡｂ＃３は、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を用いた細胞結合アッセイでは、得られた（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて）ＫＤ値は、それぞれ約４ｎＭおよび１．３ｎＭであった。
ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）アッセイ
Ａｂ＃６の結合反応速度を調査するさらなる実験では、キネティック排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））を用いて、Ａｂ＃６の会合速度および解離速度を決定する。１．４３×１０５Ｍ−１ｓ−２の会合速度および１．１０×１０−４ｓ−１の解離速度を、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）装置を用いて測定し、測定した解離定数（Ｋｄ）は７６９ｐＭであった。
実施例４：ＥｒｂＢ３についての結合特異性／エピトープ結合
ＥｒｂＢ３に対するＡｂ＃６のＩｇＧ２アイソタイプの結合特異性を、下記のようのＥＬＩＳＡを用いてアッセイする。Ａｂ＃６によって結合されるエピトープの同定も分析する。
９６ウェルのＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＢプレートを、５μｇ／ｍＬの個々のタンパク質を５０μＬ／ウェルで用いて、一晩、室温でのインキュベーションによって被覆する。これらのタンパク質は、組換えヒトＥＧＦＲ外部ドメイン、ＢＳＡ、組換えヒトＥｒｂＢ３外部トメインおよびＴＧＦ−αである。翌朝、プレートをＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄する。ウェルを、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡを用いて１時間、室温でブロックして、前述のように再度洗浄する。約５０μＬのＡｂ＃６を２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴ中にいくつかの希釈（１μＭおよび連続的な２倍希釈）で加える。全ての試料を２連で行い、かつプレートシェーカー上で２時間、４℃でインキュベートする。プレートを前述のように再度洗浄する。５０μＬのヒトＩｇＧ−Ｆｃ検出抗体（ＨＲＰ結合型、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ；２％ＢＳＡ中ＰＢＳＴで、１：７５０００で希釈）を加えて、プレートを１時間、室温でインキュベートする。プレートを前述のように再度洗浄する。５０μＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ基質を加えて、プレートをＦＵＳＩＯＮプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で読む。ＥＸＣＥＬプログラムを用いてデータを分析する。２連の試料を平均し、エラーバーで２つの複製物間での標準偏差を表す。
図３に示すように、上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、Ａｂ＃６はＥＬＩＳＡでは組換えＥｒｂＢ３に結合したが、ＥＧＦＲ、ＢＳＡまたはＴＧＦ−αにはいずれの感知できる結合を示さなかったことを示す。
成熟ＥｒｂＢ３（配列番号７３）のアミノ酸残基１〜１８３に対応するＥｒｂＢ３外部ドメイン断片をコードするＤＮＡ断片は、Ｎｈｅ制限部位とＢｓｉＷＩ制限部位の間で酵母提示ベクターであるｐＹＤ２（Ｈｉｓタグの前で操作された終止コドンを有するｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改変バージョン）にクローン化する。酵母菌株ＥＢＹ１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプラスミドを形質転換し、このプラスミドを含むクローンをＴｒｐ−選択培地で選択する。グルコースを含む培地で一晩、３０℃でクローンを増殖させ、ガラクトースを含む培地に移すことによってＥｒｂＢ３切断変異体の発現を２日間、１８℃で誘導させる。ＥｒｂＢ３切断変異体を示す酵母を、５０ｎＭのＡｂ＃６を用い、その後、Ａｌｅｘａ色素−６４７で標識したヤギ抗ヒト抗体を用いて染色する。二次抗体の酵母との非特異的な結合がないことを示すために、別の試料をヤギ抗ヒト抗体のみで染色する。分析は、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のフローサイトメトリーによって行う。
図３９に示すデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）が示すように、Ａｂ＃６は、ＥｒｂＢ３外部ドメイン、すなわち、成熟ＥｒｂＢ３（配列番号７３）のアミノ酸残基１〜１８３に結合した。
実施例５：腫瘍細胞上の全ＥｒｂＢ３のダウンレギュレーション
腫瘍細胞におけるインビトロおよびインビボの両方でのＥｒｂＢ３発現をダウンレギュレートするＡｂ＃６の能力を下記のように試験する。
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間、３７℃、５％二酸化炭素で増殖させる。次に培地を、１ｕＭ、２５０ｎＭ、６３ｎＭ、１６ｎＭ、４．０ｎＭ、１．０ｎＭ、２４０ｐＭ、６１ｐＭおよび１５ｐＭの濃度の抗体を含む場合と含まない場合とで、ＦＢＳを含まない同じ培地に切り替える。ＦＢＳまたは抗体を含まない培地を対照として用いる。細胞を２４時間、３７℃、５％二酸化炭素で増殖させて、冷ＰＢＳで洗浄し、次に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｕＭ ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、５０ｕＭフェニルアルシン、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ２７１４）を加えた哺乳動物タンパク質抽出（ＭＰＥＲ）溶解バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、７８５０５）を用いて収集する。ＰＢＳＴ（０．１％ｔｗｅｅｎ−２０）中４％ウシ血清アルブミンで細胞溶解物を２倍に希釈し、次に、マウス抗ヒトＥｒｂＢ３捕捉用抗体およびビオチニル化マウス抗ヒトＥｒｂＢ３二次検出抗体を用いてＥＬＩＳＡによって分析する。ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、３７０７０）と反応する西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンによってシグナルを生成する。ルミノメーターを用いてＥＬＩＳＡを定量化する。
図４に示すように、上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、ＥＬＩＳＡで測定すると、Ａｂ＃６が、インビトロでＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞において全ＥｒｂＢ３レベルを約４６．９％減少させたことを示している。
さらなる実験では、Ａｂ＃６のＩｇＧ１およびＩｇＧ２のアイソタイプを用いるＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞上のＥｒｂＢ３受容体のダウンレギュレーションを、ＦＡＣＳ分析を用いて調べる。ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を１５ｃｍディッシュからトリプシン処理して、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを用いて１回洗浄する。細胞ペレットを１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させる。２×１０５細胞の２つのアリコートを１２ウェル組織培養プレート中の個々のウェルに加えて、それぞれを８００ｕＬ ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳの最終量で再懸濁させる。１つのウェルに対しては、Ａｂ＃６ＩｇＧ１またはＡｂ＃６ＩｇＧ２のアイソタイプを最終濃度１００ｎＭ（処理試料）に加え、他のウェルに対しては、等量のＰＢＳ（非処理試料）を加える。
翌日、処理細胞および非処理細胞をトリプシン処理し、洗浄して、ＢＤ染色バッファー中の１００ｎＭのＡｂ＃６とともに３０分間、氷上で、インキュベートする。１ｍＬのＢＤ染色バッファーを用いて細胞を２回洗浄し、１００ｕＬの１：５００希釈したＡｌｅｘａ６４７標識ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ６４７とともに４５分間、氷上で、インキュベートする。次に、細胞を洗浄して、３００ｕＬのＢＤ染色バッファー＋０．５ｕｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムに再懸濁させる。１０，０００個の細胞の分析は、ＦＬ４チャネルを用いてＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで行う。
図５Ａおよび５Ｂに示すように、上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、Ａｂ＃６のＩｇＧ１およびＩｇＧ２のアイソタイプの両方が、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞上のＥｒｂＢ３をそれぞれ約６２％及び約６６％ダウンレギュレートしたことを示している。
このＥｒｂＢ３のダウンレギュレーションが、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞表面のＥｒｂＢ３受容体の内在化に起因するかどうかを決定するために、細胞表面蛍光消光アッセイを行う。ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中の６ウェルプレート（０．２×１０６／ウェル）で一晩平板培養する。翌日、古い培地を取り除いて、蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８に結合した１００ｎＭのＡｂ＃６を含むＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ中の細胞を６０分間、氷上でプレインキュベートする。次に、細胞を３７℃のインキュベーターに戻して、０．５時間、２時間または２４時間インキュベートする。各時点の終わりに、細胞をトリプシン処理して、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ染色バッファー）を用いて洗浄し、次いで全ての試料の準備が整うまで氷上で保管する。０時の時点では、６０分間のプレインキュベーション後に細胞をトリプシン処理して、氷上で保管する。全ての時点で細胞を収集した後、各時点の試料をそれぞれ２つの試験管に分ける。１組の試験管を２５ｕｇ／ｍＬの抗Ａｌｅｘａ４８８抗体とともに氷上で６０分間インキュベートして、細胞表面のいずれの蛍光源（すなわち、Ａｌｅｘａ４８８が結合したＡｂ＃６）を消光させる。もう１組の試験管を非消光のままにして、このインキュベーションの間、氷上で保管する。消光時間が終わると、細胞をＦＡＣＳ染色バッファーで２回洗浄し、次いで３００ｕＬの最終量のＦＡＣＳ染色バッファーに再懸濁させる。各試料について１０，０００現象を収集してＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで分析する。このプロトコールでは、Ａｂ＃６（蛍光で測定した）が細胞表面に残存する割合（各時点で蛍光が消光した細胞と非消光した細胞間の差異によって示される）および内部移行される量（蛍光が消光した細胞のレベルによって示される）の指標が得られる。
図６に示すように、Ａｂ＃６の存在下でのＥｒｂＢ３のダウンレギュレーションを０時間（図６Ａ）、０．５時間（図６Ｂ）、２時間（図６Ｃ）および２４時間（図６Ｄ）で測定した。図６Ａ〜６Ｄに示すように、細胞表面のＥｒｂＢ３受容体が、約３０分後に約５０％ダウンレギュレートし、約２４時間で、約９３％ダウンレギュレートした。
また、メラノーマ細胞中インビボでＥｒｂＢ３ダウンレギュレーションを引き起こすＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べる。
Ｔ細胞欠損ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＩＨ由来の３〜４週齢の雌マウス；非近交系；アルビノバックグラウンド）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。移植のためのＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を培養液（ＲＰＭＩ培地、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質、３７℃、５％、ＣＯ２）中で約８０％の培養密度まで増殖させて収集した。移植するまで細胞を氷上で保持した。マウスに右脇腹から１００μＬのＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（ＰＢＳ中３．５×１０６細胞）を皮下注射を介して移植して、初期の腫瘍増殖についてモニターしなから、回復させた。
デジタルカリパーによって腫瘍（長さ×幅）を測定し、マウスを静脈注射によってマウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７７６９−５ｍｇ）で前処置して、マウスＦｃ受容体で検査した抗体の欠乏をｉｎ ｖｉｖｏでブロックした。各ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の型を別々にＡｂ＃１、Ａｂ＃６、Ａｂ＃１１、およびＡｂ＃１３を１５μｇまたは１００μｇのいずれかでマウスに１日おきに腹腔内に投与して、１週間につき３回、腫瘍を測定し、測定結果をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥＸＣＥＬスプレッドシートに記録した。
最終の腫瘍測定（Ｌ×Ｗ）を行い、ＣＯ２窒息によってマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して、液体窒素中で瞬時に凍結し、−８０℃で保存した（生化学分析用）。最終の腫瘍測定結果を分析し、例えば、Ｂｕｒｔｒｕｍら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：８９１２−８９２１に記載されるように、腫瘍面積と腫瘍体積によってグラフにした。また、腫瘍体積と腫瘍面積の両方について「標準化」および「非標準化」した方法でデータを分析した。データの「標準化」については、測定の各時点で、各群の各腫瘍をカリパー測定によって測定した初期の腫瘍サイズによって分けた。
図７に示すように、ＰＢＳを対照として使用し、この異種移植モデルで検査した種々の抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプにＡｂ＃１１を含み、Ａｂ＃１、Ａｂ＃６およびＡｂ＃１３のそれぞれをＩｇＧ１およびＩｇＧ２のアイソタイプの両方に含んでいた。これらのうち、Ａｂ＃６だけが、全ＥｒｂＢ３の有意なダウンレギュレーションを引き起こした、Ａｂ＃６のＩｇＧ１またはＩｇＧ２のアイソタイプバージョンのいずれかで処置した腫瘍において注射から２４時間後すぐに見られた効果であった。
さらなる実験では、インビボでのＡｄｒＲ異種移植片においてＥｒｂＢ３をダウンレギュレートするＡｂ＃６の能力を調べた。
要約すると、凍結粉砕機（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｉｎｃ）で試料を粉砕した。特別のバッグ（腫瘍を添加する前に予備秤量した）に腫瘍を保存し、それらを取り扱う間、液体窒素中に配置しておいた。小さな腫瘍については、２００μＬの溶解バッファーを最初に、腫瘍を含むバッグに加えて、液体窒素中で凍結させ、次に、バッグからの腫瘍の回収を改善するために粉砕させた。粉砕させた腫瘍を２ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ試験管に移し、溶解させるまで液体窒素中に配置しておいた。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充した溶解バッファー中で腫瘍を溶解させた。６２．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で腫瘍アリコートに溶解バッファーを加えた。腫瘍試料を３０秒間ボルテックスしてホモジナイズし、氷上で３０分間置いた。溶解物を、試料のさらなる均質化のために、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡＳＨＲＥＤＤＥＲカラム中で約１０分間回転させた。澄明になった溶解物を新しい試験管に分注した。
ＢＣＡアッセイを、上掲の材料および方法の節に本質的に記載したように行う。
ＥｒｂＢ３の全レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡ試薬は、ＤＵＯＳＥＴキットとしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。９６ウェルのＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＢプレートを、５０μＬの関連する捕捉用抗体を用いて被覆させ、室温で一晩インキュベートした。翌朝、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルを用いてプレートを３回洗浄し、その後、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡを用いて、室温で１時間ブロックした。次に、プレートを前述のように再度洗浄した。溶解物（５０μＬ）と標準物を５０％溶解バッファーおよび１％ＢＳＡで希釈した。全ての試料は２連で行った。プレートをプレートシェーカー上で２時間、４℃でインキュベートし、次に、前述のように再度洗浄した。２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴで希釈した５０マイクロリットルの検出抗体を加えて、プレートを１時間、室温でインキュベートした。プレートを前述のように再度洗浄した。５０マイクロリットルのストレプトアビジン−ＨＲＰを加えて、プレートを３０分間、室温でインキュベートした。プレートを前述のように再度洗浄した。５０マイクロリットルのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ基質を加えて、読み出しをＦｕｓｉｏｎプレートリーダーで行った。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥＸＣＥＬを用いてデータを分析した。２連の試料を平均して、エラーバーで、２つの複製物間の標準偏差を表す。
この実験の結果を図８に示す。図８に示すように、Ａｂ＃６は、インビボでのＡｄｒＲ異種移植片でＥｒｂＢ３をダウンレギュレートした。
実施例６：腫瘍細胞増殖の阻害
ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の細胞増殖を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べる。
ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＡＣＨＮおよびＮＣＩ／ＡｄｒＲ細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間、３７℃、および５％二酸化炭素で増殖させる。次に、１ｕＭ、２５０ｎＭ、６３ｎＭ、１６ｎＭ、４．０ｎＭ、１．０ｎＭ、２４０ｐＭ、６１ｐＭおよび１５ｐＭ濃度でＡｂ＃６の存在下または非存在下で、培地を、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むがＦＢＳを含まないＲＰＭＩ−１６４０に切り替える。細胞を９６時間、３７℃、および５％二酸化炭素で増殖させ、次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７３）を用いて収集して、ルミノメーター上で分析する。血清および抗体を含まない培地を対照として用いる。
図９、１０および１１に示すように、上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、Ａｂ＃６が、ＥｒｂＢ３を発現するＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（図９）、ＡｄｒＲ卵巣癌細胞（図１０）、およびＡＣＨＮ細胞（図１１）の増殖を阻害したことを示している。具体的には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いて測定すると、Ａｂ＃６は、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞の増殖を約１９．６％阻害し、およびＡｄｒＲ卵巣癌細胞の増殖を約３０．５％阻害した。また、図１１に示すように、Ａｂ＃６は、ＡＣＨＮ細胞の増殖を約２５．４％阻害した。
実施例７：腫瘍細胞におけるＥｒｂＢ３リン酸化の阻害
インビボにおけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べる。
図８に関して、上掲の実施例５に記載したように試料を実質的に粉砕する。ＢＣＡアッセイを、上掲の材料および方法の節に記載したように行い、および図８に関して、ＥＬＩＳＡアッセイを、上掲の実施例５に記載したように実質的に行う。
この実験の結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図１２に示す。図１２に示すように、リン酸化ＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）の量をｎｇ／ｍｇ総タンパク質で測定すると、Ａｂ＃６は、インビボでのＡｄｒＲ卵巣異種移植片においてＥｒｂＢ３リン酸化を有意に阻害した。
ＢＴＣまたはＨＲＧが誘導するＥｒｂＢ３リン酸化のＡｂ＃６による阻害を下記のとおりインビトロで調べる。
５０ｍＭのＢＴＣ、１０ｍＭのＨＲＧまたは３３３ｎＭのＴＧＦ−αで刺激する前に、卵巣ＡｄｒＲ細胞をＡｂ＃６とともに３０分間プレインキュベートする。プレインキュベーションの後、培地を取り除き、５０ｎＭのＢＴＣまたは３３３ｎＭのＴＧＦ−αを用いて、細胞を５分、３７℃、５％ＣＯ２において刺激する。ＨＲＧ対照（５分間、５ｎＭ）、１０％血清および０％血清対照も用いる。細胞を１×冷ＰＢＳで洗浄して、３０μＬの***解バッファー（Ｍ−ＰＥＲバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）＋バナジウム酸ナトリウム（ＮａＶＯ４、Ｓｉｇｍａ）、２−グリセロリン酸エステル、フェニルアルシンオキシド、ＢｐＶおよびプロテアーゼ阻害剤）中で、氷上で３０分間インキュベートすることによって溶解させる。溶解物を−８０℃で一晩保管する。
図１３Ａ〜１３Ｃに示すように、上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、Ａｂ＃６がベータセルリンおよびヘレグリンの両方が媒介するＥｒｂＢ３のリン酸化を有意に阻害したことを示している。
さらなる実験では、卵巣腫瘍細胞系統ＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８においてＥｒｂＢ３リン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおりに調べた。
ＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８の細胞系統は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（「ＤＣＴＤ」）から得る。ＥＬＩＳＡは、上掲の材料および方法の節に記載したように実質的に行う。
この実験の結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図１４Ａおよび１４Ｂに示す。図１４Ａおよび１４Ｂに示すように、Ａｂ＃６は、ＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８の卵巣癌細胞系統の両方においてＥｒｂＢ３リン酸化を阻害した。
上記で検討したように、Ａｂ＃６は、ベータセルリン媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する。ベータセルリン媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化がＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ３を介して起こるのかを調べるために、下記の実験を行った。
ＡｄｒＲ細胞またはＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（１×１０５）を、５０μＬのＢＤ染色バッファー中の２５μＭの抗ＥｒｂＢ３ Ａｂ＃６または２５μＭのセツキシマブ（抗ＥｒｂＢ１）とともに、３０分間、氷上でプレインキュベートする。３０分後、５０μＬの４００ｎＭビオチニル化ＢＴＣを細胞に加えて、さらに３０分間、氷上でインキュベートした。これにより、１２．５μＭ抗体および２００ｎＭのＢＴＣの最終濃度がもたらされる。次に、細胞を５００μＬのＢＤ染色バッファーを用いて２回洗浄し、ＢＤ染色バッファー中の、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μＬとともに４５分間、インキュベートした。最終的に、細胞を２回洗浄し、３００μＬのＢＤ染色バッファーに再懸濁させて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで分析した。陽性対照として、１×１０５のＡｄｒＲまたはＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を、２００ｎＭのＢＴＣとともに、３０分間、氷上でインキュベートして、２回洗浄し、次いで１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートする。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、細胞を、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥの１００μＬのみとともに４５分間インキュベートする。
この実験の結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図１５Ａ〜１５Ｃに示す。図１５Ａに示すように、ＢＴＣは、ＥｒｂＢ１陰性ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞とのいかなる感知できる結合も示さない。しかしながら、図１５Ｂおよび１５Ｃに示すように、ＢＴＣは、ＥｒｂＢ１陽性ＡｄｒＲ細胞との結合を示す。
また、図１５Ｂおよび１５Ｃに示すように、ＥｒｂＢ１との結合は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体であり、かつＥＧＦ様リガンドがＥＧＦＲに結合することを示すための対照として含めたセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））によってブロックされた。これは、例えば、Ａｄａｍｓら（２００５），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１４７−１１５７に記載されている。
実施例８：腫瘍細胞におけるヘレグリン媒介のシグナル伝達の阻害
ヘレグリン媒介の腫瘍細胞のシグナル伝達を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べる。
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞およびＯＶＣＡＲ８細胞を９６ウェル組織培養プレートに別々に播種（３５，０００細胞／ウェル）し、抗生物質、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間、３７℃、および５％二酸化炭素で増殖させる。抗生物質および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で２４時間、３７℃、および５％二酸化炭素で、細胞を血清不足状態にする。細胞を１μＭ、２５０ｎＭ、６３ｎＭ、１６ｎＭ、４．０ｎＭ、１．０ｎＭ、２４０ｐＭ、６１ｐＭおよび１５ｐＭの濃度の抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６のＩｇＧ２アイソタイプ）を含む場合と、含まない場合とで３０分間前処理し、次に、５ｎＭのＨＲＧで、１０分間、３７℃、および５％二酸化炭素において刺激する。対照は、抗体を含まないＨＲＧと非処理細胞（ＨＲＧを含まない、およびＡｂを含まない）である。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、次に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、２２１３６８−１００Ｇ）、１０ｕＭ ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、２０３６９５）、５０μＭオキソフェニルアルシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５２１０００）、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ６５０８−１０Ｇ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ２７１４）を含む哺乳動物タンパク質抽出（Ｍ−ＰＥＲ）溶解バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、７８５０５）を用いて収集する。細胞溶解物をＰＢＳＴ（０．２％ｔｗｅｅｎ−２０）中の４％ウシ血清アルブミンで２倍に希釈し、次に、ＥｒｂＢ３またはＡＫＴ（ＥｒｂＢ３の下流エフェクター）のいずれかのリン酸化についてＥＬＩＳＡによって分析する。
ＡＫＴリン酸化について検査するために、溶解物を、ＡＫＴに特異的な捕捉用抗体と、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）のリン酸化セリン４７３に特異的なビオチニル化検出抗体とを用いてＥＬＩＳＡプレート上を移動させる。シグナルは、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、３７０７０）と反応した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンより生じる。ＥｒｂＢ３リン酸化を評価するために、溶解物を、ＥｒｂＢ３に特異的な捕捉用抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン検出抗体とを用いてＥＬＩＳＡプレート上を移動させる。次に、これを同じ化学発光基質と反応させる。ＥＬＩＳＡ上の発光シグナルをルミノメーターを用いて測定する。
図１６Ａ〜Ｄに示すデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）が示すように、ＥｒｂＢ３（図１６Ａ）およびＡＫＴ（図１６Ｂ）のリン酸化の減少によって測定すると、Ａｂ＃６は、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞およびＯＶＣＡＲ８細胞においてヘレグリン媒介のシグナル伝達の強力な阻害剤である。特に、Ａｂ＃６によるＡＫＴおよびＥｒｂＢ３それぞれのリン酸化の本質的に完全な阻害が観察される。
実施例９：卵巣、前立腺、および膵臓の腫瘍増殖の阻害
インビボでのＡｂ＃６の有効性を評価するために、ヒト癌のいくつかの異種移植モデルをヌードマウスで構築し、腫瘍増殖の阻害をＡｂ＃６の複数の投与量で評価する。例えば、Ｔ細胞欠損ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＩＨ由来の３〜４週齢の雌マウス；非近交系；アルビノバックグラウンド）は、異種移植研究のために、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入する。移植のためのＡｄｒＲ細胞を、培養液中（ＲＰＭＩ培地、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質、３７℃、５％ＣＯ２）で約８５％の培養密度まで増殖させて、収集する。移植するまで細胞を氷上で保持する。マウスに、右脇腹から１００μＬのＡｄｒＲ細胞（ＰＢＳ中６×１０６細胞）を皮下注射を介して移植し、初期の腫瘍増殖についてモニターしながら回復させる。
デジタルカリパーによって腫瘍（長さ×幅）を測定し、静脈注射によってＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７７６９−５ＭＧ）をマウスに投与する。マウスに、Ａｂ＃６の３０μｇまたは３００μｇのいずれかを３日ごとに腹腔内に投与し、次いで１週間につき３回、腫瘍を測定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシートに記録する。
最終的な腫瘍測定（Ｌ×Ｗ）を行い、ＣＯ２窒息によってマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、液体窒素中で瞬時に凍結し、−８０℃で保存する（生化学分析用）。最終的な腫瘍測定結果を分析し、Ｂｕｒｔｒｕｍら、上掲、に記載されるように、腫瘍面積と腫瘍体積によってグラフにする。また、データを腫瘍体積と腫瘍面積の両方について「標準化」および「非標準化」された手法によって分析する。データの「標準化」については、測定の各時点で、各群の各腫瘍をカリパー測定によって測定した初期の腫瘍サイズによって分ける。
ヒト腫瘍細胞系統であるＡｄｒＲ（卵巣）、Ｄｕ１４５（前立腺）およびＯｖＣＡＲ８（卵巣）に由来する３種の異なるモデルからのデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図１７Ａ〜Ｃに示し、Ｃｏｌｏ３５７（脾臓）異種移植研究データを図１７Ｄに示す。これらの図のそれぞれでは、右パネルは、Ａｂ＃６の特定の投与量で達成した血清レベルを示し、左パネルは異なる処置による腫瘍体積の変化を示す。これらの試験からのデータは、３日ごとに（Ｑ３ｄ）３００ｕｇ用量のＡｂ＃６が腫瘍増殖の有意な阻害をもたらすことを示す（研究期間中の複数の時点に対してｐ＜０．０５）。加えて、Ｄｕ１４５前立腺癌モデル、並びに腎癌（ＡＣＨＮ）および膵癌（ＣＯＬＯ３５７）の異種移植モデルにおいて、用量が６００ｕｇ Ｑ３ｄまで増加すると、Ａｂ＃６の阻害効果は、さらに上昇する。しかしながら、１５００ｕｇ Ｑ３ｄまで用量をさらに増加させると、有効性の増加をもたらさなかった（ＯｖＣＡＲ８−図１７Ｃ；ＣＯＬＯ３５７−図１７Ｄ）。これは、６００ｕｇが、腫瘍増殖阻害に関して飽和していることを示唆する。これらの研究から動物由来の血清の薬物動態（ＰＫ）解析は、Ａｂ＃６の血清滞留において用量依存的な増加を示す。同様に、これらの異なる研究からのＡｂ＃６の腫瘍内レベルの生化学的分析は、全腫瘍溶解物の０〜約６ｐｇ Ａｂ＃６／ｕｇの用量依存的な範囲を示した。
実施例１０：腫瘍細胞上のＥｒｂＢ３とのＥｒｂＢ３リガンドの結合の阻害
さらなる実験では、ＥｒｂＢ３リガンドのＥｒｂＢ３との結合を阻害するが、ＥＧＦ様リガンドのＥＧＦＲとの結合は阻害しないＡｂ＃６およびＡｂ＃６の特異性を下記のとおり調べる。
一実施形態では、ＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリンおよびエピレグリン）のＥｒｂＢ３との結合を阻害するＡｂ＃６およびＡｂ＃３のＦａｂバージョン（Ａｂ／Ｆａｂ＃３）の特異性を調べ、ヘレグリンのＥｒｂＢ３との結合を阻害するＡｂ＃６およびＡｂ／Ｆａｂ＃３の能力を調べる。
ＭＡＬＭＥ３Ｍ細胞（１×１０５）を、５０μＬのＢＤ染色バッファー中の１０μＭの抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、Ａｂ＃６またはＡｂ／Ｆａｂ＃３）とともに３０分間、氷上でインキュベートする。３０分後、５０μＬの４０ｎＭビオチニル化ヘレグリンＥＧＦを該細胞に加えて、さらに１０分間、氷上でインキュベートする。これにより、５μＭ抗体および２０ｎＭのヘレグリンＥＧＦの最終濃度がもたらされる。次に、細胞を５００μＬのＢＤ染色バッファーで２回洗浄して、ＢＤ染色バッファー中の、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μＬとともに４５分間、インキュベートする。最終的に、細胞を２回洗浄し、３００μＬのＢＤ染色バッファーに再懸濁させて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで分析する。陽性対照として、１×１０５のＭＡＬＭＥ３Ｍ細胞を、２０ｎＭのヘレグリンＥＧＦとともに、１０分間、氷上でインキュベートして、２回洗浄し、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートする。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、１×１０５のＭＡＬＭＥ３Ｍ細胞を、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ１００μＬのみとともに４５分間インキュベートする。
この実験の結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。図１８Ａおよび１８Ｂに示すように、Ａｂ＃６およびＡｂ／Ｆａｂ＃３の両方は、ヘレグリンのＥｒｂＢ３との結合を阻害することができる。
同様に、別のＥｒｂＢ３リガンドであるエピレグリンのＥｒｂＢ３との結合を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べる。
ＡｄｒＲ細胞（１×１０５）を、５０μＬのＢＤ染色バッファー中の、２５μＭの抗ＥｒｂＢ３抗体であるＡｂ＃６、または２５μＭの抗ＥｒｂＢ１抗体セツキシマブとともに、または抗体を加えずに（対照として）３０分間、氷上でインキュベートする。３０分後、５０μＬの２μＭビオチニル化ヘレグリンＥｐｉを該細胞に加えて、さらに３０分間、氷上でインキュベートする。これにより、１２．５μＭの抗体および１μＭＥｐｉの最終濃度がもたらされる。次に、細胞を５００μＬのＢＤ染色バッファーで２回洗浄し、ＢＤ染色バッファー中の、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン、蛍光タンパク質の１種）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μＬとともに４５分間、インキュベートする。最終的に、細胞を２回洗浄し、３００μＬのＢＤ染色バッファーに再懸濁させて、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで分析する。陽性対照として、１×１０５のＡｄｒＲ細胞を１μＭのＥｐｉとともに３０分間、氷上でインキュベートして、２回洗浄し、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートする。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、細胞を、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ １００μＬのみとともに４５分間インキュベートする。
この実験の結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。図１９Ａに示すように、エピレグリンは、ＥｒｂＢ３陽性ＡｄｒＲ細胞に結合する。さらに、図１９Ｂに示すように、この結合は、セツキシマブおよびＡｂ＃６の両方によって阻害され、エピレグリンがＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ３の両方に結合し得ることを示唆する。
Ａｂ＃６が、ＥＧＦ様リガンド（例えば、ＨＢ−ＥＧＦ）の腫瘍細胞との結合を阻害することができるかを調べるために、さらなる実験を行う。
ＡｄｒＲ細胞（１×１０５）を、５０μＬのＢＤ染色バッファー中の２５μＭのＡｂ＃６または２５μＭのセツキシマブ（対照として）とともに３０分間、氷上でプレインキュベートする。３０分後、５０μＬの４００ｎＭビオチニル化ＨＢ−ＥＧＦを細胞に加えて、さらに３０分間、氷上でインキュベートする。これにより、１２．５μＭの抗体および２００ｎＭのＨＢ−ＥＧＦの最終濃度がもたらされる。次に、細胞を５００μＬのＢＤ染色バッファーで２回洗浄し、ＢＤ染色バッファー中の、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μＬとともに４５分間、インキュベートする。最終的に、細胞を２回洗浄し、３００μＬのＢＤ染色バッファーに再懸濁させ、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで分析する。陽性対照として、１×１０５のＡｄｒＲ細胞を２００ｎＭのＨＢ−ＥＧＦとともに、３０分間、氷上でインキュベートし、２回洗浄して、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートする。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥの１００μＬのみとともに細胞を４５分間インキュベートする。
図２０に記載するデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）で示すように、ＨＢ−ＥＧＦは、ＡｄｒＲ細胞、ＡｄｒＲ細胞上のＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４のいずれかまたは両方と思われる、と結合する。Ａｂ＃６はこの結合を阻害せず、Ａｂ＃６が、ＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリンおよびエピレグリン）のＥｒｂＢ３との結合の阻害に特異的であることを証明している。
実施例１１：腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ分泌の阻害
ＥｒｂＢ３を発現する細胞（例えば、癌細胞）のＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を、上述の材料および方法の節の「ＥＬＩＳＡアッセイ」下に記述したように、ＶＥＧＦ分泌アッセイ（ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ２９３Ｂ）を用いて調べる。最初に、非処理およびＨＲＧ処理したＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ細胞およびＣＯＬＯ−３５７細胞におけるＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を分析する。図２４Ａに示すように、これらの研究は、ＣＯＬＯ−３５７が培地中に最大量のＶＥＧＦを分泌することを明らかにした。また、これらの細胞は、極めて高レベルのＨＲＧを示すので、培地にＨＲＧを加えることでの、ＶＥＧＦ分泌を誘導することはほとんどない。対照的に、ＨＲＧは、ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ細胞において倍以上のＶＥＧＦ分泌を誘導することができる。Ａｂ＃６は、３つの全ての細胞系統において高レベルで強力な阻害効果を示し、最大はＣＯＬＯ−３５７においてである（図２４Ａ、ＦＵ＝蛍光単位）。
また、Ａｂ＃６は、３種の異なる異種移植片においてＶＥＧＦ分泌を阻害することによって、インビボで同様の効果を示し、最大はＣＯＬＯ−３５７異種移植片においてである（図２４Ｂ）。ＶＥＧＦの阻害は、ＥｒｂＢ３のリン酸化の阻害と相関している（図２４Ｃ）。骨髄腫細胞分泌因子、例えばＶＥＧＦおよびｂＦＧＦが、血管新生を誘導することは立証されている（例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６（４９３５）：１３０６−９；Ｙｅｎら（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９（３１）：３４６０−９を参照されたい）。ＶＥＧＦ分泌の阻害も、腫瘍が誘導する血管新生、すなわち腫瘍増殖のファシリテーターの阻害と相関する。
実施例１２：細胞移動の阻害
ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞）の移動を阻害するＡｂ＃６の能力をトランスウェルアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，＃ＥＣＭ５５２）を用いて調べる。最初に、ＭＣＦ−７細胞を一晩、血清不足状態にし、次に、Ａｂ＃６（最終濃度８ｕＭ）の存在下および非存在下で、１５分間、室温でインキュベートする。その後、細胞が移動できるＩ型コラーゲンを被覆したメンブレンによって下段チャンバーと分離されている上段チャンバーに細胞を移す。Ａｂ＃６の存在下および非存在下で、１０％ＦＢＳを化学誘引物質として作用するように下段チャンバーの培地に加える。該チャンバーを３７℃で１６時間インキュベートし、次に、該メンブレンを通過して下段に移動する細胞を、解離バッファーを用いて取り除き、細胞結合蛍光色素とともにインキュベートする。蛍光プレートリーダーを用いて蛍光を定量化する。平均蛍光±ＳＥＭ（ｎ＝２）を図２５に示す。
図２５のデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）で示すように、非処理の対照（レーン１）と比較すると、１０％ＦＢＳは、細胞移動（レーン３）を刺激し、８ｕＭのＡｂ＃６は、ＦＢＳ誘導性細胞移動（レーン４）を阻害する。
実施例１３：スフェロイド増殖の阻害
ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖を阻害するＡｂ＃６の能力を、発達している腫瘍増殖の状態を近似するアッセイ（Ｈｅｒｍａｎら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２００８ Ｊａｎ；１３（１）：１−８，Ｅｐｕｂ ２００７ Ｎｏｖ ２６）を用いて調べる。ＡｄｒＲ（卵巣癌細胞系統）およびＤＵ１４５（前立腺癌細胞系統）のスフェロイドを、ドロップ法（Ｈｅｒｒｍａｎｎら、上掲）を用いて、９６ウェルプレートの１ウェルあたり１個のスフェロイドの頻度で開始する。サブコンフルエントな細胞をトリプシン処理し、カウントしてから、濾過培地に再懸濁させる。細胞濃度を１００，０００細胞／ｍＬに調整して、２０ｕＬ（２０００細胞を含む）を１滴下、９６ウェルプレートのフタの裏側の各リングに加える。次に、これらの懸垂液滴を有するフタを元の９６ウェルプレートの上に戻す。該９６ウェルプレートの各ウェルには水分を維持するための１００ｕＬのＰＢＳが含まれている。最初のプレーティングから４日後、スフェロイドを含んでいる懸垂液滴を、新しい９６ウェルプレートに再播種する。この再プレーティングは、該懸垂液滴を含むフタを、１％アガロース／ＲＰＭＩを被覆した新しい９６ウェルプレートに移すことが含まれる。新しい９６ウェルプレートは１ウェルあたり１５０ｕＬの培地が含まれている。次に、該プレートおよびフタを一緒に５００ｒｐｍで１分間遠心して、液滴を含むスフェロイドをフタからウェルに移す。次に、プレートを加湿したＣＯ２インキュベーター内で３７℃でさらにインキュベートする。スフェロイドを倒立位相差顕微鏡で撮影する。スフェロイドの大きさを測定するために、１マイクロメートルのスケールも同じ拡大率で撮影する。スフェロイドの直径は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアｒ（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定する。
このようにして得た個々のスフェロイドを、次に、Ａｂ＃６（最終濃度８ｕＭ）、ヘレグリン−β１ ＥＧＦドメイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３９６−ＨＢ、最終濃度３．４ｎＭ）のいずれか、または両方の組み合わせで処理する。スフェロイドの直径は、１日目と１３日目に光学顕微鏡（１０×対物レンズ）を用いて測定する。
図２６Ａおよび２６Ｂに示すデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）は、Ａｂ＃６がＡｄｒＲ細胞におけるスフェロイド増殖を阻害すること、および３．４ｎＭのＨＲＧがスフェロイド増殖を刺激するが、Ａｂ＃６がＨＲＧ効果を阻害する（図２６Ｂ）ことを示している。図２６Ｃに示すデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）は、ＤＵ１４５由来のスフェロイドが１３日間の実験の間、大きさが増加しなかったが、しかしながら、増殖はＨＲＧによって有意に刺激されることを示している。これらの細胞において、８ｕＭのＡｂ＃６はＨＲＧ誘導性スフェロイド増殖を阻害する。
さらなる実験では、別のヒト卵巣細胞系統であるＯＶＣＡＲ８細胞のスフェロイド増殖を阻害するＡｂ＃６の能力を調べる。多細胞腫瘍スフェロイドを前述のように作製する。Ａｂ＃６のスフェロイド増殖への効果を検査するために、スフェロイド形成の１日目と４日目に最終濃度２５μｇ／ｍＬになるまで、抗体を加える。上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、Ａｂ＃６がＯＶＣＡＲ８スフェロイド面積において３０〜４０％の減少を引き起こしたことを示した。
実施例１４：シグナル伝達の阻害
異なるリガンドによって誘導されるシグナル伝達を阻害するＡｂ＃６の能力を調べる。例えば、ＥｒｂＢ３受容体を発現しているＡｄｒＲ細胞とのＨＲＧおよびＢＴＣの結合とのＡｂ＃６の効果を調べる。図２７ＡおよびＢに示すＦＡＣＳ分析結果が示すように、Ａｂ＃６は、ＡｄｒＲ細胞との結合に対してＨＲＧと競合するが、ＢＴＣとは競合しない。したがって、Ａｂ＃６は、ＨＲＧ誘導性シグナル伝達を活性化しない（以下の実験で示すように）ので、ＥｒｂＢ３とのＨＲＧ結合がＡｂ＃６によってブロックされることで、ＨＲＧによって誘導されるシグナル伝達が阻害されることになる。
ＥｒｂＢ３リン酸化の誘導について種々のリガンドを検査する。少なくとも３つのリガンド、ＨＲＧ、ＢＴＣ、およびＨＧＦは、ＡｄｒＲ細胞においてＥｒｂＢ３誘導性リン酸化を刺激することができるが、ＥＧＦはできない。図２８に示すように、Ａｂ＃６は、ＡｄｒＲ細胞においてＨＧＦ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する。さらに、当技術分野において知られているように（例えば、Ｗａｌｌｅｎｉｕｓら（２０００）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５６（３）：８２１−９を参照されたい）、向上したＨＧＦシグナル伝達が種々の上皮および非上皮腫瘍で報告されている。
ＥｒｂＢ３／ｃ−ＭＥＴ相互作用およびこの相互作用の調節におけるＡｂ＃６の役割
ＥＧＦＲにおいて活性化変異を担持する非小細胞肺癌は、ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ３を補充すること、したがってＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ細胞生存経路を活性化することによってチロシンキナーゼインヒビターに対する耐性を生ずることが知られている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６：１０３９−１０４３；Ｇｏｕ（２００７）ＰＮＡＳ：１０５（２）：６９２−６９７）。活性化ＥＧＦＲ変異を担持する細胞系統におけるＥＧＦＲとｃ−ＭＥＴとの間の関連性は、同時免疫沈降によって十分に確立している（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら、２００７；Ｇｏｕ，２００７）。Ｇｕｏらは最近、同時免疫沈降を用いて、ｃ−ＭＥＴおよびＥｒｂＢ３も、増幅したｃ−ＭＥＴに依存することが知られている胃の細胞系統ＭＫＮ４５において複合体で存在することを示した。
また、このｃ−ＭＥＴ−ＥｒｂＢ３相互作用は、野生型ＥＧＦＲを担持しているＡｄｒＲ細胞に起こり、増幅したｃ−ＭＥＴに依存しない。図２８に示すように、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）は、用量依存的様式でＡｄｒＲ細胞においてＥｒｂＢ３リン酸化を誘導する。
さらに、Ａｂ＃６は、ＨＧＦ誘導性ＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する。
また、ＨＲＧおよびＢＴＣのＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ３の両方のリン酸化への効果を調べ、ＨＲＧおよびＢＴＣが、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ３の両方のリン酸化を誘導することがわかる。ＨＲＧは、ＥｒｂＢ３のリン酸化のより強力な誘導因子であるが、ＢＴＣは、ＥｒｂＢ１のリン酸化の強力な誘導因子であることがわかる（図２９Ａ）。このリン酸化は、ＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ３との間の複合体によって促進される可能性がある。ＥｒｂＢ３とのＨＲＧ結合は、ＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ３との間で複合体形成を誘導し、両方の受容体の活性化をもたらす。ＥｒｂＢ１とのＢＴＣ結合がＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ３との間の複合体形成を刺激し、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ３の両方のリン酸化をもたらす場合には、同じ現象がＢＴＣについても出現する可能性がある。
ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥＧＦ、およびＨＧＦが刺激するＥｒｂＢ３リン酸化の阻害
リガンド（ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥＧＦ、およびＨＧＦ）誘導性ＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を、下記の方法によって調べる：
１．１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地に３０，０００細胞／ウェル／１００μＬの密度で９６ウェルプレートにＡｄｒＲ細胞を播種し、一晩増殖させる；
２．翌日、培地を、ＦＢＳを含まない培地に変えることによって細胞を血清不足状態にし、一晩増殖させる；
３．異なる濃度のＡｂ＃６（０．０１ｎＭ〜１００ｎＭ）、またはバッファー（前処理なし、「０」）を用いて２時間、細胞を前処理する；
４．次に、前処理細胞および前処理なし細胞を１０ｎＭ ＨＲＧもしくはＨＧＦで１０分間、または１０ｎＭ ＢＴＣもしくはＥＧＦで５分間刺激し、かつ前処理なし細胞の個々のウェルを非刺激状態のままにする（「対照」）；
５．培地を除去することによって反応を停止させ、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄する；
６．その後、１×プロテアーゼ阻害剤および１×ホスファターゼ阻害剤を含む、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＋７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．０％ ＣＨＡＰＳ、１０％ｖ／ｖグリセロールに細胞を溶解させ；次いで
７．Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥｒｂＢ３ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹＣ１７６９）を用いて、製造業者の説明書に従って、細胞溶解物中でＥｒｂＢ３リン酸化を測定する。
上述の方法またはそれを多少変更した方法によって得た結果を図３８Ａ〜Ｄに記載する。
ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３タンパク質複合体形成の抗体阻害
ＡｄｒＲ細胞は、バッファー（対照）、または２５０ｎＭ Ａｂ＃６とともに６０分間、室温でプレインキュベートし、次に１０ｎＭ ＨＲＧもしくは１０ｎＭ ＢＴＣまたは対照バッファーを用いて１０分間処理する。０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、５０ｍＴＵ／ｍＬアプロチニン、および１００ｕＭロイペプチンを含む、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＋７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．０％ ＣＨＡＰＳ、１０％ｖ／ｖグリセロールに細胞を溶解し、次いで粗溶解物を短時間で遠心して、不溶性物質を除去する。上清は、新しいＥＰＰＥＮＤＯＲＦ試験管に移して、抗ＥｒｂＢ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−２８５）を１：５００希釈で加える。上清を穏やかに振とうしながら、４℃で一晩インキュベートする。６０ｕＬのＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇアガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，＃２０４２１）を、最初に１×ＰＢＳで洗浄する。細胞溶解物−抗体の混合物をＰＢＳ洗浄したビーズに加えて、穏やかに振とうしながら４℃で２時間インキュベートする。次に、免疫沈降物を氷冷した溶解バッファーを用いて３回洗浄し、３０ｕＬの２×ＳＤＳ試料バッファーに再懸濁させ、９５℃で７分間熱変性させ、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上を移動させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１０％ＭｅＯＨを含むＴｒｉ−Ｇｌｙｃｉｎｅバッファー中でＰＶＤＦメンブレンに電気的に移す。１０ｍＬのブロッキングバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，＃９２７−４００００）中でメンブレンを１時間ブロッキングし、次に、１０ｍＬのブロッキングバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃９２７−４００００）中の１：１０００での抗ＥｒｂＢ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，＃２９Ｄ８）とともにインキュベートする。１０ｍＬのブロッキングバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃９２７−４００００）中の１：５０００（２μＬ）でのヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００を用いてシグナルを検出する。
上述の方法またはそれを多少変更した方法によって、Ａｂ＃６が、ＨＲＧによって刺激されたＥｒｂＢ２／３複合体形成を完全に阻害することが示された（図２９Ｂ）。
実施例１５：Ａｂ＃６の阻害プロファイルは、セツキシマブ、ラパチニブおよびペルツズマブとは異なる。
この実施例では、阻害剤用量反応の研究を、Ａｂ＃６、セツキシマブ、ラパチニブまたはペルツズマブのいずれかの存在下で、ＨＲＧまたはＢＴＣのいずれかで刺激されたＡｄｒＲ細胞を用いて行う。血清不足のＡｄｒＲ細胞を、Ａｂ＃６、２ｍＭ〜７．６ｐＭのラパチニブもしくはセツキシマブ、または１００ｎＭ〜１．５ｐＭのペルツズマブを４倍段階希釈したものとともに、３０分間プレインキュベートし、次に２５ｎＭのＨＲＧまたはＢＴＣで１０分間刺激する。ＥｒｂＢ３のリン酸化をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＤＹＣ１７６９−５、製造業者プロトコールによる）で測定し、次いでＩＣ５０値をＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して決定する。
上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得たデータは、以下のことを示した：
Ａｂ＃６は、ＨＲＧ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化およびＢＴＣ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化を阻害し、ＩＣ５０値はそれぞれ、2．４ｎＭと５．９ｎＭであった（９５％信頼区間は、それぞれ１．５〜３．８ｎＭと２．５〜１３．６ｎＭであった）。
ラパチニブ（ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２の可逆的チロシンキナーゼ阻害剤）は、ＨＲＧ誘導性ＢＴＣ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化を阻害し、ＩＣ５０値はそれぞれ１５０ｎＭと３６０ｎＭ（９５％信頼区間は、それぞれ４６〜５０４ｎＭと１１９〜１０６９ｎＭ）であった。
セツキシマブ（抗ＥｒｂＢ１抗体）は、ＢＴＣ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化を、１．８ｎＭのＩＣ５０値（９５％信頼区間は０．９〜３．８ｎＭであった）で阻害した。しかしセツキシマブがＨＲＧ誘導性ＥｒｂＢ３誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化を阻害せず、ＨＲＧシグナル伝達はＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３のヘテロ二量体ではなく、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３によって主に媒介されることを初期の観察で確認する。
ペルツズマブ（ＥｒｂＢリガンド複合体へのＥｒｂＢ2の補充を立体的に妨げるモノクローナル抗体）は、ＨＲＧ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化を３．６ｎＭのＩＣ５０値（９５％信頼区間は１．０〜１３．５ｎＭであった）で阻害したが、ＢＴＣ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化は阻害しなかった。
このように、Ａｂ＃６は、ＨＲＧおよびＢＴＣの両刺激に対して低いナノモルＩＣ５０値で、ＥｒｂＢ３リン酸化を強力に阻害することができる検査した唯一の阻害剤であった。
実施例１６：Ａｂ＃６と他の治療薬との併用療法
この実施例では、異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を阻害するＡｂ＃６の有効性を、他の治療薬、すなわち、エルロチニブまたはタキソールと併用して評価する。
第１の実験では、ＡＣＨＮ（腎腫瘍細胞系統）異種移植腫瘍を有するマウスを、ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の側腹部に皮下で腫瘍を確立することによって準備する。腫瘍を有するマウスに、３００μｇの最適下限用量のＡｂ＃６またはビヒクルのいずれかを３日ごとに腹腔内（ＩＰ）に投与する。エルロチニブ（２５ｍｇ／ｋｇ）を、単独でまたはＡｂ＃６処置との併用のいずれかで１日１回経口投与する。腫瘍サイズ（長さ×幅）を週に２回測定して、測定結果を用いて、腫瘍体積（ｐ／６（Ｌ×Ｗ２）を算出する。図３０に示すデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）は、Ａｂ＃６またはエルロチニブは単独でも腫瘍増殖を阻害するが、併用療法（Ａｂ＃６＋エルロチニブ）による阻害はいずれかの単一剤よりも大きく、相加効果をもたらすことを示している。
第２の実験では、ＤＵ１４５（前立腺腫瘍細胞系統）異種移植腫瘍を有するマウスを、ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の側腹部に皮下で腫瘍を確立することによって準備する。腫瘍を有するマウスに、Ａｂ＃６（３００μｇ）またはビヒクルを３日ごとに腹膜内に（IＰ）投与する。タキソール（２０ｍｇ／ｋｇ）を、単独でまたはＡｂ＃６処置との併用のいずれかで週１回IＰ投与する。再び、腫瘍サイズを週に２回測定して、測定結果を用いて、腫瘍体積を算出する。図３１に示すデータ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）は、Ａｂ＃６またはタキソールは単独でも腫瘍増殖を阻害するが、併用療法（Ａｂ＃６＋タキソール）による阻害はいずれかの単一剤よりも大きく、相加効果をもたらすことを示している。
実施例１７：ＫＲＡＳ変異体腫瘍細胞の増殖の阻害
この実施例では、ＫＲＡＳ変異を含む腫瘍細胞の増殖を阻害するＡｂ＃６の能力を、単独で、または、他の剤と併用して調べる。
Ａ５４９は、ヒトＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２での変異である、Ｇ１２Ｓ ＫＲＡＳ変異を含む肺癌細胞系統であり、該変異ではコドンがグリシン（Ｇ）をコードするコドンからセリン（Ｓ）をコードするコドンに変えられている。この細胞系統は、単独のエルロチニブまたはタキソールによる処置に対して非感受性である。インビトロでのＡ５４９細胞増殖を阻害するＡｂ＃６単独の能力を検査するために、該細胞を多細胞腫瘍スフェロイド（２０００細胞／スフェロイド／９６ウェルプレートのウェル）として増殖させ、次に０、０．００１、０．０１、０．１または１μＭのＡｂ＃６を用いて７日間処置する。スフェロイドの面積を、１日目および７日目に４×拡大率の下で、ＭＥＴＡＭＯＲＰＨソフトウェアを使用して測定し、次いでスフェロイド面積のパーセント変化を算出する（最初の面積−最終面積／最初の面積×１００）。結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を、図３２Ａのグラフ（グラフのＸ軸上の「−４」は「０」用量に相当する）、および図３２Ｂの写真に示す。図３２Ａのデータは、Ａｂ＃６単独処理でもインビトロでのＫＲＡＳ変異体Ａ５４９腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分であり、Ａｂ＃６濃度が１０倍増加したことを示すスフェロイド面積でのパーセント減少に関して線形用量反応の結果であることを示している。代表的なスフェロイドの写真を図３２Ｂに示す。非処理スフェロイドは、７日間に約５％増殖したのに対して１μＭのＡｂ＃６で処理したスフェロイドの大きさは３５％減少した。
インビボでのＫＲＡＳ変異Ａ５４９細胞の増殖を単独で阻害するＡｂ＃６の能力を検査するために、Ａ５４９皮下異種移植腫瘍を有するヌードマウスを６００μｇのＡｂ＃６を３日ごとに処置し、続いて腫瘍体積を測定する。結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図３２Ｃに示す。該グラフは、Ａｂ＃６処置だけにより腫瘍増殖を有意に阻害し、２２日目に投与を中止した後も増殖阻害は保持されていることを示す。このように、Ａｂ＃６は単独でもインビボでＫＲＡＳ変異体腫瘍細胞の増殖を阻害することができた。
インビボでＫＲＡＳ変異Ａ５４９細胞の増殖を阻害するエルロチニブまたはタキソールのいずれかと併用でのＡｂ＃６の能力を検査するために、Ａ５４９皮下異種移植腫瘍を有するヌードマウスを以下のいずれかで処置する：（ｉ）３００μｇのＡｂ＃６単独を３日ごとに；（ｉｉ）２５ｍｇ／ｋｇのタキソール単独を毎日；（ｉｉｉ）２０ｍｇ／ｋｇのタキソール単独を７日ごとに；（ｉｖ）Ａｂ＃６とエルロチニブとの併用（同じ投与量で）；または（ｖ）Ａｂ＃６とタキソールとの併用（同じ投与量で）。エルロチニブ実験およびタキソール実験の結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）は、図３３Ａと３３Ｂに示す。両実験からの結果は、ＫＲＡＳ変異体Ａ５４９異種移植片が、エルロチニブまたはタキソールのいずれか単独での処置に対して非感受性であることと、ＫＲＡＳ変異体異種移植片の増殖がＡｂ＃６単独処置によって阻害されることと、Ａｂ＃６処置とエルロチニブまたはタキソールのいずれかの処置とを組み合わせることで、Ａｂ＃６単剤療法で観察される腫瘍増殖阻害をさらに上回る増殖阻害をもたらすこととを示している。
実施例１８：Ａｂ＃６のＥｒｂＢ３との結合のエピトープマッピング
この実施例では、アラニン置換を用いて、Ａｂ＃６と結合するＥｒｂＢ３内のエピトープをマッピングする。
Ａｂ＃６はＥｒｂＢ３と結合するＨＲＧを阻害するので、アラニン置換の分析はＥｒｂＢ３の細胞外ドメイン（外部ドメイン）内、特にＥｒｂＢ３の外部ドメインのドメインＩ内での予測されるＨＲＧ結合部位に焦点を合わせることから始める。どの残基を変異させるかの選択を支援するために、ＨＲＧと複合体を形成したＥｒｂＢ３の結晶構造が入手不可能であったために、ＴＧＦαと複合体を形成したＥＧＦＲの結晶構造（Ｇａｒｒｅｔら（２００２）Ｃｅｌｌ １１０：７６３−７７３）をモデルとして用いた。ＥｒｂＢ３とＥＧＦＲは構造において相同であり、したがって、たとえ相互作用する残基が同一でなくとも、構造要素（特定のループまたは螺旋面）は同じはずである。したがって、Ｇａｒｒｅｔら、上掲、に記載されるように、リガンド結合に関与することが特定されているＥＧＦＲの残基は特定され、およびＥｒｂＢ３とＥＧＦＲの配列アライメントからは対応するＥｒｂＢ３残基が明らかになる。リガンド結合部位に加えて、ＥｒｂＢ３外部ドメインのドメインＩの他の面を、ガイドとしてＥｒｂＢ３の結晶構造を用いて変異させる（ＣｈｏおよびＬｅａｈｙ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１３３０−１３３３）。
したがって、以下のＥｒｂＢ３の点変異を作製する：Ｌ１４Ａ、Ｎ１５Ａ、Ｌ１７Ａ、Ｓ１８Ａ、Ｖ１９Ａ、Ｔ２０Ａ、Ｎ２５Ａ、Ｋ３２Ａ、Ｌ３３Ａ、Ｖ４７Ａ、Ｌ４８Ａ、Ｍ７２Ａ、Ｙ９２Ａ、Ｙ９２Ｐ、Ｄ９３Ａ、Ｍ１０１Ａ、Ｌ１０２Ａ、Ｙ１０４Ａ、Ｙ１０４Ｐ、Ｎ１０５Ａ、Ｔ１０６Ａ、Ｙ１２９Ａ、Ｙ１２９Ｐ、Ｋ１３２Ａ、Ｑ５９Ａ、Ｔ７７Ａ、Ｑ９０Ａ、Ｑ１１４Ａ、Ｑｌ１９Ａ、Ｒ１４５Ａ、Ｒ１５１Ａ、Ｖ１５６Ａ、Ｈ１６８Ａ、Ｋ１７２ＡおよびＬ１８６Ａ。標準一文字アミノ酸略記を用いるこの表記法では、例えば、Ｌ１４Ａは、成熟ＥｒｂＢ３（配列番号７３）のアミノ酸１４位でのロイシン（Ｌ）が、アラニン（Ａ）に特異的に変異されることを示し、他の置換変異も同じ様式で示す。変異誘発は当技術分野で知られている標準方法を使用して達成され、ＥｒｂＢ３外部ドメインのドメインＩと関連して、ＥｒｂＢ３変異体を当技術分野で知られている標準方法を用いることによって酵母菌の表面に発現させる。全ての変異体は、野生型ＥｒｂＢ３ドメインＩのそれらと同じレベルで酵母の表面に十分に発現した。ＥｒｂＢ３ドメインＩ変異体の酵母上の発現によって、最初に組換えタンパク質を精製せずにＦＡＣＳを用いることによるＡｂ＃６の変異体との結合の検査が可能になる。
単一変異を含むＥｒｂＢ３外部ドメインのドメインＩ断片とのＡｂ＃６の結合を、標準ＦＡＣＳ分析によって決定する。ＥｒｂＢ３上のエピトープに結合し、Ａｂ＃６によって結合した該エピトープと重複しない（ＥｒｂＢ３との結合の競合の欠如によって明らかなように）第２の抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１；ＬａｂＶｉｓｉｏｎ）を対照として用いて、これらの変異体がＥｒｂＢ３構造をただおおむね不安定にしているのではないことを裏付ける。このように、両抗体の結合に影響を及ぼすＥｒｂＢ３の変異をさらなる特徴付けから除外する。ＦＡＣＳ分析の場合、酵母細胞表面でＥｒｂＢ３ドメインＩの異なる変異体バージョンを発現する酵母細胞にＡｂ＃６（二次抗体としてヤギ抗ヒトＡｂ−Ａｌｅｘａ４８８が続く）とＳＧＰ１−Ａｌｅｘａ６４７とで同時に標識する。データ（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）は、上述のアラニン点変異の４つが、ＥｒｂＢ３外部ドメインのドメインＩとのＡｂ＃６の結合を阻害するが、対照の抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１）の結合を阻害しないことを示している。これらの４つの点変異は以下の通りである：Ｄ９３Ａ、Ｍ１０１Ａ、Ｌ１０２ＡおよびＹ１０４Ａ。
Ａｂ＃６エピトープが成熟ＥｒｂＢ３（配列番号７３）の残基９３、１０１、１０２および１０４を含むことをさらに確認するために、これらの４つの変異（Ｄ９３Ａ、Ｍ１０１Ａ、Ｌ１０２ＡおよびＹ１０４Ａ）を、この状況においてそれらの影響を調べるために、ＣＨＯ Ｋ１細胞への安定なトランスフェクションの後に完全長の成熟ＥｒｂＢ３と関連して発現させる。野生型完全長ＥｒｂＢ３を発現するＣＨＯ Ｋ１細胞は、陽性対照として役立つ。高発現クローンを各変異体のために選択して、標準ＦＡＣＳ分析のために、Ａｂ＃６またはＳＧＰ１（ＥｒｂＢ３の適切な折り畳みを確認するために）のいずれかで標識する。ＳＧＰ１をＡｌｅｘａ６４７色素で直接標識し、Ａｂ＃６をＡｌｅｘａ４８８色素で直接標識する。
結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図３４Ａ〜３４Ｅに示す。これらの図は、ＳＧＰ１もしくはＡｂ＃６の、野生型ＥｒｂＢ３、Ｄ９３Ａ変異体、Ｍ１０１Ａ変異体、Ｌ１０２Ａ変異体またはＹ１０４Ａ変異体との結合をそれぞれ示す。これらの結果が示すのは、対照抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳＧＰ１）が４つの全ての変異体に結合することができるが、Ａｂ＃６は変異体のうちの３つ（Ｄ９３Ａ、Ｌ１０２ＡおよびＹ１０４Ａ）との結合を本質的に示さず、４番目の変異体（Ｍ１０１Ａ）とのごくわずかな結合のみを示すことである。このように、完全長ＥｒｂＢ３ ＣＨＯ細胞の発現実験は、ＥｒｂＢ３上のＡｂ＃６エピトープが、配列番号７３に示す成熟、ヒトＥｒｂＢ３配列の残基９３、１０１、１０２および１０４を含むことを示す。これらの４つの残基は、ＥｒｂＢ３内の５ストランド平行βシートのストランド３上に位置する。類似した様式でさらに行った実験では、エピトープが配列番号７３に示した成熟、ヒトＥｒｂＢ３配列の残基９２、９９および１２９をさらに含むことを示すデータをもたらした。このように、Ａｂ＃６によって結合されたエピトープは、配列番号７３に示した成熟ヒトＥｒｂＢ３配列の残基９２〜１０４および１２９（折り畳まれたタンパク質では９２〜１０４に隣接する）にわたる配列を含むとみなされ得る。
実施例１９：ＰＩ３Ｋ変異体腫瘍細胞の増殖の阻害
この実施例では、ＰＩ３Ｋ変異を含む腫瘍細胞の増殖を阻害するＡｂ＃６の能力を単独でまたは別の剤との併用のいずれかで調べる。
ＳＫＯＶ３（ＳＫＯＶ−３）は、ＰＩ３Ｋの発現をアップレギュレートする変異を含む卵巣癌細胞系統である。ＰＩ３Ｋ変異体ＳＫＯＶ３細胞のインビボでの増殖を単独で阻害するＡｂ＃６の能力を検査するために、ＳＫＯＶ３皮下異種移植腫瘍（１５０〜２００ｍｍ３の腫瘍体積）を有するヌードマウスに、３日ごとに６００μｇのＡｂ＃６で処置し、続いて腫瘍体積を測定する。結果（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）を図３５Ａのグラフに示し、Ａｂ＃６の単独処置が腫瘍増殖の部分的阻害をもたらすことを示す。この実験では、腫瘍増殖において約３０日の「誘導期」が、ビヒクル処置したマウスでも観察された。これは、この腫瘍がインビボでゆっくりと増殖することを示す。それにもかかわらず、ビヒクル処置したマウスと比較すると、Ａｂ＃６処置したマウスでは、３０日後に腫瘍体積が減少し、Ａｂ＃６の単独処置がＰＩ３Ｋ変異腫瘍細胞をインビボで阻害することができることを示す。
シスプラチンとの併用で、ＰＩ３Ｋ変異体ＳＫＯＶ３細胞の増殖をインビボで阻害するＡｂ＃６の能力を検査するために、ＳＫＯＶ３皮下異種移植腫瘍を有するヌードマウスを以下のいずれかで処置する：（ｉ）３日ごとに３００μｇのＡｂ＃６を単独で（Ａｂ＃６の最適下限用量）；（ｉｉ）１．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチン（ＣＤＤＰ）を単独で；または（ｉｉｉ）Ａｂ＃６とシスプラチンとを併用で（同じ投与量で）。上述のＡｂ＃６単剤療法の実験で観察された３０日の「誘導期」を考慮して、併用実験においてＡｂ＃６による投与を３０日の誘導期が経過するまで開始しない。併用療法の実験（上述の方法またはそれを多少変更した方法を用いて得た）に関する結果を図３５Ｂに示す。結果は、Ａｂ＃６およびシスプラチン両方とも単独でＳＫＯＶ３異種移植腫瘍の増殖を阻害することができること、併用処置はいずれかの剤の単独でよりもさらに大きい腫瘍増殖の阻害をもたらすこととを示し、それによってシスプラチンなどの第２の治療薬と併用すると、Ａｂ＃６処置の有効性が向上することを示している。
実施例２０：Ａｂ＃６のパラトープマッピング
この実施例では、Ａｂ＃６のパラトープマッピングを、抗体の単鎖（ｓｃＦｖ）バージョンを用いて行う。このｓｃＦｖバージョン（配列番号７２）では、ＶＨ領域(配列番号１)およびＶＬ領域（配列番号２）を（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号７２のアミノ酸１２３〜１３７；また、このリンカー配列は配列番号７４に示す）と連結しても、このｓｃＦｖはＥｒｂＢ３に特異的に結合する能力を依然として保持する。この型を用いて、ＣＤＲループにおけるアラニン（場合によってはフェニルアラニン）置換変異のＥｒＢ３結合への影響を調べる。
Ａｂ＃６のＣＤＲループにおいてどの残基が露出する表面であるかを予測するために、Ａｂ＃６の結晶構造がまだ経験的に決定されていないので、２つの極めて相同な抗体の検証構造を調べた。その結晶構造がＡｂ＃６と最も相同であると思われる入手可能な抗体は、ＶＨ鎖の場合は１ｍｈｐ（抗α１インテグリン、Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２７：１０３１（２００３））およびＶＬ鎖の場合は１ｍｃｏ（Ｇｕｄｄａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４２７１（１９９３））である。変異のために選択して、ボールド体と下線で強調した残基を有するＡｂ＃６のＣＤＲループを以下の表１に示す。１ｍｈｐ抗体のＶＨＣＤＲの配列および１ｍｃｏ抗体のＶＬＣＤＲ配列も表１に示し、各ＣＤＲの配列番号の後にＡｂ＃６と比較したアミノ酸ミスマッチの数を括弧内に示し、および表面残基をイタリック体、ボールド体、および下線で強調した。
（表１）抗体＃６におけるＣＤＲループ
Figure 0005752687
Ａｂ＃６で生成した変異を以下の表２にまとめる。変異のためのアミノ酸残基のナンバリングは、ｓｃＦｖ型内のＶＨおよびＶＬの残基のリニアナンバリングに相当し、Ｋａｂａｔナンバリングに相当するのではない。表記法Ｔｈｒ２８Ａｌａは、ｓｃＦｖのアミノ酸２８位でのスレオニン（Ｔｈｒ）がアラニン（Ａｌａ）に特異的に変異されることを示し、置換変異の残りも同じ様式で示す。
（表２）Ａｂ＃６の変異
Figure 0005752687
Figure 0005752687
表２に示すように、全ての変異はアラニンに対するが、ただしチロシン残基もフェニルアラニンに変異される。これはＰｈｅとＴｙｒが構造的に極めて似ている（例えば、両方とも芳香族である）ので、したがって、このような変異は、抗原結合に関して混乱を起こさせるのが少ないと予想される。本来のＣＤＲ内で作られる変異に加えて、ＣＤＲの外側の重鎖残基２８と３０も、ＣＤＲ領域内に落ちると、変異される（表２の変異Ｍ１とＭ２）。変異の全てを標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製し、ＥｒｂＢ３との変異体の結合を当技術分野で知られている標準スクリーニング手法を使用して検査する。
図３６に示すように、いくつかの変異がｓｃＦｖのプロテインＡ（その結合はＣＤＲを含まない）との結合を変化させるより以上にｓｃＦｖのＥｒｂＢ３ドメインとの結合を選択的に影響を及ぼすことを確認した。それらの同一性および影響（図３６に示した３つのグループ化に基づく）を以下の表３に示す。「結合に影響を及ぼさない」とは、ＥｒｂＢ３との結合が実質的に影響を受けないこと、または対応する減少がｓｃＦｖタンパク質の不安定化に起因するプロテインＡとの結合に対応する減少があることのいずれかを示す。大部分の結合残基は、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３のループに位置し、一部はＬ１およびＬ３のループに位置する。多くの他の抗体抗原複合体に見られるように、Ｌ２ ＣＤＲは、直接結合に寄与しない。
（表３）Ａｂ＃６変異のＥｒｂＢ３結合への影響
Figure 0005752687
Figure 0005752687
表３に示す結果に基づいて、各重鎖および軽鎖のＣＤＲのコンセンサス配列を導き出す。これらのコンセンサス配列を、図３７Ａと３７Ｂにおいて、野生型ＣＤＲ配列の下に示す。コンセンサス配列は、アラニンに変異されかつ実質的に結合に影響を及ぼさないことがわかっているアミノ酸残基が、それらの位置でいずれのアミノ酸（Ｘａａ）でも許容されるように総称化されている点で野生型ＣＤＲ配列とは異なる。さらに、その中の芳香族フェニルアラニンへの変異は結合に影響を及ぼさなかったが、アラニンへの変異が結合に影響を及ぼした芳香族チロシン残基を含むそれらのアミノ酸位置の場合、芳香族アミノ酸チロシン、ヒスチジン、トリプトファンおよびフェニルアラニンのいずれかは、図３７Ａに示すコンセンサス配列中のその位置で可能にされるが、図３７Ｂに示すコンセンサス配列中ではそれらのアミノ酸位置は、チロシンまたはフェニルアラニンのいずれかになることが可能にされる。
さらにまた、表３に示す結果に基づいて、重鎖および軽鎖のＣＤＲのそれぞれのパラトープ配列を導き出す。これらのパラトープ配列を図３７Ａおよび３７Ｂにおいて野生型配列およびコンセンサスＣＤＲ配列の下に示す。パラトープ配列は、アラニンに変異されるとき、ＥｒｂＢ３との結合が実質的に減少を示したＣＤＲ内のアミノ酸残基の位置に対応し、それによって抗原結合においてこれらの位置における実質的な役割を示唆する。さらに、その中の芳香族フェニルアラニンへの変異は結合に影響を及ぼさなかったが、脂肪族アラニンへの変異が結合に影響を及ぼした芳香族チロシン残基を含むそれらのアミノ酸位置の場合、図３７Ａの芳香族アミノ酸チロシン、ヒスチジン、トリプトファンおよびフェニルアラニンのいずれか（または代わりに図３７Ｂのチロシンおよびフェニルアラニン）は、パラトープでのそのような各位置で可能にされる。抗原結合に直接関与するようにみえないＣＤＲ内の他のアミノ酸位置は、パラトープ内でいずれのアミノ酸残基（Ｘａａ）になるように可能にされる。
Ａｂ＃６の野生型重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列も、それぞれ配列番号７、８および９に示し、並びにＡｂ＃６の野生型軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１０、１１および１２に示す。ＡＢ＃６のコンセンサス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列も、それぞれ配列番号６０と７５（ＣＤＲ１）、６１（ＣＤＲ２）および６２（ＣＤＲ３）に示し、並びにＡｂ＃６のコンセンサス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列も、それぞれ配列番号６６と７７（ＣＤＲ１）、６７（ＣＤＲ２）および６８と７９（ＣＤＲ３）に示す。Ａｂ＃６の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のパラトープ配列も、それぞれ配列番号６３と７６（ＣＤＲ１）、６４（ＣＤＲ２）および６５（ＣＤＲ３）に示し、並びにＡｂ＃６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のパラトープ配列も、それぞれ配列番号６９と７７（ＣＤＲ１）、７０（ＣＤＲ２）および７１と８０（ＣＤＲ３）に示す。
均等物
当業者は、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または確認して、実行することができる。
このような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。従属クレームに開示されている実施形態の任意の組み合わせは、本発明の範囲内にあることが意図される。
参照による援用
本明細書に言及されている、ありとあらゆる米国および外国の特許および係属している特許出願の開示並びに全ての刊行物は、全体として参照により本明細書に援用される。

Claims (14)

  1. 配列番号７３の残基９２〜１０４を含むヒトＥｒｂＢ３のエピトープに結合し、かつＥｒｂＢ３を発現する癌細胞の増殖を阻害することによって特徴付けられる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ただし該抗体は、（ｉ）配列番号１および２にそれぞれ示されるＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体；または（ｉｉ）配列番号７、８および９にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体ではない、前記抗体またはその抗原結合部分。
  2. 抗体が、（ｉ）配列番号３および４にそれぞれ示されるＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体；（ｉｉ）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体；（ｉｉｉ）配列番号３５および３６にそれぞれ示されるＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体；（ｉｖ）配列番号３９、４０および４１にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号４２、４３および４４にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体；（ｖ）配列番号３７および３８にそれぞれ示されるＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体；または（ｖｉ）配列番号４５、４６および４７にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列と、配列番号４８、４９および５０にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列とを含む抗体ではない、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  3. 前記エピトープが配列番号７３の残基１２９をさらに含む、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  4. 前記癌細胞がＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞、ＡｄｒＲ細胞、またはＡＣＨＮ細胞であり、前記増殖が対照と比べると少なくとも１０％減少する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  5. 配列番号７３の残基９３（アスパラギン）、残基１０１（メチオニン）、残基１０２（ロイシン）および残基１０４（チロシン）から選択されるヒトＥｒｂＢ３のアミノ酸残基のいずれか１つがアラニンで置換されて単一アミノ酸置換を有する変異体ＥｒｂＢ３を作製する場合に、該変異体ＥｒｂＢ３に対する該抗体またはその抗原結合部分の結合が、配列番号７３のアミノ酸配列を含むヒトＥｒｂＢ３に対する前記抗体またはその抗原結合部分の結合と比較して減少する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  6. （ａ）抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、もしくはキメラ抗体である；
    （ｂ）抗原結合部分が、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体の一部である；
    （ｃ）抗体もしくはその抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、もしくはドメイン抗体である；または
    （ｄ）抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプである、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
  7. 抗体が、ＫＲＡＳ変異またはＰＩ３Ｋ変異のいずれかまたは両方を含む腫瘍細胞の増殖を阻害することができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、任意で抗体がインビボでＫＲＡＳ変異体Ａ５４９細胞および／またはＰＩ３Ｋ変異体ＳＫＯＶ３細胞の増殖を阻害することができる、前記抗体またはその抗原結合部分。
  8. 薬学的に許容される担体中に請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、組成物。
  9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、被験体において癌を処置するための医薬組成物。
  10. 癌から得られる細胞試料が、ＫＲＡＳ変異またはＰＩ３Ｋ変異のいずれかまたは両方を含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記被験体がヒトであり、
    （ｉ）前記ＫＲＡＳ変異がヒトＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２もしくはコドン１３の変異を含む；または
    （ｉｉ）前記ＰＩ３Ｋ変異がヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエキソン９もしくはエキソン２０の変異を含む、
    請求項１０に記載の組成物。
  12. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である第１の剤を含む、癌を処置するための医薬組成物であって、
    該第１の剤以外の抗がん剤である第２の剤の治療有効量と組み合わせて使用される、前記組成物。
  13. 前記第２の剤が、
    （ａ）抗体もしくはその抗原結合部分を含む；
    （ｂ）タンパク質合成阻害剤、ソマトスタチン類似体、免疫治療剤、もしくは酵素阻害剤である；または
    （ｃ）ＩＧＦ１Ｒを標的とする小分子、ＥＧＦＲを標的とする小分子、ＥｒｂＢ２を標的とする小分子、ｃＭＥＴを標的とする小分子、代謝拮抗薬、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤、ホルモン療法、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害薬、ｍＴＯＲ阻害剤、化学療法薬、プロテインキナーゼＢ阻害剤、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、もしくはＭＥＫ阻害剤である、
    請求項１２に記載の組成物。
  14. （ａ）前記第２の剤に含まれる抗体がパニツムマブ、トラスツズマブもしくはセツキシマブである；
    （ｂ）微小管標的剤がパクリタキセルである；
    （ｃ）アルキル化剤がシスプラチンである；または
    （ｄ）ＥＧＦＲを標的とする小分子がエルロチニブもしくはラパチニブである、
    請求項１３に記載の組成物。
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